JP2014005206A - アリールアミノヘテロ環カルボキサミド化合物 - Google Patents

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Abstract

【課題】EML4-ALK融合タンパクのキナーゼ活性の阻害剤として有用な化合物を提供する。
【解決手段】本発明者らは、EML4-ALK融合タンパクのキナーゼ活性を阻害する作用を有する化合物について鋭意検討した結果、本発明のアリールアミノヘテロ環カルボキサミド化合物が、EML4-ALK融合タンパクのキナーゼ活性の阻害活性を有することを知見し、本発明を完成させた。本発明化合物は、癌、肺癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌等の予防及び／又は治療用医薬組成物として使用しうる。
【選択図】なし

Description

本発明は医薬組成物、殊に癌治療用医薬組成物の有効成分として有用なアリールアミノヘテロ環カルボキサミド化合物に関する。
肺癌は、気管、気管支、肺胞の細胞が正常機能を失った結果、無秩序に増殖することにより発生するものであり、肺癌による死亡者数は全癌死の17%を占め最も多く、世界中で年間130万人ほどが肺癌で死亡している。
肺癌に対する治療は、手術（外科療法）、抗癌剤（化学療法）、放射線照射（放射線療法）に大別されるが、その組織型によりその治療が奏効するかどうかは変動する。例えば、肺癌の確定診断は、病理医の手による顕微鏡標本の細胞病理組織診断で行われるが、肺癌の20%程度を占める小細胞肺癌は一般的に悪性度が高く、急速に増大、進展し、他の臓器への転移が多く見られることから、発見時にすでに進行癌であることが多い。このため、化学療法や放射線療法が行われることが多いが、これらに対して比較的感受性はあっても多くは再発するため、予後はあまりよくない。一方、残る80%程度を占める非小細胞肺癌は、あるステージまでは手術療法が検討されるものの、そのステージ以降では手術の適応となることはあまりなく、化学療法や放射線療法が治療の主体となる。
従って、いずれの肺癌においても、化学療法はその治療の重要な選択肢である。
ALK（Anaplastic lymphoma kinase）は、受容体型チロシンキナーゼであり、中央部に細胞膜貫通領域を有し、そのカルボキシル末端側にチロシンキナーゼ領域、アミノ末端側に細胞外領域を有するタンパク質である。これまでに、神経芽細胞腫、神経膠芽腫、乳がん、メラノーマ等、いくつかの外胚葉を起源とする癌細胞において全長ALKが発現していることが報告されている（非特許文献１）。また、ヒト悪性リンパ腫の一部の症例において、ALK遺伝子が染色体転座の結果、他の遺伝子（例えば、NPM遺伝子、CLTCL遺伝子、TFG遺伝子、TPM3遺伝子、ATIC遺伝子、及びTPM4遺伝子）と融合し、癌化能を持った融合型チロシンキナーゼを作ることが報告されている（Science, vol.263, p.1281, 1994；Blood, vol.86, p.1954, 1995；Blood, vol.95, p.3204, 2000；Blood, vol.94, p.3265, 1999；Oncogene, vol.20, p.5623, 2001）。炎症性筋線維芽細胞腫瘍（Inflammatory Myofibroblastic Tumor）においても、染色体転座の結果、CARS遺伝子、SEC31L1遺伝子、及びRanBP2遺伝子等の他の遺伝子とALK遺伝子が融合し、融合型チロシンキナーゼを作ることが知られている（Laboratory Investigation, a journal of technical methods and pathology, vol.83, p.1255, 2003；International Journal of Cancer, vol.118, p.1181, 2006；Medicinal Research Reviews, vol.28, p.372, 2008）。ALKと融合するパートナー分子の多くは複合体形成ドメインを有し、融合体自身も複合体を形成していると考えられており、この複合体形成がALKのチロシンキナーゼ活性の制御不能を引き起こし、細胞内シグナルが異常に活性化される結果、癌化を引き起こしていると考えられている（Cellular and Molecular Life Science, vol.61, p.2939, 2004；Nature Reviews Cancer, vol.8, p.11, 2008）。
また、最近の報告では食道癌においてTPM4-ALK融合蛋白が存在していることがプロテオミックス解析手法によって示されている（World Journal of Gastroenterology, vol.12, p.7104, 2006；Journal of Molecular Medicine, vol.85, p.863, 2007）。さらに、肺癌患者の検体からEML4(echinoderm microtubule associated protein like-4)とALKとの融合遺伝子が確認され、このEML4-ALK融合遺伝子に腫瘍形成能があり、癌の原因遺伝子であること、及びそのキナーゼ活性の阻害剤がEML4-ALK融合タンパクが発現した各種細胞の増殖を抑制することが報告されている（特許文献１、非特許文献２）。さらに当該文献には、EML4-ALK融合タンパクの阻害剤が、EML4-ALKポリヌクレオチド陽性の肺癌患者における肺癌に対する治療薬として有用であることが記載されている。更に肺癌ではEML4-ALKの多くのバリアントの存在が証明され（特許文献１、Annals of surgical oncology, vol.17, p.889, 2010、Molecular Cancer Research, vol.7, p.1466, 2009、
Clinical Cancer Research, vo.15, p.3143, 2009、Cancer, vol.115, p.1723, 2009、
Clinical Cancer Research, vol.14, p.6618, 2008、Clinical Cancer Research, vol.14, p.4275, 2008）ており、また、TFG-ALK（Cell, vol.131, p.1190, 2007）及びKIF5B-ALK（Clinical Cancer Research, vol.15, p.3143, 2009）の存在が報告されている。さらに、EML4-ALKは肺癌にも大腸癌や乳癌の患者でも発現している例があることが知られている（Molecular Cancer Research, vol.7, p.1466, 2009）。
また、特許文献１には、EML4-ALK融合タンパクの阻害活性を有する化合物として、以下の化合物Ａ〜Ｄ（いずれの化合物もALK阻害剤として知られる化合物である。）が例示され、そのEML4-ALK融合タンパクの阻害活性値が具体的に開示されている。しかし、本発明に係るアリールアミノヘテロ環カルボキサミド化合物の具体的開示はない。
Figure 2014005206
 それぞれの化学名は、化合物Aが4-[(3’-ブロモ-4’-ヒドロキシフェニル)アミノ]-6,7-ジメトキシキナゾリン（WHI-P154とも呼ばれる。）であり、化合物BがN-[2-(3-クロロフェニル)エチル]-2-[({[4-(トリフルオロメトキシ)フェノキシ]アセチル}アミノ)メチル]-1,3-チアゾール-4-カルボキサミドであり、化合物Cが5-クロロ-N4-[2-(イソプロピルスルホニル)フェニル]-N2-{2-メトキシ-4-[4-(4-メチルピペラジン-1-イル)ピペリジン-1-イル]フェニル}ピリミジン-2,4-ジアミン（TAE684とも呼ばれる。）であり、化合物Dが2-[(5-ブロモ-2-{[2-メトキシ-4-(4-メチルピペラジン-1-イル)フェニル]アミノ}ピリミジン-4-イル)アミノ]-N-メチルベンゼンスルホンアミドである。
また、ALK融合体発現リンパ腫細胞において、ALK阻害活性を有する化合物であるWHI-P154（前述の化合物Ａ）が細胞増殖抑制、アポトーシスを誘導することが報告されている（非特許文献３）。しかし、本発明に係るアリールアミノヘテロ環カルボキサミド化合物の具体的開示はない。
また、NPM遺伝子とALK遺伝子との融合遺伝子による融合タンパクの阻害剤として、TAE684（前述の化合物Ｃ）が知られている。
TAE684は、特に２つの-NH基に挟まれた中央の環がクロロ置換ピリミジン環である点で、本発明化合物とその化学構造が異なっている。
また、TAE684がNPM-ALK融合タンパクの阻害活性により、未分化大細胞性リンパ腫（ALCL）の進展を阻害したことが報告されている（非特許文献４）。その一方、TAE684を含めた化合物に接着斑キナーゼ（FAK）の阻害活性があり、その阻害活性のため、非小細胞肺癌、小細胞肺癌の予防及び／又は処置に有用であることが記載されてはいるが、具体的な肺癌の治療効果については全く記載されていない（特許文献２）。また、本発明に係るアリールアミノヘテロ環カルボキサミド化合物の具体的開示もない。
なお、ELM4-ALKが非小細胞肺癌細胞（NCI-H2228）で発現していること、TFG-ALKが非小細胞肺癌患者で発現していること、TAE684が非小細胞肺癌細胞（NCI-H2228）の増殖を阻害することが報告されている（特許文献１、非特許文献５、６）。
また、下記の化合物が、Syk阻害活性を有し、アレルギー、炎症、免疫疾患、血栓や癌等、Sykの関与する疾患の予防若しくは治療剤の有効成分として有用であることが報告されている（特許文献３）。
Figure 2014005206
 （式中の記号は、当該公報を参照のこと。）
しかし、本発明に係るアリールアミノヘテロ環カルボキサミド化合物の具体的開示はない。また、EML4-ALK融合タンパクのキナーゼ活性の阻害活性について開示や示唆はなく、癌に対する治療効果についても具体的開示はない。
また、下記の化合物が、プロテインキナーゼＣ阻害活性を有し、糖尿病性合併症、虚血、炎症や癌等、プロテインキナーゼＣの関与する疾患の予防若しくは治療剤の有効成分として有用であることが報告されている（特許文献４）。
Figure 2014005206
 （式中の記号は、当該公報を参照のこと。）
しかし、本発明に係るアリールアミノヘテロ環カルボキサミド化合物の具体的開示はない。また、EML4-ALK融合タンパクのキナーゼ活性の阻害活性について開示や示唆はなく、癌に対する治療効果についても具体的開示はない。
また、下記の化合物が、EML4-ALK融合タンパク及び変異EGFRタンパクのキナーゼ活性の阻害活性を有し、肺癌等を含む癌治療剤の有効成分として有用であることが報告されている（特許文献５）。
Figure 2014005206
 （式中の-X-は、置換されていてもよい1,3,5-トリアジン-2,4-ジイル又はキナゾリン-2,4-ジイル。その他の式中の記号は、当該公報を参照のこと。）
しかし、本発明に係るアリールアミノヘテロ環カルボキサミド化合物の具体的開示はない。
また、下記の化合物が、ALKを含む各種キナーゼの阻害活性を有し、細胞増殖性疾患の治療に有用であることが報告されている（特許文献６）。
Figure 2014005206
 （式中の記号は、当該公報を参照のこと。）
しかし、本発明に係るアリールアミノヘテロ環カルボキサミド化合物の具体的開示はない。
また、下記の化合物が、ALK及び／又はc-Metの阻害活性を有し、増殖性疾患の治療に有用であることが報告されている（特許文献７）。
Figure 2014005206
 （式中の記号は、当該公報を参照のこと。）
しかし、本発明に係るアリールアミノヘテロ環カルボキサミド化合物の具体的開示はない。
また、下記の化合物が、ALKを含む各種キナーゼの阻害活性を有し、過剰増殖性疾患や血管新生疾患の治療に有用であることが報告されている（特許文献８）。
Figure 2014005206
 （式中の記号は、当該公報を参照のこと。）
しかし、本発明に係るアリールアミノヘテロ環カルボキサミド化合物の具体的開示はない。
また、下記の化合物が、IGF-1RやALKを含む各種キナーゼの阻害活性を有し、癌治療に有用であることが報告されている（特許文献９）。
Figure 2014005206
 （式中の記号は、当該公報を参照のこと。）
しかし、本発明に係るアリールアミノヘテロ環カルボキサミド化合物の具体的開示はない。
また、下記の化合物が、Syk阻害活性を有し、アレルギー、自己免疫疾患、癌や骨髄性細胞増殖異常の治療に有用であることが報告されている（特許文献１０）。
Figure 2014005206
 （式中の記号は、当該公報を参照のこと。）
しかし、本発明に係るアリールアミノヘテロ環カルボキサミド化合物の具体的開示はない。また、EML4-ALK融合タンパクのキナーゼ活性の阻害活性について開示や示唆はなく、癌に対する治療効果についても具体的開示はない。
また、下記の化合物が、Aurora-Bキナーゼ阻害活性を有し、癌、感染症、炎症や自己免疫疾患の治療に有用であることが報告されている（特許文献１１）。
Figure 2014005206
 （式中の記号は、当該公報を参照のこと。）
しかし、本発明に係るアリールアミノヘテロ環カルボキサミド化合物の具体的開示はない。また、EML4-ALK融合タンパクのキナーゼ活性の阻害活性について開示や示唆はない。
また、下記の化合物が、STAT6活性化阻害活性やTh2細胞分化抑制活性を有し、呼吸器疾患、喘息や慢性閉塞性肺疾患の治療に有用であることが報告されている（特許文献１２）。
Figure 2014005206
 （式中の記号は、当該公報を参照のこと。）
しかし、本発明に係るアリールアミノヘテロ環カルボキサミド化合物の具体的開示はない。また、EML4-ALK融合タンパクのキナーゼ活性の阻害活性について開示や示唆はなく、癌に対する治療効果についても具体的開示はない。
また、下記の化合物が、PKC阻害活性を有し、アレルギー、炎症、糖尿病や癌等の治療に有用であることが報告されている（特許文献１３）。
Figure 2014005206
 （式中の記号は、当該公報を参照のこと。）
しかし、本発明に係るアリールアミノヘテロ環カルボキサミド化合物の具体的開示はない。また、EML4-ALK融合タンパクのキナーゼ活性の阻害活性について開示や示唆はなく、癌に対する治療効果についても具体的開示はない。
また、下記の化合物が、PLK-1及びPLK-3阻害活性を有し、癌、細胞増殖性疾患、ウイルス感染症、自己免疫疾患、神経変性疾患の治療に有用であることが報告されている（特許文献１４）。
Figure 2014005206
 （式中の記号は、当該公報を参照のこと。）
しかし、本発明に係るアリールアミノヘテロ環カルボキサミド化合物の具体的開示はない。また、EML4-ALK融合タンパクのキナーゼ活性の阻害活性について開示や示唆はない。
また、下記の化合物が、HSP-90阻害活性を有し、細胞増殖性疾患、癌、炎症、関節炎や血管新生疾患の治療に有用であることが報告されている（特許文献１５）。
Figure 2014005206
 （式中の記号は、当該公報を参照のこと。）
しかし、本発明に係るアリールアミノヘテロ環カルボキサミド化合物の具体的開示はない。また、EML4-ALK融合タンパクのキナーゼ活性の阻害活性について開示や示唆はない。
また、下記の化合物が、ALK、c-MetやMps1キナーゼ阻害活性を有し、過剰増殖性疾患、癌や血管新生疾患の治療に有用であることが報告されている（特許文献１６）。
Figure 2014005206
 （式中の記号は、当該公報を参照のこと。）
しかし、本発明に係るアリールアミノヘテロ環カルボキサミド化合物の具体的開示はない。
また、下記の化合物が、SykやJak阻害活性を有し、心疾患、炎症、自己免疫疾患や細胞増殖性疾患の治療に有用であることが報告されている（特許文献１７）。
Figure 2014005206
 （式中の記号は、当該公報を参照のこと。）
しかし、本発明に係るアリールアミノヘテロ環カルボキサミド化合物の具体的開示はない。また、EML4-ALK融合タンパクのキナーゼ活性の阻害活性について開示や示唆はない。
また、下記の化合物が、IKK阻害活性を有し、炎症、免疫異常、癌、神経変性疾患、加齢に伴なう疾患、心疾患や代謝異常の治療に有用であることが報告されている（特許文献１８）。
Figure 2014005206
 （式中の記号は、当該公報を参照のこと。）
しかし、本発明に係るアリールアミノヘテロ環カルボキサミド化合物の具体的開示はない。また、EML4-ALK融合タンパクのキナーゼ活性の阻害活性について開示や示唆はない。
また、下記の化合物が、ALKを含む各種キナーゼの阻害活性を有し、細胞増殖性疾患や癌の治療に有用であることが報告されている（特許文献１９）。
Figure 2014005206
 （式中の記号は、当該公報を参照のこと。）
しかし、本発明に係るアリールアミノヘテロ環カルボキサミド化合物の具体的開示はない。
また、下記の化合物が、ALK、ROS、IGF-1RやInsRのキナーゼ阻害活性を有し、細胞増殖性疾患の治療に有用であることが報告されている（特許文献２０）。
Figure 2014005206
 （式中の記号は、当該公報を参照のこと。）
しかし、本発明に係るアリールアミノヘテロ環カルボキサミド化合物の具体的開示はない。
また、下記の化合物が、ALK、ROS、IGF-1RやInsRのキナーゼ阻害活性を有し、細胞増殖性疾患の治療に有用であることが報告されている（特許文献２１）。
Figure 2014005206
 （式中の記号は、当該公報を参照のこと。）
しかし、本発明に係るアリールアミノヘテロ環カルボキサミド化合物の具体的開示はない。
また、下記の化合物が、SykやJak阻害活性を有し、心疾患、炎症、自己免疫疾患や細胞増殖性疾患の治療に有用であることが報告されている（特許文献２２）。
Figure 2014005206
 （式中の記号は、当該公報を参照のこと。）
しかし、本発明に係るアリールアミノヘテロ環カルボキサミド化合物の具体的開示はない。また、EML4-ALK融合タンパクのキナーゼ活性の阻害活性について開示や示唆はない。
欧州特許出願公開EP 1914240号公報 国際公開第WO 2004/080980号パンフレット 国際公開第WO 00/75113号パンフレット 国際公開第WO 00/76980号パンフレット 国際公開第WO 2009/008371号パンフレット 国際公開第WO 2008/073687号パンフレット 国際公開第WO 2008/051547号パンフレット 国際公開第WO 2009/032703号パンフレット 国際公開第WO 2009/020990号パンフレット 特開2008-13499号公報 国際公開第WO 2008/077885号パンフレット 国際公開第WO 2004/002964号パンフレット 国際公開第WO 2009/012421号パンフレット 国際公開第WO 2009/040399号パンフレット 国際公開第WO 2008/024974号パンフレット 国際公開第WO 2009/032694号パンフレット 国際公開第WO 2009/136995号パンフレット 国際公開第WO 2009/089042号パンフレット 国際公開第WO 2009/143389号パンフレット 国際公開第WO 2009/126514号パンフレット 国際公開第WO 2009/126515号パンフレット 国際公開第WO 2009/145856号パンフレット
International Journal of Cancer、100巻、49頁、2002年 Nature、448巻、2号、561頁、2007年 Laboratory Investigation、85巻、1544頁、2005年 Proceedings of the National Academy of Science、104巻、1号、270頁、2007年 Cell、131巻、 1190頁、2007年 Proceedings of the National Academy of Science、104巻、50号、19936頁、2007年
医薬組成物、特に癌治療用医薬組成物の有効成分として有用かつ医薬組成物の有効成分としてより安全に使用しうる化合物を提供する。
本発明者らは、癌治療用医薬組成物の有効成分として有用な化合物について鋭意検討した結果、本発明のアリールアミノヘテロ環カルボキサミド化合物が、優れたEML4-ALK融合タンパクのキナーゼ活性の阻害活性を有し、癌治療用医薬組成物の有効成分として有用であることを知見して本発明を完成した。
即ち、本発明は、式（Ｉ）の化合物又はその塩、並びに、式（Ｉ）の化合物又はその塩、及び賦形剤を含有する医薬組成物に関する。
Figure 2014005206
 （式中、
Qは、C(R4)又はNであり、
Lは、N(R5)又はSであり、
-X-は、-N=C(R6)-又は-C(=O)-N(R7)-であり、
R1は、-H又はハロゲンであり、
R2は、G1群から選択される1以上の基で置換されていてもよいシクロアルキル、G1群から選択される1以上の基で置換されていてもよい非芳香族へテロ環、G2群から選択される1以上の基で置換されていてもよい低級アルキル、又はR00で置換されていてもよい芳香族へテロ環であり、
QがC(R4)である場合、R3及びR4のいずれか一方は、(i)-W-Y-Zで示される基、(ii)-W-Vで示される基、(iii)-NR00 2、(iv)R00又は-OHで置換されていてもよい二環式飽和へテロ環、又は(v)オキソで置換されていてもよいシクロアルキルであり、R3及びR4の残りの一方は、-H、-OH、ハロゲン、R00、シクロアルキル、芳香族へテロ環、-O-R00、-C(=O)-O-R00、-O-RZ、-O-シクロアルキル、-O-R00で置換されていてもよいフェニル、-S02-R00、-SO2-(非芳香族へテロ環)、-SO2-NH-(シクロアルキル)、-C(=O)-O-R00で置換されていてもよい低級アルケニル、-O-RD、非芳香族へテロ環、-NH2、又はシアノであり、
QがNである場合、R3は、(i)-W-Y-Zで示される基、(ii)-W-Vで示される基、(iii)-NR00 2、(iv)R00又は-OHで置換されていてもよい二環式飽和へテロ環、又は(v)オキソで置換されていてもよいシクロアルキルであり、
R5は、-H又は低級アルキルであり、
LがN(R5)である場合、Lは、R2と一体となって、G1群から選択される1以上の基で置換されていてもよい環状アミノを形成してもよく、
R6は、-H、ハロゲン、R00、RD、シクロアルキル、RZ、又は-(低級アルキレン)-O-RZであり、
R7は、-H、R00、又はシクロアルキルであり、
Vは、式（ＩＩ）又は式（ＩＩＩ）の基であり、
Figure 2014005206
 （式中、
-A-は、-(CH2)n-であり、
nは、それぞれ同一又は異なって、1又は2であり、
R8は、R00又はベンジルであり、
Tは、CH又はNである。）
-W-は、結合、又は、それぞれOHで置換されていてもよい、シクロヘキサン-1,4-ジイル、ピロリジン-1,2-ジイル、ピロリジン-1,3-ジイル、ピペリジン-1,3-ジイル、ピペリジン-1,4-ジイル、若しくはピペラジン-1,4-ジイルであり、
-Y-は、結合、-O-(低級アルキレン)-、低級アルキレン、-O-、又は-NH-であり、
Zは、G3群から選択される1以上の基で置換されていてもよい非芳香族へテロ環であり、
G1群は、ベンジル、-OH、-NR00 2、-C(=O)-O-R00、-C(=O)-NR00 2、-C(=O)-NH-R00、-O-R00、R00、-C(=O)-RZ、シクロアルキル、-NH2、-NH-C(=O)-R00、-NH-SO2-R00、-NH-RZ、-NH-R00、-SO2-フェニル、-C(=O)-R00、-C(=O)-フェニル、-SO2-R00、-C(=O)-(シアノで置換されていてもよいシクロアルキル)、オキソ、RZ、-S-R00、非芳香族へテロ環、ハロゲン、及び-O-ベンジルからなる群であり、
G2群は、1以上の-O-R00で置換されていてもよいフェニル、-OH、G1群から選択される1以上の基で置換されていてもよいシクロアルキル、G1群から選択される1以上の基で置換されていてもよい非芳香族へテロ環、-O-R00、ハロゲン、-NR00 2、及び-C(=O)-NH-R00からなる群であり、
G3群は、R00、-C(=O)-O-R00、シクロアルキル、RZ、-OH、オキソ、-NH-RZ、-NH-R00、-NR00 2、R00で置換されていてもよりフェニル、-C(=O)-R00、-SO2-R00、ハロゲン、-N(RZ)-C(=O)-R00、-N(R00)-C(=O)-R00、-NRZ 2、-N(R00)-RZ、-N(RZ)-C(=O)-O-R00、-N(R00)-C(=O)-O-R00、-NH2、及び-NH-C(=O)-O-R00からなる群であり、
R00は、1以上のハロゲンで置換されていてもよい低級アルキルであり、
RZは、シアノ、-NH-SO2-R00、-C(=O)-O-R00、-SO2-R00、-O-C(=O)-R00、-NH-C(=O)-O-R00、シクロアルキル、-OH、-O-R00、-NH2、-NH-R00、及び-NR00 2からなる群より選択される1以上の基で置換されており、更に1以上のハロゲンで置換されていてもよい低級アルキルであり、
RDは、1以上のハロゲンで置換されていてもよい低級アルケニルである。）
なお、-NR00 2及び-C(=O)-NR00 2において、各基に含まれる二つのR00は同一であっても異なっていてもよい。また、-NRZ 2において、二つのRZは、同一であっても異なっていてもよい。
また、特に記載がない限り、本明細書中のある化学式中の記号が他の化学式においても用いられる場合、同一の記号は同一の意味を示す。
また、本発明は、式（Ｉ）の化合物又はその塩を含有するEML4-ALK融合タンパクのキナーゼ活性の阻害剤に関する。
また、本発明は、式（Ｉ）の化合物又はその塩を含有する癌治療用医薬組成物に関する。なお、この医薬組成物は、式（Ｉ）の化合物又はその塩を含有する癌治療剤を包含する。
また、本発明は、癌治療用医薬組成物の製造のための式（Ｉ）の化合物又はその塩の使用、癌の治療のための式（Ｉ）の化合物またはその塩の使用、並びに、式（Ｉ）の化合物又はその塩の有効量を患者に投与することからなる癌治療方法に関する。
式（Ｉ）の化合物又はその塩は、EML4-ALK融合タンパクのキナーゼ活性の阻害活性、並びに、EML4-ALK融合タンパク依存的な細胞の増殖抑制活性を有し、癌、ある態様としては、肺癌、別の態様としては、非小細胞肺癌若しくは小細胞肺癌、また別の態様としては、ALK融合ポリヌクレオチド陽性の癌、さらに別の態様としては、ALK融合ポリヌクレオチド陽性の肺癌、さらに別の態様としては、ALK融合ポリヌクレオチド陽性の非小細胞肺癌、さらに別の態様としては、ALK融合タンパク陽性の癌、さらに別の態様としては、ALK融合タンパク陽性の肺癌、さらに別の態様としては、ALK融合タンパク陽性の非小細胞肺癌、さらに別の態様としては、EML4-ALK融合ポリヌクレオチド陽性の癌、さらに別の態様としては、EML4-ALK融合ポリヌクレオチド陽性の肺癌、さらに別の態様としては、EML4-ALK融合ポリヌクレオチド陽性の非小細胞肺癌、さらに別の態様としては、EML4-ALK融合タンパク陽性の癌、さらに別の態様としては、EML4-ALK融合タンパク陽性の肺癌、さらに別の態様としては、EML4-ALK融合タンパク陽性の非小細胞肺癌等の予防及び／又は治療用医薬組成物の有効成分として使用できる。
以下、本発明を詳細に説明する。
本明細書中、「ハロゲン」は、F、Cl、Br、Iを意味する。
「低級アルキル」とは、直鎖又は分枝状の炭素数１乃至８（以下、「C1-8」と略す。）のアルキルであり、例えばメチル、エチル、n-プロピル、イソプロピル、n-ブチル、イソブチル、sec-ブチル、tert-ブチル、n-ペンチル、sec-イソアミル、ネオペンチル、n-ヘキシル、2-メチルペンタン-3-イル、n-ヘプチル、2,4-ジメチルペンタン-3-イル、n-オクチル等であり、別の態様としてはC1-7アルキルであり、さらに別の態様としてはC1-4アルキルであり、さらに別の態様としてはメチル、エチル、イソプロピル、tert-ブチルである。
「低級アルケニル」とは、C2-6の直鎖又は分枝状の少なくとも1つの二重結合を有する炭化水素鎖の1価基であり、例えば、ビニル、プロペニル、イソプロペニル、ブテニル、ペンテニル、1-メチルビニル、1-メチル-2-プロペニル、1,3-ブタジエニル、1,3-ペンタジエニル等である。別の態様としてはC1-4アルケニルであり、さらに別の態様としてはビニル、イソプロペニルである。
「低級アルキレン」とは、直鎖又は分枝状のC1-6のアルキレン、例えばメチレン、エチレン、トリメチレン、テトラメチレン、ペンタメチレン、ヘキサメチレン、プロピレン、メチルメチレン、エチルエチレン、1,2-ジメチルエチレン、1,1,2,2-テトラメチルエチレン等である。別の態様としては、C1-4アルキレンであり、さらに別の態様としては、メチレン、エチレンである。
「シクロアルキル」とは、架橋していてもよいC3-10の飽和炭化水素環基であり、例えばシクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、ビシクロ[2.2.1]ヘプチル、ビシクロ[3.1.1]ヘプチル、アダマンチル等である。また、部分的に不飽和結合を有した、シクロペンテニル、シクロヘキセニル、シクロオクタジエニル、ビシクロ[3.1.1]ヘプテニル等も含む。別の態様としては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、ビシクロ[2.2.1]ヘプチル、シクロペンテニル、シクロヘキセニルである。
「環状アミノ」とは、少なくとも1つの窒素原子を有し、さらに窒素、酸素及び硫黄からなる群より選択される同一又は異なるヘテロ原子を1つ以上有していてもよい環員数3乃至8の単環式非芳香族環状アミンの1価基であり、少なくとも1つ有する窒素原子が結合手を有する基を示す。具体的には例えば、アジリジニル、アゼチジニル、ピロリジニル、ピペリジニル、アゼパニル、アゾカニル、ピペラジニル、ホモピペラジニル、モルホリニル、オキサゼパニル、チオモルホリニル、チアゼパニル等である。別の態様としては、少なくとも1つの窒素原子を有し、さらに窒素、酸素及び硫黄からなる群より選択されるヘテロ原子を1つ有していてもよい環員数5乃至6の単環式非芳香族環状アミンの１価基であり、さらに別の態様としては、ピロリジニル、ピペリジニル、ピペラジニル、モルホリニルである。なお、これらの環は、2,5-ジアザビシクロ[2.2.1]ヘプチル、9-アザビシクロ[3.3.1]ノニル等のごとく、低級アルキレンで架橋されていてもよい。また、ジヒドロピロリル、ジヒドロピリジル、テトラヒドロピリジル、テトラヒドロピラジル等のごとく、環の一部に不飽和結合を有していてもよい。
「非芳香族ヘテロ環」とは、窒素、酸素及び硫黄からなる群より選択される同一又は異なるヘテロ原子を１乃至４個有する環員数3乃至10の単環式非芳香族ヘテロ環の1価基であり、例えば、アジリジニル、アゼチジニル、ピロリジニル、ピペリジニル、アゼパニル、ジアゼパニル、アゾカニル、ピペラジニル、ホモピペラジニル、モルホリニル、オキサゼパニル、チオモルホリニル、チアゼパニル、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロフリル、ジオキサニル、ジオキソラニル、テトラヒドロチエニル、テトラヒドロチオピラニル等である。別の態様としては、5乃至6員環の単環式非芳香族ヘテロ環の1価基である。なお、これらの環は、7-オキサビシクロ[2.2.1]ヘプチル、2,5-ジアザビシクロ[2.2.1]ヘプチル、3-アザビシクロ[3.2.1]オクチル、8-アザビシクロ[3.2.1]オクチル、9-アザビシクロ[3.3.1]ノニル、3,9-ジアザビシクロ[3.3.1]ノニル等のごとく、低級アルキレンで架橋されていてもよい。また、ジヒドロピラニル、ジヒドロピロリル、ジヒドロピリジル、テトラヒドロピリジル、テトラヒドロピラジル等のごとく、環の一部に不飽和結合を有していてもよい。別の態様としては、窒素、酸素及び硫黄からなる群より選択される同一又は異なるヘテロ原子を１乃至２個有する環員数5乃至7の単環式非芳香族ヘテロ環の1価基であり、さらに別の態様としては、少なくとも1つの窒素原子を有し、さらに窒素、酸素及び硫黄からなる群より選択されるヘテロ原子を1つ有していてもよい環員数5乃至7の単環式非芳香族ヘテロ環の1価基であり、さらに別の態様としては、ピロリジニル、ピペリジニル、ピペラジニル、モルホリニル、チオモルホリニル、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロフリル、テトラヒドロチエニル、7-オキサビシクロ[2.2.1]ヘプチル、3-アザビシクロ[3.2.1]オクチル、8-アザビシクロ[3.2.1]オクチル、3,9-ジアザビシクロ[3.3.1]ノニル、ジヒドロピラニルであり、さらに別の態様としては、ピペリジニル、ピペラジニル、テトラヒドロピラニルである。
「芳香族ヘテロ環」とは、窒素、酸素及び硫黄からなる群より選択されるヘテロ原子を１乃至４個有する環員数5乃至10の単環式芳香族ヘテロ環の1価基であり、例えばピリジル、ピロリル、ピラジニル、ピリミジニル、ピリダジニル、イミダゾリル、ピラゾリル、チアゾリル、オキサゾリル、チエニル、フリル、1,2,4-オキサジアゾリル等である。別の態様としては、ピリジル、イミダゾリル、ピラゾリルであり、さらに別の態様としては、ピラゾリルである。
「二環式飽和へテロ環」とは、窒素、酸素及び硫黄からなる群より選択される同一又は異なるヘテロ原子を１乃至２個有する、環員数5乃至7の２つの単環式飽和ヘテロ環が縮合した環員数8乃至12の二環式縮合環の1価基である（なお、縮合する２つの単環式飽和へテロ環は、同一又は異なっていてもよい）。別の態様としては、窒素原子を１乃至２個有する環員数5乃至7の含窒素単環式飽和ヘテロ環が縮合した環員数8乃至12の二環式縮合環の1価基であり（なお、縮合する２つの含窒素単環式飽和ヘテロ環は、同一又は異なっていてもよい）、例えば、オクタヒドロピロロ[3,4-c]ピロリル、オクタヒドロピロロ[1,2-a]ピラジニル等である。
「ALK融合ポリヌクレオチド」とは、ALK遺伝子とその他の遺伝子が融合し、癌化能を有する融合型チロシンキナーゼを発現する融合型ポリヌクレオチドであり、例えば、EML4-ALK融合ポリヌクレオチド、TFG-ALK融合ポリヌクレオチド、KIF5B -ALK融合ポリヌクレオチド、NPM-ALK融合ポリヌクレオチド、CLTCL-ALK融合ポリヌクレオチド、TPM3-ALK融合ポリヌクレオチド、TPM4-ALK融合ポリヌクレオチド、ATIC-ALK融合ポリヌクレオチド、CARS-ALK融合ポリヌクレオチド、SEC31L1-ALK融合ポリヌクレオチド、及びRanBP2-ALK融合ポリヌクレオチド等であり、別の態様としては、EML4-ALK融合ポリヌクレオチド、TFG-ALK融合ポリヌクレオチド、及びKIF5B-ALK融合ポリヌクレオチドである。
「ALK融合タンパク」とは、ALK融合ポリヌクレオチドの発現により作られた融合型チロシンキナーゼである。
「EML4-ALK融合ポリヌクレオチド」とは、ALK遺伝子とEML4遺伝子が融合（EML4-ALK融合遺伝子）し、癌化能を有するALK融合タンパクを発現する融合型ポリヌクレオチドであり、そのバリアント、例えば、EML4-ALK融合ポリヌクレオチドv1（特許文献１の配列番号１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド）、EML4-ALK融合ポリヌクレオチドv2（特許文献１の配列番号６で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド）、及びEML4-ALK融合ポリヌクレオチドv3（特許文献１の配列番号１２９で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド）の他、各種バリアント（Annals of surgical oncology, vol.17, p.889, 2010、Molecular Cancer Research, vol.7, p.1466, 2009、Clinical Cancer Research, vo.15, p.3143, 2009、Cancer, vol.115, p.1723, 2009、Clinical Cancer Research, vol.14, p.6618, 2008、Clinical Cancer Research, vol.14, p.4275, 2008等）を含む。
「EML4-ALK融合タンパク」とは、EML4-ALK融合ポリヌクレオチドの発現により作られた融合型チロシンキナーゼである。
式（Ｉ）における-X-が-N=C(R6)-である場合の式（Ｉ）の化合物又はその塩とは、式（ＩＶ）の化合物又はその塩であることを意味する。
Figure 2014005206
式（Ｉ）における-X-が-C(=O)-N(R7)-である場合の式（Ｉ）の化合物又はその塩とは、式（Ｖ）の化合物又はその塩であることを意味する。
Figure 2014005206
式（Ｉ）におけるQがC(R4)である場合のR3又はR4において、或いは、式（Ｉ）におけるQがNである場合のR3において、-W-Y-Zで示される基における-Y-が-O-(低級アルキレン)-である場合の-W-Y-Zで示される基とは、-W-O-(低級アルキレン)-Zで示される基であることを意味する。
「置換されていてもよい」とは、無置換、若しくは置換基を１〜５個有していることを意味する。なお、複数の基で置換されている場合、それらの基はそれぞれ同一であっても異なっていてもよい。
「置換されており」とは、置換基を１〜５個有していることを意味する。なお、複数の基で置換されている場合、それらの基はそれぞれ同一であっても異なっていてもよい。
「１つ以上のハロゲンで置換されていてもよい低級アルキル」とは、例えば1乃至7つの同一又は異なったハロゲンで置換されていてもよい低級アルキルであり、別の態様としては1乃至5つのハロゲンで置換されていてもよい低級アルキルである。さらに別の態様としては1乃至3つのハロゲンで置換されていてもよい低級アルキルである。
「１つ以上のハロゲンで置換されていてもよい低級アルケニル」とは、例えば1乃至3つのハロゲンで置換されていてもよい低級アルケニルである。
式（Ｉ）の化合物又はその塩のある態様を以下に示す。
（１）式（Ｉ）において、（１−１）-X-が-N=C(R6)-であり、R6がハロゲン又は低級アルキルである化合物、別の態様としては、（１−２）-X-が-N=C(R6)-であり、R6がハロゲンである化合物、さらに別の態様としては、（１−３）-X-が-N=C(R6)-であり、R6が低級アルキルである化合物、さらに別の態様としては、（１−４）-X-が-N=C(R6)-であり、R6がクロロ、エチル又はイソプロピルである化合物、さらに別の態様としては、（１−５）-X-が-C(=O)-N(R7)-であり、R7がR00又はシクロアルキルである化合物、さらに別の態様としては、（１−６）-X-が-C(=O)-N(R7)-であり、R7が低級アルキルである化合物、さらに別の態様としては、（１−７）-X-が-C(=O)-N(R7)-であり、R7がエチル又はイソプロピルである化合物、さらに別の態様としては、（１−８）-X-が-C(=O)-N(R7)-であり、R7がエチルである化合物、さらに別の態様としては、（１−９）-X-が-C(=O)-N(R7)-であり、R7がイソプロピルである化合物、又はその塩。
（２）式（Ｉ）において、（２−１）QがC(R4)である化合物、別の態様としては、（２−２）QがC(R4)であり、R4が-H、-OH、ハロゲン、R00、シクロアルキル、芳香族へテロ環、-O-R00、-C(=O)-O-R00、-O-RZ、-O-シクロアルキル、-O-R00で置換されていてもよいフェニル、-S02-R00、-SO2-(非芳香族へテロ環)、-SO2-NH-(シクロアルキル)、-C(=O)-O-R00で置換されていてもよい低級アルケニル、-O-RD、非芳香族へテロ環、-NH2、又はシアノである化合物、さらに別の態様としては、（２−３）QがC(R4)であり、R4がハロゲン、R00、又は-O-R00である化合物、さらに別の態様としては、（２−４）QがC(R4)であり、R4が-F、メチル、又はメトキシである化合物、又はその塩。
（３）式（Ｉ）において、（３−１）LがN(R5)である化合物、別の態様としては、（３−２）LがN(R5)であり、R5が-Hである化合物、さらに別の態様としては、（３−３）LがSである化合物、又はその塩。
（４）式（Ｉ）において、R1が-Hである化合物、又はその塩。
（５）式（Ｉ）において、（５−１）R2がテトラヒドロピラニルである化合物、別の態様としては、（５−２）R2が-OH又はメトキシで置換されていてもよいシクロヘキシルである化合物、さらに別の態様としては、（５−３）R2が4-ヒドロキシシクロヘキシル、4-メトキシシクロヘキシル、又はテトラヒドロピラン-4-イルである化合物、さらに別の態様としては、（５−４）R2がG2群から選択される1以上の基で置換されていてもよい低級アルキルである化合物、さらに別の態様としては、（５−５）R2が-OH、G1群から選択される1以上の基で置換されていてもよいシクロアルキル、G1群から選択される1以上の基で置換されていてもよい非芳香族へテロ環、-O-R00、ハロゲン、-NR00 2、及び-C(=O)-NH-R00からなる群より選択される1以上の基で置換されていてもよい低級アルキルである化合物、さらに別の態様としては、（５−６）R2が-OHで置換されていてもよい低級アルキルである化合物、さらに別の態様としては、（５−７）R2が-OHで置換されていてもよいイソプロピル、又は-OHで置換されていてもよいtert-ブチルである化合物、さらに別の態様としては、（５−８）R2がイソプロピル、tert-ブチル、1-ヒドロキシプロパン-2-イル、又は1-ヒドロキシ-2-メチルプロパン-2-イルである化合物、又はその塩。
（６）式（Ｉ）において、（６−１）R3が-W-Y-Zで示される基である化合物、別の態様としては、（６−２）R3が-W-Y-Zで示される基であり、-W-が結合、ピペリジン-1,4-ジイル（ただし、R3が結合する炭素原子は、当該ピペリジン1位の窒素原子と結合し、-Zは当該ピペリジン4位の炭素原子と結合する）、又はピペラジン-1,4-ジイルであり、-Y-が結合であり、-Zが低級アルキルで置換されていてもよい非芳香族へテロ環である化合物、さらに別の態様としては、（６−３）R3が4-(4-メチルピペラジン-1-イル)ピペリジン-1-イル、1-メチルピペリジン-4-イル、又は4-メチルピペラジン-1-イルである化合物、又はその塩。
（７）上記（１）乃至（６）の矛盾しないいずれか二以上の組み合わせである化合物、又はその塩。
（８）上記（１）乃至（７）の態様の例としては、（８−１）上記（１−５）である化合物、別の態様としては、（８−２）上記（１−５）かつ（２−１）かつ（３−２）かつ（４）かつ（６−１）である化合物、さらに別の態様としては、（８−３）上記（１−６）かつ（２−１）かつ（３−２）かつ（４）かつ（６−１）である化合物、さらに別の態様としては、（８−４）上記（５−５）である化合物、さらに別の態様としては、（８−５）上記（５−５）かつ（２−１）かつ（３−２）かつ（４）かつ（６−１）である化合物、さらに別の態様としては、（８−６）上記（５−５）かつ（２−１）かつ（３−２）かつ（４）かつ（６−１）かつ（１−１）である化合物、さらに別の態様としては、（８−７）上記（１−１）かつ（５−４）である化合物、さらに別の態様としては、（８−８）上記（３−３）である化合物、又はその塩。
本発明に包含される具体的化合物の例として、以下に示す化合物が挙げられる。
5-(tert-ブチルアミノ)-6-エチル-3-({3-メトキシ-4-[4-(4-メチルピペラジン-1-イル)ピペリジン-1-イル]フェニル}アミノ)ピラジン-2-カルボキサミド、
6-エチル-5-{[(2R)-1-ヒドロキシプロパン-2-イル]アミノ}-3-({3-メチル-4-[4-(4-メチルピペラジン-1-イル)ピペリジン-1-イル]フェニル}アミノ)ピラジン-2-カルボキサミド、
6-エチル-3-{[3-フルオロ-4-(1-メチルピペリジン-4-イル)フェニル]アミノ}-5-(テトラヒドロ-2H-ピラン-4-イルアミノ)ピラジン-2-カルボキサミド、
3-({3-フルオロ-4-[4-(4-メチルピペラジン-1-イル)ピペリジン-1-イル]フェニル}アミノ)-6-イソプロピル-5-(イソプロピルアミノ)ピラジン-2-カルボキサミド、
1-エチル-2-(イソプロピルアミノ)-4-({3-メチル-4-[4-(4-メチルピペラジン-1-イル)ピペリジン-1-イル]フェニル}アミノ)-6-オキソ-1,6-ジヒドロピリミジン-5-カルボキサミド、
6-クロロ-5-[(1-ヒドロキシ-2-メチルプロパン-2-イル)アミノ]-3-{[3-メチル-4-(1-メチルピペリジン-4-イル)フェニル]アミノ}ピラジン-2-カルボキサミド、
1-エチル-2-(イソプロピルアミノ)-4-{[3-メチル-4-(4-メチルピペラジン-1-イル)フェニル]アミノ}-6-オキソ-1,6-ジヒドロピリミジン-5-カルボキサミド、又は
1-エチル-4-{[3-フルオロ-4-(1-メチルピペリジン-4-イル)フェニル]アミノ}-2-(イソプロピルアミノ)-6-オキソ-1,6-ジヒドロピリミジン-5-カルボキサミド、若しくはこれらの塩。
式（Ｉ）の化合物には、置換基の種類によって、互変異性体や幾何異性体（シクロアルキル基等の飽和環基を有する化合物のシス-トランス異性体を含む）が存在しうる。本明細書中、式（Ｉ）の化合物が異性体の一形態のみで記載されることがあるが、本発明は、それ以外の異性体も包含し、異性体の分離されたもの、あるいはそれらの混合物も包含する。
また、式（Ｉ）の化合物には、不斉炭素原子や軸不斉を有する場合があり、これに基づく光学異性体が存在しうる。本発明は、式（Ｉ）の化合物の光学異性体の分離されたもの、あるいはそれらの混合物も包含する。
さらに、本発明は、式（Ｉ）で示される化合物の製薬学的に許容されるプロドラッグも包含する。製薬学的に許容されるプロドラッグとは、加溶媒分解により又は生理学的条件下で、アミノ基、水酸基、カルボキシル基等に変換されうる基を有する化合物である。プロドラッグを形成する基としては、例えば、Prog. Med., 5, 2157-2161(1985)や、「医薬品の開発」（廣川書店、1990年）第7巻 分子設計163-198に記載の基が挙げられる。
また、式（Ｉ）の化合物の塩とは、式（Ｉ）の化合物の製薬学的に許容される塩であり、置換基の種類によって、酸付加塩又は塩基との付加塩を形成する場合がある。具体的には、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸等の無機酸や、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、フマル酸、マレイン酸、乳酸、リンゴ酸、マンデル酸、酒石酸、ジベンゾイル酒石酸、ジトルオイル酒石酸、クエン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、p-トルエンスルホン酸、アスパラギン酸、グルタミン酸等の有機酸との酸付加塩、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム、アルミニウム等の無機塩基、メチルアミン、エチルアミン、エタノールアミン、リシン、オルニチン等の有機塩基との塩、アセチルロイシン等の各種アミノ酸及びアミノ酸誘導体との塩やアンモニウム塩等が挙げられる。
さらに、本発明は、式（Ｉ）の化合物及びその塩の各種の水和物や溶媒和物、及び結晶多形の物質も包含する。また、本発明は、種々の放射性又は非放射性同位体でラベルされた化合物も包含する。
式（Ｉ）の化合物及びその製薬学的に許容される塩は、その基本骨格あるいは置換基の種類に基づく特徴を利用し、種々の公知の合成法を適用して製造することができる。その際、官能基の種類によっては、当該官能基を原料乃至中間体の段階で適当な保護基（容易に当該官能基に転化可能な基）に置き換えておくことが製造技術上効果的な場合がある。このような保護基としては、例えば、グリーン(Greene)及びウッツ(Wuts)著、「Greene’s Protective Groups in Organic Synthesis(第4版、2007年)」に記載の保護基等を挙げることができ、これらの反応条件に応じて適宜選択して用いればよい。このような方法では、当該保護基を導入して反応を行なったあと、必要に応じて保護基を除去することにより、所望の化合物を得ることができる。
また、式（Ｉ）の化合物のプロドラッグは、上記保護基と同様、原料乃至中間体の段階で特定の基を導入、あるいは得られた式（Ｉ）の化合物を用いてさらに反応を行なうことで製造できる。反応は通常のエステル化、アミド化、脱水等、当業者に公知の方法を適用することにより行うことができる。
以下、式（Ｉ）の化合物の代表的な製造法を説明する。各製法は、当該説明に付した参考文献を参照して行うこともできる。なお、本発明の製造法は以下に示した例には限定されない。
（第１製法）
Figure 2014005206
 （式中、-LAは脱離基を示し、例えば、低級アルキルスルファニルが挙げられる。）
本製法は、化合物(1a)と化合物(2)とを反応させ、本発明化合物（Ｉ−ａ）を製造する方法である。
この反応では、化合物(1a)と化合物(2)とを等量若しくは一方を過剰量用い、これらの混合物を、反応に不活性な溶媒中、又は無溶媒下、冷却下から加熱還流下、好ましくは0℃〜180℃において、通常0.1時間〜5日間撹拌する。マイクロウェーブ反応装置を使用して反応を行うのが、反応を円滑に進行させる上で有利な場合がある。ここで用いられる溶媒の例としては、反応に不活性な溶媒であれば特に限定はされないが、ベンゼン、トルエン、キシレン等の芳香族炭化水素類、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン（THF）、ジオキサン、ジメトキシエタン等のエーテル類、1,2-ジクロロエタン、クロロホルム等のハロゲン化炭化水素類、メタノール、エタノール、2-プロパノール等のアルコール類、1-メチル-2-ピロリドン（NMP）、N,N-ジメチルホルムアミド（DMF）、N,N-ジメチルアセトアミド（DMA）、1,3-ジメチル-2-イミダゾイジノン（DMI）、ジメチルスルホキシド（DMSO）、アセトニトリル及びこれらの混合物が挙げられる。トリエチルアミン、N,N-ジイソプロピルエチルアミン若しくはN-メチルモルホリン等の有機塩基、又は炭酸カリウム、炭酸ナトリウム若しくは水酸化カリウムなどの無機塩基の存在下で反応を行うのが、反応を円滑に進行させる上で有利な場合がある。
また、上記のような塩基の存在下で反応を行なった場合、原料化合物の性質等によっては、例えば、原料化合物が分解する等、望む反応が進行しない、若しくは進行しにくい場合がある。その場合には、塩酸や臭化水素酸等の鉱酸、酢酸やプロピオン酸等の有機酸、メタンスルホン酸やp-トルエンスルホン酸等のスルホン酸類の存在下で反応を行なうのが、反応を円滑に進行させる上で有利な場合もある。さらに、-LAが低級アルキルスルファニルである場合、S原子をオキソン(登録商標)、m-クロロ過安息香酸(mCPBA)、過酢酸等の種々の酸化剤で酸化して、低級アルキルスルフィニルや低級アルキルスルホニルに変換した後に化合物(2)と反応させる方法も、反応を円滑に進行させる上で有利な場合がある。
[文献]
S. R. Sandler 及び W. Karo 著、「Organic Functional Group Preparations」、第2版、第1巻、Academic Press Inc.、1991年
日本化学会「実験化学講座（第5版）」14巻（2005年）（丸善）
（第２製法）
Figure 2014005206
 （式中、-LDは脱離基を示し、例えば、F、Cl、I等のハロゲン、メタンスルホニルオキシ、p-トルエンスルホニルオキシ、トリフルオロメタンスルホニルオキシ等のスルホニルオキシ基が挙げられる。また、式中、R7aはR00又はシクロアルキルを示す。）
本製法は、本発明化合物（Ｉ−ａ１）と化合物(8)とを反応させ、本発明化合物（Ｉ−ａ２）を製造する方法である。
この反応では、本発明化合物（Ｉ−ａ１）と化合物（8）とを等量若しくは一方を過剰量用い、これらの混合物を、塩基の存在下、反応に不活性な溶媒中、冷却下から加熱還流下、好ましくは0℃から80℃において、通常0.1時間〜5日間撹拌する。ここで用いられる溶媒の例としては、特に限定はされないが、ベンゼン、トルエン、キシレン等の芳香族炭化水素類、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、ジオキサン、ジメトキシエタン等のエーテル類、ジクロロメタン、1,2-ジクロロエタン、クロロホルム等のハロゲン化炭化水素類、N,N-ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、酢酸エチル、アセトニトリル及びこれらの混合物が挙げられる。塩基の例には、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、1,8-ジアザビシクロ[5.4.0]-7-ウンデセン、n-ブチルリチウム等の有機塩基、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、水素化ナトリウム、水素化リチウム、カリウムtert-ブトキシド等の無機塩基が含まれる。塩化テトラ-n-ブチルアンモニウム等の相間移動触媒の存在下で反応を行うことが有利な場合がある。
（第３製法）
Figure 2014005206
 （式中、-LBは脱離基を示し、例えば、F、Cl等のハロゲン、メタンスルホニルオキシ、p-トルエンスルホニルオキシ、トリフルオロメタンスルホニルオキシ等のスルホニルオキシ基、あるいは、低級アルキルスルファニルや低級アルキルスルホニルが挙げられる。）
本製法は、化合物(1b)と化合物(2)とを反応させ、本発明化合物（Ｉ−ｂ）を製造する方法である。
この反応では、第１製法の方法を準用することができる。
（原料合成１）
Figure 2014005206
 （式中、-LCは脱離基を示し、例えば、F、Cl等のハロゲン、メタンスルホニルオキシ、p-トルエンスルホニルオキシ、トリフルオロメタンスルホニルオキシ等のスルホニルオキシ基が挙げられる。また、式中、RAはアシル、ベンジル、低級アルキル又は-Hを示し、Mはアルカリ金属を示す。）
本製法は、化合物(3)と化合物(4)とを反応させて得られる化合物(5)に対して、化合物(6)を反応させた後、脱保護反応に付してRAを除去することで化合物(1a-a)を製造する方法である。
化合物(5)を得る反応では、第１製法の方法を準用することができる。また、化合物(1a-a)を得る反応では、第１製法の方法を準用して、化合物(6)や系中で化合物(6)を発生させる試薬を用いて反応させることができ、その後、例えば、グリーン(Greene)及びウッツ(Wuts)著、「Greene’s Protective Groups in Organic Synthesis(第4版、2007年)」に記載の反応条件を適宜選択して、脱保護反応を行うことができる。ここで、化合物(6)の例としては、酢酸ナトリウムやナトリウムメトキシドが挙げられる。なお、化合物(6)を用いる代わりに、過酸化水素水を用いて反応させた後、塩酸等で酸処理することで化合物(1a-a)を製造することもできる。
（原料合成２）
Figure 2014005206
 本製法は、化合物(1a-a)と化合物(8)とを反応させ、化合物(1a-b)を製造する方法である。
この反応では、第２製法の方法を準用することができる。
（原料合成３）
Figure 2014005206
 本製法は、化合物(7)と化合物(4)とを反応させ、化合物(1b)を製造する方法である。
この反応では、第１製法の方法を準用することができる。
式（Ｉ）の化合物は、遊離化合物、その製薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、あるいは結晶多形の物質として単離され、精製される。式（Ｉ）の化合物の製薬学的に許容される塩は、常法の造塩反応に付すことにより製造することもできる。
単離、精製は、抽出、分別結晶化、各種分画クロマトグラフィー等、通常の化学操作を適用して行なわれる。
各種の異性体は、適当な原料化合物を選択することにより製造でき、あるいは異性体間の物理化学的性質の差を利用して分離することができる。例えば、光学異性体は一般的な光学分割法（例えば、光学活性な塩基又は酸とのジアステレオマー塩に導く分別結晶化や、キラルカラム等を用いたクロマトグラフィ等）により、光学的に純粋な異性体に導くことができる。また、適当な光学活性な原料化合物から製造することもできる。
式（Ｉ）の化合物の薬理活性は、以下の試験により確認された。特に断りがない場合、以下に示す試験例は、欧州特許出願公開EP 1914240号公報に記載の方法やその他の公知の方法に従って実施可能であって、市販の試薬やキット等を用いる場合には市販品の指示書に従って実施可能である。なお、EML4-ALK融合タンパクv1とは、特許文献１の配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドであり、EML4-ALK融合タンパクv3とは、特許文献１の配列番号１３０で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである。
試験例１ EML4-ALK融合タンパクのキナーゼ活性の阻害活性評価
EML4-ALK融合タンパクv1のcDNAを組み込んだ発現プラスミドＦＬＡＧ−ＥＭＬ４−ＡＬＫｖ１／ｐＭＸ−ｉｒｅｓＣＤ８から組み換えレトロウィルスを作製し、マウスリンパ系細胞株ＢＡ／Ｆ３細胞に感染させた。細胞分離用磁気ビーズ試薬及び精製カラム（ＣＤ８に対する磁気ビーズ結合モノクローナル抗体とＭｉｎｉＭＡＣＳ純化カラム；共にＭｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社）を用いて、細胞表面ＣＤ８発現細胞を純化し、EML4-ALK融合タンパクv1発現BA/F3細胞を樹立した。本細胞からEML4-ALK融合タンパクv1を精製してキナーゼ活性評価に供した。EML4-ALK融合タンパクv1のペプチド基質に対するリン酸化活性をキナーゼ活性検出キット(HTRF KinEASE-TK;Cisbio社)を用いて検討した。被験化合物を最終濃度1000 nMから0.3 nMの8段階になるように酵素蛋白を含む反応液中に添加し、次いでATPを添加し1時間反応させた。ATP濃度は100μMを使用した。酵素蛋白を含み、被験化合物を添加しない反応液（被験化合物の代わりに溶媒であるDMSOのみ0.4%添加）を作製し、ATPを添加、又は添加せずに同様に反応させた。被験化合物未添加での、ATP未添加及び添加時のリン酸化のカウントをそれぞれ100%阻害、0%阻害として、50%阻害するときの被験化合物濃度（IC50）をロジスティック回帰法により算出した。
いくつかの本発明化合物について、IC50値を表１に示す。Exは実施例化合物番号を示す。なお、表中、Compound Xとは国際公開第WO 2009/136995号パンフレットに記載の実施例174の化合物のラセミ体（rac-2-{[(1R,2S)-2-アミノシクロヘキシル]アミノ}-4-{[4'-(モルホリン-4-イル)ビフェニル-4-イル]アミノ}ピリミジン-5-カルボキサミド）を示し、Compound Yとは国際公開第WO 00/76980号パンフレットに記載の実施例26-22の化合物（5-{[2-(ジメチルアミノ)エチル]アミノ}-6-エチル-3-[(3-メチルフェニル)アミノ]ピラジン-2-カルボキサミド）を示す。
Figure 2014005206
試験例２ EML4-ALK融合タンパク依存的な細胞増殖の抑制活性評価
EML4-ALK融合タンパクv1発現BA/F3細胞はIL-3非存在下でも増殖することができる。即ち、本細胞はEML4-ALK融合タンパクv1依存的に増殖する細胞である。
384ウェルプレート（Iwaki）に、EML4-ALK融合タンパクv1を発現するBA/F3細胞を、1ウェル当り500細胞となるように10%牛胎児血清を含むRPMI1640培地（Invitrogen）で播種した。被験化合物（最終濃度10μMから0.1nM）及び陰性対照として被験化合物の溶媒であるDMSOを添加した。5%CO2存在下、37℃で2日間培養し、細胞数測定試薬（AlmarBlue; Biosource社）を添加し150分間培養した後、発光測定装置（Safire ; Tecan社）を用いて、試薬に添付された方法にて蛍光強度を測定した。培地のみでの測定値及び陰性対照での測定値をそれぞれ100%抑制、0%抑制として被験化合物の抑制率を算出し、50%抑制濃度（IC50値）をロジスティック回帰法により求めた。
いくつかの本発明化合物について、IC50値を表２に示す。なお、表中、Compound X及びCompound Yとは、試験例１で記載した化合物を示す。
Figure 2014005206
上記の試験例１〜２の結果より、本発明化合物は、EML4-ALK融合タンパクv1のキナーゼ活性の阻害活性及びEML4-ALK融合タンパクv1発現BA/F3細胞の増殖抑制活性を有していることが確認された。一方、試験例１で記載したCompound X及びCompound Yは、本発明化合物と比較して、EML4-ALK融合タンパクv1のキナーゼ活性の阻害活性及びEML4-ALK融合タンパクv1発現BA/F3細胞の増殖抑制活性が極めて弱いことが確認された。
試験例３ EML4-ALK融合タンパク依存的な細胞に対する抗腫瘍試験（in vivo）
EML4-ALK融合タンパクv1のcDNAを組み込んだ発現プラスミドＥＭＬ４−ＡＬＫｖ１／ｐＭＸＳをリン酸カルシウム法で３Ｔ３線維芽細胞に導入することによりEML4-ALK融合タンパクv1発現３Ｔ３細胞を樹立した。PBSに懸濁したEML4-ALK融合タンパクv1発現3T3細胞3×106個を、5週齡の雄性Balb/cヌードマウス(日本チャールズリバー社)の背部皮下に注射して植えつけた。植付け7日後に被験化合物の投与を開始した。試験は溶媒群及び化合物投与群各4匹で行い、0.5% メチルセルロースの溶媒に被験化合物を懸濁し、10 mg/kgを経口投与した。投与は5日間1日1回行い、体重及び腫瘍径を隔日で測定した。腫瘍体積の算出には以下の式を用いた。
[腫瘍体積(mm3)]=[腫瘍の長径(mm)]×[腫瘍の短径(mm)]2×0.5
被験化合物投与開始日の腫瘍体積を0%退縮、腫瘍が消失した状態を100％退縮として、披験化合物の退縮率を算出した。
いくつかの本発明化合物について、退縮率を表３に示す。
Figure 2014005206
 従って、本発明化合物の経口投与により、EML4-ALK融合タンパクv1発現３Ｔ３細胞を植えつけたマウスにおける腫瘍が退縮し、本発明化合物に経口活性があることが確認された。
試験例４ EML4-ALK融合タンパク依存的な細胞に対する抗腫瘍試験（in vivo）
試験例３のEML4-ALK融合タンパクv1発現３Ｔ３細胞に替えて、ヒト非小細胞肺癌細胞株NCI-H2228細胞（EML4-ALK融合ポリヌクレオチド陽性の肺癌患者由来の細胞（EML4-ALK融合タンパクv3依存的な細胞））を用いても、下記のとおり、EML4-ALK融合タンパク依存的な細胞に対する抗腫瘍効果が確認できる。
50% Matrigel（Invitrogen）に懸濁したNCI-H2228細胞3×106個を5週齡の雄性NOD/SCIDマウス（日本チャールズリバー社）の背部皮下に注射して植えつけた。植付け3週後に被験化合物の投与を開始した。試験は溶媒群及び被験化合物投与群各6匹で行い、10% 1-メチル-2-ピロリドン(SIGMA-ALDRICH社)/90% ポリエチレングリコール300(Fluka社)の組成の溶媒に被験化合物を溶解し、1 mg/kgを経口投与した。投与は14日間1日1回行い、体重及び腫瘍径を隔日で測定した。腫瘍体積の算出には以下の式を用いた。
[腫瘍体積(mm3)]=[腫瘍の長径(mm)]×[腫瘍の短径(mm)]2×0.5
被験化合物投与開始日及び投与終了日の溶媒群の腫瘍体積をそれぞれ100%抑制、0%抑制として被験化合物の抑制率を算出した。
その結果、例えば、実施例143の化合物は、NCI-H2228細胞の腫瘍の増殖を、75%抑制した。
従って、本発明化合物の経口投与により、ヒト非小細胞肺癌細胞株NCI-H2228細胞を植えつけたマウスにおける腫瘍増大が抑制され、本発明化合物に経口活性があることが確認された。
一方、試験例１で記載したCompound X及びCompound Yを投与した場合は、30 mg/kgで投与しても、溶媒群と比較して、NCI-H2228細胞（腫瘍）に対する有意な増殖抑制を示さなかった。なお、有意差検定はStudent's t検定により行った。
以上の結果より、本発明化合物は、試験例１〜２において、EML4-ALK融合タンパクのキナーゼ活性の阻害活性を有すること、EML4-ALK融合タンパク依存的な細胞の増殖抑制活性を有することが確認された。また、これらの作用に基づき、試験例３及び試験例４においては、EML4-ALK融合タンパク依存的な細胞（腫瘍）に対して、抗腫瘍作用を有することが確認された。以上のことから、本発明化合物が、癌、ある態様としては、肺癌、別の態様としては、非小細胞肺癌若しくは小細胞肺癌、また別の態様としては、ALK融合ポリヌクレオチド陽性の癌、さらに別の態様としては、ALK融合ポリヌクレオチド陽性の肺癌、さらに別の態様としては、ALK融合ポリヌクレオチド陽性の非小細胞肺癌、さらに別の態様としては、ALK融合タンパク陽性の癌、さらに別の態様としては、ALK融合タンパク陽性の肺癌、さらに別の態様としては、ALK融合タンパク陽性の非小細胞肺癌、さらに別の態様としては、EML4-ALK融合ポリヌクレオチド陽性の癌、さらに別の態様としては、EML4-ALK融合ポリヌクレオチド陽性の肺癌、さらに別の態様としては、EML4-ALK融合ポリヌクレオチド陽性の非小細胞肺癌、さらに別の態様としては、EML4-ALK融合タンパク陽性の癌、さらに別の態様としては、EML4-ALK融合タンパク陽性の肺癌、さらに別の態様としては、EML4-ALK融合タンパク陽性の非小細胞肺癌等の予防及び／若しくは治療用医薬組成物の有効成分として有用であることは明らかである。
さらに、これまでALK遺伝子に関しては、神経芽腫患者由来の細胞において、複数種類の活性型点変異の存在や遺伝子増幅を伴う過剰発現が確認されている（Nature, vol.455, p.971, 2008；Cancer Research, vol.68, p.3389, 2008）。また、ALKタンパクのキナーゼ活性の阻害活性を有する化合物が、変異ALKポリヌクレオチド陽性の癌患者由来細胞やALKポリヌクレオチドの過剰発現がある癌患者由来の細胞に対して、抗腫瘍作用を示すことが知られている（Cancer Research, vol.68, p.3389, 2008）。以上のことから、本発明化合物は、神経芽腫、ある態様としては、変異ALKポリヌクレオチド陽性の癌、また別の態様としては、ALKポリヌクレオチドの過剰発現がある癌、さらに別の態様としては、変異ALKポリヌクレオチド陽性の神経芽腫、さらに別の態様としては、ALKポリヌクレオチドの過剰発現がある神経芽腫等の予防及び／若しくは治療用医薬組成物の有効成分として有用であると考えられる。
また、式（Ｉ）の化合物の薬理活性を、以下の試験でも確認した。なお、特に断りがない場合、以下に示す試験例は公知の方法に従って実施可能であって、市販の試薬やキット等を用いる場合には市販品の指示書に従って実施可能である。
試験例５ L256M変異EML4-ALK融合タンパク依存的な細胞増殖の抑制活性評価
96ウェルプレート（Iwaki）に、L256M変異EML4-ALK融合タンパクv1（ALKの256番目のロイシンがメチオニンに変異したEML4-ALK融合タンパクv1）を発現するBA/F3細胞を、1ウェル当り2000細胞となるように10%牛胎児血清を含むRPMI1640培地（Invitrogen）で播種した。被験化合物（最終濃度10μMから0.17nM）及び陰性対照として被験化合物の溶媒であるDMSOを添加した。5%CO2存在下、37℃で3日間培養し、細胞数測定試薬（CellTiter-GloTM; Promega社）を添加し、測定装置（EnVision ; PerkinElmer社）を用いて、試薬に添付された方法にて発光強度を測定した。培地のみでの測定値及び陰性対照での測定値をそれぞれ100%抑制、0%抑制として被験化合物の抑制率を算出し、50%抑制濃度（IC50値）をロジスティック回帰法により求めた。
その結果、本発明化合物の中には、L256M変異EML4-ALK融合タンパクv1を発現するBA/F3細胞に対して、増殖抑制活性を示す化合物が存在することを確認した。
試験例６ L256M変異EML4-ALK融合タンパク依存的な細胞に対する抗腫瘍試験（in vivo）
L256M変異EML4-ALK融合タンパクv1のcDNAを組み込んだ発現プラスミドを３Ｔ３線維芽細胞に導入することによりL256M変異EML4-ALK融合タンパクv1発現３Ｔ３細胞を樹立した。PBSに懸濁したL256M変異EML4-ALK融合タンパクv1発現3T3細胞3×106個を、5週齡の雄性Balb/cヌードマウス(日本チャールズリバー社)の背部皮下に注射して植えつけた。植付け14日後に被験化合物の投与を開始した。試験は溶媒群及び化合物投与群各4匹で行い、0.5% メチルセルロースの溶媒に被験化合物を懸濁し、30 mg/kgを経口投与した。投与は9日間1日1回行い、体重及び腫瘍径を3日、6日および9日後に測定した。腫瘍体積の算出には以下の式を用いた。
[腫瘍体積(mm3)]=[腫瘍の長径(mm)]×[腫瘍の短径(mm)]2×0.5
被験化合物投与開始日の腫瘍体積を0%退縮、腫瘍が消失した状態を100％退縮として、披験化合物の退縮率を算出した。
その結果、本発明化合物の中には、L256M変異EML4-ALK融合タンパクv1発現３Ｔ３細胞の腫瘍を退縮させる化合物が存在することを確認した。
これまでALK融合遺伝子に関しては、ALK阻害剤に感受性低下を引き起こす変異型が二つ報告されており（報告１：Biochemistry 2009, 48, 3600-3609、報告２：American Association for Cancer Research Annual Meeting 2010, LB-298）、これらの報告で共通な変異がL256M変異である（報告２ではL1196M変異として報告されている）。また、ALKの256番目のロイシンの位置はキナーゼドメイン内のゲートキーパーと呼ばれる位置に存在しており、他の抗癌剤標的キナーゼであるABL、KITおよびEGFRにおいてもゲートキーパー位のアミノ酸変異が阻害剤耐性の原因になっていることがよく知られている（Blood 2005, 15, 2128-2137、Clinical Cancer Research 2007, 15, 4874-4881、New England Journal of Mrdicine 2005, 352, 786-792）。L256M変異を有するNPM-ALK融合タンパクをコードする遺伝子又はEML4-ALK融合タンパクをコードする遺伝子に依存した細胞増殖に対して、試験に供されたALK阻害剤（報告１でのCpmd1、報告２でのPF-02341066及びAP26113）は、変異の無いNPM-ALK融合遺伝子又はEML4-ALK融合遺伝子に依存した細胞増殖の阻害活性と比較して、明らかな阻害活性の減弱が観察されている。即ち、ALK融合ポリヌクレオチド陽性の癌の患者が、上記報告で試験に供されたALK阻害剤による治療を受けたとしても、これらのALK阻害剤では細胞増殖を十分に阻害できないL256M変異を有するALK融合ポリヌクレオチド陽性の癌が新たに再燃する可能性が想定される。従って、L256M変異を有するALK融合ポリヌクレオチドに依存的な細胞増殖に対しても、十分な阻害活性を有する化合物、特には変異の無いALK融合ポリヌクレオチドに依存的な細胞増殖と同程度若しくはそれ以上の阻害活性を有する化合物は、ALK融合ポリヌクレオチド陽性の癌及び変異による耐性ALK融合ポリヌクレオチド陽性の癌の予防や治療用医薬組成物の有効成分としても有用であると考えられる。
以上のことから、試験例５及び試験例６の結果に基づき、本発明化合物は、変異ALK融合ポリヌクレオチド陽性の癌、ある態様としては、変異EML4-ALK融合ポリヌクレオチド陽性の癌、また別の態様としては、変異EML4-ALK融合ポリヌクレオチド陽性の肺癌、さらに別の態様としては、変異EML4-ALK融合ポリヌクレオチド陽性の非小細胞肺癌、さらに別の態様としては、L256M変異ALK融合ポリヌクレオチド陽性の癌、さらに別の態様としては、L256M変異EML4-ALK融合ポリヌクレオチド陽性の癌、さらに別の態様としては、L256M変異EML4-ALK融合ポリヌクレオチド陽性の肺癌、さらに別の態様としては、L256M変異EML4-ALK融合ポリヌクレオチド陽性の非小細胞肺癌等の予防及び／若しくは治療用医薬組成物の有効成分として有用であると考えられる。
以下にL256M変異ALKに関する用語を説明する。
「L256M変異ALK融合タンパク」とは、ALKの256番目のロイシンがメチオニンに変異したALK融合タンパクである。
「L256M変異ALK融合ポリヌクレオチド」とは、L256M変異ALK融合タンパクをコードするポリヌクレオチドである。
「L256M変異EML4-ALK融合タンパク」とは、ALKの256番目のロイシンがメチオニンに変異したEML4-ALK融合タンパクである。
「L256M変異EML4-ALK融合ポリヌクレオチド」とは、L256M変異EML4-ALK融合タンパクをコードするポリヌクレオチドである。
試験例７ RETタンパクのキナーゼ活性の阻害活性評価
RETタンパクのキナーゼドメインのみの部分タンパクをカルナバイオサイエンス株式会社より購入した。ペプチド基質に対するリン酸化活性をEZreader(Caliper社)を用いて検討した。被験化合物を最終濃度100 nMから0.03 nMの8段階になるようにタンパク溶液と混合し、次いでATP及び基質ペプチド（Caliper社）混合液を添加し30分間反応させた。ATP濃度は、100μMとした。タンパクを含み、被験化合物を添加しない反応液（被験化合物の代わりに溶媒であるDMSOのみ0.8%添加）を作製し、ATPを添加、又は添加せずに同様に反応させた。被験化合物未添加での、ATP未添加及び添加時のリン酸化ペプチドピークをそれぞれ100%阻害、0%阻害として、50%阻害するときの被験化合物濃度（IC50）をロジスティック回帰法により算出した。
その結果、本発明化合物の中には、RETタンパクのキナーゼ活性に対して、阻害活性を示す化合物が存在することを確認した。
RET（Rearranged during transfection）は、受容体型チロシンキナーゼであり、中央部に細胞膜貫通領域を有し、そのカルボキシル末端側にチロシンキナーゼ領域、アミノ末端側に細胞外領域を有するタンパク質である。
これまでRET遺伝子に関しては、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、甲状腺癌、副腎褐色細胞腫、大腸癌、及び膵臓癌由来の細胞又は癌組織検体において、活性型点変異が確認されており、また、甲状腺癌、卵巣癌、及び中皮腫由来の細胞または癌組織検体において、H4、H4L、PRKAR1A、NCOA4、GOLGA5、HTIF1、TIF1G、TKTN1、RFG9、ELKS、PCM1、RFP、及びHOOK3遺伝子との融合が確認されている（非小細胞肺癌での点変異：Nature Genetics, 2007, 39, 347-351；小細胞肺癌での点変異：Japanese Journal of Cancer Research, 1995, 86, 1127-1130；甲状腺癌での融合及び点変異：Endocrine Reviews, 2006, 27, 535-560；副腎腫瘍での点変異：Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism, 1996, 81, 2041-2046；大腸がんでの点変異：Science, 2006, 314, 268-274；膵臓がんでの点変異：Cancer Research, 2005, 65, 11536-11544；卵巣癌での融合：Internatinal Journal of Surgical Pathology, 2009, 17, 107-110；中皮腫での融合：Cancer letters, 2008, 265, 55-66）。また、RETタンパクのキナーゼ活性の阻害活性を有する化合物が、変異RETポリヌクレオチド陽性の癌患者由来の細胞や融合型RETポリヌクレオチド陽性の癌患者由来の細胞に対して、抗腫瘍作用を示すことが知られている（Endocrine Reviews, 2006, 27, 535-560）。以上のことから、本発明化合物は、甲状腺癌、ある態様としては、副腎褐色細胞腫、また別の態様としては、大腸癌、さらに別の態様としては、膵臓癌、さらに別の態様としては、卵巣癌、さらに別の態様としては、中皮腫、さらに別の態様としては、変異RETポリヌクレオチド陽性の癌、さらに別の態様としては、変異RETポリヌクレオチド陽性の肺癌、さらに別の態様としては、変異RETポリヌクレオチド陽性の非小細胞肺癌、さらに別の態様としては、変異RETポリヌクレオチド陽性の小細胞肺癌、さらに別の態様としては、変異RETポリヌクレオチド陽性の甲状腺癌、さらに別の態様としては、変異RETポリヌクレオチド陽性の副腎褐色細胞腫、さらに別の態様としては、変異RETポリヌクレオチド陽性の大腸癌、さらに別の態様としては、変異RETポリヌクレオチド陽性の膵臓癌、さらに別の態様としては、RET融合ポリヌクレオチド陽性の癌、さらに別の態様としては、RET融合ポリヌクレオチド陽性の甲状腺癌、さらに別の態様としては、RET融合ポリヌクレオチド陽性の卵巣癌、さらに別の態様としては、RET融合ポリヌクレオチド陽性の中皮腫等の予防及び／若しくは治療用医薬組成物の有効成分として有用であると考えられる。
試験例８ KIF5B-RET融合タンパク依存的な細胞に対する抗腫瘍試験（in vivo）
KIF5B-RET融合タンパクv1S（配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド）のcDNAを組み込んだレンチウイルスを３Ｔ３線維芽細胞に感染させ、KIF5B-RET融合タンパクv1S発現３Ｔ３細胞を樹立した。PBSに懸濁したKIF5B-RET融合タンパクv1S発現3T3細胞3×106個を、5週齡の雄性Balb/cヌードマウス(日本チャールズリバー社)の背部皮下に注射して植えつけた。植付け9日後に被験化合物の投与を開始した。試験は溶媒群及び化合物投与群各4匹で行い、0.5% メチルセルロースの溶媒に被験化合物を懸濁し、30 mg/kgを経口投与した。投与は9日間1日1回行い、体重及び腫瘍径を隔日で測定した。腫瘍体積の算出には以下の式を用いた。
[腫瘍体積(mm3)]=[腫瘍の長径(mm)]×[腫瘍の短径(mm)]2×0.5
被験化合物投与開始日の腫瘍体積を0%退縮、腫瘍が消失した状態を100％退縮として、披験化合物の退縮率を算出した。
その結果、本発明化合物の中には、KIF5B-RET融合タンパクv1S発現３Ｔ３細胞の腫瘍を退縮させる化合物が存在することを確認した。
また、RET融合遺伝子に関しては、下記試験例９及び試験例１０に示すとおり、肺癌患者から得た癌組織検体において、KIF5B（Kinesin family protein 5B）とRETとの融合遺伝子（KIF5B-RET融合遺伝子）が存在すること、さらにこれらの融合遺伝子が腫瘍形成能を有し、癌の原因遺伝子であることを見出している。
以上のことから、試験例７及び試験例８の結果に基づき、本発明化合物は、RET融合ポリヌクレオチド陽性の癌、ある態様としては、RET融合ポリヌクレオチド陽性の肺癌、また別の態様としては、RET融合ポリヌクレオチド陽性の非小細胞肺癌、さらに別の態様としては、KIF5B-RET融合ポリヌクレオチド陽性の癌、ある態様としては、KIF5B-RET融合ポリヌクレオチド陽性の肺癌、また別の態様としては、KIF5B-RET融合ポリヌクレオチド陽性の非小細胞肺癌等の予防及び／若しくは治療用医薬組成物の有効成分として有用であると考えられる。
また、前述したとおり、甲状腺癌、卵巣癌、及び中皮腫由来の細胞または癌組織検体において、RET融合遺伝子が確認されていることから、試験例７及び試験例８の結果に基づき、本発明化合物は、甲状腺癌、ある態様としては、卵巣癌、また別の態様としては、中皮腫、さらに別の態様としては、RET融合ポリヌクレオチド陽性の甲状腺癌、さらに別の態様としては、RET融合ポリヌクレオチド陽性の卵巣癌、さらに別の態様としては、RET融合ポリヌクレオチド陽性の中皮腫等の予防及び／若しくは治療用医薬組成物の有効成分として有用であると考えられる。
試験例９ ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合ポリヌクレオチドｖ１の単離
非小細胞肺癌患者肺癌組織由来ＲＮＡ（米国アステランド社）Ｌｇ１６５検体ＲＮＡに対して、逆転写酵素（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩＩ、ライフテクノロジーズ社）およびオリゴ（ｄＴ）プライマー（オリゴ （ｄＴ）２０プライマー、ライフテクノロジーズ社）を用いて、キットのプロトコールにしたがって逆転写反応を行い、ｃＤＮＡを合成した。
次に、制限酵素ＮｏｔＩ認識配列を含んだ配列番号５および配列番号６のプライマーを用いて、上記で得たｃＤＮＡを鋳型として、ＤＮＡポリメラーゼ（ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＨＳ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ；タカラバイオ株式会社）を行いてＰＣＲ（９８℃１０秒、６０℃１５秒、６８℃３．５分を３５サイクル）を行い、電気泳動したところ、約３ｋｂのＰＣＲ産物を得たことがわかった。本ＰＣＲ産物をＮｏｔＩ消化し、発現ベクター（ｐＴｒａｃｅｒ―ＣＭＶ―ｂｓｄ；ライフテクノロジーズ社）のマルチクローニングサイトに存在するＮｏｔＩサイトにクローニングし発現プラスミドを構築した。インサートはダイデオキシシーケンス法により配列を決定した（ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ３．１ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ；ライフテクノロジーズ）。この結果、ＮＣＢＩに登録されているＫＩＦ５Ｂ（ＮＭ ００４５２１）のコーディングシーケンス（以下ＣＤＳ）のＮ末端からエキソン１５までが、ＲＥＴのショートフォーム（ＮＭ ０２０６３０）のＣＤＳのエキソン１２からＣＤＳのＣ末端までと融合している転写産物（ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴｖ１Ｓ）（配列番号1）が存在していることが明らかになった。配列番号１によりコードされるポリペプチドを配列番号２に示す。
また、同様にＮｏｔＩ配列を含んだ配列番号５および配列番号７のプライマーを用いてＰＣＲを行い、クローニングした結果、ＮＣＢＩに登録されているＫＩＦ５ＢのＣＤＳのＮ末端からエキソン１５までが、ＲＥＴのロングフォーム（ＮＭ ０２０９７５）のＣＤＳのエキソン１２からＣＤＳのＣ末端までと融合している転写産物（ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴｖ１Ｌ）（配列番号３）が存在していることを見出した。配列番号３によりコードされるポリペプチドを配列番号４に示す。
また、ＫＩＦ５Ｂ―ＲＥＴｖ１Ｓ及びＫＩＦ５Ｂ―ＲＥＴｖ１ＬのＯＲＦ全長をＮ末端にＦＬＡＧタグが付加されたタンパク質として発現するため、ＮｏｔＩサイトおよびＦＬＡＧ配列を導入した配列番号８および配列番号６のプライマー及び配列番号８および配列番号７のプライマーにて、上記ＫＩＦ５Ｂ―ＲＥＴｖ１Ｓ及びＫＩＦ５Ｂ―ＲＥＴｖ１ＬのＯＲＦ全長を含むＰＣＲ産物をそれぞれ鋳型として、同条件によるＰＣＲを行い、発現ベクター（ｐＴｒａｃｅｒ―ＣＭＶ―ｂｓｄ；ライフテクノロジーズ社）のマルチクローニングサイトに存在するＮｏｔＩサイトにクローニングし発現プラスミドを構築した。（（ＦＬＡＧ―ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴｖ１Ｓ ／ｐＴｒａｃｅｒ―ＣＭＶ―ｂｓｄ、ＦＬＡＧ―ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴｖ１Ｌ ／ｐＴｒａｃｅｒ―ＣＭＶ―ｂｓｄ）
試験例１０ ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合ポリヌクレオチドｖ１の足場非依存的増殖亢進作用及び腫瘍形成能の検討
ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴｖ１Ｓ ＯＲＦ全長をレンチウイルス発現ベクターにサブクローニングするため、ＳｐｅＩサイトを導入した配列番号９および、ＳａｌＩサイトを導入した配列番号１０のプライマーを設計した。
上記ＦＬＡＧ−ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴｖ１Ｓ／ｐＴａｒｃｅｒ−ＣＭＶ―ｂｓｄを鋳型として、（ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＨＳ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ；タカラバイオ株式会社）を行いてＰＣＲ（９８℃１０秒、６０℃１５秒、６８℃３．５分を３５サイクル）を行ったところ、約３ｋｂのＰＣＲ産物が得られた。本ＰＣＲ産物を精製し（ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ；キアゲン社）、本ＰＣＲ産物をＳｐｅＩ、ＳａｌＩ消化した産物をレンチウイルス発現ベクター（ｐＬｅｎｔｉ６．３／Ｖ５−ＴＯＰＯ；ライフテクノロジーズ社）のマルチクローニングサイトに存在するＳｐｅＩ− ＸｈｏＩサイトにクローニングした。（ＦＬＡＧ−ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴｖ１Ｓ／ｐＬｅｎｔｉ６．３と命名した。）
上記、ＦＬＡＧ−ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴｖ１Ｓ／ｐＬｅｎｔｉ６．３を３μｇ、パッケージング用プラスミド９μｇ（ＶｉｒａＰｏｗｅｒＴＭ Ｐａｃｋａｇｉｎｇ Ｍｉｘ；ライフテクノロジーズ社）と共に、トランスフェクション試薬（ＬｉｐｏｆｅｃｔＡｍｉｎｅ２０００； ライフテクノロジーズ社）を用いて、２９３ＦＴ細胞パッケージング細胞（ライフテクノロジーズ社）に導入した。導入３日後の培養上清を、レンチウイルスとして回収し、ポリブレン（ｐｏｌｙｂｒｅｎｅ；Ｓｉｇｍａ社）を６μｇ／ｍｌの濃度で添加した後、マウスＮＩＨ３Ｔ３細胞に添加した。２日後にＮＩＨ３Ｔ３細胞の培養上清をＤＭＥＭ培地（インビトロジェン社）に１０％牛血清（インビトロジェン社）、Ｂｌａｓｔｃｉｄｉｎ（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ社）５μｇ／ｍｌを添加したものに交換し、さらに２週間培養を続け、Ｎ末端にＦＬＡＧが付加されたＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴｖ１Ｓを安定発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞（ＦＬＡＧ−ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴｖ１Ｓ／ＮＩＨ３Ｔ３と命名）を取得した。
９６ウェルスフェロイドプレート（スミロンセルタイトスフェロイド９６Ｕ；住友ベークライト）に、ＦＬＡＧ−ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴｖ１Ｓ／ＮＩＨ３Ｔ３細胞、及び親株であるＮＩＨ３Ｔ３を、それぞれ１ウェル当り３×１０３個となるように１０％牛胎児血清を含む培地で播種した。５％ＣＯ２存在下、３７℃にて培養後、翌日（Ｄａｙ１）および６日後（Ｄａｙ６）の細胞数を細胞数測定試薬（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−ＧｌｏＴＭ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ；Ｐｒｏｍｅｇａ社）をマニュアルの方法に従って測定した。検出には発光測定装置（Ｅｎｖｉｓｉｏｎ；パーキンエルマー社）を用いた。ＮＩＨ３Ｔ３細胞はＤａｙ１からＤａｙ６までで細胞数のカウントは増加しなかったのに対して、ＦＬＡＧ−ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴｖ１Ｓ／ＮＩＨ３Ｔ３細胞はＤａｙ１からＤａｙ６までで細胞数のカウントの増加が確認された。以上から、ＦＬＡＧ−ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴｖ１Ｓ／ＮＩＨ３Ｔ３細胞は足場非依存的細胞増殖を示すことが明らかとなった。
次に、ｉｎ ｖｉｖｏにおける造腫瘍能を検討するため本細胞株をヌードマウスに移植し腫瘍形成能を検討した。ＦＬＡＧ−ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴｖ１Ｓ／ＮＩＨ３Ｔ３細胞をヌードマウスの皮下に３ｘ１０６個ずつ接種し８日観察したところ腫瘍形成が確認された。以上から、ＫＩＦ５Ｂ−ＲＥＴ融合ポリヌクレオチドｖ１Ｓは癌の原因遺伝子であることが示された。
以下にRETに関する用語を説明する。
「RET融合ポリヌクレオチド」とは、RET遺伝子とその他の遺伝子が融合し、癌化能を有する融合型チロシンキナーゼを発現する融合型ポリヌクレオチドであり、例えば、KIF5B-RET融合ポリヌクレオチド、H4-RET融合ポリヌクレオチド、H4L-RET融合ポリヌクレオチド、PRKAR1A-RET融合ポリヌクレオチド、NCOA4-RET融合ポリヌクレオチド、GOLGA5-RET融合ポリヌクレオチド、HTIF1-RET融合ポリヌクレオチド、HTIF1-RET融合ポリヌクレオチド、TKTN1-RET融合ポリヌクレオチド、RFG9-RET融合ポリヌクレオチド、ELKS-RET融合ポリヌクレオチド、PCM1-RET融合ポリヌクレオチド、RFP-RET融合ポリヌクレオチド、及びHOOK3-RET融合ポリヌクレオチド等であり、別の態様としては、KIF5B-RET融合ポリヌクレオチドである。
「RET融合タンパク」とは、RET融合ポリヌクレオチドの発現により作られた融合型チロシンキナーゼである。
「KIF5B-RET融合ポリヌクレオチド」とは、RET遺伝子とKIF5B遺伝子が融合（KIF5B-RET融合遺伝子）し、癌化能を有するRET融合タンパクを発現する融合型ポリヌクレオチドであり、そのバリアント、例えば、KIF5B-RET融合ポリヌクレオチドv1S（配列番号１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド）及びKIF5B-RET融合ポリヌクレオチドv1L（配列番号３で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド）の他、各種バリアントを含む。
「KIF5B-RET融合タンパク」とは、KIF5B-RET融合ポリヌクレオチドの発現により作られた融合型チロシンキナーゼである。
試験例１１ ROSタンパクのキナーゼ活性の阻害活性評価
ROSタンパクのキナーゼドメインのみの部分タンパクをカルナバイオサイエンス株式会社より購入し、試験例５と同様に試験を実施した。ただし、ATP及び基質ペプチド（Caliper社）混合液におけるATP濃度は50μMとした。
いくつかの本発明化合物について、IC50値を表４に示す。
Figure 2014005206
試験例１２ SLC34A2-ROS融合タンパク依存的な細胞に対する抗腫瘍試験（in vivo）
SLC34A2-ROS融合タンパク（SLC34A2-ROS(long)融合ポリヌクレオチド（Cell, 2007, 131, 1190-1203、GenBank Accession Number; EU236946）の発現により作られた融合タンパク）のcDNAを組み込んだレトロウイルスを３Ｔ３線維芽細胞に感染させ、SLC34A2-ROS融合タンパク発現３Ｔ３細胞を樹立した。PBSに懸濁したSLC34A2-ROS融合タンパク発現3T3細胞3×106個を、5週齡の雄性Balb/cヌードマウス(日本チャールズリバー社)の背部皮下に注射して植えつけた。植付け10日後に被験化合物の投与を開始した。試験は溶媒群及び化合物投与群各4匹で行い、0.5% メチルセルロースの溶媒に被験化合物を懸濁し、10 mg/kgを経口投与した。投与は5日間1日1回行い、体重及び腫瘍径を隔日で測定した。腫瘍体積の算出には以下の式を用いた。
[腫瘍体積(mm3)]=[腫瘍の長径(mm)]×[腫瘍の短径(mm)]2×0.5
被験化合物投与開始日及び投与終了日の溶媒群の腫瘍体積をそれぞれ100%抑制、0%抑制として被験化合物の抑制率を算出した。
いくつかの本発明化合物について、抑制率を表５に示す。
Figure 2014005206
 従って、本発明化合物の経口投与により、SLC34A2-ROS融合タンパク発現３Ｔ３細胞を植えつけたマウスにおける腫瘍増大が抑制され、本発明化合物に経口活性があることが確認された。
ROS（v-Ros avian UR2 sarcoma virus oncogene homolog 1）は、受容体型チロシンキナーゼであり、中央部に細胞膜貫通領域を有し、そのカルボキシル末端側にチロシンキナーゼ領域、アミノ末端側に細胞外領域を有するタンパク質である。
これまでROS遺伝子に関しては、非小細胞肺癌及び膠芽腫由来の細胞又は癌組織検体において、FIG遺伝子、SLC34A2遺伝子、及びCD74遺伝子との融合が確認されている（Biochimica et Biophysica Acta (BBA) Reviews on Cancer, 2009, 1795, 37-52、Cell, 2007, 131, 1190-1203）。また、SLC34A2-ROS融合ポリヌクレオチド陽性の癌患者由来の細胞株に対して当該分子発現を抑制するsiRNAが抗腫瘍作用を示すことが知られている（Cell, 2007, 131, 1190-1203）。
以上のことから、試験例１１及び試験例１２の結果に基づき、本発明化合物は、膠芽腫、ある態様としては、ROS融合ポリヌクレオチド陽性の癌、別の態様としては、ROS融合ポリヌクレオチド陽性の肺癌、さらに別の態様としては、ROS融合ポリヌクレオチド陽性の非小細胞肺癌、さらに別の態様としては、ROS融合ポリヌクレオチド陽性の膠芽腫、さらに別の態様としては、SLC34A2-ROS融合ポリヌクレオチド陽性の肺癌、さらに別の態様としては、SLC34A2-ROS融合ポリヌクレオチド陽性の非小細胞肺癌等の予防及び／若しくは治療用医薬組成物の有効成分としても有用であると考えられる。
以下にROSに関する用語を説明する。
「ROS融合ポリヌクレオチド」とは、ROS遺伝子とその他の遺伝子が融合し、癌化能を有する融合型チロシンキナーゼを発現する融合型ポリヌクレオチドであり、例えば、SLC34A2-ROS融合ポリヌクレオチド、CD74-ROS融合ポリヌクレオチド、及びFIG-ROS融合ポリヌクレオチド等であり、別の態様としては、SLC34A2-ROS融合ポリヌクレオチド及びCD74-ROS融合ポリヌクレオチドである。
「ROS融合タンパク」とは、ROS融合ポリヌクレオチドの発現により作られた融合型チロシンキナーゼである。
「SLC34A2-ROS融合ポリヌクレオチド」とは、ROS遺伝子とSLC34A2遺伝子が融合（SLC34A2-ROS融合遺伝子）し、癌化能を有するROS融合タンパクを発現する融合型ポリヌクレオチドであり、そのバリアント、例えば、SLC34A2-ROS(long)融合ポリヌクレオチド（Cell, 2007, 131, 1190-1203、GenBank Accession Number; EU236946）で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド）及びSLC34A2-ROS(short)融合ポリヌクレオチド（Cell, 2007, 131, 1190-1203、GenBank Accession Number; EU236947）で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド）の他、各種バリアントを含む。
「SLC34A2-ROS融合タンパク」とは、SLC34A2-ROS融合ポリヌクレオチドの発現により作られた融合型チロシンキナーゼである。
試験例１３ FLT3タンパクのキナーゼ活性の阻害活性評価
FLT3タンパクのキナーゼドメインのみの部分タンパクをカルナバイオサイエンス株式会社より購入し、試験例５と同様に試験を実施した。
いくつかの本発明化合物について、IC50値を表６に示す。
Figure 2014005206
FLT3（Fms- like tyrosine kinase 3）は、受容体型チロシンキナーゼであり、中央部に細胞膜貫通領域を有し、そのカルボキシル末端側にチロシンキナーゼ領域、アミノ末端側に細胞外領域を有するタンパク質である。
これまでFLT3遺伝子に関しては、急性骨髄性白血病患者由来の細胞において活性型点変異及び膜近傍領域における遺伝子内縦列重複（Internal tandem duplication）変異（FLT3-ITD）が確認されており、また、異型慢性骨髄性白血病患者由来の細胞において、SPTBN1遺伝子との融合が確認されている（急性骨髄性白血病での活性型点変異及び膜近傍領域における遺伝子内縦列重複：Current Pharmaceutical Design, 2005, 11, 3449-3457；異型慢性骨髄性白血病での融合：Experimental Hematology, 2007, 35, 1723-1727）。また、FLT3タンパクのキナーゼ活性の阻害活性を有する化合物が、変異FLT3ポリヌクレオチド陽性の癌患者由来の細胞やSPTBN1-FLT3融合ポリヌクレオチド陽性の癌患者由来の細胞に対して、抗腫瘍作用を示すことが知られている（Current Pharmaceutical Design, 2005, 11, 3449-3457；Experimental Hematology, 2007, 35, 1723-1727）。以上のことから、本発明化合物は、急性骨髄性白血病、ある態様としては、異型慢性骨髄性白血病患者、また別の態様としては、変異FLT3ポリヌクレオチド陽性の癌、さらに別の態様としては、変異FLT3ポリヌクレオチド陽性の急性骨髄性白血病、さらに別の態様としては、FLT3融合ポリヌクレオチド陽性の癌、さらに別の態様としては、FLT3融合ポリヌクレオチド陽性の異型慢性骨髄性白血病等の予防及び／若しくは治療用医薬組成物の有効成分としても有用であると考えられる。
試験例１４ Ames試験
（１）試験系（試験菌）
Salmonella typhimurium TA100, TA98, TA1535, TA1537 及びEscherichia coli WP2urvA
（２）培養液及び培地
（２−１）前培養液
注射用水にニュートリエントブロス（DIFCO)と塩化ナトリウムをそれぞれ0.8及び0.5％の割合で溶解し、高圧蒸気滅菌したものを使用した。
（２−２）最少グルコース寒天平板培地
市販のクリメディアAM-N 培地（オリエンタル酵母工業（株）以下プレートと称する）を用いた。表７にその組成を示す。
Figure 2014005206
 （２−３）上層用寒天培地
注射用水に塩化ナトリウムと寒天（Bacto-Agar）をそれぞれ0.5 及び0.6%の割合で添加して高圧蒸気滅菌したものに、0.5 mM L-ヒスチジン・0.5 mM D-ビオチン・0.5 mM L-トリプトファン溶液を容量比 10:1 の割合で用時に加えた。
（３）S9 Mix
超低温冷凍庫（設定温度: -80℃）に保存されたS9 Mix（キッコーマン（株））を用時に解凍して使用した。なお、S9 は、フェノバルビタールと 5,6-ベンゾフラボンを腹腔内投与したSprague Dawley (Slc:SD)系雄ラットの肝臓より調製した9000×ｇ上清画分である。S9 Mix の組成を表８に示す。
Figure 2014005206
 （４）試験物質
被験物質の溶媒としてジメチルスルホキシド（DMSO）を用いた(最高濃度は、50mg/mL)。最高用量を5000 μg/plate とし、以下公比2 で合計5 用量設けた。
陰性対照物質として、溶媒（DMSO）を用いた。陽性対照物質は、2-ニトロフルオレン、2-(2-フリル)-3-(5-ニトロ-2-フリル)アクリルアミド及び2-アミノアントラセンを用いた。
（５）試験操作
（５−１）前培養
前培養液を5 mL 分注したＬ字型試験管に試験用保存菌懸濁液 10 μL を接種し、37℃で約8 時間振盪（約100 回／分）し、試験用菌懸濁液を作製した。
（５−２）試験培養
表９に示す組成の反応液を37℃で約20 分間振盪培養した後、約45℃に加温した上層用寒天培地2 mL を加えて撹拌し、これをプレート上に重層してさらに37℃で約48 時間培養した。
Figure 2014005206
 （５−３）観察
プレート上のコロニー（復帰変異コロニー）をコロニーアナライザー(CA-11，システムサイエンス株式会社)を用いて計数した。
（５−４）評価方法
被験物質で処理したプレートの復帰変異コロニー数(平均値)が溶媒対照の復帰変異コロニー数(平均値)の2 倍以上に増加し、用量依存性が認められた場合に遺伝子突然変異誘発性を有すると判断した。
その結果、本発明化合物の中には、遺伝子突然変異誘発性を有さない化合物が存在することを確認した。
式（Ｉ）の化合物又はその製薬学的に許容される塩の１種又は２種以上を有効成分として含有する医薬組成物は、当分野において通常用いられている薬剤用賦形剤、薬剤用担体等を用いて、通常使用されている方法によって調製することができる。
投与は錠剤、丸剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、液剤等による経口投与、又は、関節内、静脈内、筋肉内等の注射剤、坐剤、点眼剤、眼軟膏、経皮用液剤、軟膏剤、経皮用貼付剤、経粘膜液剤、経粘膜貼付剤、吸入剤等による非経口投与のいずれの形態であってもよい。
経口投与のための固体組成物としては、錠剤、散剤、顆粒剤等が用いられる。このような固体組成物においては、1種又は2種以上の有効成分が、少なくとも1種の不活性な賦形剤、例えば乳糖、マンニトール、ブドウ糖、ヒドロキシプロピルセルロース、微結晶セルロース、デンプン、ポリビニルピロリドン、及び／又はメタケイ酸アルミン酸マグネシウム等と混合される。組成物は、常法に従って、不活性な添加剤、例えばステアリン酸マグネシウムのような滑沢剤やカルボキシメチルスターチナトリウム等のような崩壊剤、安定化剤、溶解補助剤を含有していてもよい。錠剤又は丸剤は必要により糖衣又は胃溶性若しくは腸溶性物質のフィルムで被膜してもよい。
経口投与のための液体組成物は、薬剤的に許容される乳濁剤、溶液剤、懸濁剤、シロップ剤又はエリキシル剤等を含み、一般的に用いられる不活性な希釈剤、例えば精製水又はエタノールを含む。当該液体組成物は不活性な希釈剤以外に可溶化剤、湿潤剤、懸濁剤のような補助剤、甘味剤、風味剤、芳香剤、防腐剤を含有していてもよい。
非経口投与のための注射剤は、無菌の水性又は非水性の溶液剤、懸濁剤又は乳濁剤を含有する。水性の溶剤としては、例えば注射用蒸留水又は生理食塩液が含まれる。非水性の溶剤としては、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール又はオリーブ油のような植物油、エタノールのようなアルコール類、又はポリソルベート８０（局方名）等がある。このような組成物は、さらに等張化剤、防腐剤、湿潤剤、乳化剤、分散剤、安定化剤、又は溶解補助剤を含んでもよい。これらは例えばバクテリア保留フィルターを通す濾過、殺菌剤の配合又は照射によって無菌化される。また、これらは無菌の固体組成物を製造し、使用前に無菌水又は無菌の注射用溶媒に溶解又は懸濁して使用することもできる。
外用剤としては、軟膏剤、硬膏剤、クリーム剤、ゼリー剤、パップ剤、噴霧剤、ローション剤、点眼剤、眼軟膏等を包含する。一般に用いられる軟膏基剤、ローション基剤、水性又は非水性の液剤、懸濁剤、乳剤等を含有する。例えば、軟膏又はローション基剤としては、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、白色ワセリン、サラシミツロウ、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、モノステアリン酸グリセリン、ステアリルアルコール、セチルアルコール、ラウロマクロゴール、セスキオレイン酸ソルビタン等が挙げられる。
吸入剤や経鼻剤等の経粘膜剤は固体、液体又は半固体状のものが用いられ、従来公知の方法に従って製造することができる。例えば公知の賦形剤や、更に、pH調整剤、防腐剤、界面活性剤、滑沢剤、安定剤や増粘剤等が適宜添加されていてもよい。投与は、適当な吸入又は吹送のためのデバイスを使用することができる。例えば、計量投与吸入デバイス等の公知のデバイスや噴霧器を使用して、化合物を単独で又は処方された混合物の粉末として、もしくは医薬的に許容し得る担体と組み合わせて溶液又は懸濁液として投与することができる。乾燥粉末吸入器等は、単回又は多数回の投与用のものであってもよく、乾燥粉末又は粉末含有カプセルを利用することができる。あるいは、適当な駆出剤、例えば、クロロフルオロアルカン、ヒドロフルオロアルカン又は二酸化炭素等の好適な気体を使用した加圧エアゾールスプレー等の形態であってもよい。
通常経口投与の場合、1日の投与量は、体重当たり約0.001〜100 mg/kg、好ましくは0.005〜30 mg/kg、更に好ましくは0.01〜10 mg/kgが適当であり、これを1回であるいは2乃至4回に分けて投与する。静脈内投与される場合は、1日の投与量は、体重当たり約0.0001〜10 mg/kgが適当で、1日1回乃至複数回に分けて投与する。また、経粘膜剤としては、体重当たり約0.001〜100 mg/kgを1日1回乃至複数回に分けて投与する。投与量は症状、年令、性別等を考慮して個々の場合に応じて適宜決定される。
式（Ｉ）の化合物は、前述の式（Ｉ）の化合物が有効性を示すと考えられる疾患の種々の治療剤又は予防剤と併用することができる。一般に、腫瘍、特に悪性腫瘍の化学療法において抗腫瘍剤を単独で投与する場合、副作用等の点からその効果には限界があり、十分な抗腫瘍効果が得られない場合が多い。そのため、臨床の場では作用機序の異なる2剤若しくは3剤以上を組み合わせた多剤併用療法が行なわれている。この併用療法は、作用機序の異なる抗腫瘍剤を組み合わせることにより、１）非感受性細胞集団を減少させる、２）薬剤耐性出現を予防若しくは遅延させる、３）毒性の異なる薬剤の組み合わせにより毒性を分散させる、等の副作用の軽減や抗腫瘍作用の増強を目的とする。当該併用は、同時投与、或いは別個に連続して、若しくは所望の時間間隔をおいて投与してもよい。同時投与製剤は、配合剤であっても別個に製剤化されていてもよい。
併用しうる薬剤としては、アルキル化剤、代謝拮抗剤等の化学療法剤、免疫療法剤、ホルモン療法剤、細胞増殖因子阻害剤を挙げることができ、具体的には、シスプラチン、カルボプラチン、パクリタキセル、ドセタキセル、ゲムシタビン、イリノテカン、ビノレルビン、ベバシズマブ、ペメトレキセド等の薬剤を挙げることができる。
以下、実施例に基づき、式（Ｉ）の化合物の製造法をさらに詳細に説明する。なお、本発明は、下記実施例に記載の化合物に限定されるものではない。また、原料化合物の製法を製造例にそれぞれ示す。また、式（Ｉ）の化合物の製造法は、以下に示される具体的実施例の製造法のみに限定されるものではなく、式（Ｉ）の化合物はこれらの製造法の組み合わせ、あるいは当業者に自明である方法によっても製造されうる。
また、実施例、製造例及び後記表中において、以下の略号を用いることがある。
Rex：製造例番号、Ex：実施例番号、Structure：化学構造式、Data：物理化学的データ（FAB+：FAB-MS[M+H]+、ESI+：ESI-MS[M+H]+、APCI/ESI+：APCI/ESI-MS[M+H]+(APCI/ESIはAPCIとESIの同時測定を意味する)、FAB-：FAB-MS[M-H]-、ESI-：ESI-MS[M-H]-、EI:EI[M]+、1H-NMR(CDCl3)：重クロロホルム中の1H-NMRにおけるピークのδ(ppm)、1H-NMR(CD3OD)：重メタノール中の1H-NMRにおけるピークのδ(ppm)、1H-NMR(DMSO-d6)：DMSO-d6中の1H-NMRにおけるピークのδ(ppm)）、HCl：塩酸塩として得られたことを示す、2HCl：2塩酸塩として得られたことを示す、TFA：トリフルオロ酢酸塩として得られたことを示す、FM：フマル酸塩として得られたことを示す、2FM：2フマル酸塩として得られたことを示す、Me：メチル、Et：エチル、nPr：ノルマルプロピル、iPr：イソプロピル、tBu：tert-ブチル、cPr：シクロプロピル、cBu：シクロブチル、cPen：シクロペンチル、cHex：シクロヘキシル、cHep：シクロヘプチル、Ph：フェニル、Bn：ベンジル、Boc：tert-ブチルオキシカルボニル、Ac：アセチル、CN：シアノ、Tf：トリフルオロメチルスルホニル。Syn：製造方法（当該化合物が、表記された製造例又は実施例と同様の方法により、対応する原料を用いて製造されたことを示す。1)、2)等とある場合は、対応する原料から番号順に連続反応を行って得られたことを示す（例えば、製造例番号４９９の化合物は、対応する原料（製造例番号５００の化合物）から、製造例６と同様に反応後、製造例１２、続いて製造例１９と同様の反応を行うことにより得られたことを示す））。
なお、実施例の表中において、実施例番号に＊を付した化合物は、シス-トランス異性体が存在し、シス又はトランスのいずれか一方の立体配置を示すが、それらシス又はトランスいずれかのラセミ体（SS体及びRR体の混合物、又はSR体及びRS体の混合物）であることを示す。これらの化合物の化学構造式中での立体配置の表示は、シス又はトランスの立体配置が決定済みの化合物の場合は、シス体のいずれか一方、又はトランス体のいずれか一方とし、シス又はトランスの立体配置が未決定の化合物の場合は、立体配置の表示を行わなかった。
また、本明細書において、化合物の命名にACD/Name（登録商標、Advanced Chemistry Development, Inc.）Ver.12.02 等の命名ソフトを使用している場合がある。
製造例５
tert-ブチル 4-(4,4,5,5-テトラメチル-1,3,2-ジオキサボロラン-2-イル)-3,6-ジヒドロピリジン-1(2H)-カルボキシラート(3.16 g)、4-ブロモ-3-メトキシ-1-ニトロベンゼン(2.63 g)およびDMF（N,N-ジメチルホルムアミド）(31.6 mL)の混合物に、[1,1'-ビス(ジフェニルホスフィノ)フェロセン]ジクロロパラジウム(II), ジクロロメタン付加体(0.50 g)と炭酸カリウム(4.24 g)を加え、80℃で4時間攪拌した。反応液を減圧濃縮した後、水と酢酸エチルを加え、不溶物をセライトを用いてろ別し、ろ液の分液操作を行った。有機層を飽和食塩水で洗浄した後、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧留去し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液；n-ヘキサン：酢酸エチル=1:0-2:1)で精製し、tert-ブチル 4-(2-メトキシ-4-ニトロフェニル)-3,6-ジヒドロピリジン-1(2H)-カルボキシラート(2.21 g)を黄色固体として得た。
製造例６
tert-ブチル 4-(2-メトキシ-4-ニトロフェニル)-3,6-ジヒドロピリジン-1(2H)-カルボキシラート (製造例５) (2.21 g)、エタノール(40 mL)およびTHF（テトラヒドロフラン）(20 mL)の混合物に、10%パラジウム担持炭素(1.0 g)を加え、常圧水素雰囲気下、室温で3時間撹拌した。触媒をセライトを用いてろ別した後、ろ液を減圧留去し、tert-ブチル 4-(4-アミノ-2-メトキシフェニル)ピペリジン-1-カルボキシラート(1.97 g)を灰色固体として得た。
製造例７
2-クロロ-5-ニトロフェノール(5.0 g）、炭酸カリウム(8.0 g)およびDMF(50 mL)の混合物に、2-ヨードプロパン(5.44 g)を加え、室温で終夜撹拌した。反応液を放冷後、水を加え、析出した固体をろ取、乾燥し、1-クロロ-2-イソプロポキシ-4-ニトロベンゼン(5.73 g)を薄茶色固体として得た。
製造例１２
3,5-ジクロロ-6-エチルピラジン-2-カルボキサミド(990 mg)、3-メトキシ-4-[4-(4-メチルピペラジン-1-イル)ピペリジン-1-イル]アニリン (製造例４) (1.37 g)、N,N-ジイソプロピルエチルアミン(0.78 mL)およびジオキサン(60 mL)の混合物を、110℃で終夜攪拌した。反応液を放冷後、クロロホルムと飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で分液操作を行った。有機層を飽和食塩水で洗浄した後、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を留去した後、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液；クロロホルム：メタノール：飽和アンモニア水=100:0:0-10:1:0.1）で精製し、5-クロロ-6-エチル-3-({3-メトキシ-4-[4-(4-メチルピペラジン-1-イル)ピペリジン-1-イル]フェニル}アミノ)ピラジン-2-カルボキサミド(1.06 g)を橙色固体として得た。
製造例１６
5-クロロ-6-(1-ヒドロキシ-1-メチルエチル)-3-({4-[4-(4-メチルピペラジン-1-イル)ピペリジン-1-イル]-3-(トリフルオロメチル)フェニル}アミノ)ピラジン-2-カルボキサミド (製造例４７８) (2.45 g)と酢酸(30 mL)の混合物を、120℃で5時間攪拌した。反応液を放冷後、溶媒を減圧留去し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加えた。析出した固体をろ取し、水で洗浄した。得られた固体を塩基性シリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液；クロロホルム）で精製し、5-クロロ-6-イソプロペニル-3-({4-[4-(4-メチルピペラジン-1-イル)ピペリジン-1-イル]-3-(トリフルオロメチル)フェニル}アミノ)ピラジン-2-カルボキサミド(990 mg)を黄色固体として得た。
製造例１８
tert-ブチル 4-(4-アミノ-2-メトキシフェニル)ピペリジン-1-カルボキシラート (製造例６) (4.25 g)とTHF(100 mL)の混合物に、炭酸水素ナトリウム(1.28 g)と水(30 mL)を加えた後、氷冷下、クロロギ酸ベンジル(1.98 mL)を滴下した。反応液を室温で終夜攪拌した後、水を加え、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄した後、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧留去し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液；n-ヘキサン：酢酸エチル=2:1)で精製し、tert-ブチル 4-(4-{[(ベンジロキシ)カルボニル]アミノ}-2-メトキシフェニル)ピペリジン-1-カルボキシラート(4.92 g)を無色アモルファスとして得た。
製造例１９
tert-ブチル 4-(4-{[(ベンジロキシ)カルボニル]アミノ}-2-メトキシフェニル)ピペリジン-1-カルボキシラート (製造例１８) (4.92 g)、トリフルオロ酢酸(10 mL)および1,2-ジクロロエタン(50 mL)の混合物を、室温で1時間攪拌した。反応液を減圧濃縮し、得られた残渣に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、クロロホルムで抽出した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥した後、溶媒を減圧留去し、得られた残渣にジエチルエーテルを加え固体化し、ベンジル (3-メトキシ-4-ピペリジン-4-イルフェニル)カルバマート(3.24 g)を白色固体として得た。
製造例２０
ベンジル (3-メトキシ-4-ピペリジン-4-イルフェニル)カルバマート (製造例１９) (1.52 g)と1,2-ジクロロエタン(70 mL)の混合物に、ホルマリン(3.62 mL)とトリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム(1.42 g)を加え、室温で終夜撹拌した。反応液に水および飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加えた後、クロロホルムで抽出し、有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧留去した後、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(溶出液；クロロホルム：メタノール：飽和アンモニア水=100:0:0-10:1:0.1)で精製し、ベンジル [3-メトキシ-4-(1-メチルピペリジン-4-イル)フェニル]カルバマート(1.26 g)を白色固体として得た。
製造例２２
ベンジル [3-メトキシ-4-(1-メチルピペリジン-4-イル)フェニル]カルバマート (製造例２０) (1.26 g)、エタノール(20 mL)およびTHF(10 mL)の混合物に、5%パラジウム担持炭素(0.38 g)を加え、常圧水素雰囲気下、室温で終夜撹拌した。触媒をセライトを用いてろ別した後、ろ液を減圧留去し、3-メトキシ-4-(1-メチルピペリジン-4-イル)アニリン(0.80 g)を薄いピンク色固体として得た。
製造例２６
2-クロロ-5-ニトロフェノール(2.0 g）、ピリジン(9.32 mL)およびジクロロメタン(37 mL)の混合物に2,4,6-トリビニルボロキシン-ピリジン錯体(1.83 g)と酢酸銅(II) (2.09 g)を加え、室温で終夜攪拌した。溶媒を減圧留去し、得られた残渣に水を加え、酢酸エチルで抽出した。有機層を1M塩酸で洗浄後、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、水、飽和食塩水で順次洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧留去し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液；ヘキサン：酢酸エチル=4:1）で精製し、1-クロロ-4-ニトロ-2-(ビニロキシ)ベンゼン(0.73 g)を薄黄色固体として得た。
製造例２７
1-フルオロ-2-メチル-4-ニトロベンゼン(3.0 g）、炭酸カリウム(5.35 g)およびDMF(30 mL)の混合物に、1,4-ジオキサ-8-アザスピロ[4.5]デカン(4.15 g)を加え、80℃で20時間撹拌した。反応液を冷却後、酢酸エチルで希釈し、水及び飽和食塩水で洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥した後、溶媒を留去し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液；クロロホルム：メタノール=100:0-100:1）で精製して、8-(2-メチル-4-ニトロフェニル)-1,4-ジオキサ-8-アザスピロ[4.5]デカン(5.13 g)を黄色固体として得た。
製造例２８
8-(2-メチル-4-ニトロフェニル)-1,4-ジオキサ-8-アザスピロ[4.5]デカン (製造例２７) (5.13 g)、エタノール(45mL)とTHF(15mL)の混合物に、5%パラジウム担持炭素(0.54 g)を加え、常圧水素雰囲気下、室温で18時間攪拌した。触媒をセライトを用いてろ別した後、ろ液を減圧留去した。得られた残渣をクロロホルムで希釈し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧留去し、4-(1,4-ジオキサ-8-アザスピロ[4.5]デカ-8-イル)-3-メチルアニリン(4.40 g)を薄紫色固体として得た。
製造例３２
アルゴン雰囲気下、ジクロロメタン（15 mL）を氷冷し、ジエチル亜鉛（5.1 mL, 1.0M n-ヘキサン溶液,）を加えた後に、トリフルオロ酢酸(0.4 mL)をゆっくり滴下し、氷冷下、30分間撹拌した。続いてジヨードメタン(0.40 mL)をゆっくり滴下し、さらに30分間撹拌した。反応液に、1-クロロ-4-ニトロ-2-(ビニロキシ)ベンゼン (製造例２６) (0.51 g)とジクロロメタン（10 mL）の混合液を滴下し、室温で終夜撹拌した。反応液に塩化アンモニウム水溶液を加え、酢酸エチルで抽出後、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧留去し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液；ヘキサン：酢酸エチル=4:1）で精製し、1-クロロ-2-(シクロプロピロキシ)-4-ニトロベンゼン(160 mg)を黄色固体として得た。
製造例５９
2-(4-メチルピペラジン-1-イル)エタノール(1.12 g)とTHF(30 mL)の混合物に、氷冷下、カリウム tert-ブトキシド(0.87 g)を加え、30分間攪拌した。反応液に1-フルオロ-2-メチル-4-ニトロベンゼン(1.0 g)とTHF(20 mL)の混合液を滴下し、室温で2時間攪拌した。反応液に水を加え、酢酸エチルで抽出後、有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧留去し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液；クロロホルム：メタノール：飽和アンモニア水=10:0:0-10:1:0.1）で精製し、1-メチル-4-[2-(2-メチル-4-ニトロフェノキシ)エチル]ピペラジン(1.42 g)を薄黄色油状物として得た。
製造例６４
2-クロロ-5-ニトロフェノール(2.0 g）、トリフェニルホスフィン(4.54 g)、2-フルオロエタノール(1.11 g)およびTHF(40 mL)の混合物に、氷冷下、アゾジカルボン酸ジエチル(7.86 mL, 2.2M in トルエン)を加え、室温で終夜攪拌した。溶媒を減圧留去し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液；ヘキサン：酢酸エチル=1:0-5:1）で精製し、1-クロロ-2-(2-フルオロエトキシ)-4-ニトロベンゼン(2.5 g)を得た。
製造例８１
1-{1-[2-(メトキシメトキシ)-4-ニトロフェニル]ピペリジン-4-イル}-4-メチルピペラジン（製造例８０） (400 mg)、THF(4 mL)およびメタノール(4 mL)の混合物に、氷冷下、濃塩酸(0.55 mL)を加えた後、60℃で終夜攪拌した。溶媒を減圧留去した後、水を加えた。析出した固体をろ取した後、乾燥し、2-[4-(4-メチルピペラジン-1-イル)ピペリジン-1-イル]-5-ニトロフェノール (280mg)を得た。
製造例９９
3-ベンジル-3,9-ジアザスピロ[5.5]ウンデカン ２塩酸塩(1.00 g)、2,2,2-トリフルオロエチル トリフルオロメタンスルホナート(1.23 mL)、炭酸水素ナトリウム(0.93 g)とエタノール(10 mL)の混合物を、80℃で終夜攪拌した。反応液を放冷後、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え塩基性とした後、クロロホルムで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後、溶媒を減圧留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液；クロロホルム：メタノール：飽和アンモニア水=10:0:0-10:1:0.1）で精製し、3-ベンジル-9-(2,2,2-トリフルオロエチル)-3,9-ジアザスピロ[5.5]ウンデカン(750 mg)を得た。
製造例１００
3-ベンジル-9-(2,2,2-トリフルオロエチル)-3,9-ジアザスピロ[5.5]ウンデカン (製造例９９) (750 mg)とメタノール(60 mL)の混合液を、連続水素化反応装置(H-Cube（登録商標）; ThalesNano製)を用い、CatCart（登録商標） 水酸化パラジウム (ThalesNano製)、流速 1 ml/min、温度50℃、圧力 50 bar条件下で反応を行った。溶媒を減圧留去し、3-(2,2,2-トリフルオロエチル)-3,9-ジアザスピロ[5.5]ウンデカン(446 mg)を得た。
製造例１２６
4,6-ジクロロ-2-(メチルスルファニル)ピリミジン-5-カルボキサミド(3.50 g)、4-(1,4-ジオキサ-8-アザスピロ[4.5]デカ-8-イル)-3-メトキシアニリン (製造例３１) (3.96 g)、N,N-ジイソプロピルエチルアミン(9.15 mL)およびジオキサン(35 mL)の混合物を、110℃で終夜攪拌した。反応液を放冷後、酢酸エチルと飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で分液操作を行った。有機層を飽和食塩水で洗浄した後、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧留去し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液；クロロホルム：メタノール：飽和アンモニア水=100:0:0-20:1:0.1）で精製し、4-クロロ-6-{[4-(1,4-ジオキサ-8-アザスピロ[4.5]デカ-8-イル)-3-メトキシフェニル]アミノ}-2-(メチルスルファニル)ピリミジン-5-カルボキサミド(6.12 g)を得た。
製造例１２９
4-クロロ-6-{[4-(1,4-ジオキサ-8-アザスピロ[4.5]デカ-8-イル)-3-メトキシフェニル]アミノ}-2-(メチルスルファニル)ピリミジン-5-カルボキサミド (製造例１２６) (6.11 g)とDMF(61 mL)の混合物に、酢酸ナトリウム(2.15 g)を加え、100℃で3.5時間攪拌した。反応液を放冷後、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、析出した固体をろ取し、5-カルバモイル-6-{[4-(1,4-ジオキサ-8-アザスピロ[4.5]デカ-8-イル)-3-メトキシフェニル]アミノ}-2-(メチルスルファニル)ピリミジン-4-イル アセテート(4.86 g)を得た。
製造例１３６
5-クロロ-6-(2-ヒドロキシプロパン-2-イル)-3-({3-メトキシ-4-[4-(4-メチルピペラジン-1-イル)ピペリジン-1-イル]フェニル}アミノ)ピラジン-2-カルボキサミド (製造例７６) (300 mg)とトリフルオロ酢酸(3 mL)の混合物に、氷冷下、トリエチルシラン(1.29 mL)を加え、氷冷で10分間、室温で終夜攪拌した。反応液を減圧濃縮した後、クロロホルムで希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水で洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥した後、溶媒を留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(溶出液；クロロホルム：メタノール：飽和アンモニア水=100:0:0-20:1:0.1)で精製し、5-クロロ-6-イソプロピル-3-({3-メトキシ-4-[4-(4-メチルピペラジン-1-イル)ピペリジン-1-イル]フェニル}アミノ)ピラジン-2-カルボキサミド(240mg)を得た。
製造例１９３
2-クロロ-5-ニトロベンゼンスルホニルクロリド(2.00 g)とTHF(5 mL)の混合物に、氷冷下、モルホリン(1.5 mL)を加え、室温で25分間攪拌した。反応液を5%塩酸水溶液中に注ぎ、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液；酢酸エチル：n-ヘキサン）にて精製し、4-[(2-クロロ-5-ニトロフェニル)スルホニル]モルホリン(1.30 g)を褐色固体として得た。
製造例２００
1-[1-(2-ヨード-4-ニトロフェニル)ピペリジン-4-イル]-4-メチルピペラジン (製造例１６８) (790 mg)、シクロプロピルボロン酸(632 mg)、ジオキサン(45 mL)および水(9 mL)の混合物に、アルゴン気流下、炭酸カリウム(2.54 g)とテトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム(850 mg)を加え、4日間加熱還流した。反応液を放冷後、水中に注ぎ、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液；クロロホルム：メタノール）で精製し、1-[1-(2-シクロプロピル-4-ニトロフェニル)ピペリジン-4-イル]-4-メチルピペラジン(439 mg)を橙色固体として得た。
製造例２２８
1-{4-[1-(2-メチル-4-ニトロフェニル)ピペリジン-4-イル]モルホリン-2-イル}メタンアミン (製造例２２９) (265 mg)とジクロロメタン(4 mL)の混合物に、氷冷下、トリエチルアミン(0.22 mL)とメタンスルホニルクロリド(0.1 mL)を加え、室温で1時間攪拌した。反応液を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液中に注ぎ、ジクロロメタンで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液；クロロホルム：メタノール）で精製し、N-({4-[1-(2-メチル-4-ニトロフェニル)ピペリジン-4-イル]モルホリン-2-イル}メチル)メタンスルホンアミド(273 mg)を黄色油状物として得た。
製造例２２９
2-({4-[1-(2-メチル-4-ニトロフェニル)ピペリジン-4-イル]モルホリン-2-イル}メチル)-1H-イソインドール-1,3(2H)-ジオン (製造例２３０) (1.17 g)、エタノール(20 mL)およびTHF(10 mL)の混合物に、ヒドラジン一水和物(0.25 mL)を加え、3.5時間加熱還流した。反応液を減圧濃縮後、得られた残渣に10 %水酸化ナトリウム水溶液とクロロホルムを加え溶解し、抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を減圧留去し、1-{4-[1-(2-メチル-4-ニトロフェニル)ピペリジン-4-イル]モルホリン-2-イル}メタンアミン(846 mg)を黄色油状物として得た。
製造例２３７
1-(2-メチル-4-ニトロフェニル)-4-[(トリメチルシリル)オキシ]-1,2,3,6-テトラヒドロピラジン (製造例２３８) (669 mg)とジクロロメタン(3 mL)の混合物に、氷冷下、炭酸水素ナトリウム(348 mg)と3-クロロ過安息香酸(658 mg)を加え、氷冷下で10分間攪拌した。反応液を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液中に注ぎ、ジクロロメタンで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液；酢酸エチル：n-ヘキサン）で精製し、3-ヒドロキシ-1-(2-メチル-4-ニトロフェニル)ピペリジン-4-オン(412 mg)を黄色固体として得た。
製造例２３８
1-(2-メチル-4-ニトロフェニル)ピペリジン-4-オン(1.00 ｇ)とジクロロメタン(5 mL)の混合物に、氷冷下、トリエチルアミン(0.9 mL)とトリメチルシリル トリフルオロメタンスルホナート(0.9 mL)を加え、室温で1時間攪拌した。反応液を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液中に注ぎ、ジクロロメタンで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液；酢酸エチル：n-ヘキサン）で精製し、1-(2-メチル-4-ニトロフェニル)-4-[(トリメチルシリル)オキシ]-1,2,3,6-テトラヒドロピラジン(669 mg)を黄色油状物として得た。
製造例２４５
1-ベンジル-3-(ヒドロキシメチル)ピペリジン-4-オン(800 mg)とジクロロメタン(8 mL)の混合物に、1-メチルピぺラジン(383 mg)を加え、室温で17時間攪拌した。次いで反応液にトリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム(810 mg)を加え、室温で6.5時間攪拌した。反応液を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液中に注ぎ、ジクロロメタンで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液；クロロホルム：メタノール）にて精製し、[1-ベンジル-4-(4-メチルピペラジン-1-イル)ピペリジン-3-イル]メタノール(534 mg)を黄色油状物として得た。
製造例２５２
1-[1-(2-ヨード-4-ニトロフェニル)ピペリジン-4-イル]-4-メチルピペラジン (製造例１６８) (578 mg)、トリエチルアミン(1.7 mL)、アクリル酸エチル(0.44 mL)およびアセトニトリル(9 mL)の混合物に、アルゴン気流下、トリ-o-トリルホスフィン(245 mg)と酢酸パラジウム(90 mg)を加え、80℃で24時間攪拌した。反応液を放冷後、水中に注ぎ、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液；クロロホルム：メタノール）で精製し、(2E)-3-{2-[4-(4-メチルピペラジン-1-イル)ピペリジン-1-イル]-5-ニトロフェニル}アクリル酸エチル(416 mg)を褐色固体として得た。
製造例２５４
1-{1-[2-(3,5-ジメチル-1,2-オキサゾール-4-イル)-4-ニトロフェニル]ピペリジン-4-イル}-4-メチルピペラジン (製造例２５５) (436 mg）、メタノール(4 mL)および水(2 mL)の混合物に、塩化アンモニウム(700 mg)と亜鉛粉末(700 mg)を加え、55℃で1.5時間攪拌した。反応液を放冷後、不溶物をセライトを用いてろ別し、ろ液を減圧留去した。得られた残渣に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、クロロホルムで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を減圧留去し、3-(3,5-ジメチル-1,2-オキサゾール-4-イル)-4-[4-(4-メチルピペラジン-1-イル)ピペリジン-1-イル]アニリン(366 mg)を黒色個体として得た。
製造例２６９
1-[1-(2-ヨード-4-ニトロフェニル)ピペリジン-4-イル]-4-メチルピペラジン (製造例１６８) (435 mg)、4-(4,4,5,5-テトラメチル-[1,3,2]ジオキサボロラン-2-イル)-3,6-ジヒドロ-2H-ピラン(634 mg)およびDMF(4 mL)の混合物に、アルゴン気流下、炭酸カリウム(210 mg)と[1,1’-ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセン]ジクロロパラジウム ジクロロメタン錯体(41 mg)を加え、90℃で20時間攪拌した。反応液を放冷後、水中に注ぎ、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液；クロロホルム：メタノール）で精製し、1-{1-[2-(3,6-ジヒドロ-2H-ピラン-4-イル)-4-ニトロフェニル]ピペリジン-4-イル}-4-メチルピペラジン(87 mg)を褐色固体として得た。
製造例３２３
1-(4-ニトロフェニル)-1,2,3,6-テトラヒドロピリジン-4-イル トリフルオロメタンスルホナート (製造例３２４) (867 mg)とジオキサン(8 mL)の混合物に、アルゴン気流下、酢酸カリウム(724 mg)、1,1’-ビス（ジフェニルホスフィノフェロセン）(41 mg)、ビス（ピナコラト）ジボロン(639 mg)および[1,1’-ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセン]ジクロロパラジウム ジクロロメタン錯体(60 mg)を順次加え、80℃で15時間攪拌した。反応液を水中に注ぎ、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液；酢酸エチル:n-ヘキサン）で精製し、1-(4-ニトロフェニル)-4-(4,4,5,5-テトラメチル-1,3,2-ジオキサボロラン-2-イル)-1,2,3,6-テトラヒドロピリジン(664 mg)を黄色固体として得た。
製造例３２４
ジイソプロピルアミン(1.5 mL)とTHF(20 mL)の混合物に、氷冷下、n-ブチルリチウム (3.8 mL, 2M n-ヘキサン溶液)を滴下し、同温度で20分間攪拌した。次いで-78 ℃に冷却後、1-(4-ニトロフェニル)ピペリジン-4-オン(2.00ｇ)とTHF(20 mL)の混合液を滴下し、同温度で30分間攪拌した。反応液にN-フェニルビス（トリフルオロメタンスルホンイミド）(3.90 g)加えた後、室温まで昇温し、14時間攪拌した。反応液を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液中に注ぎ、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液；酢酸エチル：n-ヘキサン）で精製し、1-(4-ニトロフェニル)-1,2,3,6-テトラヒドロピリジン-4-イル トリフルオロメタンスルホナート(867 mg)を黄色油状物として得た。
製造例３４３
4-(2-メトキシ-4-ニトロフェニル)ピペラジン-2-オン (製造例３４４) (364 mg)とDMF(3 mL)の混合物に、63 %油性水素化ナトリウム(70 mg)を加え、室温で1時間攪拌した。次いでヨウ化メチル(1.1 mL)を加え、室温で4時間攪拌した。反応液を飽和塩化アンモニウム水溶液中に注ぎ、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液；クロロホルム:メタノール）で精製し、4-(2-メトキシ-4-ニトロフェニル)-1-メチルピペラジン-2-オン(162 mg)を黄色油状物として得た。
製造例４０４
3-({4-[4-(2-アミノエチル)ピペラジン-1-イル]フェニル}アミノ)-5-クロロ-6-エチルピラジン-2-カルボキサミド (製造例４０５) (526 mg)とメタノール(5 mL)の混合物に、二炭酸 ジ-tert-ブチル(307 mg)を加え、室温で2時間攪拌した。溶媒を減圧留去した後、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液；クロロホルム：メタノール）で精製し、tert-ブチル [2-(4-{4-[(3-カルバモイル-6-クロロ-5-エチルピラジン-2-イル)アミノ]フェニル}ピペラジン-1-イル)エチル]カルバマート(402 mg)を赤色固体として得た。
製造例４０９
5-クロロ-3-({4-[4-(2-ヒドロキシエチル)ピペラジン-1-イル]-3-メトキシフェニル}アミノ)-6-(2-ヒドロキシプロパン-2-イル)ピラジン-2-カルボキサミド (製造例４１０) (279 mg)とジクロロメタン(2 mL)の混合物に、ピリジン(0.5 mL)と無水酢酸(0.06 mL)を加え、室温で5時間攪拌した。反応液を水中に注ぎ、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を減圧留去し、2-[4-(4-{[3-カルバモイル-6-クロロ-5-(2-ヒドロキシプロパン-2-イル)ピラジン-2-イル]アミノ}-2-メトキシフェニル)ピペラジン-1-イル]エチル アセテート(362 mg)を黄色固体として得た。
製造例４５５
3,5-ジクロロ-6-(1-ヒドロキシエチル)ピラジン-2-カルボキサミド(1.58 g)とTHF(20 mL)の混合物に、氷冷下、N,N-ジイソプロピルエチルアミン(5.0 mL)とクロロメチルメチルエーテル(2.1 mL)を加え、室温で24時間攪拌した。反応液を水中に注ぎ、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液；クロロホルム：メタノール）で精製し、3,5-ジクロロ-6-[1-(メトキシメトキシ)エチル]ピラジン-2-カルボキサミド(1.36 g)を黄白色固体として得た。
製造例４６１
4-(2-メチル-4-ニトロフェニル)-1,2,3,6-テトラヒドロピリジン(800 mg)とDMF(8 mL)の混合物に、炭酸カリウム(558 mg)と2-ブロモエタノール(0.29 mL)を加え、室温で18時間攪拌した。反応液を飽和塩化アンモニウム水溶液中に注ぎ、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を減圧留去し、2-[4-(2-メチル-4-ニトロフェニル)-3,6-ジヒドロピリジン-1(2H)-イル]エタノール(913 mg)を褐色油状物として得た。
製造例４９６
5-クロロ-3-{[4-(1,4-ジオキサスピロ[4.5]デカ-8-イル)フェニル]アミノ}-6-エチルピラジン-2-カルボキサミド (製造例４９７) (108 mg)、THF(1.5 mL)および酢酸(1.5 mL)の混合物に、5%塩酸水溶液(1 mL)を加え、80℃で2時間攪拌した。反応液を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液中に注ぎ、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を減圧留去し、5-クロロ-6-エチル-3-{[4-(4-オキソシクロヘキシル)フェニル]アミノ}ピラジン-2-カルボキサミド(89 mg)を黄色固体として得た。
上記製造例で製造した製造例化合物、及び上記製造例の方法と同様にして、それぞれ対応する原料を使用して製造した製造例化合物の化学構造を表１０〜表７５に示す。また、これら製造例化合物の製造方法及び物理化学的データを表７６〜表１０２に示す。
実施例１１
6-エチル-3-({3-メチル-4-[4-(4-メチルピペラジン-1-イル)ピペリジン-1-イル]フェニル}アミノ)-5-(ピペリジン-4-イルアミノ)ピラジン-2-カルボキサミド (実施例１４８) (100 mg)、メトキシ酢酸(19 mg)およびDMF(2 mL)の混合物に、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩(47 mg)と1-ヒドロキシ-1H-ベンゾトリアゾール一水和物(33 mg)を加え、室温にて6時間攪拌した。反応液に酢酸エチルと飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加えて分液操作を行い、有機層を無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥した。有機層を減圧濃縮し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液；クロロホルム：メタノール：飽和アンモニア水=100:0:0-100:1:0.1）で精製した。得られた粗精製物を酢酸エチルとヘキサンの混合溶媒で洗浄し、6-エチル-5-{[1-(メトキシアセチル)ピペリジン-4-イル]アミノ}-3-({3-メチル-4-[4-(4-メチルピペラジン-1-イル)ピペリジン-1-イル]フェニル}アミノ)ピラジン-2-カルボキサミド(63 mg)を薄黄色粉体として得た。
実施例１７
5-クロロ-3-({3-(シクロブチロキシ)-4-[4-(4-メチルピペラジン-1-イル)ピペリジン-1-イル]フェニル}アミノ)-6-エチルピラジン-2-カルボキサミド (製造例４８) (140 mg)、トランス-4-アミノシクロヘキサノール(153 mg)およびNMP（1-メチル-2-ピロリドン）(3 mL)の混合物を、マイクロウェーブ反応装置を用いて、190℃で30分間攪拌した。反応液に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄した後、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧留去し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(溶出液；クロロホルム：メタノール：飽和アンモニア水=100:0:0-10:1:0.1)で精製し、3-({3-(シクロブチロキシ)-4-[4-(4-メチルピペラジン-1-イル)ピペリジン-1-イル]フェニル}アミノ)-6-エチル-5-[(トランス-4-ヒドロキシシクロヘキシル)アミノ]ピラジン-2-カルボキサミド(57 mg)を黄色固体として得た。
実施例４１
6-クロロ-5-[(トランス-4-ヒドロキシシクロヘキシル)アミノ]-3-{[4-(4-オキソピペリジン-1-イル)フェニル]アミノ}ピラジン-2-カルボキサミド (実施例７１４) (950 mg)、1-メチルピペラジン(0.38 mL)、ジクロロエタン(30 mL)およびTHF(30 mL)の混合物に、トリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム(727 mg)を加え、室温で16時間攪拌した。反応液に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加えた後、クロロホルムと2-プロパノールの混合溶媒で抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を減圧留去し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液；クロロホルム：メタノール：飽和アンモニア水=100:0:0-20:1:0.1）で精製した。得られた粗精製物を酢酸エチルで洗浄し、6-クロロ-5-[(トランス-4-ヒドロキシシクロヘキシル)アミノ]-3-({4-[4-(4-メチルピペラジン-1-イル)ピペリジン-1-イル]フェニル}アミノ)ピラジン-2-カルボキサミド(312 mg)を黄色固体として得た。
実施例５５
3-({4-[4-(4-メチルピペラジン-1-イル)ピペリジン-1-イル]-3-(トリフルオロメチル)フェニル}アミノ)-5-[(1-メチルピペリジン-4-イル)アミノ]-6-(プロパ-1-エン-2-イル)ピラジン-2-カルボキサミド (実施例７１５) (144 mg)、エタノール(15 mL)およびTHF(5 mL)の混合物に、常圧水素雰囲気下、10%パラジウム担持炭素(100 mg)を加え、室温で13時間攪拌した。セライトを用いて触媒をろ別した後、溶媒を減圧留去し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液；クロロホルム：メタノール：飽和アンモニア水=100:0:0-10:1:0.1）で精製した。得られた粗精製物を酢酸エチルで洗浄し、6-イソプロピル-3-({4-[4-(4-メチルピペラジン-1-イル)ピペリジン-1-イル]-3-(トリフルオロメチル)フェニル}アミノ)-5-[(1-メチルピペリジン-4-イル)アミノ]ピラジン-2-カルボキサミド(65 mg)を淡黄色固体としてを得た。
実施例５８
60%油性水素化ナトリウム(62 mg)とTHF(5 mL)の混合物に、N-ヒドロキシアセトアミジン(128 mg)を加え、室温で15分間攪拌した。反応液にメチル 5-{[3-カルバモイル-5-エチル-6-(テトラヒドロ-2H-ピラン-4-イルアミノ)ピラジン-2-イル]アミノ}-2-[4-(4-メチルピペラジン-1-イル)ピペリジン-1-イル]ベンゾエート (実施例５７) (200 mg)とTHF（10 mL)の混合液およびモレキュラーシーブ3A(1 g)を加え、室温で30分間攪拌した後、50℃で6時間攪拌した。反応液に氷と1M塩酸(1.5 mL)を加えた後、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加えた。反応液を酢酸エチルで希釈し、モレキュラーシーブ3Aをろ別した後、分液操作を行った。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧留去した後、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液；クロロホルム：メタノール=10:0:-10:1で精製後、再度シリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液；クロロホルム：メタノール：飽和アンモニア水=100:0:0-20:1:0.1)で精製した。得られた粗精製物とメタノール(3 mL)、THF(2 mL)、１M水酸化ナトリウム水溶液(0.5 mL)の混合液を50℃で5時間攪拌した。反応液を濃縮した後、水で希釈し、析出した固体をろ取した。得られた固体をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(溶出液；クロロホルム：メタノール：飽和アンモニア水=100:0:0-10:1:0.1)で精製した。得られた粗精製物をジイソプロピルエーテルで洗浄し、6-エチル-3-({3-(3-メチル-1,2,4-オキサジアゾール-5-イル)-4-[4-(4-メチルピペラジン-1-イル)ピペリジン-1-イル]フェニル}アミノ)-5-(テトラヒドロ-2H-ピラン-4-イルアミノ)ピラジン-2-カルボキサミド(10 mg)を黄色固体として得た。
実施例５９
6-エチル-5-[(トランス-4-ヒドロキシシクロヘキシル)アミノ]-3-({3-(メトキシメトキシ)-4-[4-(4-メチルピペラジン-1-イル)ピペリジン-1-イル]フェニル}アミノ)ピラジン-2-カルボキサミド (実施例７６９) (90 mg)、THF(0.9 mL)とメタノール(0.9mL)の混合物に、氷冷下、濃塩酸(0.08 mL)を加えた後、60℃で終夜攪拌した。溶媒を減圧留去した後、水を加え、析出した固体をろ取し、6-エチル-5-[(トランス-4-ヒドロキシシクロヘキシル)アミノ]-3-({3-ヒドロキシ-4-[4-(4-メチルピペラジン-1-イル)ピペリジン-1-イル]フェニル}アミノ)ピラジン-2-カルボキサミド(33.5 ｍｇ)を得た。
実施例６８
5-[(2,4-ジメトキシベンジル)アミノ]-6-エチル-3-({3-メチル-4-[4-(4-メチルピペラジン-1-イル)ピペリジン-1-イル]フェニル}アミノ)ピラジン-2-カルボキサミド (実施例６７) (200 mg)とジクロロメタン(2 mL)の混合物に、氷冷下、トリフルオロ酢酸(2 mL)を加え1時間攪拌した。反応液に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、クロロホルムで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後、溶媒を減圧留去した。得られた残渣に酢酸エチルを加え、析出した固体をろ取し、5-アミノ-6-エチル-3-({3-メチル-4-[4-(4-メチルピペラジン-1-イル)ピペリジン-1-イル]フェニル}アミノ)ピラジン-2-カルボキサミド(104 ｍｇ)を得た。
実施例１０５
4-({3-メチル-4-[4-(4-メチルピペラジン-1-イル)ピペリジン-1-イル]フェニル}アミノ)-2-(メチルスルファニル)-6-オキソ-1,6-ジヒドロピリミジン-5-カルボキサミド (実施例７２６) (140 mg)、テトラヒドロ-2H-ピラン-4-アミン 酢酸塩(239 mg)およびNMP(2.1 mL)の混合物を、マイクロウェーブ反応装置を用いて200℃で2時間加熱した。反応液を放冷後、酢酸エチルで希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液；クロロホルム：メタノール：飽和アンモニア水=100:0:0-20:1:0.1）で精製した。得られた粗精製物をジイソプロピルエーテルで固体化し、4-({3-メチル-4-[4-(4-メチルピペラジン-1-イル)ピペリジン-1-イル]フェニル}アミノ)-6-オキソ-2-(テトラヒドロ-2H-ピラン-4-イルアミノ)-1,6-ジヒドロピリミジン-5-カルボキサミド(11.6 mg)を得た。
実施例３８３
4-{[3-メトキシ-4-(4-オキソピペリジン-1-イル)フェニル]アミノ}-1-メチル-6-オキソ-2-(テトラヒドロ-2H-ピラン-4-イルアミノ)-1,6-ジヒドロピリミジン-5-カルボキサミド (実施例７６８) (105 mg)、1-メチルピペラジン(34 mg)および1,2-ジクロロエタン(2.1 mL)の混合物に、トリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム(71 mg)を加え、室温24時間攪拌した。反応液に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液とクロロホルムを加えて分液操作を行なった。有機層を飽和食塩水で洗浄した後、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧留去した後、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液；クロロホルム：メタノール：飽和アンモニア水=100:0:0-20:1:0.1）で精製した。得られた粗精製物を酢酸エチルで洗浄し、4-({3-メトキシ-4-[4-(4-メチルピペラジン-1-イル)ピペリジン-1-イル]フェニル}アミノ)-1-メチル-6-オキソ-2-(テトラヒドロ-2H-ピラン-4-イルアミノ)-1,6-ジヒドロピリミジン-5-カルボキサミド(51 mg)を白色固体として得た。
実施例３８５
5-[(1-ベンジルピペリジン-4-イル)アミノ]-6-エチル-3-({4-[4-(4-メチルピペラジン-1-イル)ピペリジン-1-イル]フェニル}アミノ)ピラジン-2-カルボキサミド (実施例７３９) (1.89 g)、エタノール(38 mL)および酢酸(19 mL)の混合物に、水酸化パラジウム(0.96 g)を加え、常圧水素雰囲気下、室温で終夜攪拌した。触媒をろ別後、溶媒を減圧濃縮し、得られた残渣にクロロホルムと飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加えて分液操作を行った。水層に塩化ナトリウムを加えて、再度分液操作を行った。混合した有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮し、6-エチル-3-({4-[4-(4-メチルピペラジン-1-イル)ピペリジン-1-イル]フェニル}アミノ)-5-(ピペリジン-4-イルアミノ)ピラジン-2-カルボキサミド(1.08 g)を薄黄色固体として得た。
実施例３８６
6-エチル-3-({4-[4-(4-メチルピペラジン-1-イル)ピペリジン-1-イル]フェニル}アミノ)-5-(ピペリジン-4-イルアミノ)ピラジン-2-カルボキサミド (実施例３８５) (100 mg)、トリエチルアミン（0.035 mL）および1,2-ジクロロエタン(3 mL)の混合物に、氷冷下、ベンゼンスルホニルクロリド(37 mg)、同温度にて30分間攪拌した。反応液に酢酸エチルと飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加えて分液操作を行い、有機層を無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥した。有機層を減圧濃縮し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液；クロロホルム：メタノール：飽和アンモニア水=100:0:0-100:1:0.1）で精製した。得られた粗精製物を酢酸エチルとヘキサンの混合溶媒で洗浄し、6-エチル-3-({4-[4-(4-メチルピペラジン-1-イル)ピペリジン-1-イル]フェニル}アミノ)-5-{[1-(フェニルスルホニル)ピペリジン-4-イル]アミノ}ピラジン-2-カルボキサミド (99 mg)を薄黄色粉体として得た。
実施例４２３
3-({3-フルオロ-4-[4-(2-ヒドロキシエチル)ピペラジン-1-イル]フェニル}アミノ)-6-イソプロピル-5-(テトラヒドロ-2H-ピラン-4-イルアミノ)ピラジン-2-カルボキサミド (実施例４２１) (80 mg)とジクロロメタン(1 mL)の混合物に、ピリジン(0.02 mL)と無水酢酸(0.03 mL)を加え、室温で1.5時間攪拌した。反応液を水中に注ぎ、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を減圧留去し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液；クロロホルム：メタノール）で精製し、2-[4-(4-{[3-カルバモイル-5-イソプロピル-6-(テトラヒドロ-2H-ピラン-4-イルアミノ)ピラジン-2-イル]アミノ}-2-フルオロフェニル)ピペラジン-1-イル]エチル アセテート(42 mg)を黄色固体として得た。
実施例４５０
2-[4-(4-{[3-カルバモイル-5-イソプロピル-6-(テトラヒドロ-2H-ピラン-4-イルアミノ)ピラジン-2-イル]アミノ}-2-メトキシフェニル)ピペリジン-1-イル]エチル アセテート (実施例８３１) (60 mg)とメタノール(2 mL)の混合物に、炭酸カリウム(20 mg)を加え、室温で4時間攪拌した。反応液を減圧濃縮した後、酢酸エチルで希釈し、水中に注ぎ抽出操作を行った。有機層を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧留去した。得られた残渣を酢酸エチルとジエチルエーテルの混合溶媒で洗浄し、3-({4-[1-(2-ヒドロキシエチル)ピペリジン-4-イル]-3-メトキシフェニル}アミノ)-6-イソプロピル-5-(テトラヒドロ-2H-ピラン-4-イルアミノ)ピラジン-2-カルボキサミド(40 mg)を橙色固体として得た。
実施例５４５
1-エチル-2-(イソプロピルアミノ)-4-{[3-メチル-4-(4-オキソピペリジン-1-イル)フェニル]アミノ}-6-オキソ-1,6-ジヒドロピリミジン-5-カルボキサミド (実施例７５５) (5.3 g)とジクロロエタン(106 mL)の混合物に、1-メチルピペラジン(2.05 mL)を加え、室温で30分間攪拌した後、トリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム(3.95 g)を加え、室温で終夜攪拌した。反応液にクロロホルムと飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、分液操作を行った。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムを用いて乾燥した後、溶媒を減圧濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液；クロロホルム：メタノール：飽和アンモニア水）で精製し、1-エチル-2-(イソプロピルアミノ)-4-({3-メチル-4-[4-(4-メチルピペラジン-1-イル)ピペリジン-1-イル]フェニル}アミノ)-6-オキソ-1,6-ジヒドロピリミジン-5-カルボキサミド (実施例４３８) (5.16 g)と1-エチル-4-{[4-(4-ヒドロキシピペリジン-1-イル)-3-メチルフェニル]アミノ}-2-(イソプロピルアミノ)-6-オキソ-1,6-ジヒドロピリミジン-5-カルボキサミド (実施例５４５) (69 mg)を得た。
実施例５７３
6-クロロ-5-(イソプロピルアミノ)-3-{[4-(ピペリジン-4-イル)フェニル]アミノ}ピラジン-2-カルボキサミド (実施例７７５) (140 mg)、エタノール(4 mL)およびTHF(4 mL)の混合物に、1H-ベンゾトリアゾール-1-イルメタノール (56 mg)を加え、室温で2時間攪拌した後、トリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム(114 mg)を加え、室温で6時間攪拌した。反応液にクロロホルムと飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、分液操作を行った。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥した後、溶媒を減圧留去し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液；クロロホルム：メタノール：飽和アンモニア水=100:0:0-20:1:0.1）で精製した。得られた粗精製物を酢酸エチルとジイソプロピルエーテルの混合液で洗浄し、6-クロロ-5-(イソプロピルアミノ)-3-{[4-(1-メチルピペリジン-4-イル)フェニル]アミノ}ピラジン-2-カルボキサミド(50mg)を薄い黄色固体として得た。
実施例６１２
1-エチル-2-(イソプロピルアミノ)-4-{[3-メチル-4-(ピペラジン-1-イル)フェニル]アミノ}-6-オキソ-1,6-ジヒドロピリミジン-5-カルボキサミド (実施例８０４) (200 mg)、ヨウ化メチル(70 mg)およびDMF(2 mL)の混合物に、炭酸カリウム(100 mg)を加え、室温で2時間攪拌した。反応液に酢酸エチルと水を加え、分液操作を行った。有機層を飽和食塩水で洗浄した後、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧留去し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液；クロロホルム：メタノール：飽和アンモニア水）で精製し、1-エチル-2-(イソプロピルアミノ)-4-{[3-メチル-4-(4-メチルピペラジン-1-イル)フェニル]アミノ}-6-オキソ-1,6-ジヒドロピリミジン-5-カルボキサミド(39 mg)を得た。
実施例６４７
酢酸パラジウム(2.2mg)、2,2'-ビス(ジフェニルホスフィノ)-1,1'-ビナフタレン(9.3 mg)、炭酸セシウム(13.0 mg)およびTHF(0.1 mL)の混合物を、アルゴン雰囲気下、室温にて30分間撹拌した後、3-[(3-ブロモフェニル)アミノ]-6-エチル-5-[(4-ヒドロキシシクロヘキシル)アミノ]ピラジン-2-カルボキサミド (実施例７０７) (9.5 mg)、チオモルホリン 1,1-ジオキシド(9.5 mg)およびTHF（0.1 mL）の混合物を加え、70℃で一晩撹拌した。室温に冷却後、クロロホルムと水を加えて分液操作を行った。有機層を減圧留去し、得られた残渣をHPLC（カラム：サンファイア（SunFire；登録商標） C18 5μm 19mmｘ100mm、溶媒：MeOH/0.1% HCOOH-H2O = 10/90 (0 min) - 10/90 (1 min) -95/5 (9 min) - 95/5 (12 min)、流速：25 mL/min）にて分取精製を行い、3-{[3-(1,1-ジオキシドモルホリン-4-イル)フェニル]アミノ}-6-エチル-5-[(4-ヒドロキシシクロヘキシル)アミノ]ピラジン-2-カルボキサミド(1.0 mg)を得た。
実施例６５１
5-クロロ-6-エチル-3-({3-メチル-4-[4-(4-メチルピペラジン-1-イル)ピペリジン-1-イル]フェニル}アミノ)ピラジン-2-カルボキサミド (製造例５２０) (11.8 mg)、シクロペンチルアミン(6.0 mg)およびNMP(0.6 mL)の混合物を、マイクロウェーブ反応装置を用いて、190℃で30分間攪拌した。室温に冷却後、有機層を減圧留去し、得られた残渣をHPLC（カラム：サンファイア（SunFire；登録商標） C18 5μm 19mmｘ100mm、溶媒：MeOH/0.1% HCOOH-H2O = 10/90 (0 min) - 10/90 (1 min) -95/5 (9 min) - 95/5 (12 min)、流速：25 mL/min）にて分取精製を行い、5-(シクロペンチルアミノ)-6-エチル-3-({3-メチル-4-[4-(4-メチルピペラジン-1-イル)ピペリジン-1-イル]フェニル}アミノ)ピラジン-2-カルボキサミド(3.0 mg)を得た。
実施例７１２
3-{[4-(1,4-ジオキサ-8-アザスピロ[4.5]デカ-8-イル)フェニル]アミノ}-5-[(トランス-4-ヒドロキシシクロヘキシル)アミノ]ピラジン-2-カルボキサミド (実施例７１１) (1.00 g)とクロロホルム(50 mL)の混合物に、N-ブロモコハク酸イミド(399 mg)を加え、室温で1時間攪拌した。反応液にシリカゲル(10 g)を加え溶媒を減圧留去した後、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(溶出液；クロロホルム：メタノール=100:0:0-30:1)で精製し、6-ブロモ-3-{[4-(1,4-ジオキサ-8-アザスピロ[4.5]デカ-8-イル)フェニル]アミノ}-5-[(トランス-4-ヒドロキシシクロヘキシル)アミノ]ピラジン-2-カルボキサミド(0.46 g)を黄色アモルファスとして得た。
実施例７１３
3-{[4-(1,4-ジオキサ-8-アザスピロ[4.5]デカ-8-イル)フェニル]アミノ}-5-[(トランス-4-ヒドロキシシクロヘキシル)アミノ]ピラジン-2-カルボキサミド (実施例７１１) (1.30 g)とクロロホルム(65 mL)の混合物に、N-クロロコハク酸イミド(389 mg)を加え、60℃で1時間攪拌した。反応液を放冷後、シリカゲル(10 g)を加え溶媒を減圧留去した後、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(溶出液；クロロホルム：メタノール=100:0:0-10:1)で精製し、6-クロロ-3-{[4-(1,4-ジオキサ-8-アザスピロ[4.5]デカ-8-イル)フェニル]アミノ}-5-[(トランス-4-ヒドロキシシクロヘキシル)アミノ]ピラジン-2-カルボキサミド(1.15 g)を黄色アモルファスとして得た。
実施例７１４
6-クロロ-3-{[4-(1,4-ジオキサ-8-アザスピロ[4.5]デカ-8-イル)フェニル]アミノ}-5-[(トランス-4-ヒドロキシシクロヘキシル)アミノ]ピラジン-2-カルボキサミド (実施例７１３) (1.15 g)、酢酸(10 mL)および水(10 mL)の混合物に濃塩酸(1 mL)を加え、80℃で14時間攪拌した。反応液を放冷後、酢酸エチルで希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を少しずつ加え中和した。反応液の分液操作を行った後、有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧留去し、6-クロロ-5-[(トランス-4-ヒドロキシシクロヘキシル)アミノ]-3-{[4-(4-オキソピペリジン-1-イル)フェニル]アミノ}ピラジン-2-カルボキサミド (950 mg)を黄色固体として得た。
実施例７２１
6-ブロモ-3-{[4-(1,4-ジオキサ-8-アゾスピロ[4.5]デカ-8-イル)フェニル]アミノ}-5-[(トランス-4-ヒドロキシシクロヘキシル)アミノ]ピラジン-2-カルボキサミド (実施例７１２) (462 mg)、シクロプロピルホウ酸(145 mg)、テトラキストリフェニルホスフィンパラジウム(195 mg)、炭酸カリウム(583 mg)、ジオキサン(23 mL)および水(4.5 mL)の混合物を115℃にて終夜攪拌した。反応液を放冷後、クロロホルム、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水にて分液操作を行った。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥後、減圧濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液；クロロホルム：メタノール=10:0-10:1）で精製し、6-シクロプロピル-3-{[4-(1,4-ジオキサ-8-アザスピロ4.5]デカ-8-イル)フェニル]アミノ}-5-[(トランス-4-ヒドロキシシクロヘキシル)アミノ]ピラジン-2-カルボキサミド(290 mg)を得た。
実施例７３８
5-カルバモイル-6-{[4-(1,4-ジオキサ-8-アザスピロ[4.5]デカ-8-イル)-3-メトキシフェニル]アミノ}-2-(メチルスルファニル)ピリミジン-4-イル アセテート (実施例１２９) (4.86 g)、エタノール(50 mL)およびTHF(50 mL)の混合物に、1M水酸化ナトリウム水溶液(19.9 mL)を加え、室温で5時間攪拌した。1M塩酸(19.9 mL)を加え、更に水(200 mL)を加えた後、溶媒を減圧濃縮した。析出した固体をろ取し、4-{[4-(1,4-ジオキサ-8-アザスピロ[4.5]デカ-8-イル)-3-メトキシフェニル]アミノ}-2-(メチルスルファニル)-6-オキソ-1,6-ジヒドロピリミジン-5-カルボキサミド(4.07 g)を得た。
実施例７４２
4-{[4-(1,4-ジオキサ-8-アザスピロ[4.5]デカ-8-イル)-3-メチルフェニル]アミノ}-6-オキソ-2-(テトラヒドロ-2H-ピラン-4-イルアミノ)-1,6-ジヒドロピリミジン-5-カルボキサミド (実施例７４０) (740 mg)、炭酸カリウム(317 mg)およびDMF(7.4 mL)の混合物に、ヨウ化エチル(0.19 mL)を加え、室温で25時間攪拌した。反応液に水、酢酸エチル、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、抽出操作を行った。有機層を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧留去した後、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液；クロロホルム：メタノール：飽和アンモニア水=100:0:0-40:1:0.1）で精製し、4-{[4-(1,4-ジオキサ-8-アザスピロ[4.5]デカ-8-イル)-3-メチルフェニル]アミノ}-1-エチル-6-オキソ-2-(テトラヒドロ-2H-ピラン-4-イルアミノ)-1,6-ジヒドロピリミジン-5-カルボキサミド(416 mg)を薄黄色固体として得た。
実施例７６８
4-{[4-(1,4-ジオキサ-8-アザスピロ[4.5]デカ-8-イル)-3-メトキシフェニル]アミノ}-1-メチル-6-オキソ-2-(テトラヒドロ-2H-ピラン-4-イルアミノ)-1,6-ジヒドロピリミジン-5-カルボキサミド (実施例７６７) (296 mg)と酢酸(6 mL)と水(6 mL)と濃塩酸(0.24 mL)の混合液を、80℃で終夜攪拌した。反応液に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液と酢酸エチルを加えて分液操作を行った。有機層を飽和食塩水で洗浄した後、無水硫酸マグネシウムを用いて乾燥した。溶媒を減圧留去した後、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液；クロロホルム：メタノール：飽和アンモニア水=100:0:0-40:1:0.1）で精製し、4-{[3-メトキシ-4-(4-オキソピペリジン-1-イル)フェニル]アミノ}-1-メチル-6-オキソ-2-(テトラヒドロ-2H-ピラン-4-イルアミノ)-1,6-ジヒドロピリミジン-5-カルボキサミド(240 mg)を得た。
実施例８０４
tert-ブチル 4-(4-{[5-カルバモイル-1-エチル-2-(イソプロピルアミノ)-6-オキソ-1,6-ジヒドロピリミジン-4-イル]アミノ}-2-メチルフェニル)ピペラジン-1-カルボキシラート (実施例８０３) (510 mg)とジクロロメタン(2.5 mL)の混合物に、氷冷下、トリフルオロ酢酸(2.5 mL)を加え、室温で2時間反応させた。反応液を減圧濃縮した後、得られた残渣に水、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を順次加えた。析出した固体をろ取し、1-エチル-2-(イソプロピルアミノ)-4-{[3-メチル-4-(ピペラジン-1-イル)フェニル]アミノ}-6-オキソ-1,6-ジヒドロピリミジン-5-カルボキサミド(359 mg)を得た。
実施例８８４
tert-ブチル 4-(4-{[5-カルバモイル-1-エチル-6-オキソ-2-(テトラヒドロ-2H-ピラン-4-イルアミノ)-1,6-ジヒドロピリミジン-4-イル]アミノ}-2-メチルフェニル)ピペリジン-1-カルボキシラート (実施例８８３) (835 mg)とジクロロメタン(4.2 mL)の混合物に、氷冷下トリフルオロ酢酸(1.9 mL)を加え、室温で2時間攪拌した。溶媒を減圧濃縮した後、得られた残渣にメタノール(4mL)を加えた後、0.4M炭酸カリウム水溶液（50 mL)を加え、室温で30分間攪拌した。析出した固体を固体をろ取、乾燥し、1-エチル-4-{[3-メチル-4-(ピペリジン-4-イル)フェニル]アミノ}-6-オキソ-2-(テトラヒドロ-2H-ピラン-4-イルアミノ)-1,6-ジヒドロピリミジン-5-カルボキサミド (622 mg)を白色固体として得た。
上記実施例で製造した実施例化合物、及び上記実施例の方法と同様にして、それぞれ対応する原料を使用して製造した実施例化合物の化学構造を表１０３〜表２２８に示す。また、これら実施例化合物の製造方法及び物理化学的データを表２２９〜表２４４に示す。
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以下、表２４５〜表２６８に本発明の別の化合物の構造を示す。これらは、上記の製造法や実施例記載の方法、及び当業者にとって自明である方法、又はこれらの変法を用いることにより合成されたか、合成することができる。
なお、表中の記号は以下の意味を示す。
No：化合物番号、
-R11及び-R12:一般式中の置換基、nBu：ノルマルブチル、2Py：2-ピリジル、3Py：3-ピリジル、4Py：4-ピリジル。
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式（Ｉ）の化合物又はその塩は、EML4-ALK融合タンパクのキナーゼ活性の阻害活性、並びに、EML4-ALK融合タンパク依存的な細胞の増殖抑制活性を有し、癌、ある態様としては、肺癌、別の態様としては、非小細胞肺癌若しくは小細胞肺癌、また別の態様としては、ALK融合ポリヌクレオチド陽性の癌、さらに別の態様としては、ALK融合ポリヌクレオチド陽性の肺癌、さらに別の態様としては、ALK融合ポリヌクレオチド陽性の非小細胞肺癌、さらに別の態様としては、ALK融合タンパク陽性の癌、さらに別の態様としては、ALK融合タンパク陽性の肺癌、さらに別の態様としては、ALK融合タンパク陽性の非小細胞肺癌、さらに別の態様としては、EML4-ALK融合ポリヌクレオチド陽性の癌、さらに別の態様としては、EML4-ALK融合ポリヌクレオチド陽性の肺癌、さらに別の態様としては、EML4-ALK融合ポリヌクレオチド陽性の非小細胞肺癌、さらに別の態様としては、EML4-ALK融合タンパク陽性の癌、さらに別の態様としては、EML4-ALK融合タンパク陽性の肺癌、さらに別の態様としては、EML4-ALK融合タンパク陽性の非小細胞肺癌等の予防及び／又は治療用医薬組成物の有効成分として使用できる。
以下の配列表の数字見出し<223>は、「Artificial Sequence」の説明を記載する。具体的には、配列表の配列番号5〜10の配列で表される各塩基配列は、人工的に合成したプライマー配列である。

Claims (10)

  1. 式（Ｉ）の化合物又はその塩。
    Figure 2014005206
     （式中、
    Qは、C(R4)又はNであり、
    Lは、N(R5)又はSであり、
    -X-は、-N=C(R6)-又は-C(=O)-N(R7)-であり、
    R1は、-H又はハロゲンであり、
    R2は、G1群から選択される1以上の基で置換されていてもよいシクロアルキル、G1群から選択される1以上の基で置換されていてもよい非芳香族へテロ環、G2群から選択される1以上の基で置換されていてもよい低級アルキル、又はR00で置換されていてもよい芳香族へテロ環であり、
    QがC(R4)である場合、R3及びR4のいずれか一方は、(i)-W-Y-Zで示される基、(ii)-W-Vで示される基、(iii)-NR00 2、(iv)R00又は-OHで置換されていてもよい二環式飽和へテロ環、又は(v)オキソで置換されていてもよいシクロアルキルであり、R3及びR4の残りの一方は、-H、-OH、ハロゲン、R00、シクロアルキル、芳香族へテロ環、-O-R00、-C(=O)-O-R00、-O-RZ、-O-シクロアルキル、-O-R00で置換されていてもよいフェニル、-S02-R00、-SO2-(非芳香族へテロ環)、-SO2-NH-(シクロアルキル)、-C(=O)-O-R00で置換されていてもよい低級アルケニル、-O-RD、非芳香族へテロ環、-NH2、又はシアノであり、
    QがNである場合、R3は、(i)-W-Y-Zで示される基、(ii)-W-Vで示される基、(iii)-NR00 2、(iv)R00又は-OHで置換されていてもよい二環式飽和へテロ環、又は(v)オキソで置換されていてもよいシクロアルキルであり、
    R5は、-H又は低級アルキルであり、
    LがN(R5)である場合、Lは、R2と一体となって、G1群から選択される1以上の基で置換されていてもよい環状アミノを形成してもよく、
    R6は、-H、ハロゲン、R00、RD、シクロアルキル、RZ、又は-(低級アルキレン)-O-RZであり、
    R7は、-H、R00、又はシクロアルキルであり、
    Vは、式（ＩＩ）又は式（ＩＩＩ）の基であり、
    Figure 2014005206
     （式中、
    -A-は、-(CH2)n-であり、
    nは、それぞれ同一又は異なって、1又は2であり、
    R8は、R00又はベンジルであり、
    Tは、CH又はNである。）
    -W-は、結合、又は、それぞれOHで置換されていてもよい、シクロヘキサン-1,4-ジイル、ピロリジン-1,2-ジイル、ピロリジン-1,3-ジイル、ピペリジン-1,3-ジイル、ピペリジン-1,4-ジイル、若しくはピペラジン-1,4-ジイルであり、
    -Y-は、結合、-O-(低級アルキレン)-、低級アルキレン、-O-、又は-NH-であり、
    Zは、G3群から選択される1以上の基で置換されていてもよい非芳香族へテロ環であり、
    G1群は、ベンジル、-OH、-NR00 2、-C(=O)-O-R00、-C(=O)-NR00 2、-C(=O)-NH-R00、-O-R00、R00、-C(=O)-RZ、シクロアルキル、-NH2、-NH-C(=O)-R00、-NH-SO2-R00、-NH-RZ、-NH-R00、-SO2-フェニル、-C(=O)-R00、-C(=O)-フェニル、-SO2-R00、-C(=O)-(シアノで置換されていてもよいシクロアルキル)、オキソ、RZ、-S-R00、非芳香族へテロ環、ハロゲン、及び-O-ベンジルからなる群であり、
    G2群は、1以上の-O-R00で置換されていてもよいフェニル、-OH、G1群から選択される1以上の基で置換されていてもよいシクロアルキル、G1群から選択される1以上の基で置換されていてもよい非芳香族へテロ環、-O-R00、ハロゲン、-NR00 2、及び-C(=O)-NH-R00からなる群であり、
    G3群は、R00、-C(=O)-O-R00、シクロアルキル、RZ、-OH、オキソ、-NH-RZ、-NH-R00、-NR00 2、R00で置換されていてもよりフェニル、-C(=O)-R00、-SO2-R00、ハロゲン、-N(RZ)-C(=O)-R00、-N(R00)-C(=O)-R00、-NRZ 2、-N(R00)-RZ、-N(RZ)-C(=O)-O-R00、-N(R00)-C(=O)-O-R00、-NH2、及び-NH-C(=O)-O-R00からなる群であり、
    R00は、1以上のハロゲンで置換されていてもよい低級アルキルであり、
    RZは、シアノ、-NH-SO2-R00、-C(=O)-O-R00、-SO2-R00、-O-C(=O)-R00、-NH-C(=O)-O-R00、シクロアルキル、-OH、-O-R00、-NH2、-NH-R00、及び-NR00 2からなる群より選択される1以上の基で置換されており、更に1以上のハロゲンで置換されていてもよい低級アルキルであり、
    RDは、1以上のハロゲンで置換されていてもよい低級アルケニルである。）
  2. -X-が-C(=O)-N(R7)-であり、R7がR00又はシクロアルキルである、請求項１記載の化合物又はその塩。
  3. QがC(R4)であり、LがN(R5)であり、R5が-Hであり、R1が-Hであり、R3が-W-Y-Zで示される基であり、R5が-Hである、請求項２記載の化合物又はその塩。
  4. R7が低級アルキルである、請求項３記載の化合物又はその塩。
  5. R2が-OH、G1群から選択される1以上の基で置換されていてもよいシクロアルキル、G1群から選択される1以上の基で置換されていてもよい非芳香族へテロ環、-O-R00、ハロゲン、-NR00 2、及び-C(=O)-NH-R00からなる群より選択される1以上の基で置換されていてもよい低級アルキルである、請求項１記載の化合物又はその塩。
  6. QがC(R4)であり、LがN(R5)であり、R5が-Hであり、R1が-Hであり、R3が-W-Y-Zで示される基であり、R5が-Hである、請求項５記載の化合物又はその塩。
  7. -X-が-N=C(R6)-であり、R6がハロゲン又は低級アルキルである、請求項６記載の化合物又はその塩。
  8. LがSである、請求項１記載の化合物又はその塩。
  9. -X-が-N=C(R6)-であり、R6がハロゲン又は低級アルキルであり、R2がG2群から選択される1以上の基で置換されていてもよい低級アルキルである、請求項１記載の化合物又はその塩。
  10. 5-(tert-ブチルアミノ)-6-エチル-3-({3-メトキシ-4-[4-(4-メチルピペラジン-1-イル)ピペリジン-1-イル]フェニル}アミノ)ピラジン-2-カルボキサミド、
    6-エチル-5-{[(2R)-1-ヒドロキシプロパン-2-イル]アミノ}-3-({3-メチル-4-[4-(4-メチルピペラジン-1-イル)ピペリジン-1-イル]フェニル}アミノ)ピラジン-2-カルボキサミド、
    6-エチル-3-{[3-フルオロ-4-(1-メチルピペリジン-4-イル)フェニル]アミノ}-5-(テトラヒドロ-2H-ピラン-4-イルアミノ)ピラジン-2-カルボキサミド、
    3-({3-フルオロ-4-[4-(4-メチルピペラジン-1-イル)ピペリジン-1-イル]フェニル}アミノ)-6-イソプロピル-5-(イソプロピルアミノ)ピラジン-2-カルボキサミド、
    1-エチル-2-(イソプロピルアミノ)-4-({3-メチル-4-[4-(4-メチルピペラジン-1-イル)ピペリジン-1-イル]フェニル}アミノ)-6-オキソ-1,6-ジヒドロピリミジン-5-カルボキサミド、
    6-クロロ-5-[(1-ヒドロキシ-2-メチルプロパン-2-イル)アミノ]-3-{[3-メチル-4-(1-メチルピペリジン-4-イル)フェニル]アミノ}ピラジン-2-カルボキサミド、
    1-エチル-2-(イソプロピルアミノ)-4-{[3-メチル-4-(4-メチルピペラジン-1-イル)フェニル]アミノ}-6-オキソ-1,6-ジヒドロピリミジン-5-カルボキサミド、又は
    1-エチル-4-{[3-フルオロ-4-(1-メチルピペリジン-4-イル)フェニル]アミノ}-2-(イソプロピルアミノ)-6-オキソ-1,6-ジヒドロピリミジン-5-カルボキサミドである、請求項１記載の化合物又はその塩。
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