JP2014100672A - 脂質二重膜の形成方法及びそのための器具 - Google Patents
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Abstract
【課題】脂質二重膜が壊れた場合に、容易に脂質二重膜を再生することができる、脂質二重膜の形成方法及びそのための器具を提供すること。
【解決手段】脂質二重膜の形成方法は、脂質一重膜で囲包された液滴を、脂質一重膜で囲包された他の液滴と機械的な外力で接触させ、その接触面に脂質二重膜を形成することを含む。脂質一重膜で囲包された２個の液滴は、例えば、脂質一重膜で囲包された液滴を外力により複数の液滴に分割し、生じた液滴に一重膜を再生させ、脂質一重膜で囲包された複数の分割液滴を生成させることにより得られたものでもよい。
【選択図】 図１
【解決手段】脂質二重膜の形成方法は、脂質一重膜で囲包された液滴を、脂質一重膜で囲包された他の液滴と機械的な外力で接触させ、その接触面に脂質二重膜を形成することを含む。脂質一重膜で囲包された２個の液滴は、例えば、脂質一重膜で囲包された液滴を外力により複数の液滴に分割し、生じた液滴に一重膜を再生させ、脂質一重膜で囲包された複数の分割液滴を生成させることにより得られたものでもよい。
【選択図】 図１
Description
本発明は、脂質二重膜の形成方法及びそのための器具に関する。
生物を構成する細胞や、細胞内に存在するミトコンドリア、ゴルジ体、小胞体等の各種オルガネラ、細胞核等は、外側が生体膜で覆われており、この生体膜は、基本的に脂質二重膜から構成されている。生理活性を有する様々なタンパク質、すなわち、レセプターや酵素等がこの脂質二重膜を貫通する形で脂質二重膜上に保持されている。これらの膜貫通タンパク質は、生体内で重要な役割を果たしている。特に、細胞膜上に存在する各種レセプターは、生体内に存在するリガンドと結合することにより、様々な生理学的反応を引き起こす引き金になることがわかっている。このため、レセプターの機能を亢進する各種リガンドや、レセプターの機能を阻害する阻害剤等が医薬品として用いられており、また、新たな医薬品として利用可能な天然又は人工のリガンドや阻害剤が研究されている。
これらの膜貫通タンパク質や、そのリガンド、阻害剤等を開発するためには、生体内と同じ状態、すなわち、膜貫通タンパク質が生体膜に保持された状態で各種測定を行うことが望まれる。脂質二重膜の形成方法として、浅い円筒状の凹部（ウェル）を２個隣接して配置し、かつ、２個のウェルが互いに接する境界部分を空隙（一辺数mm程度）としたダブルウェルチャンバーを用いる方法が知られている（非特許文献１〜３）。この方法は、このダブルウェルチャンバーの各ウェルに脂質溶液を充填し、次いで、各ウェルに水系緩衝液を添加して脂質溶液中に緩衝液の液滴を形成させると、ウェルの境界部分で脂質溶液と緩衝液との界面が形成され、この部分に脂質二重膜が形成されることを利用するものである。
本願発明者らは、さらに、従来の脂質二重膜の形成方法に比べて、脂質二重膜をより高い再現性で形成することができ、形成された脂質二重膜をより安定的に維持する方法として、孔径が１μｍ未満の透孔を有する自己支持性フィルムの透孔に脂質二重膜を形成する方法（特許文献１）や、孔径が５００ nm〜５００μmの１個又は複数の貫通孔を有する隔壁を介して隔てられた２つのウェルのそれぞれに脂質二重膜形成性脂質溶液を添加し、各ウェルに水系緩衝液を添加して脂質溶液中に緩衝液の液滴を形成させ、この状態で放置して、貫通孔の部分に脂質二重膜を形成する方法（特許文献２）を開発している。
K. Funakoshi et al., Anal. Chem. 2006, 78, 8169-8174
J. Poulos et al., J. Schmidt Biosens. Bioelectron. 2009, 24, 1806-1810
G. Maglia et al., Nat. Nanotech. 2009, 4, 437-440
公知の方法では、脂質二重膜が壊れた場合には、そのシステムで再生することは困難であるという問題がある。また、脂質二重膜に接する液滴を交換することが困難である。
従って、本発明の目的は、脂質二重膜が壊れた場合に、容易に脂質二重膜を再生することができる、脂質二重膜の形成方法及びそのための器具を提供することである。また、本発明の目的は、脂質二重膜に接する液滴を容易に交換することができる、脂質二重膜の形成方法及びそのための器具を提供することである。
本願発明者らは、鋭意研究の結果、脂質一重膜で囲包された液滴を外力により分割し、生じた液滴に一重膜を再生させ、脂質一重膜で囲包された複数の分割液滴を生成させ、得られた分割液滴の少なくとも１個を、同様に生成させた他の分割液滴と接触させ、その接触面に脂質二重膜を形成することにより、脂質二重膜に接する液滴を容易に交換することができ、また、脂質二重膜が壊れた場合には、容易に脂質二重膜を再生することができることを見出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、脂質一重膜で囲包された液滴を、脂質一重膜で囲包された他の液滴と機械的な外力で接触させ、その接触面に脂質二重膜を形成することを含む、脂質二重膜の形成方法を提供する。特に好ましい実施形態では、本発明は、脂質一重膜で囲包された液滴を外力により複数の液滴に分割し、生じた液滴に一重膜を再生させ、脂質一重膜で囲包された複数の分割液滴を生成させる工程と、得られた分割液滴の少なくとも１個を、同様に生成させた他の分割液滴と接触させ、その接触面に脂質二重膜を形成する工程とを含む、上記本発明の脂質二重膜の形成方法を提供する。
また、本発明は、周縁部に複数の凹部を有する回転可能な円板であって、各凹部は、水平方向の外側に向かって開口している円板と、前記円板に外接する固定板であって、その内周縁部に、前記複数の凹部にそれぞれ接する位置に複数の凹部を有し、各凹部は、水平方向の内側に向かって開口している固定板とを具備し、前記円板内の各凹部の開口部と、前記固定板内の各凹部の開口部を位置合わせすることによりそれぞれ１個の凹部が形成される、脂質二重膜形成器具を提供する。
さらに本発明は、凹部を有する基板と、該凹部の一部分を被覆する液滴スプリッターとを具備し、該液滴スプリッターは、鉛直方向の壁により囲包されて成り、互いに分断可能な複数のセパレーターを含み、各セパレーターは、鉛直方向に延びる、対向する一対の壁を具備し、該セパレーターのうちの少なくとも一部は、前記凹部の、液滴スプリッターにより被覆されていない領域上まで水平方向にスライド可能である、脂質二重膜形成器具を提供する。
本発明により、脂質二重膜が壊れた場合には、容易に脂質二重膜を再生することができる、脂質二重膜の形成方法及びそのための器具が初めて提供された。また、組成の異なる別の液滴を分割した分割液滴同士を接触させる場合には、本発明の方法により脂質二重膜に接する液滴を容易に交換することができる。
上記の通り、本発明の好ましい実施形態の方法では、先ず、脂質一重膜で囲包された液滴を形成する。脂質一重膜で囲包された液滴は、周知の方法に従い、容易に形成することができる。例えば、脂質二重膜形成性脂質溶液に水又は水溶液を添加することにより容易に脂質一重膜を形成することができる。ここで、脂質二重膜形成性脂質としては、リポソームの作製に用いられている周知のリン脂質でよく、生体膜における反応を模するためには、生体膜と同じか類似したものが好ましく、この分野において従来から広く用いられているリン脂質、例えば、ジフィタノイルフォスファチジルコリン(diphytanoyl phosphatidylcholine, DPhPC)、ジパルミトイルフォスファチジルコリン(dipalmytoyl phosphatidylcholine)、パルミトイルオレオイルフォスファチジルコリン(1-Palmitoyl 2-Oleoyl phosphatidylcholine, POPC)、ジオレオイルフォスファチジルコリン(Dioleoyl phosphatidylcholine, DOPC)等を好ましい例として挙げることができる。これらの多くは市販されているので、市販品を好ましく用いることができる。脂質二重膜の形成に用いられる溶液中のリン脂質の濃度は、脂質二重膜が形成可能な濃度であれば特に限定されないが、通常、5g/L〜30g/L程度、好ましくは10g/L〜20g/L程度である。また、リン脂質溶液の溶媒は、特に限定されないが、有機溶媒が好ましく、n-デカンのような脂肪族炭化水素溶媒が好ましい。なお、脂質一重膜により囲包される液滴は、公知の方法又は本発明の方法により形成された脂質二重膜が壊れることにより生じたものであってもよい。この場合には、壊れた脂質二重膜を、本発明の方法により容易に再生することができる。
次に、脂質一重膜で囲包された液滴を外力により複数の液滴に分割する。好ましい分割の方法の具体例は後述する。３個以上の液滴に分割することもできるが、２個の液滴に分割することが簡便であり、後述するスピン型の本発明の器具を用いて容易に行うことができるので好ましい。もっとも、後述するスライド型の本発明の器具を用いれば、液滴を３個以上に容易に分割することも可能である。分割した液滴は、分割により引き裂かれた部分が脂質一重膜を欠いているが、短時間放置することにより脂質一重膜が再生され、液滴の全体が脂質一重膜により囲包される。
次に、分割により生じた分割液滴を、同様に生成した他の分割液滴と接触させる。この場合、互いに接触させる２個の分割液滴は、それぞれ異なる液滴を分割して生じたものであってもよいし、同一の液滴を分割して生じたものであってもよい。前者の場合、接触させる分割液滴が、それぞれ異なる組成の液を内包するものであってもよく、この場合には、脂質二重膜に接する液滴を交換することができる。また、後者の場合で、もともと脂質二重膜が形成されていたが、その脂質二重膜が壊れることにより脂質一重膜で囲包された液滴となった液滴に適用すれば、壊れた脂質二重膜を容易に再生することができる。
上記本発明の方法により脂質二重膜を形成した後、形成された脂質二重膜を介して接触する液滴を、脂質二重膜の部分で外力により分割し、生じた液滴に一重膜を再生させ、脂質一重膜で囲包された複数の分割液滴を生成させ、得られた分割液滴の少なくとも１個を、同様に生成させた他の分割液滴と接触させ、その接触面に脂質二重膜を形成することもできる。すなわち、本発明の方法により脂質二重膜を形成した後、これを意図的に分断し、生じた液滴を上記本発明の方法に付すこともできる。さらにこれを繰り返すことにより、脂質二重膜の形成と破壊を繰り返すことができ、新たに脂質二重膜を形成する際に、異なる組成の液を内包するもの同士を接触させることにより、脂質二重膜に接する液滴を次々に交換していくことができる。
本発明の方法により形成された脂質二重膜は、該脂質二重膜に保持された状態におけるタンパク質の性質や機能を調べたり、該タンパク質に結合して、その生理活性を変化させるリガンドをスクリーニングしたりその性質を調べたりする各種測定に好適に用いられるものであるので、脂質二重膜は、タンパク質を含んでいることが好ましく、特に生体内で生体膜に保持された状態で機能している膜貫通タンパク質が好ましい。脂質二重膜に保持するタンパク質としては、各種レセプターや酵素を挙げることができ、例としては、α−ヘモリシン、グラミシジン、アラメチシンなどのペプチドタンパク質類、各種イオンチャンネル、ABCトランスポータタンパク質等を挙げることができるがこれらに限定されるものではない。タンパク質が水溶性の場合、上記水溶液としてタンパク質の水溶液を用いることが好ましく、水系緩衝液中にタンパク質を含む水溶液を用いることがさらに好ましい。これらの溶液中のタンパク質の濃度は、特に限定されるものではなく、適宜選択することができるが、通常、1nM〜1mM程度、好ましくは0.1μM〜10μM程度である。なお、タンパク質は、接触させる２つの液滴のいずれか一方に含まれていればよいが、両方の液滴中に含まれていてもよい。また、脂質二重膜に保持するタンパク質が脂溶性の場合には、膜タンパク質を発現させたプロテオリポソームを、本発明の方法により形成された脂質二重膜に融合させることで使用可能である。
タンパク質がα−ヘモリシンやアラメチシン等のイオンチャネルを形成するタンパク質である場合、脂質二重膜にタンパク質が正しく保持されると、保持されたタンパク質の部分がイオンチャネルを形成して、２つのウェルが電気的に導通される。従って、２つのウェル間に所定の電圧をかけ、脂質二重膜を介して流れる電流を測定することにより、タンパク質が脂質二重膜中に正しく保持された脂質二重膜が形成されたことを確認することができる。また、タンパク質に種々の物質を作用させることにより、タンパク質の構造を変化させてイオンチャネルを閉じたり開いたりする物質をスクリーニングすることもでき、このような物質は何らかの生理活性を発揮する可能性があり、医薬品の候補となり得る。また、この本発明の方法により形成された脂質二重膜を用いれば、簡単に再現性良く膜タンパク質の解析が可能であることから、今後、膜タンパク質の機能解析に関する研究効率を飛躍的に向上させることが期待できる。
次に、本発明の好ましい方法及びそれに用いられる好ましい器具を説明する。なお、本明細書及び特許請求の範囲において、「上」、「鉛直」、「水平」等の語は、器具に液を入れて使用する際の使用状態を基準にした方向を示す。
第１の好ましい方法は、周縁部に複数の凹部を有する回転可能な円板であって、各凹部は、水平方向の外側に向かって開口している円板と、前記円板に外接する固定板であって、その内周縁部に、前記複数の凹部にそれぞれ接する位置に複数の凹部を有し、各凹部は、水平方向の内側に向かって開口している固定板とを具備し、前記円板内の各凹部の開口部と、前記固定板内の各凹部の開口部を位置合わせすることによりそれぞれ１個の凹部が形成される、脂質二重膜形成器具（スピン型）を用いる方法である。以下、この方法の好ましい具体例を図面に基づき説明する。
図１は、この具体例に用いられる脂質二重膜形成器具の模式的斜視図である。器具は、基板１０を含む。この具体例では、基板１０は、上記した固定板を構成するものである。基板１０の中央付近には、円板１２が回転可能に枢支されている。円板１２は、基板１０の中央付近に設けられた円板収容凹部内に収容されており、円板１２の上面は、基板１０の上面より上部にある。円板１２は、一方向に回転可能であればよいが、両方向に回転可能、すなわち、回動自在に枢支されている方が便利である。円板１２の周縁部には複数の凹部１４が設けられている。図示の例では、４個の凹部１４が設けられているが、この個数は４個に限定されるものではなく、通常、２個〜１６個程度である。各凹部１４は、水平方向の外側に向かって開口している（開口部１４ａ）。図示の例では、各凹部１４の底部は、基板１０中の円板収容凹部の上面により構成されている。
円板１２に外接する、基板１０の内周縁部には、凹部１４のそれぞれ接する位置に複数の凹部１６が設けられている。各凹部１６は、水平方向の内側に向かって開口している（開口部１６ａ）。すなわち、円板１２内の各凹部１４と、基板１０内の各凹部１６が接している位置に来るように円板１２を位置合わせすると、各凹部１４の開口部１４ａと、各凹部１６の開口部１６ａとは接することになり、各凹部１４と各凹部１６とによりそれぞれ１個の凹部が形成される。図１の右上部分には、円板１２を回転させて、各凹部１４と各凹部１６とが接していない状態が示されている。基板１０には、この器具を用いて形成した脂質二重膜を用いて各種実験を行う場合に便利な、各凹部に接続する電極２０が接続される。なお、特に限定されないが、凹部１４及び凹部１６の直径は、例えば、2 mm〜 10 mm程度、開口部１４ａと開口部１６ａの長さは、例えば1 mm〜5 mm程度、円板１２の直径は、例えば5 mm〜20 mm程度、円板１２の厚さは、例えば1 mm〜 5 mm程度でよい。
次に、この器具を用いて脂質二重膜を形成する方法を図２を参照して説明する。図２は、器具を上面から見た模式図である。先ず、図２の１（左上の図）に示す通り、脂質二重膜形成性溶液を基板１０の凹部に注入して、円板１２を各凹部１４の開口部と、各凹部１６の開口部とがそれぞれ接し、各凹部１４と各凹部１６とによりそれぞれ１個のひょうたん形の凹部が形成されるように配置する。
次に、図２の２（右上の図）に示すように、各ひょうたん形の凹部に水溶液（例えば、水系緩衝液内に、実験に必要なタンパク質等を溶解したもの等）を注入する。そうすると、図２の２の右下の枠内に模式的に示すように、各ひょうたん形の凹部内において、脂質一重膜で囲包されたひょうたん形の液滴が生成する。このとき、各ひょうたん形の凹部に、組成が異なる水溶液を注入しておくこともできる。
次に、図２の３（右下の図）に示すように、円板１２を時計回りに回転させる。そうすると、各各ひょうたん形の凹部は分断され、脂質一重膜で囲包されたひょうたん形の液滴はそれぞれ２個の液滴に分割される。分割直後は、凹部１４の開口部１４ａ及び凹部１６の開口部１６ａの部分に脂質一重膜は存在しないが、直ちにこの部分に脂質一重膜が自動的に形成され、図２の３の右下の枠内に模式的に示すように、各凹部１４内及び各凹部１６内でそれぞれ、脂質一重膜で囲包された分割液滴が形成される。
次に、図２の４（左下の図）に示すように、各凹部１４が、最初に接していた各凹部１６のそれぞれ隣の各凹部１６と接する位置に来るまで、円板１２をさらに時計回りに回転させる。すなわち、図２の１の位置から時計回りに９０度の位置に来るまで回転させる。そうすると、各凹部１４及び各凹部１６内でそれぞれ形成されていた、脂質一重膜で囲包された分割液滴同士が各開口部１４ａ及び各開口部１６ａの位置で互いに接触し、図２の４の右下の枠内に模式的に示すように、この位置に脂質二重膜が自動的に形成される。ここで、上記図２の２の段階で、各ひょうたん形の凹部に注入する水溶液として、組成が異なる水溶液を注入しておくと、図２の４の段階では、それぞれ異なる組成の液を内包する分割液滴同士が接触し、これらの間で脂質二重膜が形成されることになる。
この状態で形成された脂質二重膜を用いて所望の測定を行い、それで実験を終了してもよいが、この状態で所望の測定を行った後、さらに、円板１２を回転させ、各ひょうたん形の凹部を分断してもよい。そうすると、形成されていた脂質二重膜は分断され、各開口部１４ａ及び各開口部１６ａの位置には、脂質一重膜で囲包された液滴が収容される状態、すなわち、図２の３の状態になる。この状態からさらに時計回りに円板１２を回転させる。各凹部１４が、最初に接していた各凹部１６の隣の隣の各凹部１６と接触する位置に来るまで時計回りに円板１２を回転させる（すなわち、最初の位置から１８０度回転させた位置まで回転させる）と、図２の４に示すように、脂質一重膜で囲包された分割液滴同士が各開口部１４ａ及び各開口部１６ａの位置で互いに接触し、図２の４の右下の枠内に模式的に示すように、この位置に脂質二重膜が自動的に形成される。ここで、上記図２の２の段階で、各ひょうたん形の凹部に注入する水溶液として、組成が異なる水溶液を注入しておくと、図２の４の段階では、先に脂質二重膜を形成した際とはまた異なる組成の液を内包する分割液滴同士が接触し、これらの間で脂質二重膜が形成されることになる。
この状態で必要な測定を行い、所望により、さらに円板１２を回転して、上記と同様の操作を行うことも可能であり、それによって、これまでとはさらに別の組成を有する分割液滴同士を接触させてそれらの間で脂質二重膜を形成することができる。
なお、上記具体例では、円板１２をずっと時計回りに回しているが、円板１２を回転させて凹部１４と凹部１６とを分断し、脂質一重膜を再生後、円板１２を逆回転させて元の凹部同士を接触させてもよい。この方法によれば、例えば、一旦形成された脂質二重膜が何らかの理由で壊れた際に、単に円板１２を少し回転させ、元に戻すという極めて簡単な操作により、先に壊れた脂質二重膜と同じ脂質二重膜を再生することができる。また、円板１２は、モーターにより自動的に回転させるようにしてもよい。
本発明の方法を実施する第２の好ましい方法は、凹部を有する基板と、該凹部の一部分を被覆する液滴スプリッターとを具備し、該液滴スプリッターは、鉛直方向の壁により囲包されて成り、互いに分断可能な複数のセパレーターを含み、各セパレーターは、鉛直方向に延びる、対向する一対の壁を具備し、該セパレーターのうちの少なくとも一部は、前記凹部の、液滴スプリッターにより被覆されていない領域上まで水平方向にスライド可能である、脂質二重膜形成器具（スライド型）を用いる方法である。以下、この方法の好ましい具体例を図面に基づき説明する。
図３は、この具体例に用いられる脂質二重膜形成器具の模式的斜視図である。器具は、基板２２を含み、基板２２には凹部２４が形成されている。凹部２４上には液滴スプリッター２６が配置され、該液滴スプリッター２６が凹部２４の一部分を被覆している。該液滴スプリッター２６は、鉛直方向の壁２６ａにより囲包されて成り、互いに分断可能な複数のセパレーター２７を含む（図示の例では４つのセパレーター）。各セパレーター２７は、鉛直方向に延びる、対向する一対の壁２７ａを具備する（図３の右上の枠内参照）。図示の例では、４つのセパレーター２７のうち、一番端の１つを除き、頂部が頂板２７により覆われており、この頂板２７を介して対向する一対の壁２７ａ同士が連結され、従って、各セパレーター２７は、液滴スプリッター２６の長手方向に直行する方向に、水平方向から見て断面コの字形の形状を有している。各頂板２７ｂには、空気孔２８が設けられている。一端のセパレーターには頂板がなく、解放されており、この開口が水注入口３０を構成している。両端のセパレーターには、前記対向する壁２７ａを連結する側板２７ｃが、液滴スプリッター２６の長手方向に直行する方向の最端部に設けられており、両端のセパレーターに液を充填しても各セパレーターから液がこぼれ出ないようになっている。さらに、各セパレーター同士が接する部分の手前側には、短冊状の側板２７ｄが壁２７ａと直行する方向に設けられている（図３の右上の枠内参照）。側板２７ｄは、脂質一重膜を切断しやすくするためのもので、設けなくても問題はない。基板２２には、この器具を用いて形成した脂質二重膜を用いて各種実験を行う場合に便利な、各セパレーター内部に接続する電極３２が接続される。なお、図３の右上の枠内は、４個のセパレーター２７のうち、隣接していない２個を水平方向にスライドさせた後の状態を示す。セパレーター２７のサイズは、特に限定されないが、例えば、一辺が１mm〜10mm程度の立方体でよく、凹部２４の広さは、所望の個数のセパレータを収容し、スライドさせることができる大きさでよく、凹部２４の深さは、特に限定されないが、例えば、1mm〜5mm程度である。
次に、この器具を用いて脂質二重膜を形成する方法を図４を参照して説明する。図４は、器具を上方から見た平面模式図であり、明瞭性のために頂板２７ｂは省かれている。図４の１に示すように、先ず、凹部２４に脂質二重膜形成性溶液を入れ、上から液滴スプリッター２６を被せる。
次に、水注入口３０（図３参照）から、水又は水溶液（以下、単に「水」）を注入し、液滴スプリッター２６内に水を充填する。そうすると、水は、脂質二重膜形成性溶液よりも重いので、下に沈み、脂質二重膜形成性溶液と側面でも接触し、図４の右側の拡大枠２に示される通り、液滴スプリッター２６内に脂質一重膜で囲包された液滴が形成される。なお、図４の右側の拡大枠２に示される脂質一重膜の２個の出っ張りは、短冊型の側板２７ｄにより形成される突起である。
次に、図４の３に示すように、液滴スプリッター２６を構成する４個のセパレーターのうち、水注入口３０を形成したセパレーターと、その隣の隣のセパレーターをそのままの位置に置いたまま、残る２個のセパレーターを、凹部２４の液滴スプリッター２６により覆われていない部分に向けてスライドさせる。そうすると、図４の３に示すように、脂質一重膜で囲包された液滴が４個の液滴に分割される。各液滴の分断された面には、分割直後は脂質一重膜が存在しないが、直ちにこの部分に脂質一重膜が自動的に形成され、図４の３の右側の枠内に模式的に示すように、各セパレーター２７内でそれぞれ、脂質一重膜で囲包された分割液滴が形成される。
次に、図４の４に示すように、スライドさせた２個のセパレーターを元の位置に戻す。そうすると、各セパレーター間で、脂質一重膜同士が接触し、この部分に脂質二重膜が形成される。図示の例では、セパレーターが４個あるので、それらの各境界において、合計３つの脂質二重膜が形成される。
なお、スライド型の器具では、セパレーターの形状を変化させることで、上下左右どの方向にも脂質二重膜を形成可能であり、有機溶媒中でなら、どこにでも脂質二重膜を形成可能である。また、複数の液滴を結合させることで、脂質二重膜を介した液滴ネットワークを形成できる。さらに、様々な液滴を用意しておけば、自由な組合せで液滴ネットワークを形成可能である。
なお、上記実施形態では、１個の脂質一重膜に囲包された液滴を先ず分割し、生じた分割液滴同士を接触させているが、本発明の方法は、これに限定されるものではなく、それぞれ予め生成した脂質一重膜に囲包された液滴２個同士を機械的外力により接触させてもよい。例えば、上記スピン型の器具を用い、凹部１４と凹部１６とが接していない状態で、各凹部内で脂質一重膜に囲包された液滴を形成し、円板１２を回転させて凹部１４と凹部１６とを接触させてもよい。
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
実施例１
図１及び図２に示したスピン型の器具を作製した。各凹部１４及び各凹部１６の直径は、４mm、円板１４の厚さは３mmであった。円板１２を取り外した円板収容凹部に、卵黄フォスファチジルコリンのn-デカン溶液（20mg/mL)50μLを入れ、円板１２を回動自在に装着し、各凹部１４と各凹部１６が接してそれぞれひょうたん形の凹部が形成される位置に円板を回転した。この状態で、合計４個の各ひょうたん形の凹部に、10nMのα−ヘモリシン（αHL)及び1M KClを含む緩衝液をそれぞれ40μLずつ滴下した。円板１２を９０度回転させ、各凹部１４を、最初に接していた凹部１６に隣接する凹部１６と接触させ、再度ひょうたん形の凹部を形成した。各凹部に接続した電極を用いて各凹部間に100 mVの電圧をかけ、各凹部間に流れる電流を経時的に測定した。
図１及び図２に示したスピン型の器具を作製した。各凹部１４及び各凹部１６の直径は、４mm、円板１４の厚さは３mmであった。円板１２を取り外した円板収容凹部に、卵黄フォスファチジルコリンのn-デカン溶液（20mg/mL)50μLを入れ、円板１２を回動自在に装着し、各凹部１４と各凹部１６が接してそれぞれひょうたん形の凹部が形成される位置に円板を回転した。この状態で、合計４個の各ひょうたん形の凹部に、10nMのα−ヘモリシン（αHL)及び1M KClを含む緩衝液をそれぞれ40μLずつ滴下した。円板１２を９０度回転させ、各凹部１４を、最初に接していた凹部１６に隣接する凹部１６と接触させ、再度ひょうたん形の凹部を形成した。各凹部に接続した電極を用いて各凹部間に100 mVの電圧をかけ、各凹部間に流れる電流を経時的に測定した。
結果を図５に示す。図５に示すように、４つのひょうたん形の凹部に形成された脂質二重膜に、α−ヘモリシンによりチャネルが形成され、電流が流れることが、全ての凹部について確認された。電流は、形成されるチャネルの個数の増大に伴い、階段的に大きくなった。
実施例２
実施例１と同じ器具を用い、基本的に実施例１と同じ操作を行った。ただし、４つのひょうたん形の凹部のうち、隣接する２個に実施例１と同じ、α−ヘモリシン水溶液を滴下し、他の１個に100μMのs7βCD（β−シクロデキストリン）水溶液を滴下し、残りの１個に10nM α−ヘモリシンと50merの一本鎖ポリチミジル酸(ssDNA)（25μM）の水溶液を滴下した。この状態で、図６のb)に示す、白い点線で囲まれたひょうたん形の凹部（α−ヘモリシン水溶液を滴下）において、凹部１４と凹部１６の間に流れる電流を実施例１と同様に測定した。
実施例１と同じ器具を用い、基本的に実施例１と同じ操作を行った。ただし、４つのひょうたん形の凹部のうち、隣接する２個に実施例１と同じ、α−ヘモリシン水溶液を滴下し、他の１個に100μMのs7βCD（β−シクロデキストリン）水溶液を滴下し、残りの１個に10nM α−ヘモリシンと50merの一本鎖ポリチミジル酸(ssDNA)（25μM）の水溶液を滴下した。この状態で、図６のb)に示す、白い点線で囲まれたひょうたん形の凹部（α−ヘモリシン水溶液を滴下）において、凹部１４と凹部１６の間に流れる電流を実施例１と同様に測定した。
円板１２を反時計回りに９０度回転させ、共にα−ヘモリシン水溶液を含む分割液滴間に脂質二重膜を形成した。図６に示すように、α−ヘモリシンによりチャネルが形成され、電流が流れることが確認された。
次に、円板１２をさらに９０度反時計回りに回転させると、α−ヘモリシン水溶液を含む分割液滴が、s7βCD水溶液を含む分割液滴と接し、この間に脂質二重膜が形成された。α−ヘモリシンによりチャネルが形成され、電流が流れることが確認されたが、s7βCDがチャネル内を通過する間は、チャネルがs7βCDにより閉塞されて電流がときどき流れなくなることも確認された（図６のc)。
次に、円板１２をさらに９０度反時計回りに回転させると、α−ヘモリシン水溶液を含む分割液滴が、ssDNA水溶液を含む分割液滴と接し、この間に脂質二重膜が形成された。α−ヘモリシンによりチャネルが形成され、電流が流れることが確認されたが、ssDNAがチャネル内を通過する間は、チャネルがssDNAにより閉塞されて電流がときどき流れなくなることも確認された（図６のd)。
次に、円板１２をさらに９０度反時計回りに回転させると、α−ヘモリシン水溶液を含む分割液滴が、同じくα−ヘモリシン水溶液を含む分割液滴と接し（最初の状態に戻る）、α−ヘモリシンによるチャネルが形成されて電流が定常的に流れることが確認された（図６のe)。
実施例３
図３及び図４に示すスライド型の脂質二重膜形成器具を作製した。セパレータは、１辺が5mmの立方体であり、凹部２４の深さは1mmであった。凹部２４に卵黄フォスファチジルコリンのn-デカン溶液（20mg/mL)100μLを入れ、一方、水注入口３０から、水100μLを注入し、注入した水が４つのセパレーター内で均等に配分されるまで待った。4つのセパレータをそれぞれ個別に分断し（この時水も一緒に分断される）、再び元の位置に戻すと、輸送された液滴の接触界面に脂質二重膜を形成し、さらに脂質二重膜を介した液滴のネットワークを形成することができた。
図３及び図４に示すスライド型の脂質二重膜形成器具を作製した。セパレータは、１辺が5mmの立方体であり、凹部２４の深さは1mmであった。凹部２４に卵黄フォスファチジルコリンのn-デカン溶液（20mg/mL)100μLを入れ、一方、水注入口３０から、水100μLを注入し、注入した水が４つのセパレーター内で均等に配分されるまで待った。4つのセパレータをそれぞれ個別に分断し（この時水も一緒に分断される）、再び元の位置に戻すと、輸送された液滴の接触界面に脂質二重膜を形成し、さらに脂質二重膜を介した液滴のネットワークを形成することができた。
実施例４
セパレータの数が２個、凹部２４に入れた卵黄フォスファチジルコリンのn-デカン溶液の量が40μL、水注入口３０から注入した水の量が50μLであることを除き、実施例３と同様な操作を行った。元の位置に戻したセパレータ間に形成された脂質二重膜を介して流れる電流を経時的に測定した。
セパレータの数が２個、凹部２４に入れた卵黄フォスファチジルコリンのn-デカン溶液の量が40μL、水注入口３０から注入した水の量が50μLであることを除き、実施例３と同様な操作を行った。元の位置に戻したセパレータ間に形成された脂質二重膜を介して流れる電流を経時的に測定した。
結果を図７に示す。形成された脂質二重膜に、α−ヘモリシンによりチャネルが形成され、電流が流れることが、確認された。電流は、形成されるチャネルの個数の増大に伴い、階段的に大きくなった。
１０ 基板
１２ 円板
１４ 凹部
１４ａ 凹部開口部
１６ 凹部
１６ａ 凹部開口部
２０ 電極
２２ 基板
２４ 凹部
２６ 液滴スプリッター
２６ａ 壁
２７ セパレーター
２７ａ 壁
２７ｂ 頂板
２７ｃ 側板
２７ｄ 側板
２８ 空気孔
３０ 水注入口
３２ 電極
１２ 円板
１４ 凹部
１４ａ 凹部開口部
１６ 凹部
１６ａ 凹部開口部
２０ 電極
２２ 基板
２４ 凹部
２６ 液滴スプリッター
２６ａ 壁
２７ セパレーター
２７ａ 壁
２７ｂ 頂板
２７ｃ 側板
２７ｄ 側板
２８ 空気孔
３０ 水注入口
３２ 電極
Claims (12)
- 脂質一重膜で囲包された液滴を、脂質一重膜で囲包された他の液滴と機械的な外力で接触させ、その接触面に脂質二重膜を形成することを含む、脂質二重膜の形成方法。
- 脂質一重膜で囲包された液滴を外力により複数の液滴に分割し、生じた液滴に脂質一重膜を再生させ、脂質一重膜で囲包された複数の分割液滴を生成させる工程と、得られた分割液滴の少なくとも１個を、同様に生成させた他の分割液滴と接触させ、その接触面に脂質二重膜を形成する工程とを含む、請求項１記載の方法。
- 脂質一重膜で囲包された液滴を外力により２個の液滴に二分割し、同様に二分割された他の分割液滴と接触させる請求項２記載の方法。
- 互いに接触させる分割液滴が、それぞれ異なる液滴を分割して生じたものである請求項２又は３記載の方法。
- 互いに接触させる分割液滴が、それぞれ異なる組成の液を内包する請求項４記載の方法。
- 互いに接触させる分割液滴が、同一の液滴を分割して生じたものである請求項２又は３記載の方法。
- 周縁部に複数の凹部を有する回転可能な円板であって、各凹部は、水平方向の外側に向かって開口している円板と、
前記円板に外接する固定板であって、その内周縁部に、前記複数の凹部にそれぞれ接する位置に複数の凹部を有し、各凹部は、水平方向の内側に向かって開口している固定板とを具備し、
前記円板内の各凹部の開口部と、前記固定板内の各凹部の開口部を位置合わせすることによりそれぞれ１個の凹部が形成される、脂質二重膜形成器具を用い、
前記円板内の各凹部の開口部と、前記固定板内の各凹部の開口部とを位置合わせしてそれぞれ１個の凹部を形成した状態で、各凹部内において脂質一重膜で囲包された液滴を形成する工程と、
前記円板を回転させて、各凹部内で形成された液滴をそれぞれ２個の液滴に分割し、生じた各液滴に脂質一重膜を再生させ、脂質一重膜で囲包された複数の分割液滴を生成させる工程と、
前記円板をさらに回転又は逆回転させて、円板内の各凹部を、先に接触していた固定板内凹部と同一又は異なる固定板内凹部と位置合わせしてそれぞれ１個の凹部を形成し、それによって、各凹部内の分割液滴同士を接触させ、この接触面において脂質二重膜を形成する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。 - 凹部を有する基板と、
該凹部の一部分を被覆する液滴スプリッターとを具備し、
該液滴スプリッターは、鉛直方向の壁により囲包されて成り、互いに分断可能な複数のセパレーターを含み、各セパレーターは、鉛直方向に延びる、対向する一対の壁を具備し、該セパレーターのうちの少なくとも一部は、前記凹部の、液滴スプリッターにより被覆されていない領域上まで水平方向にスライド可能である、脂質二重膜形成器具を用い、
前記凹部内に、脂質溶液を入れる工程と、
前記液滴スプリッターに水又は水溶液を注入して該液滴スプリッター内において、脂質一重膜で囲包された液滴を形成する工程と、
該液滴スプリッターの前記複数のセパレーターのうちの少なくとも一部のセパレーターを、該液滴スプリッターにより被覆されていない領域上まで水平方向にスライドさせ、一方、水平方向にスライドさせるセパレーターに隣接するセパレーターはスライドさせず、それによって、前記液滴を複数の液滴に分割し、生じた各液滴に脂質一重膜を再生させ、脂質一重膜で囲包された複数の分割液滴を生成させる工程と、
水平方向にスライドさせたセパレーターを元の位置に戻し、それによって、各セパレーター内の分割液滴同士を接触させ、この接触面において脂質二重膜を形成する、請求項１〜３及び６のいずれか１項に記載の方法。 - 請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法により脂質二重膜を形成した後、形成された脂質二重膜を介して接触する液滴を、脂質二重膜の部分で外力により分割し、生じた液滴に脂質一重膜を再生させ、脂質一重膜で囲包された複数の分割液滴を生成させる工程と、得られた分割液滴の少なくとも１個を、同様に生成させた他の分割液滴と接触させ、その接触面に脂質二重膜を形成する工程とをさらに含む、脂質二重膜の形成方法。
- 周縁部に複数の凹部を有する回転可能な円板であって、各凹部は、水平方向の外側に向かって開口している円板と、
前記円板に外接する固定板であって、その内周縁部に、前記複数の凹部にそれぞれ接する位置に複数の凹部を有し、各凹部は、水平方向の内側に向かって開口している固定板とを具備し、
前記円板内の各凹部の開口部と、前記固定板内の各凹部の開口部を位置合わせすることによりそれぞれ１個の凹部が形成される、脂質二重膜形成器具。 - 前記固定板を構成する基板を具備し、前記円板は、該基板に設けられた円板収容凹部内に収容され、該円板の前記各凹部の底部は、該基板中の前記円板収容凹部の上面により構成される請求項１０記載の脂質二重膜形成器具。
- 凹部を有する基板と、
該凹部の一部分を被覆する液滴スプリッターとを具備し、
該液滴スプリッターは、鉛直方向の壁により囲包されて成り、互いに分断可能な複数のセパレーターを含み、各セパレーターは、鉛直方向に延びる、対向する一対の壁を具備し、該セパレーターのうちの少なくとも一部は、前記凹部の、液滴スプリッターにより被覆されていない領域上まで水平方向にスライド可能である、脂質二重膜形成器具。
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