JP2014105180A - モノマー化方法 - Google Patents

Abstract

【課題】複数のタンパク質が凝集した凝集体を高精度でかつ容易にモノマー化することができるモノマー化方法を提供すること。
【解決手段】複数のタンパク質が凝集した凝集体を、各タンパク質にモノマー化するモノマー化方法であり、前記凝集体を含有する試料液を用意する第１の工程と、前記凝集体にｐＨ６．０以上の緩衝液を接触させて、前記凝集体からモノマー化された前記タンパク質を得る第２の工程とを有する。また、第２の工程の後に、吸着剤として少なくとも表面がリン酸カルシウム系化合物で構成されたものを用いたクロマトグラフィー処理を施し、該クロマトグラフィー処理により得られる分画液を回収することで、モノマー化された前記タンパク質を精製する第３の工程を有することが好ましい。
【選択図】なし

Description

本発明は、複数のタンパク質が凝集した凝集体を、各タンパク質にモノマー化するモノマー化方法に関するものである。

近年、血漿中に含まれる抗体（天然の抗体）や、遺伝子工学的に処理した宿主生細胞により産生される組換え融合タンパク質（人工の抗体）等のタンパク質を試料液中から精製する方法として、アフィニティークロマトグラフィー法や、イオン交換クロマトグラフィー法が用いられている（例えば、特許文献１参照。）。

例えば、アフィニティークロマトグラフィー法は、プロテインＡのような結合性タンパク質を固体支持体に固定化したものを吸着剤として用い、この結合性タンパク質に対して、抗体および組換え融合タンパク質が有する定常（Ｆｃ）部が優れた可逆的相互作用を有することから、かかる相互作用を利用して、抗体および組換え融合タンパク質等のタンパク質を容易に精製することができるため広く利用されている。

ここで、アフィニティークロマトグラフィー法や、イオン交換クロマトグラフィー法を用いた、タンパク質の精製では、試料液中に含まれるタンパク質とは異なる他の混入物と分離することができるものの、タンパク質のモノマー（単量体）と、複数のタンパク質が凝集することで生じた凝集体とを充分に分離することができない。

また、このようなタンパク質を薬理学的用途で使用する場合、薬理作用を発揮するものは、タンパク質のモノマーであり、凝集体は、薬理作用を有さず、これとは異なる副作用を発揮することもあるため、通常、モノマーが薬理学的用途で使用され、凝集体はモノマーから分離・破棄される。

しかしながら、この凝集体を、各タンパク質にモノマー化することができれば、得られたタンパク質を、薬理学的用途で使用することができるが、凝集体を、高精度でかつ容易にモノマー化することができるモノマー化方法については知られていないのが実状である。

また、このような問題は、天然および人工の抗体のようなタンパク質に限らず、アルブミン、フィブリノゲン、ペプシノーゲンのような他のタンパク質についても同様に生じている。

特表２００５−５６００３７号公報

本発明の目的は、複数のタンパク質が凝集した凝集体を高精度でかつ容易にモノマー化することができるモノマー化方法を提供することにある。

このような目的は、下記（１）〜（１０）の本発明により達成される。
（１） 複数のタンパク質が凝集した凝集体を、各タンパク質にモノマー化するモノマー化方法であって、
前記凝集体を含有する試料液を用意する第１の工程と、
前記凝集体にｐＨ６．０以上の緩衝液を接触させて、前記凝集体からモノマー化された前記タンパク質を得る第２の工程とを有することを特徴とするモノマー化方法。

これにより、複数のタンパク質が凝集した凝集体を高精度でかつ容易にモノマー化することができる。

（２） 前記緩衝液のｐＨは、６．０以上、９．０未満である上記（１）に記載のモノマー化方法。

これにより、変質・劣化が的確に抑制または防止されたタンパク質をモノマーとして確実に得ることができる。

（３） 前記緩衝液は、変性剤を含有する上記（１）または（２）に記載のモノマー化方法。

これにより、凝集物における結合の切断がより確実に行われることとなるため、凝集体からのモノマーの回収率を向上させることができる。

（４） 変性剤は、塩酸グアニジン、尿素およびアルギニンのうちの少なくとも１種である上記（３）に記載のモノマー化方法。

これにより、モノマー化されたタンパク質の変質・劣化をより確実に防止しつつ、凝集物における結合の切断をより確実に行うことができる。

（５） 前記第２の工程の後に、吸着剤として少なくとも表面がリン酸カルシウム系化合物で構成されたものを用いたクロマトグラフィー処理を施し、該クロマトグラフィー処理により得られる分画液を回収することで、モノマー化された前記タンパク質を精製する第３の工程を有する上記（１）ないし（４）のいずれか１項に記載のモノマー化方法。

これにより、凝集体とモノマー化されたタンパク質とを含有する試料液中から、モノマー化されたタンパク質を精製することができる。

（６） 前記第３の工程において、前記クロマトグラフィー処理を複数回行う上記（５）に記載のモノマー化方法。

これにより、凝集体とモノマー化されたタンパク質とを含有する試料液中から、モノマー化されたタンパク質をより優れた収率で回収することができる。

（７） 前記第３の工程における、前記クロマトグラフィー処理は、
前記吸着剤に前記第２の工程で得られた前記タンパク質を含有する試料液を接触させ、前記吸着剤に前記タンパク質を吸着させる工程と、
前記吸着剤に溶出液を供給し、得られる分画液を回収することで、該分画液中に前記吸着剤から溶出した前記タンパク質が精製される上記（５）または（６）に記載のモノマー化方法。

これにより、凝集体とモノマー化されたタンパク質とを含有する試料液中から、モノマー化されたタンパク質を精製することができる。

（８） 前記溶出液は、塩濃度が１．０ｍＭ〜５００ｍＭのリン酸緩衝液である上記（７）に記載のモノマー化方法。

これにより、モノマー化されたタンパク質へのリン酸系緩衝液中の金属イオンによる悪影響を防止することができる。

（９） 前記溶出液は、ｐＨが６．０〜９．０のリン酸緩衝液である上記（７）または（８）に記載のモノマー化方法。

これにより、分離するモノマー化されたタンパク質の変質を防止することができ、その特性が変化するのを防止することができる。

（１０） 前記タンパク質は、免疫グロブリン定常ドメインを有する、天然の抗体、または組換え融合タンパク質である上記（１）ないし（９）のいずれか１項に記載のモノマー化方法。

本発明のモノマー化方法は、天然の抗体、または組換え融合タンパク質の精製に好適に適用される。

本発明のモノマー化方法によれば、複数のタンパク質が凝集した凝集体を、高精度でかつ容易にモノマー化することができる。

本実施形態で説明するモノマー化方法に用いられる吸着装置の一例を示す縦断面図である。 実施例ＡにおけるｐＨが３．２８および６．８の試料液Ａを、それぞれ、サイズ排除クロマトグラフィー処理を施した際の吸光度変化を示す図である。 実施例ＡにおけるｐＨが３．２８および６．８の試料液Ａを、それぞれ、ハイドロキシアパタイト処理を施した際の吸光度変化を示す図である。 実施例ＡにおけるｐＨが３．２８の試料液Ａをハイドロキシアパタイト処理を施すことにより得られた画分１８を、２時間、４４時間および４０８時間保存した後に、サイズ排除クロマトグラフィー処理を施した際の吸光度変化を示す図である。 実施例１ＢにおけるｐＨが７．５の試料液１Ｂを、０時間および２４時間保存した後に、サイズ排除クロマトグラフィー処理を施した際の吸光度変化を示す図である。 実施例２Ｂにおける塩酸グアニジンが０．５Ｍ、ｐＨが７．５の試料液２Ｂを、０時間および２４時間保存した後に、サイズ排除クロマトグラフィー処理を施した際の吸光度変化を示す図である。 実施例３ＢにおけるｐＨが９．５の試料液３Ｂを、０時間および２４時間保存した後に、サイズ排除クロマトグラフィー処理を施した際の吸光度変化を示す図である。 実施例４Ｂにおける塩酸グアニジンが０．５Ｍ、ｐＨが７．５の試料液４Ｂを、０時間および２４時間保存した後に、サイズ排除クロマトグラフィー処理を施した際の吸光度変化を示す図である。

以下、本発明のモノマー化方法の好適な実施形態について詳細に説明する。
なお、本発明のモノマー化方法を説明するのに先立って、好適な実施形態を説明するにあたり、説明に使用する用語を以下に定義する。

「複数のタンパク質が凝集した凝集体」とは、少なくとも２つの同一のタンパク質同士が結合した結合物（凝集物）のことを言い、この結合物の結合様式は、特に限定されず、共有結合、非共有結合、ジスルフィド結合、および非還元性架橋結合等のうちのいずれであってもよい。

「モノマー化」とは、免疫グロブリン定常ドメインを有するタンパク質（抗体）のねじれ構造を元の状態に戻す、いわゆるリフォールディングとは異なり、複数の凝集体の結合を切断する（解す）ことをいう。

「抗体」とは、タンパク質またはタンパク質複合体であり、それぞれが、少なくとも１つの免疫グロブリン可変ドメイン、および少なくとも１つの免疫グロブリン定常ドメインを含むものをいう。また、「抗体」は、一本鎖抗体、二量体抗体、またはいずれかの高次タンパク質複合体であってよく、これにはヘテロ二量体抗体が含まれるが、これらに限定されるものではない。

「免疫グロブリン定常ドメイン」とは、ヒトまたは動物由来のＣ_L、Ｃ_H１、Ｃ_H２、Ｃ_H３またはＣ_H４ドメインと同一または実質的に類似する免疫グロブリンドメインのことを言い、抗体のＦｃ部もこれに含まれる。（例えば、Ｃｈａｒｌｅｓ Ａ Ｈａｓｅｍａｎｎ ａｎｄ Ｊ．Ｄｏｎａｌｄ Ｃａｐｒａ，免疫グロブリン：構造と機能，Ｗｉｌｌｉａｍ Ｅ．Ｐａｕｌ編，Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第２版，２０９，２１０−２１８（１９８９）参照。）。

「免疫グロブリン可変ドメイン」とは、ヒトまたは動物由来のＶ_LまたはＶ_Hドメインと同一または実質的に類似する免疫グロブリンドメインのことを言う。なお、本発明では、実質的類似性を判定するための免疫グロブリン可変ドメインの生物学的活性は、抗原結合性である。

「吸着剤」とは、固体支持体に固定した少なくとも１種類の分子、またはそれ自体が固体である少なくとも１種類の分子で構成され、各種クロマトグラフィーを実施するために用いられるものである。

「アフィニティークロマトグラフィー」とは、クロマトグラフィー分離を行うために、分子の一般的な特性（例えば、等電点、疎水性またはサイズ）ではなく、生体分子間の特異的な可逆的相互作用（例えば、プロテインＡがＩｇＧ抗体のＦｃ部に結合する能力）を利用するクロマトグラフィーである。具体的には、アフィニティークロマトグラフィーは、例えば、固体支持体にプロテインＡ等の結合性タンパク質が固定化されたものを吸着剤として用いて、吸着剤に対する分子の吸着力（結合力）の差に基づいて分子をクロマトグラフィー分離することをいう（Ｏｓｔｒｏｖｅ（１９９０）Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８２：３５７−３７９参照。）。

「プロテインＡ」とは、最初にブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）の細胞壁に発見されたタンパク質であり、ＩｇＧ抗体のＦｃ部に特異的に結合する特性を有するものである。本発明では、「プロテインＡ」は、ブドウ球菌由来のプロテインＡと同一または実質的に類似するいずれかのタンパク質のことを言い、市販および／または組換え型のプロテインＡも含まれる。なお、本発明では、実質的類似性を判定するためのプロテインＡの生物学的活性は、ＩｇＧ抗体のＦｃ部への結合能である。

「プロテインＧ」とは、最初に連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）の細胞壁に発見されたタンパク質であり、ＩｇＧ抗体のＦｃ部に特異的に結合する特性を有するものである。本発明では、「プロテインＧ」は、連鎖球菌由来のプロテインＧと同一または実質的に類似するいずれかのタンパク質のことを言い、市販および／または組換え型のプロテインＧも含まれる。なお、本発明では、実質的類似性を判定するためのプロテインＧの生物学的活性は、ＩｇＧ抗体のＦｃ部への結合能である。

次に、本実施形態で説明するモノマー化方法に用いられる吸着装置（分離装置）の一例について説明する。

＜吸着装置＞
図１は、本実施形態で説明するモノマー化方法に用いられる吸着装置の一例を示す縦断面図である。なお、以下の説明では、図１中の上側を「流入側」、下側を「流出側」と言う。

ここで、流入側とは、精製すべきモノマー化されたタンパク質を精製（分離）する際に、試料液（タンパク質を含有する液体）および溶出液等の液体を、吸着装置内に供給する側のことを言い、一方、流出側とは、前記流入側と反対側、すなわち、前記試料液が流出液として吸着装置内から流出する側のことを言う。

図１に示す吸着装置１は、カラム２と、吸着剤（充填剤）３と、２枚のフィルタ部材４、５とを有している。

カラム２は、カラム本体２１と、このカラム本体２１の流入側端部および流出側端部に、それぞれ装着されるキャップ（蓋体）２２、２３とで構成されている。

カラム本体２１は、例えば円筒状の部材で構成されている。カラム本体２１を含めカラム２を構成する各部（各部材）の構成材料としては、例えば、各種ガラス材料、各種樹脂材料、各種金属材料、各種セラミックス材料等が挙げられる。

カラム本体２１には、その流入側開口および流出側開口を、それぞれ塞ぐようにフィルタ部材４、５を配置した状態で、その流入側端部および流出側端部に、それぞれキャップ２２、２３が螺合により装着される。

このような構成のカラム２では、カラム本体２１と各フィルタ部材４、５とにより、吸着剤充填空間２０が画成されている。そして、この吸着剤充填空間２０の少なくとも一部に（本実施形態では、ほぼ満量で）、吸着剤３が充填されている。

吸着剤充填空間２０の容積は、試料液の容量に応じて適宜設定され、特に限定されないが、試料液１ｍＬに対して、０．０５〜１００ｍＬ程度が好ましく、０．１〜１００ｍＬ程度がより好ましく、０．５〜５０ｍＬ程度がさらに好ましい。

また、カラム２では、カラム本体２１に各キャップ２２、２３を装着した状態で、これらの間の液密性が確保されるように構成されている。

これらキャップ２２、２３のほぼ中央には、それぞれ、流入管２４および流出管２５が液密に固着（固定）されている。この流入管２４およびフィルタ部材４を介して吸着剤３に、試料液（液体）が供給される。また、吸着剤３に供給された試料液は、吸着剤３同士の間（間隙）を通過して、フィルタ部材５および流出管２５を介して、カラム２外へ流出する。

各フィルタ部材４、５は、それぞれ、吸着剤充填空間２０から吸着剤３が流出するのを防止する機能を有するものである。これらのフィルタ部材４、５は、それぞれ、例えば、ガラス焼結体、金属あるいはポリウレタン、ポリビニルアルコール、ポリプロピレン、ポリエーテルポリアミド、ポリエチレンテレフタレート、ポリブチレンテレフタレート等の合成樹脂からなる不織布、発泡体（連通孔を有するスポンジ状多孔質体）、織布、メッシュ等で構成されている。

また、後述するモノマー化方法では、吸着装置１は、第３の工程におけるクロマトグラフィー処理に用いられ、吸着剤３として少なくとも表面がリン酸カルシウム系化合物で構成されたものを備えている。

かかる吸着剤３には、試料液中に含まれるタンパク質が有する固有の吸着（担持）力で特異的に吸着するため、この吸着力の差に応じて、モノマー化されたタンパク質と、このタンパク質とは異なる他のタンパク質とが分離・精製される。

リン酸カルシウム系化合物としては、特に限定されず、例えば、ハイドロキシアパタイト（Ｃａ_１０（ＰＯ_４）_６（ＯＨ）_２）、ＴＣＰ（Ｃａ_３（ＰＯ_４）_２）、Ｃａ_２Ｐ_２Ｏ_７、Ｃａ（ＰＯ_３）_２、ＤＣＰＤ（ＣａＨＰＯ_４・２Ｈ_２Ｏ）、Ｃａ_４Ｏ（ＰＯ_４）_２や、これらの一部が他の原子または原子団で置換されたもの等が挙げられ、これらのうちの１種または２種以上を組み合わせて用いることができる。

これらの中でも、リン酸カルシウム系化合物は、ハイドロキシアパタイトを主成分とするものが好ましい。特に、ハイドロキシアパタイトは、生体を構成する成分に近いため、タンパク質を吸着・分離する際に、かかるタンパク質が変質（変性）するのを好適に防止することができる。また、溶出液として、リン酸系緩衝液の塩濃度を変えて用いることで、タンパク質を、吸着剤３から特異的に取り外すことができる。

以上のような吸着剤３の形態（形状）は、図１に示すように、粒子状（顆粒状）のものであるのが好ましいが、その他、例えばペレット状（小塊状）、ブロック状（例えば、隣接する空孔同士が互いに連通する多孔質体、ハニカム形状、モノリス）等とすることもできる。なお、吸着剤３を粒子状とすることにより、その表面積を増大させることができ、タンパク質の分離特性の向上を図ることができる。

粒状の吸着剤３の平均粒径は、特に限定されないが、０．５〜１５０μｍ程度であるのが好ましく、１０〜８０μｍ程度であるのがより好ましい。このような平均粒径の吸着剤３を用いることにより、前記フィルタ部材５の目詰まりを確実に防止しつつ、吸着剤３の表面積を十分に確保することができる。

次に、このような吸着装置（分離装置）１を用いた、複数のタンパク質が凝集した凝集体を、各タンパク質にモノマー化するモノマー化方法について説明する。

＜モノマー化方法＞
本実施形態のモノマー化方法は、複数のタンパク質が凝集した凝集体を含有する試料液を用意する第１の工程と、この凝集体にｐＨ６．０以上の緩衝液を接触させて、凝集体からモノマー化されたタンパク質を得る第２の工程と、吸着剤として少なくとも表面がリン酸カルシウム系化合物で構成されたものを用いたクロマトグラフィー処理を施し、該クロマトグラフィー処理により得られる分画液を回収することで、モノマー化された前記タンパク質を精製する第３の工程とを有する。

以下、このモノマー化方法について詳述する。
なお、以下では、タンパク質として、免疫グロブリン定常ドメインを有する、天然の抗体、または組換え融合タンパク質の凝集体を、モノマー化する場合を代表に説明する。

［１］ 第１の工程
まず、複数のタンパク質が凝集した凝集体を含有する試料液を用意する。

タンパク質は、免疫グロブリン定常ドメイン（例えば、抗体のＦｃ部）を有するタンパク質またはそのタンパク質の複合体であり、例えば、かかるタンパク質が産生されるように遺伝子工学的に処理した宿主生細胞により産生される。

この場合、タンパク質が産生されるように細胞を遺伝子工学的に処理する方法は、当技術分野で周知である（例えば、Ａｕｓａｂｅｌ ｅｔ ａｌ．編（１９９０），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｗｉｌｌｅｙ，ニューヨーク）参照。）。

なお、タンパク質は、１以上の免疫グロブリン定常ドメインを有するものであればよく、１個または２個以上の免疫グロブリン可変ドメインを有するものであってもよく、免疫グロブリン可変ドメインを有しないものであってもよい。

さらに、タンパク質は、天然タンパク質（天然の抗体）または組換え融合タンパク質であってもよく、組換え融合タンパク質としては、例えば、抗体のＦｃ部を有するものが挙げられ、非抗体タンパク質であってもよい。

組換え融合タンパク質の具体例としては、１以上の免疫グロブリン定常ドメイン（例えば、抗体のＦｃ部）と、下記のタンパク質のいずれかと同一または実質的に類似するタンパク質とを含むものが挙げられる。

前記タンパク質としては、例えば、ｆｌｔ３リガンド（国際特許出願ＷＯ９４／２８３９１参照。）、ＣＤ４０リガンド（米国特許第６，０８７，３２９号参照。）、エリスロポエチン、トロンボポエチン、カルシトニン、Ｆａｓリガンド、ＮＦ−κＢの受容体アクチベーターに対するリガンド（ＲＡＮＫＬ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ、国際特許出願ＷＯ９７／０１６３３参照。）、胸腺ストローマ由来リンホポエチン、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ、オーストラリア特許Ｎｏ．５８８８１９参照。）、マスト細胞増殖因子、幹細胞増殖因子、上皮増殖因子、ＲＡＮＴＥＳ、成長ホルモン、インスリン、インスリノトロピン、インスリン様増殖因子、副甲状腺ホルモン、インターフェロン、神経成長因子、グルカゴン、インターロイキン１〜１８、コロニー刺激因子、リンホトキシン−β、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、白血病阻害因子、オンコスタチン−Ｍ、ならびに細胞表面分子ＥＬＫおよびＨｅｋに対する種々のリガンド（例えば、ｅｐｈ関連キナーゼまたはＬＥＲＫＳに対するリガンド）等が挙げられる。

また、組換え融合タンパク質の具体例としては、１以上の免疫グロブリン定常ドメイン（例えば、抗体のＦｃ部）と、前記タンパク質のいずれかに対する受容体またはそのような受容体と実質的に類似するタンパク質とを含むものが挙げられる。

前記受容体としては、両形態のＴＮＦＲ（ｐ５５およびｐ７５と呼ばれる）、Ｉ型およびＩＩ型インターロイキン−１受容体（ＥＰ特許Ｎｏ．０ ４６０ ８４６、米国特許第４，９６８，６０７号および米国特許第５，７６７，０６４号参照。）、インターロイキン−２受容体、インターロイキン−４受容体（ＥＰ特許Ｎｏ．０ ３６７ ５６６および米国特許第５，８５６，２９６号参照。）、インターロイキン−１５受容体、インターロイキン−１７受容体、インターロイキン−１８受容体、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子受容体、顆粒球コロニー刺激因子受容体、オンコスタチン−Ｍおよび白血病阻害因子に対する受容体、ＮＦ−κＢの受容体アクチベーター（ＲＡＮＫ、米国特許第６，２７１，３４９号参照。）、ＴＲＡＩＬに対する受容体（ＴＲＡＩＬ受容体１、２、３および４を含む）、ならびにデスドメインを含む受容体、例えば、Ｆａｓまたはアポトーシス誘導受容体（ＡＩＲ）等が挙げられる。

さらに、組換え融合タンパク質の具体例としては、１以上の免疫グロブリン定常ドメイン（例えば、抗体のＦｃ部）と、分化抗原（ＣＤタンパク質と呼ばれる）もしくは分化抗原または分化抗原と実質的に類似するタンパク質とを含むものが挙げられる。

前記分化抗原としては、Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ｔｙｐｉｎｇ ＶＩ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ ＶＩｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｗｏｒｋｓｈｏｐ ａｎｄ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ，Ｋｉｓｈｉｍｏｔｏ，Ｋｉｋｕｔａｎｉ ｅｔ ａｌ．編，日本，神戸，１９９６）に示されており、具体的には、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ３９、ＣＤ４０、およびそれらに対するリガンド（ＣＤ２７リガンド、ＣＤ３０リガンド、など）が挙げられる。

なお、幾つかのＣＤ抗原は、ＴＮＦ受容体ファミリーの１種であり、これには４１ＢＢリガンドおよびＯＸ４０も含まれる。上記リガンドは、４１ＢＢリガンドおよびＯＸ４０リガンドと同様にＴＮＦファミリーの１種である。

その例には、少なくとも１つの免疫グロブリン定常ドメインと、下記のタンパク質のいずれかもしくはそれらのリガンドまたはこれらのいずれかと実質的に類似するタンパク質の全体または一部とを含む組換え融合タンパク質が挙げられ、例えば、メタロプロテイナーゼ−ディスインテグリンファミリーのメンバー、種々のキナーゼ、グルコセレブロシダーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、組織プラスミノーゲンアクチベーター、ＶＩＩＩ因子、ＩＸ因子、アポリポタンパク質Ｅ、アポリポタンパク質Ａ−Ｉ、グロビン、ＩＬ−２アンタゴニスト、α−１アンチトリプシン、ＴＮＦ−α変換酵素、前記酵素のいずれかに対するリガンド、ならびに他の多数の酵素およびそれらのリガンドが挙げられる。

さらに、タンパク質としては、抗体（天然の抗体）またはその一部、およびキメラ抗体、例えば、ヒト免疫グロブリン定常ドメインが１以上のネズミ免疫グロブリン可変ドメインに結合した抗体、またはそのフラグメントであってもよいし、抗体と細胞傷害性物質または発光物質とを含む結合体であってもよい。細胞傷害性物質または発光物質としては、メイタンシン（ｍａｙｔａｎｓｉｎｅ）誘導体（例えば、ＤＭ１）；エンテロトキシン（例えば、ブドウ球菌エンテロトキシン）；ヨウ素同位体（例えば、Ｉ−１２５）；テクニウム同位体（例えば、Ｔｃ−９９ｍ）；シアニン蛍光色素（例えば、Ｃｙ５．５．１８）；およびリボソーム不活性化タンパク質（例えば、ボーガニン（ｂｏｕｇａｎｉｎ）、ゲロニン（ｇｅｌｏｎｉｎ）、またはサポリン−Ｓ６（ｓａｐｏｒｉｎ−Ｓ６））等が挙げられる。

なお、抗体、抗体／細胞毒素結合体、または抗体／発光団結合体としては、例えば、前記タンパク質および／または下記抗原のうちいずれか１種類またはその組合わせを認識するものが挙げられ、抗原としては、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１４、ＣＤ１８、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ３３、ＣＤ４０、ＣＤ４４、ＣＤ５２、ＣＤ８０（Ｂ７．１）、ＣＤ８６（Ｂ７．２）、ＣＤ１４７、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−２受容体、ＩＬ−４受容体、ＩＬ−６受容体、ＩＬ−１３受容体、ＩＬ−１８受容体サブユニット、ＰＤＧＦ−β、ＶＥＧＦ、ＴＧＦ、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β１、ＥＧＦ受容体、ＶＥＧＦ受容体、Ｃ５補体、ＩｇＥ、腫瘍抗原ＣＡ１２５、腫瘍抗原ＭＵＣＩ、ＰＥＭ抗原、ＬＣＧ（肺癌に関連して発現する遺伝子産物）、ＨＥＲ−２、腫瘍関連糖タンパク質ＴＡＧ−７２、ＳＫ−１抗原、結腸癌および／または膵臓癌の患者血清中に高濃度で存在する腫瘍関連エピトープ、胸部、結腸、扁平上皮細胞、前立腺、膵臓、肺および／または腎臓癌細胞、および／または黒色腫、グリオーマもしくは神経芽細胞に発現する癌関連エピトープまたはタンパク質、腫瘍壊死コア、インテグリンα４β７、インテグリンＶＬＡ−４、Ｂ２インテグリン、ＴＲＡＩＬ受容体１、２、３および４、ＲＡＮＫ、ＲＡＮＫリガンド、ＴＮＦ−α、接着分子ＶＡＰ−１、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、細胞間接着分子−３（ＩＣＡＭ−３）、ロイコインテグリンアドヘシン、血小板糖タンパク質ｇｐＩＩｂ／ＩＩＩａ、心臓ミオシンＨ鎖、副甲状腺ホルモン、ｒＮＡＰｃ２（ＶＩＩａ因子−組織因子の阻害薬）、ＭＨＣ Ｉ、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、ＣＴＬＡ−４（細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原である）、Ｆｃ−γ−１受容体、ＨＬＡ−ＤＲ １０β、ＨＬＡ−ＤＲ抗原、Ｌ−セレクチン、ＩＦＮ−γ、呼吸系発疹ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）および黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｓ）等が挙げられる。

このような凝集体を含有する試料液には、タンパク質のモノマー（単量体）と、複数のタンパク質が凝集した凝集体との他、これら以外の混入物が含まれ、この混入物としては、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、免疫グロブリン定常ドメインを有するタンパク質以外のタンパク質等の生体高分子が挙げられる。

より具体的には、混入物としては、タンパク質が遺伝子工学的に処理した宿主生細胞により産生される場合、宿主細胞に由来する、ＤＮＡ、ＲＮＡおよび免疫グロブリン定常ドメインを有しないタンパク質等が挙げられ、また、タンパク質が天然の抗体である場合、血漿中に含まれるアルブミン、βグロブリン、αグロブリンのような免疫グロブリン定常ドメインを有しないタンパク質等が挙げられる。

なお、本実施形態で用意する試料液としては、凝集体の他、モノマーおよび混入物が含まれるものであってもよいし、予め、モノマーおよび混入物の少なくとも一方が除去されたものであってもよい。

試料液中から混入物を除去する方法としては、例えば、プロテインＡ等の結合性タンパク質が固体支持体に固定化された固定化部材を備えるものを吸着剤として用いたアフィニティークロマトグラフィー処理が挙げられる。

また、試料液中からモノマーを除去する方法としては、例えば、第３の工程［３］で説明するクロマトグラフィー処理が挙げられる。

なお、本実施形態では、上記のような混入物およびモノマーを除去する方法を試料液に適用したとしても、その全てが試料液中から除去されることはなく、これらのうちの少なくとも一部は、試料液中に残存することとする。

［２］ 第２の工程
次に、複数のタンパク質が凝集した凝集体にｐＨ６．０以上の緩衝液を接触させる。

これにより、少なくとも２つの同一のタンパク質同士が結合した凝集物（結合物）において、凝集物を形成する結合が切断され、その結果、凝集体からモノマー化された複数のタンパク質を得ることができる。なお、このような凝集体は、タンパク質（抗体）精製において一般的に適用される、例えばｐＨ６を下回る低いｐＨ（特にｐＨ５以下）に晒されることによって、その割合がより増加する傾向にある。

凝集体に対するｐＨ６．０以上の緩衝液の接触は、例えば、前記工程［１］で用意した試料液に緩衝液を添加し、緩衝液が添加された試料液のｐＨを６．０以上に設定することにより行うことができる。

緩衝液が添加された試料液のｐＨは、６．０以上であればよいが、６．０以上、９．０未満であるのが好ましい。これにより、モノマー化されたタンパク質の変質・劣化を的確に抑制または防止しつつ、凝集物を形成する結合を確実に切断することができる。すなわち、変質・劣化が的確に抑制または防止されたタンパク質をモノマーとして確実に得ることができる。

緩衝液としては、特に限定されないが、例えば、トリス（トリス［ヒドロキシメチル］アミノメタン）緩衝液、ＨＥＰＰＳ（Ｎ−［２−ヒドロキシエチル］ピペラジン−Ｎ’−［３−プロパン−スルホン酸］）緩衝液、ＣＡＰＳ（３−［シクロヘキシルアミノ］−１−プロパンスルホン酸）緩衝液およびＣＨＥＳ（２−［Ｎ−シクロヘキシルアミノ］エタンスルホン酸）等が挙げられる。

凝集体に緩衝液を接触させる時間は、０．２〜２４時間程度であるのが好ましく、１〜１０時間程度であるのがより好ましい。これにより、凝集物を形成する結合をより確実に切断することができる。

また、緩衝液が添加された試料液の温度は、２〜４０℃程度であるのが好ましく、１０〜３０℃程度であるのがより好ましい。これにより、モノマー化されたタンパク質の変質・劣化をより的確に抑制または防止しつつ、凝集物を形成する結合を確実に切断することができる。

さらに、緩衝液は、変性剤を含有するのが好ましい。これにより、凝集物（結合物）における結合の切断がより確実に行われることとなるため、凝集体からのモノマーの生成率（回収率）を向上させることができる。

変性剤としては、特に限定されないが、例えば、塩酸グアニジン、尿素およびアルギニン等が挙げられ、これらのうちの１種または２種以上を組み合わせて用いることができる。これにより、モノマー化されたタンパク質の変質・劣化をより確実に防止しつつ、凝集物における結合の切断をより確実に行うことができる。

なお、変性剤としては、界面活性剤として使用されるラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）等であってもよい。

緩衝液中における変性剤の含有量は、０．５〜５．０Ｍ程度であるのが好ましく、１．０〜３．０Ｍ程度であるのがより好ましい。これにより、前記効果をより顕著に発揮させることができる。

以上のように、本発明のモノマー化方法によれば、凝集体にｐＨ６．０以上の緩衝液を接触させるという単純な工程で、凝集体を優れた精度でモノマー化することができる。すなわち、凝集体を高精度でかつ容易にモノマー化することができる。

［３］ 第３の工程
次に、吸着剤として少なくとも表面がリン酸カルシウム系化合物で構成されたものを用いたクロマトグラフィー処理を施し、該クロマトグラフィー処理により得られる分画液を回収する。
これにより、モノマー化されたタンパク質が精製される。

以下、このモノマー化されたタンパク質を、上述した吸着装置１を用いて精製する方法について詳述する。

［３−１］ 吸着装置への供給工程
次に、前記工程［２］を経ることで、モノマー化されたタンパク質を含む試料液を、吸着装置１に供給する。すなわち、モノマー化されたタンパク質を含む試料液を、吸着装置１の流入管２４およびフィルタ部材４を介して吸着剤３に供給する。

これにより、カラム２（吸着装置１）内を試料液が通過して、少なくとも表面がリン酸カルシウム系化合物で構成される吸着剤３に試料液が接触する。

この際、試料液中に含まれる緩衝液または塩類のｐＨおよび濃度が以下のようになるように設定する。

すなわち、吸着剤３に対する吸着能が凝集体およびモノマーを含むタンパク質で高くなり、その他の混入物で低くなるように設定されている。

換言すれば、本工程［３］は、混入物は、吸着剤３に吸着（結合）しないが、凝集体およびモノマーを含むタンパク質は、吸着剤３に吸着（結合）する条件下で実施される。

これにより、凝集体およびモノマーを含むタンパク質が、吸着剤３に吸着（結合）され、混入物が、フィルタ部材５および流出管２５を介してカラム２内から流出液として流出する。

緩衝液または塩類としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、塩化物、フッ化物、酢酸塩、リン酸塩および／またはクエン酸塩、ならびに／あるいはトリス緩衝液が挙げられ、中でも、トリス緩衝液またはリン酸ナトリウム緩衝液であるのが好ましい。
そのような緩衝液または塩類は、６．０以上のｐＨに設定される。

また、リン酸ナトリウム緩衝液を用いる場合、その濃度は、特に限定されないが、好ましくは０．５〜５０ｍＭ、より好ましくは１５〜５０ｍＭ程度に設定される。

さらに、リン酸緩衝液（リン酸ナトリウム緩衝液）のｐＨは、６．０〜８．６程度であるのが好ましく、６．０〜７．０程度であるのがより好ましい。

以上のことを考慮すると、かかる溶液としては、特に、濃度５０ｍＭ程度、ｐＨ７．０程度のリン酸ナトリウムが好ましく用いられる。

［３−２］ 吸着装置による分画工程
次に、吸着装置１の流入管２４からカラム２内に、タンパク質を流出させるための溶出液（洗浄液）を供給する。そして、カラム２内から流出管２５を介して流出する流出液を、所定量ずつ分画（採取）する。これにより、吸着剤３に吸着しているモノマーと凝集体とは、それぞれ、モノマーおよび凝集体が有する吸着剤３に対する吸着力の差に応じて、各分画内に溶出した状態で回収（分離）される。

そのため、モノマーが溶出した分画を分画液として回収することで、モノマー化されたタンパク質が精製される。

ここで、カラム２内に供給する溶出液は、前記工程［３−１］で説明した緩衝液を用いることができ、モノマーおよび凝集体が有する吸着剤３に対する吸着力の差に応じて、それぞれが溶出する分画が異なるものが用いられる。

このような溶出液は、具体的には、そのｐＨが好ましくは６．０〜９．０程度、より好ましくは７．０〜８．０程度のリン酸緩衝液が好適に用いられる。これにより、分離するモノマー化されたタンパク質の変質（変性）を防止することができ、その特性が変化するのを防止することができる。また、吸着剤３の変質（溶解等）を好適に防止することができ、吸着装置１における分離能の変化を防止することもできる。

溶出液としてリン酸系緩衝液を用いる場合、その温度は、特に限定されないが、３０〜５０℃程度であるのが好ましく、３５〜４５℃程度であるのがより好ましい。これにより、分離するタンパク質の変質（変性）を防止することができる。

また、この場合における、リン酸系緩衝液の塩濃度は、１．０ｍＭ〜５００ｍＭ程度であるのが好ましく、１０ｍＭ〜４００ｍＭ程度であるのがより好ましい。このような塩濃度のリン酸系緩衝液を用いて、凝集体とモノマーとの分離を行うことにより、リン酸系緩衝液中の金属イオンによるモノマー（タンパク質）への悪影響を防止することができる。

また、リン酸系緩衝液は、凝集体とモノマーとの分離操作の際に、連続的または段階的に変化させるのが好ましい。これにより、凝集体とモノマーとの分離操作の効率化を図ることができる。

さらに、リン酸系緩衝液の流速は、０．１〜１０ｍＬ／分程度であるのが好ましく、１〜５ｍＬ／分程度であるのがより好ましい。このような流速で、凝集体とモノマーとの分離を行うことにより、分離操作に長時間を要することなく、凝集体とモノマーとを確実に分離すること、すなわち、高純度にモノマー化されたタンパク質を精製することができる。
以上のような操作により、所定の画分に、モノマー化されたタンパク質が回収される。

また、モノマー化されたタンパク質が回収される画分とは異なる画分には、凝集体が回収される。この凝集体が回収される画分を、ｐＨ６．０以上とし、一定時間保持することで、この凝集体を、さらに、各タンパク質にモノマー化することができる。

そのため、凝集体が回収された画分に対して、上述した工程［３−１］、［３−２］を繰り返して行うこと、すなわち、クロマトグラフィー処理を繰り返して行うことにより、モノマー化されたタンパク質をより優れた収率で回収することができる。

なお、凝集体が回収される画分を、ｐＨ６．０以上で保持する時間は、特に限定されないが、５．０〜４８時間程度であるのが好ましく、１０〜４５時間程度であるのがより好ましい。

また、凝集体が回収される画分のｐＨは、６．０以上であればよいが、６．０以上、９．０未満であるのがより好ましい。

凝集体が回収される画分を保持する際の条件を上記範囲内に設定することにより、凝集体をより優れた精度でモノマー化することができる。

以上、本発明のモノマー化方法について説明したが、本発明は、これに限定されるものではない。

例えば、本発明では、任意の目的で、工程［１］の前工程、各工程［１］〜［３］同士の間に存在する中間工程、または工程［３］の後工程を追加するようにしてもよい。

また、前記工程［２］において、試料液中に含まれる凝集体を検出限界以下となるようにモノマー化できる場合には、前記工程［３］を省略することができる。

さらに、前記工程［１］において、混入物を除去して凝集体およびモノマーを粗精製する方法として、アフィニティークロマトグラフィー法を用いるのに代えて、吸着剤として陰イオン交換樹脂または陽イオン交換樹脂を備えるイオン交換クロマトグラフィー法を用いるようにしてもよい。

また、前記実施形態では、免疫グロブリン定常ドメインを有する、天然の抗体、または組換え融合タンパク質の凝集体を、モノマー化する場合について説明したが、このようなタンパク質に限定されず、アルブミン、フィブリノゲン、ペプシノーゲンのような免疫グロブリン定常ドメインを有しないタンパク質の凝集体を、本発明によればモノマー化することができる。

次に、本発明の具体的実施例について説明する。
・免疫グロブリン定常ドメインを有するタンパク質に対するｐＨの影響
（実施例Ａ）
−１− まず、免疫グロブリン定常ドメインを有するタンパク質として、抗ヒトＣＤ２０ヒト・マウスキメラ抗体（中外製薬社製、「一般名：リツキシマブ」）を試料液Ａ（ｐＨ６．８）として用意し、この試料液Ａに、０．１Ｍ ＨＣｌを添加することでそのｐＨを３．２８とした後、６４時間放置した。

なお、ｐＨが３．２８および６．８の試料液Ａについて、それぞれ、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）処理を施したところ、図２に示すように、ｐＨが６．８の試料液Ａでは、凝集体の形成が認められないものの、ｐＨ３．２８の試料液Ａでは、凝集体の形成が認められた。

なお、元々のｐＨ６．８の試料液Ａには凝集体が含まれていない。ｐＨが３．２８の試料液Ａは、後工程に供する試料液の作成として、ｐＨを低くすることで強制的に凝集体を形成した。よって、ｐＨが３．２８の試料液Ａには、凝集体とモノマーが共に含まれる。

−２− 次に、ｐＨが３．２８の試料液Ａについて、吸着装置を用いて、ハイドロキシアパタイト処理を施した。

すなわち、１ｍＬのｐＨが３．２８の試料液Ａを、吸着装置内に供給（アプライ）した後、溶出液Ａを０．５ｍＬ／ｍｉｎの流速で５分間で供給し、次いで、溶出液Ａおよび溶出液Ｂを、それらの容量比で溶出液Ｂが０％〜１００％に連続的に変化するように、０．５ｍＬ／ｍｉｎの流速で３０分間供給し、その後、この状態を維持した状態で溶出液Ａおよび溶出液Ｂを５分間供給して、カラム内から流出する流出液を１ｍＬずつ分画した。

なお、吸着装置には、吸着剤としてハイドロキシアパタイトビーズ（ＣＨＴ ＴｙｐｅII、平均粒径２０μｍ、ＨＯＹＡ社製）を約０．８ｇ充填した、カラム（サイズ４ｍｍ×１００ｍｍ）を用いた。

また、溶出液Ａには、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）を、溶出液Ｂには、４００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）を、それぞれ用いた。

−３− 次に、５０μＬのｐＨが６．８０の試料液Ａ（Control）についても、前記工程−２−で説明したのと同様にして、吸着装置を用いて、ハイドロキシアパタイト処理を施した。

その結果、図３に示すように、図２に示したＳＥＣ処理の結果と同様に、ｐＨが６．８の試料液Ａでは、凝集体の形成が認められないものの、３．２８の試料液Ａでは、凝集体の形成が認められた。

また、ｐＨが３．２８および６．８の試料液Ａでは、画分１１でモノマーが回収され、ｐＨが３．２８の試料液Ａでは、画分１８〜画分２３で凝集体が回収される結果となった。なお、図２に示すようにＳＥＣによっても凝集体とモノマーが分離されているが、ＳＥＣでは画分中における目的物濃度が低下してしまうため、ハイドロキシアパタイトによる処理が好ましく用いられる。

−４− 次に、ｐＨが３．２８の試料液Ａから得られた画分（フラクション）１８を、４℃の条件下で、４０８時間保存した。

そして、かかる条件下で保存した画分１８（ｐＨ６．５）について、その経過時間が、２時間、４４時間および４０８時間に達した時点で、それぞれ、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）処理を施した。

その結果、図４に示すように、画分１８では、そのｐＨを回収時の状態を維持すること、すなわちｐＨを６．５とすることで、複数のタンパク質が凝集した凝集体がモノマー化される結果となった。

ただし、４０８時間保存した画分１８では、Volume５．５ｍＬ付近に凝集体に由来するピークが強く認められるため、長時間の画分１８の保存により、凝集体を構成するタンパク質が変質・劣化したものと推察される。

・免疫グロブリン定常ドメインを有するタンパク質に対するｐＨおよび変性剤の影響
（実施例１Ｂ）
−１− まず、免疫グロブリン定常ドメインを有するタンパク質として、抗ヒトＣＤ２０ヒト・マウスキメラ抗体（中外製薬社製、「一般名：リツキシマブ」）を試料液Ａ（ｐＨ６．８）として用意し、この試料液Ａに、０．１Ｍ ＨＣｌを添加することでそのｐＨを３．２８とした後、６４時間放置した。

−２− 次に、ｐＨが３．２８の試料液Ａについて、０．１Ｍ ＮａＯＨを添加することにより、ｐＨが７．５の試料液１Ｂを調製した。

−３− 次に、ｐＨが７．５の試料液１Ｂを、４℃の条件下で、２４時間保存した。

そして、かかる条件下で保存した試料液１Ｂについて、その経過時間が、０時間および２４時間の時点で、それぞれ、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）処理を施した（図５参照。）。

（実施例２Ｂ）
前記実施例１Ｂの工程−２−において、ｐＨが３．２８の試料液Ａに対して、最終濃度が０．５Ｍとなるように塩酸グアニジンを添加した後、さらに、０．１Ｍ ＮａＯＨを添加することにより、ｐＨが７．５の試料液２Ｂを調製したこと以外は、前記実施例１Ｂと同様にして、試料液２Ｂのサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）処理を実施した（図６参照。）。

（実施例３Ｂ）
前記実施例１Ｂの工程−２−において、ｐＨが３．２８の試料液Ａに対して、０．１Ｍ ＮａＯＨを添加することにより、ｐＨが９．５の試料液３Ｂを調製したこと以外は、前記実施例１Ｂと同様にして、試料液３Ｂのサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）処理を実施した（図７参照。）。

（実施例４Ｂ）
前記実施例１Ｂの工程−２−において、ｐＨが３．２８の試料液Ａに対して、最終濃度が０．５Ｍとなるように塩酸グアニジンを添加した後、さらに、０．１Ｍ ＮａＯＨを添加することにより、ｐＨが９．５の試料液４Ｂを調製したこと以外は、前記実施例１Ｂと同様にして、試料液４Ｂのサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）処理を実施した（図８参照。）。

その結果、図５〜８に示すように、実施例１Ｂ〜４Ｂの試料液１Ｂ〜４Ｂでは、そのｐＨを６．０以上とすることで、複数のタンパク質が凝集した凝集体がモノマー化される傾向を示した。

さらに、このようなモノマー化は、塩酸グアニジンのような変性剤が添加された試料液２Ｂ、４Ｂとすることで、より確実に行われる傾向を示した。

１ 吸着装置
２ カラム
２０ 吸着剤充填空間
２１ カラム本体
２２、２３ キャップ
２４ 流入管
２５ 流出管
３ 吸着剤
４、５ フィルタ部材

Claims (10)

1. 複数のタンパク質が凝集した凝集体を、各タンパク質にモノマー化するモノマー化方法であって、
   前記凝集体を含有する試料液を用意する第１の工程と、
   前記凝集体にｐＨ６．０以上の緩衝液を接触させて、前記凝集体からモノマー化された前記タンパク質を得る第２の工程とを有することを特徴とするモノマー化方法。
2. 前記緩衝液のｐＨは、６．０以上、９．０未満である請求項１に記載のモノマー化方法。
3. 前記緩衝液は、変性剤を含有する請求項１または２に記載のモノマー化方法。
4. 変性剤は、塩酸グアニジン、尿素およびアルギニンのうちの少なくとも１種である請求項３に記載のモノマー化方法。
5. 前記第２の工程の後に、吸着剤として少なくとも表面がリン酸カルシウム系化合物で構成されたものを用いたクロマトグラフィー処理を施し、該クロマトグラフィー処理により得られる分画液を回収することで、モノマー化された前記タンパク質を精製する第３の工程を有する請求項１ないし４のいずれか１項に記載のモノマー化方法。
6. 前記第３の工程において、前記クロマトグラフィー処理を複数回行う請求項５に記載のモノマー化方法。
7. 前記第３の工程における、前記クロマトグラフィー処理は、
   前記吸着剤に前記第２の工程で得られた前記タンパク質を含有する試料液を接触させ、前記吸着剤に前記タンパク質を吸着させる工程と、
   前記吸着剤に溶出液を供給し、得られる分画液を回収することで、該分画液中に前記吸着剤から溶出した前記タンパク質が精製される請求項５または６に記載のモノマー化方法。
8. 前記溶出液は、塩濃度が１．０ｍＭ〜５００ｍＭのリン酸緩衝液である請求項７に記載のモノマー化方法。
9. 前記溶出液は、ｐＨが６．０〜９．０のリン酸緩衝液である請求項７または８に記載のモノマー化方法。
10. 前記タンパク質は、免疫グロブリン定常ドメインを有する、天然の抗体、または組換え融合タンパク質である請求項１ないし９のいずれか１項に記載のモノマー化方法。

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