JP2014207018A

JP2014207018A - 超解像光ゆらぎイメージング（ｓｏｆｉ）

Info

Publication number: JP2014207018A
Application number: JP2014149779A
Authority: JP
Inventors: エンダーラインヨルグ; Enderlein Joerg
Original assignee: Sofast GmbH
Current assignee: Sofast GmbH
Priority date: 2009-06-02
Filing date: 2014-07-23
Publication date: 2014-10-30
Anticipated expiration: 2030-06-02
Also published as: US20100303386A1; US20140099043A1; EP2438555A4; EP2438555A1; JP2012529119A; JP5856252B2; US9111366B2; EP2438555B1; JP5588507B2; US8625863B2; WO2010141608A1

Abstract

【課題】ゆらぐ物体の画像スタックの、自己及び相互相関／キュムラントに基づいた統計的分析技術を用いて、古典的回折限界を超えて解像度を向上させ、バックグランドを低減させる。【解決手段】画像フレームにおける全てのピクセルの時間軌道は、それ自身及び／又は隣接するピクセルの時間軌道と相関している。時間差の間隔について任意の時間差又は平均された又は統合された時間差における各ピクセルの自己又は相互相関／キュムラントの振幅は、生成された超解像光ゆらぎ画像における当該ピクセルの強度値として用いられる。【選択図】図２

Description

本願は、２００９年６月２日に出願された「超解像光ゆらぎイメージング（ＳＯＦＩ）」と題したヨルク・エンデルラインの仮出願番号６１１８３５１９の優先権に依存するものである。

本発明は概して、データスタック（時間関数としての複数のｘ−ｙ画像／フレームのシーケンス、すなわち、動画）の信号処理方法に基づくサブ回折及びバックグランド低減の光（又は、電磁波）画像法に関する。この方法は、画像のシーケンス（動画）に記録される時間ゆらぎ（例えば、蛍光点滅／間欠性により発生する）の複数次の自己及び相互相関（及び自己／相互キュムラント）の統計的分析に基づく。この方法は、発光物体、吸収物体又は、拡散点滅物体からなる超解像静止サンプル及び非静止サンプルに適用することができる。使用分野には、顕微鏡法、望遠鏡使用法、医用イメージング及び、他の形式の電磁波イメージングなどが含まれる。

本発明の背景を説明しその実践に関する詳細を追加するために本明細書おいて引用する出版物、特許及び、他の参考資料は、本明細書に含まれるものとする。

光学的画像法（顕微鏡法、望遠鏡使用法など）の空間解像度は、光の回折限界（アッベ限界）によって制限される。光学的顕微鏡法及び、特に、蛍光顕微鏡法によって、生細胞、組織及び生きた有機体の３次元（３Ｄ）の研究を可能とする。しかしながら、上述した限界のために、可視光の発光波長（〜２００―３００ｎｍ）のおよそ半分よりも小さい特徴を、従来の遠視野顕微鏡法で解像することはできない。同様に、天体観測では、光の回折限界よりも低い隣接する天体を解像することはできない。

電子顕微鏡法（走査電子望遠鏡、伝送電子顕微鏡、低温電子顕微鏡）及び、走査型プローブ顕微鏡法（走査トンネル顕微鏡、原子間力顕微鏡）などの他の非光学画像法により分子レベルの解像を達成するが、生体内の特徴を結像するためには好適ではない。それらは、分析している表面（膜）又は固定された薄く分割されたサンプルに限定される。

光学的回折限界は、最近の１０年間に以下に説明するような新しい概念の導入により克服されてきた。

ヘル（Hell）及びヴィックマン（Wichmann）、「誘導放出による回折解像限界の打破：誘導放出の枯渇による蛍光顕微鏡法（Breaking the Diffraction resolution limit by stimulated emission: Stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy）」、１９９４年、米国光学学会、オプティックスレターズ（Optics Letters）、第１９巻、７８０−７８２頁、ヘル（Ｈｅｌｌ）及びクロウク（Ｋｒｏｕｇ）、「基底状態の枯渇による蛍光顕微鏡法：回折解像限界を打破するための概念（Ground-state-depletion fluorescence microscopy: A concept for breaking the diffraction resolution limit)」、１９９５年、応用物理Ｂ、レーザーズオプティックス（Lasers Optics）、第６０巻、４９５−４９７頁、クラー（Klar）等、「遠視野蛍光顕微鏡法におけるサブ回折解像度（Subdiffraction resolution in far-field fluorescence microscopy）」、１９９９年７月１５日、米国光学学会、オプティックスレターズ（Optics Letters）、第２４巻、１４番、９５４−９５６頁、ＵＳ５７３１５８８、ＵＳ７７１９６７９、ＵＳ７５３８８９３、ＵＳ７４３００４５、ＵＳ７２５３８９３及びＵＳ７０６４８２４は、特別な装置、特別なエミッタ（フルオロフォア）及び比較的強いレーザー照明が必要な誘導放出の枯渇（ＳＴＥＤ）顕微鏡法及び関連方法を教示する。

グスタフソン（Gustafsson）、「構造化照明顕微鏡法を用いて２の係数により方位解像限界を上回ること（Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy）」、２０００年、顕微鏡法ジャーナル（Journal of Microscopy）、第１９８巻、８２−８７頁、ハインツマン（Heintzmann）等、「飽和しパターン形成された励起顕微鏡法：光学的解像度の向上のための概念（Saturated patterned excitation microscopy: A concept for optical resolution improvement）」、２００２年、米国光学学会Ａジャーナル（Journal of Optical Society of America A）、第１９巻、１５９９−１６０９頁、グスタフソン（Gustafsson）等、（ＩＭ）−Ｍ−５「１００ｎｍよりもいい距離解像度を有する３次元広視野光顕微鏡法（3D wide-field light microscopy with better than 100-nm axial resolution）」、１９９９年、顕微鏡法ジャーナル（Journal of Microscopy）、第１９５巻、１０−１６頁及び、ＵＳ５６７１０８５は、構造的照明顕微鏡法及び飽和した構造的照明顕微鏡法（ＳＩＭ／ＳＳＩＭ）及び画像干渉顕微鏡法（Ｉ⁵Ｍ）を教示する。

ベッチック（Betzig）等、「ナノメートル解像度での細胞間蛍光タンパク質のイメージング（Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution）」、２００６年、サイエンス、第３１３巻、１６４２−１６４５頁、ヘス（Hess）等、「蛍光光活性化局在性顕微鏡法による超高解像イメージング（Ultra-high-resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy）」、２００６年、生物物理学ジャーナル（Biophysics Journal）、第１９巻、４２５８−４２７２頁、ＵＥ７７１０５６３、ＵＳ７６２６７０３、ＵＳ７６２６６９５、ＵＳ７６２６６９４、ＵＳ７５３５０１２は、光活性化局在性顕微鏡法（ＰＡＬＭ）及び関連した方法を教示し、ラスト（Rust）等、「確率的光学再構築顕微鏡法によるサブ回折限界イメージング（Subdiffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy （STORM)）」、２００６年、ネーチャーメソッド（Nature Methods）、第３巻、７９３−７９５頁は、関連する確率論的光学再構成顕微鏡法（ＳＴＯＲＭ）を教示する。

マリオット（Mariott）等、「生細胞におけるコントラストが向上した画像のための光学ロックイン検出イメージング顕微鏡法（Optical lock-in detection imaging microscopy for contrast enhanced imaging in living cells）」、２００８年、国立科学アカデミー予稿集、米国、第１０５巻、１７７８９−１７７９４頁によって教示されるように、切換可能な蛍光プローブの発展も、光学ロックイン検出（ＯＬＩＤ）などの新しいバックグランド低減、コントラスト向上技術の出現を引き起こした。

ＳＴＥＤは、ビデオレートの解像度を向上させたが、この方法は、標識化手順、染料の選択に関して非常に注文が多く、退屈な位置合わせの手順を必要とするため、困難である。最近の１１Ｈｚでの超解像顕微鏡法は、ＳＩＭを用いて示され、２倍増の方位解像度を実現する。シュテンゲル（Shtengel）等、「３次元細胞超微細構造を解像する干渉蛍光超解像顕微鏡法（Interferometric fluorescent super-resolution microscopy resolves 3D cellular ultrastructure）」、２００９年、国立科学アカデミー予稿集、第１０６巻、米国、３１２５−３１３０頁、ジュエット（Juette）等、「厚いサンプルの３次元サブ１００ｎｍ解像蛍光顕微鏡法（Three-dimensional sub-100-nm resolution fluorescence microscopy of thick samples）」、２００８年、ネーチャーメソッド（Nature Methods）、第５巻、５２７−５２９頁、フアン（Huang）等、「ナノメートル解像度を有する細胞構造間の相互作用を解明する全細胞３次元ＳＴＯＲＭ（Whole-cell 3D STORM reveals interactions between cellular structures with nanometer-scale resolution）」、２００８年、ネーチャーメソッド（Nature Methods）、第５巻、１０４７−１０５２頁によって教示されるように、全ての超解像法は、３次元での解像度を向上させることができるが、主要な技術的要求又は顕微鏡法への修正を犠牲にすることが多い。ＰＡＬＭ及びＳＴＯＲＭは、ナノメートルの解像度を実現するが、その代わりに取得速度が遅い。完全な超解像画像の取得には、通常数分から数時間かかる。最後に、ＯＬＩＤは、向上したコントラストを有する早いイメージングを提供するが、超解像の能力に欠ける。

リドケ（Lidke）等は、「点滅統計を用いた量子ドットの局在性による超解像（Superresolution by localization of quantum dots using blinking statistics）」、２００５年、オプティックスエクスプレス（Optics Express）、第１３巻、７０５２−７０６２頁において、エミッタを分解し局在させるための高次統計的分析に基づいてエミッタを同時に重ね合わせ変動させる分析方法を教示する。彼らが開発してきたものは、独立成分分析（ＩＣＡ）及びＱＤの点滅の統計に基づく超解像イメージングである。彼らは、この方法が、回折限界よりも下に狭い間隔で並んだＱＤを解像することができることを示した。リドケ（Lidke）等が指摘したように、ＱＤの数を少なく又は多く見積もることで、（正しくない数の）エミッタの軌跡の判断における精度に影響を与えてしまう。現行の発明（ＳＯＦＩ）において示されているように、エミッタの数についてのそのような演繹的知識は必要としない。「ウェーブレットのプレフィルタリングを用いる力学的スペクル照明（ＤＳＩ）顕微鏡法（Dynamic speckle illumination （DSI) microscopy with wavelet pre-filtering）」、２００７年、オプティックスレターズ（Optics Letters）、第３２巻、１４１７−１４１９頁、２００７年においてベンタロン（Ventalon）等は、分散の線形加算に基づいた統計学的分析法を議論する。それは、観察された信号のゆらぎの評価に基づくが、励起光によって誘導され、その後、ＳＯＦＩと同様な方法で評価される。この手法により光軸に沿ったセクショニングを生じさせたとしても、ゆらぎが独立した微視的（すなわち、サブ回折の大きさの）エミッタからのものではなく、回折限界のスペックルからのものであるという事実により、回折限界であるためにＤＳＩ解像度において本質的に限界が強いられる。ＳＯＦＩと上述した方法は、相関関数の共通な数学的概念にのみその起源を有するという類似点を有する。しかしながら、これらの手法の詳しい分析によって、能力、結果として得られる効果、利用法及び応用において、劇的な違いが明らかとなる。

そのため、シンプルで、早く、低コストで、内在する３次元の可能性を有し、光毒性を持たず、生体細胞の画像化に適している超解像イメージング及びバックグランド低減イメージングに対して大きな需要がある。この方法は、フレキシブルで、様々な広く展開された市販の顕微鏡によって取得された画像スタックにおいて実施可能であり、その実施及び操作が簡単でなければならない。

本発明は、古典的回折限界を超えて解像度を向上させバックグランドを低減させる、ゆらぐ物体の画像スタック（動画）の統計的分析技術（自己及び相互相関／キュムラントに基づく）を開示するものである。画像フレームにおける全てのピクセルの時間軌道は、それ自身及び／又は隣接するピクセルの時間軌道と相関している。各ピクセルの（時間差の間隔について、任意の時間差又は平均された又は統合された時間差での）自己又は相関関数／キュムラントの振幅は、生成された超解像ＳＯＦＩ画像における当該ピクセルの強度値として用いられる。使用分野には、顕微鏡法、望遠鏡使用法、医用イメージング及び他の形式の点滅物体の電磁波イメージングが含まれる。

図１（ａ）〜図１（ｆ）は、ＳＯＦＩ法を用いてバックグランドを低減した超解像画像を生成すために必要なステップを表す図である。図１（ａ）〜図１（ｆ）は、ＳＯＦＩ法を用いてバックグランドを低減した超解像画像を生成すために必要なステップを表す図である。図１（ａ）〜図１（ｆ）は、ＳＯＦＩ法を用いてバックグランドを低減した超解像画像を生成すために必要なステップを表す図である。図１（ａ）〜図１（ｆ）は、ＳＯＦＩ法を用いてバックグランドを低減した超解像画像を生成すために必要なステップを表す図である。図１（ａ）〜図１（ｆ）は、ＳＯＦＩ法を用いてバックグランドを低減した超解像画像を生成すために必要なステップを表す図である。図１（ａ）〜図１（ｆ）は、ＳＯＦＩ法を用いてバックグランドを低減した超解像画像を生成すために必要なステップを表す図である。図２は、２次ＳＯＦＩ画像を生成するためのプロトコルを詳述するフローチャートである。図３（ａ）〜図３（ｃ）は、異なる時間差構成を用いて２次自己相関関数に基づいたＳＯＦＩ画像を得るための様々な方法を表す図である。図３（ａ）〜図３（ｃ）は、異なる時間差構成を用いて２次自己相関関数に基づいたＳＯＦＩ画像を得るための様々な方法を表す図である。図３（ａ）〜図３（ｃ）は、異なる時間差構成を用いて２次自己相関関数に基づいたＳＯＦＩ画像を得るための様々な方法を表す図である。図４（ａ）〜図４（ｃ）は、異なる時間差構成を用いて２次相互相関関数に基づいたＳＯＦＩ画像を得るための様々な方法を表す図である。図４（ａ）〜図４（ｃ）は、異なる時間差構成を用いて２次相互相関関数に基づいたＳＯＦＩ画像を得るための様々な方法を表す図である。図４（ａ）〜図４（ｃ）は、異なる時間差構成を用いて２次相互相関関数に基づいたＳＯＦＩ画像を得るための様々な方法を表す図である。図５（ａ）〜図５（ｃ）は、ＳＯＦＩ画像に対してインターリーブするピクセルを、物理ピクセル間において生成する原理を示す図である（特定の２次キュムラントの場合についての例を示す）。図５（ａ）〜図５（ｃ）は、ＳＯＦＩ画像に対してインターリーブするピクセルを、物理ピクセル間において生成する原理を示す図である（特定の２次キュムラントの場合についての例を示す）。図５（ａ）〜図５（ｃ）は、ＳＯＦＩ画像に対してインターリーブするピクセルを、物理ピクセル間において生成する原理を示す図である（特定の２次キュムラントの場合についての例を示す）。図６は、相互キュムラントを用いてインターリーブピクセルを生成し、距離係数に対して補正するためのプロトコルを詳述するフローチャートである。図７（ａ）〜７（ｄ）は、完全にアップサンプルされた２次ＳＯＦＩ画像を得るためにピクセルの時間軌道を相互相関させることができる例を示す図である。図７（ａ）〜７（ｄ）は、完全にアップサンプルされた２次ＳＯＦＩ画像を得るためにピクセルの時間軌道を相互相関させることができる例を示す図である。図７（ａ）〜７（ｄ）は、完全にアップサンプルされた２次ＳＯＦＩ画像を得るためにピクセルの時間軌道を相互相関させることができる例を示す図である。図７（ａ）〜７（ｄ）は、完全にアップサンプルされた２次ＳＯＦＩ画像を得るためにピクセルの時間軌道を相互相関させることができる例を示す図である。図８は、２次自己相関及び相互相関を用いてアップサンプリングされた２次ＳＯＦＩ画像を生成するためのプロトコルを詳述するフローチャートである。図９（ａ）及び図９（ｂ）は、相互相関がある様々なピクセルの時間軌道による同じＳＯＦＩピクセルの求め方を示す図である。図９（ａ）及び図９（ｂ）は、相互相関がある様々なピクセルの時間軌道による同じＳＯＦＩピクセルの求め方を示す図である。図１０は、ＳＯＦＩの解像度向上を従来の広視野顕微鏡法のものと比較する図である。

ＳＯＦＩは、独立して点滅する点のような物体（図１（ａ））を含む視野又はそのような物体で標識付けられる構造を結像させる方法である。「点のような」とは、イメージングシステムの点広がり関数（ＰＳＦ）のサイズよりもずっと小さいエミッタのサイズを言う。エミッタのそれぞれは、放射、吸収、拡散などの１つ以上の光学的特性において、確率的及び独立的（互いに）にゆらぎ（又は「点滅」）する。ゆらぎは、物体それ自体に内在するものであっても良いし、外部手段によって誘発されるものであっても良いが、独立していなければならず、他の物体間で同期されてはならない。ゆらぎは、その要因が（分子の）遷移、（分子の）配向性又は、（分子の）配座にあり、ある光学的特性を測定可能な度合いに変更させる。これは、例えば、分子の２つ以上のエネルギー状態同士の遷移によるもの又は、分子の双極子再配向による光学的偏光放出、吸収又は、拡散における変化によるものであっても良い。ゆらぎ（又は、点滅）は、例えば、「オン」や「オフ」といった蛍光状態のようなバイナリ特性を有する必要はないことが強調される。測定可能なゆらぎであれば、ＳＯＦＩ画像の生成に用いることができる。この例において、エミッタのｋ及びｊは、回折限界よりも短い距離によって分離される。

上述した視野（サンプル又は対物面）は、光学的イメージングシステム（顕微鏡、望遠鏡など）を、デジタルカメラ（又は他のアレイ検出器）を用いて平行又は連続して（１ピクセルずつ）（図１（ｂ））、繰り返し（１フレームずつ）、時間をかける（すなわち、データは、様々な低速度撮影の顕微鏡法の１つによって取得される）ことによって結像される。エミッタｋ及びｊ（及び他の全てのエミッタ）からの信号は、光の回折による顕微鏡点広がり関数（ＰＳＦ）で本来折り畳まれ、サブ回折グリッドに時間関数として記憶される（例えば、ＣＣＤカメラのピクセルや走査像）。これにより、図１（ａ）の点線で描いた箱に詳細を示した視野のひと続きの拡大図（動画、画像のスタック又は、フレーム、図１（ｃ））が生成される。イメージングシステム及び記録システムの構成は、空間及び時間における物体のゆらぎ（例においては、点滅蛍光エミッタ）を検出して記録するのに適しており、十分な感度を有する。視野は、記録された画像の１ピクセルがＰＳＦの画像の大きさの断片に対応する程度までイメージングシステムによって拡大される（すなわち、例えば、〜４ｘ４−１０ｘ１０ピクセルによってＰＳＦがサンプルされる）。

時間軌道（又は、時間トレース）は、その位置ｒ_i：Ｆ（ｒ_i，ｔ）（図１（ｄ））における時間ｔの関数として（蛍光）強度のゆらぎを表す、記録された画像スタックにおけるピクセル毎ｒ_i＝（ｘ_i，ｙ_i，ｚ_i）に抽出される。ｉは、アレイ検出器の全てのピクセルを列挙する離散インデックスである。各ピクセルの時間軌道は、それぞれのエミッタの信号（そのＰＳＦは、特定のピクセルのＰＳＦに寄与する）の加重和からなる。その時間軌道がエミッタｋ及びｊから発せられる信号の加重和である（図１（ｃ）に示したような）３つの仮想ピクセルｉ−１，ｉ，ｉ＋１の時間軌道を示す。

Ｆ（ｒ_i，ｔ）の時間平均値を計算して、記憶した時間軌道から減算することでゼロ平均ゆらぎ信号

を生成する。

は、時間平均を表す。
次に、時間２次自己相関関数

をピクセルの時間軌道毎に計算して、結果としてＧ２（ｒｉ，０，１）の値の行列を得る。一般性を喪失することなく、τ₁＝０及びτ₂＝０を設定すると、０は、動画の第１のフレームの時点を表し、１は、２つの隣接するフレーム間の時間差を表す（しかしながら、記録された時間範囲内におけるτ₁及びτ₂対しては、如何なる時間差の値を選んでも良い）（図１（ｅ）及び図３（ａ））。この数学操作の有益な結果は、無相関なバックグランドを排除することである。

ＳＯＦＩ画像は、

に従って、行列Ｇ₂（ｒ_i，０，１）から構成される。ここで、各ピクセルは、値Ｓ₂（ｒ_i）が割り当てられる（式１及び図１（ｆ））。ｋは、サンプル／視野内における全ての物体／エミッタに渡って延びる。時間差の他の選択又は、選択した時間差の範囲に渡るこれらの関数の有限積分の値を利用することができる。この例では、エミッタｋ及びｊは、ここでは、結果として得られたＳＯＦＩ画像に解像される。

元々の画像（位置ｒ_j）は、物体／エミッタｋ毎の形式Ｕ（ｒ_k−ｒ_i）の点広がり関数（ＰＳＦ）の重ね合わせからなる一方、ＳＯＦＩ画像は、明るさのターム

及び各エミッタの時間的ゆらぎを表すタームによって拡大された形式Ｕ²（ｒ_k−ｒ_i）のＰＳＦの重ね合わせからなる。近似された３次元ガウスＰＳＦは、

結果として得られたＳＯＦＩ修正されたＰＳＦの関数形式は、

ここで、

及び

である。その結果、ＰＳＦの幅は、ｘ，ｙ，ｚのそれぞれの方向において、係数√２によって減少する。ＰＳＦは多くの場合、上記式が正当であることを証明する３次元のガウス分布として近似させてモデル化することができる。このことは、エアリーディスクなどのＰＳＦのより正確な説明又は実際の実験的手法で決まったＰＳＦについても言える。ＳＯＦＩ修正されたＰＳＦは、形式Ｕ²（ｒ）を依然として持つが、幅は結果として縮小する。

図２は、段落００１６から００３０までに説明したようなＳＯＦＩアルゴリズムのステップを要約する図である。

実施例１：任意の時間差を用いた２次自己相関に基づくＳＯＦＩ
任意の時間差τ_jに対する２次自己相関関数Ｇ₂（ｒ_i，τ₁，τ₂）は、

によって与えられる。
ＳＯＦＩ画像は、段落００１９から００２２において説明したように時間差τ₁＝０及びτ₂＝１に対してだけではなく、τ₁、τ₂の任意の組み合わせに対する時間差２次自己相関関数を用いて生成することができる（図３（ｂ））。多くのそのような組み合わせを重ね合わせることでもＳＯＦＩ画像を生成することができる（式（５）及び図３（ｃ））。

なお、τ_jは、有限の時間差の値であっても良く、時間差同士の差であっても良い。

実施例２：高次自己キュムラントに基づくＳＯＦＩ
好適な実施形態及び実施例１（段落００１６〜００３４）の上記説明では、２次自己相関を利用する。自己キュムラントの概念を利用して高次ＳＯＦＩ画像を生成することができる。自己キュムラントは、自己相関関数から導き出すことができ、次数１、２、３（１次相関は、時間平均値に対応する）に対する自己相関関数と同じである。高次自己相関関数（ピクセルｒ_iに対する）は、

によって、自己キュムラント（メンデル（J.Mendel）、「信号処理における高次統計（スペクトラ）及びシステム論理に関するチュートリアル：論理的結果及び応用（Tutorial on Higher-Order Statistics （Spectra) in Signal Processing and System Theory: Theoretical Results and Some Applications）」、１９９１年、ＩＥＥＥ予稿集、第１９巻、３番、式Ａ−１）を利用して計算され、Ｇ_n（ｒ_i，τ₁，．．．，τ_n）は、以下の自己キュムラントＣ_nと自己相関Ｇ_nとの間の関係を表す式（７）によって計算することができる（４次までの関係のみを示す）。

式（５）と同様に、より高次のＳＯＦＩ画像は、より高次のキュムラントＳ_n（ｒ_i）の重ね合わせた値を対応するピクセルに割り当てることで構成することができ：

また、式（１）と同様に、このより高次のＳＯＦＩ画像は、ｎ乗Ｕⁿ（ｒ_k−ｒ_i）まで上げられ、かつ、明るさ係数

によって乗算された元々のＰＳＦ及び時間的重み付け係数ｗ_k（τ₁，．．．，τ_n）を有する形式：

を持つことになる。３次元ガウスＰＳＦ近似に対して、ＰＳＦの幅が係数√ｎによって改善する。ＰＳＦ（エアリーディスク又は実験的に決定されたＰＳＦ）のより正確な近似に対して、結果として得られる解像度の向上は、Ｕⁿ（ｒ）及びＵ（ｒ）の相対的な幅によって決まる。

実施例３：２次相互相関に基づくＳＯＦＩ
２次自己相関ＳＯＦＩ法（段落００１６〜００３１）に類似した方法で、時空間的２次相互相関に基づくＳＯＦＩ法を定義することができる。この場合、異なるピクセルのｒ_i1及びｒ_i2の時間軌道は、時間差τ₁＝０及びτ₂＝１において相関性がある。２次相互相関ＸＧ₂は、

によって与えられる（図４（ａ）参照）。
元々のＰＳＦがいくつかのピクセルによってオーバーサンプリングされ、これらのピクセルが相関するように近隣のエミッタからゆらぎを記録する場合はいつでも、相互相関を計算することができる。異なるピクセルの時間軌道を用いて相互相関のタームを計算するけれども、ＸＧ₂の値は、

による特定のＳＯＦＩ画像のピクセルに割り当てられる。ここで、ｋは視野／サンプルに存在する全てのエミッタに渡って延び、ｒ_kは、エミッタｋの位置を表す。ｒ_i1及びｒ_i2は、相互相関に用いるピクセル時間軌道の位置を表す。ＸＧ₂の値は、最終的なＳＯＦＩ画像における位置

（すなわち、ｒ_i1及びｒ_i2の幾何学的中心）に割り当てられる。割り当てられたＳＯＦＩのピクセル強度は、

によって与えられる。
ｒ_i1＝ｒ_i2を設定し、式（１２）におけるＰＳＦ（Ｕ（０）＝１）を正規化することにより、自己相関の結果（式（１））が回復される。

実施例４：任意の時間差を用いる２次相互相関に基づくＳＯＦＩ
実施例１にあるように、２次相互相関の手法は任意の時間差τｊまで広げることができる。

ＳＯＦＩ画像は、実施例３において説明したように時間差τ₁＝０及びτ₂＝１に対してだけではなく、τ₁、τ₂の任意の組み合わせに対する時間差２次相互相関関数を用いて生成することができる（図４（ｂ））。多くのそのような組み合わせを重ね合わせることでもＳＯＦＩ画像を生成することができる（式（１４）及び図４（ｃ））。

実施例５：２次相互間に基づくＳＯＦＩを計算するための複数の方法
２次相互相関に基づくＳＯＦＩピクセルの位置は、２つのピクセルｒ_i1、ｒ_i2

（図５（ａ））の幾何学的中心位置に割り当てられ、ピクセルの組み合わせの組は、同じ幾何学的中心を有することができるので（図９（ａ））、

がおよそＰＳＦの幅又はそれ以下である組を利用することが最も有効である。ＳＯＦＩは、次の形式を取ることができる。

実施例６：より高次の相互キュムラントに基づくＳＯＦＩ
より高次の時間的自己キュムラント法（実施例２）に類似した方法で、より高次な空間時間的相互キュムラントに基づくＳＯＦＩの手法を定義することができる。この場合、異なるピクセルの時間軌道は、相関性がある。相互キュムラントは、相互相関関数から導き出すことができ、次数２及び３に対するものと同じである。より高次時の空間的相互相関関数ＸＧ_nは、入力として、ｎ組のピクセルの時間軌道（ｒ_i1，ｒ_i2，．．．，ｒ_in）及びｎ組の時間差（τ₁，τ₂，．．．，τ_n）を有する。ＸＧ_nは、

によって与えられ、相互キュムラント（メンデル（J.Mendel）、「信号処理における高次統計（スペクトラ）及びシステム論理に関するチュートリアル：論理的結果及び応用（Tutorial on Higher-Order Statistics （Spectra) in Signal Processing and System Theory: Theoretical Results and Some Applications）」、１９９１年、ＩＥＥＥ予稿集、１９巻、３号、式Ａ−１）を利用して計算することができる。ＸＧ_n（ｒ_i1，．．．，ｒ_in｜τ₁，．．．，τ_n）は、相互キュムラントＸＣ_nと相互相関ＸＧ_nとの関係を説明する以下の式（１７）によって計算することができる。（４次までの関係のみを示す。）

元々のエミッタのＰＳＦの画像がいくつかのピクセルによってオーバーサンプルされるだけ十分に大きく、それらのピクセルが相関したゆらぎを検出できる時はいつも、相互相関を、１つの領域を互いにオーバーサンプルするピクセル間において行うことができる。各計算された相互キュムラントを用いてＳＯＦＩ画像を生成することができる。相互キュムラントは、異なるピクセルの時間軌道を入力として計算に入れるが、ユニークな位置（ピクセル）を、最終的なＳＯＦＩ画像の結果として得られる相関キュムラントの値に対して割り当てることが可能である。ＸＣ_nは、以下の式によって与えられる。

対応するＳＯＦＩピクセルの位置は（式（１８）から分かるように）、

によって与えられる。より高次の相互キュムラントＳＯＦＩ画像は、

によって与えられる。
式（１４）と類似して、多くの時間差の組み合わせの重ね合わせを用いて、より高次の相互キュムラントＳＯＦＩ画像を計算することができる。

ｎ次相互キュムラントに基づくＳＯＦＩ画像の位置は、ｎ個のピクセル

の幾何学的中心位置に割り当てられ、ピクセル組の他の組み合わせは、同じ幾何学的中心を持つことができるので、

（全ての組み合わせ（ｌ，ｊ）に対する）が、およそＰＳＦの幅の大きさ又は、それよりも小さい組を利用することが最も有効である。ＳＯＦＩ画像は、次の形式を取ることができる。

結果として得られるより高次のＳＯＦＩ画像には、明るさの係数

及び時間重み付け係数ｗ_k（τ₁，．．．，τ_n）を有する形式Ｕⁿ（ｒ_k−ｒ）のＰＳＦの組み合わせが含まれる。３次元ガウスＰＳＦの近似に関しては、ＰＳＦの幅が係数√ｎによって改善する。ＰＳＦのより正確な近似（エアリーディスク又は、実験的に決定したＰＳＦ）に関しては、結果として得られる解像度の改善は、Ｕⁿ（ｒ）及びＵ（ｒ）の相対的幅によって決まる。

実施例７：相互キュムラントによるインターリーブされたピクセルの生成
インターリーブピクセルは、幾何学的中心が物理的（「実際の」）ピクセル同士の範囲に入るピクセルの相互相関軌道によって生成することができる。図５（ａ）は、インターリーブされたピクセルを、２次相互相関によって生成する方法を示す図である。２つの隣接するピクセルの時間軌道は相互相関し、その結果として、２つの物理的ピクセルの間に位置するインターリーブされたピクセルを得る。例えば、座標ｒ₁＝１００のピクセルの時間軌道と座標ｒ₂＝１０１のピクセルの時間軌道との間の２次相互相関は、座標ｒ＝１００．５のピクセルを生成する。この手法は、より高次のキュムラントに対しても当てはまる。相互キュムラントは、相互キュムラントを生成するために用いられるピクセルの時間軌道の距離に基づく係数によって重み付けされる（図５（ｂ）及び５（ｃ））。

この距離係数（式（２３））は、ＳＯＦＩ画像における各ピクセルにとって公知でなければならない。そして、全てのピクセルに対するＳＯＦＩの値は、式（２０）式（２１）、式（２２）のそれぞれに従って計算することができる。近隣のピクセルの可能な組み合わせを考えると、近隣のピクセル同士の２次相互相関の計算は、各水平、垂直、斜めの組み合わせの間の中間に有効なピクセルを生成する（図６及び図７（ａ）〜７（ｄ））。同様に、より高次の相互相関は、各可能な組み合わせによって与えられるより多くの有効ピクセルを生成する。例えば、４次相互キュムラントによって４つの異なるピクセルの時間軌道の組み合わせが可能となる。

補間とは対称的に、これらの相互キュムラントから導き出されたインターリーブされたピクセルは、真に改善された解像度を提供する。例えば、ピクセルのサンプリングサイズよりも近くに配置された（そして、それゆえ元々の従来の画像では解像されない）１組のエミッタを、相互相関／相互キュムラントを用いて解像することで、十分な数のＳＯＦＩピクセルを生成することができるので、２つの強度ピーク（２つのエミッタを表す）間における強度減少が明らかとなる。その結果、相互相関の手法を複数のキュムラントの次数に渡って自己相関の手法と組み合わせることで、結果として得られる画像においてさらに増加するピクセルを生成することができ、単一の画像スタックが様々な解像度、様々な数の結果として得られる画像及び、元々のピクセルサンプリングサイズさえ超える解像度を有するＳＯＦＩ画像を生成することを可能とする。一般的に、相互相関の手法は、ＰＳＦのサイズが縮小するような場合でも、ＳＯＦＩ画像を記録するために用いなければならない（例えば、カメラの有効ピクセルサイズ：ｎｍ／ピクセルなど）サンプリングの頻度を調整する必要がないという利点を有する。ＰＳＦに対する元々のサンプリング頻度を維持することができる。ＳＯＦＩ画像のそのようなアップサンプルされたＳＯＦＩ画像を生成するフローチャートを図８に示し、この２次技術を立証する。

実施例８：相互相関による信号強化
相互相関を用いて、異なるピクセルの時間軌道の組（ｎ次のＳＯＦＩ画像に対して、それぞれのピクセル時間軌道の３組又はｎ組）を用いてピクセル（仮想又は実際の）ＳＯＦＩの値を複数回計算することができる。各相互キュムラントが異なるピクセル時間軌道の組（ｎ次ＳＯＦＩ画像に対して、それぞれのピクセル時間軌道の３組又はｎ組）から得られたものだが同じ情報を伝えるので、この手法を用いてノイズの多い信号を強めることができる。どのピクセル時間軌道を相互相関させなければならないかは、式（１９）から分かる。例えば、図９（ａ）及び９（ｂ）を参照のこと。

実施例９：顕微鏡法の応用
ＳＯＦＩは、蛍光顕微鏡法の応用に特に適している。ほぼ全ての蛍光顕微鏡において、２つ以上の強度、寿命、偏光又は、スペクトル状態の間を独立して遷移するフルオロフォアを用いて、超解像及びバックグランド低減をもたらすために用いることができる。そのようなフルオロフォア遷移の例には、量子ドット点滅、その間光を発しないフルオロフォア三重項状態、特定の波長（及び低強度であっても良い）の照明下でのスペクトラの電源を切る又は変更する可能性を有する光スイッチ可能なプローブが含まれる。

ＳＯＦＩの手法は、幅広い標準的蛍光顕微鏡において機器に修正を加える必要なく機能するので、他の超解像技術との比較において優れている。これが可能なのは、解像度の向上に対する鍵が、エミッタの確率的に独立した点滅／ゆらぎであるためである。顕微鏡は、その点滅／ゆらぎが分析できるように、こられのエミッタの画像スタックを記録するための手段を提供するだけで良い。その結果、ＳＯＦＩを、カメラを用いて視野全体を同時に結像する広視野顕微鏡において実施することができる。また、焦点外の光をセクショニングして排除することがピンホールの回転ディスクによって改善された共焦点回転ディスク顕微鏡などの改良型広視野顕微鏡及び、内反射を用いて、非常に狭い照明片（ガラス面に近い）を選択して、幅（ｚ）方向に非常に狭いＰＳＦを生じさせる内部全反射蛍光（ＴＩＲＦ）顕微鏡において用いることもできる。それぞれの場合において、顕微鏡は、初期（回折限度）ＰＳＦを提供し、ＳＯＦＩアルゴリズムの以下の利用法は、３方向全ての超解像及びバックグランド低減を提供する。

ＳＯＦＩの手法は、単一の励起スポットをサンプル（走査ビーム又は走査ステージ）によって走査して画像を生成するラスター走査設定においても用いることができる。これは、単一の点でゆらぎが観測できる程十分ゆっくりと走査するだけで達成することができる。或いは、ゆらぎの速度に対してゆらぎをオーバーサンプルするのに十分早く、ビームが同じ点に戻ることがとても早い（すなわち、信号は、正しいテンポでまだ十分に相関している）ので、サンプルを複数回走査することによってゆらぎをサンプルしようと試みることができる。第３の選択肢を用いることもできる。すなわち全てのｊに対する組み合わせτ_j＝０（００７４参照のこと）。この手法に関して、時間相関が完全に失われている。しかしながら、相互キュムラントの手法を用いることはもはやできない。

実施例１０：非蛍光性顕微鏡法の応用
ＳＯＦＩは、電磁放射特性、吸収特性又は散乱特性において点滅する／ゆらぐ全ての物体に用いることができる。例えば、確率的に再配向／回転拡散する小さな金ナノロッドは、異方的に光を拡散する。偏光光学及び適切なカメラを備える広視野かつ暗視野の顕微鏡は、そのように再配向する物体の光拡散におけるゆらぎを結像し記憶して、ＳＯＦＩと互換性のあるデータセットを取得することができる。同様に、吸収双極子の配向性における変化を利用してＳＯＦＩ分析にかけることができる。

実施例１１：非顕微鏡法の応用
ＳＯＦＩの応用は、顕微鏡法に限定されるものではない。ゆらいでいる点のような発光し／吸収し／拡散するソースからの信号を記憶する、電磁遠視野画像システム又は、回折限度を受ける波動現象は、ＳＯＦＩアルゴリズムを利用することができる。可能な応用には、望遠鏡使用法、医用イメージング及び、他の形式の電磁波イメージングが含まれる。

実施例１２：時間差の選択、点滅する時間スケール、ショットノイズ、フレームレート及び、画像スタック期間
相関関数は、任意の時間差τ_j又は相関する信号値同士の相対的時間遅延に対して役立つ。しかしながら、典型的なゆらぎ／点滅の時間スケール（レート）、時間取得フレームレート及び、選択した相関時間差の間を注意深く整合することが、ＳＯＦＩアルゴリズムを正しく実施するには必要である。アフターパルスなどの通常は不要な短い時間スケールの検出器のゆらぎ、すなわち、カウントのすぐ後に他のカウントを生成する検出器における傾向又は、１つのフレームから直後のフレームへの信号強度における非相関の統計的ゆらぎであるショットノイズを含ませる又は排除することに影響を与える。

時間差の最も単純な選択は、全てに対してτ_j＝０を設定して、相関関数を平均化されたモーメント及び、より従来型のキュムラントと等しい一般化されたキュムラントに相当させることである。例えば、この特殊なケースでは、２次ＳＯＦＩ画像は、各ピクセルの時間的分散に相当する。これは、考え方としては最も単純であり、非常に短い時間スケールのゆらぎの観察を可能とするが、独立してゆらぐエミッタを解像する能力を低減させるショットノイズ挙動を含んでしまうことになる。ショットノイズは、カメラの測定されたノイズ分布又はポアソン分布したフォトン計数検出器のショットノイズなどの公知の挙動に従うかどうかで取り除くことができる。このようにしてショットノイズを取り除くことで、超解像を依然として得ながらエミッタの短い時間スケールのゆらぎに対する検出感度を与える。

しかしながら、１つ以上の非ゼロ時間差が選択される場合、元々ショットノイズが存在しないＳＯＦＩ画像を生成することができる。この手法は、実際の統計的分布とは関係なくショットノイズの寄与を抑制することを保証する。一旦非ゼロ時間差を用いると、エミッタが示した元々の点滅挙動の時間スケールを考慮する必要がある。この手法を用いて点滅挙動を観察するのに良好な感度を得るためには、典型的な点滅時間スケールは、１つの点滅期間（「ｏｆｆ」時）が元々の画像スタックのフレーム毎の１つの積分時間（フレームレートの逆数）よりも長く続くように、十分長くなければならない。

独立したピクセル間の相互相関が（自己相関の代わりに）用いられると、ショットノイズのゆらぎは、ゼロ時間差についても抑制される。よって、ショットノイズ分布の減算（自己相関を用いる場合）又はゼロ時間差を用いた相互相関手法のどちらかを用いて、点滅時間スケールを、例えば、ストローブ励起を用いてフレームレートの逆数よりも短くて良い単一フレームの取得時間と同じくらい短いものと見なすことができる（そのため、蛍光エミッタを励起する照明は、各フレームのわずかな時間だけ電源が入り、フレームレートよりずっと短い点滅時間スケールからＳＯＦＩ画像を生成させることができる）。例えば、この手法を用いることで、フルオロフォアがマイクロ秒からミリ秒の間の非発光三重項状態に入ることにより点滅する短い時間スケールの三重項状態を結像することができる。

分析のために時間スケールを選択する他の重要な側面は、ＳＯＦＩ画像の生成を混乱させる、ゆっくりとした時間スケールが平均してドリフト（例えば、サンプルステージがゆっくりと熱的又は機械的にドリフト）することを防止することである。これは、平均が各セグメントの中心になるようにドリフトの時間スケールよりもずっと短いセグメントにおいて相関関数を生成する又は、相関しないランダムなノイズを加えて平均を正規化させることによって解決することができる。例えば、染料を用いる蛍光サンプルは、フルオロフォアが永久的に暗状態に入る各励起を有する可能性があり、共通して色あせを経験する。このため、結果として、フルオロフォア及び励起出力に基づいて、減衰時間が秒から分よりも長い範囲で変動できる指数関数的減衰を示す平均強度となる。その染料を用いる画像の全てが同様に色あせるので、これは、画像スタックの初めのより明るい状態から画像スタックの最後の暗状態まで移行するＳＯＦＩにとっては独立していなければならない多くのエミッタを互いに効果的に相関させる。画像スタックを１組の短いスタックに分割する又は、ランダムノイズ法を用いることで、この問題を緩和させることができる。

実施例１３：画像スタックのスタック−ＳＯＦＩ動画の生成
ＳＯＦＩ画像を取得する速度は、イメージングシステム及びゆらぎの時間スケールによって与えられる。そのため、複数の画像スタックを取得し、超解像を盛り込んだＳＯＦＩ画像のシーケンス（ＳＯＦＩ動画）を生成することができる。具体的には、結像された対象物が動いている時、潜在的に短い取得時間が有利であることが分かるが、それは、そうでなければぼやけた画像となってしまうためである。ＳＯＦＩ画像の計算は、ソフトウェア又はハードウェアのどちらかを用いる手法によって非常に効率的かつ素早く行うことができる。

実施例１４：バックグランド低減
ＳＯＦＩ画像の生成は、平均信号レベルに対する時間信号のゆらぎの分析に依存する。その結果、一定のままのバックグランド信号又は、非常に小さいゆらぎを発生させるバックグランド信号が抑制され、結果としてバックグランドが低減された（バックグランドがない場合さえある）コントラストが向上したＳＯＦＩ画像を得ることになる。このバックグランド低減は、非常に大きな一定信号を排除することができるので、より小さいゆらぎの信号を見えるようにすることができる。これにより、大きなバックグランドでは見失ったり見えなかったりする（超解像以上の）構造の観察が可能となる。

ゼロよりも大きい時間差セレクションを選択すると、コントラストの向上は、元々の画像スタックの各フレームにまたがるピクセルにおいて持続する信号だけを選択する。その結果、バックグランドの一部としてショットノイズがフレームの長さよりもずっと短い他の多くの信号として低減される。相互相関も、例えば、検出器のアフターパルス、宇宙線、ダークカウント及び、ショットノイズなどゼロ時間差であっても単一ピクセルにおいてのみ存在する任意のゆらぐバックグランドを低減させ、複数のピクセルに渡って相関して起こるゆらぎだけをコントラスト向上のために選択する。

蛍光による細胞イメージングの場合、画質を乱す共通の問題は、焦点の合っていない光及び細胞の自己蛍光（細胞の自然な含有物が励起光に応答して光を発する）の両方によってもたらされる高度なバックグランドである。焦点の合っていない光及び細胞の自己蛍光の両方は、ゆらぎのない信号であるため、ＳＯＦＩ画像では取り除かれて、実質的に高品質の画像を生成し、細胞イメージングで重要なコントラストの問題を解決する。

焦点の合っていない光及び散乱は、コントラストの低減及び、生きている動物や組織のイメージングにおける画像性能の低減に有意に寄与する。上述した細胞イメージングについての同じ原理がここでも当てはまる。ＳＯＦＩのバックグランド低減及びコントラスト向上は、そのような生体内における応用の大きな補助となることができる。

実施例１５：３次元（３Ｄ）イメージング
ＳＯＦＩの手法は、本質的にＰＳＦを３方向全てにおいて縮ませる。そのため、３次元超解像を実現することができる。実際、２次元のＳＯＦＩ画像でさえ、焦点に近いエミッタからの信号を向上させるので、ｚ方向において解像度が増加している。３次元に超解像されたスタックは、いくつかの異なる深さ（セクション）のそれぞれにおける画像スタックを取得し、各セクションについてＳＯＦＩ画像を計算するだけで得られるので、３次元に超解像されたバックグランドが低減されたＳＯＦＩ画像スタックとなる。

ｚ方向に沿ってインターリーブするピクセルは、異なるセクションからの相互相関信号又は、ＳＯＦＩアルゴリズムを実施する前に画像スタックを中間セクションに挿入することで実施例７のように計算することができる。しかしながら、これは、イメージングの時間スケールに対する要件を導入する。中間ピクセルを得るためには、各深さのフレームを同時又は異なる深さのフレーム同士の相関が保てるよう十分素早く測定しなければならない。

異なる深さのピクセル同士の相互相関を有する３次元のＳＯＦＩ画像を得るためには、２つの深さにおける信号を同時又は相前後し、かつ、（相関が保てるように）ゆらぎの時間スケールに対して十分素早く測定する必要がある。

発明の実施化

デルティンガー（Dertinger）等、「高速で、バックグランドがない、３次元高解像光ゆらぎイメージング（ＳＯＦＩ）（Fast, background-free, 3D super-resolution optical fluctuation imaging （SOFI)）」、２００９年、全米科学アカデミー予稿集、第１０６巻、２２２８７〜２２２９２頁は、ＳＯＦＩ実施の詳細な説明及び発明の実施化を提供する。以下に簡単な要約を提供する。３Ｔ３繊維芽細胞の微小管を量子ドット（ＱＤ）で免疫染色して、ＣＣＤカメラを備える広視野顕微鏡において結像させ、ＳＯＦＩアルゴリズムによってデータスタックを分析した。超解像し、バックグランド低減したＳＯＦＩ画像の結果として得られた断面図（上述した参考文献の図Ｆ〜Ｈ）を図１０に示す。以下に一覧で示したものは、ＳＯＦＩ画像を得るための詳細である。

細胞標識
ＮＩＨ−３Ｔ３（ＡＴＣＣ、マナッサス、バージニア州、米国）細胞をダルベッコ変法イーグル培地（ＡＣＣＴ、カタログ番号３０、２００２年）において〜８０％の合流レベル及び、１０％のウシ胎仔血清（１００８２−１４７、インビトロジェン社、カールスバッド）及び、１００単位のペニシリンストレプトマイシン（Ｐｅｎ−Ｓｔｒｅｐ、１５１４０１２２、インビトロジェン社、カールスバッド）まで成長させた。固化させるために以下の手順を適用した。細胞は、室温において１５分間ＣＢバッファ（１０ｍＭＭＥＳ、ｐＨ６．２、１４０ｍＭ、ＮａＣｌ、２．５ｍＭＥＧＴＡ、５ｍＭＭｇＣｌ₂）、１１％のスクロース、３．７％のパラホルムアルデヒド、０．５％のグルタルアルデヒド、０．２５％のトリトンを定着剤として用いて培養した。ＣＢにおいて０．５ｍｇ／ｍｌの水酸化ホウ素ナトリウムにおいて８分間のクエンチング行った。細胞を一度ＰＢＳで洗浄し、室温で１時間２％のＢＳＡ＋ＰＢＳにおいてブロックした。微小管を２％のＢＳＡ＋ＰＢＳにおいてＤＭ１Ａの抗αチューブリン単クローン抗体（シグマ社）の１：５００の希釈を用いて着色した。それから細胞を量子ドット（ＱＤ）ＱＤ６２５の標識ヤギＦ（ａｂ）₂の１：４００の希釈及び、６％のＢＳＡ＋ＰＢＳにおける抗マウスＩｇＧ抗体（Ｈ＋Ｌ）（インビトロジェン社、カールスバッド）を用いて、ＰＢＳで３回洗浄して室温で１時間培養した。細胞をＰＢＳで３回洗浄した。全てのステップは、湿度室において行われた。標本は、３０％、７０％、９０％、１００％のエタノールにおいて５秒間連続してカバースリップを浮かせることで乾燥させた。その後、１ｍｇ／ｍｌのＰＶＡで優しくスピンコート（〜５００ｒｐｍ）した。

顕微鏡設定
動画を反転広視野顕微鏡（オリンパス、ＩＸ７１）で撮影した。４７０ｎｍＬＥＤアレイ装置を光源（ルーメンコア社、アウラライトエンジン（Aura Light Engine）、ビバートン、オレゴン州、米国）として用いる。サンプル励起及び蛍光収集を、高開口数の物体（オリンパス、ＵＰｌａｎＡｐｒｏ６０ｘ、１．４５、オイル、センターバレー、ペンシルバニア州、米国）を用いて行った。励起光は、６２０／４０バンドパス吸収フィルタ（Ｄ６２０／４０、クロマテクノロジー社、ロッキンガム、バーモント州、米国）を用いて蛍光からフィルタされる。蛍光は、ＣＣＤカメラ（Ａｎｄｏｒ、ｉＸｏｎ^EM＋８８５、ベルファスト、北アイルランド）に集光された。３５ｎｍ／ピクセルを得られるように倍率を調整した。

データ取得
動画を、３０００フレーム、１００ｍｓ／フレームで取得した。

データ分析
上記段落００１６〜００３１において説明した特注したマットラブ（Ｍａｔｌａｂ）のソフトウェアを用いるＳＯＦＩアルゴリズムを用いて動画を分析した。

図１０。ＳＯＦＩの解像度向上を比較されたい。デルティンガー等の図５Ｅ〜Ｈにおける点線から抽出した強度プロファイル。実線は、元々の広視野画像の断面を示す。破線は、２次ＳＯＦＩ画像における同じ断面を示す。この比較により、解像度における増加及びバックグランドにおける低減が明らかとなる。

Claims

独立して点滅する物体の視野を分析する方法であって、
（ｉ）１つ以上の光学的特性において確率的及び互いに独立的にゆらぐ光学的に信号を伝達する物体の集合からの物体からなるサンプル又は観察画像を選択するステップと、
（ｉｉ）時間関数として前記物体の光学画像のシーケンスを取得してピクセルのｘ，ｙ，ｔ画像スタックを生成するステップと、
（ｉｉｉ）前記画像スタックからピクセル毎に時間軌道を抽出するステップと、
（ｉｖ）各ピクセルの時間軌道の自己相関、自己キュムラント、相互相関、又は相互キュムラントを少なくとも２次まで計算するステップと、
（ｖ）自己相関関数、自己キュムラント関数、相互相関関数、又は相互キュムラント関数の選択した時間差又は、時間差の範囲に渡る自己相関関数、自己キュムラント関数、相互相関関数、又は相互キュムラント関数の有限積分の値を用いて、強度値が振幅であるピクセルを含む前記計算された関数から、超解像されバックグランド低減された画像を生成するステップと、を含む方法。
前記独立して点滅する物体は、使用したイメージングシステムの回折限界で解像した距離よりも短い距離によって分離させることができる上記請求項１に記載の方法。
前記サンプル又は前記観察画像を含む前記サンプル物体は、発光材料、吸収材料又は、拡散材料及びそのような材料で標識付けられた物体からなる集合から選択される上記請求項１に記載の方法。
前記光学画像のシーケンスは、走査ビーム又は走査サンプルから平行又は連続する広視野、或いは、ピクセル毎のシーケンスにおいて生成される上記請求項１に記載の方法。
前記相関関数又はキュムラント関数は、２次よりも高次の関数である上記請求項５に記載の方法。
前記取得した光学画像のシーケンスは、複数の画像スタックの組を含む上記請求項５に記載の方法。
解像度が回折限界よりも低い物体の視野を、前記視野における光学エミッタが、使用したイメージングシステムの回折限界を解像した距離よりも短い距離の間隙を介して配置され、時間と共に独立してゆらぐことができるシステムにおいてイメージングする方法であって、
（ｉ）時間関数として任意の点広がり関数の光学システムを有する視野を光学的にイメージングして、強度がサブ回折の大きさの独立したエミッタから放出される信号の重ね合わせである様々なピクセルシーケンスをそれぞれが含むｘ，ｙ，ｔのスタックを生成するステップと、
（ｉｉ）ピクセル毎の前記画像スタックから時間軌道を抽出するステップと、
（ｉｉｉ）少なくとも２次までの各ピクセルの前記時間軌道の相関関数又はキュムラント関数を計算するステップと、
（ｉｖ）ピクセルを含む新しい画像を生成するステップと、を含み、
ピクセルの強度値は、選択した時間差又は時間差の範囲に渡る前記関数の有限関数に従って相関関数又はキュムラント関数に関連付けられて、超解像されバックグランド低減された光学画像を導き出す方法。
前記エミッタのサイズは、前記点広がり関数よりも実質的に小さく、前記方法は、ピクセルが点広がり関数画像サイズの断片となるように前記視野を拡大することを含み、ゼロ平均ゆらぎ信号は、各ピクセルの前記時間軌道から導かれ減算され、２次相関関数又はキュムラント関数をピクセル毎に計算して、２次ＳＯＦＩ画像におけるＳＯＦＩピクセルの前記強度を定義する行列を構成する上記請求項７に記載の方法。