JP2014237710A - トリアゾール含有マクロライドを用いた生体防御 - Google Patents

Abstract

【課題】生体防御病原体により引き起こされる急性曝露および疾患の治療法の提供。【解決手段】式Ｉで表わされるマクロライド。（Ｒ１０はＨ又はアシル；ＸはＨ；かつＹはＯＲ７；Ｒ７は単糖又は二糖等；Ｘ及びＹは、付加された炭素と一緒になってカルバモイルを形成；ＶはＣ（Ｏ）等；Ｗは、Ｈ、Ｆ等；Ａは、ＣＨ２、Ｃ（Ｏ）などであり；Ｂは（ＣＨ２）ｎであり、ここで、ｎは０〜１０の整数であるか、またはＢは不飽和炭素鎖であり；かつＣは、水素、ヒドロキシなどである。）【選択図】図１

Description

関連出願への相互参照
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）項の下で、２００８年１０月２４日に出願された米国仮特許出願第６１／１０８，１１０号、２００８年１０月２４日に出願された米国仮特許出願第６１／１０８，１１２号、２００８年１０月２４日に出願された米国仮特許出願第６１／１０８，１３４号、２００８年１０月２４日に出願された米国仮特許出願第６１／１０８，１３７号、２００８年１０月２４日に出願された米国仮特許出願第６１／１０８，１６８号、および２００９年３月２０日に出願された米国仮特許出願第６１／１６２，１０９号に対する恩典を主張するものであり、これらの各々の開示全体が参照により本明細書に組み込まれる。

本明細書に記載の発明は、生体防御病原体によって引き起こされる急性曝露および疾患の治療に関する。特に、本明細書に記載の発明は、マクロライドおよびケトライド抗生物質を用いた、生体防御病原体によって引き起こされる急性曝露および疾患の治療に関する。

大量感染を引き起こすエアロゾル化した微生物が戦場で使用されるかまたはこのような微生物によって国内テロ攻撃を受けるという恐れられているシナリオが存在し続けている。遺伝子操作または自然発生による最近の治療に対する耐性の可能性が加わることを考慮すると、新しい有効な抗生物質を同定することは、このような攻撃に対抗するために極めて重要である。生物テロや生物兵器と戦うための治療道具として、幅広い吸入病原体に対する有効な治療剤が必要となる。驚くべきことに、トリアゾール含有マクロライドおよびケトライドが、生物兵器および／または生物テロによる潜在的な脅威をもたらす様々な生物に対して高い活性を示すことが発見された。

一実施形態では、１以上の生物テロ病原菌および／または生物兵器病原菌から生じる疾患を治療するための化合物、組成物、方法、および医薬品が本明細書に記載されている。例示的な病原菌としては、炭疽菌（ＢＡ）、ペスト菌（ＹＰ）、野兎病菌（ＦＴ）、鼻疽菌（ＢＭ）、および類鼻疽菌（ＢＰ）が挙げられる。別の実施形態では、炭疽菌、ペスト菌、野兎病菌、および鼻疽菌から選択される１以上の生物テロ病原菌および／または生物兵器病原菌から生じる疾患を治療するための化合物、組成物、方法、および医薬品が本明細書に記載されている。驚くべきことに、本明細書に記載のトリアゾール含有化合物が野兎病菌に対して活性が高いことが本明細書で発見されている。別の実施形態では、本化合物、組成物、方法、および医薬品は、１以上の生物テロ病原菌および／または生物兵器病原菌の曝露または吸入後の、医学的対策などの、曝露後予防手段として有用である。別の実施形態では、本化合物、組成物、方法、および医薬品は、肺炎、ペスト、野兎病、類鼻疽などを含むが、これらに限定されない、１以上の生物テロ病原菌および／または生物兵器病原菌の曝露または吸入によって引き起こされる疾患を治療するのに有用である。

例示的な一実施形態では、薬学的に許容されるその塩、水和物、溶媒和物、エステル、およびプロドラッグを含む、式（Ｉ）の化合物が本明細書に記載される。

一態様では、Ｒ_１０は水素またはアシルである。別の態様では、ＸはＨであり；かつＹはＯＲ_７であり；ここで、Ｒ_７は単糖または二糖、アルキル、アリール、ヘテロアリール、アシル、またはＣ（Ｏ）ＮＲ_８Ｒ_９であり、ここで、Ｒ_８およびＲ_９は、各々独立に、水素、ヒドロキシ、アルキル、アラルキル、アルキルアリール、ヘテロアルキル、アリール、ヘテロアリール、アルコキシ、ジメチルアミノアルキル、アシル、スルホニル、ウレイド、およびカルバモイルからなる群から選択されるか；またはＸおよびＹは、付加された炭素と一緒になってカルバモイルを形成する。

別の態様では、Ｖは、Ｃ（Ｏ）、Ｃ（＝ＮＲ_１１）、ＣＨ（ＮＲ_１２，Ｒ_１３）、またはＮ（Ｒ_１４）ＣＨ_２であり、ここで、Ｎ（Ｒ_１４）は、式１および２の化合物のＣ−１０炭素に付加されており；ここで、Ｒ_１１はヒドロキシまたはアルコキシであり、Ｒ_１２およびＲ_１３は、各々独立に、水素、ヒドロキシ、アルキル、アラルキル、アルキルアリール、アルコキシ、ヘテロアルキル、アリール、ヘテロアリール、ジメチルアミノアルキル、アシル、スルホニル、ウレイド、およびカルバモイルからなる群から選択され；Ｒ_１４は、水素、ヒドロキシ、アルキル、アラルキル、アルキルアリール、アルコキシ、ヘテロアルキル、アリール、ヘテロアリール、ジメチルアミノアルキル、アシル、スルホニル、ウレイド、またはカルバモイルである。

別の態様では、Ｗは、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、またはＯＨである。

別の態様では、Ａは、ＣＨ_２、Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｏ、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、Ｓ（Ｏ）_２、Ｓ（Ｏ）_２ＮＨ、Ｃ（Ｏ）ＮＨＳ（Ｏ）_２である。別の態様では、Ｂは（ＣＨ_２）_ｎであり、ここで、ｎは０〜１０の整数であるか、またはＢは炭素数２〜１０の不飽和炭素鎖である。別の態様では、Ｃは、水素、ヒドロキシ、アルキル、アラルキル、アルキルアリール、アルコキシ、ヘテロアルキル、アリール、ヘテロアリール、アミノアリール、アルキルアミノアリール、アシル、アシルオキシ、スルホニル、ウレイド、またはカルバモイルである。

別の実施形態では、治療有効量の１以上の式（Ｉ）の化合物、または様々なその亜属を含む組成物が本明細書に記載される。薬学的組成物は、追加の薬学的に許容される担体、希釈剤、および／または賦形剤を含み得る。

疾患の動物モデルにおける予備的なインビボ研究は、これらの病原体に対する防御も示す。 ＣＥＭ−１０１最小阻害濃度分布を棒グラフの形で示す。 ｐＨ調整済みブロス中でのＭＩＣ測定に基づく、ＣＥＭ−１０１、ＴＥＬ、ＡＺＩ、およびＣＬＲに対する黄色ブドウ球菌ＡＴＣＣ ２５９２３およびＬ．モノサイトゲネスＥＧＤの比較感受性。 ブロス中（左のパネル；ｐＨ７．４）またはＴＨＰ−１マクロファージによる貪食後（右のパネル）の黄色ブドウ球菌（ＡＴＣＣ ２５９２３）に対するＣＥＭ−１０１およびＡＺＩの短期的な時間−殺菌効果。両方の薬物を、０．７ｍｇ／リットル（上のパネル）または４ｍｇ／リットル（下のパネル）のいずれかの細胞外濃度で使用した。ＣＥＭ−１０１およびＡＺＩのＭＩＣは、それぞれ、０．０６および０．５ｍｇ／リットルであった。値は全て、３回の独立した実験の平均±標準偏差（ＳＤ）である（見えない場合、ＳＤ棒は記号よりも小さい）。 ブロス中（左のパネル）およびＴＨＰ−１マクロファージによる貪食後（右のパネル）の黄色ブドウ球菌（ＡＴＣＣ ２５９２３）に対するＣＥＭ−１０１、ＴＥＬ、ＣＬＲ、およびＡＺＩの濃度−効果関係。縦軸は、最初の種菌と比べた２４時間での（ブロス）１ｍｌ当たりまたは細胞タンパク質１ｍｇ（ＴＨＰ−１マクロファージ）当たりのＣＦＵの変化（Δｌｏｇ ＣＦＵ）を示す。横軸は、以下のように抗生物質の濃度を示す：（ｉ）上のパネル、ブロス中（左）または培養培地中（右）の重量濃度（ｍｇ／リットルで示す） および（ｉｉ）下のパネル、ｐＨ７．４のブロス中で測定したときのＭＩＣの倍数。値は全て、３回の独立した実験の平均±標準偏差（ＳＤ）である（見えない場合、ＳＤ棒は記号よりも小さい）。曲線当てはめパラメータの大域解析（一元配置分散分析）に基づく統計解析;ブロス中のＣＥＭ−１０１とＡＺＩにのみ有意差がある（Ｐ＝０．０４）。関連する薬理学的記述子の数値およびその差の統計解析を表１に示す。 食細胞内のＬ．モノサイトゲネス（ＥＧＤ株、左のパネル）およびＮ．ニューモフィラ（ＡＴＣＣ ３３１５３株、右のパネル）に対するＣＥＭ−１０１およびＡＺＩの濃度−効果関係。縦軸は、最初の貪食後種菌と比べた２４時間（Ｌ．モノサイトゲネス）または４８時間（Ｎ．ニューモフィラ）での細胞タンパク質１ｍｇ当たりのＣＦＵの変化（Δｌｏｇ ＣＦＵ）を示す。横軸は、以下のように抗生物質の濃度を示す：（ｉ）上のパネル、重量濃度（ｍｇ／リットルで示す）；（ｉｉ）下のパネル、ｐＨ７．４のブロス中で測定したときのＭＩＣの倍数。値は全て、３回の独立した実験の平均±標準偏差（ＳＤ）である（見えない場合、ＳＤ棒は記号よりも小さい）。 ３７℃でのＴＨＰ−１細胞におけるＣＥＭ−１０１と比較子の蓄積（薬物は全て、１０ｍｇ／リットルの細胞外濃度である）。（Ａ）蓄積の反応速度論（ＡＺＩ）；Ｃｃ、細胞内濃度；Ｃｅ、細胞外濃度）；（Ｂ）蓄積に対するＣＥＭ−１０１（黒塗りの記号および実線）およびＡＺＩ（白抜きの記号および点線）の培養培地のｐＨの影響（３０分）；（Ｃ）ＡＺＩおよびＣＥＭ−１０１の細胞蓄積に対するモネンシン（５０μＭ；２時間のインキュベーション）、ベラパミル（１５０μＭ；２４時間のインキュベーション）、またはゲムフィブロジル（２５０μＭ；２４時間のインキュベーション）の影響。値は全て、３回の独立した測定の平均±標準偏差（ＳＤ）である（見えない場合、ＳＤ棒は記号よりも小さい）。 細胞内活性：他の抗ブドウ球菌剤を用いた比較研究。ＴＨＰ−１マクロファージ中の細胞内黄色ブドウ球菌（ＡＴＣＣ ２５９２３株）に対する抗生物質の比較用量−静菌応答。棒は、ＭＩＣ（ｍｇ／Ｌで示す）または細胞外静菌用量を表す。 時間０〜２４時間のDｌｏｇ ＣＦＵの用量応答曲線と対数用量で表した、ＡＺＩ、ＣＬＲ、およびＴＥＬと比べたＣＥＭ−１０１の細胞内活性。

一実施形態では、細胞内で活性のある化合物が本明細書に記載されている。トリアゾール含有マクロライドの細胞内蓄積および細胞内活性は、Ｐｇｐまたは多剤耐性タンパク質（ＭＲＰ）阻害剤による影響を受けないことも本明細書で発見された。したがって、本明細書に記載の化合物は、Ｐ−糖タンパク質（原形質または透過性糖タンパク質、Ｐｇｐ）の基質ではないまたは悪い基質であると考えられている。Ｐｇｐは、いくつかの生物による特定の抗生物質に対する耐性をもたらし得る排出機構であることが理解されており、この機構は、例えば、ＡＺＩおよびＥＲＹについて、両方の抗生物質がＰ−糖タンパク質の基質となっているマクロファージにおいて報告されている。したがって、本明細書に記載の化合物が細胞内に蓄積することが分かったのは驚くべきことである。細胞内蓄積に加えて、本明細書に記載のトリアゾール含有マクロライドおよびケトライド化合物が高い細胞内活性を有することが発見されたことは驚くべきことである。本明細書に記載の化合物が、限定されるものではないが、膿瘍をはじめとする、細菌感染で見られるｐＨなどの、より低いｐＨで、マクロライドに典型的なタンパク質結合よりも低いタンパク質結合を有することが本明細書で分かったことも驚くべきことである。他のマクロライドやケトライドをはじめとする抗菌剤で通常観察される細胞内活性の欠如は、高いタンパク質結合による、および／または膿瘍に存在するような、細胞内コンパートメントの比較的より低いｐＨによる可能性があることが理解される。

しかしながら、能動的な排出によって除去されない場合でも、リソソームコンパートメントのｐＨが低いために、マクロファージにおける、他のマクロライドやケトライドをはじめとする他の抗菌剤の濃度は、疾患を治療するのに有効でない可能性がある。例えば、（炭疽菌、ペスト菌、野兎病菌、および／または鼻疽菌の１つまたは複数がその細胞内段階でとどまる）ファゴリソソームに広がる酸性環境は、ＡＺＩ、ＣＬＲおよびＴＥＬなどの抗生物質の活性を障害し得る。本明細書に記載の化合物が低いｐＨでその抗菌活性を保持することが分かったのは予想外のことである。本明細書に記載の化合物の細胞内活性は、標的生物における耐性の迅速かつ完全な根絶、およびおそらくはまた、予防にとっての、重要な決定因子であり得ることが理解される。

効果的な抗微生物療法がないために、細菌が細胞内で生存することになり、これが、細菌のまん延、致命的な治療不全、および慢性的な再発性感染症の確立の主因となっている。これらの状況は、炭疽菌、ペスト菌、野兎病菌、および鼻疽菌をはじめとする、生体防御生物によって引き起こされる感染の過程で観察される。

抗生物質の細胞内蓄積は、細菌に対する有効な活性を示すものであると報告されているが、多くの一連のよく使用される抗生物質の薬力学的評価から、細胞内バイオアベイラビリティや感染コンパートメントにおける活性の調節などの他のパラメータも重要であることが明らかになっている。本明細書に記載のトリアゾール含有マクロライドが、ＴＥＬ、ＡＺＩ、およびＣＬＲなどの、既知のマクロライドやケトライドと比べて、驚くべきほどの異なる挙動を示すために、本明細書に記載の観察は、これに関してマクロライドで行なわれたこれまでの観察を確認し、敷延するものである。

驚くべきことに、トリアゾール含有マクロライドは、ＡＺＩをはじめとする比較子よりもかなり大きい程度に蓄積し、かつより大きな効力（低いＥ_５０値およびＣ_ｓ値）を一貫して表す一方で、比較子と同様の最大効力（Ｅ_ｍａｘ）を示すことが見出されている。理論に束縛されるものではないが、これは、ＣＥＭ−１０１に導入された構造的修飾がもたらす改善が、その作用様式の変化にではなく、薬物動態特性や（感染コンパートメントに広がる物理化学的条件に対するその低下した感受性をはじめとする）内活性の調節に関連することを示すと考えられている。したがって、トリアゾール含有マクロライドは、本質的に静菌的なマクロライド特性を示すが、細胞内環境において比較子よりも良好におよび比較子よりもかなり低い細胞外濃度でこの特性を表す。

理論に束縛されるものではないが、ＣＥＭ−１０１などのトリアゾール含有マクロライドの細胞蓄積は、全てのマクロライドに対して想定される弱い有機塩基のプロトン捕捉という一般的な機構によってもたらされると考えられているが、それは、蓄積が、ＡＺＩと同じように、酸性ｐＨまたはプロトンイオノフォアのモネンシンに曝露することによってほぼ完全に抑制されるからである。酸性の膜結合コンパートメントにおける弱塩基の拡散／分離の一般的モデルに基づき、蓄積は、イオン化可能な基の数および非イオン化形態の薬物とイオン化形態の薬物の膜透過性係数の比によって決定される。ＣＥＭ−１０１は、２つのイオン化可能な官能基を有するが、アミノフェニルトリアゾールのｐＫａを計算すると４未満となり、この分子は、中性ｐＨおよびリソソームのｐＨ（約５）でさえも、（ＣＬＲやＴＥＬと同様に）主としてモノカチオン性であることが示唆される。対照的に、ＡＺＩは、ｐＫ_ａが６よりも大きい２つのイオン化可能な官能基を有しており、それゆえに、細胞内でジカチオン性である。しかしながら、ＣＥＭ−１０１は、２位にフルオロ置換基を有しており、このために、ＣＬＲまたはＴＥＬよりも親油性になっているはずである。理論に束縛されるものではないが、ＣＬＲまたはＴＥＬと比べた非イオン化形態のＣＥＭ−１０１とイオン化形態のＣＥＭ−１０１の透過定数の比は、弱い有機塩基の細胞蓄積のレベルを決定するために、イオン化可能な官能基の数と同じぐらい重要であり得ると考えられている。理論に束縛されるものではないが、ＣＥＭ−１０１のより大きい細胞蓄積は、１つには、アジスロマイシンおよび他のマクロライドまたはケトライド系抗生物質とは対照的に、（本発明者らの培養条件下でＴＨＰ−１マクロファージにより発現される）Ｐｇｐ介在性の排出に対して感受性がないことが原因であり得ると考えられている。

多くの既知のマクロライドは大量分布することが観察されており、これは、 酸性コンパートメント、すなわち、リソソームおよび関連する空胞における拡散／分離によって真核生物細胞内に蓄積するその能力に関連すると考えられている。結果として、既知のマクロライドは、これらのコンパートメントに局在する感染の治療のための候補と考えられてきた。したがって、炭疽菌、ペスト菌、野兎病菌、および鼻疽菌などの典型的な細胞内病原体によって引き起こされる感染症を治療するのに好適であると仮定することが可能である。しかしながら、黄色ブドウ球菌またはＬ．モノサイトゲネスなどの通性細胞内病原体を用いた細胞内活性と細胞外活性の直接的な定量的比較により、既知のマクロライドは、特に、その大きい細胞内蓄積を考慮すると、その抗菌能の最低限の部分しか細胞内で発現していないことが示唆される。ファゴリソソームおよび関連する空胞で複製する生物に対するこの最低限に抑えられた抗菌能は、既知のマクロライドの活性を低下させることが知られている酸性ｐＨに関連すると考えられている。別の要因は、炭疽菌、ペスト菌、野兎病菌、および鼻疽菌などのいくつかの生物が、他の細胞内コンパートメントで実際に複製し得ることである。さらに、ＡＺＩなどの特定のマクロライドは、マクロファージからの能動的な排出を受け、これがさらに、準最適な細胞内活性の一因となっている。

対照的に、本明細書に記載のトリアゾール含有化合物の細胞蓄積や細胞内活性は、抗生物質の細胞内薬力学の研究のために開発されたモデルを用いると、ケトライドをはじめとする既知のマクロライドよりも大幅に改善されている。したがって、本明細書に記載の化合物は、そのＭＩＣの最大効力を維持しており、かつＴＥＬ、ＡＺＩ、およびＣＬＲと比べて、例えば、炭疽菌、ペスト菌、野兎病菌、および鼻疽菌の細胞内形態に対するより大きい効力を示す。理論に束縛されるものではないが、本明細書に記載のトリアゾール含有化合物のこの改善された細胞内効力は、低いｐＨでの保持された活性、および幅広い細胞内コンパートメントに分布する能力と相まって、炭疽菌、ペスト菌、野兎病菌、および鼻疽菌に対するより高い内活性の組合せから生じると考えられている。

別の実施形態では、トリアゾール含有マクロライドおよびケトライド化合物は、炭疽菌、ペスト菌、野兎病菌、および鼻疽菌に対する細胞内活性などの、細胞内活性を有する。真核生物細胞内でのこれらの生物の生存は、感染の持続にとって極めて重要である。ルーチンの感受性試験は、通常、細胞外細菌のみに対して決定されるものであり、それゆえ、細胞内生物に対する効力を予測するときに誤解を招く恐れがあることが理解される。

別の実施形態では、本明細書に記載の化合物、方法、および医薬品は、治療有効量の本明細書に記載の１以上の化合物を含み、ここで、治療有効量は、細胞内抗菌活性を示すのに有効な量である。

別の実施形態では、殺菌性の化合物が本明細書に記載されている。別の実施形態では、本明細書に記載の化合物、方法、および医薬品は、治療有効量の本明細書に記載の１以上の化合物を含み、ここで、治療有効量は、インビボでの殺菌活性をはじめとする、殺菌活性を示すのに有効な量である。マクロライドは、通常、静菌性であることが報告されている。静菌化合物は、細菌を死滅させるのではなく、その代わりに、例えば、細菌を死滅させずに細菌の増殖や生殖を阻害する。死滅させるのは、殺菌剤によって達成される。身体から微生物を除去するためには、静菌剤が免疫系とともに作用しなければならないことが理解される。静菌性抗生物質は、細菌タンパク質産生、ＤＮＡ複製、または他の細菌細胞代謝の局面を妨害することによるものなどの、いくつかのメカニズムを介して細菌の増殖を制限し得る。対照的に、殺菌性抗生物質は細菌を死滅させ、静菌性抗生物質は、その増殖または生殖を遅くするに過ぎない。細胞壁前駆体を破壊すること、３０ｓリボソームサブユニットに不可逆的に結合すること、翻訳忠実度を低下させ、不正確なタンパク質合成をもたらすことを含む、いくつかの殺菌機構が報告されており、これらの殺菌機構は、ｍＲＮＡとリボソームタンパク質の複合体の早過ぎる分離により、タンパク質合成を阻害する。最終的な結果は、細菌細胞死である。

別の実施形態では、本明細書に記載の化合物、組成物、方法、および医薬品は、治療有効量の本明細書に記載の１以上の化合物を含み、ここで、治療有効量は、炭疽菌、ペスト菌、野兎病菌、および鼻疽菌の１つまたは複数に対する殺菌活性を示すのに有効な量である。理論に束縛されるものではないが、静菌剤を用いてこのような疾患を治療するのは、２つの点でうまくいかない可能性があると考えられている。第１に、免疫系が必要なレベルでこの疾患を治す手助けをするようには介入しない可能性があるので、この疾患の進行を静菌剤で止めるだけでは不十分である可能性がある。例えば、いくつかの細菌生物は、細胞内コンパートメントに存在するので、免疫系によって死滅させられない。したがって、治療コースが終わるとすぐに、疾患の急速な再発が起こり得る。第２に、細菌集団の一部が排除される可能性が高いので、残りの集団が、耐性発生について選択される可能性がある。細胞内で活性がある薬剤、および／または細胞内で活性がありかつ殺菌性である薬剤は、このような疾患を治療するのに有効であると本明細書で考えられている。例示的な一実施形態では、標的とされる細菌のＭＩＣの２０倍の細胞内濃度を達成する本明細書に記載の化合物。全てではないにせよ、ほとんどのマクロライド系抗生物質は、インビトロで殺菌性であるが、インビボでは静菌性でしかないことが報告されている。例えば、本明細書に記載されるように、化合物の最後の投与の間の時間を延長したとき、汚染微生物数（ｂｉｏｌｏａｄ）の減少レベルは、本明細書に記載のトリアゾール含有化合物では変わらず、殺菌応答を示した。対照的に、ＴＥＬおよびＣＬＲ投与群は、時間間隔を延長したときに、汚染微生物数の増加を示した。したがって、これらの後者２つのマクロライド／ケトライド剤は、より古典的な静菌応答を示した。

ＣＥＭ−１０１は、曝露後の炭疽菌症状に対して現在承認されている抗生物質（シプロフロキサシン、ＭＩＣ_９０ ０．０３１ｕｇ／ｍｌ）または提案されている抗生物質（セスロマイシン、ＭＩＣ_９０ ０．０６３ｕｇ／ｍｌ）のインビトロ活性と比べて遜色がない炭疽菌に対する強力なインビトロ活性を有することも分かった。

図１に示すように、エアロゾル化した炭疽菌に対する用量依存的活性（生存パーセント）は、１４日間の経口投与の間ずっと観察される。特に重要なのは、ここで示される防御用量（例えば、２．５〜２０．００ｍｇ／ｋｇ）が、齧歯類モデルでＣＥＭ−１０１の高い血清レベルと組織レベルも提供するという事実であり、このレベルは、ヒトの治験において安全な投与レジメンを用いて達成可能なレベルである。蓄積したＧＬＰ毒性データに基づくと、ＣＥＭ−１０１を、吸入炭疽に曝露した後の管理に推奨されるようなより長い期間（例えば、３０〜６０日）にわたって投与することが可能になるはずである（Ｄｒｕｓａｎｏ，ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ａｇｅｎｔｓ ａｎｄ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｓｐｙ，Ｎｏｖ，２００８，ｐ３９７３−３９７９，Ｖｏｌ５２，Ｎｏ １１） 。これらの遅延型の予防レジメンは、休眠胞子が発芽した後の栄養細胞を根絶するために必要となり、この休眠胞子は、臨床症状を発症する前に、曝露した対象の肺組織に様々な期間および潜在的には延長した期間、存在することが知られている（Ｉｎｇｌｅｓｂｙ，ｅｔ ａｌ．，ＪＡＭＡ ２００２；２８７（１７） ２２３６−２２５２）。さらに、曝露後または３０〜６０日の予防レジメンの中断後の胞子の潜伏期間に対する不安を考慮すると、この生体防御シナリオでは、経口製剤による急性治療が、選択された、症状のある対象において必要となり得る。

細胞モデルでは、ＣＥＭ−１０１は、細胞内に存在する生物に対して他の抗菌剤よりも有意に活性が大きい 。これは、多剤耐性細菌をはじめとする耐性細菌に対して活性がある。インビトロでのＣＥＭ−１０１に対する細菌耐性の証拠が観察されている。理論に束縛されるものではないが、生存能力と病原性を低下させる複数の突然変異を有することになるので、耐性になる例には、生存上の強みがない可能性が高いと考えられている。

細胞内寄生が、ここで懸念されている生物学的脅威を与える病原菌による疾患の病態生理学の基礎になるので、抗微生物効力を伴って、組織に蓄積するおよび高い細胞内濃度を達成するＣＥＭ−１０１の能力は、薬理学的特性である。図６は、ＣＥＭ−１０１によるレジオネラ・ニューモフィラ（リソソームコンパートメント）やリステリア・モノサイトゲネス（細胞質）のマクロファージ取込みと細胞内死滅が、試験した他のマクロライド系薬剤によるものよりもさらに活発であることを示す（Ｌｅｍａｉｒｅ，ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ．Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．５３：３７３４−３７４３，２００９）。血漿で達成される濃度よりも２０〜２００倍高い細胞内濃度は、細胞への速やかな取込みと排出ポンプＰ−糖タンパク質の回避によって促進され、したがって、細胞内病原体の複製の効果的な根絶を可能にしている。ＣＥＭ−１０１は、アジスロマイシンやセスロマイシンとは異なり、Ｐ−糖タンパク質の基質ではない。

齧歯類および非ヒト霊長類における毒性研究でＣＥＭ−１０１が反復投与されたいくつかのインビボプロトコルによって、最大血漿レベルよりも約１７〜１００倍高いＣＥＭ−１０１の組織レベルが示されている。組織中に蓄積したＣＥＭ−１０１および濃度は、肝臓、脾臓、肺、および唾液腺で最も高かった。この関係性は、放射性ＣＥＭ−１０１を用いた齧歯類ＡＤＭＥ研究で確認された。１００ｍｇ／ｋｇで経口投与された場合、約１３：１の肺組織対血漿の放射能比がオスとメスの動物で観察された。２０ｍｇ／ｋｇでＩＶ投与した後、このデータはより変動しやすくなり、オスの場合１７．６、メスの場合６．２の肺／血漿比が観察された。ＣｍａｘおよびＡＵＣの範囲は、用量範囲の全体にわたって０．０２２μｇ／ｍＬおよび０．０４μｇ・ｈ／ｍＬから１．９６μｇ／ｍＬおよび２８．６０μｇ・ｈ／ｍＬであった。５０ｍｇから１６００ｍｇの用量範囲全体にわたって、平均ＣＥＭ−１０１ ｔ_ｍａｘは１．５時間から６．０時間に増加し、平均終末相半減期は、２．２時間から７．９時間に増加した。

別の例示的な実施形態では、ＸおよびＹが付加された炭素と一緒になってＣ（Ｏ）基を形成する、式（Ｉ）の化合物が本明細書に記載されている。別の実施形態では、ＸはＨであり、ＹはＯＲ^７であり、ここで、Ｒ^７は、クラジノシルなどの、単糖ラジカルである。別の実施形態では、Ｗがフルオロである、式（Ｉ）の化合物が本明細書に記載されている。別の実施形態では、ＡおよびＢが一緒になって、限定されるものではないが、プロピレン、ブチレン、およびペンチレンをはじめとするアルキレン基を形成する、式（Ｉ）の化合物が本明細書に記載されている。別の実施形態では、ＡおよびＢが一緒になってブチレンを形成する、式（Ｉ）の化合物が本明細書に記載されている。別の実施形態では、ＡおよびＢが一緒になってペンチレンを形成する、式（Ｉ）の化合物が本明細書に記載されている。別の実施形態では、ＡおよびＢが一緒になってブチレンを形成し、Ｃが２−ピリジニルまたはアミノフェニル、例えば、３−アミノフェニルである、式（Ｉ）の化合物が本明細書に記載されている。別の実施形態では、ＡおよびＢが一緒になって、プロピレン、ブチレン、またはペンチレンを形成し、Ｃがアミノフェニル、例えば、３−アミノフェニルである、式（Ｉ）の化合物が本明細書に記載されている。別の実施形態では、ＡおよびＢが一緒になってペンチレンを形成し、Ｃが３−ピリジニルまたはベンゾトリアゾールである、式（Ｉ）の化合物が本明細書に記載されている。別の実施形態では、Ｃが任意に置換されたアリールまたはヘテロアリール基である、式（Ｉ）の化合物が本明細書に記載されている。別の実施形態では、Ｖがカルバモイル基である、式（Ｉ）の化合物が本明細書に記載されている。別の実施形態では、Ｒ^１０が水素である、式（Ｉ）の化合物が本明細書に記載されている。別の実施形態では、ＸはＨであり、ＹはＯＲ^７であり、ここで、Ｒ^７は、クラジノシルなどの、単糖ラジカルであり、Ｃは３−ピリジニルまたはベンゾトリアゾリルである。

別の実施形態では、Ｃは、フェニル、ハロフェニル、ハロアルキルフェニル、アミノフェニルなどの任意に置換されたフェニル、２−ピリジニルや３−ピリジニルなどの任意に置換されたピリジニル、任意に置換されたベンゾトリアゾールなどである。

別の実施形態では、ＡおよびＢは一緒になってブチレンまたはペンチレンを形成し、ＸおよびＹは付加された炭素と一緒になってＣ（Ｏ）基を形成する。

別の実施形態では、ＶがＣ（Ｏ）である、前述の実施形態のいずれかに記載の化合物が記載されている。別の実施形態では、ＷがＨまたはＦである、前述の実施形態のいずれかに記載の化合物が記載されている。別の実施形態では、ＡがＣＨ_２であり、Ｂが（ＣＨ_２）_ｎであり、ｎが２〜４の整数である、前述の実施形態のいずれかに記載の化合物が記載されている。別の実施形態では、Ｃがアリールまたはヘテロアリールである、前述の実施形態のいずれかに記載の化合物が記載されている。別の実施形態では、Ｃが３−アミノフェニルまたは３−ピリジニルである、前述の実施形態のいずれかに記載の化合物が記載されている。別の実施形態では、Ｒ_１０が水素である、前述の実施形態のいずれかに記載の化合物が記載されている。別の実施形態では、ＡおよびＢが一緒になってブチレンまたはペンチレンを形成し、ＸおよびＹが付加された炭素と一緒になってＣ（Ｏ）基を形成する、前述の実施形態のいずれかに記載の化合物が記載されている。別の実施形態では、ＡおよびＢが一緒になってブチレンまたはペンチレンを形成し、ＸおよびＹが付加された炭素と一緒になってＣ（Ｏ）基を形成し、ＷがＦである、前述の実施形態のいずれかに記載の化合物が記載されている。

別の実施形態では、抗菌組成物が本明細書に記載されており、ここで、この組成物は、有効量の本明細書に記載の１以上の化合物、および薬学的に許容されるそのための担体、賦形剤、もしくは希釈剤、またはその組合せを含む。

本明細書で使用されるとき、「組成物」という用語は、通常、指定された量の指定された成分を含む任意の産物、および直接的または間接的に、指定された量の指定された成分の組合せから得られる任意の産物を指す。例として、組成物は、１以上の担体、希釈剤、および／または賦形剤を含み得る。本明細書に記載の化合物は、１以上のそのための担体、希釈剤、および／または賦形剤を含む、本明細書に記載の方法のための従来の投薬形態として、治療有効量で製剤化し得る。このような製剤組成物は、本明細書に記載の方法のための幅広い種類の従来の経路により、当該技術分野で認識される製品を利用して、幅広い種類の投薬形式で投与し得る。一般には、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（第１６版、１９８０）を参照されたい。本明細書に記載の組成物を、本明細書に記載の単離された化合物または本明細書に記載の化合物の塩、溶液、水和物、溶媒和物、およびその他の形態から調製し得ることが理解されるべきである。これらの組成物を、本明細書に記載の化合物の様々なアモルファス、非アモルファス、部分結晶、結晶、および／またはその他の形態学的形態から調製し得ることも理解されるべきである。

本明細書で使用される「治療有効量」という用語は、研究者、獣医、医師または他の臨床医が求めている組織システム、動物またはヒトにおける生物学的または医学的応答を誘発する活性化合物または医薬品の量を指し、この生物学的または医学的応答には、治療される疾患または障害の症状の緩和が含まれる。一態様では、治療有効量とは、任意の医学的処置に適用できる妥当なベネフィット・リスク比で疾患または疾患の症状を治療または緩和し得る量のことである。しかしながら、本明細書に記載の化合物および組成物の合計日用量は、健全な医学的判断の範囲内において担当医によって決められ得ることが理解されるべきである。任意の特定の患者に対する特定の治療有効用量レベルは、治療される障害およびその障害の重症度；使用される特定化合物の活性；使用される特定組成物；患者の年齢、体重、全体的な健康、性別および食事：投与の時間、投与の経路、および使用される特定化合物の排泄速度；治療の持続期間；使用される特定化合物と組み合わせてまたは同時に使用される薬物；ならびに医学の分野でよく知られている同様の因子をはじめとする種々の因子によって決まるであろう。

一実施形態では、本明細書に記載の化合物は、約１〜約１０ｍｇ／ｋｇ患者体重、約２〜約８ｍｇ／ｋｇ患者体重、または約４〜約６ｍｇ／ｋｇ患者体重の用量でヒトに経口投与される。別の実施形態では、成人ヒトの日用量は、約１００〜約１，０００ｍｇであり、これは、１日１回、１日２回、１日３回などで投与し得る。別の実施形態では、成人ヒトの日用量は、約４００〜約６００ｍｇであり、これは、１日１回、１日２回、１日３回などで投与し得る。このような用量を、１日１回、１日２回、または１日３回投与し得る。例示的な経口単位投薬量は、５０、１００、２００、および４００ｍｇ（単回または分割）である。理論に束縛されるものではないが、このような例示的投薬量は、例えば、炭疽菌、ペスト菌、野兎病菌、および鼻疽菌の１つまたは複数に関して、本明細書に記載の化合物の殺菌活性を認めるのに十分であり得る、約１μｇ／ｍＬの血漿レベルを達成するのに十分であると考えられている。本明細書に記載されるように、ＣＥＭ−１０１をはじめとする本明細書に記載の化合物は、肺組織などの組織で高濃度に達することが理解される。理論に束縛されるものではないが、ＣＥＭ−１０１をはじめとする本明細書に記載の化合物は、マクロライド耐性株、例えば、限定されるものではないが、炭疽菌、ペスト菌、野兎病菌、および鼻疽菌（これらの耐性株を含む）をはじめとする株のＭＩＣの少なくとも１０倍となる組織レベルを達成し得ると本明細書で考えられている。

本明細書に記載の化合物は、本明細書に記載の通りに、または米国特許出願公開第２００６／０１００１６４号およびＰＣＴ国際公開ＷＯ２００９／０５５５５７号に従って調製することができ、これらの開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

簡潔に述べると、トリアゾール含有ケトライドの合成は、クラリスロマイシン（２）からの１２−アシル−イミダゾール中間体４（スキームＩ）の既知の２工程調製から開始される。中間体４は、対応する３−、４−または５−炭素結合アミノアルコールとの反応によって、１１，１２−環状カルバメート５ａ−ｃに変換される。５ａ−ｃを塩化トシルで処理すると、トシレート６ａ−ｃが得られる。このトシル基をＮａＮ_３と置き換えると、対応するアジド化合物７ａ−ｃが得られる。クラジノース糖７ａ−ｃの８ａ−８ｃへの切断は、ＭｅＯＨ中のＨＣｌによる処理によって達成される。８ａ−ｃの３−ヒドロキシ基のスワン酸化により、対応する保護ケトライド９ａ−ｃが得られ、その後、これらをメタノールで脱保護すると、それぞれ、所要のアジドケトライド１０ａ−ｃが得られる。これらのアジド化合物を、ヨウ化銅の存在下、トルエン中６０℃で末端置換アルキンと反応させると、対応する４−置換−［１，２，３］−トリアゾール１１ａ−１８ａ、１１ｂ−１８ｂ、および１１ｃ−１８ｃが位置選択的に得られた。

中間体１０ａ−ｃのアジドは、置換アセチレンとの付加環化反応によって４−置換−［１，２，３］−トリアゾールに変換される。トリアゾール環は、スキームＩＩの経路Ａに示すように、１，４−位置異性体と１，５−位置異性体の混合物を生じさせるアジドとアルキンのヒュスゲン１＋３付加環化反応によって形成してもよい。あるいは、スキームＩＩの経路Ｂに示すように、反応液へのＣｕＩ触媒の添加を用いて、１，４−位置異性体を選択的にまたは排他的に生成させるＲｏｓｔｏｖｔｓｅｖら^８の方法に従ってもよい。

トリアゾール環側鎖もクラリスロマイシン環系に組み入れられる。一実施形態では、ブチルアルキル側鎖が選択される。ケトライドシリーズの多くのブチル側鎖類似体により、インビトロのＭＩＣ結果に基づく抗菌活性が改善されていることが理解される。中間体７ｂは、スキームＩＩＩに示すように、銅が触媒する末端置換アセチレンとの環化によって、４−置換−［１，２，３］−トリアゾールに直接的に変換される。１９ａ−ｅのアセテート保護基をメタノール中のＬｉＯＨで除去すると、対応する４−置換−［１，２，３］−トリアゾール２０ａ−ｅが得られる。

２位水素とフッ素との置換は、Ｓｅｌｅｃｔｆｌｕｏｒ（登録商標）を用いた９ｂの求電子フッ素化（スキームＩＶ）によって達成される。中間体２２のアジド基は、標準的な条件によって、一連の４−置換−［１，２，３］−トリアゾール２３ａ−ｂに変換される。

スキームＩ

スキームＩＩ

スキームＩＩＩ

スキームＩＶ

別の実施形態では、以下の化合物が記載されている。

^ａ米国臨床検査標準委員会。Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｄｉｌｕｔｉｏｎ Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ Ｔｅｓｔｓ ｆｏｒ Ｂａｃｔｅｒｉａ ｔｈａｔ Ｇｒｏｗ Ａｅｒｏｂｉｃａｌｌｙ，第６版；Ａｐｐｒｏｖｅｄ ｓｔａｎｄａｒｄ：ＮＣＣＬＳ文書Ｍ７−Ａ６，２００３。

別の実施形態では、以下の化合物が記載されている。

別の実施形態では、以下の化合物が記載されている。

前述の実施形態の各々では、１次スクリーニングパネルは、関連する黄色ブドウ球菌、化膿レンサ球菌、肺炎レンサ球菌（アジスロマイシンおよびテリスロマイシンに耐性のある株を含む）からなるものであった。全ての病原体に対するＭＩＣを、ＮＣＣＬＳ指針の通り、ブロス微量希釈法を用いて決定した。本明細書に記載の化合物、例えば、ＣＥＭ−１０１は、それぞれテリスロマイシンの１μｇ／ｍＬおよび８μｇ／ｍＬと比べて、肺炎レンサ球菌（３７７３）に対して０．１２５μｇ／ｍＬ以下および化膿レンサ球菌（１８５０）に対して０．５μｇ／ｍＬというＭＩＣを有する極めて強力なものであることが分かった。３−Ｏ−クラジノースを含有するＣＥＭ−１０１の類似体である、ＣＥＭ−１０３（２０ｃ）は、活性が低いことが分かった。非ヘテロ芳香族置換トリアゾール含有ケトライドは活性が低かった。

ケトライドを、黄色ブドウ球菌（２９２１３（Ｅｒｙ−Ｓ）と９６：１１４８０（Ｅｒｙ−Ｒ））、肺炎レンサ球菌（４９６１９（Ｅｒｙ−Ｓ）と１６３および３０３（Ｅｒｙ−Ｒ））ならびにインフルエンザ菌（４９２４７（Ｅｒｙ−Ｓ））のエリスロマイシン感受性株（Ｅｒｙ−Ｓ）およびエリスロマイシン耐性株（Ｅｒｙ−Ｒ）に対して試験した（表１〜３）。ブロス微量希釈法を用いて、臨床検査標準協会（ＣＬＳＩ）の通り、全ての病原体に対する最小阻害濃度（ＭＩＣ）を決定した。

アルキル側鎖の鎖長は活性に影響を及ぼした（表１）。例えば、３−炭素結合フェニル置換トリアゾール１１ａは、被験濃度では、Ｅｒｙ−ＳおよびＥｒｙ−Ｒの黄色ブドウ球菌に対する活性が低く、Ｅｒｙ−Ｒの肺炎レンサ球菌３０３（ｅｒｍＢ）に対しては不活性であったのに対し、対応する４−および５−炭素結合フェニル置換トリアゾール１１ｂおよび１１ｃは、これらの生物に対してより活性があった。同様の傾向は、２−ピリジル置換トリアゾール１４ａ−ｃ、３−アミノ−フェニル置換トリアゾール１６ａ−ｃ、および２，５−ジクロロフェノキシ置換トリアゾール１７ａ−ｃで観察された。

４−炭素結合２−ピリジル置換トリアゾール１４ｂおよび３−アミノ−フェニル置換トリアゾール１６ｂは、肺炎レンサ球菌３０３に対して最も高い効力を有し、ＭＩＣ値は両方ともテリスロマイシンと同程度（≦０．１２５μｇ／ｍＬ）であった。４−炭素結合３−ピリジル置換トリアゾール１５ｂを含有するケトライドは、この株に対する活性が低かった（ＭＩＣ ６４μｇ／ｍＬ）。このシリーズにおいて、抗菌活性は、炭素リンカーを５原子伸長させることにより改善され、例えば、化合物１５ｃの肺炎レンサ球菌３０３に対するＭＩＣは、６４μｇ／ｍＬから４μｇ／ｍＬに改善された。同様の効果は、黄色ブドウ球菌に対してベンゾトリアゾール含有ケトライド１８ｃでも観察されたが、１８ｃは、肺炎レンサ球菌３０３に対しては依然として不活性であった。リンカーの長さとトリアゾールの芳香族置換の性質の均衡が、マクロライド耐性の肺炎レンサ球菌および黄色ブドウ球菌に対する全体的な活性に影響を及ぼし得ることが理解される。

リンカーの長さと活性の相関はインフルエンザ菌（４９２４７）でも観察されたが、この場合、最も強力なケトライドシリーズは、４−炭素鎖（１１ｂ−１４ｂ、１６ｂ、１７ｂ）または５−炭素鎖（１５ｃ、１８ｃ）のいずれかを介して結合した置換トリアゾールを有していた。興味深いことに、インフルエンザ菌に対する最も強力な芳香族シリーズは、それぞれ、１６、２、および８μｇ／ｍＬというＭＩＣを有する、３−、４−または５−炭素リンカー（１６ａ、１６ｂ、１６ｃ）を有する３−アミノ−フェニルであった。

３位にクラジノースを含有するマクロライドは全て、Ｅｒｙ−Ｓの肺炎レンサ球菌（４９６１９）に対する活性が高かった（表２）。しかしながら、これらの類似体は、Ｅｒｙ−Ｒ株に対してはテリスロマイシンよりも強力でなかった。ＭＩＣは、対応するケトライドよりも、２−ピリジル、２−アミノフェニルまたは２，６−ジクロロフェニルトリアゾール置換基を有するクラジノース含有類似体で有意に高かった（２０ａ、２０ｃ、および２０ｄ対１４ｂ、１６ｂ、および１７ｂ）。反対に、抗菌活性は、類似体２０ｂ（３−ピリジル）および２０ｅ（ベンゾトリアゾール）においてケトをクラジノース基と置き換えることによって、ケトライド類似体１５ｂ（３−ピリジル）および１８ｂ（ベンゾトリアゾール）で再度確立された。ＭＩＣは、それぞれ、１５ｂおよび１８ｂの６４μｇ／ｍＬから２０ｂおよび２０ｅの１μｇ／ｍＬおよび２μｇ／ｍＬに改善された。同様の活性傾向は、Ｅｒｙ−Ｒの肺炎レンサ球菌１６３（ＭｅｆＡ）でも観察された。

化合物例

１１−Ｎ−（４−アジド−ブチル）−６−Ｏ−メチル−５−（３−ジメチルアミン−４−デオキシ−６−Ｏ−アセチル−ｇｌｕ−コピラノシル）−２−フルオロ−３−オキソ−エリスロノライドＡ、１１，１２−カルバメート（１５ｍｇ、０．０１９ｍｍｏｌ）、６−エチニル−ピリジン−２−イルアミン（４．７ｍｇ、０．４ｍｍｏｌ）、ＣｕＩ（１ｍｇ、０．００５ｍｍｏｌ）、およびトルエン（０．２ｍＬ）の混合物を７０℃に加熱した。１６時間後、この混合物を濃縮し、そのままシリカゲルクロマトグラフィー（９：１、クロロホルム：メタノール＋１％水酸化アンモニウム）に供すると、１４ｍｇの所望の化合物が得られた。ＭＳ：Ｃ_４４Ｈ_６６ＦＮ_７Ｏ_１２、計算値Ｍ^＋＝９０３．５、実測値：Ｍ＋Ｈ^＋＝９０４．５。

１１−Ｎ−４−（３−アミノフェニル）−［１，２，３］トリアゾール−１−イル］−ブチル｝−５−デソサミニル−３−オキソ−２−フルオロ−エリスロノライドＡ、１１，１２−環状カルバメート（ＣＥＭ−１０１）。１１−Ｎ−（４−アジド−ブチル）−６−Ｏ−メチル−５−デソサミニル−３−オキソ−２−フルオロ−エリスロノライドＡ、１１，１２−カルバメート（１７ｍｇ、０．０２３ｍｍｏｌ）、３−エチニル−フェニルアミン（５．４ｍｇ、０．０４６ｍｍｏｌ）、ＣｕＩ（１ｍｇ、０．００５ｍｍｏｌ）、およびトルエン（０．２ｍＬ）の混合物を７０℃に加熱した。１６時間後、この混合物を濃縮し、そのままシリカゲルクロマトグラフィー（９：１、クロロホルム：メタノール＋１％水酸化アンモニウム）に供すると、１７ｍｇの所望の化合物が得られた。ＭＳ Ｃ_４３Ｈ_６５ＦＮ_６Ｏ_１０、計算値Ｍ^＋＝８４４．４７、実測値：Ｍ＋Ｈ^＋＝８４５．５。

１１−Ｎ−｛４−［４−（６−アミノ−ピリジン−２−イル）−［１，２，３］トリアゾール−１−イル］−ブチル｝−５−デソサミニル−３−オキソ−２−フルオロ−エリスロノライドＡ、１１，１２−環状カルバメート。１１−Ｎ−（４−アジド−ブチル）−６−Ｏ−メチル−５−デソサミニル−３−オキソ−２−フルオロ−エリスロノライドＡ、１１，１２−カルバメート（１５ｍｇ、０．０２ｍｍｏｌ）、６−エチニル−ピリジン−２−イルアミン（４．７ｍｇ、０．４ｍｍｏｌ）、ＣｕＩ（１ｍｇ、０．００５ｍｍｏｌ）、およびトルエン（０．２ｍＬ）の混合物を７０℃に加熱した。１６時間後、この混合物を濃縮し、そのままシリカゲルクロマトグラフィー（９：１、クロロホルム：メタノール＋１％水酸化アンモニウム）に供すると、１４ｍｇの所望の化合物ＯＰ１３５７が得られた。ＭＳ：Ｃ_４２Ｈ_６４ＦＮ_７Ｏ_１０、計算値Ｍ^＋＝８４５．５、実測値：Ｍ＋Ｈ^＋＝８４６．５。

１１−Ｎ−［４−（４−ベンゾトリアゾール−１−イルメチル−［１，２，３］トリアゾール−１−イル）−ブチル］−６−Ｏ−メチル−５−Ｏ−ダソサミニル−３−オキソ−エリスロノライドＡ、１１，１２−カルバメート。１１−Ｎ−（４−アジド−ブチル）−６−Ｏ−メチル−５−Ｏ−デソサミニル−３−オキソ−エリスロノライドＡ、１１，１２−カルバメート（３ｍｇ、０．００３９ｍｍｏｌ）、１−プロプ−２−イニル−１Ｈ−ベンゾトリアゾール（３ｍｇ、０．４ｍｍｏｌ）、ＣｕＩ（１ｍｇ、０．００５ｍｍｏｌ）、およびトルエン（０．２ｍＬ）の混合物を８０℃に加熱した。１６時間後、この混合物を濃縮し、そのままシリカゲルクロマトグラフィー（９：１、クロロホルム：メタノール＋１％水酸化アンモニウム）に供すると、３ｍｇの所望の化合物が得られた。ＭＳ：Ｃ_４４Ｈ_６６Ｎ_８Ｏ_１０、計算値Ｍ^＋＝８６６．５、実測値：Ｍ＋Ｈ^＋８６７．５。

１１−Ｎ−［４−（４−ベンゾトリアゾール−１−イルメチル−［１，２，３］トリアゾール−１−イル）−ブチル］−６−Ｏ−メチル−５−ミカミノシル−３−オキソ−エリスロノライドＡ、１１，１２−カルバメート。１１−Ｎ−（４−アジド−ブチル）−６−Ｏ−メチル−５−ミカミノシル−３−オキソ−エリスロノライドＡ、１１，１２−カルバメート（３ｍｇ、０．００４ｍｍｏｌ）、１−プロプ−２−イニル−１Ｈ−ベンゾトリアゾール（３ｍｇ、０．４ｍｍｏｌ）、ＣｕＩ（１ｍｇ、０．００５ｍｍｏｌ）、およびトルエン（０．２ｍＬ）の混合物を８０℃に加熱した。１６時間後、この混合物を濃縮し、そのままシリカゲルクロマトグラフィー（９：１、クロロホルム：メタノール＋１％水酸化アンモニウム）に供すると、３ｍｇの所望の化合物が得られた。ＭＳ：Ｃ_４４Ｈ_６６Ｎ_８Ｏ_１１、計算値Ｍ^＋＝８８２．５、実測値：Ｍ＋Ｈ^＋＝８８３．５。

方法例
実施例。致死的エアロゾル投与に対するＣＥＭ−１０１の効力を評価する、カニクイザルでの致死的な吸入による炭疽菌投与に対するＣＥＭ−１０１の極めて重要な効力。約２．５〜５．０ｋｇ、約２〜５歳の投薬を受けていないカニクイザル４２匹（オス２１匹、メス２１匹）（Ｃｏｖａｎｃｅから入手可能）を試験する（４０匹を研究し、２匹を予備とする）。サルを結核について試験して陰性であることを確認し、また、受容前の３０日以内にプレスクリーニングして、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、サルＴリンパ球向性ウイルス−１（ＳＴＬＶ−１）、およびオナガザルヘルペスウイルス１（ヘルペスＢウイルス）について血清反応陰性であることと、ＰＣＲによりサルレトロウイルス（ＳＲＶ１およびＳＲＶ２）について陰性であることとを確認する。表７を参照されたい。

研究−７日目と０日目に動物の体重を量る。研究で死ぬかまたは安楽死させるサルについては、解剖前に体重を量る。疾患が進行する間に動物の体重が減少しているように見える場合には、さらに体重を量ることがある。全てのサルの臨床的観察は、投与前期間中１日２回行なう。血液試料を、表８で指定される日に、大腿動脈もしくは大腿静脈、伏在静脈、または他の適当な静脈から採取する。投与当日に回収される血液試料は、投与前に回収される。埋め込み（約−７日）から２８日目まで１日２回、埋め込み型のプログラム可能な温度トランスポンダーチップ（例えば、ＩＰＴＴ−３００ ＢＭＤＳ，Ｓｅａｆｏｒｄ，ＤＥ）を介して体温をモニタリングする。

投与の約５〜１０日前にサルをＢＬ（バイオハザード実験室レベル３）に移して、馴化する時間を与える。投与前に、各々の投与日群中のサルを投与順について無作為化する。０日目に、サルにテラゾール（１〜６ｍｇ／ｋｇ、ＩＭ）で麻酔をかけて、衝突ネブライザーでエアロゾル化され、頭部のみの吸入曝露チャンバーを通じて送達される投与病原菌をターゲッティングするために、プレスチモグラフィーチャンバーおよびクラスＩＩＩのキャビネットシステムに入れる。

投与物質のエアロゾル濃度は、コロニー形成単位（ｃｆｕ）を決定して定量化する。流出液をインライン式の全ガラス製インピンジャーによって動物曝露口から直接回収する。インピンジャー試料の連続希釈液をプレーティングし、計数する。

投与後、サルを１日２回、最低２８日間、ＢＬ−３条件下で、生存および病気の臨床的兆候について観察する。生き残った動物は、３回連続して血液培養が陰性であることを示した後、２８日目以降に、ＢＬ−３から取り出してもよい。

表８に示した時点からの血液試料を培養して、細菌の有無を決定する。血液学的評価（ＣＢＣ）も行なう。処理後の各々の全血液試料から回収した残りの血漿に対してＣＲＰ解析を行なう。血漿を分離することができる場合は、ＥＤＴＡチューブに回収した末端血液試料に対してもＣＲＰ解析を行なう。凝固アッセイには、プロトロンビン時間（ＰＴ）、活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）、フィブリノゲン、およびＤ−ダイマーが含まれる。

統計解析：フィッシャーの直接確率検定を用いて、各抗生物質処置群と対照群の生存率を比較する。これらのデータに対して死亡までの時間解析を行ない、生存期間モデルに基づいて異なる群についての防御に違いがあるかどうかを決定する。カプラン−マイヤーの生存確率推定値をプロットする。ログランク検定またはウィルコクソン検定またはコックス比例ハザード回帰を用いて、これらの群間に有意差があるかどうかを決定し、もしあるならば、どの群が有意に異なるかを決定する。菌血培養データを各時点で別々に解析する。９５パーセント信頼区間を有する要約統計量を各群および各時点について作成する。フィッシャーの直接確率検定を用いて、群間の菌血培養データに有意差があるかどうかを検定する。血液検査、臨床化学、凝固、温度、抗生物質のピーク値とトラフ値について、９５パーセント信頼区間を有する要約統計量を各群について作成する。分散分析（ＡＮＯＶＡ）モデルを各時点の各パラメータに当てはめて、処置群間に有意差があるかどうかを決定することができる。生存が期待される対照動物はほとんどなく、処置動物のベースライン値をこれらの比較において使用してもよく、各動物はそれ自身の対照としての役割を果たす。温度、臨床化学、および血液検査パラメータの変化の平均値をゼロと比較して、健康状態のいかなる変化も評価する。

ＮＨＰにおける致死的な吸入による野兎病菌、ペスト菌、および鼻疽菌投与に対するＣＥＭ−１０１の効力ならびにＮＨＰにおける致死的な吸入による炭疽菌投与に対するＣＥＭ−１０１の予備的効力を下記の方法を用いて決定する。

実施例。ウサギ薬物動態および認容性研究

ＣＥＭ−１０１の投与前および投与中の指示された時点の処置ウサギおよび対照ウサギから回収した血液試料からＣＥＭ−１０１の血液レベルを決定する。

実施例。非ヒト霊長類における薬物動態（ＰＫ）。ＰＫデータを３つの段階で回収する。８匹のサル（オス４匹、メス４匹）が各段階で参加する（表３）。各段階の後で、次の段階を開始する前に、最低７日間の洗い出し期間を設ける。

実施例。大量動物曝露システムにおける鼻疽菌投与物質および送達の特徴解析。鼻疽菌株を分離用に適当な増殖培地（例えば、４％グリセロールを含む溶原（ＬＢ）寒天またはアッシュダウン培地）にストリークする。（形態学的に異なるコロニーが鼻疽菌にはよくあることを考慮して）コロニーの純度と形態を確認した後、全てのコロニーを取り除き、適当な細菌保存培地に懸濁し、−７０℃以下で凍結させる。単一の単離コロニーではなく、コロニーの集団を調製する（単一のコロニー型を単離することにより、病原性特性が変化した変異体が間違って選択される可能性があることが理解される）。回収したコロニーはマスター細胞バンクを構成する。マスター細胞バンクからストリークすることによってこの手順を繰り返し、ワーキング細胞バンクを調製する。

マスター細胞バンクおよびワーキング細胞バンクを調製するときに寒天培地上で調製される全ての培養物をコロニーの形態および純度について調べる。肉眼的な形態検査には、コロニーの形状、サイズ、隆起、縁、色、外観、密度、および粘稠度についての記載が含まれる。細胞バンクに汚染物が含まれることが明らかになった場合、マスターまたは細胞バンクから再度得られる。

マスター細胞バンクおよびワーキング細胞バンクからの培養物質をグラム染色する。グラム染色の結果および肉眼的な細胞形態を観察し、公開文献中のこれまで結果と比較する。ワーキング細胞バンク物質を用いてブロス培養液に植菌し、フラスコを様々な時間インキュベートして、培養物の光学密度を測定する。複数のブロス培養物を調製する。各培養物を標的光学密度まで増殖させ、その後、スプレッドプレート計数により培養物のＣＦＵ／ｍＬの数を決定する。複数の培養物の結果を１つの培養物密度について平均化することにより、ＣＦＵ／ｍＬの数の比を決定する。リアルタイム定量ＰＣＲ（＋／− ＰＣＲ）を行ない、核酸レベルで、各ワーキング細胞バンクが本当に、提供された鼻疽菌株であることを決定する。全ての株のマスター細胞バンクおよびワーキング細胞バンクにおける細菌の濃度は、スプレッドプレート計数、または同等の技術により決定される。

新鮮な鼻疽菌懸濁液はストック試料から調製する。新鮮なバッチは、エアロゾル試験が行なわれる日ごとに調製する。エアロゾル化用の出発（ネブライザー）鼻疽菌溶液を、０．０１％（ｗｔ／ｖｏｌ）ゼラチンと９．７％トレハロース（ｗｔ／ｖｏｌ）とを含有する滅菌リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（ＢＳＧＴ）に希釈し、約８ｍＬを各試験用にネブライザーに入れる。ｃｆｕカウントのためにプレーティングするまで、０．０１％（ｗｔ／ｖｏｌ）ゼラチンを含む滅菌リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（ＢＳＧ）と０．０１％消泡剤Ａ、約２０ｍＬで満たされたガラス製インピンジャー（例えば、モデル７５４１ Ａｃｅ Ｇｌａｓｓ，Ｉｎｃ．）を用いて、エアロゾル試料を曝露チャンバーから回収する。エアロゾルの粒径分布を曝露システムからサンプリングし、エアロダイナミックパーティクルサイザーを用いて測定する。

生きた鼻疽菌のエアロゾル濃度（すなわち、ＣＦＵ）およびエアロゾル生成の再現性を定量するために、一連のエアロゾル曝露システム−特徴解析試験を行なう。表４は、エアロゾルシステムの再現性の試験に使用可能な試験マトリクスを示す。特徴解析試験を繰り返して、各々の日に３日間の４つの異なる標的エアロゾル濃度を作成する。各々の標的エアロゾル濃度の作成を各々の日に３回繰り返す。エアロゾル試料を回収し、スプレッドプレート技術でＣＦＵについて計数する。さらに、各試験中の温度、相対湿度、およびエアロゾル粒径を少なくとも１つの時点の間、モニタリングする。

完全な試験マトリクス（表１〜４）を連続しない３日間、繰り返す。

エアロゾル特徴解析試験については、統計的ＡＮＯＶＡモデルをエアロゾルシステムについての試験データに当てはめる。これらのデータは４つのエアロゾル濃度からなり、これらの濃度は、各々の日に３回試験され、実験全体が３つの異なる日に繰り返される。測定されたシステム出力（例えば、噴霧係数）に再現性がある（すなわち、別の日と比較してある日に統計的に有意な差がない）かどうかについて、統計的仮説を試験する。ネガティブな結果（すなわち、統計的に有意でないこと）により、再現性ありとの結論が下される。実際の差の同定に対する試験の最小感度を決定するために、出力分析も行なう。

実施例。鼻疽菌の作製、送達、および回収のためのマウスエアロゾルシステムの開発。生きた鼻疽菌のエアロゾル濃度（すなわち、ＣＦＵ）および曝露システムの再現性を定量するために、一連のエアロゾル曝露システム−特徴解析試験を行なう。表４は、エアロゾルシステムの再現性の試験に使用される、提案される暫定試験マトリクスを示す。特徴解析試験を繰り返して、各々の日に３日間の４つの異なる標的エアロゾル濃度を作成する。各々の標的エアロゾル濃度の作成を各々の日に３回繰り返す。上記のようにエアロゾル試料を回収し、スプレッドプレート技術でコロニー形成単位（ｃｆｕ）について計数する。

エアロゾル特徴解析検定については、統計的ＡＮＯＶＡモデルをエアロゾルシステムについての検定データに当てはめる。上記のように、これらのデータは４つのエアロゾル濃度からなり、これらの濃度は、各々の日に３回試験され、実験全体が３つの異なる日に繰り返される。測定されたシステム出力（例えば、噴霧係数）に再現性がある（すなわち、別の日と比較してある日に統計的に有意な差がない）かどうかについて、統計的仮説を検定する。ネガティブな結果（すなわち、統計的に有意でないこと）により、再現性ありとの結論が下される。実際の差の同定に対する試験の最小感度を決定するために、出力分析も行なう。

実施例。マウスにおける鼻疽菌の吸入半致死量（ＬＤ_５０）の決定。鼻疽菌の吸入ＬＤ_５０の決定を段階的に行なう。この研究の各段階は、２８日にまで及ぶ投与後期間からなっている。動物に投与する日を研究０日目と表す。第Ｉ段階は５つの群、第ＩＩ段階は４つの群からなり、第ＩＩＩ段階および第ＩＶ段階は各々３つの群からなる。前の段階の死亡結果に基づいて、新しい標的曝露用量を決定する。この段階的アプローチにより、吸入ＬＤ_５０値の信頼を高めることが可能になる。

（各段階の）研究０日目に、吸入経路を介してマウスに鼻疽菌を投与する。鼻のみのエアロゾル曝露システム（例えば、ＣＨ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｔｏｗｅｒ）を用いて、所望のエアロゾル用量をマウスに送達する。マウスエアロゾル投与試験に用いられるＣＨ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｔｏｗｅｒシステムは、インピンジャー試料、エアロゾル粒径分析器、温度および湿度モニタリング、ならびにエアロゾルフローを制御および／またはモニタリングするためのマスフローメーター（ＭＦＭ）およびマスフローコントローラー（ＭＦＣ）を伴って、一度に最大３０匹のマウスに曝露させることができる。簡潔に述べると、強制空気が高性能微粒子空気（ＨＥＰＡ）フィルターを通ってシステムに侵入し、連続する気流（連続空気）と、（エアロゾル生成時に）衝突ネブライザーに流入するかまたは（エアロゾル生成とエアロゾル生成の間に）それを迂回するかのいずれかの気流とに分かれる。ＭＦＣは、これらの気流の各々についての流量を調節する。曝露塔に送達する前に、このネブライザーで作り出される鼻疽菌エアロゾルを連続空気と混合する。これらの用量を送達するのに必要とされるエアロゾル曝露パラメータは、上記の提案されたマウスエアロゾルシステム特徴解析研究からの結果に基づく。

鼻疽菌のエアロゾル濃度は、コロニー形成単位（ｃｆｕ）を決定して定量化する。流出液をインライン式の全ガラス製インピンジャーによって動物曝露口から直接回収する。インピンジャー試料の連続希釈液をプレーティングし、カウントする。

マウスを１日２回、合計２９日間（研究０日目から研究２８日目までを含む）観察して、疾患の臨床的兆候の発症および生存性を決定する。

マウスにおけるＬＤ_５０ （吸入半致死用量）決定のために、実験を段階的に行なう（Ｆｅｄｅｒ，１９９２）。最大尤度法を用いて、プロビット用量−応答モデルをマウスの用量−致死データに当てはめてる（Ｆｉｎｎｅｙ，１９７１およびＦｅｄｅｒ，１９９１）。プロビット用量−応答モデルの推定パラメータを用いて、ＬＤ_５０を計算する。フィーラー法（Ｆｉｎｎｅｙ，１９７１）または他の適切な方法を用いて、ＬＤ_５０についての９５％信頼区間を計算する。

各々の臨床的兆候の発症までの時間を、動物の死亡、安楽死、または臨床的観察期間の最後まで記録する。各々の臨床的兆候を示す動物と各々の兆候の発症までの時間の割合を決定する。死亡は観察された時点で記録する。用量を説明変数として、コックスの比例ハザードモデルを、発症までの時間と死亡までの時間のデータに当てはめる。より重篤な兆候があまり重篤でない兆候を隠す場合があるので、この解析のために兆候を分類してもよい。兆候までの平均期間と死亡までの平均期間をＬＤ_５０で算出する。

実施例。カニクイザルにおける吸入鼻疽菌疾患の自然史／ＬＤ_５０決定。カニクイザルにおける鼻疽菌の致死用量（ＬＤ_５０）の決定および吸入類鼻疽の自然史の特徴解析を、選択された器官における臨床的観察、血液検査、臨床化学、テレメトリーパラメータ、凝固アッセイ、菌血、および細菌数をはじめとする、疾患の臨床的兆候をモニタリングすることにより決定する。

約２．５〜５．０ｋｇ（約２〜５歳）の投薬を受けていないカニクイザル（サル、ＮＨＰ）２２匹（オス１１匹、メス１１匹）を入手する（Ｃｏｖａｎｃｅから入手可能）。ＮＨＰのうち２匹は、第Ｉ段階、第ＩＩ段階、および第ＩＩＩ段階で必要になった場合に、交代要員としての役割を果たす。サルを結核について試験して陰性であることを確認し、また、受容前の３０日以内にプレスクリーニングして、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、サルＴリンパ球向性ウイルス−１（ＳＴＬＶ−１）、およびオナガザルヘルペスウイルス１（ヘルペスＢウイルス）について血清反応陰性であることと、ＰＣＲによりサルレトロウイルス（ＳＲＶ１およびＳＲＶ２）について陰性であることとを確認する。サルは、研究に供される前に最低５週間検疫を受ける。研究に供される前に、全てのサルに、テレメトリートランスミッター（例えば、Ｄａｔａ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，ＤＳＩから購入される、品目Ｄ７０−ＰＣＴＰ）を手術で埋め込む。

１０群のサルを、４段階かけてエアロゾルにより送達される様々な用量の鼻疽菌に曝露させる（表７参照）。前の段階の死亡データに基づいて、次の段階のために新しい標的曝露用量を決定する。この段階的アプローチにより、吸入ＬＤ_５０推定値の信頼を高めることが可能になる。最初の３つの段階を用いて、ＮＨＰにおける鼻疽菌のＬＤ_５０を決定する。最後の段階では、残りの４匹のＮＨＰに、最初の３つの段階からの結果に基づいて大半の動物において致死的であると考えられる高度の曝露を施す（すなわち、ＬＤ_９０前後の曝露用量を標的にする）。第Ｉ段階、第ＩＩ段階、または第ＩＩＩ段階で使用しない場合、第ＩＶ段階で交代要員のＮＨＰにこのような曝露を施す。第ＩＶ段階で収集される情報は、最初の３つの段階で収集される自然史情報を裏付け、効力研究で使用し得るものと同様の上昇した用量を投与れた動物における疾患進行への理解を高める。第ＩＶ段階から得られる結果は、ＬＤ_９０推定の精度も高め得る。

検疫期間中と研究−７日目および０日目に、動物の体重を量る。研究で死ぬかまたは安楽死させるサルについては、解剖前に体重を量る。疾患が進行する間に動物の体重が減少しているように見える場合には、さらに体重を量ることがある。全てのサルの臨床的観察は、曝露前期間中１日２回行なう。エアロゾル曝露後、サルを１日３回、曝露後２８日間、生存および病気の臨床的兆候、すなわち、瀕死、呼吸困難、食欲、活動性（横臥、衰弱、または無反応）、発作、および（観察者により記載される）他の臨床的観察についてモニタリングする。

表８に指定されている日に、血液試料を大腿動脈もしくは大腿静脈、伏在静脈、または他の適当な静脈から採取する。曝露当日に回収される血液試料は、曝露前に回収される。

遠隔操作：体温；ＥＣＧ；活動性；ならびに心血管機能（心拍数、収縮期／拡張期圧、脈圧、平均圧、および呼吸圧）に関するベースラインデータおよび投与後データを、研究期間中１５分ごとに少なくとも３０秒間回収する。ベースラインデータを投与前に少なくとも１０日間回収する。特別な操作およびデータ収集の詳細は、ＳＯＰ ＢＢＲＣ．ＶＩ−０８７、ＳＯＰ ＢＢＲＣ．ＶＩ−０９３、およびＳＯＰ ＢＢＲＣ．ＶＩ−０９６に含まれている。

曝露の約１４日前にサルをＢＬ−３に移して、馴化する時間を与える。０日目に、サルにテラゾール（１〜６ｍｇ／ｋｇ、ＩＭ）で麻酔をかけ、プレスチモグラフィーチャンバーおよびクラスＩＩＩキャビネットシステムに入れ、衝突ネブライザーでエアロゾル化されて頭部のみの吸入曝露チャンバーを通じて送達される標的用量の鼻疽菌に曝露させる。鼻疽菌のエアロゾル濃度は、ＣＦＵを決定して定量化する。流出液をインライン式の全ガラス製インピンジャーによって動物曝露口から直接回収する。インピンジャー試料の連続希釈液をプレーティングし、計数する。

曝露期間後２８日生き残ったサルを安楽死させ、以下に記載するように調べる。生き残ったサルは慢性的な感染症を発症する可能性があるので、全ての動物を安楽死させなければならない。さらに、後の効力研究における動物の組織中の細菌量の定量化により、解析のための二次エンドポイントが提供され得る（すなわち、処置によって死亡数がそれほど低下しない場合、細菌量が顕著に低下する可能性がある）。

表８に示した時点からの血液試料を培養して、鼻疽菌の有無を決定する。さらに、これらの時点の各々で、約１００μｌの全血液を回収し、この全血液からＤＮＡを単離して、ＱＰＣＲ解析を行なう。

血液学的評価（ＣＢＣ）が実施され、これらには、限定されるものではないが、以下のパラメータが含まれる。

臨床化学評価が実施され、これらには、限定されるものではないが、以下のパラメータが含まれる。

凝固因子の解析のための血液試料を、クエン酸ナトリウムを含有するチューブ中に回収する。処理後の各々の全血液試料から回収した残りの血漿に対してＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）解析を行なう。血漿を分離することができる場合は、ＥＤＴＡチューブに回収した末端血液試料に対してもＣＲＰ解析を行なう。

死ぬかまたは安楽死させる全てのサルに対して肉眼的解剖を行なう。限定されるものではないが、肺、脾臓、および肝臓を含む標的組織の部分をホモジナイズし、ＤＮＡを単離し、ｑＰＣＲを行なって、これらの器官における細菌量を決定する。限定されるものではないが、脳、肺、腎臓、肝臓、脾臓、縦隔リンパ節および気管支リンパ節を含む標的組織ならびに全ての肉眼的病変の切片を１０％中性緩衝ホルマリンに保存する。研究２８日目に安楽死させる生き残りを含む全ての動物に対して組織病理学的検査を行なう。

最大尤度法を用いて、プロビット用量−応答モデルをサルの用量−致死データに当てはめてる（Ｆｉｎｎｅｙ，１９７１およびＦｅｄｅｒ，１９９１）。プロビット用量−応答モデルの推定パラメータを用いて、ＬＤ_５０およびＬＤ_９０を計算する。フィーラー法（Ｆｉｎｎｅｙ，１９７１）または他の適切な方法を用いて、ＬＤ_５０およびＬＤ_９０についての９５％信頼区間を計算する。

各々の臨床的兆候の発症までの時間を、動物の死亡、安楽死、または臨床的観察期間の最後まで記録する。各々の臨床的兆候を示す動物と各々の兆候の発症までの時間の比率を決定する。用量を説明変数として、コックスの比例ハザードモデルを、発症までの時間と死亡までの時間のデータに当てはめる。より重篤な兆候があまり重篤でない兆候を隠す場合があるので、この解析のために兆候を分類してもよい。病気の兆候までの平均期間と死亡までの平均期間をＬＤ_５０用量で算出する。

血液検査、臨床化学、凝固およびｑＰＣＲの結果の統計的解析：これらのパラメータを、各々のデータ回収時点での平均投与前レベルからの変化を計算することにより、同じ動物のベースラインと比べて評価する。必要であれば、血液検査および臨床化学のデータをまず対数変換して、より正規分布する応答を作成する。この場合、最終的な結果を累乗法によりそのもとの単位に戻す。これらのデータに対して要約統計量を提供する。各々の時点で、全ての動物についてのベースラインからの平均変化をｔ−検定を用いて評価し、パラメータ変化が、無変化と統計学的に有意に異なるかどうかを明らかにする。テレメトリーパラメータの各々については、投与直前に回収したデータを各動物について平均化し、ベースライン平均を得る。次に、投与後期間におけるテレメトリーの結果を、ベースライン平均を差し引くことにより各動物に対して調整する。移動平均または他の適当な方法により、さらなるデータ平滑化を利用してもよい。ベースラインで調整および平滑化したデータ測定値ならびに各々のテレメトリーパラメータの調整値の累積合計の時間的傾向を全ての動物についてプロットする。

テレメトリーデータを用いて疾患の発症について特定の基準を確立する。統計的検定は、疾患基準が集団のある程度の割合に見られる具体的な時点を評価するおよび／または疾患の一定の平均発現前後の時間間隔を示すものと決定される。実行可能でかつ関連性があると判断される場合、死亡までの時間、血液検査、細菌検査、および臨床的観察に関する追加のデータをこの解析に組み入れて、治療を開始する最適なタイミングを決定することもできる。

実施例。ＢＡＬＢ／ｃマウスにおける致死的な吸入による野兎病菌、ペスト菌、および鼻疽菌投与に対するＣＥＭ−１０１の効力。

１１０匹のＢＡＬＢ／ｃマウスをこの処理において使用した（１００匹を研究に使用し、１０匹を予備とする）。０日目に、マウスを鼻のみのエアロゾル曝露システムに入れ、衝突ネブライザーでエアロゾル化された病原菌に曝露させる。病原菌のエアロゾル濃度は、コロニー形成単位（ｃｆｕ）を決定して定量化する。流出液をインライン式の全ガラス製インピンジャーによって曝露口から直接回収する。インピンジャー試料の連続希釈液をプレーティングし、計数する。

投与後、生存と病気の臨床的兆候とについて、マウスを１日２回、２８日間観察する。肺、脾臓および末梢血における細菌量を、死んでいるのが見つかったかまたは安楽死させた全てのマウスから定量的ＰＣＲにより決定する。２８日の投与後観察期間を生き残った全ての動物に麻酔をかけて、末端血液試料を回収し、その後すぐに安楽死させる。安楽死の後、細菌量解析のために、肺と脾臓の標本も回収する。

フィッシャーの直接確率検定を用いて、各抗生物質処置群と対照群の生存率を比較する。これらのデータに対して死亡までの時間解析を行ない、生存期間モデルに基づいて異なる群についての防御に違いがあるかどうかを決定する。

ウサギにおける致死的な吸入による炭疽菌投与に対するＣＥＭ−１０１の予備的効力および重要な効力（下記の一般的なウサギ効力研究の概要を参照されたい）。

上記の方法を用いて、エアロゾル化した炭疽菌によるウサギの吸入投与に対するＣＥＭ−１０１の効力

投与後１８〜２４日の間、動物を処置する。全ての動物を投与後２８日間モニタリングする。ＣＥＭ−１０１のピークレベルおよびトラフレベルのための採血を最初の、真ん中のおよび最後の抗生物質処置の後に回収する。

実施例。臨床検査標準協会（ＣＬＳＩ、正式にはＮＣＣＬＳ）に従って９６ウェル中で微量希釈法によりＭＩＣを決定した（１）。抗生物質を５０μｌのカチオン調整したミュラー−ヒントンブロス（ＣＡＭＨＢ）中で連続２倍希釈した。野兎病菌の測定のために、ＣＡＭＨＢに２％アイソバイタルエックス（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を補充した。抗生物質範囲は、植菌後の１００μｌの最終ウェル体積に基づくと１６〜０．００８μｇ／ｍｌであった。

１８〜２４時間（炭疽菌、鼻疽菌もしくは類鼻疽菌）または４８時間（ペスト菌、野兎病菌）のヒツジ血液（ＳＢＡ）またはチョコレート寒天プレート（ＣＬＳＩによる）からのコロニーを懸濁することにより、種菌を調製した。懸濁した培養物を、１０^６ＣＦＵ／ｍｌの細菌細胞密度になるようにＣＡＭＨＢで希釈した。９６ウェルプレートの各ウェルに、最終的な種菌が約５×１０^４ＣＦＵ／ウェルとなるように、この希釈液５０μｌを添加した。プレートを３５℃でインキュベートした。プレートを６００ｎｍ（ＳｐｅｃｔｒｏＭａｘ Ｍ２，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）で読み取ることにより、２４時間および４８時間でＭＩＣを目視決定した。

種菌の調製と抗生物質の微量希釈は、ＣＬＳＩ法に従って行なった。各細菌種の遺伝的および地理的多様性を表す３０の株について、３５℃で１８または４２時間インキュベートした後、９６ウェルプレート中で微量希釈法により、各薬剤のＭＩＣを決定した。

抗生物質ストックの品質管理は、黄色ブドウ球菌ＡＴＣＣ ２９２１３および大腸菌ＡＴＣＣ ２５９２２を用いて確立した。

抗生物質感受性試験により、類鼻疽菌を例外として、この研究における全ての細菌種が、治療的に達成可能なＣＥＭ−１０１範囲にあることが示された。類鼻疽菌は、マクロライドに対して活性のある証明済みの多剤排出機構を有しており（２）、ＣＥＭ−１０１耐性を示すデータは一貫性がある。野兎病菌の分布は、この種の２つの異なる次亜種の「Ａ」と「Ｂ」の重複を反映している。Ｂ株は、より高いＭＩＣに分布しているが、Ａ株は、下端に分布している。Ａ株はより病原性が高く、より大きなＢＷ／ＢＴ脅威をもたらすので、その感受性がより大きいことは好運なこととなる。

これらの細菌性病原菌の多くは感染時に細胞内にあるので、多くのマクロライドが細胞内に選択的に蓄積するという観察された能力は、エアロゾル化されたＢＷ／ＢＴ病原菌に曝露された個体での効力を増強する可能性がある。種々の潜在的ＢＷ／ＢＴ細菌性病原菌に対する証明済みの幅広い活性は、経口バイオアベイラビリティーとともに、ＣＥＭ−１０１を曝露や感染後の治療の魅力ある候補にしている。これらの病原菌についての動物感染モデルにおけるＣＥＭ−１０１の効力を評価すべきである。

実施例。ヒトＴＨＰ−１マクロファージを用いた。蓄積を微生物学的アッセイで測定した。用量応答法（ＡＡＣ ２００６；５０：８４１−５１）を用いて、貪食された黄色ブドウ球菌（ＡＴＣＣ ２５９２３；ＭＩＣ：ＣＥＭ−１０１、０．１２５ｍｇ／Ｌ；ＡＺＩ、０．５ｍｇ／Ｌ）に対して細胞内活性を決定した。ベラパミル（１００μＭ）およびゲムフィブロジル（２５０μＭ）を、それぞれ、Ｐ−糖タンパク質およびＭＲＰの阻害剤として用いた（ＡＡＣ，２００７；５１：２７４８−５７）。

排出輸送体阻害剤とともにおよび排出輸送体阻害剤なしで、２４時間インキュベートした後の蓄積および活性を以下の表に示す。表中、Ｃｃ／Ｃｅは、見かけの細胞濃度対細胞外濃度比であり、Ｅ_ｍａｘは、（用量−効果応答実験の非線形回帰［シグモイド］から計算された）貪食後種菌と比べた細胞内ｃｆｕの最大減少である。

実施例。抗生物質の細胞内活性。食細胞内の黄色ブドウ球菌株ＡＴＣＣ ２５９２３に対する抗生物質活性の決定を行なった。食細胞内の黄色ブドウ球菌（ＡＴＣＣ ２５９２３株［ＭＩＣ：ＣＥＭ−１０１、０．１２５ｍｇ／Ｌ；ＡＺＩ、０．５ｍｇ／Ｌ］に対するＣＥＭ−１０１およびＡＺＩの細胞内活性の調節における能動的排出の影響を評価するために、完全な用量−応答研究を行なった。抗生物質を、（ｉ）その相対的な静菌濃度（Ｃｓ）、および（ｉｉ）その相対的な最大効力（Ｅ）について、２４時間で比べた。ベラパミルはＡＺＩの細胞内活性を増加させるが（ゲムフィブロジルは増加させない）、どちらの阻害剤もＣＥＭ−１０１の活性に対してそれほど効果がなく、ＣＥＭ−１０１は、ＡＺＩとは対照的に、対応する真核生物輸送体の基質ではないことが示唆される。

実施例。抗生物質の細胞蓄積。マクロライドの細胞内含有量を、黄色ブドウ球菌ＡＴＣＣ ２５９２３を試験生物として用いて、微生物学的アッセイにより、ＴＨＰ−１マクロファージで測定した。細胞タンパク質を、フォーリン−チオカルト／ビウレット法を用いて並行してアッセイした。総細胞タンパク質含有量を参照してマクロライドの細胞関連含有量を表し、（培養細胞に対して一般に用いられる）５μＬ／ｍｇ細胞タンパク質という変換係数を用いて、見かけの濃度に変換した。

ＴＨＰ−１細胞におけるＡＺＩの細胞蓄積と比べたＣＥＭ−１０１の細胞蓄積をまず測定した（図７（パネルＡ））。２４時間で、両方の抗生物質は細胞内に大量に濃縮されたが、ＣＥＭ−１０１の方がより大きい値（Ｃｃ／Ｃｅ）であった。第２段階で、ＣＥＭ−１０１がＰｇｐまたはＭＲＰ排出輸送体の基質であるかどうかを調べた（図７（パネルＢ））。Ｐｇｐ阻害剤（ベラパミル）またはＭＲＰ阻害剤（ゲムフィブロジル）を用いると、ベラパミルによって、ＡＺＩの細胞蓄積は有意に増加するが、ＣＥＭ−１０１の細胞蓄積の有意な変動は観察されない。

ＣＥＭ−１０１の取込みは経時的に線形であり、２４時間以内に約３７５倍の蓄積レベルに達した（ＡＺＩ、１６０倍、ＣＬＲ、３０倍、ＴＥＬ、２１倍）。蓄積は、酸性ｐＨまたはプロトンイオノフォアのモネンシンの添加により抑制されたが、ベラパミルまたはゲムフィブロジル（ぞれぞれ、ＰｇｐおよびＭＲＰの選択的阻害剤）によって改変されなかった。パネルＢは、これらの実験が酸性ｐＨで行なわれたときに、ＣＥＭ−１０１とＡＺＩの両方の蓄積が低下し、ｐＨを７から６にしたときに、この変化がほぼ完全に起こったことを示している。パネルＣは、多くの弱い有機塩基の細胞蓄積を減少させることが知られているモネンシンも、ＣＥＭ−１０１とＡＺＩの両方の蓄積をほぼ完全に抑制したことを示している。対照的に、Ｐ−糖タンパク質排出輸送体（Ｐｇｐ、別名ＭＤＲ１）の阻害剤であるベラパミルは、ＣＥＭ−１０１の蓄積に影響を及ぼすことなく、ＡＺＩの蓄積を増加させ、その一方、多剤耐性タンパク質（ＭＲＰ）および他の有機アニオン輸送体の阻害剤であるゲムフィブロジルは、どちらの化合物にも影響を及ぼさなかった。ベラパミルもゲムフィブロジルもＴＥＬまたはＣＬＲの蓄積に影響を及ぼさなかった（データは示さない）。１０ｍｇ／ＬのＣＥＭ−１０１とともに１時間インキュベートし、その後、薬物を含まない培地に移した細胞からのＣＥＭ−１０１の排出を調べた。排出は二峰性に進行し、細胞関連薬物の半分は約１０分以内に放出され、次いで、数時間のより緩徐な放出期があった（データは示さない）。

実施例。マクロライドは真核生物細胞に蓄積し、細胞内感染の治療に有利であると考えられる。ケトライドは、エリスロマイシン耐性生物に対する活性がある。細胞内形態の黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａ．）、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌ．ｍ．）、およびレジオネラ・ニューモフィラ（Ｌ．ｐ．）に対するＣＥＭ−１０１の細胞蓄積および細胞内活性を、ＡＺＩ、ＣＬＲ、およびＴＥＬと比べて、以下の表に示す。

実施例。抗生物質のＭＩＣおよび細胞外活性を中性ｐＨと酸性ｐＨの両方のＭＨＢ中で決定した。ＴＨＰ−１マクロファージによって貪食される黄色ブドウ球菌（ＡＴＣＣ ２５９２３）に対する細胞内活性を以前に記載された通りに決定した（ＡＡＣ，２００６，５０：８４１−８５１）。結果を０時間と比べた効力の変化として表した。

１−ブロス（細胞外）または感染マクロファージ（細胞内）で行なわれた最初の貪食後種菌と比べた（用量−効果応答の非線形回帰［シグモイド］から計算された）細胞内ｃｆｕの最大減少。２−見かけの静菌効果をもたらす細胞外濃度（ｍｇ／Ｌで示したＣｓ）。用量−効果研究から得られた比較薬理学的記述子（Ｅｍａｘおよび静菌濃度［Ｃｓ］）。ミュラー−ヒントンブロスでの用量−応答研究。黄色ブドウ球菌ＡＴＣＣ ２５９２３に対しておよびｐＨ７．４のブロス中で、ＣＥＭ−１０１は、ＡＺＩ、ＣＬＲおよびＴＥＬよりも体系的に活性が高く、ｐＨ５．５では、ＡＺＩ、ＣＬＲおよびＴＥＬはその効力の有意な減少を示すが、ＣＥＭ−１０１はあまり変化を示さない。

ＡＺＩ、ＣＬＲおよびＴＥＬと比べて、ＣＥＭ−１０１活性は、ブロスの酸性ｐＨによる影響をあまり受けず、細胞内の黄色ブドウ球菌に対するより大きい効力（より少ない静菌用量）およびより大きい最大効力（Ｅｍａｘ）を示した。

実施例。細胞株。マクロファージ様活性を示すヒト骨髄単球性細胞株であるＴＨＰ−１細胞（ＡＴＣＣ ＴＩＢ−２０２；Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）を用いて、実験を行なった（例えば、Ｂａｒｃｉａ−Ｍａｃａｙ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．５０：８４１‐８５１（２００６）を参照されたい）。細胞関連マクロライドのアッセイおよび見かけの細胞濃度対細胞外濃度比の計算。マクロライドを、黄色ブドウ球菌ＡＴＣＣ ２５９２３を試験生物として用いて、微生物学的方法によりアッセイした。細胞タンパク質を、フォーリン−チオカルト／ビウレット法を用いて並行してアッセイした。総細胞タンパク質含有量を参照してマクロライドの細胞関連含有量を表し、多くの培養細胞に見られる平均値である５μＬ／ｍｇ細胞タンパク質という変換係数を用いて、見かけの濃度に変換した。

細菌株、感受性試験、およびブロスを用いた２４時間の用量−応答曲線研究。黄色ブドウ球菌ＡＴＣＣ ２５９２３（メチシリン（ｍｅｔｈｉｃｉｌｌｉｎ）［メチシリン（ｍｅｔｉｃｉｌｌｉｎ）］感受性）、Ｌ．モノサイトゲネス株ＥＧＤ、およびＬ．ニューモフィラ株ＡＴＣＣ ３３１５３を本研究で用いた。ＭＩＣの決定は、２４時間インキュベーションした後のミュラー−ヒントンブロス（黄色ブドウ球菌用）およびトリプティックソイブロス（Ｌ．モノサイトゲネス用）、または４８時間インキュベーションした後のα−ケトグルタル酸緩衝酵母抽出物ブロス（Ｎ．ニューモフィラ用）において行なわれた。黄色ブドウ球菌の研究については、無細胞培地中での２４時間の濃度−応答実験をミュラー−ヒントンブロスにおいて行なった。

細胞感染および抗生物質の細胞内活性の評価。黄色ブドウ球菌およびＬ．モノサイトゲネスについては従来の方法を用いてまたはＬ．ニューモフィラについては、少し改変して（ｉ）マクロファージ当たり感染多重度１０の細菌および（ｉｉ）貪食されていない細菌を排除するための３０〜４５分間のゲンタマイシン（５０ｍｇ／リットル）を用いて、ＴＨＰ−１細胞の感染および抗生物質細胞内活性の評価を行なった。

統計解析。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍバージョン４．０３およびＧｒａｐｈＰａｄ Ｉｎｓｔａｔバージョン３．０６（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いて、曲線当てはめ統計解析を行なった。

実施例。黄色ブドウ球菌ＡＴＣＣ ２５９２３、リステリア・モノサイトゲネスＥＧＤ、およびレジオネラ・ニューモフィラＡＴＣＣ ３３１５３に対する感受性。ＣＥＭ−１０１は、従来の感受性試験で、３つの選択された生物（黄色ブドウ球菌、０．０６および０．５ｍｇ／リットル；Ｌ．モノサイトゲネス、０．００４および１ｍｇ／リットル；ならびにＬ．ニューモフィラ、０．００４および０．０１６ｍｇ／リットル）に対してＡＺＩよりも低いＭＩＣを示した。黄色ブドウ球菌およびＬ．モノサイトゲネスに対するＣＥＭ−１０１、ＴＥＬ、ＡＺＩ、およびＣＬＲのＭＩＣを、５．５〜７．４の範囲のｐＨ値に調整したブロス中で測定した。抗生物質が、考察される２つの生物に対して細胞外環境でまたは細胞内で曝露され得る値を網羅するように、この範囲が選択された。図３に示すように、４つの薬物は全て、ｐＨが７．４から５．５に減少したときに両方の生物に対する効力の著明な減少を示し、ＡＺＩは最も著しい活性の喪失を示した。ＣＥＭ−１０１は、最も高い活性を保持し、調べた全てのｐＨ範囲において一貫して最小のＭＩＣを示し、値（ｍｇ／リットル）は、黄色ブドウ球菌（ＡＴＣＣ ２５９２３）については０．０６（ｐＨ７．４）〜０．５（ｐＨ５．５）、およびＬ．モノサイトゲネス（ＥＤＧ）については０．００３９（ｐＨ７．４）〜０．２５（ｐＨ５．５）であった。Ｎ．ニューモフィラ（データは示さない）については、ブロスのｐＨが７．４から６．５に減少したときに、ＣＥＭ−１０１のＭＩＣは０．００５から０．０１に増加し、ＡＺＩのＭＩＣは約０．０１から０．２５ｍｇ／リットルに増加した（増殖しないので、より低いｐＨ値では決定することができなかった）。

実施例。細胞外および食細胞内の黄色ブドウ球菌に対する時間および濃度効果。０．７および４ｍｇ／リットルという２つの単一固定濃度を用いて、ブロス中でおよびＴＨＰ−１マクロファージによる貪食後に、黄色ブドウ球菌（ＡＴＣＣ ２５９２３）に対するＡＺＩの短期間（６時間）の時間−殺菌曲線と比べた、ＣＥＭ−１０１についての短期間（６時間）の時間−殺菌曲線を得た。より低い濃度は、ＡＺＩおよびＣＥＭ−１０１の血清濃度と関連があるように選択され、より高い濃度は、対象となる生物に対するＡＺＩのＭＩＣを上回るように選択された。図５に示す結果は、これらの条件下では、ＣＥＭ−１０１のみが、ブロス中およびＴＨＰ−１マクロファージ中、０．７ｍｇ／リットルの濃度で、ＣＦＵを有意に減少させることができたことを示している。ブロス中、４ｍｇ／リットルの濃度で、ＡＺＩは、最終的にはＣＥＭ−１０１と同じ抗菌効果を達成したが、速度は遅かった（１時間と比べて５時間）。ＴＨＰ−１マクロファージでは、ＡＺＩについて、一貫性のある活性は４ｍｇ／リットルの濃度ですら検出されなかったが、ＣＥＭ−１０１は、０．７ｍｇ／リットルの濃度で見られる大きさと類似した、約１．５ｌｏｇ１０ ＣＦＵの低下をやはり達成した。ＣＥＭ−１０１を用いた全ての状況において、ＣＦＵの最大減少は１時間以内に得られ、その後も維持された。

次に、本発明者らは、ＣＥＭ−１０１活性の関連する薬理学的記述子（ＣＬＲ、ＡＺＩおよびＴＥＬ活性と比べた相対効力［５０％有効濃度｛ＥＣ５０｝］、見かけの静菌濃度［Ｃ_ｓ］、および相対最大効力［Ｅ_ｍａｘ］を得るために、固定された時点（２４時間）で濃度−応答実験を行なった（さらなる詳細は、Ｂａｒｃｉａ−Ｍａｃａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｏｄｙｎａｍｉｃ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ ａｇａｉｎｓｔ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ ｉｎ ａ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ＴＨＰ−１ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．５０：８４１−８５１（２００６）に記載されている）。データを、（ｉ）重量濃度（ｍｇ／リットル）および（ｉｉ）ＭＩＣの倍数（ｐＨ７．４のブロス中で決定される）の関数として図４に示す。対応する薬理学的記述子の数値を表に示す。

^ａ図６に示す全てのデータ点（抗生物質の細胞外濃度が０．０１倍のＭＩＣよりも低いときは抗生物質なしの試料からのデータ）を用いた（５）
^＋もとの種菌［時間＝０時間］：０．９７±０．２４×１０^６ＣＦＵ／ｍＬ（ｎ＝３）
^＋＋もとの（貪食後）種菌［時間＝０時間］：２．７４±０．５５×１０^６ＣＦＵ／ｍｇタンパク質（ｎ＝３）
^◆抗生物質濃度＝∞に関して外挿されたときの、対応するもとの種菌からの時間＝２４時間の時点でのＣＦＵ減少（ｌｏｇ_１０単位で示す）；５未満のカウントを生じる試料は、検出レベル未満とみなされた。
^◇（傾斜因子１を用いて）ヒル方程式から得られる、初期値（Ｅ_０）と最大値（Ｅ_ｍａｘ）の中間にまで種菌を低下させる濃度（ｍｇ／Ｌまたは×ＭＩＣで示す）；
^◇◇グラフ内挿法によって決定される、細菌増殖が見られないようになる濃度（ｍｇ／Ｌまたは×ＭＩＣで示す）（ＣＦＵの数は、もとの種菌と同じである）；統計解析。抗生物質間の違いの解析（対応する行の列ごとに；全ての薬物の各パラメータ間の複数の比較についてのテューキー検定による一元配置ＡＮＯＶＡ）：様々な小文字を伴う数字は、互いに有意に異なる（ｐ＜０．０５）。ブロスとＴＨＰ−１マクロファージの違いの解析（対応する列の行ごとに；対応のない両側ｔ検定）：様々な小文字を伴う数字は、互いに有意に異なる（ｐ＜０．０５）。

シグモイド形の各最適関数（ヒル方程式）で示されるように、ブロスとＴＨＰ−１マクロファージの両方における活性は濃度依存的に発生した。ブロス中では、ＣＥＭ−１０１の相対効力（Ｅ_ｍａｘ −１．３７ｌｏｇ_１０）は、他の薬物の相対効力（Ｅ_ｍａｘ値 −１．００〜−１．４１ｌｏｇ_１０）と同様であった。ＴＨＰ−１マクロファージ中では、ＣＥＭ−１０１の相対効力は、ブロス中での相対効力（Ｅ_ｍａｘ −０．８６ｌｏｇ_１０）と比べて有意に減少したが、他の薬物の相対効力と同じ程度には減少せず、本質的には静菌的にしかならなかった（Ｅ_ｍａｘ値 ０．０４〜−０．２９ｌｏｇ_１０）。重量ベースでは、ＣＥＭ−１０１は、ブロスとＴＨＰ−１マクロファージの両方における３つ全ての比較子薬物よりも高い相対効力（低いＥ_５０値）および低い静菌濃度（低いＣ_ｓ値）を有していた。データを、等効力濃度の関数（ＭＩＣの倍数）として解析すると、これらのＥＣ_５０値の差が低下し、ＭＩＣが、このような状況での主な駆動パラメータであったことを示している。ブロス中では、ＭＩＣの倍数として解析したときでさえも、ＣＥＭ−１０１およびＣＬＲは、依然としてＴＥＬおよびＡＺＩよりも有意に低いＥ_５０を示した。

実施例。食細胞内Ｌ．モノサイトゲネスおよびＮ．ニューモフィラに対する活性。濃度−効果関係および対応する関連する薬理学的記述子に関する情報を得るために、黄色ブドウ球菌に対するアプローチと同じアプローチを用いて、貪食されたＬ．モノサイトゲネスおよびＬ．ニューモフィラに対するＣＥＭ−１０１およびＡＺＩの活性を評価した。図６に示すように、ヒル方程式と適合する関係性が全ての場合に見られたが、Ｌ．ニューモフィラの増殖が限られていることで、関数の当てはめがややより不明確になった。このデータを重量濃度に対してプロットすると、ＣＥＭ−１０１が、Ｌ．モノサイトゲネスとＮ．ニューモフィラの両方についてＡＺＩよりも高い相対効力（低いＥＣ５０）を有するように見えた。Ｌ．ニューモフィラについてのデータをＭＩＣの倍数に対してプロットすると、この差は低下したが、それでも有意なままであり、ＭＩＣが、この生物に対する細胞内活性の唯一ではないが、重要な駆動因子であることを示した。反対に、データをＭＩＣの倍数として表したとき、Ｌ．モノサイトゲネスについて、応答の差は見られなかった。関連する薬理学的記述子の数値とその差の総計解析とを表に示す。

^ａ図６に示す全てのデータ点（抗生物質の細胞外濃度が０．０１倍のＭＩＣよりも低いときは抗生物質なしの試料からのデータ）を用いた（５）。^＋もとの（貪食後）種菌［時間＝０時間；ＣＦＵ／ｍｇタンパク質］：Ｌ．モノサイトゲネス、１．６７±０．２２×１０^６（ｎ＝３）；Ｌ．ニューモフィラ、０．９４±０．６０×１０^６。^◆抗生物質濃度∞に関して外挿されたときの、対応するもとの種菌からの時間＝２４時間（Ｌ．モノサイトゲネス）または４８時間（Ｎ．ニューモフィラ）の時点でのＣＦＵ減少（ｌｏｇ_１０単位で示す）；５未満のカウントを生じる試料は、検出レベル未満とみなされた。^◇（傾斜因子１を用いて）ヒル方程式から得られる、初期値（Ｅ_０）と最大値（Ｅ_ｍａｘ）の中間にまで種菌を低下させる濃度（ｍｇ／Ｌまたは×ＭＩＣで示す）。^◇◇グラフ内挿法によって決定される、細菌増殖が見られないようになる濃度（ｍｇ／Ｌまたは×ＭＩＣで示す）（ＣＦＵの数は、もとの種菌と同じである）。統計解析：２つの抗生物質間の違いの解析（対応する行の列ごとに；対応のない両側ｔ検定）：様々な小文字を伴う数字は、互いに有意に異なる（ｐ＜０．０５）。

実施例。食細胞内の黄色ブドウ球菌ＡＴＣＣ ２５９２３に対する感染ＴＨＰ−１マクロファージにおける用量−応答研究。ＣＥＭ−１０１は、ＡＺＩ、ＣＬＲおよびＴＥＬよりも強力である（Ｃｓが低い）。さらに、ＣＥＭ−１０１は、細胞内種菌（Ｅ_ｍａｘ 約１ｌｏｇ）を低下させることができる。これは、ＡＺＩ、ＣＬＲおよびＴＥＬのいずれでも観察されない。

実施例。細胞内黄色ブドウ球菌ＡＴＣＣ ２５９２３（ＴＨＰ−１マクロファージ）に対するＣＥＭ−１０１と比較子（ＡＺＩ、ＣＬＲおよびＴＥＬ）の用量−応答研究例。図９および表を参照されたい。

実施例。細胞内活性：他の抗ブドウ球菌剤を用いた比較研究。ＴＨＰ−１マクロファージにおける細胞内黄色ブドウ球菌（ＡＴＣＣ ２５９２３株）に対する抗生物質の比較用量−静菌応答を測定した。図８を参照されたい。棒は、ＭＩＣ（ｍｇ／Ｌで示す）または細胞外静菌用量を表す。

方法。マウス腹腔マクロファージに生きたライ菌を感染させ、薬物を添加し、３３℃で３日間インキュベートした。３日後、マクロファージを溶解させて、細胞内のライ菌を放出させ、次に、このライ菌を、放射性呼吸測定および生死判別染色によって生存についてアッセイした。ＣＥＭ−１０１は、細胞内ライ菌の生存に対する効力を示す。

無胸腺ｎｕ／ｎｕマウス足蹠における連続的継代により維持された、ライ菌のタイ−５３分離株を全ての実験に用いた。純培養試験のために、新しく採取した生きたライ菌を、様々な濃度の薬物（ＣＥＭ−１０１、ＣＬＲおよびリファンピシン）とともに３３℃で７日間培地中でインキュベートした。このインキュベーションの最後に、薬物処理したライ菌を、放射性呼吸測定にかけて、パルミテートの酸化に基づく生存を評価し、生死判別色素による染色を施して、膜損傷の程度を評価した。細胞内試験のために、Ｓｗｉｓｓマウス由来の腹腔マクロファージに新しく採取した生きたライ菌を２０：１のＭＯＩで１２時間感染させた。感染の最後に、細胞外細菌を洗浄し、薬物を様々な濃度で添加し、３３℃で３日間インキュベートした。３日間の最後に、細胞を溶解させて、放射性呼吸測定および生死判別染色のための細胞内ライ菌を得た。

対照と比べたとき、０．１５μｇ／ｍＬのＣＥＭ−１０１は、純培養と細胞内培養の両方においてライ菌の生存を有意に（Ｐ＜０．００１）低下させることができた。ＣＥＭ−１０１による阻害は、 同一条件下、同一濃度で、ＣＬＲで得られる阻害と有意には異ならなかった。

実施例。肺炎レンサ球菌、β溶血性レンサ球菌およびビリダンス群レンサ球菌、ブドウ球菌種、および腸球菌に対するＣＥＭ−１０１の高い効力は、標準的な臨床検査標準協会（ＣＬＳＩ）法を用いて行なわれた初期のスクリーニング研究に記載されている。ＭＬＳＢ−ケトライド類を含み得る耐性のメカニズムと発生が急速に増加しつつあるので、野生型（ＷＴ）と表現型／遺伝子型が規定された耐性生物サブセットとを試験したときのＣＥＭ−１０１の殺菌活性（ＭＢＣおよび死滅曲線）を５つの選択された種類の抗微生物剤とともに評価した。ＣＥＭ−１０１、ＴＥＬ、およびＣＬＲのＭＢＣ決定では、４０（６つの種の群）についてＣＬＳＩ法を用いた。ＫＣでは、８つの株（６つの種の群）を用いた。ＰＡＥを、１時間または２時間の曝露の間、４倍濃度で試験した（５株）；ＴＥＬ対照。

ＭＢＣおよび死滅曲線研究：合計４０株（１０の肺炎レンサ球菌、１０の黄色ブドウ球菌、ならびに各々５つのβ溶血性レンサ球菌、ビリダンス群レンサ球菌、コアグラーゼ陰性ブドウ球菌［ＣｏＮＳ］および腸球菌）についてＭＩＣを試験し、次いで、ＣＬＳＩ法を用いてＭＢＣを決定した（ＭＩＣおよびＭＢＣ範囲、０．００８〜１６μｇ／ｍｌ）。最初の種菌の９９．９％以上を死滅させる被験薬剤の最低濃度をＭＢＣ終点と定義した（表２および３）。８つの選択された株に対する時間殺菌活性を、Ｍｏｏｄｙ ＆ Ｋｎａｐｐ，ＮＣＣＬＳ Ｍ２１−Ａ３およびＭ２６−Ａに記載の方法に従って、ＣＥＭ−１０１、ＴＥＬ、ＣＬＲ、およびＡＺＩについて行なった。これらの化合物を２倍、４倍、８倍のＭＩＣで試験し、コロニーカウントをＴ０、Ｔ２、Ｔ４、Ｔ８およびＴ２４で行なった。

ＣＥＭ−１０１は、ＢＳＡ、ＳＡおよびコアグラーゼ陰性ブドウ球菌についての低いＭＢＣ／ＭＩＣ比（≦４）；およびＴＥＬよりも２倍大きい効力を示した。ＳＡ、腸球菌およびいくつかのマクロライド／ＣＬＮ耐性（Ｒ）株は、より高い比を有していた。ＫＣの結果は、ＴＥＬと比べてＣＥＭ−１０１についてのより速やかでかつより大きい殺菌活性（濃度依存的）を示した。ＣＥＭ−１０１は、ＴＥＬよりも大きい速度および程度でいくつかのグラム陽性種に対する殺菌活性を示した。

ＣＥＭ−１０１は、黄色ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌、肺炎レンサ球菌、化膿レンサ球菌（８倍のＭＩＣでのみ）およびビリダンス群レンサ球菌のマクロライド感受性株、ならびにマクロライド耐性化膿レンサ球菌に対する速やかな殺菌活性（≧３ｌｏｇ１０ ＣＦＵ／ｍｌの低下）を示した。ＣＥＭ−１０１は、ＴＥＬまたはマクロライドのＣＬＲおよびＡＺＩと比べたとき、ＣＦＵ／ｍｌのより大きい低下とより速やかな死滅とをもたらした。

ＣＥＭ−１０１は、マクロライド感受性レンサ球菌、ＣｏＮＳおよびマクロライド耐性ＣＬＮ感受性肺炎レンサ球菌に対して試験したとき、殺菌活性を示した。ＣＥＭ−１０１のＭＢＣ／ＭＩＣ比は、黄色ブドウ球菌については高くなることがあるが、いくつかの株は、感受性のある濃度範囲内にとどまるＭＢＣ結果を示した。

実施例。クラミジアに対する活性。ＣＥＭ−１０１、ＴＥＬ、ＡＺＩ、ＣＬＲ、およびドキシサイクリンを粉末として準備し、製造元の指示に従って可溶化した。アッセイを実施するたびに、薬物懸濁液を新たに作製した。

肺炎クラミジア：試験した肺炎クラミジアの分離株には、標準株（ＴＷ １８３）、米国起源の肺炎を有する子供および成人由来の９つの分離株（ＡＲ３９、Ｔ２０２３、Ｔ２０４３、Ｗ６８０５、ＣＷＬ ０２９、ＣＭ−１）、日本起源の肺炎を有する子供由来の１つの分離株（Ｊ−２１）、および米国起源のヒト免疫不全ウイルス感染症と肺炎を有する患者の気管支肺胞洗浄標本由来の２つ（ＢＡＬ１５およびＢＡＬ１６）が含まれていた。

Ｃ．トラコマチス：ＡＴＣＣ（Ｅ−ＢＯＵＲ、Ｆ−ＩＣ−ＣＡＬ３、Ｃ−ＨＡＲ３２、Ｊ−ＵＷ−３６、Ｌ２４３４、Ｄ−ＵＷ−５７ｋｘ、Ｂ−ＨＡＲ−３６）からの標準的な分離株および最近の臨床分離株（Ｎ１８（子宮頸部）、Ｎ１９（子宮頸部）、７０１５（幼児の目））を含む、１０のトラコーマ病原体分離株。

インビトロ感受性試験：肺炎クラミジアおよびＣ．トラコマチスの感受性試験は、９６ウェルマイクロタイタープレート中で増殖させたＨＥｐ−２細胞を用いて細胞培養で行なった。各ウェルに、１０^３〜１０^４ＩＦＵ／ｍｌになるよう希釈した試験株０．１ｍｌを植菌し、１，７００×ｇで１時間遠心分離し、３５℃で１時間インキュベートした。ウェルを吸引し、１ｍＬ当たり１μgのシクロヘキサミドと連続２倍希釈した試験薬とを含有する培地０．２ｍＬを重層した。

２つ１組のプレートに植菌した。３５℃で４８〜７２時間インキュベートした後、培養物を固定し、リポ多糖属抗原に対するフルオレセインコンジュゲート抗体（Ｐａｔｈｆｉｎｄｅｒ，Ｋａｌｌｅｓｔａｄ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｃｈａｓｋａ，Ｍｉｎｎ）で含有について染色した。最小阻害濃度（ＭＩＣ）は、含有が見られなかった最小の抗生物質濃度である。抗生物質を含有する培地を吸引し、リン酸緩衝生理食塩水でウェルを２回洗浄し、抗生物質を含まない培地を添加することにより、最小殺菌濃度（ＭＢＣ）を決定した。培養物を−７０℃で凍結させ、解凍させ、新しい細胞に感染させ、７２時間インキュベートした後、上記のように固定および染色した。ＭＢＣは、感染後に含有を生じない最小の抗生物質濃度である。試験は全て３回１組で実施した。

この研究の結果は、ＣＥＭ−１０１が、他のマクロライドおよびケトライドと同程度のＣ．トラコマチスおよび肺炎クラミジアに対するインビトロ活性を有することを示した。

実施例。組織分布。ＣＥＭ−１０１は、組織によく吸収され、分布した。ラットでは、２５０ｍｇ／ｋｇ／ｄで、ＣＥＭ−１０１の平均の肺濃度および肝臓濃度は、血漿中よりも１７倍および１５倍高かった。肺濃度および肝臓濃度は、サルでは、２００ｍｇ／ｋｇ／ｄ用量で、血漿濃度よりも５０３倍および７１１倍高かった。心臓におけるＣＥＭ−１０１濃度は、肺または肝臓で見られるレベルよりも有意に低く、ラットおよびサルでの血漿濃度よりも、それぞれ、５倍および５４倍高いレベルであった。

Claims (18)

1. 少なくとも一部は炭疽菌、ペスト菌、野兎病菌、および鼻疽菌、ならびにそれらの組合せからなる群から選択される生物によって引き起こされる疾患を治療するための医薬品の製造における治療有効量の化合物であって、前記化合物が、式
   

   

   および薬学的に許容されるその塩であり、ここで、
   Ｒ_１０は水素またはアシルであり；
   ＸはＨであり；かつＹはＯＲ_７であり；ここで、Ｒ_７は単糖または二糖、アルキル、アリール、ヘテロアリール、アシル、またはＣ（Ｏ）ＮＲ_８Ｒ_９であり、ここで、Ｒ_８およびＲ_９は、各々独立に、水素、ヒドロキシ、アルキル、アラルキル、アルキルアリール、ヘテロアルキル、アリール、ヘテロアリール、アルコキシ、ジメチルアミノアルキル、アシル、スルホニル、ウレイド、およびカルバモイルからなる群から選択されるか；またはＸおよびＹは、付加された炭素と一緒になってカルバモイルを形成し；
   Ｖは、Ｃ（Ｏ）、Ｃ（＝ＮＲ_１１）、ＣＨ（ＮＲ_１２，Ｒ_１３）、またはＮ（Ｒ_１４）ＣＨ_２であり、ここで、Ｎ（Ｒ_１４）は、式１および２の化合物のＣ−１０炭素に付加されており；ここで、Ｒ_１１はヒドロキシまたはアルコキシであり、Ｒ_１２およびＲ_１３は、各々独立に、水素、ヒドロキシ、アキル、アラルキル、アルキルアリール、アルコキシ、ヘテロアルキル、アリール、ヘテロアリール、ジメチルアミノアルキル、アシル、スルホニル、ウレイド、およびカルバモイルからなる群から選択され；Ｒ_１４は、水素、ヒドロキシ、アルキル、アラルキル、アルキルアリール、アルコキシ、ヘテロアルキル、アリール、ヘテロアリール、ジメチルアミノアルキル、アシル、スルホニル、ウレイド、またはカルバモイルであり；
   Ｗは、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、またはＯＨであり；
   Ａは、ＣＨ_２、Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｏ、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、Ｓ（Ｏ）_２、Ｓ（Ｏ）_２ＮＨ、Ｃ（Ｏ）ＮＨＳ（Ｏ）_２であり；
   Ｂは（ＣＨ_２）_ｎであり、ここで、ｎは０〜１０の整数であるか、またはＢは炭素数２〜１０の不飽和炭素鎖であり；かつ
   Ｃは、水素、ヒドロキシ、アルキル、アラルキル、arylalkyl、アルキルアリール、アルコキシ、ヘテロアルキル、アリール、ヘテロアリール、アミノアリール、アルキルアミノアリール、アシル、アシルオキシ、スルホニル、ウレイド、またはカルバモイルである、化合物の使用。
2. Ｒ_７がアミノ糖またはハロ糖である、請求項１に記載の使用。
3. Ｒ_７が４−ニトロ−フェニルアセチルまたは２−ピリジルアセチルである、請求項１に記載の使用。
4. Ｂがアルケニレンである、請求項１に記載の使用。
5. Ｖが−Ｃ（Ｏ）−である、請求項１に記載の使用。
6. ＷがＨまたはＦである、請求項１に記載の使用。
7. ＸおよびＹが付加された炭素と一緒になってカルバモイルを形成する、請求項１に記載の使用。
8. ＷがＦである、請求項１に記載の使用。
9. ＸおよびＹが付加された炭素と一緒になってカルバモイルを形成し；かつＷがＦである、請求項１に記載の使用。
10. ＡがＣＨ_２であり、Ｂが（ＣＨ_２）_ｎであり、かつｎが２〜４の整数である、請求項１に記載の使用。
11. Ｃがアリールまたはヘテロアリールである、請求項１に記載の使用。
12. Ｃが３−アミノフェニルまたは３−ピリジニルである、請求項１０または１１に記載の使用。
13. Ｒ_１０が水素である、請求項１に記載の使用。
14. Ｒ_７がアミノ糖またはハロ糖である、請求項１に記載の使用。
15. Ｒ_７が４−ニトロ−フェニルアセチルまたは２−ピリジルアセチルである、請求項１に記載の使用。
16. 請求項１〜１５のいずれか１項に記載の１以上の化合物、および１以上の薬学的に許容される担体、希釈剤、もしくは賦形剤、またはその組合せを含む薬学的組成物。
17. 炭疽菌、ペスト菌、野兎病菌、および鼻疽菌、ならびにそれらの組合せからなる群から選択される１以上の生物に曝露された患者の急性曝露治療のための方法であって、前記患者に請求項１〜１５のいずれか１項に記載の１以上の化合物、またはその薬学的組成物を投与し、ここで、前記薬学的組成物は、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の１以上の化合物、および１以上の薬学的に許容される担体、希釈剤、もしくは賦形剤、またはその組合せを含む、工程を含む方法。
18. 少なくとも一部は炭疽菌、ペスト菌、野兎病菌、および鼻疽菌、ならびにそれらの組合せからなる群から選択される１以上の生物によって引き起こされる疾患を有する患者を治療するための方法であって、前記患者に請求項１〜１５のいずれか１項に記載の１以上の化合物、またはその薬学的組成物を投与し、ここで、前記薬学的組成物は、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の１以上の化合物、および１以上の薬学的に許容される担体、希釈剤、もしくは賦形剤、またはその組合せを含む、工程を含む方法。

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