JP2014506128A - 植物由来アルファ−マンノシダーゼ及びそれを使用する方法 - Google Patents

植物由来アルファ−マンノシダーゼ及びそれを使用する方法 Download PDF

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Abstract

本発明は、植物のアルファ-マンノシダーゼ配列及びその使用、特にそれらの発現を制御する調節エレメント、イントロン及びエクソン配列を含むゲノムヌクレオチド配列、並びにアルファ-マンノシダーゼ酵素をコードするポリヌクレオチド配列に関する。非常に有益な変異糖類組成を有する糖タンパク質を製造するために、そのようなアルファ-マンノシダーゼ活性改変植物を用いることができる。本発明はまた、マンノースを加水分解するためにこれらのアルファ-マンノシダーゼ酵素を使用することに関する。

Description

本発明は、植物のアルファ-マンノシダーゼ配列、特にそれらの発現を制御する調節エレメント、イントロン及びエクソン配列を含むゲノムヌクレオチド配列、並びにアルファ-マンノシダーゼ酵素をコードするポリヌクレオチド配列に関する。本発明はまた、1つ以上のアルファ-マンノシダーゼの植物における発現を改変してアルファ-マンノシダーゼ活性が増加又は低下した植物を作出するために、これらの配列を使用することに関する。非常に有益な変異糖類組成を有する糖タンパク質を製造するために、そのようなアルファ-マンノシダーゼ活性改変植物を用いることができる。本発明はまた、マンノースを加水分解するためにこれらのアルファ-マンノシダーゼ酵素を使用することに関する。
治療（例えばヒトの治療）に用いることができるタンパク質の組換え発現は、トランスジェニック植物の重要な応用の1つである。しかしながら、植物で糖タンパク質を製造する場合の主要な障害は、植物によって生成される糖タンパク質のN-グリカン上の植物に固有のベータ-1,2-キシロース及びアルファ-1,3-フコース糖類の存在である。なぜならば、これらの植物に固有の糖類は高度に免疫原性であることが知られているからである。アスパラギン結合グリコシレーション又はN-グリコシレーションは、タンパク質への多糖類又はN-グリカンの添加を必要とする（前記タンパク質は糖タンパク質と称される）。N-グリコシレーションプロセスは多数の連続する酵素的工程を含み、植物及び哺乳動物で高度に類似する。N-グリコシレーションは、アスパラギン残基（Asn又はN）への前駆体Glc3-Man9-GlcNAc2オリゴ糖の添加で開始し、前記はGlc3-Man9-GlcNAc2-Asn N-グリコシル化タンパク質を生じる（前記式中Glcはグルコースであり、Manはマンノースであり、GlcNAcはN-アセチルグルコサミンである）。続いてこの前駆体は、最初に小胞体で3つのグリコシダーゼ（グリコシダーゼI、II及びIII）で始まる多数の酵素により連続的に処理され、Man9-GlcNAc2-Asn N-グリコシル化タンパク質を生じる。次に、1つ以上のアルファ-マンノシダーゼI酵素が高マンノースMan9-GlcNAc2-Asn N-グリカンをさらに連続的にトリミングして、Man8-GlcNAc2-Asn、Man7-GlcNAc2-Asn、Man6-GlcNAc2-Asnを、最終的にはMan5-GlcNAc2-Asn N-グリカンを生じる。ゴルジネットワークで、Man5-GlcNAc2-Asnは更なるプロセッシング及び成熟を経る。成熟の第一の工程は、N-アセチルグルコサミンの還元末端への添加による高マンノースMan5-GlcNAc2-Asn N-グリカンのハイブリッド型N-グリカンへの変換を含み、N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIの活性によりGlcNAc-Man5-GlcNAc2-Asn N-グリカンを生じる。成熟の次の工程は、1つ以上のアルファ-マンノシダーゼII酵素によるGlcNAc-Man5-GlcNAc2-AsnからGlcNAc-Man4-GlcNAc2-Asnへ、最終的にはGlcNAc-Man3-GlcNAc2-Asn N-グリカンへの加水分解を含む。次に、さらに別のGlcNAcがN-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼII酵素によって添加され、GlcNAc2-Man3-GlcNAc2-Asn N-グリカンが生成される。この時点までN-グリコシレーション経路は哺乳動物と植物で同様である。哺乳動物では、続いてアルファ-1,6-フコース（Fuc）が非還元末端の最初のGlcNAcに添加されてGlcNAc2-Man3-Fuc(α1,6)-GlcNAc2-Asnが生成され、さらに1つ以上のベータ-1,4-ガラクトース（Gal）及びアルファ-2,3-シアリン酸がベータ-1,4-ガラクトシルトランスフェラーゼ及びアルファ-2,3-シアリルトランスフェラーゼの作用によりそれぞれ添加されてNeuAc2-Gal2-GlcNAc2-Man3-Fuc(α1,6)-GlcNAc2-Asn N-グリカンが生成される。植物では、キシロース（Xyl）がベータ-1,2-結合中のコアマンノースに、さらにアルファ-フコースが非還元末端の最初のGlcNAcに添加されてGlcNAc2-Man3-Xyl-Fuc(α1,3)-GlcNAc2-Asn N-グリカンが生成される。
アルファ-マンノシダーゼはオリゴマンノシドN-グリカン構造を加水分解し、前記酵素は小胞体内在アルファ-マンノシダーゼ及びゴルジ内在アルファ-マンノシダーゼから成る。アルファ-マンノシダーゼI（EC 3.2.1.113）は、小胞体及びcis-ゴルジでオリゴマンノシドMan9をMan5に加水分解するアルファ-1,2-マンノシダーゼI（α(1,2)-マンノシダーゼI）である。アルファ-マンノシダーゼII（EC 3.2.1.114）は、もっぱらゴルジ内在アルファ-マンノシダーゼであり、アルファ-1,3-マンノース（α1,3-マンノース）及びアルファ-1,6-マンノース（α1,6-マンノース）に高度に特異的で、オリゴマンノシドMan5及びMan4ハイブリッド型N-グリカンをMan3 N-グリカンに加水分解する。
しかしながら、植物で組換えタンパク質を生成する潜在能力を与えられたとして、上記に記載の植物固有の糖類の糖タンパク質への添加を植物で妨げる方法は現在のところ利用可能ではない。
したがって、植物固有の糖類の糖タンパク質、特に糖タンパク質のN-グリカンへの添加を植物で妨げる方法が希求される。特に、糖タンパク質のN-グリカンにアルファ-1,3-結合フコース及びベータ-1,2-結合キシロース残基を実質的に欠く糖タンパク質を生成することができる植物及び植物細胞を入手することが所望される。本発明が主眼を置くこの希求は、独立の特許請求の範囲の特徴によって規定する本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチド及び方法によって解決される。好ましい実施態様は従属する特許請求の範囲の主題である。
本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチド及び方法は、植物固有のベータ-1,2キシロース及びアルファ-1,3-フコースを欠く、糖タンパク質のN-グリカンに多様な量のマンノースを含む異種糖タンパク質を植物細胞、植物又はその部分で製造することを今や可能にした。特に、本トランスジェニック植物細胞、植物又はその部分は、コントロールの対応物と比較して糖タンパク質のN-グリカンに改変量のマンノースを提示し、医薬組成物の製造を目的とする異種糖タンパク質の製造のために用いることができる。そのような植物生成糖タンパク質を含む医薬組成物は、したがってヒト対象動物で使用するために好ましい免疫原性特性及び改善された有効性を有し得る。
定義
本出願の範囲内で用いられる技術用語及び表現には、植物生物学及び分子生物学に関する分野でそれらに一般的に適用される意味が概ね与えられる。以下の用語の定義の全てが本出願の全内容に適用される。“含む”という語は、他の成分又は工程を排除せず、不定冠詞“a”又は“an”は複数形を排除しない。単一工程は特許請求の範囲で列挙したいくつかの特徴の機能を満たすことができる。属性又は値に関して“本質的に”、“約”、“およそ”などという用語はまた、それぞれ当該属性を厳密に限定し又は当該値を厳密に限定する。ある数値又は範囲の関係で“約”という用語は、ある値又は範囲の20％以内、10％以内又は5％以内である値又は範囲を指す。
本明細書で用いられる“ポリヌクレオチド”という用語はヌクレオチドのポリマーを指し、前記は改変されていない又は改変されたデオキシリボ核酸（DNA）又はリボ核酸（RNA）であり得る。したがって、ポリヌクレオチドは、ゲノムDNA、相補性DNA（cDNA）、mRNA又はアンチセンスRNAであり得るが、ただしこれらに限定されない。さらにまた、ポリヌクレオチドは、一本鎖若しくは二本鎖DNA、一本鎖及び二本鎖領域の混合物であるDNA、DNA及びRNAを含むハイブリッド分子、又は一本鎖及び二本鎖領域の混合物を含むハイブリッド分子であり得る。さらにまた、ポリヌクレオチドは、DNA、RNA又はその両方を含む三本鎖領域を含むことができる、ポリヌクレオチドは、1つ以上の改変塩基（例えばホスホチオエート）を含むことができ、さらにペプチド核酸（PNA）であり得る。全般的には、本発明によって提供されるポリヌクレオチドは、単離、増幅又はクローニングされたcDNA、ゲノムDNA、エクソン配列、イントロン配列、オリゴヌクレオチド、又は前述の個々のヌクレオチド若しくは合体物からアッセンブリングされ得る。本明細書に記載するポリヌクレオチド配列はDNA配列として示されるが、前記配列にはそれらの対応するRNA配列及びそれらの相補性DNA又はRNA配列（その逆相補鎖を含む）が含まれる。
本明細書で用いられる“NtMNS1aポリヌクレオチド”という用語は、単離されたNtMNS1a遺伝子（本明細書では配列番号：1、配列番号：2、配列番号：30又は配列番号：94と称される）、NtMNS1aエクソン配列（本明細書では配列番号：3、配列番号：5、配列番号：7、配列番号：9、配列番号：11、配列番号：13、配列番号：15、配列番号：17、配列番号：19、配列番号：21、配列番号：23、配列番号：25、配列番号：27又は配列番号：29と称される）、及びNtMNS1aイントロン配列（本明細書では配列番号：4、配列番号：6、配列番号：8、配列番号：10、配列番号：12、配列番号：14、配列番号：16、配列番号：18、配列番号：20、配列番号：22、配列番号：24、配列番号：26又は配列番号：28と称される）を含む、前記から成る、又は本質的に前記から成るヌクレオチドポリマーを指す。この用語はまた、配列番号：1から30のいずれかと実質的な相同性又は配列類似性又は実質的な同一性を有するポリヌクレオチド、配列番号：1、配列番号：2、配列番号：30及び配列番号：94のフラグメント、並びに配列番号：1、配列番号：2、配列番号：30及び配列番号：94のフラグメントであって前記と実質的な相同性又は配列類似性又は実質的な同一性を有するものを包含する。
本明細書に記載するように、変種は、単離されたNtMNS1a遺伝子の配列と少なくとも50％、55％、60％、70％、71％、72％、73％、特に少なくとも74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％又は99％の配列同一性を有し得る。本明細書に記載するNtMNS1aポリヌクレオチド配列はDNA配列として示されているが、当該配列にはそれらの対応するRNA配列及びそれらの相補性DNA又はRNA配列（その逆相補鎖又は相補鎖を含む）が含まれる。
本明細書で用いられる“NtMNS1bポリヌクレオチド”という用語は、単離されたNtMNS1b遺伝子（本明細書では配列番号：32、配列番号：33、配列番号：61又は配列番号：96と称される）、NtMNS1bエクソン配列（本明細書では配列番号：34、配列番号：36、配列番号：38、配列番号：40、配列番号：42、配列番号：44、配列番号：46、配列番号：48、配列番号：50、配列番号：52、配列番号：54、配列番号：56、配列番号：58又は配列番号：60と称される）、及びNtMNS1bイントロン配列（本明細書では配列番号：35、配列番号：37、配列番号：39、配列番号：41、配列番号：43、配列番号：45、配列番号：47、配列番号：47、配列番号：49、配列番号：51、配列番号：53、配列番号：55、配列番号：57又は配列番号：59と称される）を含む、前記から成る、又は本質的に前記から成るヌクレオチドポリマーを指す。この用語はまた、配列番号：32から61のいずれかと実質的な相同性又は配列類似性又は実質的な同一性を有するポリヌクレオチド、配列番号：32、配列番号：33、配列番号：61又は配列番号：96のフラグメント、並びに配列番号：32、配列番号：33、配列番号：61及び配列番号：96のフラグメントであって前記と実質的な相同性又は配列類似性又は実質的な同一性を有するものを包含する。
本明細書に記載するように、変種は、単離されたNtMNS1b遺伝子の配列と少なくとも50％、55％、60％、70％、71％、72％、73％、特に少なくとも74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％又は99％の配列同一性を有し得る。本明細書に記載するNtMNS1bポリヌクレオチド配列はDNA配列として示されているが、当該配列にはそれらの対応するRNA配列及びそれらの相補性DNA又はRNA配列（その逆相補鎖又は相補鎖を含む）が含まれる。
本明細書で用いられる“NtMNS2ポリヌクレオチド”という用語は、単離されたNtMNS2遺伝子（本明細書では配列番号：63、配列番号：64又は配列番号：92と称される）、NtMNS2エクソン配列（本明細書では配列番号：65、配列番号：67、配列番号：69、配列番号：71、配列番号：73、配列番号：75、配列番号：77、配列番号：79、配列番号：81、配列番号：83、配列番号：85、配列番号：87、配列番号：89又は配列番号：91と称される）、及びNtMNS2イントロン配列（本明細書では配列番号：66、配列番号：68、配列番号：70、配列番号：72、配列番号：74、配列番号：76、配列番号：78、配列番号：80、配列番号：82、配列番号：84、配列番号：86、配列番号：88、又は配列番号：90と称される）を含む、前記から成る、又は本質的に前記から成るヌクレオチドポリマーを指す。この用語はまた、配列番号：63から92のいずれかと実質的な相同性又は配列類似性又は実質的な同一性を有するポリヌクレオチド、配列番号：63、配列番号：64又は配列番号：92のフラグメント、並びに配列番号：63、配列番号：64及び配列番号：92のフラグメントであって前記と実質的な相同性又は配列類似性又は実質的な同一性を有するものを包含する。
本明細書に記載するように、変種は、単離されたNtMNS2遺伝子の配列と少なくとも50％、55％、60％、70％、71％、72％、73％、特に少なくとも74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％又は99％の配列同一性を有し得る。本明細書に記載するNtMNS2ポリヌクレオチド配列はDNA配列として示されているが、当該配列にはそれらの対応するRNA配列及びそれらの相補性DNA又はRNA配列（その逆相補鎖又は相補鎖を含む）が含まれる。
本明細書で用いられる“NtMan1.4ポリヌクレオチド”という用語は、単離されたNtMan1.4遺伝子（本明細書では配列番号：98と称される）を含む、前記から成る、又は本質的に前記から成るヌクレオチドポリマーを指す。
本明細書に記載するように、変種は、単離されたNtMan1.4遺伝子の配列と少なくとも50％、55％、60％、70％、71％、72％、73％、特に少なくとも74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％又は99％の配列同一性を有し得る。本明細書に記載するNtMan1.4ポリヌクレオチド配列はDNA配列として示されているが、当該配列にはそれらの対応するRNA配列及びそれらの相補性DNA又はRNA配列（その逆相補鎖又は相補鎖を含む）が含まれる。
本明細書で用いられる“単離された”という用語は、ある物質の天然の環境から取り出された物質に関するが、ただし前記用語は精製度については一切示唆しない。
本明細書で用いられる“遺伝子配列”という用語は、ポリペプチド又は生物学的に活性なRNAをコードする核酸分子又はポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を指し、さらに単にタンパク質のフラグメントをコードする部分的なコード配列のヌクレオチド配列を包含する。遺伝子配列はまた、当該コード配列に対して上流又は下流に位置する遺伝子の発現に関して調節性機能を有する配列を含むことができる（前記は、例えば非翻訳リーダー配列及びプロモーター並びにターミネーター配列とともに遺伝子のイントロン及びエクソンであるが、ただしこれらに限定されない）。
“NtMNS1aポリペプチド”という用語は、単離されたNtMNS1a遺伝子によってコードされるアミノ酸配列を含む、前記から成る又は本質的に前記から成るポリペプチド、又は本明細書で配列番号：31及び配列番号：95とそれぞれ称されるポリペプチドを指す。この用語はまた、配列番号：31及び配列番号：95と実質的な相同性又は配列類似性又は実質的同一性を有するポリペプチド；配列番号：31及び配列番号：95のフラグメント；及び配列番号：31及び配列番号：95のフラグメントであって前記と実質的な相同性又は配列類似性又は実質的な同一性を有するものを包含する。NtMNS1aポリペプチドは、マンノースを加水分解することができる、それぞれ配列番号：31及び配列番号：95に対して十分な若しくは実質的な程度の同一性又は類似性を含む配列を含む。NtMNS1aポリペプチドはまた、任意のタイプの変化を導入することによって生成される変種又は変異体を含む。前記任意のタイプの変化は、意図的に操作し得るか又は天然に単離し得る、例えばアミノ酸の挿入、欠失又は置換；N-グリコシル化を含むグリコシル化状態の変化；再折畳み若しくは異性化、三次元構造又は自己結合状態に影響を及ぼす変化であるが、ただしこれらに限定されない。NtMNS1aポリペプチドは線状形であっても、公知の方法を用いて環化されてあってもよい。本明細書に記載されているように、変種は、NtMNS1aポリペプチドの配列と少なくとも50％、55％、60％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、特に少なくとも76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％又は99％の同一性、又はNtMNS1aポリペプチドの配列と少なくとも84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％又は99％の類似性を有し得る。
“NtMNS1bポリペプチド”という用語は、単離されたNtMNS1a遺伝子によってコードされるアミノ酸配列を含む、前記から成る又は本質的に前記から成るポリペプチド、又は本明細書で配列番号：62及び配列番号：97とそれぞれ称されるポリペプチドを指す。この用語はまた、配列番号：62及び配列番号：97と実質的な相同性又は配列類似性又は実質的同一性を有するポリペプチド；配列番号：62及び配列番号：97のフラグメント；並びに配列番号：62及び配列番号：97のフラグメントであって前記と実質的な相同性又は配列類似性又は実質的な同一性を有するものを包含する。NtMNS1bポリペプチドは、マンノースを加水分解することができる、それぞれ配列番号：62及び配列番号：97に対して十分な若しくは実質的な程度の同一性又は類似性を含む配列を含む。NtMNS1bポリペプチドはまた、任意のタイプの変化を導入することによって生成される変種又は変異体を含む。前記任意のタイプの変化は、意図的に操作し得るか又は天然に単離し得る、例えばアミノ酸の挿入、欠失又は置換；N-グリコシル化を含むグリコシル化状態の変化；再折畳み若しくは異性化、三次元構造又は自己結合状態に影響を及ぼす変化であるが、ただしこれらに限定されない。NtMNS1bポリペプチドは線状形であっても、公知の方法を用いて環化されてあってもよい。本明細書に記載されているように、変種は、NtMNS1bポリペプチドの配列と少なくとも50％、55％、60％、70％、71％、72％、73％、74％、特に少なくとも75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％又は99％の同一性、又はNtMNS1bポリペプチドの配列と少なくとも84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％又は99％の類似性を有し得る。
“NtMNS2ポリペプチド”という用語は、単離されたNtMNS2遺伝子によってコードされるアミノ酸配列を含む、前記から成る又は本質的に前記から成るポリペプチド、又は本明細書で配列番号：93と称されるポリペプチドを指す。この用語はまた、配列番号：93と実質的な相同性又は配列類似性又は実質的同一性を有するポリペプチド；配列番号：93のフラグメント；及び配列番号：93のフラグメントであって前記と実質的な相同性又は配列類似性又は実質的な同一性を有するものを包含する。NtMNS2ポリペプチドは、マンノースを加水分解することができる、配列番号：93に対して十分な若しくは実質的な程度の同一性又は類似性を含む配列を含む。NtMNS2ポリペプチドはまた、任意のタイプの変化を導入することによって生成される変種又は変異体を含む。前記任意のタイプの変化は、意図的に操作し得るか又は天然に単離し得る、例えばアミノ酸の挿入、欠失又は置換；N-グリコシル化を含むグリコシル化状態の変化；再折畳み若しくは異性化、三次元構造又は自己結合状態に影響を及ぼす変化であるが、ただしこれらに限定されない。NtMNS2ポリペプチドは線状形であっても、公知の方法を用いて環化されてあってもよい。本明細書に記載されているように、変種は、NtMNS2ポリペプチドの配列と少なくとも50％、55％、60％、70％、71％、72％、73％、特に少なくとも74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％又は99％の同一性、又はNtMNS2ポリペプチドの配列と少なくとも83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％又は99％の類似性を有し得る。
“NtMan1.4ポリペプチド”という用語は、単離されたNtMan1.4遺伝子によってコードされるアミノ酸配列を含む、前記から成る又は本質的に前記から成るポリペプチド、又は本明細書で配列番号：99と称されるポリペプチドを指す。この用語はまた、配列番号：99と実質的な相同性又は配列類似性又は実質的同一性を有するポリペプチド；配列番号：99のフラグメント；及び配列番号：99のフラグメントであって前記と実質的な相同性又は配列類似性又は実質的な同一性を有するものを包含する。NtMan1.4ポリペプチドは、マンノースを加水分解することができる、配列番号：99に対して十分な若しくは実質的な程度の同一性又は類似性を含む配列を含む。NtMan1.4ポリペプチドはまた、任意のタイプの変化を導入することによって生成される変種又は変異体を含む。前記任意のタイプの変化は、意図的に操作し得るか又は天然に単離し得る、例えばアミノ酸の挿入、欠失又は置換；N-グリコシル化を含むグリコシル化状態の変化；再折畳み若しくは異性化、三次元構造又は自己結合状態に影響を及ぼす変化であるが、ただしこれらに限定されない。NtMan1.4ポリペプチドは線状形であっても、公知の方法を用いて環化されてあってもよい。本明細書に記載されているように、変種は、NtMan1.4ポリペプチドの配列と少なくとも50％、55％、60％、70％、71％、72％、73％、特に少なくとも74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％又は99％の同一性、又はNtMan1.4ポリペプチドの配列と少なくとも83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％又は99％の類似性を有し得る。
“NtMNS1a遺伝子配列”という用語は、それぞれ配列番号：31及び配列番号：95のNtMNS1aポリペプチドをコードする核酸分子若しくはポリヌクレオチド又は生物学的に活性なRNAのヌクレオチド配列を指し、単にNtMNS1aポリペプチドのフラグメントをコードする部分的コード配列のヌクレオチド配列を包含する。遺伝子配列はまた、当該コード配列に対して上流又は下流に位置する遺伝子の発現に関して調節性機能を有する配列を含むことができる（前記は、例えば非翻訳リーダー配列及びプロモーター並びにターミネーター配列とともに遺伝子のイントロン及びエクソンであるが、ただしこれらに限定されない）。
“NtMNS1b遺伝子配列”という用語は、それぞれ配列番号：62及び配列番号：97のNtMNS1bポリペプチドをコードする核酸分子若しくはポリヌクレオチド又は生物学的に活性なRNAのヌクレオチド配列を指し、単にNtMNS1bポリペプチドのフラグメントをコードする部分的コード配列のヌクレオチド配列を包含する。遺伝子配列はまた、当該コード配列に対して上流又は下流に位置する遺伝子の発現に関して調節性機能を有する配列を含むことができる（前記は、例えば非翻訳リーダー配列及びプロモーター並びにターミネーター配列とともに遺伝子のイントロン及びエクソンであるが、ただしこれらに限定されない）。
“NtMNS2遺伝子配列”という用語は、配列番号：93のNtMNS2ポリペプチドをコードする核酸分子若しくはポリヌクレオチド又は生物学的に活性なRNAのヌクレオチド配列を指し、単にNtMNS2ポリペプチドのフラグメントをコードする部分的コード配列のヌクレオチド配列を包含する。遺伝子配列はまた、当該コード配列に対して上流又は下流に位置する遺伝子の発現に関して調節性機能を有する配列を含むことができる（前記は、例えば非翻訳リーダー配列及びプロモーター並びにターミネーター配列とともに遺伝子のイントロン及びエクソンであるが、ただしこれらに限定されない）。
“NtMan1.4遺伝子配列”という用語は、配列番号：99のNtMan1.4ポリペプチドをコードする核酸分子若しくはポリヌクレオチド又は生物学的に活性なRNAのヌクレオチド配列を指し、単にNtMan1.4ポリペプチドのフラグメントをコードする部分的コード配列のヌクレオチド配列を包含する。遺伝子配列はまた、当該コード配列に対して上流又は下流に位置する遺伝子の発現に関して調節性機能を有する配列を含むことができる（前記は、例えば非翻訳リーダー配列及びプロモーター並びにターミネーター配列とともに遺伝子のイントロン及びエクソンであるが、ただしこれらに限定されない）。
本明細書で用いられる“ベクター”という用語は、核酸の移送を可能にするDNA成分、核酸構築物及び核酸連結物などの結合体を含む核酸ベヒクルを指す。適切なベクターには、染色体外複製の能力を有するエピソーム、例えば環状二本鎖DNAプラスミド；線状化二本鎖DNAプラスミド；T-DNAを植物細胞の核に移転させることができる二元性ベクター；及び任意の起源の他のベクターが含まれる。
“発現ベクター”という用語は、核酸の発現を可能にするDNA成分、核酸構築物及び核酸連結物などの結合体を含む核酸ベヒクルを指す。適切な発現ベクターには、染色体外複製の能力を有するエピソーム、例えば環状二本鎖DNAプラスミド；線状化二本鎖DNAプラスミド；T-DNAを植物細胞の核に移転させることができる二元性ベクター；及び任意の起源の他の機能的に等価の発現ベクターが含まれる。発現ベクターは、上流に配置され作動できるように核酸に連結された少なくとも1つのプロモーター；核酸構築物又は核酸連結物（下記に規定される）を含む。
“構築物”という用語は、NtMNS1a、NtMNS1b、NtMNS2又はNtMan1.4ポリヌクレオチドを含む二本鎖組換えDNAフラグメントを指す。前記構築物は、相補性の“センス又はコード鎖”と塩基対を形成した“鋳型鎖”を含む。与えられた構築物は、ベクター（例えば発現ベクター、特に二元性発現ベクター）内に配置されるプロモーターの向きに対して2つの可能な向き（同じ（センスの）向き又は逆（又はアンチセンスの）向き）でベクターに挿入できる。
“鋳型鎖”という用語は、DNAデュープレックスの“センス又はコード鎖”の配列を相補する配列を含む鎖を指す（前記DNAデュープレックスは、例えばNtMNS1a、NtMNS1b、NtMNS2又はNtMan1.4ゲノムフラグメント；NtMNS1a、NtMNS1b、NtMNS2又はNtMan1.4 cDNA；又はNtMNS1a、NtMNS1b、NtMNS2又はNtMan1.4構築物；又はRNAポリメラーゼによって転写され得る核酸配列を含む任意のDNAフラグメントである）。転写時に、RNAポリメラーゼは、初期RNA合成の間に鋳型鎖に沿って3’から5’方向に移動することができる。
本明細書で“コード鎖”という用語と互換的に用いられる“センス鎖”という用語は、DNAデュープレックス中の鋳型鎖の配列を相補する配列を含む鎖を指す。例えば、同定したNtMNS1aゲノムクローンのセンス鎖の配列（“センス配列”）は、配列番号：1又は配列番号：2と称される。例えばセンス鎖が仮定的配列5'-TAATCCGGT-3'を含む場合、仮定的な標的mRNA内の対応する実質的に同一の配列は5'-UAAUCCGGU-3'である。
“逆相補性配列”という用語は、問題の“センス配列”（例えば同じ鎖内に配置されているエクソン配列）を当該センス配列に対して同じ向きで相補する配列を指す。例えば、鎖が仮定的配列5'-TAATCCGGT-3'を含む場合、逆相補性配列5'-ACCGGATTA-3'が、スペーサー配列によって分離され、作動できるようにセンス配列に連結され得る。
“NtMNS1a RNA”と互換的に用いられる“NtMNS1a RNA転写物”という用語は、問題の宿主植物細胞内で生成されるポリリボ核酸分子を含む（前記核酸分子は例えば配列番号：1、配列番号：2、配列番号：30又は配列番号：94の内因性NtMNS1a遺伝子の転写から生じる）。したがって、この用語はNtMNS1aの転写生成物として生成される任意のRNA種又はRNA変種（構造的又は機能的レベルで十分な類似性を有するRNA種又はRNA変種を含む）を含む。例えば、NtMNS1a RNA転写物は以下を含む：（1）例えば配列番号：1、配列番号：2、配列番号：30又は配列番号：94の単離NtMNS1a遺伝子の転写から生成されるpre-mRNA及びmRNA；（2）単離NtMNS1a遺伝子の配列と少なくとも50％、55％、60％、70％、71％、72％、73％、特に少なくとも74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％又は99％の同一性を有する任意の遺伝子、例えば同定されたNtMNS1a遺伝子と実質的に同一でありアルファ-マンノシダーゼI酵素の関連するアイソフォームをコードする他の別個の遺伝子の転写から生成されるpre-mRNA及びmRNA；及び（3）NtMNS1a遺伝子の対立遺伝子の転写から生成されるpre-mRNA及びmRNA。前記NtMNS1a RNA転写物は、個々のNtMNS1a遺伝子の異核RNA（“hnRNA”）の代替RNAスプライシング反応の結果として生成されるRNA変種、そのような代替RNAスプライシング反応から生じたmRNA変種、及び任意のRNA変種中間体を含む。
“NtMNS1b RNA”と互換的に用いられる“NtMNS1b RNA転写物”という用語は、問題の宿主植物細胞内で生成されるポリリボ核酸分子を含む（前記核酸分子例えば配列番号：32、配列番号：33、配列番号：61又は配列番号：96の内因性NtMNS1a遺伝子の転写から生じる）。したがって、この用語はNtMNS1bの転写生成物として生成される任意のRNA種又はRNA変種（構造的又は機能的レベルで十分な類似性を有するRNA種又はRNA変種を含む）を含む。例えば、NtMNS1b RNA転写物は以下を含む：（1）例えば配列番号：32、配列番号：33、配列番号：61又は配列番号：96の単離NtMNS1b遺伝子の転写から生成されるpre-mRNA及びmRNA；（2）単離NtMNS1b遺伝子の配列と少なくとも50％、55％、60％、70％、71％、72％、73％、特に少なくとも74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％又は99％の同一性を有する任意の遺伝子、例えば同定されたNtMNS1b遺伝子と実質的に同一でありアルファ-マンノシダーゼI酵素の関連するアイソフォームをコードする他の別個の遺伝子の転写から生成されるpre-mRNA及びmRNA；及び（3）NtMNS1b遺伝子の対立遺伝子の転写から生成されるpre-mRNA及びmRNA。前記NtMNS1b RNA転写物は、個々のNtMNS1b遺伝子の異核RNA（“hnRNA”）の代替RNAスプライシング反応の結果として生成されるRNA変種、そのような代替RNAスプライシング反応から生じたmRNA変種、及び任意のRNA変種中間体を含む。
“NtMNS2 RNA”と互換的に用いられる“NtMNS2 RNA転写物”という用語は、問題の宿主植物細胞内で生成されるポリリボ核酸分子を含む（前記核酸分子例えば配列番号：63、配列番号：64又は配列番号：92の内因性NtMNS2遺伝子の転写から生じる）。したがって、この用語はNtMNS2の転写生成物として生成される任意のRNA種又はRNA変種（構造的又は機能的レベルで十分な類似性を有するRNA種又はRNA変種を含む）を含む。例えば、NtMNS2 RNA転写物は以下を含む：（1）例えば配列番号：63、配列番号：64又は配列番号：92の単離NtMNS2遺伝子の転写から生成されるpre-mRNA及びmRNA；（2）単離NtMNS2遺伝子の配列と少なくとも50％、55％、60％、70％、71％、72％、73％、特に少なくとも74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％又は99％の同一性を有する任意の遺伝子、例えば同定されたNtMNS2遺伝子と実質的に同一でありアルファ-マンノシダーゼI酵素の関連するアイソフォームをコードする他の別個の遺伝子の転写から生成されるpre-mRNA及びmRNA；及び（3）NtMNS2遺伝子の対立遺伝子の転写から生成されるpre-mRNA及びmRNA。前記NtMNS2 RNA転写物は、個々のNtMNS2遺伝子の異核RNA（“hnRNA”）の代替RNAスプライシング反応の結果として生成されるRNA変種、そのような代替RNAスプライシング反応から生じたmRNA変種、及び任意のRNA変種中間体を含む。
“NtMan1.4 RNA”と互換的に用いられる“NtMan1.4 RNA転写物”という用語は、問題の宿主細胞内で生成されるポリリボ核酸分子を含む（前記核酸分子例えば配列番号：98の内因性NtMNS1a遺伝子の転写から生じる）。したがって、この用語はNtMan1.4の転写生成物として生成される任意のRNA種又はRNA変種（構造的又は機能的レベルで十分な類似性を有するRNA種又はRNA変種を含む）を含む。例えば、NtMan1.4 RNA転写物は以下を含む：（1）例えば配列番号：98の単離NtMan1.4遺伝子の転写から生成されるpre-mRNA及びmRNA；（2）単離NtMan1.4遺伝子の配列と少なくとも50％、55％、60％、70％、71％、72％、73％、特に少なくとも74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％又は99％の同一性を有する任意の遺伝子、例えば同定されたNtMan1.4遺伝子と実質的に同一でありアルファ-マンノシダーゼI酵素の関連するアイソフォームをコードする他の別個の遺伝子の転写から生成されるpre-mRNA及びmRNA；及び（3）NtMan1.4遺伝子の対立遺伝子の転写から生成されるpre-mRNA及びmRNA。前記NtMan1.4 RNA転写物は、個々のNtMan1.4遺伝子の異核RNA（“hnRNA”）の代替RNAスプライシング反応の結果として生成されるRNA変種、そのような代替RNAスプライシング反応から生じたmRNA変種、及び任意のRNA変種中間体を含む。
“上流”という用語は、線状ポリヌクレオチド配列上の参照エレメントに対する相対的な方向又は位置に関し、前記はポリヌクレオチド配列の5'末端に向かう方向又は位置を示す。“上流”は“参照エレメントの5'末端”と互換的に用いることができる。
“作動できるように連結される”という用語は、機能的な転写ユニット又は機能的な発現ベクターを生成するための別個のDNAエレメント、フラグメント又は配列の結合を指す。
“プロモーター”という用語は、二本鎖DNAフラグメント（例えば、それぞれ配列番号：30、配列番号：94、配列番号：61、配列番号：96、配列番号：92又は配列番号：98のNtMNS1a、NtMNS1b、NtMNS2又はNtMan1.4 cDNA）又はRNAi構築物の典型的には上流に配置され前記と作動できるように連結された核酸エレメントを指す。後者の構築物の場合には、適切なプロモーターは、転写複合体（RNAポリメラーゼ及び多様な因子を含む）を補充することによってNtMNS1a、NtMNS1b、NtMNS2又はNtMan1.4 RNAi構築物の転写を活性化しRNA合成を開始させることができる。プロモーターは、問題の本来の遺伝子に近接する領域からそっくりそのまま入手できるが、或いは本来のものではあるが別個のプロモーター又は合成DNAセグメントから入手した別個のエレメントを含んでいてもよい。
“エンハンサー”という用語は、転写調節タンパク質（例えば転写アクチベーター）を補充しプロモーター活性を高めることによって転写活性化を強化できる核酸分子又は核酸配列を指す。適切なエンハンサーは、問題の本来のプロモーターに近接する領域（同種供給源）から入手できるが、或いは本来のものではない環境（異種供給源）から入手して、NtMNS1a、NtMNS1b、NtMNS2又はNtMan1.4構築物（例えばcDNA発現ベクター又はRNAi発現ベクター）内で任意の問題のプロモーターと作動できるように連結してプロモーターの活性又は組織特異性を強化してもよい。いくつかのエンハンサーは、転写ユニットの向きに対して任意の向きで作動することができる。例えば、エンハンサーは、プロモーター及びNtMNS1a、NtMNS1b、NtMNS2又はNtMan1.4構築物を含む転写ユニットの上流又は下流に配置することができる。
本明細書で用いられる“植物”という用語は、植物のライフサイクル又は発育の任意の段階における任意の植物及びその子孫を指す。
本明細書で用いられる“植物細胞”という用語は、植物の構造的及び生物学的ユニットを指す。前記植物細胞は、細胞壁をもたないプロトプラストとしての形態、単離された単一細胞若しくは培養細胞、又は高等な組織化されたユニット（例えば植物組織、植物器官又は全植物であるが、ただしこれらに限定されない）の部分として存在し得る。
“植物細胞培養”という用語は、植物細胞（例えばプロトプラスト、細胞培養の細胞、培養植物組織の細胞、外移植片の細胞であるが、ただしこれらに限定されない）の培養、及び花粉培養を指す。
“植物材料”という用語は、任意の固体液体若しくは気体状組成物又は前記の結合体を指し、前記材料は植物（葉、茎、根、花若しくは花の部分、果実、花粉、卵細胞、接合体、種子、切り枝、抽出物、細胞若しくは組織培養、又は植物の他の任意の部分若しくは生成物を含む）から入手できる。
“植物組織”という用語は、構造的又は機能的ユニットに組織化された一群の植物細胞に関する。植栽又は培養されている植物のいずれの組織も含まれる。この用語には全植物、植物器官及び種子が含まれるが、ただし前記に限定されない。
“植物器官”という用語は、植物の別個の又は弁別された部分、例えば根、茎、葉、花芽又は胚に関する。
“異種配列”という用語は、与えられたゲノム（例えば核ゲノム、プラスミドゲノム又はミトコンドリアゲノムであるが、ただしこれらに限定されない）の関係では対象の細胞又は生物に天然には存在しない生物学的配列を指す。
“異種タンパク質”という用語は、細胞によって生成されるが当該細胞内では天然には存在しないタンパク質を指す。例えば、植物細胞内で生成される異種タンパク質は哺乳動物又はヒトのタンパク質であり得る。異種タンパク質は、翻訳時又は翻訳後改変でポリペプチド骨格に共有結合される1つ以上のオリゴ糖鎖（例えばN-グリカン）を含むことができる。
“N-グリカン”という用語は、タンパク質骨格中のAsn-Xaa-Ser又はAsn-Xaa-Thr配列モチーフの部分である、アスパラギン（Asn又はN）残基と結合する炭水化物又はオリゴ糖鎖を指す（ここでXaaはプロリンを除く任意のアミノ酸であり、Serはタンパク質骨格上のアミノ酸のセリンでThrはスレオニンで、Asnはアスパラギンである）。
“N-グリコシル化”という用語は、小胞体膜内の特異的なドリコール（Dol）脂質結合前駆体オリゴ糖であるDol-PP-GlcNAc2-Man9-Glc3を、タンパク質骨格中のAsn-Xaa-Ser又はAsn-Xaa-Thrモチーフの部分であるアスパラギン残基（Asn）の遊離アミノ基に移転させることにより開始してGlc3-Man9-GlcNAc2-Asnグリコシル化タンパク質を生じるプロセスを指す。本明細書で用いられる略語、“Man”はマンノースを指し、“GlcNAc”はN-アセチルグルコサミンを指し、“Glc”はグルコースを指し、“Xyl”はキシロースを指し、“Fuc”はフコースを指し、“Gal”はガラクトースを指し、“NeuAc”はシアリン酸を指す。GlcNAc2の接尾辞の2は2つのN-アセチルグルコサミン残基の存在を指し、Man3の接尾辞3は3つのマンノースの存在を指し、さらにMan5は5つのマンノースを指す。アルファ-1,3又はα(1,3)の添付は、対応する糖類のN-グリカン上に一列に並ぶ次の糖類への結合を意味する。
“N-グリカンの非還元末端”という用語は、当該タンパク質骨格のアスパラギンに結合するN-グリカンの部分を指す。
“N-グリカンの還元末端”という用語は、非還元末端に向かい合いさらに加水分解による還元に自由にアクセスできるN-グリカンの部分を指す。
“アルファ-マンノシダーゼI”という用語は、クラスIアルファ-マンノシダーゼ（EC 3.2.1.113）を指し、前記は、α(1,2)-マンノース残基に高度に特異的な転化グリコシルヒドロラーゼである。
“アルファ-マンノシダーゼII”という用語は、クラスIIアルファ-マンノシダーゼ（EC 3.2.1.114）を指し、前記は、α(1,3)-及びα(1,6)-マンノース残基、及び典型的にはゴルジ装置内の残基に高度に特異的な転化グリコシルヒドロラーゼである。
“ベータ-1,2-キシロシルトランスフェラーゼ”又は“β(1,2)-キシロシルトランスフェラーゼ”という用語は、ベータ-1,2-結合のキシロース（β(1,2)-Xyl）を、糖タンパク質のN-グリカンのトリマンノシル（Man3）コア構造のベータ-1,4結合マンノース（β(1,4)-Man）に添加する、EC2.4.2.38と称されるキシロシルトランスフェラーゼを指す。
“アルファ-1,3-フコシルトランスフェラーゼ”又は“α(1,3)-フコシルトランスフェラーゼ”という用語は、アルファ-1,3-結合のフコース（α(1,3)-フコース）を、N-グリカンの非還元末端の近位N-アセチルグルコサミン残基に添加する、EC2.4.1.214と称されるフコシルトランスフェラーゼを指す。
“N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼI”という用語は、N-アセチルグルコサミンをMan5-GlcNAc2-Asnオリゴマンノシルレセプターの1-3アーム上のマンノースに転化する、EC2.4.1.101と称される酵素を指す。
“低下する”又は“低下した”という用語は、ある量又は活性（例えば酵素活性、転写活性、リボ核酸及びタンパク質発現であるが、ただしこれらに限定されない）の約10％から約99％の減少、又は少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも25％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、又は100％までの減少を指す。
“増加する”又は“増加した” という用語は、ある量又は活性（例えば酵素活性、転写活性、リボ核酸及びタンパク質発現であるが、ただしこれらに限定されない）の約10％から約100％の増加、又は少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも75％、少なくとも100％、少なくとも200％、少なくとも250％、少なくとも500％、少なくとも750％、又は1000％までの増加を指す。
“阻害する”又は“阻害された”という用語は、ある量又は活性（例えば酵素活性、転写活性、リボ核酸及びタンパク質発現であるが、ただしこれらに限定されない）の約95％から約100％の減少、又は少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、特に少なくとも100％の減少を指す。
本明細書で用いられるように、“実質的に阻害する”又は“実質的に阻害された”という用語は、ある量又は活性（例えば酵素活性、転写活性、リボ核酸及びタンパク質発現であるが、ただしこれらに限定されない）の約80％から約100％の減少、又は少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、又は100％までの減少を指す。
本明細書で用いられるように、“実質的に増加する”又は“実質的に増加した”という用語は、ある量又は活性（例えば酵素活性、転写活性、リボ核酸及びタンパク質発現であるが、ただしこれらに限定されない）の約100％から約1000％の増加、又は少なくとも100％、少なくとも200％、少なくとも250％、少なくとも300％、少なくとも400％、少なくとも500％、又は1000％までの増加を指す。
“ゲノム編集”又は“ゲノム編集技術”という用語は、生物のゲノム内のヌクレオチド配列を改変する任意の方法（例えばジンクフィンガーヌクレアーゼ媒介変異導入、化学的変異導入、放射線照射変異導入、又はメガヌクレアーゼ媒介変異導入であるが、ただしこれらに限定されない）を指す。
“ジンクフィンガーヌクレアーゼ”という用語は、ジンクフィンガーDNA結合ドメイン及びDNA切断ドメインから成るタンパク質を指す。ジンクフィンガーDNA結合ドメインは天然のものであってもよいが、特異的なポリヌクレオチド又は遺伝子配列を標的とするために操作してもよい。標的ヌクレオチド又は核酸との結合時に、ジンクフィンガーヌクレアーゼは、内因性DNA修復機構を活性化して改変ポリヌクレオチド又はヌクレオチド配列をもたらすブレークを生じる。
“メガヌクレアーゼ”という用語は、ほぼ12から40塩基対の固有の結合部位を認識するエンドデオキシリボヌクレアーゼ活性を有するタンパク質を指す。メガヌクレアーゼは、遺伝的に操作して固有の部位に結合するようにできる。結合時に、メガヌクレアーゼはDNAブレークを形成し、前記ブレークはDNA修復を活性化して相同組換えをもたらすことができる。
本明細書で用いられる“エクソン”という用語は、前駆体RNA（イントロン）がcis-スプライシングによって除去された後又は2つ以上のRNA分子がtrans-スプライシングによって連結された後のRNA分子の成熟型で出現するヌクレオチド配列を指す。この成熟RNA分子はメッセンジャーRNA又は非コードRNAの機能型（例えばrRNA又はtRNA）であり得る。
本明細書で用いられる“イントロン”という用語は、タンパク質に翻訳されない遺伝子内のヌクレオチド配列である。これらの非コード断片は前駆体mRNA（pre-mRNA）及びいくつかの他のRNA（例えば長い非コードRNA）に転写され、その後成熟RNAへのプロセッシング中にスプライシングと称される過程によって除去される。イントロンのスプライシングの後で、mRNAはエクソン由来の配列のみから成り、当該mRNAがタンパク質に翻訳される。
2つ以上のヌクレオチド配列又はアミノ酸配列の関係で“パーセント同一性”又は“配列同一性”という用語は、最大一致の比較及びアラインメントを実施したとき、2つ以上の配列又は部分配列が同じであるか、或いはそれらが同じアミノ酸残基又はヌクレオチドの明確なパーセンテージを有する前記2つ以上の配列又は部分配列を指す。前記比較及びアラインメントは、以下の配列比較アルゴリズムの1つを用いるか又は目視精査によって測定される。“同一性”という用語はヌクレオチド配列又はアミノ酸配列の関係において本明細書で用いられ、2つの配列が、互いに少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、特に少なくとも70％、特に少なくとも71％、特に少なくとも72％、特に少なくとも73％、特に少なくとも74％、特に少なくとも75％、さらに特に少なくとも80％、特に少なくとも85％、少なくとも86％、少なくとも87％、少なくとも88％、少なくとも89％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％又は100％同一であることを示す。
互いに比較される2つの配列の長さが異なる場合、配列同一性は、好ましくは長い方の配列のヌクレオチド残基と同一である短い方の配列のヌクレオチド残基のパーセンテージに関係する。本明細書で用いられるように、2つの配列間のパーセント同一性は、当該配列が共有する同一である位置の数の関数であり（すなわち％同一性＝同一である位置の数／位置の総数ｘ100）、2つの配列の最適なアラインメントのために導入する必要があるギャップの数及び各ギャップの長さが考慮される。2つの配列間の配列比較及びパーセント同一性の決定は、本明細書の下記で述べる数学的アルゴリズムを用いて達成できる。例えば通常的には、配列同一性は、コンピュータープログラム、例えばBestfitプログラム（Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive Madison, WI 53711）を用いて決定できる。Bestfitは、2つの配列間で最高の配列同一性を有する断片を見つけるために、SmithとWaterman（Advances in Applied Mathematics 2 (1981), 482-489）の局所相同性アルゴリズムを利用する。個々の配列が本発明の参照配列と例えば95％の同一性を有するか否かを決定するためにBestfit又は別の配列アラインメントプログラムを用いるとき、パラメーターは、好ましくは同一性パーセンテージが参照配列の全長にわたって計算されるように、さらに参照配列中のヌクレオチド総数の5％までの相同性ギャップが許容されるように調整される。Bestfitを用いるとき、いわゆるオプションパラメーターはそれらの予め定めた値（“規定値”）に委ねられる。与えられた配列と本発明の上記の配列との間の比較で出現する逸脱は、例えば付加、欠失、置換、挿入又は組換えによって生じ得る。そのような配列比較はまた、好ましくはプログラム“fasta20u66”（バージョン2.0u66, September 1998 by William R. Pearson and the University of Virginia；以下もまた参照されたい：W.R. Pearson (1990), Methods in Enzymology 183, 63-98）を用いて実施できる。この目的のために“規定値”パラメーター設定を用いることができる。また別には、2つの配列のパーセンテージ同一性は、EMBOSSニードルコンピュータプログラム（Rice et al. (2000) Trends in Genetics 16:276-277）を用いて配列情報を比較することによって決定できる。EMBOSSニードルは2つのインプット配列を読み取り、さらにそれらの最適な総配列アラインメントを書き込んでファイルする。前記はNeedleman-Wunschアラインメントアルゴリズム（Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48: 443-453）を用いて、2つの配列の最適なアラインメント（ギャップを含む）をそれらの全長にわたって見出す。同一性の値は、アラインメントが実施された報告領域（当該全長における一切のギャップを含む）における2つの配列の同一マッチのパーセンテージである。
配列比較によって較べられるべき2つの配列の長さが異なる場合、配列同一性は短い方の配列及び前記短い方の配列とマッチする長い方の配列の当該部分を指す。換言すれば、比較される配列が同じ長さをもたないとき、同一性の度合いは、好ましくは長い方の配列中のヌクレオチド残基と同一である短い方の配列中のヌクレオチド残基のパーセンテージ、又は短い方の配列中のヌクレオチド配列と同一である長い方の配列中のヌクレオチドのパーセンテージを指す。この関係では、当業者は、短い方の配列に“マッチする”長い方の部分を容易に決定できよう。
例えば、本明細書に記載のヌクレオチド又はアミノ酸配列と少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、特に少なくとも70％、特に少なくとも70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％又は99％同一性を有するヌクレオチド又はアミノ酸配列は、対立遺伝子、好ましくは同様な生物学的機能を有するこれら配列の誘導体又は変種であり得る。それらは、天然に存在する変種（例えば対立遺伝子配列、他の生態型、系統、種などに由来する配列）又は変異であり得る。変異は天然に形成されたものでも、或いは意図的な変異導入方法（例えば本発明に開示するもの）によって生成されたものでもよい。さらにまた、変種型は合成により生成された配列でもよい。対立遺伝子変種は、天然に存在する変種でも合成により生成された変種でも、又は組換えDNA技術によって生成された変種でもよい。上記に記載のポリヌクレオチドから派生するものは、例えば欠失、置換、付加、挿入又は組換え、又は挿入及び組換えによって生成されたものであり得る。“付加”という用語は、与えられた配列の末端への少なくとも1つの核酸残基又はアミノ酸の付加を指し、一方、“挿入”は与えられた配列内部への少なくとも1つの核酸残基又はアミノ酸の挿入を指す。
2つの核酸配列が実質的に同一であるという別の指標は、2つのポリヌクレオチドがストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズするということである。“特異的にハイブリダイズする”という語句は、ある分子が複雑な混合物として存在するとき（例えば全細胞RNA又はDNA）、当該分子がストリンジェントな条件下で特定のヌクレオチド配列とのみ結合し、デュープレックスを形成し、又はハイブリダイズすることをいう。“実質的に結合する”とは、核酸プローブと標的核酸との間の相補性ハイブリダイゼーションを指し、標的核酸配列の所望の検出を達成するためにハイブリダイゼーション媒体のストリンジェンシーを低下させることによって収容し得る小さなミスマッチが許容される。
本明細書で提供されるポリヌクレオチドとハイブリダイズできるポリヌクレオチド配列は、例えば植物のゲノムDNAライブラリー又はcDNAライブラリーから単離できる。特に、そのようなポリヌクレオチドは、植物起源（特に好ましくはニコチアナ属に属する植物）に由来する。また別には、そのようなヌクレオチド配列は、遺伝的操作又は化学的合成によって調製できる。
ハイブリダイズする能力を有するポリヌクレオチド配列は、本明細書に記載のポリヌクレオチド若しくはその部分又は逆相補鎖を用いることによって、例えば標準的な方法によるハイブリダイゼーションによって同定及び単離することができる（例えば以下を参照されたい：Sambrook and Russell (2001), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CSH Press, Cold Spring Harbor, NY, USA）。列挙した配列番号に示すヌクレオチド配列と同じもの又は実質的に同じものを含むヌクレオチド配列又はその部分若しくはフラグメントを、例えばハイブリダイゼーションプローブとして用いることができる。ハイブリダイゼーションプローブとして用いられるフラグメントはまた、通常の合成技術によって調製される合成フラグメントでもよい（前記の配列は本発明のヌクレオチド配列の配列と実質的に同一である）。
核酸ハイブリダイゼーション実験（例えばサザン及びノザンハイブリダイゼーション）の関係では、“ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件”及び“ストリンジェントなハイブリダイゼーション洗浄条件”は配列依存性であり、異なる環境パラメーターの下では異なっている。より長い配列はより高温で特異的にハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションについての詳細な手引きは以下で見出される：Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes part I chapter 2 “Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays”Elsevier（New York）。一般的には、高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション及び洗浄条件は、規定のイオン強度及びpHで固有の配列についての融解温度よりも約5℃低いように選択される。典型的には、“ストリンジェントな条件”下では、プローブはその標的配列とハイブリダイズするが他の配列とはハイブリダイズしない。
融解温度は、（既定のイオン強度及びpHで）標的配列の50％が完全にマッチするプローブとハイブリダイズする温度である。非常にストリンジェントな条件は、個々のプローブの融解温度（Tm）と等しいように選択される。100よりも大きい相補性残基を有する相補性核酸のサザン又はノザンブロットのフィルター上でのハイブリダイゼーションのためのストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例は、42℃で1mgヘパリン含有50％ホルムアミドであり、ハイブリダイゼーションは一晩実施される。高度にストリンジェントな洗浄条件の例は72℃で約15分の0.15M NaClである。ストリンジェントな洗浄条件の例は65℃で15分の0.2倍SSCである（SSC緩衝液の記載については上掲書（Sambrook）を参照されたい）。高度にストリンジェントな洗浄には、プローブのバックグラウンドシグナルを除去するためにしばしば低度にストリンジェントな洗浄が先行する。デュープレックス（例えば100を超えるヌクレオチド）のための中等度ストリンジェンシー洗浄の例は、45℃で15分の1倍SSCである。デュープレックス（例えば100を超えるヌクレオチド）のための低ストリンジェンシー洗浄の例は、45℃で15分の4−6倍SSCである。短いプローブ（例えば約10から50ヌクレオチド）のためには、ストリンジェントな条件は典型的には約1.0M未満のNaイオン濃度、約0.01から1.0MのNaイオン濃度（又は他の塩）でpH7.0から8.3を含み、さらに温度は典型的には少なくとも約30℃である。ストリンジェントな条件はまた、脱安定化剤（例えばホルムアミド）の添加により達成できる。一般的には、個々のハイブリダイゼーションアッセイで無関係のプローブで観察されるシグナル対ノイズ比の2倍のシグナル対ノイズ比があれば、特異的なハイブリダイゼーションの検出を示す。ストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズしない核酸は、それらがコードするタンパク質が実質的に同一であるならばやはり実質的に同一である。前記は、例えば核酸のコピーが、遺伝暗号によって許容される最高のコドン縮退を用いて作成されるときに生じる。
本明細書で開示されるように、本発明は、植物又は植物細胞でヌクレオチド配列を改変する方法を提供し、前記改変は、アルファ-マンノシダーゼの酵素活性の低下、阻害又は実質的な阻害を示すか、或いはアルファマンノシダーゼの発現レベルの低下を示す植物をもたらす。酵素活性の低下、阻害若しくは実質的阻害、又は発現レベルの変化は、天然に存在する植物細胞、未改変植物細胞、又は本発明の方法によって改変されなかった植物細胞、コントロールとして用いることができるいずれかの植物細胞との比較である。そのようなコントロールに対する酵素活性又は発現レベルの比較は、当業界で公知の任意の方法によって実施できる。
当業界で公知の多くの方法を用いて、本発明のアルファマンノシダーゼのヌクレオチド配列を変異させることができる。遺伝子配列に変異をランダムに導入する方法は、化学的変異導入（EMS変異導入であるがただし前記に限定されない）及び放射線照射変異導入であり得るが、ただしこれらに限定されない。標的照準変異導入を遺伝子配列（例えばNtMNS1a、NtMNS1b又はNtMSN2遺伝子配列）に導入する方法には、多様なゲノム編集技術（特にジンクフィンガーヌクレアーゼ媒介変異導入）、文献（McCallum et al., Plant Physiol, June 2000, Vol. 123, pp. 439-442 and Henikoff et al., Plant Physiology 2004,135:630-636）記載のチリング（tilling；targeting induced local lesion in genomes（ゲノム内局所損傷誘導標的設定）、相同組換え、オリゴヌクレオチド特異的変異導入、及びメガヌクレアーゼ媒介変異導入が含まれるが、ただしこれらに限定されない。変異遺伝子配列スクリーニングのために当業界で公知の多くの方法を用いて、変異を同定又は確認することができる。
本発明の方法はしたがって、変異導入（例えば化学的変異導入又は放射線照射変異導入）の適用によって、植物細胞で本発明のアルファマンノシダーゼをコードする配列を改変する工程を含む。本発明の別の方法は、ゲノム編集技術（例えばジンクフィンガーヌクレアーゼ媒介変異導入、チリング（標的設定によるゲノム内局所損傷導入）、相同組換え、オリゴヌクレオチド特異的変異導入、及びメガヌクレアーゼ媒介変異導入が含まれるが、ただしこれらに限定されない）の適用によって、本発明のアルファマンノシダーゼをコードする配列内の標的部位を改変する工程を含む。
多数のアルファマンノシダーゼ、変種及び対立遺伝子が植物細胞内で活性を有し得ると仮定した場合、当該酵素活性の低下、実質的阻害又は完全な阻害を達成するためには、アルファマンノシダーゼをコードする2つ以上の遺伝子配列が当該植物細胞で改変されねばならない。本発明の好ましい実施態様では、改変は、当業界で公知の1つ以上のゲノム編集技術を適用することによって実施される。
本発明の改変植物細胞又は改変植物は、未改変植物又は植物細胞で生成されるアルファマンノシダーゼと異なる分子量を有するアルファマンノシダーゼ変異体の生成によって同定することができる。アルファマンノシダーゼ変異体は、未改変植物又は植物細胞で生成されるアルファマンノシダーゼの切端型又は伸長型であり、改変植物又は植物細胞の同定を補助するマーカーとして用いることができる。ポリペプチドの切端又は伸長は、典型的にはコード配列への終止コドンの導入又は読み枠内のシフト（また別の読み枠内の終止コドンの使用を生じる）によりもたらされる。また別には、そのようなアルファマンノシダーゼ変異体は、アルファマンノシダーゼゲノム配列のイントロン-エクソン境界内の変異（対応するイントロン-エクソン配列のスプライシングの変更をもたらす）から生じ得る。pre-mRNAのまた別のスプライシングは切端又は伸長され得る変異cDNAを生じ得る。伸長はポリペプチド配列の挿入であり得る。
2つ以上の改変アルファマンノシダーゼ遺伝子配列を含む改変植物又は植物細胞を作出するまた別の方法は2つの異なる植物を交雑する工程を必要とし、ここで前記2つの植物の各々は1つ以上の異なる改変アルファマンノシダーゼ遺伝子配列を含む。交雑に用いられる改変植物は、上記に記載の本発明の方法によって作出することができる。
上記に記載の交雑又はゲノム改変に用いられる改変植物及び植物細胞は、改変植物又は植物細胞における、（i）1つ以上のアルファマンノシダーゼの活性の低下又は非検出性；（ii）1つ以上のアルファマンノシダーゼの発現の低下又は非検出性；（iii）植物タンパク質又は異種タンパク質のN-グリカン上のアルファ-1,3-結合フコース、ベータ-1,2-結合キシロース又はその両方若しくはその残留物のレベルの低下又は非検出性；又は（iv）高マンノース型N-グリカンの増加又は蓄積によって同定又は選別できる。
本発明は随伴する特許請求の範囲に示す特徴及び実施態様に関する。
ある特徴では、NtNMS1a、NtMNS1b若しくはNtMNS2のゲノム配列、又は配列番号：１、配列番号：2、配列番号：32、配列番号：33、配列番号：63若しくは配列番号：64、又は前記の部分を有するヌクレオチド配列を含む、前記から成る、又は本質的に前記から成るポリヌクレオチドが提供される。ある実施態様では、本発明は、NtNMS1a、NtMNS1b若しくはNtMNS2のゲノム配列、又は配列番号：１、配列番号：2、配列番号：32、配列番号：33、配列番号：63若しくは配列番号：64、又は前記の部分と少なくとも76％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、前記から成る、又は本質的に前記から成るポリヌクレオチドに関する。本発明はまた、NtNMS1a、NtMNS1b、NtMNS2若しくはNtMan1.4の遺伝子配列、又は配列番号：30、配列番号：94、配列番号：61、配列番号：96、配列番号：92若しくは配列番号：98のいずれか、又は前記の部分を有するヌクレオチド配列を含む、前記から成る、又は本質的に前記から成るポリヌクレオチドを提供する。ある実施態様では、本発明は、NtNMS1a、NtMNS1b、NtMNS2若しくはNtMan1.4の遺伝子配列、又は配列番号：30、配列番号：94、配列番号：61、配列番号：96、配列番号：92若しくは配列番号：98のいずれか、又は前記の部分と少なくとも88％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、前記から成る、又は本質的に前記から成るポリヌクレオチドに関する。本発明はまた、NtNMS1a、NtMNS1b、NtMNS2若しくはNtMan1.4の1つ以上のコード配列、又は配列番号：31、配列番号：95、配列番号：62、配列番号：97、配列番号：93若しくは配列番号：99、又は前記の部分と少なくとも76％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、前記から成る、又は本質的に前記から成るポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、前記から成る、又は本質的に前記から成るポリヌクレオチドを提供する。本発明はまた、遺伝暗号の縮退によって前述のコード配列のヌクレオチド配列又はその部分から派生するポリヌクレオチドを提供する。本発明はまた、その相補鎖が、（i）−（iii）のいずれか、又は配列番号：3から29、配列番号：34から60若しくは配列番号：65から91のいずれかのヌクレオチド配列から成る核酸プローブとハイブリダイズするポリヌクレオチドを提供する。好ましくは、前述のポリヌクレオチドは、マンノース加水分解活性を示すポリペプチドをコードする。
本発明はまた以下の（i）−（iv）から成る群から選択されるポリペプチドを提供する：（i）配列番号：31、配列番号：95、配列番号：62、配列番号：97、配列番号：93又は配列番号：99に示す配列を有するアミノ酸配列を含む、前記から成る又は本質的に前記から成るポリペプチド又はその部分；（ii）配列番号：31、配列番号：95、配列番号：62、配列番号：97、配列番号：93又は配列番号：99に示す配列のいずれかと少なくとも76％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、前記から成る又は本質的に前記から成るポリペプチド又はその部分；（iii）請求項1の（i）−（v）に記載のヌクレオチド配列によって発現されるポリペプチド；（iv）配列番号：2、配列番号：30、配列番号：94、配列番号：33、配列番号：61、配列番号：96、配列番号：64、配列番号：92、配列番号：98に示すヌクレオチド配列、又はその部分によって発現されるポリペプチド。好ましくは、前述のポリペプチド又はその部分はマンノース加水分解活性を有する。
さらに別の特徴では、前述の配列を含むポリヌクレオチド又はポリペプチドのいずれかの、核酸分子又はポリペプチドと結合する分子を同定するための使用が提供される。さらにまた、配列番号：1から30、32から61、若しくは63から92；又は配列番号：94、96若しくは98のいずれかと特異的に結合する、デオキシリボ核酸オリゴヌクレオチド、リボ核酸オリゴヌクレオチド、ジンクフィンガーヌクレアーゼ又はメガヌクレアーゼが提供される。さらに別の特徴では、配列番号：31、配列番号：62若しくは配列番号：93、又は配列番号：95、97若しくは99と結合するポリペプチド、タンパク質、抗体又は抗体フラグメントが提供される。
ジンクフィンガーヌクレアーゼ媒介変異導入の一般的な使用は当業界で公知であり、特許公開公報、例えばWO02057293、WO02057294、WO0041566、WO0042219及びWO2005084190（ただしこれらに限定されない）（前記文献は参照によりその全体が本明細書に含まれる）に記載されている。メガヌクレアーゼ媒介変異導入の一般的な使用は当業界で公知であり、特許公開公報、例えばWO96/14408、WO2003025183、WO2003078619、WO2004067736、WO2007047859及びWO2009059195（ただしこれらに限定されない）（前記文献は参照によりその全体が本明細書に含まれる）に記載されている。
さらに別の特徴では、植物の少なくとも一部分でアルファマンノシダーゼIレベルを低下させる方法が提供される。前記方法は、NtMNS1a、NtMNS1b、NtMNS2若しくはNtMan1.4又は前記の組合せの発現、及びNtMNS1a、NtMNS1b、NtMNS2若しくはNtMan1.4ポリペプチド又は前記の組合せの活性、又はNtMNS1a、NtMNS1b、NtMNS2若しくはNtMan1.4遺伝子配列又は前記の組合せによってコードされるポリペプチドの活性を、NtMNS1a、NtMNS1b、NtMNS2若しくはNtMan1.4の発現又はNtMNS1a、NtMNS1b、NtMNS2若しくはNtMan1.4タンパク質若しくはポリペプチドの活性が低下していないコントロール植物と比較して低下させる工程を含む。
ある特徴では、植物の少なくとも一部分でアルファマンノシダーゼIレベルを低下させる方法が提供され、前記方法は、NtMNS1a、NtMNS1b、NtMNS2及びNtMan1.4の発現又はNtMNS1a、NtMNS1b、NtMNS2及びNtMan1.4タンパク質若しくはポリペプチドの活性が低下していないコントロール植物と比較して、以下を低下させる工程を含む：
a）NtMNS1a及びNtMNS1bの発現並びにNtMNS1a及びNtMNS1bポリペプチドの活性、又はNtMNS1a及びNtMNS1b遺伝子配列によってコードされるポリペプチドの活性；又は
b）NtMNS1a及びNtMNS2の発現並びにNtMNS1a及びNtMNS2ポリペプチドの活性、又はNtMNS1a及びNtMNS2遺伝子配列によってコードされるポリペプチドの活性；又は
c）MtNMS1a及びNtMan1.4の発現並びにMtNMS1a及びNtMan1.4ポリペプチドの活性、又はMtNMS1a及びNtMan1.4遺伝子配列によってコードされるポリペプチドの活性；又は
d）NtMNS1b及びNtMNS2の発現並びにNtMNS1b及びNtMNS2ポリペプチドの活性、又はNtMNS1b及びNtMNS2遺伝子配列によってコードされるポリペプチドの活性；又は
e）NtMNS1b及びNtMan1.4の発現並びにNtMNS1b及びNtMan1.4ポリペプチドの活性、又はNtMNS1b及びNtMan1.4遺伝子配列によってコードされるポリペプチドの活性；又は
f）NtMNS2及びNtMan1.4の発現並びにNtMNS2及びNtMan1.4ポリペプチドの活性、又はNtMNS2及びNtMan1.4遺伝子配列によってコードされるポリペプチドの活性。
ある特徴では、植物の少なくとも一部分でアルファマンノシダーゼIレベルを低下させる方法が提供され、前記方法は、NtMNS1a、NtMNS1b、NtMNS2及びNtMan1.4の発現又はNtMNS1a、NtMNS1b、NtMNS2及び NtMan1.4タンパク質若しくはポリペプチドの活性が低下していないコントロール植物と比較して、以下を低下させる工程を含む：
a）NtMNS1a及びNtMNS1b及びNtMNS2の発現並びにNtMNS1a及びNtMNS1b及びNtMNS2ポリペプチドの活性、又はNtMNS1a及びNtMNS1b及びNtMNS2遺伝子配列によってコードされるポリペプチドの活性；又は
b）NtMNS1a及びNtMNS2及びNtMan1.4の発現並びにNtMNS1a及びNtMNS2及びNtMan1.4ポリペプチドの活性、又はNtMNS1a及びNtMNS2及びNtMan1.4遺伝子配列によってコードされるポリペプチドの活性；又は
c）MtNMS1a及びNtMNS1b及びNtMan1.4の発現並びにMtNMS1a及びNtMNS1b及びNtMan1.4ポリペプチドの活性、又はMtNMS1a及びNtMNS1b及びNtMan1.4遺伝子配列によってコードされるポリペプチドの活性；又は
d）NtMNS1b及びNtMNS2及びNtMan1.4の発現並びにNtMNS1b及びNtMNS2及びNtMan1.4ポリペプチドの活性、又はNtMNS1b及びNtMNS2及びNtMan1.4遺伝子配列によってコードされるポリペプチドの活性。
ある特徴では、植物の少なくとも一部分でアルファマンノシダーゼIレベルを低下させる方法が提供され、前記方法は、NtMNS1a、NtMNS1b、NtMNS2及びNtMan1.4の発現又はNtMNS1a、NtMNS1b、NtMNS2及びNtMan1.4タンパク質若しくはポリペプチドの活性が低下していないコントロール植物と比較して、NtMNS1a及びNtMNS1b及びNtMNS2及びNtMan1.4の発現並びにNtMNS1a及びNtMNS1b及びNtMNS2及びNtMan1.4ポリペプチドの活性、又はNtMNS1a及びNtMNS1b及びNtMNS2及びNtMan1.4遺伝子配列によってコードされるポリペプチドの活性を低下させる工程を含む。
具体的な特徴では、本発明の及び本明細書の先行する実施態様に記載の植物細胞のアルファマンノシダーゼI活性を低下させる方法が提供される。前記方法は、植物細胞のゲノム中のポリヌクレオチド配列を改変し、植物細胞の核ゲノムにおいて、NtMNS1a、NtMNS1b、NtMNS2又はNtMan1.4ポリペプチドの活性を低下させる工程を含み、ここで、前記ポリヌクレオチド配列は以下を含む：（i）配列番号：1から30、32から61又は63から92に示されるヌクレオチド配列、（ii）配列番号：1から30、32から61又は63から92に示されるヌクレオチド配列に示されるヌクレオチド配列と少なくとも50％、55％、60％、70％、71％、72％、73％、特に少なくとも74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％又は99％同一であるヌクレオチド配列、（iii）（i）若しくは（ii）又はその相補鎖のヌクレオチド配列から成るポリヌクレオチドプローブが、特にストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるヌクレオチド配列。別の特徴では、植物細胞のアルファマンノシダーゼI活性を低下させる方法が提供され、前記方法は、配列番号：1から30、32から61若しくは63から92、又は配列番号：94、96若しくは98のいずれかのポリヌクレオチド又は前記のフラグメントを植物細胞に、センス又はアンチセンスの向きで発現できる態様で導入し、NtMNS1a、NtMNS1b、NtMNS2又はNtMan1.4ポリペプチドの活性を低下させる工程を含む。
別の特徴では、植物細胞のアルファマンノシダーゼI活性を低下させる方法が提供され、前記方法は、配列番号：1から30、32から61若しくは63から92、又は配列番号：94、96若しくは98のいずれかと相補的な又は部分的に相補的なリボ核酸を植物細胞に導入するか、又は植物細胞で発現させて、NtMNS1a、NtMNS1b、NtMNS2又はNtMan1.4ポリペプチドの活性を低下させる工程を含む。
別の特徴では、植物細胞のアルファマンノシダーゼI活性を低下させる方法が提供され、前記方法は、配列番号：1から30、32から61若しくは63から92、又は配列番号：94、96若しくは98のいずれかと相補的な又は部分的に相補的なリボ核酸を植物細胞に導入するか、又は植物細胞で発現させて、NtMNS1a及びNtMNS1bポリペプチドの活性、又はNtMNS1a及びNtMNS2ポリペプチドの活性、又はNtMNS1a及びNtMan1.4ポリペプチドの活性、又はNtMNS1b及びNtMNS2ポリペプチドの活性、又はNtMNS1b及びNtMan1.4ポリペプチドの活性、又はNtMNS2及びNtMan1.4ポリペプチドの活性を低下させる工程を含む。
別の特徴では、植物細胞のアルファマンノシダーゼI活性を低下させる方法が提供され、前記方法は、配列番号：1から30、32から61若しくは63から92、又は配列番号：94、96若しくは98のいずれかと相補的な又は部分的に相補的なリボ核酸を植物細胞に導入するか、又は植物細胞で発現させて、NtMNS1a及びNtMNS1bポリペプチドの活性、又はNtMNS1a及びNtMNS2ポリペプチドの活性、又はNtMNS1a及びNtMan1.4ポリペプチドの活性、又はNtMNS1b及びNtMNS2ポリペプチドの活性、又はNtMNS1b及びNtMan1.4ポリペプチドの活性、又はNtMNS2及びNtMan1.4ポリペプチドの活性を低下させる工程を含む。
別の特徴では、植物細胞のアルファマンノシダーゼI活性を低下させる方法が提供され、前記方法は、配列番号：1から30、32から61若しくは63から92、又は配列番号：94、96若しくは98のいずれかと相補的な又は部分的に相補的なリボ核酸を植物細胞に導入するか、又は植物細胞で発現させて、NtMNS1a及びNtMNS1b及びNtMNS2及びNtMan1.4ポリペプチドの活性を低下させる工程を含む。
別の特徴では、植物細胞のアルファマンノシダーゼI活性を低下させる方法が提供され、前記方法は、配列番号：1から99のいずれかと特異的に結合する分子を植物細胞に導入する工程を含む。
さらに別の特徴では、植物細胞のアルファマンノシダーゼI活性を低下させる方法が提供され、前記方法は、配列番号：1から30、32から61若しくは63から92、又は配列番号：94、96若しくは98のいずれかと特異的に結合するデオキシリボ核酸オリゴヌクレオチド、リボ核酸オリゴヌクレオチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体若しくは抗体フラグメント、ジンクフィンガータンパク質又はメガヌクレアーゼ；又は配列番号：31、配列番号：62若しくは配列番号：93、又は配列番号：95、配列番号：97若しくは配列番号：99と結合するポリペプチド、タンパク質、抗体若しくは抗体フラグメントを植物細胞に導入し、NtMNS1a、NtMNS1b、NtMNS2又はNtMan1.4の活性を低下させる工程を含む。
さらに別の特徴では、植物細胞のアルファマンノシダーゼI活性を低下させる方法が提供され、前記方法は、配列番号：1から30、32から61若しくは63から92、又は配列番号：94、96若しくは98のいずれかと特異的に結合するデオキシリボ核酸オリゴヌクレオチド、リボ核酸オリゴヌクレオチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体若しくは抗体フラグメント、ジンクフィンガータンパク質又はメガヌクレアーゼ；又は配列番号：31、配列番号：62若しくは配列番号：93、又は配列番号：95、配列番号：97若しくは配列番号：99と結合するポリペプチド、タンパク質、抗体若しくは抗体フラグメントを植物細胞に導入し、NtMNS1a及びNtMNS1bポリペプチドの活性、又はNtMNS1a及びNtMNS2ポリペプチドの活性、又はNtMNS1a及びNtMan1.4ポリペプチドの活性、又はNtMNS1b及びNtMNS2ポリペプチドの活性、又はNtMNS1b及びNtMan1.4ポリペプチドの活性、又はNtMNS2及びNtMan1.4ポリペプチドの活性を低下させる工程を含む。
さらに別の特徴では、植物細胞のアルファマンノシダーゼI活性を低下させる方法が提供され、前記方法は、配列番号：1から30、32から61若しくは63から92、又は配列番号：94、96若しくは98のいずれかと特異的に結合するデオキシリボ核酸オリゴヌクレオチド、リボ核酸オリゴヌクレオチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体若しくは抗体フラグメント、ジンクフィンガータンパク質又はメガヌクレアーゼ；又は配列番号：31、配列番号：62若しくは配列番号：93、又は配列番号：95、配列番号：97若しくは配列番号：99と結合するポリペプチド、タンパク質、抗体若しくは抗体フラグメントを植物細胞に導入し、NtMNS1a及びNtMNS1b及びNtMNS2ポリペプチドの活性、又はNtMNS1a及びNtMNS2及びNtMan1.4ポリペプチドの活性、又はNtMNS1a及びNtMNS1b及びNtMan1.4ポリペプチドの活性、又はNtMNS1b及びNtMNS2及びNtMan1.4ポリペプチドの活性を低下させる工程を含む。
さらに別の特徴では、植物細胞のアルファマンノシダーゼI活性を低下させる方法が提供され、前記方法は、配列番号：1から30、32から61若しくは63から92、又は配列番号：94、96若しくは98のいずれかと特異的に結合するデオキシリボ核酸オリゴヌクレオチド、リボ核酸オリゴヌクレオチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体若しくは抗体フラグメント、ジンクフィンガータンパク質又はメガヌクレアーゼ；又は配列番号：31、配列番号：62若しくは配列番号：93、又は配列番号：95、配列番号：97若しくは配列番号：99と結合するポリペプチド、タンパク質、抗体若しくは抗体フラグメントを植物細胞に導入し、NtMNS1a及びNtMNS1b及びNtMNS2及びNtMan1.4ポリペプチドの活性を低下させる工程を含む。
さらに別の特徴では、植物の少なくとも一部分でアルファマンノシダーゼIレベルを増加させる方法が提供され、前記方法は、NtMNS1a、NtMNS1b、NtMNS2若しくはNtMan1.4又は前記の組合せの発現、及びNtMNS1a、NtMNS1b、NtMNS2若しくはNtMan1.4ポリペプチド又は前記の組合せの活性、又はNtMNS1a、NtMNS1b、NtMNS2若しくはNtMan1.4遺伝子配列又は前記の組合せによってコードされるポリペプチドの活性を、NtMNS1a、NtMNS1b、NtMNS2及びNtMan1.4の発現及びNtMNS1a、NtMNS1b、NtMNS2及びNtMan1.4タンパク質又はポリペプチドの活性が改変されていないコントロール植物と比較して増加させる工程を含む。
ある特徴では、植物の少なくとも一部分でアルファマンノシダーゼIレベルを増加させる方法が提供され、前記方法は、NtMNS1a、NtMNS1b、NtMNS2及びNtMan1.4の発現、又はNtMNS1a、NtMNS1b、NtMNS2及びNtMan1.4タンパク質又はポリペプチドの活性が改変されていないコントロール植物と比較して以下を増加させる工程を含む：
a）NtMNS1a及びNtMNS1bの発現並びにNtMNS1a及びNtMNS1bポリペプチドの活性；又は NtMNS1a及びNtMNS1b遺伝子配列によってコードされるポリペプチドの活性；又は
b）NtMNS1a及びNtMNS2の発現並びにNtMNS1a及びNtMNS2ポリペプチドの活性；又は NtMNS1a及びNtMNS2遺伝子配列によってコードされるポリペプチドの活性；又は
c）NtMNS1a及びNtMan1.4の発現並びにNtMNS1a及びNtMan1.4ポリペプチドの活性；又は NtMNS1a及びNtMan1.4遺伝子配列によってコードされるポリペプチドの活性；又は
d）NtMNS1b及びNtMNS2の発現並びにNtMNS1b及びNtMNS2ポリペプチドの活性；又は NtMNS1b及びNtMNS2遺伝子配列によってコードされるポリペプチドの活性；又は
e）NtMNS1b及びNtMan1.4の発現並びにNtMNS1b及びNtMan1.4ポリペプチドの活性；又は NtMNS1b及びNtMan1.4遺伝子配列によってコードされるポリペプチドの活性；又は
ｆ）NtMNS2及びNtMan1.4の発現並びにNtMNS2及びNtMan1.4ポリペプチドの活性；又は NtMNS2及びNtMan1.4遺伝子配列によってコードされるポリペプチドの活性。
ある特徴では、植物の少なくとも一部分でアルファマンノシダーゼIレベルを増加させる方法が提供され、前記方法は、NtMNS1a、NtMNS1b、NtMNS2及びNtMan1.4の発現、又はNtMNS1a、NtMNS1b、NtMNS2及びNtMan1.4タンパク質又はポリペプチドの活性が改変されていないコントロール植物と比較して以下を増加させる工程を含む：
a）NtMNS1a及びNtMNS1b及びNtMNS2の発現並びにNtMNS1a及びNtMNS1b及びNtMNS2ポリペプチドの活性；又は NtMNS1a及びNtMNS1b及びNtMNS2遺伝子配列によってコードされるポリペプチドの活性；又は
b）NtMNS1a及びNtMNS2及びNtMan1.4の発現並びにNtMNS1a及びNtMNS2及びNtMan1.4ポリペプチドの活性；又は NtMNS1a及びNtMNS2及びNtMan1.4遺伝子配列によってコードされるポリペプチドの活性；又は
c）NtMNS1a及びNtMNS1b及びNtMan1.4の発現並びにNtMNS1a及びNtMNS1b及びNtMan1.4ポリペプチドの活性；又は NtMNS1a及びNtMNS1b及びNtMan1.4遺伝子配列によってコードされるポリペプチドの活性；又は
d）NtMNS1b及びNtMNS2及びNtMan1.4の発現並びにNtMNS1b及びNtMNS2及びNtMan1.4ポリペプチドの活性；又は NtMNS1b及びNtMNS2及びNtMan1.4遺伝子配列によってコードされるポリペプチドの活性。
ある特徴では、植物の少なくとも一部分でアルファマンノシダーゼIレベルを増加させる方法が提供され、前記方法は、NtMNS1a、NtMNS1b、NtMNS2及びNtMan1.4の発現、又はNtMNS1a、NtMNS1b、NtMNS2及びNtMan1.4タンパク質又はポリペプチドの活性が改変されていないコントロール植物と比較して、NtMNS1a及びNtMNS1b及びNtMSN2及びNtMan1.4の発現並びにNtMNS1a及びNtMNS1b及びNtMNS2及びNtMan1.4ポリペプチドの活性、又は NtMNS1a及びNtMNS1b及びNtMNS2及びNtMan1.4遺伝子配列によってコードされるポリペプチドの活性を増加させる工程を含む。
具体的な特徴では、本発明の及び本明細書の先行する実施態様に記載の植物細胞のアルファマンノシダーゼI活性を低下させる方法が提供される。前記方法は、ゲノム編集又はゲノム操作技術（前記技術はジンクフィンガーヌクレアーゼ媒介変異導入、化学的誘導変異導入、放射線照射変異導入、相同組換え、オリゴヌクレオチド媒介変異導入又はメガヌクレアーゼ媒介変異導入を含むリストから選択される）によって、植物細胞のゲノム中のポリヌクレオチド配列を改変する工程を含み、ここで、前記ポリヌクレオチド配列は以下のポリヌクレオチド配列を含む：（i）配列番号：1、配列番号：32又は配列番号：63に示されるヌクレオチド配列、（ii）配列番号：1、配列番号：32又は配列番号：63に示されるヌクレオチド配列と少なくとも50％、55％、60％、70％、71％、72％、73％、特に少なくとも74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％又は99％同一であるヌクレオチド配列、（iii）（i）若しくは（ii）又はその相補鎖のヌクレオチド配列から成るポリヌクレオチドプローブが、特にストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるヌクレオチド配列。
ある特徴では、本発明は、以下の（a）−（e）のヌクレオチド配列において標的部位を同定して改変するための、本明細書で多様な実施態様に規定の本発明のヌクレオチド配列又はその部分の使用に関し、前記改変は、非改変植物細胞と対比して当該改変を含む改変植物細胞内のアルファ-マンノシダーゼIの活性又は発現が変化するような改変であり、ここで前記アルファ-マンノシダーゼIは、NtMNS1a、NtMNS1b、NtMNS2及びNtMan1.4から成る群から選択され、さらに以下の第一、第二、第三及び第四の標的アルファ-マンノシダーゼIは互いに異なっている：
（a）アルファ-マンノシダーゼIのコード配列を含むゲノム領域内の第一の標的ヌクレオチド配列；又は
（b）アルファ-マンノシダーゼIのコード配列を含むゲノム領域内のa）の第一の標的ヌクレオチド配列及び第二の標的ヌクレオチド配列；又は
（c）アルファ-マンノシダーゼIのコード配列を含むゲノム領域内のa）の第一の標的ヌクレオチド配列、b）の第二の標的ヌクレオチド配列及び第三の標的ヌクレオチド配列；
（d）アルファ-マンノシダーゼIのコード配列を含むゲノム領域内のa）の第一の標的ヌクレオチド配列、b）の第二の標的ヌクレオチド配列、c）の第三の標的ヌクレオチド配列及び第四の標的ヌクレオチド配列；
（e）a）、b）、c）及びd）の全ての標的ヌクレオチド配列。
本発明の具体的な特徴では、本発明の及び本明細書で多様な実施態様に記載の改変ニコチアナ・タバクムの植物細胞又はニコチアナ・タバクムの植物の第一、第二、第三及び／又は第四の標的ヌクレオチド配列は、（i）配列番号：1から30、32から61若しくは63から92、又は配列番号：94、96若しくは98、特に配列番号：1、配列番号：2、配列番号：32、配列番号：33、配列番号：63若しくは配列番号：64、又は前記の部分と少なくとも76％の配列同一性；（ii）配列番号：1から30、32から61若しくは63から92、又は配列番号：94、96若しくは98、特に配列番号：30、配列番号：94、配列番号：61、配列番号：96、配列番号：92若しくは配列番号：98、又は前記の部分と少なくとも88％の配列同一性を有する。
本発明の別の具体的な特徴では、本発明の及び本明細書で多様な実施態様に記載の改変ニコチアナ・タバクムの植物細胞又はニコチアナ・タバクムの植物の第一、第二、第三及び／又は第四の標的ヌクレオチド配列は、（i）配列番号：1から30、32から61若しくは63から92、又は配列番号：94、96若しくは98、特に配列番号：1、配列番号：2、配列番号：32、配列番号：33、配列番号：63若しくは配列番号：64、又は前記の部分；（ii）配列番号：30、配列番号：94、配列番号：61、配列番号：96、配列番号：92若しくは配列番号：98、又はその部分を含む、本質的に前記を含む、又は前記から成る。
具体的な特徴では、本発明の及び本明細書で多様な実施態様に記載のヌクレオチド配列は、本明細書に規定のヌクレオチド配列内の部位でゲノムDNA分子を選択的に切断する非天然のメガヌクレアーゼを作製するために用いることができる。
別の具体的な特徴では、本明細書で多様な実施態様に記載のヌクレオチド配列は、本明細書に規定の標的ヌクレオチド配列の少なくとも1つに二本鎖ブレークを導入するジンクフィンガーヌクレアーゼを作製するために用いることができる。
さらに別の特徴では、アルファマンノシダーゼI活性が変化した、特にアルファマンノシダーゼ活性が低下又は増加した植物細胞、特に本明細書で多様な実施態様に記載した本発明の方法により得られる植物細胞が提供される。
特に本発明は、遺伝的に改変されたニコチアナ・タバクムの植物細胞又は前記改変植物細胞を含むニコチアナ・タバクムの植物に関し、ここで前記改変植物細胞は、NtMNS1a、NtMNS1b、NtMNS2及びNtMan1.4及び／又は対立遺伝子変種から成る群から選択されるアルファマンノシダーゼIのコード配列を含むゲノム領域内の第一の標的ヌクレオチド配列の少なくとも1つの改変を含み、前記改変は、（i）非改変植物細胞と対比して改変植物細胞内のアルファ-マンノシダーゼIの活性又は発現が変化するような改変である。
ある特徴では、前記改変ニコチアナ・タバクム植物細胞又はニコチアナ・タバクム植物は、（a）第一の標的ヌクレオチド配列の改変に加えて、（b）アルファマンノシダーゼIのコード配列を含むゲノム領域内の第二の標的ヌクレオチド配列の少なくとも1つの改変、又は（c）アルファマンノシダーゼIのコード配列を含むゲノム領域内の第三の標的ヌクレオチド配列の少なくとも1つの改変、又は（d）アルファマンノシダーゼIのコード配列を含むゲノム領域内の第四の標的ヌクレオチド配列の少なくとも1つの改変、又は（a）及び（b）、（a）及び（c）、（a）及び（d）、（b）及び（c）、（b）及び（d）、又は（c）及び（d）の組合せ；又は（a）及び（b）及び（c）、（a）及び（b）及び（d）、（a）及び（c）及び（d）、又は（b）及び（c）及び（d）の組合せ；又は（a）及び（b）及び（c）及び（d）の組合せを含み、ここで、前記アルファマンノシダーゼIは、NtMNS1a、NtMNS1b、NtMNS2及びNtMan1.4から成る群から選択され、さらに第一、第二、第三及び第四のアルファマンノシダーゼIは互いに異なっている。
本発明の具体的な特徴では、本発明の及び本明細書で多様な実施態様に記載の改変ニコチアナ・タバクム植物細胞又はニコチアナ・タバクム植物の第一、第二、第三及び／又は第四の標的ヌクレオチド配列は、（i）配列番号：1から30、32から61若しくは63から92、又は配列番号：94、96若しくは98、特に配列番号：1、配列番号：2、配列番号：32、配列番号：33、配列番号：63若しくは配列番号：64、又は前記の部分と少なくとも76％の配列同一性；（ii）配列番号：1から30、32から61若しくは63から92、又は配列番号：94、96若しくは98、特に配列番号：30、配列番号：94、配列番号：61、配列番号：96、配列番号：92若しくは配列番号：98、又は前記の部分と少なくとも88％の配列同一性を有する。
本発明の別の具体的な特徴では、本発明の及び本明細書で多様な実施態様に記載の改変ニコチアナ・タバクム植物細胞又はニコチアナ・タバクム植物の第一、第二、第三及び／又は第四の標的ヌクレオチド配列は、（i）配列番号：1から30、32から61若しくは63から92、又は配列番号：94、96若しくは98、特に配列番号：1、配列番号：2、配列番号：32、配列番号：33、配列番号：63若しくは配列番号：64、又は前記の部分；（ii）配列番号：30、配列番号：94、配列番号：61、配列番号：96、配列番号：92若しくは配列番号：98、又は前記の部分を含む、本質的に前記を含む、又は前記から成る。
本発明の多様な実施態様では、本発明の及び本明細書で多様な実施態様に記載の改変ニコチアナ・タバクム植物細胞又はニコチアナ・タバクム植物が提供され、ここで、前記改変植物細胞のアルファマンノシダーゼIの活性又は発現は、非改変植物細胞と対比して（a）低下又は（b）増加する。
さらにまた本発明に含まれるものは、本発明の及び本明細書で多様な実施態様に記載の改変ニコチアナ・タバクム植物から入手できる子孫であり、ここで、前記子孫植物は本発明の及び本明細書で多様な実施態様に記載の標的配列の少なくとも１つにおける改変を含み、そのアルファマンノシダーゼIの活性又は発現は、非改変植物細胞と対比して変化し、特に増加又は低下する。
コントロール植物と比較した活性の増加は約5から約100％であるか、又は少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも25％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％又は100％以上、例えば200％又は300％以上であり得る（前記は転写活性若しくはタンパク質の発現における増加又はその両方の増加を含む）。
コントロール植物と比較した活性の低下は約5から約100％であるか、又は少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも25％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％又は100％であり得る（前記は転写活性若しくはタンパク質の発現における増加又はその両方の増加を含む）。
コントロール植物と比較したマンノース含有量の増加は約5から約100％であるか、又は少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも25％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％若しくは100％まで、又は100％以上、例えば200％又は300％以上であり得る。
コントロール植物と比較したマンノース含有量の低下は約5から約100％であるか、又は少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも25％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％又は100％まであり得る。
さらに別の特徴では、コントロール植物と比較して改変されたアルファマンノシダーゼ活性及び低下又は増加したアルファマンノシダーゼ活性Iを有する、非天然又は改変アルファルファ、アオウキクサ、イネ、トウモロコシ又はニンジンの植物細胞、又はニコチアナ属（特にニコチアナ・ベンタミアナ（Nicotiana benthamiana）、N.シルベストリス（sylvestris）、N.エクセルシア（excelsior）、N.エクシグア（exigua）、N.トメントシホルミス（tomentosiformis）、N.ルスチカ（rustica）、N.オトフォラ（otophora）若しくはN.タバクム（tabacum）又はその品種、系統、選抜品種若しくは栽培品種）に属する植物の植物細胞、特に本明細書で多様な実施態様に記載した本発明の方法から得られる植物細胞が提供される。
ある実施態様では、本発明の及び本明細書で多様な実施態様に記載の改変された（すなわち遺伝的に改変された）ニコチアナ・タバクム植物細胞又は前記改変植物細胞を含むニコチアナ・タバクム植物（その子孫を含む）は、ニコチアナ・タバクム栽培品種PM132である。その種子は、アクセッション番号NCIMB41802で2011年1月6日にNCIMB Ltd（ブダペスト条約による国際寄託機関である（住所：Ferguson Building, Craibstone Estate, Bucksburn, Aberdeen, AB21 9YA（英国））に寄託された。別の実施態様では、本発明の及び本明細書で多様な実施態様に記載の改変された（すなわち遺伝的に改変された）ニコチアナ・タバクム植物細胞又は前記改変植物細胞を含むニコチアナ・タバクム植物（その子孫を含む）は以下である：ニコチアナ・タバクム系統PM016（その種子は、アクセッション番号NCIMB41798で寄託された）、ニコチアナ・タバクム系統PM021（その種子は、アクセッション番号NCIMB41799で寄託された）、ニコチアナ・タバクム系統PM092（その種子は、アクセッション番号NCIMB41800で寄託された）、ニコチアナ・タバクム系統PM102（その種子は、アクセッション番号NCIMB41801で寄託された）、ニコチアナ・タバクム系統PM204（その種子は、2011年1月6日にアクセッション番号NCIMB41803でNCIMB Ltdに寄託された）、ニコチアナ・タバクム系統PM205（その種子は、アクセッション番号NCIMB41804で寄託された）、ニコチアナ・タバクム系統PM215（その種子は、アクセッション番号NCIMB41805で寄託された）、ニコチアナ・タバクム系統PM216（その種子は、アクセッション番号NCIMB41806で寄託された）、及びニコチアナ・タバクム系統PM217（その種子は、アクセッション番号NCIMB41807で寄託された）。
本明細書でさらに提供されるものは、ヒト化糖タンパク質を産生することができる改変植物細胞を含むニコチアナ・タバクム植物細胞又はニコチアナ・タバクム植物を作出する方法である。前記方法は、（i）タバコの植物細胞のゲノムにおいて、（a）アルファ-マンノシダーゼIのコード配列を含むゲノム領域内の第一の標的ヌクレオチド配列；又は（b）アルファ-マンノシダーゼIのコード配列を含むゲノム領域内のa）の第一の標的ヌクレオチド配列及び第二の標的ヌクレオチド配列；又は（c）アルファ-マンノシダーゼIのコード配列を含むゲノム領域内のa）の第一の標的ヌクレオチド配列、b）の第二の標的ヌクレオチド配列及び第三の標的ヌクレオチド配列；（d）アルファ-マンノシダーゼIのコード配列を含むゲノム領域内のa）の第一の標的ヌクレオチド配列、b）の第二の標的ヌクレオチド配列、c）の第三の標的ヌクレオチド配列及び第四の標的ヌクレオチド配列；a）、b）、c）及びd）の全ての標的ヌクレオチド配列を改変する工程；
（ii）前記標的ヌクレオチド配列内に前記改変を含む改変植物又は植物細胞を同定し、さらに場合によって選別する工程；
（iii）前記改変植物を別のニコチアナ植物とともに繁殖させる工程を含み、
ここで、前記アルファ-マンノシダーゼIは、NtMNS1a、NtMNS1b、NtMNS2、及びNtMan1.4から成る群から選択され、前記第一、第二、第三及び第四の標的アルファ-マンノシダーゼIは互いに異なり、さらに非改変植物細胞と対比して前記改変を含む改変植物細胞内のアルファ-マンノシダーゼIの活性又は発現は、前記改変植物細胞により生成される糖タンパク質が未改変植物細胞から入手される糖タンパク質と比較してそのN-グリカンにアルファ-1,3-結合フコース及びベータ-1,2-結合キシロースを実質的に欠くように変化している。
具体的な特徴では、第一、第二、第三及び／又は第四の標的ヌクレオチド配列は、（i）配列番号：1から30、32から61若しくは63から92、又は配列番号：94、96若しくは98、特に配列番号：1、配列番号：2、配列番号：32、配列番号：33、配列番号：63若しくは配列番号：64、又は前記の部分と少なくとも76％の配列同一性；（ii）配列番号：1から30、32から61若しくは63から92、又は配列番号：94、96若しくは98、特に配列番号：30、配列番号：94、配列番号：61、配列番号：96、配列番号：92若しくは配列番号：98、又は前記の部分と少なくとも88％の配列同一性を有する。
本発明の別の具体的な特徴では、第一、第二、第三及び／又は第四の標的ヌクレオチド配列は、（i）配列番号：1から30、32から61若しくは63から92、又は配列番号：94、96若しくは98、特に配列番号：1、配列番号：2、配列番号：32、配列番号：33、配列番号：63若しくは配列番号：64、又は前記の部分；（ii）配列番号：30、配列番号：94、配列番号：61、配列番号：96、配列番号：92若しくは配列番号：98、又は前記の部分を含む、本質的に前記を含む、又は前記から成る。
タバコの植物又は植物細胞のゲノムの改変は以下の工程を含むことが本明細書ではさらに意図される：
（a）ニコチアナ・タバクムの植物又は植物細胞の標的ヌクレオチド配列において、さらに場合によって少なくとも1つのその対立遺伝子変種において、標的部位を同定する工程；
（b）前記標的部位を認識し、さらに前記標的部位で又はその近くで結合することができる変異原性オリゴヌクレオチドを、請求項8又は9に規定のヌクレオチド配列を土台にしてデザインする工程；及び
（c）前記ゲノムが改変される条件下で、前記変異原性オリゴヌクレオチドをタバコの植物又は植物細胞のゲノム内の標的ヌクレオチド配列と結合させる工程。
さらに別の特徴では、以下の工程を含む、糖タンパク質を製造する方法が提供される：コントロール植物と比較してアルファマンノシダーゼI活性が増加若しくは低下した非天然又は改変細胞、特に本明細書で多様な実施態様に記載した本発明の植物細胞に標的糖タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含む発現構築物を導入する工程、標的糖タンパク質を製造するために十分な時間前記植物細胞を培養する工程、及び場合によって前記植物細胞から植物を再生する工程、又は改変植物細胞又は前記改変植物細胞を含む植物から糖タンパク質を採集する工程。
具体的な特徴では、本発明は、以下の工程を含む異種タンパク質を製造する方法に関する：
（a）異種糖タンパク質、特にワクチン製造用抗原、サイトカイン、ホルモン、凝固タンパク質、アポリポタンパク質、ヒトの代替治療法のための酵素、免疫グロブリン又はそのフラグメントをコードするヌクレオチド配列を含む発現構築物を、請求項1から6のいずれか1項に規定の改変ニコチアナ・タバクムの植物細胞又は植物に導入し、さらに前記発現構築物を含む改変植物細胞を、前記異種糖タンパク質が生成されるように培養する工程（ここで、前記糖タンパク質は、非改変植物細胞から得られる糖タンパク質と比較してそのN-グリカンにアルファ-1,3-結合フコース及びベータ-1,2-結合キシロースを実質的に欠く）、（b）場合によって前記植物細胞から植物を再生し、さらに前記植物及びその子孫を生育させる工程、及び（c）場合によって前記糖タンパク質を採集する工程。
さらに別の特徴では、改変植物細胞又は改変植物細胞を含む植物、特に本発明の及び本明細書で多様な実施態様に記載の改変植物細胞又は改変植物細胞を含む植物から入手される糖タンパク質を含み、前記糖タンパク質が、コントロール植物から得られる同じ糖タンパク質と比較して前記糖タンパク質のN-グリカンにマンノース量の増加又は低下を有することを特徴とする、植物組成物が提供される。具体的な特徴では、本発明は、本明細書で多様な実施態様に規定する改変植物細胞を含む植物から入手できる異種糖タンパク質を含む植物組成物を提供し、ここで、前記糖タンパク質は、未改変植物細胞から得られる糖タンパク質と比較して、そのN-グリカンにアルファ-1,3-結合フコース及びベータ-1,2-結合キシロースを実質的に欠いている。
さらに別の特徴では、前記糖タンパク質を含む植物組成物から、及び改変植物細胞又は改変植物細胞を含む植物から、特に本発明の及び本明細書で多様な実施態様に記載の改変植物細胞又は改変植物細胞を含む植物から入手され、前記糖タンパク質が、アルファマンノシダーゼI活性が正常レベルのコントロール植物から得られる同じ糖タンパク質と比較して前記糖タンパク質のN-グリカンにマンノース量の増加又は低下を有することを特徴とする、実質的に純粋な糖タンパク質が提供される。
本発明のある実施態様では、ある植物細胞で第一のアルファマンノシダーゼ又はそのフラグメントをコードする第一の遺伝子配列が改変され、続いて前記第一のアルファマンノシダーゼの活性の低下を示す改変植物が同定又は単離される。改変された第一のアルファマンノシダーゼ遺伝子を含む改変植物細胞は続いて変異導入に付され、第二のアルファマンノシダーゼ又はそのフラグメントをコードする第二の遺伝子配列が改変される。この工程に続いて、第二のアルファマンノシダーゼ活性の低下を示すか、又は第一の改変のみを保有する細胞のアルファマンノシダーゼ活性と対比してアルファマンノシダーゼ活性の更なる低下を示す改変植物細胞が同定又は単離される。改変植物細胞は同定後に単離できる。この段階で入手される改変植物細胞は、2つのアルファマンノシダーゼ、又はアルファマンノシダーゼの2つの変種若しくは対立遺伝子をコードする2つの遺伝子配列に2つの改変を含む。
本発明の別の実施態様では、ある植物細胞で第一のアルファマンノシダーゼI又はそのフラグメントをコードする第一の遺伝子配列が改変され、さらに別の植物細胞で第二のアルファマンノシダーゼI又はそのフラグメントをコードする第二の遺伝子配列が改変され、続いて、第一及び第二のアルファマンノシダーゼIの活性の低下を示す第一及び第二の改変植物細胞が同定及び単離される。改変された第一及び第二のアルファマンノシダーゼIを含む改変植物細胞を含む植物を交雑して、2つのアルファマンノシダーゼI、又はアルファマンノシダーゼIの2つの変種若しくは対立遺伝子をコードする2つのアルファマンノシダーゼIの遺伝子配列に2つの改変を含む子孫を得ることができる。
ある特徴では、第一のアルファマンノシダーゼ及び第二のアルファマンノシダーゼをコードする2つの遺伝子配列は、NtMNS1a、NtMNS1b、NtMNS2及びNtMan1.4から成る群から選択されるか、又は本明細書で多様な実施態様に記載した前記の変種又は対立遺伝子である。
具体的な特徴では、2つの遺伝子配列は、NtMNS1a及びNtMNS1b、又はNtMNS1a及びNtMNS2、又はNtMNS1a及びNtMan1.4、又はNtMNS1b及びNtMNS2、又はNtMNS1b及びNtMan1.4、又はNtMNS2及びNtMan1.4ポリペプチド、又は本明細書で多様な実施態様に記載した前記の変種又は対立遺伝子をコードする。
ある特徴では、本発明は、3つのアルファマンノシダーゼ又は本明細書で多様な実施態様に記載のアルファマンノシダーゼの3つの変種若しくは対立遺伝子をコードする3つの遺伝子配列に3つの改変を含む改変植物細胞に関する。
具体的な特徴では、前記3つの遺伝子配列は、NtMNS1a及びNtMNS1b及びNtMNS2ポリペプチド、又はNtMNS1a及びNtMNS2及びNtMan1.4ポリペプチド、又はNtMNS1a及びNtMan1.4、又はNtMNS1b及びNtMNS2、又はNtMNS1b及びNtMan1.4、又はNtMNS1a及びNtMNS1b及びNtMan1.4ポリペプチド、又はNtMNS1b及びNtMNS2及びNtMan1.4ポリペプチド、又は本明細書で多様な実施態様に記載した前記の変種又は対立遺伝子をコードする。
ある特徴では、本発明は、4つのアルファマンノシダーゼ又は本明細書で多様な実施態様に記載のアルファマンノシダーゼの4つの変種若しくは対立遺伝子をコードする4つの遺伝子配列に4つの改変を含む改変植物細胞に関する。
具体的な特徴では、前記4つの遺伝子配列は、NtMNS1a及びNtMNS1b及びNtMNS2及びNtMan1.4ポリペプチドをコードする。
さらに別の特徴では、糖タンパク質のN-グリカンのマンノースの量が、正常レベルのアルファマンノシダーゼI活性を有する正常な植物から得られる同じ糖タンパク質と比較して増加又は低下した糖タンパク質を含む、改変アルファマンノシダーゼI活性を有する植物、特に本発明の及び本明細書の先行する実施態様に記載の植物から得られる医薬組成物が提供される。
本発明の医薬組成物は、好ましくは医薬的に許容できる担体を含む。“医薬的に許容できる担体”とは、非毒性の固体、半固体若しくは液体の充填剤、希釈剤、被包化物質又は任意のタイプの処方補助剤を意味する。本明細書で用いられる“非経口”という用語は、静脈内、筋肉内、腹腔内、胸骨内、皮下及び関節内注射又は輸液を含む投与態様を指す。前記担体は非経口用担体、より具体的には受容者の血液と等張な溶液であり得る。そのような担体ベヒクルの例には、水、食塩水、リンゲル液及びデキストロース溶液が含まれる。非水性ベヒクル（例えば不揮発性油及びオレイン酸エチル）もまたリポソームと同様に本発明で有用である。適切には、担体は少量の添加物（例えば等張性及び化学的安定性を高める物質）を含む。そのような物質は、用いられる濃度及び投与量では受容者にとって非毒性であり、以下が含まれる：緩衝剤（例えばリン酸塩、クエン酸塩、コハク酸塩、酢酸及び他の有機酸又はそれらの塩）、抗酸化剤（例えばアスコルビン酸）、低分子量（10残基未満）(ポリ)ペプチド（例えばポリアルギニン又はトリペプチド）、タンパク質（例えば血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリン）、疎水性ポリマー（例えばポリビニルピロリドン）、アミノ酸（例えばグリシン、グルタミン酸、アスパラギン酸又はアルギニン）、単糖類、二糖類、及び他の炭水化物（セルロース若しくはその誘導体、グルコース、マンノース又はデキストリン）、キレート剤（例えばEDTA）、糖アルコール（例えばマンニトール又はソルビトール）、対イオン（例えばナトリウム）、非イオン性界面活性剤（例えばポリソルベート、ポロキサマー又はPEG）など。
さらに別の特徴では、配列番号：1から30、32から61、若しくは63から92、又は配列番号：94、96若しくは98のいずれかのポリヌクレオチド又は核酸構築物を含む発現ベクターが提供される。
本発明にしたがえば、アルファマンノシダーゼIの量が変化した、天然には存在しない改変植物細胞及び植物（それらから得られる細胞、バイオマス、種子及び葉を含む）を作出することは多数の利点を提供する。
例示すれば、前記植物細胞又は植物（トランスジェニックで天然に存在しないタバコの植物細胞又は植物を含む）は、その糖タンパク質のN-グリカンに種々の量のマンノースを含む異種糖タンパク質の製造のために栽培又は生育させることができる。
更なる例を示せば、トランスジェニックで天然に存在しない植物（それらから得られる細胞、バイオマス、種子及び葉を含む）は、対応するコントロールと比較して糖タンパク質のN-グリカンのマンノース量の改変を示し、医薬組成物の製造を目的として異種糖タンパク質の製造に用いることができる。
上記の多様な実施態様に記載したようにマンノース量が改変された糖タンパク質を含む、本明細書で用いられる医薬組成物、特にワクチンで用いることができる抗原はより有効であり得る。なぜならば、抗原提示細胞は高マンノースと結合する潜在的能力を有し、免疫応答の強化をもたらすことができるからである。植物で生成されるある種の抗体について、高マンノースの存在は抗体依存細胞性細胞傷害の増加をもたらし得る。本開示方法にしたがって操作することができる適切な植物には組換えタンパク質の製造のために栽培可能な植物が含まれ、前記にはタバコ、タバコの近縁種及びニコチアナ属に属するもの、トウモロコシ、アルファルファ、アオウキクサ、ニンジン及びコケが含まれるが、ただしこれらに限定されない。
本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチド及び方法は、例示的実施態様及び下記の配列情報を参考に上記及び下記でより詳細に説明される：
配列1（配列番号：1）はNtMNS1aポリヌクレオチドを示し、前記では5'及び3'UTR領域は小文字でさらに下線を付され、エクソンは大文字で示され、イントロンは小文字で示され、さらに開始及び終止コドンは大文字の太字で示されさらに下線が付されている。
配列30（配列番号：30）はNtMNS1aのcDNA配列を示す。
配列31（配列番号：31）はNtMNS1aのタンパク質配列を示す。
配列32（配列番号：32）はNtMNS1bのポリヌクレオチドを示し、前記では5'及び3'UTR領域は小文字でさらに下線を付され、エクソンは大文字で示され、イントロンは小文字で示され、さらに開始及び終止コドンは大文字の太字で示されさらに下線が付されている。
配列61（配列番号：61）はNtMNS1bのcDNA配列を示す。
配列62（配列番号：62）はNtMNS1bのタンパク質配列を示す。
配列63（配列番号：63）はNtMNS2のポリヌクレオチドを示し、前記では5'及び3'UTR領域は小文字でさらに下線を付され、エクソンは大文字で示され、イントロンは小文字で示され、さらに開始及び終止コドンは大文字の太字で示されさらに下線が付されている。
表1は、EMBOSSニードルを用いてもっとも近縁な植物配列AtMNS1及びAtMNS2と比較した、NtMNS予想タンパク質配列の％同一性及び類似性を示す。NtMNS1aは配列番号：30の予想タンパク質であり、NtMNS1bは配列番号：61の予想タンパク質であり、さらにNtMNS2は配列番号：92の予想タンパク質である。AtMNS1は、仮定的アラビドプシス・タリアナ（Arabidopsis thaliana）のマンノシル-オリゴ糖1,2-アルファ-マンノシダーゼ（At1g51590）の予想タンパク質であり、さらにNtMNS2は、仮定的A.タリアナマンノシダーゼ（At3g21160）の予想タンパク質である（以下の文献により報告（Kajiura et al., 2010, Glycobaiology 20:235-247））。
表2は、EMBOSSウォータープログラムを用いたローカルペアワイズアラインメントによる配列（配列番号）の同一性（％）及びデータベース登録（最高マッチ）、塩基対による配列の長さ、並びにベストローカルアラインメントで同一である塩基対の数を示す。
本発明に関する更なる特徴及び実施態様を以下で詳細に述べる。
アルファ-マンノシダーゼ：
クラスIアルファ-マンノシダーゼ又はアルファ-マンノシダーゼI酵素（EC 3.2.1.113）はマングビーン（mung bean）のミクロソームにおいて最初に報告された（Forsee (1985) Arch. Biochem. Biophys. 242: 48-57）。マングビーンから精製された酵素は特異的なα(1,2-)-マンノシダーゼ活性を有していたが、配列情報は提供されなかった。最初の仮定的植物アルファ-マンノシダーゼI遺伝子（Gm-Man1と称される）は、Nebenfuhrによって1999年にダイズ（グリシン・マックス（Glycine max））からクローニングされた（Nebenfuhr et al. (1999) Plant Physiol. 121: 1127-1142；GenBankアクセッション番号AF126550）。この仮定的アルファ-マンノシダーゼIと緑色蛍光タンパク質の融合タンパク質は、タバコで過剰発現させたときにシスゴルジ層板でその存在が明らかであったが（Nebenfur（1999）上掲書）、しかしながらN-グリカン生合成におけるその酵素活性及び役割は報告されていない。アラビドプシス・タリアナゲノム配列決定プロジェクトによって、以下の多数の仮定的アルファ-マンノシダーゼI配列が明らかにされた：MNS1（At1g51590）、MNS2（At3g21160）、MNS3（At1g30000）、MNS4（At5g43710）及びMNS5（At1g27520）。これらの予想される完全長のcDNA配列は公知であり、この配列情報はGenBankに存在する。
MNS1及びMNS2はゴルジ停留アルファ-マンノシダーゼのようであるが、MNS3は小胞体に局在していた（Liebminger et al. (2009) The Plant Cell 21: 3850-3867）。MNS3がMan9-GlcNAc2基質からただ１つのα(1,2)-マンノースを切断するとき、MNS1及びMNS2はMan8-GlcNAc2から3つのα(1,2)-マンノースを切断しMan5-GlcNAcを生じた。アラビドプシスのMNS1、MNS2及びMNS3並びに前記の組合せにおける変異は異常なN-グリカンを生じ、これらの遺伝子は、アラビドプシスにおける初期N-グリカン生合成、根の発育及び細胞壁の生合成に必須であることを示した（Liebminger et al. (2009)、上掲書）。
NtMNSタバコアルファ-マンノシダーゼポリヌクレオチド：
配列情報に示すように、5'及び3'非翻訳領域を含む配列番号：1のNtMNS1aゲノムクローン又は5'及び3'非翻訳領域を含まない配列番号：2のNtMNS1aゲノムクローンは以下の14のエクソン及び13のイントロンを含む：エクソン1（配列番号：3）、エクソン2（配列番号：5）、エクソン3（配列番号：7）、エクソン4（配列番号：9）、エクソン5（配列番号：11）、エクソン6（配列番号：13）、エクソン7（配列番号：15）、エクソン8（配列番号：17）、エクソン9（配列番号：19）、エクソン10（配列番号：21）、エクソン11（配列番号：23）、エクソン12（配列番号：25）、エクソン13（配列番号：27）、エクソン14（配列番号：29）、イントロン1（配列番号：4）、イントロン2（配列番号：6）、イントロン3（配列番号：8）、イントロン4（配列番号：10）、イントロン5（配列番号：12）、イントロン6（配列番号：14）、イントロン7（配列番号：16）、イントロン8（配列番号：18）、イントロン9（配列番号：20）、イントロン10（配列番号：22）、イントロン11（配列番号：24）、イントロン12（配列番号：26）及びイントロン13（配列番号：28）。5'及び3'非翻訳領域を含む配列番号：32のNtMNS1bゲノムクローン又は5'及び3'非翻訳領域を含まない配列番号：33のNtMNS1bゲノムクローンは以下の14のエクソン及び13のイントロンを含む：エクソン1（配列番号：34）、エクソン2（配列番号：36）、エクソン3（配列番号：38）、エクソン4（配列番号：40）、エクソン5（配列番号：42）、エクソン6（配列番号：44）、エクソン7（配列番号：46）、エクソン8（配列番号：48）、エクソン9（配列番号：50）、エクソン10（配列番号：52）、エクソン11（配列番号：54）、エクソン12（配列番号：56）、エクソン13（配列番号：58）、エクソン14（配列番号：60）、イントロン1（配列番号：35）、イントロン2（配列番号：37）、イントロン3（配列番号：39）、イントロン4（配列番号：41）、イントロン5（配列番号：43）、イントロン6（配列番号：45）、イントロン7（配列番号：47）、イントロン8（配列番号：49）、イントロン9（配列番号：51）、イントロン10（配列番号：53）、イントロン11（配列番号：55）、イントロン12（配列番号：57）及びイントロン13（配列番号：59）。5'及び3'非翻訳領域を含む配列番号：63のNtMNS2ゲノムクローン又は5'及び3'非翻訳領域を含まない配列番号：64のNtMNS2ゲノムクローンは以下の14のエクソン及び13のイントロンを含む：エクソン1（配列番号：65）、エクソン2（配列番号：67）、エクソン3（配列番号：69）、エクソン4（配列番号：71）、エクソン5（配列番号：73）、エクソン6（配列番号：75）、エクソン7（配列番号：77）、エクソン8（配列番号：79）、エクソン9（配列番号：81）、エクソン10（配列番号：83）、エクソン11（配列番号：85）、エクソン12（配列番号：87）、エクソン13（配列番号：89）、エクソン14（配列番号：91）、イントロン1（配列番号：66）、イントロン2（配列番号：68）、イントロン3（配列番号：70）、イントロン4（配列番号：72）、イントロン5（配列番号：74）、イントロン6（配列番号：76）、イントロン7（配列番号：78）、イントロン8（配列番号：80）、イントロン9（配列番号：82）、イントロン10（配列番号：84）、イントロン11（配列番号：86）、イントロン12（配列番号：88）及びイントロン13（配列番号：90）。
多様な実施態様が、NtMNS1a、NtMNS1b及びNtMNS2遺伝子座の配列（すなわち配列番号：1、配列番号：2、配列番号：32、配列番号：33、配列番号：63及び配列番号：64）；配列番号：1、配列番号：2、配列番号：32、配列番号：33、配列番号：63若しくは配列番号：64又はその変種のフラグメントの配列；又はNtMNS1a、NtMNS1b及びNtMNS2のイントロン若しくはエクソンの配列（配列番号：3から29、34から60及び65から91に示す配列を含む）をそれぞれ別個に含むポリヌクレオチドに向けられる。
多様な実施態様が、配列番号：1、配列番号：2、配列番号：32、配列番号：33、配列番号：63及び配列番号：64のフラグメントの配列を含むポリヌクレオチドに向けられる。前記は各々、それらの個々のエクソン又はイントロのサイズに応じて、約5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.9kb、0.8kb、0.7kb、0.6kb、0.5kb、0.4kb、0.3kb、0.2kb又は0.1kb未満のヌクレオチド配列を含む。他の実施態様では、ポリヌクレオチドは長さが10−20、21−50、51−100，101−200、201−400、401−750、751−1000、1001−1250又は1251−1500塩基である。
多様な実施態様が、配列番号：1、配列番号：2、配列番号：32、配列番号：33、配列番号：63若しくは配列番号：64、又は配列番号：1、配列番号：2、配列番号：32、配列番号：33、配列番号：63若しくは配列番号：64のフラグメントと少なくとも50％、55％、60％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％又は99％の配列同一性を含むNtMNS1a、NtMNS1b及びNtMNS2ポリヌクレオチド変種に向けられる。
多様な実施態様が、配列番号：3から29、34から60又は65から91のいずれか、又はそのフラグメントと少なくとも50％、55％、60％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％又は99％の配列同一性を含むNtMNS1a、NtMNS1b及びNtMNS2イントロンのエクソン又はイントロンの変種に向けられる。表2を参照されたい（配列番号：3から29、34から63又は65から91の各々の変種の配列同一性の最小パーセンテージを示す）。
多様な実施態様が、NtMNS1a、NtMNS1b及びNtMNS2ポリヌクレオチド変種の配列を相補する配列を有するポリヌクレオチドに向けられる。前記変種は、配列番号：1、配列番号：2、配列番号：32、配列番号：33、配列番号：63若しくは配列番号：64、又は配列番号：1、配列番号：2、配列番号：32、配列番号：33、配列番号：63若しくは配列番号：64のフラグメントと少なくとも50％、55％、60％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％又は99％の配列同一性を含む。
多様な実施態様が、配列番号：1、配列番号：2、配列番号：32、配列番号：33、配列番号：63若しくは配列番号：64、又は配列番号：1、配列番号：2、配列番号：32、配列番号：33、配列番号：63若しくは配列番号：64のフラグメントと、中等度から高度にストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドに向けられる。
多様な実施態様が、配列番号：30、配列番号：94、配列番号：61、配列番号：96、配列番号：92若しくは配列番号：98、又は配列番号：30、配列番号：94、配列番号：61、配列番号：96、配列番号：92若しくは配列番号：98のフラグメント，又はその変種を含む、NtMNS1a、NtMNS1b、NtMNS2及びNtMan1.4のcDNA配列を提示するポリヌクレオチドに向けられる。
多様な実施態様が、以下を含む、NtMNS1a、NtMNS1b、NtMNS2エクソンコード配列を提示するポリヌクレオチドに向けられる：NtMNS1aエクソン1（配列番号：3）、エクソン2（配列番号：5）、エクソン3（配列番号：7）、エクソン4（配列番号：9）、エクソン5（配列番号：11）、エクソン6（配列番号：13）、エクソン7（配列番号：15）、エクソン8（配列番号：17）、エクソン9（配列番号：19）、エクソン10（配列番号：21）、エクソン11（配列番号：23）、エクソン12（配列番号：25）、エクソン13（配列番号：27）、エクソン14（配列番号：29）；NtMNS1bエクソン1（配列番号：34）、エクソン2（配列番号：36）、エクソン3（配列番号：38）、エクソン4（配列番号：40）、エクソン5（配列番号：42）、エクソン6（配列番号：44）、エクソン7（配列番号：46）、エクソン8（配列番号：48）、エクソン9（配列番号：50）、エクソン10（配列番号：52）、エクソン11（配列番号：54）、エクソン12（配列番号：56）、エクソン13（配列番号：58）、エクソン14（配列番号：60）；及びNtMNS2エクソン1（配列番号：65）、エクソン2（配列番号：67）、エクソン3（配列番号：69）、エクソン4（配列番号：71）、エクソン5（配列番号：73）、エクソン6（配列番号：75）、エクソン7（配列番号：77）、エクソン8（配列番号：79）、エクソン9（配列番号：81）、エクソン10（配列番号：83）、エクソン11（配列番号：85）、エクソン12（配列番号：87）、エクソン13（配列番号：89）及びエクソン14（配列番号：91）。
当業者には理解されるところであるが、線状DNAは2つの可能な向き、5'から3'方向及び3'から5'方向を有する。例えば、参照配列が5'から3'方向に配置され、第二の配列が同じポリヌクレオチド内に5'から3'方向に配置されるならば、前記参照配列及び第二の配列は同じ方向を向くか、又は同じ向きを有する。典型的には、あるプロモーターの調節下又は調節制御下にあるプロモーター配列及び対象遺伝子は同じ向きで配置される。しかしながら、5'から3'方向で配置された参照配列に対して、第二の配列が同じポリヌクレオチド内で3'から5'方向で配置されるならば、前記参照配列及び第二の配列は、アンチセンス方向を向くか、又はアンチセンスの向きを有する。互いに対してアンチセンスの向きを有する2つの配列は、参照配列（5'から3'方向）及び前記参照配列の逆相補性配列（参照配列は5'から3'で配置）が同じポリヌクレオチド内に配置される場合、同じ向きを有すると言い換えることができる。本明細書に示す配列は5'から3'方向で示される。
NtMNSポリペプチド：
NtMNSポリペプチドには、NtMNS1a、NtMNS1b、NtMNS2及びNtMan1.4ポリペプチド、並びに任意のタイプの変異（例えばアミノ酸挿入、欠失若しくは置換；グリコシル化状態の変更；再折畳み若しくは異性化、三次元構造又は自己結合に影響を与える変更（前記は意図的に操作でき又は自然に起こり得る））を導入することによって生成される変種が含まれる。NtMNS1a、NtMNS1b、NtMNS2及びNtMan1.4ポリペプチドは、連続した少なくとも10、少なくとも20、少なくとも30、又は少なくとも40のアミノ酸を含む。
多様な実施態様が、配列番号：1、配列番号：2、配列番号：30、配列番号：32、配列番号：33、配列番号：61、配列番号：63、配列番号：64若しくは配列番号：92、又は配列番号：94、配列番号：96若しくは配列番号：98；配列番号：1、配列番号：2、配列番号：30、配列番号：32、配列番号：33、配列番号：61、配列番号：63、配列番号：64若しくは配列番号：92、又は配列番号：94、配列番号：96若しくは配列番号：98のフラグメント；又はその変種を含む、前記から成る、本質的に前記から成るポリヌクレオチド配列によってコードされるNtMNS1a、NtMNS1b、NtMNS2及びNtMan1.4ポリペプチドに向けられる。
多様な実施態様が、配列番号：31、配列番号：62若しくは配列番号：93、又は配列番号：95、配列番号：97若しくは配列番号：99；又は配列番号：31、配列番号：62若しくは配列番号：93、又は配列番号：95、配列番号：97若しくは配列番号：99のフラグメントと少なくとも50％、55％、60％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％又は99％の配列同一性を含む、NtMNS1a、NtMNS1b、NtMNS2及びNtMan1.4ポリペプチド変種に向けられる。
NtMNS1a、NtMNS1b、NtMNS2及びNtMan1.4の変異体ポリペプチド変種もまた特許請求の範囲に包含され、本明細書に開示される。
NtMNSポリヌクレオチドと結合するジンクフィンガータンパク質：
ジンクフィンガーDNA結合ドメイン又はモチーフはほぼ30アミノ酸から成り、前記30アミノ酸はベータ-ベータ-アルファ（ββα）構造に折り畳まれ、そのアルファヘリックス（α-ヘリックス）がDNA二本鎖ヘリックスに挿入される。“アルファヘリックス（α-ヘリックス）”は、右回り又は左回りらせんのどちらかのタンパク質の二次構造モチーフを指し、ここでアミノ酸の各N-H基の水素は、第一のアミノ酸に対して-4位のアミノ酸のC=O基と結合する。本明細書で用いられる“ベータ-バレル”（β‐バレル）は、2つのベータ鎖（β鎖）を含むタンパク質の二次構造モチーフを指し、ここで第一の鎖は第二の鎖と水素結合して閉鎖構造を形成する。本明細書で用いられる“ベータ-ベータ-アルファ（ββα）構造”は、2つのアンチパラレルβ鎖及び1つのαヘリックスを含むβ-バレルから成るタンパク質構造を指す。“ジンクフィンガーDNA結合ドメイン”という用語は、亜鉛イオンを含み特異的な3つの塩基対のDNA配列と結合することができるタンパク質ドメインを指す。“非天然のジンクフィンガーDNA結合ドメイン”という用語は、改変されるべきDNAを含む細胞又は生物には存在しないジンクフィンガーDNA結合ドメインを指す。
標的DNA内の3つの塩基対配列と結合するジンクフィンガーDNA結合ドメイン又はモチーフ内の重要なアミノ酸は、アルファ-ヘリックス（αヘリックス）の開始に対して-1、+1、+2、+3、+4、+5及び+6のアミノ酸である。ジンクフィンガーDNA結合ドメイン又はモチーフのαヘリックスの開始に対して-1、+1、+2、+3、+4、+5及び+6位のアミノ酸を改変し、一方ベータ-バレル（βバレル）骨格を維持して、異なる3塩基対配列と結合する新規なDNA結合ドメイン又はモチーフを創出することができる。そのような新規なDNA結合ドメインは非天然のジンクフィンガーDNA結合ドメインであり得る。αヘリックスの開始に対して-1、+1、+2、+3、+4、+5及び+6位のアミノ酸による3塩基対配列の認識に加えて、これらアミノ酸のいくつかはまた、前記3塩基対配列認識部位の外側の塩基対と相互作用できる。2つ、3つ、4つ5つ、6つ又は7つ以上のジンクフィンガーDNA結合ドメイン又はモチーフと結合することによって、より長いDNA配列と特異的に結合するジンクフィンガータンパク質を創出することができる。例えば、2つのジンクフィンガーDNA結合ドメイン又はモチーフを含むジンクフィンガータンパク質は特異的な6塩基対配列を認識し、4つのジンクフィンガーDNA結合ドメイン又はモチーフを含むジンクフィンガータンパク質は特異的な12塩基対配列を認識できる。ジンクフィンガータンパク質は、2つ又は3つ以上の天然のジンクフィンガーDNA結合ドメイン又はモチーフ、又は2つ又は3つ以上の非天然のジンクフィンガーDNA結合ドメイン又はモチーフ（選別方法（例えばファージディスプレー選別、細菌性2ハイブリッド選別又は細菌性1ハイブリッド選別を含むがただしこれらに限定されない）と対にして、切端若しくは伸長又は位置指定変異導入により天然又は野生型ジンクフィンガータンパク質から誘導される）、又は天然及び非天然のジンクフィンガーDNA結合ドメインの任意の組合せを含むことができる。この関係で用いられる“切端”は、天然のジンクフィンガータンパク質で見出されるジンクフィンガーDNA結合ドメイン又はモチーフの総数よりも少ないドメイン又はモチーフを含むジンクフィンガータンパク質を指す。この関係で用いられる“伸長”は、天然のジンクフィンガータンパク質で見出されるジンクフィンガーDNA結合ドメイン又はモチーフの総数よりも多いドメイン又はモチーフを含むジンクフィンガータンパク質を指す。ジンクフィンガータンパク質結合のためにゲノム配列内のポリヌクレオチド配列を選別する技術は当分野で公知であり、本発明で用いることができる。
WO98/54311は、標的遺伝子にとって固有である特異的ヌクレオチド配列と結合するジンクフィンガータンパク質ドメインをデザインする方法を開示する。18ヌクレオチドを含む配列が、高等生物のゲノムで固有の位置を特定するために十分であると計算された。したがって典型的には、ジンクフィンガータンパク質ドメインは6つのジンクフィンガーを含み、各々は、個々のトリプレットと相互作用するために特異的に設計されたアルファヘリックスを有する。しかしながら、いくつかの事例では、より短いかより長いヌクレオチド標的配列が所望される場合がある。したがって、当該タンパク質内のジンクフィンガードメインは、2から12フィンガー、例えば3から8フィンガー、5から7フィンガー又は6フィンガーを含むことができる。
所望の核酸結合特性を有するジンクフィンガータンパク質を設計し同定する方法にはまたWO98/53060に記載された方法が含まれる（WO98/53060は、標的核酸配列において4つ一組の核酸と結合できるCys2-His2ジンクフィンガークラスの核酸結合タンパク質を調製する方法を報告する）。
本発明で使用されるジンクフィンガータンパク質は、少なくとも1つの第二のDNA結合ドメイン（場合によって第二のジンクフィンガーポリペプチドである）にリンカー（好ましくは可撓性リンカー）を介して連結された少なくとも1つのジンクフィンガーポリペプチドを含むことができる。ジンクフィンガータンパク質は、3つ以上のDNA結合ドメインを1つ以上の調節ドメインと同様に含むことができる。ジンクフィンガーポリペプチドは、選択した遺伝子内の選択標的部位を認識するように操作することができる。
ある実施態様では、ジンクフィンガータンパク質は、天然に存在するジンクフィンガータンパク質から誘導されたフレームワーク（又は骨格）を含むことができる。天然に存在する任意のジンクフィンガータンパク質に由来するフレームワーク（又は骨格）を用いてもよい。例えば、C2H2モチーフを含むジンクフィンガータンパク質に由来するフレームワーク（又は骨格）を含むジンクフィンガータンパク質を用いることができる。
別の具体的な実施態様では、ジンクフィンガータンパク質は、植物細胞で天然に機能するジンクフィンガータンパク質に由来するフレームワーク（又は骨格）を含む。例えば、ジンクフィンガータンパク質は、C3Hジンクフィンガー、QALGGHモチーフ、RING-H2ジンクフィンガーモチーフ、9アミノ酸C2H2モチーフ、アラビドプシスLSD1のジンクフィンガーモチーフ、及びBBF/Dofドメインタンパク質のジンクフィンガーモチーフを含むことができる。
多様な実施態様が、NtMNS1a、NtMNS1b及びNtMNS2ポリヌクレオチド（配列番号：1、配列番号：2、配列番号：32、配列番号：33、配列番号：63及び配列番号：64、配列番号：1、配列番号：2、配列番号：32、配列番号：33、配列番号：63若しくは配列番号：64のフラグメント、又はその変種を含む）、NtMNS1a、NtMNS1b及びNtMNS2のイントロン及びエクソン（配列番号：3から29、34から60及び65から91を含む）、及びNtMNS1a、NtMNS1b及びNtMNS2のイントロンとエクソンの組合せ（配列番号：3から29、34から60及び65から91を含む）と特異的に結合するジンクフィンガータンパク質に向けられる。当業者には理解されるところであるが、本発明の関係におけるイントロン及びエクソンの組合せは、対応するゲノムポリヌクレオチド上で互いに直に連結されたイントロン及びエクソンを指し、例えばNtMNS1aのエクソン3（配列番号：7）及びイントロン3（配列番号：8）、又はNtMNS1aのイントロン2（配列番号：6）及びエクソン3（配列番号：7）である。
NtMNSポリヌクレオチドと結合するメガヌクレアーゼ：
本発明の特徴はさらに、ゲノム操作又はゲノム編集技術を用いてNtMNSポリヌクレオチド及びポリペプチドの発現を改変する方法を提供する。したがって、ある種の実施態様では、メガヌクレアーゼ（例えば非天然又は組換えメガヌクレアーゼ）を用いて、NtMNSポリペプチドをコードするゲノムDNAのただ１つの部位又は比較的少数の部位で二本鎖ブレークを特異的に発生させ、NtMNSポリヌクレオチド（例えばNtMNS1a、NtMNS1b及びNtMNS2）の破壊を可能にする。前記メガヌクレアーゼは、WO07/047859に記載の改変されたDNA認識特性を有する操作されたメガヌクレアーゼであり得る（WO07/047859は、天然に存在するメガヌクレアーゼI-Crelに由来するメガヌクレアーゼの構造依拠操作の方法を記載する）。操作メガヌクレアーゼは、予め定めた22塩基対DNA配列を認識しこれを切断するように作製することができる。メガヌクレアーゼタンパク質は、当業界で公知の異なる多様なメカニズムによって細胞にデリバーできる。
多様な実施態様が、NtMNS1a、NtMNS1b及びNtMNS2ポリヌクレオチド（配列番号：1、配列番号：2、配列番号：32、配列番号：33、配列番号：63及び配列番号：64；配列番号：1、配列番号：2、配列番号：32、配列番号：33、配列番号：63若しくは配列番号：64のフラグメント；又はその変種を含む）、NtMNS1a、NtMNS1b及びNtMNS2のイントロン及びエクソン（配列番号：3から29、34から60及び65から91を含む）、及びNtMNS1a、NtMNS1b及びNtMNS2のイントロンとエクソンの組合せ（配列番号：3から29、34から60及び65から91を含む）と特異的に結合するメガヌクレアーゼに向けられる。当業者には理解されるところであるが、本発明の関係におけるイントロン及びエクソンの組合せは、対応するゲノムポリヌクレオチド上で互いに直に連結されたイントロン及びエクソンを指し、例えばNtMNS1aのエクソン3（配列番号：7）及びイントロン3（配列番号：8）、又はNtMNS1aのイントロン2（配列番号：6）及びエクソン3（配列番号：7）である。
NtMNSポリペプチドと結合する抗体：
別の実施態様では、NtMNSポリペプチド（NtMNS1a、NtMNS1b、NtMNS2又はNtMan1.4並びに配列番号：31、配列番号：95、配列番号：62、配列番号：97、配列番号：93及び配列番号：99を含む）と免疫反応する抗体が本明細書で提供される。本明細書に示すNtMNSポリペプチド、フラグメント、変種、融合ポリペプチドなどを、前記と免疫反応する抗体の製造で“免疫原”として用いることができる。そのような抗体は、抗体の抗原結合部位を介して前記ポリペプチドと特異的に結合する。特異的に結合する抗体は、NtMNSファミリーポリペプチド、ホモローグ及び変種と結合するが、他の分子とは結合しないものである。ある実施態様では、前記抗体は、本明細書で配列番号：31、配列番号：95、配列番号：62、配列番号：97、配列番号：93及び配列番号：99に示すNtMNS1a、NtMNS1b又はNtMNS2アミノ酸配列を有するポリペプチドに特異的であり、他のポリペプチドとは交差反応しない。前記抗体はまた、NtMNSポリペプチド又はフラグメントの存在をin vitro又はin vivoで検出するアッセイで用いることができる。抗体はまた、免疫親和性クロマトグラフィーによるポリペプチド又はフラグメントの精製で、又はNtMNSポリペプチドの発現の改変で用いることができる。
形質転換：
改変されたアルファ-マンノシダーゼI活性を有するトランスジェニックで改変された植物細胞及びそのような細胞を含む植物が、１つ以上の組換え核酸（例えば異種ポリヌクレオチド）を含む、アルファ-マンノシダーゼI活性が改変されたトランスジェニック植物細胞及び植物と同様に本明細書に記載される。前記異種ポリヌクレオチドは、本発明のポリヌクレオチド、キメラ遺伝子、核酸構築物、dsRNA、又は発現ベクターであり得る。前記異種ポリヌクレオチドはまた、本発明の改変植物細胞又は植物で発現させる、本発明の医薬組成物の製造のための異種タンパク質をコードする構築物であり得る。
植物又は植物細胞は、安定的に形質転換させるために組換え核酸をそのゲノムに組み込ませて形質転換できる。安定的に形質転換した細胞は、典型的には細胞分裂の度に導入された核酸を維持する。植物又は植物細胞はまた、組換え核酸がそのゲノムに組み込まれないように一過性に形質転換させることができる。一過性に形質転換された細胞は、典型的には、導入された組換え核酸が十分な細胞分裂回数後には娘細胞で検出できないように細胞分裂のたびに導入された組換え核酸の全部又はいくらかの部分を失う。
核酸を単子葉並びに双子葉植物及び植物細胞に導入する技術は当業界で公知であり、例えばアグロバクテリウム媒介形質転換及び浸潤、ウイルスベクター媒介形質転換、エレクトロポレーション及び粒子銃形質転換が含まれる。例えば米国特許4,459,355号は、Tiプラスミドを含むアグロバクテリウム株を用いて感受性植物（双子葉植物を含む）を形質転換する方法を開示し、米国特許4,795,855号はアグロバクテリウムベクターを用いる木本植物の形質転換を開示し、米国特許4,940,838号は二元性アグロバクテリウムベクターを開示する。米国特許4,945,050号及び米国特許5,015,580号も技術を開示する。細胞又は培養組織を形質転換のためのレシピエント組織として用いる場合は、形質転換させた培養細胞を培養するか、或いは所望するならば、形質転換植物細胞を形質転換培養又は組織から当業者に公知の技術により再生することができる。異種タンパク質又は糖タンパク質を含む医薬組成物を植物細胞で製造するために、前記タンパク質をコードする異種ポリヌクレオチド又は遺伝子配列を植物細胞で機能する調節エレメントの制御下で遺伝子構築物又は形質転換ベクターに配置する。
調節エレメント：
組換え構築物に含まれるべき調節エレメントの選択はいくつかの要件に左右される。前記要件には効率、選別性、誘導性、所望される発現レベル、及び細胞又は組織優先性発現が含まれるが、ただしこれらに限定されない。コード配列に対して調節領域を適切に選択し配置することによってコード配列の発現を調整することは、当業者には日常的な事柄である。核酸の転写も同様な態様で調整することができる。いくつかの適切な調節領域は、ある種の細胞タイプで転写だけを又は転写を優先的に開始させる。
プロモーター：
適切なプロモーターには、種々の組織又は細胞タイプに存在する組織特異的因子によって認識される組織特異的プロモーター、例えば根特異的プロモーター、シュート特異的プロモーター、木部特異的プロモーター、葉特異的プロモーター、又は種々の発育段階時に存在するプロモーター、又は種々の環境条件に応答して存在するプロモーターが含まれる。適切なプロモーターには、特異的な誘導物質を要求することなく大半の細胞タイプで活性化され得る構成的プロモーターが含まれる。NtMNS1a、NtMNS1b、NtMNS2及びNtMan1.4 RNAiポリヌクレオチド産生を制御するために適切なプロモーターの例には、カリフラワーモザイクウイルス35Sプロモーター、Rubisco小サブユニットプロモーター、オクトピンシンターゼプロモーター、ノパリンシンターゼプロモーター、又はユビキチン-又はファゼオリン-プロモーターが含まれる。当業者は組換えプロモーターの多数の変型を創出することができる。
NtMNS構築物を含むRNAi発現ベクター：
RNA干渉（“RNAi”）又はRNAサイレンシングは、特定のmRNAを酵素分解の標的にすることができる、進化の間に保存されたプロセスである。RNAi経路を開始させるためには、二本鎖RNA（dsRNA）を導入するか、或いは細胞（例えばdsRNAウイルス）によって又はNtMNS RNAiポリヌクレオチドによって二本鎖RNA（dsRNA）を産出せねばならない。dsRNAは、RNアーゼIII（dsRNA特異的エンドヌクレアーゼである）によって長さが21−23bpの多数のsiRNAデュープレックスに変換され得る。このsiRNAは続いてRNA誘導サイレンシング複合体によって認識され得る（前記複合体はATP依存プロセスを介してsiRNAの巻き戻しを促進する）。siRNAの巻き戻されたアンチセンス鎖は、活性化されたRNA誘導サイレンシング複合体を標的mRNAに誘導する。前記標的mRNAは、siRNAアンチセンス鎖と相補的な配列を含むNtMNS1a、NtMNS1b、NtMNS2及びNtMan1.4 RNA変種であり得る。
NtMNS1a、NtMNS1b、NtMNS2又はNtMan1.4 RNAiポリヌクレオチドをコードするNtMNS1a、NtMNS1b、NtMNS2及びNtMan1.4 RNAi構築物を含む、NtMNS1a、NtMNS1b、NtMNS2及びNtMan1.4 RNAi発現ベクターは、NtMNS1a、NtMNS1b、NtMNS2及びNtMan1.4 mRNA；又はNtMNS1a、NtMNS1b、NtMNS2及びNtMan1.4 pre-mRNA；又は関連するNtMNS1a、NtMNS1b、NtMNS2及びNtMan1.4 RNA変種の発現レベルを低下させることによってRNA干渉活性を示す。発現ベクターは、本明細書でさらに記載するように、上流に配置されNtMNS RNAi構築物と作動できるように連結されたプロモーターを含むことができる。NtMNS RNAi発現ベクターは、適切な最小コアプロモーター、対象のNtMNS RNAi構築物、上流（5'）の調節領域、下流（3'）の調節領域（転写終了及びポリアデニル化シグナルを含む）、及び当業者に公知の他の配列（例えば多様な選別マーカー）を含むことができる。
ある実施態様では、1つ以上の上記基準を満たす、長さが約14から約30ヌクレオチドの標的NtMNS1a、NtMNS1b、NtMNS2又はNtMan1.4 mRNA配列が選択される。別の実施態様では、1つ以上の上記基準を満たす、長さが約16から約30ヌクレオチドの標的配列が選択される。さらに別の実施態様では、1つ以上の上記基準を満たす、長さが約19から約30ヌクレオチドの標的配列が選択される。別の実施態様では、1つ以上の上記基準を満たす、長さが約19から約25ヌクレオチドの標的配列が選択される。
例示的な実施態様では、siRNA分子は、配列番号：30、配列番号：94、配列番号：61、配列番号：96、配列番号：92又は配列番号：98に示す配列のいずれか1つの連続する少なくとも12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30又は31以上のヌクレオチドと相補的な特異的アンチセンス配列を含む。
siRNA分子に含まれる前記特異的アンチセンス配列は標的配列の相補鎖と同一又は実質的に同一であり得る。本発明のある実施態様では、siRNA分子に含まれる前記特異的アンチセンス配列は、標的mRNA配列の相補鎖と少なくとも約50％、55％、60％、70％、71％、72％、73％、74％、特に少なくとも75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％又は99％配列同一である。配列同一性を決定する方法は当業界で公知であり、例えばウィスコンシン大学コンピュータグループ（GCG）のソフトウェア又はNCBIウェブサイトで提供されるBLASTNプログラムを用いて決定できる。
同時抑制によってNtMNS遺伝子発現を低下させる発現ベクター：
NtMNS1a、NtMNS1b、NtMNS2又はNtMan1.4遺伝子発現の同時抑制を促進することによってNtMNS1a、NtMNS1b、NtMNS2又はNtMan1.4遺伝子の内因性発現レベルを調整する（低下を含む）多様な組成物及び方法が提供される。同時抑制現象は、多数のトランスジーンコピーの植物細胞への導入の結果として生じる。多数のトランスジーンコピーの組み込みは、トランスジーン及び標的とされる内因性遺伝子の発現低下をもたらすことができる。同時抑制の程度は、トランスジーンと標的とされる内因性遺伝子との間の配列同一性の程度に左右される。内因性遺伝子及びトランスジーンの両方のサイレンシングは、サイレンシングされる遺伝子座、内因性プロモーター及び対象の内因性遺伝子の十二分なメチル化（転写を妨げる）によって生じ得る。また別にいくつかの事例では、内因性遺伝子及びトランスジーンの同時抑制は転写後遺伝子サイレンシング（“PTGS”）によって生じ、前記では転写物は生成されるが分解速度の増加が転写物の蓄積を妨げることができる。PTGSによる同時抑制のメカニズムは、RNA干渉に類似すると考えられ（RNAはこれらのプロセスの重要な開始因子及び標的の両方であるように思われるという点で）、同じ分子機構（おそらくmRNAのRNA誘導分解を介する）によって少なくとも部分的に媒介され得る。
NtMNS1a、NtMNS1b、NtMNS2又はNtMan1.4の同時抑制は、配列番号：30、配列番号：94、配列番号：61、配列番号：96、配列番号：92又は配列番号：98のNtMNS1a、NtMNS1b、NtMNS2又はNtMan1.4 cDNA又はそのフラグメントの多数のコピーをトランスジーンとして対象の植物のゲノムに組み込むことによって達成できる。宿主植物は、NtMNS1a、NtMNS1b、NtMNS2又はNtMan1.4 cDNA又はそのフラグメントに作動できるように連結されたプロモーターを含む発現ベクターで形質転換できる。多様な実施態様が内因性NtMNS遺伝子の同時抑制を促進する発現ベクターに向けられ、前記発現ベクターは以下を含む：NtMNS1a、NtMNS1b、NtMNS2又はNtMan1.4（例えば配列番号：30、配列番号：94、配列番号：61、配列番号：96、配列番号：92又は配列番号：98と同定されたcDNA）又はそのフラグメント（例えば配列番号：5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89又は91のいずれか）又はその変種（前記と少なくとも約50％、55％、60％、70％、71％、72％、73％、特に少なくとも74％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％又は99％の配列同一性を有する）に作動できるように連結されたプロモーター。
多様な実施態様が、配列番号：30、配列番号：94、配列番号：61、配列番号：96、配列番号：92又は配列番号：98と同定されるNtMNS1a、NtMNS1b若しくはNtMNS2、又はそのフラグメント、又はその変種（前記と少なくとも50％、55％、60％、70％、71％、72％、73％、特に少なくとも74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％又は99％の配列同一性を有する）の多数のコピーを植物ゲノムに組み込むことによって達成される、NtMNS1a、NtMNS1b、NtMNS2又はNtMan1.4の発現レベルを調整する（低下又は阻害する）方法に向けられる。前記方法は発現ベクターで植物細胞宿主を形質転換する工程を含み、前記発現ベクターは、配列番号：30、配列番号：94、配列番号：61、配列番号：96、配列番号：92若しくは配列番号：98、又はそのフラグメント、又はその変種（前記と少なくとも50％、55％、60％、70％、71％、72％、73％、特に少なくとも74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％又は99％の配列同一性を有する）に作動できるように連結されたプロモーターを含む。
アンチセンス物質による翻訳の阻害によってNtMNS発現を低下させる発現ベクター：
NtMNS1a、NtMNS1b、NtMNS2及びNtMan1.4の内因性発現レベルをNtMNS1a、NtMNS1b、NtMNS2又はNtMan1.4 mRNAの翻訳を阻害することによって低下させる多様な組成物及び方法が提供される。宿主植物細胞は、NtMNS1a、NtMNS1b、NtMNS2又はNtMan1.4 mRNAの一部分と相補的な配列を有するRNAポリヌクレオチドの発現を可能にするために、プロモーターに対してアンチセンスの向きで配置されたNtMNS1a、NtMNS1b、NtMNS2若しくはNtMan1.4又はその変種又はフラグメントに作動できるように連結されたプロモーターを含む発現ベクターで形質転換できる。
NtMNS1a、NtMNS1b、NtMNS2又はNtMan1.4 mRNAの翻訳を阻害する多様な発現ベクターは、NtMNS1a、NtMNS1b、NtMNS2若しくはNtMan1.4（配列番号：30、配列番号：94、配列番号：61、配列番号：96、配列番号：92又は配列番号：98と同定される）、又はそのフラグメント、又はその変種（前記と少なくとも50％、55％、60％、70％、71％、72％、73％、特に少なくとも74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％又は99％の配列同一性を有する）（前記配列はプロモーターに対してアンチセンスの向きで配置される）と作動できるように連結されたプロモーターを含むことができる。NtMNS1a、NtMNS1b、NtMNS2及びNtMan1.4のアンチセンスRNAポリヌクレオチドの長さは変動可能であり、約15−20ヌクレオチド、約20−30ヌクレオチド、約30−50ヌクレオチド、約50−75ヌクレオチド、約75−100ヌクレオチド、約100−150ヌクレオチド、約150−200ヌクレオチド、及び約200−300ヌクレオチドであり得る。
NtMNS発現を低下させる他の組成物及び方法：
NtMNS1a、NtMNS1b、NtMNS2及びNtMan1.4ポリヌクレオチド及びポリペプチドの保存的変種及びより分岐性の高い変種を得る方法は当業者には公知である。変異導入を誘導できることが知られている多様な方法（位置指定変異導入、オリゴヌクレオチド指定変異導入、化学的誘導変異導入（例えばエチルメタンスルフォネート）、照射線誘導変異導入及び他の等価の方法を含む）によって関心のある任意の植物を遺伝的に改変できる。また別には、ゲノム内局所損傷誘導標的設定（Targeting Induced Local Lesions IN Genomics（“Tilling”）と称される方法、前記は高密度点変異と変異の急速高感度検出を一体化させる）によって、NtMNS1a、NtMNS1b、NtMNS2及びNtMan1.4遺伝子を不活化の標的とすることができる。典型的には、植物種子を変異原、例えばエチルメタンスルフォネート（EMS）又はEMSアルキレートグアニン（前記は典型的にはミスペアリングをもたらす）に曝露する。適切な物質及び方法は、以下に記載されているように当業者には公知である（McCallum et al., (2000), “Targeting Induced Local Lesions IN Genomics (TILLING) for Plant Functional Genomics,” Plant Physiology 123:439-442; McCallum et al., (2000) “Targeted screening for induced mutations,” Nature Biotechnology 18:455-457;及びColbert et al., (2001) “High-Throughput Screening for Induced Point Mutations,” Plant Physiology 126:480-484）。主として点変異及び短い欠失、挿入、トランスバージョン、トランジションを生じる変異原（化学変異原又は放射線照射を含む）又は全てを用いて変異を創出できる。変異原には以下が含まれる（ただしこれらに限定されない）：エチルメタンスルフォネート（EMS）、メチルメタンスルフォネート（MMS）、N-エチル-N-ニトロソウレア（ENU）、トリエチルメラミン（TEM）、N-メチル-N-ニトロソウレア（MNU）、プロカルバジン、クロラムブシル、シクロホスファミド、硫酸ジエチル、アクリルアミドモノマー、メルファラン、ナイトロジェンマスタード、ビンクリスチン、ジメチルニトロソアミン、N-メチル-N’−ニトロ-ニトロソグアニジン（MNNG）、ニトロソグアニジン、2-アミノプリン、7,12ジメチル-ベンザアントラセン（DMBA）、エチレノキシド、ヘキサメチルホスホロアミド、ビスルファン、ジエポキシアルカン（ジエポキシオクタン（DEO）、ジエポキシブタン（BEB）など）、2-メトキシ-6-クロロ9[3-(エチル-2-クロロ-エチル)アミノプロピルアミノ]アクリジンジヒドロクロリド（ICR-170）及びホルムアルデヒド。
NtMNSポリヌクレオチドの変異導入：
本発明のNtMNSポリヌクレオチドと結合するジンクフィンガーペアを用いて、NtMNSポリヌクレオチドを改変するジンクフィンガーヌクレアーゼを作製できる。ジンクフィンガーヌクレアーゼ媒介変異導入の一般的な使用は当業界で公知であり、例えばWO02/057293、WO02/057294、WO00/041566、WO00/042219及びWO05/084190に記載されている。ゲノム配列、例えばNtMNS1a、NtMNS1b、NtMNS2又はNtMan1.4をコードするゲノムDNA配列をジンクフィンガーヌクレアーゼ媒介変異導入によって変異させる方法は、場合によって1つ以上の以下の工程を含む：（i）遺伝子配列内の異なる標的部位と選択的に結合する少なくとも2つのジンクフィンガータンパク質を提供する工程；（ii）植物細胞で作動可能な発現制御配列に作動できるように連結されてある、工程（i）の2つの異なる非天然ジンクフィンガータンパク質の1つとヌクレアーゼを含む2つの発現構築物（各々は異なるジンクフィンガーヌクレアーゼをコードする）を構築する工程；（iii）2つの異なるジンクフィンガーヌクレアーゼが生成される植物細胞に、植物細胞ゲノム内のゲノムDNA配列の標的部位の少なくとも1つに又はその近くに二本鎖DNAブレークが導入されるように前記2つの発現構築物を導入する工程。2つの発現構築物の植物細胞への導入は同時に又は連続的に実施でき、場合によって最初の構築物を取り込んだ細胞の選別を含む。
本明細書で用いられる二本鎖ブレーク（DSB）は、DNA又はRNAの両方の鎖のブレークを指す。二本鎖ブレークは、標的部位の一方からの隔たりが5塩基対から1500塩基対を超えない、特に5塩基対から200塩基対を超えない、特に5塩基対から20塩基対を超えない、位置のゲノムDNA配列上で生じる。二本鎖ブレークは非相同性末端の結合を促進して、標的部位又はその近くのゲノムDNA配列内に変異を生じる。本明細書で用いられる“非相同性末端結合（NHEJ）”は、相同な鋳型を必要としない直接結合によって二本鎖ブレークを修復し、したがってブレークが生じる前の配列と対比して変異原性であり得る修復メカニズムを指す。
本方法はさらに場合によって、（iv）二本鎖ブレークの上流のヌクレオチド配列と相同な少なくとも1つの第一の領域及び二本鎖ブレークの下流のヌクレオチド配列と相同な第二の領域を含むポリヌクレオチドを植物細胞に導入する工程を含むことができる。前記ポリヌクレオチドは、異種ヌクレオチド配列の欠失又は挿入を含むNtMNS1a、NtMNS1b、NtMNS2又はNtMan1.4配列と一致するヌクレオチド配列を含むことができる。したがって、前記ポリヌクレオチドは標的部位又はその近くでの相同組換えを促進し、当該ゲノムへの異種配列の挿入又は当該ゲノムからゲノムDNA配列の欠失を生じることができる。得られた植物細胞のゲノムDNA配列は、発現された変異体NtMNS1a、NtMNS1b、NtMNS2又はNtMan1.4の酵素活性を破壊する変異、早期翻訳終止コドン、又はpre-mRNAからmRNAへの適切なプロセッシングを妨害する配列モチーフを含み、当該遺伝子の発現低下及び不活化をもたらすことができる。タンパク質をコードする遺伝子配列に変異を導入することによってタンパク質合成を破壊する方法は当業者には公知である。
ジンクフィンガーヌクレアーゼは、NtMNS1a、NtMNS1b、NtMNS2又はNtMan1.4と結合するジンクフィンガータンパク質をコードする第一のポリヌクレオチド、及び非特異的なエンドヌクレアーゼ（例えばIIS型エンドヌクレアーゼであるが、ただし前記に限定されない）をコードする第二のポリヌクレオチドの融合物を作製することによって構築できる。IIS型エンドヌクレアーゼは、認識ドメインとエンドヌクレアーゼ切断ドメインが分離した制限酵素であり、この酵素は認識部位から離れた位置にあるDNAを切断する。IIS型エンドヌクレアーゼの非限定的な例は、AarI、BaeI、CdiI、DrdII、EciI、FokI、FauI、GdiII、HgaI、Ksp632I、MboII、Pfl1108I、Rle108I、RleAI、SapI、TspDTI又はUbaPIであり得るが、ただしこれらに限定されない。融合タンパク質を設計及び構築する方法、IIS型エンドヌクレアーゼの配列認識ドメインからエンドヌクレアーゼドメインを選別及び分離する方法、ジンクフィンガータンパク質とエンドヌクレアーゼとの融合タンパク質を含むジンクフィンガーヌクレアーゼを設計及び構築する方法は当業界で公知である。具体的な実施態様では、ジンクフィンガーヌクレアーゼのヌクレアーゼドメインはFokIである。ジンクフィンガータンパク質とFokIのヌクレアーゼとの融合タンパク質は2つの塩基対から成るスペーサーを含むことができる。また別には、スペーサーは3、4、5、6、又は7つ以上の塩基対から成ることができる。ある実施態様では、第一のジンクフィンガーヌクレアーゼのエンドヌクレアーゼが第二のジンクフィンガーヌクレアーゼと接触したときにダイマー化することができるように、7塩基対のスペーサーを有する融合タンパク質が記載される。ここでは、前記ジンクフィンガーヌクレアーゼを構成する2つのジンクフィンガータンパク質は、標的DNA配列の上流と下流に結合することができる。ダイマー化に際して、ジンクフィンガーヌクレアーゼは標的ヌクレオチド配列に二本鎖ブレークを導入し、その後に二本鎖ブレークの両側にフランキングする領域と相同性を有する外因性ヌクレオチド配列との相同性末端結合又は相同組換えが続く。
さらに別の実施態様では、ジンクフィンガータンパク質及びエンハンサータンパク質を含み、ジンクフィンガーアクチベーターを生じる融合タンパク質が提供される。ジンクフィンガーアクチベーターを用いて、NtMNS1a、NtMNS1b、NtMNS2又はNtMan1.4の転写をアップレギュレート又は活性化することができる。前記は以下の工程を含む：（i）NtMNS1a、NtMNS1b、NtMNS2又はNtMan1.4のコード配列と作動できるように連結されたプロモーター又は配列内の領域と結合するジンクフィンガータンパク質を操作する工程；（ii）前記ジンクフィンガータンパク質と転写アクチベーターとの融合タンパク質を作製する工程；（iii）細胞（例えば植物細胞）内で活性なプロモーターの制御下で前記ジンクフィンガーアクチベーターをコードするポリヌクレオチド配列を含む発現構築物を作製する工程；（iv）前記遺伝子構築物を前記細胞に導入する工程；（v）前記細胞を培養し、ジンクフィンガーアクチベーターを発現させる工程；及び（vi）NtMNS1a、NtMNS1b、NtMNS2又はNtMan1.4の発現の増加を示す細胞の特徴を決定する工程。
さらに別の実施態様では、本発明は、ジンクフィンガータンパク質及び遺伝子リプレッサーを含みジンクフィンガーリプレッサーを生じる融合タンパク質を提供する。ジンクフィンガーリプレッサーを用いて、NtMNS1a、NtMNS1b、NtMNS2又はNtMan1.4の転写をダウンレギュレート又は抑制することができる。前記は以下の工程を含む：（i）NtMNS1a、NtMNS1b、NtMNS2又はNtMan1.4と作動できるように連結されたプロモーター又は配列内の領域と結合するジンクフィンガータンパク質を操作する工程；（ii）前記ジンクフィンガータンパク質と転写リプレッサーとの融合タンパク質を作製する工程；（iii）細胞（例えば植物細胞）内で活性なプロモーターの制御下で前記ジンクフィンガーリプレッサーをコードするポリヌクレオチド配列を含む発現構築物を開発する工程；（iv）前記遺伝子構築物を前記細胞に導入する工程；（v）ジンクフィンガーリプレッサーの発現を提供する工程；及び（vi）NtMNS1a、NtMNS1b、NtMNS2又はNtMan1.4の転写の低下を示す細胞の特徴を決定する工程。
さらに別の実施態様では、本発明は、ジンクフィンガータンパク質及びメチラーゼを含みジンクフィンガーメチラーゼを生じる融合タンパク質を提供する。ジンクフィンガーメチラーゼを用いて、細胞（例えば植物細胞）内でのNtMNS1a、NtMNS1b、NtMNS2又はNtMan1.4の発現をNtMNS1a、NtMNS1b、NtMNS2又はNtMan1.4のプロモーター領域内の領域をメチル化することによってダウンレギュレート又は阻害することができる。前記は以下の工程を含む：（i）配列番号：1、配列番号：32、又は配列番号：63内のコード配列の上流に存在するNtMNS1a、NtMNS1b、NtMNS2又はNtMan1.4のプロモーター内の領域と結合することができるジンクフィンガータンパク質を操作する工程；（ii）前記ジンクフィンガータンパク質とメチラーゼとの融合タンパク質を作製する工程；（iii）細胞内で活性なプロモーターの制御下で前記ジンクフィンガーメチラーゼをコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子構築物を開発する工程；（iv）前記遺伝子構築物を前記細胞に導入する工程；（v）ジンクフィンガーメチラーゼを発現させる工程；及び（vi）細胞内でのNtMNS1a、NtMNS1b、NtMNS2又はNtMan1.4の発現が低下した、又は本質的に発現がない細胞の特徴を決定する工程。
本発明の多様な実施態様では、NtMNS1a、NtMNS1b又はNtMNS2の調節配列と結合するように、本発明の方法にしたがってジンクフィンガータンパク質を選択することができる。より具体的には、前記調節配列は、転写開始部位、開始コドン、エクソン領域、エクソン-イントロン境界、ターミネーター又は終止コドンを含む。ジンクフィンガータンパク質は、ヌクレアーゼ、アクチベーター又はリプレッサータンパク質と融合させることができる。
本発明の多様な実施態様では、ジンクフィンガーヌクレアーゼは、NtMNS1a、NtMNS1b、NtMNS2又はNtMan1.4のゲノムDNA配列の調節領域、コード領域又は非コード領域に二本鎖ブレークを導入し、NtMNS1a、NtMNS1b、NtMNS2又はNtMan1.4の発現レベルの低下、抑制若しくは実質的抑制、又は前記によってコードされるアルファ-マンノシダーゼI若しくは当該タンパク質のマンノース加水分解活性の低下、阻害若しくは実質的阻害をもたらす。
本発明はまた、以下の工程を含む細胞（例えば植物細胞）を改変する方法を提供する（前記方法では植物細胞のゲノムがジンクフィンガーヌクレアーゼ媒介変異導入によって改変される）：（a）ゲノムヌクレオチド配列内の異なる標的部位に改変のために選択的に結合する少なくとも2つの非天然ジンクフィンガータンパク質を同定し作製する工程；（b）少なくとも2つの融合タンパク質（各々がヌクレアーゼ及び前記少なくとも2つの非天然ジンクフィンガータンパク質の1つを含む）を、植物ゲノムのゲノムヌクレオチド配列内に、特にゲノムヌクレオチド配列内の標的部位又はその近くに二本鎖ブレークが導入されるように植物細胞内で発現させる工程；及び、場合によって（c）二本鎖ブレークの上流の配列と相同な第一の領域及び二本鎖ブレークの下流の領域と相同な第二の領域を含むヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを、前記ポリヌクレオチドがゲノム内のDNAと組換えを生じるように細胞に導入する工程。さらにまた開示されるものは、1つ以上の融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む1つ以上の発現構築物を含む細胞である。
メガヌクレアーゼ媒介変異導入の一般的な使用は当業界で公知であり、特許公開公報、例えばWO96/14408、WO03/025183、WO03/078619、WO04/067736、WO07/047859及びWO09/059195に記載されている。ある種の実施態様では、NtMNS1a、NtMNS1b、NtMNS2又はNtMan1.4を破壊するために、メガヌクレアーゼ（例えば組換えメガヌクレアーゼ）を用いて、特異的に植物のゲノムDNA内のただ1つの部位又は比較的少数の部位に二本鎖ブレークが引き起こされる。メガヌクレアーゼは、WO07/047859に記載のDNA認識特性を有する操作されたメガヌクレアーゼでもよい（WO07/047859は、天然に存在するメガヌクレアーゼI-Crelから誘導されるメガヌクレアーゼの構造に依拠する操作方法を開示する）。
ジンクフィンガーヌクレアーゼ若しくはメガヌクレアーゼタンパク質又はジンクフィンガータンパク質ペアは、当業界で公知の任意の適切な方法により植物細胞に提供することができる。例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼは外因的に植物細胞に添加することができ、この植物細胞をジンクフィンガーヌクレアーゼのジンクフィンガータンパク質が標的ヌクレオチド配列と結合し、前記ヌクレアーゼの活性を介して前記標的遺伝子を改変する条件下で維持する。また別には、ジンクフィンガータンパク質をコードするヌクレオチド配列を植物細胞で発現させることができ、発現ジンクフィンガータンパク質が標的ヌクレオチド配列と結合し、植物細胞で標的遺伝子の発現を調節する条件下で前記細胞を維持する。ジンクフィンガーヌクレアーゼは、任意の適切な植物発現ベクターを用いて植物で発現させることができる。高等植物での遺伝子の発現に有用な典型的なベクターは当業界で周知である。
NtMNSアルファ-マンノシダーゼI活性を調整する組成物及び方法：
本発明の実施態様は、アルファマンノシダーゼIによってコードされるタンパク質の活性又はそのようなタンパク質をコードする遺伝子の転写を低下又は増加させることによって、アルファ-マンノシダーゼI活性が低下又は増加するように改変させた非天然の又はトランスジェニックな植物を作出する組成物及び方法に向けられる。NtMNS1a、NtMNS1b、NtMNS2又はNtMan1.4のRNAの定常状態レベルをコントロール植物と比較して低下又は増加させることができる。結果として、糖タンパク質のN-グリカンのマンノースの加水分解に利用できる機能的に活性なNtMNS1a、NtMNS1b、NtMNS2又はNtMan1.4アルファ-マンノシダーゼI酵素の数を、当該植物細胞の糖タンパク質のN-グリカンのマンノースレベルが増加又は低下するように低下又は増加させることができる。
NtMNS1a、NtMNS1b、NtMNS2又はNtMan1.4の発現の低下は約5％から約100％、又は少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも25％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％又は100％までの低下であり得る（前記は転写活性又はタンパク質発現の低下を含む）。
NtMNS1a、NtMNS1b、NtMNS2又はNtMan1.4ポリペプチドの活性の低下は約5％から約100％、又は少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも25％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％又は100％までの低下であり得る。
NtMNS1a、NtMNS1b又はNtMNS2の発現の増加は約10％から約1000％、又は少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも25％、少なくとも50％、少なくとも100％、少なくとも200％、少なくとも500％、少なくとも750％又は1000％までの増加であり得る（前記は転写活性又はタンパク質発現の増加を含む）。
NtMNS1a、NtMNS1b、NtMNS2又はNtMan1.4ポリペプチドの活性の増加は約10％から約1000％、又は少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも25％、少なくとも50％、少なくとも100％、少なくとも200％、少なくとも500％、少なくとも750％又は1000％までの増加であり得る．
阻害は、約98％から約100％の低下、又は少なくとも98％、少なくとも99％、特に100％の低下を指す。
構築物及びベクター：
本発明のポリヌクレオチドを発現させるために、本明細書で提供する組換え構築物を用いて植物又は植物細胞を形質転換できる。組換え核酸構築物は、植物又は細胞での異種ポリペプチドの発現に適切な調節領域に作動できるように連結された、本明細書に記載の異種タンパク質をコードする核酸を含むことができる。組換え核酸構築物（例えば本明細書に記載されたもの）を含むベクターが提供される。適切なベクターの骨格には、例えば当業界で日常的に用いられるもの（例えばプラスミド、ウイルス、人工染色体、BAC、YAC又はPAC）が含まれる。適切な発現ベクターにはプラスミド及びウイルスベクター（例えばバクテリオファージ、バキュロウイルス及びレトロウイルスから誘導される）が含まれるが、ただしこれらに限定されない。多数のベクター及び発現系が商業的に入手できる。
ベクターはまた、複製起点、足場結合領域（SAR）又はマーカーを含むことができる。マーカー遺伝子は、植物細胞に選別可能な表現型を付与することができる。例えばマーカーは、殺生物剤耐性、例えば抗生物質（例えばカナマイシン、G418、ブレオマイシン又はヒグロマイシン）に対する耐性、又は除草剤（例えばグリフォセート、クロルスルフロン又はホスフィノスリシン）に対する耐性を付与することができる。さらにまた、発現ベクターは、発現されたポリペプチドの操作又は検出（例えば精製又は局在）を容易にするために設計されたタグ配列を含むことができる。タグ配列（例えばルシフェラーゼ、ベータ-グルクロニダーゼ（GUS）、緑色蛍光タンパク質（GFP）、グルタチオンS-トランスフェラーゼ（GST）、ポリヒスチジン、c-myc又はヘマグルチニン配列）は、典型的にはコードされるポリペプチドとの融合物として発現される。そのようなタグはポリペプチド内の任意の場所（カルボキシル又はアミノ末端のどちらかを含む）に挿入することができる。
改変アルファ-マンノシダーゼI活性を有するトランスジェニック又は非天然植物細胞及び植物：
多様な実施態様が、種々の方法によりアルファ-マンノシダーゼI活性に関して改変された、トランスジェニックで天然に存在しない植物に向けられる。前記方法は、NtMNS遺伝子発現を低下させるか又はサイレンシングさせ、それによってNtMNSアルファ-マンノシダーゼI酵素活性の発現レベルが問題の植物組織内で低下し得る植物を作出するために利用できる。他の実施態様は、NtMNS発現を増加させアルファ-マンノシダーゼI活性レベルの増加をもたらすために利用できる多様な方法によって改変された植物細胞及び植物に向けられる。
遺伝的改変に適切な植物には単子葉及び双子葉植物並びに植物細胞系が含まれ、前記には以下の科の1つに由来する種が含まれる：アカンタセアエ（Acanthaceae）、アリアセアエ（Alliaceae）、アルストロエメリアセアエ（Alstroemeriaceae）、アマリリダセアエ（Amaryllidaceae）、アポシナセアエ（Apocynaceae）、アレカセアエ（Arecaceae）、アステラセアエ（Asteraceae）、ベルベリダセアエ（Berberidaceae）、ビキサセアエ（Bixaceae）、ブラッシカセアエ（Brassicaceae）、ブロメリアセアエ（Bromeliaceae）、カンナバセアエ（Cannabaceae）、カリオフィラセアエ（Caryophyllaceae）、セファロタキサセアエ（Cephalotaxaceae）、チェノポジアセアエ（Chenopodiaceae）、コリキカセアエ（Colchicaceae）、ククルビタセアエ（Cucurbitaceae）、ジオスコレアセアエ（Dioscoreaceae）、エフェドラセアエ（Ephedraceae）、エリスロキシラセアエ（Erythroxylaceae）、ユーフォルビアセアエ（Euphorbiaceae）、ファバセアエ（Fabaceae）、ラミアセアエ（Lamiaceae）、リナセアエ（Linaceae）、リコポジアセアエ（Lycopodiaceae）、マルバセアエ（Malvaceae）、メランシアセアエ（Melanthiaceae）、ムサセアエ（Musaceae）、ミルタセアエ（Myrtaceae）、ニッサセアエ（Nyssaceae）、パパベラセアエ（Papaveraceae）、ピナセアエ（Pinaceae）、プランタギナセアエ（Plantaginaceae）、ポアセアエ（Poaceae）、ロサセアエ（Rosaceae）、ルビアセアエ（Rubiaceae）、サリカセアエ（Salicaceae）、サピンダセアエ（Sapindaceae）、ソラナセアエ（Solanaceae）、タキサセアエ（Taxaceae）、テアセアエ（Theaceae）又はビタセアエ（Vitaceae）。
適切な種は以下の属のメンバーを含むことができる：アベルモスクス（Abelmoschus）、アビエス（Abies）、アーセル（Acer）、アグロスチス（Agrostis）、アリウム（Allium）、アルストロエメリア（Alstroemeria）、アナナス（Ananas）、アンドログラフィス（Andrographis）、アンドロポゴン（Andropogon）、アルテミシア（Artemisia）、アルンド（Arundo）、アトロパ（Atropa）、ベルベリス（Berberis）、ベータ（Beta）、ビキサ（Bixa）、ブラシッカ（Brassica）、カレンデュラ（Calendula）、カメリア（Camellia）、カンポテカ（Camptotheca）、カンナビス（Cannabis）、カプシクム（Capsicum）、カルタムス（Carthamus）、カサランツス（Catharanthus）、セファロタクス（Cephalotaxus）、クリサンテマム（Chrysanthemum）、シンコナ（Cinchona）、シトルルス（Citrullus）、コフェア（Coffea）、コルキクム（Colchicum）、コレウス（Coleus）、ククミス（Cucumis）、ククルビタ（Cucurbita）、シノドン（Cynodon）、ダツラ（Datura）、ジアンタス（Dianthus）、ジギタリス（Digitalis）、ジオスコレア（Dioscorea）、エラエイス（Elaeis）、エフェドラ（Ephedra）、エリアンタス（Erianthus）、エリスロキシルム（Erythroxylum）、ユーカリプタス（Eucalyptus）、フェスツカ（Festuca）、フラガリア（Fragaria）、ガランタス（Galanthus）、グリシン（Glycine）、ゴッシピウム（Gossypium）、ヘリアンタス（Helianthus）、ヘベア（Hevea）、ホルデウム（Hordeum）、ヒオシアムス（Hyoscyamus）、ジャトロファ（Jatropha）、ラクツカ（Lactuca）、リヌム（Linum）、ロリウム（Lolium）、ルピヌス（Lupinus）、リコペルシコン（Lycopersicon）、リコポジウム（Lycopodium）、マニホト（Manihot）、メジカゴ（Medicago）、メンタ（Mentha）、ミスカンタス（Miscanthus）、ムサ（Musa）、ニコチアナ（Nicotiana）、オリザ（Oryza）、パニュクム（Panicum）、パパベル（Papaver）、パルテニウム（Parthenium）、ペニセタム（Pennisetum）、ペツニア（Petunia）、ファラリス（Phalaris）、フェレウム（Phleum）、ピヌス（Pinus）、ポア（Poa）、ポインセチア（Poinsettia）、ポプルス（Populus）、ラウウォルフィア（Rauwolfia）、リキヌス（Ricinus）、ロサ（Rosa）、サッカルム（Saccharum）、サリクス（Salix）、サングイナリア（Sanguinaria）、スコポリア（Scopolia）、セカレ（Secale）、ソラナム（Solanum）、ソルグム（Sorghum）、スパルチナ（Spartina）、スピナセア（Spinacea）、タナセツム（Tanacetum）、タクス（Taxus）、テオブロマ（Theobroma）、トリチコセカレ（Triticosecale）、トリチクム（Triticum）、ウニオラ（Uniola）、ベラトラム（Veratrum）、ビンカ（Vinca）、ビチス（Vitis）及びゼア（Zea）。
適切な種には以下が含まれ得る：パニクム亜種、ソルグム亜種、ミスカンタス亜種、サッカルム亜種、エリアンタス亜種、ポプルス亜種、アンドロポドン・ゲラルジー（Andropogon gerardii）（ビッグブルーステム）、ペニセツム・プルプレウム（Pennisetum purpureum）（アフリカチカラシバ）、パパリス・アルンジナセア（Phalaris arundinacea）（リードカナリアグラス）、シノドン・ダクチロン（Cynodon dactylon）（バミューダグラス）、フェスツカ・アルンジナセア（Festuca arundinacea）（ウシノケグサ）、スパルチナ・ペクチナタ（Spartina pectinata）（プレーリーコードグラス）、メジカゴ・サチバ（Medicago sativa）（アルファルファ）、アルンド・ドナクス（Arundo donax）（ジャイアントリード）、セカレ・セレアレ（Secale cereale）（ライムギ）、サリックス亜種（ヤナギ）、ユーカリプタス亜種（ユーカリ）、トリチコセカレ（トリチクム：コムギ、タイムス、ライムギ）、タケ、ヘリアンタス・アヌヌス（Helianthus annuus）（ヒマワリ）、カルタムス・チンクトリウス（Carthamus tinctorius）（ベニバナ）、ジャトロファ・クルカス（Jatropha curcas）（ジャトロファ）、リシヌス・コムニス（Ricinus communis）（クリ）、エラエイス・グイネエンシス（Elaeis guineensis）（ヤシ）、リヌム・ウシタチッシマム（Linum usitatissimum）（アマ）、ブラシッカ・ジュンセア（Brassica juncea）、ベータ・ブルガリス（Beta vulgaris）（サトウダイコン）、マニホト・エスクレンタ（Manihot esculenta）（キャッサヤ）、リコペルシコン・エスクレンタム（Lycopersicon esculentum）（トマト）、ラクツカ・サチバ（Lactuca sativa）（レタス）、ムサ・パラジシアカ（Musa paradisiaca）（バナナ）、ソラナム・ツベロスム（Solanum tuberosum）（ジャガイモ）、ブラシッカ・オレラセア（Brassica oleracea）（ブロッコリー、カリフラワー、芽キャベツ）、カメリア・シネンシス（Camellia sinensis）（茶）、フラガリア・アナナッサ（Fragaria ananassa）（イチゴ）、テオブロマ・カカオ（Theobroma cacao）（ココア）、コフェア・アラビカ（Coffea arabica）（コーヒー）、ビチス・ビニフェラ（Vitis vinifera）（ブドウ）、アナナス・コモスス（Ananas comosus）（パイナップル）、カプシクム・アヌム（Capsicum annum）（トウガラシ、ピーマン）、アリウム・セパ（Allium cepa）（タマネギ）、ククミス・メロ（Cucumis melo）（メロン）、ククミス・サチバス（Cucumis sativus）（キュウリ）、ククルビタ・マキシマ（Cucurbita maxima）（スクォッシュ）、ククルビタ・モスチャタ（Cucurbita moschata）（スクォッシュ）、スピナセア・オレラセア（Spinacea oleracea）（ホーレンソウ）、シトルルス・ラナツス（Citrullus lanatus）（スイカ）、アベルモスクス・エスクレンタス（Abelmoschus esculentus）（オクラ）、ソラナム・メロンゲナ（Solanum melongena）（ナス）、ロサ亜種（バラ）、ジアンタス・カリオフィルス（Dianthus caryophyllus）（カーネーション）、ペツニア亜種（ペチュニア）、ポインセチア・プルケリマ（Poinsettia pulcherrima）（ポインセチア）、ルピヌス・アルブス（Lupinus albus）（ルピナス）、ウニオラ・パニクラタ（Uniola paniculata）（エンバク）、コヌカグサ（アグロスチス亜種）、ポプルス・トレムロイデス（Populus tremuloides）（ポプラ）、ピヌス亜種（マツ）、アビエス亜種（モミ）、アーセル亜種（カエデ）、ホルデウム・ブルガレ（Hordeum vulgare）（オオムギ）、ポア・プラテンシス（Poa pratensis）（ブルーグラス）、ロリウム亜種（ライグラス）及びフレウム・プラテンセ（）（チモシー）、パニクム・ビルガツム（Panicum virgatum）（アメリカクサキビ）、ソルグム・ビコラー（Sorghum bicolor）（ソルガム、スーダングラス）、ミスカンタス・ギガンテウス（Miscanthus giganteus）（ミスカンタス）、サッチャルム亜種（エネルギーケイン）、ポプルス・バルサミフェラ（Populus balsamifera）（ポプラ）、ゼア・マイス（Zea mays）（トウモロコシ）、グリシン・マクス（Glycine max）（ダイズ）、ブラシッカ・ナプス（Brassica napus）（キャノーラ）、トリチクム・アエスチブム（Triticum aestivum）（コムギ）、ゴシッピウム・ヒルスツム（Gossypium hirsutum）（ワタ）、オリザ・サチバ（Oryza sativa）（イネ）、ヘリアンタス・アヌウス（Helianthus annuus）（ヒマワリ）、メジカゴ・サチバ（Medicago sativa）（アルファルファ）、ベータ・ブルガリス（Beta vulgaris）（サトウダイコン）、又はペニセツム・グラウクム（Pennisetum glaucum）（トンジンビエ）。
多様な実施態様が、NtMNS1a、NtMNS1b、NtMNS2又はNtMan1.4遺伝子発現レベルが種々の方法によって改変され、それによって対象の植物組織内でNtMNS1a、NtMNS1b、NtMNS2又はNtMan1.4アルファ-マンノシダーゼI酵素レベルが低下又は増加し得るトランスジェニックで天然に存在しないタバコ植物に向けられる。開示の組成物及び方法は関心のある任意の植物種に適用できる。前記植物にはニコチアナ属の植物、以下を含むニコチアナの多様な種が含まれる：N.ルスチカ（rustica）及びN.タバクム（tabacum）、例えばLA B21、LN KY171、TI 1406、バスマ（Basma）、ガルパオ（Galpao）、ペリクー（Perique）、ベインハート（Beinhart）1000-1、ペチコ（Petico）、デルフィールド（Delfield）、オッタワ（Ottawa）、コーカー（Coker）48、ラブ（Labu）、デリー（Delhi）、TI 115、イェローマンモス（Yellow Mammoth）、ハバナ（Havana）307、バーリー（Burley）1、キサンシー（Xanthi）、デルゴールド（Delgold）、TI 90、グリーンブライア（Green Briar）、TI 161、ケンタッキー（Kentucky）16、メリーランド（Maryland）201、ハバナ（Havana）38、ダッケスン（Duquesne）、バーリー（Burley）49、CT 681、81V9 MS、TI 170、ジューディースプライド（Judy's Pride）、TI 164、CT 572、TI 158、ケンタッキー10、カネル（Cannelle）、ベル（Bell）C、コーカー（Coker）371ゴールド、サムスン（Samsun）、ターキッシュサムスン（Turkish Samsun）、サムシンNN、TI 94、ベルB、CT 157、TI 75、ホワイトマンモス（White Mammoth）、ビニカ（Vinica）、ケリー（Kelly）、グランドルージュ（Grande Rouge）、ゴールドダラー（Gold Dollar）、ベルギーク（Belgique）3007、ホワイトゴールド、ヒックスブロードリーフ（Hicks Broadleaf）、リトルクリッテンデン（Little Crittenden）、ボナンザ（Bonanza）、ハバナ425。他の種には以下が含まれる：N.アカウリス（acaulis）、N.アクミナタ（acuminata）、N.アクミナタ多花品種（N. a. var. multiflora）、N.アフリカーナ（africana）、N.アラタ（alata）、N.アｍプレキシカウリス（amplexicaulis）、N.アレンツイー（arentsii）、N.アテニュアータ（attenuata）、N.ベナビデシー（benavidesii）、N.ベンタミアナ（benthamiana）、N.ビゲロビー（bigelovii）、N.ボナリエンシス（bonariensis）、N.カビコラ（cavicola）、N.クレベランジー（clevelandii）、N.コルジフォリア（cordifolia）、N.コリムボサ（corymbosa）、N.デブネイー（debneyi）、N.エクセルシア（excelsior）、N.フォルゲチアナ（forgetiana）、N.フラグランス（fragrans）、N.グラウカ（glauca）、N.グルチノサ（glutinosa）、N.グードスページー（goodspeedii）、N.ゴッセイ（gossei）、N.ハイブリド（hybrid）、N.イングルバ（ingulba）、N.カワカミー（kawakamii）、N.ナイチアナ（knightiana）、N.ラングスドルフィー（langsdorffii）、N.リニアリス（linearis）、N.ロンギフローラ（longiflora）、N.マリチマ（maritima）、N.メガロシフォン（megalosiphon）、N.ミエルシー（miersii）、N.ノクチフロラ（noctiflora）、N.ヌジカウリス（nudicaulis）、N.オブツシホリア（obtusifolia）、N.オクシデンタリス（occidentalis）、N.オクシデンタリス亜種ヘスペリス（Hesperis）、N.オトフォラ（otophora）、N.パニクラタ（paniculata）、N.パウシフロラ（pauciflora）、N.ペツニオイデス（petunioides）、N.プルムバギニフォリア（plumbaginifolia）、N.クアドリバルビス（quadrivalvis）、N.ライモンジー（raimondii）、N.レパンダ（repanda）、N.ロスラタ（rosulata）、N.ロスラタ亜種イングルバ（Ingulba）、N.ロツンジフォリア（rotundifolia）、N.セッチェリー（setchellii）、N.シムランス（simulans）、N.ソラニフォリア（solanifolia）、N.スペガジニー（spegazzinii）、N.ストックトニー（stocktonii）、N.スアベオレンス（suaveolens）、N.シルベストリス（sylvestris）、N.シルシフロラ（thyrsiflora）、N.トメントサ（tomentosa）、N.トメトシホルミス（tomentosiformis）、N.トリゴノフィラ（trigonophylla）、N.ウンブラチカ（umbratica）、N.ウンデュラタ（undulata）、N.ベルチナ（velutina）、N.ウィガンジオイデス（wigandioides）及びN. x サンデラエ（sanderae）。栽培品種及び精選栽培品種の使用もまた本明細書で意図される。
本発明の方法によって改変できるニコチアナ・タバクムの品種、育種系統及び栽培品種の非限定的な例には以下が含まれる：N.タバクムアクセッションPM016、PM021、PM92、PM102、PM132、PM204、PM205、PM215、PM216又はPM217（NCIMB（Aberdeen, Scotland）に寄託）、又はDAC Mata Fina、PO2、BY-64、AS44、RG17、RG8、HB04P、バスマ・キサンティ（Basma Xanthi）BX 2A、コーカー319、ヒックス（Hicks）、マクネア（McNair）944 (MN 944)、バーリー（Burley）21、K149、ヤカ（Yaka）JB 125/3、カスツリ・マワー（Kasturi Mawar）、NC 297、コーカー371ゴールド、PO2、ウィスリカ（Wislica）、シンマバ（Simmaba）、ターキッシュサムソン（Turkish Samsun）、AA37-1、B13P、BU21とホヤ・パラド（Hoja Parado）系統系統97との交雑に由来するF4、サムスンNN、イズミア（Izmir）、キサンシー（Xanthi）NN、カラバルガー（Karabalgar）、デニズリ（Denizli）及びPO1。
変異の積み重ね：
多様な実施態様が、NtMNS1a、NtMNS1b、NtMNS2又はNtMan1.4遺伝子発現レベルが改変され、さらにまた以下を調整するために改変されたトランスジェニックで天然に存在しないタバコ植物に向けられる：（i）NtMNS1a及びNtMNS1bの発現、又は（ii）NtMNS1a及びNtMNS2の発現、又は（iii）NtMNS1a及びNtMan1.4の発現、又は（iv）NtMNS1b及びNtMNS2の発現、又は（v）NtMNS1b及びNtMan1.4の発現、又は（vi）NtMNS2及びNtMan1.4の発現、又は（vii）NtMNS1a及びNtMNS1b及びNtMNS2の発現、又は（viii）NtMNS1a及びNtMNS2及びNtMan1.4の発現、又は（ix）NtMNS1a及びNtMNS1b及びNtMan1.4の発現、又は（x）NtMNS1b及びNtMNS2及びNtMan1.4の発現、又は（xi）NtMNS1a及びNtMNS1b及びNtMNS2及びNtMan1.4の発現、又はより多くのさらに別の関心のある内因性遺伝子の発現。他の改変の例には、ヒトでの使用に好ましい免疫原性特性を有するタンパク質を産生する植物が含まれるが、ただし前記に限定されない。例えば、そのN-グリカンにアルファ-1,3-結合フコース残基及びベータ-1,2-結合キシロース残基を実質的に欠くタンパク質を産生することができる植物は有用であり得る。
植物育種：
本発明にしたがえば、NtMNS1a、NtMNS1b、NtMNS2又はNtMan1.4（又は本明細書で多様な実施態様に記載されたその任意の組合せ）の変異対立遺伝子を保有するタバコ植物を植物育種プログラムで用いて、有用な系統、品種及びハイブリッドを作出することができる、特に、変異対立遺伝子を上記に記載の品種に異種間浸透させる。したがって、変異体植物、天然に存在しない植物、又は上記に記載のトランスジェニック植物を異なる遺伝的実体を含む植物と交雑する工程を含む、植物育種方法が提供される。本方法はさらに、子孫植物を別の植物と交雑し、さらに場合によって、所望の遺伝的特質又は遺伝的背景を有する子孫が得られるまで交雑を繰り返す工程を含むことができる。そのような交雑方法によって供される1つの目的は、他の品種、育種系統、ハイブリッド又は栽培品種、特に商業的に関心がもたれるもの（例えば異種タンパク質をコードする発現可能なポリヌクレオチドを既に含んでいるもの）に、所望の遺伝的特質を導入することである。別の目的は、単一の植物品種、系統、ハイブリッド又は栽培品種中の種々の遺伝子の遺伝的改変の積み重ねを容易にすることである。種間交配と同様に種内交配が意図される。そのような交雑から生じた子孫植物（育種系統とも称される）は、天然に存在しない本発明の植物の例である。
ある実施態様では、以下の工程を含む、天然に存在しないタバコの植物を作出する方法が提供される：（a）変異体タバコ植物又はトランスジェニックなタバコ植物を第二のタバコ植物と交雑して子孫タバコの種子を得る工程；（b）植物の生育条件下で前記子孫タバコの種子を生育させて天然に存在しないタバコ植物を得る工程。前記方法はさらに以下の工程を含む：（c）前の世代の天然に存在しないタバコ植物をそれ自体又は別のタバコ植物と交雑して子孫タバコの種子を得る工程；（d）工程（c）の子孫タバコの種子を植物の生育条件下で生育させてさらに別の天然に存在しないタバコ植物を得る工程；及び（e）（c）及び（d）の交雑及び生育工程を何回も繰り返して天然に存在しないタバコ植物の更なる世代を作出する工程。前記方法は、場合によって工程（a）の前に、特徴を調べて変異体植物又はトランスジェニック植物とは同一でない遺伝的実体を含む親植物を提供する工程を含むことができる。いくつかの実施態様では、天然に存在しないタバコ植物を作出するために、育種プログラムにしたがって交雑及び生育工程は、0から2回、0から3回、0から4回、0から5回、0から6回、0から7回、0から8回、0から9回、0から10回繰り返される。戻し交配は、親の一方の遺伝的実体とより近い遺伝的実体を有する次の世代の子孫植物を得るために、その親の一方又はその親と遺伝的に類似する別の植物と子孫が交雑されるそのような方法の一例である。植物育種、特にタバコの植物育種のための技術は周知であり、本発明の方法で用いることができる。本発明はさらにこれらの方法によって産出される天然に存在しないタバコ植物を提供する。
本明細書に記載の方法のいくつかの実施態様では、変種遺伝子の育種及びスクリーニングから生じた系統が、標準的な野外手順を用いて野外で評価される。第一の変異が導入されていない親を含むコントロールの遺伝子型を加え、登録は任意抽出された完全なブロックデザイン又はフィールドデザインで野外で整えられる。データの統計解析を実施して、選別した系統の親系統との類似性を確認する。選別植物の細胞遺伝学的解析も場合によって実施して、染色体総数及び染色体対合関係を確認する。
DNAフィンガープリント、一ヌクレオチド多形性、マイクロサテライトマーカー、又は同様な技術をマーカー支援選別（MAS）育種プログラムで用いて、1つの遺伝子の変異対立遺伝子を他のタバコに本明細書に記載するように移転又は繁殖させることができる。例えば、育種家は、農学的に所望される遺伝子型を有する変異対立遺伝子を含む遺伝子型の雑種から分離集団を作出することができる。本明細書に列挙した技術を用い、F2又は戻し交配世代の植物をゲノム配列又はそのフラグメントから生じたマーカーによりスクリーニングすることができる。変異対立遺伝子を保有すると同定された植物を戻し交配又は自家受粉させて、スクリーニングすることができる第二の集団を作出できる。予想される遺伝パターン又は用いられるMAS技術に応じて、戻し交配の各サイクルの前に選別植物を自家受粉させて、所望の個々の植物の同定を補助することが必要かもしれない。戻し交配又は他の育種方法を、再出現する親の所望の表現型が回収されるまで繰り返すことができる
本開示にしたがえば、ある育種プログラムでは良好な交雑は生殖能力を有するF1植物を生じる。選別F1植物を親の一方と交雑し、さらに最初の戻し交配世代を自家受粉させて集団を得て、これを再度変種遺伝子発現（例えば当該遺伝子のゼロ型）についてスクリーニングすることができる。最終的なスクリーニングで生殖能力を有し再出現の親と相応に類似する植物が得られるまで、戻し交配、自家受粉及びスクリーニングのプロセスを例えば少なくとも4回繰り返す。所望の場合は、前記植物を自家受粉させ、続いて子孫を再度スクリーニングして当該植物が変種遺伝子の発現を示すことを確認する。いくつかの実施態様では、F2世代の植物集団を変種遺伝子発現についてスクリーニングし、例えば、遺伝子が存在しないためにポリペプチドを発現できない植物が、標準的な方法にしたがって（例えばPCR方法を用いて）同定される。前記PCR方法では、本明細書に記載のNtMNS1a、NtMNS1b、NtMNS2又はNtMan1.4ポリヌクレオチド（又はその任意の組み合わせ）を含むポリヌクレオチドについてのヌクレオチド配列情報によるプライマーが使用される。
ハイブリッドタバコ品種は、第一の品種の雌の親植物（すなわち種子の親）の自家受粉を防止し、第二の品種の雄の親植物の花粉を受け入れて雌の親植物を受精させ、当該雌植物でF1ハイブリッドの種子を形成させる。雌植物の自家受粉は、花の発育の初期段階で花を除雄することによって防止できる。また別には、雌の親で雄性不稔の形態を利用して花粉の形成を妨げることができる。例えば、雄性不稔は、細胞質雄性不稔（CMS）、又はトランスジェニック雄性不稔（トランスジーンが小胞子形成及び／又は花粉形成を阻害する）又は自己不適合によってもたらされ得る。CMSを含む雌の親植物は特に有用である。雌親植物がCMSである実施態様では、花粉は生殖能力を有する雄植物から採集して、CMS雌親植物の柱頭に手で適用し、生成されるF1種子を採集する。
本明細書に記載の品種及び系統を用いて、単交雑タバコF1ハイブリッドを形成することができる。そのような実施態様では、親品種の植物を実質的に均質な隣接集団として生育させて、雄親植物から雌親植物への自然な交雑受粉を促進させることができる。雌親植物で形成されたF1種子を通常の手段によって選択的に採集する。さらにまた二親の植物品種を塊として生育させ、自家受粉の結果として雌親及び雄親で形成されたF1ハイブリッド種子を採集する。また別には、単交雑F1ハイブリッドが雌親として用いられ種々の雄親と交雑される三系交雑を実施できる。別の代替方法として、2つの別個の単交雑のF1子孫自体を交雑させる二重交雑ハイブリッドを作出することができる。
変異体（天然に存在しないか又はトランスジェニック植物）の集団を、所望の特質又は表現型を有する集団のメンバーについてスクリーニング又は選別することができる。例えば、1回の形質転換事象を経た子孫集団を、NtMNS1a、NtMNS1b、NtMNS2若しくはNtMan1.4又はそれらによってコードされるポリペプチドの発現若しくは活性の所望のレベルを有する植物についてスクリーニングすることができる。物理的及び生化学的方法を用いて発現又は活性レベルを認定することができる。これら方法には以下が含まれる：ポリヌクレオチドの検出にはサザン分析又はPCR増幅；RNA転写物の検出にはノザンブロット、S1 RNase保護、プライマー-伸長又はRT-PCR増幅；ポリペプチド及びポリヌクレオチドの酵素活性又はリボザイム活性の検出には酵素アッセイ；並びにポリペプチドの検出にはタンパク質ゲル電気泳動、ウェスタンブロット、免疫沈澱、及び酵素結合免疫アッセイ。他の技術（例えばin situハイブリダイゼーション、酵素染色、並びに免疫染色及び酵素アッセイ）もまた、ポリペプチド又はポリヌクレオチドの発現又は活性の有無の検出に用いることができる。
変異体、天然に存在しないか又はトランスジェニックな植物細胞及び植物が本明細書に記載される。前記は、1つ以上の組換えポリヌクレオチド、例えば1つ以上の単離されたNtMNS1a、NtMNS1b、NtMNS2又はNtMan1.4ポリヌクレオチド（又はその2つ以上若しくは3つ以上の組合せ）、1つ以上のポリヌクレオチド構築物、1つ以上の二本鎖RNA、1つ以上の連結物、又は1つ以上のベクター/発現ベクターを含む。
本明細書に記載の植物は、本発明の発明にしたがって当該発現又は活性が調整される前又は調整された後で他の目的のために改変され得る（ただし常にそうであるとは限らない）。そのような改変の例は、関心のある異種タンパク質をコードする発現可能なポリヌクレオチドの当該植物への導入である。本発明の関係で“発現可能な”という用語は、植物細胞である遺伝子（好ましくは葉に含まれる）によってコードされるタンパク質又はポリペプチドの発現を指令する調節エレメントとの当該遺伝子の作動的結合を指す。
マンノース含有量が改変された異種糖タンパク質の産生：
多様な実施態様が、ヒトの治療薬としての使用に適切な異種タンパク質の改変アルファ-マンノシダーゼI活性を有する植物での産生に向けられる。異種タンパク質の例には、成長因子、レセプター、リガンド、シグナリング分子；キナーゼ、酵素、ホルモン、腫瘍抑制因子、血液凝固タンパク質、細胞周期タンパク質、代謝性タンパク質、ニューロンタンパク質、心臓性タンパク質、特定の病的状態で不足するタンパク質、抗体、抗原、疾患に対して抵抗性を提供するタンパク質、ヒトの遺伝性疾患の代替療法のためのタンパク質、抗菌タンパク質、インターフェロン及びサイトカインが含まれるが、ただしこれらに限定されない。“抗体”という用語は、モノクローナル抗体、マルチ特異性抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、ラクダ化抗体、キメラ抗体、単鎖Fv（scFv）、単鎖抗体、一ドメイン抗体、ドメイン抗体（VH、VHH、VLA）、Fabフラグメント、F(ab')フラグメント、ジスルフィド結合Fv（sdFv）、及び上記のいずれかのエピトープ結合フラグメントを指す。特に、抗体は、免疫グロブリン分子及び免疫グロブリン分子の免疫学的に活性なフラグメント（すなわち抗原結合部位を含む分子）を含む。免疫グロブリン分子は、任意のタイプ（例えばIgG、IgE、IgM、IgD、IgA及びIgY）、クラス（例えばIgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及びIgA2）、又はサブクラスであり得る。産生することができる抗体又はそのフラグメントの例には、アブシキシマブ、アダリブマブ、アレムツズマブ、バシリキシマブ、ベリムマブ、ベバキシズマブ、ブレンツキシマブ、カナキヌマブ、セツキシマブ、セルトリズマブ、ダクリズマブ、デノスマブ、エクリズマブ、エファリズマブ、ゲムツズマブ、ゴリムマブ、イブリツモマブ、イピリムマブ、ナタリズマブ、オフアツムマブ、オマリズマブ、パリビズマブ、パニツムマブ、ラニビズマブ、リツキシマブ、トシリズマブ、トシツモマブ、トラスツズマブ、及び上記列挙のモノクローナル抗体と同じ抗原決定基に結合する抗体が含まれる。
植物由来の糖タンパク質（異種糖タンパク質を含む）のN-グリカンの植物特異的免疫原性アルファ-1,3-フコース及びベータ-1,2-キシロースは、そのようなアルファ-1,3-フコース及びベータ-1,2-キシロースの付加をコードする遺伝子に影響を及ぼすことなく、多様な方法によって低下させるか又は除去することができる。植物細胞のN-グリカンでそのような糖類を低下させるか又は除去する方法は以下の工程を含む：本発明のアルファ-マンノシダーゼI酵素の1つ以上の酵素活性を植物又は植物細胞で低下させ、阻害し又は実質的に阻害し、それによって高マンノース型N-グリカンからハイブリッド型N-グリカン及び最終的には複合型N-グリカンへの更なるプロセッシングを妨げる工程。植物細胞では、複合型N-グリカンはアルファ-1,3-フコース及びベータ-1,2-キシロースを含む。したがって、理論に拘束されないが、NtMNS1a、NtMNS1b、NtMNS2及びNtMan1.4が実質的に阻害された植物を、免疫原性特性が改変されるとともに有効性が改善された糖タンパク質の製造に用いることができる。そのような植物の使用には以下が含まれる：（a）NtMNS1a、NtMNS1b、NtMNS2及びNtMan1.4が実質的に阻害された植物を、そのN-グリカンにアルファ-1,3-結合フコース及びベータ-1,2-結合キシロースを実質的に欠く異種糖タンパク質の産生に用いることができる。そのような植物によって産生される糖タンパク質は、好ましくは高マンノースN-グリカンを有するであろう。抗原の高マンノース型N-グリカンは、抗原提示細胞との結合の増加をもたらす。高マンノース型N-グリカンを有するある種の抗体は抗体依存細胞性細胞傷害の増加を示す。
（b）NtMNS1a、NtMNS1b、NtMNS2若しくはNtMan1.4又はその組み合わせの活性が増加した植物は高マンノース型N-グリカンが低下し、したがって当該植物で産生される糖タンパク質でハイブリッド型及び複合型成熟N-グリカンが増加するであろう。ある種の高マンノース型N-グリコシル化糖タンパク質は、高マンノースレセプターとの結合増加によりより迅速に血流から除去される。高マンノース量の低下は除去時間を低下させ、したがって半減期を延長することができる。
実施例
以下の実施例は例示として提供され限定として提供されるものではない。特段の指示がなければ、本発明は、分子生物学、植物生物学、バイオインフォーマティクス、及び植物育種の通常の技術及び方法を利用する。
NtMNS1a、NtMNS1b及びNtMNS2のゲノム配列の同定
NtMNS1a、NtMNS1b及びNtMNS2のゲノム配列が、BACライブラリーのスクリーニング、及びNtMNS1a、NtMNS1b又はNtMNS2をそれぞれ含むゲノムの部分を含む3つのBACクローンの塩基配列決定によって同定される。これらの配列は配列情報のセクションに示されている。NtMNS1a、NtMNS1b及びNtMNS2の演繹アミノ酸配列を他のタンパク質又はNCBIの演繹タンパク質の配列と比較し、A.タリアナの2つのタンパク質AtMNS1（At1g51590）及びAtMNS2（At3g21160）が最高の配列同一性及び類似性を共有することを示す（表1）。
表1：アラインメントのためのEMBOSSニードルプログラムを用いたNtMNS1a、1b及び2タンパク質とアラビドプシス・タリアナAtMNS1及びAtMNS2とのパーセンテージ同一性
Figure 2014506128
公知の配列と対比して本発明のヌクレオチド配列の％配列同一性を概算するために、NCBI blastnを用いて、入力配列と相同性を示す公開データベースの配列を同定した。Blastnは、megablast、dc-megablast、blastn、及びblastn-shortを用いる検索のための予め規定されたパラメーターセットの使用を許容する。以下のデータベースを検索した：NCBI特許ヌクレオチド、非重複EBI特許ヌクレオチドレベル1、非重複EBI特許ヌクレオチドレベル2、TAIR9 cdnaモデル及びNCBIヌクレオチド登録。blast検索結果は、e値が1以下のヒットに限定した。入力ヌクレオチド配列（配列番号：1から30、配列番号：32から61及び配列番号：63から92）の各々について、予め規定されたパラメーターの4セットを用いてblastn検索を実施した。各入力ヌクレオチド配列について、EMBOSSウォータープログラムを用いるローカルペアワイズアラインメントを、任意のblastn検索を用いて同定した配列とともに続いて実施した。得られた最良のローカルアラインメントにおける同一の塩基対の数を概算し、これを用いて、全入力配列、配列番号：1から30、配列番号：32から61及び配列番号：63から92と最高のヒットを有するデータベース配列との同一性パーセンテージを算出した。同一塩基対の数を同定配列の全長で割る。blastの結果は表2に要約する。
表2：EMBOSSウォータープログラムを用いるローカルペアワイズアラインメントを利用する配列（配列番号）とデータベース登録（最高マッチを示すもの）との同一性（％）、塩基対による配列の長さ、及びベストローカルアラインメントにおける同一塩基対の数
Figure 2014506128

Figure 2014506128

Figure 2014506128
ジンクフィンガーヌクレアーゼ標的部位の選別のための検索プロトコル
本実施例は、遺伝子の発現を改変するツールを開発するために、あるゲノムデータベースと比較してある遺伝子配列内の固有の標的部位の出現についてスクリーニングするためにNtMNS遺伝子（NtMNS1a、NtMNS1b、NtMNS2遺伝子）を検索する仕方を例示する。本発明の方法（以下に開示するものを含む）によって同定される標的部位、配列モチーフ、及び植物（例えばタバコ）の対応する遺伝子配列の改変における部位又はモチーフのいずれかの使用が本発明に包含される。
2.1 検索アルゴリズム：あるスペーサーサイズによって分離されてある2つの固定長サブストリングDNAモチーフの出現について、DNAデータベース内のサフィックスアレイ（例えば実施例1のタバコゲノム配列アッセンブリー）を用いて入力クェリー（標的）ヌクレオチド配列をスクリーニングすることを可能にするコンピュータープログラムを開発する。サフィックスアレイ構築物及び検索は、公開供給源libdivsufsortライブラリー2.0.0（http://code.google.com/p/libdivsufsort/）（前記は任意の入力ストリングを直接Burrows-Wheeler転換ストリングに変換する）を使用する。前記プログラムは、完全な入力（標的）ヌクレオチド配列をスキャンし、選択したデータベースにおいて選択回数未満で生じる全てのサブストリングの組合せを返答する。
2.2 クェリー配列のジンクフィンガーヌクレアーゼ媒介変異導入のための標的部位の選別：ジンクフィンガーDNA結合ドメインは3塩基対ヌクレオチド配列を認識する。ジンクフィンガーヌクレアーゼは、1、2、3、4、5、6又は7つ以上のジンクフィンガーDNA結合ドメインを含むジンクフィンガータンパク質及びIIS型制限酵素の非特異的ヌクレアーゼを含む。ジンクフィンガーヌクレアーゼは、標的配列に二本鎖ブレークを導入するために用いられる。二本鎖ブレークを導入するために、ジンクフィンガーヌクレアーゼペア（そのうちの一方が標的配列のプラス（上部）鎖に他方が0、1、2、3、4、5、6又は7つ以上分離されてある同じ標的のマイナス（下部）鎖と結合する）が要求される。2つの固定長のサブストリングDNAモチーフの各々について3という複数を用いることによって、本プログラムはを用いて、与えられたスペーサーの長さによって分離されてある2つのジンクフィンガータンパク質標的部位を同定できる。
2.3 プログラム入力：
1．標的クェリーDNA配列
2．検索されるべきDNAデータベース
3．第一のサブストリングDNAモチーフの固定サイズ
4．スペーサーの固定サイズ
5．第二のサブストリングDNAモチーフの固定サイズ
6．プログラム入力2の選択データベースでプログラム入力4によって分離されてあるプログラム入力3と5の組合せの出現閾値数
2.4 プログラム出力：各配列について、DNAデータベースで最大のプログラム入力6の閾値で当該配列が生じる回数を含むヌクレオチド配列リスト。
エチルメタンスルホネートによって誘導されるタバコの標的照準局所変異
3.1 変異導入：ニコチアナ・タバクムのM0種子にエチルメタンスルホネート（EMS；C3H8O3S）により変異を導入して、ランダム点変異を有する植物集団を創出する。種々の濃度及びインキュベーション期間を試験する。各処置の効果を評価するために、各処置についてM1世代の殺滅曲線を評価し、さらに致死性を完全な実生の消失として測定する。さらにまた、生殖能力を各植物の朔及び種子の生成能力として測定し、キメラ植物の数を概算する。植物の表現型が葉の色の変化（例えばアルビノ又は黄色の扇形）又は植物の変形を示す場合、当該植物はキメラと称される。M1植物を自家受精させ、M2種子を採集し播種する。M2生殖細胞質はヘテロ接合体として劣性及び致死性対立遺伝子を回復させる。
3.2 変異の検出：DNAを個々の植物から抽出し、それらの種子を更なるサンプリングのために保存する。標的のNtMNS1a、NtMNS1b又はNtMNS2遺伝子のフラグメントを固有のプライマーを用いて増幅し、標的遺伝子の変異を塩基配列決定によって検出することができる。個々の植物のDNAはまた増幅前に選択的にプールすることができる。また別には、ミスマッチのヘテロデュープレックスが野生型と変異DNAとの間で生じるように、蛍光標識プライマーを用いてそのようなDNAを増幅させてもよい。続いてヘテロデュープレックスをエンドヌクレアーゼCEL1（ヘテロデュープレックスのミスマッチ部位を切断する）とともにインキュベートし、生じた切断生成物をキャピラリーABI3730シークェンサーで泳動し蛍光標識トレースを分析する。このCEL1アッセイは以下に記載されている：Olekowski et al. 1998, Nucleic Acids Res. 26:4597-4602。後者の技術はまたTILLING（Targeting Induced Local Lesion In Genomes（ゲノム内局所損傷誘導標的設定））としても知られ、逆遺伝学プロセスである。改変TILLINGプロセスは以下に記載されている（Colbert et al. 2001, Plant Physiol. 126:480-484. High-throughput screening for induced point mutations）。前記プロセスは、正常DNAと変異DNA鎖がアニールするときのそれらのミスマッチを検出する特殊な酵素の能力に依存する。プールしたDNAの個々の植物DNAのその後の分析によって、所望の変異を保持する植物が同定される。
リツキシマブモノクローナル抗体のタバコでの一過性発現
本実施例は、そのN-グリカンに改変マンノース含有量を有する抗体を改変アルファ-マンノシダーゼI活性を有するタバコ植物でどのようにして生成するかを示す。
4.1 リツキシマブモノクローナル抗体発現ベクターの構築：リツキシマブモノクローナル抗体軽鎖及び重鎖の完全なコード配列（CASレジストリー番号174722-31-7又はWO02/060955）を含む発現カセットを、タバコ植物細胞での発現に最適化させたコドンを用いて化学合成によって作製した。重鎖配列をパタチンシグナルペプチドとともに合成し、HT-CPMVプロモーター並びにHT-CPMV 5'及び3' 非翻訳UTR配列（特許WO09/087391に記載のとおり）並びにカリフラワーモザイクウイルス35Sターミネーター配列の制御下に配置した。パパチンシグナルペプチドを含む軽鎖は、特許WO01/25455に記載されたようにプラストシアニンプロモーター及びターミネーター配列の制御下に配置した。両発現カセットをpCambia-2300（GenBank: AF234315.1；Hajdukiewicz et al., 1994. Plant. Mol. Biol. 25: 989-994）のT-DNAでクローニングし、pCambia-リツキシマブを作製した。
4.2 ニコチアナ・ベンタミアナ植物の浸透：pCambia-リツキシマブをアグロバクテリウム・ツメファシエンスAgl1に導入する。以下を含むYEB培地でロータリーシェーカー（250rpm）上のエーレンマイヤーでOD600＞1.6まで細菌を28℃で増殖させる：2 g/L のビーフ抽出物、0.4 g/Lの酵母抽出物、2 g/LのBacto-ペプトン、2 g/Lのシュクロース、0.1 g/L MgSO4及び対応するアグロバクテリウム株選別用の適切な抗生物質並びに二元性ベクター。前記培養を続いて新鮮なLBブロスミラー（Miller）培地（10mMの2-(N-モルフォリノ)-エタンスルホン酸（MES）及び適切な抗生物質を含む）で1：100に稀釈し、さらにロータリーシェーカー（250rpm）上でOD600＞2まで28℃で増殖させる。増殖後、細菌を4℃で8000g、15分間の遠心沈殿によって収集する。ペレットの細菌を浸透溶液（10 mM MgCl2及び5mM MESを含む、最終pH 5.6）にOD600＝2で再懸濁する。トマトブッシースタントウイルス（TBSV）p19遺伝子サイレンシングサプレッサー（Swiss-Prot P50625）を含むアグロバクテリウム・ツメファシエンス株Agl1及びpCambia-リツキシマブを1：1比及び最終OD600nm＝0.3で改変アルファ-マンノシダーゼI活性を有する4週齢のニコチアナ・ベンタミアナ植物に共浸透させる。TBSV p19遺伝子サイレンシングサプレッサーのコード配列は、pBin19（Bevan MW (1984) Binary Agrobacterium vectors for plant transformation. Nucleic Acids Res. 12: 8711-8721）中でカリフラワーモザイクウイルス35Sプロモーターとターミネーターとの二重制御下にある。V-855レギュレーターに連結したV-710 Buchiポンプを用い、ガラスのベルジャー（Schott-Duran Mobilex 300mm）内の細菌に真空浸透を実施する。人工光（80-100 μmol光量子/cm2）を全浸透プロセスの間維持し、定常的な照明条件を担保する。浸透の後、植物を非浸透コントロール植物とともに温室に採集まで維持する。成長条件（例えば施肥、証明期間及び温度）は浸透前に用いたものと同じである。水及び肥料はドリップ灌漑系を用いて植物に与える。
4.3 採集、材料サンプリング及び発現の分析：浸透から6日後に、葉の材料を熱密封性小袋に収集して密封し、ドライアイス層の間に少なくとも10分間置く。採集後、全ての葉のサンプルを更なる処理まで-80℃で保存する。ドライアイス上でコーヒー豆挽きにより葉を微細な粉末に均質化し、3 vol/wtの抽出緩衝液で抽出する（緩衝液は以下を含む：50mM Tris（pH 7.4）、150 mM NaCl、0.1% Triton X-100、4M尿素及び2mM DTT）。リツキシマブモノクローナル抗体の発現はELISAによって可溶性抽出物中で定量する。プレート（Immulon 2HB, Thermofisher）を2.5 ug/mLの濃度の捕捉抗体（ヤギ抗マウスIgG1重鎖特異的、Sigma, #M8770）で一晩、4℃で被覆する。標準曲線（4−80ng/mL）は、偽似抽出物（p19遺伝子サイレンシングサプレッサー細菌懸濁物のみを浸透させた葉の材料から調製）でマウスIgG1コントロールタンパク質（Bethyl, #MI10-102）を用いて調製される。可溶性抽出物を稀釈緩衝液（50 mM Tris pH 7.4、150 mM NaCl、0.1% Triton X-100）で1：1000に稀釈し、標準物及びサンプルをトリプリケートで添加し、37℃で1時間インキュベートする。検出用抗体はペルオキシダーゼ連結ヤギ抗マウスIgG Fc特異的抗体（Jackson ImmunoResearch, #115-035-205）（1：40,000稀釈で用いる）で、37℃で1時間インキュベートする。抽出物中の全可溶性タンパク質は、クーマシー-プラス（Coomassie-Plus）アッセイ試薬（Pierce, #24236）を用いて決定する。
4.4 N-グリカン組成の分析：植物細胞抽出物中のリツキシマブ抗体のN-グリカン組成を標準的な方法（Bakker et al. (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 2899-2904）にしたがって決定する。
アルファ-マンノシダーゼcDNAのクローニング
5.1 リボ核酸の単離及びcDNA合成：温室で生育させたニコチアナ・タバクム植物の葉を液体窒素中ですりつぶして微細粉末にする。RNeasy RNA抽出キット（Qiagen AG, Hombrechtikon, Germany）を用い、製造業者の推奨にしたがってすりつぶした葉の粉末200mgからRNAを抽出する。全RNAの1マクログラム（1μg）をDNaseI（New England Biolabs, Ipswich, USA）で製造業者の推奨にしたがい処理する。500ngのDNaseI処理RNAからcDNAを、AMV逆転写酵素（Invitrogen AG, Basel, Switzerland）を製造業者の推奨にしたがって用いて合成する。
5.2 PCRによるクローニング：第一鎖cDNAを10倍希釈し、マスターサイクラーグラジエントマシーン（Eppendorf）を用いてPCRによって増幅する。反応は50μL（25 μlの2ｘヒュージョンマスターミックス（Phusion mastermix）（Finnzyme）、20 μlの水、1 μlの稀釈cDNA及び2 μLの各プライマー（10 μM）を含む）で実施する。NtMNS1a cDNAを増幅するプライマーは以下である：
Figure 2014506128
サーモサイクラー条件は供給業者の推奨のとおりであり、58℃のアニーリング温度を用いる。PCRに続いて、得られた生成物を3'末端でアデニル化する。50μLの2ｘTaqマスターミックス（New England Biolabs）をPCR反応混合物に添加し、72℃で10分間インキュベートする。得られたPCR生成物をQIAquick PCR精製キット（Qiagen）を用いて精製する。精製した生成物をpCR2.1-TOPOで製造業者（Invitrogen）の推奨にしたがってクローニングし、標準的プロトコルにしたがってTOP10大腸菌（Escherichia coli）細胞を形質転換する。個々のクローンからDNAを単離し、得られたプラスミドDNAの塩基配列を標準的プロトコルにしたがって決定する。
5.3 配列分析：ポリヌクレオチド配列はContig Express and AlignX（Vector NTI, Invitrogen）を用いてコンパイルする。MNS1a cDNA配列は配列番号：30として以下に示されている。MNS1a cDNA配列は、対応するcDNA PCRフラグメントの塩基配列決定で観察された配列である。
配列情報
発明の説明及び実施例で、以下の配列が引用され、前記はまた配列表に提示されている：
配列番号：1（5'及び3'UTRを含むNtMNS1a）
Figure 2014506128

Figure 2014506128

Figure 2014506128

Figure 2014506128

Figure 2014506128
配列番号：30（NtMNS1a cDNA配列）
Figure 2014506128
配列番号：31（NtMNS1aタンパク質配列）
Figure 2014506128
配列番号：32（5'及び3'UTRを含むNtMNS1b）
Figure 2014506128

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Figure 2014506128

Figure 2014506128

Figure 2014506128
配列番号：61（NtMNS1b cDNA配列）
Figure 2014506128
配列番号：62（NtMNS1bタンパク質配列）
Figure 2014506128
配列番号：63（5'及び3'UTRを含むNtMNS2）
Figure 2014506128

Figure 2014506128

Figure 2014506128

Figure 2014506128
配列番号：92（NtMNS2 cDNA配列）
Figure 2014506128
配列番号：93（NtMNS2タンパク質配列）
Figure 2014506128
配列番号：94（NtMNS1a cDNA配列）
Figure 2014506128
配列番号：95（NtMNS1aタンパク質配列）
Figure 2014506128
配列番号：96（（NtMNS1b cDNA配列）
Figure 2014506128
配列番号：97（NtMNS1bタンパク質配列）
Figure 2014506128
配列番号：98（NtMan1.4 cDNA配列）
Figure 2014506128
配列番号：99（NtMan1.4タンパク質配列）
Figure 2014506128
寄託：
以下の種子サンプルは、NCBI（Ferguson Building, Craibstone Estate, Bucksburn, Aberdeen AB21 9YA, Scotland, UK）にブダペスト条約の規定にしたがいPhilip Morris Products S.Aの名で2011年1月6日に寄託された。
Figure 2014506128
Figure 2014506128
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Claims (16)

  1. 遺伝的に改変されたニコチアナ・タバクム（Nicotiana tabacum）の植物細胞、又は前記改変植物細胞を含むニコチアナ・タバクムの植物であって、前記改変植物細胞が、NtMNS1a、NtMNS1b、NtMNS2及びNtMan1.4及び／又はその対立遺伝子変種から成る群から選択されるアルファ-マンノシダーゼIのコード配列を含むゲノム領域内の第一の標的ヌクレオチド配列の少なくとも１つの改変を含み、前記改変が、（i）当該改変植物細胞におけるアルファ-マンノシダーゼIの活性又は発現が非改変植物細胞と対比して変化するような改変である、前記植物細胞又は植物。
  2. （a）第一の標的ヌクレオチド配列の改変に加えて、（b）アルファ-マンノシダーゼIのコード配列を含むゲノム領域内の第二の標的ヌクレオチド配列の少なくとも1つの改変、又は（c）アルファ-マンノシダーゼIのコード配列を含むゲノム領域内の第三の標的ヌクレオチド配列の少なくとも1つの改変、又は（d）アルファ-マンノシダーゼIのコード配列を含むゲノム領域内の第四の標的ヌクレオチド配列の少なくとも1つの改変、又は（a）及び（b）、（a）及び（c）、（a）及び（d）、（b）及び（c）、（b）及び（d）、又は（c）及び（d）；又は（a）及び（b）及び（c）、（a）及び（b）及び（d）、（a）及び（c）及び（d）、又は（b）及び（c）及び（d）；又は（a）及び（b）及び（c）及び（d）の組合せを含み、前記アルファ-マンノシダーゼIがNtMNS1a、NtMNS1b、NtMNS2及びNtMan1.4から成る群から選択され、さらに前記第一、第二、第三及び第四のアルファ-マンノシダーゼIが互いに異なる、請求項1に記載の改変ニコチアナ・タバクムの植物細胞又はニコチアナ・タバクムの植物。
  3. 第一、第二、第三及び／又は第四の標的ヌクレオチド配列が（i）配列番号：1、配列番号：2、配列番号：32、配列番号：33、配列番号：63若しくは配列番号：64又はその部分と少なくとも76％の配列同一性、（ii）配列番号：30、配列番号：94、配列番号：61、配列番号：96、配列番号：92若しくは配列番号：98又はその部分のいずれかと少なくとも88％の配列同一性を有する、請求項1又は2のいずれか1項に記載の改変ニコチアナ・タバクムの植物細胞又はニコチアナ・タバクムの植物。
  4. 第一、第二、第三及び／又は第四の標的ヌクレオチド配列が、（i）配列番号：1、配列番号：2、配列番号：32、配列番号：33、配列番号：63若しくは配列番号：64又はその部分、（ii）配列番号：30、配列番号：94、配列番号：61、配列番号：96、配列番号：92若しくは配列番号：98又はその部分を含むか、本質的に前記を含むか、又は前記から成る、請求項3に記載の改変ニコチアナ・タバクムの植物細胞又はニコチアナ・タバクムの植物。
  5. 改変植物細胞におけるアルファ-マンノシダーゼIの活性又は発現が、非改変植物細胞と対比して（a）低下又は（b）増加する、請求項1から4のいずれか1項に記載の改変ニコチアナ・タバクムの植物細胞又はニコチアナ・タバクムの植物。
  6. 請求項1から5のいずれか1項に記載の改変ニコチアナ・タバクムの植物の子孫であって、前記子孫植物が請求項1から5のいずれかに規定の標的配列の少なくとも1つに改変を含み、アルファ-マンノシダーゼIの活性又は発現が、非改変植物細胞と対比して低下する、前記子孫。
  7. 以下の工程を含む、異種タンパク質を製造する方法：
    （a）異種糖タンパク質、特にワクチンを作製するための抗原、サイトカイン、ホルモン、凝固タンパク質、アポリポタンパク質、ヒトの代替治療法のための酵素、免疫グロブリン又はそのフラグメントをコードするヌクレオチド配列を含む発現構築物を、請求項1から6のいずれか1項に規定の改変ニコチアナ・タバクムの植物細胞又は植物に導入し、さらに前記発現構築物を含む改変植物細胞を、前記異種糖タンパク質が生成されるように培養する工程であって、前記糖タンパク質が、非改変植物細胞から得られる糖タンパク質と比較してそのN-グリカンにアルファ-1,3-結合フコース及びベータ-1,2-結合キシロースを実質的に欠いている、前記工程、（b）場合によって前記植物細胞から植物を再生し、さらに前記植物及びその子孫を生育させる工程、及び（c）場合によって前記糖タンパク質を採集する工程。
  8. 以下のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドであって、前記ヌクレオチド配列又はその部分がマンノース加水分解活性を示すポリペプチドをコードする、前記ポリヌクレオチド：
    （i）配列番号：1、配列番号：2、配列番号：32、配列番号：33、配列番号：63若しくは配列番号：64又はその部分と少なくとも76％の配列同一性を有するヌクレオチド配列；
    （ii）配列番号：30、配列番号：94、配列番号：61、配列番号：96、配列番号：92若しくは配列番号：98又はその部分のいずれかと少なくとも88％の配列同一性を有するヌクレオチド配列；
    （iii）配列番号：31、配列番号：95、配列番号：62、配列番号：97、配列番号：93若しくは配列番号：99又はその部分と少なくとも83％の配列同一性を有する配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
    （iv）その相補鎖が、（i）−（iii）のいずれか、又は配列番号：3から29、配列番号：34、35、37から41、43から49及び51から60若しくは配列番号：65から91のいずれかのヌクレオチド配列から成る核酸プローブとハイブリダイズするヌクレオチド配列；
    （v）（i）−（iv）のいずれかに規定のヌクレオチド配列から遺伝暗号の縮退により派生するヌクレオチド配列又はその部分。
  9. 以下から成る群から選択されるマンノース加水分解活性を有するポリペプチド：
    （i）配列番号：31、配列番号：95、配列番号：62、配列番号：97、配列番号：93若しくは配列番号：99に示す配列のいずれか又はその部分と少なくとも83％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド；
    （ii）請求項1の（i）−（v）に記載のヌクレオチド配列によって発現されるポリペプチド；
    （iii）配列番号：2、配列番号：30、配列番号：33、配列番号：94、配列番号：61、配列番号：64、配列番号：96、配列番号：92若しくは配列番号：98に示されるヌクレオチド配列又はその部分によって発現されるポリペプチド。
  10. 以下のヌクレオチド配列内の標的部位を同定して改変するための請求項8若しくは9に規定のヌクレオチド配列又はその部分の使用であって、前記改変が、非改変植物細胞と対比して当該改変を含む改変植物細胞内のアルファ-マンノシダーゼIの活性又は発現が変化するような改変であり、前記アルファ-マンノシダーゼIが、NtMNS1a、NtMNS1b、NtMNS2、及びNtMan1.4から成る群から選択され、さらに前記第一、第二、第三及び第四の標的アルファ-マンノシダーゼIが互いに異なる、前記使用：
    （a）アルファ-マンノシダーゼIのコード配列を含むゲノム領域内の第一の標的ヌクレオチド配列；又は
    （b）アルファ-マンノシダーゼIのコード配列を含むゲノム領域内のa）の第一の標的ヌクレオチド配列及び第二の標的ヌクレオチド配列；又は
    （c）アルファ-マンノシダーゼIのコード配列を含むゲノム領域内のa）の第一の標的ヌクレオチド配列、b）の第二の標的ヌクレオチド配列及び第三の標的ヌクレオチド配列；
    （d）アルファ-マンノシダーゼIのコード配列を含むゲノム領域内のa）の第一の標的ヌクレオチド配列、b）の第二の標的ヌクレオチド配列、c）の第三の標的ヌクレオチド配列及び第四の標的ヌクレオチド配列；
    a）、b）、c）及びd）の全ての標的ヌクレオチド配列。
  11. 請求項8又は9に規定のヌクレオチド配列内の部位でゲノムDNA分子を選択的に切断する非天然のメガヌクレアーゼタンパク質を作製するための請求項10に規定のヌクレオチド配列の使用。
  12. 請求項8又は9に規定の標的ヌクレオチド配列の少なくとも1つに二重鎖ブレークを導入するジンクフィンガーヌクレアーゼを作製するための請求項10に規定のヌクレオチド配列の使用。
  13. 請求項1−6のいずれか1項に規定の改変植物細胞を含む植物から入手し得る異種糖タンパク質を含む植物組成物であって、前記糖タンパク質が、未改変植物細胞から入手し得る糖タンパク質と比較して、そのN-グリカンにアルファ-1,3-結合フコース及びベータ-1,2-結合キシロースを実質的に欠く、前記植物組成物。
  14. 以下の工程を含む、ヒト化糖タンパク質を生成することができる改変植物細胞を含むニコチアナ・タバクムの植物細胞又はニコチアナ・タバクムの植物を作出する方法であって、アルファ-マンノシダーゼIが、NtMNS1a、NtMNS1b、NtMNS2、及びNtMan1.4から成る群から選択され、前記第一、第二、第三及び第四の標的アルファ-マンノシダーゼIが互いに異なり、さらに非改変植物細胞と対比して当該改変を含む改変植物細胞内のアルファ-マンノシダーゼIの活性又は発現が、前記改変植物細胞により生成される糖タンパク質が未改変植物細胞から入手される糖タンパク質と比較してそのN-グリカンにアルファ-1,3-結合フコース及びベータ-1,2-結合キシロースを実質的に欠くように変化している、前記方法：
    （i）タバコの植物細胞のゲノムにおいて、（a）アルファ-マンノシダーゼIのコード配列を含むゲノム領域内の第一の標的ヌクレオチド配列；又は（b）アルファ-マンノシダーゼIのコード配列を含むゲノム領域内のa）の第一の標的ヌクレオチド配列及び第二の標的ヌクレオチド配列；又は（c）アルファ-マンノシダーゼIのコード配列を含むゲノム領域内のa）の第一の標的ヌクレオチド配列、b）の第二の標的ヌクレオチド配列及び第三の標的ヌクレオチド配列；（d）アルファ-マンノシダーゼIのコード配列を含むゲノム領域内のa）の第一の標的ヌクレオチド配列、b）の第二の標的ヌクレオチド配列、c）の第三の標的ヌクレオチド配列及び第四の標的ヌクレオチド配列；a）、b）、c）及びd）の全ての標的ヌクレオチド配列を改変する工程；
    （ii）前記標的ヌクレオチド配列内に前記改変を含む改変植物又は植物細胞を同定し、さらに場合によって選別する工程；
    （iii）前記改変植物を別のニコチアナ植物とともに繁殖させる工程。
  15. 標的ヌクレオチド配列が請求項8又は9に規定のヌクレオチド配列を含む、請求項13に記載の方法。
  16. タバコの植物又は植物細胞のゲノムの改変が以下の工程を含む、請求項1から15のいずれか1項に記載の方法：
    （a）ニコチアナ・タバクムの植物又は植物細胞の標的ヌクレオチド配列において、さらに場合によって少なくとも1つのその対立遺伝子変種において、標的部位を同定する工程；
    （b）前記標的部位を認識し、さらに前記標的部位で又はその近くで結合することができる変異原性オリゴヌクレオチドを、請求項8又は9に規定のヌクレオチド配列を土台にしてデザインする工程；及び
    （c）前記ゲノムが改変される条件下で、前記変異原性オリゴヌクレオチドをタバコの植物又は植物細胞のゲノム内の標的ヌクレオチド配列と結合させる工程。
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