JP2014506568A - Ｗｎｔ組成物およびその使用方法 - Google Patents

Abstract

Ｗｎｔ組成物およびそれらの使用のための方法が提供される。本発明の組成物は、所望の生物学的活性を有するｗｎｔポリペプチドのフラグメントを含み、上記フラグメントは、「ミニｗｎｔ」と本明細書でいわれる。これら組成物および方法は、Ｗｎｔレセプターへの結合を決定すること；Ｗｎｔレセプターを発現する細胞におけるＷｎｔシグナル伝達を阻害すること；Ｗｎｔレセプターを発現する細胞へ機能部分を送達することにおける；およびＷｎｔ特異的抗体を生成するための免疫原としての、特定の使用が見いだされる。

Description

（発明の背景）
Ｗｎｔタンパク質は、胚発生の間に細胞間相互作用を調節する、高度に保存された分泌型シグナル伝達分子のファミリーを形成する。Ｗｎｔ遺伝子およびＷｎｔシグナル伝達はまた、がんに関わっている。Ｗｎｔ糖タンパク質は、いくつかの原始的細胞タイプにおいて活性なパラクリンシグナルもしくはオートクリンシグナルとして機能すると考えられている。

上記Ｗｎｔ増殖因子ファミリーは、マウスおよびヒトにおいて同定された１９個より多い遺伝子を含む。上記Ｗｎｔ−１がん原遺伝子（ｉｎｔ−１）は、元々は、ウイルスＤＮＡ配列の挿入に起因してマウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）によって誘導された乳腺腫瘍から同定された（非特許文献１）。Ｗｎｔタンパク質の発現は変動するが、しばしば、例えば、胚性組織および胎児組織において、発生プロセスと関連する。Ｗｎｔは、局所的細胞シグナル伝達において役割を果たし得る。生化学研究から、上記分泌型Ｗｎｔタンパク質の多くは、媒体中に自由に拡散可能ではなく、細胞表面もしくは細胞外マトリクスと会合して見いだされ得ることが示された。

Ｗｎｔ作用機構への洞察は、いくつかのシステムから明らかになってきた：ＤｒｏｓｏｐｈｉｌａおよびＣａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓにおける遺伝学；細胞培養物における生化学およびＸｅｎｏｐｕｓ胚において正常でない位置に起こる遺伝子発現。マウスにおける多くのＷｎｔ遺伝子は、変異させられて、非常に特異的な発生欠損をもたらしてきた。現在理解されているように、Ｗｎｔタンパク質は、Ｆｒｉｚｚｌｅｄファミリーのレセプター、ＲＯＲファミリーのレセプター、ならびに細胞表面上にあるＬＲＰ５レセプター、ＬＲＰ６レセプター、およびＦＲＬ１レセプターに結合する。標準のＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路において、ＦｒｉｚｚｌｅｄレセプターへのＷｎｔ結合は、β−カテニンの核局在化を生じ、これは、次いで、ＴＣＦと複合体形成して、Ｗｎｔ標的遺伝子の転写を活性化する。

Ｗｎｔ遺伝子における変異の研究から、増殖制御および組織パターン形成におけるＷｎｔの役割が示された。Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａにおいて、ｗｉｎｇｌｅｓｓ（ｗｇ）はＷｎｔ遺伝子をコードし、ｗｇ変異は、胚体外胚葉、神経発生、および成虫原基成長（ｏｕｔｇｒｏｗｔｈ）のパターンを変化させる。Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓにおいて、ｌｉｎ−４４は、Ｗｎｔをコードし、これは、非対称性の細胞分裂に必要とされる。マウスにおけるノックアウト変異は、Ｗｎｔが脳発生、ならびに腎臓、尾芽、および肢芽の胚性原基の成長に必須であることを示した。乳腺におけるＷｎｔの過剰発現は、乳腺過形成、および早熟の肺胞発生（ｐｒｅｃｏｃｉｏｕｓ ａｌｖｅｏｌａｒ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）を生じ得る。従って、Ｗｎｔシグナル伝達は、動物の発生において多くの事象（幹細胞の増殖および神経堤の指定が挙げられる）に関与する。Ｗｎｔタンパク質は、従って、特定の細胞タイプを拡げるにあたって、およびインビボでの状態の処置において潜在的に重要な試薬である。

データから、その天然の形態において、生物学的に活性なＷｎｔが、保存されたシステイン上においてパルミトイル化される必要があることが示された。とりわけ、非特許文献２；および非特許文献３を参照のこと。これら脂質基は、上記Ｗｎｔタンパク質の水溶性を低下させる。従って、今日まで、生物学的に有効な濃度の活性な天然のかつ組換えのＷｎｔの単離法は、界面活性剤もしくはリポソームの使用を要した（非特許文献２、非特許文献４；および非特許文献５を参照のこと）。Ｗｎｔの溶解度についてのこれら化学薬剤の要件は、これら化学物質を動物に注射するという問題に起因して、その薬学的有用性を制限する。水溶性である薬学的に活性なｗｎｔ組成物の開発は、従って、非常に重要である。

（刊行物）
可溶性ｗｉｎｇｌｅｓｓタンパク質の生物学的活性は、非特許文献６に記載されている。可溶性の生物学的に活性な脊椎動物Ｗｎｔタンパク質を使用するＷｎｔ−ｆｒｉｚｚｌｅｄ相互作用の生化学的特徴付けは、非特許文献７によって記載されている。非特許文献８は、有糸分裂活性を有するｗｎｔタンパク質の可溶性形態を記載している。非特許文献９は、短縮型ＷｎｔであるドミナントネガティブＷｎｔポリペプチド（短縮型Ｘｗｎｔ−８および短縮型マウスＷｎｔ−１）を記載している。非特許文献１０は、アンチモルフ効果を有する実質的にカルボキシ末端が欠失した分泌型タンパク質をコードするＤｗｎｔ−１の変異対立遺伝子を記載している。他のドミナントネガティブＷｎｔポリペプチドおよびそれらの使用法は、特許文献１に記載されている。

非特許文献２は、界面活性剤の助けを借りて、Ｗｎｔタンパク質を精製する方法を記載している。非特許文献５は、Ｗｎｔタンパク質をリポソームに製剤化し、リポソーム中にパッケージされたＷｎｔがどのようにインビボで生物学的活性を保持するかを記載している。特許刊行物としては、特許文献２；および特許文献３；ならびに特許文献４が挙げられる。

国際公開第２０１０／０７８４５８号 米国特許第７，３３５，６４３号明細書 米国特許第７，１５３，８３２号明細書 米国特許出願公開第２００８／０２２６７０７号明細書

Ｎｕｓｓｅ ａｎｄ Ｖａｒｍｕｓ（１９８２）Ｃｅｌｌ ３１：９９−１０９ Ｗｉｌｌｅｒｔ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｎａｔｕｒｅ ４２３：４４８−４５２ Ｎｕｓｓｅ（２００５）Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １５：２８−３２ Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．４６５：３３１−３４７ Ｍｏｒｒｅｌｌ ｅｔ ａｌ．（２００８）ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ３（８）：ｅ２９３０ ｖａｎ Ｌｅｅｕｗｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ ２４：３６８（６４６９）：３４２−４ Ｈｓｉｅｈ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ９６（７）：３５４６−５１ Ｂｒａｄｌｅｙ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １５（８）：４６１６−２２ Ｈｏｐｐｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖ．１０：２８０５−２８１７ Ｃｏｕｓｏ ａｎｄ Ｍａｒｔｉｎｅｚ−Ａｒｉａｓ（１９９４）Ｃｅｌｌ ７９（２）：２５９−７２

（発明の要旨）
Ｗｎｔ組成物およびそれらの使用法が提供される。本発明の組成物は、所望の生物学的活性を有する、ｗｎｔポリペプチドのフラグメントを含み、このフラグメントは、本明細書で「ミニｗｎｔ」といわれる。目的のミニｗｎｔポリペプチドは、天然のｗｎｔタンパク質のフラグメントおよびその誘導体（例えば、目的の特性（例えば、溶解度、標的としたレセプターに対する親和性もしくは特異性）を増強する、上記天然配列に対する１もしくはそれより多くのアミノ酸変化を含むアナログ）を含む。上記フラグメント、特にＷｎｔ Ｃ末端のフラグメントは、水溶性であり得る。目的の組成物としては、薬学的に受容可能な賦形剤中の有効用量のミニｗｎｔポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。組成物は、さらなる薬剤（例えば、アジュバントなど）を含み得る。ミニｗｎｔポリペプチドは、当該分野で公知であるように、合成によって生成されてもよいし；種々の適切な組換え法などによって、生成されてもよい。

これら組成物および方法は、Ｗｎｔレセプターを発現する細胞におけるＷｎｔシグナル伝達を阻害するにあたって（例えば、異常な細胞増殖を阻害するため）；機能部分（例えば、治療部分もしくは画像化部分）を、Ｗｎｔレセプターを発現する細胞に送達するにあたって；およびＷｎｔ特異的抗体を生成するための免疫原として、特定の使用を見いだす。通常は、ミニｗｎｔは、Ｗｎｔ共レセプター（ｃｏ−ｒｅｃｅｐｔｏｒ）対のうちの一方に結合するが、両方には結合しない。

いくつかの実施形態において、上記ミニｗｎｔは、Ｃ末端の、すなわち「Ｃｔｅｒｍ」ミニｗｎｔであり、ここでＣｔｅｒｍ ミニｗｎｔは、ｗｎｔポリペプチドのカルボキシ末端ドメインを含むかもしくは上記ドメインからなり、アミノ末端ドメインのアミノ酸残基を含まない、ポリペプチドである。上記カルボキシ末端ドメインの図は、例えば、図６に示されるように、複数のヒトＷｎｔタンパク質とともに本明細書で例示される。Ｗｎｔカルボキシ末端ドメインはまた、本明細書に提供される配列とのアラインメントによって経験的に同定され得る。一例において、Ｃｔｅｒｍ ミニｗｎｔアミノ酸配列は、保存された残基によってヒトＷｎｔ１の２９８〜３７０位と整列し、ヒトＷｎｔ１の１〜２５７残基と整列するアミノ酸配列を欠く。Ｃｔｅｒｍ ミニｗｎｔ（Ｃｔｅｒｍ ｍｉｎ−ｗｎｔ）は、一般に、水溶性である。

他の実施形態において、上記ミニｗｎｔは、Ｎ末端の、すなわち「Ｎｔｅｒｍ」ミニｗｎｔであり、ここでＮｔｅｒｍ ミニｗｎｔは、ｗｎｔポリペプチドのアミノ末端ドメインを含むかもしくは上記ドメインからなり、上記カルボキシ末端ドメインのアミノ酸残基を含まない、ポリペプチドである。上記アミノ末端ドメインの図は、例えば、図８に示されるように、複数のヒトＷｎｔタンパク質とともに本明細書で例示される。Ｗｎｔアミノ末端ドメインはまた、本明細書で提供される配列とのアラインメントによって経験的に同定され得る。一例において、Ｎｔｅｒｍ ミニｗｎｔアミノ酸配列は、保存された残基によってヒトＷｎｔ１の３４〜２４７位と整列し、ヒトＷｎｔ１の残基２８８〜３７０に対応する残基と整列するアミノ酸配列を欠く。Ｎｔｅｒｍ ミニｗｎｔは、水溶性であってもよいし、脂溶性であってもよい。

いくつかの実施形態において、上記ミニｗｎｔポリペプチドは、機能部分に融合もしくは結合体化され、上記機能部分は、治療部分（例えば、細胞を細胞傷害性部分、またはＡＤＣＣ指向性細胞死もしくはＣＤＣ指向性細胞死の標的とする部分）であり得る。目的の治療部分としては、上記細胞の活動を変化させるものが挙げられる。いくつかの実施形態において、上記機能部分は、画像化部分（例えば、発蛍光団、発光団、放射性同位体など）である。いくつかの実施形態において、上記機能部分は、例えば、ジッパーもしくはＦｃポリペプチドを使用するか、または他のアビディティ増強化学物質因子もしくはタンパク質因子を使用することによって、上記ミニｗｎｔが、ホモダイマー、ホモトリマー、ホモテトラマー以上、またはヘテロダイマー、ヘテロトリマー、ヘテロテトラマー以上へと、オリゴマー化することを誘導するオリゴマー化部分である。いくつかの実施形態において、上記機能部分は、上記ミニｗｎｔポリペプチドの半減期を延ばし、そして／もしくはそのサイズを増大させるタンパク質もしくは化学部分である。

本発明のいくつかの局面において、細胞に機能部分を送達するための方法が提供され、上記方法は、Ｗｎｔレセプターを発現する目的の細胞を、目的の機能部分を含むミニｗｎｔと接触させる工程を包含する。他の実施形態において、細胞におけるＷｎｔシグナル伝達を阻害するための方法が提供される。このような方法において、Ｗｎｔレセプターを発現する細胞は、上記ミニｗｎｔの不存在下でのシグナル伝達と比較して、シグナル伝達を阻害する（例えば、２５％、５０％、７５％、９０％、９５％またはそれより大きくシグナル伝達を低下させる）ために有効である濃度のミニｗｎｔポリペプチドと接触させられる。このようなシグナル伝達阻害は、上記標的とした細胞の増殖を阻害してもよいし、上記標的とした細胞において活性なＷｎｔシグナル伝達経路に別な方法で干渉してもよい。

本発明の方法において、上記ＷｎｔレセプターがＦｚタンパク質、ＲＯＲタンパク質、もしくはＲｙｋタンパク質である場合、上記ミニｗｎｔポリペプチドは、通常、Ｃｔｅｒｍ ミニｗｎｔである。上記Ｗｎｔレセプターが、ＬＲＰ５、ＬＲＰ６、もしくはＦＲＬ１／ｃｒｙｐｔｏである場合、通常、上記ミニｗｎｔポリペプチドは、Ｎｔｅｒｍ ミニｗｎｔである。いくつかの方法において、上記レセプター発現細胞は、インビトロで接触させられる。他の実施形態において、上記レセプター発現細胞は、インビボで接触させられる。目的の細胞は、当該分野で公知であるように、広く種々のＷｎｔレセプター発現細胞を含む。

Ｗｎｔ特異的抗体を作製するための方法が提供され、上記方法は、動物を、（必要に応じて、アジュバントとともに製剤化した）有効用量のＣｔｅｒｍもしくはＮｔｅｒｍ ミニｗｎｔポリペプチドで免疫する工程を包含する。ポリクローナル抗体が、血清から得られてもよいし、上記動物由来の細胞が、組換え生成される抗体を生成するためのポリヌクレオチド供給源としてモノクローナル抗体の生成において使用されてもよい、などである。

Ｗｎｔタンパク質の同族レセプターを決定するための方法が提供され、上記方法は、候補Ｗｎｔレセプターもしくはそのフラグメントを、目的のＷｎｔタンパク質に対応するミニｗｎｔポリペプチドと接触させる工程；および上記候補レセプターへの上記ミニｗｎｔの結合を決定する工程を包含し、ここで特異的結合の存在は、上記Ｗｎｔタンパク質が上記候補レセプターのリガンドであることを示す。目的のレセプターは、Ｆｚタンパク質、ＲＯＲタンパク質、もしくはＲｙｋタンパク質（これらは、Ｃｔｅｒｍ ミニｗｎｔと接触させられる）；およびＬＲＰ５、ＬＲＰ６、もしくはＦＲＬ１／ｃｒｙｐｔｏ（これらは、Ｎｔｅｒｍ ミニｗｎｔと接触させられ得る）を含む。種々の結合アッセイは、例えば、上記候補レセプターを発現する細胞を利用する用途を見出すが、特に重要なのは、例えば、（Ｆｚ−ＣＲＤポリペプチドと水溶性Ｃｔｅｒｍ ミニｗｎｔポリペプチドとの間の相互作用が挙げられるが、これらに限定されない）結合に上記レセプターの可溶性フラグメントを利用して、溶液中で行われ得るアッセイである。

本発明の組成物および方法の利益は、標的化の特異性であり、ここで上記ミニｗｎｔは、その由来の天然のｗｎｔタンパク質と同じ細胞を標的とする。例えば、ミニｗｎｔは、上記Ｗｎｔ親タンパク質に応答性の細胞においてＷｎｔシグナル伝達を選択的に阻害する。当該分野で公知のＷｎｔシグナル伝達のインヒビター（例えば、特異的Ｗｎｔレセプターに結合する抗体）は、上記Ｗｎｔ親によって標的とされる全てのＷｎｔレセプターに結合するのではなく、むしろこれらが特異性を有するＷｎｔレセプターのみに結合する。さらに、ミニｗｎｔの水溶性形態という利点は、それらの治療有用性を制限し得る製剤化添加物の必要性がないことである。

本発明は、添付の図面と共に読めば、以下の詳細な説明から最良に理解される。特許もしくは特許出願フィルは、色つきで仕上げられた少なくとも１つの図面を含む。カラー図面付きのこの特許もしくは特許出願の公報のコピーは、請求および必要な料金を支払った際に、当局によって提供される。一般実務によれば、図面の種々の特徴は一定縮尺ではないことは、強調される。対照的に、種々の特徴の寸法は、明瞭さのために自由裁量で拡大もしくは縮小される。以下の図が、図面に含まれる。

可溶性Ｘｅｎｏｐｕｓ Ｗｎｔ８（「Ｘｗｎｔ８」）の進化。パネルＡ（左側）は、酵母の場合に表面に発現されるＷｎｔ分子の模式図を示す。上記Ｗｎｔ分子は、上記分子の水溶性を生じるいくつかの変異（星）を有する。上記ＷｎｔのＣ末端に接続されるのは、Ｍｙｃに体する抗体を使用して、発現されたＷｎｔを検出する実験において使用される「Ｍｙｃ」タグである。また、パネルＡ（右側）にあるのは、上記ＷｎｔレセプターＦｒｉｚｚｌｅｄのＷｎｔ結合ドメイン（この場合、Ｆｚ５）の模式図である。このドメインは、「ＣＲＤ」といわれる。上記ＣＲＤの模式図は、可視化のための蛍光色素に連結している、四価のストレプトアビジン分子（真ん中の十字型の模式図）に結合して配置された４個のＣＲＤ分子が示されている。パネルＢにおいて、Ｆｚ５ ＣＲＤは、それがストレプトアビジンに結合し得るように、そのＣ末端に付加されたビオチンを含むことが示される。これは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにおいて示され、ここで上記Ｆｚ５ ＣＲＤは「シフト」アップして、ゲル中のストレプトアビジンに結合する。この「シフト」は、ビオチンが上記Ｆｚ５およびＦｚ８ ＣＲＤに存在することを示す。パネルＣは、Ｎｔｅｒｍ（紫の濃淡をつけている）ミニＷｎｔ、リンカー（緑色で濃淡をつけた）、およびＣ−ｔｅｒｍ ミニＷｎｔ（赤で濃淡を付けた）へとさらに分けた全長Ｘｅｎｏｐｕｓ Ｗｎｔ８の配列を示す。Ｂ７、Ａ１２、Ｂ２、およびＡ３と示される赤色のブロック（ｂｏｃｋ）矢印は、ミニｗｎｔの異なる配列境界を示す。各ミニＷｎｔの実際の境界は、可変であり（図６を参照のこと）、いくつかの残基をリンカーへと拡げ得る。 個々のＡクローンの検証。各クローンについて、図１に示される上記Ｗｎｔ Ｃ末端エピトープへの抗ｍｙｃ抗体結合、ならびに酵母のディスプレイされたＸＷｎｔ８へのＦｚ５およびＦｚ８ＣＲＤ結合は、上のＦＡＣＳパネルに示される。茶色のブロック矢印によって下に繋げられた対のパネルにおいては、上記Ｗｎｔが３Ｃプロテアーゼで上記酵母から切断された場合に、上記抗ＭｙｃおよびＦｚ５／Ｆｚ８−ＣＲＤ結合が失われることを示す。上記酵母にディスプレイされたＷｎｔは、上記Ｗｎｔと上記酵母との間に３Ｃプロテアーゼ切断部位を含むので、ＭｙｃおよびＦｚ−ＣＲＤへの結合の喪失は、上記ディスプレイされたＷｎｔとの特異的相互作用を示し、非特異的方法において上記酵母との相互作用を示さない。このようにして、切断の際の結合の喪失は、結合特異性の非常に厳密な試験である。（Ａ）クローンｗｎｔ Ａ３の検証。構築物ＡＧＡ２−リンカー−３Ｃ部位−ＧＳ−ＡＷＳＡＰＤＹＣＬＫＮＩＳＬＧＬＱＧＴＥＧＲＥＣＬＱＳＧＫＮＬＳＱＷＥＲＲＳＣＫＲＬＣＴＤＣＧＬＲＶＥＥＫＫＴＥＩＩＳＳＣＮＣＫＦＨＷＣＣＴＶＫＣＥＱＣＫＱＶＶＩＥＨＦＣＡＧＳＳＧＧＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬＬＥＩ＊＊を使用した。（Ｂ）クローンｗｎｔ Ａ１２の検証。構築物ＡＧＡ２−リンカー−３Ｃ部位−ＧＳ−ＡＷＳＶＮＮＦＬＥＤＳＰＤＨＣＬＫＮＩＳＬＧＬＱＧＴＥＧＲＥＣＬＱＳＧＫＮＬＳＱＷＥＲＲＳＣＫＲＬＣＴＤＣＧＬＲＶＥＥＫＫＴＥＩＩＳＳＣＮＣＫＦＨＷＣＣＴＶＫＣＥＱＣＫＱＶＶＩＫＹＦＣＡＧＳＳＧＧＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬＬＥＩ＊＊を使用した。 個々のＡクローンの検証。各クローンについて、図１に示される上記Ｗｎｔ Ｃ末端エピトープへの抗ｍｙｃ抗体結合、ならびに酵母のディスプレイされたＸＷｎｔ８へのＦｚ５およびＦｚ８ＣＲＤ結合は、上のＦＡＣＳパネルに示される。茶色のブロック矢印によって下に繋げられた対のパネルにおいては、上記Ｗｎｔが３Ｃプロテアーゼで上記酵母から切断された場合に、上記抗ＭｙｃおよびＦｚ５／Ｆｚ８−ＣＲＤ結合が失われることを示す。上記酵母にディスプレイされたＷｎｔは、上記Ｗｎｔと上記酵母との間に３Ｃプロテアーゼ切断部位を含むので、ＭｙｃおよびＦｚ−ＣＲＤへの結合の喪失は、上記ディスプレイされたＷｎｔとの特異的相互作用を示し、非特異的方法において上記酵母との相互作用を示さない。このようにして、切断の際の結合の喪失は、結合特異性の非常に厳密な試験である。（Ａ）クローンｗｎｔ Ａ３の検証。構築物ＡＧＡ２−リンカー−３Ｃ部位−ＧＳ−ＡＷＳＡＰＤＹＣＬＫＮＩＳＬＧＬＱＧＴＥＧＲＥＣＬＱＳＧＫＮＬＳＱＷＥＲＲＳＣＫＲＬＣＴＤＣＧＬＲＶＥＥＫＫＴＥＩＩＳＳＣＮＣＫＦＨＷＣＣＴＶＫＣＥＱＣＫＱＶＶＩＥＨＦＣＡＧＳＳＧＧＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬＬＥＩ＊＊を使用した。（Ｂ）クローンｗｎｔ Ａ１２の検証。構築物ＡＧＡ２−リンカー−３Ｃ部位−ＧＳ−ＡＷＳＶＮＮＦＬＥＤＳＰＤＨＣＬＫＮＩＳＬＧＬＱＧＴＥＧＲＥＣＬＱＳＧＫＮＬＳＱＷＥＲＲＳＣＫＲＬＣＴＤＣＧＬＲＶＥＥＫＫＴＥＩＩＳＳＣＮＣＫＦＨＷＣＣＴＶＫＣＥＱＣＫＱＶＶＩＫＹＦＣＡＧＳＳＧＧＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬＬＥＩ＊＊を使用した。 個々のＢクローンの検証。各クローンについて、図１に示される上記Ｗｎｔ Ｃ末端エピトープに対する抗ｍｙｃ抗体結合、ならびに酵母にディスプレイされたＸＷｎｔ８に対するＦｚ５およびＦｚ８ＣＲＤの結合は、上のＦＡＣＳパネルに示される。比較において、茶色のブロック矢印によって下に繋げられた対のパネルにおいては、上記Ｗｎｔが３Ｃプロテアーゼで上記酵母から切断された場合に、上記抗ＭｙｃおよびＦｚ５／Ｆｚ８−ＣＲＤ結合が失われることを示す。上記酵母にディスプレイされたＷｎｔは、上記Ｗｎｔと上記酵母との間に３Ｃプロテアーゼ切断部位を含むので、ＭｙｃおよびＦｚ−ＣＲＤへの結合の喪失は、上記ディスプレイされたＷｎｔとの特異的相互作用を示し、非特異的方法において上記酵母との相互作用を示さない。このようにして、切断の際の結合の喪失は、結合特異性の非常に厳密な試験である。（Ａ）クローンｗｎｔ Ｂ２の検証。構築物ＡＧＡ２−リンカー−３Ｃ部位−ＧＳ−ＮＧＫＡＭＱＧＶＦＥＹＹＫＳＶＴＦＶＳＮＣＧＳＨＰＳＴＴＳＫＧＳＰＩＮＴＱＹＶＦＫＤＮＳＳＴＩＥＧＲＹＰＹＤＶＰＤＹＡＬＱＡＳＧＧＧＧＳＶＬＥＤＬＰＤＹＣＬＫＮＩＳＬＧＬＱＧＴＥＧＲＥＣＬＱＳＧＫＮＬＳＱＷＥＲＲＳＣＫＲＬＣＴＤＣＧＬＨＶＥＥＫＫＩＥＩＩＳＳＣＮＣＫＦＨＷＣＣＴＶＫＣＥＱＣＫＱＶＶＶＫＨＦＣＡＧＳＳＧＧＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬＬＥＩ＊＊を使用した。（Ｂ）クローンｗｎｔ Ｂ７の検証。構築物ＡＧＡ２−リンカー−３Ｃ部位−ＧＳ−ＡＷＳＶＮＮＥＬＩＦＬＥＤＳＰＤＹＣＬＫＮＩＳＬＧＬＱＧＴＥＧＲＥＣＬＱＳＧＫＮＬＳＱＷＥＲＲＳＣＫＲＬＣＴＤＣＧＬＲＶＥＥＲＫＴＥＩＩＳＳＣＮＣＫＦＨＷＣＣＴＶＫＣＥＱＣＫＱＶＶＩＫＨＦＣＡＧＳＳＧＧＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬＬＥＩ＊＊を使用した。 個々のＢクローンの検証。各クローンについて、図１に示される上記Ｗｎｔ Ｃ末端エピトープに対する抗ｍｙｃ抗体結合、ならびに酵母にディスプレイされたＸＷｎｔ８に対するＦｚ５およびＦｚ８ＣＲＤの結合は、上のＦＡＣＳパネルに示される。比較において、茶色のブロック矢印によって下に繋げられた対のパネルにおいては、上記Ｗｎｔが３Ｃプロテアーゼで上記酵母から切断された場合に、上記抗ＭｙｃおよびＦｚ５／Ｆｚ８−ＣＲＤ結合が失われることを示す。上記酵母にディスプレイされたＷｎｔは、上記Ｗｎｔと上記酵母との間に３Ｃプロテアーゼ切断部位を含むので、ＭｙｃおよびＦｚ−ＣＲＤへの結合の喪失は、上記ディスプレイされたＷｎｔとの特異的相互作用を示し、非特異的方法において上記酵母との相互作用を示さない。このようにして、切断の際の結合の喪失は、結合特異性の非常に厳密な試験である。（Ａ）クローンｗｎｔ Ｂ２の検証。構築物ＡＧＡ２−リンカー−３Ｃ部位−ＧＳ−ＮＧＫＡＭＱＧＶＦＥＹＹＫＳＶＴＦＶＳＮＣＧＳＨＰＳＴＴＳＫＧＳＰＩＮＴＱＹＶＦＫＤＮＳＳＴＩＥＧＲＹＰＹＤＶＰＤＹＡＬＱＡＳＧＧＧＧＳＶＬＥＤＬＰＤＹＣＬＫＮＩＳＬＧＬＱＧＴＥＧＲＥＣＬＱＳＧＫＮＬＳＱＷＥＲＲＳＣＫＲＬＣＴＤＣＧＬＨＶＥＥＫＫＩＥＩＩＳＳＣＮＣＫＦＨＷＣＣＴＶＫＣＥＱＣＫＱＶＶＶＫＨＦＣＡＧＳＳＧＧＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬＬＥＩ＊＊を使用した。（Ｂ）クローンｗｎｔ Ｂ７の検証。構築物ＡＧＡ２−リンカー−３Ｃ部位−ＧＳ−ＡＷＳＶＮＮＥＬＩＦＬＥＤＳＰＤＹＣＬＫＮＩＳＬＧＬＱＧＴＥＧＲＥＣＬＱＳＧＫＮＬＳＱＷＥＲＲＳＣＫＲＬＣＴＤＣＧＬＲＶＥＥＲＫＴＥＩＩＳＳＣＮＣＫＦＨＷＣＣＴＶＫＣＥＱＣＫＱＶＶＩＫＨＦＣＡＧＳＳＧＧＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬＬＥＩ＊＊を使用した。 バキュロウイルス感染昆虫細胞からの組換えの水溶性Ｃ末端ミニＷｎｔ８ドメインの生成、およびＦｚ５ ＣＲＤとの相互作用の実証。工程１において、ミニＸｗｎｔ８の上記Ｂ７境界バージョンを、Ｃ末端ヘキサヒスチジンタグ付きで、昆虫細胞から発現させた（上の一番左の模式図）。工程２において、次に、このタンパク質を、ｓｕｐｅｒｄｅｘ−７５ゲル濾過クロマトグラフィーによって（そして付随して、クーマシーブルーで染色したＳＤＳゲルによって）精製した。ここでそれは、ミニＷｎｔとして正確なＭＷの適切に折りたたみされたタンパク質を表す位置において、上記カラムから溶出することが示された。工程３において、このミニＷｎｔ８を次に、Ｆｚ５−ＣＲＤ−Ｆｃ融合物に添加し、工程４において、ゲル濾過で再分析する。Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５カラムでの混合物の分画、続いて、非還元型ポリアクリルアミドゲルでの電気泳動は、同じ画分中に上記Ｃｔｅｒｍ ミニｗｎｔ８およびＦｚ５ＣＲＤ−Ｆｃ融合物が存在し、上記Ｃｔｅｒｍ ミニｗｎｔ８は、Ｆｚ５ＣＲＤ−Ｆｃの非存在下よりも早い画分において溶出することを実証した。工程５において、プロテインＡでの上記Ｆｚ５ＣＲＤ−Ｆｃ融合物のＦｚ免疫沈降は、上記Ｃｔｅｒｍ ミニｗｎｔ８タンパク質もまた沈降させた。従って、ミニＸＷｎｔ８とＦｚ５−ＣＲＤとの間の特異的結合相互作用の形成は、２つの方法で実証された：工程４−ゲル濾過を使用する同時溶出（ｃｏ−ｅｌｕｔｉｏｎ）、および工程５−同時免疫沈降（ｃｏ−ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）。 表面プラズモン共鳴（Ｂｉａｃｏｒｅ）によるｍＦｚ８／５−ＣＲＤのミニＸＷｎｔ８（アミノ酸残基２４８〜３３８）の結合親和性測定。上記Ｆｚ８−ＣＲＤもしくはｍＦｚ５ ＣＲＤを、ストレプトアビジン被覆ＣＭ４ Ｂｉａｃｏｒｅチップに、Ｃ末端ビオチンを介して繋げる。データは、精製された昆虫で発現されたミニＸＷｎｔ８ Ｃ−ｔｅｒｍフラグメントと、Ｆｚ５ ＣＲＤおよびＦｚ８ ＣＲＤの両方との直接相互作用を実証する。図の下には、生の曲線適合データおよび結果が示される。 表面プラズモン共鳴（Ｂｉａｃｏｒｅ）によるｍＦｚ８／５−ＣＲＤのミニＸＷｎｔ８（アミノ酸残基２４８〜３３８）の結合親和性測定。上記Ｆｚ８−ＣＲＤもしくはｍＦｚ５ ＣＲＤを、ストレプトアビジン被覆ＣＭ４ Ｂｉａｃｏｒｅチップに、Ｃ末端ビオチンを介して繋げる。データは、精製された昆虫で発現されたミニＸＷｎｔ８ Ｃ−ｔｅｒｍフラグメントと、Ｆｚ５ ＣＲＤおよびＦｚ８ ＣＲＤの両方との直接相互作用を実証する。図の下には、生の曲線適合データおよび結果が示される。 ヒトＷｎｔのＣ末端ドメインと、Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ（ＮＭ＿００１０８８１６８）由来のＷｎｔ８およびＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ由来のＷｎｔ５（「Ｄｒｏｍｅ」）のＣ末端ドメインとの整列。 上記ＬＲＰ６細胞外ドメインとＸＷｎｔ８およびその変異体のＮ末端ミニＷｎｔとの間の相互作用。（ａ）ＸＷｎｔ８の野生型Ｎｔｅｒｍ ミニｗｎｔとＬＲＰ６との間の相互作用。（ｂ）エラープローン酵母ライブラリーに由来するＸＷｎｔ８のＮｔｅｒｍ ミニｗｎｔのクローンとＬＲＰ６との間の相互作用。クローンを、抗ｃ−ｍｙｃ（ヒストグラム；ｃ−ｍｙｃ抗体：１：２５０一次、１：１００二次）でのＦＡＣＳによって分析して、表面ディスプレイを確認し、ＬＲＰ６（Ｅ１Ｅ２）−Ｆｃ（ドットプロット；ＬＲＰ６（Ｅ１Ｅ２）−Ｆｃ：２μＭ，１：２５二次）で分析して、上記ドメインがＬＲＰ６に結合することを実証した。上記ヒストグラムのゲート制御されたドメインにおけるピークは、ｃ−ｍｙｃについての陽性シグナルを示し、従って、Ｎｔｅｒｍ ミニｗｎｔ−８の存在を示す。上記ドットプロットの右下４分円における集団は、ＬＲＰ６についての陽性シグナルを示す。（ｂ）にある上記クローンが全て、（ａ）にあるものに対して匹敵するＦＡＣＳプロットを有することに注意のこと。これらは、野生型Ｎ−ｔｅｒｍ ミニｗｎｔから生成された。いくつかのクローンにおいて、Ｃｙｓ５５ＡｌａもしくはＳｅｒ１８７Ａｌａ変異を、上記ライブラリーを作製する前に、親ＸＷｎｔ８ ｃＤＮＡに組み込んで、上記ポリペプチドが、パルミテート脂質基の付加によって改変されないことを確実にした。これら変異部位を、パルミトイル化の部位としてＷｎｔ３Ａにおいて類似の５５位および１８７位を示す公開された文献に基づいて選択した（例えば、Ｗｉｌｌｅｒｔ ｅｔ ａｌ． （２００３）前出を参照のこと）。ＸＷｎｔ８ Ｎ−ｔｅｒｍドメインの非変異野生型染色もまた提供する。これはまた、Ｌｒｐ６への実質的結合を示す。従って、これらデータは、ＬＲＰ６への水溶性Ｎｔｅｒｍ ミニＷｎｔ結合を実証する。 上記ＬＲＰ６細胞外ドメインとＸＷｎｔ８およびその変異体のＮ末端ミニＷｎｔとの間の相互作用。（ａ）ＸＷｎｔ８の野生型Ｎｔｅｒｍ ミニｗｎｔとＬＲＰ６との間の相互作用。（ｂ）エラープローン酵母ライブラリーに由来するＸＷｎｔ８のＮｔｅｒｍ ミニｗｎｔのクローンとＬＲＰ６との間の相互作用。クローンを、抗ｃ−ｍｙｃ（ヒストグラム；ｃ−ｍｙｃ抗体：１：２５０一次、１：１００二次）でのＦＡＣＳによって分析して、表面ディスプレイを確認し、ＬＲＰ６（Ｅ１Ｅ２）−Ｆｃ（ドットプロット；ＬＲＰ６（Ｅ１Ｅ２）−Ｆｃ：２μＭ，１：２５二次）で分析して、上記ドメインがＬＲＰ６に結合することを実証した。上記ヒストグラムのゲート制御されたドメインにおけるピークは、ｃ−ｍｙｃについての陽性シグナルを示し、従って、Ｎｔｅｒｍ ミニｗｎｔ−８の存在を示す。上記ドットプロットの右下４分円における集団は、ＬＲＰ６についての陽性シグナルを示す。（ｂ）にある上記クローンが全て、（ａ）にあるものに対して匹敵するＦＡＣＳプロットを有することに注意のこと。これらは、野生型Ｎ−ｔｅｒｍ ミニｗｎｔから生成された。いくつかのクローンにおいて、Ｃｙｓ５５ＡｌａもしくはＳｅｒ１８７Ａｌａ変異を、上記ライブラリーを作製する前に、親ＸＷｎｔ８ ｃＤＮＡに組み込んで、上記ポリペプチドが、パルミテート脂質基の付加によって改変されないことを確実にした。これら変異部位を、パルミトイル化の部位としてＷｎｔ３Ａにおいて類似の５５位および１８７位を示す公開された文献に基づいて選択した（例えば、Ｗｉｌｌｅｒｔ ｅｔ ａｌ． （２００３）前出を参照のこと）。ＸＷｎｔ８ Ｎ−ｔｅｒｍドメインの非変異野生型染色もまた提供する。これはまた、Ｌｒｐ６への実質的結合を示す。従って、これらデータは、ＬＲＰ６への水溶性Ｎｔｅｒｍ ミニＷｎｔ結合を実証する。 上記ＬＲＰ６細胞外ドメインとＸＷｎｔ８およびその変異体のＮ末端ミニＷｎｔとの間の相互作用。（ａ）ＸＷｎｔ８の野生型Ｎｔｅｒｍ ミニｗｎｔとＬＲＰ６との間の相互作用。（ｂ）エラープローン酵母ライブラリーに由来するＸＷｎｔ８のＮｔｅｒｍ ミニｗｎｔのクローンとＬＲＰ６との間の相互作用。クローンを、抗ｃ−ｍｙｃ（ヒストグラム；ｃ−ｍｙｃ抗体：１：２５０一次、１：１００二次）でのＦＡＣＳによって分析して、表面ディスプレイを確認し、ＬＲＰ６（Ｅ１Ｅ２）−Ｆｃ（ドットプロット；ＬＲＰ６（Ｅ１Ｅ２）−Ｆｃ：２μＭ，１：２５二次）で分析して、上記ドメインがＬＲＰ６に結合することを実証した。上記ヒストグラムのゲート制御されたドメインにおけるピークは、ｃ−ｍｙｃについての陽性シグナルを示し、従って、Ｎｔｅｒｍ ミニｗｎｔ−８の存在を示す。上記ドットプロットの右下４分円における集団は、ＬＲＰ６についての陽性シグナルを示す。（ｂ）にある上記クローンが全て、（ａ）にあるものに対して匹敵するＦＡＣＳプロットを有することに注意のこと。これらは、野生型Ｎ−ｔｅｒｍ ミニｗｎｔから生成された。いくつかのクローンにおいて、Ｃｙｓ５５ＡｌａもしくはＳｅｒ１８７Ａｌａ変異を、上記ライブラリーを作製する前に、親ＸＷｎｔ８ ｃＤＮＡに組み込んで、上記ポリペプチドが、パルミテート脂質基の付加によって改変されないことを確実にした。これら変異部位を、パルミトイル化の部位としてＷｎｔ３Ａにおいて類似の５５位および１８７位を示す公開された文献に基づいて選択した（例えば、Ｗｉｌｌｅｒｔ ｅｔ ａｌ． （２００３）前出を参照のこと）。ＸＷｎｔ８ Ｎ−ｔｅｒｍドメインの非変異野生型染色もまた提供する。これはまた、Ｌｒｐ６への実質的結合を示す。従って、これらデータは、ＬＲＰ６への水溶性Ｎｔｅｒｍ ミニＷｎｔ結合を実証する。 上記ＬＲＰ６細胞外ドメインとＸＷｎｔ８およびその変異体のＮ末端ミニＷｎｔとの間の相互作用。（ａ）ＸＷｎｔ８の野生型Ｎｔｅｒｍ ミニｗｎｔとＬＲＰ６との間の相互作用。（ｂ）エラープローン酵母ライブラリーに由来するＸＷｎｔ８のＮｔｅｒｍ ミニｗｎｔのクローンとＬＲＰ６との間の相互作用。クローンを、抗ｃ−ｍｙｃ（ヒストグラム；ｃ−ｍｙｃ抗体：１：２５０一次、１：１００二次）でのＦＡＣＳによって分析して、表面ディスプレイを確認し、ＬＲＰ６（Ｅ１Ｅ２）−Ｆｃ（ドットプロット；ＬＲＰ６（Ｅ１Ｅ２）−Ｆｃ：２μＭ，１：２５二次）で分析して、上記ドメインがＬＲＰ６に結合することを実証した。上記ヒストグラムのゲート制御されたドメインにおけるピークは、ｃ−ｍｙｃについての陽性シグナルを示し、従って、Ｎｔｅｒｍ ミニｗｎｔ−８の存在を示す。上記ドットプロットの右下４分円における集団は、ＬＲＰ６についての陽性シグナルを示す。（ｂ）にある上記クローンが全て、（ａ）にあるものに対して匹敵するＦＡＣＳプロットを有することに注意のこと。これらは、野生型Ｎ−ｔｅｒｍ ミニｗｎｔから生成された。いくつかのクローンにおいて、Ｃｙｓ５５ＡｌａもしくはＳｅｒ１８７Ａｌａ変異を、上記ライブラリーを作製する前に、親ＸＷｎｔ８ ｃＤＮＡに組み込んで、上記ポリペプチドが、パルミテート脂質基の付加によって改変されないことを確実にした。これら変異部位を、パルミトイル化の部位としてＷｎｔ３Ａにおいて類似の５５位および１８７位を示す公開された文献に基づいて選択した（例えば、Ｗｉｌｌｅｒｔ ｅｔ ａｌ． （２００３）前出を参照のこと）。ＸＷｎｔ８ Ｎ−ｔｅｒｍドメインの非変異野生型染色もまた提供する。これはまた、Ｌｒｐ６への実質的結合を示す。従って、これらデータは、ＬＲＰ６への水溶性Ｎｔｅｒｍ ミニＷｎｔ結合を実証する。 上記ヒトＷｎｔのＮ末端ドメインと、Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ Ｗｎｔ８およびＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ Ｗｎｔ５（「Ｄｒｏｍｅ」）のＮ末端ドメインとの整列。

（発明の詳細な説明）
本発明の方法および組成物を記載する前に、本発明は、記載される特定の方法にも組成物にも限定されず、よって、当然のことながら、変動し得ることが理解されるべきである。本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるので、本明細書で使用される用語法は、特定の実施形態を記載する目的に過ぎず、限定されることは意図していないことも理解されるべきである。

ある範囲の値が提供される場合、文脈が明らかに別のことを示さなければ、その範囲の上限と下限との間にある、下限の単位の１／１０までの、間にある各値もまた、具体的に開示されていると理解される。示された範囲における任意の示される値もしくは間にある値と、その示された範囲における任意の他の示されるもしくは間にある値との間のより小さなそれぞれの範囲は、本発明内に包含される。これらのより小さな範囲の上限および下限は、独立して、上記範囲に含まれてもよいし、排除されてもよく、上記限界のいずれか一方か、いずれでもないか、もしくは両方の限界がより小さな範囲に含まれる各範囲もまた、上記示された範囲における任意の具体的に排除された限界を条件として、本発明内に包含される。上記示された範囲が上記限界のうちの一方もしくは両方を含む場合、その含められた限界のうちのいずれかもしくは両方を排除する範囲もまた、本発明に包含される。

別段定義されなければ、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものに類似もしくは等価な任意の方法および材料が、本発明の実施もしくは試験にあたって使用され得るが、いくつかの潜在的かつ好ましい方法および材料が、ここで記載される。本明細書で言及される全ての刊行物は、上記刊行物が引用されるものに関連して方法および／もしくは材料を開示および記載するために、本明細書に参考として援用される。本開示は、矛盾が存在する程度まで援用される刊行物の任意の開示に取って代わることが理解される。

本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「１つの、ある（ａ）」、「１つの、ある（ａｎ）」および「上記、この、その（ｔｈｅ）」は、文脈が明らかに別のことを示さなければ、複数形の指示対象を含むことに注意しなければならない。従って、例えば、「１つの細胞」への言及は、このような複数の細胞を包含し、「上記ペプチド」への言及は、１種以上のペプチドおよびその等価物（例えば、当業者に公知の、ポリペプチドなど）への言及を包含する。

本明細書で考察される刊行物は、本願の出願日より前のそれらの開示を提供するに過ぎない。本発明が、先行発明によってこのような刊行物より前にある権利を与えられないということを認めるものとして解釈されるべきことは、本明細書には何もない。さらに、提供される刊行物の日付は、実際の刊行日とは異なる場合があり、独立して確認される必要があるかもしれない。

（定義）
ミニｗｎｔ組成物およびそれらの使用法が提供される。これら組成物および方法は、Ｗｎｔレセプターを発現する細胞においてＷｎｔシグナル伝達を阻害することにおいて（例えば、異常な細胞増殖を阻害するために）；治療部分を、Ｗｎｔレセプターを発現する細胞に送達することにおいて；画像化部分を、Ｗｎｔレセプターを発現する細胞に送達することにおいて；およびＷｎｔ特異的抗体を生成することにおいて特定の用途を見出す。本発明のこれらおよび他の目的、利点、および特徴は、以下でより十分に記載されるような、上記組成物および方法の詳細を読めば、当業者に明らかになる。

「Ｗｎｔタンパク質」は、胚形成および成熟組織の両方において重要な役割を果たす高度に保存された分泌型シグナル伝達分子のファミリーのメンバーである。用語「Ｗｎｔ」もしくは「Ｗｎｔ遺伝子生成物」もしくは「Ｗｎｔポリペプチド」は、本明細書で使用される場合、天然の配列のＷｎｔポリペプチド、Ｗｎｔポリペプチド改変体、ＷｎｔポリペプチドフラグメントおよびキメラＷｎｔポリペプチドを包含する。「ミニｗｎｔポリペプチド」は、その由来の上記全長Ｗｎｔタンパク質が１種以上のＷｎｔレセプターに特異的に結合する能力を保持する、全長Ｗｎｔタンパク質のフラグメントであるポリペプチドである。Ｗｎｔレセプターへの上記ミニｗｎｔの結合は、上記Ｗｎｔレセプターからのシグナル伝達が阻害されるという点において、ドミナントネガティブ効果を有し得る。

用語「天然配列のＷｎｔポリペプチド」とは、これらが天然において見いだされる場合の配列を含むＷｎｔポリペプチドをいう。例えば、本願における目的のヒトの天然配列のＷｎｔタンパク質は、以下を含む：

各メンバーは、上記ファミリーと種々の程度の配列同一性を有するが、全ては、２３〜２４個の保存されたシステイン残基を含む小さな（すなわち、３９〜４６ｋＤ）、アシル化され、パルミトイル化された、分泌型の糖タンパク質（その間隔は、高度に保存されている（ＭｃＭａｈｏｎ， Ａ Ｐ ｅｔ ａｌ．， Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ． １９９２；８： ２３６−２４２；Ｍｉｌｌｅｒ， Ｊ Ｒ． Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ． ２００２；３（１）： ３００１．１−３００１．１５））をコードする。本発明において目的の他の天然配列のＷｎｔポリペプチドは、任意の哺乳動物（飼い慣らされた動物および家畜、ならびに動物園動物、実験動物もしくはペット動物（例えば、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウサギ、ラット、マウス、カエル、ゼブラフィッシュ、ショウジョウバエ、蠕虫など）が挙げられる）に由来する上記のもののオルソログを含む。

「天然配列」のミニｗｎｔポリペプチドは、ある配列のＷｎｔポリペプチドのアミノ酸配列のフラグメントである。このような天然配列のポリペプチドは、内因性Ｗｎｔタンパク質を生成する細胞から単離され得るか、または組換え手段もしくは合成手段によって生成され得る。従って、天然配列のミニｗｎｔポリペプチドは、例えば、天然に存在するヒトＷｎｔポリペプチド、マウスＷｎｔポリペプチド、または任意の他の哺乳動物種もしくは非哺乳動物種（例えば、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ、Ｃ． ｅｌｅｇａｎｓなど）に由来するポリペプチドによって含まれるアミノ酸配列を有し得る。

「改変」ミニｗｎｔポリペプチドは、そのフラグメントの長さにわたって、天然のＷｎｔ配列と１００％未満の配列同一性を有する、以下に定義されるとおりの生物学的に活性なポリペプチドを意味する。このような改変体は、１もしくはそれより多くのアミノ酸残基が上記天然配列のＮ末端もしくはＣ末端において、または上記天然配列の中に付加されたポリペプチド；約１〜４０個のアミノ酸残基が欠失され、必要に応じて、１もしくはそれより多くのアミノ酸残基によって置換されたポリペプチド；およびアミノ酸残基が、得られた生成物が天然に存在しないアミノ酸を有するように、共有結合で改変された上記ポリペプチドの誘導体を含む。通常、生物学的に活性な改変体は、天然配列のポリペプチドと少なくとも約７５％の配列同一性、約８０％の配列同一性、約８５％のアミノ酸配列同一性、約９０％のアミノ酸配列同一性（好ましくは、少なくとも約９５％、より好ましくは、少なくとも約９９％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を有する。当該分野で公知の種々の方法は、このような改変ポリペプチドを開発するにあたって利用され得る。

「キメラ」ミニｗｎｔポリペプチドは、異種ポリペプチドに融合もしくは結合体化されたミニｗｎｔポリペプチドを含むポリペプチドである。上記キメラミニｗｎｔポリペプチドは、一般に、少なくとも１つの生物学的特性を、上記最初のミニｗｎｔポリペプチドと共有する。キメラポリペプチドの例としては、１種もしくはそれより多くの機能部分（例えば、治療部分、画像化部分、エピトープタグ）に融合されたミニｗｎｔポリペプチドが挙げられる。代表的には、上記機能部分がポリペプチド部分である場合、上記部分は、ある機能（例えば、マルチマー化を促進する、細胞死を促進する、細胞機能を変化させる、蛍光シグナル、エピトープ配列など）を提供するために十分な残基を有するが、上記ミニｗｎｔポリペプチドの生物学的活性に干渉しないように十分に短い。エピトープとして使用するために適切なタグポリペプチドは、一般に、少なくとも６個のアミノ酸残基、および通常は、約６〜２５０個の間のアミノ酸残基を有する。

「水溶性」によって、界面活性剤の非存在下で水性緩衝液中に可溶性である（上記ポリペプチドの生物学的に有効な用量を提供する濃度において通常は可溶性である）組成物が意味される。水溶性である組成物は、出発物質（これから実質的に均質な組成物が精製される）のものの少なくとも約５％、通常は、上記出発物質のものの少なくとも約１０％、２０％、もしくは３０％、より通常には、上記出発物質のものの約４０％、５０％、もしくは６０％であり、そして約５０％、約９０％もしくはそれより大であり得る比活性を有する実質的に均質な組成物を形成する。本発明のミニｗｎｔ組成物は、代表的には、少なくとも２５μＭもしくはそれより大、例えば、少なくとも２５μＭ、４０μＭ、もしくは５０μＭ、通常は、少なくとも６０μＭ、７０μＭ、８０μＭ、もしくは９０μＭ、ときおり、１００μＭ、１２０μＭ、もしくは１５０μＭ程度の濃度において、実質的に均質な溶液を形成する。言い換えると、本発明のミニｗｎｔ組成物は、代表的には、約０．１ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ、もしくは約１ｍｇ／ｍｌもしくはそれより大の濃度において実質的に均質な溶液を形成する。

「Ｗｎｔタンパク質シグナル伝達」もしくは「Ｗｎｔシグナル伝達」は、生物学的に活性なＷｎｔが、細胞に対してその効果を発揮して、細胞の活性を調節する機構に言及するために本明細書で使用される。Ｗｎｔタンパク質は、Ｗｎｔレセプター（Ｆｒｉｚｚｌｅｄ（Ｆｚ）ファミリーのタンパク質に由来するタンパク質、ＲＯＲファミリーのタンパク質に由来するタンパク質、ＬＲＰファミリーのタンパク質に由来するタンパク質であるＬＲＰ５、ＬＲＰ６、タンパク質ＦＲＬ１／ｃｒｙｐｔｏ、およびタンパク質Ｄｅｒａｉｌｅｄ／Ｒｙｋが挙げられる）への結合によって細胞活性を調節する。Ｗｎｔ結合によっていったん活性化されると、上記Ｗｎｔレセプターは、１種以上の細胞内シグナル伝達カスケードを活性化する。これらとしては、標準のＷｎｔシグナル伝達経路；Ｗｎｔ／平面内細胞極性（Ｗｎｔ／ＰＣＰ）経路；Ｗｎｔ−カルシウム（Ｗｎｔ／Ｃａ^２＋）経路（Ｇｉｌｅｓ， ＲＨ ｅｔ ａｌ． （２００３） Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １６５３， １−２４；Ｐｅｉｆｅｒ， Ｍ． ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２０： ３６９−３８０；Ｐａｐｋｏｆｆ， Ｊ． ｅｔ ａｌ （１９９６） Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １６： ２１２８−２１３４；Ｖｅｅｍａｎ， Ｍ． Ｔ． ｅｔ ａｌ． （２００３） Ｄｅｖ． Ｃｅｌｌ ５： ３６７−３７７）；および当該分野で周知であるとおりの他のＷｎｔシグナル伝達経路が挙げられる。例えば、上記標準のＷｎｔシグナル伝達経路の活性化は、細胞内タンパク質β−カテニンのリン酸化の阻害を生じ、サイトゾル中のβ−カテニンの蓄積およびこれが転写因子（例えば、ＴＣＦ／ＬＥＦ）と相互作用して、標的遺伝子を活性化するところである核へのその後のその転位をもたらす。上記Ｗｎｔ／ＰＣＰ経路の活性化は、ＲｈｏＡ、ｃ−Ｊｕｎ Ｎ末端キナーゼ（ＪＮＫ）、およびｎｅｍｏ様キナーゼ（ＮＬＫ）のシグナル伝達カスケードを活性化して、組織極性および細胞移動のような生物学的プロセスを制御する。（例えば、Ｗｎｔ−４、Ｗｎｔ−５ＡもしくはＷｎｔ−１１の結合による）上記Ｗｎｔ／Ｃａ２＋の活性化は、カルシウムイオンの細胞内放出を誘発し、このことは、プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）、カルシウム−カルモジュリン依存性キナーゼＩＩ（ＣａｍＫＩＩ）もしくはカルシニューリン（ＣａＣＮ）のようなカルシウム感受性酵素を活性化する。上記シグナル伝達経路の活性についてアッセイすることによって、Ｗｎｔ組成物の生物学的活性は、容易に決定され得る。「生物学的に活性なミニｗｎｔ」は、インビトロもしくはインビボで細胞に提供される場合、すなわち、動物（例えば、哺乳動物）に投与される場合、Ｗｎｔレセプターに特異的に結合し得、かつＷｎｔシグナル伝達を調節し得るミニｗｎｔ組成物である。頻繁には、ミニｗｎｔポリペプチドは、ｗｎｔシグナル伝達のドミナントネガティブ（または競合性）インヒビターである。

用語「特異的結合」とは、共有結合的もしくは非共有結合的な相互作用、または共有結合的相互作用と非共有結合的相互作用との組み合わせによって媒介され得る、酵素／基質、レセプター／リガンド、抗体／抗原、およびレクチン／炭水化物のような対形成した種の間で起こる結合をいう。上記２種の相互作用が非共有結合的に結合した複合体を生成する場合、起こる結合は、代表的には、静電気的結合、水素結合、もしくは親油性相互作用の結果である。よって、「特異的結合」は、抗体／抗原相互作用もしくはリガンド／レセプター相互作用の特徴を有する結合した複合体を生成する、２種の間に相互作用が存在する、対形成した種の間で起こる。インビボでの投与後に、機能アッセイにおける活性（例えば、骨再生を遅らせること、幹細胞増殖のダウンレギュレーションなど）のレベルを決定すること、非機能アッセイ（例えば、免疫染色、ＥＬＩＳＡ、クーマシーもしくは銀染色したゲルでの定量など）に存在するミニｗｎｔタンパク質の量を定量すること、およびインビボで生物学的に活性なミニｗｎｔの総ミニｗｎｔに対する比を決定することによって、組成物中のミニｗｎｔタンパク質の生物学的活性が決定され得る。生物学的に活性であるミニｗｎｔ組成物は、Ｗｎｔタンパク質の活性を、少なくとも約４０％、約６０％、より通常には、約７０％、７５％、もしくは８０％、しばしば、約８５％、９０％、もしくは９５％、ときおり１００％という高さ（すなわち、Ｗｎｔシグナル伝達の完全な排除）調節するものである。

用語「Ｗｎｔアンタゴニスト」、「Ｗｎｔインヒビター」および「Ｗｎｔシグナル伝達のインヒビター」は、細胞の活性のＷｎｔ調節を拮抗するか、阻害するか、もしくは負に調節する因子を意味するために、本明細書において交換可能に使用される。同様に、語句「Ｗｎｔシグナル伝達を拮抗する」および「Ｗｎｔシグナル伝達を阻害する」とは、細胞の活性のＷｎｔ調節を拮抗するか、阻害するか、または別の方法で負に調節することを意味するために、本明細書で交換可能に使用される。

「Ｆｚ」、「Ｆｚタンパク質」および「Ｆｚレセプター」とは、Ｆｒｉｚｚｌｅｄレセプターファミリーのタンパク質をいうために、本明細書で使用される。これらタンパク質は、ＣＲＤドメインを含む７回膜貫通タンパク質である（Ｉｎｇｈａｍ， Ｐ． Ｗ． （１９９６） Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ． １２： ３８２−３８４；Ｙａｎｇ−Ｓｎｙｄｅｒ， Ｊ． ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｃｕｒｒ． Ｂｉｏｌ． ６： １３０２−１３０６；Ｂｈａｎｏｔ， Ｐ． ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｎａｔｕｒｅ ３８２： ２２５−２３０）。Ｆｚファミリーには、１０個の既知のメンバー（Ｆｚ１からＦｚ１０）があり、そのうちのいずれかは、Ｗｎｔのレセプターとして働き得る。Ｆｚレセプターは、多くのＷｎｔ生物学的活性を媒介し、上記活性としては、シナプス形成の調節が挙げられるが、これらに限定されない。

「ＬＲＰ」、「ＬＲＰタンパク質」および「ＬＲＰレセプター」とは、低密度リポタンパク質レセプター関連タンパク質ファミリーのタンパク質をいうために、本明細書において使用される。これらレセプターは、レセプター媒介性エンドサイトーシスのプロセスにおいてリガンドを結合しかつインターナライズする１回貫通膜タンパク質である。ＬＲＰタンパク質であるＬＲＰ５（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿００２３３５．２）およびＬＲＰ６（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿００２３３６．２）は、上記Ｗｎｔレセプター複合体に含まれる。

Ｒｙｋ（そのＤｒｏｓｏｐｈｉｌａホモログは、Ｄｅｒａｉｌｅｄである）は、増殖因子レセプタープロテインチロシンキナーゼのファミリーの典型的でないメンバーであり、他のメンバーとは、活性化およびヌクレオチド結合ドメインにおける多くの保存された残基において異なる。上記Ｒｙｋのタンパク質配列は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿００１００５８６１（アイソフォーム１）およびＮＭ＿００２９５８．３（アイソフォーム２）において見いだされ得る。Ｒｙｋは、Ｗｎｔタンパク質のレセプターとして、通常、Ｆｚの共レセプターとして機能し、Ｗｎｔ生物学的活性（例えば、骨芽細胞分化、細胞移動、細胞運命決定、軸索誘導、および神経突起伸長の調節（運動ニューロン標的選択および神経筋結合部におけるシナプス形成が挙げられる））を媒介する。傷害による上記Ｗｎｔ／Ｒｙｋ経路の活性化は、軸索再生を阻害する。

「ＲＯＲ」、「ＲＯＲタンパク質」および「ＲＯＲレセプター」とは、レセプターチロシンキナーゼ様オーファンレセプターファミリーのＲＯＲ１タンパク質およびＲＯＲ２タンパク質をいうために、本明細書において使用される。上記ＲＯＲ１のタンパク質配列は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿００５０１２．２（アイソフォーム１）およびＮＭ＿００１０８３５９２．１（アイソフォーム２）において見いだされ得る。上記ＲＯＲ２のタンパク質配列は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿００４５６０．３において見いだされ得る。ＲＯＲ１およびＲＯＲ２は、Ｗｎｔタンパク質のレセプターとして、通常は、Ｆｚの共レセプターとして機能する。

「ＥＧＦ−ＣＦＣタンパク質」および「ＥＧＦ−ＣＦＣレセプター」とは、上皮増殖因子（ＥＧＦ）−ｃｒｙｐｔｏ、ＦＲＬ−１、ｃｒｙｐｔｉｃファミリーによってコードされるタンパク質をいうために、本明細書において使用される。これらタンパク質は、Ｃｒｉｐｔｏ（奇形がん腫由来増殖因子１、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿００３２１２．３（アイソフォーム１）およびＮＭ＿００１１７４１３６．１（アイソフォーム２）については、「ＣＲ−１」および「Ｔｄｇｆ１」ともいわれる）およびＣｒｙｐｔｉｃ（「ＣＦＣ１」ともいわれる。ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿０３２５４５．２）を含む。ＥＧＦ−ＣＦＣタンパク質は、改変ＥＧＦ様モチーフ（保存されたシステインリッチドメイン）、およびＣ末端疎水性領域を共有する。これらタンパク質はＷｎｔレセプターであり、脊椎動物胚形成および腫瘍増殖の間の細胞間シグナル伝達経路において重要な役割を果たす。

「含む」とは、記載される要素が、上記組成物／方法／キットにおいて必要とされるが、他の要素が、特許請求の範囲内において上記組成物／方法／キットなどを形成するために含められ得ることを意味する。例えば、ミニｗｎｔポリペプチドを含む組成物は、当該分野で容易に理解されるように、何らかの否定形の但し書きによって包含される要素を除いて、ミニｗｎｔポリペプチドに加えて、他の要素（例えば、上記ミニｗｎｔポリペプチドに結合した（例えば、共有結合した）機能部分（例えば、ポリペプチド、低分子、もしくは核酸）；上記ミニｗｎｔ組成物の安定性を促進する因子、上記ミニｗｎｔ組成物の溶解度を促進する因子、アジュバントなど）を含み得る組成物である。別の例として、例えば、ヒトＷｎｔの残基２９８〜３７０もしくは例えば、残基３４〜２４７に対応するＷｎｔアミノ酸配列、を含むミニｗｎｔポリペプチドは、否定形の但し書きによって記載される任意の配列を除き、その配列に加えて、Ｗｎｔアミノ酸配列を含み得る。

「〜から本質的になる」とは、本発明の基本的かつ新規な特徴に本質的に影響を及ぼさない、特定される材料もしくは工程に対して、記載される組成物もしくは方法の範囲の限定を意味する。例えば、開示される配列「から本質的になる」ミニｗｎｔポリペプチドは、上記開示されるアミノ酸配列±その由来の全長親Ｗｎｔ配列に基づいて、上記配列の境界において約５アミノ酸残基を有する（例えば、上記記載される境界をなしているアミノ酸残基より約５残基、４残基、３残基、２残基もしくは約１残基少ない、または上記記載される境界をなしているアミノ酸残基より約１残基、２残基、３残基、４残基、もしくは５残基多い）。

「〜からなる」とは、上記組成物、方法、もしくはキットから、特許請求の範囲において特定されていないあらゆる要素、工程、もしくは成分を排除することを意味する。例えば、開示された配列「からなる」ミニｗｎｔポリペプチドは、上記開示されたアミノ酸配列のみからなる。

「機能部分」もしくは「ＦＭ」とは、組成物に対して機能活性を付与するポリペプチド、低分子もしくは核酸組成物を意味する。機能部分の例としては、治療部分、結合部分および画像化部分が挙げられるが、これらに限定されない。

「治療部分」もしくは「ＴＭ」とは、組成物に対して治療活性を付与するポリペプチド、低分子もしくは核酸組成物を意味する。治療部分の例としては、細胞に対して本質的に有害な細胞毒素（例えば、低分子化合物、タンパク質毒素、および放射線増感部分（すなわち、放射性核種など）；細胞の活動を変化させる因子（例えば、低分子、ペプチド摸倣物、サイトカイン、ケモカイン）；および細胞をＡＤＣＣ依存性死滅もしくはＣＤＣ依存性死滅の標的とする部分（例えば、免疫グロブリンのＦｃ成分）が挙げられる。

「画像化部分」もしくは「ＩＭ」とは、細胞（例えば、本出願の組成物によって標的とされた細胞）の位置を突き止め、必要に応じて、上記細胞を可視化するために使用され得る非細胞傷害性の因子を意味する。

オリゴマー化部分は、当該分野で公知であるように、上記ミニｗｎｔを、ホモダイマー、ホモトリマー、ホモテトラマーもしくはより高次のオリゴマーへと、またはヘテロダイマー、ヘテロトリマー、ヘテロテトラマーもしくはより高次のオリゴマーへと、例えば、ジッパー、もしくはＦｃポリペプチド、ビオチンおよびアビジン／ストレプトアビジン、または他のアビディティ増強化学物質もしくはタンパク質因子によってオリゴマー化することを誘導するポリペプチド、低分子もしくは核酸組成物である。

語句「Ｗｎｔ媒介性状態」および「Ｗｎｔ媒介性障害」は、異常なもしくは望ましくないＷｎｔシグナル伝達によって特徴付けられる状態、障害もしくは疾患状態を記載するために、本明細書において交換可能に使用される。具体的局面において、上記異常なＷｎｔシグナル伝達は、類似の非罹患細胞もしくは非罹患組織におけるＷｎｔシグナル伝達のレベルを超える、罹患していると疑われる細胞もしくは組織におけるＷｎｔシグナル伝達のレベルである。Ｗｎｔ媒介性障害の例としては、異常な脈管形成と関連するもの（例えば、網膜症）、および異常な増殖と関連するもの（例えば、がん）が挙げられる。

用語「処置」、「処置する」などは、所望の薬理学的および／もしくは生理学的効果を得ることを一般に意味するために、本明細書において使用される。上記効果は、疾患もしくはその症状を完全にもしくは部分的に予防するという点から予防的であってもよいし、そして／または疾患および／もしくは上記疾患に原因があり得る有害な影響の部分的もしくは完全な治癒の点から治療的であってもよい。「処置」とは、本明細書で使用される場合、哺乳動物における疾患の任意の処置を網羅し、以下を含む：（ａ）上記疾患に対する素因があり得るが、上記疾患を有するとは未だ診断されていない被験体において上記疾患が起こるのを予防すること；（ｂ）上記疾患を阻害すること（すなわち、その発達を阻止すること）；または（ｃ）上記疾患を軽減すること（すなわち、上記疾患の後退を引き起こすこと）。上記治療剤は、疾患もしくは傷害が始まる前、その間、もしくはその後に投与され得る。進行中の疾患の処置（ここで上記処置は、上記患者の望ましくない臨床的症状を安定化させるかもしくは低下させる）は、特に重要である。このような処置は、望ましくは、罹患組織における機能が完全に失われる前に行われる。本発明の治療は、望ましくは、上記疾患の症候性段階中に投与され、いくつかの場合においては、上記疾患の症候性段階の後に投与される。

用語「個体」、「被験体」、「宿主」および「患者」とは、本明細書において交換可能に使用され、診断、処置もしくは治療が望まれる任意の哺乳動物被験体（特に、ヒト）をいう。

分子生化学および細胞生化学における一般的方法は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ３ｒｄ Ｅｄ． （Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， ＣＳＨ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ ２００１）；Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ４ｔｈ Ｅｄ． （Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ． ｅｄｓ．， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ １９９９）；Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ （Ｂｏｌｌａｇ ｅｔ ａｌ．， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ １９９６）；Ｎｏｎｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ （Ｗａｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ． ｅｄｓ．， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９９９）；Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ （Ｋａｐｌｉｆｔ ＆ Ｌｏｅｗｙ ｅｄｓ．， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９９５）；Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍａｎｕａｌ （Ｉ． Ｌｅｆｋｏｖｉｔｓ ｅｄ．， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９９７）；ならびにＣｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ： Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ （Ｄｏｙｌｅ ＆ Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ １９９８）（これらの開示は、本明細書に参考として援用される）のような標準テキストにおいて見いだされ得る。本開示において言及される遺伝子操作の試薬、クローニングベクター、およびキットは、販売業者（例えば、ＢｉｏＲａｄ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、およびＣｌｏｎＴｅｃｈ）から入手可能である。

（組成物）
ミニｗｎｔ組成物およびそれらの使用法が提供される。ミニｗｎｔ組成物は、ミニｗｎｔポリペプチドを含む組成物である。上記で考察されるように、ミニｗｎｔポリペプチドは、その由来の全長Ｗｎｔタンパク質の、少なくとも１種のＷｎｔレセプターに特異的に結合する能力を保持する、全長Ｗｎｔタンパク質のフラグメントであるポリペプチドである。全長Ｗｎｔタンパク質（これは、２種の別個の共レセプターに同時に結合し得る）とは異なり、ミニｗｎｔは、代表的には、上記共レセプターのうちの一方にのみ結合する。ミニｗｎｔポリペプチドは、通常、少なくとも約４０アミノ酸の長さ、通常は、少なくとも約５０アミノ酸の長さ、および約１２０アミノ酸以下の長さ、通常は、約１００アミノ酸以下の長さ、およびいくつかの実施形態においては、約８０〜約１００アミノ酸の長さである。

いくつかの実施形態において、上記ミニｗｎｔポリペプチドは、Ｃ末端ミニｗｎｔポリペプチド（本明細書において「Ｃ末端ミニｗｎｔ」もしくは「Ｃｔｅｒｍ ミニｗｎｔ」ともいわれる）である。Ｃｔｅｒｍ ミニｗｎｔは、Ｆｚ、ＲＯＲ、および／もしくはＲｙｋ Ｗｎｔレセプターに結合する、Ｗｎｔタンパク質のＣ末端ドメインから誘導した（すなわち、上記Ｃ末端ドメインからの配列を含む）ポリペプチド組成物である。いくつかの実施形態において、上記Ｃｔｅｒｍ ミニｗｎｔは、水溶性である。

Ｃｔｅｒｍ ミニｗｎｔは、上記ｗｎｔポリペプチドのカルボキシ末端ドメインを含むかもしくはこれからなり、アミノ末端ドメインのアミノ酸残基を含まない。上記カルボキシ末端ドメインの図は、（例えば、図６に示されるように）複数のヒトＷｎｔタンパク質とともに本明細書で例示され、上記図示されたドメインに示されるアミノ酸残基の実質的に全てからなってもよいし、上記図示されたドメインのアミノ末端もしくはカルボキシ末端のいずれかにおいて１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個またはそれより多くのアミノ酸残基が短縮されていてもよい。Ｃｔｅｒｍ ミニｗｎｔはまた、本明細書で提供される配列とのアラインメントによって経験的に同定され得る。一例において、Ｃｔｅｒｍ ミニｗｎｔ アミノ酸配列は、ヒトＷｎｔ１の２９８〜３７０位と保存された残基によって整列し、ヒトＷｎｔ１の１〜２５７残基と整列するアミノ酸配列を欠いているか、または上記で示されるように短縮され得る。いくつかの実施形態において、Ｃｔｅｒｍ ミニｗｎｔは、上記で定義されるとおりの改変体もしくはアナログである。いくつかの実施形態において、上記バリエーション（すなわち変異）は、その同族レセプターに対する親和性；溶解度；および／もしくはその同族レセプターに対する特異性を変化させる。

いくつかの実施形態において、上記ミニｗｎｔポリペプチドは、Ｎ末端ミニｗｎｔポリペプチド（本明細書において「Ｎ末端ミニｗｎｔ」もしくは「Ｎｔｅｒｍ ミニｗｎｔ」ともいわれる）である。Ｎｔｅｒｍ ミニｗｎｔは、ＬＲＰ５、ＬＲＰ６、および／もしくはｃｒｙｐｔｏに結合するＷｎｔタンパク質のＮ末端ドメインから誘導された（すなわち、上記Ｎ末端ドメインに由来する配列からなる）ポリペプチド組成物である。いくつかの実施形態において、上記Ｎｔｅｒｍ ミニｗｎｔは水溶性であり、他の実施形態において、上記Ｎｔｅｒｍ ミニｗｎｔは、脂溶性である。

いくつかの実施形態において、Ｎ末端ミニｗｎｔポリペプチドは、ｗｎｔポリペプチドのアミノ末端ドメインを含むかもしくは上記ドメインからなるポリペプチドであり、上記カルボキシ末端ドメインのアミノ酸残基を含まない。上記アミノ末端ドメインの図は、例えば、図８に示されるように、複数のヒトＷｎｔタンパク質とともに、本明細書で例示され、上記図示されたドメインにおいて示される実質的に全てのアミノ酸残基からなってもよいし、上記図示されたドメインのアミノ末端もしくはカルボキシ末端いずれかにおいて１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個またはそれより多くのアミノ酸残基が短縮されていてもよい。Ｎｔｅｒｍ ミニｗｎｔはまた、本明細書で提供される配列とのアラインメントによって経験的に同定され得る。一例において、Ｎｔｅｒｍ ミニｗｎｔ アミノ酸配列は、ヒトＷｎｔ１の３４〜２４７位と保存された残基によって整列し、ヒトＷｎｔ１の残基２８８〜３７０に対応する残基と整列するアミノ酸配列を欠くか、または上記で示されるように短縮されていてもよい。Ｎｔｅｒｍ ミニｗｎｔは、水溶性であってもよいし、脂溶性であってもよい。いくつかの実施形態において、Ｃｔｅｒｍ ミニｗｎｔは、上記で定義されるとおりの改変体もしくはアナログである。いくつかの実施形態において、上記バリエーション（すなわち変異）は、その同族レセプターに体する親和性；溶解度；および／もしくはその同族レセプターに対する特異性を変化させる。いくつかのこのような実施形態において、アミノ酸置換は、ヒトＷｎｔ１の残基９３および／もしくは残基２２４に整列される残基において行われ、その結果、ヒトＷｎｔ１の残基Ｃｙｓ^５５および／もしくはＳｅｒ^１８７に対応する上記残基は、ここでアラニンである。

任意の種の生物（例えば、マウス、ラット、ネコ、ニワトリ、ショウジョウバエ、カエル、ゼブラフィッシュ、イヌ、蠕虫など）に由来するＷｎｔタンパク質に対応するＣｔｅｒｍ ミニｗｎｔポリペプチドおよびＮｔｅｒｍ ミニｗｎｔポリペプチドは、本発明の組成物において用途を見いだす。このようなミニｗｎｔのポリペプチド配列は、当該分野で周知であるように、アラインメントソフトウェア（例えば、ＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴ、ＣｌｕｓｔａｌＷ、もしくは他のソフトウェア）を使用して、上記目的のホモログもしくはオルソログと、図６および図８に示される提供されたＷｎｔ配列とのアラインメントを行うことによって、容易に決定され得る。ミニｗｎｔポリペプチドを含む組成物は、上記記載されるミニｗｎｔポリペプチドから除外されると本明細書で具体的に示される要素を除いて、種々の要素を含み得る。例えば、上記ミニｗｎｔは、外因性ポリペプチドに融合され得る。この融合物が作製される部位は、上記ポリペプチドの生物学的活性、分泌もしくは結合特徴を最適化するために選択され得る。上記最適な部位は、慣用的な実験によって決定される。

例えば、ミニｗｎｔポリペプチドを含む組成物は、必要に応じて、それらの溶解度をさらに増大させるために、上記ミニｗｎｔポリペプチドに融合されたポリペプチドを含む。上記ドメインは、規定されるプロテアーゼ切断部位（例えば、ＴＥＶプロテアーゼによって切断されるＴＥＶ配列）を介して上記ポリペプチドに連結され得る。上記リンカーはまた、１つ以上の可撓性配列を含み得る（例えば、１〜１０個のグリシン残基）。いくつかの実施形態において、上記融合タンパク質の切断は、上記生成物の溶解度を維持する緩衝液中で、例えば、０．５〜２Ｍ 尿素の存在下で、溶解度を増大させるポリペプチドおよび／もしくはポリヌクレオチドの存在下などで、行われる。目的のドメインとしては、エンドソーム溶解（ｅｎｄｏｓｏｍｏｌｙｔｉｃ）ドメイン（例えば、インフルエンザＨＡドメイン）；および生成を補助する他のポリペプチド（例えば、ＩＦ２ドメイン、ＧＳＴドメイン、ＧＲＰＥドメインなど）が挙げられる。

別の例として、ミニｗｎｔポリペプチドを含む組成物は、必要に応じて、溶解度を改善するために上記ミニｗｎｔポリペプチドに体する改変を含み得る。例えば、上記ペプチドは、ＰＥＧ化されてもよい。ここでポリエチレンオキシ基は、増大した血流中半減期を提供する。上記ポリペプチドは、インビボ安定性を増大させるために、別のポリペプチドに融合され得る。一般に、このような融合パートナーは、安定な血漿タンパク質であり、これは、例えば、融合物として存在する場合に、上記ポリペプチドのインビボ血漿半減期を延ばし得、特に、このような安定な血漿タンパク質は、免疫グロブリン定常ドメインである。上記安定な血漿タンパク質が通常マルチマー形態において見いだされる大部分の場合において（例えば、免疫グロブリンもしくはリポタンパク質（ここで同じもしくは異なるポリペプチド鎖は、通常、ジスルフィド結合および／もしくは非共有結合して、組み立てられた複数鎖のポリペプチドを形成する））、上記ポリペプチドを含む本明細書中の融合物はまた、上記安定な血漿タンパク質前駆体と実質的に同じ構造を有するマルチマーとして生成および使用される。これらマルチマーは、これらが含む上記ポリペプチド因子に関して均質であるか、またはそれらは、１種より多くのポリペプチド因子を含み得る。

安定な血漿タンパク質は、代表的には、それらの天然の環境において、循環中で延びた半減期（すなわち、約２０時間より長い）を示すタンパク質である。適した安定な血漿タンパク質の例は、免疫グロブリン、アルブミン、リポタンパク質、アポリポタンパク質およびトランスフェリンである。上記ポリペプチド因子は、代表的には、上記ポリペプチドに対して延びた半減期を付与し得る上記血漿タンパク質もしくはそのフラグメントのＮ末端において上記血漿タンパク質（例えば、ＩｇＧ）に融合される。上記ポリペプチドの血漿半減期に対して約１００％より高い増大は、申し分ない。通常、上記ポリペプチドは、免疫グロブリンの可変領域の代わりに、その定常領域のＮ末端へとＣ末端が融合されるが、Ｎ末端融合もまた、用途を見いだし得る。代表的には、このような融合物は、免疫グロブリン重鎖の定常領域の少なくとも機能的に活性なヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインを保持する。上記重鎖は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、およびＩｇＤを含み得、通常、上記ＩｇＧクラスにおけるタンパク質のうちの１つもしくは組み合わせを含む。融合はまた、定常ドメインの上記Ｆｃ部分のＣ末端に、または上記重鎖のＣＨ１の直ぐＮ末端に、または軽鎖の対応する領域に対して行われる。これは、通常、適切なＤＮＡ配列を構築し、これを組換え細胞培養物において発現させることによって達成される。あるいは、上記ポリペプチドは、公知の方法に従って合成され得る。

いくつかの実施形態において、上記ミニｗｎｔは、その配列を変化させることなく改変される。一次配列を変化させない目的の改変としては、ポリペプチドの化学的誘導体化（例えば、アシル化、アセチル化、カルボキシル化、アミド化など）が挙げられる。また、グリコシル化の改変（例えば、その合成およびプロセシング中に、またはさらなるプロセシング工程において、ポリペプチドのグリコシル化パターンを改変することによって行われるもの）が含まれる；例えば、上記ポリペプチドをグリコシル化に影響を及ぼす酵素（例えば、哺乳動物のグリコシル化酵素もしくは脱グリコシル化酵素）に曝すことによる。また、リン酸化アミノ酸残基（例えば、ホスホチロシン、ホスホセリン、もしくはホスホスレオニン）を有する配列が含まれる。

本発明の組成物および方法において使用するためのミニｗｎｔポリペプチドは、これらのタンパク質分解に対する耐性を改善するか、または溶解度特性を最適化するか、またはこれらを治療剤としてより適切にするように、通常の分子生物学的技術および合成化学を使用して改変され得る。このようなポリペプチドのアナログとしては、天然に存在するＬ−アミノ酸以外の残基（例えば、Ｄ−アミノ酸もしくは天然に存在しない合成アミノ酸）を含むものが挙げられる。Ｄ−アミノ酸は、上記アミノ酸残基のうちのいくつかもしくは全ての代わりに使用され得る。

上記ミニｗｎｔポリペプチドは、当該分野で公知の従来方法を使用して、インビトロ合成によって調製され得る。種々の市販の合成装置（例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｉｎｃ．、Ｂｅｃｋｍａｎなどによる自動化合成機）が利用可能である。合成機を使用することによって、天然に存在するアミノ酸は、天然でないアミノ酸で置換され得る。特定の配列および調製様式は、便利さ、経済性、必要とされる純度などによって決定される。所望されれば、他の分子へのもしくは表面への連結を可能にする種々の基が合成の間にもしくは発現の間に上記ペプチドに導入され得る。従って、システインは、チオエーテルを作製するために使用され得、ヒスチジンは、金属イオン錯体へ連結するために使用され得、カルボキシル基は、アミドもしくはエステルを形成するために使用され得、アミノ基は、アミドを形成するために使用され得る、などである。

あるいは、上記ミニｗｎｔポリペプチドは、当該分野で公知の多くのシステムのうちのいずれか１つを使用して、細胞性もしくは無細胞性のポリペプチド合成システムにおける組換えＤＮＡ技術によって調製され得る。上記成分のうちの１種以上を含む適切なベクターの構築は、標準的な連結技術を使用する。単離されたプラスミドもしくはＤＮＡフラグメントは切断され、調整され、そして所望の形態において再度連結されて、必要とされるプラスミドを生成する。構築されたプラスミド中の正確な配列を確認する分析に関しては、上記連結混合物は、宿主細胞を形質転換するために使用され、そして適切な場合、アンピシリン耐性もしくはテトラサイクリン耐性によって首尾良い形質転換体が選択される。上記形質転換体からプラスミドが調製され、制限エンドヌクレアーゼ消化によって分析され、そして／または配列決定される。

本明細書におけるベクターにおいて上記ＤＮＡをクローニングもしくは発現するために適した宿主細胞は、原核生物、酵母、もしくは高等真核生物の細胞であり、植物、哺乳動物、昆虫などの細胞が挙げられるが、これらに限定されない。この目的に適した原核生物としては、

原核生物に加えて、真核生物である微生物（例えば、糸状菌もしくは酵母）は、適切な発現宿主である。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、もしくは一般的な製パン酵母は、下等真核生物宿主微生物の中で最も一般的に使用される。しかし、多くの他の属、種、および株が、一般に利用可能であり、本明細書において有用である

適切な宿主細胞はまた、多細胞生物に由来し得る。このような宿主細胞は、複雑なプロセシングおよびグリコシル化活性が可能である。原則としては、脊椎動物の培養物に由来しようと、無脊椎動物の培養物に由来しようと、任意の高等真核生物細胞培養物が機能し得る。無脊椎動物細胞の例としては、植物細胞および昆虫細胞が挙げられる。多くのバキュロウイルス株および改変体、ならびに対応する許容昆虫宿主細胞（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（芋虫）、Ａｅｄｅｓ ａｅｇｙｐｔｉ（蚊）、Ａｅｄｅｓ ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ（蚊）、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ（ショウジョウバエ）、およびＢｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉのような宿主に由来する）が同定された。トランスフェクションのための種々のウイルス株が、公に入手可能であり（例えば、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＮＰＶのＬ−１改変体およびＢｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ ＮＰＶのＢｍ−５株）、このようなウイルスは、本発明にしたがって、本明細書においてウイルスとして、特に、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞のトランスフェクションのために使用され得る。

綿、トウモロコシ、ジャガイモ、ダイズ、ペチュニア、トマト、およびタバコの植物細胞培養物は、宿主として利用され得る。代表的には、植物細胞は、細菌Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓの特定の株とのインキュベーションによってトランスフェクトされる。上記植物細胞培養物のこのようなインキュベーション中に、ＤＮＡコード配列は、上記植物細胞宿主に移入され、その結果、トランスフェクトされ、適切な条件下で、上記ＤＮＡを発現する。さらに、植物細胞と適合性の調節配列およびシグナル配列（例えば、ノパリンシンターゼプロモーターおよびポリアデニル化シグナル配列）が利用可能である。

組換え合成によって調製される上記ミニｗｎｔポリペプチドは、代表的には、組換え合成の従来法に従って単離および精製される。上記発現宿主の溶解物が調製され得、上記溶解物は、ＨＰＬＣ、排除クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、アフィニティークロマトグラフィー、もしくは他の精製技術を使用して精製され得る。たいていは、使用される組成物は、上記生成物の調製およびその精製の方法に関連した夾雑物に関連して、少なくとも２０重量％、より通常には、少なくとも約７５重量％、好ましくは、少なくとも約９５重量％、および治療目的では、通常は、少なくとも約９９．５重量％の上記所望の生成物を含む。通常、パーセンテージは、総タンパク質に基づく。

本発明のミニｗｎｔポリペプチドは、同族Ｗｎｔレセプターへの結合において通常は生物学的に活性である。このような場合において、上記ミニｗｎｔは、Ｗｎｔレセプターに特異的に結合し、上記レセプターを発現する細胞（通常は、一方に結合するが、両方にもＷｎｔ共レセプター対にも結合しない）を接触させる場合に、Ｗｎｔシグナル伝達を阻害する。機能アッセイにおいて上記ミニｗｎｔによって阻害されるＷｎｔ活性（例えば、β−カテニンの不安定化、幹細胞の増殖の阻害など）の量を決定し、非機能アッセイ（例えば、免疫染色、ＥＬＩＳＡ、クーマシーもしくは銀染色したゲルでの定量など）によって存在するミニｗｎｔポリペプチドの量を定量し、そして生物学的に活性なミニｗｎｔの、総ミニｗｎｔに対する比を決定することによって、組成物中のミニｗｎｔポリペプチドの生物学的活性が決定され得る。ミニｗｎｔポリペプチド比活性の例示的アッセイは、細胞と、Ｗｎｔ含有組成物（例えば、Ｗｎｔタンパク質を発現する細胞からの培養培地）とを、β-カテニンを安定化するに十分な時間（通常は、少なくとも約１時間）にわたって接触させる工程を包含する。次いで、ミニｗｎｔ組成物を上記細胞に提供し、上記細胞を通常は、少なくとも約１時間インキュベートして、上記ミニｗｎｔポリペプチドが上記Ｗｎｔタンパク質と競合的に置き換わるのを可能にする。次いで、上記細胞を溶解し、上記細胞溶解物をＳＤＳ ＰＡＧＥによって分離し、次いで、ニトロセルロースに転写し、β−カテニンに特異的な抗体でプローブする。他のアッセイとしては、Ｘｅｎｏｐｕｓ動物極キャップアッセイにおけるＣ５７ＭＧ形質転換および標的遺伝子の誘導が挙げられる。ミニｗｎｔポリペプチドの有効用量もしくは濃度は、（例えば、核β-カテニンの存在下によって実証される場合の）シグナル伝達を、上記ミニｗｎｔの非存在下でのシグナル伝達と比較して、２５％、５０％、７５％、９０％、９５％もしくはそれより大きく低下させるものである。

ミニｗｎｔの結合活性の局面は、ミニｗｎｔを誘導した上記全長Ｗｎｔタンパク質のレセプター特異性を決定する能力である。代表的には、このような方法において使用されるミニｗｎｔは、その対応する全長Ｗｎｔタンパク質と実質的な配列同一性を有する。ここで上記ミニｗｎｔは、通常、少なくとも、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個もしくはそれより大きな連続するアミノ酸の拡がりにわたって、対応する全長Ｗｎｔタンパク質に同一である。Ｗｎｔ−Ｆｚ相互作用を確認することの主要な障害は、Ｆｒｉｚｚｌｅｄレセプターへのそれらの結合を測定するためにＷｎｔを発現できないことであった。例えば、Ｋｉｋｕｃｈｉ Ａ， Ｙａｍｅｔ ａｌ． （２００７） Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌ １９： ６５９−７１；Ｌｏｇａｎ ａｎｄ Ｎｕｓｓｅ （２００４） Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ ２０： ７８１−８１０；およびＷａｎｇ ｅｔ ａｌ． （２００５） Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２５： ５０２２−３０を参照のこと。容易に組換え発現され、上記Ｆｚ−ＣＲＤに結合するミニＷｎｔとともに、上記結合試薬として上記ミニＷｎｔを使用して、ＦｚレセプターとＷｎｔとを組み合わせることは、いまや直接的な方法において可能である。Ｗｎｔ−Ｆｚ相互作用をこのようにしてデオーファナイズ（ｄｅｏｒｐｈａｎｉｚｅ）することは、発生生物学、ならびに再生生物学および薬物設計にとって変形させる力がある（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｖｅ）。

Ｗｎｔタンパク質の同族レセプターを決定するための方法において、候補Ｗｎｔレセプターもしくはそのフラグメントは、天然のＷｎｔタンパク質であり得る目的の全長Ｗｎｔタンパク質に対応するミニｗｎｔポリペプチドと接触させられ；上記候補レセプターへの上記ミニｗｎｔの結合を決定し、ここで特異的結合の存在は、上記全長Ｗｎｔタンパク質が、上記候補レセプターのリガンドであることを示す。目的のレセプターとしては、Ｆｚタンパク質、ＲＯＲタンパク質、もしくはＲｙｋタンパク質（これらは、Ｃｔｅｒｍ ミニｗｎｔと接触させられ得る）；およびＬＲＰ５、ＬＲＰ６、もしくはＦＲＬ１／ｃｒｙｐｔｏ（これらは、Ｎｔｅｒｍ ミニｗｎｔと接触させられ得る）が挙げられる。種々の結合アッセイは、例えば、上記候補レセプターを発現する細胞を利用する用途を見出すが、例えば、結合のために上記レセプターの可溶性フラグメントを利用して、溶液中で行われ得るアッセイが特に重要である（Ｆｚ−ＣＲＤポリペプチドと水溶性Ｃｔｅｒｍ ミニｗｎｔとの間の相互作用が挙げられるが、これらに限定されない）。

いくつかの実施形態において、本発明のミニｗｎｔポリペプチドは、種々の機能部分（例えば、ポリペプチド、薬物、放射性ヌクレオチド、もしくは毒素）に結合体化される。言い換えると、本発明の組成物は、上記ミニｗｎｔポリペプチドに結合体化された機能部分を含む。例えば、ＰＣＴ公報ＷＯ ９２／０８４９５；ＷＯ ９１／１４４３８；ＷＯ ８９／１２６２４；米国特許第５，３１４，９９５号；およびＥＰ ３９６，３８７を参照のこと。

ミニｗｎｔポリペプチドに結合体化され得る機能部分の一例は、治療部分である。治療部分としては、細胞死を促進する部分、および細胞活性を変化させる部分が挙げられるが、これらに限定されない。

細胞死を促進する部分の例としては、細胞傷害性薬剤（すなわち、細胞毒素（例えば、細胞増殖抑制低分子もしくは細胞破壊性低分子））、ポリペプチド因子もしくは放射活性金属イオンが挙げられる。細胞毒素もしくは細胞毒性因子としては、細胞に対して有害な任意の因子が挙げられる。例としては、以下が挙げられる：パクリタキセル、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テニポシド（ｔｅｎｏｐｏｓｉｄｅ）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラセンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、およびピューロマイシン、ならびにこれらのアナログもしくはホモログ。細胞傷害性薬剤としてはまた、以下が挙げられる：細胞傷害性の生物学的活性を有するタンパク質、ペプチド、もしくはポリペプチド（例えば、毒素（例えば、アブリン、リシンＡ、シュードモナス外毒素、コレラ毒素、およびジフテリア毒素））。細胞傷害性薬剤としてはまた、以下が挙げられる：放射活性金属イオン（すなわち、放射性核種（例えば、α放射体（例えば、ビスマス−２１３、ラジウム−２２６、鉛−２１２、アクチニウム−２２５、およびアスタチン−２１１）、およびβ放射体（例えば、ヨウ素−１３１、イットリウム−９０、レニウム−１８８、ルテチウム−１７７、銅−６７および銅−６４）、ならびに放射性金属イオン（例えば、^１３１Ｉｎ、^１３１Ｌ、^１３１Ｙ、^１３１Ｈｏ、^１３１Ｓｍ）をポリペプチドもしくは前出で列挙されたもののうちのいずれかに結合体化するために有用な大環状キレート化剤。大環状キレート化剤は、リンカー分子を介して抗体に結合され得る（例えば、Ｄｅｎａｒｄｏ ｅｔ ａｌ．， １９９８， Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ４（１０）：２４８３−９０；Ｐｅｔｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， １９９９， Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ． Ｃｈｅｍ． １０（４）：５５３−７；およびＺｉｍｍｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．， １９９９， Ｎｕｃｌ． Ｍｅｄ． Ｂｉｏｌ． ２６（８）：９４３−５０（各々、それらの全体において本明細書に参考として援用される）に記載されるとおり）。

細胞死を促進する部分はまた、細胞を抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞媒介性ファゴサイトーシス（ＡＤＣＰ）、もしくは補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ（補体媒介性細胞溶解、もしくはＣＭＣとしても公知））の標的とする部分（例えば、免疫グロブリンのＦｃ成分）を含む。例えば、Ｒａｇｈａｖａｎ ｅｔ ａｌ．， １９９６， Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ １２：１８１−２２０；Ｇｈｅｔｉｅ ｅｔ ａｌ．， ２０００， Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ １８：７３９−７６６；Ｒａｖｅｔｃｈ ｅｔ ａｌ．， ２００１， Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９：２７５−２９０）を参照のこと。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するために、インビトロＡＤＣＣアッセイが行われ得る。このようなアッセイに有用なエフェクター細胞としては、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）およびナチュラル・キラー（ＮＫ）細胞が挙げられる。代わりに、もしくはさらに、上記目的の分子のＡＤＣＣ活性は、インビボで、例えば、Ｃｌｙｎｅｓ ｅｔ ａｌ． ＰＮＡＳ （ＵＳＡ） ９５：６５２−６５６ （１９９８）において開示されるもののような動物モデルにおいて評価され得る。全てのＦｃγＲは、Ｃγ２ドメインのＮ末端およびその前にあるヒンジにおいてＦｃの同じ領域に結合し、この領域は、本発明の目的のために機能部分として利用され得る。Ｆｃの重なり合っているが別個の部位は、補体タンパク質Ｃ１ｑの接点として働く。そのＦｃ／ＦｃγＲ結合がＡＤＣＣおよびＡＤＣＰを媒介するのと同じようにして、Ｆｃ／Ｃ１ｑ結合は、補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）を媒介する。上記Ｃγ２ドメインとＣγ３ドメインとの間にあるＦｃの部位は、新生仔型レセプターＦｃＲｎとの相互作用を媒介し、その結合は、エンドサイトーシスされた抗体をエンドソームから血流へと戻してリサイクルする。

本明細書において使用される場合、Ｆｃ融合物は、当該分野において使用されるように、用語「イムノアドヘシン」、「Ｉｇ融合物」、「Ｉｇキメラ」、および「レセプターグロブリン」の類義語である（Ｃｈａｍｏｗ ｅｔ ａｌ．， １９９６， Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １４：５２−６０；Ａｓｈｋｅｎａｚｉ ｅｔ ａｌ．， １９９７， Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ ９：１９５−２００）。Ｆｃ融合物は、例えば、免疫グロブリンのＦｃ領域と、上記ＣｔｅｒｍもしくはＮｔｅｒｍのミニｗｎｔとを併せ持つ。例えば、米国特許第５，７６６，８８３号および同第５，８７６，９６９号（ともに、明示的に参考として援用される）を参照のこと。

細胞死を促進するもの以外の治療部分としては、細胞の活性を変化させる因子が挙げられる。このような治療因子としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：サイトカイン、ケモカイン、代謝拮抗物質（例えば、メトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシル、デカルバジン（ｄｅｃａｒｂａｚｉｎｅ））、アルキル化剤（例えば、メクロレタミン、チオテパ、クロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）およびロムスチン（ＣＣＮＵ））、シクロホスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、およびシス−ジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アントラサイクリン（例えば、ダウノルビシン（以前は、ダウノマイシン）およびドキソルビシン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（以前は、アクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシン、およびアントラマイシン（ＡＭＣ））、ならびに抗有糸分裂因子（例えば、ビンクリスチンおよびビンブラスチン）。

本出願のミニｗｎｔへの結合体化に適した他の機能部分としては、画像化部分が挙げられる。上記で考察されるように、画像化部分は、細胞（例えば、本出願の組成物によって標的とされた細胞）の位置を突き止めるために、および必要に応じて、細胞を可視化するために使用され得る非細胞傷害性因子である。例えば、蛍光色素は、画像化部分として使用され得る。別の例において、非細胞傷害性である放射活性因子はまた、画像化部分であり得る。画像化部分は、検出のための基質の添加を要し得る（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼなど）。あるいは、画像化部分（例えば、発蛍光団もしくは発色団色素（例えば、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８（登録商標）もしくはＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７（登録商標））、または発蛍光団もしくは発色団を含むタンパク質（例えば、ＧＦＰ、ＲＦＰ、ｄｓＲＥＤ、ｐｈｉＹＦＰなど）およびこれらの変異体）は、検出のために基質の添加を要しない検出可能なシグナルを提供し得る。

２種以上のミニｗｎｔ（ｍｉｎ−ｗｎｔ）のマルチマーを誘導する機能部分もまた、重要であり、例えば、当該分野で公知であるように、高親和性を有する結合対（例えば、ビオチンおよびアビジン／ストレプトアビジン、ジッパードメインのようなペプチド配列など）が挙げられる。

ポリペプチドへ機能部分を結合体化するための技術は、当該分野で周知である。

を参照のこと。

機能部分は、代表的には、共有結合的相互作用によって、本発明の組成物の上記ミニｗｎｔポリペプチドに結合している。いくつかの実施形態において、リンカーが使用され得、ここで上記リンカーは、上記ミニｗｎｔポリペプチドを上記機能部分へ連結するために使用され得る任意の部分であり得る。いくつかの実施形態において、上記リンカーは、切断可能なリンカーである。切断可能なリンカーを使用すると、上記細胞によっていったん吸収されると、上記ミニｗｎｔポリペプチドに連結された部分が、上記ミニｗｎｔポリペプチドから放出させられ得、上記細胞本体へと輸送され得る。上記切断可能なリンカーは、化学物質因子によって、酵素によって、ｐＨ変化に起因して、もしくはエネルギーに曝されることによって、切断され得る。使用され得るエネルギーの形態の例としては、光、マイクロ波、超音波、および無線周波数が挙げられる。

特定の適用において、特に、上記部分が治療部分である場合、上記化合物が上記細胞にいったん入ったら、上記機能部分を放出し、上記部分の放出を生じることは望ましいことであり得る。よって、１つのバリエーションにおいて、上記リンカーＬは、切断可能なリンカーである。このことは、上記部分Ｍが、細胞の中にいったん入れば、上記化合物から放出されることを可能にする。これは、例えば、上記機能部分が、上記ミニｗｎｔポリペプチドから分離される場合により大きな治療効果を有する治療部分である場合に望ましいことであり得る。例えば、上記治療部分は、上記ミニｗｎｔポリペプチドから分離される場合に、上記細胞の細胞内成分によって吸収されるより高い能力を有し得る。よって、上記治療部分が、細胞内区画に入り得るように、上記治療部分を上記ミニｗｎｔポリペプチドから分離することは、必要であるかもしくは望ましいことであり得る。

（方法）
本発明の方法において、ミニｗｎｔを含む組成物の有効量が、例えば、細胞と、その組成物の有効量とを接触させて、所望の効果（例えば、Ｗｎｔシグナル伝達を阻害するか、増殖もしくは異常な脈管形成を阻害するか、治療部分もしくは画像化部分を送達するか、抗体を生成するなど）を達成することによって、細胞に提供される。

本発明のいくつかの方法において、本発明の組成物の有効量は、細胞におけるＷｎｔシグナル伝達を阻害するために提供される。生化学的に言えば、Ｗｎｔインヒビターの有効量もしくは有効用量は、細胞におけるＷｎｔシグナル伝達を、上記ミニｗｎｔの非存在下でのシグナル伝達と比較して、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは１００％低下させるかもしくは弱めるインヒビターの量である。言い換えると、ミニｗｎｔ組成物の有効量もしくは有効用量と接触させられた細胞のＷｎｔシグナル伝達に対する応答性は、ミニｗｎｔ組成物の有効量／用量と接触させられなかった細胞で観察されるＷｎｔシグナル伝達に対する応答の強度と比較して、約７０％以下、約６０％以下、約５０％以下、約４０％以下、約３０％以下、約２０％以下、約１０％以下、約５％以下であるか、もしくは約０％である（すなわち、無視できる）。Ｗｎｔによる細胞の活性（すなわち、Ｗｎｔシグナル伝達に対する細胞の応答性）の調節の量は、Ｗｎｔ生物学の当業者に公知の多くの方法によって決定され得る。例えば、細胞中のリン酸化β−カテニンの量が測定され得るか；細胞における細胞質ゾルのβ−カテニンの量が測定され得るか；またはＷｎｔシグナル伝達によって通常活性化される転写因子（例えば、ＴＣＦ／ＬＥＦ）の活性の量が、例えば、ＴＣＦ／ＬＥＦの転写標的である遺伝子のＲＮＡレベルもしくはタンパク質レベルを測定することによって、または上記細胞を、レポータータンパク質（例えば、ルシフェラーゼ）に作動可能に連結されたＴＣＦ結合部位（ＴＯＰ）（ＴＯＰＦｌａｓｈ）、ＥＧＦＰに作動可能に連結されたＴＣＦ結合部位（ＴＯＰ−ＥＧＦＰ）などを含む核酸ベクターでトランスフェクト／感染させ、生成されるレポータータンパク質の量を定性的にもしくは定量的に測定することによって、測定され得る。このようにして、上記因子のアンタゴニスト効果は、確認され得る。

臨床的意味においては、ミニｗｎｔ組成物の有効用量は、適切な期間にわたって、通常は、少なくとも約１週間、およびおそらく約２週間もしくはそれよりも長い期間から、最大約４週間、８週間もしくはそれよりも長い期間までの期間にわたって投与される場合、望ましくないＷｎｔシグナル伝達と関連する症状の変化を実証する用量である。例えば、有効用量は、適切な期間にわたって、通常は、少なくとも約１週間、およびおそらく約２週間もしくはそれよりも長い期間から、最大約４週間、８週間もしくはそれよりも長い期間までの期間にわたって投与される場合に、がんに罹患している患者における腫瘍増殖または糖尿病網膜症に罹患している患者の眼における新血管新生を遅らせるかもしくはさらに停止させる用量である。いくつかの実施形態において、有効用量は、上記疾患状態の進行を遅らせ得るかもしくは停止させ得るのみならず、上記状態の改善をも誘導し得る。最初の用量が、このような期間にわたって投与され得、続いて、維持用量（これは、いくつかの場合においては、低下した投与量である）が投与され得ることは、当業者によって理解される。

いくつかの実施形態において、本発明の組成物の有効量は、機能部分（例えば、治療部分もしくは画像化部分）を細胞に送達するために提供される。このような実施形態において、有効量は、上記機能部分によって治療効力もしくは画像化効力を達成するために必要とされる量である。

例えば、いくつかの実施形態において、上記機能部分は、細胞傷害性である治療部分である。細胞傷害性部分を含む組成物の有効量は、上記ミニｗｎｔ組成物（これに、上記細胞傷害性部分が融合される）によって標的とされる細胞において選択的に細胞死を促進するために十分な量である。いくつかの場合において、機能部分の有効量は周知である；例えば、放射性核種は、代表的には、１０〜３０ｃＧｙ／ｈの範囲において送達され、上記レジメンは、上記放射性同位体の半減期に依存する。他の場合において、上記有効量は、細胞死をアッセイするために当該分野で公知の任意の便利な方法（例えば、ＴＵＮＥＬ染色、アネキシン染色、ヨウ化プロピジウム取り込みなど）を使用して、当業者によって容易に決定され得る。最初の用量が、このような期間にわたって投与され得、続いて、維持用量（これは、いくつかの場合において、低下した投与量である）が投与され得ることは、当業者によって理解される。

別の例として、いくつかの実施形態において、上記機能部分は、細胞をＡＤＣＣもしくはＣＤＣの標的とする治療部分である。細胞をＡＤＣＣもしくはＣＤＣの標的とする部分を含む組成物の有効量は、上記細胞傷害性部分が融合される上記ミニｗｎｔ組成物によって標的とされる細胞において選択的にＡＤＣＣもしくはＣＤＣを促進するために十分な量である。上記有効量は、ＡＤＣＣおよびＣＤＣをアッセイするために当該分野で公知の任意の便利な方法を使用して、当業者によって容易に決定され得る。

別の例として、いくつかの実施形態において、上記機能部分は、画像化部分である。画像化部分を含む本発明の組成物の有効量は、上記画像化部分が融合される上記ミニｗｎｔ組成物によって標的とされる細胞を選択的に標識するために十分な量である。上記有効量は、画像化部分を可視化するための当該分野で公知の任意の便利な方法（例えば、顕微鏡（例えば、落射蛍光顕微鏡もしくは光学顕微鏡））を使用して、当業者によって容易に決定され得る。

投与されるべきミニｗｎｔ組成物の有効量もしくは有効用量の計算は、当業者の技術範囲内であり、当業者にとって慣用的である。言うまでもなく、投与されるべき最終量は、投与経路に、および処置されるべき上記障害もしくは状態の性質に依存する。

本発明の方法における使用に適した細胞は、１種以上のＷｎｔレセプターを含む細胞である。上記で考察されるように、Ｗｎｔレセプターとしては、Ｆｚタンパク質、ＲＯＲタンパク質、Ｒｙｋ、ＬＲＰ５、ＬＲＰ６およびＥＧＦ−ＣＦＣタンパク質が挙げられる。いくつかの実施形態において、上記細胞は、ＣＲＤドメインもしくはＷＩＦドメインを含む、Ｗｎｔレセプターを発現する細胞である。このような実施形態において、上記方法において使用される組成物は、Ｃｔｅｒｍ ミニｗｎｔであるミニｗｎｔポリペプチドを含む。ＣＲＤドメインを含むＷｎｔレセプターの例としては、Ｆｚタンパク質およびＲＯＲ膜貫通キナーゼが挙げられる。ＷＩＦドメインを含むＷｎｔレセプターの例としては、Ｄｅｒａｉｌｅｄ／Ｒｙｋが挙げられる。いくつかの実施形態において、上記細胞は、ＬＲＰ５、ＬＲＰ６、もしくはｃｒｙｐｔｏであるＷｎｔレセプターを発現する細胞である。このような実施形態において、上記方法において使用される組成物は、Ｎｔｅｒｍ ミニｗｎｔであるミニｗｎｔポリペプチドを含む。

上記接触させられるべき細胞は、インビトロに（すなわち、培養中）あってもよいし、インビボに（すなわち、被験体の中に）あってもよい。細胞は、任意の生物に由来するかもしくは上記生物の中にあり得るが、好ましくは、哺乳動物（ヒト、飼い慣らされた動物および家畜、ならびに動物園動物、実験動物、もしくは愛玩動物（例えば、イヌ，ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウサギ、ラット、マウス、カエル、ゼブラフィッシュ、ショウジョウバエ、蠕虫など）が挙げられる）に由来する。好ましくは、上記哺乳動物は、ヒトである。細胞は、任意の組織に由来し得る。細胞は、冷凍されていてもよいし、新鮮であってもよい。それらは、初代細胞であってもよいし、細胞株であってもよい。より通常には、それらは、インビボでの初代細胞である。

特に重要な細胞は、（特に、それらが以下に記載されるＷｎｔ媒介性疾患状態に関連し得る場合）Ｗｎｔシグナル伝達に応答性であり、望ましくないもしくは別の点で異常な細胞増殖と関連しているもの（例えば、腫瘍形成、脈管形成など）である。例として、目的の細胞としては、内皮細胞（これは、血管の内表面を裏打ちする細胞であり、異常に活性である場合、異常な脈管形成と関連し得る）が挙げられる。別の例として、目的の細胞としては、がん細胞（例えば、腫瘍細胞（例えば、がん幹細胞（これは、正常の幹細胞と関連する特徴、すなわち、特定のがんサンプルにおいて全ての細胞タイプを生じる能力を有し、かつ異常な細胞増殖と関連するタイプのがん細胞である）））が挙げられる。

インビトロでの細胞は、当該分野で周知の多くの方法のうちのいずれかによって、ミニｗｎｔポリペプチドを含む組成物と接触させられ得る。例えば、上記組成物は、主題の細胞が培養されている培地中の上記細胞に提供され得る。上記ミニｗｎｔポリペプチドをコードする核酸は、それらの取り込みを促進することが当該分野で周知の条件下で（例えば、エレクトロポレーション、塩化カルシウムトランスフェクション、およびリポフェクチン）、上記主題の細胞、もしくは上記主題の細胞と共存培養される細胞にベクター上で提供され得る。あるいは、上記Ｗｎｔインヒビターをコードする核酸は、上記主題の細胞、もしくは上記主題の細胞とともに共存培養される細胞に、ウイルスを介して提供され得る（すなわち、上記細胞は、上記ミニｗｎｔポリペプチドをコードする核酸を含むウイルス粒子と接触させられる）。レトロウイルス（例えば、レンチウイルス）は、非分裂細胞をトランスフェクトするために使用され得るので、本発明の方法に特に適している（例えば、Ｕｃｈｉｄａ ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ． ９５（２０）：１１９３９−４４を参照のこと）。一般に使用されるレトロウイルスベクターは、「欠損性」である（すなわち、生産能力のある感染に必要なウイルスタンパク質を生成できない）。むしろ、上記ベクターの複製は、パッケージング細胞株における増殖を必要とする。

同様に、インビボでの細胞は、ペプチドもしくは核酸を被験体に投与するための当該分野で周知の多くの方法のうちのいずれかによって、本発明のミニｗｎｔ組成物と接触させられ得る。上記ミニｗｎｔ組成物は、種々の製剤へと組み込まれ得、いくつかの実施形態において、および特に、Ｃｔｅｒｍ ミニｗｎｔに関して、これは、全長Ｗｎｔタンパク質の製剤について記載されてきたように、界面活性剤、リポソームなどの非存在下で製剤化される。より具体的には、本発明の化合物は、適切な薬学的に受容可能なキャリアもしくは希釈剤と組み合わせることによって薬学的組成物へと製剤化され得、固体、半固体、液体もしくは気体様形態（例えば、錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、軟膏剤、液剤、坐剤、注射物、吸入物、ゲル、ミクロスフェア、およびエアロゾル）の調製物へと製剤化され得る。よって、上記ミニｗｎｔ組成物の投与は、種々の方法（経口投与、口内投与、直腸投与、非経口投与、腹腔内投与、皮内投与、経皮投与、気管内（ｉｎｔｒａｃｈｅａｌ）投与などが挙げられる）において達成され得る。上記活性薬剤は、投与後に全身にあってもよいし、局所投与、壁内投与の使用、または移植部位において活性用量を保持するように作用するインプラントの使用によって局在していてもよい。上記活性薬剤は、直ぐ活性であるように製剤化されてもよいし、徐放用に製剤化されてもよい。

いくつかの状態、特に中枢神経系状態については、薬剤が血液脳関門（ＢＢＢ）を横断するように製剤化する必要があり得る。血液脳関門（ＢＢＢ）を通過する薬物送達のための１つのストラテジーは、マンニトールもしくはロイコトリエンのような浸透性の手段によって、またはブラジキニンのような血管作用性物質の使用によって生化学的にのいずれかで、上記ＢＢＢの破壊を必然的に伴う。ＢＢＢ開放を使用して、脳腫瘍へ特定の因子を標的化する能力もまた、選択肢である。ＢＢＢ破壊因子は、本発明の治療組成物が脈管内注射によって投与される場合に、本発明の治療組成物とともに、同時投与され得る。上記ＢＢＢを通過させる他のストラテジーは、内因性輸送システム（ｃａｖｅｏｉｌ−１媒介性トランスサイトーシス、キャリア媒介性輸送体（例えば、グルコースおよびアミノ酸キャリア）、インスリンもしくはトランスフェリンについてのレセプター媒介性トランスサイトーシス、ならびに活性なエフラックス輸送体（例えば、ｐ−糖タンパク質）が挙げられる）の使用を必然的に伴い得る。活性な輸送部分はまた、本発明における使用のための治療化合物に結合体化されて、上記血管の内皮壁を横断する輸送を促進し得る。あるいは、上記ＢＢＢのうしろの（ｂｅｈｉｎｄ）治療因子の薬物送達は、局所送達による（例えば、Ｏｍｍａｙａレザバ（例えば、米国特許第５，２２２，９８２号および同第５３８５５８２号を参照のこと）（本明細書に参考として援用される）を介して、例えば、鞘内送達による；ボーラス注射による、例えば、シリンジによる（例えば、硝子体内にもしくは頭蓋内に）；連続注入による（例えば、カニューレ挿入によって）、例えば、対流で（例えば、米国特許出願公開第２００７０２５４８４２号（本明細書に参考として援用される））；または上記薬剤が可逆性に付着したデバイスを移植することによる（例えば、米国特許出願公開第２００８００８１０６４号および同第２００９０１９６９０３号（本明細書に参考として援用される）を参照のこと）ものであり得る。

治療用途。 上記に示唆されるように、本発明のミニｗｎｔ組成物は、Ｗｎｔシグナル伝達に応答性の細胞においてＷｎｔシグナル伝達を阻害することにおける用途を見出す。Ｗｎｔへの細胞の応答性は、当該分野で公知の、および本明細書に記載される方法によって、当業者によって容易に決定され得る。生物学的に活性なミニｗｎｔ組成物は、細胞におけるＷｎｔシグナル伝達を阻害する（すなわち、拮抗もしくは抑制する）。言い換えると、生物学的に活性なミニｗｎｔ組成物は、Ｗｎｔシグナル伝達のドミナントネガティブ調節因子である。

Ｗｎｔシグナル伝達のドミナントネガティブ調節因子（例えば、本発明のミニｗｎｔ組成物）は、Ｗｎｔ媒介性疾患状態（例えば、異常な細胞増殖もしくは異常な脈管形成と関連する障害（Ｗｎｔと関連する種々のがんが挙げられる））に罹患している哺乳動物（例えば、ヒト患者）の処置において用途を見いだす。このような状態によって特徴付けられる疾患に罹患している患者は、係属中の本願発明の処置プロトコルによって大いに利益を受ける。

用語「がん」とは、代表的には、調節されない細胞成長／増殖によって特徴付けられる、哺乳動物における生理学的状態をいう。がんの例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：癌腫、リンパ腫、細胞芽腫、および白血病。がんのより具体的な例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：結腸直腸がん、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、肺がん（非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）が挙げられる）、乳がん、卵巣がん、子宮頸がん、子宮体がん、前立腺がん、結腸直腸がん、消化管カルチノイド、膀胱がん、胃がん、膵臓がん、肝がん（肝細胞癌）、肝芽腫、食道がん、肺腺癌、中皮腫、滑膜肉腫、骨肉腫、頭頸部扁平上皮癌、若年性鼻咽頭血管線維腫、脂肪肉腫、甲状腺がん、黒色腫、基底細胞癌（ＢＣＣ）、髄芽腫および類腱腫。本発明の方法による処置に関して特に重要ながんとしては、神経膠腫、髄芽腫、結腸がん、結腸直腸がん、黒色腫、乳がん、肺がん、肝臓がん、および胃がんが挙げられる。

腫瘍の増殖を阻害するミニｗｎｔポリペプチドを含む組成物は、インビトロでがん細胞の増殖速度の測定可能な低下もしくはインビボでの腫瘍の増殖阻害を生じるものである。例えば、好ましい増殖阻害性Ｗｎｔアンタゴニストは、適切なコントロール（上記コントロールは、代表的には、上記試験されるＷｎｔアンタゴニスト分子で処置されないがん細胞である）と比較して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、好ましくは、約２０％〜約５０％、およびさらにより好ましくは、５０％より高く（例えば、約５０％〜約１００％）腫瘍の増殖を阻害する。上記Ｗｎｔアンタゴニストは、約１μｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重の上記Ｗｎｔアンタゴニストの投与が、１回目の投与から約５日間〜３ヶ月間以内に、好ましくは、約５〜３０日間以内に、腫瘍サイズもしくは細胞増殖の低下を生じる場合、インビボで増殖阻害性である。

別の例として、本発明の組成物および方法は、ＣＮＳ細胞における異常な脈管形成を阻害することにおいて用途を見いだす。用語「脈管形成」とは、新たな血管が既存の脈管から増殖もしくは萌芽する生物学的プロセスを記載するために使用される。脈管形成は、胚形成中、血管系の合成において、および成熟生物において（例えば、創傷治癒において）の両方で重要な役割を果たす。しかし、持続性の無秩序なもしくは不適切に調節された脈管形成によって駆動される多くの疾患状態がある。このような疾患状態においては、この異常な脈管形成は、特定の疾患を引き起こし得るか、または既存の病的状態を増悪させ得るかのいずれかである。例えば、眼における脈絡膜新生血管（ＣＮＶ）およびその後の網膜症は、失明の最も一般的な原因として関連付けられており、多くの眼病の病状の根底にある（最も顕著なものとしては、糖尿病網膜症および加齢性黄斑変性（ＡＭＤ、ＡＲＭＤ）、特に、ウェット型／滲出性加齢性黄斑変性）。Ｗｎｔシグナル伝達は、発生の間にＣＮＳおよび網膜における脈管形成を促進することに関連付けられた。よって、Ｗｎｔインヒビターは、異常な脈管形成が寄与因子であるＣＮＳの疾患状態を処置すること、すなわち、その発生もしくは進行を停止させることにおいて用途を見いだす。

ＣＮＳにおける異常な脈管形成を阻害するか、またはＣＮＳにおける新血管新生を阻害するミニｗｎｔ組成物は、新たな血管系の発生（例えば、培養中の内皮細胞による管形成もしくは被験体における血管形成）の測定可能な阻害を生じるものである。好ましいＷｎｔアンタゴニストは、適切なコントロール（上記コントロールは、代表的には、上記試験されているＷｎｔアンタゴニスト分子で処置されていない細胞である）と比較して、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、好ましくは、約２０％〜約５０％、およびさらにより好ましくは、５０％より高く（例えば、約５０％〜約１００％）新たな血管系の発生速度を阻害する。上記Ｗｎｔアンタゴニストは、約１μｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ 体重の上記Ｗｎｔアンタゴニストの投与が、上記Ｗｎｔインヒビターの最初の投与から約５日間〜６ヶ月間以内に、好ましくは、約５日間〜約２ヶ月間以内に、新血管系の発生の遅延もしくは停止を生じる場合、インビボで阻害性である。新血管系発生は、当該分野で周知かつ当業者に明らかな多くの方法によって観察され得る。例えば、脈絡膜新生血管形成の阻害は、眼底撮影法によって直接的に、もしくは視力検査での改善された得点についてアッセイすることによって間接的に、容易に観察され得る。

さらに、他の障害は、異常なＷｎｔシグナル伝達と関連しており、以下が挙げられるが、これらに限定されない：骨粗鬆症、変形性関節症、多発性嚢胞腎、糖尿病、統合失調症、血管疾患、心臓病、非腫瘍形成性増殖疾患、および神経変性疾患（例えば、アルツハイマー病）。

Ｗｎｔシグナル伝達を阻害する代わりとしてもしくは上記を阻害するのに加えて、ミニｗｎｔ組成物は、前述の疾患のうちのいずれかの処置について先に考察されたように、治療部分を送達するために使用され得る。例えば、ミニｗｎｔ組成物は、細胞傷害性部分を腫瘍形成性細胞に送達するために、または腫瘍形成性細胞をＡＤＣＣもしくはＣＤＣ媒介性の細胞死の標的とするＦｃ部分で腫瘍形成性細胞をタグ化するために使用されうる。別の例として、ミニｗｎｔ組成物は、神経変性状態におけるニューロンへのシナプス形成またはＣＮＳ傷害の部位における軸索伸長を促進するサイトカインを送達するために使用され得る。本発明のミニｗｎｔ組成物についてのこれらおよび他の治療適用は、当業者に容易に明らかである。

医薬に含めることについて、ミニｗｎｔポリペプチドは、一般に、受け入れられた製造法を使用して得られ得る。一般的な前提として、１用量につき非経口投与される上記Ｗｎｔインヒビター化合物の全ての薬学的に有効な量は、用量応答曲線によって測定され得る範囲内にある。

薬学的組成物は、所望される製剤に依存して、薬学的に受容可能な、非毒性のキャリアもしくは賦形剤（これらは、動物もしくはヒトへの投与について薬学的組成物を製剤化するために一般に使用されるビヒクルとして定義される）を含み得る。上記希釈剤は、上記組み合わせの生物学的活性に影響を与えないように選択される。このような希釈剤の例は、蒸留水、緩衝化した水、生理食塩水、ＰＢＳ、リンゲル溶液、デキストロース溶液、およびハンクス溶液である。さらに、上記薬学的組成物もしくは製剤は、他のキャリア、アジュバント、もしくは非毒性の非治療的な非免疫原性の安定化剤、賦形剤などを含み得る。上記組成物はまた、生理学的条件に近づけるためにさらなる物質（例えば、ｐＨ調節および緩衝化因子、毒性調節因子、湿潤剤および界面活性剤）を含み得る。

上記組成物はまた、種々の安定化因子のうちのいずれか（例えば、抗酸化剤）を含み得る。上記薬学的組成物がポリペプチドを含む場合、上記ポリペプチドは、上記ポリペプチドのインビボ安定性を増強するか、またはその薬理学的特性を別の方法で増強する（例えば、上記ポリペプチドの半減期を増大させる、その毒性を低下させる、溶解度もしくは取り込みを増強する）種々の周知の化合物と複合体化され得る。このような改変もしくは複合体化因子の例としては、スルフェート、グルコネート、シトレートおよびホスフェートが挙げられる。上記組成物のポリペプチドはまた、それらのインビボ属性を増強する分子と複合体化され得る。このような分子としては、以下が挙げられる：例えば、炭水化物、ポリアミン、アミノ酸、他のペプチド、イオン（例えば、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、マンガン）、および脂質。

種々のタイプの投与に適した製剤についてのさらなるガイダンスは、以下に見出され得る：Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｍａｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ， Ｐａ．， １７ｔｈ ｅｄ． （１９８５）。薬物送達のための方法の簡潔な総説については、Ｌａｎｇｅｒ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７−１５３３ （１９９０）を参照のこと。

上記薬学的組成物は、予防的処置および／もしくは治療的処置のために投与され得る。上記活性成分の毒性および治療効力は、細胞培養物および／もしくは実験動物において標準の薬学的手順（例えば、ＬＤ_５０（集団のうちの５０％にとって致死的な用量）およびＥＤ_５０（集団のうちの５０％において治療上有効な用量）を決定することが挙げられる）に従って決定され得る。毒性効果と治療効果との間の用量比は、治療指数であり、比ＬＤ_５０／ＥＤ_５０として表され得る。大きな治療指数を示す化合物が好ましい。

細胞培養および／もしくは動物研究から得られるデータは、ヒトに関する投与量の範囲を製剤化することにおいて使用され得る。上記活性成分の投与量は、代表的には、低毒性でＥＤ_５０を含む循環濃度の範囲内にある。上記投与量は、使用される投与形態および利用される投与経路に依存して、この範囲内で変動し得る。

上記薬学的組成物を処方するために使用される成分は、好ましくは、高純度であり、かつ潜在的に有害な夾雑物を実質的に含まないものである（例えば、少なくともナショナルフード（ＮＦ）グレード、一般に、少なくとも分析グレード、およびより代表的には、少なくとも製薬グレード）。さらに、インビボでの使用が意図された組成物は、通常は、無菌である。所定の化合物が使用前に合成されなければならない程度まで、得られる生成物は、代表的には、合成もしくは精製プロセス中に存在し得るいかなる潜在的に毒性の因子（特に、いかなる外毒素）をも実質的に含まない。非経口投与のための組成物はまた、無菌であり、実質的に等張性であり、ＧＭＰ条件の下で作製される。

本発明の方法はまた、組み合わせ治療において用途を見いだす。例えば、多くの因子（例えば、アンギオスタチン、エンドスタチン、ＶＥＧＦインヒビターなど）は、異常な脈管形成の処置において有用であり得る。同様に、多くの因子（例えば、化学療法剤、放射線療法など）は、がんの処置において有用であり得る。本発明のミニｗｎｔおよびこれら他の因子の組み合わされた使用は、個々の薬物の必要とされる投与量がより低く、上記異なる薬物の効果を補完し合うという利点を有し得る。

画像化部分の送達。 上記に示唆されるように、本発明のミニｗｎｔ組成物はまた、Ｗｎｔレセプターを発現する細胞に画像化部分を送達することにおいて用途を見いだす。例えば、蛍光部分に結合体化されたミニｗｎｔ組成物は、インビトロおよびインビボで細胞を標識し、追跡するために（例えば、研究目的で）使用され得る。

抗体生成。 本発明のミニｗｎｔ組成物はまた、抗体を生成するために使用され得る。抗体は、当該分野で公知の任意の適切な方法によって作製され得る。本発明の抗体は、ポリクローナル抗体であってもよいし、モノクローナル抗体であってもよい。それらは、一価であってもよいし、二価であってもよいし、多価であってもよい。それらは、フラグメント（例えば、Ｆ（ａｂ）フラグメント）であってもよい。抗体を調製する方法は、当業者に公知である（Ｈａｒｌｏｗ， ｅｔ ａｌ．， Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， （Ｃｏｌｄ ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， ２ｎｄ ｅｄ． （１９８８）（これは、その全体において本明細書に参考として援用される））。

本発明の抗体を生成するにあたって、ミニｗｎｔポリペプチドを含む本発明の組成物は、（例えば、アジュバントとともに）注射用に製剤化され、得られる免疫原は、動物を免疫するために使用される。免疫原組成物の上記ミニｗｎｔポリペプチドは、有益な場合、上記ミニｗｎｔポリペプチドが融合セグメントに結合される融合タンパク質として生成され得る。上記融合セグメントは、しばしば、例えば、上記融合タンパク質がアフィニティークロマトグラフィーによって単離および精製されることを可能にすることによって、タンパク質精製を補助する。融合タンパク質は、上記タンパク質のカルボキシル末端および／もしくはアミノ末端のいずれかに結合される上記融合セグメントを含むタンパク質をコードする融合核酸配列で形質転換された組換え細胞を培養することによって、生成され得る。融合セグメントとしては、免疫グロブリンＦｃ領域、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、二価金属イオンに結合し得るポリヒスチジンセグメント、およびマルトース結合タンパク質が挙げられ得るが、これらに限定されない。

ポリクローナル抗体を生成するために、上記で記載されるとおりの免疫原は、種々の宿主動物（ウサギ、マウス、ラットなどが挙げられるが、これらに限定されない）に投与されて、上記抗原に特異的なポリクローナル抗体を含む血清の生成を誘導し得る。上記免疫原の投与は、免疫因子および所望であれば、アジュバントの１回以上の注射を含み得る。種々のアジュバントは、上記宿主の種に依存して、免疫学的応答を増大させるために使用され得、フロイントアジュバント（完全および不完全）、ミネラルゲル（例えば、水酸化アルミニウム）、表面活性剤（例えば、リゾレシチン）、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油エマルジョン、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、および潜在的に有用なヒトアジュバント（例えば、ＢＣＧ（カルメット・ゲラン桿菌）およびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍが挙げられ得るが、これらに限定されない。使用され得るアジュバントのさらなる例としては、ＭＰＬ−ＴＤＭアジュバント（モノホスホリルリピドＡ）、合成トレハロースジコリノミコレート）が挙げられる。免疫プロトコルは、当該分野で周知であり、上記選択された動物宿主において免疫応答を誘発する任意の方法によって行われ得る。アジュバントはまた、当該分野で周知である。

代表的には、上記免疫原（アジュバントありもしくはなし）は、複数回の皮下もしくは腹腔内の注射によって、または筋肉内にもしくはＩＶを介して、上記哺乳動物へと注射される。上記免疫原は、ＩＬ１３ポリペプチド、融合タンパク質もしくはその改変体を含み得る。上記ポリペプチドの性質（すなわち、疎水性％、親水性％、安定性、正味の電荷、等電点など）に依存して、上記免疫原を、免疫される上記哺乳動物において免疫原性であることが公知のタンパク質に結合体化することは、有用であり得る。このような結合体化としては、共有結合が形成されるように、上記免疫原および上記結合体化されるべき免疫原性タンパク質の両方に活性な化学的官能基を誘導体化することによるか、または融合タンパク質ベースの方法論を介するか、または当業者に公知の他の方法を介する、化学的結合体化が挙げられる。このような免疫原性タンパク質の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：キーホールリンペットヘモシアニン、オボアルブミン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、ダイズトリプシンインヒビター、および無差別のＴヘルパーペプチド。種々のアジュバントが、上記のように、免疫学的応答を増大させるために使用され得る。

モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ技術（例えば、Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ， Ｎａｔｕｒｅ， ２５６：４９５ （１９７５）および米国特許第４，３７６，１１０号によって、Ｈａｒｌｏｗ， ｅｔ ａｌ．， Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， （Ｃｏｌｄ ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， ２^ｎｄ ｅｄ． （１９８８）によって、Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇ， ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｔ−Ｃｅｌｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ （Ｅｌｓｅｖｉｅｒ， Ｎ．Ｙ．， （１９８１））によって記載されるもの）を使用して、もしくは当業者に公知の他の方法によって調製され得る。モノクローナル抗体を生成するために使用され得る方法の他の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｓｂｏｒ ｅｔ ａｌ．， １９８３， Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ ４：７２；Ｃｏｌｅ ｅｔ ａｌ．， １９８３， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８０：２０２６−２０３０）、およびＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅ ｅｔ ａｌ．， １９８５， Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ， Ａｌａｎ Ｒ． Ｌｉｓｓ， Ｉｎｃ．， ｐｐ． ７７−９６）。このような抗体は、任意の免疫グロブリンクラス（ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびこれらの任意のサブクラスが挙げられる）のものであり得る。本発明のｍＡｂを生成するハイブリドーマは、インビトロもしくはインビボで培養され得る。

モノクローナル抗体を生成するための種々の方法が当該分野に存在するので、本発明は、それらのハイブリドーマでの生成のみには限定されない。例えば、上記モノクローナル抗体は、組換えＤＮＡ方法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号に記載されるもの）によって作製され得る。この文脈において、用語「モノクローナル抗体」とは、単一の真核生物クローン、ファージクローン、もしくは原核生物クローンから得られる抗体をいう。本発明のモノクローナル抗体をコードする上記ＤＮＡは、従来の手順を使用して（例えば、マウス抗体の重鎖および軽鎖、またはヒト、ヒト化もしくは他の供給源に由来するこのような鎖をコードする遺伝子に特異的に結合し得るオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）容易に単離されかつ配列決定され得る。本発明のハイブリドーマ細胞は、このようなＤＮＡの好ましい供給源として機能する。いったん単離されたら、上記ＤＮＡは、発現ベクターの中に入れられ得、これは、次いで、ＮＳ０細胞、シミアンＣＯＳ細胞、チャイニーズ・ハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または別の方法では免疫グロブリンタンパク質を生成しない骨髄腫細胞のような宿主細胞に形質転換されて、上記組換え宿主細胞におけるモノクローナル抗体の合成を得る。上記ＤＮＡはまた、例えば、ヒト重鎖および軽鎖の定常ドメインのコード配列を、相同なマウス配列の代わりに使用することによって（米国特許第４，８１６，５６７号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ，前出）、または上記免疫グロブリンコード配列に、非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列のうちの全てもしくは一部を共有結合することによって、改変され得る。このような非免疫グロブリンポリペプチドは、本発明の抗体の定常ドメインの代わりに使用され得るか、または本発明の抗体の１つの抗原結合部位の可変ドメインの代わりに使用されて、キメラ二価抗体を作製し得る。

上記抗体は、一価抗体であってもよい。一価抗体を調製するための方法は、当該分野で周知である。例えば、１つの方法は、免疫グロブリンの軽鎖および改変された重鎖の組換え発現を包含する。上記重鎖は、一般に、重鎖架橋を妨げるように、上記Ｆｃ領域におけるいずれかの点において短縮される。あるいは、関連するシステイン残基が、別のアミノ酸残基で置換されるか、または架橋を妨げるように欠失される。

特異的エピトープを認識する抗体フラグメントは、公知の技術によって生成され得る。例えば、本発明のＦａｂおよびＦ（ａｂ’）_２フラグメントは、免疫グロブリン分子を、パパイン（Ｆａｂフラグメントを生成するため）もしくはペプシン（Ｆ（ａｂ’）_２フラグメントを生成するため）のような酵素を使用してタンパク質分解切断することによって生成され得る。Ｆ（ａｂ’）_２フラグメントは、可変領域、軽鎖定常領域および重鎖のＣＨ１ドメインを含む。

ヒトにおける抗体のインビボでの使用およびインビトロ検出アッセイを含むいくつかの用途については、キメラ抗体、ヒト化抗体、もしくはヒト抗体を使用することは好ましいことであり得る。キメラ抗体は、上記抗体の異なる部分が異なる動物種に由来する分子である（例えば、マウスモノクローナル抗体に由来する可変領域およびヒト免疫グロブリン定常領域を有する抗体）。キメラ抗体を生成するための方法は、当該分野で公知である。例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：１２０２ （１９８５）；Ｏｉ ｅｔ ａｌ．， ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４：２１４ （１９８６）；Ｇｉｌｌｉｅｓ ｅｔ ａｌ．， （１９８９） Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ １２５：１９１−２０２；米国特許第５，８０７，７１５号；同第４，８１６，５６７号；および同第４，８１６３９７号（これらは、それらの全体において本明細書に参考として援用される）を参照のこと。

ヒト化抗体は、非ヒト種に由来する１個以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）およびヒト免疫グロブリン分子に由来するフレームワーク（ＦＲ）領域を有する、所望の抗原に結合する、非ヒト種において生成された抗体分子である。しばしば、ヒトフレームワーク領域におけるフレームワーク残基は、上記ＣＤＲドナー抗体に由来する対応する残基で置換されて、抗原結合を変化させる（好ましくは、改善する）。これらフレームワーク置換は、当該分野で周知の方法によって、例えば、抗原結合および配列比較に重要なフレームワーク残基を同定して、特定の位置における稀なフレームワーク残基を同定するために、上記ＣＤＲとフレームワーク残基との相互作用のモデリングによって、同定される（例えば、Ｑｕｅｅｎ ｅｔ ａｌ．， 米国特許第５，５８５，０８９号；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３ （１９８８）（これらは、それらの全体において本明細書に参考として援用される）を参照のこと）。抗体は、当該分野で公知の種々の技術（例えば、ＣＤＲグラフト化（ＥＰ ２３９，４００；ＰＣＴ公開ＷＯ ９１／０９９６７；米国特許第５，２２５，５３９号；同第５，５３０，１０１号；および同第５，５８５，０８９号）、ベニアリング（ｖｅｎｅｅｒｉｎｇ）もしくはリサーフェシング（ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ）（ＥＰ ５９２，１０６；ＥＰ ５１９，５９６；Ｐａｄｌａｎ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２８（４／５）：４８９−４９８ （１９９１）；Ｓｔｕｄｎｉｃｋａ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ７（６）：８０５−８１４ （１９９４）；Ｒｏｇｕｓｋａ ｅｔ ａｌ．， ＰＮＡＳ ９１：９６９−９７３ （１９９４））、および鎖シャッフリング（米国特許第５，５６５，３３２号）が挙げられる）を使用して、ヒト化され得る。

完全ヒト抗体は、ヒト患者の治療的処置のために特に望ましい。ヒト抗体は、当該分野で公知の種々の方法（ヒト免疫グロブリン配列に由来する抗体ライブラリーを使用する、上記に記載されるファージディスプレイ法が挙げられる）によって作製され得る。米国特許第４，４４４，８８７号および同第４，７１６，１１１号；ならびにＰＣＴ公開ＷＯ ９８／４６６４５、ＷＯ ９８／５０４３３、ＷＯ ９８／２４８９３、ＷＯ ９８／１６６５４、ＷＯ ９６／３４０９６、ＷＯ ９６／３３７３５、およびＷＯ ９１／１０７４１（これらの各々は、その全体において本明細書に参考として援用される）もまた参照のこと。Ｃｏｌｅ ｅｔ ａｌ．およびＢｏｅｒｄｅｒ ｅｔ ａｌ．の技術はまた、ヒトモノクローナル抗体の調製のために利用可能である（Ｃｏｌｅ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ， Ａｌａｎ Ｒ． Ｒｉｓｓ， （１９８５）；およびＢｏｅｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １４７（１）：８６−９５， （１９９１））。ヒト抗体はまた、機能的内因性免疫グロブリンを発現し得ないが、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現し得るトランスジェニックマウスを使用して、生成され得る。

候補ミニｗｎｔ抗体は、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ウェスタンイムノブロッティング、もしくは他の免疫化学的技術によって試験されて、上記標的Ｗｎｔに対するそれらの親和性および特異性を確認し得る。上記個々の抗体を特徴付けるために行われるアッセイとしては、（１）がん幹細胞のＷｎｔオートクリン増殖の阻害；および（２）Ｗｎｔ誘導性ＴＣＦ−ＬＥＦ誘導性遺伝子発現の阻害が挙げられるが、これらに限定されない。

本発明の抗体はまた、それらの交叉反応性の点から記載されるかもしくは特定され得る。ミニｗｎｔポリペプチドに結合し、ヒトＷｎｔに対して少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６５％、少なくとも６０％、少なくとも５５％、および少なくとも５０％の同一性を有する（当該分野で公知かつ本明細書に記載される方法を使用して計算される場合）抗体はまた、本発明に包含される。従って、本発明の抗体は、上記ミニｗｎｔを誘導した天然の親Ｗｎｔタンパク質のＷｎｔドメインに結合し、そのＷｎｔによって通常結合されるレセプター複合体の活性化を阻害する。

好ましい結合親和性は、１０^−８〜１０^−１５Ｍの平衡解離定数もしくはＫ_Ｄを有するものを含む。本発明はまた、競合結合を決定するために当該分野で公知の任意の方法（例えば、本明細書に記載されるイムノアッセイ）によって決定される場合に、本発明のエピトープへの抗体の結合を競合的に阻害する抗体を提供する。好ましい実施形態において、上記抗体は、上記エピトープへの結合を、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、もしくは少なくとも５０％競合的に阻害する。

以下の実施例は、当業者に、本発明を作製および使用する方法の完全な開示および説明を提供するために記載されるのであって、本発明者らが発明として解釈しているものの範囲を限定することを意図しておらず、以下の実験が行われる全てのもしくは唯一の実験であることを表すことを意図していない。使用される数値（例えば、量、温度など）に関して正確性を期す努力がなされたが、いくらかの実験誤差および偏差があるはずである。別段示されなければ、部は、重量部であり、分子量は重量平均分子量であり、温度は摂氏温度であり、圧力は大気圧または大気圧付近である。

本発明者らは、インビトロ進化法を使用することによって、生物学的活性を保持したＷｎｔもしくはＷｎｔフラグメントの水溶性バージョンを同定しようとした。野生型Ｗｎｔが、それらの可溶性および組換え発現される能力を大いに低下させる脂質基で修飾されているという点において、野生型Ｗｎｔによって課される困難性を考えると、本発明者らは、レセプター結合活性を保持した水溶性ＷｎｔもしくはＷｎｔフラグメントが、あらゆるレベルでのＷｎｔ研究にとって変革的であり（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｖｅ）：アンタゴニストもしくはアゴニストのいずれかとしてのＷｎｔ薬物の設計に関して生物学的、機能的、およびトランスレーショナル（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ）であると推論した。

この目的に向かって、インビトロ進化を使用して、ａ）上記レセプターＦｒｉｚｚｌｅｄを結合することにおいて活性である、およびｂ）水溶性である、Ｗｎｔ形態を発見した。酵母表面ディスプレイを使用して、これら基準を満たすものについてＷｎｔ改変体をスクリーニングした。酵母は、脂質基をＷｎｔに結合させるために必要とされる酵素を有しないので、上記酵母表面ディスプレイシステムは、この目的に比類なく適している：Ｆｚに対する結合親和性を有すると同定されている任意の変異Ｗｎｔは、上記スクリーニングにおいて酵母によって発現されるので、脂質基を欠いておらねばならず、よって水溶性でなければならない。概念実証として、Ｆｚ−ＣＲＤ構築物に対する結合は、酵母でのＸｅｎｏｐｕｓ ＸＷｎｔ８の上記野生型配列の発現後に認められなかった。

酵母によって発現され得、かつ上記Ｆｚ−ＣＲＤに正確に結合し得るＸＷｎｔ８の変異形態もしくは改変形態を同定するために、変異させたＸＷｎｔ８遺伝子の大きなライブラリーを、１遺伝子あたり３〜４塩基の変化を導入するエラープローンＰＣＲを使用して生成した。次いで、これら改変体を、酵母Ａｇａ２タンパク質と融合させ、上記融合構築物を、酵母に形質転換した。Ｗｎｔ改変体（酵母１個あたり約５０，０００コピー）のライブラリーを、Ｆｚ−ＣＲＤ（この場合は、Ｆｚ５−ＣＲＤ）組成物を使用してスクリーニングした（ここで上記Ｆｚ−ＣＲＤは、ストレプトアビジンに結合体化されて、ｓｔｒｅｐ−Ｆｚ−ＣＲＤ「テトラマー」を形成した（図１））。ストレプトアビジンへの結合体化は、上記Ｆｚ−ＣＲＤの結合力（もしくはマルチマー性質）を上昇させ、それによって、試薬の感度を増強した。例えば、図１ｂに示されるように、Ｆｚ５およびＦｚ８ ＣＲＤは、完全にビオチン化される。なぜなら、ストレプトアビジンの付加は、上記ＣＲＤ（ここでは、ストレプトアビジンに結合されている（「＋」レーンを参照のこと））を、遙かに高い分子量において泳動させるからである。従って、ｓｔｒｅｐ−Ｆｚ−ＣＲＤ「テトラマー」は、上記酵母ライブラリー選択のために使用するのに非常に効率的な試薬である。

上記遺伝子および名称およびＮ末端ドメイン、リンカー、ならびにＣ末端ドメインのカラーコードを、その後の図面において示される実験に基づいて、この図において後付けで行った。選択実験の前に、上記Ｗｎｔ遺伝子をこれら領域に細分化したことは知られておらず、インビトロ進化実験の結果に鑑みて、これら境界が上記Ｗｎｔ遺伝子に引かれ得ることに過ぎない。図１Ｃにおいて上記遺伝子上の赤い矢印は、短縮化したミニＷｎｔ Ｃ末端フラグメントの境界のいくつかを示しており、ミニＷｎｔが全長遺伝子のどの程度の割合を占めるかを示す。

Ｆｚ５およびＦｚ８−ＣＲＤテトラマーにおけるＸＷｎｔ８エラープローンライブラリーの数回の選択の後に、特異的で反応性であるような個々の酵母クローンを単離した。上記Ｆｚ−ＣＲＤテトラマーについての個々の酵母クローンの特異性を、ＦＡＣＳ分析によって確認した。簡潔には、各融合構築物を、上記酵母と上記ＸＷｎｔ８との間にある上記リンカー中にプロテアーゼ部位を、および酵母上の上記ＸＷｎｔ８の末端においてＣ末端Ｍｙｃタグを含めるように設計した。上記プロテアーゼの非存在下および存在下で上記酵母をＦｚ−ＣＲＤテトラマーもしくはＭｙｃ特異的抗体で染色することによって、これは、上記テトラマーが、実際に、上記Ｗｎｔと特異的に反応しているか否か、または上記相互作用が、上記酵母への非特異的結合に過ぎなかったかを強く決定した。図２および図３に示されるように、上記Ｆｚ−ＣＲＤテトラマーによるＦＡＣＳ染色は、プロテアーゼを添加したときに失われる。このことは、上記Ｆｚ−ＣＲＤについての酵母クローンの反応性が、実際に、その酵母クローンによってディスプレイされた上記Ｗｎｔ改変体に起因し、上記酵母に対するＦｚ−ＣＲＤの非特異的親和性ではなかったことを示す。同様に、上記プロテアーゼの存在下で、Ｍｙｃ反応性は失われる。従って、特異的結合相互作用は、上記同定された酵母クローンとＦｚＣＲＤとの間で確認された。

Ｆｚ−ＣＲＤに対して特異的結合活性を示したＸＷｎｔ８改変体を発現する酵母クローンを、可溶性組換え形態において発現させた（図４）。一例として、上記ＸＷｎｔ８改変体Ｂ７を、昆虫細胞において発現させ、ゲル濾過によって精製したところ、これが、界面活性剤の非存在下で十分に折りたたまれた水溶性タンパク質であることを示す（図４，上）。この精製Ｂ７改変体に添加したＦｚ５−ＣＲＤは、ゲル濾過によって複合体として上記Ｂ７改変体とともに同時に溶出する。このことは、上記Ｆｚ５−ＣＲＤがこの組換え水溶性ＸＷｎｔ８改変体を「引っ張り落とす」か、または上記改変体に特異的に結合することを示す。従って、上記ＸＷｎｔ８改変体Ｂ７は、水溶性であって、Ｗｎｔのレセプター結合バージョンである。

上記に記載されるとおりのさらなるＸＷｎｔ８改変体の分析から、可溶性でありかつＦｚ−ＣＲＤに結合した上記改変体の全ては、上記全長ＸＷｎｔ８の小さな短縮されたバージョンであることが明らかになった。これら配列は、ＷｎｔのＣ末端の約１００アミノ酸程度を含んだに過ぎず、従って、「ミニＷｎｔ」と称した。上記ミニＷｎｔの正確な境界は、変動し得る（図１に示されるとおり）が、これらミニｗｎｔは、主要な領域（図１においてピンク色）が含まれる限りにおいてＦｚ結合活性を保持する。この領域は、全てのＷｎｔにおいて種にまたがって非常に保存されているので、上記ミニＷｎｔは、全ての種にまたがってＷｎｔの保存されたＦｚ結合フラグメントを表す。

上記Ｆｚ−ＣＲＤに対する上記ミニｗｎｔ改変体の結合親和性を正確に定量するために、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を行った。ミニＸＷｎｔ８を発現させ、バキュロウイルスから精製した。ビオチン化Ｆｚ５−ＣＲＤおよびＦｚ８−ＣＲＤをＳＰＲチップに結合し、その上に、バキュロウイルス発現させたミニＸｗｎｔ８を流した。数学的モデルに適合可能である結合曲線を作成するために、いくつかのミニＷｎｔ濃度を、上記チップの上に注入し、結合の程度を応答単位（ＲＵ）において記録した。このデータから、本発明者らは、結合曲線を適合し、約１〜２マイクロモル濃度の親和性定数（ＫＤ）を計算できた。従って、この実験は、精製システムにおいて、ミニＸＷｎｔ８が、界面活性剤を欠く水性緩衝液中で、生理学的親和性でＦｚ−ＣＲＤに結合することを証明する。

上記ミニＸＷｎｔ８の発見の、他のＷｎｔに対する関連性は、非常に明らかである。図６は、上記ＷｎｔのミニＷｎｔ領域（Ｗｎｔのほぼ最後の１１０残基）を含む上記ＸＷｎｔ８と一緒に、全てのヒトＷｎｔの配列アラインメントを示す。上記配列は、高度に保存されている。このことは、哺乳動物、脊椎動物、および非脊椎動物の全てのＷｎｔの上記Ｆｚ結合ドメインが、そのように図示されるＣ末端ミニＷｎｔドメインにあることを示す。このドメインは、いかなる脂質付加部位をも含まず、水溶性であり、従って、Ｗｎｔシグナル伝達を調節するＷｎｔポリペプチドを生成する理想的なプラットフォームを提供する。

上記Ｆｚレセプターを介する大部分のＷｎｔシグナル伝達が、Ｆｚおよび共レセプター（例えば、ＬＲＰ５／６）の両方へのＷｎｔ結合を要することは公知である。しかし、この共レセプター相互作用に必要なＷｎｔのドメインについては、何も知られていない。ミニＷｎｔ Ｃ末端ドメインがＦｚに結合するという本発明者らの発見に基づいて、本発明者らは、上記Ｎ末端ドメイン（図１に示されるとおり）が、Ｌｒｐ６に結合すると推論した。上記ＷｎｔのＮ末端ドメインがＬｒｐ６と相互作用するか否かを決定するために、酵母ディスプレイを使用する類似の実験を上記のように行った。第１に、上記野生型ＸＷｎｔ８ Ｎ末端ドメインを発現する酵母クローンを、上記Ｍｙｃ抗体で染色するために示したところ、上記Ｎ末端ミニＷｎｔが、酵母の表面に発現されることが判明した（図７ａ，左パネル）。次いで、酵母上の上記野生型ＸＷｎｔ８への上記ＬＲＰ６の結合を、示した。このことは、上記ミニＷｎｔのＮ末端ドメインが、上記Ｌｒｐ６結合ドメインであることを明らかに実証する（図７ａ，右パネル）。

次いで、本発明者らは、上記ＸＷｎｔ８ Ｎ末端ドメインのエラープローンライブラリーを作製し、上記Ｃｔｅｒｍ ミニｗｎｔに類似のアプローチにおいてＬＲＰ６を使用してクローンを選択した。図７ｂは、上記ｍｙｃ抗体でおよび上記Ｌｒｐ６レセプターで特異的に染色するこのエラープローンライブラリーからのある範囲の酵母クローンを示す。これらのクローンのうちのいくつかは、野生型Ｎ末端ドメインより遙かにより強く染色され、従って、より安定であり得るか、もしくはより高い親和性で結合し得る。従って、図７は、生物学的に活性なミニＮ末端Ｗｎｔの作製の証拠を提供する。図８において、本発明者らは、上記ヒトＷｎｔのＮ末端領域がまた、非常に保存されており、Ｗｎｔのこれら形態もまた、Ｌｒｐ６に結合するために上記Ｎ末端ドメインを使用することを示す。従って、本発明者らの研究は、Ｘｅｎｏｐｕｓ Ｗｎｔ８を使用したが、強い配列保存を考えると、上記結果は、他の種に外挿される。

まとめると、これら実験は、Ｗｎｔが、Ｎ末端Ｌｒｐ５／６結合ドメインおよび水溶性Ｃ末端ミニＷｎｔ Ｆｚ結合ドメインへと分けられることを実証する。いずれのドメインも、Ｗｎｔシグナル伝達を調節するための診断剤もしくは治療剤として働く、Ｌｒｐ５／６もしくはＦｚ結合分子を作るためのプラットフォームとして使用され得る。

前述は、本発明の原理を例示するに過ぎない。当業者が、本明細書に明示的に記載されておらず、示されてもいないが、本発明の原理を具体化し、その趣旨および範囲内に含められる種々の取り合わせを考案し得ることは認識される。さらに、本明細書に記載される全ての例および条件の語法は、主に、技術を促進するために読み手に本発明の原理および本発明者らによって与えられた概念を理解させる助けとなることが意図され、このような具体的に記載される例および条件に限定しないと解釈されるべきである。さらに、本発明の原理、局面および実施形態を本明細書に記載する全ての主張、ならびにその具体例は、構造的およびその機能的な等価物の両方を包含することが意図される。さらに、このような等価物は、現在公知である等価物および将来的に開発される等価物の両方を含む、すなわち、構造に関係なく、同じ機能を発揮する開発される任意の要素を含むことが意図される。従って、本発明の範囲は、本明細書に示されかつ記載される例示的実施形態に限定することは意図されない。むしろ、本発明の範囲及び趣旨は、添付の特許請求の範囲によって具体化される。

Claims (21)

1. ミニｗｎｔポリペプチドを含む組成物であって、ここで該ミニｗｎｔポリペプチドは、ＣｔｅｒｍミニｗｎｔもしくはＮｔｅｒｍミニｗｎｔのいずれかである、組成物。
2. 前記ミニｗｎｔポリペプチドは、Ｆｚタンパク質、ＲＯＲタンパク質、もしくはＲｙｋタンパク質に結合しかつ対応するＷｎｔ共レセプターには結合しないＣｔｅｒｍミニｗｎｔである、請求項１に記載の組成物。
3. 前記Ｃｔｅｒｍミニｗｎｔは、図６に示されるＣｔｅｒｍミニｗｎｔアミノ酸配列からなるポリペプチドもしくはその改変体である、請求項２に記載の組成物。
4. 前記Ｃｔｅｒｍミニｗｎｔは、ヒトＷｎｔ１の２９８〜３７０位と保存された残基によって整列し、かつ、ヒトＷｎｔ１の残基１〜２５７と整列するアミノ酸配列を欠くか、もしくはその改変体である、請求項２に記載の組成物。
5. 前記ミニｗｎｔポリペプチドは、ＬＲＰ５、ＬＲＰ６、もしくはＦＲＬ１／ｃｒｙｐｔｏタンパク質に結合しかつ対応するＷｎｔ共レセプターに結合しないＮｔｅｒｍ ミニｗｎｔである、請求項１に記載の組成物。
6. 前記Ｎｔｅｒｍ ミニｗｎｔは、図８に示されるＷｎｔアミノ酸配列からなるポリペプチドもしくはその改変体である、請求項５に記載の組成物。
7. 前記Ｎｔｅｒｍ ミニｗｎｔは、ヒトＷｎｔ１の３４〜２４７位と保存された残基によって整列し、かつ、ヒトＷｎｔ１の残基２８８〜３７０に対応する残基と整列するアミノ酸配列を欠くか、もしくはその改変体である、請求項５に記載の組成物。
8. 前記改変体は、短縮形態である、請求項２〜７のいずれか１項に記載の組成物。
9. 前記改変体は、１もしくはより多くのアミノ酸の欠失もしくは置換を含む、請求項２〜７のいずれか１項に記載の組成物。
10. 前記ミニｗｎｔポリペプチドは、水溶性である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の組成物。
11. 融合もしくは結合体化された機能部分をさらに含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の組成物。
12. 前記機能部分は、治療部分もしくは画像化部分である、請求項１１に記載の組成物。
13. 前記組成物は、アジュバントと共に製剤化されている、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の組成物。
14. 前記組成物は、薬学的投与のために製剤化されている、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の組成物。
15. 細胞におけるＷｎｔシグナル伝達を阻害するための方法であって、該方法は、
    Ｗｎｔレセプターを発現する細胞と、有効量の、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の組成物とを接触させる工程であって、ここでＷｎｔシグナル伝達が阻害される、工程
    を包含する、方法。
16. 前記細胞の増殖は、阻害される、請求項１５に記載の方法。
17. 前記細胞は、癌細胞である、請求項１６に記載の方法。
18. 前記細胞は、インビトロにある、請求項１５に記載の方法。
19. 前記細胞は、インビボにある、請求項１５に記載の方法。
20. 機能部分を細胞へ送達する方法であって、該方法は、
    Ｗｎｔレセプターを発現する細胞と、請求項１１または１２に記載の組成物とを接触させる工程
    を包含する、方法。
21. Ｗｎｔタンパク質の同族レセプターを決定する方法であって、該方法は、
    候補Ｗｎｔレセプターもしくはそのフラグメントと、目的のＷｎｔタンパク質に対応するミニｗｎｔポリペプチドとを接触させる工程；
    該候補レセプターへの該ミニｗｎｔポリペプチドの結合を決定する工程；
    を包含し、ここで特異的結合の存在は、該Ｗｎｔタンパク質が該候補レセプターのリガンドであることを示す、方法。