JP2014509593A - ＥｒｂＢ経路阻害剤に対する耐性の克服 - Google Patents

Abstract

ＥＧＦＲ阻害剤またはＨＥＲ２阻害剤などのＥｒｂＢ経路阻害剤に対する耐性を克服するための方法を提供する。耐性は、ゲフィチニブに対する獲得耐性などの、ＥＧＦＲ阻害剤に対する獲得耐性であり得る。提供する方法において、ＥｒｂＢ経路阻害剤に対する耐性を示す対象を選択し、ＥｒｂＢ３阻害剤と、ＥＧＦＲ阻害剤またはＨＥＲ２阻害剤などの第２のＥｒｂＢ経路阻害剤との両方を対象に投与する。Ｔ７９０Ｍ ＥＧＦＲ変異を含む腫瘍をＥｒｂＢ３阻害剤およびＥＧＦＲ阻害剤と接触させることによって、腫瘍の成長を阻害する方法も提供する。ＥｒｂＢ３阻害剤と、ＥＧＦＲ阻害剤またはＨＥＲ２阻害剤などの第２のＥｒｂＢ経路阻害剤との両方を含むＥｒｂＢ経路阻害剤に対する耐性を克服するための組成物も提供する。

Description

背景
受容体チロシンキナーゼのＥｒｂＢファミリーには、ＥＧＦＲ（ＨＥＲ１）、ＨＥＲ２（ＥｒｂＢ２）、ＥｒｂＢ３（ＨＥＲ３）、およびＥｒｂＢ４（ＨＥＲ４）が含まれる。過去１０年間で、多くの上皮癌が、それらの成長および生存のためにＥＧＦＲまたはＨＥＲ２のシグナル伝達を必要とすることが明らかになってきている。ＥＧＦＲを標的とする薬剤は、肺癌、結腸直腸癌、頭頸部癌、および典型的には、ゲムシタビンと併用して、膵癌などの癌の治療のために広く使用されるようになってきた。例えば、ＥＧＦＲシグナル伝達経路を下方制御する小分子チロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）、例えば、非小細胞肺癌の治療に適応されるゲフィチニブ（イレッサ（登録商標））、非小細胞肺癌および膵癌の治療に適応されるエルロチニブ（タルセバ（登録商標））、およびＨＥＲ２陽性乳癌の治療に適応されるラパチニブ（タイケルブ（登録商標））が開発された。さらに、ＥＧＦＲに特異的な抗体、例えば、結腸直腸癌および頭頸部癌の治療に適応されるヒト化モノクローナル抗体セツキシマブ（アービタックス（登録商標））が開発された。ＨＥＲ２を標的とする薬剤は、乳癌などの癌の治療にも広く用いられるようになってきた。ＨＥＲ２を標的とする薬剤の例としては、ＨＥＲ２過剰発現乳癌の治療のために世界中で用いられているヒト化抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体トラスツズマブ（ハーセプチン（登録商標））が挙げられる。

最近の研究により、ＥＧＦＲ阻害剤に対して感受性のある癌は、ホスホイノシチド３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）シグナル伝達が、ＥＧＦＲの単独制御下にあるという点で特有であることが明らかになった。ＥＧＦＲ阻害剤が有効であるためには、ＥＧＦＲ阻害剤は、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ経路を下方制御させなければならない（Ｂｉａｎｃｏ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２２：２８１２−２８２２）。ＥＧＦＲによって促進される癌を有する患者は、最初は、ＥＧＦＲ標的療法に十分に反応するが、時間と共に、最初に反応していた多くの患者は再発に苦しみ、元の治療に対して耐性のある腫瘍を発症する場合が多い。さらに、特定のＥＧＦＲ陽性癌は、ＥＧＦＲ標的療法に対する耐性の素因を示す。かかる耐性の発症を観察した一つの方法は、ＥＧＦＲの変異を介した方法である。これには「Ｔ７９０Ｍ ＥＧＦＲ変異」が含まれ、野生型ＥＧＦＲの７９０位に存在するスレオニンのメチオニンへの変化によって識別される。この変異は、ＥＧＦＲのキナーゼドメインに位置し、例えば、Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３５２：７８６−７９２およびＰａｏ，Ｗ．ｅｔ ａｌ．（２００５）ＰＬｏＳ Ｍｅｄ．２：２２５−２３５で説明されている。

ＥｒｂＢ３を介するＰＩ３Ｋシグナル伝達経路の持続的活性化は、ゲフィチニブ耐性とも関連している（Ｅｎｇｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．（２００５）上記；Ｅｎｇｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．（２００７）上記）。

トラスツズマブおよびラパチニブなどのＨＥＲ２阻害剤に対する耐性も報告されている。ＥＧＦＲ阻害剤耐性と同様に、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴシグナル伝達経路の持続的活性化は、ＨＥＲ２阻害剤に対する獲得耐性について報告されている機構のうちの少なくとも１つである。

複数の研究が、ＥｒｂＢファミリーのキナーゼ欠損メンバー（ｋｉｎａｓｅ−ｄｅａｄ ｍｅｍｂｅｒ）であるＥｒｂＢ３を、ＥＧＦＲ依存性癌におけるＰＩ３Ｋ／ＡＫＴシグナル伝達の活性化因子として同定した（Ｅｎｇｅｌｍａｎ，Ｊ．Ａ．ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０２：３７８８−３７９３；Ｅｎｇｅｌｍａｎ，Ｊ．Ａ．ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１６：１０３９−１０４５）。これらの細胞において、ＥｒｂＢ３は、ＥＧＦＲ依存的にチロシンがリン酸化され、その後、ＰＩ３Ｋに直接結合する。ＥＧＦＲ阻害の際に、ＥｒｂＢ３リン酸化が失われ、ＥｒｂＢ３はＰＩ３Ｋに結合せず、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴシグナル伝達が損失する（Ｅｎｇｅｌｍａｎ，Ｊ．Ａ．ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０２：３７８８−３７９３；Ｅｎｇｅｌｍａｎ，Ｊ．Ａ．ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１６：１０３９−１０４５）。さらに、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を用いたＥｒｂＢ３の下方制御により、ＥＧＦＲ依存性癌におけるＡＫＴリン酸化が減少する（Ｅｎｇｅｌｍａｎ，Ｊ．Ａ．ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０２：３７８８−３７９３）。同様に、ＥｒｂＢ３は、ＨＥＲ２増幅乳癌におけるＰＩ３Ｋの主要な活性化因子である。トラスツズマブ治療により、これらの癌においてＥｒｂＢ３リン酸化が失われ、ＥｒｂＢ３とＰＩ３Ｋが解離し、ＡＫＴリン酸化が失われる。したがって、ＥｒｂＢ３を介するシグナル伝達は、ＥＧＦＲおよびＨＥＲ２の両方によって促進される癌におけるＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ活性化の主要メカニズムであると考えられる。

ＥｒｂＢ３の再活性化にＥＧＦＲ、ＨＥＲ２およびＭＥＴを結び付ける耐性の例もある（Ｅｎｇｅｌｍａｎ，Ｊ．Ａ．ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１６：２６９５−２７０６；Ｅｎｇｅｌｍａｎ，Ｊ．Ａ．ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１６：１０３９−１０４５；Ｒｉｔｔｅｒ，Ｃ．Ａ．ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１３：４９０９−４９１９；Ｓｅｒｇｉｎａ，Ｎ．Ｖ．ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｎａｔｕｒｅ ４４５：４３７−４４１）。さらに、ＨＥＲ２−ＥｒｂＢ３ヘテロダイマーのヘレグリン誘導性活性化は、ＥＧＦＲ阻害剤に対する耐性にも関連している（Ｚｈｏｕ，Ｂ．Ｂ．ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ １０：３９−５０）。

上記のことを考えると、（ＴＫＩおよび抗ＥＧＦＲ抗体などの）ＥＧＦＲ阻害剤ならびに（ＴＫＩおよび抗ＨＥＲ２抗体などの）ＨＥＲ２阻害剤を含むＥｒｂＢ経路阻害剤に対する耐性を克服するための組成物および方法は、標的癌治療の有効性を拡大または回復する見込みがあるので、積極的に求められている。

概要
ＥｒｂＢ経路阻害剤に対する耐性を克服するための方法、およびかかる方法の実施に使用できる医薬組成物を提供する。本明細書に提供する方法および組成物は、少なくとも部分的に、ＥｒｂＢ経路阻害剤と組み合わせてＥｒｂＢ３阻害剤を使用すると、ＥｒｂＢ経路阻害剤に対する腫瘍耐性を克服することができるという本発明者らの発見に基づく。例えば、抗ＥＧＦＲ抗体と組み合わせて二重特異性抗ＥｒｂＢ３，抗ＥｒｂＢ２抗体（または抗ＥｒｂＢ３抗体）を使用すると、小分子ＥＧＦＲ阻害剤ゲフィチニブに対するインビボでの獲得耐性を克服することが実証されている。

したがって、一態様では、対象のＥｒｂＢ経路阻害剤に対する腫瘍の耐性を克服または予防するための方法であって、
ＥｒｂＢ経路阻害剤に対する耐性を示す腫瘍を有するか、または発症するリスクのある対象を選択する工程と、
この対象に（ｉ）ＥｒｂＢ３阻害剤および（ｉｉ）ＥｒｂＢ経路阻害剤を投与する工程と
を含む方法を提供する。

典型的には、対象に投与するＥｒｂＢ経路阻害剤は、対象が耐性を示すＥｒｂＢ経路阻害剤と同じＥｒｂＢ経路に対して指向されるが、対象に投与するＥｒｂＢ経路阻害剤は、対象が耐性を示すＥｒｂＢ経路阻害剤と同じである必要はない。例えば、ＥＧＦＲ経路阻害剤ゲフィチニブに対して耐性を示す対象には、ＥｒｂＢ３阻害剤とＥＧＦＲ阻害剤を同時投与してもよく、このＥＧＦＲ阻害剤は、例えば、ゲフィチニブまたは抗ＥＧＦＲ抗体セツキシマブであり得る。

特定の実施形態では、ＥｒｂＢ経路阻害剤に対して対象が示す耐性は獲得耐性である。一実施形態では、この獲得耐性は、腫瘍中のＥＧＦＲが、Ｔ７９０Ｍ ＥＧＦＲ変異を含むＥＧＦＲ遺伝子を含む腫瘍細胞を含む獲得耐性などの、ＥＧＦＲ阻害剤に対する獲得耐性である。別の実施形態では、この腫瘍は、少なくとも１つのＫＲＡＳ変異、例えば、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２Ｃ、もしくはＧ１２ＶのＫＲＡＳ変異またはＱ６１Ｒ ＫＲＡＳ変異を含むＫＲＡＳ遺伝子を含む腫瘍細胞を含む。一実施形態では、この獲得耐性は、ゲフィチニブに対する耐性である。別の実施形態では、この獲得耐性は、トラスツズマブに対する獲得耐性などのＨＥＲ２阻害剤に対する獲得耐性である。様々な実施形態では、対象が示す耐性は、対象の腫瘍細胞におけるＰＩ３Ｋ／ＡＫＴシグナル伝達の再活性化と関連する。

一実施形態では、対象に投与するＥｒｂＢ３阻害剤は、抗ＥｒｂＢ３抗体である。代表的な抗ＥｒｂＢ３抗体は、配列番号１および配列番号２にそれぞれ示されるＶ_Ｈ配列およびＶ_Ｌ配列を含むＭＭ−１２１（Ａｂ＃６）である。あるいは、抗ＥｒｂＢ３抗体は、ＭＭ−１２１の重鎖ＣＤＲおよび軽鎖ＣＤＲを含む抗体である（すなわち、抗ＥｒｂＢ３抗体は、配列番号３〜５にそれぞれ示されるＶ_Ｈ ＣＤＲ１配列、Ｖ_Ｈ ＣＤＲ２配列およびＶ_Ｈ ＣＤＲ３配列、ならびに配列番号６〜８にそれぞれ示されるＶ_Ｌ ＣＤＲ１配列、Ｖ_Ｌ ＣＤＲ２配列およびＶ_Ｌ ＣＤＲ３配列を含む）。別の実施形態では、抗ＥｒｂＢ３抗体は、それぞれ配列番号４２および配列番号４３に記載のアミノ酸配列を含む重鎖および軽鎖を有する抗体である。他の実施形態では、抗ＥｒｂＢ３抗体は、（配列番号９および配列番号１０にそれぞれ示されるＶ_Ｈ配列およびＶ_Ｌ配列を含む）Ａｂ＃３、（配列番号１７および配列番号１８にそれぞれ示されるＶ_Ｈ配列およびＶ_Ｌ配列を含む）Ａｂ＃１４、（配列番号２５および配列番号２６にそれぞれ示されるＶ_Ｈ配列およびＶ_Ｌ配列を含む）Ａｂ＃１７または（配列番号３３および配列番号３４にそれぞれ示されるＶ_Ｈ配列およびＶ_Ｌ配列を含む）Ａｂ＃１９である。さらに他の実施形態では、抗ＥｒｂＢ３抗体は、ｍＡｂ １Ｂ４Ｃ３もしくはｍＡｂ ２Ｄ１Ｄ１２またはそのヒト化バージョン、ｍＡｂ ２０５．１０（例えば、ｍＡｂ ２０５．１０．１、ｍＡｂ ２０５．１０．２、もしくはｍＡｂ ２０５．１０．３）（Ｒｏｃｈｅ−Ｇｌｙｃａｒｔ社）、ＡＭＧ−８８８（Ｕ３−１２８７、Ｕ３ Ｐｈａｒｍａ ＡＧ社およびＡｍｇｅｎ社）、ＡＶ−２０３（Ａｖｅｏ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社）ならびにヒト化ｍＡｂ ８Ｂ８から選択される。典型的には、ＥｒｂＢ３阻害剤は、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴシグナル伝達を阻害する。

一実施形態では、対象に投与するＥｒｂＢ３阻害剤は、配列番号４４に記載の、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）コンジュゲート中に２つのｓｃＦｖを含むＭＭ−１１１などの二重特異性抗ＥｒｂＢ３，抗ＥｒｂＢ２抗体である。ＭＭ−１１１は、ＥｒｂＢ２生物活性に顕著な影響を与えることなく、ＥｒｂＢ２／ＥｒｂＢ３へのヘレグリン結合を抑制し、ＥｒｂＢ２／ＥｒｂＢ３のヘレグリン活性化を阻害する。（Ｂ２Ｂ３−１とも称される）ＭＭ−１１１、ならびにＡ５−ＨＳＡ−ＭＬ３．９、Ａ５−ＨＳＡ−Ｂ１Ｄ２、Ｂ１２−ＨＳＡ−Ｂ１Ｄ２、Ａ５−ＨＳＡ−Ｆ５Ｂ６Ｈ２、Ｈ３−ＨＳＡ−Ｆ５Ｂ６Ｈ２、およびＦ４−ＨＳＡ−Ｆ５Ｂ６Ｈ２を含む、ｓｃＦｖ ＨＳＡコンジュゲートである多くの二重特異性抗ＥｒｂＢ２／抗ＥｒｂＢ３抗体については、同時係属中の米国特許出願公開第２０１１００５９０７６号およびＰＣＴ公開番号ＷＯ２００９／１２６９２０に記載されている。他の適切な二重特異性抗ＥｒｂＢ２／抗ＥｒｂＢ３抗体については、米国特許第７，３３２，５８０号および同第７，３３２，５８５号に開示され、請求されている。ＭＭ−１１１は、現在、臨床試験を受けており、これには、進行性で、難治性のＨＥＲ２陽性癌患者におけるＭＭ−１１１のオープンラベルフェーズ１−２試験および薬理学的研究、ならびに進行性ＨＥＲ２陽性乳癌患者における、トラスツズマブ（ハーセプチン（登録商標））と組み合わせたＭＭ−１１１のオープンラベルフェーズ１−２試験が含まれる。特定の実施形態では、ＥｒｂＢ３阻害剤は、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴシグナル伝達を阻害する。

一実施形態では、対象に投与するＥｒｂＢ経路阻害剤は、ＥＧＦＲ阻害剤である。例えば、このＥＧＦＲ阻害剤は、セツキシマブなどの抗ＥＧＦＲ抗体であり得る。他の代表的な抗ＥＧＦＲ抗体は、ＭＭ−１５１、Ｓｙｍ００４、マツズマブ、パニツムマブ、ニモツズマブおよびｍＡｂ ８０６である。

別の実施形態では、対象に投与するＥＧＦＲ阻害剤は、ゲフィチニブなどのＥＧＦＲシグナル伝達の小分子阻害剤である。ＥＧＦＲシグナル伝達の他の代表的な小分子阻害剤は、アファチニブ、ラパチニブ、カネルチニブ、エルロチニブＨＣＬ、ペリチニブ、ＰＫＩ−１６６、ＰＤ１５８７８０、およびＡＧ１４７８である。

別の実施形態では、対象に投与するＥｒｂＢ経路阻害剤は、ＨＥＲ２阻害剤である。例えば、このＨＥＲ２阻害剤は、トラスツズマブなどの抗ＨＥＲ２抗体であり得る。あるいは、対象に投与するＨＥＲ２阻害剤は、ラパチニブなどのＨＥＲ２シグナル伝達の小分子阻害剤であり得る。

別の態様では、Ｔ７９０Ｍ ＥＧＦＲ変異細胞を含む腫瘍含有細胞の成長を阻害する方法であって、この腫瘍を（ｉ）ＥＧＦＲ阻害剤、および（ｉｉ）ＥｒｂＢ３阻害剤と接触させる工程を含む方法を開示する。一実施形態では、このＥｒｂＢ３阻害剤は、上記の抗ＥｒｂＢ３抗体のうちの１つまたは複数などの抗ＥｒｂＢ３抗体を含む。別の実施形態では、このＥｒｂＢ３阻害剤は、上記の二重特異性抗体のうちの１つまたは複数などの二重特異性抗ＥｒｂＢ３，抗ＥｒｂＢ２抗体を含む。一実施形態では、このＥｒｂＢ３阻害剤は、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴシグナル伝達を阻害する。別の実施形態では、このＥＧＦＲ阻害剤は、上記の抗体のうちの１つまたは複数などの抗ＥＧＦＲ抗体を含む。さらに別の実施形態では、このＥＧＦＲ阻害剤は、上記の小分子阻害剤のうちの１つまたは複数などのＥＧＦＲシグナル伝達の小分子阻害剤を含む。

さらに別の態様では、対象の腫瘍を治療する方法であって、
Ｔ７９０Ｍ ＥＧＦＲ変異に陽性を示す生検によって担癌対象を選択する工程と、
この対象に（ｉ）ＥＧＦＲ阻害剤、および（ｉｉ）ＥｒｂＢ３阻害剤を投与する工程と
を含む方法を提供する。

特定の実施形態では、対象に投与するＥｒｂＢ３阻害剤は、上記の抗ＥｒｂＢ３抗体のうちの１つまたは複数などの抗ＥｒｂＢ３抗体を含む。特定の実施形態では、対象に投与するＥｒｂＢ３阻害剤は、上記の二重特異性抗体のうちの１つまたは複数などの二重特異性抗ＥｒｂＢ３，抗ＥｒｂＢ２抗体を含む。代表的なＥｒｂＢ３阻害剤は、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴシグナル伝達を阻害する。別の実施形態では、対象に投与するＥＧＦＲ阻害剤は、上記の抗体のうちの１つまたは複数などの抗ＥＧＦＲ抗体を含む。さらに別の実施形態では、対象に投与するＥＧＦＲ阻害剤は、上記の小分子阻害剤のうちの１つまたは複数などのＥＧＦＲシグナル伝達の小分子阻害剤を含む。

本明細書に提供する組成物および方法を用いて、腫瘍の成長、浸潤または転移を阻害するか、またはＥｒｂＢ経路阻害に対して耐性を示す腫瘍を有する対象を治療することができる。一実施形態では、この腫瘍は、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）腫瘍、例えば、腺癌ＮＳＣＬＣ、扁平上皮癌ＮＳＣＬＣ、または大細胞癌ＮＳＣＬＣなどの肺癌腫瘍である。他の実施形態では、この腫瘍は、結腸直腸癌、頭頸部癌、膵癌または乳癌の腫瘍であり得る。

別の態様では、ＥｒｂＢ経路阻害剤に対する耐性を克服するための医薬組成物を提供する。これらの医薬組成物は、上記のＥｒｂＢ３阻害剤および上記のＥｒｂＢ経路阻害剤のうちの１つまたは複数を含む。一実施形態では、このＥｒｂＢ３阻害剤およびＥｒｂＢ経路阻害剤は、単一組成物中に医薬担体と共に製剤化される。別の実施形態では、このＥｒｂＢ３阻害剤は、第１の医薬担体と共に製剤化されて第１の組成物を形成し、このＥｒｂＢ経路阻害剤は、第２の医薬担体と共に製剤化されて第２の組成物を形成し、この第１の組成物および第２の組成物は、任意で一緒に包装される。

抗ＥｒｂＢ３抗体ＭＭ−１２１によって、ＡＣＨＮ、ＤＵ１４５およびＯｖＣＡＲ８の細胞株におけるＥｒｂＢ３（ｐＥｒｂＢ３）、ＡＫＴ（ｐＡＫＴ）およびＥＲＫ（ｐＥＲＫ）のヘレグリン誘導性リン酸化の阻害を示すＥＬＩＳＡアッセイ結果の一連のグラフである。データは、２つの独立した実験の平均値±ＳＤを表す。 ＥＧＦＲ野生型ＮＳＣＬＣ細胞株を用いたスフェロイドアッセイを示す一連のグラフである。スフェロイド細胞培養物を、ＥＧＦ（１０ｎＭ）で処理するか、ヘレグリン１−β１（ＨＲＧ）（１０ｎＭ）で処理するか、ＥＧＦとＨＲＧ（１０ｎＭ）の両方で処理するか、または外因性リガンドで処理しないか、ならびにエルロチニブ（１μＭ）で処理するか、ＭＭ−１２１（１μＭ）で処理するか、これらの２種類（それぞれ１μＭ）の組み合わせで処理するか、または薬物を含めないで処理した。試験した細胞株には、腺癌細胞株ＮＣＩ−Ｈ３２２Ｍ（図２Ａ）、ＥＫＶＸ（図２Ｂ）、Ａ５４９（図２Ｃ）、Ｈ３５８（図２Ｄ）、および扁平上皮細胞株ＳＷ−９００（図２Ｅ）が含まれる。ｙ軸は、相対生細胞密度を表す。 ＥＧＦＲ野生型ＮＳＣＬＣ細胞株を用いたスフェロイドアッセイを示す一連のグラフである。スフェロイド細胞培養物を、ヘレグリン１−β１（ＨＲＧ）の非存在下または存在下のいずれかで、ならびにＭＭ １２１の非存在下または存在下のいずれかで、０〜１０μΜの範囲の用量のエルロチニブで処理した。試験した細胞には、腺癌細胞株ＮＣＩ−Ｈ３２２Ｍ（図３Ａ）、ＥＫＶＸ（図３Ｂ）、Ａ５４９（図３Ｃ）、ＮＣＩ−Ｈ３５８（図３Ｄ）、およびＮＣＩ−Ｈ４４１（図３Ｅ）、ＮＣＩ−Ｈ２３４７（図３Ｆ）、扁平上皮癌細胞株ＮＣＩ−Ｈ２１７０（図３Ｇ）、および大細胞癌細胞株ＮＣＩ−Ｈ６６１（図３Ｈ）が含まれる。ｙ軸は、相対生細胞密度を表す。 シスプラチン処理後のシスプラチン感受性細胞（Ａ２７８０）および耐性細胞（Ａ２７８０ｃｉｓ）の細胞生存率を示すグラフである。細胞生存率（Ｙ軸）を、培地対照に対する生存率（％）として与え、薬物濃度（ｌｏｇ μΜ）に対してプロットする。 抗ｐＡＫＴをプローブにした３つのウェスタンブロットの画像である。シスプラチンで処理したＡ２７８０細胞（図５Ａ）、シスプラチンで処理したＡ２７８０ｃｉｓ細胞（図５Ｂ）、ＭＭ−１２１で処理したＡ２７８０ｃｉｓ細胞（図５Ｃ）の溶解物中のｐＡＫＴレベルを示す。Ｓは、未処理の感受性細胞対照を示し、Ｒは、未処理の耐性細胞対照を示す。Ｘ軸は、薬物処理後に溶解物を収集した時間（ｈ）を示し、Ｙ軸は薬物濃度（μΜ）を示す。 ラパチニブ（図６Ａ）、トラスツズマブ（図６Ｂ）、またはＭＭ−１１１（図６Ｃ）による処理後の、インビトロでのＢＴ４７４−Ｍ３細胞の（対照に対する割合（％）としての）細胞生存率（Ｙ軸）を示す一連のグラフである。それぞれの図について、Ｘ軸は薬物濃度（ｎＭ）を示す。 ラパチニブ（図７Ａ）、トラスツズマブ（図７Ｂ）での処理後の、ヘレグリン刺激ＢＴ４７４−Ｍ３細胞におけるＡＫＴの活性化の阻害を示す２つのグラフ（Ｙ軸、ｐＡＫＴの標準化量）である。それぞれの図について、Ｘ軸は、示したとおりのＥｒｂＢ経路阻害剤濃度を示す。図７ＡにおいてＸ軸に沿って示したそれぞれのラパチニブ濃度については、グループ化したバーは、左から右に読んで、０ｎＭ、１ｎＭ、４ｎＭ、１６ｎＭ、６３ｎＭ、２５０ｎＭ、および１０００ｎΜのＭＭ−１１１濃度に対応する。図７ＢにおいてＸ軸に沿って示したトラスツズマブ濃度については、グループ化バーは、左から右に読んで、０ｎＭ、１ｎＭ、１０ｎＭ、１００ｎＭ、および１０００ｎΜのトラスツズマブ濃度に対応する。「基底」と印をつけた線は、ヘレグリンで刺激せず、ＭＭ−１１１、ラパチニブ、またはトラスツズマブで処理しなかった細胞中のｐＡＫＴレベルを示す。 ＭＭ−１１１、ラパチニブ、またはＭＭ−１１１とラパチニブの組み合わせ（図８Ａ）、ＭＭ−１１１、トラスツズマブ、またはＭＭ−１１１とトラスツズマブの組み合わせ（図８Ｂ）での処理後の、ＢＴ４７４−Ｍ３異種移植乳癌異種移植モデルにおける腫瘍体積の減少を示す２つのグラフである。Ｙ軸は平均腫瘍体積（ｍｍ^３）を表し、ｘ軸は、腫瘍移植後の時間（日数）を表す。 トラスツズマブ耐性ＢＴ４７４−Ｍ３細胞内のＥｒｂＢ受容体のＦＡＣＳ解析を示す３つのプロットである。それぞれの図について、細胞数（Ｙ軸）を、以下の蛍光色素の発光強度（Ｘ軸）に対してプロットする：図９Ａ、ＥｒｂＢ２の受容体の状態−太い黒色の実線＝ＥｒｂＢ２について染色したトラスツズマブ耐性細胞、細い灰色の実線＝トラスツズマブ耐性細胞（未染色）、点線＝ＥｒｂＢ２について染色した非耐性細胞、破線＝非耐性細胞（未染色）；図９Ｂ、ＥＧＦＲの状態−太い黒色の実線＝ＥＧＦＲについて染色したトラスツズマブ耐性細胞、細い灰色の実線＝トラスツズマブ耐性細胞（未染色）、点線＝ＥＧＦＲについて染色した非耐性細胞、破線＝非耐性細胞（未染色）；図９Ｃ、ＥｒｂＢ３状態ＥｒｂＢ３受容体状態−太い黒色の実線＝ＥｒｂＢ３について染色したトラスツズマブ耐性細胞、細い灰色の実線＝トラスツズマブ耐性細胞（未染色）、点線＝ＥｒｂＢ３について染色した非耐性細胞、破線＝非耐性細胞（未染色）。 トラスツズマブ耐性ＢＴ４７４−Ｍ３細胞の細胞成長を阻害するトラスツズマブ（図１０Ａ）およびＭＭ−１１１（図１０Ｂ）の能力を比較した２つのグラフである。それぞれの図について、親（非耐性）ＢＴ４７４−Ｍ３細胞およびトラスツズマブ耐性ＢＴ４７４−Ｍ３細胞の成長を、トラスツズマブ（Ａ）またはＭＭ−１１１（Ｂ）の用量範囲（Ｘ軸、トラスツズマブまたはＭＭ−１１１（ｎＭ））で処理した後の対照（トラスツズマブまたはＭＭ−１１１を添加していない）細胞に対する割合（％）（Ｙ軸）として示す。 トラスツズマブ耐性ＢＴ４７４−Ｍ３細胞スフェロイドにおける細胞成長を阻害するトラスツズマブ（図１１Ａ）およびＭＭ−１１１（図１１Ｂ）の能力を比較した２つのグラフである。親（非耐性）ＢＴ４７４−Ｍ３細胞スフェロイドおよびトラスツズマブ耐性ＢＴ４７４−Ｍ３細胞スフェロイドの成長を、薬物の用量範囲（Ｘ軸、トラスツズマブまたはＭＭ−１１１（ｎＭ））で処理した後の対照（トラスツズマブまたはＭＭ−１１１を添加していない）細胞に対する割合（％）（Ｙ軸）として示す。 ３００ｎＭのエルロチニブ（図１２Ａ）または１００ｎＭのゲフィチニブ（図１２Ｂ）と組み合わせた場合の、トラスツズマブ耐性ＢＴ４７４−Ｍ３細胞スフェロイドの細胞成長に対するＭＭ−１１１またはトラスツズマブの効果を比較した２つのグラフである。これらの細胞スフェロイドの成長を、対照に対する割合（％）として示す（破線、薬物添加なし）。エルロチニブ単独またはゲフィチニブ単独で処理した細胞スフェロイドの成長を鎖線で示す。ｘ軸は、ＭＭ−１１１および／またはトラスツズマブのそれぞれの濃度（ｎＭ）の対数目盛であり、ｙ軸は、対照スフェロイドサイズに対する割合（％）としてのスフェロイドサイズである。 ＢＴ４７４−Ｍ３異種移植モデルにおける腫瘍成長阻害に対するＭＭ−１１１、ラパチニブ、およびタモキシフェンの効果を示す一連のグラフである。図１３Ａ、１３Ｂ、および１３Ｃにおいて、左側のパネルは、緑色蛍光タンパク質を発現するように遺伝子操作したＢＴ４７４−Ｍ３細胞の異種移植片の腫瘍体積を示し、右側のパネルは、ＧＦＰおよびヘレグリン１を発現するように遺伝子操作したＢＴ４７４−Ｍ３細胞の異種移植片の腫瘍体積を示す。図１３Ａは、マウスをＭＭ−１１１（４８ｍｐｋ）、ラパチニブ（１５０ｍｐｋ）およびタモキシフェン（５ｍｇ）で治療したＢＴ４７４−Ｍ３−ＧＦＰ腫瘍およびＢＴ４７４−Ｍ３−ＧＦＰ−ＨＲＧ腫瘍の腫瘍成長曲線を示す。図１３Ｂは、マウスをＭＭ−１１１（４８ｍｐｋ）＋ラパチニブ（１５０ｍｐｋ）、ＭＭ−１１１＋タモキシフェン（５ｍｇ）、およびラパチニブ＋タモキシフェンの併用療法で治療したＢＴ４７４−Ｍ３−ＧＦＰ腫瘍およびＢＴ４７４−Ｍ３−ＧＦＰ−ＨＲＧ腫瘍の腫瘍成長曲線を示す。図１３Ｃは、マウスをラパチニブ＋タモキシフェンおよびＭＭ−１１１＋ラパチニブ＋タモキシフェンの併用療法で治療したＢＴ４７４−Ｍ３−ＧＦＰ腫瘍およびＢＴ４７４−Ｍ３−ＧＦＰ−ＨＲＧ腫瘍の腫瘍成長曲線を示す。対照マウスには治療を行わなかった。ｘ軸は時間（日数）であり、ｙ軸は、接種後１７日目または２０日目の治療開始時の腫瘍体積と比較した腫瘍体積（「Ｄ１７に対する比」または「Ｄ２０に対する比」）である。 ＢＴ４７４−Ｍ３−ＧＦＰ腫瘍（左パネル）およびＢＴ４７４−Ｍ３−ＧＦＰ−ＨＲＧ腫瘍（右パネル）における、ＨＲＧ誘導性シグナル伝達に対するＭＭ−１１１、ラパチニブおよびタモキシフェンの単剤療法ならびにＭＭ−１１１、ラパチニブおよびタモキシフェンの併用療法の効果を示す一連のグラフである。図１４ＡはｐＥｒｂＢ３レベル（ｐｇ／ｍｌ）を示し、図１４Ｂは、全ＥｒｂＢ３（ｔＥｒｂＢ３）レベル（ｐｇ／ｍｌ）を示し、図１４Ｃは、リン酸化ＥｒｂＢ３と全ＥｒｂＢ３の比を示し、図１４Ｄは、リン酸化Ａｋｔ（ｐＡｋｔ）レベル（ｐｇ／ｍｌ）を示し、図１４Ｅは、全Ａｋｔ（ｔＡｋｔ）レベル（ｐｇ／ｍｌ）を示し、図１４Ｆは、ｐＡｋｔとｔＡｋｔの比を示し、図１４Ｇは、増殖性細胞核抗原（ＰＣＮＡ）レベルで標準化したリン酸化ＥＲＫｌ／２（ｐＥＲＫ）レベルを示し、図１４Ｈは、ＰＣＮＡレベルで標準化した全ＥＲＫｌ／２（全ＥＲＫ）レベルを示し、図１４Ｉは、ｐＥＲＫレベルと全ＥＲＫレベルの比を示す。ｘ軸は、担癌マウスが受けた療法を表す。対照マウスには治療を行わなかった。 ＮＣＩ−Ｎ８７異種移植片モデルにおける腫瘍成長曲線を示す一連のグラフである。図１５Ａは、治療をしない（対照）か、またはトラスツズマブ（３．５ｍｐｋ）＋５−フルオロウラシル（５−ＦＵ；１２ｍｐｋ ５日／週）、トラスツズマブ＋５−ＦＵ＋シスプラチン（５ｍｐｋ）、第１のＭＭ−１１１（９６ｍｐｋ）＋トラスツズマブ＋５−ＦＵ、第２のＭＭ−１１１＋トラスツズマブ＋５−ＦＵおよび第２のＭＭ−１１１＋トラスツズマブ＋５−ＦＵ＋シスプラチンで治療した担癌マウスを示す。第１の治療から第２の治療への切り替えおよび化学療法の中止を矢印で示す。図１５Ｂは、トラスツズマブ＋５−ＦＵおよび第２のＭＭ−１１１＋トラスツズマブ＋５−ＦＵで治療したＮＣＩ−Ｎ８７腫瘍の腫瘍成長曲線を示す。図１５Ｃは、トラスツズマブ＋５−ＦＵ＋シスプラチンおよび第２のＭＭ−１１１＋トラスツズマブ＋５−ＦＵ＋シスプラチンで治療したＮＣＩ−Ｎ８７腫瘍の腫瘍成長曲線を示す。ｘ軸は時間（日数）であり、ｙ軸は腫瘍体積（ｍｍ^３）である。 ＢＴ４７４−Ｍ３−ＧＦＰ腫瘍（左パネル）およびＢＴ４７４−Ｍ３−ＧＦＰ−ＨＲＧ腫瘍（右パネル）のＨＲＧ誘導性シグナル伝達におけるＭＭ−１１１、ラパチニブおよびタモキシフェンの単剤療法ならびにＭＭ−１１１、ラパチニブおよびタモキシフェンの併用療法の効果を示す一連のグラフである。担癌マウスを、ＭＭ−１１１、ラパチニブおよびトラスツズマブの単剤療法（図１６Ａ）、ＭＭ−１１１＋ラパチニブ、ＭＭ−１１１＋トラスツズマブ、およびラパチニブ＋トラスツズマブの併用療法（図１６Ｂ）、またはラパチニブ＋トラスツズマブおよびＭＭ−１１１＋ラパチニブ＋トラスツズマブの併用療法（図１６Ｃ）で治療した。ｘ軸は時間（日数）であり、ｙ軸は、接種後１７日目の治療の開始時の腫瘍体積と比較した腫瘍体積である（「比」）。 ＮＣＩ−Ｎ８７異種移植片モデルにおける腫瘍成長曲線を示すグラフである。担癌マウスを、治療しない（対照）か、またはパクリタキセル（２０ｍｐｋ）、トラスツズマブ（３．５ｍｐｋ）＋パクリタキセル、またはＭＭ−１１１（４８ｍｐｋ）＋トラスツズマブ＋パクリタキセルで治療した。ｘ軸は時間（日数）であり、ｙ軸は腫瘍体積（ｍｍ^３）である。

詳細な説明
ＥｒｂＢ経路阻害剤に対する耐性を克服するための方法、およびかかる方法において使用することができる医薬組成物を提供する。実施例でさらに説明するとおり、ＥｒｂＢ３阻害剤、例えば、抗ＥｒｂＢ３抗体または二重特異性抗ＥｒｂＢ３，抗ＥｒｂＢ２抗体は、インビトロとインビボの両方のＥｒｂＢ経路標的療法（例えば、ＥＧＦＲ標的療法）に対するリガンド誘導性（例えば、ヘレグリン誘導性）耐性を克服することができることをここで証明してきた。したがって、ＥｒｂＢ３阻害剤とＥｒｂＢ経路阻害剤とを組み合わせて使用することによって、ＥｒｂＢ経路阻害剤に対する耐性を克服するための方法を本明細書に提供する。

メカニズムに限定されることも、操作のいかなる理論に拘束されることもないが、本明細書に記載のＥｒｂＢ３阻害剤がＥｒｂＢ経路阻害剤に対する耐性を克服する能力は、少なくとも部分的に、ＥｒｂＢ３阻害剤が、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴシグナル伝達の再活性化につながるＥｒｂＢ３シグナル伝達のリガンド依存的再活性化を阻止する能力によるものであると考えられる。

この開示がより容易に理解されるように、特定の用語を最初に定義する。

本明細書で使用する「阻害剤」という用語は、受容体または他のシグナル伝達タンパク質によって媒介されるシグナル伝達を含む、受容体または他のシグナル伝達タンパク質の活性を阻害、下方調節、抑制、または下方制御する治療薬を示す。この用語は、小分子阻害剤（例えば、小分子チロシンキナーゼ阻害剤）および抗体、干渉ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ）、ならびに可溶性受容体などを包含する。

「ＥｒｂＢ経路阻害剤」は、ＥＧＦＲ（ＥｒｂＢ１／ＨＥＲ１）シグナル伝達経路またはＨＥＲ２（ＥｒｂＢ２、ｎｅｕ）シグナル伝達経路などの１つまたは複数のＥｒｂＢシグナル伝達経路のうちの１つまたは複数のタンパク質に作用する阻害剤である。

「ＥＧＦＲ阻害剤」は、ＥＧＦＲに作用する。

「ＨＥＲ２阻害剤」は、ＨＥＲ２（ＥｒｂＢ２）に作用する。

「ＥｒｂＢ３阻害剤」は、ＥｒｂＢ３に作用する。

「抗体」は、抗体全体またはその任意の抗原結合断片（すなわち、「抗原結合部分」）もしくその一本鎖である。「抗体」という用語は、（ｉ）モノクローナル抗体、（ｉｉ）組換え抗体（すなわち、組換え手段によって調製、発現、作製または単離される抗体）、（ｉｉｉ）キメラ抗体（すなわち、可変ドメイン（複数可）が一方の種に由来し、定常ドメイン（複数可）がもう一方の種に由来する抗体）、（ｉｖ）ヒト化抗体（すなわち、追加のＦＲ置換、ドナー置換または非ドナー置換／非アクセプター置換のいずれか一方が組み込まれてもよいが、ＣＤＲのみがドナー種に由来し、抗体構造の残りの部分はヒトである抗体）、（ｖ）完全ヒト抗体（すなわち、可変領域ＣＤＲおよびＦＲが、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する抗体）、ならびに（ｖｉ）二重特異性抗体および多重特異性抗体（すなわち、異なる抗原結合特異性を有する２つ以上の結合部位を有する抗体）を包含する。本明細書で使用する、抗体の「抗原結合部分」（または単に「抗体部分」）という用語は、抗原（例えば、ＥｒｂＢ３）に特異的に結合する能力を保持する抗体のうちの１つまたは複数の断片を指す。抗体の「抗原結合部分」という用語に包含される結合断片の例としては、（ｉ）Ｆａｂ断片、Ｖ_Ｌドメイン、Ｖ_Ｈドメイン、ＣＬドメインおよびＣＨ１ドメインからなる一価断片、（ｉｉ）Ｆ（ａｂ'）_２断片、ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断片、（ｉｉｉ）Ｖ_ＨドメインおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片、（ｉｖ）抗体の単一アームのＶ_ＬドメインおよびＶ_ＨドメインからなるＦｖ断片、（ｖ）Ｖ_ＨドメインおよびＶ_Ｌドメインを含むｄＡｂ、（ｖｉ）Ｖ_ＨドメインからなるｄＡｂ断片、（ｖｉｉ）Ｖ_ＨドメインまたはＶ_ＬドメインからなるｄＡｂ断片、ならびに（ｖｉｉｉ）例えば、合成リンカーによって結合している２つ以上の単離されたＣＤＲの組み合わせが挙げられる。さらに、Ｆｖ断片の２つのドメインであるＶ_ＬおよびＶ_Ｈは、別々の遺伝子によってコードされるが、Ｖ_Ｌ領域およびＶ_Ｈ領域が対になり、一価分子を形成する（一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られる）単一タンパク質鎖として作られることを可能にする合成リンカーによって、組換え法を用いてＶ_ＬおよびＶ_Ｈを結合させることができる。かかる一本鎖抗体は、抗体の「抗原結合部分」という用語に包含されることも意図される。これらの抗体断片は、当業者に公知の従来技術を用いて得ることができ、かつこれらの断片を、インタクトな抗体と同じ方法で有用性についてスクリーニングすることができる。抗原結合部分は、組換えＤＮＡ技術によって、またはインタクトな免疫グロブリンの酵素的切断または化学的切断によって生成することができる。

「ＥｒｂＢ経路阻害剤に対する耐性」という（例えば、「ＥｒｂＢ経路阻害剤に対する耐性を示す」の中の）用語は、より早い時点の同じ細胞と比較するか、またはＥｒｂＢ経路阻害剤に反応するのと同じ種類の他の細胞と比較して、細胞が、（例えば、阻害剤の細胞成長または細胞増殖を阻害する能力によって測定されるとおり）ＥｒｂＢ経路阻害剤に対する反応性の低下、減少または欠如を示す細胞（例えば、癌細胞）の特性を指す。この細胞は、組織、例えば、腫瘍組織内に存在し得る。さらに、組織、例えば、腫瘍組織は、対象がＥｒｂＢ経路阻害剤に対して耐性を示すと言われる場合には、対象に存在し得る。

本明細書で使用する「獲得耐性」という用語は、ＥｒｂＢ経路阻害剤に対する細胞の反応が、治療開始時の阻害剤に対するかかる細胞の反応と比較して、経時的に減少するような、経時的に、典型的には、ＥｒｂＢ経路阻害剤による治療の過程において細胞内で発生する、ＥｒｂＢ経路阻害剤に対する耐性を指す。あらかじめ反応細胞において経時的に発生するこの「獲得耐性」は、ＥｒｂＢ経路阻害剤に対する「耐性の素因」となる細胞とは対照的であり、ＥｒｂＢ経路阻害剤に対して反応性を示す細胞（すなわち、その成長および／または増殖が、ＥｒｂＢ経路阻害剤によって著しく阻害される細胞）と比較して、ＥｒｂＢ経路阻害剤での治療に対するこれらの細胞の反応性の固有の欠如を、または著しい低下を指す。

阻害剤、例えば、ＥｒｂＢ経路阻害剤に対する、本明細書で使用する「耐性の克服」および「耐性を克服する」という用語は、細胞が、その耐性状態の細胞と比較して、同じシグナル伝達経路を阻害する同じ阻害剤または別の阻害剤に対して測定可能な程度の反応性（または反応性の増加）を示すように、あらかじめ耐性のある細胞内の阻害剤に対する耐性のレベルもしくは量または程度が、減少、低下、または逆転する現象を指す。例えば、耐性が示されている阻害剤が、例えば、ゲフィチニブである細胞における「ＥＧＦＲ経路阻害剤に対する耐性の克服」は、その耐性状態の細胞と比較して、ゲフィチニブまたは（抗ＥＧＦＲ抗体セツキシマブなどの）別のＥＧＦＲ経路阻害剤に対する測定可能な程度の反応性を示す細胞をもたらす。

本明細書で使用する「対象」という用語には、本明細書に提供する方法を用いて、ＥｒｂＢ経路阻害剤に対する耐性に取り組むことができる、かかる耐性を示す腫瘍を有する対象または患者などの、疾患または障害を有する任意のヒトまたは非ヒト哺乳類が含まれる。

Ｉ．ＥｒｂＢ３阻害剤
本明細書でさらに詳細に説明するように、本明細書に提供する方法および組成物は、１つまたは複数のＥｒｂＢ３阻害剤の使用を含む。

ＭＭ−１２１は、現在フェーズＩＩ臨床試験を受けている完全ヒト抗ＥｒｂＢ３抗体である。（「Ａｂ＃６とも称される」）ＭＭ−１２１および関連するヒト抗ＥｒｂＢ３抗体については、米国特許第７，８４６，４４０号、米国特許出願公開第２００９０２９１０８５号、同第２０１０００５６７６１号、および同第２０１００２６６５８４号、ならびにＰＣＴ公開番号ＷＯ２００８／１００６２４で詳細に説明されている。開示される組み合わせで使用することができる他の抗ＥｒｂＢ３抗体には、Ａｂ＃３、Ａｂ＃１４、Ａｂ＃１７もしくはＡｂ＃１９などの、米国特許第７，８４６，４４０号に記載の他の抗ＥｒｂＢ３抗体またはＥｒｂＢ３との結合についてＡｂ＃３、Ａｂ＃１４、Ａｂ＃１７もしくはＡｂ＃１９と競合する抗体の全てが含まれる。本明細書に開示される方法にしたがって投与することができる抗ＥｒｂＢ３抗体のさらなる例としては、米国特許第７，２８５，６４９号、米国特許出願公開第２０１００３１０５５７号、および同第２０１００２５５０１０号に開示される抗体、ならびに抗体１Ｂ４Ｃ３（カタログ番号ｓｃ−２３８６５、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）および２Ｄ１Ｄ１２（Ｕ３ Ｐｈａｒｍａ ＡＧ社）（これらの両方は、例えば、米国特許出願公開第２００４０１９７３３２号で説明されており、（ＤＳＭＺに寄託された）ハイブリドーマ細胞株ＤＳＭ ＡＣＣ ２５２７もしくはＤＳＭ ＡＣＣ ２５１７によって生成される）、米国特許第７，７０５，１３０号に開示される抗ＥｒｂＢ３抗体が挙げられ、例えば、米国特許第７，７０５，１３０号に記載のＡＭＧ８８８（Ｕ３−１２８７、Ｕ３ Ｐｈａｒｍａ ＡＧ社およびＡｍｇｅｎ社）と称される抗ＥｒｂＢ３抗体、米国特許出願公開第２０１１０２５６１５４号に記載のＡＶ−２０３（Ａｖｅｏ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社）と称される抗ＥｒｂＢ３抗体、米国特許第５，９６８，５１１号に記載の８Ｂ８（ＡＴＣＣ（登録商標）ＨＢ−１２０７０（商標））、および、例えば、米国特許出願公開第２０１１０１７１２２２号に記載の抗ＥｒｂＢ３抗体ｍＡｂ ２０５．１０（例えば、ｍＡｂ ２０５．１０．１、ｍＡｂ ２０５．１０．２、またはｍＡｂ ２０５．１０．３）（Ｒｏｃｈｅ−Ｇｌｙｃａｒｔ社）などのモノクローナル抗体（そのヒト化型を含む）を含むが、これらに限定されない。他のこのような例としては、多特異性抗体であり、少なくとも第２の治療抗体または追加の治療剤に連結された少なくとも１つの抗ＥｒｂＢ３抗体（例えば、上述の抗ＥｒｂＢ３抗体のうちの１つ）を含む抗ＥｒｂＢ３抗体が挙げられる。さらなる他の適切な抗ＥｒｂＢ３抗体は、以下のもののいずれかを含む：１）それぞれ配列番号４５および配列番号４６に記載の核酸配列によってコードされる可変重鎖（ＶＨ）領域および／もしくは可変軽鎖（ＶＬ）領域、または２）それぞれ配列番号１および配列番号２に記載のアミノ酸配列を含むＶＨおよび／もしくはＶＬ領域、または３）配列番号３（ＣＤＲＨ１）、配列番号４（ＣＤＲＨ２）および配列番号５（ＣＤＲＨ３）に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ１配列、ＣＤＲＨ２配列、およびＣＤＲＨ３配列、ならびに／または配列番号６（ＣＤＲＬ１）、配列番号７（ＣＤＲＬ２）および配列番号８（ＣＤＲＬ３）に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ１配列、ＣＤＲＬ２配列、およびＣＤＲＬ３配列、ならびにヒトＥｒｂＢ３に結合し、上述の抗体１）、２）、または３）と少なくとも９０％の可変領域配列同一性を有する抗体。別の実施形態において、この抗体は、上述の抗体のいずれか１つと同じヒトＥｒｂＢ３上のエピトープと結合について競合する、かつ／または同じヒトＥｒｂＢ３上のエピトープに結合する。この抗体がＭＭ−１２１である場合、エピトープは、典型的には、ヒトＥｒｂＢ３（配列番号４１）の残基９２−１０４を含む。他の実施形態において、この抗体は、ＥｒｂＢ３に結合する完全ヒトモノクローナル抗体であり、生細胞において、ａ）ＥｒｂＢ２／ＥｒｂＢ３複合体形成を阻害するか、ｂ）以下のヘレグリン、ＥＧＦ、ＴＧＦα、ベータセルリン、ヘパリン結合上皮成長因子、ビレグリン（ｂｉｒｅｇｕｌｉｎ）、エピジェン、エピレグリン、およびアンフィレグリンのそれぞれの形態のいずれかによって誘導されるＥｒｂＢ３の細胞内リン酸化を阻止するか、またはａ）とｂ）の両方を行う。

上記の抗ＥｒｂＢ３抗体は、例えば、原核細胞または真核細胞において、例えば、ＣＨＯ細胞などのタンパク質をグリコシル化できる細胞株において、当業者に周知の方法を用いて産生することができる。

（Ｂ２Ｂ３−１とも称される）ＭＭ−１１１については、同時係属中の米国特許出願第１２／７５７，８０１号およびＰＣＴ公開番号ＷＯ２００９／１２６９２０に記載されている。その中で、ｓｃＦｖ ＨＳＡコンジュゲートであり、Ａ５−ＨＳＡ−ＭＬ３．９、Ａ５−ＨＳＡ−Ｂ１Ｄ２、Ｂ１２−ＨＳＡ−Ｂ１Ｄ２、Ａ５−ＨＳＡ−Ｆ５Ｂ６Ｈ２、Ｈ３−ＨＳＡ−Ｆ５Ｂ６Ｈ２、およびＦ４−ＨＳＡ−Ｆ５Ｂ６Ｈ２を含む、本明細書に提供する方法および組成物における使用に適する他の二重特異性抗ＥｒｂＢ２／抗ＥｒｂＢ３抗体も開示されている。本明細書に提供する方法および組成物における使用に適する他の二重特異性抗ＥｒｂＢ２／抗ＥｒｂＢ３抗体には、ＡＬＭおよびＨ３×Ｂ１Ｄ２が含まれ、それぞれ、抗ＥｒｂＢ２抗体に連結した抗ＥｒｂＢ３抗体を含み、これらについては、米国特許第７，３３２，５８５号および同第７，３３２，５８０号、ならびにＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０２４２８７でさらに説明されている。

さらに別の実施形態において、この二重特異性抗ＥｒｂＢ３，抗ＥｒｂＢ２抗体は、２種類以上の二重特異性抗ＥｒｂＢ３，抗ＥｒｂＢ２抗体の混合物、すなわちカクテルを含むことができ、これらの各々は、ＥｒｂＢ３上の異なるエピトープに結合する。一実施形態において、この混合物、すなわちカクテルは、３種類の二重特異性抗ＥｒｂＢ３，抗ＥｒｂＢ２抗体を含み、これらの各々は、ＥｒｂＢ３上の異なるエピトープに結合する。

別の実施形態において、このＥｒｂＢ３阻害剤は、ＥｒｂＢ３の発現または活性を阻害するＲＮＡ分子などの核酸分子を含む。ＥｒｂＢ３のＲＮＡアンタゴニストについて記載されている（例えば、米国特許出願公開第２００８０３１８８９４号参照）。さらに、ＥｒｂＢ３の発現および／または活性を特異的に阻害するｓｈＲＮＡまたはｓｉＲＮＡなどの、ＥｒｂＢ３に特異的な干渉ＲＮＡについて記載されている（例えば、Ｓｅｒｇｉｎａ，Ｎ．Ｖ．ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｎａｔｕｒｅ ４４５：４３７−４４１；Ｌｉｕ，Ｂ．ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ １２０：１８７４−１８８２；Ｆｒｏｌｏｖ，Ａ．ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．６：５４８−５５４；Ｓｉｔｈａｎａｎｄａｍ，Ｇ．ａｎｄ Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｌ．Ｍ．（２００８）Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１５：４１３−４１８；Ｌｅｅ−Ｈｏｅｆｌｉｃｈ，Ｓ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６８：５８７８−５８８７参照）。

さらに別の実施形態において、このＥｒｂＢ３阻害剤は、ＥｒｂＢ３の経路を介したシグナル伝達を阻害するＥｒｂＢ３受容体の可溶型を含む。かかる可溶性ＥｒｂＢ３分子については、当技術分野において記載されている（例えば、それぞれＭａｉｈｌｅらによる米国特許第７，３９０，６３２号、米国特許出願公開第２００８０２７４５０４号、および米国特許出願公開第２００８０２６１２７０号、ならびにＺｈｏｕによる米国特許出願公開第２００８００５７０６４号参照）。

別の実施形態において、このＥｒｂＢ３阻害剤は、ＥｒｂＢ３の発現または活性を阻害する、ＲＮＡ分子などの核酸分子を含む。ＥｒｂＢ３のＲＮＡアンタゴニストについて記載されている（例えば、米国特許出願公開第２００８０３１８８９４号参照）。さらに、ＥｒｂＢ３の発現および／または活性を特異的に阻害するｓｈＲＮＡまたはｓｉＲＮＡなどの、ＥｒｂＢ３に特異的な干渉ＲＮＡについて記載されている（例えば、Ｓｅｒｇｉｎａ，Ｎ．Ｖ．ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｎａｔｕｒｅ ４４５：４３７−４４１；Ｌｉｕ，Ｂ．ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ １２０：１８７４−１８８２；Ｆｒｏｌｏｖ，Ａ．ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．６：５４８−５５４；Ｓｉｔｈａｎａｎｄａｍ，Ｇ．ａｎｄ Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｌ．Ｍ．（２００８）Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１５：４１３−４１８；Ｌｅｅ−Ｈｏｅｆｌｉｃｈ，Ｓ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６８：５８７８−５８８７参照）。

さらに別の実施形態において、このＥｒｂＢ３阻害剤は、ＥｒｂＢ３の経路を介したシグナル伝達を阻害するＥｒｂＢ３受容体の可溶型を含む。かかる可溶性ＥｒｂＢ３分子については、当技術分野において記載されている（例えば、それぞれＭａｉｈｌｅらによる米国特許第７，３９０，６３２号、米国特許出願公開第２００８０２７４５０４号、および米国特許出願公開第２００８０２６１２７０号、ならびにＺｈｏｕによる米国特許出願公開第２００８００５７０６４号参照）。

ＩＩ．ＥｒｂＢ経路阻害剤
本明細書でさらに詳細に説明するとおり、本明細書に提供する方法および組成物は、１つまたは複数のＥｒｂＢ経路阻害剤の使用を含む。

一実施形態において、このＥｒｂＢ経路阻害剤は、ＥＧＦＲ阻害剤（すなわち、ＥＧＦＲを阻害し、それによってＥＧＦＲ経路シグナル伝達を阻害する阻害剤）である。

一実施形態において、このＥＧＦＲ阻害剤は、抗ＥＧＦＲ抗体を含む。１つの有用な抗ＥＧＦＲ抗体はセツキシマブ（アービタックス（登録商標）、ＩｍＣｌｏｎｅ社）である。抗ＥＧＦＲ抗体の他の例としては、（Ｂｕｋｈａｌｉｄらによって２０１１年７月５日に出願された、同時係属中の同一出願人による米国特許出願第６１／５０４，６３３号に詳細に記載されている）ＭＭ−１５１、Ｓｙｍ００４（Ｓｙｍｐｈｏｇｅｎ社，Ｐｅｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｊａｎｕａｒｙ １５，２０１０ ７０；５８８、米国特許第７，８８７，８０５号も参照されたい）、マツズマブ（ＥＭＤ７２０００）、パニツムマブ（ベクティビックス（登録商標）；アムジェン社）；ニモツズマブ（ＴｈｅｒａＣＩＭ社）およびｍＡｂ８０６（Ｍｉｓｈｉｍａ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６１：５３４９−５３５４）が挙げられる。

別の実施形態では、このＥＧＦＲ阻害剤は、ＥＧＦＲシグナル伝達経路を阻害するチロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）などのＥＧＦＲシグナル伝達経路の小分子阻害剤を含む。ＥＧＦＲシグナル伝達経路の小分子阻害剤の例としては、ゲフィチニブ（イレッサ（登録商標）、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ社およびＴｅｖａ社）が挙げられる。ＥＧＦＲの小分子阻害剤の他の例としては、エルロチニブＨＣＬ（ＯＳＩ−７７４；タルセバ（登録商標）；ＯＳＩ Ｐｈａｒｍａ社）、ラパチニブ（タイケルブ（登録商標）、ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ社）、カネルチニブ（ＰＤ１８３８０５；Ｐｆｉｚｅｒ社）、ＰＫＩ−１６６（Ｎｏｖａｒｔｉｓ社）、ＰＤ１５８７８０、ペリチニブ、およびＡＧ １４７８（４−（３−クロロアニリノ）−６，７−ジメトキシキナゾリン）が挙げられる。

別の実施形態では、このＥｒｂＢ経路阻害剤は、ＨＥＲ２阻害剤（すなわち、ＨＥＲ２経路シグナル伝達を阻害する阻害剤）である。

一実施形態では、このＨＥＲ２阻害剤は、抗ＨＥＲ２抗体を含む。抗ＨＥＲ２抗体の例としては、トラスツズマブ（ハーセプチン（登録商標））が挙げられる。ハーセプチンは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ社から市販されている。抗ＨＥＲ２抗体の別の例としては、ペルツズマブ（オムニターグ（登録商標）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ社）が挙げられる。

別の実施形態では、このＨＥＲ２阻害剤は、ＨＥＲ２シグナル伝達を阻害するチロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）などのＨＥＲ２の小分子阻害剤を含む。ＨＥＲ２シグナル伝達の小分子阻害剤の限定されない例としては、ラパチニブ（タイケルブ（登録商標）、ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ社）、ＣＩ−１０３３（ＰＤ １８３８０５；Ｐｆｉｚｅｒ社）、ＰＫＩ−１６６（Ｎｏｖａｒｔｉｓ社）およびペリチニブＥＫＢ−５６９が挙げられる。

ＩＩＩ．方法
一態様では、対象におけるＥｒｂＢ経路阻害剤に対する耐性を克服する方法であって、
ＥｒｂＢ経路阻害剤に対する耐性を示す対象を選択する工程と、
この対象に（ｉ）ＥｒｂＢ３阻害剤および（ｉｉ）ＥｒｂＢ経路阻害剤を投与する工程と
を含む方法を提供する。

典型的には、対象に投与するＥｒｂＢ経路阻害剤は、対象が耐性を示すＥｒｂＢ経路阻害剤と同じＥｒｂＢ経路に対して指向されるが、対象に投与するＥｒｂＢ経路阻害剤は、対象が耐性を示すＥｒｂＢ経路阻害剤と同じである必要はない。例えば、ＥＧＦＲ経路阻害剤ゲフィチニブに対して耐性を示す対象には、ＥｒｂＢ３阻害剤とＥＧＦＲ阻害剤を同時投与してもよく、このＥＧＦＲ阻害剤は、例えば、ゲフィチニブまたは抗ＥＧＦＲ抗体セツキシマブであり得る。

ＥｒｂＢ３阻害剤およびＥｒｂＢ経路阻害剤を対象に同時投与することができるか、または、もう１つの方法として、ＥｒｂＢ３阻害剤は、ＥｒｂＢ経路阻害剤の投与に先立って投与することができる。ＥｒｂＢ３阻害剤およびＥｒｂＢ経路阻害剤は、対象への阻害剤の効果的な送達に適する任意の経路により、対象に投与することができる。例えば、多くの小分子阻害剤は、経口投与に適している。抗体および他の生物学的製剤は、典型的には、静脈内、腹腔内または筋肉内に投与される。

ＥｒｂＢ経路阻害剤に対して耐性を示す対象の同定は、当技術分野で周知の標準的な方法によって達成することができる。例えば、ＥｒｂＢ経路阻害剤が対象の腫瘍細胞（またはインビトロで培養された対象由来の腫瘍細胞試料）の成長および／または増殖を阻害することができない（またはその能力が低下する）ことは、耐性を示し得る。

いくつかの実施形態では、ＥｒｂＢ経路阻害剤に対する耐性は獲得耐性であり、例えば、ＥＧＦＲ阻害剤に対する獲得耐性、例えば、ゲフィチニブに対する獲得耐性である。別の実施形態では、ＥＧＦＲ阻害剤に対する獲得耐性は、対象における、例えば、対象の腫瘍におけるＴ７９０Ｍ ＥＧＦＲ変異と関連する。別の実施形態において、この獲得耐性は、ＨＥＲ２阻害剤に対してである。

対象が示す耐性は、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴシグナル伝達の再活性化と関連する耐性であってよく、ＥｒｂＢ３阻害剤は、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴシグナル伝達を阻害する。実施例で詳細に記載するアッセイなどの、ＥｒｂＢ３阻害剤のＰＩ３Ｋ／ＡＫＴシグナル伝達を阻害する能力を評価するための方法は、当技術分野で公知である。例えば、ＥｒｂＢ３阻害剤のＡＫＴリン酸化を阻害する能力は、当技術分野で公知の標準技術を用いて評価することができる。

別の実施形態では、対象に投与するＥｒｂＢ３阻害剤は、抗ＥｒｂＢ３抗体である。有用な抗ＥｒｂＢ３抗体は、配列番号１および配列番号２にそれぞれ示されるＶ_Ｈ配列およびＶ_Ｌ配列を含むＭＭ−１２１、または配列番号３〜５にそれぞれ示されるＶＨ ＣＤＲ１配列、ＶＨ ＣＤＲ２配列およびＶＨ ＣＤＲ３配列、ならびに配列番号６〜８にそれぞれ示されるＶ_Ｌ ＣＤＲ１配列、Ｖ_Ｌ ＣＤＲ２配列およびＶ_Ｌ ＣＤＲ３配列（すなわち、ＭＭ−１２１のＶ_Ｈ ＣＤＲおよびＶ_Ｌ ＣＤＲ）を含む抗体を含む。別の実施形態では、この抗ＥｒｂＢ３抗体は、それぞれ配列番号４２および配列番号４３に記載のアミノ酸配列を含む重鎖および軽鎖を有する抗体である。さらなる限定されない代表的な抗ＥｒｂＢ３抗体およびＥｒｂＢ３阻害剤の他の形態については、上記のサブセクションＩに詳細に記載されている。

別の実施形態では、対象に投与するＥｒｂＢ経路阻害剤は、ＥＧＦＲ阻害剤である。有用なＥＧＦＲ阻害剤は、抗ＥＧＦＲ抗体、例えば、セツキシマブである。さらなる限定されない代表的な抗ＥＧＦＲ抗体については、上記のサブセクションＩＩに詳細に記載されている。

別の実施形態では、対象に投与するＥｒｂＢ経路阻害剤は、上記のサブセクションＩＩに記載したように、ＥＧＦＲシグナル伝達の小分子阻害剤である。ＥＧＦＲシグナル伝達の有用な小分子阻害剤は、ゲフィチニブである。追加の限定されない代表的なＥＧＦＲシグナル伝達の小分子阻害剤については、上記のサブセクションＩＩに詳細に記載されている。

さらに別の実施形態では、対象に投与するＥｒｂＢ経路阻害剤は、ＨＥＲ２阻害剤である。有用なＨＥＲ２阻害剤には、ラパチニブおよび抗ＨＥＲ２抗体、例えば、トラスツズマブが含まれる。さらなる限定されない代表的な抗ＨＥＲ２阻害剤については、上記のサブセクションＩＩに詳細に記載されている。

別の態様では、Ｔ７９０Ｍ ＥＧＦＲ変異を含む細胞を含む腫瘍の成長、浸潤または転移を阻害する方法であって、この腫瘍（またはその細胞）を（ｉ）ＥＧＦＲ阻害剤、および（ｉｉ）ＥｒｂＢ３阻害剤と接触させる工程を含む方法を提供する。

特定の実施形態では、ＥｒｂＢ３阻害剤は、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴシグナル伝達を阻害する。実施例で詳細に記載するアッセイなどの、ＥｒｂＢ３阻害剤のＰＩ３Ｋ／ＡＫＴシグナル伝達を阻害する能力を評価するための方法は、当技術分野で公知である。例えば、ＥｒｂＢ３阻害剤のＡＫＴリン酸化を阻害する能力は、当技術分野で公知の標準技術を用いて評価することができる。

一実施形態では、この腫瘍（またはその細胞）を、上記のサブセクションＩに詳細に記載したような抗ＥｒｂＢ３抗体を含むＥｒｂＢ３阻害剤と接触させる。

別の実施形態では、この腫瘍（または腫瘍細胞）を、上記サブセクションＩＩに詳細に記載したような抗ＥＧＦＲ抗体を含むＥＧＦＲ阻害剤と接触させる。別の実施形態では、この腫瘍（または腫瘍細胞）を、上記サブセクションＩＩに詳細に記載したようなＥＧＦＲシグナル伝達の小分子阻害剤を含むＥＧＦＲ阻害剤と接触させる。

さらに別の態様では、対象の腫瘍を治療する方法であって、
Ｔ７９０Ｍ ＥＧＦＲ変異を含む腫瘍を有する対象を選択する工程と、
この対象に（ｉ）ＥＧＦＲ阻害剤、および（ｉｉ）ＥｒｂＢ３阻害剤を投与する工程と
を含む方法を提供する。

ＥｒｂＢ３阻害剤およびＥＧＦＲ阻害剤を対象に同時投与することができるか、または、もう１つの方法として、ＥｒｂＢ３阻害剤は、ＥＧＦＲ阻害剤の投与に先立って投与することができる。ＥｒｂＢ３阻害剤およびＥＧＦＲ阻害剤は、対象への阻害剤の効果的な送達に適する任意の経路により、対象に投与することができる。例えば、多くの小分子阻害剤は、経口投与に適している。抗体および他の生物学的製剤は、典型的には、静脈内、腹腔内または筋肉内に投与される。

Ｔ７９０Ｍ ＥＧＦＲ変異を含む腫瘍を有する対象の同定は、対象の腫瘍細胞試料（例えば、生検）中のゲノムＤＮＡ、またはその試料から調製されるＥＧＦＲをコードするｃＤＮＡの分析などによる（例えば、ＰＣＲおよび配列決定による）当技術分野で周知の方法を用いて達成することができる。

有用なＥｒｂＢ３阻害剤は、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴシグナル伝達を阻害するものである。実施例に詳細に記載するアッセイなどの、ＥｒｂＢ３阻害剤のＰＩ３Ｋ／ＡＫＴシグナル伝達を阻害する能力を評価するための方法は、当技術分野で周知である。

対象に投与するＥｒｂＢ３阻害剤は、抗ＥｒｂＢ３抗体、例えば、配列番号１および配列番号２にそれぞれ示されるＶ_Ｈ配列およびＶ_Ｌ配列を含むＭＭ−１２１を含んでよく、またはこのＥｒｂＢ３阻害剤は、配列番号３〜５にそれぞれ示されるＶ_Ｈ ＣＤＲ１配列、Ｖ_Ｈ ＣＤＲ２配列およびＶ_Ｈ ＣＤＲ３配列、ならびに配列番号６〜８にそれぞれ示されるＶ_Ｌ ＣＤＲ１配列、Ｖ_Ｌ ＣＤＲ２配列およびＶ_Ｌ ＣＤＲ３配列（すなわち、ＭＭ−１２１のＶ_Ｈ ＣＤＲおよびＶ_Ｌ ＣＤＲ）を含む抗体であってよい。さらなる限定されない代表的な抗ＥｒｂＢ３抗体およびＥｒｂＢ３阻害剤の他の形態については、上記のサブセクションＩに詳細に記載されている。

別の実施形態では、対象に投与するＥＧＦＲ阻害剤は、上記サブセクションＩＩに詳細に記載したような抗ＥＧＦＲ抗体を含む。別の実施形態では、対象に投与するＥＧＦＲ阻害剤は、上記のサブセクションＩＩに詳細に記載したようなＥＧＦＲシグナル伝達の小分子阻害剤を含む。

本明細書に開示する方法は、本方法が用いられる疾患は典型的には癌であるが、かかる耐性が観察される、基本的に全ての疾患または障害におけるＥｒｂＢ経路阻害剤に対する耐性の克服に使用するのに適する。耐性がＥＧＦＲ阻害剤である状況では、この癌は、典型的には、肺癌（例えば、非小細胞肺癌）、結腸直腸癌、頭頸部癌および膵癌からなる群から選択される。耐性がＨＥＲ２阻害剤に対する状況では、この癌は、典型的には乳癌である。

ＩＶ．医薬組成物
別の態様では、本明細書に提供する方法で使用できる医薬組成物、すなわち、ＥｒｂＢ経路阻害剤に対する耐性を克服するための医薬組成物を提供する。これらの医薬組成物は、典型的には、（上記のセクションＩに詳細に記載したような）ＥｒｂＢ３阻害剤、（上記のセクションＩＩに詳細に記載したような）ＥｒｂＢ経路阻害剤および医薬担体を含む。ＥｒｂＢ３阻害剤およびＥｒｂＢ経路阻害剤は、単一組成物中に医薬担体と共に製剤化することができる。もう１つの方法として、このＥｒｂＢ３阻害剤は、医薬担体と共に製剤化されて第１の組成物を形成することができ、このＥｒｂＢ経路阻害剤は、医薬担体と共に製剤化されて第２の組成物を形成することができ、この第１の組成物および第２の組成物を一緒に包装することができる。さらに、この医薬組成物は、例えば、ＥｒｂＢ経路阻害剤に対する耐性を克服するために、この組成物の使用説明書を含むことができる。

本明細書で使用する「薬学的に許容される担体」には、任意のおよび全ての溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤、緩衝剤、ならびに生理学的に適合性のある他の賦形剤が含まれる。好ましくは、この担体は、非経口投与、経口投与、または局所投与に適する。投与経路に依存して、活性化合物、例えば、小分子または生物製剤は、化合物を不活性化し得る酸および他の自然条件の作用から化合物を保護する物質でコーティングしてもよい。

薬学的に許容される担体には、滅菌水溶液または分散液、および無菌の注射可能な溶液もしくは分散液の即時調製のための無菌粉末、ならびに錠剤、丸剤、およびカプセル剤などの調製用の従来の賦形剤が含まれる。薬学的に活性のある物質の製剤化のためのかかる媒体および薬剤の使用は、当技術分野で知られている。任意の従来の媒体または薬剤が活性化合物と不適合である場合を除き、本明細書に開示する医薬組成物におけるその使用が企図される。補助的な活性化合物も、この組成物に組み込むことができる。

薬学的に許容される担体には、薬学的に許容される抗酸化剤が含まれ得る。薬学的に許容される抗酸化剤の例としては、（１）アスコルビン酸、塩酸システイン、重硫酸ナトリウム、二亜硫酸ナトリウム、および亜硫酸ナトリウムなどの水溶性抗酸化剤、（２）パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、没食子酸プロピル、およびα−トコフェロールなどの油溶性抗酸化剤、ならびに（３）クエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、およびリン酸などの金属キレート剤が挙げられる。

本明細書に開示する医薬組成物に用いることができる適切な水性担体および非水性担体の例としては、水、エタノール、（グリセロール、プロピレングリコール、およびポリエチレングリコールなどの）ポリオール、およびそれらの適切な混合物、オリーブ油などの植物油、ならびにオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルが挙げられる。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング材料の使用によって、分散液の場合には必要な粒径の維持によって、かつ界面活性剤の使用によって維持することができる。多くの場合において、等張剤、例えば、糖類、マンニトール、ソルビトールなどの多価アルコール類、または塩化ナトリウムを、組成物中に含めることが有用である。注射用組成物の長期吸収は、吸収を遅らせる薬剤、例えば、モノステアリン酸塩およびゼラチンを組成物中に含めることによってもたらされ得る。

これらの組成物は、保存剤、湿潤剤、乳化剤および分散剤などの機能性賦形剤を含んでもよい。

治療用組成物は、典型的には、製造および貯蔵の条件下で無菌であり、非発熱性であり、かつ安定でなければならない。この組成物は、溶液、マイクロエマルション、リポソーム、または高い薬物濃度に適する他の秩序構造として製剤化することができる。

無菌の注射可能な溶液は、上記に列挙した成分の１つまたは複数の組合せを、適切な溶媒中に必要量の活性化合物を組み込み、その後、必要に応じて、滅菌、例えば、精密濾過によって調製することができる。一般に、分散液は、塩基性分散媒体および上記に列挙したものからの必要とされる他の成分を含む滅菌ビヒクル中に活性化合物を組み込むことによって調製される。滅菌注射溶液の調製のための滅菌粉末の場合には、調製の代表的な方法は、有効成分と、その予め滅菌濾過した溶液由来の任意のさらなる所望の成分の粉末をもたらす真空乾燥および凍結乾燥（ｆｒｅｅｚｅ−ｄｒｙｉｎｇ）（凍結乾燥（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚａｔｉｏｎ））である。

微生物の存在の防止は、上記の滅菌手順、ならびに様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、およびソルビン酸などを含めることの両方によって確実にすることができる。

本明細書に開示する医薬組成物は、本明細書に記載のＥｒｂＢ３阻害剤およびＥｒｂＢ経路阻害剤以外の他の薬剤と組み合わせて投与することもできる。例えば、併用療法には、ＥｒｂＢ３阻害剤およびＥｒｂＢ経路阻害剤、ならびに、当技術分野で知られる１つまたは複数の化学療法剤などの少なくとも１つまたは複数の追加の治療剤との組み合わせが含まれ得る。本明細書に開示する医薬組成物およびその組み合わせは、放射線療法および／または外科手術と組み合わせて投与することもできる。

投薬計画は、最適な所望の反応（例えば、治療反応）を提供するように調整される。例えば、単一のボーラスを投与してもよく、いくつかの分割用量を経時的に投与してもよく、または治療状況の緊急性に応じて、投与量を比例的に減少または増加させることができる。

投与および用量の均一性を容易にするために、本明細書に開示する非経口組成物を投与単位形態で製剤化することが特に都合がよい。本明細書で使用する投与単位形態は、治療される対象のための単位投与量として適する物理的に別個の単位を指し、各単位は、必要な医薬担体と共同で所望の治療効果が生じるように計算された所定量の活性化合物を含む。投与単位形態の仕様は、（ａ）活性化合物のユニークな特徴および達成されるべき特定の治療効果、ならびに（ｂ）個体の感受性の治療のためにかかる活性化合物を配合する際の、当技術分野に特有の制限によって指示され、それらに直接依存する。

本明細書に提供する医薬組成物中の有効成分の実際の投薬レベルは、患者に毒性がなく、特定の患者、組成物、および投与方法に求められる治療反応を達成するのに有効な有効成分量が得られるように変えることができる。

本明細書で使用する「非経口投与」および「非経口投与する」という語句は、経腸投与および局所投与以外の、通常は注射による投与方法を意味し、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、髄腔内、硬膜外および胸骨内への注射ならびに注入を含むがこれらに限定されない。

活性化合物は、滅菌条件下で、薬学的に許容される担体、および必要とされ得る任意の保存剤、緩衝剤、または噴射剤と混合されてもよい。

本明細書に提供する化合物をヒトまたは動物に医薬品として投与する場合、それらは、単独で、または、例えば、薬学的に許容される担体と組み合わせて、０．００１〜９０％（例えば、０．００５〜７０％もしくは０．０１〜３０％）の有効成分を含む医薬組成物として与えることができる。

以下の実施例は、上記の開示をさらに限定するものとして解釈されるべきではない。本明細書に引用するそれぞれのおよび全ての特許出願および特許公開ならびに発行された特許は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

パートＩ：ＥｒｂＢ経路阻害剤に対する耐性を克服するための抗ＥｒｂＢ３抗体の使用
実施例１：ＭＭ−１２１は、ＥｒｂＢ３のリガンド誘導性活性化を阻止する
この実施例では、ＥｒｂＢ３リン酸化およびシグナル伝達のリガンド誘導性活性化を阻害する抗ＥｒｂＢ３モノクローナル抗体ＭＭ−１２１（Ａｂ＃６、米国特許第７，８４６，４４０号に開示されている）の能力を、一連のインビトロ実験で調べた。

ＥＬＩＳＡ法により測定されるインビトロシグナル伝達試験
実験の第１のセットにおいて、米国立癌研究所の発達治療プログラム（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｐｒｏｇｒａｍ）から入手した３種類の癌細胞株であるＡＣＨＮ（腎細胞腺癌、ＡＴＣＣ（登録商標）＃ＣＲＬ−１６１１（商標））、Ｄｕ１４５（前立腺癌、ＡＴＣＣ（登録商標）＃ＨＴＢ−８１（商標））およびＯｖＣＡＲ ８（卵巣腺癌、ＡＴＣＣ（登録商標）＃ＨＴＢ−１６１（商標））の細胞株を、９６ウェルプレートに１ウェル当たり３５，０００細胞で播種し、一晩増殖させた（維持培地は、１０％ウシ胎児血清、２ｍＭのＬ−グルタミン、およびＰｅｎ−Ｓｔｒｅｐを補充したＲＰＭＩ−１６４０培地であり、細胞は、５％ＣＯ_２、９５％空気、３７℃の加湿雰囲気中で成長させた）。細胞を、２０〜２４時間の血清飢餓により同調させた。次いで、これらの細胞を、３０分間、ＭＭ−１２１の２ｍＭから７．６ｐＭの範囲の４倍段階希釈物でプレインキュベートした。次いで、これらの細胞を、１０分間、２５ｎＭのヘレグリン（ＨＲＧ）−１ベータで刺激し、冷ＰＢＳで１回洗浄し、ＭＰＥＲ溶解緩衝液（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社）に溶解した。

細胞溶解物のＥＬＩＳＡ分析のために、ＥｒｂＢ１（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社、ＡＦ２３１）、ＥｒｂＢ２（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社、ＭＡＢ１１２９）、ＥｒｂＢ３（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社、ＭＡＢ ３４８１）およびＡＫＴ（Ｕｐｓｔａｔｅ社、０５−５９１ＭＧ）に対する捕捉抗体を、室温で一晩、３８４ウェルの黒色平底ポリスチレン高結合プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社、３７０８）中でインキュベートした。ＥＬＩＳＡを、一時間、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）でブロックし、次いで、室温で２時間、２％ＢＳＡ、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０およびＰＢＳで希釈した溶解物とインキュベートした。インキュベーションステップの間に、プレートを、ＰＢＳ中０．５％のＴｗｅｅｎ−２０で３回洗浄した。リン酸化ＥｒｂＢ１、リン酸化ＥｒｂＢ２およびリン酸化ＥｒｂＢ３を測定するＥＬＩＳＡを、２時間、リン光体チロシン西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合モノクローナル抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社、ＨＡＭ１６７６）とインキュベートした。リン光体ＡＫＴを測定するＥＬＩＳＡを、２時間、セリン４７３特異的抗リン酸化ＡＫＴマウスモノクローナル１次抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、５１０２）とインキュベートし、次いで、３０分間、ストレプトアビジン−ＨＲＰ（ＤＹ９９８）とインキュベートした。全てのＥＬＩＳＡを、スーパーシグナル（ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ（登録商標））ＥＬＩＳＡピコ化学発光基質（ＥＬＩＳＡ Ｐｉｃｏ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）（Ｐｉｅｒｃｅ社、カタログ番号３７０６９）で可視化し、発光シグナルを、ルミノメーターを用いて測定した。

細胞溶解物のＥＬＩＳＡ分析を、図１に示すグラフにまとめる。このデータは、ＭＭ−１２１を含まない２５ｎＭのＨＲＧ対照と比較して、ＭＭ−１２１が、ＨＲＧに誘導されるＥｒｂＢ３、ＡＫＴおよびＥＲＫのリン酸化を阻害することを示す。阻害剤のＩＣ_５０値を、シグモイド曲線（グラフパッドプリズム（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（登録商標）、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ社、ラ・ホーヤ、カリフォルニア州）を用いて用量反応データを最小二乗適合により計算した。多くの場合に、ＭＭ−１２１を用いたｐＥｒｂＢ３、ｐＡＫＴおよびｐＥＲＫの最大阻害は、刺激していない対照細胞によって測定されるシグナル伝達の基礎レベル近くまたはそれ以下で生じた。したがって、図１の結果は、ＡＣＨＮ、Ｄｕｌ４５およびＯｖＣＡＲ８細胞において、ＭＭ−１２１が、ＥｒｂＢ３ならびに下流のＡＫＴおよびＥＲＫのリン酸化を刺激するヘレグリンの能力を阻止し、非刺激細胞と同等またはそれ以下までシグナル伝達レベルを低下させたことを示す。

実施例２：ＭＭ−１２１は、ＥＧＦＲ野生型非小細胞肺癌のインビトロモデルにおいて、エルロチニブに対する耐性を克服する
方法
以下の９種類の非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）細胞株を、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションから入手した：Ａ５４９（ＡＴＣＣ（登録商標）＃ＣＣＬ−１８５（商標））、ＥＫＶＸ（ＮＣＩ ｖｉａｌ ０５０２４５４）、ＮＣＩ−Ｈ２１７０（ＡＴＣＣ（登録商標）＃ＣＲＬ−５９２８（商標））、ＮＣＩ−Ｈ２３４７（ＡＴＣＣ（登録商標）＃ＣＲＬ−５９４２（商標））、ＮＣＩ−Ｈ３２２Ｍ（ＡＴＣＣ（登録商標）＃ＣＲＬ−５８０６（商標））、ＮＣＩ−Ｈ３５８（ＡＴＣＣ（登録商標）＃ＣＲＬ−５８０６（商標））、ＮＣＩ−Ｈ４４１（ＡＴＣＣ（登録商標）＃ＨＴＢ−１７４（商標））、ＮＣＩ−Ｈ６６１（ＡＴＣＣ（登録商標）＃ＨＴＢ−１８３（商標））およびＳＷ−９００（ＡＴＣＣ（登録商標）＃ＨＴＢ−５９（商標））。これらの細胞株は、それらのＥＧＦＲ遺伝子内に変異を有しておらず、３つの異なる組織学的サブタイプを表す（以下の表Ｘを参照）。Ｒａｓ変異を有する細胞を示す。

細胞を、９６ウェルの３次元培養系（低結合性ナノカルチャー（ＮａｎｏＣｕｌｔｕｒｅ（登録商標））プレート、Ｓｃｉｖａｘ社）において、１ウェル当たり５，０００細胞で播種し、１０％ウシ胎児血清およびＰｅｎ−Ｓｔｒｅｐを補充したＲＰＭＩ−１６４０培地中で、３７℃で増殖させた。スフェロイドを形成した後の４８時間後に、血清を２％まで低下させ、細胞を３７℃で６日間、リガンドおよび薬物と共にインキュベートした。次いで、相対生細胞密度を、セルタイター（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ）Ｇｌｏ（登録商標）試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いて測定した。

２セットの実験を行った。第１のセットにおいて、細胞を、ＥＧＦ（１０ｎＭ）で処理するか、ヘレグリン１−β１（ＨＲＧ）（１０ｎＭ）で処理するか、２種類のリガンドのプール（各リガンド１０ｎＭ）で処理するか、または外因性リガンドを含めないか、エルロチニブ（１μＭ）で処理するか、ＭＭ−１２１（１μＭ）で処理するか、これらの２種類の薬物（各薬物１μＭ）の組み合わせで処理するか、または薬物を含めないで処理した。実験の第２のセットにおいて、細胞を、１０ｎＭのヘレグリン１−β１の非存在下または存在下のいずれかで、かつ１μＭのＭＭ１２１の非存在下または存在下のいずれかで、０〜１０μＭの範囲の用量のエルロチニブで処理した。

（表１）ＥＧＦＲ野生型ＮＳＣＬＣ細胞株

結果
エルロチニブ（タルセバ（登録商標））は、非小細胞肺癌患者の治療に適応され、ＥＧＦＲ変異を保有する腫瘍を有する患者に有効であることが示されているが、診療所において、野生型ＥＧＦＲを有する腫瘍を有する患者は、エルロチニブに対する反応速度が低いことが示されており、ＥＧＦＲ治療中の一部の患者は、新しいＴ７９０Ｍ変異の出現により耐性を発現する（Ｈａｍｍｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，（２００９）Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １５（２４），７５０２−７５０９）。インビトロで、ＥＧＦＲ野生型ＮＳＣＬＣ細胞株は、実質的にエルロチニブに対する感受性が低く、ＥＧＦＲ活性化変異を保有する細胞株よりもＧＩ_５０が数ケタ分高い。Ｒａｓ癌遺伝子の活性化変異（Ｈ−Ｒａｓ、Ｎ−Ｒａｓ、およびＫ−Ｒａｓ）が、肺癌、特に、肺腺癌におけるＫ−Ｒａｓ変異と関連することも示されている。腺癌以外のＮＳＣＬＣサブタイプが、臨床試験においてエルロチニブに対する反応の乏しさと相関することも見出されている。

複数の組織学的サブタイプを有するＥＧＦＲ野生型ＮＳＣＬＣ細胞において、エルロチニブに対する耐性を克服することにおけるＭＭ−１２１の有効性を実証するために、ＭＭ−１２１を、腺癌、扁平上皮癌、または大細胞癌の組織学的サブタイプを有する９種類のＥＧＦＲ野生型ＮＳＣＬＣ細胞株において試験した。これらの細胞株は、表１に示すＲａｓ癌遺伝子について野生型であるか、またはＫ−Ｒａｓ変異もしくはＮ−Ｒａｓ変異を有する。

５種類の細胞株を、それぞれスフェロイドとして成長させ、上記のとおり、上皮成長因子（ＥＧＦ）、ヘレグリン１−β１（ＨＲＧ）、リガンドのプール（ＥＧＦ＋ＨＲＧ）で処理するか、または外因性リガンドで処理しないか（培地）、エルロチニブ、ＭＭ−１２１、エルロチニブとＭＭ−１２１の組み合わせで処理するか、または薬物を含めないで処理した。次いで、腫瘍サイズを、生細胞密度を測定することによって決定した。図２に示すとおり、エルロチニブは、外因性リガンドの非存在下およびＥＧＦの存在下で細胞の成長を阻害したが、ＨＲＧの存在下で成長した細胞の成長阻害には効果的ではなかった。ＭＭ−１２１とエルロチニブの組み合わせは、いくつかの細胞株において、ＥＧＦ刺激細胞の細胞成長を阻害するのにより効果的であったが、ＭＭ−１２１は、ＨＲＧ刺激細胞においてエルロチニブに対する細胞の感受性を大幅に向上させることができた。このことは、腺癌細胞株ＮＣＩ−Ｈ３２２Ｍ（図２Ａ）、ＥＫＶＸ（図２Ｂ）、Ａ５４９（図２Ｃ）、Ｈ３５８（図２Ｄ）、および扁平上皮細胞株ＳＷ−９００（図２Ｅ）を含む試験した全ての細胞スフェロイドについて当てはまった。Ｋ−Ｒａｓ遺伝子の変異状態は、エルロチニブに対する細胞の感受性の増加におけるＭＭ−１２１の有効性に影響を与えなかった。

次いで、８種類の細胞株を、上記のとおり、それぞれスフェロイドとして成長させ、ヘレグリン−１β１（ＨＲＧ）の非存在下または存在下のいずれかで、かつＭＭ−１２１の非存在下または存在下のいずれかで、０〜１０μＭの範囲の用量のエルロチニブで処理した。図３に示すとおり、エルロチニブは、高濃度を除き、ＨＲＧ刺激細胞における細胞成長を阻害することができなかったが、ＭＭ−１２１の添加により、ＨＲＧの存在下で、エルロチニブに対するスフェロイドの感受性を回復することができた。このことは、腺癌細胞株ＮＣＩ−Ｈ３２２Ｍ（図３Ａ）、ＥＫＶＸ（図３Ｂ）、Ａ５４９（図３Ｃ）、ＮＣＩ−Ｈ３５８（図３Ｄ）、ＮＣＩ−Ｈ４４１（図３Ｅ）、ＮＣＩ−Ｈ２３４７（図３Ｆ）、扁平上皮癌細胞株ＮＣＩ−Ｈ２１７０（図３Ｇ）、および大細胞癌細胞株ＮＣＩ−Ｈ６６１（図３Ｈ）を含む、試験した全ての細胞スフェロイドについて当てはまった。Ｋ−Ｒａｓ遺伝子の変異状態は、エルロチニブに対する細胞の感受性の増加におけるＭＭ−１２１の有効性に影響を与えなかった。

これらの結果は、ＨＲＧ媒介シグナル伝達が、ＥＧＦＲ野生型細胞におけるエルロチニブに対する耐性に役割を果たし得ることを示す。これらのデータは、さらに、ＭＭ−１２１が、併用療法においてエルロチニブに対する腫瘍細胞の感受性を回復するのに有効であることを示す。

実施例３：インビトロでのヒト卵巣癌細胞におけるｐＡＫＴ生成の阻害
材料および方法
Ａ２７８０ヒト卵巣癌細胞株は、もともと未治療患者の腫瘍組織から樹立された。Ａ２７８０ｃｉｓ細胞株は、シスプラチン耐性である（カタログ番号９３１１２５１７、Ｓｉｇｍａ社）。Ａ２７８０ｃｉｓ細胞株は、シスプラチンの濃度の増加に親シスプラチン感受性Ａ２７８０細胞株（カタログ番号９３１１２５１９、Ｓｉｇｍａ社）を慢性曝露することによって作られた。Ａ２７８０ｃｉｓは、メルファラン、アドリアマイシンおよび照射に対して交叉耐性を示す。耐性を維持するために、接着後、２〜３継代ごとにシスプラチンを培地に添加する。

シスプラチンに対する耐性を、７２時間、段階希釈したシスプラチン（０．０１〜１０μΜ）でＡ２７８０細胞およびＡ２７８０ｃｉｓ細胞を処理することによって確認した。細胞生存率を、製造業者の説明書に従って、セルタイターグロアッセイ（Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ Ｇｌｏ ａｓｓａｙ）（カタログ番号Ｇ７５７０、Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いて測定する。

ＡＫＴ経路に対するシスプラチンの効果を、１時間、４時間、２４時間または７２時間、インビトロでシスプラチンの用量範囲（０．１〜１０μΜ）で感受性細胞（Ａ２７８０）および耐性細胞（Ａ２７８０ｃｉｓ）を処理することによって決定する。インキュベーション後、細胞溶解物を調製し、ウェスタンブロットによりｐＡＫＴ（ｓｅｒ４７３）（カタログ番号９２７１、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）について分析する。

ＡＫＴ経路に対するＭＭ−１２１の効果を、１時間、４時間、２４時間または７２時間、インビトロでＭＭ−１２１の用量範囲（０．０１〜１μΜ）で感受性細胞（Ａ２７８０）および耐性細胞（Ａ２７８０ｃｉｓ）を処理することによって決定する。インキュベーション後、細胞溶解物を調製し、ウェスタンブロットによりｐＡＫＴ（ｓｅｒ４７３）（カタログ番号９２７１、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）について分析する。

結果
シスプラチン処理に対する細胞株Ａ２７８０ｃｉｓの耐性を、上記の方法またはそれを少し改良した方法により評価した。耐性Ａ２７８０ｃｉｓ細胞および感受性Ａ２７８０細胞を播種し、段階希釈したシスプラチン（０．０１〜１０μΜ）で、インビトロで７２時間処理した。細胞生存率は、ＡＴＰを定量化することにより代謝的に活性のある細胞を測定するセルタイターグロアッセイによって測定した。図４に示すとおり、Ａ２７８０ｃｉｓ細胞は、感受性株Ａ２７８０よりもはるかに高い生存率（培地対照に対する割合として示す）を有した。

インビトロでＡＫＴ経路に対するシスプラチンの効果を特徴付けるために、Ａ２７８０細胞およびＡ２７８０ｃｉｓ細胞を、上記のとおり、１時間、４時間（Ａ２７８０ｃｉｓのみ）、２４時間、または７２時間、シスプラチンの用量範囲で処理した。シスプラチンに対して感受性を示す細胞は、特に、処理の２４時間後および／または高シスプラチン濃度（１０μΜ）でｐＡＫＴ生成の減少を示したが（図８Ａ）、シスプラチン耐性細胞は、ｐＡＫＴ生成に影響を示さなかった（図８Ｂ）。図８Ｃに示すとおり、これらの細胞は、ＭＭ−１２１での処理後、ＡＫＴリン酸化の減少を示した。Ａ２７８０ｃｉｓ細胞を、上記のとおり、１時間、４時間、２４時間または７２時間、ＭＭ−１２１の用量範囲で処理した。細胞は、全ての用量レベルでｐＡＫＴ生成の漸減、および経時的増加を示した。

実施例４：ＭＭ−１２１は、インビトロでヒト卵巣癌細胞株におけるシスプラチン耐性を救出する
ＭＭ−１２１が、インビトロでＡ２７８０ｃｉｓ細胞のシスプラチン耐性表現型を救出することができるかどうかを決定するために、耐性Ａ２７８０ｃｉｓ細胞および感受性Ａ２７８０細胞を上記のとおり播種し、シスプラチン、ＭＭ−１２１、またはそれらの組み合わせの用量範囲で１時間、４時間、２４時間、または７２時間処理した。細胞溶解物をｐＡＫＴについてウェスタンブロットによって分析する。シスプラチンに対して感受性を示す細胞は、シスプラチンおよびＭＭ−１２１での処理後にｐＡＫＴレベルの減少を示し、かつシスプラチンとＭＭ−１２１の両方で処理した細胞については、ｐＡＫＴのさらなる大幅な減少を示す。シスプラチンに対して耐性を示す細胞は、シスプラチンでの処理後にｐＡＫＴの減少を示さず、かつＭＭ−１２１での処理後にｐＡＫＴの適度な量の減少を示す。ＭＭ−１２１とシスプラチンの組み合わせで処理したＡ２７８０ｃｉｓ細胞は、ＭＭ−１２１単独で処理した細胞よりも治療後にｐＡＫＴの量の大幅な減少を示し、このことは、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴシグナル伝達の阻害およびシスプラチンに対する感受性の回復における相加効果を示唆する。

パートＩＩ：ＥｒｂＢ経路阻害剤に対する耐性を克服するための二重特異性抗ＥｒｂＢ３，抗ＥｒｂＢ２抗体の使用
方法
インビトロ乳癌モデル
ＢＴ４７４−Ｍ３細胞（Ｎｏｂｌｅ，Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２００９ ６４：７４１−５１参照）を、５ｎＭのヘレグリンの存在下または非存在下で、ラパチニブ、トラスツズマブまたはＭＭ−１１１の用量範囲で処理する。生存細胞を、処理の６日後に数える。ＡＫＴリン酸化の阻害に対するラパチニブまたはトラスツズマブと組み合わせたＭＭ−１１１の効果を、ヘレグリン刺激ＢＴ４７４−Ｍ３細胞において、用量範囲にわたって評価する。

インビボ乳癌異種移植モデル
ＢＴ４７４−Ｍ３細胞（１匹のマウスあたり２×１０^７細胞）を、Ｎｕ／Ｎｕ免疫不全マウスに皮下接種し、実験前日に、エストロゲンペレット（０．７２ｍｇ；６０日放出）を移植する。腫瘍を７日後に測定し、マウスを４群に無作為化する：これらを、プラセボ、ＭＭ−１１１（６６ｍｇ／ｋｇ、ｑ７ｄ）、ラパチニブ（１５０ｍｇ／ｋｇ、ｑ１ｄ）、またはＭＭ−１１１とラパチニブの組み合わせで治療する。腫瘍を週に２回測定し、実験を４０日で終了する。ＢＴ４７４−Ｍ３乳房腫瘍異種移植モデルも、ＭＭ−１１１（３ｍｇ／ｋｇ、ｑ３ｄ）、トラスツズマブ（１ｍｇ／ｋｇ、ｑ７ｄ）またはこれらの用量の両薬物の組み合わせで治療する。

トラスツズマブ耐性細胞株の開発
トラスツズマブ耐性細胞を樹立するために、ＢＴ４７４−Ｍ３細胞を、６ヶ月間、１００ｎＭのトラスツズマブを有するＲＰＭＩ１６４０培地中で培養し、２ヶ月間、２００ｎＭのトラスツズマブを有するＲＰＭＩ１６４０培地中で培養し、その後、用量レベルを５００ｎＭまで増加する。細胞を定期的に細胞増殖についてアッセイし、トラスツズマブに対する耐性レベルを確認する。

細胞増殖アッセイ
ＢＴ４７４−Ｍ３の親細胞（野生型）およびトラスツズマブ耐性細胞を、９６ウェルプレート（３０００細胞／ウェル）に播種する。一晩インキュベーションした後、細胞をトラスツズマブまたはＭＭ−１１１の一連の希釈物で処理する。治療の５日後、細胞生存率を、製造業者の説明書に従って、ＷＳＴ−１（Ｒｏｃｈｅ社、カタログ番号５０１５９４４００１）によって測定する。対照（１０％ＦＢＳを有するＲＰＭＩ１６４０）で処理した細胞を１００％として設定し、他の処理物を、対照に対する割合として表す。

フローサイトメトリー分析
ＢＴ４７４−Ｍ３の親細胞およびトラスツズマブ耐性細胞上の受容体の状態を決定するために、細胞をトリプシン処理し、ＦＡＣＳ緩衝液で洗浄する。次いで、細胞を、４℃で１時間、アレクサフルオル（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標））６４７標識マウス抗ＥｒｂＢ２抗体（バイオレジェンド（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ（登録商標））カタログ番号３２４４１２）、セツキシマブ抗体（抗ＥＧＦＲ）、およびＢ１２抗体（抗ＥｒｂＢ３）でインキュベートする。ＦＡＣＳ緩衝液で洗浄後、細胞をＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（商標）（ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）により分析した。

スフェロイドアッセイ
ＢＴ４７４−Ｍ３の野生型細胞およびトラスツズマブ耐性細胞（２０００細胞／ウェル）を、超低クラスター（Ｕｌｔｒａ Ｌｏｗ Ｃｌｕｓｔｅｒ）９６ウェルプレート（コースター（Ｃｏｓｔａｒ（登録商標））、Ｃｏｒｎｉｎｇ社、ニューヨーク州）に播種する。一晩インキュベーションした後、トラスツズマブまたはＭＭ−１１１の一連の希釈物をプレートに導入する。細胞を６日間培養する。次いで、スフェロイドをニコン顕微鏡で調べ、ＭｅｔａＭｏｒｐｈ（登録商標）画像解析ソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社）により分析する。１０％ＦＢＳを含む培地で培養した細胞のスフェロイドサイズを、対照として設定する。

実施例５：Ｈｅｒ２指向薬剤のトラスツズマブおよびラパチニブの活性は、ヘレグリン刺激ＥｒｂＢ３シグナル伝達によって減弱するが、ＭＭ−１１１は活性を保持する
ヘレグリン存在下でのＭＭ−１１１、ラパチニブおよびトラスツズマブの細胞増殖を阻害する能力を試験した。基底条件下では、ラパチニブ（図６Ａ）、トラスツズマブ（図６Ｂ）およびＭＭ−１１１（図６Ｃ）は、ＢＴ４７４−Ｍ３細胞増殖を、それぞれ、５０％、３２％および２４％阻害することが見出された。細胞を、５ｎＭのヘレグリン存在下で培養した時、ラパチニブとトラスツズマブの両方の効果が減少し、その結果、細胞増殖阻害は、それぞれ、２３％および９％まで減少した。逆に、ＭＭ−１１１による腫瘍細胞成長の阻害は、ヘレグリンが存在する場合には保持され、３３％の成長阻害が観察された。

実施例６：ラパチニブまたはトラスツズマブへのＭＭ−１１１の添加は、ｐＡＫＴ阻害を増加させる
ＭＭ−１１１とラパチニブの組み合わせまたはＭＭ−１１１とトラスツズマブの組み合わせのインビボでＡＫＴリン酸化（活性化）を阻害する能力を調べた。ラパチニブ単独では、ヘレグリン存在下でＡＫＴのリン酸化を阻害するが、ＭＭ−１１１とラパチニブの組み合わせは、治療的に適切な濃度で、基底レベルをはるかに下回るほどＡＫＴリン酸化を非常に効果的に阻害することが見出された（図７Ａ）。トラスツズマブは、ヘレグリン刺激後に、ＡＫＴリン酸化を阻害しなかった（図７Ｂ）。しかし、トラスツズマブにＭＭ−１１１を添加すると、ほぼ基底レベルまでｐＡＫＴを阻害するトラスツズマブ単独について観察されたヘレグリン刺激ＡＫＴリン酸化の阻害を改善し、このことは、この組み合わせの相加効果を示唆した（図７Ｂ）。

実施例７：ラパチニブまたはトラスツズマブへのＭＭ−１１１の添加は、インビボ活性を増強する
トラスツズマブとＭＭ−１１１の組み合わせまたはラパチニブとＭＭ−１１１の組み合わせについて、ＢＴ４７４−Ｍ３乳癌異種移植モデルを用いてインビボで調べた。ＭＭ−１１１（３日ごとに３ｍｇ／ｋｇを投与）およびトラスツズマブ（毎週１ｍｇ／ｋｇを投与）の準最適単剤療法用量を、単剤療法群および併用療法群間の全ての活性の違いの観察を可能にする組み合わせ実験のために選択した。マウスにおける各薬剤の異なる薬物動態学的特性により、３日ごとに３ｍｇ／ｋｇで投与したＭＭ−１１１は、週用量の１ｍｇ／ｋｇのトラスツズマブと同様の暴露をもたらした。３ｍｇ／ｋｇのＭＭ−１１１および１ｍｇ／ｋｇのトラスツズマブの組み合わせで投与した群における腫瘍成長阻害は、ＭＭ−１１１単独およびトラスツズマブ単独に比べてより強力であり、統計的有意性に達した。さらに、完全縮小が観察されない単剤療法治療群と比較して、併用治療により完全縮小した腫瘍の数の増加が観察された（図８Ａ）。ＭＭ−１１１およびラパチニブを、それぞれ、毎週および毎日、最適有効用量で投与した。ＭＭ−１１１およびラパチニブの組み合わせは、いずれかの薬物単独と比較してより高い効力をもたらした（図８Ｂ）。

実施例８：ＭＭ−１１１は、トラスツズマブ耐性細胞株において活性がある
野生型ＢＴ４７４−Ｍ３細胞株およびトラスツズマブ耐性ＢＴ４７４−Ｍ３細胞株における受容体の状態を決定するために、フローサイトメトリー分析を行った。野生型細胞またはトラスツズマブ耐性細胞を、アレクサフルオル（登録商標）６４７で標識したマウスの抗ＥｒｂＢ２抗体、抗セツキシマブ抗体（抗ＥＧＦＲ）、または抗Ｂ１２抗体（抗ＥｒｂＢ３）で染色した。トラスツズマブ耐性細胞では、ＥｒｂＢ２レベル（図９Ａ）がわずかに減少したが、ＥＧＦＲ（図９Ｂ）およびＥｒｂＢ３（図９Ｃ）は変わらなかった。

トラスツズマブ耐性ＢＴ４７４−Ｍ３細胞増殖の阻害におけるＭＭ−１１１の有効性を決定するために、親の野生型ＢＴ４７４−Ｍ３細胞およびトラスツズマブ耐性ＢＴ４７４−Ｍ３細胞を、ＭＭ−１１１またはトラスツズマブのいずれかの一連の希釈物で上記のとおり処理した。トラスツズマブは、親細胞における細胞増殖を著しく阻害するが、その阻害効果は、トラスツズマブ耐性細胞において著しく減少した（図１０Ａ）。対照的に、ＭＭ−１１１は、親細胞およびトラスツズマブ耐性細胞の両方において同様の阻害活性を維持し（図１０Ｂ）、したがって、ＭＭ−１１１は、トラスツズマブへの反復暴露後に、細胞によって発達した耐性機構を回避することができることを示した。

ＭＭ−１１１のトラスツズマブ耐性細胞における細胞成長を阻害する能力をさらに調べるために、親の野生型ＢＴ４７４−Ｍ３細胞およびトラスツズマブ耐性ＢＴ４７４−Ｍ３細胞の多細胞スフェロイドを、上記の方法またはその少し改良した方法を用いて調製し、ＭＭ−１１１またはトラスツズマブのいずれかの一連の希釈物で処理した。トラスツズマブの阻害効果は、トラスツズマブ耐性ＢＴ４７４−Ｍ３細胞で減少したが、ＢＴ４７４−Ｍ３親細胞のスフェロイド成長を著しく阻害した（図１１Ａ）。対照的に、ＭＭ−１１１は、トラスツズマブ耐性ＢＴ４７４−Ｍ３細胞および野生型ＢＴ４７４−Ｍ３細胞の両方のスフェロイド成長を著しく減少させた（図１１Ｂ）。野生型細胞におけるその阻害活性と比較した時、トラスツズマブ耐性細胞におけるその阻害活性がわずかに改善された。

前述の実施例のデータは、ＭＭ−１１１が、トラスツズマブに対する耐性を発現した細胞における細胞成長を阻害するのに有効であることを示す。

実施例９：トラスツズマブではなくＭＭ−１１１が、トラスツズマブ耐性ＢＴ４７４−Ｍ３細胞における抗ＥＧＦＲ治療薬と組み合わさる
ＥＧＦＲ阻害剤と組み合わせる場合に、細胞成長を阻害するＭＭ−１１１およびトラスツズマブの能力を比較するために、トラスツズマブ耐性ＢＴ４７４−Ｍ３細胞のスフェロイドを上記の方法を用いて調製し、３００ｎＭのエルロチニブ（図１２Ａ）または１００ｎＭのゲフィチニブ（図１２Ｂ）のいずれかの存在下で、ＭＭ−１１１およびトラスツズマブの一連の希釈物で処理した。図１２Ａおよび１２Ｂに示すとおり、トラスツズマブではなくＭＭ−１１１をエルロチニブまたはゲフィチニブと組み合わせることで、トラスツズマブ耐性細胞スフェロイドにおける細胞成長を低減することができた。これらのデータは、ＭＭ−１１１とＥＧＦＲ阻害剤の組み合わせが、トラスツズマブに対する耐性を発現した細胞における細胞成長を阻害するのに有効であることを示す。さらに、ＥＧＦＲ阻害剤とトラスツズマブの組み合せは、これらの細胞の耐性を克服するのに十分ではなかった。

実施例１０：ヘレグリンの存在下または非存在下での、ＢＴ４７４−Ｍ３腫瘍異種移植片におけるＭＭ−１１１、ラパチニブおよびタモキシフェンとの併用療法
方法
ＧＦＰを発現するように遺伝子操作した１５×１０^６個のＢＴ４７４−Ｍ３細胞（ＢＴ４７４−Ｍ３−ＧＦＰ）またはＧＦＰおよびヘレグリン１を発現するように遺伝子操作した１５×１０^６個のＢＴ４７４−Ｍ３細胞（ＢＴ４７４−Ｍ３−ＧＦＰ−ＨＲＧ）を、エストロゲン（６０日の徐放性生分解性担体中の１７β−エストラジオール０．７２ｍｇ）を補充したメスのＮＣｒ／ＮＵ−マウス（Ｔａｃｏｎｉｃ Ｆａｒｍｓ社）の乳腺脂肪体に移植した。腫瘍体積が、平均５１６ｍｍ^３（腫瘍移植後１７日目のＢＴ４７４−Ｍ３−ＧＦＰ−ＨＲＧ）または４２２ｍｍ^３（腫瘍移植後２０日目のＢＴ４７４−Ｍ３−ＧＦＰ）に達した時に、マウスを、１０〜１５匹の８群に分けた。これらの群を治療しない（対照）か、ＭＭ−１１１（４８ｍｐｋ ｑ３ｄ ｉ．ｐ．（３日ごとに腹腔内投与））、ラパチニブ（１５０ｍｐｋ ｑｄ ｐ．ｏ．（毎日経口投与））、タモキシフェン（６０日の徐放性生分解性担体中の遊離塩基タモキシフェン５ｍｇ）、ＭＭ−１１１とラパチニブ、ＭＭ−１１１とタモキシフェン、ラパチニブとタモキシフェンまたはＭＭ−１１１、ラパチニブならびにタモキシフェンのいずれかで治療した。腫瘍を、デジタル口径測定器を用いて週２回測定した。

研究の最後（ＢＴ４７４−Ｍ３−ＧＦＰ−ＨＲＧとＢＴ４７４−Ｍ３−ＧＦＰそれぞれについて、治療開始後２１日目または２５日目）に、腫瘍試料を（最後のＭＭ−１１１投与後２４時間および最後のラパチニブ投与後６時間に）収集し、目的の、下流のシグナル伝達阻害について分析した。ＥｒｂＢ３およびＡｋｔの全タンパク質レベルならびにリン酸化タンパク質レベルを、サスペンションアレイ技術（ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ａｒｒａｙ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）（Ｌｕｍｉｎｅｘ社）によって腫瘍溶解物から分析し、Ｅｒｋ１／２の全タンパク質レベルならびにリン酸化タンパク質レベルを、ＰＣＮＡを用いるウェスタンブロットにより分析し、結果を標準化した。

結果
インビボでヘレグリン（ＨＲＧ）刺激細胞の腫瘍成長を低減するための、ＭＭ−１１１併用療法の有効性を実証するために、併用療法を、上記の方法にしたがって、ＢＴ４７４−Ｍ３−ＧＦＰおよびＢＴ４７４−Ｍ３−ＧＦＰ−ＨＲＧ異種移植モデルにおいて試験した。図１３Ａに示すとおり、ＢＴ４７４−Ｍ３−ＧＦＰおよびＢＴ４７４−Ｍ３−ＧＦＰ−ＨＲＧの担癌マウスを、ＭＭ−１１１（４８ｍｐｋ）、ラパチニブ（１５０ｍｐｋ）およびタモキシフェン（５ｍｇ）の単剤療法で治療した。腫瘍性のＨＲＧ過剰発現は、タモキシフェンの有効性を改善し、ＭＭ−１１１の有効性をわずかに改善した。次いで、ＢＴ４７４−Ｍ３−ＧＦＰおよびＢＴ４７４−Ｍ３−ＧＦＰ−ＨＲＧの担癌マウスを、ＭＭ−１１１（４８ｍｐｋ）＋ラパチニブ（１５０ｍｐｋ）、およびＭＭ−１１１＋タモキシフェン（５ｍｇ）、ならびにラパチニブ＋タモキシフェンの併用療法で治療した。図１３Ｂに示すとおり、腫瘍性ＨＲＧ過剰発現は、ＭＭ−１１１＋タモキシフェンの併用療法の有効性をわずかに改善した。次いで、ＢＴ４７４−Ｍ３−ＧＦＰおよびＢＴ４７４−Ｍ３−ＧＦＰ−ＨＲＧの担癌マウスを、ラパチニブ＋タモキシフェンおよびＭＭ−１１１＋ラパチニブ＋タモキシフェンの併用療法との組み合わせで治療した。図１３Ｃに示すとおり、ＭＭ−１１１は、両方の腫瘍モデルにおいて、ラパチニブ＋タモキシフェンの併用療法の有効性を大幅に高め、このことは、ＭＭ−１１１が、腫瘍性ＨＲＧ発現にかかわらず、最大抗腫瘍効果に必要であることを示した。

次いで、ＢＴ４７４−Ｍ３−ＧＦＰおよびＢＴ４７４−Ｍ３−ＧＦＰ−ＨＲＧの担癌マウス（それぞれ図１４の左パネルおよび右パネル）を、（左から右へ）対照（未治療）、ＭＭ−１１１、ラパチニブ、およびタモキシフェンの単剤療法、ＭＭ−１１１＋ラパチニブ、ＭＭ−１１１＋タモキシフェン、およびラパチニブ＋タモキシフェンの２つの組み合わせ、ならびに３つの組み合わせで治療した。リン酸化ＥｒｂＢ３（ｐＥｒｂＢ３）を示す図１４Ａに示すとおり、腫瘍性ＨＲＧ発現により、ＥｒｂＢ３のリン酸化タンパク質レベルが増加し、ｐＥｒｂＢ３レベルの低下におけるＭＭ−１１１単剤療法およびＭＭ−１１１併用療法の有効性が高まった。腫瘍性ＨＲＧ発現により、ｐＥｒｂＢ３レベルの低下におけるラパチニブおよびラパチニブ＋タモキシフェンの活性が減少した。図１４Ｂに示すとおり、ＭＭ−１１１の単剤療法およびＭＭ−１１１の併用療法は、両方の腫瘍モデルにおいて全ＥｒｂＢ３発現を増加させた。ｐＥｒｂＢ３と全ＥｒｂＢ３（ｔＥｒｂＢ３）の比を示す図１４Ｃに示すとおり、ＭＭ−１１１単剤療法およびＭＭ−１１１併用療法の両方は、ＨＲＧの存在下でさえＥｒｂＢ３活性を減少させるが、ラパチニブおよびラパチニブ＋タモキシフェンの有効性は、ＨＲＧの存在下で低減した。

リン酸化Ａｋｔ（ｐＡｋｔ、図１４Ｄ）と全Ａｋｔ（ｔＡｋｔまたは全Ａｋｔ、図１４Ｅ）の比を示す図１４Ｆに示すとおり、ＨＲＧの腫瘍性発現により、Ａｋｔのリン酸化タンパク質レベル／全タンパク質レベルが増加し、ラパチニブ療法およびラパチニブ＋タモキシフェン療法の有効性を減少させたが、ＭＭ−１１１の単剤療法および併用療法は、ＨＲＧの存在下でｐＡｋｔ生成の減少に有効であった。

リン酸化ＥＲＫ（ＥＲＫｔ、図１４Ｇ）と全Ａｋｔ（全ＥＲＫ、図１４Ｈ）の比を示す図１４Ｉに示すとおり、ＨＲＧの腫瘍性発現は、ＥＲＫ１／２のリン酸化タンパク質レベル／全タンパク質レベルを増加させ、ラパチニブ療法およびラパチニブ＋タモキシフェン療法の有効性を減少させたが、ＭＭ−１１１の単剤療法および併用療法は、ＨＲＧの存在下でｐＥＲＫ生成の減少に有効であった。

実施例１１：ＮＣＩ−Ｎ８７腫瘍異種移植片におけるＴｏＧＡ投薬計画と組み合わせたＭＭ−１１１
ＴｏＧＡ研究（Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ社、ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ ＮＣＴ０１０４１４０４）は、ＨＥＲ２陽性進行胃癌患者において、化学療法単独と比較した、化学療法と組み合わせたトラスツズマブの研究であった。その研究では、トラスツズマブを、３週間毎に、６ｍｇ／ｋｇ（負荷用量８ｍｇ／ｋｇ）の静脈内注射として投与した。この化学療法は、フルオロウラシル（３週間毎に８００ｍｇ／ｍ^２／日の静脈内注射）およびシスプラチン（３週間毎に８０ｍｇ／ｍ^２の静脈内注射）、またはカペシタビン（３週間毎に１４日間は１日２回、１０００ｍｇ／ｍ^２ ｐ．ｏ．）ならびにシスプラチン（３週間毎に８０ｍｇ／ｍ^２の静脈内注射）の６サイクルの組み合わせからなっていた。トラスツズマブによる治療は、疾患進行まで継続した。この治療計画を、以下の方法に従って、ＮＣＩ−Ｎ８７胃癌異種移植モデルにおいて繰り返した。

方法
７．５×１０^６個のＮＣＩ−Ｎ８７細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）カタログ番号ＣＲＬ−５８２２（商標））を、メスのＮｕ／Ｎｕマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）の脇腹に皮下移植した。腫瘍体積が平均３２５ｍｍ^３に達した時（腫瘍移植後１８日目）、マウスを８〜３５匹の４群に分けた。

ＭＭ−１１１を、マウスの初期治療で第１の治療としてまたは第２の治療として投与し、ＭＭ−１１１を治療計画に追加した（矢印参照、図１５Ａ）。これらの群を治療しない（対照）か、トラスツズマブ（３．５ｍｐｋ ｑ３ｄ ｉ．ｐ．）＋５−ＦＵ（１２ｍｐｋ ｑｄ、１週間に５回、ｉ．ｐ．）、トラスツズマブ（３．５ｍｐｋ ｑ３ｄ ｉ．ｐ．）＋５−ＦＵ（１２ｍｐｋ ｑｄ、１週間に５回、ｉ．ｐ．）＋シスプラチン（５ｍｐｋ ｑ７ｄ ｉ．ｐ．）または第１のＭＭ−１１１（９６ｍｐｋ ｑ３ｄ ｉ．ｐ．）＋トラスツズマブ（３．５ｍｐｋ ｑ３ｄ ｉ．ｐ．）＋５−ＦＵ（１２ｍｐｋ ｑｄ、１週間に５回、ｉ．ｐ．）で治療した。腫瘍を、デジタル口径測定器を用いて週２回測定した。

２９日目の継続的な腫瘍成長時に、トラスツズマブ＋５−ＦＵ治療群を、ａ）トラスツズマブ＋５−ＦＵまたはｂ）第２のＭＭ−１１１＋トラスツズマブ＋５−ＦＵのいずれかを受け取る２つの治療群に分けた（矢印参照、２９日目）。同様に、５４日目の継続的な腫瘍成長時に、トラスツズマブ＋５−ＦＵ＋シスプラチン治療群を、ａ）トラスツズマブ＋５−ＦＵ＋シスプラチンまたはｂ）第２のＭＭ−１１１＋トラスツズマブ＋５−ＦＵ＋シスプラチンのいずれかを受け取る２つの治療群に分けた（矢印参照、５４日目）。化学療法に起因する毒性の徴候を示した動物によって、シスプラチン投与は５２日目に中止しなければならず、５−ＦＵ投与は６４日目に中止しなければならなかった。化学療法の中止を、図１５Ａに矢印で示す。

結果
図１５Ａは、上記のとおりに治療したＮＣＩ−Ｎ８７腫瘍の腫瘍成長曲線を示す。図１５Ｂ〜図１５Ｄは、それぞれ、図１５Ａに示したデータのサブセットを強調したものである。図１５Ｂに示すとおり、トラスツズマブ＋５−ＦＵで治療したマウスに与えられる第２の治療としてＭＭ−１１１を加えると、トラスツズマブ＋５−ＦＵ単独による治療で進行した腫瘍の腫瘍細胞成長阻害における有効性が増加した。同様に、図１５Ｃに示すとおり、トラスツズマブ＋５−ＦＵ＋シスプラチンで治療したマウスに与えられる第２の治療としてＭＭ−１１１を加えると、トラスツズマブ＋５−ＦＵ＋シスプラチン単独による治療で進行した（治療に抵抗した）腫瘍の腫瘍細胞成長阻害における有効性が増加した。最終的に、図１５Ｄに示したとおり、腫瘍体積が治療の最初から増加したトラスツズマブ＋５−ＦＵの併用治療とは対照的に、第１の治療としてトラスツズマブおよび５−ＦＵと組み合わせたＭＭ−１１１による治療は、治療の最初の６０日間、腫瘍成長を防いだ。

実施例１２：ＮＣＩ−Ｎ８７腫瘍異種移植片におけるトラスツズマブおよびパクリタキセルと組み合わせたＭＭ−１１１
方法
７．５×１０^６個のＮＣＩ−Ｎ８７細胞を、メスのＮｕ／Ｎｕマウスの脇腹に皮下移植した。腫瘍体積が平均３４１ｍｍ^３に達した時（腫瘍移植後２４日目）、マウスを１０匹の４群に分けた。これらの群を治療しない（対照）か、パクリタキセル（２０ｍｐｋ ｑ７ｄ ｉ．ｐ．）、トラスツズマブ（３．５ｍｐｋ ｑ３ｄ ｉ．ｐ．）＋パクリタキセルまたはＭＭ−１１１（４８ｍｐｋ ｑ３ｄ ｉ．ｐ．）＋トラスツズマブ＋パクリタキセルで治療した。腫瘍を、デジタル口径測定器を用いて週２回測定した。

結果
図１６に示すとおり、トラスツズマブ＋パクリタキセルをＭＭ−１１１と組み合わせると、ＮＣＩ−Ｎ８７腫瘍の腫瘍細胞成長阻害における有効性が増加し、パクリタキセル単独およびトラスツズマブ＋パクリタキセルとは対照的に継続的な腫瘍退縮が生じ、せいぜい腫瘍鬱血のみを引き起こした。

実施例１３：ＢＴ４７４−Ｍ３（±ＨＲＧ）腫瘍異種移植片におけるＭＭ−ｌｌｌ／ラパチニブ／トラスツズマブ
方法
ＧＦＰを発現するように遺伝子操作した１５×１０^６個のＢＴ４７４−Ｍ３細胞（ＢＴ４７４−Ｍ３−ＧＦＰ）またはＧＦＰおよびヘレグリン１を発現するように遺伝子操作した１５×１０^６個のＢＴ４７４−Ｍ３細胞（ＢＴ４７４−Ｍ３−ＧＦＰ−ＨＲＧ）を、エストロゲン（６０日の徐放性生分解性担体中の１７β−エストラジオール０．７２ｍｇ）を補充したメスのＮＣＲ／ＮＵマウスの乳腺脂肪体に移植した。腫瘍体積が、平均２８６ｍｍ^３（腫瘍移植後１４日目のＢＴ４７４−Ｍ３−ＧＦＰ−ＨＲＧ）または３０５ｍｍ^３（腫瘍移植後１６日目のＢＴ４７４−Ｍ３−ＧＦＰ）に達した時に、マウスを８匹の８群に分けた。これらの群を治療しない（対照）か、ＭＭ−１１１（４８ｍｐｋ ｑ３ｄ ｉ．ｐ．）、ラパチニブ（１５０ｍｐｋ ｑｄ ｐ．ｏ．）、トラスツズマブ（３．５ｍｐｋ ｑ３ｄ ｉ．ｐ．）、ＭＭ−１１１＋ラパチニブ、ＭＭ−１１１＋トラスツズマブ、ラパチニブとトラスツズマブまたはＭＭ−１１１とラパチニブとトラスツズマブで治療した。腫瘍を、デジタル口径測定器を用いて週２回測定した。

結果
ＢＴ４７４−Ｍ３−ＧＦＰ担癌マウスおよびＢＴ４７４−Ｍ３−ＧＦＰ−ＨＲＧ担癌マウスを、ＭＭ−１１１、ラパチニブおよびトラスツズマブの単剤療法（図１７Ａ）、ＭＭ−１１１＋ラパチニブ、ＭＭ−１１１＋トラスツズマブ、ならびにラパチニブ＋トラスツズマブの併用療法（図１７Ｂ）、およびラパチニブ＋トラスツズマブならびにＭＭ−１１１＋ラパチニブ＋トラスツズマブの併用療法（図１７Ｃ）で治療した。図１７Ｂに示したとおり、腫瘍性ＨＲＧ過剰発現は、ＭＭ−１１１＋トラスツズマブの組み合わせの有効性を増加させ、トラスツズマブ＋ラパチニブの組み合わせの有効性を減少させた。

さらに、図１７Ｃに示すとおり、ＭＭ−１１１が、ＢＴ４７４−Ｍ３−ＧＦＰ−ＨＲＧ腫瘍モデルにおいて、ラパチニブ＋トラスツズマブの併用療法の有効性を著しく増強させたことは、ＢＴ４７４−Ｍ３腫瘍がヘレグリン１を過剰発現する時に、ＭＭ−１１１が最大抗腫瘍効果に必要であることを示した。

前述の実施例の結果は、他の治療薬に対する耐性の発達を防ぐための第１の治療および他の治療薬による治療に対して腫瘍細胞を再感作させるための第２の治療の両方としての併用治療におけるＭＭ−１１１の有効性を示す。

等価物
当業者は、単なる日常的な実験を用いて、本明細書に記載の本発明の特定の実施形態の多くの等価物を認識するか、または確かめることができる。かかる等価物は、以下の特許請求の範囲によって包含されると意図される。全ての独立請求項および従属請求項のいずれかに開示される実施形態のうちの１つまたは複数の任意の組合せも、本発明の範囲内であると企図される。

参照による組み込み
本明細書で言及されるそれぞれのおよび全ての特許、係属中の特許出願、および出版物は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

配列表の概要

Claims (98)

1. ＥｒｂＢ経路阻害剤に対する対象の腫瘍の耐性を克服するための方法であって、
   ＥｒｂＢ経路阻害剤に対する耐性を示す腫瘍を有する対象を選択する工程と、
   前記対象に（ｉ）ＥｒｂＢ３阻害剤および（ｉｉ）ＥｒｂＢ経路阻害剤を投与する工程と
   を含む方法。
2. 前記ＥｒｂＢ経路阻害剤に対する耐性が獲得耐性である、請求項１に記載の方法。
3. 前記獲得耐性が、ＥＧＦＲ阻害剤に対する獲得耐性である、請求項２に記載の方法。
4. 前記獲得耐性が、腫瘍細胞におけるＴ７９０Ｍ ＥＧＦＲ変異と関連する、請求項３に記載の方法。
5. 前記獲得耐性が、腫瘍細胞におけるＫＲＡＳ変異と関連する、請求項３に記載の方法。
6. 前記ＫＲＡＳ変異が、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２Ｃ、またはＧ１２ＶのＫＲＡＳ変異である、請求項５に記載の方法。
7. 前記ＫＲＡＳ変異が、Ｑ６１Ｒ ＫＲＡＳ変異である、請求項５に記載の方法。
8. 前記獲得耐性が、ゲフィチニブ、トラスツズマブ、またはラパチニブに対する耐性である、請求項３に記載の方法。
9. 前記獲得耐性が、ＨＥＲ２阻害剤に対する獲得耐性である、請求項２に記載の方法。
10. 前記耐性が、前記対象の腫瘍細胞におけるＰＩ３Ｋ／ＡＫＴシグナル伝達の再活性化と関連する、請求項１に記載の方法。
11. 前記対象に投与されるＥｒｂＢ３阻害剤が抗ＥｒｂＢ３抗体である、請求項１に記載の方法。
12. 前記対象に投与されるＥｒｂＢ３阻害剤が、二重特異性抗ＥｒｂＢ３，抗ＥｒｂＢ２抗体である、請求項１に記載の方法。
13. 前記抗ＥｒｂＢ３抗体が、配列番号１および配列番号２にそれぞれ示されるＶ_Ｈ配列およびＶ_Ｌ配列を含む、請求項１１に記載の方法。
14. 前記抗ＥｒｂＢ３抗体が、配列番号３〜５にそれぞれ示されるＶ_Ｈ ＣＤＲ１配列、Ｖ_Ｈ ＣＤＲ２配列およびＶ_Ｈ ＣＤＲ３配列、ならびに配列番号６〜８にそれぞれ示されるＶ_Ｌ ＣＤＲ１配列、Ｖ_Ｌ ＣＤＲ２配列およびＶ_Ｌ ＣＤＲ３配列を含む抗体を含む、請求項１２に記載の方法。
15. 前記抗ＥｒｂＢ３抗体が、配列番号９および配列番号１０にそれぞれ示されるＶ_Ｈ配列およびＶ_Ｌ配列を含む、請求項１１に記載の方法。
16. 前記抗ＥｒｂＢ３抗体が、配列番号１７および配列番号１８にそれぞれ示されるＶ_Ｈ配列およびＶ_Ｌ配列を含む、請求項１１に記載の方法。
17. 前記抗ＥｒｂＢ３抗体が、配列番号２５および配列番号２６にそれぞれ示されるＶ_Ｈ配列およびＶ_Ｌ配列を含む、請求項１１に記載の方法。
18. 前記抗ＥｒｂＢ３抗体が、配列番号３３および配列番号３４にそれぞれ示されるＶ_Ｈ配列およびＶ_Ｌ配列を含む、請求項１１に記載の方法。
19. 前記抗ＥｒｂＢ３抗体が、ＡＶ−２０３、ｍＡｂ １Ｂ４Ｃ３、ｍＡｂ ２Ｄ１Ｄ１２、ＡＭＧ−８８８、ｍＡｂ ２０５．１０．１、ｍＡｂ ２０５．１０．２、ｍＡｂ ２０５．１０．３、およびヒト化ｍＡｂ ８Ｂ８からなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。
20. 前記ＥｒｂＢ３阻害剤がＰＩ３Ｋ／ＡＫＴシグナル伝達を阻害する、請求項１に記載の方法。
21. 前記ＥｒｂＢ経路阻害剤がＥＧＦＲ阻害剤である、請求項１に記載の方法。
22. 前記ＥＧＦＲ阻害剤が抗ＥＧＦＲ抗体である、請求項２１に記載の方法。
23. 前記抗ＥＧＦＲ抗体がセツキシマブを含む、請求項２２に記載の方法。
24. 前記抗ＥＧＦＲ抗体が、ＭＭ−１５１、Ｓｙｍ００４、マツズマブ、パニツムマブ、ニモツズマブおよびｍＡｂ ８０６からなる群から選択される、請求項２２に記載の方法。
25. 前記対象に投与されるＥＧＦＲ阻害剤が、ＥＧＦＲシグナル伝達の小分子阻害剤である、請求項２１に記載の方法。
26. 前記ＥＧＦＲシグナル伝達の小分子阻害剤がゲフィチニブである、請求項２５に記載の方法。
27. 前記ＥＧＦＲシグナル伝達の小分子阻害剤が、ラパチニブ、カネルチニブ、ＣＩ−１０３３（ＰＤ １８３８０５）、エルロチニブ、ＰＫＩ−１６６、ＰＤ−１５８７８０、ペリチニブ、ＥＫＢ−５６９、およびチルホスチンＡＧ １４７８からなる群から選択される、請求項２５に記載の方法。
28. 前記対象に投与されるＥｒｂＢ経路阻害剤がＨＥＲ２阻害剤である、請求項１に記載の方法。
29. 前記ＨＥＲ２阻害剤が抗ＨＥＲ２抗体である、請求項２８に記載の方法。
30. 前記抗ＨＥＲ２抗体がトラスツズマブまたはペルツズマブである、請求項２９に記載の方法。
31. 前記腫瘍が肺癌である、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の方法。
32. 前記肺癌が非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）である、請求項３１に記載の方法。
33. 前記ＮＳＣＬＣが腺癌である、請求項３２に記載の方法。
34. 前記ＮＳＣＬＣが扁平上皮癌である、請求項３２に記載の方法。
35. 前記ＮＳＣＬＣが大細胞癌である、請求項３２に記載の方法。
36. 前記対象が、結腸直腸癌、頭頸部癌、膵癌および乳癌からなる群から選択される癌を有する、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の方法。
37. Ｔ７９０Ｍ ＥＧＦＲ変異、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２Ｃ、もしくはＧ１２ＶのＫＲＡＳ変異、およびＱ６１Ｒ ＫＲＡＳ変異のうちの１つまたは複数を含む腫瘍の成長、浸潤または転移を阻害する方法であって、
    前記腫瘍を（ｉ）ＥＧＦＲ阻害剤および（ｉｉ）ＥｒｂＢ３阻害剤と接触させる工程を含む方法。
38. 前記ＥｒｂＢ３阻害剤が抗ＥｒｂＢ３抗体を含む、請求項３７に記載の方法。
39. 前記ＥｒｂＢ３阻害剤が二重特異性抗ＥｒｂＢ３，抗ＥｒｂＢ２抗体を含む、請求項３７に記載の方法。
40. 前記抗ＥｒｂＢ３抗体が、配列番号１および配列番号２にそれぞれ記載されるＶ_Ｈ配列およびＶ_Ｌ配列を含む、請求項３８に記載の方法。
41. 前記二重特異性抗ＥｒｂＢ３，抗ＥｒｂＢ２抗体が、配列番号４４に記載のアミノ酸配列を含む、請求項３９に記載の方法。
42. 前記抗ＥｒｂＢ３抗体が、ｍＡｂ １Ｂ４Ｃ３、ｍＡｂ ２Ｄ１Ｄ１２、ＡＭＧ−８８８、Ａｖ−２０３、ｍＡｂ ２０５．１０．１、ｍＡｂ ２０５．１０．２、ｍＡｂ ２０５．１０．３、およびヒト化ｍＡｂ ８Ｂ８からなる群から選択される、請求項３８に記載の方法。
43. 前記二重特異性抗ＥｒｂＢ３，抗ＥｒｂＢ２抗体が、ＡＬＭ、Ａ５−ＨＳＡ−ＭＬ３．９、Ａ５−ＨＳＡ−Ｂ１Ｄ２、Ｂ１２−ＨＳＡ−Ｂ１Ｄ２、Ａ５−ＨＳＡ−Ｆ５Ｂ６Ｈ２、Ｈ３−ＨＳＡ−Ｆ５Ｂ６Ｈ２、およびＦ４−ＨＳＡ−Ｆ５Ｂ６Ｈ２を含む群から選択される、請求項３９に記載の方法。
44. 前記ＥｒｂＢ３阻害剤が、前記腫瘍のＰＩ３Ｋ／ＡＫＴシグナル伝達を阻害する、請求項３７に記載の方法。
45. 前記腫瘍を、抗ＥＧＦＲ抗体を含むＥＧＦＲ阻害剤と接触させる、請求項３７に記載の方法。
46. 前記抗ＥＧＦＲ抗体がセツキシマブを含む、請求項４５に記載の方法。
47. 前記抗ＥＧＦＲ抗体が、ＭＭ−１５１、Ｓｙｍ００４、マツズマブ、パニツムマブ、ニモツズマブおよびｍＡｂ ８０６からなる群から選択される、請求項４５に記載の方法。
48. 前記腫瘍を、ＥＧＦＲシグナル伝達の小分子阻害剤を含むＥＧＦＲ阻害剤と接触させる、請求項３７に記載の方法。
49. 前記ＥＧＦＲシグナル伝達の小分子阻害剤がゲフィチニブである、請求項４８に記載の方法。
50. 前記ＥＧＦＲシグナル伝達の小分子阻害剤が、アファチニブ、ラパチニブ、カネルチニブ、エルロチニブＨＣＬ、ペリチニブ、ＰＫＩ−１６６、ＰＤ１５８７８０、およびチルホスチンＡＧ １４７８からなる群から選択される、請求項４８に記載の方法。
51. 前記腫瘍が肺癌腫瘍である、請求項３７〜５０のいずれか一項に記載の方法。
52. 前記肺癌が非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）である、請求項５１に記載の方法。
53. 前記ＮＳＣＬＣが腺癌である、請求項５１に記載の方法。
54. 前記ＮＳＣＬＣが扁平上皮癌である、請求項５１に記載の方法。
55. 前記ＮＳＣＬＣが大細胞癌である、請求項５１に記載の方法。
56. 前記腫瘍が、結腸直腸癌、頭頸部癌、乳癌、および膵癌からなる群から選択される癌である、請求項３７〜５０のいずれか一項に記載の方法。
57. 対象の腫瘍を治療する方法であって、
    Ｔ７９０Ｍ ＥＧＦＲ変異、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２Ｃ、もしくはＧ１２ＶのＫＲＡＳ変異、およびＱ６１Ｒ ＫＲＡＳ変異のうちの１つまたは複数を含む腫瘍を有する対象を選択する工程と、
    前記対象に（ｉ）ＥＧＦＲ阻害剤および（ｉｉ）ＥｒｂＢ３阻害剤を投与する工程と
    を含む方法。
58. 前記対象に投与されるＥｒｂＢ３阻害剤が、抗ＥｒｂＢ３抗体である、請求項５７に記載の方法。
59. 前記抗ＥｒｂＢ３抗体が、配列番号１および配列番号２にそれぞれ記載されるＶ_Ｈ配列およびＶ_Ｌ配列を含む、請求項５８に記載の方法。
60. 前記抗ＥｒｂＢ３抗体が、配列番号３〜５にそれぞれ示されるＶ_Ｈ ＣＤＲ１配列、Ｖ_Ｈ ＣＤＲ２配列およびＶ_Ｈ ＣＤＲ３配列、ならびに配列番号６〜８にそれぞれ示されるＶ_Ｌ ＣＤＲ１配列、Ｖ_Ｌ ＣＤＲ２配列およびＶ_Ｌ ＣＤＲ３配列を含む抗体を含む、請求項５８に記載の方法。
61. 前記抗ＥｒｂＢ３抗体が、配列番号９および配列番号１０にそれぞれ示されるＶ_Ｈ配列およびＶ_Ｌ配列を含む、請求項５８に記載の方法。
62. 前記抗ＥｒｂＢ３抗体が、配列番号１７および配列番号１８にそれぞれ示されるＶ_Ｈ配列およびＶ_Ｌ配列を含む、請求項５８に記載の方法。
63. 前記抗ＥｒｂＢ３抗体が、配列番号２５および配列番号２６にそれぞれ示されるＶ_Ｈ配列およびＶ_Ｌ配列を含む、請求項５８に記載の方法。
64. 前記抗ＥｒｂＢ３抗体が、配列番号３３および配列番号３４にそれぞれ示されるＶ_Ｈ配列およびＶ_Ｌ配列を含む、請求項５８に記載の方法。
65. 前記抗ＥｒｂＢ３抗体が、ｍＡｂ １Ｂ４Ｃ３、ｍＡｂ ２Ｄ１Ｄ１２、ＡＭＧ−８８８、ＡＶ−２０３、ｍＡｂ ２０５．１０．１、ｍＡｂ ２０５．１０．２、ｍＡｂ ２０５．１０．３、およびヒト化ｍＡｂ ８Ｂ８からなる群から選択される、請求項５８に記載の方法。
66. 前記ＥｒｂＢ３阻害剤が、前記腫瘍の細胞におけるＰＩ３Ｋ／ＡＫＴシグナル伝達を阻害する、請求項５７に記載の方法。
67. 前記対象に投与されるＥＧＦＲ阻害剤が抗ＥＧＦＲ抗体である、請求項５７に記載の方法。
68. 前記抗ＥＧＦＲ抗体がセツキシマブを含む、請求項６７に記載の方法。
69. 前記抗ＥＧＦＲ抗体が、ＭＭ−１５１、Ｓｙｍ００４、マツズマブ、パニツムマブ、ニモツズマブおよびｍＡｂ ８０６からなる群から選択される、請求項６７に記載の方法。
70. 前記対象に投与されるＥＧＦＲ阻害剤がＥＧＦＲシグナル伝達の小分子阻害剤である、請求項５７に記載の方法。
71. 前記ＥＧＦＲシグナル伝達の小分子阻害剤がゲフィチニブである、請求項７０に記載の方法。
72. 前記ＥＧＦＲシグナル伝達の小分子阻害剤が、アファチニブ、ラパチニブ、カネルチニブ、エルロチニブＨＣＬ、ペリチニブ、ＰＫＩ−１６６、ＰＤ１５８７８０、およびＡＧ １４７８からなる群から選択される、請求項７０に記載の方法。
73. 前記腫瘍が肺癌である、請求項５７〜７２のいずれか一項に記載の方法。
74. 前記肺癌が非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）である、請求項７３に記載の方法。
75. 前記ＮＳＣＬＣが腺癌である、請求項７４に記載の方法。
76. 前記ＮＳＣＬＣが扁平上皮癌である、請求項７４に記載の方法。
77. 前記ＮＳＣＬＣが大細胞癌である、請求項７４に記載の方法。
78. 前記対象が、結腸直腸癌、頭頸部癌、乳癌、および膵癌からなる群から選択される癌を有する、請求項５７〜７２のいずれか一項に記載の方法。
79. ＥｒｂＢ経路阻害剤に対する腫瘍の耐性を克服するための医薬組成物であって、ＥｒｂＢ３阻害剤、ＥｒｂＢ経路阻害剤および少なくとも１種類の医薬担体を含む医薬組成物。
80. ＥｒｂＢ３阻害剤およびＥｒｂＢ経路阻害剤が、単一組成物中に少なくとも１種類の医薬担体と共に製剤化される、請求項７９に記載の医薬組成物。
81. 前記ＥｒｂＢ３阻害剤が、医薬担体と共に製剤化されて第１の組成物を形成し、前記ＥｒｂＢ経路阻害剤が、医薬担体と共に製剤化されて第２の組成物を形成し、かつ第１の組成物および第２の組成物が、任意で一緒に包装される、請求項７９に記載の医薬組成物。
82. 前記ＥｒｂＢ３阻害剤が抗ＥｒｂＢ３抗体である、請求項７９〜８１のいずれか一項に記載の医薬組成物。
83. 前記ＥｒｂＢ３阻害剤が抗ＥｒｂＢ３抗体である、請求項８２に記載の医薬組成物。
84. 前記抗ＥｒｂＢ３抗体が、配列番号１および配列番号２にそれぞれ記載されるＶ_Ｈ配列およびＶ_Ｌ配列を含む、請求項８３に記載の医薬組成物。
85. 前記ＥｒｂＢ３阻害剤が、二重特異性抗ＥｒｂＢ３，抗ＥｒｂＢ２抗体である、請求項７９〜８１のいずれか一項に記載の医薬組成物。
86. 前記二重特異性抗ＥｒｂＢ３，抗ＥｒｂＢ２抗体が、配列番号４４に記載のアミノ酸配列を含む、請求項８５に記載の医薬組成物。
87. 前記二重特異性抗ＥｒｂＢ３，抗ＥｒｂＢ２抗体が、ＨＥＲ２媒介シグナル伝達に重大な作用を示さない、請求項８５に記載の医薬組成物。
88. 前記ＥｒｂＢ３阻害剤が、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴシグナル伝達を阻害する、請求項７９〜８１のいずれか一項に記載の医薬組成物。
89. 前記組成物に含まれるＥｒｂＢ経路阻害剤が抗ＥＧＦＲ抗体である、請求項７９〜８１のいずれか一項に記載の医薬組成物。
90. 前記抗ＥＧＦＲ抗体がセツキシマブを含む、請求項８９に記載の医薬組成物。
91. 前記組成物に含まれるＥｒｂＢ経路阻害剤が、ＥＧＦＲシグナル伝達の小分子阻害剤である、請求項７９〜８１のいずれか一項に記載の医薬組成物。
92. 前記ＥＧＦＲシグナル伝達の小分子阻害剤がゲフィチニブである、請求項９１に記載の医薬組成物。
93. 前記組成物に含まれるＥｒｂＢ経路阻害剤が抗ＨＥＲ２抗体である、請求項７９〜８１のいずれか一項に記載の医薬組成物。
94. 前記抗ＨＥＲ２抗体がトラスツズマブを含む、請求項９３に記載の医薬組成物。
95. 前記腫瘍が肺癌である、請求項７９〜８１のいずれか一項に記載の医薬組成物。
96. 前記肺癌が、腺癌、扁平上皮癌および大細胞癌から選択される非小細胞肺癌である、請求項９５に記載の医薬組成物。
97. 前記腫瘍が、Ｔ７９０Ｍ ＥＧＦＲ変異、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２Ｃ、もしくはＧ１２ＶのＫＲＡＳ変異、およびＱ６１Ｒ ＫＲＡＳ変異のうちの１つまたは複数を含む腫瘍細胞を含む、請求項９５に記載の医薬組成物。
98. 前記腫瘍が、腺癌、扁平上皮癌および大細胞癌から選択される非小細胞肺癌であり、かつ前記腫瘍が、Ｔ７９０Ｍ ＥＧＦＲ変異、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２Ｃ、もしくはＧ１２ＶのＫＲＡＳ変異、およびＱ６１Ｒ ＫＲＡＳ変異のうちの１つまたは複数を含む腫瘍細胞をさらに含む、請求項９５に記載の医薬組成物。

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