JP2015128376A - グリセロールを原料としたメタン発酵を迅速に立ち上げる方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】反復バッチのメタン発酵の馴養段階における基質の種類の変化（醸造廃水からグリセロールへの変化）と関連した、経時的な真正細菌叢と古細菌叢のシフトを解明し、グリセロールを原料としたメタン発酵槽を迅速に立ち上げる方法を提供することを目的とする。
【解決手段】本発明は、有機性廃棄物のメタン発酵系においてメタン生成を開始させるまでの時間を短縮させる方法であって、特定のプライマーセットによって検出される塩基配列を含む１６Ｓ ｒＲＮＡ又は１６Ｓ ｒＤＮＡを有する、グリセロールを原料としてメタン生成を行う微生物を有機性廃棄物のメタン発酵系に供給することを含む方法を提供する。
【選択図】なし
【解決手段】本発明は、有機性廃棄物のメタン発酵系においてメタン生成を開始させるまでの時間を短縮させる方法であって、特定のプライマーセットによって検出される塩基配列を含む１６Ｓ ｒＲＮＡ又は１６Ｓ ｒＤＮＡを有する、グリセロールを原料としてメタン生成を行う微生物を有機性廃棄物のメタン発酵系に供給することを含む方法を提供する。
【選択図】なし
Description
本発明は、グリセロールを原料としたメタン発酵を迅速に立ち上げる方法に関する。より具体的には、グリセロールを原料としたメタン発酵において、メタン発酵に関与する微生物をメタン発酵槽に供給することを含む、メタン発酵を早期に開始させるための方法に関する。
将来の石油燃料の枯渇に対処するために、新しいエネルギー供給源として、バイオガス、バイオエタノール、及びバイオディーゼルが研究されている（非特許文献１）。バイオディーゼルは、石油系燃料に代わる魅力的な代替燃料であるため、バイオディーゼルの生産は、日本を含む多くの国において関心が高い。しかしながら、バイオディーゼル燃料の製造時には、副生成廃棄物として大量のグリセロールが生じるため、廃グリセロールの適切な処分が急務とされる。
これまでも、バイオディーゼル製造時に生じるグリセロール又はグリセロールを含む廃水を用いてメタン発酵を試みた報告例はある（非特許文献２〜５）。非特許文献２では、グリセロールを含む廃水を酸で前処理することによって、廃水の生分解性及びメタン収率をそれぞれ１００％及び０．３０６ｍ３ ＣＨ４／ｋｇグリセロールにできることを報告している。非特許文献３では、グリセロールとブタ糞尿を混合することで基質のＣ／Ｎバランスが調整され、嫌気性消化過程における遊離アンモニアの生成量を減らすことができるため、高い有機物負荷量での運転が可能であることを明らかにした。さらに、該文献ではグリセロールを基質としたメタン発酵における微生物叢が調べられている。非特許文献４では、グリセロールを含有する合成廃棄物を５５℃にて固定床嫌気性発酵槽を用いて処理し、メタノバクテリウム属種（Methanobacterium sp.）及びメタノサルシナ属種（Methanosarcina sp.）が支配的な古細菌であり、クロストリジウム属種（Clostridium sp.）、デスルホトマクル属種（Desulfotomaculum sp.）及びルミノコッカス（Ruminococcus sp.）が支配的な細菌であることを明らかにしている。非特許文献５は、バイオディーゼル製造時に副生する廃グリセロールを含む廃水の嫌気的な水素生成プロセスとメタン生成プロセスにおける真正細菌叢と古細菌叢を調べ、これらの真正細菌及び古細菌の中には、発酵条件下で安定に維持されるものがあることを示した。しかしながら、グリセロールのメタン発酵の馴養段階において、微生物叢の動的変化を調べた報告例はない。
安定な嫌気性消化を達成させるには長期の馴養時間を必要とし、発酵槽中の異なる微生物群の活性のバランスは、この経過時間中に確立される（非特許文献６〜８）。したがって、安定に稼働しているメタン発酵槽から得た種汚泥の供給は、基質の種類がそれまでのメタン発酵槽と新規のメタン発酵槽との間で相違するとしても、新規発酵槽の立ち上げにしばしば行われている。種類が異なる基質を処理している発酵槽に種汚泥を導入する場合、微生物叢が、それまでの基質から新しい基質への馴養段階の進行に伴って変化することがある。初期の種汚泥中の微生物叢と馴養後の微生物叢を比較した報告例もある（非特許文献９〜１１）。非特許文献９は、乳加工廃水の嫌気性消化槽に、都市廃水を処理する嫌気性消化槽から得た汚泥を種汚泥として導入後、全真正細菌と全古細菌の菌体濃度の変化を明らかにした。非特許文献１０では、都市下水由来の種汚泥を導入することによって、いくつかの異なる種類の廃水を処理する嫌気性消化槽におけるメタン生成細菌叢の分析を行っている。上記２つの研究では、メタン発酵がバッチ操作によって行われたため、消化槽の基質濃度が発酵の進行とともに変化しており、微生物叢の違いが基質の種類の違いによって引き起こされたものか、基質の濃度が変化したためなのかはっきりしない。また、非特許文献１１は、異なる種類の基質を処理するメタン発酵槽にグラニュール汚泥を導入することによって、微生物叢の変化を調べている。ここでは、ジャム及びゼリー製造時の廃水を処理する上向流嫌気性汚泥床法（ＵＡＳＢ）に由来する汚泥（グラニュールＳ）を、高濃度のスターチ及び脂質廃水を処理する第二の嫌気性リアクター用の種汚泥として用い、この第二の嫌気性リアクターで得られた汚泥（グラニュールＮ）を引き続いてチーズ製造会社からの廃水を処理するための種汚泥として用いており、最終的に得られた汚泥をグラニュールＢとしている。結果として、特定の原料に対応する固有の微生物叢が観察された。グラニュールＳにおいては、プロテオバクテリア（Proteobacteria）及びフィルミクテス（Firicutes）に属する真正細菌が最も優勢であり（８５％）、一方、未分類の細菌は全体の６％にすぎなかった。グラニュールＮでは、プロテオバクテリア、フィルミクテス及び未分類の細菌が、それぞれ全体の３分の１を占めた。なお、グラニュールＢにおける主な真正細菌は、未分類のクロロフレクサス（４７％）又は未分類の細菌（２８％）のいずれかに分類された。
これまで、従来の研究者らの報告においては、新しい基質を用いたメタン発酵の初期及び最終の基質馴養段階で回収した試料中の微生物叢を比較しているが、この新しい基質に対する馴養段階における微生物叢の経時的な変化は調べられていない。また、馴養段階において消長する真正細菌と古細菌のメンバーに言及している研究は非常に限定的である。
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本発明は、反復バッチのメタン発酵の馴養段階における基質の種類の変化（醸造廃水からグリセロールへの変化）と関連した、経時的な真正細菌叢と古細菌叢のシフトを解明し、グリセロールを原料としたメタン発酵槽を迅速に立ち上げる方法、及び該方法において使用する微生物を含む組成物を提供することを目的とする。
本発明者らは、汚泥中に増殖し、グリセロールを分解してメタン生成に寄与する菌を特定することに成功し、さらに、このようなメタン生成に寄与する菌を用いることによって、グリセロールを原料としたメタン発酵の迅速な立ち上げを行うことができることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、以下の通りである。
［１］有機性廃棄物のメタン発酵系においてメタン生成を開始させるまでの時間を短縮させる方法であって、下記のプライマーセット：
（１）プライマーセット１
（ａ）配列番号１に示される塩基配列又はこれと実質的に同一の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、及び
（ｂ）配列番号２に示される塩基配列又はこれと実質的に同一の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
（２）プライマーセット２
（ｃ）配列番号３に示される塩基配列又はこれと実質的に同一の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、及び
（ｄ）配列番号４に示される塩基配列又はこれと実質的に同一の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；及び／又は
（３）プライマーセット３
（ｅ）配列番号５に示される塩基配列又はこれと実質的に同一の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、及び
（ｆ）配列番号６に示される塩基配列又はこれと実質的に同一の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
によって検出される塩基配列を含む１６Ｓ ｒＲＮＡ又は１６Ｓ ｒＤＮＡを有する、グリセロールを原料としてメタン生成を行う微生物を有機性廃棄物のメタン発酵系に供給することを含む方法。
［２］前記プライマーセット１によって検出させる微生物が真正細菌であって、配列番号７、８、又は９に示される塩基配列を含む、上記［１］に記載の方法。
［３］前記真正細菌がトリココッカス属種（Trichococcus sp.）である、上記［２］に記載の方法。
［４］前記プライマーセット２によって検出させる微生物が古細菌であって、配列番号１０に示される塩基配列を含む、上記［１］に記載の方法。
［５］前記古細菌がメタノバクテリウム属種（Methanobacterium sp.）である、上記［４］に記載の方法。
［６］前記プライマーセット３によって検出させる微生物が古細菌であって、配列番号１１に示される塩基配列を含む、上記［１］に記載の方法。
［７］前記古細菌がメタノスピリルム属種（Methanospirillum sp.）である、上記［６］に記載の方法。
［８］有機性廃棄物が、食品廃棄物、糞尿、動植物残さ、古紙、及び汚泥からなる群から選択される、上記［１］〜［７］に記載の方法。
［９］前記馴養期間が０〜２０日である、上記［１］〜［８］に記載の方法。
［１０］有機性廃棄物のメタン発酵系においてメタン生成を開始するまでの時間を短縮させるために使用される組成物であって、下記のプライマーセット：
（１）プライマーセット１
（ａ）配列番号１に示される塩基配列又はこれと実質的に同一の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、及び
（ｂ）配列番号２に示される塩基配列又はこれと実質的に同一の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
（２）プライマーセット２
（ｃ）配列番号３に示される塩基配列又はこれと実質的に同一の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、及び
（ｄ）配列番号４に示される塩基配列又はこれと実質的に同一の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；及び／又は
（３）プライマーセット３
（ｅ）配列番号５に示される塩基配列又はこれと実質的に同一の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、及び
（ｆ）配列番号６に示される塩基配列又はこれと実質的に同一の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
によって検出される塩基配列を有する微生物を含む組成物。
［１］有機性廃棄物のメタン発酵系においてメタン生成を開始させるまでの時間を短縮させる方法であって、下記のプライマーセット：
（１）プライマーセット１
（ａ）配列番号１に示される塩基配列又はこれと実質的に同一の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、及び
（ｂ）配列番号２に示される塩基配列又はこれと実質的に同一の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
（２）プライマーセット２
（ｃ）配列番号３に示される塩基配列又はこれと実質的に同一の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、及び
（ｄ）配列番号４に示される塩基配列又はこれと実質的に同一の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；及び／又は
（３）プライマーセット３
（ｅ）配列番号５に示される塩基配列又はこれと実質的に同一の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、及び
（ｆ）配列番号６に示される塩基配列又はこれと実質的に同一の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
によって検出される塩基配列を含む１６Ｓ ｒＲＮＡ又は１６Ｓ ｒＤＮＡを有する、グリセロールを原料としてメタン生成を行う微生物を有機性廃棄物のメタン発酵系に供給することを含む方法。
［２］前記プライマーセット１によって検出させる微生物が真正細菌であって、配列番号７、８、又は９に示される塩基配列を含む、上記［１］に記載の方法。
［３］前記真正細菌がトリココッカス属種（Trichococcus sp.）である、上記［２］に記載の方法。
［４］前記プライマーセット２によって検出させる微生物が古細菌であって、配列番号１０に示される塩基配列を含む、上記［１］に記載の方法。
［５］前記古細菌がメタノバクテリウム属種（Methanobacterium sp.）である、上記［４］に記載の方法。
［６］前記プライマーセット３によって検出させる微生物が古細菌であって、配列番号１１に示される塩基配列を含む、上記［１］に記載の方法。
［７］前記古細菌がメタノスピリルム属種（Methanospirillum sp.）である、上記［６］に記載の方法。
［８］有機性廃棄物が、食品廃棄物、糞尿、動植物残さ、古紙、及び汚泥からなる群から選択される、上記［１］〜［７］に記載の方法。
［９］前記馴養期間が０〜２０日である、上記［１］〜［８］に記載の方法。
［１０］有機性廃棄物のメタン発酵系においてメタン生成を開始するまでの時間を短縮させるために使用される組成物であって、下記のプライマーセット：
（１）プライマーセット１
（ａ）配列番号１に示される塩基配列又はこれと実質的に同一の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、及び
（ｂ）配列番号２に示される塩基配列又はこれと実質的に同一の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
（２）プライマーセット２
（ｃ）配列番号３に示される塩基配列又はこれと実質的に同一の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、及び
（ｄ）配列番号４に示される塩基配列又はこれと実質的に同一の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；及び／又は
（３）プライマーセット３
（ｅ）配列番号５に示される塩基配列又はこれと実質的に同一の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、及び
（ｆ）配列番号６に示される塩基配列又はこれと実質的に同一の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
によって検出される塩基配列を有する微生物を含む組成物。
本発明によれば、グリセロールを原料としたメタン発酵に関与する微生物を用いた微生物を供給することで、グリセロールを原料としたメタン発酵の早期開始が可能となる。
以下、本発明の説明のために、好ましい実施形態に関して詳述する。
前述の通り、本発明は、有機性廃棄物のメタン発酵系においてメタン生成を開始するまでの時間を短縮させる方法であって、下記のプライマーセット：
（１）プライマーセット１
（ａ）配列番号１に示される塩基配列又はこれと実質的に同一の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、及び
（ｂ）配列番号２に示される塩基配列又はこれと実質的に同一の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
（２）プライマーセット２
（ｃ）配列番号３に示される塩基配列又はこれと実質的に同一の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、及び
（ｄ）配列番号４に示される塩基配列又はこれと実質的に同一の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；及び／又は
（３）プライマーセット３
（ｅ）配列番号５に示される塩基配列又はこれと実質的に同一の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、及び
（ｆ）配列番号６に示される塩基配列又はこれと実質的に同一の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
によって検出される塩基配列を有する、グリセロールを原料としてメタン生成を行う微生物を有機性廃棄物のメタン発酵系に添加することを含む方法に関する。
前述の通り、本発明は、有機性廃棄物のメタン発酵系においてメタン生成を開始するまでの時間を短縮させる方法であって、下記のプライマーセット：
（１）プライマーセット１
（ａ）配列番号１に示される塩基配列又はこれと実質的に同一の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、及び
（ｂ）配列番号２に示される塩基配列又はこれと実質的に同一の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
（２）プライマーセット２
（ｃ）配列番号３に示される塩基配列又はこれと実質的に同一の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、及び
（ｄ）配列番号４に示される塩基配列又はこれと実質的に同一の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；及び／又は
（３）プライマーセット３
（ｅ）配列番号５に示される塩基配列又はこれと実質的に同一の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、及び
（ｆ）配列番号６に示される塩基配列又はこれと実質的に同一の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
によって検出される塩基配列を有する、グリセロールを原料としてメタン生成を行う微生物を有機性廃棄物のメタン発酵系に添加することを含む方法に関する。
１．グリセロールを原料としたメタン生成に関与する微生物の特定
（１）グリセロールへの馴養
一般に、メタン発酵の開始時、すなわち、メタン発酵槽の新規立ち上げ時には、原料（基質）となる有機性廃棄物の供給量（有機物負荷）を段階的に増加させて供給することによって、メタン生成菌を原料に馴染ませる馴養の方法が行われている。これは、いきなり高濃度の新しい基質を供給するとメタン発酵の微生物がその基質を利用することができないためである。段階的に基質を増加させる方法は優れた方法ではあるが、高濃度の基質を供給しても、微生物が高い活性を維持し、メタン発酵が完全に行われるまでには長い期間（馴養期間）を要し、メタン発酵槽の新規立ち上げ時に時間的制約を受けることが問題となっている。本発明者らは、有機性廃棄物であるグリセロールを原料として供給した場合に、グリセロールによる馴養期間の前後において、発酵槽内における微生物叢の変化から、グリセロールを原料としてメタンを生成する活性の高い微生物を特定することに成功し、該微生物をメタン発酵槽の新規立ち上げ時に添加することによって、上記馴養期間を顕著に短縮できることを見出し、本発明を完成するに至った。なお、グリセロールを炭素源としてメタン生成を行う微生物の特定において、上記の通り、発酵槽におけるグリセロール濃度を段階的に高めたが、この段階的なグリセロール濃度の増加は、例えば、０〜６０日の間、０ｍｏｌ／Ｌから開始して０．０８９ｍｏｌ／Ｌに達するように適宜調整することができる（実施例１参照）。なお、この馴養期間中は、炭素源濃度を一定にするために、グリセロール以外の炭素源としてグルコース、酢酸、乳酸等を添加し、グリセロール濃度の段階的な増加に伴って、他の炭素源の濃度を段階的に減少させている。
（１）グリセロールへの馴養
一般に、メタン発酵の開始時、すなわち、メタン発酵槽の新規立ち上げ時には、原料（基質）となる有機性廃棄物の供給量（有機物負荷）を段階的に増加させて供給することによって、メタン生成菌を原料に馴染ませる馴養の方法が行われている。これは、いきなり高濃度の新しい基質を供給するとメタン発酵の微生物がその基質を利用することができないためである。段階的に基質を増加させる方法は優れた方法ではあるが、高濃度の基質を供給しても、微生物が高い活性を維持し、メタン発酵が完全に行われるまでには長い期間（馴養期間）を要し、メタン発酵槽の新規立ち上げ時に時間的制約を受けることが問題となっている。本発明者らは、有機性廃棄物であるグリセロールを原料として供給した場合に、グリセロールによる馴養期間の前後において、発酵槽内における微生物叢の変化から、グリセロールを原料としてメタンを生成する活性の高い微生物を特定することに成功し、該微生物をメタン発酵槽の新規立ち上げ時に添加することによって、上記馴養期間を顕著に短縮できることを見出し、本発明を完成するに至った。なお、グリセロールを炭素源としてメタン生成を行う微生物の特定において、上記の通り、発酵槽におけるグリセロール濃度を段階的に高めたが、この段階的なグリセロール濃度の増加は、例えば、０〜６０日の間、０ｍｏｌ／Ｌから開始して０．０８９ｍｏｌ／Ｌに達するように適宜調整することができる（実施例１参照）。なお、この馴養期間中は、炭素源濃度を一定にするために、グリセロール以外の炭素源としてグルコース、酢酸、乳酸等を添加し、グリセロール濃度の段階的な増加に伴って、他の炭素源の濃度を段階的に減少させている。
（２）グリセロールを炭素源とする真正細菌及び古細菌の特定
本発明者らは、グリセロールによる馴養期間の前後における微生物叢の変化、すなわち、馴養期間中からその期間後において発酵槽中で増加するグリセロールを炭素源としてメタン生成を行う真正細菌（３種）及び古細菌（３種）を特定することができた。本発明によれば、馴養期間を短縮させるために使用可能な真正細菌は、トリココッカス属種（Trichococcus sp.）であり、種名が特定されていない菌種の真正細菌であって、固有の１６Ｓ ｒＲＮＡ（又は１６Ｓ ｒＤＮＡ）を有する。本明細書においては、上記３種の真正細菌は、１６Ｓ ｒＲＮＡの部分塩基配列のバンドに因んで、それぞれ「バンドＢ７」、「バンドＢ８」、及び「バンドＢ１０」として命名された。バンドＢ７及びＢ８は、近縁のトリココッカス属種（Trichococcus sp.）（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＦＪ３７４７６９）の１６Ｓ ｒＲＮＡ（又は１６Ｓ ｒＤＮＡ）の部分塩基配列（配列番号１２）の情報を利用することにより特定された（実施例１参照）。また、バンドＢ１０は、近縁のトリココッカス・コリンシ（Trichococcus collinsii）（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＥＵ４３４５３６）の部分塩基配列（配列番号１３）の情報を利用することにより特定された（実施例１参照）。
本発明者らは、グリセロールによる馴養期間の前後における微生物叢の変化、すなわち、馴養期間中からその期間後において発酵槽中で増加するグリセロールを炭素源としてメタン生成を行う真正細菌（３種）及び古細菌（３種）を特定することができた。本発明によれば、馴養期間を短縮させるために使用可能な真正細菌は、トリココッカス属種（Trichococcus sp.）であり、種名が特定されていない菌種の真正細菌であって、固有の１６Ｓ ｒＲＮＡ（又は１６Ｓ ｒＤＮＡ）を有する。本明細書においては、上記３種の真正細菌は、１６Ｓ ｒＲＮＡの部分塩基配列のバンドに因んで、それぞれ「バンドＢ７」、「バンドＢ８」、及び「バンドＢ１０」として命名された。バンドＢ７及びＢ８は、近縁のトリココッカス属種（Trichococcus sp.）（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＦＪ３７４７６９）の１６Ｓ ｒＲＮＡ（又は１６Ｓ ｒＤＮＡ）の部分塩基配列（配列番号１２）の情報を利用することにより特定された（実施例１参照）。また、バンドＢ１０は、近縁のトリココッカス・コリンシ（Trichococcus collinsii）（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＥＵ４３４５３６）の部分塩基配列（配列番号１３）の情報を利用することにより特定された（実施例１参照）。
一方、本発明によれば、馴養期間を短縮させるために使用可能な古細菌は、メタノバクテリウム属種（Methanobacterium sp.）に含まれる種名が特定されていない菌種の古細菌、及びメタノスピリリウム・フンガテイ（Methanospirillum hungatei）に類縁の古細菌であり、固有の１６Ｓ ｒＲＮＡ（又は１６Ｓ ｒＤＮＡ）を有する。本明細書においては、上記３種の古細菌は、後述するように、１６Ｓ ｒＲＮＡの部分塩基配列のバンドに因んで、それぞれ「バンドＡ８」、「バンドＡ９」、及び「バンドＡ１３」として命名された。バンドＡ８及びＡ９は、近縁のメタノバクテリウム・カナギエンセ（Methanobacterium kanagiense）（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＢ３６８９１７）の１６Ｓ ｒＲＮＡ（又は１６Ｓ ｒＤＮＡ）の部分塩基配列（配列番号１４）の情報を利用することにより特定された（実施例１参照）。また、バンドＡ１３は、近縁のメタノスピリリウム・フンガテイ（Methanospirillum hungatei）（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＪＱ３４６７４７）の部分塩基配列（配列番号１５）の情報を利用することにより特定された（実施例１参照）。
本発明において使用されるバンドＢ７、Ｂ８、及びＢ１０の真正細菌、並びにＡ８、Ａ９、及びＡ１３の古細菌の特定は、例えば、以下のようにして行うことができる。簡単には、真正細菌及び古細菌から核酸を抽出後、ＰＣＲで増幅して、変性剤の濃度勾配を有するアクリルアミドゲルにより核酸断片を篩い分ける方法で分離し、特定のバンドを切り出す方法等の常法に従って核酸を単離することができる。メタン発酵に関与する真正細菌及び古細菌は複数種含まれるため、最初に特定の真正細菌及び古細菌における固有の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を特定することが必要である。まず、上記馴養にて使用されたメタン発酵槽に含まれる微生物叢の１６Ｓ ｒＲＮＡをＰＣＲ−ＤＧＧＥ法によって分離及び検出する。具体的には、メタン発酵槽内の溶液をサンプリングし、微生物を遠心分離によって回収した後、溶菌し、微生物に含まれるタンパク質及び脂質をクロロホルムの添加によって抽出・除去する。続いて、エタノールの添加により核酸のみを回収する。
その後、真正細菌由来のＤＮＡを検出するために汎用されている以下のプライマーセット（以下、「プライマーセットＡ」と称する場合がある。）：
３５７ｆ（フォワード）：５’−ＣＧＣＣＣＧＣＣＧＣＧＣＧＣＧＧＣＧＧＧＣＧＧＧＧＣＧＧＧＧＧＣＡＣＧＧＧＧＧＧＣＣＴＡＣＧＧＧＡＧＧＣＡＧＣＡＧ−３’（配列番号１７ （下線部はＧＣクランプの配列である）（ヌクレオチド４１−５７は、配列番号１６（大腸菌の１６Ｓ ｒＲＮＡ）のヌクレオチド３４１−３５７に対応する）、及び
５１８ｒ（リバース）：５’−ＡＴＴＡＣＣＧＣＧＧＣＴＧＣＴＧＧ−３’（配列番号１８）（配列番号１６（大腸菌の１６Ｓ ｒＲＮＡ）のヌクレオチド５３４−５１８に対応する）
を用いて、該核酸をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法により増幅する。なお、上記プライマーセットＡは、真正細菌の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子に結合するとされるユニバーサルプライマーであって、従前の文献（Ｕｅｎｏ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，５７，６５−７３（２００１））に基づいて作製した。
３５７ｆ（フォワード）：５’−ＣＧＣＣＣＧＣＣＧＣＧＣＧＣＧＧＣＧＧＧＣＧＧＧＧＣＧＧＧＧＧＣＡＣＧＧＧＧＧＧＣＣＴＡＣＧＧＧＡＧＧＣＡＧＣＡＧ−３’（配列番号１７ （下線部はＧＣクランプの配列である）（ヌクレオチド４１−５７は、配列番号１６（大腸菌の１６Ｓ ｒＲＮＡ）のヌクレオチド３４１−３５７に対応する）、及び
５１８ｒ（リバース）：５’−ＡＴＴＡＣＣＧＣＧＧＣＴＧＣＴＧＧ−３’（配列番号１８）（配列番号１６（大腸菌の１６Ｓ ｒＲＮＡ）のヌクレオチド５３４−５１８に対応する）
を用いて、該核酸をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法により増幅する。なお、上記プライマーセットＡは、真正細菌の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子に結合するとされるユニバーサルプライマーであって、従前の文献（Ｕｅｎｏ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，５７，６５−７３（２００１））に基づいて作製した。
一方、古細菌由来のＤＮＡを検出するために汎用されている以下のプライマーセット（以下、「プライマーセットＢ」、「プライマーセットＣ」と称する場合がある。）：
プライマーセットＢ：
ＰＲＡ４６ｆ（フォワード）：５’−（Ｃ／Ｔ）ＴＡＡＧＣＣＡＴＧＣ（Ｇ／Ａ）ＡＧＴ−３’（配列番号１９）（大腸菌の１６Ｓ ｒＲＮＡのヌクレオチド４６−６０に対応）からなる）、及び
ＰＲＥＡ１１００ｒ（リバース）：５’−（Ｔ／Ｃ）ＧＧＧＴＣＴＣＧＣＴＣＧＴＴ（Ｇ／Ａ）ＣＣ−３’（配列番号２０）（大腸菌の１６Ｓ ｒＲＮＡのヌクレオチド１１１７−１１００に対応）；並びに
プライマーセットＣ：
ＰＡＲＣＨ３４０ｆ（フォワード）：５’−ＣＧＣＣＣＧＣＣＧＣＧＣＧＣＧＧＣＧＧＧＣＧＧＧＧＣＧＧＧＧＧＣＡＣＧＧＧＧＧＧＣＣＣＴＡＣＧＧＧＧ（Ｃ／Ｔ）ＧＣＡ（Ｇ／Ｃ）ＣＡＧ−３’ （配列番号２１）（下線部はＧＣクランプの配列である）（ヌクレオチド４１−５８は大腸菌の１６Ｓ ｒＲＮＡのヌクレオチド３４０−３５７に対応）、及び
ＰＡＲＣＨ５１９ｒ（リバース）：５’−ＴＴＡＣＣＧＣＧＧＣ（Ｇ／Ｔ）ＧＣＴＧ−３’ （配列番号２２）（大腸菌の１６Ｓ ｒＲＮＡのヌクレオチド５３３−５１０に対応）
を用いて、該核酸をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法により増幅する。なお、上記プライマーセットＢとＣは、外側のプライマーと内側のプライマーを使って２段階のＰＣＲを行うネスティッドＰＣＲのために使用した。上記プライマーセットＢとＣは、古細菌の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子に結合するとされるユニバーサルプライマーであって、従前の文献（Ｏｖｒｅａｓ，Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６３，３３６７−３３７３（１９９７））に記載されている。
プライマーセットＢ：
ＰＲＡ４６ｆ（フォワード）：５’−（Ｃ／Ｔ）ＴＡＡＧＣＣＡＴＧＣ（Ｇ／Ａ）ＡＧＴ−３’（配列番号１９）（大腸菌の１６Ｓ ｒＲＮＡのヌクレオチド４６−６０に対応）からなる）、及び
ＰＲＥＡ１１００ｒ（リバース）：５’−（Ｔ／Ｃ）ＧＧＧＴＣＴＣＧＣＴＣＧＴＴ（Ｇ／Ａ）ＣＣ−３’（配列番号２０）（大腸菌の１６Ｓ ｒＲＮＡのヌクレオチド１１１７−１１００に対応）；並びに
プライマーセットＣ：
ＰＡＲＣＨ３４０ｆ（フォワード）：５’−ＣＧＣＣＣＧＣＣＧＣＧＣＧＣＧＧＣＧＧＧＣＧＧＧＧＣＧＧＧＧＧＣＡＣＧＧＧＧＧＧＣＣＣＴＡＣＧＧＧＧ（Ｃ／Ｔ）ＧＣＡ（Ｇ／Ｃ）ＣＡＧ−３’ （配列番号２１）（下線部はＧＣクランプの配列である）（ヌクレオチド４１−５８は大腸菌の１６Ｓ ｒＲＮＡのヌクレオチド３４０−３５７に対応）、及び
ＰＡＲＣＨ５１９ｒ（リバース）：５’−ＴＴＡＣＣＧＣＧＧＣ（Ｇ／Ｔ）ＧＣＴＧ−３’ （配列番号２２）（大腸菌の１６Ｓ ｒＲＮＡのヌクレオチド５３３−５１０に対応）
を用いて、該核酸をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法により増幅する。なお、上記プライマーセットＢとＣは、外側のプライマーと内側のプライマーを使って２段階のＰＣＲを行うネスティッドＰＣＲのために使用した。上記プライマーセットＢとＣは、古細菌の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子に結合するとされるユニバーサルプライマーであって、従前の文献（Ｏｖｒｅａｓ，Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６３，３３６７−３３７３（１９９７））に記載されている。
核酸を増幅するための方法としては、ＰＣＲ法（Ｓａｉｋｉ Ｒ．Ｋ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３０，１３５０−１３５４（１９８５））に限定されず、当業者であれば、ライゲース連鎖反応（ＬＣＲ）（Ｗｕ Ｄ．Ｙ．ら，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，４，５６０−５６９（１９８９））、及び転写に基づく増幅（Ｋｗｏｈ Ｄ．Ｙ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６，１１７３−１１７７（１９８９））等の温度循環を必要とする反応、並びに鎖置換反応（ＳＤＡ）（Ｗａｌｋｅｒ Ｇ．Ｔ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９，３９２−３９６（１９９２）； Ｗａｌｋｅｒ Ｇ．Ｔ．ら，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２０，１６９１−１６９６（１９９２））等を用いることができることは容易に理解される。なお、本発明の方法においては、簡便であるという利点を考えて、ＰＣＲ法を利用することが好ましい。
次に、上記で核酸を増幅させたＰＣＲ増幅産物をポリアクリルアミドゲルで電気泳動することによって分離する。電気泳動によるＰＣＲ増幅産物の分離は常法に従って容易に行うことができる。電気泳動で使用するゲルは、核酸を変性させるための変性剤を含み、核酸の分離に適した所定の濃度勾配を有するポリアクリルアミドゲルであることが好ましい。また、電気泳動に使用される泳動溶液及び電圧等の泳動条件は適宜調整することができる。上記のＰＣＲ−ＤＧＧＥ法を使用することにより、各真正細菌及び各古細菌に該当する核酸のバンドの濃淡から、可視的に真正細菌及び古細菌の経時的な増減をモニタリングすることができる。ここで、ゲル上のバンドの検出は、限定されないが、エチジウムブロマイド含有溶液を用いてゲルを染色することにより行う。なお、ゲル上の１つのバンドは、１つの真正細菌又は古細菌の１６Ｓ ｒＲＮＡに対応する。
本発明の方法で使用される真正細菌及び古細菌は、グリセロールによる馴養期間中又はその期間後に出現する細菌である。したがって、上記の電気泳動上の経時的なバンドの濃淡の変化において、馴養期間中又はその期間後に出現したバンド（固有の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子に対応するＤＮＡ断片）を切り出し、塩基配列を解析することにより、グリセロールを炭素源としてメタン生成を行う真正細菌及び古細菌を特定することができる。なお、ゲルから切り出されたＤＮＡ断片には、目的以外のＤＮＡ断片が混在している可能性があるため、所望のＤＮＡ断片を得るためにさらに分離及び精製することが好ましい。一般に、ＰＣＲ産物をクローニングするために、ベクター（例えば、ｐＣＲ４、ｐＭＷ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ、ｐＤＥＬ系などのプラスミドベクター、Ｍ１３ｍｐなどのファージベクター、Ｃｈａｒｏｍｉｄ９系などのコスミドベクター）に、ＰＣＲ産物をライゲーションさせ、コンピテントセルに形質転換させる。形質転換したコンピテントセルを培養してコロニーを形成させ、塩基配列の解読のためのサンプルとする。その後、所望のＤＮＡ断片の塩基配列を決定するが、塩基配列の解読は、従来法を用いればよく、例えば、Ｓａｎｇｅｒ法、サイクルシークエンス法による自動シークエンサーを利用することができる。自動シークエンサーのシークエンス反応には、プライマーを蛍光標識したＤｙｅ ｐｒｉｍｅｒ法、ｄｄＮＴＰを蛍光標識したＤｙｅ ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ法、さらに基質のｄＮＴＰに標識したＩｎｔｅｒｎａｌ−ｌａｂｅｌ法があるが、いずれの方法でもよい。
バンドＢ７、Ｂ８、Ｂ１０、Ａ８、Ａ９、及びＡ１３のクローニングにおいては、所望のＤＮＡ断片を得るために、ＰＣＲによるＤＮＡ合成の際に付加されるデオキシアデノシン（ｄＡ）を利用したＴＡクローニング法を用いることができる。ＴＡクローニング法は、３’→５’エキソヌクレア−ゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼを利用したクローニング法であり、まず、このＤＮＡポリメラーゼを用いて得られたＰＣＲ産物の平滑末端をＴａｑＤＮＡポリメラーゼ等のｐｏｌＩ型酵素によって処理することによって、３’末端にアデニン又はチミンを付加させる。一方、ベクターにｄＴＴＰ又はｔａｑＤＮＡポリメラーゼを反応させることによってＴＡベクターを作製する。次に、上記のように処理した核酸断片とベクターをライゲーションさせて宿主細胞に形質転換し、所望のＤＮＡをクローニングする方法である。より具体的には、真正細菌については、上記でゲルから切り出されたＤＮＡ断片をまず上記のプライマーセットＡを使用し、ＰＣＲにより増幅する。次に、得られたＰＣＲ産物をＴＡクローニング用のプラスミドに組込み、このプラスミドを大腸菌に形質転換する。次に、ＰＣＲ産物が組み込まれたプラスミドによって大腸菌に形質転換されたことを確認するために、アンピシリン等の抗生物質とカラーセレクションによる選択を行う。その後、プラスミドＤＮＡを抽出し、プライマーセットＡを用いて所望のＰＣＲ産物を増幅させ、さらに、上記と同様にＤＧＧＥを行い、バンド位置を確認した後、各バンドの部分塩基配列を決定することができる。古細菌については、プライマーセットＣを用いてＰＣＲ増幅させる。真正細菌の場合と同様に、ＰＣＲ産物をクローニングし、大腸菌への形質転換を確認後、プライマーセットＣを用いて所望のＰＣＲ産物を増幅させ、ＤＧＧＥでバント位置を確認し、各バンドの部分塩基配列を決定することできる。
本明細書においては、プライマーセットＡを用いて増幅し、ゲル上で分離されたバンドＢ７、Ｂ８、及びＢ１０の部分塩基配列から、ＤＤＢＪのデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／Ｗｅｌｃｏｍｅ−ｊ．ｈｔｍｌ）を用いた相同性検索を行い、最も近縁な微生物として、バンドＢ７及びバンドＢ８についてはトリココッカス属種の株（ＦＪ３７４７６９）、バンドＢ１０についてはトリココッカス・コリンシ株（ＥＵ４３４５３６）を特定した（実施例１参照）。得られたバンドＢ７の部分塩基配列と上記トリココッカス属種の株の部分塩基配列とを比較すると、両者は一致していた。バンドＢ８の部分塩基配列については９９％一致していた。また、得られたバンドＢ１０の部分塩基配列とトリココッカス・コリンシ株の部分塩基配列とを比較すると、両者は９９％一致していた。バンドＢ７、Ｂ８、及びＢ１０の部分塩基配列は、それぞれ配列番号７、８、及び９に示される通りであった。
本明細書においては、プライマーセットＢ、引き続いてプライマーセットＣを用いて増幅し、ゲル上で分離されたバンドＡ８、Ａ９、及びＡ１３の部分塩基配列から、ＤＤＢＪのデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／Ｗｅｌｃｏｍｅ−ｊ．ｈｔｍｌ）を用いた相同性検索を行い、最も近縁な微生物として、バンドＡ８及びバンドＡ９についてはメタノバクテリウム・カナギエンセ株（ＡＢ３６８９１７）、バンドＡ１３についてはメタノスピリリウム・フンガテイ株（ＪＱ３４６７４７）と特定した（実施例１参照）。得られたバンドＡ８の部分塩基配列とメタノバクテリウム・カナギエンセ株の部分塩基配列とを比較すると、両者は一致していた。バンドＡ９の部分塩基配列についても同様であった。また、得られたバンドＡ１３の部分塩基配列とメタノスピリリウム・フンガテイ株の部分塩基配列とを比較すると、両者は一致していた。なお、プライマーセットＢ及びＣは、文献（Ｏｖｒｅａｓ，Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６３，３３６７−３３７３（１９９７））に記載されている。バンドＡ８及びＡ９の部分塩基配列は配列番号１０、並びにＡ１３の部分塩基配列は配列番号１１に示される通りであった。
２．メタン発酵の迅速立ち上げ
本発明によれば、グリセロールを原料としたメタン発酵において、メタン生成が開始するまでの時間を短縮させるための方法が提供され、具体的には、後述するプライマーセット１、２及び／又は３によって検出される塩基配列を有する微生物をメタン発酵槽に添加することを含む方法が提供される。
本発明によれば、グリセロールを原料としたメタン発酵において、メタン生成が開始するまでの時間を短縮させるための方法が提供され、具体的には、後述するプライマーセット１、２及び／又は３によって検出される塩基配列を有する微生物をメタン発酵槽に添加することを含む方法が提供される。
本明細書で使用するとき、用語「有機性廃棄物」とは、一般に、生物学的分解によって環境中に直接還元することができる廃棄物を指し、限定されないが、生ごみなどの食品廃棄物、糞尿、動植物性残さ、古紙、及び汚泥などが挙げられる。食品廃棄物には、一般廃棄物（事業系及び家庭系を問わない）及び産業廃棄物が含まれる。具体的には、食品廃棄物の例は、限定されないが、生ごみ、シロップ廃液、おから、排乳、ホエイ、コーヒーかす、茶かすなどが挙げられる。
有機性廃棄物に含まれるグリセロールを炭素源としたメタン発酵系においては、まず真正細菌がグリセロールを分解して得られる中間体の有機酸を生成し、続いて、古細菌が該有機酸を分解してメタンを生成するものと考えられる。本発明によれば、グリセロールを原料としたメタン発酵系に真正細菌及び／又は古細菌を添加することによって、メタン生成を迅速に開始することができる。このようなメタン生成を迅速に開始させるために使用される真正細菌及び／又は古細菌は、本発明の上記使用目的を達成するものであれば限定されないが、例えば、以下のプライマーセットによって検出及び／又は定量することができる塩基配列を有する微生物が挙げられる。
具体的には、
（１）プライマーセット１：
（ａ）Ｔｒｉ３５７ｆ（フォワード）：５’−ＣＴＡＣＧＧＧＡＧＧＣＡＧＣＡＧ−３’（配列番号１）に示される塩基配列（配列番号２３のヌクレオチド３３１−３４６に対応）又はこれと実質的に同一の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、及び
（ｂ）Ｔｒｉ４５９ｒ（リバース）：５’−ＣＧＡＣＴＴＧＴＴＣＴＴＣＴＣＴＧＡＣＡ−３’（配列番号２）に示される塩基配列（配列番号２３のヌクレオチド４４８−４２９に対応）又はこれと実質的に同一の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
によって検出及び／又は定量される微生物、より具体的には、バンドＢ７、Ｂ８、及び／又はＢ１０に対応する真正細菌である。
（２）プライマーセット２：
（ａ）Ｍｅｂ３９０ｆ（フォワード）：５’−ＡＡＡＣＣＴＣＣＧＣＡＡＴＧＣＧＡＧＣＡ−３’（配列番号３）に示される塩基配列（配列番号２４のヌクレオチド２５２−２７１に対応）又はこれと実質的に同一の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、及び
（ｂ）Ｍｅｂ４９５ｒ（リバース）：５’−ＧＣＣＣＡＧＣＣＣＴＴＡＴＴＣＣＴＧＡＡＧＣＴ−３’（配列番号４）に示される塩基配列（配列番号２４のヌクレオチド３５４−３３２に対応）又はこれと実質的に同一の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
によって検出及び／又は定量される微生物、より具体的には、バンドＡ８及びＡ９に対応する古細菌である。
（３）プライマーセット３：
（ａ）Ｍｅｓ３７２ｆ（フォワード）：５’−ＴＴＴＡＣＣＡＴＧＣＧＧＧＣＡＡＣＣＧＴＧＡＴ−３’（配列番号５）に示される塩基配列（配列番号２５のヌクレオチド３４５−３６７に対応）又はこれと実質的に同一の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、及び
（ｂ）Ｍｅｓ４６９ｒ（リバース）：５’−ＴＴＡＣＡＣＴＧＧＴＧＧＡＣＡＧＣＣＡＧ−３’（配列番号６）に示される塩基配列（配列番号２５のヌクレオチド４１３−３９４に対応）又はこれと実質的に同一の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
によって検出及び／又は定量される微生物、より具体的には、バンドＡ１３に対応する古細菌である。ここで、本明細書で使用するとき、語句「実質的に同一な塩基配列」とは、対応する上記プライマーの塩基配列と９０％以上、９５％以上、９８％以上、若しくは９９％以上の配列同一性を有する塩基配列、又は上記プライマーの塩基配列の塩基の複数個、好ましくは５個、より好ましくは４個、さらに好ましくは３個、さらにより好ましくは２個、最も好ましくは１個が欠失、付加及び／又は置換されている塩基配列をいう。
（１）プライマーセット１：
（ａ）Ｔｒｉ３５７ｆ（フォワード）：５’−ＣＴＡＣＧＧＧＡＧＧＣＡＧＣＡＧ−３’（配列番号１）に示される塩基配列（配列番号２３のヌクレオチド３３１−３４６に対応）又はこれと実質的に同一の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、及び
（ｂ）Ｔｒｉ４５９ｒ（リバース）：５’−ＣＧＡＣＴＴＧＴＴＣＴＴＣＴＣＴＧＡＣＡ−３’（配列番号２）に示される塩基配列（配列番号２３のヌクレオチド４４８−４２９に対応）又はこれと実質的に同一の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
によって検出及び／又は定量される微生物、より具体的には、バンドＢ７、Ｂ８、及び／又はＢ１０に対応する真正細菌である。
（２）プライマーセット２：
（ａ）Ｍｅｂ３９０ｆ（フォワード）：５’−ＡＡＡＣＣＴＣＣＧＣＡＡＴＧＣＧＡＧＣＡ−３’（配列番号３）に示される塩基配列（配列番号２４のヌクレオチド２５２−２７１に対応）又はこれと実質的に同一の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、及び
（ｂ）Ｍｅｂ４９５ｒ（リバース）：５’−ＧＣＣＣＡＧＣＣＣＴＴＡＴＴＣＣＴＧＡＡＧＣＴ−３’（配列番号４）に示される塩基配列（配列番号２４のヌクレオチド３５４−３３２に対応）又はこれと実質的に同一の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
によって検出及び／又は定量される微生物、より具体的には、バンドＡ８及びＡ９に対応する古細菌である。
（３）プライマーセット３：
（ａ）Ｍｅｓ３７２ｆ（フォワード）：５’−ＴＴＴＡＣＣＡＴＧＣＧＧＧＣＡＡＣＣＧＴＧＡＴ−３’（配列番号５）に示される塩基配列（配列番号２５のヌクレオチド３４５−３６７に対応）又はこれと実質的に同一の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、及び
（ｂ）Ｍｅｓ４６９ｒ（リバース）：５’−ＴＴＡＣＡＣＴＧＧＴＧＧＡＣＡＧＣＣＡＧ−３’（配列番号６）に示される塩基配列（配列番号２５のヌクレオチド４１３−３９４に対応）又はこれと実質的に同一の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
によって検出及び／又は定量される微生物、より具体的には、バンドＡ１３に対応する古細菌である。ここで、本明細書で使用するとき、語句「実質的に同一な塩基配列」とは、対応する上記プライマーの塩基配列と９０％以上、９５％以上、９８％以上、若しくは９９％以上の配列同一性を有する塩基配列、又は上記プライマーの塩基配列の塩基の複数個、好ましくは５個、より好ましくは４個、さらに好ましくは３個、さらにより好ましくは２個、最も好ましくは１個が欠失、付加及び／又は置換されている塩基配列をいう。
プライマーの設計は以下の通りである。上述した通り、プライマーセットＡを用いて決定されたバンドＢ７、Ｂ８、及びＢ１０の部分塩基配列から、これらは、トリココッカス・パタゴニエンシス（Ｔｒｉｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｐａｔａｇｏｎｉｅｎｓｉｓ）株ＰＭａｇＧ１（ＮＲ ０４１８４１）に近縁していた（図１参照）。一方、プライマーセットＢ、続くプライマーセットＣを用いて決定されたバンドＡ８、Ａ９、及びＡ１３の部分塩基配列から、バンドＡ８及びバンドＡ９はメタノバクテリウム・アアルセンセ（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａａｒｈｕｓｅｎｓｅ）株Ｈ２−ＬＲ（ＮＲ＿０４２８９５）、バンドＡ１３はメタノスピリリウム・フンガテイ株（ＮＲ ０７４１７７）に近縁していた（図２参照）。そこで、バンドＢ７、Ｂ８、及びＢ１０については、トリココッカス・パタゴニエンシスＰＭａｇＧ１（ＮＲ ０４１８４１）の塩基配列情報（配列番号２３）に基づいて、ＢｉｏＥｄｉｔ ｖ７．０．９ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎを用いて、トリココッカス・パタゴニエンシスＰＭａｇＧ１（ＮＲ ０４１８４１）とその他の微生物群における塩基配列の相同性を確認し、塩基配列中で保存性の低い領域を検索して、特異性の高いプライマーをＦａｓｔＰＣＲ（ＵＲＬ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｒｉｍｅｒｄｉｇｉｔａｌ．ｃｏｍ／ｆａｓｔｐｃｒ．ｈｔｍｌ）の推奨結果を参考に設計した（プライマーセット１、上述）。同様に、バンドＡ８及びＡ９については、メタノバクテリウム・アアルセンセ株Ｈ２−ＬＲ（ＮＲ＿０４２８９５）の塩基配列情報（配列番号２４）、並びにバンドＡ１３についてはメタノスピリリウム・フンガテイ（ＮＲ ０７４１７７）の塩基配列情報（配列番号２５）に基づいてプライマーを設計した（それぞれプライマーセット２及び３、上述）。なお、プライマーの設計は、一般的にいわれている以下の条件を満たすように留意した。増幅サイズは８０〜１５０塩基（増幅効率を１００％にするため）、プライマー長さは１７〜２５塩基（長過ぎるとアニーリング効率が低下する）ＧＣ含量は４０〜６０％（４５〜５５％が望ましい）とし、偏りがないように、部分的にＧＣ、ＡＴリッチができないように注意する、Ｔ／Ｃ、Ａ／Ｇが連続しないように注意する、プライマー内部での３塩基以上の相補的配列を避ける、プライマー間での３塩基以上の相補的配列を避ける、プライマー３’末端が２塩基相補する配列を避ける。プライマーの標的塩基配列への特異性を確認するため、所定のＰＣＲ反応条件下で定量的ＰＣＲ法（例えば、ＳＹＢＲグリーンを利用したリアルタイムＰＣＲ法、蛍光プローブ法、競合ＰＣＲ法）を行い、増幅曲線分析及び融解曲線分析を行って、（ｉ）バンドＢ７＋Ｂ８＋Ｂ１０に相当する微生物群、（ｉｉ）バンドＡ８＋Ａ９に相当する微生物群、及び（ｉｉｉ）バンドＡ１３に相当する微生物の濃度を定量することができる。
プライマーセット１によって特定される微生物は、グリセロールを分解して揮発性脂肪酸を生成する真正細菌であり、プライマーセット２又は３によって特定される微生物は、生成された揮発性脂肪酸を分解してメタンを生成する古細菌であると考えられる。本発明によれば、グリセロールを炭素源としたメタン発酵槽を新規に立ち上げる場合において、上記の微生物を発酵槽に添加することによって、グリセロールから中間体である揮発性脂肪酸を経てメタン生成を開始するまでの時間を短縮することができる。そこで、メタン発酵槽に添加させる微生物は、プライマーセット１〜３のいずれかによって特定される微生物であってもよく、又は特定された微生物のいずれの組み合わせであってもよい。添加に適した微生物は、典型的には、バンドＢ７に相当する真正細菌、バンドＢ８に相当する真正細菌、バンドＢ１０に相当する真正細菌、バンドＡ８に相当する古細菌、バンドＡ９に相当する古細菌、及び／又はバンドＡ１３に相当する古細菌である。また、好ましい微生物の組み合わせとしては、限定されないが、（ｉ）バンドＢ７＋Ｂ８＋Ｂ１０に相当する微生物群、（ｉｉ）バンドＡ８＋Ａ９に相当する微生物群、（ｉｉｉ）バンドＡ１３に相当する微生物、又は（ｉｖ）バンドＢ７＋Ｂ８＋Ｂ１０＋Ａ８＋Ａ９＋Ａ１３に相当する微生物群、などが挙げられる。
使用されるメタン発酵槽は、特に限定されないが、例えば、上向流嫌気性汚泥床法（ＵＡＳＢ）を用いたメタン発酵槽であってもよい。このような発酵槽に本発明の上記微生物を添加する場合、微生物を直接添加してもよく、又は微生物を含むグラニュールや微生物を適正な担体に固定した固定化微生物として添加してもよい。なお、微生物を固定化する方法は、当業者に周知であり、例えば、大即信明、中崎清彦編著「工業材料」朝倉書店（２０１３年）等に記載されている。また、発酵槽に微生物を添加する量（又は比率）は、メタン生成効率を確認しながら適宜調整することができる。例えば、発酵槽に微生物を含むグラニュールを添加する場合、グリセロールに対して馴養されていない、醸造廃液処理のＵＡＳＢリアクターから得られた汚泥中のグラニュール（多種の微生物を含む）と本発明の微生物を含むグラニュールとの比率は、限定されないが、４：１、３：１、２：１、１：１、１：２、１：３、１：４が好ましい。
後述する実施例２に記載されるように、（Ａ）醸造廃液処理のＵＡＳＢリアクターから得られた多種の微生物を含むグラニュールと本発明の微生物を含むグラニュールを添加した系、及び（Ｂ）醸造廃液処理のＵＡＳＢリアクターから得られたグラニュールのみを添加した系のそれぞれにおいてメタン生成の立ち上げ時間を測定すると、（Ａ）の系では、添加の２日後から顕著なメタン生成が確認され、一方、（Ｂ）の系では、（Ａ）の系とほぼ同様なメタン生成がおこるのは添加の１３日後からであることが判明した。このように、メタン発酵の新規立ち上げにおいて、本発明の微生物の添加が非常に有効であることが示唆された。上記（Ａ）の系の場合、馴養期間は２日前後である。したがって、本発明の微生物を用いた場合、馴養期間は０〜３日、好ましくは１〜２日である。
３．本発明の微生物を含む組成物
本発明によれば、発酵槽の新規立ち上げにおいて、本発明の微生物を含む組成物を発酵槽に添加することによって、メタン生成が開始するまでの時間を短縮することができる。使用される組成物としての形態は、特に限定されないが、液体、ペースト状、グラニュール状、固定化微生物状（包括固定化物、吸着固定化物、カプセルなど）であってもよく、好ましくはグラニュール状態である。なお、組成物には、本発明の微生物の他、微生物の生育に適した栄養素、培地等を添加してもよい。組成物中に含まれる微生物の量は、適宜変更可能である。
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されない。
本発明によれば、発酵槽の新規立ち上げにおいて、本発明の微生物を含む組成物を発酵槽に添加することによって、メタン生成が開始するまでの時間を短縮することができる。使用される組成物としての形態は、特に限定されないが、液体、ペースト状、グラニュール状、固定化微生物状（包括固定化物、吸着固定化物、カプセルなど）であってもよく、好ましくはグラニュール状態である。なお、組成物には、本発明の微生物の他、微生物の生育に適した栄養素、培地等を添加してもよい。組成物中に含まれる微生物の量は、適宜変更可能である。
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されない。
実施例１：グリセロールに対する馴養期間中のメタン生成と微生物の特定
（１）グリセロールに対する馴養
２種の基質溶液として、グルコース、酢酸ナトリウム、及び乳酸を混合した溶液とグリセロール溶液を調製し、グリセロール量を０％から１００％に段階的に増加させるようにして、上記２種の比率を変えながら発酵槽に流入させた。最初の２日を除いて、発酵全体でＣＯＤ負荷率を一定にした（２．５ｇ ＣＯＤ／Ｌ／日）。発酵槽に添加する溶液の成分及び量、並びにグリセロールの段階的な添加量及び期間は以下の表１の通りである。
（１）グリセロールに対する馴養
２種の基質溶液として、グルコース、酢酸ナトリウム、及び乳酸を混合した溶液とグリセロール溶液を調製し、グリセロール量を０％から１００％に段階的に増加させるようにして、上記２種の比率を変えながら発酵槽に流入させた。最初の２日を除いて、発酵全体でＣＯＤ負荷率を一定にした（２．５ｇ ＣＯＤ／Ｌ／日）。発酵槽に添加する溶液の成分及び量、並びにグリセロールの段階的な添加量及び期間は以下の表１の通りである。
発酵には、３Ｌ容量のＰｙｒｅｘ（登録商標）ガラス製（高さ２５０ｍｍ、径１２０ｍｍ）リアクターを使用した。実験の開始時に、醸造廃水を処理するフルスケールＵＡＳＢリアクターから得られた３００ｍＬのグラニュール汚泥を上記リアクターに添加し、表１中の溶液Ｉ（２７００ｍＬ）を添加した。毎日の反復バッチ操作において、グラニュール汚泥は２時間沈殿させ、上清７５０ｍＬを回収後、表１に記載の流入溶液を新たに７５０ｍＬ添加した。回収した７５０ｍＬの上清を物理化学的分析及び生物学的分析に供した。リアクターの内容物は、機械的に１００ｒｐｍで撹拌し、リアクターを水浴中で３９℃に維持した。生成されたバイオガスをＴｅｄｌａｒバッグに回収した。バイオガスの容積を測定し、ガスクロマトグラフィー−質量分析計（ＧＳ−ＭＳ）（CP-Polar Bond Q溶融シリカカラム（２５ｍ×０．２５ｍｍ径、フィルム厚３μｍ、Varian Instruments, CA, US）を備えたShimazu QP-5050A）を用いて、バイオガスの組成を分析した。また、揮発性脂肪酸（ＶＦＡ）濃度を測定するための液体試料を０．４５μｍのメンブレンフィルター（DISMIC-25 JP, Advantec, Osaka, Japan）で濾過し、液体試料中のＶＦＡ濃度を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）（YMC-UltraHT Pro C18カラム（AS12S02-1003WT, YMC Corporation, Kyoto, Japan)を備えたLC-2000 plus HPLC system, Jasco, Tokyo, Japan）によって測定した。
馴養期間（１０４日間）中のメタン生成速度（ｍｏｌ／日）及び有機酸濃度の測定結果を図３及び４に示す。メタン生成速度はリアクターからの排出ガス及びメタン濃度から計算した。図３に示すように、メタン生成速度は、発酵開始から１０日までに急速に増加し、発酵開始から６１日後には一定になった。また、６１日〜１０４日間におけるグリセロールからのメタンの平均濃度は約５５．３％であった。一方、脂肪酸濃度は、図４Ａ及びＢに示されるように、発酵開始時に、グリセロールよりも容易に分解される成分として、例えば、グルコース、酢酸ナトリウム、及び乳酸が、流入溶液に含まれていたため、リアクター中の全脂肪酸濃度が顕著に増加していた。しかしながら、発酵が進行し、流入溶液におけるグリセロールの比率が徐々に増加するにつれて、脂肪酸濃度は減少した。操作期間の６１日目から、リアクターは炭素源として１００％のグリセロールが供給された。全脂肪酸濃度は、０．２ｇ／Ｌ未満（酢酸、プロピオン酸、酪酸、及びイソ酪酸の総量によって計算された）であり、この濃度は実験終了まで安定していた。脂肪酸は、嫌気性消化中の真正細菌（酸生成菌）によって生成される中間体であって、さらに、古細菌（メタン生成菌）によってメタンに変換される。酸生成菌とメタン生成菌の増殖の不均衡によって、中間体（脂肪酸）の蓄積と嫌気性消化の失敗を引き起こすことが知られている。対照的に、発酵が積極的に進行している場合、脂肪酸が利用され、脂肪酸生成後直ちにメタンに変換されるため、リアクター中の脂肪酸濃度は低い値で安定する。図４Ａ及びＢの結果からも明らかなように、酸生成菌とメタン生成菌の均衡が良好に保たれていることが分かる。
（２）グリセロールを炭素源としてメタン生成に関与する微生物の特定
グリセロールを炭素源としてメタン生成に関与する微生物の特定を試みた。実験開始の０日、１７日、１９日、２８日、３７日、４５日、４９日、５５日、６１日、６７日、７７日、及び８４日目にリアクターから回収したグラニュールを含む汚泥について生物学的分析を行った。汚泥試料（３０ｍＬ）を４４，２８０×ｇにて１０分間の遠心分離によって、液体試料に含まれる汚泥を分別し、その０．３ｇ（湿重量）をＤＮＡ抽出に供した。汚泥由来のＤＮＡは、製造業者の使用説明書に従って、Ｂｅａｄｓ Ｂｅａｔｉｎｇ Ｋｉｔ用のＩＳＯＩＬ（NO. 319-06201、Nippon Gene Co., Ltd., Toyama, Japan）を用いて抽出された。抽出したＤＮＡをＰＣＲの鋳型として用いた。ＰＣＲ増幅としては、真正細菌及び古細菌の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子領域をＰＣＲ−ＤＧＧＥ分析に使用した。真正細菌用のプライマーには、ＧＣクランプを５’側に付加した３５７ｆ（フォワード）：５’−ＣＧＣＣＣＧＣＣＧＣＧＣＧＣＧＧＣＧＧＧＣＧＧＧＧＣＧＧＧＧＧＣＡＣＧＧＧＧＧＧＣＣＴＡＣＧＧＧＡＧＧＣＡＧＣＡＧ−３’（配列番号１７）、及び５１８ｒ（リバース）：５’−ＡＴＴＡＣＣＧＣＧＧＣＴＧＣＴＧＧ−３’（配列番号１８）を用いた。一方、古細菌用のプライマーとしては、ＰＲＡ４６ｆ（フォワード）：５’−（Ｃ／Ｔ）ＧＧＧＴＣＴＣＧＣＴＣＧＴＴ（Ｇ／Ａ）ＣＣ−３’（配列番号１９）、及びＰＲＥＡ１１００ｒ（リバース）：５’−（Ｔ／Ｃ）ＧＧＧＴＣＴＣＧＣＴＣＧＴＴ（Ｇ／Ａ）ＣＣ−３’（配列番号２０）；続いて、ＰＡＲＣＨ３４０ｆ（フォワード）：５’−ＣＧＣＣＣＧＣＣＧＣＧＣＧＣＧＧＣＧＧＧＣＧＧＧＧＣＧＧＧＧＧＣＡＣＧＧＧＧＧＧＣＣＣＴＡＣＧＧＧＧ（Ｃ／Ｔ）ＧＣＡ（Ｇ／Ｃ）ＣＡＧ−３’（配列番号２１）、及びＰＡＲＣＨ５１９ｒ（リバース）：５’−ＴＴＡＣＣＧＣＧＧＣ（Ｇ／Ｔ）ＧＣＴＧ−３’（配列番号２２）を用いた。ＰＣＲ増幅は、ＴａＫａＲａＥｘ Ｔａｑ（商標）ＨＳ（RR006A, Takara Bio Inc., Otsu, Japan）を用いて行った。増幅は、最終体積として５０μＬで行い、２μＬの鋳型ＤＮＡ、５μＬの１０×Ｅｘ Ｔａｑバッファー、４μＬのｄＮＴＰ Ｍｉｘ（各２．５ｍＭ）、０．５μＬの各プライマー、０．２５μＬのＴａＫａＲａＥｘ Ｔａｑ（商標）ＨＳ（５ユニット／μＬ）、及び３７．７５μＬの滅菌水を含んでいた。ＰＣＲは、以下のステップ：真正細菌については、初期変性（９４℃にて７分間）；７サイクル（９４℃にて１分間、６５℃にて１分間、及び７２℃にて２分間）；７サイクル（９４℃にて１分間、６０℃にて１分間、及び７２℃にて２分間）；２１サイクル（９４℃にて１分間、５５℃にて１分間、及び７２℃にて２分間）；並びに最終伸長（７２℃で１０分間）、古細菌については、初期変性（９５℃にて５分間）；３５サイクル（９５℃にて１分間、５３．５℃にて１分間、及び７２℃にて１分間）；最終伸長（７２℃にて６分間）を用いて行われた。
グリセロールを炭素源としてメタン生成に関与する微生物の特定を試みた。実験開始の０日、１７日、１９日、２８日、３７日、４５日、４９日、５５日、６１日、６７日、７７日、及び８４日目にリアクターから回収したグラニュールを含む汚泥について生物学的分析を行った。汚泥試料（３０ｍＬ）を４４，２８０×ｇにて１０分間の遠心分離によって、液体試料に含まれる汚泥を分別し、その０．３ｇ（湿重量）をＤＮＡ抽出に供した。汚泥由来のＤＮＡは、製造業者の使用説明書に従って、Ｂｅａｄｓ Ｂｅａｔｉｎｇ Ｋｉｔ用のＩＳＯＩＬ（NO. 319-06201、Nippon Gene Co., Ltd., Toyama, Japan）を用いて抽出された。抽出したＤＮＡをＰＣＲの鋳型として用いた。ＰＣＲ増幅としては、真正細菌及び古細菌の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子領域をＰＣＲ−ＤＧＧＥ分析に使用した。真正細菌用のプライマーには、ＧＣクランプを５’側に付加した３５７ｆ（フォワード）：５’−ＣＧＣＣＣＧＣＣＧＣＧＣＧＣＧＧＣＧＧＧＣＧＧＧＧＣＧＧＧＧＧＣＡＣＧＧＧＧＧＧＣＣＴＡＣＧＧＧＡＧＧＣＡＧＣＡＧ−３’（配列番号１７）、及び５１８ｒ（リバース）：５’−ＡＴＴＡＣＣＧＣＧＧＣＴＧＣＴＧＧ−３’（配列番号１８）を用いた。一方、古細菌用のプライマーとしては、ＰＲＡ４６ｆ（フォワード）：５’−（Ｃ／Ｔ）ＧＧＧＴＣＴＣＧＣＴＣＧＴＴ（Ｇ／Ａ）ＣＣ−３’（配列番号１９）、及びＰＲＥＡ１１００ｒ（リバース）：５’−（Ｔ／Ｃ）ＧＧＧＴＣＴＣＧＣＴＣＧＴＴ（Ｇ／Ａ）ＣＣ−３’（配列番号２０）；続いて、ＰＡＲＣＨ３４０ｆ（フォワード）：５’−ＣＧＣＣＣＧＣＣＧＣＧＣＧＣＧＧＣＧＧＧＣＧＧＧＧＣＧＧＧＧＧＣＡＣＧＧＧＧＧＧＣＣＣＴＡＣＧＧＧＧ（Ｃ／Ｔ）ＧＣＡ（Ｇ／Ｃ）ＣＡＧ−３’（配列番号２１）、及びＰＡＲＣＨ５１９ｒ（リバース）：５’−ＴＴＡＣＣＧＣＧＧＣ（Ｇ／Ｔ）ＧＣＴＧ−３’（配列番号２２）を用いた。ＰＣＲ増幅は、ＴａＫａＲａＥｘ Ｔａｑ（商標）ＨＳ（RR006A, Takara Bio Inc., Otsu, Japan）を用いて行った。増幅は、最終体積として５０μＬで行い、２μＬの鋳型ＤＮＡ、５μＬの１０×Ｅｘ Ｔａｑバッファー、４μＬのｄＮＴＰ Ｍｉｘ（各２．５ｍＭ）、０．５μＬの各プライマー、０．２５μＬのＴａＫａＲａＥｘ Ｔａｑ（商標）ＨＳ（５ユニット／μＬ）、及び３７．７５μＬの滅菌水を含んでいた。ＰＣＲは、以下のステップ：真正細菌については、初期変性（９４℃にて７分間）；７サイクル（９４℃にて１分間、６５℃にて１分間、及び７２℃にて２分間）；７サイクル（９４℃にて１分間、６０℃にて１分間、及び７２℃にて２分間）；２１サイクル（９４℃にて１分間、５５℃にて１分間、及び７２℃にて２分間）；並びに最終伸長（７２℃で１０分間）、古細菌については、初期変性（９５℃にて５分間）；３５サイクル（９５℃にて１分間、５３．５℃にて１分間、及び７２℃にて１分間）；最終伸長（７２℃にて６分間）を用いて行われた。
ＰＣＲ産物の２μＬを１．０×Ｔｒｉｓ−ホウ酸塩−ＥＤＴＡ（ＴＢＥ）アガロースゲルにおける電気泳動によって分析した。Ｄｃｏｄｅ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｍｕｔａｔｉｏｎ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Bio-Rad, Hercules, CA, USA）をＤＧＧＥ（変性勾配ゲル電気泳動）に使用した。３０％から６０％（１００％は７Ｍ尿素と４０％ｗｔ／ｖｏｌホルムアミドに対応する）の変性勾配を有するポリアクリルアミドゲル（８％ｗｔ／ｖｏｌ、３７．５：１のアクリルアミド−ビスアクリルアミド）を用いた。電気泳動は、６０℃の定温にて、１×Ｔｒｉｓ−酢酸塩−ＥＤＴＡ（ＴＡＥ）中で、３．５時間２００Ｖで行われた。電気泳動後、２０μＬのエチジウムブロミド溶液を含む１×ＴＡＥ（２００ｍＬ）中でゲルを染色し、引き続きＥｐｉ−Ｌｉｇｈｔ ＵＶ ＦＡ５００（Taitec Co., Ltd., Koshigaya, Japan）を用いて可視化し、画像をデジタル処理で捕捉した。
ＤＧＧＥゲルバンドを切り出し、滅菌水に入れ、−２０℃にて３０分間凍結させた。その後室温で融解し、ゲルからＤＮＡを抽出した。抽出したＤＮＡを含む水は、上記と同じプライマーを用いて同条件でＰＣＲを行った。ＰＣＲ増幅産物は、ＴＡクローニングキット（Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, USA）を用いて、製造業者の使用説明に従ってクローニングされ、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｘ−ｇａｌ）（9031, Takara Bio Inc., Shiga, Japan）を用い、アンピシリンを含むＬＢ培地によりスクリーニングを行った。挿入物を含むコロニー（白色コロニー）を無作為に選択し、５μＬの滅菌水に懸濁させた。懸濁させた溶液を用いてＰＣＲをおこない、キットを用いて精製後、シーケンス反応と引き続く精製を行った後、ＤＮＡシーケンサーを用いて配列を決定した。
プラスミドへのＤＮＡ断片の挿入は、以下のプライマーセット：
Ｍ１３ Ｆ（５’−ＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧ−３’）（配列番号２６）
Ｍ１３ Ｒ（５’−ＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣ−３’）（配列番号２７）
を用いたＰＣＲ増幅によって確認した。さらに、挿入された断片は、真正細菌についてはプライマーセットＡを用い、古細菌についてはプライマーセットＣを用いてＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲ産物をＤＧＧＥによって試験し、同じ位置に同一のバンドを確認した。ＰＣＲ産物は、Ｗｉｚａｒｄ ＳＶゲル及びＰＣＲ Ｃｌｅａｎ−ＵＰシステム（A9281, Promega, Madison, WI, USA）を用いて精製し、配列決定は、ＢｉｇＤｙｅキット（PerkinElmer Japan, Applied Biosystems Division）を用いて行われた。配列を遺伝子データベース（ＤＤＢＪ、ＧｅｎＢａｎｋ）において利用可能な１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子と比較した。ヌクレオチド配列の類似性に基づいて、ＭＥＧＡ３．１を用いて系統樹を構築した（図１及び２）。
Ｍ１３ Ｆ（５’−ＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧ−３’）（配列番号２６）
Ｍ１３ Ｒ（５’−ＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣ−３’）（配列番号２７）
を用いたＰＣＲ増幅によって確認した。さらに、挿入された断片は、真正細菌についてはプライマーセットＡを用い、古細菌についてはプライマーセットＣを用いてＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲ産物をＤＧＧＥによって試験し、同じ位置に同一のバンドを確認した。ＰＣＲ産物は、Ｗｉｚａｒｄ ＳＶゲル及びＰＣＲ Ｃｌｅａｎ−ＵＰシステム（A9281, Promega, Madison, WI, USA）を用いて精製し、配列決定は、ＢｉｇＤｙｅキット（PerkinElmer Japan, Applied Biosystems Division）を用いて行われた。配列を遺伝子データベース（ＤＤＢＪ、ＧｅｎＢａｎｋ）において利用可能な１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子と比較した。ヌクレオチド配列の類似性に基づいて、ＭＥＧＡ３．１を用いて系統樹を構築した（図１及び２）。
汚泥試料中の特定の真正細菌及び古細菌のＤＮＡを定量するためにリアルタイムＰＣＲを用いた。上記で抽出されたＤＮＡ溶液を鋳型として使用した。リアルタイムＰＣＲ分析のためのプライマーセットは、以下の通りである。
リアルタイムＰＣＲは、ＳｍａｒｔＣｙｃｌｅｒ ＩＩシステム（Cepheid, California, USA）及びＳＹＢＲｐｒｅｍｉｘ ＥＸ Ｔａｑ（商標）（Takara Bio Inc., Otsu, Japan）を用いて行われた。反応混合物（２５μｌ）には、ＳＹＢＲｐｒｅｍｉｘ ＥＸ Ｔａｑ（商標）、フォワードとリバースプライマー（各０．２ｍＭ）、抽出されたＤＮＡ（２μＬ）、及び滅菌水が含まれる。リアルタイムＰＣＲプログラムは、初期変性及びポリメラーゼ活性化ステップ（９５℃にて１０秒間、続く９５℃にて５秒間の変性、６０℃にて２０秒間のアニーリングと伸長ステップの４０サイクル）であった。また、検量線を作製するために、抽出されたＤＮＡを連続的に希釈し、特定の古真正細菌と古細菌の各々の種に対する各プライマーセットを用いてリアルタイムＰＣＲに供した。メタン発酵の馴養中及び馴養後の試料について特定の古真正細菌と古細菌の各々の種に対するＣｔ値を測定後、相対的なＤＮＡ濃度、すなわち相対的な菌体濃度を検量線から計算した。
（ａ）真正細菌の特定
図５Ａは、メタン発酵中の真正細菌叢の動的変化をＰＣＲ−ＤＧＧＥパターンの変化として示したものであり、図５Ｂは、ＤＧＧＥ上に出現した特徴的なバンドに対応するいくつかの真正細菌濃度の時間的な変化を表している。ＤＧＧＥ上のバンドの光強度は、各汚泥試料中のバンドに対応する真正細菌の相対的な濃度に対応している。全真正細菌の濃度がメタン発酵全体で同じであれば、特定のバンドの光強度の変化からその真正細菌の濃度の動的変化を見積もることができる。しかしながら、本研究の条件では全真正細菌の濃度が一定であるという確証がないので、本実験では、真正細菌の濃度変化は、リアルタイムＰＣＲによって直接的に決定した。リアルタイムＰＣＲは、汚泥試料から単離後、その微生物を用いた検量線を作製することによって、多種の微生物が共存したとしても、汚泥中のＤＮＡコピー数／ｇを単位として個々の微生物の菌体濃度を定量することができる。
図５Ａは、メタン発酵中の真正細菌叢の動的変化をＰＣＲ−ＤＧＧＥパターンの変化として示したものであり、図５Ｂは、ＤＧＧＥ上に出現した特徴的なバンドに対応するいくつかの真正細菌濃度の時間的な変化を表している。ＤＧＧＥ上のバンドの光強度は、各汚泥試料中のバンドに対応する真正細菌の相対的な濃度に対応している。全真正細菌の濃度がメタン発酵全体で同じであれば、特定のバンドの光強度の変化からその真正細菌の濃度の動的変化を見積もることができる。しかしながら、本研究の条件では全真正細菌の濃度が一定であるという確証がないので、本実験では、真正細菌の濃度変化は、リアルタイムＰＣＲによって直接的に決定した。リアルタイムＰＣＲは、汚泥試料から単離後、その微生物を用いた検量線を作製することによって、多種の微生物が共存したとしても、汚泥中のＤＮＡコピー数／ｇを単位として個々の微生物の菌体濃度を定量することができる。
しかしながら、注目している特徴的な真正細菌は、単離することはできなかった。したがって、注目している特徴的な真正細菌についてはその相対的な菌体濃度を計算した。汚泥試料に含まれる異なる種類の真正細菌の濃度を定量的に比較するために、各真正細菌の補正された相対濃度をリアルタイムＰＣＲで得られるＣｔ値を用いて計算した。特定の真正細菌と参照となる真正細菌の間におけるＣｔ値の差は、その真正細菌が参照となる真正細菌と同一のＤＮＡの閾値濃度に到達するまでに必要とするＰＣＲの複製回数の差に相当する。よって、各真正細菌の補正された相対濃度は、以下の式を用いて計算された。
ＲＣｉ（ｔ）は、ある時間（ｔ）におけるある特定の真正細菌ｉの補正された相対濃度を示す。Ｃｉ（ｔ）及びＣｉｍａｘは、それぞれ、ある時間ｔにおける検量線から計算されたある特定の真正細菌ｉの菌体濃度、及び発酵期間中の最大菌体濃度を表す。この計算において、参照の真正細菌は、バンドＢ７、Ｂ８及びＢ１０に対応する真正細菌（これらの細菌はすべてトリココッカス属に属し、プライマーセット１によって検出された）とした。補正された真正細菌の相対濃度を計算する基準となる参照時間Ｔは、ＤＧＧＥゲルに多数のバンドが出現した発酵４８日目とした。いくつかの真正細菌の補正された相対濃度（相対的濃度をログスケールで表す）を図５Ｂに示す。
図５Ａの結果から、醸造廃水からグルコース、酢酸ナトリウム、及び乳酸の混合物（Ｇ０溶液）に基質溶液を変化させた直後から真正細菌のＤＧＧＥパターンが変化し、約１３個の特徴的なバンドが観察された。これらのうち、バンドＢ１４、Ｂ３０、Ｂ３１、Ｂ３２、Ｂ３３、Ｂ３４、Ｂ３５、及びＢ３６はバンドの輝度が次第に減少する傾向にあり、グリセロールへの馴養段階において支配的でなくなった。これらのバンドに対応する真正細菌は、グリセロールを分解することができなかった可能性がある。リアルタイムＰＣＲ分析は、これらの真正細菌のうちの代表例であるＢ３３は、僅かに減少したが、他の共存する真正細菌であるバンドＢ７、Ｂ８、Ｂ１０、及びＢ１４は増加していたことを示す（図５Ａ）。バンドＢ７、Ｂ８、及びＢ１０は、発酵の後期段階において支配的となった。リアルタイムＰＣＲで測定したところ、これらの真正細菌濃度は、初期段階（０〜１７日）において急速に増加し、その後も高い濃度が維持されていた。バンドＢ７、Ｂ８、及びＢ１０の光強度は、１７日目から発酵の後期段階まで強くなり、これは、リアルタイムＰＣＲの結果と一致していた。バンドＢ７、Ｂ８、及びＢ１０に対応する真正細菌は、グルコース、酢酸ナトリウム、及び乳酸の混合物の基質、並びにグリセロールの両方の基質を利用することができることを示唆する。バンドＢ１４は、１８日から４８日にかけての発酵中盤において高い光強度を示し、その期間において、バンドＢ１４の相対的濃度は高かった。この結果は、バンドＢ１４の補正された相対濃度が、この期間中のいずれの他の真正細菌よりも高いという観察を裏付けるものである。結果として、ＤＧＧＥパターンにおける真正細菌の濃度変化は、リアルタイムＰＣＲによるＤＮＡ濃度の定量的測定と本質的に対応することがわかった。よって、バンドＢ９は選択的プライマーセットを設計することができなかったのでリアルタイムＰＣＲは適用されなかったが、ＰＣＲ-ＤＧＧＥパターンから、バンドＢ９に対応する真正細菌が、グリセロールへの馴養とともに増加する、と考えることができる。
表３は、ＤＧＧＥバンドに関連した真正細菌のヌクレオチド配列を示す。バンドＢ７、Ｂ８、及びＢ１０から得られたヌクレオチド配列は、ヌクレオチドＢＬＡＳＴサーチ検索から登録されているトリココッカス属のヌクレオチド配列ときわめて相同性が高いことが分かった。
（ｂ）古細菌の特定
図６Ａは、メタン発酵中の古細菌叢の動的変化をＰＣＲ−ＤＧＧＥパターンの変化として示したものであり、図６Ｂは、ＤＧＧＥ上に出現した特徴的なバンドに対応するいくつかの古細菌濃度の時間的な変化を表している。いくつかの古細菌の補正された相対濃度は、真正細菌と同様の方法を用いて決定した。この計算においては、バンドＡ８及びＡ９に対応する古細菌（これらの古細菌はメタノバクテリウム・カナギエンセに関連し、プライマーセット２によって検出された）を参照の古細菌として用いた。参照時間Ｔは、真正細菌の場合と同様に発酵の４８日目とした。バンドＡ８及びバンドＡ９に対応する古細菌は、１桁分の増加を示し、最大濃度に達した（図６Ｂ）。バンドＡ１０及びＡ１１に対応する古細菌は僅かに増加し、一方、バンドＡ１２に対応する古細菌は発酵の進行とともに減少した。バンドＡ１３に対応する古細菌の増加は、バンドＡ８及びＡ９に対応する古細菌の濃度よりも低かったが、最も顕著に現れた。補正された相対濃度におけるこれらの変化は、ＤＧＧＥプロファイルにおける各バンドの光強度の変化と一致していた。バンドＡ１２は緩やかに変化し、これは、メタン発酵中のグリセロール分解の中間化合物がバンドＡ１２に対応する古細菌の増殖に利用されていないことを示唆している。対照的に、バンドＡ８、Ａ９、Ａ１０、Ａ１１、及びＡ１３の強度は、馴養中に大幅に増加することから、グリセロール分解の中間化合物が、バンドＡ８、Ａ９、Ａ１０、Ａ１１、及びＡ１３に対応する古細菌にとって、好ましい基質であることが示唆される。
図６Ａは、メタン発酵中の古細菌叢の動的変化をＰＣＲ−ＤＧＧＥパターンの変化として示したものであり、図６Ｂは、ＤＧＧＥ上に出現した特徴的なバンドに対応するいくつかの古細菌濃度の時間的な変化を表している。いくつかの古細菌の補正された相対濃度は、真正細菌と同様の方法を用いて決定した。この計算においては、バンドＡ８及びＡ９に対応する古細菌（これらの古細菌はメタノバクテリウム・カナギエンセに関連し、プライマーセット２によって検出された）を参照の古細菌として用いた。参照時間Ｔは、真正細菌の場合と同様に発酵の４８日目とした。バンドＡ８及びバンドＡ９に対応する古細菌は、１桁分の増加を示し、最大濃度に達した（図６Ｂ）。バンドＡ１０及びＡ１１に対応する古細菌は僅かに増加し、一方、バンドＡ１２に対応する古細菌は発酵の進行とともに減少した。バンドＡ１３に対応する古細菌の増加は、バンドＡ８及びＡ９に対応する古細菌の濃度よりも低かったが、最も顕著に現れた。補正された相対濃度におけるこれらの変化は、ＤＧＧＥプロファイルにおける各バンドの光強度の変化と一致していた。バンドＡ１２は緩やかに変化し、これは、メタン発酵中のグリセロール分解の中間化合物がバンドＡ１２に対応する古細菌の増殖に利用されていないことを示唆している。対照的に、バンドＡ８、Ａ９、Ａ１０、Ａ１１、及びＡ１３の強度は、馴養中に大幅に増加することから、グリセロール分解の中間化合物が、バンドＡ８、Ａ９、Ａ１０、Ａ１１、及びＡ１３に対応する古細菌にとって、好ましい基質であることが示唆される。
表４は、ＤＧＧＥバンドに関連した古細菌のヌクレオチド配列を示す。バンドＡ８及びＡ９は、メタノバクテリウム・カナギエンセに密接に関連していた。この古細菌は、唯一のエネルギー源及び炭素源として水素と二酸化炭素を用いて増殖し、増殖に最適な条件は、ｐＨ＝７．７〜８．５、４０℃であることが知られており、これは本メタン発酵の条件と一致している。好ましい温度及びｐＨは実験全体で維持されたが、バンドＡ８及びＡ９は、メタン発酵期間の中期から後期の段階においてのみ支配的であった。したがって、これらの古細菌の増殖をさらに促すためにグリセロールの分解中間体として供給される炭素源は重要な因子であることが想定される。バンドＡ１０及びＡ１１のヌクレオチド配列は、未分類のこれまで培養できていない古細菌の遺伝子に密接に関連していた。バンドＡ１２は、未分類の古細菌の嫌気性メタン生成古細菌に密接に関連していた。バンドＡ１３は、メタノスピリリウム・フンガテイに密接に関連していた。このメタン生成菌は、最適な増殖温度が３０〜３７℃であり、ｐＨ＝６．６〜７．４である湾曲桿菌として報告されている。メタノスピリリウム・フンガテイは、メタン生成において、ギ酸塩、Ｈ２及びＣＯ２を基質として利用する偏性嫌気性菌である。メタノスピリリウム・フンガテイは、グリセロール、１，３−プロパジオール及びフコースの分解においてデスルホビブリオ（Desulfovibrio）と同時に現れることが知られている。メタノスピリリウム属は、長鎖脂肪酸の分解において、シントロホモナダセア（Syntrophomonadaceae）科と同時に現れることが知られている。本研究では、シントロホモナダセア科とメタノスピリウム属が同時に検出されており、これらがメタン生成のために共生関係を構築したことを示す。ＤＧＧＥゲル上に出現した高い光強度を有するバンドで同定できなかったものは、それらの古細菌に対応するＤＮＡ断片をクローニングすることができなかったためである。
実施例２：グリセロールで馴養された微生物を用いた新規メタン発酵槽の立ち上げ
（１）メタン発酵用の運転試料の調製
実施例１においてグリセロールへの馴養後のメタン発酵槽からグラニュール汚泥を採取した。このグラニュール汚泥には、グリセロールを炭素源とする支配的な少なくとも上記バンドＢ７、Ｂ７、Ｂ１０、Ａ８、Ａ９、及びＡ１３に対応する微生物が含まれる。一方、対照として、醸造廃水を処理しているメタン発酵装置から得たグラニュール汚泥をそのまま用いた。
（１）メタン発酵用の運転試料の調製
実施例１においてグリセロールへの馴養後のメタン発酵槽からグラニュール汚泥を採取した。このグラニュール汚泥には、グリセロールを炭素源とする支配的な少なくとも上記バンドＢ７、Ｂ７、Ｂ１０、Ａ８、Ａ９、及びＡ１３に対応する微生物が含まれる。一方、対照として、醸造廃水を処理しているメタン発酵装置から得たグラニュール汚泥をそのまま用いた。
（２）メタン発酵の運転
発酵には、３Ｌ容量のＰｙｒｅｘ（登録商標）ガラス製（高さ２５０ｍｍ、径１２０ｍｍ）リアクターを２つ使用した。実験の開始時に、リアクターの１つには、上記（１）で調製した特定の微生物を含むグラニュール汚泥１００ｍＬと醸造廃水処理のメタン発酵装置から得たグラニュール汚泥２００ｍＬを混合した３００ｍＬを添加し（運転Ａ）、もう１つには、醸造廃水処理のメタン発酵装置から得た汚泥３００ｍＬを添加し（運転Ｂ）、実施例１の方法に準じてグリセロールに対する馴養を行ったが、リアクターに添加する溶液の成分及び量、並びにグリセロールの段階的な添加量及び時間は以下の表５の通りである。
発酵には、３Ｌ容量のＰｙｒｅｘ（登録商標）ガラス製（高さ２５０ｍｍ、径１２０ｍｍ）リアクターを２つ使用した。実験の開始時に、リアクターの１つには、上記（１）で調製した特定の微生物を含むグラニュール汚泥１００ｍＬと醸造廃水処理のメタン発酵装置から得たグラニュール汚泥２００ｍＬを混合した３００ｍＬを添加し（運転Ａ）、もう１つには、醸造廃水処理のメタン発酵装置から得た汚泥３００ｍＬを添加し（運転Ｂ）、実施例１の方法に準じてグリセロールに対する馴養を行ったが、リアクターに添加する溶液の成分及び量、並びにグリセロールの段階的な添加量及び時間は以下の表５の通りである。
実施例１と同様に、生成されたバイオガスの容積を測定し、ガスクロマトグラフィー−質量分析計（ＧＳ−ＭＳ）を用いて、バイオガスの組成を分析した。また、揮発性脂肪酸濃度を測定した。結果は、運転Ａにおいては、添加の２日後から速やかに顕著なメタン生成が確認され、一方、運転Ｂでは、添加の１３日後を経過して活発にメタン生成が行われることが判明した（図７）。このように、メタン発酵の新規立ち上げにおいて、本発明の微生物の添加が非常に有効であることが示唆された。また、運転Ａ及びＢにおいて、生成された脂肪酸の濃度を比較すると、運転Ａの脂肪酸濃度は、運転Ｂの脂肪酸濃度よりも低い値を維持し続けた。これは、運転Ａでは、脂肪酸が蓄積されることなくメタン生成が高いレベルで継続的に行われていることを示す。一方、運転Ｂでは、運転初期において脂肪酸濃度が高く、これはメタン生成ステップの低活性が脂肪酸を高濃度に蓄積させていると説明できる（図８）。
さらに、上記運転Ａ及びＢにおける発酵槽に含まれる、グリセロールを炭素源としてメタン生成する真正細菌のうちバンドＢ７、Ｂ８、及びＢ１０に対応するトリココッカス濃度を経時的に測定した。バンドＢ７、Ｂ８、及びＢ１０の濃度は、実施例１と同様に、リアルタイムＰＣＲ法で相対濃度として求めた。図９に示すように、運転Ａでは、汚泥の添加直後から真正細菌の濃度は安定して高レベルで維持された。一方、運転Ｂでは、バンドＢ７、Ｂ８、及びＢ１０の濃度が徐々に増加し、これは、メタン生成量の経時的な変化と連動していた。
以上のように、グリセロールを炭素源とする微生物を用いることによって、メタン発酵槽の新規立ち上げのための時間を顕著に短縮することができた。
Claims (10)
- 有機性廃棄物のメタン発酵系においてメタン生成を開始させるまでの時間を短縮させる方法であって、下記のプライマーセット：
（１）プライマーセット１
（ａ）配列番号１に示される塩基配列又はこれと実質的に同一の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、及び
（ｂ）配列番号２に示される塩基配列又はこれと実質的に同一の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
（２）プライマーセット２
（ｃ）配列番号３に示される塩基配列又はこれと実質的に同一の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、及び
（ｄ）配列番号４に示される塩基配列又はこれと実質的に同一の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；及び／又は
（３）プライマーセット３
（ｅ）配列番号５に示される塩基配列又はこれと実質的に同一の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、及び
（ｆ）配列番号６に示される塩基配列又はこれと実質的に同一の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
によって検出される塩基配列を含む１６Ｓ ｒＲＮＡ又は１６Ｓ ｒＤＮＡを有する、グリセロールを原料としてメタン生成を行う微生物を有機性廃棄物のメタン発酵系に供給することを含む方法。 - 前記プライマーセット１によって検出させる微生物が真正細菌であって、配列番号７、８、又は９に示される塩基配列を含む、請求項１に記載の方法。
- 前記真正細菌がトリココッカス属種（Trichococcus sp.）である、請求項２に記載の方法。
- 前記プライマーセット２によって検出させる微生物が古細菌であって、配列番号８に示される塩基配列を含む、請求項１に記載の方法。
- 前記古細菌がメタノバクテリウム属種（Methanobacterium sp.）である、請求項４に記載の方法。
- 前記プライマーセット３によって検出させる微生物が古細菌であって、配列番号９に示される塩基配列を含む、請求項１に記載の方法。
- 前記古細菌がメタノスピリルム属種（Methanospirillum sp.）である、請求項５に記載の方法。
- 有機性廃棄物が、食品廃棄物、糞尿、動植物残さ、古紙、及び汚泥からなる群から選択される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
- 前記馴養期間が０〜２０日である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
- 有機性廃棄物のメタン発酵系においてメタン生成を開始するまでの時間を短縮させるために使用される組成物であって、下記のプライマーセット：
（１）プライマーセット１
（ａ）配列番号１に示される塩基配列又はこれと実質的に同一の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、及び
（ｂ）配列番号２に示される塩基配列又はこれと実質的に同一の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
（２）プライマーセット２
（ｃ）配列番号３に示される塩基配列又はこれと実質的に同一の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、及び
（ｄ）配列番号４に示される塩基配列又はこれと実質的に同一の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；及び／又は
（３）プライマーセット３
（ｅ）配列番号５に示される塩基配列又はこれと実質的に同一の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、及び
（ｆ）配列番号６に示される塩基配列又はこれと実質的に同一の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
によって検出される塩基配列を有する微生物を含む組成物。
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2018012011A1 (ja) * | 2016-07-11 | 2018-01-18 | 三菱ケミカル株式会社 | 口腔内検査方法 |
| CN110747149A (zh) * | 2019-12-03 | 2020-02-04 | 中国科学院烟台海岸带研究所 | 一株耐盐的产甲烷古菌及其应用 |
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|---|---|---|---|---|
| JP2004261124A (ja) * | 2003-03-03 | 2004-09-24 | Ebara Corp | メタン生成細菌を検出するためのプライマー及びそれを用いた検出方法等 |
| US20090305376A1 (en) * | 2005-11-11 | 2009-12-10 | Wilhelm Gantefort | Fermenter for producing biogas from organic material |
-
2014
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| CN109790531A (zh) * | 2016-07-11 | 2019-05-21 | 三菱化学株式会社 | 口腔内检查方法 |
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