JP2015137272A

JP2015137272A - 新規のペプチド及び疾患の検出方法

Info

Publication number: JP2015137272A
Application number: JP2014011433A
Authority: JP
Inventors: 中山　亮; Akira Nakayama; 亮中山; 信之河合; Nobuyuki Kawai
Original assignee: Tosoh Corp
Current assignee: Tosoh Corp
Priority date: 2014-01-24
Filing date: 2014-01-24
Publication date: 2015-07-30

Abstract

【課題】ヒトＢ型ナトリウム利尿ペプチド（ｈＢＮＰ）に関連した新規のペプチドを提供する。
【解決手段】以下の特徴を有するペプチド
（Ｉ）ｈｐｒｏＢＮＰ及びｈＢＮＰ（３−３２）には結合しないがｈＢＮＰには結合する抗体と、ｈＢＮＰのＣ末端尾部に結合する抗体とを用いたサンドイッチアッセイで検出される。及び
（ＩＩ）血液中のｈＢＮＰ分解機構に対してｈＢＮＰよりも耐性を有する。
並びに、検体中に存在する当該ペプチドを測定して心疾患等のｈＢＮＰの増減を指標とする疾患を検出する。
【選択図】図２

Description

本発明は、ヒトＢ型ナトリウム利尿ペプチドに関連する新規のペプチドに関する。

ＢＮＰはブタの脳から最初に単離された（非特許文献１）ことから、脳性ナトリウム利尿ペプチド（ＢｒａｉｎＮａｔｒｉｕｒｅｔｉｃＰｅｐｔｉｄｅ：ＢＮＰ）と命名された。しかし、ヒトにおいて、ＢＮＰは心臓で合成・分泌されることが示唆され、（非特許文献２）、心臓より単離・同定された（非特許文献３）。従って、脳（ｂｒａｉｎ）という単語はＢ型に変更され、現在ではＢＮＰはＢ型ナトリウム利尿ペプチドを意味する。

ＢＮＰは血中を循環し、強力な心血管性及び腎性作用を発揮する。ヒトＢ型ナトリウム利尿ペプチド（以下、ｈＢＮＰとする）は３２アミノ酸残基からなり、ｈＢＮＰの前駆体であるヒトプロＢ型ナトリウム利尿ペプチド（以下、ｈｐｒｏＢＮＰとする）のアミノ酸配列７７−１０８位に相当する。ｈＢＮＰは、２つのシステイン残基の間のジスルフィド結合によって閉じている１７アミノ酸からなる環状部、９アミノ酸からなるＮ末端尾部及び６アミノ酸からなるＣ末端尾部からなる。また、血中でｈＢＮＰをインキュベートすると、Ｎ末端の２アミノ酸残基が脱離し、ｈＢＮＰ（３−３２）が生じることが知られている（非特許文献４）。ｈＢＮＰ（３−３２）は、ｈＢＮＰのアミノ酸配列３−３２位に相当し、ｈｐｒｏＢＮＰのアミノ酸配列の７９−１０８位に相当するペプチドである。さらに、心疾患患者の血液中には、ｈＢＮＰやｈＢＮＰ（３−３２）のみならず、ｈＢＮＰ（４−３２）やｈＢＮＰ（５−３２）（それぞれｈＢＮＰのアミノ酸配列の４−３２位、５−３２位に相当するペプチド）などの、ｈｐｒｏＢＮＰから派生した様々な分子が存在することが確認されている（特許文献１）。

現在、サンドイッチアッセイで用いられている２つの抗ｈＢＮＰ抗体の認識部位は、それぞれｈＢＮＰの環状部、Ｃ末端尾部である。このようなサンドイッチアッセイを用いた場合、ｈＢＮＰのみならず、ｈＢＮＰと同じ環状部及びＣ末端尾部を有する分子すべてが区別なく検出される（以下、該サンドイッチアッセイで検出される分子の総称をｈＢＮＰ分子群とする）。

国際公開第２０１０／０２３７４９号パンフレット

Ｎａｔｕｒｅ３３２，７８−８１（１９８８）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１５９，１４２７−１４３４（１９８９）ＦＥＢＳＬｅｔｔ．２５９，３４１−３４５（１９９０）ＣｌｉｎＣｈｉｍＡｃｔａ３１６：１２９−１３５（２００２）

本発明は、ｈＢＮＰに関連した新規のペプチドを提供することを目的とする。

本発明者らは上記の課題に関し鋭意研究を行なった結果、本発明を完成するに至った。即ち本発明は、以下のとおりである。
（１）以下の特徴を有するペプチド。
（Ｉ）ｈｐｒｏＢＮＰ及びｈＢＮＰ（３−３２）には結合しないがｈＢＮＰには結合する抗体と、ｈＢＮＰのＣ末端尾部に結合する抗体とを用いたサンドイッチアッセイで検出される。及び
（ＩＩ）血液中のｈＢＮＰ分解機構に対してｈＢＮＰよりも耐性を有する。
（２）検体中に存在する（１）に記載のペプチドを測定することを特徴とする、ｈＢＮＰの増減を指標とする疾患の検出方法。

以下に本発明を詳細に説明する。本発明のペプチドは、いくつかの心疾患患者の血液検体中に見出された。該ペプチドは、ｈｐｒｏＢＮＰ及びｈＢＮＰ（３−３２）には結合しないがｈＢＮＰには結合する抗体（以下、ｈＢＮＰ特異抗体とする）と、ｈＢＮＰのＣ末端尾部に結合する抗体を用いたサンドイッチアッセイで検出されるペプチドである。また該ペプチドは、血液中のｈＢＮＰ分解機構に対してｈＢＮＰよりも耐性を有する、即ち分解されにくいという特徴を有する。

心疾患患者の血液検体中のｈＢＮＰ分子群濃度とｈＢＮＰ濃度（ｈＢＮＰ特異抗体とｈＢＮＰのＣ末端尾部に結合する抗体を用いたサンドイッチアッセイで検出されるもの）を測定したところ、ｈＢＮＰ分子群濃度に対するｈＢＮＰ濃度の割合が大きい血液検体と小さい血液検体の２つのグループに分類されることを見出した（以下、それぞれをグループ１、グループ２とする）。当初、グループ１のｈＢＮＰ分子群濃度に対するｈＢＮＰ濃度の割合が大きいのは、血液検体中のｈＢＮＰ分解活性が低下しているため、ｈＢＮＰの残存量が大きいからだと考えた。そこで、市販のｈＢＮＰを心疾患患者の血液検体に添加し、一定時間経過後ごとにｈＢＮＰ濃度を測定したところ、ｈＢＮＰ濃度の減少はグループ１とグループ２で大きな差はなかった。すなわち、グループ１の血液検体のｈＢＮＰ分解活性が特別に低下しているわけではないことがわかった。

よって、グループ２の血液検体には従来のｈＢＮＰが存在するが、グループ１の血液検体には従来のｈＢＮＰに加えて本発明の新規なペプチドが存在し、その分だけ高い値を示したと考えられる。

この本発明のペプチドは、ｈＢＮＰ特異抗体とｈＢＮＰのＣ末端尾部に結合する抗体を用いたサンドイッチアッセイで検出することができるため、ｈＢＮＰそのものであるとも考えられた。しかし、ｈＢＮＰは血液中で非常に分解されやすいのに対して、本発明のペプチドは血液中で分解されにくいため、ｈＢＮＰそのものではなく、亜型のｈＢＮＰであると考えられる。

本発明はさらに、検体中に存在する該ペプチドを測定しｈＢＮＰの増減を指標とする疾患を検出する方法を提供する。ｈＢＮＰの増減を指標とする疾患とは、高血圧、心疾患、腎疾患などが挙げられ、特に心疾患に有用であることが期待される。概ペプチドの測定は、ＥＬＩＳＡや質量分析等の各種手法により行なえばよい。検体としては血液等が挙げられる。

本発明は、ＢＮＰに関連する新規のペプチドである。本発明は高血圧や心機能・腎機能の診断など、ｈＢＮＰの増減を指標とする疾病の診断に有用であることが期待される。

実施例１の結果を示したグラフである。実施例２の結果を示したグラフである。実施例３の結果を示したグラフである。

以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は本実施例により限定されるものではない。

［実施例１］ｈＢＮＰ特異抗体の単離
ｈＢＮＰ特異抗体を以下の方法で単離した。

（１）免疫用コンジュゲ−ト液の作製
配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチドは、業者にペプチド合成を依頼して得た。該ペプチドフラグメント溶液（１０ｍｇ／ｍｌ、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で溶解したもの）と、マレイミド活性化ＫＬＨ溶液（１０ｍｇ／ｍｌ、ＰＢＳで溶解したもの）を、体積比１：１で混和し、室温で２時間撹拌して反応させた。その後、反応液をＰＢＳに対して２日間４℃で透析することにより、免疫用コンジュゲート液を得た。

（２）免疫
上述の免疫用コンジュゲート液（１ｍｇ／ｍｌ）とフロイントの完全アジュバントを等量ずつ混合して乳濁液とし、これをマウス（雌、６週令）の腹腔内に０．１ｍｌずつ１週間間隔で計４回注射した。マウス１匹１回当たりのコンジュゲ−ト投与量は５０μｇであった。更に最終免疫の１週間後に、ブ−スタ−として免疫用コンジュゲート液をＰＢＳで０．５ｍｇ／ｍｌに希釈したもの（０．１ｍｌ）を腹腔内に投与した。

（３）細胞融合
ブ−スタ−免疫から３日後にマウスの脾臓を摘出し、その細胞を赤血球溶解バッファーにて赤血球を破壊した。残った細胞をＥ−ＲＤＦ培地に懸濁して細胞融合に用いる脾リンパ球とした。次に同じくＥ−ＲＤＦ培地に懸濁したミエローマ細胞０．４×１０^７個を脾リンパ球１．６×１０^７個と混合し、遠心（１０００ｒｐｍ、５分）後、上清を除去した。細胞沈殿物をマンニトール緩衝液（２５０ｍＭマンニトール、１００ｍＭ塩化カルシウム、１００ｍＭ塩化マグネシウム）に懸濁し、電気的細胞融合を行なった。電気的細胞融合を行なった細胞懸濁液をＨＡＴ培地（１００μＭヒポキサンチン、０．４μＭアミノプテリン、１６μＭチミジンを含むＧＩＴ培地）２００ｍｌに懸濁し、３８４ウエル細胞培養プレ−ト１０枚の各ウエルに０．０５ｍｌずつ分注した。約７日後にはハイブリド−マの増殖が認められた。

（４）スクリーニング
得られたハイブリドーマから定法により抗体を得た。該抗体をＥＬＩＳＡプレートに０．１μｇ／ウェルで固定化し、１重量％スキムミルクでブロッキングした。ウェルを洗浄後、ｈＢＮＰ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、ＢｒａｉｎＮａｔｒｉｕｒｅｔｉｃＰｅｐｔｉｄｅ−３２ｈｕｍａｎ）を１ｎｇ／ｍＬの濃度で調整し、当該溶液１００μＬをウェルに添加して反応させた。ウェルを洗浄後、ｈＢＮＰのＣ末端尾部を認識する抗体ＢＣ２３−１１（特開２０１１−１２２９５７号公報）のアルカリ性フォスファターゼ標識体をウェルに添加して反応させた。反応後、定法に従いアルカリ性フォスファターゼ活性を測定することで該抗体とｈＢＮＰとの結合を観察した。該抗体とｈｐｒｏＢＮＰまたはｈＢＮＰ（３−３２）との結合は、ｈＢＮＰの代わりにｈｐｒｏＢＮＰ（ＨｙＴｅｓｔ社、ＨｕｍａｎｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｒｏＢＮＰｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ）またはｈＢＮＰ（３−３２）（業者によるペプチド合成により取得）を使用した上記測定方法を用いて観察した。結果を図１に示す。該抗体はｈｐｒｏＢＮＰ及びｈＢＮＰ（３−３２）には結合しないがｈＢＮＰには結合する抗体（ｈＢＮＰ特異抗体）であることが明らかとなった。

［実施例２］ｈＢＮＰ分子群及びｈＢＮＰの測定
免疫測定装置として市販の全自動エンザイムイムノアッセイ装置（ＡＩＡ−２０００、東ソー社製）を用い、１ステップサンドイッチ法によりｈＢＮＰ分子群及びｈＢＮＰの測定を行った。ｈＢＮＰ分子群の測定は、市販の免疫測定用試薬であるＥテスト「ＴＯＳＯＨ」ＩＩ（ＢＮＰ）（東ソー社製）を使用した。ｈＢＮＰの測定は、実施例１で得られたｈＢＮＰ特異抗体と、ＢＣ２３−１１を用いた免疫測定試薬を使用した。より具体的には、該免疫測定試薬には、水不溶性の担体に固定化したｈＢＮＰ特異抗体と、アルカリ性フォスファターゼを標識したＢＣ２３−１１を含む。

免疫測定試薬に血液検体（採血から室温で９０分以上経過したもの）を添加し、定法に従い上述の装置でアルカリ性フォスファターゼ活性を測定した。なお、上記のようなサンドイッチ免疫測定において、予め既知濃度のｈＢＮＰを含む標準品を用いてその活性強度とｈＢＮＰ濃度による標準曲線を作成しておけば、ｈＢＮＰ未知の試料の活性強度を測定することにより、そのｈＢＮＰ濃度を標準曲線より算出することができる。

各血液検体のｈＢＮＰ分子群濃度とｈＢＮＰ濃度を測定した結果を図２に示す。ｈＢＮＰ分子群濃度に対するｈＢＮＰ濃度の割合が大きい血液検体（グループ１）と小さい血液検体（グループ２）の２つのグループに分類されることがわかった。

［実施例３］血液検体のｈＢＮＰ分解活性の測定
実施例２で分類された２つのグループの中から、それぞれ無作為に３つの血液検体を選択した。各血液検体８００μｌに２０ｎｇ／ｍｌのｈＢＮＰ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、ＢｒａｉｎＮａｔｒｉｕｒｅｔｉｃＰｅｐｔｉｄｅ−３２ｈｕｍａｎ）を４２μｌ添加した。添加０分後、３０分後、６０分後、９０分後に、実施例２と同様の免疫測定により、ｈＢＮＰ濃度を測定した。結果を図３に示す。いずれの血液検体も同様に、ｈＢＮＰ濃度は時間経過とともに減少した。すなわち、血液検体によるｈＢＮＰの分解活性の差はないことがわかった。つまり、グループ１の血液検体中のｈＢＮＰは、従来のｈＢＮＰのみならず、血液中で分解されにくい亜型のｈＢＮＰを含むと考えられる。

Claims

以下の特徴を有するペプチド。
（Ｉ）ヒトプロＢ型ナトリウム利尿ペプチド及びヒトＢ型ナトリウム利尿ペプチドのアミノ酸配列３−３２位に相当するペプチドには結合しないがヒトＢ型ナトリウム利尿ペプチドには結合する抗体と、ヒトＢ型ナトリウム利尿ペプチドのＣ末端尾部に結合する抗体とを用いたサンドイッチアッセイで検出される。及び
（ＩＩ）血液中のヒトＢ型ナトリウム利尿ペプチドの分解機構に対して、ヒトＢ型ナトリウム利尿ペプチドよりも耐性を有する。
検体中に存在する請求項１に記載のペプチドを測定することを特徴とする、ヒトＢ型ナトリウム利尿ペプチドの増減を指標とする疾患の検出方法。