JP2016185166A - 多機能性対立遺伝子 - Google Patents

Abstract

【課題】多機能性対立遺伝子の提供。【解決手段】ゲノムに修飾を提供するための核酸構築物と方法が提供される。ここでは、修飾には、ヌル対立遺伝子、条件的対立遺伝子、およびＣＯＩＮを含有しているヌル対立遺伝子が含まれる。多機能性対立遺伝子（ＭＦＡ）、ならびにそれらを作製するための方法が提供される。多機能性対立遺伝子を作製するための方法は、１回の標的化において、ヌル対立遺伝子、条件的対立遺伝子、またはヌル対立遺伝子でありさらにＣＯＩＮを含む対立遺伝子を作製するために使用することができる１つの対立遺伝子を導入する能力を提供する。ＭＦＡには、類似するリコンビナーゼ認識部位の複数の対、動作配列および／または薬剤選択カセット、ならびに目的のヌクレオチド配列、ならびにＣＯＩＮが含まれる。ここでは、リコンビナーゼの作用を受けると、ＣＯＩＮを持つ条件的対立遺伝子が形成される。【選択図】図２

Description

本発明は、ノックアウト構築物およびゲノム中にＣＯＩＮを配置するための構築物を含む、ゲノムを修飾するための核酸構築物に関する。遺伝的操作されたヒト以外の動物には、例えば、ヒト以外の動物において（例えば、マウスおよびラットにおいて）ヌル対立遺伝子、選択可能な対立遺伝子、レポーティング対立遺伝子（ｒｅｐｏｒｔｉｎｇ ａｌｌｅｌｅ）、および／または条件的対立遺伝子が形成するように、遺伝子または核酸エレメントの欠失あるいは反転を可能にする、選択されたリコンビナーゼ認識部位とともに並べられた遺伝子あるいは核酸エレメントを有している遺伝子操作されたマウスが含まれる。

典型的には、ノックアウトは、選択された別の配列（通常は、レポーターおよび選択カセット）で標的遺伝子を相同性によって置き換えることにより作製される。この場合、選択カセットには、類似する部位特異的リコンビナーゼの作用による上記選択カセットの除去ができるようにするための部位特異的リコンビナーゼ部位が隣接していることが好ましい。上記選択カセットは、続いて、対応する類似するリコンビナーゼで細胞を処理することによるか、またはマウスの子孫を「除去因子（ｄｅｌｅｔｏｒ）」株と交雑することによるかのいずれかで除去することができる。例えば、ＬｏｘＰ配列が導入された対立遺伝子（ここでは、目的の配列にｌｏｘＰ部位が隣接している）の場合には、類似するリコンビナーゼはＣｒｅであり、ゲノム中に残るのは１つのｌｏｘＰ部位とレポーターである。

関連するストラテジーが、条件的ヌル対立遺伝子を作製するために従来利用されてきた。これには、類似するリコンビナーゼが作用すると、部位特異的リコンビナーゼ認識部位が隣接する領域が欠失させられ、得られる対立遺伝子がヌル対立遺伝子である様式で、部位特異的リコンビナーゼ認識部位（例えば、Ｃｒｅについてはｌｏｘ、そしてＦｌｐについてはＦＲＴ）を含む、目的の遺伝子の隣接部分が含まれる。

１つの標的化ベクターの中にヌルと条件的機能性の両方を取り込ませるため、および１回の標的化工程で対応する修飾された対立遺伝子の組み立てを達成するための多数の試みが行われてきたが、そのような試みにより得られた方法にはいくつかの欠点があり、成功と失敗が繰り返されてきた。これらの欠点としては、例えば、真の機能性の欠如（すなわち、ヌルバージョンがレポーター機能の真のヌルではない、条件的対立遺伝子がレポーター機能の真の条件的欠失ではないなど）、または所望される特性を持つ実際に作動する対立遺伝子が実現できないことが挙げられる。

したがって、操作された遺伝子座が多機能性遺伝子座（例えば、真のＫＯ−ｆｉｒｓｔ対立遺伝子、次いで、条件的ヌルまたは他の条件的突然変異対立遺伝子）である、標的化により遺伝的操作された生物を作製することが当該分野で必要とされている。

概要
ヌル対立遺伝子および条件的対立遺伝子、ならびにヌルとＣＯＩＮの特徴を併せ持つ対立遺伝子を作製するための方法と組成物が提供される。様々な実施形態において、１回の標的化工程においてゲノム中に多機能性対立遺伝子を操作するための方法と組成物が提供される。遺伝的操作されたヒト以外の動物におけるノックアウトの相補性解析のための方法と組成物が提供される。これには、１回の標的化工程を含む方法が含まれる。

１つの態様では、３’スプライシング領域とスプライシングアクセプター、スプライシングアクセプターに関して３’にある動作配列、および動作配列に関して３’にある目的のヌクレオチド配列（ＮＳＩ）を含有している修飾された対立遺伝子が提供される。ここでは、ＮＳＩは、標的遺伝子に関して（または修飾しようとする遺伝子座に関して、もしくは動作配列に関して）アンチセンス方向で存在している。

１つの実施形態においては、動作配列は、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、転写終結シグナル（例えば、ポリアデニル化領域）、ｃＤＮＡをコードするヌクレオチド配列、またはそれらの任意の組み合わせより選択され、そして動作配列には、オペレーター、エンハンサー、およびインスレーターのような調節エレメントが含まれ得る。特異的な実施形態においては、ｃＤＮＡがレポーターをコードする（例えば、ＬａｃＺをコードする）。１つの実施形態においては、動作配列にエキソンが含まれる。特異的な実施形態においては、エキソンは１つの遺伝子座の最も５’にあるエキソンである。

１つの実施形態においては、ＮＳＩに１つのエキソンが含まれる。１つの実施形態においては、ＮＳＩには、１つのエキソンと隣接するイントロン配列が含まれる。特異的な実施形態においては、隣接するエキソンには、５’および３’にイントロン配列が隣接している。１つの実施形態においては、ヌクレオチド配列には、２つ以上のエキソンが含まれ、特異的な実施形態においては、イントロン配列（単数または複数）が含まれる。別の実施形態においては、ＮＳＩは１つのエキソンが欠失しているか、またはエキソンの１つの断片が欠失している。

１つの実施形態においては、修飾された対立遺伝子にＣＯＩＮが含まれる。１つの実施形態においては、ＣＯＩＮは、ＮＳＩに関して３’に存在する。別の実施形態においては、ＣＯＩＮは、ＮＳＩに関して５’に存在する。

１つの実施形態においては、ＣＯＩＮは、レポーター、遺伝子トラップ様エレメント（ＧＴ様エレメント）、および遺伝子トラップ様レポーター（ＧＴ様レポーター）より選択される。特異的な実施形態においては、ＧＴ様エレメントは、ＳＡ−薬剤耐性ｃＤＮＡ−ｐｏｌｙＡより選択される。特異的な実施形態においては、ＧＴ様レポーターは、ＳＡ−レポーター−ｐｏｌｙＡより選択される。

１つの実施形態においては、ＣＯＩＮに３’スプライシング領域が含まれる。特異的な実施形態においては、３’スプライシング領域の後ろに、ｃＤＮＡ、エキソン−イントロン配列、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡクラスター、低分子ＲＮＡ、コドンスキップエレメント、ＩＲＥＳ、ポリアデニル化配列、またはそれらの任意の組み合わせより選択される配列が続く。特異的な実施形態においては、低分子ＲＮＡはミュートロンである。特異的な実施形態においては、コドンスキップエレメントは、Ｔ２Ａ、Ｅ２Ａ、またはＦ２Ａである。

１つの実施形態においては、修飾された対立遺伝子に薬剤選択カセット（ＤＳＣ）が含まれる。

１つの実施形態においては、修飾された対立遺伝子は、上流と下流のホモロジーアームを含む標的化構築物上に存在する。１つの実施形態においては、少なくとも一方のホモロジーアームがマウスのホモロジーアームである。特異的な実施形態においては、両方のホモロジーアームがマウスのホモロジーアームである。

１つの実施形態においては、修飾された対立遺伝子には、５’から３’方向に、スプライシングアクセプター、動作配列、ＤＳＣ、ＮＳＩ、およびＣＯＩＮが含まれる。ここでは、目的のヌクレオチド配列とＣＯＩＮはいずれも、動作配列および５対の部位特異的リコンビナーゼ認識部位に関してアンチセンス方向で存在する。１つの実施形態においては、修飾された対立遺伝子は、部位特異的リコンビナーゼ認識部位の第１の対の間にある配列を別々に認識し、反転させ、部位特異的リコンビナーゼ認識部位の第２の対の間にある配列を欠失させる第１の部位特異的リコンビナーゼに対して暴露されると、転写のセンス方向のＮＳＩを含み、ＤＳＮを欠失しており、そしてＣＯＩＮをアンチセンス方向で含む対立遺伝子を生じる。１つの実施形態においては、修飾された対立遺伝子には、第３および第４の部位特異的リコンビナーゼ認識部位を別々に認識する第２のリコンビナーゼに対してその対立遺伝子がさらに暴露されると、ＮＳＩの欠失と転写のセンス方向でのＣＯＩＮの配置を生じるように並べられた、第３および第４の部位特異的リコンビナーゼ認識部位が含まれる。

１つの態様では、（ａ）センス方向のレポーターと選択された適切な方向のＤＳＣ、およびアンチセンス方向のＮＳＩとＣＯＩＮ；（ｂ）５対の部位特異的リコンビナーゼ認識部位を含む核酸構築物が提供される。ここでは、５対のリコンビナーゼ認識部位は、３種類を超えないリコンビナーゼにより認識される。この場合、第１のリコンビナーゼで核酸構築物が処理されると、（ｉ）ＮＳＩがセンス方向で配置されており、（ｉｉ）ＣＯＩＮはアンチセンス方向のままであり、（ｉｉｉ）レポーターとＤＳＣが欠失しており、そして（ｉｖ）第２のリコンビナーゼで処理されると、修飾された対立遺伝子が、ＮＳＩを反転および／または欠失させ、ＣＯＩＮをセンス方向で配置する、修飾された対立遺伝子が形成される。

１つの実施形態においては、５対の部位特異的リコンビナーゼ認識部位は、ＦＲＴ３、Ｒｏｘ、ＦＲＴ、ｌｏｘＰ、およびｌｏｘ２３７２対である。

１つの実施形態においては、第１のリコンビナーゼはＦｌｐリコンビナーゼであり、第２のリコンビナーゼはＣｒｅリコンビナーゼである。

１つの実施形態においては、修飾された対立遺伝子は、第２のリコンビナーゼで処理されると、第１または第２のリコンビナーゼによっては欠失または反転させることができない対立遺伝子を生じる。

１つの実施形態においては、目的のヌクレオチド配列は１つの遺伝子の１つの野生型エキソンである。別の実施形態においては、ＮＳＩは、１つ以上の核酸置換、欠失、または付加を有している、遺伝子の１つのエキソンである。

１つの実施形態においては、ＮＳＩは、１つの遺伝子の１つの野生型エキソンと隣接するイントロンである。別の実施形態においては、ＮＳＩは、１つ以上の核酸置換、欠失、または付加を有している、遺伝子のエキソンと隣接するイントロン配列である。

１つの実施形態においては、ＮＳＩは１つの遺伝子の１つの野生型イントロンである。別の実施形態においては、ＮＳＩは、１つ以上の核酸置換、欠失、または付加を有している、１つの遺伝子の１つのイントロンである。

１つの実施形態においては、ＣＯＩＮに、１つ以上の核酸置換、欠失、または付加を含む、１つの遺伝子の１つのエキソンまたは複数のエキソンが含まれる。特異的な実施形態においては、ＣＯＩＮには、哺乳動物の１つのエキソンが含まれる。特異的な実施形態においては、哺乳動物は、ヒト、マウス、サル、またはラットである。

１つの実施形態においては、ＣＯＩＮに、３’スプライシング領域が含まれる。特異的な実施形態においては、３’スプライシング領域の後ろに、ｃＤＮＡ、エキソン−イントロン配列、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡクラスター、低分子ＲＮＡ、コドンスキップエレメント、ＩＲＥＳ、ポリアデニル化配列、およびそれらの組み合わせより選択される配列が続く。特異的な実施形態においては、低分子ＲＮＡはミュートロンである。特異的な実施形態においては、コドンスキップエレメントはＴ２Ａである。

１つの実施形態においては、ＣＯＩＮは、レポーター、遺伝子トラップ様エレメント（ＧＴ様エレメント）、および遺伝子トラップ様レポーター（ＧＴ様レポーター）より選択される。特異的な実施形態においては、ＧＴ様エレメントは、ＳＡ−薬剤耐性ｃＤＮＡ−ｐｏｌｙＡより選択される。特異的な実施形態においては、ＧＴ様レポーターは、ＳＡ−レポーター−ｐｏｌｙＡより選択される。

１つの実施形態においては、上記構築物にはさらに、上流および下流のホモロジーアームが含まれる。１つの実施形態においては、上流および下流のホモロジーアームは、マウスまたはラットのホモロジーアームである。特異的な実施形態においては、ホモロジーアームはマウスのホモロジーアームであり、ＮＳＩにヒトの配列が含まれる。特異的な実施形態においては、ヒトの配列に、マウスのエキソンのヒトホモログであるヒトのエキソンが含まれる。

１つの実施形態においては、レポーターは、蛍光タンパク質、発光タンパク質、または酵素より選択される。特異的な実施形態においては、レポーターは、ＧＦＰ、ｅＧＦＰ、ＣＦＰ、ＹＦＰ、ｅＹＦＰ、ＢＦＰ、ｅＢＦＰ、ＤｓＲｅｄ、ＭｍＧＦＰ、ルシフェラーゼ、ＬａｃＺ、およびアルカリホスファターゼより選択される。

１つの実施形態においては、ＤＳＣに、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏ^ｒ）、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ（ｈｙｇ^ｒ）、ピューロマイシン−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ（ｐｕｒｏ^ｒ）、ブラストサイジンＳデアミナーゼ（ｂｓｒ^ｒ）、キサンチン／グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｇｐｔ）、ノーセオトリシンアセチルトランスフェラーゼ（ｎａｔ１）、および単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｔｋ）より選択される活性をコードする配列が含まれる。

１つの態様では、３’スプライシングアクセプターを含む動作配列、その後ろにセンス方向のレポーター、選択された適切な方向のＤＳＣ、アンチセンス方向のＮＳＩ、そしてアンチセンス方向のＣＯＩＮが続く核酸構築物が提供される。ここでは、動作配列とレポーターの上流にはリコンビナーゼ認識部位Ｒ１が隣接しており、リコンビナーゼ認識部位Ｒ２はレポーターとＤＳＣの間に配置されており、リコンビナーゼ部位Ｒ３はＤＳＣと目的のヌクレオチド配列の間に配置されており、リコンビナーゼ部位Ｒ４は部位Ｒ３とＮＳＩの間に配置されており、リコンビナーゼ部位Ｒ５はＮＳＩとＣＯＩＮの間に配置されており、リコンビナーゼ部位Ｒ１’は部位Ｒ５とＣＯＩＮの間に配置されており、リコンビナーゼ部位Ｒ３’はＲ１’とＣＯＩＮの間に配置されており、組み換え部位Ｒ５’はＣＯＩＮの下流に配置されており、組み換え部位Ｒ４’は部位Ｒ５’の下流に配置されており、そして組み換え部位Ｒ２’は部位Ｒ４’の下流に配置されている。ここでは、Ｒ１とＲ１’は反対方向で存在し、Ｒ２とＲ２’は同じ方向で存在し、Ｒ３とＲ３’は反対方向で存在し、Ｒ４とＲ４’は同じ方向で存在し、そしてＲ５とＲ５’は同じ方向で存在する。

１つの実施形態においては、レポーターの後ろにポリアデニル化領域が続く。

１つの実施形態においては、Ｒ１とＲ１’は、Ｒ３とＲ３’を認識するリコンビナーゼにより認識される。１つの実施形態においては、Ｒ４とＲ４’は、Ｒ５とＲ５’を認識するリコンビナーゼにより認識される。１つの実施形態においては、Ｒ２とＲ２’は、Ｒ１／Ｒ１’、Ｒ３／Ｒ３’、Ｒ４／Ｒ４’、またはＲ５／Ｒ５’を認識するいずれのリコンビナーゼによっても認識されない。１つの実施形態においては、Ｒ１とＲ１’、Ｒ３とＲ３’、およびＲ２とＲ２’は、Ｒ４とＲ４’、およびＲ５とＲ５’を認識するいずれのリコンビナーゼによっても認識されない。１つの実施形態においては、Ｒ４とＲ４’、Ｒ５とＲ５’、およびＲ２とＲ２’は、Ｒ１とＲ１’、およびＲ３とＲ３’を認識するいずれのリコンビナーゼによっても認識されない。

１つの実施形態においては、１種類のリコンビナーゼでの処理により、ＤＳＣ、ＮＳＩ、およびＣＯＩＮが欠失している核酸構築物が生じる。特異的な実施形態においては、得られる核酸構築物は、基本的に、動作配列、Ｒ１、およびＲ２またはＲ２’からなる。特異的な実施形態においては、Ｒ１はＦＲＴ３部位であり、Ｒ２（またはＲ２’）はＲｏｘ部位である。

１つの実施形態においては、１種類のリコンビナーゼでの処理により、センス方向の動作配列を含むが、ＤＳＣが欠失しており、ＮＳＩが欠失しており、そしてＣＯＩＮが欠失している核酸構築物が生じる。特異的な実施形態においては、Ｒ２とＲ２’はＲｏｘ部位であり、上記１種類のリコンビナーゼはＤｒｅリコンビナーゼである。

１つの実施形態においては、１種類のリコンビナーゼでの処理により、アンチセンス方向のＮＳＩとアンチセンス方向のＣＯＩＮを含む核酸構築物が生じる。１つの実施形態においては、上記１種類のリコンビナーゼはＦｌｐリコンビナーゼであり、Ｒ１とＲ１’は、Ｒ３およびＲ３’とは交差反応しないＦＲＴ変異体配列であり（Ｒ３およびＲ３’もまたＦＲＴまたはＦＲＴ変異体でもある）、Ｒ２とＲ２’はＲｏｘ配列であり、そしてＲ４とＲ４’は、Ｒ５およびＲ５’とは交差反応しないｌｏｘＰまたはｌｏｘ変異体配列である。ここでは、Ｒ５とＲ５’はｌｏｘ変異体配列である。

１つの実施形態においては、１種類のリコンビナーゼでの処理により、センス方向のＮＳＩとアンチセンス方向のＣＯＩＮを含む核酸構築物が生じる。１つの実施形態においては、上記１種類のリコンビナーゼはＦｌｐリコンビナーゼであり、Ｒ１とＲ１’はＦＲＴ３配列であり、Ｒ２とＲ２’はＲｏｘ配列であり、Ｒ３とＲ３’はＦＲＴ配列であり、Ｒ４とＲ４’はｌｏｘＰ配列であり、Ｒ５とＲ５’はｌｏｘ２３７２配列である。

１つの実施形態においては、ＮＳＩは１つの遺伝子の１つの野生型エキソンである。別の実施形態においては、ＮＳＩは、１つ以上の核酸置換、欠失、または付加を有している、１つの遺伝子の１つのエキソンである。

１つの実施形態においては、ＣＯＩＮに、１つ以上の核酸置換、欠失、または付加を含む、１つの遺伝子の１つのエキソンまたは複数のエキソンが含まれる。特異的な実施形態においては、ＣＯＩＮには、哺乳動物の１つのエキソンが含まれる。１つの実施形態においては、哺乳動物は、ヒト、マウス、サル、またはラットである。

１つの実施形態においては、上記構築物にはさらに、上記構築物の上流にあるホモロジーアーム（上流のホモロジーアーム）と上記構築物の下流にあるホモロジーアーム（下流のホモロジーアーム）が含まれる。１つの実施形態においては、上流および下流のホモロジーアームは、マウスまたはラットのホモロジーアームである。特異的な実施形態においては、上記ホモロジーアームはマウスのホモロジーアームであり、ＮＳＩにヒトの配列が含まれる。特異的な実施形態においては、ヒトの配列に、マウスのエキソンに相同であるヒトのエキソンが含まれる。

１つの実施形態においては、レポーターは、蛍光タンパク質、発光タンパク質、または酵素より選択される。特異的な実施形態においては、レポーターは、ＧＦＰ、ｅＧＦＰ、ＣＦＰ、ＹＦＰ、ｅＹＦＰ、ＢＦＰ、ｅＢＦＰ、ＤｓＲｅｄ、ＭｍＧＦＰ、ルシフェラーゼ、ＬａｃＺ、およびアルカリホスファターゼより選択される。１つの実施形態においては、ＤＳＣに、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏ^ｒ）、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ（ｈｙｇ^ｒ）、ピューロマイシン−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ（ｐｕｒｏ^ｒ）、ブラストサイジンＳデアミナーゼ（ｂｓｒ^ｒ）、キサンチン／グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｇｐｔ）、ノーセオトリシンアセチルトランスフェラーゼ（ｎａｔ１）、および単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｔｋ）より選択される活性をコードする配列が含まれる。

１つの態様では、第１、第２、第３、第４、および第５の重複している組み換え可能なユニットを含有している、遺伝子座を修飾するための核酸構築物が提供される。ここでは、組み換え可能なユニットには、１対の類似する部位特異的リコンビナーゼ認識部位が含まれ、ここでは、（ａ）第１の組み換え可能なユニットは、反対方向のリコンビナーゼ部位Ｒ１およびＲ１’により枠で囲まれている（これによりＲ１／Ｒ１’による反転が可能となる）。この場合、Ｒ１とＲ１’の間には、標的遺伝子の転写方向に関してセンス方向の動作配列、その後ろに続くリコンビナーゼ部位Ｒ２、その後ろに続く選択された適切な方向のＤＳＣ、その後ろに続くリコンビナーゼ部位Ｒ３、その後ろに続くリコンビナーゼ部位Ｒ４、その後ろに続くアンチセンス方向のＮＳＩ、その後ろに続くリコンビナーゼ部位Ｒ５が配置されている；（ｂ）第２の組み換え可能なユニットは、同じ方向のリコンビナーゼ部位Ｒ２およびＲ２’により枠で囲まれている（これによりＲ２／Ｒ２’による欠失が可能となる）。この場合、Ｒ２とＲ２’の間には、選択された適切な方向のＤＳＣ、その後ろに続くＲ３、その後ろに続くＲ４、その後ろに続くアンチセンス方向のＮＳＩ、その後ろに続くＲ５、その後ろに続くＲ１’、その後ろに続くリコンビナーゼ部位Ｒ３’（ここでは、Ｒ３’はＲ３に関して反対方向である（これによりＲ３／Ｒ３’による反転が可能となる））、その後ろに続くアンチセンス方向のＣＯＩＮ、その後ろに続くＲ５’（ここでは、Ｒ５’はＲ５に関して同じ方向である）、その後ろに続くＲ４’（ここでは、Ｒ４’はＲ４に関して同じ方向である）、その後ろに続くＲ２’（ここでは、Ｒ２’はＲ２に関して同じ方向である（これによりＲ２／Ｒ２’による欠失が可能となる））が配置されている；（ｃ）第３の組み換え可能なユニットは、反対方向のリコンビナーゼ部位Ｒ３とＲ３’により枠で囲まれている（これによりＲ３／Ｒ３’による反転が可能となる）。この場合、Ｒ３とＲ３’の間には、Ｒ４、アンチセンス方向のＮＳＩ、その後ろに続くＲ５、その後ろに続くＲ１’が配置されている；（ｄ）第４の組み換え可能なユニットは、同じ方向のリコンビナーゼ部位Ｒ４およびＲ４’により枠で囲まれている。この場合、Ｒ４とＲ４’の間には、アンチセンス方向のＮＳＩ、その後ろに続くＲ５、その後ろに続くＲ１’、その後ろに続くＲ３’、その後ろに続くアンチセンス方向のＣＯＩＮ、その後ろに続くＲ５’、その後ろに続くＲ４’が配置されている；そして、（ｅ）第５の組み換え可能なユニットは、同じ方向のＲ５およびＲ５’により枠で囲まれている。この場合、Ｒ５とＲ５’の間には、Ｒ１’、その後ろに続くＲ３’、その後ろに続くアンチセンス方向のＣＯＩＮが配置されている。

１つの実施形態においては、Ｒ１／Ｒ１’およびＲ３／Ｒ３’は同じ部位特異的リコンビナーゼに関して機能的であり、ここでは、上記同じ部位特異的リコンビナーゼは、Ｒ４／Ｒ４’、およびＲ５／Ｒ５’、およびＲ２／Ｒ２’に関しては機能的ではない。

１つの実施形態においては、Ｒ４／Ｒ４’およびＲ５／Ｒ５’は同じ部位特異的リコンビナーゼに関して機能的であり、ここでは、上記同じ部位特異的リコンビナーゼは、Ｒ１／Ｒ１’、およびＲ３／Ｒ３’、およびＲ２／Ｒ２’に関しては機能的ではない。

１つの実施形態においては、Ｒ２／Ｒ２’は１種類のリコンビナーゼに関して機能的であり、ここでは、上記リコンビナーゼは、Ｒ１／Ｒ１’、Ｒ３／Ｒ３’、Ｒ４／Ｒ４’、およびＲ５／Ｒ５’のいずれに関しても機能的ではない。

１つの実施形態においては、Ｒ１／Ｒ１’は、ＦＲＴ、ＦＲＴ３、ｌｏｘＰ、またはｌｏｘ２３７２部位である。１つの実施形態においては、Ｒ３／Ｒ３’は、ＦＲＴ、ＦＲＴ３、ｌｏｘＰ、またはｌｏｘ２３７２部位である。１つの実施形態においては、Ｒ４／Ｒ４’は、ＦＲＴ、ＦＲＴ３、ｌｏｘＰ、またはｌｏｘ２３７２部位である。１つの実施形態においては、Ｒ５／Ｒ５’は、ＦＲＴ、ＦＲＴ３、ｌｏｘＰ、またはｌｏｘ２３７２部位である。１つの実施形態においては、Ｒ２／Ｒ２’はＲｏｘ部位である。１つの実施形態においては、Ｒ２／Ｒ２’はａｔｔＰ／ａｔｔＢ部位である。

特異的な実施形態においては、Ｒ１／Ｒ１’およびＲ３／Ｒ３’は、Ｆｌｐリコンビナーゼに関して機能的である。別の特異的な実施形態においては、Ｒ１／Ｒ１’およびＲ３／Ｒ３’は、Ｃｒｅリコンビナーゼに関して機能的である。

特異的な実施形態においては、Ｒ４／Ｒ４’およびＲ５／Ｒ５’は、Ｃｒｅリコンビナーゼに関して機能的である。別の特異的な実施形態においては、Ｒ４／Ｒ４’およびＲ５／Ｒ５’は、Ｆｌｐリコンビナーゼに関して機能的である。

１つの実施形態においては、Ｒ２／Ｒ２’は、Ｄｒｅリコンビナーゼに関して機能的であるＲｏｘ部位である。別の実施形態においては、Ｒ２／Ｒ２’は、ＰｈｉＣ３１インテグラーゼ

に関して機能的なａｔｔＰ／ａｔｔＢ部位である。

１つの実施形態においては、レポーターは、蛍光タンパク質、発光タンパク質、または酵素より選択される。特異的な実施形態においては、レポーターは、ＧＦＰ、ｅＧＦＰ、ＣＦＰ、ＹＦＰ、ｅＹＦＰ、ＢＦＰ、ｅＢＦＰ、ＤｓＲｅｄ、ＭｍＧＦＰ、ルシフェラーゼ、ＬａｃＺ、およびアルカリホスファターゼより選択される。

１つの実施形態においては、ＤＳＣに、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏ^ｒ）、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ（ｈｙｇ^ｒ）、ピューロマイシン−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ（ｐｕｒｏ^ｒ）、ブラストサイジンＳデアミナーゼ（ｂｓｒ^ｒ）、キサンチン／グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｇｐｔ）、ノーセオトリシンアセチルトランスフェラーゼ（ｎａｔ１）、および単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｔｋ）より選択される活性をコードする配列が含まれる。

１つの実施形態においては、ＮＳＩは、１つの遺伝子の１つの野生型エキソンである。別の実施形態においては、ＮＳＩは、１つ以上の核酸置換、欠失、または付加を有している１つの遺伝子の１つのエキソンである。

１つの実施形態においては、ＣＯＩＮに、１つ以上の核酸置換、欠失、または付加を含む、１つの遺伝子の１つのエキソンが含まれる。特異的な実施形態においては、ＣＯＩＮには、ヒト、マウス、サル、またはラットの１つのエキソンが含まれる。

１つの実施形態においては、ＣＯＩＮに３’スプライシング領域が含まれる。特異的な実施形態においては、３’スプライシング領域の後ろに、ｃＤＮＡ、エキソン−イントロン配列、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡクラスター、低分子ＲＮＡ、コドンスキップエレメント、ＩＲＥＳ、ポリアデニル化配列、およびそれらの組み合わせより選択される配列が続く。特異的な実施形態においては、低分子ＲＮＡはミュートロンである。特異的な実施形態においては、コドンスキップエレメントは、Ｔ２Ａ、Ｅ２Ａ、またはＦ２Ａである。

１つの実施形態においては、ＣＯＩＮは、レポーター、遺伝子トラップ様エレメント（ＧＴ様エレメント）、および遺伝子トラップ様レポーター（ＧＴ様レポーター）より選択される。特異的な実施形態においては、ＧＴ様エレメントは、ＳＡ−薬剤耐性ｃＤＮＡ−ｐｏｌｙＡより選択される。特異的な実施形態においては、ＧＴ様レポーターは、ＳＡ−レポーター−ｐｏｌｙＡより選択される。

１つの実施形態においては、上記構築物にはさらに、上記構築物の上流にあるホモロジーアーム（上流のホモロジーアーム）と上記構築物の下流にあるホモロジーアーム（下流のホモロジーアーム）が含まれる。１つの実施形態においては、上記上流および下流のホモロジーアームは、マウスまたはラットのホモロジーアームである。特異的な実施形態においては、上記ホモロジーアームはマウスのホモロジーアームであり、ＮＳＩにヒトの配列が含まれる。特異的な実施形態においては、ヒトの配列には、マウスのエキソンに相同であるヒトのエキソンが含まれる。

１つの態様では、２種類以上の異なるリコンビナーゼにより認識される２つ以上の組み換え可能なユニットを含有している多機能性対立遺伝子が提供される。それぞれの組み換え可能なユニットは、それらの組み換え可能なユニットの境界を定義する１対の適合するリコンビナーゼ認識部位により定義される。それぞれの組み換え可能なユニットには、１つ以上の内部リコンビナーゼ認識部位が含まれる。１つ以上の内部リコンビナーゼ認識部位は、多機能性対立遺伝子の組み換え可能なユニットが第１のリコンビナーゼにより組み換えられると、１つの組み換え可能なユニット内の１つ以上の内部リコンビナーゼ認識部位が、別の組み換え可能なユニットの内部にある１つ以上の内部リコンビナーゼユニットと対合して、多機能性対立遺伝子の２つ以上の組み換え可能なユニットにまたがる配列の第１のリコンビナーゼにより反転および／または欠失が可能となるように選択される。ここでは、反転および／または欠失は、１つ以上の内部リコンビナーゼ認識部位が反転している場合にのみ可能である。

１つの実施形態においては、反転および／または欠失は、上記多機能性対立遺伝子のさらなるリコンビナーゼ認識部位の反転を伴う。ここでは、さらなるリコンビナーゼ認識部位の反転により、第２のリコンビナーゼによる多機能性対立遺伝子の１つのエレメントの反転または欠失が可能となる。

１つの態様では、以下を含む多機能性対立遺伝子が提供される：（ａ）第１、第２、第３、第４、および第５の組み換え可能なユニット（ここでは、それぞれの組み換え可能なユニットは適合するリコンビナーゼ認識部位により囲まれており、第１の組み換え可能なユニットは第２の組み換え可能なユニットと重複しており、第３、第４、および第５の組み換え可能なユニットは第２の組み換え可能なユニットの中に含まれている）；（ｂ）動作配列、ＤＳＣ、およびＮＳＩに作動可能であるように連結させられた３’スプライシングアクセプターとスプライシング領域を含有している、第１の組み換え可能なユニット；（ｃ）ＤＳＣ、ＮＳＩ、およびＣＯＩＮを含有している第２の組み換え可能なユニット；（ｄ）ＮＳＩを含有している第３の組み換え可能なユニット；（ｅ）ＮＳＩおよびＣＯＩＮを含有している第４の組み換え可能なユニット；（ｆ）ＣＯＩＮを含有している第５の組み換え可能なユニット。ここでは、多機能性対立遺伝子には、第１の組み換え可能なユニットの第１の反転を可能にする、上流および下流にある第１の組み換え可能なユニットに隣接しているリコンビナーゼ認識部位の第１の対が含まれる。この場合、第１の反転により、第２の組み換え可能なユニットの中のリコンビナーゼ部位の第２の反転が生じる。ここでは、第２の反転は、動作配列を欠失させ、ＤＳＣを欠失させるように、第２の組み換え可能なユニット内でのリコンビナーゼ部位の方向を合わせる。

１つの実施形態においては、１種類のリコンビナーゼがリコンビナーゼ認識部位の第１の対を認識し、これはまた、動作配列と薬剤選択カセットを欠失させる。

１つの実施形態においては、第２の反転が、反転後に、ＮＳＩの欠失および／またはＣＯＩＮの反転を可能にするリコンビナーゼ認識部位の第２のセットが形成されるように、組み換え部位の方向を合わせる。

１つの態様では、転写方向に関して５’から３’の方向に、アンチセンス方向のＣＯＩＮ、アンチセンス方向のＮＳＩ、ＤＳＣ、およびセンス方向のレポーターを含有しているＭＦＡを含む核酸構築物が提供される。この場合、ＭＦＡが選択されたリコンビナーゼで処理されると、ＣＯＩＮ、ＮＳＩ、およびＤＳＣが切り出され、レポーターがセンス方向で残る。この場合、異なる選択されたリコンビナーゼでの別の処理が行われると、レポーターとＤＳＣが切り出され、ＣＯＩＮがアンチセンス方向で残り、ＮＳＩがセンス方向で配置される。その結果、なお別の異なる選択されたリコンビナーゼでさらに処理されると、ＮＳＩが切り出され、ＣＯＩＮがセンス方向で配置される。

１つの実施形態においては、ＭＦＡに、第１の組み換え可能なユニット、第２の組み換え可能なユニット、および第３の組み換え可能なユニットが含まれる。ここでは、第１の組み換え可能なユニットは、第２および第３の組み換え可能なユニットと重複しており、第２の組み換え可能なユニットは第１および第３の組み換え可能なユニットと重複している。

１つの実施形態においては、第１の組み換え可能なユニットに、逆（アンチセンス）方向のＣＯＩＮと、逆方向のＮＳＩが含まれる。ここでは、組み換え可能なユニットがＣＯＩＮの上流に隣接しており、欠失させられるように方向を合わせられた適合するリコンビナーゼ部位Ｒ２とＲ２’がＮＳＩの下流に隣接している。第２の組み換え可能なユニットは第１の組み換え可能なユニットと重複しており、第２の組み換え可能なユニットは、ＤＳＣの上流にある組み換え部位とレポーターの下流にある組み換え部位に対する１種類のリコンビナーゼの作用により組み換え可能である。ここでは、上記組み換え部位は、反転させられるように方向を合わせられており、ＤＳＣの上流にある組み換え部位の後ろには、ＮＳＩを含有している配列が続く。特異的な実施形態においては、ＭＦＡには、センス鎖上の方向に関して５’から３’の方向に、以下が含まれる：第１のリコンビナーゼ部位Ｒ１、第２のリコンビナーゼ部位Ｒ２、第３のリコンビナーゼ部位Ｒ３、アンチセンス方向のＣＯＩＮ、第４のリコンビナーゼ部位Ｒ４、第５のリコンビナーゼ部位Ｒ５、第６のリコンビナーゼ部位Ｒ３’（これは、Ｒ３と適合性であり、Ｒ３とＲ３’の間にある配列の欠失を指示するように方向を合わせられている）、アンチセンス方向のＮＳＩ、第７のリコンビナーゼ部位Ｒ２’（これは、Ｒ２と適合性であり、Ｒ２とＲ２’の間にある配列を欠失を指示するように方向を合わせられている）、第８のリコンビナーゼ部位Ｒ４’、ＤＳＣ、第９のリコンビナーゼ部位Ｒ１’（これは、Ｒ１と適合性であり、Ｒ１とＲ１’の間にある配列の欠失を指示するように方向を合わせられている）、センス方向のレポーター、および第１０のリコンビナーゼ部位Ｒ５’（これは、Ｒ５と適合性であり、Ｒ５とＲ５’の間にある配列の反転を指示するように方向を合わせられている）。

特異的な実施形態においては、Ｒ１／Ｒ１’はＲｏｘ部位であり、Ｒ２／Ｒ２’はｌｏｘＰ部位であり、Ｒ３／Ｒ３’は、ｌｏｘ２３７２部位であり、Ｒ４／Ｒ４’はＦＲＴ部位であり、そしてＲ５／Ｒ５’はＦＲＴ３部位である。特異的な実施形態においては、ＭＦＡには、図１１、パネルＡに示すような、リコンビナーゼ部位およびＣＯＩＮ、ＮＳＩ、ＤＳＣと、レポーターの配置が含まれる。特異的な実施形態においては、Ｒ１／Ｒ１’を認識する１種類のリコンビナーゼに対して暴露されると、図１１、パネルＢに示すような対立遺伝子が形成される。特異的な実施形態においては、Ｒ４／Ｒ４’およびＲ５／Ｒ５’を認識する１種類のリコンビナーゼに対して暴露されると、図１１、パネルＣに示すような対立遺伝子が形成される。特異的な実施形態においては、Ｒ２／Ｒ２’およびＲ３／Ｒ３’を認識するさらなるリコンビナーゼに対して図１１、パネルＣの対立遺伝子が暴露されると、図１１、パネルＤに示すような対立遺伝子が形成される。

１つの態様では、転写方向に関して５’から３’の方向に、アンチセンス方向のＮＳＩ、ＤＳＣ、センス方向のレポーター、およびアンチセンス方向のＣＯＩＮを含有しているＭＦＡを含む核酸構築物が提供される。この場合、ＭＦＡが選択されたリコンビナーゼで処理されると、ＮＳＩとＤＳＣが切り出され、レポーターはセンス方向で残り、ＣＯＩＮはアンチセンス方向で残る。ここでは、異なる選択されたリコンビナーゼで別の処理が行われると、ＤＳＣとレポーターが切り出され、ＮＳＩはセンス方向で配置され、ＣＯＩＮはアンチセンス方向で存在する。この場合、異なる選択されたリコンビナーゼでの別の処理の後、対立遺伝子は、なお別の異なる選択されたリコンビナーゼで処理され、それにより、ＮＳＩの切り出しとセンス方向でのＣＯＩＮの配置が生じる。

１つの実施形態においては、ＭＦＡには、第１の組み換え可能なユニット、第２の組み換え可能なユニット、および第３の組み換え可能なユニットが含まれる。ここでは、第１の組み換え可能なユニットは第２および第３の組み換え可能なユニットと重複しており、第２の組み換え可能なユニットは第１および第３の組み換え可能なユニットと重複している。１つの実施形態においては、第１の組み換え可能なユニットにＤＳＣとセンス方向のレポーターが含まれる。この場合、組み換え可能なユニットには組み換え部位Ｒ２、続いてＲ３がＤＳＣの上流に隣接しており、レポーターの下流にはリコンビナーゼ部位Ｒ３’が隣接している。ここでは、Ｒ２／Ｒ３’は反転を指示するように方向を合わせられており、ＤＳＣの前には、反転を指示するようにＲ２に関して方向を合わせられたＲ２’が存在する。第２の組み換え可能なユニットには、アンチセンスＮＳＩの上流にＲ４が隣接しており、アンチセンスＣＯＩＮの下流にはＲ４’が隣接している。ここでは、Ｒ４／Ｒ４’は切り出しを指示するように方向を合わせられており、第２の組み換え可能なユニットにはＤＳＣとレポーターが含まれる。そして、第３の組み換え可能なユニットには、上流にＲ１が隣接しており、下流にはＲ１’が隣接している。この場合、Ｒ１／Ｒ１’は切り出しを指示するように方向を合わせられている。この場合、Ｒ１’の上流の隣接はＤＳＣであり、Ｒ１の下流の隣接はＲ２である。特異的な実施形態においては、ＭＦＡには、転写方向に関して５’から３’の方向に、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、アンチセンス方向のＮＳＩ、Ｒ５、Ｒ２’（ここでは、Ｒ２／Ｒ２’は反転を指示するように方向を合わせられている）、ＤＳＣ、Ｒ１’（ここでは、Ｒ１／Ｒ１’は反転を指示するように方向を合わせられている）、レポーター遺伝子、Ｒ３’（ここでは、Ｒ３／Ｒ３’は反転を指示するように方向を合わせられている）、アンチセンス方向のＣＯＩＮ、Ｒ５’（ここでは、Ｒ５／Ｒ５’は切り出しを指示するように方向を合わせられている）、およびＲ４’（ここでは、Ｒ４／Ｒ４’は切り出しを指示するように方向を合わせられている）が含まれる。

特異的な実施形態においては、Ｒ１／Ｒ１’はＲｏｘ部位であり、Ｒ２／Ｒ２’はＦＲＴまたはＦＲＴ３部位であり、Ｒ３／Ｒ３’はＦＲＴまたはＦＲＴ３部位であり（これらは、Ｒ２／Ｒ２’と同じではない）、Ｒ４／Ｒ４’はｌｏｘ２３７２部位またはｌｏｘＰ部位であり、そしてＲ５／Ｒ５’はｌｏｘ２３７２部位またはｌｏｘＰ部位である（これらはＲ４／Ｒ４’と同じではない）。

特異的な実施形態においては、ＭＦＡには、図１２、パネルＡに示すような、リコンビナーゼ部位およびＣＯＩＮ、ＮＳＩ、ＤＳＣ、ならびにレポーターの配置が含まれる。選択されたリコンビナーゼでの処理により、図１２、パネルＢに示す対立遺伝子が生じる。異なる選択されたリコンビナーゼでの別の処理により、図１２、パネルＣに示す対立遺伝子が生じる。図１２、パネルＣの対立遺伝子の、なお別の異なるリコンビナーゼでの処理により、図１２、パネルＤに示す対立遺伝子が生じる。

１つの態様では、転写方向に関して５’から３’の方向に、センス方向のレポーター、ＤＳＣ、アンチセンス方向のＮＳＩ、およびアンチセンス方向のＣＯＩＮを含有しているＭＦＡを含む核酸構築物が提供される。第１の選択されたリコンビナーゼでＭＦＡが処理されると、レポーターが切り出され、ＮＳＩはセンス方向に配置され、ＣＯＩＮはアンチセンス方向で残る。この場合、対立遺伝子には、第２の選択されたリコンビナーゼで処理されると、センス方向にＣＯＩＮを配置し、ＮＳＩをアンチセンス方向に配置する配列の反転を可能にするリコンビナーゼ部位が含まれる。１つの実施形態においては、第１の選択されたリコンビナーゼに続き、対立遺伝子は、第２の選択されたリコンビナーゼで処理される。１つの実施形態においては、ＣＯＩＮは、ＮＳＩが第２のリコンビナーゼでの処理後にアンチセンス方向で配置されるきっかけとなる。

１つの実施形態においては、ＭＦＡには、転写方向に関して５’から３’の方向に、リコンビナーゼ部位Ｒ１、レポーター、第２のリコンビナーゼ部位Ｒ２、ＤＳＣ、第３のリコンビナーゼ部位Ｒ３、アンチセンス方向のＮＳＩ、第４のリコンビナーゼ部位Ｒ４、第５のリコンビナーゼ部位Ｒ５、第６のリコンビナーゼ部位Ｒ１’（これはＲ１と適合性であり、反転を指示するようにＲ１に関して方向を合わせられている）、第７のリコンビナーゼ部位Ｒ３’（これはＲ３と適合性であり、反転を指示するようにＲ３に関して方向を合わせられている）、アンチセンス方向のＣＯＩＮ、第８のリコンビナーゼ部位Ｒ５’（これはＲ５と適合性であり、切り出しを指示するようにＲ５に関して方向を合わせられている）、第９のリコンビナーゼ部位Ｒ４’（これはＲ４と適合性であり、切り出しを指示するようにＲ４に関して方向を合わせられている）、および第１０のリコンビナーゼ部位Ｒ２’（これはＲ２と適合性であり、切り出しを指示するようにＲ２に関して方向を合わせられている）が含まれる。特異的な実施形態においては、Ｒ１／Ｒ１’は、ＦＲＴ３またはＦＲＴ部位であり、Ｒ２／Ｒ２’は、Ｒｏｘ部位であり、Ｒ３／Ｒ３’は、ＦＲＴ３またはＦＲＴ部位であり（これらはＲ１／Ｒ１’とは異なる）、Ｒ４／Ｒ４’は、ｌｏｘＰまたはｌｏｘ２３７２部位であり、そしてＲ５／Ｒ５’は、ｌｏｘＰまたはｌｏｘ２３７２部位である（これらはＲ４／Ｒ４’部位とは異なる）。

特異的な実施形態においては、ＭＦＡに、図１３、パネルＡに示すような、リコンビナーゼ部位およびＣＯＩＮ、ＮＳＩ、ＤＳＣ、ならびにレポーターの配置が含まれる。選択されたリコンビナーゼでの処理により、図１３、パネルＢに示す対立遺伝子が生じる。図１３、パネルＢの対立遺伝子の異なるリコンビナーゼでの処理により、図１３、パネルＣに示す対立遺伝子が生じる。

１つの態様では、転写方向に関して５’から３’の方向に、アンチセンス方向のＣＯＩＮ、アンチセンス方向のＮＳＩ、ＤＳＣ、およびセンス方向のレポーターを含有しているＭＦＡを含む核酸構築物が提供される。この場合、第１の選択されたリコンビナーゼでＭＦＡが処理されると、レポーターが切り出され、ＮＳＩがセンス方向で配置され、そしてＣＯＩＮはセンス方向で残る。ここでは、対立遺伝子には、第２の選択されたリコンビナーゼで処理されると、ＣＯＩＮをセンス方向で、そしてＮＳＩをアンチセンス方向で配置する配列の反転を可能にするリコンビナーゼ部位が含まれる。１つの実施形態においては、第１の選択されたリコンビナーゼの後、対立遺伝子は第２の選択されたリコンビナーゼで処理される。１つの実施形態においては、ＣＯＩＮは、ＮＳＩが第２のリコンビナーゼでの処理後にアンチセンス方向で配置されるきっかけとなる。

１つの実施形態においては、ＭＦＡには、転写方向に関して５’から３’の方向に、リコンビナーゼ部位Ｒ１、第２のリコンビナーゼ部位Ｒ２、第３のリコンビナーゼ部位Ｒ３、アンチセンス方向のＣＯＩＮ、第４のリコンビナーゼ部位Ｒ４、第５のリコンビナーゼ部位Ｒ５、第６のリコンビナーゼ部位Ｒ３’（これはＲ３と適合性であり、切り出しを指示するようにＲ３に関して方向を合わせられている）、第７のリコンビナーゼ部位Ｒ２’（これはＲ２と適合性であり、切り出しを指示するようにＲ２に関して方向を合わせられている）、アンチセンス方向のＮＳＩ、第８のリコンビナーゼ部位Ｒ４’（これはＲ４と適合性であり、反転を指示するようにＲ４に関して方向を合わせられている）、ＤＳＣ、第９のリコンビナーゼ部位Ｒ１’（これはＲ１と適合性であり、切り出しを指示するようにＲ１に関して方向を合わせられている）、センス方向のレポーター、および第１０のリコンビナーゼ部位Ｒ５’（これはＲ５と適合性であり、反転を指示するようにＲ５に関して方向を合わせられている）が含まれる。特異的な実施形態においては、Ｒ１／Ｒ１’はＲｏｘ部位であり、Ｒ２／Ｒ２’はｌｏｘＰまたはｌｏｘ２３７２部位であり、Ｒ３／Ｒ３’はｌｏｘＰまたはｌｏｘ２３７２部位であり（これらはＲ２／Ｒ２’とは異なる）、Ｒ４／Ｒ４’はＦＲＴまたはＦＲＴ３部位であり、そしてＲ５／Ｒ５’はＦＲＴまたはＦＲＴ３部位である（これらはＲ４／Ｒ４’とは異なる）。

特異的な実施形態においては、ＭＦＡには、図１４、パネルＡに示すような、リコンビナーゼ部位およびＣＯＩＮ、ＮＳＩ、ＤＳＣ、ならびにレポーターの配置が含まれる。選択されたリコンビナーゼでの処理により、図１４、パネルＢに示す対立遺伝子が生じる。図１４、パネルＢの対立遺伝子の異なるリコンビナーゼでの処理により、図１４、パネルＣに示す対立遺伝子が生じる。

１つの態様では、転写方向に関して５’から３’の方向に、アンチセンス方向のＮＳＩ、ＤＳＣ、センス方向のレポーター、およびアンチセンス方向のＣＯＩＮを含むＭＦＡを含有している核酸構築物が提供される。この場合、第１の選択されたリコンビナーゼでのＭＦＡの処理により、レポーターが切り出され、ＤＳＣが切り出され、ＮＳＩがセンス方向で配置され、そしてＣＯＩＮはアンチセンス方向で残る。ここでは、第１の選択されたリコンビナーゼでの処理の後、対立遺伝子には、第２の選択されたリコンビナーゼで処理されると、ＣＯＩＮをセンス方向で、そしてＮＳＩをアンチセンス方向で配置する配列の反転を可能にするリコンビナーゼ部位が含まれる。１つの実施形態においては、第１の選択されたリコンビナーゼの後、対立遺伝子は第２の選択されたリコンビナーゼで処理される。１つの実施形態においては、ＣＯＩＮは、ＮＳＩが第２のリコンビナーゼでの処理後にアンチセンス方向で配置されるきっかけとなる。

１つの実施形態においては、ＭＦＡには、転写方向に関して５’から３’の方向に、リコンビナーゼ部位Ｒ１、第２のリコンビナーゼ部位Ｒ２、第３のリコンビナーゼ部位Ｒ３、アンチセンス方向のＮＳＩ、第４のリコンビナーゼ部位Ｒ４、第５のリコンビナーゼ部位Ｒ５、第６のリコンビナーゼ部位Ｒ２’（これはＲ２と適合性であり、反転を指示するようにＲ２に関して方向を合わせられている）、ＤＳＣ、第７のリコンビナーゼ部位Ｒ１’（これはＲ１と適合性であり、切り出しを指示するようにＲ１に関して方向を合わせられている）、センス方向のレポーター、第８のリコンビナーゼ部位Ｒ３’（これはＲ３と適合性であり、反転を指示するようにＲ３に関して方向を合わせられている）、逆方向のＣＯＩＮ、第９のリコンビナーゼ部位Ｒ５’（これはＲ５と適合性であり、切り出しを指示するようにＲ５に関して方向を合わせられている）、および第１０のリコンビナーゼ部位Ｒ４’（これはＲ４と適合性であり、切り出しを指示するようにＲ４に関して方向を合わせられている）が含まれる。特異的な実施形態においては、Ｒ１／Ｒ１’は、Ｒｏｘ部位であり、Ｒ２／Ｒ２’は、ＦＲＴまたはＦＲＴ３部位であり、Ｒ３／Ｒ３’はＦＲＴまたはＦＲＴ３部位であり（これらはＲ２／Ｒ２’とは異なる）、Ｒ４／Ｒ４’は、ｌｏｘＰまたはｌｏｘ２３７２部位であり、そしてＲ５／Ｒ５’はｌｏｘＰまたはｌｏｘ２３７２部位である（これらはＲ４／Ｒ４’とは異なる）。

特異的な実施形態においては、ＭＦＡには、図１５、パネルＡに示すような、リコンビナーゼ部位およびＣＯＩＮ、ＮＳＩ、ＤＳＣ、ならびにレポーターの配置が含まれる。選択されたリコンビナーゼでの処理により、図１５、パネルＢに示す対立遺伝子が生じる。図１５、パネルＢの対立遺伝子の異なるリコンビナーゼでの処理により、図１５、パネルＣに示す対立遺伝子が生じる。

１つの態様では、ＤＳＣ、レポーター、ＣＯＩＮ、ＮＳＩ、およびレポーター、ＤＳＣ、ＣＯＩＮ、およびＮＳＩの間に並べられた５対のリコンビナーゼ部位を含有している多機能性対立遺伝子が提供される。この場合、リコンビナーゼ部位のどの対も、いずれの他の対とも同じではない。ここでは、リコンビナーゼ部位の第１の２つの対は同じ第１のリコンビナーゼにより認識され、リコンビナーゼ部位の第２の２つの対は同じ第２のリコンビナーゼにより認識され、リコンビナーゼ部位の第５の対は第３のリコンビナーゼにより認識される。ここでは、上記第１、第２、および第３のリコンビナーゼは同じではない。ここでは、ＭＦＡには、転写方向に関して（５’から３’の方向に）以下が含まれる：（ａ）（例えば、レポーターとともに）センス方向の動作配列、センス方向またはアンチセンス方向のＤＳＣ、アンチセンス方向のＮＳＩ、アンチセンス方向のＣＯＩＮ；（ｂ）アンチセンス方向のＣＯＩＮ、アンチセンス方向のＮＳＩ、センス方向またはアンチセンス方向のＤＳＣ、センス方向のレポーター；（ｃ）アンチセンス方向のＮＳＩ、センス方向またはアンチセンス方向のＤＳＣ、センス方向のレポーター、アンチセンス方向のＣＯＩＮ；（ｄ）センス方向のレポーター、センス方向またはアンチセンス方向のＤＳＣ、アンチセンス方向のＮＳＩ、アンチセンス方向のＣＯＩＮ；（ｅ）アンチセンス方向のＣＯＩＮ、アンチセンス方向のＮＳＩ、センス方向またはアンチセンス方向のＤＳＣ、センス方向のレポーター；あるいは、（ｆ）アンチセンス方向のＮＳＩ、センス方向またはアンチセンス方向のＤＳＣ、センス方向のレポーター、アンチセンス方向のＣＯＩＮ。

１つの実施形態においては、並びは（ａ）のとおりであり、リコンビナーゼ部位の対は、第３のリコンビナーゼに対して暴露されると、リコンビナーゼ部位の第５の対がＤＳＣ、ＮＳＩ、およびＣＯＩＮの切り出しを指示するように並べられている。この場合、レポーターはセンス方向で維持される。

１つの実施形態においては、並びは（ａ）のとおりであり、リコンビナーゼ部位の対は、第１のリコンビナーゼに対して暴露されると、ここでは、リコンビナーゼ部位の第１の２つの対がレポーターの切り出し、ＤＳＣの切り出し、およびＮＳＩのセンス方向への反転を指示し、ＣＯＩＮはアンチセンス方向で維持されている修飾されたＭＦＡが形成されるように並べられている。さらなる実施形態においては、修飾されたＭＦＡには、これらは、第２のリコンビナーゼに対して暴露されると、ＮＳＩが切り出されており、ＣＯＩＮがセンス方向で配置されている対立遺伝子を生じるリコンビナーゼ部位の第２の２つの対が含まれる。

１つの実施形態においては、並びは（ｂ）のとおりであり、リコンビナーゼ部位の対は、第３のリコンビナーゼに対して暴露されると、リコンビナーゼ部位の第５の対が、ＣＯＩＮ、ＮＳＩ、およびＤＳＣの切り出しを指示するように並べられている。この場合、レポーターはセンス方向で維持される。

１つの実施形態においては、並びは（ｂ）のとおりであり、リコンビナーゼ部位の対は、第１のリコンビナーゼに対して暴露されると、リコンビナーゼ部位の第１の２つの対がＤＳＣとレポーターの切り出しを指示し、そしてＮＳＩのセンス方向への反転を指示する修飾されたＭＦＡが形成されるように並べられている。ここでは、ＣＯＩＮはアンチセンス方向で維持される。さらなる実施形態においては、修飾されたＭＦＡにはリコンビナーゼ部位の第２の２つの対が含まれ、これらは、第２のリコンビナーゼに対して暴露されると、ＮＳＩが切り出されており、ＣＯＩＮがセンス方向で配置されている対立遺伝子を生じる。

１つの実施形態においては、並びは（ｃ）のとおりであり、リコンビナーゼ部位の対は、第５のリコンビナーゼに対して暴露されると、ＮＳＩとＤＳＣが切り出され、レポーターとＣＯＩＮはアンチセンス方向で維持されるように並べられている。

１つの実施形態においては、並びは（ｃ）のとおりであり、リコンビナーゼ部位の対は、第１のリコンビナーゼに対して暴露されると、ＤＳＣとレポーターが切り出されており、ＮＳＩがセンス方向で配置されており、ＣＯＩＮはアンチセンス方向で維持されている修飾されたＭＦＡが形成されるように並べられている。さらなる実施形態においては、修飾されたＭＦＡには、リコンビナーゼ部位の第２の２つの対が含まれ、これらは、第２のリコンビナーゼに対して暴露されると、ＮＳＩが切り出され、ＣＯＩＮがセンス方向で配置される対立遺伝子を生じる。

１つの実施形態においては、並びは（ｄ）のとおりであり、リコンビナーゼ部位の対は、第５のリコンビナーゼに対して暴露されると、ＤＳＣ、ＮＳＩ、およびＣＯＩＮが切り出され、レポーターがセンス方向で維持されるように並べられている。

１つの実施形態においては、並びは（ｄ）のとおりであり、リコンビナーゼ部位の対は、第１のリコンビナーゼに対して暴露されると、レポーターとＤＳＣが切り出され、ＮＳＩがセンス方向で配置され、ＣＯＩＮがアンチセンス方向で維持される修飾されたＭＦＡが形成されるように並べられている。さらなる実施形態においては、修飾されたＭＦＡにはリコンビナーゼ部位の第２の２つの対が含まれ、これらは、第２のリコンビナーゼに対して暴露されると、ＣＯＩＮがセンス方向で配置され、ＮＳＩがアンチセンス方向で配置される対立遺伝子を生じる。

１つの実施形態においては、並びは（ｅ）のとおりであり、リコンビナーゼ部位の対は、第５のリコンビナーゼに対して暴露されると、ＣＯＩＮ、ＮＳＩ、およびＤＳＣが切り出され、レポーターがセンス方向で維持されるように並べられている。

１つの実施形態においては、並びは（ｅ）のとおりであり、リコンビナーゼ部位の対は、第１のリコンビナーゼに対して暴露されると、ＤＳＣとレポーターが切り出され、ＮＳＩがセンス方向で配置され、ＣＯＩＮがアンチセンス方向で維持されている修飾されたＭＦＡが形成されるように並べられている。さらなる実施形態においては、修飾されたＭＦＡには、第２のリコンビナーゼに対して暴露されると、ＮＳＩがアンチセンス方向で配置され、ＣＯＩＮがセンス方向で配置されるように並べられたリコンビナーゼ部位の第２の２つの対が含まれる。

１つの実施形態においては、並びは（ｆ）のとおりであり、リコンビナーゼ部位の対は、第５のリコンビナーゼに対して暴露されると、ＮＳＩとＤＳＣが切り出され、レポーターがセンス方向で維持され、ＣＯＩＮがアンチセンス方向で維持されるように並べられている。

１つの実施形態においては、並びは（ｆ）のとおりであり、リコンビナーゼ部位の対は、第５のリコンビナーゼに対して暴露されると、ＮＳＩとＤＳＣが切り出され、レポーターがセンス方向で維持され、ＣＯＩＮがアンチセンス方向で維持されるように並べられている。

１つの実施形態においては、並びは（ｆ）のとおりであり、リコンビナーゼ部位の対は、第１のリコンビナーゼに対して暴露されると、ＤＳＣとレポーターが切り出され、ＮＳＩがセンス方向で配置され、ＣＯＩＮがアンチセンス方向で維持される修飾されたＭＦＡが形成されるように並べられている。さらなる実施形態においては、修飾されたＭＦＡには、第２のリコンビナーゼに対して暴露されると、ＮＳＩがアンチセンス方向で配置され、ＣＯＩＮがセンス方向で配置されるように並べられたリコンビナーゼ部位の第２の２つの対が含まれる。

１つの態様では、アンチセンス方向の目的のヌクレオチド配列とアンチセンス方向のＣＯＩＮを有している構築物を含有する細胞を作製するための方法が提供される。この方法には、本明細書中に記載されるＭＦＡを細胞のゲノムに導入する工程、ＭＦＡを含有している細胞を同定する工程、続いて、上記ゲノムを第１のリコンビナーゼに対して暴露する工程が含まれる。ここでは、ゲノム中の構築物に対する第１のリコンビナーゼの作用により、センス方向で配置された目的のヌクレオチド配列が生じる。

１つの実施形態においては、細胞は、多能性細胞、人工多能性細胞、全能細胞、またはＥＳ細胞である。特異的な実施形態においては、ＥＳ細胞は、マウスまたはラットのＥＳ細胞である。

１つの実施形態においては、構築物は、相同組み換えにより細胞に導入される。別の実施形態においては、構築物は細胞の核酸に無作為に組み込まれる。１つの実施形態においては、細胞の核酸は細胞のゲノムである。

１つの実施形態においては、ＮＳＩに１つのエキソンが含まれる。１つの実施形態においては、ＮＳＩに、１つのエキソンと隣接するイントロン配列が含まれる。特異的な実施形態においては、隣接するエキソンには、５’と３’にイントロン配列が隣接している。１つの実施形態においては、ヌクレオチド配列に２つ以上のエキソンが含まれ、特異的な実施形態においては、イントロン配列（単数または複数）が含まれる。別の実施形態においては、ＮＳＩは１つのエキソンが欠失しているか、または１つのエキソンの１つの断片が欠失している。

１つの実施形態においては、ＮＳＩは、１つの遺伝子の１つの野生型エキソンまたは複数のエキソンである。別の実施形態においては、ＮＳＩは、１つ以上の核酸置換、欠失、または付加を有している、１つの遺伝子の１つのエキソンまたは複数のエキソンである。

１つの実施形態においては、ＣＯＩＮには、１つ以上の核酸置換、欠失、または付加を含む、１つの遺伝子の１つのエキソンが含まれる。特異的な実施形態においては、ＣＯＩＮに、ヒト、マウス、サル、またはラットの遺伝子の１つのエキソンが含まれる。

１つの実施形態においては、ＣＯＩＮに３’スプライシング領域が含まれる。特異的な実施形態においては、３’スプライシング領域の後ろに、ｃＤＮＡ、エキソン−イントロン配列、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡクラスター、低分子ＲＮＡ、コドンスキップエレメント、ＩＲＥＳ、ポリアデニル化配列、およびそれらの組み合わせより選択される配列が続く。特異的な実施形態においては、低分子ＲＮＡはミュートロンである。特異的な実施形態においては、コドンスキップエレメントは、Ｔ２Ａ、Ｅ２Ａ、またはＦ２Ａである。

１つの実施形態においては、ＣＯＩＮは、レポーター、遺伝子トラップ様エレメント（ＧＴ様エレメント）、および遺伝子トラップ様レポーター（ＧＴ様レポーター）より選択される。特異的な実施形態においては、ＧＴ様エレメントは、ＳＡ−薬剤耐性ｃＤＮＡ−ｐｏｌｙＡより選択される。特異的な実施形態においては、ＧＴ様レポーターは、ＳＡ−レポーター−ｐｏｌｙＡより選択される。

１つの態様では、マウスの細胞ゲノム中に多機能性対立遺伝子を配置するための方法が提供される。この方法には、マウスの細胞中の１つの遺伝子座に、以下を含む第１の組み換え可能なユニットを含有している標的化構築物を導入する工程が含まれる：（ａ）動作配列（例えば、ヌクレオチド配列および／またはレポーター）；（ｂ）ＤＳＣ；（ｃ）上記遺伝子座に関してアンチセンス方向のＮＳＩ；（ｄ）上記遺伝子座に関してアンチセンス方向のＣＯＩＮ；ならびに、（ｅ）レポーターとＤＳＣを欠失させるため、ＮＳＩをセンス方向に反転させて戻すため、およびＣＯＩＮを反転させてＮＳＩを欠失させるかまたは再度反転させるために組み換え可能なユニットの中に並べられた部位特異的リコンビナーゼ認識部位。

１つの実施形態においては、部位特異的リコンビナーゼ認識部位は、ＮＳＩがアンチセンス鎖になるように再度反転させられ、ＣＯＩＮがセンス鎖になるように反転させられるように組み換え可能なユニットの中に並べられる。別の実施形態においては、部位特異的リコンビナーゼ認識部位は、ＮＳＩが欠失させられ、ＣＯＩＮがセンス鎖になるように反転させられるように組み換え可能なユニットの中に並べられる。

１つの実施形態においては、組み換え可能なユニットは、第１のリコンビナーゼに対してＭＦＡが修飾された標的遺伝子座が暴露されると、レポーターとＤＳＣとを含有している第１の組み換え可能なユニットが欠失させられ、ＮＳＩが、上記遺伝子座に関してセンス方向で配置され、ＣＯＩＮがアンチセンス方向で維持されて、第２の組み換え可能なユニットが形成するように並べられる。

１つの実施形態においては、アンチセンス方向の目的のヌクレオチド配列は、アンチセンス方向のエキソンまたはイントロン配列が隣接しているエキソン（ここでは、エキソンとイントロン配列は互いにアンチセンス方向で存在する）である。特異的な実施形態においては、アンチセンス方向で配置されているエキソンは、標的化構築物により置き換えられたエキソンと同一である。特異的な実施形態においては、アンチセンス方向のＮＳＩは、１つのエキソンとそのエキソンの周囲の配列である。特異的な実施形態においては、ＮＳＩは２つ以上のエキソンである。特異的な実施形態においては、ＮＳＩはエキソンではない配列である。

１つの実施形態においては、第１のリコンビナーゼの作用により生じた第２の組み換え可能なユニットが第２のリコンビナーゼに対して暴露される。ここでは、第２のリコンビナーゼがＮＳＩを欠失させ、ＣＯＩＮをセンス方向で配置する。

１つの実施形態においては、第１のリコンビナーゼの作用により生じた第２の組み換え可能なユニットが第２のリコンビナーゼに対して暴露される。ここでは、第２のリコンビナーゼがＮＳＩをアンチセンス方向で配置し、ＣＯＩＮをセンス方向で配置する。

１つの態様では、ノックアウトの相補のための方法が提供される。この方法には、ヒト以外の動物に本明細書中に記載されるＭＦＡを導入する工程が含まれる。ここでは、上記核酸構築物には、アンチセンス方向の野生型核酸配列とアンチセンス方向のＣＯＩＮが含まれ、上記核酸構築物が第１のリコンビナーゼに対して暴露されると、野生型核酸配列が反転してセンス方向となり、転写されるが、ＣＯＩＮはアンチセンス方向で残る。第２のリコンビナーゼに対して暴露されると、上記野生型核酸配列が切り出されるか、または反転してアンチセンス鎖に戻され、ＣＯＩＮは反転してセンス方向になる。

１つの実施形態においては、ヒト以外の動物はマウスである。

１つの実施形態においては、ＣＯＩＮがレポーターエレメントである。１つの実施形態においては、レポーターエレメントは、蛍光タンパク質、発光タンパク質、または酵素より選択される。特異的な実施形態においては、レポーターは、ＧＦＰ、ｅＧＦＰ、ＣＦＰ、ＹＦＰ、ｅＹＦＰ、ＢＦＰ、ｅＢＦＰ、ＤｓＲｅｄ、ＭｍＧＦＰ、ルシフェラーゼ、ＬａｃＺ、およびアルカリホスファターゼより選択される。

１つの態様では、本発明の多機能性対立遺伝子を含有している哺乳動物細胞が提供される。

１つの実施形態においては、哺乳動物細胞は、マウス細胞およびラット細胞より選択される。１つの実施形態においては、細胞は、幹細胞、胚性幹（ＥＳ）細胞、人工多能性細胞、多能性細胞、および全能細胞より選択される。

１つの態様では、本発明の多機能性対立遺伝子を含有しているヒト以外の胚またはヒト以外の動物が提供される。

１つの実施形態においては、ヒト以外の胚またはヒト以外の動物に、１種類以上の部位特異的リコンビナーゼに対して暴露された多機能性対立遺伝子が含まれる。特異的な実施形態においては、上記多機能性対立遺伝子は、交雑工程の結果として１種類以上の部位特異的リコンビナーゼに暴露されている。ここでは、多機能性対立遺伝子を含有しているヒト以外の動物が、１種類以上の部位特異的リコンビナーゼを含有しているヒト以外の動物と交配させられ、ヒト以外の胚またはヒト以外の動物は交雑工程の子孫である。

１つの態様では、本明細書中に記載されるＭＦＡを含有している細胞が提供される。ここでは、細胞は哺乳動物細胞（例えば、ＥＳ細胞または多能性細胞または人工多能性細胞）である。特異的な実施形態においては、細胞はマウスまたはラットの細胞である。

１つの態様では、本明細書中に記載されるＭＦＡ、または本明細書中に記載されるように１種類以上のリコンビナーゼに暴露されたＭＦＡを含有している、ヒト以外の動物が提供される。

１つの態様では、本明細書中に記載されるＭＦＡ、または本明細書中に記載されるように１種類以上のリコンビナーゼに暴露されたＭＦＡを含有している、ヒト以外の胚が提供される。

１つの態様では、本明細書中に記載されるＭＦＡを使用して作製された細胞、ヒト以外の胚、またはヒト以外の動物が提供される。

１つの態様では、本明細書中に記載されるＭＦＡを使用して作製された細胞、ヒト以外の胚、またはヒト以外の動物が提供される。

任意の態様または実施形態は、必要に応じて任意の他の態様または実施形態と組み合わせて使用することができる。例えば、任意の特定のＭＦＡの実施形態と組み合わせて記載される任意のレポーターまたはＤＳＣが、本明細書中に記載される任意のＭＦＡの実施形態とともに使用され得、そして、任意の特定のＭＦＡの実施形態と組み合わせて記載される任意の特定のリコンビナーゼまたはリコンビナーゼ部位が、本明細書中に記載される任意のＭＦＡの実施形態とともに使用され得る。

本願は特定の実施形態において、例えば以下の項目を提供する：
（項目１）
（ａ）細胞の核酸の標的遺伝子に対して核酸構築物を誘導するための標的化アーム；
（ｂ）前記標的遺伝子の転写に関してセンス方向の動作配列、およびセンス方向またはアンチセンス方向の薬剤選択カセット（ＤＳＣ）；
（ｂ）アンチセンス方向の、目的のヌクレオチド配列（ＮＳＩ）およびＣＯＩＮ；ならびに、
（ｃ）（ｉ）前記動作配列と前記ＤＳＣとを欠失し、かつ
（ｉｉ）センス方向の前記ＮＳＩとアンチセンス方向の前記ＣＯＩＮとを含む、
条件的対立遺伝子を形成させるための、第１のリコンビナーゼに対して暴露されると組み換わる組み換え可能なユニット；
を含む核酸構築物であって、
ここでは、前記組み換え可能なユニットに、前記第１のリコンビナーゼにより認識される類似するリコンビナーゼ認識部位の２つの第１の対、第２のリコンビナーゼにより認識される類似するリコンビナーゼ認識部位の２つの第２の対、および第３のリコンビナーゼにより認識される類似するリコンビナーゼ認識部位の１つの第３の対が含まれ；ここでは、リコンビナーゼ認識部位の前記第１の対、前記第２の対、および前記第３の対が、異なるリコンビナーゼにより認識される、核酸構築物。
（項目２）
前記条件的対立遺伝子が、第２の部位特異的リコンビナーゼに対してさらに暴露されると、前記ＮＳＩを欠失し、前記ＣＯＩＮをセンス方向で有する対立遺伝子を形成するように組み換わる、項目１に記載の核酸構築物。
（項目３）
ヒト以外の細胞を修飾するための方法であって、前記方法は：
項目１に記載の核酸構築物で細胞中の目的のヌクレオチド配列を標的化して、標的化された細胞を形成させる工程、
前記標的化された細胞を第１のリコンビナーゼに対して暴露して、条件的対立遺伝子を形成させる工程、および
前記条件的対立遺伝子を、ＮＳＩを切り出し、ＣＯＩＮをセンス方向で配置する第２のリコンビナーゼに対して暴露する工程
を包含する、方法。
（項目４）
前記細胞中の前記ＮＳＩが、１つの表現型と関係がある１つのエキソンまたは１つのヌクレオチド配列である、項目３に記載の方法。
（項目５）
前記細胞中の前記目的のヌクレオチド配列が項目１に記載の核酸構築物により置き換えられる、項目４に記載の方法。
（項目６）
前記標的化された細胞が形成させた後であるが、前記第１のリコンビナーゼに対して暴露させる前に、前記表現型が最初に決定される、項目５に記載の方法。
（項目７）
前記第１のリコンビナーゼに対して暴露した後に、前記表現型が２回目に決定される、項目６に記載の方法。
（項目８）
薬剤選択カセット（ＤＳＣ）、レポーター、ＣＯＩＮ、目的のヌクレオチド配列（ＮＳＩ）、ならびに前記レポーター、前記ＤＳＣ、前記ＣＯＩＮ、および前記ＮＳＩの間に並べられた５対のリコンビナーゼ部位を含む核酸構築物であって；
ここで、どのリコンビナーゼ部位の対も、任意の他の対とは同一ではなく、リコンビナーゼ部位の第１の２つの対は同じ第１のリコンビナーゼにより認識され、リコンビナーゼ部位の第２の２つの対は同じ第２のリコンビナーゼにより認識され、そしてリコンビナーゼ部位の第５の対は第３のリコンビナーゼにより認識され；
ここで、前記第１のリコンビナーゼ、前記第２のリコンビナーゼ、および前記第３のリコンビナーゼは同じではなく、転写方向に関して、前記レポーターはセンス方向であり、前記ＮＳＩはアンチセンス方向であり、前記ＣＯＩＮはアンチセンス方向であり、そして前記ＤＳＣはセンス方向またはアンチセンス方向であり；そして、
ここで、リコンビナーゼ部位の前記第１の２つの対とリコンビナーゼ部位の前記第２の２つの対は、前記第１のリコンビナーゼに対して暴露されると、修飾された対立遺伝子が形成するように並べられており、ここで、リコンビナーゼ部位の前記第１の２つの対が前記レポーターの切り出し、前記ＤＳＣの切り出し、前記ＮＳＩのセンス方向への反転を誘導し、前記ＣＯＩＮがアンチセンス方向で維持され、かつ（ａ）リコンビナーゼ部位の前記第２の２つの対が、前記第２のリコンビナーゼに対して暴露されると、前記ＮＳＩが切り出され、前記ＣＯＩＮがセンス方向で配置されるように並べられているか；または（ｂ）リコンビナーゼ部位の前記第２の２つの対が、前記第２のリコンビナーゼに対して暴露されると、前記ＮＳＩがアンチセンス方向で配置され、前記ＣＯＩＮがセンス方向で配置されるように並べられているかのいずれかである、核酸構築物。
（項目９）
リコンビナーゼ部位の前記第５の対が、前記第３のリコンビナーゼに対して暴露され、かつ前記第１のリコンビナーゼまたは前記第２のリコンビナーゼに対して暴露されないときに、前記第５のリコンビナーゼが前記ＣＯＩＮ、前記ＮＳＩ、および前記ＤＳＣを切り出し、そして前記レポーターを前記センス方向で維持するように並べられている、項目８に記載の核酸構築物。
（項目１０）
前記核酸構築物が１つの遺伝子に挿入される、項目８に記載の核酸構築物であって、前記遺伝子の転写方向に関して５’から３’へ、前記構築物が、センス方向のレポーター、センス方向またはアンチセンス方向のＤＳＣ、アンチセンス方向のＮＳＩ、およびアンチセンス方向のＣＯＩＮを含む、核酸構築物。
（項目１１）
前記ＤＳＣがセンス方向である、項目１０に記載の核酸構築物。
（項目１２）
前記核酸構築物が１つの遺伝子に挿入される、項目８に記載の核酸構築物であって、前記遺伝子の転写方向に関して５’から３’へ、前記構築物が、アンチセンス方向のＣＯＩＮ、アンチセンス方向のＮＳＩ、センス方向またはアンチセンス方向のＤＳＣ、およびセンス方向のレポーターを含む、核酸構築物。
（項目１３）
前記ＤＳＣがセンス方向である、項目１２に記載の核酸構築物。
（項目１４）
前記核酸構築物が１つの遺伝子に挿入される、項目８に記載の核酸構築物であって、前記遺伝子の転写方向に関して５’から３’へ、前記構築物が、アンチセンス方向のＮＳＩ、センス方向またはアンチセンス方向のＤＳＣ、センス方向のレポーター、およびアンチセンス方向のＣＯＩＮを含む、核酸構築物。
（項目１５）
前記ＤＳＣがセンス方向である、項目１４に記載の核酸構築物。
（項目１６）
前記核酸構築物が１つの遺伝子に挿入される、項目８に記載の核酸構築物であって、前記遺伝子の転写方向に関して５’から３’へ、前記構築物が、センス方向のレポーター、センス方向またはアンチセンス方向のＤＳＣ、アンチセンス方向のＮＳＩ、およびアンチセンス方向のＣＯＩＮを含む、核酸構築物。
（項目１７）
前記ＤＳＣがセンス方向である、項目１６に記載の核酸構築物。
（項目１８）
前記核酸構築物が１つの遺伝子に挿入される、項目８に記載の核酸構築物であって、前記遺伝子の転写方向に関して５’から３’へ、前記構築物が、アンチセンス方向のＣＯＩＮ、アンチセンス方向のＮＳＩ、センス方向またはアンチセンス方向のＤＳＣ、およびセンス方向のレポーターを含む、核酸構築物。
（項目１９）
前記ＤＳＣがセンス方向である、項目１８に記載の核酸構築物。
（項目２０）
前記核酸構築物が１つの遺伝子に挿入される、項目８に記載の核酸構築物であって、前記遺伝子の転写方向に関して５’から３’へ、前記構築物が、アンチセンス方向のＮＳＩ、センス方向またはアンチセンス方向のＤＳＣ、センス方向のレポーター、およびアンチセンス方向のＣＯＩＮを含む、核酸構築物。
他の実施形態が、以下の詳細な説明を検討することにより記載され、これらは当業者に明らかであろう。

図１は、同時に、１つのエレメント（Ｕ）を欠失させ、別のエレメント（Ｄ）を反転させるためのリコンビナーゼ認識部位の使用を説明する。 図２は、スプライシング領域と動作配列、その後ろに続くポリアデニル化（ｐＡ）シグナルを持つスプライシングアクセプター、薬剤選択カセット（ＤＳＣ；選択した適切な方向で）、ＣＯＩＮ、および５対のリコンビナーゼ認識部位を利用する、目的のヌクレオチド配列（ＮＳＩ）について示す、多機能性対立遺伝子（ＭＦＡ）対立遺伝子の１つの実施形態を説明する。Ｒ１／Ｒ１’、Ｒ２／Ｒ２’、Ｒ３／Ｒ３’、Ｒ４／Ｒ４’、およびＲ５／Ｒ５’は、リコンビナーゼ認識部位の類似する対を示す。 図３は、動作配列（簡単にするために、その配列の前にあるスプライシングアクセプターとスプライシング領域、およびその配列の後ろに続くｐｏｌｙＡシグナルは示していない）、ＤＳＣ（選択した適切な方向で）、ＮＳＩ、およびＣＯＩＮを利用する、ＭＦＡ対立遺伝子の１つの実施形態の組み換え可能なユニット（Ｒ１／Ｒ１’、Ｒ２／Ｒ２’、Ｒ３／Ｒ３’、Ｒ４／Ｒ４’、およびＲ５／Ｒ５’により定義される）の概念図を説明する。 図４は、説明の目的のための特異的リコンビナーゼ認識部位を持ち、これにより、ＬａｃＺ配列を含有している動作配列を含む、１回のリコンビナーゼ工程を使用して最初のＭＦＡの実施形態からＤＳＣならびにＮＳＩおよびＣＯＩＮエレメントが除去されている「クリーンアップ」ヌル対立遺伝子（ｃｌｅａｎｅｄ−ｕｐ ｎｕｌｌ ａｌｌｅｌｅ）を生じる、ＭＦＡの特定の実施形態を説明する（上部）。簡単にするために、ＬａｃＺ配列の前にあるスプライシングアクセプターとスプライシング領域、およびＬａｃＺ配列の後ろに続くｐｏｌｙＡシグナルは示さない。 図５は、１種類のリコンビナーゼ（ここでは、この対立遺伝子の実施形態のＦＲＴ３部位に最初に作用するＦｌｐリコンビナーゼ）を使用してＭＦＡからＣＯＩＮを含む／取り込む条件的対立遺伝子を作製する、ＭＦＡの１つの特定の実施形態を説明する。簡単にするために、ＬａｃＺ配列の前にあるスプライシングアクセプターとスプライシング領域、およびＬａｃＺ配列の後ろに続くｐｏｌｙＡシグナルは示さない。 図６は、１種類のリコンビナーゼ（ここでは、この対立遺伝子の実施形態のＦＲＴ部位に最初に作用するＦｌｐリコンビナーゼ）を使用してＭＦＡからＣＯＩＮを含む／取り込む条件的ヌル対立遺伝子を作製する、ＭＦＡの１つの実施形態を説明する。簡単にするために、ＬａｃＺ配列の前にあるスプライシングアクセプターとスプライシング領域、およびＬａｃＺ配列の後ろに続くｐｏｌｙＡシグナルは示さない。 図７は、リコンビナーゼ処理（図５または図６に示すようなＦｌｐ暴露）後に、対立遺伝子が第２のリコンビナーゼ（Ｃｒｅ）に対して暴露され、ＮＳＩの欠失と、転写のセンス方向でのＣＯＩＮの配置が生じる１つの実施形態を説明する。 図８は、リコンビナーゼ処理（Ｆｌｐ暴露）後に、対立遺伝子が第２のリコンビナーゼに対して暴露され、ＮＳＩの５’位置での第２のリコンビナーゼについてのリコンビナーゼ認識部位の（別の）配置が原因でＣＯＩＮとＮＳＩの反転が生じる１つの実施形態を説明する。 図９は、Ｅｎｓｅｍｂｌマウスゲノムサーバー（トップページ − ｗｗｗ．ｅｎｓｅｍｂｌ．ｏｒｇ）から編集したエキソン２〜４の領域内にあるマウスＨｐｒｔ１遺伝子のエキソン−イントロン構造を説明する。エキソン２〜エキソン４の領域を、保存領域を強調するためにＥＣＲブラウザ（ｈｔｔｐ：／／ｅｃｒｂｒｏｗｓｅｒ．ｄｃｏｄｅ．ｏｒｇ）において拡大する。エキソン３を、点々をつけた楕円形により強調する。黒色の垂直方向の矢印は動作配列とＤＳＣの挿入点を示し、一方、灰色の矢印はＣＯＩＮエレメントの挿入点を示す。これらは全て、Ｈｐｒｔ１^ＭＦＡ対立遺伝子を操作するために使用した。エキソン３に隣接している進化の過程で保存されてきたイントロン配列はいずれも、得られる対立遺伝子の中で分断されることはないことに留意すること。点々をつけた平行四辺形は、Ｈｐｒｔ１^ＭＦＡ対立遺伝子においてＮＳＩとなる領域を示す。 図１０は、ＭＦＡの一例、具体的には、Ｈｐｒｔ１遺伝子についてのＭＦＡを説明する。Ｈｐｒｔ１のエキソン３と、エキソン３に隣接している進化の過程で保存されてきたイントロン配列（図９で説明したとおり）が、ＮＳＩになる。標的化されると、ＮＳＩは、Ｈｐｒｔ１遺伝子の転写方向に関してアンチセンス鎖に配置される。動作配列（−ＳＡ−ｌａｃＺ−ｐｏｌｙＡ−）とＤＳＣは、ＮＳＩの上流に配置される。動作配列は、Ｈｐｒｔ１遺伝子の転写方向に関してセンス方向で配置され、遺伝子トラップエレメントとして効率よく作用し、動作配列の下流の転写を抑制する。ＣＯＩＮエレメントは、Ｈｐｒｔ１遺伝子の転写方向に関してアンチセンス方向でＮＳＩの下流に配置される。ＣＯＩＮエレメントとＮＳＩはいずれも、生産性があるＨｐｒｔ１ ｍＲＮＡには取り込まれ得ず、したがって、得られる対立遺伝子Ｈｐｒｔ１^ＭＦＡは、レポーター（ＬａｃＺ）を持つヌル対立遺伝子である。Ｈｐｒｔ１^ＭＦＡ対立遺伝子を含有しているエレメントには、以下のように並べられた部位特異的リコンビナーゼ認識部位が隣接する：ＦＲＴ−動作配列−Ｒｏｘ−ＤＳＣ−ＦＲＴ３−（ＬｏｘＰ）−（ＮＳＩ）−（Ｌｏｘ２３７２）−（ＦＲＴ）−（ＦＲＴ３）−（ＣＯＩＮ）−（Ｌｏｘ２３７２）−（ＬｏｘＰ）−Ｒｏｘ。この場合、括弧は、Ｈｐｒｔ１遺伝子の転写方向に関してアンチセンス方向での配置を、または部位特異的リコンビナーゼ部位の場合には、相互に認識される対に関して反対方向での配置を示す。 図１１は、ＭＦＡの１つの実施形態を説明し、特定の重複している組み換え可能なユニット（Ａ）と、第１のリコンビナーゼ（Ｂ）または第２のリコンビナーゼ（Ｃ）および第３のリコンビナーゼ（Ｄ）の作用により生じる、得られる対立遺伝子を示している。 図１２は、ＭＦＡの１つの実施形態を説明し、特定の重複している組み換え可能なユニット（Ａ）と、第１のリコンビナーゼ（Ｂ）または第２のリコンビナーゼ（Ｃ）および第３のリコンビナーゼ（Ｄ）の作用により生じる、得られる対立遺伝子を示している。 図１３は、ＭＦＡの１つの実施形態（Ａ）を説明し、ＮＳＩをセンス方向で配置する第１のリコンビナーゼ（Ｂ）、およびＮＳＩをアンチセンス方向で配置し、一方、ＣＯＩＮをセンス方向で配置する第２のリコンビナーゼ（Ｃ）の作用により生じる、得られる対立遺伝子を示している。 図１４は、ＭＦＡの１つの実施形態（Ａ）を説明し、ＮＳＩをセンス方向で配置する第１のリコンビナーゼ（Ｂ）、およびＮＳＩをアンチセンス方向で配置し、一方、ＣＯＩＮをセンス方向で配置する第２のリコンビナーゼ（Ｃ）の作用により生じる、得られる対立遺伝子を示している。 図１５は、ＭＦＡの別の実施形態（Ａ）を説明し、ＮＳＩをセンス方向で配置する第１のリコンビナーゼ（Ｂ）、およびＮＳＩをアンチセンス方向で配置し、一方、ＣＯＩＮをセンス方向で配置する第２のリコンビナーゼ（Ｃ）の作用により生じる、得られる対立遺伝子を示している。 図１６は、ＭＦＡの実施形態の一例を説明する。ここでは、レポーターは、ＳＡ（ａｄｍｌ）−ｇｔｘ−ＬａｃＺ−ｐＡであり、ＤＳＣはＮｅｏであり、ＮＳＩは重要なエキソン（ｅ_ｃ）であり、そしてＣＯＩＮはＧｔｘ−ＳＡ−ＨＡ−ｍｙｃ３−ＴＭ−Ｔ２Ａ−ＧＦＰ−ｐＡであり（Ａ）、アンチセンス方向のＣＯＩＮを維持したままの、リコンビナーゼの作用によるセンス方向でのＮＳＩの配置（Ｂ）、およびさらなる、センス方向でのＣＯＩＮの配置と同時に起こるＮＳＩの切り出し（Ｃ）；矢印は、ＭＦＡ中での（Ａ）、およびリコンビナーゼ処理した際の（ＢおよびＣ）リコンビナーゼ部位の実体と方向を確認するために使用したプライマーを示す。 図１７は、Ｈｐｒｔ１^＋／Ｙ、Ｈｐｒｔ１^ＭＦＡ／Ｙ、Ｈｐｒｔ１^ＣＯＩＮ／Ｙ、およびＨｐｒｔ１^{ＣＯＩＮ−ＩＮＶ}／Ｙ ＥＳ細胞のぞれぞれについて、細胞生存性および増殖アッセイの結果を示す。全てを、６−ＴＧを含まない標準的なＥＳ細胞培養培地（６−ＴＧなし；上のパネル）または１０μＭの６−ＴＧを補充した標準的なＥＳ細胞培養培地（６−ＴＧ；下のパネル）のいずれかの中で培養した。 図１８は、Ｈｐｒｔ１^＋／Ｙ細胞（ＷＴ）、Ｈｐｒｔ１^ＭＦＡ／Ｙ（ＭＦＡ）（すなわち、図１６ＡのＭＦＡで標的化した細胞）、Ｈｐｒｔ１^ＣＯＩＮ／Ｙ細胞（ＭＦＡ＋ＦＬＰｏ）（すなわち、図１６ＡのＭＦＡで標的化し、その後、ＦＬＰｏで処理した細胞）、およびＨｐｒｔ１^{ＣＯＩＮ−ＩＮＶ}／Ｙ細胞（ＭＦＡ＋ＦＬＰｏ＋Ｃｒｅ）（すなわち、Ｃｒｅで処理したＨｐｒｔ１^ＣＯＩＮ／Ｙ細胞）由来の全タンパク質調製物のウェスタンブロットを示す。上のパネルは、Ｈｐｒｔ１タンパク質の検出を示し、中央のパネルはＬａｃＺ（レポーター）タンパク質の検出を示し、そして下のパネルはローディング対照としてのＧＡＰＤＨタンパク質の検出を示す。

（詳細な説明）
本発明は、記載される特定の方法および実験条件に限定されない。なぜなら、そのような方法および条件を変えることができるからである。本明細書中で使用される専門用語は、特定の実施形態を記載する目的のためだけのものであり、限定とは意図されない。そのため、本発明の範囲は特許請求の範囲によってのみ限定される。

他の場所で明白に定義されない限りは、本明細書中で使用される全ての技術的および科学的用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般的に理解されている意味と同じ意味を有する。本明細書中に記載される方法および材料と類似するかまたは等価である任意の方法および材料を、本発明の実施または試験において使用することができるが、特定の方法および材料がここに記載される。本明細書中で言及される全ての刊行物は、言及されることによりそれらの全体が本明細書中に組み込まれたこととなる。

表現「センス方向」または「センス」は、ゲノムの局所の状況における転写可能な核酸配列のコード方向またはセンス鎖をいい（例えば、配列が、ゲノム中の転写可能な配列中またはその付近に「センス方向」で配置されている場合は、その配列の方向は転写と適合する）、そしてタンパク質をコードする遺伝子については、その配列が配置されている領域または遺伝子座または遺伝子の中での配列の翻訳のコード方向またはセンス鎖をいう。表現「アンチセンス方向」または「アンチセンス」は、その配列が、転写と適合する鎖とは反対の鎖（すなわち、アンチセンス）中に存在する、１つの領域または遺伝子座または遺伝子にある配列の配置をいう。したがって、特異的な例では、配列が遺伝子中で「センス」方向で配置されている場合は、これは一般的には転写され得る。配列が「アンチセンス」方向で配置されている場合は、これは一般的には転写されない。センス鎖とアンチセンス鎖との間での移動によりいずれかの鎖からの転写が生じ得る遺伝子座については、配列は、センスからアンチセンスまたはアンチセンスからセンスへの移動により、両方ではない一方からの転写が生じるように選択または操作され得る。

用語「ＣＯＩＮ」には、条件的エレメントの言及が含まれる。条件的エレメントには、その発現（または発現できないこと）が独立した事象の発生に左右されるヌクレオチド配列が含まれる。例えば、センス方向で１つのタンパク質もしくはその断片のいずれかをコードする１つのコード領域、または非コードＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）が、反対方向の部位特異的組み換え部位が両側に隣接させられて、アンチセンス方向で配置される。隣接部位を認識する部位特異的リコンビナーゼの非存在下では、コード領域は転写されない。なぜなら、これは標的遺伝子に関してアンチセンス鎖の中に配置されているからである。類似する部位特異的リコンビナーゼで処理されると、ＣＯＩＮ配列は反転させられ、結果として、これは、転写されたメッセージの中に取り込まれることになり、これにより、タンパク質もしくはその断片の発現が生じるか、またはｎｃＲＮＡの中に生じる。

用語「不適合」は、２つ以上のリコンビナーゼ認識部位を記載するために使用される場合は、２つ以上のリコンビナーゼ認識部位が互いに組み換わることができない（しかし、これらの２つ以上のリコンビナーゼ認識部位は他の類似する（例えば、同一の）リコンビナーゼ認識部位と組み換わることができる）性質をいう。

（ノックアウトおよび条件的対立遺伝子）
遺伝的方法による遺伝子機能の研究により、自然界に存在している変異体または突然変異体対立遺伝子の発見、あるいはそのような変異体および突然変異体対立遺伝子の意図的な作製が実現した。後者は、無作為な突然変異誘発と、それに続いて行われる表現型に基づくスクリーニング、その後の原因となる突然変異の解明（「順遺伝学」と呼ばれているプロセス）によるか、または突然変異を特異的「標的」遺伝子または遺伝子座の中に提供する遺伝子操作方法論（「逆遺伝学」と呼ばれているアプローチ）のいずれかにより進められる。

マウス（最も広く使用されている哺乳動物のモデル生物）においては、遺伝子の標的化により特異的な、分子的に極めて十分に定義された突然変異を操作する能力が、逆遺伝学の分野の中心となる。しかし、今日までに作製された変異体の大部分は、「ノックアウト対立遺伝子」または簡単に「ノックアウト」と一般的に呼ばれている、比較的単純なヌル対立遺伝子であり、通常は、１つの遺伝子のエキソン−イントロン領域またはその一部の欠失を含み、さらに近年になると、同時に起こる、その領域のＬａｃＺのようなレポーターｃＤＮＡでの置き換えが伴う。バクテリオファージまたは酵母由来の、哺乳動物細胞中での使用のために修飾された、部位特異的リコンビナーゼとそれらの類似する認識部位

の採用は、ＤＳＣの標的化後の切り出し（これに部位特異的リコンビナーゼ認識部位が隣接している限りにおいて）を可能にしただけではなく、条件的ヌル対立遺伝子の操作もまた可能にした、より最近の発展である。標的遺伝子のエキソン−イントロン領域（またはより頻繁には、その一部）にリコンビナーゼ認識部位が隣接している条件的ヌル対立遺伝子が開発されており、これにより、修飾された対立遺伝子は類似するリコンビナーゼの作用によるヌル状態への転換に適しているものとなる。通常のノックアウトを上回るこの方法の利点は、修飾された遺伝子のノックアウトへの転換を、場所（臓器、組織、または細胞のタイプ）、時間、そして多くの場合には、類似するリコンビナーゼが活性である期間をもまた制御することにより、時空的に制御することができることである。

従来、条件的ヌル対立遺伝子は、対応する単純なノックアウト対立遺伝子の追跡として操作されており、したがって、後者が胚性致死および／または複数の表現型を示すかのいずれかであるほとんどの場合には、標的遺伝子の機能の研究は、成人の設定では不可能となる（胚性致死の場合）か、あるいは特定の細胞のタイプまたは生物学的プロセスにおいては解明が困難となる（遺伝子が複数の表現型を示す場合）。遺伝子標的化により遺伝子操作されたマウスを作製するために費やされた多くの努力、時間、および費用を考えると、ノックアウトの最初の作製、その後のその表現型の解析、その後の条件的ヌルの操作のこの段階的様式は、研究者の数が増えることにより負担がかかると考えられている。加えて、少数の遺伝子については、通常のノックアウト対立遺伝子は、ヘテロ接合型のヌル状態でもこれらが胚性致死を生じるので、生殖細胞系列を通じて行うができない。したがって、１回の遺伝子標的化工程において二重（ヌルと条件的）対立遺伝子に、またはさらには多様式対立遺伝子に操作できるようにしたいということが、当該分野に関与している者とエンドユーザーの共同体の根強い目的である。この必要性に取り組むために２つの方法：ＦｌＥｘおよびノックアウト−ｆｉｒｓｔ（ＫＯ−ｆｉｒｓｔ）を実際に試みた。

ＦｌＥｘ法は、標的化のため、および遺伝子トラップ（ＧＴ）としての両方で使用されているが、基本的な設計原理は、最終的な用途とには関係なく同じである。ＦｌＥｘの基本的設計を図１に示す。Ｕは、例えば、ＤＳＣを示しており、Ｄはレポーターを示している。ＦｌＥｘ構築物に対するリコンビナーゼの作用の結果は、Ｕエレメント（例えば、ＤＳＣ）の永久的な欠失とＤエレメント（例えば、レポーター）の反転（および発現）である。

そのもともとの実施形態と用途においては、ＦｌＥｘは条件的対立遺伝子を操作するための方法として開発された。ＦｌＥｘは、Ｒａｒｇについての「条件的ヌル」対立遺伝子を作製するために、この遺伝子にＦｌＥｘカセットを挿入することにより最初に使用され、その結果、ｌｏｘＰ／ｌｏｘ５１１カプレットがＲａｒｇのエキソン８の上流に挿入され、そして、ＦｌＥｘカセットの残り（Ｒａｒｇに関してアンチセンスの方向のＳＡ−ｌａｃＺ−ＳＶ４０ｐｏｌｙＡ（ＧＴ様エレメント）の５’から３’、次いで、第１のｌｏｘＰ／ｌｏｘ５１１カプレットに関してアンチセンス方向の別のｌｏｘＰ／ｌｏｘ５１１カプレットからなり、そしてセンス方向のネオマイシンホスホトランスフェラーゼミニ遺伝子（ｎｅｏ）を含有している）が、Ｒａｒｇのイントロン８の中に挿入された。この設計は、ＧＴ様エレメントＳＡ−ｌａｃＺ−ＳＶ４０ｐｏｌｙＡのＣｒｅに媒介される反転ができるようにし、その結果、これはセンス鎖の中に入り、遺伝子トラップとして作用し；同時に、Ｒａｒｇのエキソン８はアンチセンス方向になる（転写がＧＴ様エレメントＳＡ−ｌａｃＺ−ＳＶ４０ｐｏｌｙＡの末端で終結しない場合でもなお、エキソン８が読み取られるメッセージに取り込まれないことが実質的に確実になる）が、ｎｅｏが同時に欠失させられ、それにより、Ｒａｒｇの発現がｌａｃＺの発現に置き換えられた、Ｒａｒｇのヌル対立遺伝子が生じる。

しかし、ヌル対立遺伝子を作製する（Ｃｒｅへの暴露による）この方法が成功したにも関わらず、Ｒａｒｇの再度並べられていない（ｐｒｅ−Ｃｒｅ）ＦｌＥｘ対立遺伝子は、もともと設計されたような真の条件的ヌルではなく、Ｒａｒｇ^ＦＬＥｘの発現がＲａｒｇとの比較において有意に減少した極めて低形質の対立遺伝子であった。結果として、Ｒａｒｇ^{ＦＬＥｘ／ＦＬＥｘ}マウスは、Ｒａｒｇノックアウトマウスのあまり低形質ではない形態と似た表現型を示し、この最初のＦｌＥｘの実施形態が、真の条件的ヌル対立遺伝子を作製することができないことが明らかになった。

ＦｌＥｘ法はまた、遺伝子トラップでの使用のために適応させることもできる。この方法のそのバリエーションにおいては、ＧＴエレメント（ＳＡ−βｇｅｏ−ｐｏｌｙＡ、ここでは、βｇｅｏはｎｅｏオープンリーディングフレームとのｌａｃＺのインフレーム融合体であり、したがって、ＬａｃＺにより報告する能力とＮｅｏにより選択する能力を併せ持つ）には、２つのＦｌＥｘ様アレイ（ＦＲＴ／ＦＲＴ３カプレットからなる外側のアレイとｌｏｘＰ／ｌｏｘ５１１カプレットからなる内側のアレイであり、いずれも、互いに鏡像の立体配置である）が隣接している。この様式においては、得られるＧＴベクターの活発に転写される遺伝子への取り込みの成功により、βｇｅｏの発現が生じ、したがって、Ｇ４１８について選択することによりこれらの事象を選択することが可能となり、理論的には、ＧＴエレメントの取り込み部位に応じて、対応する遺伝子についての機能的なヌル対立遺伝子の作製も生じる。一旦、遺伝子が捕捉されて対応するＦｌＥｘ対立遺伝子が作製されると、得られる対立遺伝子は、ノックアウト対立遺伝子または低形質の対立遺伝子（すなわち、捕捉された遺伝子の発現がダウンレギュレートされる対立遺伝子）であり得る。これらのＦｌＥｘ対立遺伝子のＦｌｐリコンビナーゼでの処理は、原理上はＧＴエレメントをアンチセンス鎖に反転させるはずであり、それにより、捕捉エレメントの中での転写終結が減少し、これにより、修飾された遺伝子が条件的ＧＴに転換する。この条件的ＧＴは、ここではアンチセンス鎖の中に「隠れており」、ＦｌＥｘアレイのｌｏｘＰ／ｌｏｘ５１１カプレットに対して作用することによりこれを再度反転させるＣｒｅへの暴露により再度活性化させることができる。

ＦｌＥｘ技術のこの用途は、ヌル対立遺伝子を作製するためにＧＴエレメントに頼る。したがって、これが遺伝子トラップ技術の限界となる。これは、真のノックアウトが作製され、不活化調節エレメントのさらなるリスク（無作為な挿入による不活化による）を引き受けることを保証するものではない。ＧＴエレメントの配置と、転写の終結においてそれが有効である程度の両方が、任意の所定の対立遺伝子がヌル対立遺伝子であるかどうかに影響を及ぼし得る。さらなる問題は、すでに確立された機能を有していない遺伝子の大部分について、そしてさらには、その遺伝子を決定的なヌル対立遺伝子の研究を通じて決定された表現型と関連づけることについて、ＧＴ対立遺伝子が真にヌル対立遺伝子であることを確定的に証明することが極めて困難であることである。実際、これらならびに他の大半の技術的理由について、大規模なマウス突然変異コンソーシアム（ｍｏｕｓｅ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ）であるＥＵＣＯＭＭによる採用および使用の４年後に、ＫＯ−ｆｉｒｓｔ法を使用する遺伝子標的化に賛成して、ＦｌＥＸに基づく遺伝子トラップ法は放棄された。

ＦｌＥｘ法と同様に、典型的な現在のＫＯ−ｆｉｒｓｔ対立遺伝子は、ノックアウト様対立遺伝子を作製するためには、少なくとも部分的に、ＧＴ様エレメント（ＳＡ−ＬａｃＺ−ｐｏｌｙＡまたはＳＡ−βｇｅｏ−ｐｏｌｙＡのいずれか）に頼る。しかし、そのアプローチに伴う限界の認識（ＧＴを用いて得られた経験からの効率的な学習、ならびに理論的検討）において、ＫＯ−ｆｉｒｓｔにもまた、真のヌル対立遺伝子を作製するためには、ＧＴ様エレメントの下流にあるＬｏｘＰ配列が導入された重要なエキソンが（Ｃｒｅを使用して）欠失させられなければならないことが必要である。したがって、実際には、この方法には、最初に、ＦＲＴが隣接するレポーター／ＧＴ様カセットと薬剤ミニ遺伝子の、欠失させようとするエキソンのいくらか上流にある標的遺伝子のイントロンの中へ配置、同時に、欠失させようと計画されたエキソンにＬｏｘＰ配列を導入することが必要である。このエキソンは「重要なエキソン」と呼ばれており、「重要なエキソン」を定義するために使用される基準とは無関係に、ＫＯ−ｆｉｒｓｔ法には、得られる対立遺伝子を真のヌルにするためにはその除去が明らかに必要である。したがって、標的化後、得られる対立遺伝子は真のヌルでも、条件的ヌル対立遺伝子でもない。得られる対立遺伝子が真のヌルではない理由は、Ｃｒｅによる重要なエキソン（これにはＬｏｘＰ配列が導入されている）が除去されない場合は、ＧＴ様カセットの周りの読み通し転写（ｒｅａｄ−ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）およびスプライシング、ならびに薬剤ミニ遺伝子の存在が原因であるＧＴ様カセットの下流の遺伝子のメッセージの転写の可能性が残るという事実に起因している。得られる対立遺伝子が条件的ヌル対立遺伝子ではない理由は、レポーター／ＧＴ様カセットおよび薬剤ミニ遺伝子の両方が除去されない場合には、正常なメッセージ（正常な組成、ならびに発現レベルおよび部位）の生成が起こり得ないという事実にある。

したがって、所望される用途（ヌルまたは条件的ヌル）に応じて、ＫＯ−ｆｉｒｓｔ対立遺伝子について、第２の標的化後工程を行わなければならない。真のヌルが所望される場合は、ＫＯ−ｆｉｒｓｔ対立遺伝子は、重要なエキソン（これにはＬｏｘＰ配列が導入されている）を欠失させるためにＣｒｅリコンビナーゼで処理されなければならない。

逆に、条件的対立遺伝子は、レポーター／ＧＴ様カセットと薬剤ミニ遺伝子（これらには、統合したものとして、ＦＲＴ部位が隣接している）のＦｌｐに媒介される除去の後で作製され得る。この様式においては、残る修飾は、ＦＲＴ部位と、ＬｏｘＰ配列が導入された「重要な」エキソンだけである。次いで、この対立遺伝子は、ＬｏｘＰ配列が導入されたエキソンのＣｒｅに媒介される除去により、ヌルに転換させられ得る。

ＫＯ−ｆｉｒｓｔ法は、ＦｌＥｘの限界のうちのいくつかに取り組むが、これはなおも、その有用性を限定する３つの主要な欠点により阻まれている：第１に、これは、真のＫＯ−ｆｉｒｓｔを作製することについてのＧＴ様エレメントの信頼性がないことを修正するが、さらなる標的化後工程を行わなければ真のＫＯ−ｆｉｒｓｔを提供することはできない。第２に、「重要なエキソン」を定義するために使用される基準が原因で、ＫＯ−ｆｉｒｓｔは、全ての非タンパク質コード遺伝子（すなわち、非常に重要な生体分子の１つのクラスである「非コード」ＲＮＡをコードするもの）が及ばない位置に効率よく位置されている、タンパク質をコードする遺伝子に限定されない。さらに、それについての「重要なエキソン」を定義することができるタンパク質をコードする遺伝子だけが、ＫＯ−ｆｉｒｓｔの設計に適している。重要なエキソンを定義するための基準は、その欠失が、それの前にあるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の一部分とその後ろにあるＯＲＦの部分との間にフレームシフトを生じることである。これは、決定的なノックアウトを提供するためには、このフレームシフトの誘導がＫＯ−ｆｉｒｓｔ法に必須であることがその理由である。したがって、タンパク質をコードする遺伝子のなお特定のクラスは、ＫＯ−ｆｉｒｓｔの設計に適していない。これらには、ＯＲＦが１つのエキソンの中に含まれている遺伝子、およびタンデムな複数のエキソン全てまたはその大部分が同じフレームの中に残る遺伝子が含まれる。第３に、一旦、ＫＯ−ｆｉｒｓｔ対立遺伝子が（Ｆｌｐの作用により）条件的ヌル対立遺伝子に転換させられると、得られる対立遺伝子は、条件的対立遺伝子がヌル状態に転換すると、ヌルであることを積極的に報告するための機構を全く提供しない。典型的には、ノックアウト−ｆｉｒｓｔ対立遺伝子は、ＤＳＣの使用（ＫＯ−ｆｉｒｓｔにおいて使用されるＳＡ−ｌａｃＺ−ｐｏｌｙＡとＤＳＣがＦＲＴ化されている場合に、Ｆｌｐリコンビナーゼ（Ｆｌｐ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅｄ）を使用して達成される工程）とともに、レポーター（例えば、ｌａｃＺ）が除去されており、これにより、ＬｏｘＰ配列が導入されたエキソン（と、その上流にあるＦＲＴ部位）だけが残る。このように、ヌル対立遺伝子の達成を報告するレポーター機能のための選択肢は、従来のノックアウト−ｆｉｒｓｔアプローチには存在していない。

（多機能性対立遺伝子）
動作配列を含む１セットの機能的エレメント（これにより除去または不活化を確認する）の導入によりゲノム中のヌクレオチド配列の除去または不活化を可能にし、それにより真のノックアウトを生じ、対立遺伝子中でのその発現が条件的であり（すなわち、特定の分子事象または合図に依存する）、報告可能である１つ以上の条件的エレメントもまた含む、多機能性対立遺伝子（ＭＦＡ）アプローチが提供される。

ＭＦＡアプローチは、標的化された対立遺伝子をヌル状態に転換させるために第２の標的化後工程を必要としない、真のノックアウト−ｆｉｒｓｔ対立遺伝子を作製するための標的化の選択肢を提供する。これにより、典型的な現在のノックアウト−ｆｉｒｓｔ対立遺伝子（標的化された対立遺伝子をヌル対立遺伝子に転換させるために標的化後の工程が必要である）を上回る利点と発想の転換がもたらされる。ＭＦＡアプローチはまた、「重要なエキソン」を伴う用途にも限定されず、フレームシフトによるノックアウトにも限定されず、一般的には、目的のあらゆるヌクレオチド配列の修飾に適用することができる。ＭＦＡは、１回の標的化工程後に、高い多用途性を持つ数え切れないほどの対立遺伝子の選択肢を提供する。

ＭＦＡアプローチは、動作配列と関連がある任意の選択された配列が反転するとレシピエントゲノム中で第２の状態を作製する機会を提供する真のＫＯ−ｆｉｒｓｔ対立遺伝子）を提供する。ここでは、反転すると、選択された配列の転写が報告され得る。選択された配列は、例えば、ＣＯＩＮであり得るがこれに限定されない。選択された配列は、それ自体が動作配列を含み、この動作配列には、例えば、別の遺伝子または調節配列の転写を制御するためのリプレッサーが含まれる。１つの例においては、１つの遺伝子座にＭＦＡを配置する１回の標的化工程により、野生型遺伝子座を特定の状態（Ｓｔａｔｅ Ａ）（例えば、内因性の遺伝子のノックアウト）になるように修飾することができる。ＭＦＡは、第１のリコンビナーゼの作用により、別の特定の状態であるＳｔａｔｅ Ｂ（例えば、野生型表現型の回復）への状態の変化が可能であるように設計される。Ｓｔａｔｅ Ｂは、第２のリコンビナーゼによりＳｔａｔｅ Ｃ（例えば、ノックアウトの再度の確立とＣＯＩＮの発現）に転換させることができるなどである。このように、選択された遺伝子座の様々な状態を、ＭＦＡを利用して１つの最初の対立遺伝子から得ることができる。

ＭＦＡアプローチは、ＭＦＡを含有しているトランスジーンが、内因性の転写活性があるプロモーターを利用するＭＦＡエレメントの発現を獲得するように、遺伝子トラップとしてＭＦＡを配置するために使用することができる。

ＭＦＡアプローチは、従来の遺伝子組み換えの用途において使用することができる。ここでは、動作配列には、プロモーター、エキソン、または複数のエキソンとイントロン、そして状況に応じた転写制御エレメント、ならびにその後ろに続くＤＳＣ（これには従来の前核注入に基づく遺伝子組み換えの必要がないので随意的）、第１の動作配列に関してアンチセンス方向のＮＳＩ（これは第２の動作配列であり得る）、および、これもまた第１の動作配列に関してアンチセンス方向で配置されたＣＯＩＮ（これは第３の動作配列であり得る）が含まれる。

ＭＦＡアプローチは、ヌル対立遺伝子、条件的ヌル対立遺伝子、ＣＯＩＮ、動作配列（これにはレポーターが含まれ得る）、およびＤＳＣ、ならびに他のエレメントを含む遺伝子座を、１回の標的化工程で作製するための多数の選択肢を提供する。この遺伝子座の標的化後の操作は、１回の標的化工程においてＭＦＡ構築物を用いてＭＦＡ含有遺伝子座に導入された組み換え可能なユニットの使用による選択肢を提供する。標的化後の遺伝子座に様々な操作可能な選択肢を実行するために必要な異なるリコンビナーゼの数は、様々な対の不適合である類似する部位特異的リコンビナーゼ認識部位（例えば、１対のＦＲＴ部位および１対のＦＲＴ３部位、１対のｌｏｘＰ部位および１対のｌｏｘ２３７２部位など）を利用することにより減少させられる。したがって、ＭＦＡを含有している遺伝子座の１種類のリコンビナーゼに対する暴露は、少なくとも２つの異なる組み換え可能なユニットに対して別々に作用することができて、ユニットが目的のエレメント（例えば、レポーター、ＤＳＣ、エキソン、ＣＯＩＮなど）を所望する方向で配置するように、ならびに、部位特異的リコンビナーゼ認識部位の方向を組み換え可能なユニットの中で再度合わせて新しい組み換え可能なユニットが形成するように、１つのユニットを組み換えることができる。

ＭＦＡアプローチは、任意の所望される配列（レポーター、または標的遺伝子もしくは標的遺伝子の一部の突然変異もしくは変異体形態をコードするｃＤＮＡ、または標的遺伝子に関連するものおよびホモログ、またはさらには非タンパク質コード配列（例えば、ｍｉｃｒｏＲＮＡまたはｍｉｃｒｏＲＮＡのクラスター）、あるいはこれらのエレメントの任意の組み合わせ（これらが、内部リボソーム侵入部位もしくは異なるエレメントの間にある「自己切断」ペプチド（選択されるエレメントに依存する）の配置により適応させることができる場合）を含むが、これらに限定されない）を含むことができるＣＯＩＮについての選択肢を提供する。

ＭＦＡアプローチは、ノックアウトが標的化により達成され、第１のリコンビナーゼがノックアウトされたエレメントを活性な（野生型の）状態に戻して再建させるために利用され、第２のリコンビナーゼが、ノックアウトを再建するために利用される選択肢を提供する。ここでは、ＣＯＩＮは、ノックアウトされたエレメントの再建またはノックインと同時にセンス方向で配置され、これにより、第２のリコンビナーゼが活性化された細胞中でのノックアウトの再建を報告する。

現在のノックアウト−ｆｉｒｓｔアプローチには、条件的対立遺伝子がヌルに転換させられた場合に、ヌルであることを報告するための機構が欠けているが、ＭＦＡアプローチは、第２のリコンビナーゼが作用すると、目的のヌクレオチド配列（例えば、エキソンと周囲の配列、図５および図６のＮＳＩ）を反転させる、または反転させて切り出し、そして、報告エレメントをセンス方向で配置し、ＮＳＩの反転および／または切り出しを効率的に報告する報告エレメント（例えば、ＣＯＩＮ、図５および図６参照、下部；遺伝子型分類により、および／あるいは視覚化、または他の定量的もしくは定性的決定により、状況に応じて細胞レベルで検出できる）の選択肢を提供する。この実施形態では、ヌル対立遺伝子は、１回の標的化工程の後に、第１のリコンビナーゼによって回復した対立遺伝子となるように転換させられ（この実施形態では、図５および図６のＮＳＩは、エキソンおよび周辺の配列、または標的化ベクターにより置き換えられた遺伝子もしくはその一部である）、そして第２のリコンビナーゼにより、センス方向のＣＯＩＮの配置によりその存在を報告するヌル対立遺伝子に転換させられる。

したがって、ＭＦＡアプローチは、ノックアウトの表現型上の効果を評価し（標的化工程後）、その後、ノックアウトされたエキソンまたはその遺伝子もしくは領域を再建させるために第１のリコンビナーゼに対して暴露し、再建（すなわち、野生型に戻る転換）の表現型上の効果を評価し（相補性解析と同等の工程であるが、新しいトランスジェニックマウス株を作製する必要性はなく、従来行われている相補性解析を行う必要もない）、その後、状況に応じて、ノックアウトを再建するために第２のリコンビナーゼに対して暴露し、ヌル対立遺伝子の再建の表現型上の効果を評価するための選択肢を提供する。これにより、ＭＦＡ対立遺伝子は、さらなる（条件的）エレメントの多用途性を持つ真のノックアウト−ｆｉｒｓｔアプローチと、１回の標的化工程を含む１つのプロトコールにおいて遺伝子操作された動物の中で真の相補型分析を行う能力を併せ持つ。

１つのＭＦＡの用途においては、相補性解析のための方法が提供される。この方法には、細胞の内因性の対立遺伝子を本発明のＭＦＡで標的化する工程、その後、標的化後工程において、ＭＦＡから条件的ヌル対立遺伝子を作製する工程（第１のリコンビナーゼに対する暴露による）（ここでは、ＭＦＡ中の目的のヌクレオチド配列には、エキソンもしくはエキソンと周囲の配列、またはセンス方向の（例えば、表現型に関係がある）目的の別の領域が含まれる）、ならびに、条件的ヌル対立遺伝子の表現型上の効果（野生型であるはずである）を評価する工程が含まれる。さらなる実施形態においては、ＭＦＡはさらに、ヌルを再建する第２のリコンビナーゼに対して暴露され、状況に応じて、表現型上の効果が再び測定される。特異的な実施形態においては、第２のリコンビナーゼもまた、条件的レポーター（例えば、ＣＯＩＮ）をセンス方向で配置する（ここでは、条件的レポーターが条件的ヌル対立遺伝子のヌル対立遺伝子への転換を報告する）か、あるいは、ヌルの再建を報告する場合もある。

１つの実施形態においては、ＮＳＩには、標的遺伝子のエキソンと隣接するイントロン配列、またはエキソン−イントロン領域が含まれる。別の実施形態においては、ＮＳＩには、ｎｃＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡクラスター、または他の小さいｎｃＲＮＡ（単数または複数）をコードする領域が含まれる。

ＭＦＡは、無作為に配置することができるか、または、ゲノム中の選択された遺伝子座に標的化させることができる対立遺伝子である。ＭＦＡは、類似する部位特異的リコンビナーゼ認識部位の対の並びの間の配列の慎重な配置により、ヌル、条件的ヌル、または組み合わせである条件的／ヌル対立遺伝子を生じるように操作される。ゲノム中の構築物の配置により生じる得られる対立遺伝子は、選択されたリコンビナーゼにより操作することができる。これは、一時的にゲノム中に構築物を導入することができるか、またはそのゲノム中に上記構築物を含有している動物の、選択されたリコンビナーゼの遺伝子を含有している動物（例えば、Ｃｒｅを発現する株、Ｆｌｐを発現する株、もしくは

を発現する株）との交雑により導入することができる。

様々な実施形態において、ヌルが、例えばリコンビナーゼの作用による「重要なエキソン」または「重要な領域」の除去のような第２の工程の実行に依存しない真のノックアウト−ｆｉｒｓｔ対立遺伝子を作製するための方法と組成物が提供される。したがって、１回の標的化組み換え工程において得られた、レポーターを持つ真のノックアウト−ｆｉｒｓｔ対立遺伝子であるという点で多機能性である対立遺伝子を、１回の標的化工程において作製するための実施形態が提供される。

ＭＦＡアプローチによりノックアウト対立遺伝子を作製するための方法と組成物は、いくつかのタイプのノックアウト対立遺伝子（例えば、ＫＯ−ｆｉｒｓｔまたはＦｌＥｘのいくつかの実施形態）に必要であるような、ヌル対立遺伝子を作製するための重要なエキソンの反転の削除によりフレームシフトを生じさせることが必要であることによっては限定されない。代わりに、ＭＦＡ法は、標的化の時に、標的遺伝子の転写ユニットからＮＳＩを除去し、一方で同時に、ＮＳＩの発現を動作配列の発現と置き換えるその能力による。動作配列には、ＧＴ様エレメント（例えば、ＳＡ−ｌａｃＺ−ｐｏｌｙＡのようなレポーター）、ｃＤＮＡ、１つのエキソンまたは複数のエキソン、調節エレメント（例えば、エンハンサー、インスレーター、オペレーター）が含まれ得る。動作配列は実験者により定義されるので、ヌル以外の対立遺伝子は等しく良好なものとすることができる。例えば、動作配列は、１つの遺伝子のドミナントネガティブ形態、または構成的に活性な形態、または活性化された形態をコードし得る。

様々な実施形態においては、ＭＦＡに、得られる対立遺伝子の中で互いにアンチセンス方向である目的のヌクレオチド配列とＣＯＩＮが含まれ、さらに、対立遺伝子中でいずれもセンス方向である（またはセンス方向とアンチセンス方向であるか、または互いに独立してセンス方向もしくはアンチセンス方向である）動作配列および／またはＤＳＣが含まれる。第１のリコンビナーゼに対して暴露された後に、動作配列および／またはＤＳＣが欠失させられると、目的のヌクレオチド配列がセンス方向に反転させられ、ＣＯＩＮはアンチセンス方向で維持される。対立遺伝子にはさらに、目的のヌクレオチド配列とＣＯＩＮの第２のリコンビナーゼによるその後の同時の反転が可能となるように配置された組み換え部位が含まれており、その結果、第２のリコンビナーゼが作用すると、目的のヌクレオチド配列はアンチセンス方向で配置され、ＣＯＩＮはセンス方向で配置される。さらなる実施形態においては、目的のヌクレオチドは、第２のリコンビナーゼで処理されると欠失させられ、ＣＯＩＮがセンス方向で残る。特異的な実施形態においては、ＣＯＩＮはレポーターまたはＤＳＣである。別の特異的な実施形態においては、目的のヌクレオチドは、１つの種の１つの遺伝子の目的の１つのエキソンまたは領域（例えば、マウス、ラット、ヒト以外の霊長類、またはヒトのエキソン）であり、ＣＯＩＮは、別の種の１つの遺伝子の１つのエキソン（例えば、マウス、ラット、ヒト以外の霊長類、またはヒトのエキソン）である。

ＭＦＡアプローチはまた、遺伝子トラップアプローチも可能にする。ＭＦＡアプローチのこの実施形態においては、ＭＦＡは、転写活性がある遺伝子座に挿入される。これは、無作為の組み換えにより、または「標的トラッピング化（ｔａｒｇｅｔｅｄ ｔｒａｐｐｉｎｇ）」により行われ得る（例えば、言及することにより本明細書中に組み込まれたこととなる米国特許第７，４７３，５５７号を参照のこと）。スプライシングアクセプターとスプライシング領域が前にあり、後ろにｐｏｌｙＡシグナルが続く動作配列は、任意の存在している転写されるゲノム配列のノックアウトまたは「ノックダウン」を提供する。プロモーターを持たない（すなわち、その発現が、転写活性がある遺伝子座のセンス鎖の中への挿入に依存する）ＤＳＣを含めることにより、ＭＦＡを含有している細胞のポジティブ選択を確実にする。部位特異的リコンビナーゼ認識部位の推奨される並びと組み合わせて、アンチセンス方向のＣＯＩＮとともに目的のヌクレオチド配列（ＮＳＩ）をアンチセンス方向で含めることにより、第１のリコンビナーゼに対して暴露されると（捕捉された遺伝子座のプロモーターから）ＮＳＩを条件的に発現する能力が提供される。その後、第２のリコンビナーゼに対して暴露されると、ＮＳＩの発現はオフにされ得、同時に、ＣＯＩＮの発現に置き換えられる。プロモーターを持たないＤＳＣは、選択された任意の細胞がプロモーターを持たないＮＳＩおよびプロモーターを持たないＣＯＩＮを発現する能力を持つこと、ならびに、発現が転写活性がある遺伝子座からの内因性の発現パターンに従うことを確実にする。

ＭＦＡを使用する特定の有利なアプローチは、便宜上、特定の実施形態と組み合わせて（すなわち、図に示すように、特定の名称のリコンビナーゼ部位とヌクレオチド配列を含有している対立遺伝子を参照して）限定ではなく利便性のために記載される。すなわち、適切なリコンビナーゼとリコンビナーゼ認識部位、動作配列、レポーター、ＤＳＣ、および目的のヌクレオチド配列を、本明細書中の開示に基づいて日常的に行われているとおりに選択することができる。「目的のヌクレオチド配列」すなわち「ＮＳＩ」は、任意の目的のヌクレオチド配列、例えば、１つのエキソン、１つのエキソンと隣接配列（単数または複数）、２つ以上のエキソン、コード配列の１つの断片、コード配列全体、調節エレメントまたは配列、非タンパク質コード配列、イントロン、あるいはそれらの任意の組み合わせなどであり得る。ＣＯＩＮには、ｃＤＮＡならびに非タンパク質コード配列が含まれ得、そしてポリアデニル化シグナルおよび部位、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、または他の非タンパク質コードＲＮＡ、ＩＲＥＳ、コドンスキップペプチド、およびそれらの任意の組み合わせのようなエレメントが組み込まれ得る。特定のＣＯＩＮとそれらを使用するためのいくつかのシステムは、例えば、米国特許第７，２０５，１４８号の中に見ることができる。

任意の細胞（ヒト以外の動物の細胞を含む）中およびヒト以外の動物の中でＭＦＡを作製し、使用するための方法と組成物が提供される。上記方法と組成物は、１つの細胞のゲノム中の任意の選択された部位（または無作為な部位）に有用な対立遺伝子を配置するための相同組み換え（または無作為な組み込み）を使用して利用され得る。上記方法と組成物は、多能性細胞、人工多能性細胞、および全能細胞において使用することができる。上記方法および組成物とともに使用するために適している細胞としては、ＥＳ細胞、例えば、マウスまたはラットのＥＳ細胞が挙げられる。様々な実施形態において、レポーター機能が内蔵されている条件的機能性についての選択肢を提供する真のＫＯ−ｆｉｒｓｔ対立遺伝子が提供される。

エレメントとリコンビナーゼ認識部位の並びを、標的遺伝子の機能を削除するであろう構築物を作製する（すなわち、ヌル対立遺伝子を作製する）か、または標的遺伝子の機能を変化させ（例えば、これをドミナントネガティブ、構成的に活性、または低形質の対立遺伝子に変える）、同時に、下流のエレメントを全て削除する（これにより、（ａ）条件的対立遺伝子の作製、および（ｂ）レポーターを用いるこれのヌルへの復帰が可能となる）ように設計することができる方法の一例を図２に説明する。

図２は、（例えば、示すＭＦＡの左右に対してホモロジーアームを使用することにより）ゲノム中に配置することができるＭＦＡの１つの実施形態を示す。標的化後、得られる対立遺伝子を条件的対立遺伝子に転換させることができる。これは、第１の選択された配列を欠失させ、第２の選択された配列を反転させることにより達成される。上記欠失と反転は、同じリコンビナーゼによって達成することも、また異なるリコンビナーゼによって達成することもできる。例えば、２対の不適合であるＦｌｐ認識部位を、一方を欠失を指示し、他方を反転を指示するように使用することができる。２つのそのようなＦｌｐ部位の一例は、ＦＲＴ部位とＦＲＴ３部位である。別の例においては、一方が欠失を指示し、他方が反転を指示する２対の不適合であるＣｒｅ部位（例えば、ｌｏｘＰとｌｏｘ２３７２）を使用することができる。さらに、２つの異なるリコンビナーゼ（例えば、Ｃｒｅで１対のｌｏｘＰ部位、およびＦｌｐで１対のＦＲＴ部位）を使用することができる。任意の適切な部位を、そのような部位が図２に示すＭＦＡのリコンビナーゼ部位の対の欠失と反転を指示することができる限りにおいて、この実施形態のために選択することができる（その特異的な実施形態を図５および図６に示す）。

図２の構築物の設計を目的の任意の配列とともに使用することができる（すなわち、ＮＳＩは目的の任意の配列である）が、この構築物の設計は、修飾されたエキソンで目的の１つのエキソンを置き換えるためには特に有用であり得る。

１つの実施形態においては、ＮＳＩは自然界に存在している１つのエキソン（または複数のエキソン）であり、そしてＣＯＩＮは修飾されたエキソン（例えば、突然変異を含有しているエキソン）である。ＭＦＡは、例えば、相同組み換えにより（適切なマウスのホモロジーアームを使用して）例えば、マウスＥＳ細胞のゲノム中に配置され、ＥＳ細胞は、マウスの生殖細胞系列の中に上記構築物を含む遺伝的操作されたマウスを作製するために利用される。１つの実施形態においては、自然界に存在しているエキソンから修飾されたエキソンへの状態の変化は、ＭＦＡに対するリコンビナーゼの作用により達成される。

１つの実施形態においては、上記構築物は、例えば、マウスのゲノム中に配置され、マウスはいずれも、その活性を調節することができるリコンビナーゼ（例えば、Ｃｒｅ）をさらに含む。リコンビナーゼは、エフェクターまたは代謝産物の制御下にリコンビナーゼが配置されている（例えば、ＣｒｅＥＲ^Ｔ２、その活性はタモキシフェンによりポジティブに制御される）、組織特異的プロモーターの制御下にリコンビナーゼが配置されている、あるいは、特定の発育段階で活性であるプロモーター（または他の調節性エレメント）（例えば、Ｎａｎｏｇプロモーター）または誘導性プロモーター（例えば、ドキシサイクリンとＴｅｔＲもしくはＴｅｔＲ変異体によりその活性が制御されるもの）の制御下にリコンビナーゼが配置されているか、あるいはこれらの技術の組み合わせの融合タンパク質を利用することにより、調節することができる。

図２に示すＭＦＡの実施形態は、動作配列、ＤＳＣ、目的のヌクレオチド配列（ＮＳＩ）、およびＣＯＩＮをコードする配列を含有しているエレメントを持つ。ここでは、上記エレメントは、ＭＦＡに対して所望される機能性を提供するように選択されたリコンビナーゼ認識部位のアレイの間に並べられる。

図２の上部は、選択されたゲノム中の目的のヌクレオチド配列（ＮＳＩ）（例えば、マウスのゲノム中のＮＳＩ）を説明する。示すようなＭＦＡは、例えば、ＮＳＩを置き換えるための相同組み換えにより、ゲノムに導入される。ＮＳＩが、示すＭＦＡで置き換えられ、この場合、ＭＦＡのＮＳＩは示すように反転させられ、これにより、もはや標的遺伝子の転写には組み込まれない。ＭＦＡの存在により、動作配列にレポーター（例えば、ｌａｃＺ）が含まれているかどうかを簡単に確認することができる。ＤＳＣはさらに、修飾された細胞（例えば、ＭＦＡで修飾されたマウスのＥＳ細胞）の選択に役立つように、存在する。

図２のＭＦＡの実施形態には、５セットのリコンビナーゼ認識部位により定義される、配列の５つの特徴的なユニットが含まれる。図３には、適合するリコンビナーゼ認識部位が隣接している配列の５つの特徴的なユニットの概念図が含まれる。

第１の特徴的な組み換え可能なユニットには、Ｒ１／Ｒ１’部位（例えば、ＦＲＴ３部位）が反対方向で含まれる（すなわち、反転を指示する）。ここでは、Ｒ１／Ｒ１’部位の間に以下が並べられる：動作配列（動作配列に関して５’にある３’スプライシング領域とアクセプター、および動作配列に関して３’にあるｐｏｌｙＡシグナルは、簡単にするために図３には示さない）、Ｒ２部位（例えば、Ｒｏｘ部位）、ＤＳＣ、Ｒ１部位と同じ方向のＲ３部位（例えば、ＦＲＴ部位）、Ｒ４部位（例えば、ｌｏｘＰ部位）、および標的遺伝子の転写方向に関してアンチセンス方向の目的のヌクレオチド配列（ＮＳＩ）（すなわち、アンチセンス鎖によりコードされる）、ならびに、Ｒ４部位と同じ方向のＲ５部位（例えば、ｌｏｘ２３７２部位）。ここでは、Ｒ３’部位（図３Ａに示すＲ３部位と反対方向の）がさらに、３’Ｒ１’部位の下流に含まれ、Ｒ１／Ｒ１’を認識するリコンビナーゼの存在下で、このユニットは、ＮＳＩを転写のための位置になるように反転させ、動作配列とＤＳＣを欠失させる。１つの実施形態においては、さらなる配列には、アンチセンス鎖上に配置されたＣＯＩＮ、その後ろに、上記ユニットのＲ４部位に関して反対方向のＲ４’部位（例えば、ｌｏｘＰ部位）が続く。その結果、Ｒ４／Ｒ４’を認識するリコンビナーゼ（例えば、Ｃｒｅ）に対して暴露されると、ここでＣＯＩＮのコード配列がＮＳＩの下流の転写のための位置に存在するように、ＣＯＩＮが反転させられる。

第２の特徴的な組み換え可能なユニット（図３Ｂ）には、Ｒ２／Ｒ２’部位（例えば、Ｒｏｘ部位）が同じ方向で含まれ（すなわち、欠失を指示する）、Ｒ２／Ｒ２’部位の間に配置された以下の配列が含まれる：ＤＳＣ、第１の特徴的な組み換え可能なユニットのＲ１部位と同じ方向の第１のＲ３部位（例えば、第１のＦＲＴ部位）、第１のＲ４部位（例えば、第１のｌｏｘＰ部位）、標的遺伝子に関して反転させられた（すなわち、アンチセンス）方向のＮＳＩ、Ｒ４部位に関して同じ方向の第１のＲ５部位（例えば、第１のｌｏｘ２３７２部位）、いずれもＲ３部位と反対方向のＲ１’部位（例えば、第２のＦＲＴ３部位）とＲ３’部位（例えば、第２のＦＲＴ部位）、ＣＯＩＮ（標的遺伝子の転写に関してアンチセンス方向）、Ｒ５部位と同じ方向のＲ５’部位（例えば、第２のｌｏｘ２３７２部位）、およびＲ４と同じ方向のＲ４’部位（例えば、第２のｌｏｘＰ部位）。この第２の特徴的な組み換え可能なユニットは、Ｒ２／Ｒ２’を認識するリコンビナーゼにより切り出すことができる。ＭＦＡ中に含まれる場合は、このユニットを、Ｒ１とＲ２またはＲ２’部位が隣接している動作配列（例えば、いくつかの実施形態においては、レポーター、例えば、ｌａｃＺをコードする配列）の後ろを残すように切り出すことができる。

第３の特徴的な組み換え可能なユニット（図３Ｃ）には、Ｒ３／Ｒ３’部位（例えば、ＦＲＴ部位）が反対方向で含まれ（すなわち、反転を指示する）、これには、Ｒ３／Ｒ３’部位の間に配置された以下の配列が含まれる：Ｒ４部位（例えば、ｌｏｘＰ部位）、標的遺伝子の転写に関して反転させられた（すなわち、アンチセンス）方向のＮＳＩ、ユニットのＲ４部位と同じ方向の（すなわち、図３Ｃの）Ｒ５部位（例えば、ｌｏｘ２３７２部位）、およびＲ３部位と反対方向のＲ１’部位（例えば、ＦＲＴ部位）。このユニットは、Ｒ３／Ｒ３’を認識するリコンビナーゼ（例えば、Ｆｌｐリコンビナーゼ、ここでは、Ｒ３／Ｒ３’部位はＦＲＴ部位である）の作用により反転させることができ、これにより、転写および翻訳に適切な方向でのＮＳＩの配置が生じる。

第４の特徴的な組み換え可能なユニット（図３Ｄ）には、Ｒ４／Ｒ４’部位（例えば、２つのｌｏｘＰ部位）が同じ方向で含まれ（すなわち、欠失を指示する）、これには、Ｒ４／Ｒ４’部位の間に配置された以下の配列が含まれる：反転させられた（すなわち、アンチセンス）方向のＮＳＩ、それぞれがＲ４部位に関して同じ方向であるＲ５部位（例えば、第１のｌｏｘ２３７２部位）およびＲ１’部位（例えば、ＦＲＴ３部位）およびＲ３’部位（例えば、ＦＲＴ部位）、ＣＯＩＮ（アンチセンス方向）、ならびに、Ｒ５部位と同じ方向のＲ５’部位（例えば、第２のｌｏｘ２３７２部位）。Ｒ４／Ｒ４’を認識するリコンビナーゼ（例えば、Ｒ４／Ｒ４’がｌｏｘＰ部位である場合には、Ｃｒｅ）の存在下で、このユニットは切り出し可能である。ＭＦＡの中に配置され、（Ｒ１／Ｒ１’、Ｒ３／Ｒ３’を認識するリコンビナーゼに対して暴露されない条件で）Ｒ４／Ｒ４’リコンビナーゼに対して暴露されると、このユニットは、欠失させられ、動作配列（例えば、いくつかの実施形態においては、レポーター、例えば、ｌａｃＺをコードする配列）とＤＳＣが残る。このように、このユニットは、ＭＦＡが、ゲノム中の配列を置き換える（例えば、１つのエキソンを置き換える）と、動作配列とＤＳＣを含有しているヌル対立遺伝子として、Ｒ４／Ｒ４’を認識するリコンビナーゼの存在下で作用できる１つの実施形態を可能にする。ＭＦＡのＤＳＣは、所望される場合には、Ｒ２／Ｒ２’を認識するリコンビナーゼ（例えば、Ｄｒｅリコンビナーゼ、ここでは、Ｒ２／Ｒ２’はＲｏｘ部位である）が作用すると、除去され得る。なぜなら、ＤＳＣには、同じ方向のＲ２／Ｒ２’部位が上流と下流に隣接しているからである。

第５の特徴的な組み換え可能なユニット（図３Ｅ）には、Ｒ５／Ｒ５’部位（例えば、２つのｌｏｘ２３７２部位）が、同じ方向で（すなわち、欠失を指示する）、ならびに第４の特徴的な組み換え可能なユニットのＲ４／Ｒ４’部位と同じ方向で含まれ、これには、Ｒ５部位とＲ５’部位の間に配置された以下の配列が含まれる：互いに同じ方向であるが、第１の特徴的な組み換え可能なユニットのＲ１部位に対して反対方向のＲ１’部位（例えば、ＦＲＴ３部位）とＲ３’部位（例えば、ＦＲＴ部位）、および標的遺伝子の転写に関してアンチセンス方向のＣＯＩＮ。

当業者に明らかであるように、重複している組み換え可能なユニットは、ＭＦＡ中の可能である組み換え可能なエレメントに限定されるのではなく、ＭＦＡの構造を伝えるためにそのように記載される。例えば、当業者は、それぞれの組み換え可能なユニットに、組み換え可能なユニットの中にある部位特異的組み換え部位が含まれること、そして、複数の部位に対するリコンビナーゼの作用（複数の組み換え可能なユニットをまたぐ）により、ＭＦＡの意図される機能を達成するＭＦＡの所望される、記載される操作が実現されることを理解するであろう。例えば、図３を参照すると、Ｒ１／Ｒ１’とＲ３／Ｒ３’を認識するリコンビナーゼの作用は、図３に概念的に示すように、５つの組み換え可能なユニットの全ての複数の部分を操作するように機能する。

一旦、ＭＦＡがゲノム中の所望される位置に配置されれば、これは、これが報告機能を持つヌル対立遺伝子を提供するように操作され得る。ここでは、ヌル対立遺伝子は、同じ方向に方向を合わせられたリコンビナーゼ認識部位が隣接している全ての配列を欠失させるように（標的化後のリコンビナーゼに媒介される工程において）再度修飾され得る。この実施形態の一例を図４に示し、これは、適切なリコンビナーゼ認識部位の例を示している。ここでは、動作配列（ここでは、ｌａｃＺをコードする）以外の全てのエレメントには、上流および下流にＲｏｘ部位が隣接している。Ｄｒｅリコンビナーゼに対して暴露されると、動作配列だけが存在する。Ｒｏｘが付いた配列の切り出しは、ＤＳＣ（ここでは、ｎｅｏ^ｒを含有している）の喪失、および／またはＣＯＩＮの喪失、および／またはＮＳＩの喪失により確認することができる。結果は、ＤＳＣ、ＮＳＩ、およびＣＯＩＮが欠失している真のヌル対立遺伝子である。

図２に説明し、図３の上部で例示するＭＦＡを、条件的対立遺伝子を作製するために使用することができる。条件的対立遺伝子は、第１の例においてこの対立遺伝子が暴露された適切なリコンビナーゼを選択することにより作製することができる。この実施形態における適切なリコンビナーゼは、ＮＳＩをセンス鎖に戻すように反転させ、ＣＯＩＮをアンチセンス方向で残すリコンビナーゼである。これは、例えば、Ｒ１／Ｒ１’を、そしてＲ３／Ｒ３’もまた認識するリコンビナーゼ（例えば、Ｆｌｐリコンビナーゼ、ここでは、Ｒ１／Ｒ１’およびＲ３／Ｒ３’は、ＦＲＴ部位およびＦＲＴ３部位より選択される；特定の実施形態については図５を参照のこと）に対してＭＦＡを暴露することにより、達成され得る。簡単に説明すると、ＭＦＡがゲノム中の所望される位置に配置されると、これは条件的対立遺伝子を作製するために使用され得る。ここでは、図２および図３の上部の反転させられたＮＳＩは、標的遺伝子の転写のための方向で配置され、一方、ＣＯＩＮはアンチセンス方向で残っており、動作配列とＤＳＣは欠失している。この実施形態の一例を図５に示す。ここでは、ｌａｃＺとｎｅｏ^ｒを含有しているＤＳＣとを含む動作配列が、Ｆｌｐリコンビナーゼに対する上記対立遺伝子の最初の暴露により除去されて、ＦＲＴ３部位により指示されるエレメントの反転が生じ、続いて、ＦＲＴ部位により指示されるＦｌｐに媒介される欠失が生じる。得られる対立遺伝子は、転写のための方向のＮＳＩを示すが、ＣＯＩＮをアンチセンス方向で残す。

図６に示すように、Ｆｌｐに媒介される反転がＦＲＴ部位（図５に示すとおり）またはＦＲＴ３部位（図６に示すとおり）により最初に起こるかにはかかわらず、同じ条件的対立遺伝子を得ることができる。

条件的対立遺伝子を作製する実施形態においては、対立遺伝子中に残っているリコンビナーゼ部位は、１種類以上の適切なリコンビナーゼでの処理により、ＮＳＩの続く欠失（またはＮＳＩの再度の反転）とＣＯＩＮの反転が生じるように選択され、その結果、上記対立遺伝子は、ＮＳＩに関してヌル対立遺伝子を生じるが、また、ＣＯＩＮを転写のための方向で配置する。この一例を、Ｃｒｅに媒介される組み換えをそれぞれが独立して指示するｌｏｘＰおよびｌｏｘ２３７２部位を使用して示す。Ｃｒｅ反応性部位が使用されるが、任意の適切な部位をＣｒｅ部位の代わりに使用することができる。

図７に示すように、センス方向の（すなわち、転写および翻訳のための位置に）ＮＳＩが、第１のｌｏｘ２３７２部位に関して３’に配置される。続いて、ＮＳＩは、第１のｌｏｘ２３７２部位と同じ方向の第１のｌｏｘＰ部位であり、反転させられた（すなわち、アンチセンス）ＣＯＩＮが、第１のｌｏｘＰ部位の下流に配置され、そして反転させられたＣＯＩＮが、第１のｌｏｘ２３７２部位に関して反対方向の第２のｌｏｘ２３７２部位の上流に配置される。第２のｌｏｘ２３７２部位の下流には、第１のｌｏｘＰ部位に関して反対方向で配置された第２のｌｏｘＰ部位が配置される。この並びにより、Ｃｒｅで処理されると、いずれかのｌｏｘ部位による反転、その後のいずれかのｌｏｘ部位による欠失が可能となる（図７を参照のこと）。得られる対立遺伝子には、センス方向の、すなわち、転写および翻訳のための位置にＣＯＩＮが含まれる。

代替えの並び（図８を参照のこと）においては、ｌｏｘＰ部位が、ＮＳＩに関して５’に（ＮＳＩとＣＯＩＮの間に配置される代わりに）配置され、その結果、Ｃｒｅに対して暴露されると、ＮＳＩのアンチセンス方向への反転とＣＯＩＮのセンス方向への反転が生じる。

ＭＦＡアプローチは、多くの実施形態の選択肢を提供する。特異的な実施形態においては、第１のリコンビナーゼに対して暴露された場合の、エレメントとリコンビナーゼ部位の並びは、図５または図６の下の構築物に示すとおりである。ここでは、示すＦＲＴ３部位は、得られる対立遺伝子中に類似する部位を有さない部位Ｒ１であり、示すＦＲＴ部位は、得られる対立遺伝子中に類似する部位を有さないリコンビナーゼ部位Ｒ３であり、最も左側のｌｏｘ２３７２部位は、示す最も右側のｌｏｘ２３７２部位を占有している類似するリコンビナーゼ部位Ｒ５’と対合する部位Ｒ５であり、示す最も左側のｌｏｘＰ部位は、示すように、最も右側のｌｏｘＰ部位により提供される類似するリコンビナーゼ部位Ｒ４’と対合する部位Ｒ４であり、そして示すＲｏｘ部位は、得られる対立遺伝子の中に類似するリコンビナーゼ部位を有さない部位Ｒ２である。

特異的な実施形態においては、第２のリコンビナーゼに対して暴露された場合の、得られる対立遺伝子のエレメントとリコンビナーゼ部位の並びは、図７の下の構築物に示すとおりである。ここでは、示すＦＲＴ３部位は、得られる対立遺伝子中に類似する部位を有していない部位Ｒ１であり、ｌｏｘ２３７２部位は、得られる対立遺伝子の中の類似するリコンビナーゼ部位とは対合しない部位Ｒ５であり、示すＦＲＴ部位は、得られる対立遺伝子の中の類似するリコンビナーゼ部位とは対合しない部位Ｒ３であり、示すｌｏｘＰ部位は、得られる対立遺伝子の中の類似するリコンビナーゼ部位とは対合しない部位Ｒ４であり、そして示すＲｏｘ部位は、得られる対立遺伝子の中の類似するリコンビナーゼ部位とは対合しない部位Ｒ２’である。

特異的な実施形態においては、得られる対立遺伝子により、第２のリコンビナーゼへの暴露後に、ＣＯＩＮの発現が可能となる。特異的な実施形態においては、ＣＯＩＮはレポーターまたはＤＳＣである。

１つの態様では、１種類のリコンビナーゼの作用により、ＣＯＩＮ、ＮＳＩ、およびＤＳＣが切り出されるが、レポーターは切り出されないように（図１１Ｂ）、一方で、異なるリコンビナーゼの作用により、ＤＳＣを欠くが、ＮＳＩをセンス方向に配置し、ＣＯＩＮをアンチセンス方向で維持されている（図１１Ｃ）対立遺伝子が生じるように並べられた、ＣＯＩＮ、ＮＳＩ、ＤＳＣ、レポーター、およびリコンビナーゼ部位を含むＭＦＡが提供される。この得られる対立遺伝子は、さらなるリコンビナーゼの作用により、ＮＳＩが切り出され、ＣＯＩＮがセンス方向で配置されるように並べられたリコンビナーゼ部位を有する（図１１Ｄ）。したがって、議論した実施形態においては、このＭＦＡにより、レポーター機能での真のノックアウトと、ＤＳＣの除去、またはＮＳＩの配置を選択することが可能となる。ここでは、その後のＮＳＩの除去は、同時に起こるＣＯＩＮのセンス方向での配置により確認される。いくつかの重複しているリコンビナーゼユニットの概要を、類似する点線の形状により示した類似するリコンビナーゼユニットを用いて、そのような対立遺伝子について図１１Ａに示す。

１つの態様では、１種類のリコンビナーゼの作用によりＮＳＩとＤＳＣが切り出されるが、レポーターとＣＯＩＮの方向は維持されており（図１２Ｂ）、一方で、異なるリコンビナーゼの作用によっては、ＤＳＣとレポーターを欠くが、ＮＳＩがセンス方向で配置されており、ＣＯＩＮがアンチセンス方向で維持されている（図１２Ｃ）対立遺伝子を生じるように並べられた、ＣＯＩＮ、ＮＳＩ、ＤＳＣ、レポーター、およびリコンビナーゼ部位を含むＭＦＡが提供される。この得られる対立遺伝子は、さらなるリコンビナーゼの作用によりＮＳＩが切り出され、ＣＯＩＮがセンス方向で配置されるように並べられたリコンビナーゼ部位を有する（図１２Ｄ）。したがって、議論した実施形態においては、このＭＦＡにより、レポーター機能の真のノックアウトとＤＳＣの除去；またはＮＳＩの配置（ここでは、続くＮＳＩの除去が、同時に起こるＣＯＩＮのセンス方向での配置により確認される）の選択が可能となる。いくつかの重複しているリコンビナーゼユニットの概要を、類似する点線の形状により示した類似するリコンビナーゼユニットを用いて、そのような対立遺伝子について図１２Ａに示す。

１つの態様では、ＣＯＩＮ、ＮＳＩ、ＤＳＣ、レポーター、およびリコンビナーゼ部位（これらは、１種類のリコンビナーゼの作用により、レポーターとＤＳＣが切り出され、ＮＳＩがセンス方向で配置されるように並べられている）を含むＭＦＡが提供される（図１３Ｂ）。この得られる対立遺伝子は、さらなるリコンビナーゼの作用により、ＮＳＩがアンチセンス方向で配置され、一方、ＣＯＩＮがセンス方向で配置されるように並べられたリコンビナーゼ部位を有する（図１３Ｃ）。したがって、議論される実施形態においては、このＭＦＡは、ＭＦＡから条件的対立遺伝子を作製することができる。

１つの態様では、ＣＯＩＮ、ＮＳＩ、ＤＳＣ、レポーターと、リコンビナーゼ部位の異なるアレイ（これらは、選択されたリコンビナーゼの作用によりレポーターとＤＳＣが切り出され、ＮＳＩがセンス方向で配置されるように並べられている）を含むＭＦＡが提供される（図１４Ｂ）。この得られる対立遺伝子は、さらなるリコンビナーゼの作用により、ＮＳＩがアンチセンス方向で配置され、一方、ＣＯＩＮがセンス方向で配置されるように並べられたリコンビナーゼ部位を有する（図１４Ｃ）。したがって、このＭＦＡもまた、ＭＦＡから条件的対立遺伝子を作製することができる。

１つの態様では、ＮＳＩ、ＤＳＣ、レポーター、ＣＯＩＮ、およびリコンビナーゼ部位（これらは、選択されたリコンビナーゼの作用により、レポーターとＤＳＣが切り出され、ＮＳＩがセンス方向で配置され、一方、ＣＯＩＮはアンチセンス方向で維持されるように並べられている）を含むＭＦＡが提供される（図１５Ｂ）。この得られる対立遺伝子は、さらなるリコンビナーゼの作用によりＮＳＩがアンチセンス方向で配置され、一方、ＣＯＩＮはセンス方向で配置されるように並べられたリコンビナーゼ部位を有する（図１５Ｃ）。したがって、このＭＦＡもまた、ＭＦＡから条件的対立遺伝子を作製することができる。

（実施例１）
Ｈｐｒｔ１ ＭＦＡ
Ｈｐｒｔ１は、マウスにおいてＸ連鎖である遺伝子であり、Ｈｐｒｔ１ヌルＥＳ細胞は、ヌクレオ塩基アナログである６−チオグアニン（６−ＴＧ）に対して耐性がある。この特性が、容易であり、堅調な表現型の試験を提供する。なぜなら、Ｈｐｒｔ１について野生型である細胞は６−ＴＧの存在下で死滅し、一方、Ｈｐｒｔ１についてヌルである細胞は生き残るからである。さらに、男性の胚盤胞に由来する（典型的な場合にそうであり、標的化のために現在使用されているＥＳ細胞株の大部分もまたそのような場合である）ＥＳ細胞を標的化する場合は、わずかに１回の標的化が、Ｈｐｒｔ１^ＭＦＡ／Ｙ ＥＳ細胞を作製するために必要である。Ｈｐｒｔ１^ＭＦＡ／Ｙ ＥＳ細胞を作製するためには、標的化ベクター中のＭＦＡは、図５（上）に示す対立遺伝子に従い、米国特許第６，５８６，２５１号およびＶａｌｅｎｚｕｅｌａら（２００３）のＨｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ ｇｅｎｏｍｅ ｃｏｕｐｌｅｄ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２１（６）：６５２−６５９（この特許および論文は、言及により本明細書中に組み込まれたこととなる）に記載されているＶＥＬＯＣＩＧＥＮＥ（登録商標）法にしたがって、標準的な遺伝子操作方法論および細菌による相同組み換えによって調製される。Ｈｐｒｔ１^ＭＦＡ対立遺伝子は、エキソン３を囲むように設計され、エキソン３と、ＮＳＩのように、そのすぐ５’および３’にある保存されているイントロン配列を定義する（図９）。これを選択する理由は、エキソン３がフレーム２（ｆ２）の中で始まり、フレーム０（ｆ０）の中で終わることにある。延長線上で考えると、前にあるエキソン（すなわち、エキソン２）はフレーム２（ｆ２）で終わり、次にくるエキソン（すなわち、エキソン４）はフレーム０（ｆ０）で始まる。これは、このＮＳＩがアンチセンス方向に反転させられると、エキソン２がエキソン４に関してフレームアウトすることを意味する。なぜなら、エキソン２はｆ２の中で終わり、エキソン４はｆ０の中で始まるからである。この様式では、Ｈｐｒｔ１^ＭＦＡ対立遺伝子中に動作配列（ＳＡ−ｌａｃＺ−ｐｏｌｙＡ（図１０））の何らかの転写履歴が存在し、最終的なｍＲＮＡ（このｍＲＮＡにはエキソン３は含まれず、ナンセンス配列をコードする）から動作配列を除去するスプライシングも存在する場合には、Ｈｐｒｔ１ヌルのｍＲＮＡと表現型が効率よく生じる。逆に、Ｈｐｒｔ１^{ＣＯＩＮ−ＩＮＶ}対立遺伝子（Ｈｐｒｔ１^ＣＯＩＮ対立遺伝子を最初に作製するための、ＦＬＰまたはＦＬＰの変異体でのＨｐｒｔ１^ＭＦＡの処理により、その後、Ｈｐｒｔ１^{ＣＯＩＮ−ＩＮＶ}を作製するためのＣｒｅでの処理により作製された）については、ＣＯＩＮエレメントのＳＡ−ｅＧＦＰ−ｐｏｌｙＡの転写履歴が存在し（図１０）、そして最終的なｍＲＮＡ（このｍＲＮＡにはエキソン３は含まれず、したがって、ナンセンス配列をコードする）からＳＡ−ｅＧＦＰ−ｐｏｌｙＡ配列を除去するスプライシングもまた存在する場合には、Ｈｐｒｔ１ヌルであるｍＲＮＡおよび表現型が効率よく生じる。

アンチセンス方向のＮＳＩはＨｐｒｔ１のエキソン３と周囲にある進化の過程で保存されてきたイントロン配列であり（図９）、そしてアンチセンス方向のＣＯＩＮはＳＡ−ｅＧＦＰ−ｐｏｌｙＡである。標的化ベクターは、第１のＦＲＴ３部位の上流であり第２のＲｏｘ部位の下流にマウスのホモロジーアーム（これは、そのＭＦＡバージョンによりそれが置き換えられるようにＨｐｒｔ１遺伝子座への標的化を指示する）を有しており、これにより、（ａ）ＳＡ−ＬａｃＺ−ｐｏｌｙＡエレメントが、Ｈｐｒｔ１の転写方向に関してセンス方向に、続いて、ＤＳＣがＨｐｒｔ１の転写方向に関してアンチセンス方向に、いずれもＨｐｒｔ１のエキソン３の前にあり、（ｂ）エキソン３はＨｐｒｔ１の転写方向に関してアンチセンス方向で配置され、そして（ｃ）エキソン３の下流にあるＣＯＩＮエレメントはＨｐｒｔ１の転写方向に関してアンチセンス方向で配置される。ここでは、これらの様々なエレメントには、動作配列であるＳＡ−ＬａｃＺ−ｐｏｌｙＡ、およびＮＳＩであるＨｐｒｔ１のエキソン３と隣接するイントロン配列とともに、図３および図１０に詳細に記載する様な組み換え可能なユニットの中に互いに並べられた部位特異的リコンビナーゼ認識部位が隣接している。

標的化ベクターは、米国特許第６，５８６，２５１号およびＶａｌｅｎｚｕｅｌａら（２００３）Ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ ｇｅｎｏｍｅ ｃｏｕｐｌｅｄ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２１（６）：６５２−６５９（これらの特許および論文は言及により本明細書中に組み入れられたこととなる）に記載されているＶＥＬＯＣＩＧＥＮＥ（登録商標）方法にしたがって調製され、ＥＳ細胞にエレクトロポレーションされる。得られるＥＳ細胞は、Ｈｐｒｔ１の野生型バージョンの代わりに、Ｈｐｒｔ１のＭＦＡ対立遺伝子を保有する。あらゆるさらなる修飾の前は、Ｈｐｒｔ１^ＭＦＡ／Ｙ ＥＳ細胞は６−ＴＧでの処理に対して耐性があり（なぜなら、これらは、Ｈｐｒｔ１について実質的にヌルであるからである）、これは、真のノックアウト−ｆｉｒｓｔ対立遺伝子を作製することについてのＭＦＡ法の有用性を実証している。Ｄｒｅでの処理後も、この特性は保たれるが、一方、細胞の遺伝子型はＨｐｒｔ１^{ＳＡ−ＬａｃＺ−ｐｏｌｙＡ}／Ｙへと転換させられる。Ｈｐｒｔ１遺伝子座については、この修飾は、レポーター（ＬａｃＺ）の発現レベルを変えることはなく、どのような表現型上の結果も有さない（６−ＴＧに対する耐性を変化させる）場合があるが、これは他の遺伝子座についてはその通りではない場合がある。相補性解析と実質的に等価である１つの工程におけるＦＬＰまたはＦＬＰ変異体での処理後、Ｈｐｒｔ１^ＭＦＡ／Ｙ ＥＳ細胞はＨｐｒｔ１^ＣＯＩＮ／Ｙ ＥＳ細胞へと転換させられる。これらは実質的に野生型であり、したがって、６−ＴＧに対して感受性がある。加えて、この操作により、Ｈｐｒｔ１メッセージの発現が回復してその野生型のものに戻る。Ｃｒｅでの処理後、Ｈｐｒｔ１^ＣＯＩＮ／Ｙ ＥＳ細胞は、Ｈｐｒｔ１^{ＣＯＩＮ−ＩＮＶ}／Ｙ ＥＳ細胞に転換される。これらは、Ｈｐｒｔ１について実質的にヌルであり、したがって、６−ＴＧに対して耐性がある。加えて、この操作により、Ｈｐｒｔ１メッセージの野生型メッセージの発現の抑制と、それと同時に起こる、Ｈｐｒｔ１の第１のエキソンとｅＧＦＰ（ＣＯＩＮエレメントによりコードされる）からなるハイブリッドメッセージでの置き換えが生じ、それにより、Ｈｐｒｔ１の代わりにｅＧＦＰを発現する対立遺伝子が作製される。この新しい特性であるｅＧＦＰの発現は、ＣＯＩＮエレメントのセンス鎖への反転をスコアするために随意に使用することができ、この事象が両方のタイプの細胞（Ｈｐｒｔ１^ＣＯＩＮ／Ｙ ＥＳ細胞とＨｐｒｔ１^{ＣＯＩＮ−ＩＮＶ}／Ｙ ＥＳ細胞）が存在する１つの細胞集団から起こる細胞の単離を可能にすることにおいてさらなる有用性を有する。したがって、ヌルになるように転換させられたＣＯＩＮ対立遺伝子だけではなく、この事象もまた、新しい、容易に測定可能であり、かつ有用な事象を特徴とする。

（実施例２）
Ｈｐｒｔ１ ＭＦＡの結果
センス方向のＬａｃＺレポーター（ＳＡ（ａｄｍｌ）−ｇｔｘ−ＬａｃＺ−ｐＡ）、ネオマイシンＤＳＣ（Ｎｅｏ）、アンチセンス方向のＮＳＩ（これには、Ｈｐｒｔ１の重要なエキソン（ｅ_ｃ）（エキソン３）と隣接している進化の過程で保存されてきたイントロン配列が含まれる）、およびＣＯＩＮ（Ｇｔｘ−ＳＡ−ＨＡ−ｍｙｃ３−ＴＭ−Ｔ２Ａ−ＧＦＰ−ｐＡ）を有しているＭＦＡを、図１６Ａに示すリコンビナーゼ部位の並びで構築した。ＭＦＡをＦ１Ｈ４ ＥＳ細胞にエレクトロポレーションし、Ｇ４１８に対する耐性について選択した。続いて、Ｇ４１８耐性コロニーを、標的化を決定するために遺伝子型分類した。スクリーニングした全部で９６個のコロニーから５つの標的化されたクローン（Ｈｐｒｔ１^ＭＦＡ／Ｙ）を得た。Ｈｐｒｔ１ヌルである細胞について予想されたとおり（Ｄｏｅｔｓｃｈｍａｎ，Ｔ．ら（１９８７）Ｔａｒｇｅｔｅｄ ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｔａｎｔ ＨＰＲＴ ｇｅｎｅ ｉｎ ｍｏｕｓｅ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ，Ｎａｔｕｒｅ ３３０：５７６−５７８）、５個のこれらのクローンの全てが、１０μＭの６−ＴＧを補充した標準的なＥＳ細胞培地中で培養された場合に生き残り、増殖することが明らかになった（これは、利用される標準的な６−ＴＧ生存分析である）。対照的に、もとの細胞株Ｆ１Ｈ４、ならびに試験した標的化されないクローンの全ては、６−ＴＧの存在下で増殖することはできなかった。これらの結果は、以前に報告されたものと一致する（Ｄｏｅｔｓｃｈｍａｎら（１９８７））。

リコンビナーゼＦＬＰｏ（Ｒａｙｍｏｎｄ，Ｃ．Ｓ．ａｎｄ Ｓｏｒｉａｎｏ，Ｐ．（２００７）Ｈｉｇｈ−ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ＦＬＰ ａｎｄ ＰｈｉＣ３１ ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ，ＰＬｏＳ ＯＮＥ ２：ｅ１６２）で処理すると、Ｈｐｒｔ１^ＭＦＡ対立遺伝子はＨｐｒｔ１^ＣＯＩＮ対立遺伝子（図１６Ｂ）に転換されて、Ｈｐｒｔ１^ＭＦＡ／Ｙ ＥＳ細胞が生じる。この操作は、ＬａｃＺレポーターであるＤＳＣの除去、ならびに、ＮＳＩのセンス鎖への再度の反転を生じる。したがって、得られる対立遺伝子（Ｈｐｒｔ１^ＣＯＩＮ）は、野生型Ｈｐｒｔ１ ｍＲＮＡがコードされ、発現されるので、機能的には野生型である。

リコンビナーゼＣｒｅ（Ｓａｕｅｒ，Ｂ．ａｎｄ Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ，Ｎ．（１９８８）Ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ＤＮＡ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｔｈｅ Ｃｒｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ Ｐ１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５１６６−５１７０）でさらに処理すると、Ｈｐｒｔ１^ＣＯＩＮ対立遺伝子はＨｐｒｔ１^{ＣＯＩＮ−ＩＮＶ}対立遺伝子（図１６Ｃ）に転換されて、Ｈｐｒｔ１^{ＣＯＩＮ−ＩＮＶ}／Ｙ ＥＳ細胞が生じる。この対立遺伝子（Ｈｐｒｔ１^{ＣＯＩＮ−ＩＮＶ}）は、Ｈｐｒｔ１ ｍＲＮＡがｅＧＦＰをコードするものに置き換えられる（そしてこれはさらに、ＮＳＩ（すなわち、設計段階で定義したように、Ｈｐｒｔ１のエキソン３と隣接するイントロン配列）を欠失している）ので、機能的にはヌルである。

ＭＦＡを持つ細胞（Ｈｐｒｔ１^ＭＦＡ／Ｙ）をヌクレオチドアナログ６−ＴＧに対する耐性について試験し、野生型細胞と比較した（図１７）。Ｈｐｒｔ１^ＭＦＡ／Ｙ ＥＳ細胞は生き残ったが、Ｈｐｒｔ１^＋／Ｙ ＥＳ細胞は死滅した。これは、Ｈｐｒｔ１^ＭＦＡ／Ｙが機能的にＨｐｒｔ１ヌルであることを示している。次いで、Ｈｐｒｔ１^ＭＦＡ／Ｙ
ＥＳ細胞をＦＬＰｏで処理して、Ｈｐｒｔ１^ＭＦＡ対立遺伝子がＨｐｒｔ１^ＣＯＩＮ対立遺伝子に転換されるかどうかを試験した。得られるＨｐｒｔ１^ＣＯＩＮ／Ｙ ＥＳ細胞は、Ｈｐｒｔ１の発現が回復するので、表現型上は野生型であると予想される。６−ＴＧの存在下で培養された場合には、それらの野生型（Ｈｐｒｔ１^＋／Ｙ）対応物と同然に、Ｈｐｒｔ１^ＣＯＩＮ／Ｙ ＥＳ細胞が死滅するので、これがまさにそのとおりであることが示された。最後に、Ｈｐｒｔ１^ＣＯＩＮ／Ｙ ＥＳ細胞をＣｒｅで処理して、Ｈｐｒｔ１^{ＣＯＩＮ−ＩＮＶ}／Ｙ ＥＳ細胞（これは、ＣＯＩＮモジュールが活性化されており、一方で同時にＨｐｒｔ１のエキソン３が欠失しているので（図１６、パネルＣ）、Ｈｐｒｔ１についてはヌルであると予想される）を作製した。６−ＴＧの存在下で培養すると、Ｈｐｒｔ１^{ＣＯＩＮ−ＩＮＶ}／Ｙ ＥＳ細胞は生き残り、増殖した。これにより、ＭＦＡの設計と用途により意図したとおり、これらがＨｐｒｔ１について機能的にヌルであることを確認する。

上で得た表現型の結果を、ここで、以下のそれぞれの遺伝子型クラスに属しているＥＳ細胞のタンパク質調製物についてウェスタンブロットを行うことにより、タンパク質レベルでさらに確認した：野生型（Ｈｐｒｔ１^＋／Ｙ）、Ｈｐｒｔ１^ＭＦＡ／Ｙ（ＭＦＡ）、Ｈｐｒｔ１^ＣＯＩＮ／Ｙ（ＭＦＡ＋ＦＬＰｏ）、およびＨｐｒｔ１^{ＣＯＩＮ−ＩＮＶ}／Ｙ（ＭＦＡ＋ＦＬＰｏ＋Ｃｒｅ）。これらのタンパク質調製物を、レポーターとＮＳＩ（すなわち、Ｈｐｒｔ１）の発現について試験した。Ｈｐｒｔ１^ＭＦＡ／Ｙ ＥＳ細胞はＨｐｒｔ１タンパク質が欠失しており、レポーター（ＬａｃＺ）を発現する。Ｈｐｒｔ１^ＣＯＩＮ／Ｙ ＥＳにおいては、Ｈｐｒｔ１の発現が野生型レベルに回復しており（これは、ＮＳＩ（Ｈｐｒｔ１のエキソン３）の配置がセンス方向に戻っていることを反映している）、レポーター（ＬａｃＺ）タンパク質の発現を示さなかった。これにより、ＦＬＰｏによるレポーターの切り出しを確認した。これにより、Ｈｐｒｔ１^ＭＦＡ対立遺伝子が実際にヌルであり、レポーターとＤＳＣの除去および同時に起こるＮＳＩのセンス鎖への再度の反転（ＦＬＰｏにより試験的に行われた操作）後に、機能性の野生型対立遺伝子に転換させることができることが立証された。Ｈｐｒｔ１タンパク質の発現レベルでは、Ｈｐｒｔ１^ＣＯＩＮ対立遺伝子が野生型（Ｈｐｒｔ１^＋）と同じであるという事実が、真の条件的ヌルを作製し、１工程のリコンビナーゼに媒介される標的化後の工程において同等の相補性解析を行うことについてのこの方法の堅調性をさらに実証している。最後に、Ｈｐｒｔ１^{ＣＯＩＮ−ＩＮＶ}／Ｙ ＥＳ細胞はＨｐｒｔ１タンパク質が欠失しており、これにより６−ＴＧ耐性試験を使用して行った表現型の観察が事実上確認される。これにより、ＣＯＩＮをベースとする条件的ヌル対立遺伝子（Ｈｐｒｔ１^ＣＯＩＮ）が意図したとおりに機能することをさらに確認する。

Claims (1)

1. 明細書に記載された発明。