JP2016189772A - エンドヌクレアーゼ活性を有するインフルエンザａ２００９パンデミックｈ１ｎ１のポリペプチド断片、及びそれらの使用 - Google Patents

エンドヌクレアーゼ活性を有するインフルエンザａ２００９パンデミックｈ１ｎ１のポリペプチド断片、及びそれらの使用 Download PDF

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Abstract

【課題】インフルエンザＡ２００９パンデミックＨ１Ｎ１ウイルスのウイルスポリメラーゼのエンドヌクレアーゼ活性を変調させることができる感染性疾患の治療のための、薬理学的組成物の提供。【解決手段】エンドヌクレアーゼ活性を有するウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのＰＡサブユニットのアミノ末端断片を含むポリペプチド断片であって、、（ｉ）Ｘ線結晶学を使用する上記ポリペプチド断片の構造決定に好適なポリペプチド断片の結晶、並びに（ｉｉ）上記ポリペプチドの構造座標を使用して該ポリペプチド断片内のヌクレオチド鎖切断活性部位を変調させ、好ましくは阻害する化合物をスクリーニング及び設計する計算方法。エンドヌクレアーゼ活性を有するＰＡポリペプチド断片と結合し、好ましくは上記ヌクレオチド鎖切断活性を阻害する化合物を、好ましくはハイスループット設定において同定する方法。【選択図】なし

Description

本発明は、エンドヌクレアーゼ活性（endonuclease activity）を有するウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのＰＡサブユニットのアミノ末端断片を含むポリペプチド断片であって、上記ＰＡサブユニットがインフルエンザＡ２００９パンデミックＨ１Ｎ１ウイルス由来のものであり、又はその変異体である、ポリペプチド断片に関する。本発明は、（ｉ）Ｘ線結晶学を使用する上記ポリペプチド断片の構造決定に好適なポリペプチド断片の結晶、並びに（ｉｉ）上記ポリペプチドの構造座標を使用して該ポリペプチド断片内のヌクレオチド鎖切断活性部位を変調させ、好ましくは阻害する化合物をスクリーニング及び設計する計算方法にも関する。加えて、本発明は、エンドヌクレアーゼ活性を有するＰＡポリペプチド断片と結合し、好ましくは上記ヌクレオチド鎖切断活性（endonucleolytic activity）を阻害する化合物を、好ましくはハイスループット設定において同定する方法に関する。この発明は、オルトミクソウイルス科、ブニヤウイルス科及び／又はアレナウイルス科（Arenaviridaefamily）のウイルスによるウイルス感染によって引き起こされ、好ましくはインフルエンザＡ２００９パンデミックＨ１Ｎ１ウイルスによるウイルス感染によって引き起こされる疾患状態の治療のための、本発明のＰＡサブユニットポリペプチド断片又はその変異体のエンドヌクレアーゼ活性を変調させることができ、好ましくはこれを阻害することができる化合物、及び上記化合物を含む薬学的組成物にも関する。好ましくは、上記化合物は、本明細書中で開示される方法によって同定可能であり、又は上記薬学的組成物は、本明細書中で開示される方法によって製造可能である。
インフルエンザは、世界中での高い罹患率及び死亡率に関与し、多くの人により、ヒトにとって最も重大なウイルスの脅威に属すると考えられている。例年、インフルエンザの流行が地球を襲い、時折新しい毒性株が、破壊力の大きな世界的大流行を引き起こす。現在のところインフルエンザウイルスの流行を制御する主要な手段はワクチン接種である。しかし、ワクチン接種の効果を回避する突然変異インフルエンザウイルスが、迅速に発生する。新しいインフルエンザワクチンを作り出すのに約６ヶ月かかるという事実に照らすと、特に迅速に拡散する流行病に対する防御の第一線として、代替的な治療手段（すなわち抗ウイルス薬）が必要である。
抗ウイルス薬の開発のための優れた出発点は、必須ウイルスタンパク質の構造データである。したがって、インフルエンザウイルス表面抗原ノイラミニダーゼの結晶構造決定（非特許文献１）は、細胞からのウイルスの放出を防止する（しかしウイルス産生は防止しない）抗ウイルス活性を有するノイラミニダーゼ阻害剤の開発を直接もたらした。これら及びそれらの誘導体は、その後抗インフルエンザ薬ザナミビル（Glaxo）及びオセルタミビル（Roche）へと発展し、これらは現在、最終的な流行病に対する防御の第一線として多くの国により貯蔵されている。しかし、これらの薬物は、臨床疾患の期間の低減をもたらすにすぎない。代替的に、アマンタジン及びリマンタジン等の他の抗インフルエンザ化合物は、ウイルス膜において、イオンチャネルタンパク質（すなわちＭ２タンパク質）を標的とし、細胞内のウイルスの脱殻（uncoating）を妨げる。しかしそれらは、その副作用と、耐性ウイルス突然変異体の迅速な発生とのために広範には使用されていない（非特許文献２）。加えて、より非特異的なウイルス薬（リバビリン等）が、インフルエンザ感染症の治療のために有効であることが示されている（非特許文献３）。しかし、リバビリンは、おそらく重度の副作用のために、数ヶ国でしか承認されていない（非特許文献４）。明らかに、好ましくは様々な標的を対象とする、新しい抗ウイルス化合物が必要とされている。
インフルエンザＡウイルス、インフルエンザＢウイルス、インフルエンザＣウイルス及びイサウイルス並びにトゴトウイルスは、ハンタウイルス、ナイロウイルス、オルトブニヤウイルス、フレボウイルス及びトスポウイルスを含むブニヤウイルス（Bunyaviridae）科と同様にマイナス鎖ＲＮＡウイルスである、オルトミクソウイルス（Orthomyxoviridae）科に属する。それらのゲノムは分節され、（ｉ）一本鎖ビリオンＲＮＡ（ｖＲＮＡ）のウイルスｍＲＮＡへの初期コピーと、（ｉｉ）ｖＲＮＡ複製とを実施するＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを含むリボ核タンパク質粒子となる。ウイルスｍＲＮＡの生成のために、ポリメラーゼは、いわゆる「キャップ・スナッチング」機構を使用する（非特許文献５、非特許文献６、非特許文献７、非特許文献８）。ポリメラーゼは、ＰＢ１（ポリメラーゼ塩基性タンパク質）、ＰＢ２及びＰＡの３つのサブユニットから構成される。キャップ・スナッチング機構に関して、ウイルスポリメラーゼはそのＰＢ２サブユニットを介して、ポリメラーゼのヌクレオチド鎖切断活性によりヌクレオチド１０〜１３で切断される細胞ｍＲＮＡ分子の５’ＲＮＡキャップと結合する。キャップＲＮＡ断片は、ＰＢ１サブユニットにおけるヌクレオチジルトランスフェラーゼ中心によるウイルスｍＲＮＡの合成のためのプライマーとして機能する（非特許文献９）。最終的に、ウイルスｍＲＮＡは、鋳型の５’末端のオリゴＵモチーフにおけるポリメラーゼのスタッタリング（stuttering）により、３’末端をポリアデニル化される。近年の研究により、キャップ結合に関与するＰＢ２の構造ドメインが正確に規定された（非特許文献１０、非特許文献１１）。ポリメラーゼのヌクレオチド鎖切断活性は現在まで、ＰＢ１サブユニットに存在すると考えられていた（非特許文献９、上記）。
ポリメラーゼ複合体は、ウイルスｍＲＮＡの合成とウイルス複製とに必須であり、また宿主細胞タンパク質中に見出されるものと顕著に異なる可能性がある幾つかの機能的活性部位を含有するので、適当な抗ウイルス薬の標的であると考えられる（非特許文献２、上記）。したがって例えば、ＰＢ１内のＰＡ結合ドメインと類似するアミノ酸数２５のペプチドにより、ポリメラーゼサブユニットの集合化を妨げることが試みられている（非特許文献１２）。また、２’−デオキシ−２’−フルオログアノシン等のヌクレオシド類似体によりウイルス転写を妨げることが試みられており（非特許文献１３）、置換ピラジン化合物であるＴ−７０５が、インフルエンザウイルスＲＮＡポリメラーゼの特異的阻害剤として機能し得ることが示されている（非特許文献４、上記）。さらに、ポリメラーゼのエンドヌクレアーゼ活性が標的とされており、一連の４−置換２，４−ジオキソブタン酸化合物が、インフルエンザウイルスにおけるこの活性の選択的阻害剤として同定されている（非特許文献１４）。加えて、真菌の種であるデリツチア・コンファータスポラ（Delitschiaconfertaspora）の抽出物中で同定されたフルチミド（flutimide）（置換２，６−ジケトピペラジン）が、インフルエンザウイルスのエンドヌクレアーゼを阻害することが示されている（非特許文献１５）。しかしながら、ウイルスポリメラーゼのヌクレオチド鎖切断活性に対する化合物の阻害作用は、現在まで、ポリメラーゼの三量体複合体全体との関連でしか研究されていない。
ポリメラーゼのＰＡサブユニットは、キャップ結合及びエンドヌクレアーゼ活性の両方、ｖＲＮＡ複製、並びに議論の余地があるもののプロテアーゼ活性に関与するが、機能的には特徴付けが最も不十分である。ＰＡ（インフルエンザＡウイルスポリメラーゼ中における７１６残基）は、トリプシン処理により残基２１３で分離可能である。近年決定されたＰＢ１のＮ末端ペプチドと結合したＰＡのＣ末端側の３分の２の結晶構造により、ＰＡサブユニットの大部分（ただしその機能は依然として不明なままである）、及び重要なサブユニット間相互作用のうちの１つの正確な性質の両方に関する最初の構造上の洞察がもたらされた（非特許文献１６、非特許文献１７）。ＰＡアミノ末端ドメインにおける保存残基の系統的突然変異により、ポリメラーゼ複合体のタンパク質の安定性、プロモーター結合、キャップ結合、及びエンドヌクレアーゼ活性に重要な残基が特定された（非特許文献１８）。未変化の（intact）ウイルスリボ核タンパク質粒子（ＲＮＰ）との関連内におけるエンドヌクレアーゼの酵素学が広範に研究されている。
近年、当該技術分野の一般的見解に反して、ヌクレオチド鎖切断活性が、インフルエンザＡ Ｈ３Ｎ２ウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのＰＡサブユニット内のみに存在することが見出された（非特許文献１９）。
ここで本発明者らは、Ｘ線結晶学によってインフルエンザＡ２００９パンデミックＨ１Ｎ１ウイルスのＰＡドメインの構造的特徴付けを達成し、上記ドメイン内のヌクレオチド鎖切断活性中心を同定した。本発明者らは驚くべきことに、上記ウイルスのＰＡサブユニットのポリペプチド断片が容易に結晶化すること、並びに、したがって、上記ポリペプチド断片が、上記ウイルスポリメラーゼのエンドヌクレアーゼ活性を標的とする新たな抗ウイルス化合物の開発を簡略化するため及び過去に同定された化合物を最適化するために、上記ポリペプチド断片との関連でインフルエンザＡ２００９パンデミックＨ１Ｎ１ウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのヌクレオチド鎖切断活性を研究するのに非常に好適であることを見出した。
インフルエンザＡ２００９パンデミックＨ１Ｎ１ウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのヌクレオチド鎖切断活性を有するＰＡポリペプチド断片を組換え技術によって作製するという本発明者らの成果によって、簡単な発現系から容易に取得可能な材料を使用して上記ウイルスポリメラーゼ上の機能部位の阻害剤に関するｉｎ ｖｉｔｒｏのハイスループットスクリーニングを行うことが可能となる。さらに、ヌクレオチド鎖切断性ＰＡ（Ｈ１Ｎ１）ポリペプチド断片及びその内部の酵素活性中心の構造データによって、狙いを定めた阻害剤の設計及び潜在的な治療用化合物に関するｉｎ ｓｉｌｉｃｏでのスクリーニングが可能となる。
本発明者らは更に、阻害剤が結合したインフルエンザＡ２００９パンデミックＨ１Ｎ１ウイルスのＰＡサブユニットのＰＡポリペプチド断片及びその変異体の共結晶化を初めて成し遂げ、それによって、インフルエンザＡ２００９パンデミックＨ１Ｎ１ウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのエンドヌクレアーゼ活性を標的とする新たな抗ウイルス化合物の開発を改善することができることを見出した。特に、共結晶化データによって初めて、インフルエンザＡ２００９パンデミックＨ１Ｎ１ウイルスのＰＡサブユニットのＰＡポリペプチド断片の活性部位に含まれるアミノ酸のうちのどれが化合物の結合に特に関与するかが詳細に示される。この新たな知識によって、その効力を改善するための既存の阻害剤に対する修飾の設計の最適化、又はエンドヌクレアーゼ活性を効果的に遮断する新規な阻害剤の設計及び最適化が可能となる。
von Itzstein etal., 1993, Nature 363:418-423 Magden et al.,2005, Appl. Microbiol.Biotechnol. 66:612-621 Eriksson et al.,1977, Antimicrob. AgentsChemother. 11:946-951 Furuta et al.,2005, Antimicrob. AgentsChemother. 49:981-986 Plotch et al.,1981, Cell 23:847-858 Kukkonen et al.,2005, Arch. Virol. 150:533-556 Leahy et al.,1997, J. Virol. 71:8347-8351 Noah and Krug,2005, Adv. Virus Res. 65:121-145 Li et al., 2001,EMBO J. 20:2078-2086 Fechter et al.,2003, J. Biol. Chem.278:20381-20388 Guilligay etal., 2008 Nat. Struct. Mol. Biol.15:500-506 Ghanem et al.,2007, J. Virol. 81:7801-7804 Tisdale et al.,1995, Antimicrob. AgentsChemother. 39:2454-2458 Tomassini etal., 1994, Antimicrob. AgentsChemother. 38:2827-2837 Tomassini etal., 1996, Antimicrob. AgentsChemother. 40:1189-1193 He et al., 2008,Nature 454:1123-1126 Obayashi et al.,2008, Nature 454:1127-1131 Hara et al.,2006, J. Virol. 80:7789-7798 Dias et al.,2009
（ｉ）Ｘ線結晶学による、ウイルスポリメラーゼ（Ｈ１Ｎ１）のＰＡサブユニットのヌクレオチド鎖切断性アミノ末端ドメインの高分解能構造データ、（ｉｉ）Ｘ線結晶学による、既知の阻害剤とともに共結晶化させたウイルスポリメラーゼ（Ｈ１Ｎ１）のＰＡサブユニットのヌクレオチド鎖切断性アミノ末端ドメインの高分解能構造データ、（ｉｉｉ）好ましくはＨ１Ｎ１のＰＡサブユニット内のヌクレオチド鎖切断活性部位をブロックすることによって、インフルエンザＡ２００９パンデミックＨ１Ｎ１ウイルスのウイルスポリメラーゼのエンドヌクレアーゼ活性を変調させることができ、好ましくはこれを阻害することができる化合物を同定する計算方法、及び好ましくはハイスループット設定における、ｉｎ ｖｉｔｒｏの方法、並びに（ｉｖ）ウイルスｍＲＮＡの合成にキャップ・スナッチング機構を使用するウイルスによって引き起こされる感染性疾患の治療のための、このような化合物を含む薬理学的組成物を提供することが、本発明の目的である。
第１の態様では、本発明は、エンドヌクレアーゼ活性を有するウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのＰＡサブユニットのアミノ末端断片を含むポリペプチド断片であって、上記ＰＡサブユニットが、配列番号２によるインフルエンザＡ２００９パンデミックＨ１Ｎ１ウイルス由来のものであり、又はその変異体であり、上記変異体が、配列番号２によるアミノ酸位置１８６に又はそれに対応するアミノ酸位置にアミノ酸セリンを含む、ポリペプチド断片に関する。
更なる一態様では、本発明は、本発明による単離ポリペプチド断片をコードする単離ポリヌクレオチドに関する。
更なる一態様では、本発明は、本発明による単離ポリヌクレオチドを含む組換えベクターに関する。
更なる一態様では、本発明は、本発明による単離ポリヌクレオチド又は本発明による組換えベクターを含む組換え宿主細胞に関する。
更なる一態様では、本発明は、インフルエンザＡ２００９パンデミックＨ１Ｎ１ウイルス由来のＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのＰＡサブユニット又はその変異体のエンドヌクレアーゼ活性を変調させる化合物を同定する方法であって、
（ａ）（ｉ）図１に示すような本発明によるポリペプチド断片の構造座標、（ｉｉ）図２に示すような本発明によるポリペプチド断片の構造座標、（ｉｉｉ）図３に示すような本発明によるポリペプチド断片の構造座標、（ｉｖ）図４に示すような本発明によるポリペプチド断片の構造座標、（ｖ）図５に示すような本発明によるポリペプチド断片の構造座標、（ｖｉ）図１５に示すような本発明によるポリペプチド断片の構造座標、又は（ｖｉｉ）図１６に示すような本発明によるポリペプチド断片の構造座標によって規定される活性部位のコンピュータモデルを構築する工程と、
（ｂ）有望な変調させる化合物を選択する工程であって、
（ｉ）分子断片を集合化させて上記化合物とすることと、
（ｉｉ）小分子データベースから化合物を選択することと、
（ｉｉｉ）上記化合物の新規リガンド設計と
からなる群から選択される方法によって、有望な変調させる化合物を選択する工程と、
（ｃ）計算手段を利用する工程であって、該活性部位における上記化合物のエネルギーを最小化した立体配置を提供するために、上記化合物と上記活性部位とのコンピュータモデル間のフィッティングプログラム操作を行う、計算手段を利用する工程と、
（ｄ）上記フィッティング操作の結果を評価する工程であって、上記化合物と該活性部位モデルとの間の会合を定量化して、それによって上記活性部位と会合する上記化合物の能力を評価する、結果を評価する工程と
を含む、化合物を同定する方法に関する。
更なる一態様では、本発明は、インフルエンザＡ２００９パンデミックＨ１Ｎ１ウイルス由来のＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのＰＡサブユニット又はその変異体のエンドヌクレアーゼ活性を変調させる化合物を同定する方法であって、
（ｉ）本発明によるポリペプチド断片若しくはその変異体又は本発明による組換え宿主細胞を試験化合物と接触させる工程と、
（ｉｉ）上記ＰＡサブユニットポリペプチド断片又はその変異体のエンドヌクレアーゼ活性を変調させる上記試験化合物の能力を分析する工程と
を含む、化合物を同定する方法に関する。
更なる一態様では、本発明は、本発明によるＰＡサブユニットポリペプチド断片又はその変異体のエンドヌクレアーゼ活性を変調させることができ、好ましくはこれを阻害することができる化合物に関する。好ましくは、上記化合物は、本発明による（ｉｎ ｖｉｔｒｏの）方法によって同定可能である。
更なる一態様では、本発明は、本発明による化合物又はその薬学的に許容可能な塩と、１つ又は複数の薬学的に許容可能な添加物及び／又は担体とを含む薬学的組成物に関する。好ましくは、上記薬学的組成物が、本発明による（ｉｎ ｖｉｔｒｏの）方法によって製造可能である。
更なる一態様では、本発明は、配列番号２によるインフルエンザＡ２００９パンデミックＨ１Ｎ１ウイルスのＰＡサブユニット又はその変異体の活性部位を対象とする抗体であって、上記変異体が、配列番号２によるアミノ酸位置１８６に又はそれに対応するアミノ酸位置にアミノ酸セリンを含む、配列番号２によるインフルエンザＡ２００９パンデミックＨ１Ｎ１ウイルスのＰＡサブユニット又はその変異体の活性部位を対象とする抗体に関する。
更なる一態様では、本発明は、オルトミクソウイルス科、ブニヤウイルス科及び／又はアレナウイルス科のウイルスによるウイルス感染によって引き起こされ、好ましくはインフルエンザＡ２００９パンデミックＨ１Ｎ１ウイルスによるウイルス感染によって引き起こされる疾患状態を治療、改善又は予防する薬物の生産のための、本発明による化合物、本発明による薬学的組成物、又は本発明による抗体の使用に関する。
更なる一態様では、本発明は、インフルエンザＡ２００９パンデミックＨ１Ｎ１ウイルスによるウイルス感染によって引き起こされる疾患状態を治療、改善又は予防する薬物の生産のための、４−［３−［（４−クロロフェニル）メチル］−１−（フェニルメチル）−３−ピペリジニル］−２−ヒドロキシ−４−オキソ−２−ブテン酸（ＥＭＢＬ−Ｒ０５−３）、４−［４−［（４−クロロフェニル）メチル］−１−（シクロヘキシルメチル）−４−ピペリジニル］−２−ヒドロキシ−４−オキソ−２−ブテン酸（ＥＭＢＬ−Ｒ０５−２）、４−［３−［（４−クロロフェニル）メチル］−１−（フェニルメチルスルホ）−３−ピペリジニル］−２−ヒドロキシ−４−オキソ−２−ブテン酸（ＥＭＢＬ−Ｒ０５−１）又は［（２Ｒ，３Ｒ）−５，７−ジヒドロキシ−２−（３，４，５−トリヒドロキシフェニル）クロマン−３−イル］３，４，５−トリヒドロキシベンゾエート（ＥＧＣＧ）の使用に関する。
更なる一態様では、本発明は、オルトミクソウイルス科、ブニヤウイルス科及び／又はアレナウイルス科のウイルスによるウイルス感染によって引き起こされ、好ましくはインフルエンザＡ２００９パンデミックＨ１Ｎ１ウイルスによるウイルス感染によって引き起こされる疾患状態を治療、改善又は予防するための、本発明による化合物、本発明による薬学的組成物、又は本発明による抗体に関する。
更なる一態様では、本発明は、インフルエンザＡ２００９パンデミックＨ１Ｎ１ウイルスによるウイルス感染によって引き起こされる疾患状態を治療、改善又は予防するための、４−［３−［（４−クロロフェニル）メチル］−１−（フェニルメチル）−３−ピペリジニル］−２−ヒドロキシ−４−オキソ−２−ブテン酸（ＥＭＢＬ−Ｒ０５−３）、４−［４−［（４−クロロフェニル）メチル］−１−（シクロヘキシルメチル）−４−ピペリジニル］−２−ヒドロキシ−４−オキソ−２−ブテン酸（ＥＭＢＬ−Ｒ０５−２）、４−［３−［（４−クロロフェニル）メチル］−１−（フェニルメチルスルホ）−３−ピペリジニル］−２−ヒドロキシ−４−オキソ−２−ブテン酸（ＥＭＢＬ−Ｒ０５−１）又は［（２Ｒ，３Ｒ）−５，７−ジヒドロキシ−２−（３，４，５−トリヒドロキシフェニル）クロマン−３−イル］３，４，５−トリヒドロキシベンゾエート（ＥＧＣＧ）に関する。
本発明を以下で詳細に説明する前に、本明細書中で説明する特定の方法論、プロトコル及び試薬は変動し得るので、本発明はこれらに限定されないと理解すべきである。本明細書中で使用される専門用語は、特定の実施の形態を説明するためのものにすぎず、添付した特許請求の範囲のみによって限定される本発明の範囲を限定することは意図されないことも理解すべきである。他に規定のない限り、本明細書中で使用される全ての技術用語及び科学用語は、当業者により一般的に理解されるのと同じ意味を有する。
以下では、本発明の要素を記載する。これらの要素を特定の実施の形態とともに列挙するが、任意の様式及び任意の数でこれらを組み合わせて、更なる実施の形態を作り出すことができることを理解すべきである。様々に記載される実施例及び好ましい実施の形態を、明示的に記載される実施の形態にのみ本発明を限定するものと解釈すべきではない。この記載を、明示的に記載される実施の形態を任意の数の開示される及び／又は好ましい要素と組み合わせた実施の形態を支持及び包含するものと理解すべきである。さらに、本出願において記載される全ての要素の任意の置換及び組合せが、文脈上他に示されぬ限り、本出願の記載により開示されるものと考えるべきである。例えば、好ましい実施の形態では本発明のポリペプチド断片が配列番号２に示すアミノ酸配列のアミノ酸１〜１９８に対応し、別の好ましい実施の形態では本発明によるＰＡポリペプチド断片を、好ましくはＴＥＶプロテアーゼを使用して、好ましくはＰＡポリペプチド断片から切断可能であるペプチドタグによりタグ付けすることができる場合、配列番号２に示すアミノ酸配列のアミノ酸１〜１９８に対応するポリペプチド断片をＴＥＶプロテアーゼを使用してＰＡポリペプチドから切断可能であるペプチドタグによりタグ付けすることは、本発明の好ましい実施の形態である。
好ましくは、本明細書中で使用される用語は、"A multilingual glossary ofbiotechnological terms: (IUPACRecommendations)", H.G.W. Leuenberger, B.Nagel and H. Koelbl, Eds., HelveticaChimica Acta, CH-4010 Basel, Switzerland,(1995)に記載されているように規定される。
本発明を実施するために、特に明示のない限り、当該技術分野の文献（例えばMolecular Cloning:A Laboratory Manual, 2nd Edition, J.Sambrook et al. eds., ColdSpring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor1989を参照されたい）において説明される、従来の化学、生化学の方法及び組換えＤＮＡ技法を利用する。
以下の本明細書及び添付の特許請求の範囲を通じて、文脈上他に必要な場合以外は、「を含む（comprise）」という単語及びその変化形（variations such as"comprises" and "comprising"）は、記載された整数若しくは工程又は整数若しくは工程の群を包含することを示唆するが、任意の他の整数若しくは工程又は整数若しくは工程の群を除外することを示唆しないと理解される。本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用されるように、数量を特定していない単数形（singular forms "a", "an", and "the"）は、その内容（content）が明らかに他の指示を与えるものでない限り、複数の指示対象を含む。
複数の文献が、本明細書の文章を通じて引用される。本明細書中で引用される文献（全ての特許、特許出願、科学的刊行物、製造業者の仕様書、取扱説明書等を含む）の各々が、上記のものであるか又は下記のものであるかに関わらず、その全体が参照により本明細書に援用される。本明細書のどの記載も、本発明が従来の発明に基づくこのような開示に先行する権利を有しないことを認めるものと解釈されないものとする。
定義
「ポリペプチド断片」という用語は、単一のアミノ酸鎖から構成されるタンパク質の一部分を表す。「タンパク質」という用語は、二次構造及び三次構造を回復するポリペプチド断片を含み、複数のアミノ酸鎖、すなわち複数のサブユニットから構成され、四次（quartenary）構造を形成するタンパク質を更に表す。「ペプチド」という用語は、二次構造又は三次構造を必ずしもとらない最大５０個のアミノ酸の短いアミノ酸鎖を表す。「ペプトイド」は、Ｎ−置換グリシンのオリゴマー集合化から得られるペプチド模倣物質である。
２つ以上のポリペプチドにおける残基は、その残基がポリペプチド構造における類似の位置を占有する場合、互いに「対応する」と言う。当該技術分野では既知であるように、２つ以上のポリペプチドにおける類似の位置は、アミノ酸配列又は構造的類似性に基づきポリペプチド配列を整列させることにより決定することができる。このようなアライメントツールは当業者に既知であり、例えば、ワールドワイドウェブ、例えば標準的な設定（好ましくはＡｌｉｇｎに関してはＥＭＢＯＳＳ：：ｎｅｅｄｌｅ、Ｍａｔｒｉｘ：Ｂｌｏｓｕｍ６２、Ｇａｐ Ｏｐｅｎ １０．０、Ｇａｐ Ｅｘｔｅｎｄ ０．５）を使用するＣｌｕｓｔａｌＷ（www.ebi.ac.uk/clustalw）又はＡｌｉｇｎ（http://www.ebi.ac.uk/emboss/align/index.html）において、得ることができる。当業者は、満足なアライメントを生成するためにいずれかの配列にギャップを導入することが必要な場合があることを理解する。２つ以上のＰＡサブユニットにおける残基が最良の配列アライメントにおいて整列する場合、それらの残基が「対応する」と言う。２つのポリペプチドの間の「最良の配列アライメント」は、整列する同一残基の数が最大となるアライメントと定義される。２つの整列させた配列の間の配列類似性、好ましくは配列同一性が、１０個、２０個又は３０個のアミノ酸の長さにわたり３０％未満、好ましくは２０％未満、より好ましくは１０％未満に低下した場合には、「最良の配列アライメントの領域」は途切れ、それにより類似性スコアの決定のための比較配列の長さの境界及び範囲（metes and bounds）が決定する。
本発明は、エンドヌクレアーゼ活性を有する、インフルエンザＡ２００９パンデミックＨ１Ｎ１ウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼＰＡサブユニット断片に関する。「ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼＰＡサブユニット」という用語は、配列番号２に示されたアミノ酸配列を有する、インフルエンザＡ２００９パンデミックＨ１Ｎ１ウイルスのＰＡサブユニットを表す。「ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼＰＡサブユニットの変異体」という用語は、配列番号２によるアミノ酸位置１８６に、又はそれに対応するアミノ酸位置にアミノ酸セリンを含み、好ましくは配列番号２に記載のアミノ酸配列と、最良の配列アライメントを使用する断片の全長にわたり、及び／又は最良の配列アライメントの領域にわたり（ここで最良の配列アライメントは、例えば、標準的な設定、好ましくはＥＭＢＯＳＳ：：ｎｅｅｄｌｅ、Ｍａｔｒｉｘ：Ｂｌｏｓｕｍ６２、Ｇａｐ Ｏｐｅｎ １０．０、Ｇａｐ Ｅｘｔｅｎｄ ０．５を使用するＡｌｉｇｎのような当該技術分野で既知のツールを用いて取得可能である）、少なくとも６０％、６５％、７０％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列類似性、好ましくは配列同一性を有する。ＰＡサブユニット変異体を配列番号２によるＰＡサブユニットと整列させる場合、そのアライメントが２つのポリペプチドの全長にわたること、したがってアライメントスコアがこれに基づき決定されることが好ましい。しかし、ＰＡサブユニット変異体が、例えばＮ末端又はＣ末端の融合を通じて、Ｃ末端／Ｎ末端の又は内部の欠失又は付加を含み得る可能性がある。この場合には、類似性及び同一性のそれぞれの評価のために、最も良く整列した領域のみが使用される。好ましくは、これらの変異体由来の断片は、好ましくはエンドヌクレアーゼ活性に必要とされる領域内において、それぞれ表示した類似性及び同一性を示す。したがって、配列番号２とＰＡサブユニット変異体との間の任意のアライメントが、好ましくはエンドヌクレアーゼ活性部位を含むものとする。したがって、配列番号２との上記の配列類似性及び同一性が、好ましくはエンドヌクレアーゼ活性部位を含む、少なくとも８０個、９０個、１００個、１１０個、１２０個、１３０個、１４０個、１５０個、１６０個、１６５個、１７０個、１８０個、１９０個、２００個、２１０個、２２０個、２３０個、２４０個、２５０個、３００個又はそれ以上のアミノ酸の長さにわたり生じる。
したがって、本発明のポリペプチド断片は、上で規定されるようなインフルエンザＡ２００９パンデミックＨ１Ｎ１ウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼＰＡサブユニット又はその変異体に基づくものである。したがって以下の明細書においては、「ポリペプチド断片（複数も可）」及び「ＰＡポリペプチド断片（複数も可）」という用語は常に、エンドヌクレアーゼ活性を有する、配列番号２に記載されるようなＰＡタンパク質由来の断片、及び上で記載されるようなそのＰＡタンパク質変異体由来の断片の両方を含む。
しかし、本明細書は、インフルエンザＡ２００９パンデミックＨ１Ｎ１ウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼＰＡサブユニット変異体に由来する、エンドヌクレアーゼ活性を有するＰＡポリペプチド断片又はＰＡ断片を具体的に表すために、「ＰＡポリペプチド断片変異体」又は「ＰＡ断片変異体」という用語も使用する。したがって本発明のＰＡポリペプチド断片は、好ましくは自然発生的なインフルエンザＡ２００９パンデミックＨ１Ｎ１ウイルスＰＡサブユニットを含むか、これから本質的になるか、又はこれからなる。しかし、ＰＡポリペプチド断片変異体が配列番号２によるアミノ酸位置１８６に、又はそれに対応するアミノ酸位置にアミノ酸セリンを含み、好ましくは１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個又はそれ以上のアミノ酸位置でのアミノ酸置換を含有し、かつ／又は配列番号２に示したアミノ酸配列と、最良の配列アライメントを使用する断片の全長にわたり、及び／若しくは最良の配列アライメントの領域にわたり（ここで最良の配列アライメントは、例えば、標準的な設定、好ましくはＥＭＢＯＳＳ：：ｎｅｅｄｌｅ、Ｍａｔｒｉｘ：Ｂｌｏｓｕｍ６２、Ｇａｐ Ｏｐｅｎ １０．０、Ｇａｐ Ｅｘｔｅｎｄ ０．５を使用するＡｌｉｇｎのような当該技術分野で既知のツールを用いて取得可能である）、少なくとも６０％、６５％、７０％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列類似性、好ましくは配列同一性を有することも想定される。本発明のＰＡ断片が、ＰＡ由来でない付加的なアミノ酸（例えばタグ、酵素等）を含むことがあり、このような付加的なアミノ酸はこのようなアライメントにおいては考慮されない（すなわち、アライメントスコアの算出から除外される）ことが理解される。好ましい実施の形態では、上で示したアライメントスコアは、少なくとも７０個、８０個、９０個、１００個、１１０個、１２０個、１３０個、１４０個、１５０個、１６０個、１６５個、１７０個、１８０個又は１９０個のアミノ酸の長さにわたり、断片の配列を配列番号２（ここで配列番号２の配列は、エンドヌクレアーゼ活性部位を含むことが好ましい）と整列させると得られる。
好ましい実施の形態では、ＰＡポリペプチド断片変異体は、配列番号２によるインフルエンザＡ２００９パンデミックＨ１Ｎ１ウイルスＰＡサブユニットのアミノ酸残基１〜１９０に対応するアミノ酸残基を少なくとも含むか、又は配列番号２によるインフルエンザＡ２００９パンデミックＨ１Ｎ１ウイルスＰＡサブユニットのアミノ酸残基１〜１９０からなり、かつ配列番号２に示したアミノ酸配列のアミノ酸残基１〜１９０と、最良の配列アライメントを使用する断片の全長にわたり、及び／又は最良の配列アライメントの領域にわたり（ここで最良の配列アライメントは、例えば、標準的な設定、好ましくはＥＭＢＯＳＳ：：ｎｅｅｄｌｅ、Ｍａｔｒｉｘ：Ｂｌｏｓｕｍ６２、Ｇａｐ Ｏｐｅｎ １０．０、Ｇａｐ Ｅｘｔｅｎｄ ０．５を使用するＡｌｉｇｎのような当該技術分野で既知のツールを用いて取得可能である）、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列類似性、好ましくは配列同一性を有する。より好ましくはＰＡポリペプチド断片変異体は、配列番号２によるインフルエンザＡ２００９パンデミックＨ１Ｎ１ウイルスＰＡサブユニットのアミノ酸残基１〜１９８に対応するアミノ酸残基を少なくとも含むか、又は配列番号２によるインフルエンザＡ２００９パンデミックＨ１Ｎ１ウイルスＰＡサブユニットのアミノ酸残基１〜１９８からなり、かつ配列番号２に示したアミノ酸配列のアミノ酸残基１〜１９８と、最良の配列アライメントを使用する断片の全長にわたり、及び／又は最良の配列アライメントの領域にわたり（ここで最良の配列アライメントは、例えば、標準的な設定、好ましくはＥＭＢＯＳＳ：：ｎｅｅｄｌｅ、Ｍａｔｒｉｘ：Ｂｌｏｓｕｍ６２、Ｇａｐ Ｏｐｅｎ １０．０、Ｇａｐ Ｅｘｔｅｎｄ ０．５を使用するＡｌｉｇｎのような当該技術分野で既知のツールを用いて取得可能である）、少なくとも７０％、より好ましくは７５％、より好ましくは８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列類似性、好ましくは配列同一性を有する。好ましくはＰＡポリペプチド断片変異体は、配列番号２によるインフルエンザＡ２００９パンデミックＨ１Ｎ１ウイルスＰＡサブユニットのアミノ酸残基１〜２００に対応するアミノ酸残基を少なくとも含むか、又は配列番号２によるインフルエンザＡ２００９パンデミックＨ１Ｎ１ウイルスＰＡサブユニットのアミノ酸残基１〜２００からなり、かつ配列番号２に示したアミノ酸配列のアミノ酸残基１〜２００と、最良の配列アライメントを使用する断片の全長にわたり、及び／又は最良の配列アライメントの領域にわたり（ここで最良の配列アライメントは、例えば、標準的な設定、好ましくはＥＭＢＯＳＳ：：ｎｅｅｄｌｅ、Ｍａｔｒｉｘ：Ｂｌｏｓｕｍ６２、Ｇａｐ Ｏｐｅｎ １０．０、Ｇａｐ Ｅｘｔｅｎｄ ０．５を使用するＡｌｉｇｎのような当該技術分野で既知のツールを用いて取得可能である）、少なくとも６０％、より好ましくは６５％、より好ましくは７０％、より好ましくは７５％、より好ましくは８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列類似性、好ましくは配列同一性を有する。上述の好ましいＰＡポリペプチド断片は全て、配列番号２によるアミノ酸位置１８６に、又はそれに対応するアミノ酸位置にアミノ酸セリンを含むことに留意するものとする。
本発明との関連では、「ＰＡ−Ｎｔｅｒ」という用語は、配列番号２に示すようなアミノ酸配列のアミノ酸残基１〜１９８（ＰＡ（Ｈ１Ｎ１）１〜１９８）及び任意に更なるアミノ末端リンカー、すなわちＭＧＳＧＭＡ（配列番号３）からなるポリペプチド断片を表す。本発明との関連では、「ＰＡ−Ｎｔｅｒ突然変異体」という用語は、アミノ酸５２〜６４がアミノ酸グリシンによって置き換えられた配列番号２に示すようなアミノ酸配列のアミノ酸残基１〜１９８（ＰＡ（Ｈ１Ｎ１）１〜１９８ Δ５２〜６４：Ｇｌｙ）、及び任意に更なるアミノ末端リンカー、すなわちＭＧＳＧＭＡ（配列番号３）からなるポリペプチド断片（変異体）を表す。
「配列類似性」という用語は、最良の配列アライメントの同じ位置でのアミノ酸が同一又は類似である、好ましくは同一であることを意味する。「類似のアミノ酸」は、類似の特性、例えば極性、溶解性、親水性、疎水性、電荷又はサイズを有する。類似のアミノ酸は好ましくは、ロイシン、イソロイシン及びバリン；フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシン；リジン、アルギニン及びヒスチジン；グルタミン酸及びアスパラギン酸；グリシン、アラニン及びセリン；トレオニン、アスパラギン、グルタミン及びメチオニンである。当業者は、例えばワールドワイドウェブ（例えばwww.ebi.ac.uk/Tools/similarity.html）上で利用可能な、配列類似性検索ツールを十分に認識している。
「可溶性の（soluble）」という用語は、本明細書中で使用する場合、有効濃度のグアニジン又は尿素等の変性剤の非存在下における、例えば０．１４Ｍ塩化ナトリウム又はスクロースのような生理学的等張条件下、少なくとも２００μｇ／ｍｌ、好ましくは少なくとも５００μｇ／ｍｌ、好ましくは少なくとも１ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは少なくとも２ｍｇ／ｍｌ、更により好ましくは少なくとも３ｍｇ／ｍｌ、更により好ましくは少なくとも４ｍｇ／ｍｌ、最も好ましくは少なくとも５ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度の水性緩衝液中で１０００００×ｇでの３０分間の遠心分離後にポリペプチド断片が上清中に残存する状態を表す。その溶解性に関して試験されるタンパク質断片は、以下で示される細胞発現系の１つにおいて発現されることが好ましい。
ポリペプチドに関して「精製（purified）」という用語は、均質調製物のように絶対的に純粋であることを要求せず、むしろそのポリペプチドが自然環境中の状態よりも相対的に純度が高いことを表す。概して、精製したポリペプチドは、好ましくは機能的に顕著なレベルで、例えば少なくとも８５％の純度、より好ましくは少なくとも９０％又は９５％の純度、最も好ましくは少なくとも９９％の純度で、該ポリペプチドが自然状態で会合する他のタンパク質、脂質、炭水化物又は他の材料を実質的に有しない。「結晶化に好適な程度まで精製されている」という表現は、純度が８５％〜１００％、好ましくは９０％〜１００％、より好ましくは９５％〜１００％又は９８％〜１００％であり、沈殿することなく３ｍｇ／ｍｌ超、好ましくは１０ｍｇ／ｍｌ超、より好ましくは１８ｍｇ／ｍｌ超まで濃縮され得るタンパク質を表す。当業者は、タンパク質精製のための標準的な技法を使用して、ポリペプチドを精製することができる。実質的に純粋なポリペプチドは、非還元ポリアクリルアミドゲル上に単一の主バンドを生じる。
本発明の方法で化合物を同定する文脈において使用されるところの「会合する（associate）」という用語は、或る分子部分（moiety）（すなわち、化学的物質若しくは化合物又はその一部分（portions）若しくはその断片）とＰＡサブユニットのエンドヌクレアーゼ活性部位との間の近接状態を表す。会合は、非共有結合的であり得る（すなわち、例えば水素結合性相互作用、ファンデルワールス相互作用、静電的相互作用又は疎水的相互作用により、近接位置（juxtaposition）がエネルギー的に有利である場合には）か、又は共有結合的であり得る。
「エンドヌクレアーゼ活性」又は「ヌクレオチド鎖切断活性」という用語は、ポリヌクレオチド鎖内におけるホスホジエステル結合の切断をもたらす酵素活性を表す。本発明との関連では、ポリペプチド断片は、（好ましくはポリヌクレオチドの種類に関して選択的でない）ヌクレオチド鎖切断活性を有し、すなわち本発明によるポリペプチド断片は、好ましくはＤＮＡ及びＲＮＡに対する、好ましくは一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）又は一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）に対するヌクレオチド鎖切断活性を示す。この関連で、「一本鎖」は、ポリヌクレオチド鎖内における好ましくは少なくとも３ヌクレオチド、好ましくは少なくとも５ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも１０ヌクレオチドのストレッチが一本鎖である、すなわち別のヌクレオチドと塩基対を形成していないことを意味する。好ましくは、本発明によるポリペプチド断片のヌクレオチド鎖切断活性は、認識部位、すなわち特異的なヌクレオチド配列に依存せず、ポリヌクレオチド鎖の非特異的な切断をもたらす。例えば、当業者は、それぞれのポリペプチド断片の存在下又は非存在下で、例えば３７℃で或る特定の期間、例えば５分間、１０分間、２０分間、４０分間、６０分間又は８０分間、ＲＮＡ基質又はＤＮＡ基質、例えばパンハンドルＲＮＡ又は線状若しくは環状の一本鎖ＤＮＡをインキュベートすることにより、本発明によるポリペプチド断片のヌクレオチド鎖切断活性に関して試験することができ、例えばゲル電気泳動により、ポリヌクレオチドの完全性（integrity）に関して試験することができる。
「ヌクレオチド」という用語は、本明細書中で使用する場合、例えばKornberg and Baker, DNAReplication, 2nd Ed.（Freeman, San Francisco, 1992）において説明されるように、１’位でペントースと連結した、プリン、デアザプリン又はピリミジンヌクレオシド塩基、例えばアデニン、グアニン、シトシン、ウラシル、チミン、デアザアデニン、デアザグアノシンからなる化合物（２’−デオキシ型及び２’−ヒドロキシル型を含む）を表し、例えばScheit, Nucleotide Analogs （John Wiley,N.Y., 1980）により概説される修飾塩基分子部分及び／又は修飾糖分子部分を有する合成ヌクレオシドを更に含むがこれらに限定されない。
「単離ポリヌクレオチド」という用語は、（ｉ）その自然環境から単離した、（ｉｉ）ポリメラーゼ連鎖反応により増幅した、又は（ｉｉｉ）全体的に若しくは部分的に合成したポリヌクレオチドを表し、デオキシリボヌクレオチド塩基又はリボヌクレオチド塩基の一本鎖又は二本鎖のポリマーを意味し、ＤＮＡ分子及びＲＮＡ分子、センス鎖及びアンチセンス鎖の両方を含む。この用語は、ｃＤＮＡ、ｃＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ及び組換えＤＮＡを含む。ポリヌクレオチドは、遺伝子全体又はその一部分からなり得る。
「組換えベクター」という用語は、本明細書中で使用する場合、プラスミドベクター、コスミドベクター、ラムダファージ等のファージベクター、アデノウイルスベクター若しくはバキュロウイルスベクター等のウイルスベクター、又は細菌人工染色体（ＢＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）若しくはＰ１人工染色体（ＰＡＣ）等の人工染色体ベクターを含む当業者に既知の任意のベクターを含む。上記ベクターは、発現ベクター及びクローニングベクターを含む。発現ベクターは、プラスミド及びウイルスベクターを含み、概して、所望のコード配列と、特定の宿主生物（例えば細菌、酵母、植物、昆虫若しくは哺乳動物）又はｉｎ ｖｉｔｒｏ発現系における操作可能に連結したコード配列の発現に必要な適当なＤＮＡ配列とを含有する。クローニングベクターは概して、或る特定の所望のＤＮＡ断片を操作及び増幅するために使用され、所望のＤＮＡ断片の発現に必要とされる機能的配列を欠くことがある。
「組換え宿主細胞」は、本明細書中で使用する場合、対象のポリペプチド断片、すなわち本発明によるインフルエンザＡパンデミックＨ１Ｎ１のＰＡポリペプチド断片又はその変異体をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を表す。このポリヌクレオチドは、（ｉ）それ自体が自由に分散して、（ｉｉ）組換えベクター中に取り込まれて、又は（ｉｉｉ）宿主細胞ゲノム若しくはミトコンドリアＤＮＡ中に組み込まれて、宿主細胞内に見出され得る。組換え細胞は、対象のポリヌクレオチドの発現のために、又は本発明のポリヌクレオチド若しくは組換えベクターの増幅のために、使用することができる。「組換え宿主細胞」という用語は、本発明のポリヌクレオチド又は組換えベクターで形質転換するか、トランスフェクトするか、又は感染させた元の細胞の子孫を含む。組換え宿主細胞は、大腸菌細胞等の細菌細胞、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）若しくはピキア・パストリス（Pichiapastoris）等の酵母細胞、植物細胞、ＳＦ９細胞若しくはＨｉｇｈ Ｆｉｖｅ細胞等の昆虫細胞、又は哺乳動物細胞であり得る。哺乳動物細胞の好ましい例は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、アフリカミドリザル腎臓（ＣＯＳ）細胞、ヒト胚腎臓（ＨＥＫ２９３）細胞、ＨＥＬＡ細胞等である。
本明細書中で使用する場合、「結晶（crystal）」又は「結晶性（crystalline）」という用語は、平面が一定の角度で交差し、構成要素である化学種の規則的な構造（内部構造等）が存在する、構造（三次元固体集合体（aggregate）等）を意味する。「結晶」という用語は、以下のいずれか１つを含み得る：実験的に調製した結晶等の固体の物理的結晶形態、結晶から誘導可能な結晶構造（二次構造要素及び／又は三次構造要素及び／又は四次構造要素を含む）、結晶構造に基づく２Ｄモデル及び／又は３Ｄモデル、その略式表示若しくはその図式表示等のその表示、又はコンピュータ用のそのデータセット。一態様では、結晶はＸ線結晶学技法において使用可能である。ここで、使用する結晶は、Ｘ線ビームへの曝露に耐えることができ、Ｘ線結晶学的構造を解明するのに必要な回折パターンデータを作製するために使用される。結晶は、T. L. Blundell and L. N. Johnson,"ProteinCrystallography", Academic Press, New York（1976）に示される結晶形態の１つにより規定されるパターンで、Ｘ線を回折することができることを特徴とし得る。
「単位格子」という用語は、基本的な立方形状又は平行六面体形状のブロックを表す。結晶の全体積は、このようなブロックの規則的な集合化により構築され得る。各単位格子は、その繰り返しが結晶を構築するパターンの単位の完全な表示を含む。
「空間群」という用語は、結晶の対称要素の配置を表す。空間群の指定においては、大文字は格子形を示し、他の記号は、その外観を変化させることなく非対称単位の内容（contents）に関して実施され得る対称操作を表す。
「構造座標」という用語は、軸の系との関連で１つ又は複数のアミノ酸残基の位置を規定する一組の値を表す。この用語は、分子（単数又は複数）の三次元構造を規定するデータセット（例えばデカルト座標、温度因子及び占有率）を表す。構造座標は、わずかに変更してもよいが、それでもほぼ同一の三次元構造をもたらす。特有の一組の構造座標の尺度は、得られた構造の二乗平均平方根偏差である。３Å、２Å、１．５Å、１．０Å又は０．５Å未満の二乗平均平方根偏差で互いに離れる三次元構造（特に酵素活性中心の三次元構造）をもたらす構造座標は、当業者により非常に類似のものとみなされ得る。
「二乗平均平方根偏差」という用語は、平均からの偏差の二乗の算術平均の平方根を意味する。これは、傾向又は目標（object）からの偏差又は変動を表現する方法である。本発明の目的のために、「二乗平均平方根偏差」は、図１によるＰＡポリペプチド断片ＰＡ−Ｎｔｅｒの構造座標により規定されるような、ＰＡポリペプチド断片又はその中の酵素活性中心の骨格からの、ＰＡポリペプチド断片の変異体又はその中の酵素活性中心の骨格の変動を規定する。
本明細書中で使用する場合、「コンピュータモデルを構築すること」という用語は、原子構造情報及び相互作用モデルに基づく分子の構造及び／又は機能の定量的かつ定性的な分析を含む。「モデリング」という用語は、従来の数値基準の分子動的モデル及びエネルギー最小化モデル、相互作用的コンピュータグラフィックモデル、改変（modified）分子力学モデル、距離幾何学法、並びに他の構造基準制約モデルを含む。
「フィッティングプログラム操作」という用語は、化学的物質を酵素活性中心、結合ポケット、分子若しくは分子複合体又はその一部分と会合させるために、化学的物質、酵素活性中心、結合ポケット、分子若しくは分子複合体又はその一部分の構造座標を利用する操作を表す。これは、化学的物質を酵素活性中心中で位置決め、回転又は平行移動し、酵素活性中心の形状及び静電的相補性を適合させることにより、達成することができる。共有結合的相互作用と、水素結合相互作用、静電的相互作用、疎水的相互作用、ファンデルワールス相互作用等の非共有結合的相互作用と、反発的な電荷−電荷相互作用、双極子−双極子相互作用及び電荷−双極子相互作用等の非相補的な静電的相互作用とが、最適化され得る。代替的に、化学的物質と酵素活性中心との結合の変形エネルギーを最小化することができる。
本明細書中で使用する場合、「試験化合物」という用語は、対象のポリペプチド断片、すなわち本発明のＰＡポリペプチド断片、又はヌクレオチド鎖切断活性（activity）を有するその変異体のヌクレオチド鎖切断活性を阻害するその能力に関して試験される化合物、分子又は複合体を含む作用物質を表す。試験化合物は、ペプチド、ペプトイド、ポリペプチド、タンパク質（抗体を含む）、脂質、金属、ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、ヌクレオシド、核酸、有機小分子若しくは無機小分子、化学的化合物、元素、糖類、同位体、炭水化物、造影剤、リポタンパク質、糖タンパク質、酵素、分析プローブ、ポリアミン並びにその組合せ及び誘導体を含むがこれらに限定されない任意の作用物質であり得る。「小分子」という用語は、５０ダルトン〜約２５００ダルトンの分子量、好ましくは２００ダルトン〜８００ダルトンの範囲の分子量を有する分子を表す。加えて、本発明による試験化合物は、検出可能な標識を任意に含み得る。このような標識は、酵素標識、放射性同位体又は放射性化合物若しくは放射性元素、蛍光化合物又は蛍光金属、化学発光化合物及び生物発光化合物を含むがこれらに限定されない。このような検出可能な標識を試験化合物に結合するために、既知の方法を使用することができる。本発明の試験化合物は、天然生成物、又は混合コンビナトリアル合成の生成物を含有する抽出物等の、物質の複雑な混合物も含み得る。これらも試験することができ、標的ポリペプチド断片のヌクレオチド鎖切断活性を阻害する成分を、その後の工程で混合物から精製することができる。試験化合物は、合成又は天然の化合物のライブラリから誘導するか、又は選択することができる。例えば、合成化合物ライブラリは、Maybridge Chemical Co.（Trevillet,Cornwall,UK）、ChemBridge Corporation（SanDiego, CA）又はAldrich（Milwaukee,WI）から市販されている。天然化合物ライブラリは、例えば、TimTecLLC（Newark, DE）から入手可能である。代替的に、細菌細胞、真菌細胞、植物細胞及び動物細胞並びに組織抽出物の形態の天然化合物のライブラリを使用することができる。さらに、試験化合物を、個々の化合物として、又は混合物としてコンビナトリアルケミストリを使用して、合成的に製造することができる。コンビナトリアルケミストリを使用して作製した化合物のコレクションは、本明細書中でコンビナトリアルライブラリと称される。
本発明との関連では、「ヌクレオチド鎖切断活性を変調させる化合物」は、インフルエンザＡ２００９パンデミックＨ１Ｎ１ウイルス若しくはインフルエンザＡ２００９パンデミックＨ１Ｎ１ウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのＰＡサブユニット又はその変異体のヌクレオチド鎖切断活性を増大又は減少させることができ、好ましくは阻害することができる。好ましくは、このような化合物は、インフルエンザＡ２００９パンデミックＨ１Ｎ１ウイルスＰＡサブユニット又はその変異体のヌクレオチド鎖切断活性に対して特異的であり、他のエンドヌクレアーゼ、特に哺乳動物のエンドヌクレアーゼのヌクレオチド鎖切断活性を変調させず、好ましくは減少させない。
「ヌクレオチド鎖切断活性を減少させる化合物」という用語は、インフルエンザＡ２００９パンデミックＨ１Ｎ１ウイルス又はインフルエンザＡ２００９パンデミックＨ１Ｎ１ウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのＰＡサブユニット又はその変異体のヌクレオチド鎖切断活性を、上記化合物の非存在下における、ただしそれ以外は同じ反応条件、すなわち緩衝剤条件、反応時間及び反応温度による上記サブユニット又はその変異体のヌクレオチド鎖切断活性と比較して５０％、より好ましくは６０％、更により好ましくは７０％、更により好ましくは８０％、更により好ましくは９０％、最も好ましくは１００％減少させる化合物を意味する。
インフルエンザＡ２００９パンデミックＨ１Ｎ１ウイルスのＰＡサブユニット又はその変異体のヌクレオチド鎖切断活性を減少させる化合物が、上記活性を阻害する、すなわち上記活性を、化合物の非存在下における活性と比較して少なくとも９５％、好ましくは１００％減少させることが最も好ましい。インフルエンザＡ２００９パンデミックＨ１Ｎ１ウイルスのＰＡサブユニット又はその変異体のヌクレオチド鎖切断活性を減少させる又は阻害する化合物が、上記ＰＡサブユニット又はその変異体のヌクレオチド鎖切断活性を特異的に減少させる又は阻害するが、他のエンドヌクレアーゼ、例えばＲＮａｓｅ Ｈ又は制限エンドヌクレアーゼのヌクレオチド鎖切断活性を同じ程度までは、好ましくは全く阻害しないことが特に好ましい。例えば、当業者は、緩衝剤条件及び反応条件並びに基質濃度及びエンドヌクレアーゼ濃度を同じものとしながら、以下の試料を設定することができる：（１）基質、例えばパンハンドルＲＮＡ、ヌクレオチド鎖切断活性を有するＰＡ（Ｈ１Ｎ１）ポリペプチド断片又はその変異体、（２）基質、例えばパンハンドルＲＮＡ、ヌクレオチド鎖切断活性を有するＰＡ（Ｈ１Ｎ１）ポリペプチド断片又はその変異体、試験化合物、（３）基質、例えばパンハンドルＲＮＡ、参照エンドヌクレアーゼ、例えばＲＮＡｓｅ Ｈ、（４）基質、例えばパンハンドルＲＮＡ、参照ヌクレオチド、例えばＲＮＡｓｅ Ｈ、試験化合物。試料のインキュベーション後、当業者は、例えばゲル電気泳動により、基質を分析することができる。試料（４）において基質の切断、試料（２）において未変化の基質をもたらす試験化合物が好ましい。
「ハイスループット設定において」という用語は、対象のポリペプチド断片のエンドヌクレアーゼ活性を阻害するその能力に関して試験化合物のライブラリをスクリーニングするために使用される、ハイスループットスクリーニングアッセイ、及び様々な種類の技法を表す。典型的には、ハイスループットアッセイはマルチウェル形式で行われ、無細胞アッセイ及び細胞基準アッセイを含む。
「抗体」という用語は、モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体の両方、すなわち、抗原又はハプテン、すなわちヌクレオチド鎖切断活性を有するインフルエンザＡ２００９パンデミックＨ１Ｎ１のＰＡポリペプチド断片又はそのペプチドを認識することができる任意の免疫グロブリンタンパク質又はその一部分を表す。好ましい実施の形態では、抗体はインフルエンザＡ２００９パンデミックＨ１Ｎ１のＰＡポリペプチド断片又はその変異体内における酵素（ヌクレオチド鎖切断）活性中心に結合することができる。抗体の抗原結合部分は、組換えＤＮＡ技法により、又は無傷抗体の酵素的切断若しくは化学的切断により作製され得る。幾つかの実施の形態では、抗原結合部分は、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｄ断片、Ｆｖ断片、ｄＡｂ断片及び相補性決定領域（ＣＤＲ）断片、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、ヒト化抗体等のキメラ抗体、ダイアボディ（diabodies）、及びポリペプチドとの特異的抗原結合をもたらすのに十分な抗体を少なくとも一部分含有するポリペプチドを含む。
「薬学的に許容可能な塩」という用語は、本発明の方法により同定可能な化合物、又は本発明の化合物の塩を表す。好適な薬学的に許容可能な塩は、例えば、本発明の化合物の溶液を、薬学的に許容可能な酸（例えば塩酸、硫酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酢酸、安息香酸、クエン酸、酒石酸、炭酸又はリン酸）の溶液と混合することにより形成することができる酸付加塩を含む。さらに、化合物が酸性分子部分を保有する場合には、その好適な薬学的に許容可能な塩は、アルカリ金属塩（例えばナトリウム塩又はカリウム塩）；アルカリ土類金属塩（例えばカルシウム塩又はマグネシウム塩）；及び好適な有機リガンド（例えばハロゲン化物イオン、水酸化物イオン、カルボン酸イオン、硫酸イオン、リン酸イオン、硝酸イオン、アルキルスルホン酸イオン及びアリールスルホン酸イオン等の対陰イオンを使用して形成した、アンモニウム陽イオン、四級アンモニウム陽イオン及びアミン陽イオン）で形成される塩を含み得る。薬学的に許容可能な塩の例示的な例は、酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスコルビン酸塩、アスパラギン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、重炭酸塩、重硫酸塩、重酒石酸塩、ホウ酸塩、臭化物塩、酪酸塩、エデト酸カルシウム、カンファー酸塩（camphorate）、カンファースルホン酸塩（camphorsulfonate）、カンシル酸塩、炭酸塩、塩化物塩、クエン酸塩、クラブラン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、二塩酸塩、ドデシル硫酸塩、エデト酸塩、エジシル酸塩、エストール酸塩（estolate）、エシル酸塩（esylate）、エタンスルホン酸塩、ギ酸塩、フマル酸塩、グルセプト酸塩、グルコヘプトン酸塩、グルコン酸塩、グルタミン酸塩、グリセロリン酸塩、グリコリルアルサニル酸塩（glycolylarsanilate）、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、ヘキシルレゾルシン酸塩（hexylresorcinate）、ヒドラバミン（hydrabamine）、臭化水素酸塩、塩酸塩、ヨウ化水素酸塩、２−ヒドロキシ−エタンスルホン酸塩、ヒドロキシナフトエ酸塩、ヨウ化物塩、イソチオン酸塩（isothionate）、乳酸塩、ラクトビオン酸塩、ラウリン酸塩、ラウリル硫酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、マンデル酸塩、メシル酸塩、メタンスルホン酸塩、メチル硫酸塩、ムチン酸塩、２−ナフタレンスルホン酸塩、ナプシル酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、Ｎ−メチルグルカミンアンモニウム塩、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パモ酸塩（エンボン酸塩（embonate））、パルミチン酸塩、パントテン酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３−フェニルプロピオン酸塩、リン酸塩／二リン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、ポリガラクツロン酸塩、プロピオン酸塩、サリチル酸塩、ステアリン酸塩、硫酸塩、塩基性酢酸塩、コハク酸塩、タンニン酸塩、酒石酸塩、テオクル酸塩、トシル酸塩、トリエチオジド（triethiodide）、ウンデカン酸塩、吉草酸塩等を含むがこれらに限定されない（例えば、S. M. Berge et al., "Pharmaceutical Salts", J. Pharm.Sci.66:1-19（1977）を参照されたい）。
本明細書中で使用される場合の「添加物」という用語は、例えば担体、結合剤、滑剤、増粘剤、界面活性剤、保存料、乳化剤、緩衝液、香料又は着色料等の、活性成分ではない、薬学的配合物中の全ての物質を示すことが意図される。
「薬学的に許容可能な担体」という用語は、例えば炭酸マグネシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、糖、ラクトース、ペクチン、デキストリン、デンプン、ゼラチン、トラガカント、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、低融点ワックス、ココアバター等を含む。
詳細な説明
エンドヌクレアーゼの活性は三量体複合体でのみ検出可能であると考えられていたが、本発明者らは驚くべきことに、インフルエンザＡ２００９パンデミックＨ１Ｎ１ウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのＰＡサブユニットのＮ末端由来の独立して折り畳まれた小ドメインが、三量体複合体に対して報告されたエンドヌクレアーゼの機能的特性を示すことを見出した。さらに、本発明者らは、このＰＡポリペプチド断片は組換え手段によって容易に作製することができ、したがってヌクレオチド鎖切断活性及び（and）その変調に関するｉｎ ｖｉｔｒｏでの研究に好適であることを見出した。本発明者らは驚くべきことに、インフルエンザＡ２００９パンデミックＨ１Ｎ１ウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのＰＡサブユニットのＮ末端由来のドメインが容易に結晶化すること、並びに、したがって、上記ドメインが、インフルエンザＡ２００９パンデミックＨ１Ｎ１ポリメラーゼのエンドヌクレアーゼ活性を標的とする新たな抗ウイルス化合物の同定、選択及び設計に、並びにコンピュータ方法によって過去に同定された化合物の最適化に非常に好適である（dedicated）ことを見出した。
エンドヌクレアーゼ活性を有するウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのＰＡサブユニットのアミノ末端断片を含むポリペプチド断片であって、上記ＰＡサブユニットが、配列番号２によるインフルエンザＡ２００９パンデミックＨ１Ｎ１ウイルス由来のものであり、又はその変異体であり、上記変異体が、配列番号２によるアミノ酸位置１８６に又はそれに対応するアミノ酸位置にアミノ酸セリンを含む、ポリペプチド断片を提供することが、本発明の一態様である。
本発明の好ましい実施の形態では、上記変異体は、アミノ酸５２〜６４がアミノ酸グリシンによって置き換えられた配列番号２に示すアミノ酸配列のアミノ酸１〜１９８を含む。本発明の更に好ましい実施の形態では、上記変異体は、アミノ酸５２〜７２がアミノ酸グリシンによって置き換えられた配列番号２に示すアミノ酸配列のアミノ酸１〜１９８を含む。本発明の別の更に好ましい実施の形態では、上記変異体は、アミノ酸５２〜６９がアミノ酸グリシンによって置き換えられた配列番号２に示すアミノ酸配列のアミノ酸１〜１９８を含む。
好ましくは、本発明によるポリペプチド断片は好ましくは水溶液中に可溶性である。本発明のポリペプチド断片の最小の長さは、ポリヌクレオチド鎖、例えばパンハンドルＲＮＡ又は一本鎖ＤＮＡを切断するその能力により決定される、すなわち該ポリペプチドの最小の長さは、そのヌクレオチド鎖切断活性により決定される。好ましくはエンドヌクレアーゼ活性はポリヌクレオチドの種類に依存せず、したがってＤＮＡ及びＲＮＡに対して、好ましくは一本鎖ＤＮＡ及び一本鎖ＲＮＡに対して発揮され得る。好ましくは、エンドヌクレアーゼ活性は、基質となるポリヌクレオチド内の特定の認識部位に依存しない。
好ましい実施の形態では、本発明によるポリペプチド断片は結晶化に好適である、すなわち好ましくはポリペプチド断片は結晶化可能である。好ましくは、本発明によるポリペプチド断片から取得可能な結晶は、Ｘ線結晶学を使用するポリペプチド断片の構造決定に好適である。好ましくは上記結晶は、２５ミクロンの立方体よりも大きく、好ましくは単色Ｘ線に対する曝露により、好ましくは３．５Åの又はより良好な分解能における８５％超の回折データ完全性（completeness）が収集されるほどに放射線に対して十分に安定である。
１つの実施の形態では、ポリペプチド断片は、（ｉ）１０ｍＭ〜３Ｍ、好ましくは１０ｍＭ〜２Ｍ、より好ましくは２０ｍＭ〜１Ｍの範囲の濃度のｐＨ３〜ｐＨ９、好ましくはｐＨ４〜ｐＨ９、より好ましくはｐＨ７〜ｐＨ９の緩衝剤系、例えばＨＥＰＥＳ又はＴｒｉｓ−ＨＣｌにおいて５ｍｇ／ｍｌ〜２０ｍｇ／ｍｌ、例えば５ｍｇ／ｍｌ、５．５ｍｇ／ｍｌ、６ｍｇ／ｍｌ、６．５ｍｇ／ｍｌ、７ｍｇ／ｍｌ、７．５ｍｇ／ｍｌ、８ｍｇ／ｍｌ、８．５ｍｇ／ｍｌ、９ｍｇ／ｍｌ、９．５ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ、１０．５ｍｇ／ｍｌ、１１ｍｇ／ｍｌ、１１．５ｍｇ／ｍｌ、１２ｍｇ／ｍｌ、１２．５ｍｇ／ｍｌ、１３ｍｇ／ｍｌ、１３．５ｍｇ／ｍｌ、１４ｍｇ／ｍｌ、１４．５ｍｇ／ｍｌ、１５ｍｇ／ｍｌ、１５．５ｍｇ／ｍｌ、１６ｍｇ／ｍｌ、１６．５ｍｇ／ｍｌ、１７ｍｇ／ｍｌ、１７．５ｍｇ／ｍｌ、１８ｍｇ／ｍｌ、１８．５ｍｇ／ｍｌ、１９ｍｇ／ｍｌ、１９．５ｍｇ／ｍｌ又は２０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは８ｍｇ／ｍｌ〜１５ｍｇ／ｍｌ、最も好ましくは１０ｍｇ／ｍｌ〜１５ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度を有するタンパク質水溶液、すなわち結晶化溶液、及び（ｉｉ）１つ又は複数の物質、例えばギ酸ナトリウム、硫酸アンモニウム、硫酸リチウム、酢酸マグネシウム、酢酸マンガン、塩化ナトリウム、グリセロール又はエチレングリコールを含む沈殿剤／リザーバ溶液を使用して結晶化可能である。
任意に、タンパク質溶液は、１つ又は複数の塩、例えば一価の塩、例えばＮａＣｌ、ＫＣｌ若しくはＬｉＣｌ、好ましくはＮａＣｌを１０ｍＭ〜１Ｍ、好ましくは２０ｍＭ〜５００ｍＭ、より好ましくは５０ｍＭ〜２００ｍＭの範囲の濃度で、及び／又は二価の塩、例えばＭｎＣｌ２、ＣａＣｌ２、ＭｇＣｌ２、ＺｎＣｌ２若しくはＣｏＣｌ２、好ましくはＭｇＣｌ２及びＭｎＣｌ２を０．１ｍＭ〜５０ｍＭ、好ましくは０．５ｍＭ〜２５ｍＭ、より好ましくは１ｍＭ〜１０ｍＭ又は１ｍＭ〜５ｍＭの範囲の濃度で、含有していてもよい。
好ましくは、沈殿剤／リザーバ溶液は、ギ酸ナトリウム０．５Ｍ〜２Ｍ、好ましくは１Ｍ〜１．８Ｍの範囲の濃度で、好ましくはｐＨ４〜８、より好ましくはｐＨ５〜７の緩衝剤系、例えばＨＥＰＥＳを１０ｍＭ〜１Ｍ、好ましくは５０ｍＭ〜５００ｍＭ、より好ましくは７５ｍＭ〜１５０ｍＭの範囲の濃度で、並びに／又はエチレングリコールを１％〜２０％、好ましくは２％〜８％、より好ましくは２％〜５％の範囲の濃度で、含む。
ＰＡポリペプチド断片又はその変異体の純度は、結晶化溶液中において、好ましくは８５％〜１００％、より好ましくは９０％〜１００％、更により好ましくは９５％〜１００％である。結晶を作製するために、結晶化に好適なタンパク質溶液を、等体積の沈殿剤溶液と混合することができる。
好ましい実施の形態では、結晶化媒体は、１．０Ｍ〜２．０Ｍ ギ酸ナトリウム、８０ｍＭ〜１２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ６．５〜ｐＨ７．５）、並びに２％〜５％ グリコール又はグリセロールを含む同様の体積、好ましくは等体積の沈殿剤溶液と混合した、０．０５μｌ〜２μｌ、好ましくは０．８μｌ〜１．２μｌの結晶化に好適なタンパク質溶液を含む。
別の実施の形態では、沈殿剤溶液は、１．６Ｍ ギ酸ナトリウム、０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）、及び５％ グリコール又はグリセロールを含み、好ましくはこれらから本質的になり、又はこれらからなり、結晶化／タンパク質溶液は、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２．０ｍＭ ＭｎＣｌ２及び２．０ｍＭ ＭｇＣｌ２中における１０ｍｇ／ｍｌ〜１５ｍｇ／ｍｌを含む、好ましくはこれらから本質的になる、又はこれらからなる。
別の実施の形態では、ＰＡポリペプチド断片は、（ｉ）１０ｍＭ〜３Ｍ、好ましくは１０ｍＭ〜２Ｍ、より好ましくは２０ｍＭ〜１Ｍの範囲の濃度のｐＨ３〜ｐＨ９、好ましくはｐＨ４〜ｐＨ９、より好ましくはｐＨ７〜ｐＨ９の緩衝剤系、例えばＨＥＰＥＳ又はＴｒｉｓ−ＨＣｌにおいて５ｍｇ／ｍｌ〜２０ｍｇ／ｍｌ、例えば５ｍｇ／ｍｌ、５．５ｍｇ／ｍｌ、６ｍｇ／ｍｌ、６．５ｍｇ／ｍｌ、７ｍｇ／ｍｌ、７．５ｍｇ／ｍｌ、８ｍｇ／ｍｌ、８．５ｍｇ／ｍｌ、９ｍｇ／ｍｌ、９．５ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ、１０．５ｍｇ／ｍｌ、１１ｍｇ／ｍｌ、１１．５ｍｇ／ｍｌ、１２ｍｇ／ｍｌ、１２．５ｍｇ／ｍｌ、１３ｍｇ／ｍｌ、１３．５ｍｇ／ｍｌ、１４ｍｇ／ｍｌ、１４．５ｍｇ／ｍｌ、１５ｍｇ／ｍｌ、１５．５ｍｇ／ｍｌ、１６ｍｇ／ｍｌ、１６．５ｍｇ／ｍｌ、１７ｍｇ／ｍｌ、１７．５ｍｇ／ｍｌ、１８ｍｇ／ｍｌ、１８．５ｍｇ／ｍｌ、１９ｍｇ／ｍｌ、１９．５ｍｇ／ｍｌ又は２０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは８ｍｇ／ｍｌ〜１５ｍｇ／ｍｌ、最も好ましくは１０ｍｇ／ｍｌ〜１５ｍｇ／ｍｌのＰＡポリペプチド断片の濃度を有するタンパク質水溶液、及び（ｉｉ）１つ又は複数の物質、例えばギ酸ナトリウム、硫酸アンモニウム、硫酸リチウム、酢酸マグネシウム、酢酸マンガン、塩化ナトリウム、エチレングリコール、グリセロール又はＰＥＧを含む沈殿剤／リザーバ溶液を使用して、或る化合物とともに、好ましくはＰＡポリペプチド断片のエンドヌクレアーゼ活性を変調させ、好ましくはこれを阻害する化合物とともに、好ましくは表１又は表２に記載の化合物とともに共結晶化可能である。共結晶化のために、或る化合物、好ましくはＰＡポリペプチド断片のエンドヌクレアーゼ活性を変調させ、例えばこれを阻害する化合物、好ましくは表１又は表２に記載の化合物を、タンパク質水溶液に添加して、０．５ｍＭ〜５ｍＭ、好ましくは１．５ｍＭ〜５ｍＭ、すなわち０．５ｍＭ、１ｍＭ、１．５ｍＭ、２ｍＭ、２．５ｍＭ、３ｍＭ、４．５ｍＭ又は５ｍＭの最終濃度とする。
任意に、タンパク質溶液は、１つ又は複数の塩、例えば一価の塩、例えばＮａＣｌ、ＫＣｌ若しくはＬｉＣｌ、好ましくはＮａＣｌを１０ｍＭ〜１Ｍ、好ましくは２０ｍＭ〜５００ｍＭ、より好ましくは５０ｍＭ〜２００ｍＭの範囲の濃度で、及び／又は二価の塩、例えばＭｎＣｌ２、ＣａＣｌ２、ＭｇＣｌ２、ＺｎＣｌ２若しくはＣｏＣｌ２、好ましくはＭｇＣｌ２及びＭｎＣｌ２を０．１ｍＭ〜５０ｍＭ、好ましくは０．５ｍＭ〜２５ｍＭ、より好ましくは１ｍＭ〜１０ｍＭ又は１ｍＭ〜５ｍＭの範囲の濃度で、含有していてもよい。
好ましくは、沈殿剤／リザーバ溶液は、硫酸アンモニウムを０．１Ｍ〜２．５Ｍ、好ましくは０．１Ｍ〜２．０Ｍの範囲の濃度で、好ましくはｐＨ４〜７、より好ましくはｐＨ５〜６の緩衝剤系、例えばＢｉｓ−Ｔｒｉｓを１０ｍＭ〜１Ｍ、好ましくは５０ｍＭ〜５００ｍＭ、より好ましくは７５ｍＭ〜１５０ｍＭの範囲の濃度で、並びに／又はＰＥＧ、例えばＰＥＧ ３３５０を１％〜３０％、好ましくは１５％〜３０％、より好ましくは２０％〜２５％の範囲の濃度で、含む。
ＰＡポリペプチド断片又はその変異体の純度は、タンパク質溶液中において、好ましくは８５％〜１００％、より好ましくは９０％〜１００％、更により好ましくは９５％〜１００％である。共結晶化のために、ＰＡポリペプチド断片又はその変異体及び化合物を含むタンパク質水溶液を、等体積の沈殿剤溶液と混合することができる。
好ましい実施の形態では、タンパク質溶液は、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２．０ｍＭ ＭｎＣｌ２及び２．０ｍＭ ＭｇＣｌ２中における１０ｍｇ／ｍｌ〜１５ｍｇ／ｍｌのＰＡポリペプチド断片、並びに１．５ｍＭの最終濃度の４−［３−［（４−クロロフェニル）メチル］−１−（フェニルメチル）−３−ピペリジニル］−２−ヒドロキシ−４−オキソ−２−ブテン酸（ＥＭＢＬ−Ｒ０５−３）を含み、好ましくはこれから本質的になり、又はこれからなり、リザーバ溶液／沈殿剤溶液は、２．０Ｍ 硫酸アンモニウム及び０．１Ｍ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ（ｐＨ５．５）を含み、好ましくはこれから本質的になり、又はこれからなる（表１も参照されたい）。
別の好ましい実施の形態では、タンパク質溶液は、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２．０ｍＭ ＭｎＣｌ２及び２．０ｍＭ ＭｇＣｌ２中における１０ｍｇ／ｍｌ〜１５ｍｇ／ｍｌのＰＡポリペプチド断片、並びに、好ましくは最初にリボウリジン一リン酸（ｒＵＭＰ）とともに成長させた結晶中に染み込ませた、１．５ｍＭの最終濃度の４−［４−［（４−クロロフェニル）メチル］−１−（シクロヘキシルメチル）−４−ピペリジニル］−２−ヒドロキシ−４−オキソ−２−ブテン酸（ＥＭＢＬ−Ｒ０５−２）を含み、好ましくはこれから本質的になり、又はこれからなり、リザーバ溶液／沈殿剤溶液は、０．１Ｍ 硫酸アンモニウム、０．１Ｍ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ（ｐＨ５．５）及び２５％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ３３５０を含み、好ましくはこれから本質的になり、又はこれからなる（表１も参照されたい）。
更に好ましい実施の形態では、タンパク質溶液は、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２．０ｍＭ ＭｎＣｌ２及び２．０ｍＭ ＭｇＣｌ２中における１０ｍｇ／ｍｌ〜１５ｍｇ／ｍｌのＰＡポリペプチド断片、並びに５ｍＭの最終濃度のリボウリジン一リン酸（ｒＵＭＰ）を含み、好ましくはこれから本質的になり、又はこれからなり、リザーバ溶液／沈殿剤溶液は、０．１Ｍ 硫酸アンモニウム、０．１Ｍ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ（ｐＨ５．５）及び２５％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ３３５０を含み、好ましくはこれから本質的になり、又はこれからなる（表１も参照されたい）。
例えば４−［３−［（４−クロロフェニル）メチル］−１−（フェニルメチルスルホ）−３−ピペリジニル］−２−ヒドロキシ−４−オキソ−２−ブテン酸（ＥＭＢＬ−Ｒ０５−１）とともに、又は［（２Ｒ，３Ｒ）−５，７−ジヒドロキシ−２−（３，４，５−トリヒドロキシフェニル）クロマン−３−イル］３，４，５−トリヒドロキシベンゾエート（ＥＧＣＧ）とともにＰＡポリペプチド断片又はその変異体を共結晶化させるための他の好ましいリザーバ溶液／沈殿剤溶液を、表１から更に見出すことができる。
結晶を、ハンギング−シッティングドロップ（hanging and sitting drop）法、サンドイッチドロップ法、透析法、及びマイクロバッチ又はマイクロチューブバッチデバイスを含むがこれらに限定されない当業者に既知の任意の方法により成長させることができる。単独での又は化合物との複合体としての本発明のＰＡポリペプチド断片又はその変異体の結晶を作製する他の結晶化条件を特定するために、上で開示された結晶化条件を変更することは、当業者には容易に分かることだろう。このような変更は、ｐＨ、タンパク質濃度及び／若しくは結晶化温度を調整すること、使用する塩及び／若しくは沈殿剤の特性若しくは濃度を変化させること、異なる結晶化方法を使用すること、又は結晶化を助ける添加剤、例えば洗浄剤（例えばＴＷＥＥＮ２０（モノラウレート）、ＬＤＯＡ、Ｂｒｉｊ３０（４ラウリルエーテル））、糖（例えばグルコース、マルトース）、有機化合物（例えばジオキサン、ジメチルホルムアミド）、ランタニドイオン若しくは多価イオン性（poly-ionic）化合物を導入することを含むがこれらに限定されない。ハイスループット結晶化アッセイを使用して結晶化条件の発見又は最適化を支援することもできる。
マイクロシーディング（Microseeding）を使用して、結晶のサイズ及び質を増大させることができる。簡潔に述べると、微結晶を粉砕して、ストック用種溶液を得る。ストック用種溶液を段階希釈する。ニードル、ガラスロッド又は一本の髪の毛（strand of hair）を使用して、各希釈溶液からの小量の試料を、種の非存在下で結晶を作り出すのに必要とされる濃度以下のタンパク質濃度を含有する一組の平衡化した液滴に添加する。目的は、液滴中において結晶成長の核となる働きをする単一の種結晶を最終的に得ることである。
本明細書で記載したような、図１〜図５に示すような構造座標を取得する方法、座標の解釈、及びタンパク質構造を理解する際のその有用性は、当業者により、標準的なテキスト、例えばJ. Drenth, "Principles of protein X-ray crystallography",2ndEd., Springer Advanced Texts in Chemistry, New York (1999)、及びG. E. Schulz and R. H. Schirmer, "Principles ofProteinStructure", Springer Verlag, New York（1985）を参照して、一般的に理解されている。例えば、１００Ｋまで凍結して凍結保護した（例えば、２０％〜３０％グリセロールを用いて）結晶を多くの場合使用して、例えばＸ線源としてシンクロトロン施設におけるビームライン又は回転陽極を使用して、Ｘ線回折データを初めに取得する。その後位相問題を一般的に既知の方法、例えば多波長異常回折（ＭＡＤ）、重原子同形置換（multiple isomorphous replacement）（ＭＩＲ）、単一波長異常回折（ＳＡＤ）又は分子置換（ＭＲ）により解決する。部分構造（sub-structure）を、ＳＨＥＬＸＤ（SchneiderandSheldrick, 2002, Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. (Pt 10 Pt2),1772-1779）を使用して解明し、ＳＨＡＲＰ（Vonrhein et al., 2006,MethodsMol. Biol. 364:215-30）で位相を算出し、溶媒平滑化（solventflattening）及び非結晶学的対称平均化により、例えばＲＥＳＯＬＶＥ（Terwilliger,2000, Acta Cryst. D. Biol. Crystallogr. 56:965-972）により改良することができる。モデル自動構築を例えばＡＲＰ／ｗＡＲＰ（Perrakis et al., 1999, Nat. Struct. Biol. 6:458-63）により、精密化を例えばＲＥＦＭＡＣ（Murshudov, 1997, Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 53: 240-255）により、行うことができる。
好ましくは、本発明によるポリペプチド断片内に含まれるＰＡ断片のアミノ末端は、配列番号２によるインフルエンザＡ２００９パンデミックＨ１Ｎ１ウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのＰＡサブユニット又はその変異体の少なくともアミノ酸１〜１９０、好ましくはアミノ酸１〜１９８、好ましくはアミノ酸１〜２００に対応し、好ましくはこれから本質的になり、又はこれからなる。
好ましい実施の形態では、本発明によるポリペプチド断片は、結晶化に好適な程度まで精製されて、好ましくはその純度は８５％〜１００％、より好ましくは９０％〜１００％、最も好ましくは９５％〜１００％である。別の好ましい実施の形態では、本発明によるポリペプチド断片は、共結晶化に好適な程度まで精製されて、好ましくはその純度は８５％〜１００％、より好ましくは９０％〜１００％、最も好ましくは９５％〜１００％である。
別の実施の形態では、本発明によるポリペプチド断片は、二価の陽イオンと結合することができる。好ましくは、本発明によるポリペプチド断片は、１つ又は複数の二価の陽イオンと結合し、好ましくは２つの二価の陽イオンと結合する。この関連で、二価の陽イオンは好ましくは、マンガン、コバルト、カルシウム、マグネシウム及び亜鉛からなる群から（from）選択され、より好ましくはマンガン又はコバルト、最も好ましくはマンガン及び／又はマグネシウムである。したがって、好ましい実施の形態では、本発明のポリペプチド断片は、（ｉ）２つのマンガン陽イオン、（ｉｉ）２つのマグネシウム陽イオン、又は（ｉｉｉ）１つのマンガン陽イオン及び１つのマグネシウム陽イオンとの複合体として存在する。好ましい実施の形態では、二価の陽イオンに、配列番号２に示すような、アミノ酸Ｇｌｕ８０及びＡｓｐ１０８に対応するアミノ酸（第２の陽イオン）、並びにアミノ酸Ｈｉｓ４１、Ａｓｐ１０８、Ｉｌｅ１２０及びＧｌｕ１１９に対応するアミノ酸（第１の陽イオン）が配位する。好ましい実施の形態では、二価の陽イオンは、部位１に対してマンガン及び部位２に対してマンガン又はマグネシウム、すなわち部位１に対してマンガン及び部位２に対してマグネシウム（図６を参照されたい）、又は部位１に対してマンガン及び部位２に対してマンガン（図７〜図１０、図１７及び図１８を参照されたい）である。
更なる実施の形態では、本発明によるポリペプチド断片は、ポリペプチド断片であって、Ｎ末端が配列番号２によるＰＡサブユニットのアミノ酸配列の１５位以下、例えば１５位、１４位、１３位、１２位、１１位、１０位、９位、８位、７位、６位、５位、４位、３位、２位若しくは１位のアミノ酸と同一であり若しくはこれに対応し、Ｃ末端が配列番号２によるＰＡサブユニットのアミノ酸配列の１８６位〜２００位、例えば１８６位、１８７位、１８８位、１８９位、１９０位、１９１位、１９２位、１９３位、１９４位、１９５位、１９６位、１９７位、１９８位、１９９位若しくは２００位から選択される位置のアミノ酸と同一であり若しくはこれに対応し、好ましくは、Ｃ末端が配列番号２によるＰＡサブユニットのアミノ酸配列の１９０位〜２００位、より好ましくは１９０位〜１９８位から選択される位置のアミノ酸と同一であり若しくはこれに対応する、ポリペプチド断片であり、又はその変異体であり、上記変異体は、配列番号２によるアミノ酸位置１８６に又はそれに対応するアミノ酸位置にアミノ酸セリンを含み、エンドヌクレアーゼ活性を保持する。
本発明の好ましい実施の形態では、上記変異体は、アミノ酸５２〜６４がアミノ酸グリシンによって置き換えられた配列番号２に示すアミノ酸配列のアミノ酸１〜１９８を含む。本発明のより好ましい実施の形態では、上記変異体は、アミノ酸５２〜６４がアミノ酸グリシンによって置き換えられた配列番号２に示すアミノ酸配列のアミノ酸１〜１９８、及び任意にアミノ酸配列ＭＧＳＧＭＡ（配列番号３）を有するアミノ末端リンカーからなる。
本発明の更に好ましい実施の形態では、上記変異体は、アミノ酸５２〜７２がアミノ酸グリシンによって置き換えられた配列番号２に示すアミノ酸配列のアミノ酸１〜１９８を含む。本発明のより好ましい実施の形態では、上記変異体は、アミノ酸５２〜７２がアミノ酸グリシンによって置き換えられた配列番号２に示すアミノ酸配列のアミノ酸１〜１９８、及び任意にアミノ酸配列ＭＧＳＧＭＡ（配列番号３）を有するアミノ末端リンカーからなる。
本発明の別の更に好ましい実施の形態では、上記変異体は、アミノ酸５２〜６９がアミノ酸グリシンによって置き換えられた配列番号２に示すアミノ酸配列のアミノ酸１〜１９８を含む。本発明のより好ましい実施の形態では、上記変異体は、アミノ酸５２〜６９がアミノ酸グリシンによって置き換えられた配列番号２に示すアミノ酸配列のアミノ酸１〜１９８、及び任意にアミノ酸配列ＭＧＳＧＭＡ（配列番号３）を有するアミノ末端リンカーからなる。
好ましくは、上記ポリペプチド断片は、配列番号２に示すアミノ酸配列及びその変異体のアミノ酸５〜１９０、アミノ酸１０〜１９０、アミノ酸１５〜１９０、アミノ酸２０〜１９０、アミノ酸５〜１９８、アミノ酸１０〜１９８、アミノ酸１５〜１９８、アミノ酸２０〜１９８からなるアミノ酸配列の群から選択されるアミノ酸配列を有し、又はこれに対応し、上記変異体は、配列番号２によるアミノ酸位置１８６に又はそれに対応するアミノ酸位置にアミノ酸セリンを含み、エンドヌクレアーゼ活性を保持する。
更なる実施の形態では、本発明によるポリペプチド断片（変異体）は、
（ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列のアミノ酸１〜１９８、及び任意にアミノ酸配列ＭＧＳＧＭＡ（配列番号３）を有するアミノ末端リンカーからなり、（ｉ）図１に示すような構造座標、（ｉｉ）図２に示すような構造座標、（ｉｉｉ）図３に示すような構造座標、（ｉｖ）図４に示すような構造座標、若しくは（ｖ）図５に示すような構造座標によって規定される構造を有し、又は
（ｂ）アミノ酸５２〜６４がアミノ酸グリシンによって置き換えられた配列番号２に示すアミノ酸配列のアミノ酸１〜１９８、及び任意にアミノ酸配列ＭＧＳＧＭＡ（配列番号３）を有するアミノ末端リンカーからなり、（ｖｉ）図１５に示すような構造座標、若しくは（ｖｉｉ）図１６に示すような構造座標によって規定される構造を有する。
本発明による上記ポリペプチド断片が、化合物との共結晶化を伴わない図１に示すような構造座標によって規定される結晶構造（ネイティブの構造）を有することが好ましい。
本発明による上記ポリペプチド断片（変異体）が、或る化合物とともに、好ましくは上記ポリペプチド断片のエンドヌクレアーゼ活性を変調させ、好ましくはこれを阻害する化合物とともに共結晶化した後に、図２〜図５、図１５又は図１６に示すような構造座標によって規定される結晶構造を有することが更に好ましい。
上記ポリペプチド断片（変異体）が、表１又は表２に記載の化合物とともに共結晶化した後に図２〜図５、図１５又は図１６に示すような構造座標によって規定される構造を、すなわち、４−［３−［（４−クロロフェニル）メチル］−１−（フェニルメチル）−３−ピペリジニル］−２−ヒドロキシ−４−オキソ−２−ブテン酸（ＥＭＢＬ−Ｒ０５−３）とともに共結晶化した後に図２及び図３に示すような構造座標によって規定される構造を、４−［４−［（４−クロロフェニル）メチル］−１−（シクロヘキシルメチル）−４−ピペリジニル］−２−ヒドロキシ−４−オキソ−２−ブテン酸（ＥＭＢＬ−Ｒ０５−２）とともに共結晶化した後に図４に示すような構造座標によって規定される構造を、リボウリジン一リン酸（ｒＵＭＰ）とともに共結晶化した後に図５に示すような構造座標によって規定される構造を、４−［３−［（４−クロロフェニル）メチル］−１−（フェニルメチルスルホ）−３−ピペリジニル］−２−ヒドロキシ−４−オキソ−２−ブテン酸（ＥＭＢＬ−Ｒ０５−１）とともに共結晶化した後に図１５に示すような構造座標によって規定される構造を、又は［（２Ｒ，３Ｒ）−５，７−ジヒドロキシ−２−（３，４，５−トリヒドロキシフェニル）クロマン−３−イル］３，４，５−トリヒドロキシベンゾエート（ＥＧＣＧ）とともに共結晶化した後に図１６に示すような構造座標によって規定される構造を、有することが特に好ましい。
上記を考慮して、当業者は、上記ポリペプチド断片（変異体）が、図１、図２〜図５、図１５又は図１６に含まれるそのアミノ酸及び任意にその結合した二価の陽イオンの構造座標のみによって規定される結晶構造を有すること、並びに該結晶構造が、図２〜図５、図１５又は図１６に同様に含まれる共結晶化に使用されるそれぞれの化合物（すなわち、化合物ＥＭＢＬ−Ｒ０５−３は図２及び図３において残基記述子（descriptor）ｃｉ３を有し、化合物ＥＭＢＬ−Ｒ０５−２は図４において残基記述子ｃｉ２を有し、化合物ｒＵＭＰは図５において残基記述子Ｕを有し、化合物ＥＭＢＬ−Ｒ０５−１は図１５において残基記述子ｃｉ１を有し、化合物ＥＧＣＧは図１６において残基記述子ｔｔｅを有する）の構造座標によっては規定されないことを容易に理解するだろう。
図１に示すような構造座標によって規定される構造を有する上記ポリペプチド断片（変異体）が、空間群Ｃ２及びａ＝２６．３６ｎｍ±０．５ｎｍ、ｂ＝６．６２ｎｍ±０．３ｎｍ、ｃ＝６．６３ｎｍ±０．３ｎｍ、α＝９０度、β＝９６度±２度、γ＝９０度の単位格子寸法を有する結晶形態を有し、図２〜図５に示すような構造座標によって規定される構造を有する上記ポリペプチド断片（変異体）が、空間群Ｐ２１２１２１及びａ＝５．４６ｎｍ±０．３ｎｍ、ｂ＝１２．２５ｎｍ±０．４ｎｍ、ｃ＝１３．０ｎｍ±０．３ｎｍ、α＝９０度、β＝９０度、γ＝９０度の単位格子寸法を有する結晶形態を有し、図１５に示すような構造座標によって規定される構造を有する上記ポリペプチド断片（変異体）が、空間群Ｐ６２２２及びａ＝７．５０ｎｍ±０．３ｎｍ、ｂ＝７．５０ｎｍ±０．３ｎｍ、ｃ＝１２．００ｎｍ±０．５ｎｍ、α＝９０度、β＝９０度、γ＝１２０度の単位格子寸法を有する結晶形態を有し、又は図１６に示すような構造座標によって規定される構造を有する上記ポリペプチド断片（変異体）が、空間群Ｐ６４２２及びａ＝９．９９ｎｍ±０．５ｎｍ、ｂ＝９．９９ｎｍ±０．５ｎｍ、ｃ＝８．２７ｎｍ±０．３ｎｍ、α＝９０度、β＝９０度、γ＝１２０度の単位格子寸法を有する結晶形態を有することも好ましい。
好ましくは、ポリペプチド断片（変異体）の結晶は、２．８Å以上、好ましくは２．６Å以上、より好ましくは２．５Å以上、更により好ましくは２．４Å以上、最も好ましくは２．１Å以上、又は１．９Å以上の分解能までＸ線を回折する。例えば、ポリペプチド断片（変異体）の結晶は、１．９Å、２．０Å、２．１Å、２．２Å、２．３Å、２．４Å、２．５Å、２．６Å、２．７Å、２．８Å以上の分解能までＸ線を回折する。
上で言及した本発明による（単離）ＰＡポリペプチド断片及びその変異体をコードする単離ポリヌクレオチドを提供することは、本発明の別の態様である。
本発明の好ましい実施の形態では、該単離ポリヌクレオチドは、配列番号２に示すアミノ酸配列のアミノ酸１〜１９８を含むＰＡポリペプチド断片をコードする。
本発明の別の好ましい実施の形態では、該単離ポリヌクレオチドは、アミノ酸５２〜６４がアミノ酸グリシンによって置き換えられた配列番号２に示すアミノ酸配列のアミノ酸１〜１９８を含むＰＡポリペプチド断片変異体をコードする。
本発明の更に好ましい実施の形態では、該単離ポリヌクレオチドは、アミノ酸５２〜７２がアミノ酸グリシンによって置き換えられた配列番号２に示すアミノ酸配列のアミノ酸１〜１９８を含むＰＡポリペプチド断片変異体をコードする。
本発明の別の更に好ましい実施の形態では、該単離ポリヌクレオチドは、アミノ酸５２〜６９がアミノ酸グリシンによって置き換えられた配列番号２に示すアミノ酸配列のアミノ酸１〜１９８を含むＰＡポリペプチド断片変異体をコードする。
このような単離ヌクレオチド断片を取得するために適用される分子生物学的方法は、概して当業者に既知である（標準的な分子生物学的方法に関しては、Sambrook et al., Eds., "Molecular Cloning: ALaboratoryManual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold SpringHarbor, New York（1989）（これは参照により本明細書に援用される）を参照されたい）。例えば、ＲＮＡを、インフルエンザＡ２００９パンデミックＨ１Ｎ１ウイルスに感染した細胞から単離することができ、ランダムプライマー（例えば、ランダムな六量体若しくは（or）十量体）、又は対象の断片の生成に特異的なプライマーを使用する逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を適用して、ｃＤＮＡを生成することができる。その後対象の断片を、断片特異的プライマーを使用する標準的なＰＣＲにより増幅することができる。
インフルエンザＡ２００９パンデミックＨ１Ｎ１ウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのＰＡサブユニット断片をコードする単離ポリヌクレオチドは、配列番号１由来である。この文脈では、「由来（derived）」は、配列番号１が全長ＰＡポリペプチドをコードし、したがって、好ましいＰＡポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチドが、それぞれコードされるＰＡポリペプチド断片による要求に応じて、ポリヌクレオチドの３’末端及び／又は５’末端に欠失を含み得ることを表す。
別の態様では、本発明は、本発明による単離ポリヌクレオチドを含む組換えベクターに関する。当業者には、対象のポリヌクレオチド配列のベクター中への取り込みに使用される技法は、十分に明らかである（Sambrook et al., 1989（上記）も参照されたい）。このようなベクターは、プラスミドベクター、コスミドベクター、ラムダファージ等のファージベクター、アデノウイルスベクター若しくはバキュロウイルスベクター等のウイルスベクター、又は細菌人工染色体（ＢＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）若しくはＰ１人工染色体（ＰＡＣ）等の人工染色体ベクターを含む、当業者に既知の任意のベクターを含む。上記ベクターは、原核生物発現又は真核生物発現に好適な発現ベクターであり得る。上記プラスミドは、複製開始点（ｏｒｉ）、多重クローニング部位、及びプロモーター（構成的な又は誘導性の）等の調節配列、転写開始部位、リボソーム結合部位、転写終結部位、ポリアデニル化シグナル、及び突然変異又は欠失の相補性に基づく抗生物質耐性マーカー又は栄養要求性マーカー等の選択マーカーを含み得る。１つの実施の形態では、対象のポリヌクレオチド配列は、調節配列と操作可能に連結している。
別の実施の形態では、上記ベクターは、対象のポリペプチド断片の精製を容易にするエピトープタグ、ペプチドタグ又はタンパク質タグをコードするヌクレオチド配列を含む。このようなエピトープタグ、ペプチドタグ又はタンパク質タグは、ヘマグルチニンタグ（ＨＡタグ）、ＦＬＡＧタグ、ｍｙｃタグ、ポリＨｉｓタグ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼタグ（ＧＳＴタグ）、マルトース結合タンパク質タグ（ＭＢＰタグ）、ＮｕｓＡタグ及びチオレドキシンタグ、又は（高感度）緑色蛍光タンパク質（（Ｅ）ＧＦＰ）、（高感度）黄色蛍光タンパク質（（Ｅ）ＹＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）（イソギンチャクモドキ（Discosoma）の種由来の赤色蛍光タンパク質（ＤｓＲｅｄ）、若しくは単量体赤色蛍光タンパク質（ｍＲＦＰ））、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）等の蛍光タンパク質タグ等を含むがこれらに限定されない。好ましい実施の形態では、エピトープタグ、ペプチドタグ又はタンパク質タグを、例えばトロンビン、第Ｘａ因子、ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ、ＴＥＶプロテアーゼ等のようなプロテアーゼを使用して、対象のポリペプチド断片から切断することができる。好ましくは、該タグは、ＴＥＶプロテアーゼを使用して切断する（cleavedoff）ことができる。このようなプロテアーゼに関する認識部位は、当業者に既知である。例えば、ＴＥＶプロテアーゼ認識部位のアミノ酸数７のコンセンサス配列は、Ｇｌｕ−Ｘ−Ｘ−Ｔｙｒ−Ｘ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ／Ｓｅｒ（ここで、Ｘはどのようなアミノ酸でもよい）であり、本発明との関連では、好ましくはＧｌｕ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ（配列番号１２）である。別の実施の形態では、ベクターは、組換え宿主細胞の培養培地中への、又は細菌の細胞膜周辺腔中への、対象のポリペプチド断片の分泌をもたらす機能的配列を含む。シグナル配列断片は、通常、細胞からのタンパク質の分泌を指示する疎水性アミノ酸を含むシグナルペプチドをコードする。タンパク質は、増殖培地中に（グラム陽性細菌）、又は細胞の内膜と外膜との間に位置する細胞膜周辺腔中に（グラム陰性細菌）分泌される。好ましくは、ｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏで切断され、シグナルペプチド断片と外来遺伝子との間にコードされ得るプロセシング部位が存在する。
別の態様では、本発明は、本発明による単離ポリヌクレオチド又は本発明による組換えベクターを含む組換え宿主細胞を提供する。組換え宿主細胞は、古細菌細胞及び細菌細胞等の原核生物細胞、又は酵母細胞、植物細胞、昆虫細胞若しくは哺乳動物細胞等の真核生物細胞であり得る。好ましい実施の形態では、宿主細胞は、大腸菌細胞等の細菌細胞である。当業者には、上記単離ポリヌクレオチド又は上記組換えベクターを上記宿主細胞中に導入する方法は、十分に明らかである。例えば、細菌細胞は、例えば化学的形質転換（例えば塩化カルシウム法）又はエレクトロポレーションを使用して、容易に形質転換することができる。酵母細胞は、例えば、酢酸リチウム形質転換法又はエレクトロポレーションを使用して、形質転換することができる。他の真核生物細胞は、例えば、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）（Invitrogen）等の市販のリポソーム系トランスフェクションキット、Ｆｕｇｅｎｅ（RocheDiagnostics）等の市販の脂質系トランスフェクションキット、ポリエチレングリコール系トランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、遺伝子銃（微粒子銃）、エレクトロポレーション又はウイルス感染を使用して、トランスフェクトすることができる。本発明の好ましい実施の形態では、組換え宿主細胞は、対象のポリヌクレオチド断片を発現する。更により好ましい実施の形態では、上記発現は、本発明の可溶性ポリペプチド断片をもたらす。これらのポリペプチド断片は、上で言及したエピトープタグ、ペプチドタグ又はタンパク質タグを任意に利用して、当業者に既知のタンパク質精製法を使用して、精製することができる。
別の一態様では、本発明は、インフルエンザＡ２００９パンデミックＨ１Ｎ１ウイルス由来のＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのＰＡサブユニット又はその変異体のエンドヌクレアーゼ活性を変調させる化合物を同定する方法であって、
（ａ）（ｉ）図１に示すような本発明によるポリペプチド断片の構造座標、（ｉｉ）図２に示すような本発明によるポリペプチド断片の構造座標、（ｉｉｉ）図３に示すような本発明によるポリペプチド断片の構造座標、（ｉｖ）図４に示すような本発明によるポリペプチド断片の構造座標、（ｖ）図５に示すような本発明によるポリペプチド断片の構造座標、（ｖｉ）図１５に示すような本発明によるポリペプチド断片（変異体）の構造座標、又は（ｖｉｉ）図１６に示すような本発明によるポリペプチド断片（変異体）の構造座標によって規定される活性部位のコンピュータモデルを構築する工程と、
（ｂ）有望な変調させる化合物を選択する工程であって、
（ｉ）分子断片を集合化させて上記化合物とすることと、
（ｉｉ）小分子データベースから化合物を選択することと、
（ｉｉｉ）上記化合物の新規リガンド設計と
からなる群から選択される方法によって、有望な変調させる化合物を選択する工程と、
（ｃ）計算手段を利用する工程であって、該活性部位における上記化合物のエネルギーを最小化した立体配置を提供するために、上記化合物と上記活性部位とのコンピュータモデル間のフィッティングプログラム操作を行う、計算手段を利用する工程と、
（ｄ）上記フィッティング操作の結果を評価する工程であって、上記化合物と該活性部位モデルとの間の会合を定量化して、それによって上記活性部位と会合する上記化合物の能力を評価する、結果を評価する工程と
を含む、化合物を同定する方法に関する。
好ましい実施の形態では、（ｉ）図１に示すような本発明によるポリペプチド断片の構造座標（すなわちアミノ酸構造座標）、及び図１に示すような二価の陽イオンの構造座標、（ｉｉ）図２に示すような本発明によるポリペプチド断片の構造座標（すなわちアミノ酸構造座標）、及び図２に示すような二価の陽イオンの構造座標、（ｉｉｉ）図３に示すような本発明によるポリペプチド断片の構造座標、及び図３に示すような二価の陽イオンの構造座標、（ｉｖ）図４に示すような本発明によるポリペプチド断片の構造座標、及び図４に示すような二価の陽イオンの構造座標、（ｖ）図５に示すような本発明によるポリペプチド断片の構造座標、及び図５に示すような二価の陽イオンの構造座標、（ｖｉ）図１５に示すような本発明によるポリペプチド断片（変異体）の構造座標（すなわちアミノ酸構造座標）、及び図１５に示すような二価の陽イオンの構造座標、並びに／又は（ｖｉｉ）図１６に示すような本発明によるポリペプチド断片（変異体）の構造座標（すなわちアミノ酸構造座標）、及び図１６に示すような二価の陽イオンの構造座標によって規定される活性部位のコンピュータモデルが、本発明の方法の工程ａ）において構築される。
好ましくは、該変調させる化合物は、インフルエンザＡ２００９パンデミックＨ１Ｎ１ウイルス由来のＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのＰＡサブユニット又はその変異体内のヌクレオチド鎖切断活性部位と会合し、好ましくはこれと結合する。該変調させる化合物は、上記ヌクレオチド鎖切断活性を増大又は減少させることができ、好ましくはこれを減少させることができる。
本発明のこの態様の好ましい実施の形態では、インフルエンザＡ２００９パンデミックＨ１Ｎ１ウイルス由来のＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのＰＡサブユニット又はその変異体のエンドヌクレアーゼ活性を変調させる化合物は上記活性を減少させ、より好ましくは上記化合物は上記活性を阻害する。好ましくは、該化合物は、インフルエンザＡ２００９パンデミックＨ１Ｎ１ウイルス由来のＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのＰＡサブユニット又はその変異体のヌクレオチド鎖切断活性を、上記化合物の非存在下における、しかしそれ以外は同じ反応条件、すなわち緩衝剤条件、反応時間及び反応温度による上記ＰＡサブユニット又はその変異体のヌクレオチド鎖切断活性と比較して５０％、より好ましくは６０％、更により好ましくは７０％、更により好ましくは８０％、更により好ましくは９０％、最も好ましくは１００％減少させる。該化合物が、インフルエンザＡ２００９パンデミックＨ１Ｎ１ウイルス由来のＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのＰＡサブユニット又はその変異体のヌクレオチド鎖切断活性を特異的に減少させる又は阻害するが、他のエンドヌクレアーゼ、特に哺乳動物のエンドヌクレアーゼのヌクレオチド鎖切断活性を同じ程度までは減少させず又は阻害せず、好ましくは全く減少させない又は阻害しないことが特に好ましい。
本発明によって、図１による（ネイティブの）ヌクレオチド鎖切断活性部位の構造座標に基づき、インフルエンザＡ２００９パンデミックＨ１Ｎ１ウイルス由来のＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのＰＡサブユニット又はその変異体のヌクレオチド鎖切断活性を変調させる可能性がある化合物を同定、選択又は設計する分子設計技法の使用が可能となる。本発明によって初めて、図２〜図５、図１５又は図１６によるヌクレオチド鎖切断活性部位の構造座標に基づき、インフルエンザＡ２００９パンデミックＨ１Ｎ１ウイルス由来のＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのＰＡサブユニット又はその変異体のヌクレオチド鎖切断活性を変調させる可能性がある化合物の同定、選択及び設計の最適化が更に可能となる。上記構造座標は、変調させる化合物とともに、好ましくは４−［３−［（４−クロロフェニル）メチル］−１−（フェニルメチル）−３−ピペリジニル］−２−ヒドロキシ−４−オキソ−２−ブテン酸（ＥＭＢＬ−Ｒ０５−３）とともに（図２及び図３を参照されたい）、４−［４−［（４−クロロフェニル）メチル］−１−（シクロヘキシルメチル）−４−ピペリジニル］−２−ヒドロキシ−４−オキソ−２−ブテン酸（ＥＭＢＬ−Ｒ０５−２）とともに（図４を参照されたい）、リボウリジン一リン酸（ｒＵＭＰ）とともに（図５を参照されたい）、４−［３−［（４−クロロフェニル）メチル］−１−（フェニルメチルスルホ）−３−ピペリジニル］−２−ヒドロキシ−４−オキソ−２−ブテン酸（ＥＭＢＬ−Ｒ０５−１）とともに（図１５を参照されたい）、又は［（２Ｒ，３Ｒ）−５，７−ジヒドロキシ−２−（３，４，５−トリヒドロキシフェニル）クロマン−３−イル］３，４，５−トリヒドロキシベンゾエート（ＥＧＣＧ）とともに（図１６を参照されたい）共結晶化させた本発明によるポリペプチド断片（ポリペプチド断片変異体）から得られたものである（表１又は表２も参照されたい）。すなわち、本発明者らは驚くべきことに、上記ポリペプチド断片（変異体）が化合物の結合後にその立体配座を変化させるため、化合物が結合していない本発明のポリペプチド断片（変異体）（すなわちネイティブのポリペプチド断片（変異体））の構造座標（例えば、図１を参照されたい）が、化合物が結合した本発明のポリペプチド断片（変異体）の構造座標（例えば、図２〜図５、図１５又は図１６を参照されたい）と異なることを見出した。したがって、この新たな三次元の知識によって、その効力を改善するための既存の阻害剤に対する修飾の設計の最適化、又はエンドヌクレアーゼ活性を効果的に遮断する新規な阻害剤の設計及び最適化が可能となる。
このような予測モデルは、ヌクレオチド鎖切断活性を変調させる可能性を有する多数の多様な化合物の調製及び試験に関連する費用が高いという観点から貴重である。インフルエンザＡ２００９パンデミックＨ１Ｎ１のＰＡポリペプチド断片（変異体）に関して生成した構造座標を使用するために、構造座標を三次元形状に変換することが必要である。これは、一組の構造座標から分子又はその一部分の三次元グラフ表示を生成することができる市販のソフトウェアの使用により達成される。このようなコンピュータプログラムの例は、ＭＯＤＥＬＥＲ（Sali and Blundell, 1993, J. Mol. Biol. 234:779-815、Ｉｎｓｉｇｈｔ ＩＩホモロジーソフトウェアパッケージ（Ｉｎｓｉｇｈｔ ＩＩ（９７．０）、Molecular Simulations Incorporated（SanDiego,CA））中で実行される）である。
当業者は、インフルエンザＡ２００９パンデミックＨ１Ｎ１のＰＡサブユニット又はインフルエンザＡ２００９パンデミックＨ１Ｎ１のＰＡサブユニットのＰＡポリペプチド変異体のヌクレオチド鎖切断活性を変調させるその能力に関して、化学的物質又は断片をスクリーニングする複数の方法を使用することができる。このプロセスは、例えば、図１〜図５、図１５又は図１６による構造座標に基づくＰＡのヌクレオチド鎖切断活性部位の三次元コンピュータモデルの目視検査により、開始し得る。選択した断片又は化学的化合物は、その後様々な方向で位置づけることができ、又は活性部位内にドッキングすることができる。Ｃｅｒｉｕｓ、Ｑｕａｎｔａ及びＳｙｂｙｌ（Tripos Associates（St. Louis, MO））等のソフトウェアを使用してドッキングを達成することができ、その後ＯＰＬＳ−ＡＡ、ＣＨＡＲＭＭ及びＡＭＢＥＲ等の標準的な分子動力学力場を用いてエネルギー最小化及び分子動力学的検討を行う。好適な化合物又は断片を選択するプロセスにおいて当業者を支援することができる更なる特別なコンピュータプログラムは、例えば、（ｉ）ＡＵＴＯＤＯＣＫ（Goodsell et al., 1990, Proteins: Struct., Funct., Genet. 8: 195-202；ＡＵＴＯＤＯＣＫはThe Scripps Research Institute（La Jolla, CA）から入手可能である）、及び（ｉｉ）ＤＯＣＫ（Kuntz et al., 1982, J. Mol. Biol., 161: 269-288；ＤＯＣＫは、カリフォルニア大学（San Francisco, CA）から入手可能である）を含む。
好適な化合物又は断片が選択されると、それらを設計するか、又は集合化させ単一の化合物又は複合体とすることができる。この手動のモデル構築は、Ｑｕａｎｔａ又はＳｙｂｙｌ等のソフトウェアを使用して行われる。個々の化合物又は断片を連結する際に当業者を支援する有用なプログラムは、例えば、（ｉ）ＣＡＶＥＡＴ（Bartlett et al., 1989, in Molecular Recognition in Chemical andBiologicalProblems, Special Publication, Royal Chem. Soc., 78:182-196、Lauri and Bartlett, 1994, J. Comp. Aid. Mol. Des. 8:51-66；ＣＡＶＥＡＴはカリフォルニア大学（Berkley, CA）から入手可能である）、（ｉｉ）ＩＳＩＳ（MDLInformationSystems（San Leandro, CA）；Martin,1992, J. Med. Chem. 35:2145-2154中で概説されている）等の３Ｄデータベースシステム、及び（ｉｉｉ）ＨＯＯＫ（Eisen et al., 1994, Proteins: Struct., Funct., Genet. 19:199-221；ＨＯＯＫはMolecular Simulations Incorporated（SanDiego,CA）から入手可能である）を含む。
本発明により可能となる別のアプローチは、インフルエンザＡ２００９パンデミックＨ１Ｎ１のＰＡサブユニットのヌクレオチド鎖切断活性部位、又はインフルエンザＡ２００９パンデミックＨ１Ｎ１のＰＡポリペプチド変異体の活性部位と全体的に又は部分的に結合することができる化合物に関する小分子データベースの計算によるスクリーニングである。このスクリーニングでは、このような化合物の活性部位への適合（fit）の質は、形状相補性により、又は推定相互作用エネルギーにより、判断することができる（Meng et al., 1992, J. Comp. Chem. 13:505-524）。
代替的に、インフルエンザＡ２００９パンデミックＨ１Ｎ１のＰＡサブユニット又はインフルエンザＡ２００９パンデミックＨ１Ｎ１のそのポリペプチド変異体のヌクレオチド鎖切断活性の有望な変調剤（modulator）、好ましくはヌクレオチド鎖切断活性の阻害剤は、図１〜図５によるＰＡポリペプチド断片の３Ｄ構造に基づいて新規に設計され得る。当業者が利用可能な、様々な新規のリガンド設計方法が存在する。このような方法は、（ｉ）ＬＵＤＩ（Bohm, 1992, J. Comp. Aid. Mol. Des. 6:61-78；ＬＵＤＩはMolecular Simulations Incorporated（SanDiego,CA）から入手可能である）、（ｉｉ）ＬＥＧＥＮＤ（Nishibata and Itai,Tetrahedron47:8985-8990；ＬＥＧＥＮＤはMolecular SimulationsIncorporated（San Diego, CA）から入手可能である）、（ｉｉｉ）ＬｅａｐＦｒｏｇ（TriposAssociates（St. Louis, MO）から入手可能）、（ｉｖ）ＳＰＲＯＵＴ（Gillet et al., 1993, J. Comp. Aid. Mol. Des. 7:127-153；ＳＰＲＯＵＴはリーズ大学（UK）から入手可能である）、（ｖ）ＧＲＯＵＰＢＵＩＬＤ（Rotstein andMurcko,1993, J. Med. Chem. 36:1700-1710）、及び（ｖｉ）ＧＲＯＷ（Moonand Howe,1991, Proteins 11:314-328）を含む。
加えて、ヌクレオチド鎖切断活性部位の有望な変調剤及び／又は阻害剤、好ましくはヌクレオチド鎖切断活性部位の結合パートナーの新規の設計及びモデリングの際に当業者を支援することができる複数の分子モデリング技法（参照により本明細書に援用される）が記載されており、例えば、Cohen et al., 1990, J. Med. Chem. 33:883-894、Navia and Murcko, 1992, Curr. Opin. Struct. Biol. 2:202-210、Balbes et al., 1994, Reviews in Computational Chemistry, Vol.5,Lipkowitz and Boyd, Eds., VCH, New York, pp. 37-380、Guida,1994,Curr. Opin. Struct. Biol. 4:777-781を含む。
インフルエンザＡ２００９パンデミックＨ１Ｎ１のＰＡサブユニット又はその変異体のヌクレオチド鎖切断活性部位と結合するものとして設計又は選択された分子は、その結合状態において好ましくは標的領域との反発的な静電的相互作用を欠くように、更に計算によって最適化することができる。このような非相補的な（例えば静電的な）相互作用は、反発的な電荷−電荷相互作用、双極子−双極子相互作用及び電荷−双極子相互作用を含む。具体的には、結合状態における結合化合物と結合ポケットとの間の全静電的相互作用の合計は、好ましくは結合のエンタルピーに対する中立的な（neutral）又は好ましい寄与をもたらす。化合物変形エネルギー及び静電的相互作用を評価することができる特定のコンピュータプログラムが、当該技術分野で利用可能である。好適なプログラムの例は、（ｉ）Ｇａｕｓｓｉａｎ ９２、ｒｅｖｉｓｉｏｎ Ｃ（Frisch, Gaussian, Incorporated（Pittsburgh,PA））、（ｉｉ）ＡＭＢＥＲ、４．０版（Kollman, カリフォルニア大学（San Francisco, CA））、（ｉｉｉ）ＱＵＡＮＴＡ／ＣＨＡＲＭＭ（MolecularSimulations Incorporated（San Diego,CA））、（ｉｖ）ＯＰＬＳ−ＡＡ（Jorgensen, 1998, Encyclopedia ofComputational Chemistry, Schleyer,Ed., Wiley, New York, Vol. 3, pp. 1986-1989）、及び（ｖ）Ｉｎｓｉｇｈｔ ＩＩ／Ｄｉｓｃｏｖｅｒ（Biosysm Technologies Incorporated（SanDiego,CA））を含む。これらのプログラムは、例えば、Ｓｉｌｉｃｏｎ Ｇｒａｐｈｉｃｓワークステーション、ＩＲＩＳ ４Ｄ／３５又はＩＢＭ ＲＩＳＣ／６０００ワークステーションモデル５５０を使用して、実行することができる。他のハードウェアシステム及びソフトウェアパッケージが、当業者に既知である。
上で説明したように、対象の分子が選択又は設計されると、その後、その結合特性を改善又は修正するために、その原子又は側基の幾つかにおいて置換が為され得る。概して、初期置換は保存的であり、すなわち、置換基は元の基とおよそ同じサイズ、形状、疎水性及び電荷を有する。勿論、立体配座を変化させることが当該技術分野において知られている成分は避けるべきであると理解すべきである。このような置換した化学的化合物は、その後、上で詳細に説明した同様のコンピュータによる（computer）方法により、インフルエンザＡ２００９パンデミックＨ１Ｎ１のＰＡサブユニット又はその変異体のヌクレオチド鎖切断活性部位への適合の効率に関して分析することができる。
上で記載した本発明の方法の１つの実施の形態では、インフルエンザＡ２００９パンデミックＨ１Ｎ１のＰＡサブユニット又はその変異体のヌクレオチド鎖切断活性部位は、配列番号２によるＰＡサブユニットのアミノ酸Ｇｌｕ８０、Ｇｌｕ１１９、Ａｓｐ１０８、Ｉｌｅ１２０及びＨｉｓ４１、又はそれに対応するアミノ酸を含む。別の実施の形態では、上記活性部位は、配列番号２によるＰＡサブユニットのアミノ酸Ｇｌｕ８０、Ｇｌｕ１１９、Ａｓｐ１０８、Ｉｌｅ１２０、Ｈｉｓ４１及びＬｙｓ３４、又はそれに対応するアミノ酸を含む。別の実施の形態では、上記活性部位は、配列番号２によるＰＡサブユニットのアミノ酸Ｇｌｕ８０、Ｇｌｕ１１９、Ａｓｐ１０８、Ｉｌｅ１２０、Ｈｉｓ４１及びＴｙｒ２４、又はそれに対応するアミノ酸を含む。別の実施の形態では、上記活性部位は、配列番号２によるＰＡサブユニットのアミノ酸Ｇｌｕ８０、Ｇｌｕ１１９、Ａｓｐ１０８、Ｉｌｅ１２０、Ｈｉｓ４１及びＡｒｇ８４、又はそれに対応するアミノ酸を含む。別の実施の形態では、上記活性部位は、配列番号２によるＰＡサブユニットのアミノ酸Ｇｌｕ８０、Ｇｌｕ１１９、Ａｓｐ１０８、Ｉｌｅ１２０、Ｈｉｓ４１及びＰｈｅ１０５、又はそれに対応するアミノ酸を含む。別の実施の形態では、上記活性部位は、配列番号２によるＰＡサブユニットのアミノ酸Ｇｌｕ８０、Ｇｌｕ１１９、Ａｓｐ１０８、Ｉｌｅ１２０、Ｈｉｓ４１及びＴｙｒ１３０、又はそれに対応するアミノ酸を含む。別の実施の形態では、上記活性部位は、配列番号２によるＰＡサブユニットのアミノ酸Ｇｌｕ８０、Ｇｌｕ１１９、Ａｓｐ１０８、Ｉｌｅ１２０、Ｈｉｓ４１及びＩｌｅ３８、又はそれに対応するアミノ酸を含む。別の実施の形態では、上記活性部位は、配列番号２によるＰＡサブユニットのアミノ酸Ｇｌｕ８０、Ｇｌｕ１１９、Ａｓｐ１０８、Ｉｌｅ１２０、Ｈｉｓ４１及びＡｒｇ１２４、又はそれに対応するアミノ酸を含む。別の実施の形態では、上記活性部位は、配列番号２によるＰＡサブユニットのアミノ酸Ｇｌｕ８０、Ｇｌｕ１１９、Ａｓｐ１０８、Ｉｌｅ１２０、Ｈｉｓ４１、Ｌｙｓ３４及びＴｙｒ２４、又はそれに対応するアミノ酸を含む。別の実施の形態では、上記活性部位は、配列番号２によるＰＡサブユニットのアミノ酸Ｇｌｕ８０、Ｇｌｕ１１９、Ａｓｐ１０８、Ｉｌｅ１２０、Ｈｉｓ４１、Ｌｙｓ３４、Ｔｙｒ２４及びＡｒｇ８４、又はそれに対応するアミノ酸を含む。別の実施の形態では、上記活性部位は、配列番号２によるＰＡサブユニットのアミノ酸Ｇｌｕ８０、Ｇｌｕ１１９、Ａｓｐ１０８、Ｉｌｅ１２０、Ｈｉｓ４１、Ｌｙｓ３４、Ｔｙｒ２４、Ａｒｇ８４及びＰｈｅ１０５、又はそれに対応するアミノ酸を含む。別の実施の形態では、上記活性部位は、配列番号２によるＰＡサブユニットのアミノ酸Ｇｌｕ８０、Ｇｌｕ１１９、Ａｓｐ１０８、Ｉｌｅ１２０、Ｈｉｓ４１、Ｌｙｓ３４、Ｔｙｒ２４、Ａｒｇ８４、Ｐｈｅ１０５及びＴｙｒ１３０、又はそれに対応するアミノ酸を含む。別の実施の形態では、上記活性部位は、配列番号２によるＰＡサブユニットのアミノ酸Ｇｌｕ８０、Ｇｌｕ１１９、Ａｓｐ１０８、Ｉｌｅ１２０、Ｈｉｓ４１、Ｌｙｓ３４、Ｔｙｒ２４、Ａｒｇ８４、Ｐｈｅ１０５、Ｔｙｒ１３０及びＩｌｅ３８、又はそれに対応するアミノ酸を含む。別の実施の形態では、上記活性部位は、配列番号２によるＰＡサブユニットのアミノ酸Ｇｌｕ８０、Ｇｌｕ１１９、Ａｓｐ１０８、Ｉｌｅ１２０、Ｈｉｓ４１、Ｌｙｓ３４、Ｔｙｒ２４、Ａｒｇ８４、Ｐｈｅ１０５、Ｔｙｒ１３０、Ｉｌｅ３８及びＡｒｇ１２４、又はそれに対応するアミノ酸を含む。
更に別の実施の形態では、上記活性部位は、配列番号２によるＰＡサブユニットのアミノ酸Ｇｌｕ８０、Ｇｌｕ１１９、Ａｓｐ１０８、Ｉｌｅ１２０、Ｈｉｓ４１、Ｌｙｓ３４、Ｔｙｒ２４、Ａｒｇ８４、Ｐｈｅ１０５、Ｔｙｒ１３０、Ｉｌｅ３８及びＧｌｕ２６、若しくはそれに対応するアミノ酸、又は配列番号２によるＰＡサブユニットのアミノ酸Ｇｌｕ８０、Ｇｌｕ１１９、Ａｓｐ１０８、Ｉｌｅ１２０、Ｈｉｓ４１、Ｌｙｓ３４、Ｔｙｒ２４、Ａｒｇ８４、Ｐｈｅ１０５、Ｔｙｒ１３０、Ｉｌｅ３８、Ａｒｇ１２４及びＧｌｕ２６、若しくはそれに対応するアミノ酸を含む。更に別の実施の形態では、上記活性部位は、配列番号２によるＰＡサブユニットのアミノ酸Ｇｌｕ８０、Ｇｌｕ１１９、Ａｓｐ１０８、Ｉｌｅ１２０、Ｈｉｓ４１、Ｌｙｓ３４、Ｔｙｒ２４、Ａｒｇ８４、Ｐｈｅ１０５、Ｔｙｒ１３０、Ｉｌｅ３８及びＬｙｓ１３４、若しくはそれに対応するアミノ酸、又は配列番号２によるＰＡサブユニットのアミノ酸Ｇｌｕ８０、Ｇｌｕ１１９、Ａｓｐ１０８、Ｉｌｅ１２０、Ｈｉｓ４１、Ｌｙｓ３４、Ｔｙｒ２４、Ａｒｇ８４、Ｐｈｅ１０５、Ｔｙｒ１３０、Ｉｌｅ３８、Ａｒｇ１２４及びＬｙｓ１３４、若しくはそれに対応するアミノ酸を含む。更に別の実施の形態では、上記活性部位は、配列番号２によるＰＡサブユニットのアミノ酸Ｇｌｕ８０、Ｇｌｕ１１９、Ａｓｐ１０８、Ｉｌｅ１２０、Ｈｉｓ４１、Ｌｙｓ３４、Ｔｙｒ２４、Ａｒｇ８４、Ｐｈｅ１０５、Ｔｙｒ１３０、Ｉｌｅ３８及びＬｅｕ１０６、若しくはそれに対応するアミノ酸、又は配列番号２によるＰＡサブユニットのアミノ酸Ｇｌｕ８０、Ｇｌｕ１１９、Ａｓｐ１０８、Ｉｌｅ１２０、Ｈｉｓ４１、Ｌｙｓ３４、Ｔｙｒ２４、Ａｒｇ８４、Ｐｈｅ１０５、Ｔｙｒ１３０、Ｉｌｅ３８、Ａｒｇ１２４及びＬｅｕ１０６、若しくはそれに対応するアミノ酸を含む。更に別の実施の形態では、上記活性部位は、配列番号２によるＰＡサブユニットのアミノ酸Ｇｌｕ８０、Ｇｌｕ１１９、Ａｓｐ１０８、Ｉｌｅ１２０、Ｈｉｓ４１、Ｌｙｓ３４、Ｔｙｒ２４、Ａｒｇ８４、Ｐｈｅ１０５、Ｔｙｒ１３０、Ｉｌｅ３８及びＬｙｓ１３７、若しくはそれに対応するアミノ酸、又は配列番号２によるＰＡサブユニットのアミノ酸Ｇｌｕ８０、Ｇｌｕ１１９、Ａｓｐ１０８、Ｉｌｅ１２０、Ｈｉｓ４１、Ｌｙｓ３４、Ｔｙｒ２４、Ａｒｇ８４、Ｐｈｅ１０５、Ｔｙｒ１３０、Ｉｌｅ３８、Ａｒｇ１２４及びＬｙｓ１３７、若しくはそれに対応するアミノ酸を含む。更に別の実施の形態では、上記活性部位は、配列番号２によるＰＡサブユニットのアミノ酸Ｇｌｕ８０、Ｇｌｕ１１９、Ａｓｐ１０８、Ｉｌｅ１２０、Ｈｉｓ４１、Ｌｙｓ３４、Ｔｙｒ２４、Ａｒｇ８４、Ｐｈｅ１０５、Ｔｙｒ１３０、Ｉｌｅ３８、Ｇｌｙ２６及びＬｙｓ１３４、若しくはそれに対応するアミノ酸、又は配列番号２によるＰＡサブユニットのアミノ酸Ｇｌｕ８０、Ｇｌｕ１１９、Ａｓｐ１０８、Ｉｌｅ１２０、Ｈｉｓ４１、Ｌｙｓ３４、Ｔｙｒ２４、Ａｒｇ８４、Ｐｈｅ１０５、Ｔｙｒ１３０、Ｉｌｅ３８、Ａｒｇ１２４、Ｇｌｙ２６及びＬｙｓ１３４、若しくはそれに対応するアミノ酸を含む。更に別の実施の形態では、上記活性部位は、配列番号２によるＰＡサブユニットのアミノ酸Ｇｌｕ８０、Ｇｌｕ１１９、Ａｓｐ１０８、Ｉｌｅ１２０、Ｈｉｓ４１、Ｌｙｓ３４、Ｔｙｒ２４、Ａｒｇ８４、Ｐｈｅ１０５、Ｔｙｒ１３０、Ｉｌｅ３８、Ｌｅｕ１０６及びＬｙｓ１３７、若しくはそれに対応するアミノ酸、又は配列番号２によるＰＡサブユニットのアミノ酸Ｇｌｕ８０、Ｇｌｕ１１９、Ａｓｐ１０８、Ｉｌｅ１２０、Ｈｉｓ４１、Ｌｙｓ３４、Ｔｙｒ２４、Ａｒｇ８４、Ｐｈｅ１０５、Ｔｙｒ１３０、Ｉｌｅ３８、Ａｒｇ１２４、Ｌｅｕ１０６及びＬｙｓ１３７、若しくはそれに対応するアミノ酸を含む。更に別の実施の形態では、上記活性部位は、配列番号２によるＰＡサブユニットのアミノ酸Ｇｌｕ８０、Ｇｌｕ１１９、Ａｓｐ１０８、Ｉｌｅ１２０、Ｈｉｓ４１、Ｌｙｓ３４、Ｔｙｒ２４、Ａｒｇ８４、Ｐｈｅ１０５、Ｔｙｒ１３０、Ｉｌｅ３８、Ｇｌｕ２６及びＬｙｓ１３７、若しくはそれに対応するアミノ酸、又は配列番号２によるＰＡサブユニットのアミノ酸Ｇｌｕ８０、Ｇｌｕ１１９、Ａｓｐ１０８、Ｉｌｅ１２０、Ｈｉｓ４１、Ｌｙｓ３４、Ｔｙｒ２４、Ａｒｇ８４、Ｐｈｅ１０５、Ｔｙｒ１３０、Ｉｌｅ３８、Ａｒｇ１２４、Ｇｌｕ２６及びＬｙｓ１３７、若しくはそれに対応するアミノ酸を含む。更に別の実施の形態では、上記活性部位は、配列番号２によるＰＡサブユニットのアミノ酸Ｇｌｕ８０、Ｇｌｕ１１９、Ａｓｐ１０８、Ｉｌｅ１２０、Ｈｉｓ４１、Ｌｙｓ３４、Ｔｙｒ２４、Ａｒｇ８４、Ｐｈｅ１０５、Ｔｙｒ１３０、Ｉｌｅ３８、Ｇｌｕ２６及びＬｅｕ１０６、若しくはそれに対応するアミノ酸、又は配列番号２によるＰＡサブユニットのアミノ酸Ｇｌｕ８０、Ｇｌｕ１１９、Ａｓｐ１０８、Ｉｌｅ１２０、Ｈｉｓ４１、Ｌｙｓ３４、Ｔｙｒ２４、Ａｒｇ８４、Ｐｈｅ１０５、Ｔｙｒ１３０、Ｉｌｅ３８、Ａｒｇ１２４、Ｇｌｕ２６及びＬｅｕ１０６、若しくはそれに対応するアミノ酸を含む。更に別の実施の形態では、上記活性部位は、配列番号２によるＰＡサブユニットのアミノ酸Ｇｌｕ８０、Ｇｌｕ１１９、Ａｓｐ１０８、Ｉｌｅ１２０、Ｈｉｓ４１、Ｌｙｓ３４、Ｔｙｒ２４、Ａｒｇ８４、Ｐｈｅ１０５、Ｔｙｒ１３０、Ｉｌｅ３８、Ｌｙｓ１３４及びＬｅｕ１０６、若しくはそれに対応するアミノ酸、又は配列番号２によるＰＡサブユニットのアミノ酸Ｇｌｕ８０、Ｇｌｕ１１９、Ａｓｐ１０８、Ｉｌｅ１２０、Ｈｉｓ４１、Ｌｙｓ３４、Ｔｙｒ２４、Ａｒｇ８４、Ｐｈｅ１０５、Ｔｙｒ１３０、Ｉｌｅ３８、Ａｒｇ１２４、Ｌｙｓ１３４及びＬｅｕ１０６、若しくはそれに対応するアミノ酸を含む。更に別の実施の形態では、上記活性部位は、配列番号２によるＰＡサブユニットのアミノ酸Ｇｌｕ８０、Ｇｌｕ１１９、Ａｓｐ１０８、Ｉｌｅ１２０、Ｈｉｓ４１、Ｌｙｓ３４、Ｔｙｒ２４、Ａｒｇ８４、Ｐｈｅ１０５、Ｔｙｒ１３０、Ｉｌｅ３８、Ｌｙｓ１３４及びＬｙｓ１３７、若しくはそれに対応するアミノ酸、又は配列番号２によるＰＡサブユニットのアミノ酸Ｇｌｕ８０、Ｇｌｕ１１９、Ａｓｐ１０８、Ｉｌｅ１２０、Ｈｉｓ４１、Ｌｙｓ３４、Ｔｙｒ２４、Ａｒｇ８４、Ｐｈｅ１０５、Ｔｙｒ１３０、Ｉｌｅ３８、Ａｒｇ１２４、Ｌｙｓ１３４及びＬｙｓ１３７、若しくはそれに対応するアミノ酸を含む。更に別の実施の形態では、上記活性部位は、配列番号２によるＰＡサブユニットのアミノ酸Ｇｌｕ８０、Ｇｌｕ１１９、Ａｓｐ１０８、Ｉｌｅ１２０、Ｈｉｓ４１、Ｌｙｓ３４、Ｔｙｒ２４、Ａｒｇ８４、Ｐｈｅ１０５、Ｔｙｒ１３０、Ｉｌｅ３８、Ｇｌｕ２６、Ｌｙｓ１３４及びＬｅｕ１０６、若しくはそれに対応するアミノ酸、又は配列番号２によるＰＡサブユニットのアミノ酸Ｇｌｕ８０、Ｇｌｕ１１９、Ａｓｐ１０８、Ｉｌｅ１２０、Ｈｉｓ４１、Ｌｙｓ３４、Ｔｙｒ２４、Ａｒｇ８４、Ｐｈｅ１０５、Ｔｙｒ１３０、Ｉｌｅ３８、Ａｒｇ１２４、Ｇｌｕ２６、Ｌｙｓ１３４及びＬｅｕ１０６、若しくはそれに対応するアミノ酸を含む。更に別の実施の形態では、上記活性部位は、配列番号２によるＰＡサブユニットのアミノ酸Ｇｌｕ８０、Ｇｌｕ１１９、Ａｓｐ１０８、Ｉｌｅ１２０、Ｈｉｓ４１、Ｌｙｓ３４、Ｔｙｒ２４、Ａｒｇ８４、Ｐｈｅ１０５、Ｔｙｒ１３０、Ｉｌｅ３８、Ｇｌｕ２６、Ｌｙｓ１３４、Ｌｅｕ１０６及びＬｙｓ１３７、若しくはそれに対応するアミノ酸、又は配列番号２によるＰＡサブユニットのアミノ酸Ｇｌｕ８０、Ｇｌｕ１１９、Ａｓｐ１０８、Ｉｌｅ１２０、Ｈｉｓ４１、Ｌｙｓ３４、Ｔｙｒ２４、Ａｒｇ８４、Ｐｈｅ１０５、Ｔｙｒ１３０、Ｉｌｅ３８、Ａｒｇ１２４、Ｇｌｕ２６、Ｌｙｓ１３４、Ｌｅｕ１０６及びＬｙｓ１３７、若しくはそれに対応するアミノ酸を含む。
更なる実施の形態では、上記活性部位は、配列番号２によるＰＡサブユニットのアミノ酸Ｇｌｕ８０、Ｇｌｕ１１９、Ａｓｐ１０８、Ｉｌｅ１２０、Ｈｉｓ４１及びＧｌｕ２６、又はそれに対応するアミノ酸を含む。更なる実施の形態では、上記活性部位は、配列番号２によるＰＡサブユニットのアミノ酸Ｇｌｕ８０、Ｇｌｕ１１９、Ａｓｐ１０８、Ｉｌｅ１２０、Ｈｉｓ４１及びＬｙｓ１３４、又はそれに対応するアミノ酸を含む。更なる実施の形態では、上記活性部位は、配列番号２によるＰＡサブユニットのアミノ酸Ｇｌｕ８０、Ｇｌｕ１１９、Ａｓｐ１０８、Ｉｌｅ１２０、Ｈｉｓ４１及びＬｅｕ１０６、又はそれに対応するアミノ酸を含む。更なる実施の形態では、上記活性部位は、配列番号２によるＰＡサブユニットのアミノ酸Ｇｌｕ８０、Ｇｌｕ１１９、Ａｓｐ１０８、Ｉｌｅ１２０、Ｈｉｓ４１及びＬｙｓ１３７、又はそれに対応するアミノ酸を含む。更なる実施の形態では、上記活性部位は、配列番号２によるＰＡサブユニットのアミノ酸Ｇｌｕ８０、Ｇｌｕ１１９、Ａｓｐ１０８、Ｉｌｅ１２０、Ｈｉｓ４１、Ｇｌｕ２６及びＬｙｓ１３４、又はそれに対応するアミノ酸を含む。更なる実施の形態では、上記活性部位は、配列番号２によるＰＡサブユニットのアミノ酸Ｇｌｕ８０、Ｇｌｕ１１９、Ａｓｐ１０８、Ｉｌｅ１２０、Ｈｉｓ４１、Ｇｌｕ２６、Ｌｙｓ１３４及びＬｅｕ１０６、又はそれに対応するアミノ酸を含む。更なる実施の形態では、上記活性部位は、配列番号２によるＰＡサブユニットのアミノ酸Ｇｌｕ８０、Ｇｌｕ１１９、Ａｓｐ１０８、Ｉｌｅ１２０、Ｈｉｓ４１、Ｇｌｕ２６、Ｌｙｓ１３４、Ｌｅｕ１０６及びＬｙｓ１３７、又はそれに対応するアミノ酸を含む。
上で記載した本発明の方法の１つの実施の形態では、インフルエンザＡ２００９パンデミックＨ１Ｎ１のＰＡサブユニット又はその変異体のヌクレオチド鎖切断活性部位は、図１〜図５によるＰＡサブユニット（配列番号２）のアミノ酸Ｇｌｕ８０、Ｇｌｕ１１９、Ａｓｐ１０８、Ｉｌｅ１２０及びＨｉｓ４１の構造座標によって、又は図１５若しくは図１６による配列番号２のアミノ酸Ｇｌｕ８０、Ｇｌｕ１１９、Ａｓｐ１０８、Ｉｌｅ１２０及びＨｉｓ４１にそれぞれ対応するＰＡサブユニットのアミノ酸Ｇｌｕ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｉｌｅ及びＨｉｓの構造座標によって規定される。別の実施の形態では、上記活性部位は、図１〜図５によるＰＡサブユニット（配列番号２）のアミノ酸Ｇｌｕ８０、Ｇｌｕ１１９、Ａｓｐ１０８、Ｉｌｅ１２０、Ｈｉｓ４１及びＬｙｓ３４の構造座標によって、又は図１５若しくは図１６による配列番号２のアミノ酸Ｇｌｕ８０、Ｇｌｕ１１９、Ａｓｐ１０８、Ｉｌｅ１２０及びＨｉｓ４１及びＬｙｓ３４にそれぞれ対応するＰＡサブユニットのアミノ酸Ｇｌｕ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｉｌｅ、Ｈｉｓ及びＬｙｓの構造座標によって規定される。別の実施の形態では、上記活性部位は、図１〜図５によるＰＡサブユニット（配列番号２）のアミノ酸Ｇｌｕ８０、Ｇｌｕ１１９、Ａｓｐ１０８、Ｉｌｅ１２０、Ｈｉｓ４１及びＴｙｒ２４の構造座標によって、又は図１５若しくは図１６による配列番号２のアミノ酸Ｇｌｕ８０、Ｇｌｕ１１９、Ａｓｐ１０８、Ｉｌｅ１２０、Ｈｉｓ４１及びＴｙｒ２４にそれぞれ対応するＰＡサブユニットのアミノ酸Ｇｌｕ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｉｌｅ、Ｈｉｓ及びＴｙｒの構造座標によって規定される。別の実施の形態では、上記活性部位は、図１〜図５によるＰＡサブユニット（配列番号２）のアミノ酸Ｇｌｕ８０、Ｇｌｕ１１９、Ａｓｐ１０８、Ｉｌｅ１２０、Ｈｉｓ４１及びＡｒｇ８４の構造座標によって、又は図１５若しくは図１６による配列番号２のアミノ酸Ｇｌｕ８０、Ｇｌｕ１１９、Ａｓｐ１０８、Ｉｌｅ１２０、Ｈｉｓ４１及びＡｒｇ８４にそれぞれ対応するＰＡサブユニットのアミノ酸Ｇｌｕ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｉｌｅ、Ｈｉｓ及びＡｒｇの構造座標によって規定される。別の実施の形態では、上記活性部位は、図１〜図５によるＰＡサブユニット（配列番号２）のアミノ酸Ｇｌｕ８０、Ｇｌｕ１１９、Ａｓｐ１０８、Ｉｌｅ１２０、Ｈｉｓ４１及びＰｈｅ１０５の構造座標によって、又は図１５若しくは図１６による配列番号２のアミノ酸Ｇｌｕ８０、Ｇｌｕ１１９、Ａｓｐ１０８、Ｉｌｅ１２０、Ｈｉｓ４１及びＰｈｅ１０５にそれぞれ対応するＰＡサブユニットのアミノ酸Ｇｌｕ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｉｌｅ、Ｈｉｓ及びＰｈｅの構造座標によって規定される。別の実施の形態では、上記活性部位は、図１〜図５によるＰＡサブユニット（配列番号２）のアミノ酸Ｇｌｕ８０、Ｇｌｕ１１９、Ａｓｐ１０８、Ｉｌｅ１２０、Ｈｉｓ４１及びＴｙｒ１３０の構造座標によって、又は図１５若しくは図１６による配列番号２のアミノ酸Ｇｌｕ８０、Ｇｌｕ１１９、Ａｓｐ１０８、Ｉｌｅ１２０、Ｈｉｓ４１及びＴｙｒ１３０にそれぞれ対応するＰＡサブユニットのアミノ酸Ｇｌｕ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｉｌｅ、Ｈｉｓ及びＴｙｒの構造座標によって規定される。別の実施の形態では、上記活性部位は、図１〜図５によるＰＡサブユニット（配列番号２）のアミノ酸Ｇｌｕ８０、Ｇｌｕ１１９、Ａｓｐ１０８、Ｉｌｅ１２０、Ｈｉｓ４１及びＩｌｅ３８の構造座標によって、又は図１５若しくは図１６による配列番号２のアミノ酸Ｇｌｕ８０、Ｇｌｕ１１９、Ａｓｐ１０８、Ｉｌｅ１２０、Ｈｉｓ４１及びＩｌｅ３８にそれぞれ対応するＰＡサブユニットのアミノ酸Ｇｌｕ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｉｌｅ、Ｈｉｓ及びＩｌｅの構造座標によって規定される。別の実施の形態では、上記活性部位は、図１〜図５によるＰＡサブユニット（配列番号２）のアミノ酸Ｇｌｕ８０、Ｇｌｕ１１９、Ａｓｐ１０８、Ｉｌｅ１２０、Ｈｉｓ４１及びＡｒｇ１２４の構造座標によって、又は図１５若しくは図１６による配列番号２のアミノ酸Ｇｌｕ８０、Ｇｌｕ１１９、Ａｓｐ１０８、Ｉｌｅ１２０、Ｈｉｓ４１及びＡｒｇ１２４にそれぞれ対応するＰＡサブユニットのアミノ酸Ｇｌｕ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｉｌｅ、Ｈｉｓ及びＡｒｇの構造座標によって規定される。
別の実施の形態では、上記活性部位は、図１〜図５によるＰＡサブユニット（配列番号２）のアミノ酸Ｇｌｕ８０、Ｇｌｕ１１９、Ａｓｐ１０８、Ｉｌｅ１２０、Ｈｉｓ４１、Ｌｙｓ３４及びＴｙｒ２４の構造座標によって、又は図１５若しくは図１６による配列番号２のアミノ酸Ｇｌｕ８０、Ｇｌｕ１１９、Ａｓｐ１０８、Ｉｌｅ１２０、Ｈｉｓ４１、Ｌｙｓ３４及びＴｙｒ２４にそれぞれ対応するＰＡサブユニットのアミノ酸Ｇｌｕ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｉｌｅ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ及びＴｙｒの構造座標によって規定される。別の実施の形態では、上記活性部位は、図１〜図５によるＰＡサブユニット（配列番号２）のアミノ酸Ｇｌｕ８０、Ｇｌｕ１１９、Ａｓｐ１０８、Ｉｌｅ１２０、Ｈｉｓ４１、Ｌｙｓ３４、Ｔｙｒ２４及びＡｒｇ８４の構造座標によって、又は図１５若しくは図１６による配列番号２のアミノ酸Ｇｌｕ８０、Ｇｌｕ１１９、Ａｓｐ１０８、Ｉｌｅ１２０、Ｈｉｓ４１、Ｌｙｓ３４、Ｔｙｒ２４及びＡｒｇ８４にそれぞれ対応するＰＡサブユニットのアミノ酸Ｇｌｕ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｉｌｅ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ｔｙｒ及びＡｒｇの構造座標によって規定される。別の実施の形態では、上記活性部位は、図１〜図５によるＰＡサブユニット（配列番号２）のアミノ酸Ｇｌｕ８０、Ｇｌｕ１１９、Ａｓｐ１０８、Ｉｌｅ１２０、Ｈｉｓ４１、Ｌｙｓ３４、Ｔｙｒ２４、Ａｒｇ８４及びＰｈｅ１０５の構造座標によって、又は図１５若しくは図１６による配列番号２のアミノ酸Ｇｌｕ８０、Ｇｌｕ１１９、Ａｓｐ１０８、Ｉｌｅ１２０、Ｈｉｓ４１、Ｌｙｓ３４、Ｔｙｒ２４、Ａｒｇ８４及びＰｈｅ１０５にそれぞれ対応するＰＡサブユニットのアミノ酸Ｇｌｕ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｉｌｅ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ｔｙｒ、Ａｒｇ及びＰｈｅの構造座標によって規定される。別の実施の形態では、上記活性部位は、図１〜図５によるＰＡサブユニット（配列番号２）のアミノ酸Ｇｌｕ８０、Ｇｌｕ１１９、Ａｓｐ１０８、Ｉｌｅ１２０、Ｈｉｓ４１、Ｌｙｓ３４、Ｔｙｒ２４、Ａｒｇ８４、Ｐｈｅ１０５及びＴｙｒ１３０の構造座標によって、又は図１５若しくは図１６による配列番号２のアミノ酸Ｇｌｕ８０、Ｇｌｕ１１９、Ａｓｐ１０８、Ｉｌｅ１２０、Ｈｉｓ４１、Ｌｙｓ３４、Ｔｙｒ２４、Ａｒｇ８４、Ｐｈｅ１０５及びＴｙｒ１３０にそれぞれ対応するＰＡサブユニットのアミノ酸Ｇｌｕ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｉｌｅ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ｔｙｒ、Ａｒｇ、Ｐｈｅ及びＴｙｒの構造座標によって規定される。別の実施の形態では、上記活性部位は、図１〜図５によるＰＡサブユニット（配列番号２）のアミノ酸Ｇｌｕ８０、Ｇｌｕ１１９、Ａｓｐ１０８、Ｉｌｅ１２０、Ｈｉｓ４１、Ｌｙｓ３４、Ｔｙｒ２４、Ａｒｇ８４、Ｐｈｅ１０５、Ｔｙｒ１３０及びＩｌｅ３８の構造座標によって、又は図１５若しくは図１６による配列番号２のアミノ酸Ｇｌｕ８０、Ｇｌｕ１１９、Ａｓｐ１０８、Ｉｌｅ１２０、Ｈｉｓ４１、Ｌｙｓ３４、Ｔｙｒ２４、Ａｒｇ８４、Ｐｈｅ１０５、Ｔｙｒ１３０及びＩｌｅ３８にそれぞれ対応するＰＡサブユニットのアミノ酸Ｇｌｕ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｉｌｅ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ｔｙｒ、Ａｒｇ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ及びＩｌｅの構造座標によって規定される。別の実施の形態では、上記活性部位は、図１〜図５によるＰＡサブユニット（配列番号２）のアミノ酸Ｇｌｕ８０、Ｇｌｕ１１９、Ａｓｐ１０８、Ｉｌｅ１２０、Ｈｉｓ４１、Ｌｙｓ３４、Ｔｙｒ２４、Ａｒｇ８４、Ｐｈｅ１０５、Ｔｙｒ１３０、Ｉｌｅ３８及びＡｒｇ１２４の構造座標によって、又は図１５若しくは図１６による配列番号２のアミノ酸Ｇｌｕ８０、Ｇｌｕ１１９、Ａｓｐ１０８、Ｉｌｅ１２０、Ｈｉｓ４１、Ｌｙｓ３４、Ｔｙｒ２４、Ａｒｇ８４、Ｐｈｅ１０５、Ｔｙｒ１３０、Ｉｌｅ３８及びＡｒｇ１２４にそれぞれ対応するＰＡサブユニットのアミノ酸Ｇｌｕ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｉｌｅ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ｔｙｒ、Ａｒｇ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｉｌｅ及びＡｒｇの構造座標によって規定される。
更に別の実施の形態では、上記活性部位は、図１〜図５によるＰＡサブユニット（配列番号２）のアミノ酸Ｇｌｕ８０、Ｇｌｕ１１９、Ａｓｐ１０８、Ｉｌｅ１２０、Ｈｉｓ４１、Ｌｙｓ３４、Ｔｙｒ２４、Ａｒｇ８４、Ｐｈｅ１０５、Ｔｙｒ１３０、Ｉｌｅ３８及びＧｌｕ２６の構造座標によって、又は図１５若しくは図１６による配列番号２のアミノ酸Ｇｌｕ８０、Ｇｌｕ１１９、Ａｓｐ１０８、Ｉｌｅ１２０、Ｈｉｓ４１、Ｌｙｓ３４、Ｔｙｒ２４、Ａｒｇ８４、Ｐｈｅ１０５、Ｔｙｒ１３０、Ｉｌｅ３８及びＧｌｕ２６にそれぞれ対応するＰＡサブユニットのアミノ酸Ｇｌｕ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｉｌｅ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ｔｙｒ、Ａｒｇ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｉｌｅ及びＧｌｕの構造座標によって規定される。更に別の実施の形態では、上記活性部位は、図１〜図５によるＰＡサブユニット（配列番号２）のアミノ酸Ｇｌｕ８０、Ｇｌｕ１１９、Ａｓｐ１０８、Ｉｌｅ１２０、Ｈｉｓ４１、Ｌｙｓ３４、Ｔｙｒ２４、Ａｒｇ８４、Ｐｈｅ１０５、Ｔｙｒ１３０、Ｉｌｅ３８及びＬｙｓ１３４の構造座標によって、又は図１５若しくは図１６による配列番号２のアミノ酸Ｇｌｕ８０、Ｇｌｕ１１９、Ａｓｐ１０８、Ｉｌｅ１２０、Ｈｉｓ４１、Ｌｙｓ３４、Ｔｙｒ２４、Ａｒｇ８４、Ｐｈｅ１０５、Ｔｙｒ１３０、Ｉｌｅ３８及びＬｙｓ１３４にそれぞれ対応するＰＡサブユニットのアミノ酸Ｇｌｕ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｉｌｅ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ｔｙｒ、Ａｒｇ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｉｌｅ及びＬｙｓの構造座標によって規定される。更に別の実施の形態では、上記活性部位は、図１〜図５によるＰＡサブユニット（配列番号２）のアミノ酸Ｇｌｕ８０、Ｇｌｕ１１９、Ａｓｐ１０８、Ｉｌｅ１２０、Ｈｉｓ４１、Ｌｙｓ３４、Ｔｙｒ２４、Ａｒｇ８４、Ｐｈｅ１０５、Ｔｙｒ１３０、Ｉｌｅ３８及びＬｅｕ１０６の構造座標によって、又は図１５若しくは図１６による配列番号２のアミノ酸Ｇｌｕ８０、Ｇｌｕ１１９、Ａｓｐ１０８、Ｉｌｅ１２０、Ｈｉｓ４１、Ｌｙｓ３４、Ｔｙｒ２４、Ａｒｇ８４、Ｐｈｅ１０５、Ｔｙｒ１３０、Ｉｌｅ３８及びＬｅｕ１０６にそれぞれ対応するＰＡサブユニットのアミノ酸Ｇｌｕ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｉｌｅ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ｔｙｒ、Ａｒｇ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｉｌｅ及びＬｅｕの構造座標によって規定される。更に別の実施の形態では、上記活性部位は、図１〜図５によるＰＡサブユニット（配列番号２）のアミノ酸Ｇｌｕ８０、Ｇｌｕ１１９、Ａｓｐ１０８、Ｉｌｅ１２０、Ｈｉｓ４１、Ｌｙｓ３４、Ｔｙｒ２４、Ａｒｇ８４、Ｐｈｅ１０５、Ｔｙｒ１３０、Ｉｌｅ３８及びＬｙｓ１３７の構造座標によって、又は図１５若しくは図１６による配列番号２のアミノ酸Ｇｌｕ８０、Ｇｌｕ１１９、Ａｓｐ１０８、Ｉｌｅ１２０、Ｈｉｓ４１、Ｌｙｓ３４、Ｔｙｒ２４、Ａｒｇ８４、Ｐｈｅ１０５、Ｔｙｒ１３０、Ｉｌｅ３８及びＬｙｓ１３７にそれぞれ対応するＰＡサブユニットのアミノ酸Ｇｌｕ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｉｌｅ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ｔｙｒ、Ａｒｇ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｉｌｅ及びＬｙｓの構造座標によって規定される。更に別の実施の形態では、上記活性部位は、図１〜図５によるＰＡサブユニット（配列番号２）のアミノ酸Ｇｌｕ８０、Ｇｌｕ１１９、Ａｓｐ１０８、Ｉｌｅ１２０、Ｈｉｓ４１、Ｌｙｓ３４、Ｔｙｒ２４、Ａｒｇ８４、Ｐｈｅ１０５、Ｔｙｒ１３０、Ｉｌｅ３８、Ｇｌｙ２６及びＬｙｓ１３４の構造座標によって、又は図１５若しくは図１６による配列番号２のアミノ酸Ｇｌｕ８０、Ｇｌｕ１１９、Ａｓｐ１０８、Ｉｌｅ１２０、Ｈｉｓ４１、Ｌｙｓ３４、Ｔｙｒ２４、Ａｒｇ８４、Ｐｈｅ１０５、Ｔｙｒ１３０、Ｉｌｅ３８、Ｇｌｕ２６及びＬｙｓ１３４にそれぞれ対応するＰＡサブユニットのアミノ酸Ｇｌｕ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｉｌｅ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ｔｙｒ、Ａｒｇ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｉｌｅ、Ｇｌｕ及びＬｙｓの構造座標によって規定される。更に別の実施の形態では、上記活性部位は、図１〜図５によるＰＡサブユニット（配列番号２）のアミノ酸Ｇｌｕ８０、Ｇｌｕ１１９、Ａｓｐ１０８、Ｉｌｅ１２０、Ｈｉｓ４１、Ｌｙｓ３４、Ｔｙｒ２４、Ａｒｇ８４、Ｐｈｅ１０５、Ｔｙｒ１３０、Ｉｌｅ３８、Ｌｅｕ１０６及びＬｙｓ１３７の構造座標によって、又は図１５若しくは図１６による配列番号２のアミノ酸Ｇｌｕ８０、Ｇｌｕ１１９、Ａｓｐ１０８、Ｉｌｅ１２０、Ｈｉｓ４１、Ｌｙｓ３４、Ｔｙｒ２４、Ａｒｇ８４、Ｐｈｅ１０５、Ｔｙｒ１３０、Ｉｌｅ３８、Ｌｅｕ１０６及びＬｙｓ１３７にそれぞれ対応するＰＡサブユニットのアミノ酸Ｇｌｕ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｉｌｅ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ｔｙｒ、Ａｒｇ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ及びＬｙｓの構造座標によって規定される。更に別の実施の形態では、上記活性部位は、図１〜図５によるＰＡサブユニット（配列番号２）のアミノ酸Ｇｌｕ８０、Ｇｌｕ１１９、Ａｓｐ１０８、Ｉｌｅ１２０、Ｈｉｓ４１、Ｌｙｓ３４、Ｔｙｒ２４、Ａｒｇ８４、Ｐｈｅ１０５、Ｔｙｒ１３０、Ｉｌｅ３８、Ｇｌｕ２６及びＬｙｓ１３７の構造座標によって、又は図１５若しくは図１６による配列番号２のアミノ酸Ｇｌｕ８０、Ｇｌｕ１１９、Ａｓｐ１０８、Ｉｌｅ１２０、Ｈｉｓ４１、Ｌｙｓ３４、Ｔｙｒ２４、Ａｒｇ８４、Ｐｈｅ１０５、Ｔｙｒ１３０、Ｉｌｅ３８、Ｇｌｕ２６及びＬｙｓ１３７にそれぞれ対応するＰＡサブユニットのアミノ酸Ｇｌｕ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｉｌｅ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ｔｙｒ、Ａｒｇ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｉｌｅ、Ｇｌｕ及びＬｙｓの構造座標によって規定される。更に別の実施の形態では、上記活性部位は、図１〜図５によるＰＡサブユニット（配列番号２）のアミノ酸Ｇｌｕ８０、Ｇｌｕ１１９、Ａｓｐ１０８、Ｉｌｅ１２０、Ｈｉｓ４１、Ｌｙｓ３４、Ｔｙｒ２４、Ａｒｇ８４、Ｐｈｅ１０５、Ｔｙｒ１３０、Ｉｌｅ３８、Ｇｌｕ２６及びＬｅｕ１０６の構造座標によって、又は図１５若しくは図１６による配列番号２のアミノ酸Ｇｌｕ８０、Ｇｌｕ１１９、Ａｓｐ１０８、Ｉｌｅ１２０、Ｈｉｓ４１、Ｌｙｓ３４、Ｔｙｒ２４、Ａｒｇ８４、Ｐｈｅ１０５、Ｔｙｒ１３０、Ｉｌｅ３８、Ｇｌｕ２６及びＬｅｕ１０６にそれぞれ対応するＰＡサブユニットのアミノ酸Ｇｌｕ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｉｌｅ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ｔｙｒ、Ａｒｇ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｉｌｅ、Ｇｌｕ及びＬｅｕの構造座標によって規定される。更に別の実施の形態では、上記活性部位は、図１〜図５によるＰＡサブユニット（配列番号２）のアミノ酸Ｇｌｕ８０、Ｇｌｕ１１９、Ａｓｐ１０８、Ｉｌｅ１２０、Ｈｉｓ４１、Ｌｙｓ３４、Ｔｙｒ２４、Ａｒｇ８４、Ｐｈｅ１０５、Ｔｙｒ１３０、Ｉｌｅ３８、Ｌｙｓ１３４及びＬｅｕ１０６の構造座標によって、又は図１５若しくは図１６による配列番号２のアミノ酸Ｇｌｕ８０、Ｇｌｕ１１９、Ａｓｐ１０８、Ｉｌｅ１２０、Ｈｉｓ４１、Ｌｙｓ３４、Ｔｙｒ２４、Ａｒｇ８４、Ｐｈｅ１０５、Ｔｙｒ１３０、Ｉｌｅ３８、Ｌｙｓ１３４及びＬｅｕ１０６にそれぞれ対応するＰＡサブユニットのアミノ酸Ｇｌｕ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｉｌｅ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ｔｙｒ、Ａｒｇ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ及びＬｅｕの構造座標によって規定される。更に別の実施の形態では、上記活性部位は、図１〜図５によるＰＡサブユニット（配列番号２）のアミノ酸Ｇｌｕ８０、Ｇｌｕ１１９、Ａｓｐ１０８、Ｉｌｅ１２０、Ｈｉｓ４１、Ｌｙｓ３４、Ｔｙｒ２４、Ａｒｇ８４、Ｐｈｅ１０５、Ｔｙｒ１３０、Ｉｌｅ３８、Ｌｙｓ１３４及びＬｙｓ１３７の構造座標によって、又は図１５若しくは図１６による配列番号２のアミノ酸Ｇｌｕ８０、Ｇｌｕ１１９、Ａｓｐ１０８、Ｉｌｅ１２０、Ｈｉｓ４１、Ｌｙｓ３４、Ｔｙｒ２４、Ａｒｇ８４、Ｐｈｅ１０５、Ｔｙｒ１３０、Ｉｌｅ３８、Ｌｙｓ１３４及びＬｙｓ１３７にそれぞれ対応するＰＡサブユニットのアミノ酸Ｇｌｕ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｉｌｅ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ｔｙｒ、Ａｒｇ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ及びＬｙｓの構造座標によって規定される。更に別の実施の形態では、上記活性部位は、図１〜図５によるＰＡサブユニット（配列番号２）のアミノ酸Ｇｌｕ８０、Ｇｌｕ１１９、Ａｓｐ１０８、Ｉｌｅ１２０、Ｈｉｓ４１、Ｌｙｓ３４、Ｔｙｒ２４、Ａｒｇ８４、Ｐｈｅ１０５、Ｔｙｒ１３０、Ｉｌｅ３８、Ｇｌｕ２６、Ｌｙｓ１３４及びＬｅｕ１０６の構造座標によって、又は図１５若しくは図１６による配列番号２のアミノ酸Ｇｌｕ８０、Ｇｌｕ１１９、Ａｓｐ１０８、Ｉｌｅ１２０、Ｈｉｓ４１、Ｌｙｓ３４、Ｔｙｒ２４、Ａｒｇ８４、Ｐｈｅ１０５、Ｔｙｒ１３０、Ｉｌｅ３８、Ｇｌｕ２６、Ｌｙｓ１３４及びＬｅｕ１０６にそれぞれ対応するＰＡサブユニットのアミノ酸Ｇｌｕ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｉｌｅ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ｔｙｒ、Ａｒｇ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｉｌｅ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ及びＬｅｕの構造座標によって規定される。更に別の実施の形態では、上記活性部位は、図１〜図５によるＰＡサブユニット（配列番号２）のアミノ酸Ｇｌｕ８０、Ｇｌｕ１１９、Ａｓｐ１０８、Ｉｌｅ１２０、Ｈｉｓ４１、Ｌｙｓ３４、Ｔｙｒ２４、Ａｒｇ８４、Ｐｈｅ１０５、Ｔｙｒ１３０、Ｉｌｅ３８、Ｇｌｕ２６、Ｌｙｓ１３４、Ｌｅｕ１０６及びＬｙｓ１３７の構造座標によって、又は図１５若しくは図１６による配列番号２のアミノ酸Ｇｌｕ８０、Ｇｌｕ１１９、Ａｓｐ１０８、Ｉｌｅ１２０、Ｈｉｓ４１、Ｌｙｓ３４、Ｔｙｒ２４、Ａｒｇ８４、Ｐｈｅ１０５、Ｔｙｒ１３０、Ｉｌｅ３８、Ｇｌｕ２６、Ｌｙｓ１３４、Ｌｅｕ１０６及びＬｙｓ１３７にそれぞれ対応するＰＡサブユニットのアミノ酸Ｇｌｕ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｉｌｅ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ｔｙｒ、Ａｒｇ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｉｌｅ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ及びＬｙｓの構造座標によって規定される。更に別の実施の形態では、上記活性部位は、図１〜図５によるＰＡサブユニット（配列番号２）のアミノ酸Ｇｌｕ８０、Ｇｌｕ１１９、Ａｓｐ１０８、Ｉｌｅ１２０、Ｈｉｓ４１、Ｌｙｓ３４、Ｔｙｒ２４、Ａｒｇ８４、Ｐｈｅ１０５、Ｔｙｒ１３０、Ｉｌｅ３８、Ａｒｇ１２４、Ｇｌｕ２６、Ｌｙｓ１３４、Ｌｅｕ１０６及びＬｙｓ１３７の構造座標によって、又は図１５若しくは図１６による配列番号２のアミノ酸Ｇｌｕ８０、Ｇｌｕ１１９、Ａｓｐ１０８、Ｉｌｅ１２０、Ｈｉｓ４１、Ｌｙｓ３４、Ｔｙｒ２４、Ａｒｇ８４、Ｐｈｅ１０５、Ｔｙｒ１３０、Ｉｌｅ３８、Ａｒｇ１２４、Ｇｌｕ２６、Ｌｙｓ１３４、Ｌｅｕ１０６及びＬｙｓ１３７にそれぞれ対応するＰＡサブユニットのアミノ酸Ｇｌｕ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｉｌｅ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ｔｙｒ、Ａｒｇ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｉｌｅ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ及びＬｙｓの構造座標によって規定される。
更なる実施の形態では、上記活性部位は、図１〜図５によるＰＡサブユニット（配列番号２）のアミノ酸Ｇｌｕ８０、Ｇｌｕ１１９、Ａｓｐ１０８、Ｉｌｅ１２０、Ｈｉｓ４１及びＧｌｕ２６の構造座標によって、又は図１５若しくは図１６による配列番号２のアミノ酸Ｇｌｕ８０、Ｇｌｕ１１９、Ａｓｐ１０８、Ｉｌｅ１２０、Ｈｉｓ４１及びＧｌｕ２６にそれぞれ対応するＰＡサブユニットのアミノ酸Ｇｌｕ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｉｌｅ、Ｈｉｓ及びＧｌｕの構造座標によって規定される。更なる実施の形態では、上記活性部位は、図１〜図５によるＰＡサブユニット（配列番号２）のアミノ酸Ｇｌｕ８０、Ｇｌｕ１１９、Ａｓｐ１０８、Ｉｌｅ１２０、Ｈｉｓ４１及びＬｙｓ１３４の構造座標によって、又は図１５若しくは図１６による配列番号２のアミノ酸Ｇｌｕ８０、Ｇｌｕ１１９、Ａｓｐ１０８、Ｉｌｅ１２０、Ｈｉｓ４１及びＬｙｓ１３４にそれぞれ対応するＰＡサブユニットのアミノ酸Ｇｌｕ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｉｌｅ、Ｈｉｓ及びＬｙｓの構造座標によって規定される。更なる実施の形態では、上記活性部位は、図１〜図５によるＰＡサブユニット（配列番号２）のアミノ酸Ｇｌｕ８０、Ｇｌｕ１１９、Ａｓｐ１０８、Ｉｌｅ１２０、Ｈｉｓ４１及びＬｅｕ１０６の構造座標によって、又は図１５若しくは図１６による配列番号２のアミノ酸Ｇｌｕ８０、Ｇｌｕ１１９、Ａｓｐ１０８、Ｉｌｅ１２０、Ｈｉｓ４１及びＬｅｕ１０６にそれぞれ対応するＰＡサブユニットのアミノ酸Ｇｌｕ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｉｌｅ、Ｈｉｓ及びＬｅｕの構造座標によって規定される。更なる実施の形態では、上記活性部位は、図１〜図５によるＰＡサブユニット（配列番号２）のアミノ酸Ｇｌｕ８０、Ｇｌｕ１１９、Ａｓｐ１０８、Ｉｌｅ１２０、Ｈｉｓ４１及びＬｙｓ１３７の構造座標によって、又は図１５若しくは図１６による配列番号２のアミノ酸Ｇｌｕ８０、Ｇｌｕ１１９、Ａｓｐ１０８、Ｉｌｅ１２０、Ｈｉｓ４１及びＬｙｓ１３７にそれぞれ対応するＰＡサブユニットのアミノ酸Ｇｌｕ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｉｌｅ、Ｈｉｓ及びＬｙｓの構造座標によって規定される。更なる実施の形態では、上記活性部位は、図１〜図５によるＰＡサブユニット（配列番号２）のアミノ酸Ｇｌｕ８０、Ｇｌｕ１１９、Ａｓｐ１０８、Ｉｌｅ１２０、Ｈｉｓ４１、Ｇｌｕ２６及びＬｙｓ１３４の構造座標によって、又は図１５若しくは図１６による配列番号２のアミノ酸Ｇｌｕ８０、Ｇｌｕ１１９、Ａｓｐ１０８、Ｉｌｅ１２０、Ｈｉｓ４１、Ｇｌｕ２６及びＬｙｓ１３４にそれぞれ対応するＰＡサブユニットのアミノ酸Ｇｌｕ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｉｌｅ、Ｈｉｓ、Ｇｌｕ及びＬｙｓの構造座標によって規定される。更なる実施の形態では、上記活性部位は、図１〜図５によるＰＡサブユニット（配列番号２）のアミノ酸Ｇｌｕ８０、Ｇｌｕ１１９、Ａｓｐ１０８、Ｉｌｅ１２０、Ｈｉｓ４１、Ｇｌｕ２６、Ｌｙｓ１３４及びＬｅｕ１０６の構造座標によって、又は図１５若しくは図１６による配列番号２のアミノ酸Ｇｌｕ８０、Ｇｌｕ１１９、Ａｓｐ１０８、Ｉｌｅ１２０、Ｈｉｓ４１、Ｇｌｕ２６、Ｌｙｓ１３４及びＬｅｕ１０６にそれぞれ対応するＰＡサブユニットのアミノ酸Ｇｌｕ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｉｌｅ、Ｈｉｓ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ及びＬｅｕの構造座標によって規定される。更なる実施の形態では、上記活性部位は、図１〜図５によるＰＡサブユニット（配列番号２）のアミノ酸Ｇｌｕ８０、Ｇｌｕ１１９、Ａｓｐ１０８、Ｉｌｅ１２０、Ｈｉｓ４１、Ｇｌｕ２６、Ｌｙｓ１３４、Ｌｅｕ１０６及びＬｙｓ１３７の構造座標によって、又は図１５若しくは図１６による配列番号２のアミノ酸Ｇｌｕ８０、Ｇｌｕ１１９、Ａｓｐ１０８、Ｉｌｅ１２０、Ｈｉｓ４１、Ｇｌｕ２６、Ｌｙｓ１３４、Ｌｅｕ１０６及びＬｙｓ１３７にそれぞれ対応するＰＡサブユニットのアミノ酸Ｇｌｕ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｉｌｅ、Ｈｉｓ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ及びＬｙｓの構造座標によって規定される。
本発明の発明者らは驚くべきことに、インフルエンザＡ２００９パンデミックＨ１Ｎ１のＰＡサブユニットの活性部位内の配列番号２によるアミノ酸Ｈｉｓ４１、Ｇｌｕ８０、Ａｓｐ１０８、Ｇｌｕ１１９及びＩｌｅ１２０が二価の陽イオンの結合に必要とされ（例えば図１及び図６を参照されたい）、インフルエンザＡ２００９パンデミックＨ１Ｎ１のＰＡサブユニットの活性部位内の配列番号２によるアミノ酸Ｔｙｒ２４、Ｌｙｓ３４、Ｉｌｅ３８、Ａｒｇ８４、Ｐｈｅ１０５及びＴｙｒ１３０が、図２〜図５に示す構造における化合物（すなわち阻害剤）の結合に必要とされ（図７〜図１０並びに表１及び表２も参照されたい）、非連結構造からその立体配座が変化するアミノ酸であることを見出した（図１及び図６を参照されたい）。加えて、本発明の発明者らは、インフルエンザＡ２００９パンデミックＨ１Ｎ１のＰＡサブユニットの活性部位内の配列番号２によるアミノ酸残基Ｌｅｕ１０６、Ｌｙｓ１３４、Ｌｙｓ１３７及びＧｌｕｅ２６も、試験される化合物との接触を形成するのに必要とされることを決定した（表１及び表２、図２〜図５及び図７〜図１０を参照されたい）。図１５〜図１９も参照されたい。加えて、本発明の発明者らは、インフルエンザＡ２００９パンデミックＨ１Ｎ１のＰＡサブユニットの活性部位内のアミノ酸Ａｒｇ１２４が、図１６及び図１８に示す構造における化合物（すなわち阻害剤）の相互作用に必要とされることを見出した。化合物／リガンドと相互作用する残基及び活性部位の可塑性に関するこの三次元の知識は、その効力を改善するための既存の阻害剤に対する修飾の設計の最適化に重要である。加えて、したがって、これらのアミノ酸と相互作用する新たな抗ウイルス化合物の設計、同定及び選択が、非常に好ましい。
以上に記載される方法によるコンピュータモデリングがインフルエンザＡ２００９パンデミックＨ１Ｎ１のＰＡサブユニット又はその変異体の活性部位に対する或る化合物の結合を示す場合、上記化合物を合成することができ、任意に、上記化合物又はその薬学的に許容可能な塩を、１つ又は複数の薬学的に許容可能な添加物及び／又は担体とともに配合することができる。したがって、上で記載した方法は、
（ｅ）上記化合物を合成するとともに、任意に、１つ又は複数の薬学的に許容可能な添加物及び／又は担体とともに上記化合物又はその薬学的に許容可能な塩を配合する更なる工程
を含み得る。
任意に、インフルエンザＡ２００９パンデミックＨ１Ｎ１のＰＡサブユニット又はその変異体のヌクレオチド鎖切断活性を変調させ、好ましくはこれを減少させ、より好ましくはこれを阻害する上記化合物若しくはその薬学的に許容可能な塩又はその配合物の能力を、
（ｆ）本発明によるＰＡポリペプチド断片若しくはその変異体又は本発明による組換え宿主細胞と上記化合物を接触させる更なる工程であって、インフルエンザＡ２００９パンデミックＨ１Ｎ１のＰＡサブユニットポリペプチド断片又はその変異体の（ｉ）活性部位と結合し、及び／又は（ｉｉ）ヌクレオチド鎖切断活性を変調させ、好ましくはこれを減少させ、より好ましくはこれを阻害する上記化合物の能力を決定する、接触させる更なる工程を含むｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏの方法で試験することができる。活性部位に対するこのような化合物の適合の質は、形状の相補性によって、又は推定相互作用エネルギーによって判断することができる（Meng et al., 1992, J. Comp. Chem. 13:505-524）。上記化合物を合成する方法は当業者に既知であり、又はこのような化合物は市販されていることがある。
本発明によるインフルエンザＡ２００９パンデミックＨ１Ｎ１のＰＡサブユニット又はその変異体のエンドヌクレアーゼ活性を変調させることができ、好ましくはこれを減少させることができ、より好ましくはこれを阻害することができる化合物を提供することは、本発明の別の態様である。該化合物が、本発明によるＰＡサブユニット又はその変異体のエンドヌクレアーゼ活性を、上記ＰＡサブユニット又はその変異体のヌクレオチド鎖切断活性部位と会合することによって、好ましくはこれと結合することによって、変調させることができ、好ましくはこれを減少させることができ、より好ましくはこれを阻害することができることが好ましい。
本発明によるインフルエンザＡ２００９パンデミックＨ１Ｎ１のＰＡサブユニットポリペプチド断片又はその変異体のエンドヌクレアーゼ活性を変調させることができ、好ましくはこれを減少させることができ、より好ましくはこれを阻害することができる化合物を提供することも、本発明の態様である。該化合物が、本発明によるＰＡサブユニットポリペプチド断片又はその変異体のエンドヌクレアーゼ活性を、上記ＰＡサブユニットポリペプチド断片又はその変異体のヌクレオチド鎖切断活性部位と会合することによって、好ましくはこれと結合することによって、変調させることができ、好ましくはこれを減少させることができ、より好ましくはこれを阻害することができることが好ましい。
他のウイルス、好ましくはオルトミクソウイルス科、ブニヤウイルス科及び／又はアレナウイルス科のウイルスのＰＡサブユニットのエンドヌクレアーゼ活性を変調させることができ、好ましくはこれを減少させることができ、より好ましくはこれを阻害することができる化合物を提供することは、本発明の更なる態様である。該化合物が、他のウイルス、好ましくはオルトミクソウイルス科、ブニヤウイルス科及び／又はアレナウイルス科のウイルスのＰＡサブユニットのエンドヌクレアーゼ活性を、上記ＰＡサブユニットのヌクレオチド鎖切断活性部位と会合することによって、好ましくはこれと結合することによって、変調させることができ、好ましくはこれを減少させることができ、より好ましくはこれを阻害することができることが好ましい。
好ましくは、上で言及したＰＡサブユニット若しくはその変異体、又はＰＡサブユニットポリペプチド断片若しくはその変異体のヌクレオチド鎖切断活性部位は、上で規定したような構造を有する。
したがって、上記活性部位が、配列番号２によるＰＡサブユニットのアミノ酸Ｇｌｕ８０、Ｇｌｕ１１９、Ａｓｐ１０８、Ｉｌｅ１２０及びＨｉｓ４１、又はそれに対応するアミノ酸を含むことが好ましい。
上記活性部位が、配列番号２によるＰＡサブユニットのアミノ酸Ｇｌｕ８０、Ｇｌｕ１１９、Ａｓｐ１０８、Ｉｌｅ１２０、Ｈｉｓ４１、Ｌｙｓ３４、Ｔｙｒ２４、Ａｒｇ８４、Ｐｈｅ１０５、Ｔｙｒ１３０及びＩｌｅ３８、若しくはそれに対応するアミノ酸を含み、又は配列番号２によるＰＡサブユニットのアミノ酸Ｇｌｕ８０、Ｇｌｕ１１９、Ａｓｐ１０８、Ｉｌｅ１２０、Ｈｉｓ４１、Ｌｙｓ３４、Ｔｙｒ２４、Ａｒｇ８４、Ｐｈｅ１０５、Ｔｙｒ１３０、Ｉｌｅ３８及びＡｒｇ１２４、若しくはそれに対応するアミノ酸を含むことがより好ましい。
上記活性部位が、配列番号２によるＰＡサブユニットのアミノ酸Ｇｌｕ８０、Ｇｌｕ１１９、Ａｓｐ１０８、Ｉｌｅ１２０、Ｈｉｓ４１、Ｇｌｕ２６、Ｌｙｓ１３４、Ｌｅｕ１０６及びＬｙｓ１３７、又はそれに対応するアミノ酸を含むこともより好ましい。
上記活性部位（site）が、配列番号２によるＰＡサブユニットのアミノ酸Ｇｌｕ８０、Ｇｌｕ１１９、Ａｓｐ１０８、Ｉｌｅ１２０、Ｈｉｓ４１、Ｌｙｓ３４、Ｔｙｒ２４、Ａｒｇ８４、Ｐｈｅ１０５、Ｔｙｒ１３０、Ｉｌｅ３８、Ｇｌｕ２６、Ｌｙｓ１３４、Ｌｅｕ１０６及びＬｙｓ１３７、若しくはそれに対応するアミノ酸を含み、又は配列番号２によるＰＡサブユニットのアミノ酸Ｇｌｕ８０、Ｇｌｕ１１９、Ａｓｐ１０８、Ｉｌｅ１２０、Ｈｉｓ４１、Ｌｙｓ３４、Ｔｙｒ２４、Ａｒｇ８４、Ｐｈｅ１０５、Ｔｙｒ１３０、Ｉｌｅ３８、Ａｒｇ１２４、Ｇｌｕ２６、Ｌｙｓ１３４、Ｌｅｕ１０６及びＬｙｓ１３７、若しくはそれに対応するアミノ酸を含むことが最も好ましい。
好ましくは、上で言及したＰＡサブユニット若しくはその変異体、又はＰＡサブユニットポリペプチド断片若しくはその変異体のヌクレオチド鎖切断活性部位が、上で言及したようなＰＡサブユニットの構造座標によって規定される。
上で言及したＰＡサブユニット若しくはその変異体、若しくはＰＡサブユニットポリペプチド断片若しくはその変異体のヌクレオチド鎖切断活性部位と会合し、好ましくはこれと結合し、及び／又はＰＡサブユニット若しくはその変異体、若しくはＰＡサブユニットポリペプチド断片若しくはその変異体のヌクレオチド鎖切断活性を変調させ、好ましくはこれを減少させ、より好ましくはこれを阻害する或る化合物の能力は、容易に評価することができる。例えば、精製したＰＡサブユニット又はＰＡサブユニットポリペプチド断片とその基質、例えばパンハンドルＲＮＡ又は一本鎖ＤＮＡとを、様々な量の試験化合物の存在下又は非存在下で接触させ、或る特定の期間、例えば５分間、１０分間、１５分間、２０分間、３０分間、４０分間、６０分間又は９０分間インキュベートする。反応条件は、ＰＡサブユニット又はＰＡサブユニットポリペプチド断片が試験化合物の非存在下でヌクレオチド鎖切断活性を有するように選ぶ。その後、基質を、分解／ヌクレオチド鎖切断に関して、例えばゲル電気泳動によって分析する。代替的には、このような試験は、基質分子がヌクレオチド鎖切断された場合にはシグナルをもたらすが基質分子が未変化である場合にはシグナルをもたらさない標識した基質分子を含み得る。例えば、基質ポリヌクレオチド鎖を、基質ポリヌクレオチド鎖が未変化である場合には蛍光レポーターが消光されるように、蛍光レポーター分子及び蛍光クエンチャーを用いて標識することができる。基質ポリヌクレオチド鎖が切断された場合には蛍光レポーター及びクエンチャーは分離し、したがって蛍光レポーターは、例えばＥＬＩＳＡリーダーによって、検出することができるシグナルを放出する。更なる好適な方法を以下に記載する。
好ましくは、上記化合物は、上で記載した方法によって同定可能である。より好ましくは、上記化合物は、上で記載した方法によって同定される。
上で記載した方法によって同定可能な化合物は、インフルエンザＡ２００９パンデミックＨ１Ｎ１のＰＡサブユニット又はその変異体のエンドヌクレアーゼ活性を変調させることができる場合がある。上で記載した方法によって同定可能な化合物は、本発明によるインフルエンザＡ２００９パンデミックＨ１Ｎ１のＰＡサブユニットポリペプチド断片又はその変異体のエンドヌクレアーゼ活性を変調させることができる場合があり、好ましくはこれを減少させることができる場合があり、より好ましくはこれを阻害することができる場合がある。上で言及した方法によって同定可能な化合物が、他のウイルス、好ましくはオルトミクソウイルス科、ブニヤウイルス科及び／又はアレナウイルス科のウイルスのＰＡサブユニットのエンドヌクレアーゼ活性を変調させることができる場合があり、好ましくはこれを減少させることができる場合があり、最も好ましくはこれを阻害することができる場合があることも考え得る。
本発明の化合物は、ペプチド、ペプトイド、ポリペプチド、タンパク質（抗体を含む）、脂質、金属、ヌクレオチド、ヌクレオシド、核酸、有機小分子若しくは無機小分子、化学的化合物、元素、糖類、同位体、炭水化物、造影剤、リポタンパク質、糖タンパク質、酵素、分析プローブ、ポリアミン、並びにその組合せ及び誘導体を含むがこれらに限定されない任意の作用物質であり得る。「小分子」という用語は、５０ダルトン〜約２５００ダルトン、好ましくは２００ダルトン〜８００ダルトンの範囲の分子量を有する分子を表す。加えて、本発明による試験化合物は、検出可能な標識を任意に含み得る。このような標識は、酵素標識、放射性同位体又は放射性化合物若しくは放射性元素、蛍光化合物又は蛍光金属、化学発光化合物、及び生物発光化合物を含むがこれらに限定されない。
本発明による化合物の好ましい実施の形態では、化合物は、４−置換２−ジオキソブタン酸、４−置換４−ジオキソブタン酸、４−置換２，４−ジオキソブタン酸、２，６−ジケトピペラジン若しくはその誘導体、置換２，６−ジケトピペラジン若しくはその誘導体ピラジン−２，６−ジオン若しくは置換ピラジン−２，６−ジオン、例えばフルチミド、Ｎ−ヒドロキサム酸、又はＮ−ヒドロキシミド（hydroxymide）ではない。
特に、本発明による化合物は、式Ｉ：
Figure 2016189772
 による化合物ではない。
本発明による化合物の別の好ましい実施の形態では、化合物は、４−［３−［（４−クロロフェニル）メチル］−１−（フェニルメチル）−３−ピペリジニル］−２−ヒドロキシ−４−オキソ−２−ブテン酸、４−［４−［（４−クロロフェニル）メチル］−１−（シクロヘキシルメチル）−４−ピペリジニル］−２−ヒドロキシ−４−オキソ−２−ブテン酸、４−［３−［（４−クロロフェニル）メチル］−１−（フェニルメチルスルホ）−３−ピペリジニル］−２−ヒドロキシ−４−オキソ−２−ブテン酸、リボウリジン一リン酸（ｒＵＭＰ）、デスオキシ−チミジン一リン酸（monophosphate）（ｄＴＭＰ）、又は２．４−ジオキソ−４−フェニルブタン酸（ＤＰＢＡ）ではない。
本発明による化合物の更に好ましい実施の形態では、化合物は、カテキンではなく、好ましくは（−）−エピガロカテキンガレート（ＥＧＣＧ）、例えば［（２Ｒ，３Ｒ）−５，７−ジヒドロキシ−２−（３，４，５−トリヒドロキシフェニル）クロマン−３−イル］３，４，５−トリヒドロキシベンゾエート、（−）−エピカテキンガレート（ＥＣＧ）、（−）−エピガロカテキン（ＥＧＣ）、（−）−エピカテキン（ＥＣ）又は没食子酸（ＧＡ）ではない。本発明の化合物の別の好ましい実施の形態では、化合物は、フェネチルフェニルフタルイミド、サリドマイド又はラルテグラビル（また、ジケトブタン酸誘導体でもある）から誘導されるフェネチルフェニルフタルイミド類似体ではない。
更なる態様では、本発明は、インフルエンザＡ２００９パンデミックＨ１Ｎ１ウイルス由来のＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのＰＡサブユニット又はその変異体のエンドヌクレアーゼ活性を変調させ、好ましくはこれを減少させ、より好ましくはこれを阻害する化合物を同定する（ｉｎ ｖｉｔｒｏの）方法であって、
（ｉ）本発明による上記ポリペプチド断片若しくはその変異体又は本発明による上記組換え宿主細胞を試験化合物と接触させる工程と、
（ｉｉ）上記ＰＡサブユニットポリペプチド断片又はその変異体のエンドヌクレアーゼ活性を変調させ、好ましくはこれを減少させ、より好ましくはこれを阻害する上記試験化合物の能力を分析する工程と
を含む、化合物を同定する（ｉｎ ｖｉｔｒｏの）方法を提供する。
上記化合物が、インフルエンザＡ２００９パンデミックＨ１Ｎ１ウイルス由来のＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのＰＡサブユニット又はその変異体のエンドヌクレアーゼ活性を、上記ＰＡサブユニットのヌクレオチド鎖切断活性部位と会合することによって、好ましくはこれと結合することによって、変調させ、好ましくはこれを減少させ、より好ましくはこれを阻害することが好ましい。
別の更なる態様では、本発明は、インフルエンザＡ２００９パンデミックＨ１Ｎ１ウイルス由来のＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのＰＡサブユニット又はその変異体のヌクレオチド鎖切断活性部位と結合し、（及び）好ましくはそのエンドヌクレアーゼ活性を変調させ、より好ましくはこれを減少させ、最も好ましくはこれを阻害する化合物を同定する（ｉｎ ｖｉｔｒｏの）方法であって、
（ｉ）本発明による上記ポリペプチド断片若しくはその変異体又は本発明による上記組換え宿主細胞を試験化合物と接触させる工程と、
（ｉｉ）上記ＰＡサブユニットポリペプチド断片又はその変異体のヌクレオチド鎖切断活性部位と結合し、（及び）好ましくはそのエンドヌクレアーゼ活性を変調させ、より好ましくはこれを減少させ、最も好ましくはこれを阻害する上記試験化合物の能力を分析する工程と
を含む、化合物を同定する（ｉｎ ｖｉｔｒｏの）方法を提供する。
１つの実施の形態では、インフルエンザＡ２００９パンデミックＨ１Ｎ１のＰＡポリペプチド断片又はその変異体と試験化合物との間の相互作用を、プルダウンアッセイの形式で分析することができる。例えば、本発明によるＰＡポリペプチド断片又はその変異体を、精製することができ、ビーズ上に固定化することができる。１つの実施の形態では、ビーズ上に固定化されたＰＡポリペプチド断片を、例えば、（ｉ）別の精製したタンパク質、ポリペプチド断片若しくはペプチド、（ｉｉ）タンパク質、ポリペプチド断片若しくはペプチドの混合物、又は（ｉｉｉ）細胞若しくは組織の抽出物と接触させることができ、タンパク質、ポリペプチド断片又はペプチドの結合を、クマシー染色又はウェスタンブロッティングと組み合わせたポリアクリルアミドゲル電気泳動によって検証することができる。未知の結合パートナーを、質量分光分析によって同定することができる。
別の実施の形態において、インフルエンザＡ２００９パンデミックＨ１Ｎ１のＰＡポリペプチド断片又はその変異体と試験化合物との間の相互作用を、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）に基づく実験の形式で分析することができる。１つの実施の形態では、本発明によるＰＡポリペプチド断片又はその変異体を、ＥＬＩＳＡプレート表面上に固定化することができ、試験化合物と接触させることができる。例えばタンパク質、ポリペプチド、ペプチド及びエピトープタグ付き化合物に対する試験化合物の結合を、試験化合物又はエピトープタグに特異的な抗体により検証することができる。これらの抗体を酵素と直接的に結合させることができるか、又は適当な基質と組み合わせて、化学発光反応（例えばホースラディッシュペルオキシダーゼ）若しくは比色反応（例えばアルカリホスファターゼ）を実施する上記酵素と結合させた二次抗体によって検出することができる。別の実施の形態では、抗体では検出することができない化合物の結合を、試験化合物と直接的に結合させた標識により検証することができる。かかる標識には、酵素標識、放射性同位体又は放射性化合物若しくは放射性元素、蛍光化合物又は蛍光金属、化学発光化合物、及び生物発光化合物が含まれ得る。別の実施の形態では、試験化合物をＥＬＩＳＡプレート上に固定化することができ、本発明による可溶性のＰＡポリペプチド断片又はその変異体と接触させることができる。上記ポリペプチドの結合を、ＰＡポリペプチド断片特異的抗体と、上で説明されるような化学発光反応又は比色反応とにより検証することができる。
更なる１つの実施の形態において、精製されたインフルエンザＡ２００９パンデミックＨ１Ｎ１のＰＡポリペプチド断片又は変異体を、ペプチドアレイとともにインキュベートすることができ、ＰＡポリペプチド断片と、特異的なペプチド配列に対応する特異的なペプチドスポットとの結合を、例えばＰＡポリペプチド特異的抗体、ＰＡポリペプチド断片と融合したエピトープタグを対象とする抗体により、又はＰＡポリペプチド断片と結合した蛍光タグから放出された蛍光シグナルにより分析することができる。
別の実施の形態において、本発明による組換え宿主細胞を試験化合物と接触させる。これは、試験タンパク質又はポリペプチドの共発現と、例えば蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）又は免疫共沈降による相互作用の検証とにより達成することができる。別の実施の形態では、直接的に標識された試験化合物を、組換え宿主細胞の培地に添加することができる。試験化合物が膜を透過し、ＰＡポリペプチド断片と結合する可能性は、例えば上記ポリペプチドの免疫沈降と標識の存在の検証とにより検証することができる。
別の実施の形態では、インフルエンザＡ２００９パンデミックＨ１Ｎ１のＰＡサブユニットポリペプチド断片又はその変異体のヌクレオチド鎖切断活性を変調させる、好ましくは減少させる、より好ましくは阻害する試験化合物の能力を評価する。例えば、精製したＰＡサブユニットポリペプチド断片と、その基質、例えばパンハンドルＲＮＡ又は一本鎖ＤＮＡとを、様々な量の試験化合物の存在下又は非存在下で接触させ、或る特定の期間、例えば５分間、１０分間、１５分間、２０分間、３０分間、４０分間、６０分間又は９０分間インキュベートする。試験化合物の非存在下でＰＡサブユニットポリペプチドがヌクレオチド鎖切断活性を有するように反応条件を選択する。その後基質を、分解／ヌクレオチド鎖切断に関して、例えばゲル電気泳動により分析する。代替的には、このような試験は、基質分子がヌクレオチド鎖切断された場合にはシグナルをもたらすが基質分子が未変化である場合にはシグナルをもたらさない標識した基質分子を含み得る。例えば、基質ポリヌクレオチド鎖を、基質ポリヌクレオチド鎖が未変化である場合には蛍光レポーターが消光されるように、蛍光レポーター分子及び蛍光クエンチャーにより標識することができる。基質ポリヌクレオチド鎖が切断された場合には蛍光レポーター及びクエンチャーは分離し、したがって蛍光レポーターは、例えばＥＬＩＳＡリーダーにより検出することができるシグナルを放出する。この実験設定をマルチウェルプレート形式において適用することができ、この設定は、インフルエンザＡ２００９パンデミックＨ１Ｎ１のＰＡサブユニットポリペプチド断片又はその変異体のエンドヌクレアーゼ活性を変調させる、減少させる、又は阻害するその能力に関する化合物のハイスループットスクリーニングに好適である。
好ましくは、インフルエンザＡ２００９パンデミックＨ１Ｎ１のＰＡサブユニットポリペプチド断片又はその変異体のエンドヌクレアーゼ活性を阻害する試験化合物の能力を、上で記載した方法で分析する。
好ましい実施の形態では、インフルエンザＡ２００９パンデミックＨ１Ｎ１のＰＡサブユニットポリペプチド断片又はその変異体のヌクレオチド鎖切断活性部位と会合し、好ましくはこれを結合し、ヌクレオチド鎖切断活性を変調させる、減少させる、及び／又は阻害する化合物を同定する上で記載した方法を、ハイスループット設定において行う。好ましい実施の形態では、上記方法を、本発明によるＰＡポリペプチド断片又はその変異体及び標識した試験化合物を使用して、上で記載したようなマルチウェルマイクロタイタープレートにおいて実施する。
好ましい実施の形態では試験化合物は、合成化合物又は天然化合物のライブラリに由来する。例えば、合成化合物ライブラリは、Maybridge Chemical Co.（Trevillet,Cornwall,UK）、ChemBridge Corporation（SanDiego, CA）又はAldrich（Milwaukee,WI）から市販されている。天然化合物ライブラリは例えば、TimTecLLC（Newark, DE）より入手可能である。代替的に、細菌、真菌、植物及び動物の抽出物の形態の天然化合物のライブラリを使用することができる。さらに、試験化合物を、個々の化合物又は混合物のいずれかとして、コンビナトリアルケミストリを使用して合成的に作製することができる。
別の実施の形態において、インフルエンザＡ２００９パンデミックＨ１Ｎ１ウイルスのライフサイクルに対する同定した化合物の阻害効果をｉｎ ｖｉｖｏ設定で試験してもよい。２９３Ｔヒト胚腎臓細胞、Ｍａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙイヌ腎臓細胞又はトリ胚線維芽細胞等のインフルエンザウイルスに感染しやすい細胞株を、同定した化合物の存在下又は非存在下でインフルエンザＡ２００９パンデミックＨ１Ｎ１ウイルスに感染させることができる。好ましい実施の形態では、同定した化合物を、様々な濃度で細胞の培養培地に添加することができる。ウイルスプラーク形成を、インフルエンザＡ２００９パンデミックＨ１Ｎ１ウイルスの感染能に関する読出し情報（read out）として使用することができ、同定した化合物で処理した細胞と処理していない細胞との間で比較することができる。
本発明の更なる実施の形態において、上で説明される方法のいずれかで適用される試験化合物は小分子である。好ましい実施の形態では、上記小分子は、ライブラリ、例えば小分子阻害剤ライブラリに由来する。別の実施の形態では、上記試験化合物はペプチド又はタンパク質である。好ましい実施の形態では、上記ペプチド又はタンパク質は、ペプチドライブラリ又はタンパク質ライブラリに由来する。
上で説明される、本発明によるインフルエンザＡ２００９パンデミックＨ１Ｎ１のＰＡサブユニットポリペプチド断片又はその変異体のヌクレオチド鎖切断活性部位と会合し、好ましくはこれと結合し、ヌクレオチド鎖切断活性を変調させ、減少させ、及び／又は阻害する化合物を計算及びｉｎ ｖｉｔｒｏで同定する方法の別の実施の形態において、上記方法は、上記化合物又はその薬学的に許容可能な塩を、１つ又は複数の薬学的に許容可能な添加物及び／又は担体とともに配合する工程を更に含む。
既に上で言及したように、本発明によるインフルエンザＡ２００９パンデミックＨ１Ｎ１のＰＡサブユニット又はその変異体のエンドヌクレアーゼ活性を変調させることができ、好ましくはこれを減少させることができ、より好ましくはこれを阻害することができる化合物を提供することは、本発明の態様である。該化合物が、本発明によるＰＡサブユニット又はその変異体のエンドヌクレアーゼ活性を、上記ＰＡサブユニット又はその変異体のヌクレオチド鎖切断活性部位と会合することによって、好ましくはこれと結合することによって、変調させることができ、好ましくはこれを減少させることができ、より好ましくはこれを阻害することができることが好ましい。
本発明によるインフルエンザＡ２００９パンデミックＨ１Ｎ１のＰＡサブユニットポリペプチド断片又はその変異体のエンドヌクレアーゼ活性を変調させることができ、好ましくはこれを減少させることができ、より好ましくはこれを阻害することができる化合物を提供することも、本発明の態様である。該化合物が、本発明によるＰＡサブユニットポリペプチド断片又はその変異体のエンドヌクレアーゼ活性を、上記ＰＡサブユニットポリペプチド断片又はその変異体のヌクレオチド鎖切断活性部位と会合することによって、好ましくはこれと結合することによって、変調させることができ、好ましくはこれを減少させることができ、より好ましくはこれを阻害することができることが好ましい。
他のウイルス、好ましくはオルトミクソウイルス科、ブニヤウイルス科及び／又はアレナウイルス科のウイルスのＰＡサブユニットのエンドヌクレアーゼ活性を変調させることができ、好ましくはこれを減少させることができ、より好ましくはこれを阻害することができる化合物を提供することは、本発明の更なる態様である。該化合物が、他のウイルス、好ましくはオルトミクソウイルス科、ブニヤウイルス科及び／又はアレナウイルス科のウイルスのＰＡサブユニットのエンドヌクレアーゼ活性を、上記ＰＡサブユニットのヌクレオチド鎖切断活性部位と会合することによって、好ましくはこれと結合することによって、変調させることができ、好ましくはこれを減少させることができ、より好ましくはこれを阻害することができることが好ましい。
上で言及したＰＡサブユニット若しくはその変異体、若しくはＰＡサブユニットポリペプチド断片若しくはその変異体のヌクレオチド鎖切断活性部位と会合し、好ましくはこれと結合し、及び／又はＰＡサブユニット若しくはその変異体、若しくはＰＡサブユニットポリペプチド断片若しくはその変異体のヌクレオチド鎖切断活性を変調させ、好ましくはこれを減少させ、より好ましくはこれを阻害する或る化合物の能力は、容易に評価することができる。例えば、精製したＰＡサブユニット又はＰＡサブユニットポリペプチド断片とその基質、例えばパンハンドルＲＮＡ又は一本鎖ＤＮＡとを、様々な量の試験化合物の存在下又は非存在下で接触させ、或る特定の期間、例えば５分間、１０分間、１５分間、２０分間、３０分間、４０分間、６０分間又は９０分間インキュベートする。反応条件は、ＰＡサブユニット又はＰＡサブユニットポリペプチド断片が試験化合物の非存在下でヌクレオチド鎖切断活性を有するように選ぶ。その後、基質を、分解／ヌクレオチド鎖切断に関して、例えばゲル電気泳動によって分析する。代替的には、このような試験は、基質分子がヌクレオチド鎖切断された場合にはシグナルをもたらすが基質分子が未変化である場合にはシグナルをもたらさない標識した基質分子を含み得る。例えば、基質ポリヌクレオチド鎖を、基質ポリヌクレオチド鎖が未変化である場合には蛍光レポーターが消光されるように、蛍光レポーター分子及び蛍光クエンチャーを用いて標識することができる。基質ポリヌクレオチド鎖が切断された場合には蛍光レポーター及びクエンチャーは分離し、したがって蛍光レポーターは、例えばＥＬＩＳＡリーダーによって検出することができるシグナルを放出する。更なる好適な方法を以下に記載する。
好ましくは、上記化合物は、上で記載した（ｉｎ ｖｉｔｒｏの）方法によって同定可能である。より好ましくは、上記化合物は、上で記載した（ｉｎ ｖｉｔｒｏの）方法によって同定される。
上で記載した（ｉｎ ｖｉｔｒｏの）方法によって同定可能な化合物は、インフルエンザＡ２００９パンデミックＨ１Ｎ１のＰＡサブユニット又はその変異体のエンドヌクレアーゼ活性を変調させることができるものとする。上で記載した（ｉｎ ｖｉｔｒｏの）方法によって同定可能な化合物は、本発明によるインフルエンザＡ２００９パンデミックＨ１Ｎ１のＰＡサブユニットポリペプチド断片又はその変異体のエンドヌクレアーゼ活性を変調させることができるものとし、好ましくはこれを減少させることができるものとし、より好ましくはこれを阻害することができるものとする。
上で記載した（ｉｎ ｖｉｔｒｏの）方法によって同定可能な化合物が、他のウイルス、好ましくはオルトミクソウイルス科、ブニヤウイルス科及び／又はアレナウイルス科のウイルスのＰＡサブユニットのエンドヌクレアーゼ活性を変調させることができるものとし、好ましくはこれを減少させることができるものとし、最も好ましくはこれを阻害することができるものとすることも可能である。
本発明の化合物は、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏのスクリーニング方法のための、上で記載したような任意の作用物質であり得る。本発明による化合物の好ましい実施の形態では、化合物は、４−置換２−ジオキソブタン酸、４−置換４−ジオキソブタン酸、４−置換２，４−ジオキソブタン酸、２，６−ジケトピペラジン若しくはその誘導体、置換２，６−ジケトピペラジン若しくはその誘導体、ピラジン−２，６−ジオン若しくは置換ピラジン−２，６−ジオン、例えばフルチミド、Ｎ−ヒドロキサム酸、又はＮ−ヒドロキシミドではない。
特に、本発明による化合物は、式Ｉ：
Figure 2016189772
 による化合物ではない。
本発明による化合物の別の好ましい実施の形態では、化合物は、４−［３−［（４−クロロフェニル）メチル］−１−（フェニルメチル）−３−ピペリジニル］−２−ヒドロキシ−４−オキソ−２−ブテン酸、４−［４−［（４−クロロフェニル）メチル］−１−（シクロヘキシルメチル）−４−ピペリジニル］−２−ヒドロキシ−４−オキソ−２−ブテン酸、４−［３−［（４−クロロフェニル）メチル］−１−（フェニルメチルスルホ）−３−ピペリジニル］−２−ヒドロキシ−４−オキソ−２−ブテン酸、リボウリジン一リン酸（ｒＵＭＰ）、デスオキシ−チミジン一リン酸（monophosphate）（ｄＴＭＰ）、又は２．４−ジオキソ−４−フェニルブタン酸（ＤＰＢＡ）ではない。
本発明による化合物の更に好ましい実施の形態では、化合物は、カテキンではなく、好ましくは（−）−エピガロカテキンガレート（ＥＧＣＧ）、例えば［（２Ｒ，３Ｒ）−５，７−ジヒドロキシ−２−（３，４，５−トリヒドロキシフェニル）クロマン−３−イル］３，４，５−トリヒドロキシベンゾエート、（−）−エピカテキンガレート（ＥＣＧ）、（−）−エピガロカテキン（ＥＧＣ）、（−）−エピカテキン（ＥＣ）又は没食子酸（ＧＡ）ではない。本発明の化合物の別の好ましい実施の形態では、化合物は、フェネチルフェニルフタルイミド、サリドマイド又はラルテグラビルから誘導されるフェネチルフェニルフタルイミド類似体（また、ジケトブタン酸誘導体）ではない。
上で言及した本発明の化合物又はその薬学的に許容可能な塩を含む薬学的組成物を提供することは、本発明の一態様である。上で言及した本発明の化合物又はその薬学的に許容可能な塩と、１つ又は複数の薬学的に許容可能な添加物及び／又は担体とを含む薬学的組成物を提供することも、本発明の一態様である。
既に上で言及したように、本発明の薬学的組成物に含まれる化合物は、（ｉ）本発明によるインフルエンザＡ２００９パンデミックＨ１Ｎ１のＰＡサブユニット若しくはその変異体のエンドヌクレアーゼ活性を、例えば上記サブユニット若しくはその変異体のヌクレオチド鎖切断活性部位と結合することによって、変調させることができ、好ましくはこれを減少させることができ、より好ましくはこれを阻害することができ、（ｉｉ）本発明によるインフルエンザＡ２００９パンデミックＨ１Ｎ１のＰＡサブユニットポリペプチド断片若しくはその変異体のエンドヌクレアーゼ活性を、例えば上記ポリペプチド断片若しくはその変異体のヌクレオチド鎖切断活性部位と結合することによって、変調させることができ、好ましくはこれを減少させることができ、より好ましくはこれを阻害することができ、又は（ｉｉｉ）他のウイルス、好ましくはオルトミクソウイルス科、ブニヤウイルス科及び／若しくはアレナウイルス科のウイルスのＰＡサブユニットのエンドヌクレアーゼ活性を、例えば上記ＰＡサブユニットのヌクレオチド鎖切断活性部位と結合することによって、変調させることができ、好ましくはこれを減少させることができ、より好ましくはこれを阻害することができる。好ましくは、本発明の薬学的組成物に含まれる化合物は、上で記載した方法によって同定可能である。より好ましくは、本発明の薬学的組成物に含まれる化合物は、上で記載した方法によって同定される。
好ましくは、上記薬学的組成物（複数も可）は、上で言及した方法によって製造可能である。
本発明による化合物を単独で投与することができるが、ヒト療法では概して、意図される投与経路及び標準的な薬務に関して選択される好適な薬学的な添加物、希釈剤又は担体と混合して投与する（以下を参照されたい）。
本発明によるインフルエンザＡ２００９パンデミックＨ１Ｎ１のＰＡサブユニットポリペプチド断片又はその変異体のヌクレオチド鎖切断活性部位に関する結合パートナー、ヌクレオチド鎖切断活性の変調剤及び／又は阻害剤のコンピュータによるモデリング又はスクリーニングの態様において、調合薬として投与される分子に有益であり得る化学的分子部分を対象の分子に導入することが可能であり得る。例えば、分子と標的領域との結合には直接影響し得ないが、例えば薬学的に許容可能な担体における分子の溶解度全体、分子のバイオアベイラビリティ、及び／又は分子の毒性に寄与する化学的分子部分を対象の分子に導入する、又は化学的分子部分を対象の分子から除外することが可能であり得る。対象の分子の薬理を最適化するための検討事項及び方法は、例えば"Goodman and Gilman's The Pharmacological BasisofTherapeutics", 8th Edition, Goodman, Gilman, Rall, Nies,&Taylor, Eds., Pergamon Press（1985）、Jorgensen & Duffy, 2000, Bioorg. Med. Chem. Lett. 10:1155-1158に見出すことができる。さらに、対象の有機分子の物理的に重要となる記載及び薬学的に関連する特性に関する迅速な予測を提供するのに、コンピュータプログラム「Ｑｉｋ Ｐｒｏｐ」を使用することができる。新たに合成された化合物の経口吸収を推測するのに、「５の法則（Rule of Five）」見込み法を使用することができる（Lipinskietal., 1997, Adv. Drug Deliv. Rev. 23:3-25）。ファーマコフォアの選択及び設計に好適なプログラムとしては、（ｉ）ＤＩＳＣＯ（Abbot Laboratories（Abbot Park, IL））、（ｉｉ）Ｃａｔａｌｙｓｔ（Bio-CAD Corp.（Mountain View, CA））及び（ｉｉｉ）Ｃｈｅｍ ＤＢＳ−３Ｄ（Chemical Design Ltd.（Oxford, UK））が挙げられる。
本発明で考慮される薬学的組成物を、当業者にとって既知の様々な方法で配合することができる。例えば、本発明の薬学的組成物は、錠剤、ピル、カプセル（軟ゲルカプセルを含む）、カシェ剤、ロゼンジ、腔坐剤、粉末、顆粒若しくは坐剤の形態のような固体形態、又はエリキシル、溶液、エマルション若しくは懸濁液の形態のような液体形態であり得る。
固体投与形態は、微小結晶性セルロース、ラクトース、クエン酸ナトリウム、炭酸カルシウム、二塩基性リン酸カルシウム、グリシン及びデンプン（好ましくはトウモロコシ、ジャガイモ又はタピオカのデンプン）等の添加物、デンプングリコール酸ナトリウム、クロスカルメロースナトリウム及び或る特定のケイ酸錯体等の崩壊剤、並びにポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）、スクロース、ゼラチン及びアカシア等の造粒結合剤を含有し得る。さらに、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、ベヘン酸グリセリル及びタルク等の平滑剤が含まれ得る。類似の種類の固体組成物をゼラチンカプセルにおける充填剤として利用してもよい。これに関する好ましい添加物としては、ラクトース、デンプン、セルロース、乳糖又は高分子量のポリエチレングリコールが挙げられる。
経口投与に適した水性の懸濁液、溶液、エリキシル及びエマルションに関して、化合物を、様々な甘味料又は香料、着色物質又は色素、乳化剤及び／又は懸濁化剤、及び水、エタノール、プロピレングリコール及びグリセリン等の希釈剤、並びにそれらの組合せと組み合わせることができる。
本発明の薬学的組成物は、例えば、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、酢酸セルロース、ポリエチレンオキシド、キサンタンガム、カルボマー、アンモニオメタクリレートコポリマー、硬化ヒマシ油、カルナバワックス、パラフィンワックス、酢酸フタル酸セルロース、フタル酸ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メタクリル酸コポリマー、及びそれらの混合物を含む放出速度調整剤を含有し得る。
本発明の薬学的組成物は、即時分散性又は溶解性の剤形配合物（fast dispersing ordissolving dosage formulations）（ＦＤＤＦ）の形態であってもよく、以下の成分を含有し得る：アスパルテーム、アセスルファムカリウム、クエン酸、クロスカルメロースナトリウム、クロスポビドン、ジアスコルビン酸、アクリル酸エチル、エチルセルロース、ゼラチン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ステアリン酸マグネシウム、マンニトール、メタクリル酸メチル、ミント香料、ポリエチレングリコール、ヒュームドシリカ、二酸化ケイ素、デンプングリコール酸ナトリウム、ステアリルフマル酸ナトリウム、ソルビトール、キシリトール。
坐剤を調製するために、初めに脂肪酸グリセリド又はココアバターの混合物等の低融点ワックスを融解させ、撹拌等により、活性成分をこの中に均一に分散させる。それから融解した均一混合物を手頃な大きさの鋳型に入れ、冷却することにより、固体化させる。
非経口投与に好適な本発明の薬学的組成物は、滅菌水溶液の形態で使用することが最良とされ、これには他の物質、例えばこの溶液を血液と等張にするのに十分な塩又はグルコースが含有されていてもよい。必要に応じて、水溶液を好適に緩衝させる（好ましくは３〜９のｐＨに）必要がある。
鼻腔内投与及び吸入による投与に好適な薬学的組成物は、例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、１，１，１，２−テトラフルオロエタン（ＨＦＡ １３４Ａ．ＴＭ．）若しくは１，１，１，２，３，３，３−ヘプタフルオロプロパン（ＨＦＡ ２２７ＥＡ．ＴＭ．）等のヒドロフルオロアルカン、二酸化炭素、又は別の好適なガス等の好適な推進剤を使用して、加圧容器、ポンプ、スプレー又はネブライザから、乾燥粉末吸入剤又はエアロゾル噴霧剤の形態で送達されることが最良とされる。加圧容器、ポンプ、スプレー又はネブライザは、例えば溶媒としてエタノールと推進剤との混合物を使用して、活性化合物の溶液又は懸濁液を含有していてもよく、平滑剤、例えばトリオレイン酸ソルビタンを更に含有していてもよい。
別の態様では、本発明は、配列番号２によるインフルエンザＡ２００９パンデミックＨ１Ｎ１ウイルスのＰＡサブユニット又はその変異体の活性部位を対象とする抗体であって、上記変異体が、配列番号２によるアミノ酸位置１８６に又はそれに対応するアミノ酸位置にアミノ酸セリンを含む、配列番号２によるインフルエンザＡ２００９パンデミックＨ１Ｎ１ウイルスのＰＡサブユニット又はその変異体の活性部位を対象とする抗体を提供する。
好ましい実施の形態では、上記抗体は、配列番号２に示すようなアミノ酸配列の配列番号４〜配列番号１１によって規定されるポリペプチド、すなわちアミノ酸２０〜３０（配列番号４）、アミノ酸３２〜４０（配列番号５）、アミノ酸４１〜５１（配列番号６）、アミノ酸８０〜９０（配列番号７）、アミノ酸１００〜１１０（配列番号８）、アミノ酸１１５〜１２５（配列番号９）、アミノ酸１３０〜１４０（配列番号１０）及びアミノ酸１７６〜１８６（配列番号１１）の群から選択されるポリペプチド断片の認識によってエンドヌクレアーゼドメインを認識する。
具体的には、上記抗体は、活性部位を規定する上で示したアミノ酸のうちの１つ又は複数を含むエピトープと特異的に結合する。この関連で、「エピトープ」という用語は、その技術分野で認識される意味を有し、好ましくは４個〜２０個のアミノ酸、好ましくは５個〜１８個、５個〜１５個又は７個〜１４個のアミノ酸のストレッチ、例えば４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個又は２０個のアミノ酸のストレッチを表す。したがって、好ましいエピトープは、４個〜２０個、５個〜１８個、好ましくは５個〜１５個若しくは７個〜１４個のアミノ酸の長さを有し、例えば４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個若しくは２０個のアミノ酸の長さを有し、並びに／又は配列番号２のＬｙｓ３４、Ｇｌｕ２６、Ｉｌｅ３８、Ｔｙｒ２４、Ｈｉｓ４１、Ｇｌｕ８０、Ａｒｇ８４、Ｌｅｕ１０６、Ａｓｐ１０８、Ｇｌｕ１１９、Ｉｌｅ１２０、Ａｒｇ１２４、Ｔｙｒ１３０、Ｌｙｓ１３４、Ｐｈｅ１０５及びＬｙｓ１３７のうちの１つ若しくは複数、若しくは１つ若しくは複数の対応するアミノ酸を含む。したがって、好ましい実施の形態では、上記抗体は、配列番号２に示すようなアミノ酸配列の５個〜１５個のアミノ酸の長さのポリペプチド断片を認識し、該ポリペプチド断片は、Ｌｙｓ３４、Ｇｌｕ２６、Ｉｌｅ３８、Ｔｙｒ２４、Ｈｉｓ４１、Ｇｌｕ８０、Ａｒｇ８４、Ｌｅｕ１０６、Ａｓｐ１０８、Ｇｌｕ１１９、Ｉｌｅ１２０、Ｔｙｒ１３０、Ｌｙｓ１３４、Ｐｈｅ１０５、Ｌｙｓ１３７及びＡｒｇ１２４からなる群から選択される１つ又は複数のアミノ酸残基を含む。
本発明の抗体は、モノクローナル抗体若しくはポリクローナル抗体又はその一部分であり得る。抗原結合部分は、組換えＤＮＡ技法により、又は無傷抗体の酵素的切断若しくは化学的切断により作製することができる。幾つかの実施の形態では、抗原結合部分は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｖ、ｄＡｂ、及び相補性決定領域（ＣＤＲ）断片、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、キメラ抗体、例えばヒト化抗体、ダイアボディ、並びにポリペプチドとの特異的な抗原結合をもたらすのに十分な抗体の少なくとも一部分を含有するポリペプチドを含む。本発明の抗体は、標準的なプロトコルに従って生成される。例えば、ポリクローナル抗体を、当業者に既知の標準的な方法に従って、任意にアジュバント、例えばフロイント完全アジュバント若しくはフロイント不完全アジュバント、ＲＩＢＩ（ムラミルジペプチド）、又はＩＳＣＯＭ（免疫刺激複合体）と組み合わせて、対象の抗原により動物、例えばマウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、ウシ又はウマを免疫付与することにより生成することができる。インフルエンザＡ２００９パンデミックＨ１Ｎ１のＰＡ又はその断片のエンドヌクレアーゼドメインを対象とするポリクローナル抗血清を、免疫付与した動物を採血（bleeding）又は屠殺することにより動物から得る。（ｉ）血清を動物から得たままの状態で使用することができ、（ｉｉ）免疫グロブリン画分を血清から得ることができ、又は（ｉｉｉ）インフルエンザＡ２００９パンデミックＨ１Ｎ１のＰＡ若しくはその断片のエンドヌクレアーゼドメインに対して特異的な抗体を血清から精製することができる。モノクローナル抗体を、当業者に既知の方法により生成することができる。簡潔に述べると、免疫付与後に動物を屠殺し、当該技術分野で既知の任意の手段によりリンパ節及び／又は脾臓Ｂ細胞を不死化する。細胞を不死化する方法は、癌遺伝子で細胞をトランスフェクトすること、細胞に腫瘍ウイルスを感染させるとともに不死化した細胞に関して選択する条件下で細胞を培養すること、細胞を発癌性化合物又は突然変異性化合物に曝露すること（subjecting）、細胞を不死化した細胞（例えば骨髄腫細胞）と融合させること、並びに腫瘍抑制遺伝子を不活性化させることを含むがこれらに限定されない。不死化した細胞を、Ｈ１Ｎ１のＰＡエンドヌクレアーゼドメイン又はその断片を使用してスクリーニングする。Ｈ１Ｎ１のＰＡエンドヌクレアーゼドメイン又はその断片を対象とする抗体を産生する細胞、例えばハイブリドーマを選択し、クローニングし、堅固な成長、高い抗体産生及び所望の抗体特性を含む所望の特性に関して更にスクリーニングする。ハイブリドーマを、（ｉ）ｉｎ ｖｉｖｏでは同系動物において、（ｉｉ）免疫系を欠く動物、例えばヌードマウスで、又は（ｉｉｉ）ｉｎ ｖｉｔｒｏでは細胞培養液で増殖させることができる。ハイブリドーマを選択し、クローニングし、増殖させる方法は、当業者に既知である。当業者は、抗体の生成に関する支援のために、標準的なテキスト、例えば“Antibodies: ALaboratory Manual”,Harlow and Lane, Eds., Cold SpringHarbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor,New York （1990）（参照により本明細書中に援用される）を参照することができる。
別の態様では、本発明は、オルトミクソウイルス科、ブニヤウイルス科及び／又はアレナウイルス科のウイルスによるウイルス感染によって引き起こされ、好ましくはインフルエンザＡ２００９パンデミックＨ１Ｎ１ウイルスによるウイルス感染によって引き起こされる疾患状態を治療、改善又は予防する薬物の生産のための、本発明による（accordingto）化合物（複数も可）、本発明による薬学的組成物（複数も可）、又は本発明による抗体の使用に関する。
上記化合物は、（ｉ）本発明によるインフルエンザＡ２００９パンデミックＨ１Ｎ１のＰＡサブユニット若しくはその変異体のエンドヌクレアーゼ活性を、例えば上記ＰＡサブユニット若しくはその変異体のヌクレオチド鎖切断活性部位と結合することによって、変調させることができ、好ましくはこれを減少させることができ、より好ましくはこれを阻害することができ、（ｉｉ）本発明によるインフルエンザＡ２００９パンデミックＨ１Ｎ１のＰＡサブユニットポリペプチド断片若しくはその変異体のエンドヌクレアーゼ活性を、例えば上記ＰＡサブユニットポリペプチド断片若しくはその変異体のヌクレオチド鎖切断活性部位と結合することによって、変調させることができ、好ましくはこれを減少させることができ、より好ましくはこれを阻害することができ、又は（ｉｉｉ）他のウイルス、好ましくはオルトミクソウイルス科、ブニヤウイルス科及び／若しくはアレナウイルス科のウイルスのＰＡサブユニットのエンドヌクレアーゼ活性を、例えば上記ＰＡサブユニットのヌクレオチド鎖切断活性部位と結合することによって、変調させることができ、好ましくはこれを減少させることができ、より好ましくはこれを阻害することができる。
上記化合物（複数も可）が、上で記載した方法によって同定可能であることが好ましい。上記薬学的組成物（複数も可）が、上で言及した方法によって製造可能であることが更に好ましい。したがって、好ましくは、本発明は、オルトミクソウイルス科、ブニヤウイルス科及び／又はアレナウイルス科のウイルスによるウイルス感染によって引き起こされ、好ましくはインフルエンザＡ２００９パンデミックＨ１Ｎ１ウイルスによるウイルス感染によって引き起こされる疾患状態を治療、改善又は予防する薬物の生産のための、インフルエンザＡ２００９パンデミックＨ１Ｎ１のＰＡサブユニットポリペプチド断片若しくはその変異体のヌクレオチド鎖切断活性部位と結合することができ、及び／若しくはインフルエンザＡ２００９パンデミックＨ１Ｎ１のＰＡサブユニットポリペプチド断片若しくはその変異体のヌクレオチド鎖切断活性を変調させることができ、好ましくはこれを減少させることができ、より好ましくはこれを阻害することができる、上で記載した方法によって同定可能な化合物、又は上で言及した方法によって製造可能な薬学的組成物の使用に関する。
更なる態様では、本発明は、オルトミクソウイルス科、ブニヤウイルス科及び／又はアレナウイルス科のウイルスによるウイルス感染によって引き起こされ、好ましくはインフルエンザＡ２００９パンデミックＨ１Ｎ１ウイルスによるウイルス感染によって引き起こされる疾患状態を治療、改善又は予防するための、本発明による化合物（複数も可）、本発明による薬学的組成物（複数も可）、又は本発明による抗体に関する。
上記化合物は、（ｉ）本発明によるインフルエンザＡ２００９パンデミックＨ１Ｎ１のＰＡサブユニット若しくはその変異体のエンドヌクレアーゼ活性を、例えば上記ＰＡサブユニット若しくはその変異体のヌクレオチド鎖切断活性部位と結合することによって、変調させることができ、好ましくはこれを減少させることができ、より好ましくはこれを阻害することができ、（ｉｉ）本発明によるインフルエンザＡ２００９パンデミックＨ１Ｎ１のＰＡサブユニットポリペプチド断片若しくはその変異体のエンドヌクレアーゼ活性を、例えば上記ＰＡサブユニットポリペプチド断片若しくはその変異体のヌクレオチド鎖切断活性部位と結合することによって、変調させることができ、好ましくはこれを減少させることができ、より好ましくはこれを阻害することができ、又は（ｉｉｉ）他のウイルス、好ましくはオルトミクソウイルス科、ブニヤウイルス科及び／若しくはアレナウイルス科のウイルスのＰＡサブユニットのエンドヌクレアーゼ活性を、例えば上記ＰＡサブユニットのヌクレオチド鎖切断活性部位と結合することによって、変調させることができ、好ましくはこれを減少させることができ、より好ましくはこれを阻害することができる。
上記化合物（複数も可）が、上で記載した方法によって同定可能であることが好ましい。上記薬学的組成物（複数も可）が、上で言及した方法によって製造可能であることが更に好ましい。したがって、好ましくは、本発明は、オルトミクソウイルス科、ブニヤウイルス科及び／又はアレナウイルス科のウイルスによるウイルス感染によって引き起こされ、好ましくはインフルエンザＡ２００９パンデミックＨ１Ｎ１ウイルスによるウイルス感染によって引き起こされる疾患状態を治療、改善又は予防するための、インフルエンザＡ２００９パンデミックＨ１Ｎ１のＰＡサブユニットポリペプチド断片若しくはその変異体のヌクレオチド鎖切断活性部位と結合することができ、及び／若しくはインフルエンザＡ２００９パンデミックＨ１Ｎ１のＰＡサブユニットポリペプチド断片若しくはその変異体のヌクレオチド鎖切断活性を変調させることができ、好ましくはこれを減少させることができ、より好ましくはこれを阻害することができる、上で記載した方法によって同定可能な化合物、又は上で言及した方法によって製造可能な薬学的組成物に関する。
別の態様では、本発明は、インフルエンザＡ２００９パンデミックＨ１Ｎ１ウイルスによるウイルス感染によって引き起こされる疾患状態を治療、改善又は予防する薬物の生産のための、化合物４−［３−［（４−クロロフェニル）メチル］−１−（フェニルメチル）−３−ピペリジニル］−２−ヒドロキシ−４−オキソ−２−ブテン酸（ＥＭＢＬ−Ｒ０５−３）、化合物４−［４−［（４−クロロフェニル）メチル］−１−（シクロヘキシルメチル）−４−ピペリジニル］−２−ヒドロキシ−４−オキソ−２−ブテン酸（ＥＭＢＬ−Ｒ０５−２）、化合物４−［３−［（４−クロロフェニル）メチル］−１−（フェニルメチルスルホ）−３−ピペリジニル］−２−ヒドロキシ−４−オキソ−２−ブテン酸（ＥＭＢＬ−Ｒ０５−１）又は化合物［（２Ｒ，３Ｒ）−５，７−ジヒドロキシ−２−（３，４，５−トリヒドロキシフェニル）クロマン−３−イル］３，４，５−トリヒドロキシベンゾエート（ＥＧＣＧ）の使用に関するが、これは、本発明の発明者らによって、上記化合物が、インフルエンザＡ２００９パンデミックＨ１Ｎ１のＰＡサブユニットポリペプチド断片又はその変異体のヌクレオチド鎖切断活性部位と結合することができ、インフルエンザＡ２００９パンデミックＨ１Ｎ１のＰＡサブユニットポリペプチド断片又はその変異体のヌクレオチド鎖切断活性を変調させることができ、すなわちこれを阻害することができることが見つけ出されたためである。
更なる一態様では、本発明は、インフルエンザＡ２００９パンデミックＨ１Ｎ１ウイルスによるウイルス感染によって引き起こされる疾患状態を治療、改善又は予防するための、４−［３−［（４−クロロフェニル）メチル］−１−（フェニルメチル）−３−ピペリジニル］−２−ヒドロキシ−４−オキソ−２−ブテン酸（ＥＭＢＬ−Ｒ０５−３）、４−［４−［（４−クロロフェニル）メチル］−１−（シクロヘキシルメチル）−４−ピペリジニル］−２−ヒドロキシ−４−オキソ−２−ブテン酸（ＥＭＢＬ−Ｒ０５−２）、４−［３−［（４−クロロフェニル）メチル］−１−（フェニルメチルスルホ）−３−ピペリジニル］−２−ヒドロキシ−４−オキソ−２−ブテン酸（ＥＭＢＬ−Ｒ０５−１）又は［（２Ｒ，３Ｒ）−５，７−ジヒドロキシ−２−（３，４，５−トリヒドロキシフェニル）クロマン−３−イル］３，４，５−トリヒドロキシベンゾエート（ＥＧＣＧ）に関する。
別の態様では、本発明は、インフルエンザＡ２００９パンデミックＨ１Ｎ１ウイルスによるウイルス感染によって引き起こされる疾患状態を治療、改善又は予防するための、４−置換２，４−ジオキソブタン酸化合物又は緑茶カテキンの使用に関する。
上記疾患状態を治療、改善又は予防するために、本発明の薬物を、動物患者、好ましくは哺乳動物患者、好ましくはヒト患者に、経口的に、口腔に、舌下に、鼻腔内に、肺経路を介して、例えば吸入により、直腸経路を介して、又は非経口的に、例えば陰茎海綿体内に（intracavernosally）、静脈内に、動脈内に、腹腔内に、髄腔内に、心室内に、尿道内に（intraurethrally）、胸骨内に（intrasternally）、脳内に（intracranially）、筋肉内に、若しくは皮下に投与することができ、本発明の薬物を、点滴法又は無針注射法により投与することができる。
本発明の薬学的組成物を、当業者に既知の様々な方法で、また上で記載したように、配合することができる。
薬学的調製物は単位投薬形態であるのが好ましい。かかる形態では、調製物を適当な量の活性成分を含有する単位用量に更に分割する。単位投薬形態は、パッケージングされた調製物、別々の量の調製物を含有するパッケージ、例えばバイアル又はアンプル中に入れられた錠剤、カプセル及び粉末であり得る。また、単位投薬形態自体がカプセル、錠剤、カシェ剤又はロゼンジであってもよく、又は単位投薬形態はパッケージングされた形態である適当な数のこれらのいずれかであってもよい。
本発明の使用において投与される単位投薬調製物における活性成分の量は、特定の用途及び活性成分の効力に応じて約１ｍｇ／ｍ２〜約１０００ｍｇ／ｍ２、好ましくは約５ｍｇ／ｍ２〜約１５０ｍｇ／ｍ２に変更又は調整することができる。
本発明の医学的使用に利用される化合物を、１日当たり約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇの初期投与量で投与する。約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約２ｍｇ／ｋｇの範囲の１日用量が好ましく、約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇの範囲の１日用量が最も好ましい。しかしながら投与量は、患者の要求、治療対象の状態の重症度、及び利用される化合物に応じて変わり得る。特定の状況に対する適切な投与量の決定は実践者の技能の範囲内である。概して、治療は化合物の最適用量未満のより少ない投与量から始める。その後、或る環境下で最適な効果に到達するまで、投与量を少しずつ増大させる。必要に応じて、便宜的に、１日の総投与量を分割し、１日の間で何回かに分けて（in portions）投与することができる。
本発明の範囲を逸脱しない本発明の様々な修正形態及び変形形態が、当業者に明らかであろう。特定の好ましい実施の形態との関連において本発明を説明したが、特許請求される発明がこのような特定の実施の形態に不当に限定されないことを理解すべきである。実際に、関連技術分野の当業者に明らかな本発明を実施するために記載された様式の様々な修正形態が、本発明に包含されることが意図される。
添付の図面及び以下の実施例は、単に本発明を例示するものであり、添付の特許請求の範囲によって示される本発明の範囲を限定するものとは決して解釈すべきでない。
Native H1N1polypeptide fragment (Chain A) 図１：ネイティブのＨ１Ｎ１ポリペプチド断片（鎖Ａ） 化合物が結合していない配列番号２に示すアミノ酸配列のアミノ酸１〜１９８によるＰＡポリペプチド断片のアミノ酸１〜１９８（ＰＡ（Ｈ１Ｎ１）１〜１９８）に関する精密な原子構造座標のリストである。各々の構造に関して、結晶学的非対称単位（ＡＳＵ）に、概してＡ、Ｂ、Ｃ及びＤと示す４つの分子が存在する。しかしながら、図１には、選択した分子を１つだけ示す（以下を参照されたい）。ファイルヘッダは、構造精密化に関する情報を与える。「Ａｔｏｍ」は、座標が測定される元素を表す。そのカラムの最初の文字は、元素を規定する。それぞれのアミノ酸の３文字コード及びアミノ酸配列の位置が示される。「Ａｔｏｍ」のラインにおける最初の３つの値は、測定された元素の原子位置を規定する。４つ目の値は占有率に相当し、５つ目（最後）の値は温度因子（Ｂ因子）である。占有因子は、各原子が座標によって特定される位置を占有する分子の割合（fraction）を表す。値「１」は、各原子が、結晶の全ての同等の分子において同じ立体配座、すなわち同じ位置を有することを示す。Ｂは、その原子中心の周りの原子の動きの尺度となる熱的因子である。この命名は、タンパク質データバンク（ＰＤＢ）形式に対応する。図１は、標準的なタンパク質データバンク（ＰＤＢ）形式におけるネイティブの（すなわち、化合物／リガンドを有しない）Ｈ１Ｎ１のＰＡエンドヌクレアーゼドメインの構造座標のリストである。非対称単位由来の鎖Ａ（二価の陽イオン、すなわち１つのマグネシウムイオン及び１つのマンガンイオン、並びに水分子が会合した）のみが含まれる。鎖Ｂ、鎖Ｃ及び鎖Ｄは非常に類似している。 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 同上 H1N1 polypeptide fragment (ChainA) with boundEMBL-R05-3 図２：ＥＭＢＬ−Ｒ０５−３が結合したＨ１Ｎ１ポリペプチド断片（鎖Ａ） 化合物が結合した配列番号２に示すアミノ酸配列のアミノ酸１〜１９８によるＰＡポリペプチド断片のアミノ酸１〜１９８（ＰＡ（Ｈ１Ｎ１）１〜１９８）に関する精密な原子構造座標のリストである。各々の構造に関して、結晶学的非対称単位（ＡＳＵ）に、概してＡ、Ｂ、Ｃ及びＤと示す４つの分子が存在する。しかしながら、図２には、選択した分子を１つだけ示す（以下を参照されたい）。ファイルヘッダは、構造精密化に関する情報を与える。「Ａｔｏｍ」は、座標が測定される元素を表す。そのカラムの最初の文字は、元素を規定する。それぞれのアミノ酸の３文字コード及びアミノ酸配列の位置が示される。「Ａｔｏｍ」のラインにおける最初の３つの値は、測定された元素の原子位置を規定する。４つ目の値は占有率に相当し、５つ目（最後）の値は温度因子（Ｂ因子）である。占有因子は、各原子が座標によって特定される位置を占有する分子の割合を表す。値「１」は、各原子が、結晶の全ての同等の分子において同じ立体配座、すなわち同じ位置を有することを示す。Ｂは、その原子中心の周りの原子の動きの尺度となる熱的因子である。この命名は、タンパク質データバンク（ＰＤＢ）形式に対応する。図２は、標準的なタンパク質データバンク（ＰＤＢ）形式における４−［３−［（４−クロロフェニル）メチル］−１−（フェニルメチル）−３−ピペリジニル］−２−ヒドロキシ−４−オキソ−２−ブテン酸（ＥＭＢＬ−Ｒ０５−３）が結合したＨ１Ｎ１のＰＡエンドヌクレアーゼドメインの構造座標のリストである。非対称単位由来の鎖Ａ（二価の陽イオン、すなわち２つのマンガンイオン、及び水分子が会合した）のみが含まれる。化合物ＥＭＢＬ−Ｒ０５−３は残基記述子ｃｉ３を有する。 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 同上 H1N1 polypeptide fragment (ChainD) with boundEMBL-R05-3 図３：ＥＭＢＬ−Ｒ０５−３が結合したＨ１Ｎ１ポリペプチド断片（鎖Ｄ） 化合物が結合した配列番号２に示すアミノ酸配列のアミノ酸１〜１９８によるＰＡポリペプチド断片のアミノ酸１〜１９８（ＰＡ（Ｈ１Ｎ１）１〜１９８）に関する精密な原子構造座標のリストである。各々の構造に関して、結晶学的非対称単位（ＡＳＵ）に、概してＡ、Ｂ、Ｃ及びＤと示す４つの分子が存在する。しかしながら、図３には、選択した分子を１つだけ示す（以下を参照されたい）。ファイルヘッダは、構造精密化に関する情報を与える。「Ａｔｏｍ」は、座標が測定される元素を表す。そのカラムの最初の文字は、元素を規定する。それぞれのアミノ酸の３文字コード及びアミノ酸配列の位置が示される。「Ａｔｏｍ」のラインにおける最初の３つの値は、測定された元素の原子位置を規定する。４つ目の値は占有率に相当し、５つ目（最後）の値は温度因子（Ｂ因子）である。占有因子は、各原子が座標によって特定される位置を占有する分子の割合を表す。値「１」は、各原子が、結晶の全ての同等の分子において同じ立体配座、すなわち同じ位置を有することを示す。Ｂは、その原子中心の周りの原子の動きの尺度となる熱的因子である。この命名は、タンパク質データバンク（ＰＤＢ）形式に対応する。図３は、標準的なタンパク質データバンク（ＰＤＢ）形式における４−［３−［（４−クロロフェニル）メチル］−１−（フェニルメチル）−３−ピペリジニル］−２−ヒドロキシ−４−オキソ−２−ブテン酸（ＥＭＢＬ−Ｒ０５−３）が結合したＨ１Ｎ１のＰＡエンドヌクレアーゼドメインの構造座標のリストである。非対称単位由来の鎖Ｄ（二価の陽イオン、すなわち２つのマンガンイオン、及び水分子が会合した）のみが含まれる。化合物ＥＭＢＬ−０５−０３は、鎖Ａにおけるもの（図２）と異なる立体配置を有する。上記化合物は残基記述子ｃｉ３を有する。 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 同上 H1N1 polypeptide fragment (ChainA) with boundEMBL-R05-2 図４：ＥＭＢＬ−Ｒ０５−２が結合したＨ１Ｎ１ポリペプチド断片（鎖Ａ） 化合物が結合した配列番号２に示すアミノ酸配列のアミノ酸１〜１９８によるＰＡポリペプチド断片のアミノ酸１〜１９８（ＰＡ（Ｈ１Ｎ１）１〜１９８）に関する精密な原子構造座標のリストである。各々の構造に関して、結晶学的非対称単位（ＡＳＵ）に、概してＡ、Ｂ、Ｃ及びＤと示す４つの分子が存在する。しかしながら、図４には、選択した分子を１つだけ示す（以下を参照されたい）。ファイルヘッダは、構造精密化に関する情報を与える。「Ａｔｏｍ」は、座標が測定される元素を表す。そのカラムの最初の文字は、元素を規定する。それぞれのアミノ酸の３文字コード及びアミノ酸配列の位置が示される。「Ａｔｏｍ」のラインにおける最初の３つの値は、測定された元素の原子位置を規定する。４つ目の値は占有率に相当し、５つ目（最後）の値は温度因子（Ｂ因子）である。占有因子は、各原子が座標によって特定される位置を占有する分子の割合を表す。値「１」は、各原子が、結晶の全ての同等の分子において同じ立体配座、すなわち同じ位置を有することを示す。Ｂは、その原子中心の周りの原子の動きの尺度となる熱的因子である。この命名は、タンパク質データバンク（ＰＤＢ）形式に対応する。図４は、標準的なタンパク質データバンク（ＰＤＢ）形式における４−［４−［（４−クロロフェニル）メチル］−１−（シクロヘキシルメチル）−４−ピペリジニル］−２−ヒドロキシ−４−オキソ−２−ブテン酸（ＥＭＢＬ−Ｒ０５−２）が結合したＨ１Ｎ１のＰＡエンドヌクレアーゼドメインの構造座標のリストである。非対称単位由来の鎖Ａ（二価の陽イオン、すなわち２つのマンガンイオン、及び水分子が会合した）のみが含まれる。鎖Ｂ、鎖Ｃ及び鎖Ｄは非常に類似している。化合物ＥＭＢＬ−Ｒ０５−２は残基記述子ｃｉ２を有する。 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 同上 H1N1 polypeptide fragment (ChainA) with boundrUMP 図５：ｒＵＭＰが結合したＨ１Ｎ１ポリペプチド断片（鎖Ａ） 化合物が結合した配列番号２に示すアミノ酸配列のアミノ酸１〜１９８によるＰＡポリペプチド断片のアミノ酸１〜１９８（ＰＡ（Ｈ１Ｎ１）１〜１９８）に関する精密な原子構造座標のリストである。各々の構造に関して、結晶学的非対称単位（ＡＳＵ）に、概してＡ、Ｂ、Ｃ及びＤと示す４つの分子が存在する。しかしながら、図５には、選択した分子を１つだけ示す（以下を参照されたい）。ファイルヘッダは、構造精密化に関する情報を与える。「Ａｔｏｍ」は、座標が測定される元素を表す。そのカラムの最初の文字は、元素を規定する。それぞれのアミノ酸の３文字コード及びアミノ酸配列の位置が示される。「Ａｔｏｍ」のラインにおける最初の３つの値は、測定された元素の原子位置を規定する。４つ目の値は占有率に相当し、５つ目（最後）の値は温度因子（Ｂ因子）である。占有因子は、各原子が座標によって特定される位置を占有する分子の割合を表す。値「１」は、各原子が、結晶の全ての同等の分子において同じ立体配座、すなわち同じ位置を有することを示す。Ｂは、その原子中心の周りの原子の動きの尺度となる熱的因子である。この命名は、タンパク質データバンク（ＰＤＢ）形式に対応する。図５は、標準的なタンパク質データバンク（ＰＤＢ）形式におけるリボウリジン一リン酸（ｒＵＭＰ）が結合したＨ１Ｎ１のＰＡエンドヌクレアーゼドメインの構造座標のリストである。非対称単位由来の鎖Ａ（二価の陽イオン、すなわち２つのマンガンイオン、及び水分子が会合した）のみが含まれる。鎖Ｂ、鎖Ｃ及び鎖Ｄは非常に類似している。化合物ｒＵＭＰは残基記述子Ｕを有する。 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 同上 H1N1 PA structure (Chain A)native 図６：Ｈ１Ｎ１のＰＡの構造（鎖Ａ）（ネイティブ） 二価の陽イオン（１つのマンガン及び１つのマグネシウム）及び主要な活性部位の残基を示し、エンドヌクレアーゼ活性部位（ＰＡポリペプチド断片（鎖Ａ））を説明する、図１の構造座標を使用する略図である。 H1N1 PA structure (Chain A) withEMBL-R05-3 図７Ａ：ＥＭＢＬ−Ｒ０５−３を有するＨ１Ｎ１のＰＡの構造（鎖Ａ） 結合した化合物ＥＭＢＬ−Ｒ０５−３、二価の陽イオン（２つのマンガン）、及び該化合物と相互作用する主要な活性部位の残基（とりわけＡｒｇ８４）又はその近くに存在する主要な活性部位の残基を示し、エンドヌクレアーゼ活性部位（ＰＡポリペプチド断片（鎖Ａ））を説明する、図２の構造座標を使用する略図である。 H1N1 PA structure (Chain A) withEMBL-R05-3 図７Ｂ：ＥＭＢＬ−Ｒ０５−３を有するＨ１Ｎ１のＰＡの構造（鎖Ａ） ＥＭＢＬ−Ｒ０５−３の結合によるＴｙｒ２４の近傍におけるループの立体配座の変化を示す、図１（左側において下にある鎖）及び図２の座標を比較する略図（鎖Ａ）である。Ｔｙｒ２４の側鎖が動いて、ＥＭＢＬ−Ｒ０５−３のクロロベンゼンと部分的に重なる（stack）。 H1N1 PA structure (Chain D) withEMBL-R05-3 図８：ＥＭＢＬ−Ｒ０５−３を有するＨ１Ｎ１のＰＡの構造（鎖Ｄ 結合した化合物ＥＭＢＬ−Ｒ０５−３、二価の陽イオン（２つのマンガン）、及び該化合物と相互作用する主要な活性部位の残基（とりわけＴｙｒ２４及びＡｒｇ８４）又はその近くに存在する主要な活性部位の残基を示し、エンドヌクレアーゼ活性部位（ＰＡポリペプチド断片（鎖Ｄ））を説明する、図３の構造座標を使用する略図である。 H1N1 PA structure (Chain A) withEMBL-R05-2 図９：ＥＭＢＬ−Ｒ０５−２を有するＨ１Ｎ１のＰＡの構造（鎖Ａ） 結合した化合物ＥＭＢＬ−Ｒ０５−２、二価の陽イオン（２つのマンガン）、及び該化合物と相互作用する主要な活性部位の残基（とりわけＴｙｒ２４及びＰｈｅ１０５）又はその近くに存在する主要な活性部位の残基を示し、エンドヌクレアーゼ活性部位（ＰＡポリペプチド断片（鎖Ａ））を説明する、図４の構造座標を使用する略図である。 H1N1 PA structure (Chain A) withribo-UridineMonophosphate 図１０：リボウリジン一リン酸を有するＨ１Ｎ１のＰＡの構造（鎖Ａ） 結合した化合物ｒＵＭＰ、二価の陽イオン（２つのマンガン）、及び該化合物と相互作用する主要な活性部位の残基（とりわけＴｙｒ２４及びＬｙｓ３４）又はその近くに存在する主要な活性部位の残基を示し、エンドヌクレアーゼ活性部位（ＰＡポリペプチド断片（鎖Ａ））を説明する、図５の構造座標を使用する略図である。 Ｈ１Ｎ１のＰＡ１〜１９８の典型的な精製による１５％ＰＡＧＥゲル及びゲルろ過プロファイルを示す図である。矢印は、残りのＭＢＰのかすかな痕跡を示す。1st Nickel column 第１のニッケルカラム2nd Nickel column 第２のニッケルカラムWhole cell 全細胞Load 装荷液Flow though 通過液（Flow through）Wash 洗浄液Elute 溶出液Elute 1st Nickel 溶出液 第１のニッケルカラム Ｐ２１２１２１空間群における、ｒＵＭＰとともに共結晶化させたＨ１Ｎ１のＰＡ−Ｎｔｅｒの凍結結晶を示す図である。 ネイティブのエンドヌクレアーゼ構造における二価のイオンの配位を示す図である。 Ｈ１Ｎ１のＰＡ−Ｎｔｅｒとの共結晶におけるｒＵＭＰ及び二価の陽イオン（マンガンＭｎ１及びＭｎ２）に関する電子密度を示す図である。精密化２Ｆｏ−Ｆｃ電子密度は１．１σで輪郭を作成した（contoured）。不偏Ｆｏ−Ｆｃ電子密度は２．８σで輪郭を作成した。異常差異マップは４σで輪郭を作成した。 H1N1 polypeptide fragment (chainA) with boundEMBL-R05-1 図１５：ＥＭＢＬ−Ｒ０５−１が結合したＨ１Ｎ１ポリペプチド断片（鎖Ａ） 化合物が結合したアミノ酸５２〜６４がアミノ酸グリシンによって置き換えられた配列番号２に示すアミノ酸配列のＰＡポリペプチド断片のアミノ酸１〜１９８（ＰＡ（Ｈ１Ｎ１）１〜１９８ Δ５２〜６４：Ｇｌｙ）に関する精密な原子構造座標のリストである。各々の構造に関して、結晶学的非対称単位（ＡＳＵ）に、１つの分子が存在する。ファイルヘッダは、構造精密化に関する情報を与える。「Ａｔｏｍ」は、座標が測定される元素を表す。そのカラムの最初の文字は、元素を規定する。それぞれのアミノ酸の３文字コード及びアミノ酸配列の位置が示される。「Ａｔｏｍ」のラインにおける最初の３つの値は、測定された元素の原子位置を規定する。４つ目の値は占有率に相当し、５つ目（最後）の値は温度因子（Ｂ因子）である。占有因子は、各原子が座標によって特定される位置を占有する分子の割合を表す。値「１」は、各原子が、結晶の全ての同等の分子において同じ立体配座、すなわち同じ位置を有することを示す。Ｂは、その原子中心の周りの原子の動きの尺度となる熱的因子である。この命名は、タンパク質データバンク（ＰＤＢ）形式に対応する。図１５は、標準的なタンパク質データバンク（ＰＤＢ）形式における４−［３−［（４−クロロフェニル）メチル］−１−（フェニルメチルスルホ）−３−ピペリジニル］−２−ヒドロキシ−４−オキソ−２−ブテン酸（ＥＭＢＬ−Ｒ０５−１）が結合したＨ１Ｎ１のＰＡエンドヌクレアーゼドメインの構造座標のリストである。非対称単位由来の鎖Ａ（二価の陽イオン、すなわち２つのマンガンイオン、及び水分子が会合した）が含まれる。化合物ＥＭＢＬ−Ｒ０５−１は残基記述子ｃｉ１を有する。 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 同上 H1N1 polypeptide fragment (chainA) with boundEGCG 図１６：ＥＧＣＧが結合したＨ１Ｎ１ポリペプチド断片（鎖Ａ） 化合物が結合したアミノ酸５２〜６４がアミノ酸グリシンによって置き換えられた配列番号２に示すアミノ酸配列のＰＡポリペプチド断片のアミノ酸１〜１９８（ＰＡ（Ｈ１Ｎ１）１〜１９８ Δ５２〜６４：Ｇｌｙ）に関する精密な原子構造座標のリストである。各々の構造に関して、結晶学的非対称単位（ＡＳＵ）に、１つの分子が存在する。ファイルヘッダは、構造精密化に関する情報を与える。「Ａｔｏｍ」は、座標が測定される元素を表す。そのカラムの最初の文字は、元素を規定する。それぞれのアミノ酸の３文字コード及びアミノ酸配列の位置が示される。「Ａｔｏｍ」のラインにおける最初の３つの値は、測定された元素の原子位置を規定する。４つ目の値は占有率に相当し、５つ目（最後）の値は温度因子（Ｂ因子）である。占有因子は、各原子が座標によって特定される位置を占有する分子の割合を表す。値「１」は、各原子が、結晶の全ての同等の分子において同じ立体配座、すなわち同じ位置を有することを示す。Ｂは、その原子中心の周りの原子の動きの尺度となる熱的因子である。この命名は、タンパク質データバンク（ＰＤＢ）形式に対応する。図１６は、標準的なタンパク質データバンク（ＰＤＢ）形式におけるエピガロカテキン３−ガレート（ＥＧＣＧ）が結合したＨ１Ｎ１のＰＡエンドヌクレアーゼドメインの構造座標のリストである。非対称単位由来の鎖Ａ（二価の陽イオン、すなわち２つのマンガンイオン、及び水分子が会合した）が含まれる。化合物ＥＧＣＧは残基記述子ｔｔｅを有する。 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、同上 H1N1 PA structure withEMBL-R05-1 bound structure 図１７：ＥＭＢＬ−Ｒ０５−１が結合した構造を伴うＨ１Ｎ１のＰＡの構造 結合した化合物ＥＭＢＬ−Ｒ０５−１、二価の陽イオン（２つのマンガン）、及び該化合物と相互作用する主要な活性部位の残基（とりわけＴｙｒ２４及びＡｒｇ８４）又はその近くに存在する主要な活性部位の残基を示し、エンドヌクレアーゼ活性部位（ＰＡポリペプチド断片）を説明する、図１５の構造座標を使用する略図である。 H1N1 PA structure with EGCGbound structure 図１８Ａ：ＥＧＣＧが結合した構造を伴うＨ１Ｎ１のＰＡの構造 結合した化合物ＥＧＣＧ、二価の陽イオン（２つのマンガンイオン）、及び該化合物と相互作用し、又はその近くに存在する主要な活性部位の残基を示し、エンドヌクレアーゼ活性部位（ＰＡポリペプチド断片）を説明する、図１６の構造座標を使用する略図である。 H1N1 PA structure with EGCGbound structure 図１８Ｂ：ＥＧＣＧが結合した構造を伴うＨ１Ｎ１のＰＡの構造 結合したＥＧＣＧ、二価の陽イオン（２つのマンガンイオン）、及び該化合物と相互作用し、又はその近くに存在する主要な活性部位の残基を示す図である。３．３Å未満の相互作用（灰色の点線）、４Å未満の更なる考え得る相互作用（濃灰色の点線）を示す。 ＰＡの活性部位において結合した全てのジケト阻害剤化合物（ＥＭＢＬ−Ｒ０５−１、ＥＭＢＬ−Ｒ０５−２並びにＥＭＢＬ−Ｒ０５−３Ａ及びＥＭＢＬ−Ｒ０５−３Ｄ）及びＥＧＣＧの重ね合わせを示す図である。図１９に示すように、（正確な位置においては或る程度の変動性が存在するものの）金属に対する３つのジケト阻害剤の結合の様式は保存されているが、各化合物の２つの「腕（arms）」がポケット１〜ポケット４の種々の組合せ中に挿入されている。ＥＭＢＬ−Ｒ０５−１はＥＭＢＬ−Ｒ０５−３Ｄと類似の立体配置を有しており、２つの腕がポケット２及びポケット３を占拠している。ＥＭＢＬ−Ｒ０５−３Ａはポケット２及びポケット４を占拠している。ピペリジニル環における置換の点でとりわけＲ０５−１及びＲ０５−３と異なる（表２）ＥＭＢＬ−Ｒ０５−２は、ポケット３及び唯一ポケット１を占拠している（図７Ｂ）。緑茶化合物ＥＧＣＧはポケット３及びポケット４を占拠している。これらのポケットのうちの３つ以上を占拠する、より強力かつ特異的な化合物を設計することができるかもしれない。
実施例を、本発明を更に例示し、より良好な理解を提供するために設計する。これらを、本発明の範囲を限定するものとは決して解釈すべきではない。
１．方法
１．１ インフルエンザ株Ａ／カリフォルニア／０４／２００９−Ｈ１Ｎ１由来のＰＡ−Ｎｔｅｒ（ＰＡ（Ｈ１Ｎ１）１〜１９８）及びＰＡ−Ｎｔｅｒ突然変異体（ＰＡ（Ｈ１Ｎ１）１〜１９８ Δ５２〜６４：Ｇｌｙ）のクローニング、発現及び精製
インフルエンザ株Ａ／カリフォルニア／０４／２００９−Ｈ１Ｎ１由来のＰＡ−Ｎｔｅｒ（残基１〜１９８）をコードするＤＮＡ（配列番号１及び配列番号２を参照されたい）を、GeneArt（Regensburg, Germany）において合成し（ＰＡ（Ｈ１Ｎ１）１〜１９８）、発現ベクターｐＥＳＰＲＩＴ００２（ＥＭＢＬ）中にサブクローニングした。配列を、タバコエッチ病ウイルス（ＴＥＶ）プロテアーゼによって１００％の切断を得るためのＮ末端のＴＥＶ切断部位の間にＭＧＳＧＭＡ（配列番号３）ポリペプチドリンカーを含有するように設計した。
結晶化特性を更に改善するために、部位特異的突然変異誘発によって柔軟なループの部分（５２〜７３）の欠失を作製した。このために、野生型遺伝子を含有する全ベクターのＰＣＲ増幅を、突然変異部位の傍の（flanking）２つのプライマー（そのうちの１つはリン酸化されている）及びＴｕｒｂｏＰｆｕポリメラーゼ（Stratagene）を使用して行った。その後、鋳型ベクターをＤｐｎＩ（NewEnglandBiolabs）によって消化し、突然変異したベクターを再連結した。ＰＡ−Ｎｔｅｒ突然変異体において、アミノ酸５２〜６４を包含するアミノ酸配列を、単一のグリシンによって置き換えた（ＰＡ（Ｈ１Ｎ１）１〜１９８ Δ５２〜６４：Ｇｌｙ）。
野生型及び突然変異体のプラスミドを、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（Stratagene）へと形質転換し、タンパク質を、ＯＤ０．８〜１．０での０．２ｍＭイソプロピル−β−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）による誘導後に２０℃で終夜、ＬＢ培地中で発現させた。タンパク質を、固定化金属アフィニティカラム（ＩＭＡＣ）によって精製した。第２のＩＭＡＣ工程を、Ｈｉｓタグ付きＴＥＶプロテアーゼによる切断後に行い、その後Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５カラム（GE Healthcare）によるゲルろ過を行った。最終的に、タンパク質を１０ｍｇ／ｍｌ〜１５ｍｇ／ｍｌまで濃縮した。図１１を参照されたい。
１．２ 化合物
共結晶化に使用した化合物を表２に示す。化合物ｒＵＭＰはSigmaから購入した。化合物ＥＭＢＬ−Ｒ０５−１、ＥＭＢＬ−Ｒ０５−２及びＥＭＢＬ−Ｒ０５−３（｛Tomassini, 1994 #397｝において初めて記載された）は、ShanghaiChemPartnerにおいてカスタム合成を行った。ＥＧＣＧはSigmaから購入した（Ｅ４１４３）。
１．３ 結晶化
初回のシッティングドロップ・スクリーニングを、ＥＭＢＬ Ｇｒｅｎｏｂｌｅの結晶化プラットフォームで直角座標ロボットを使用して１００ｎＬのタンパク質溶液（１５ｍｇ／ｍＬ）を１００ｎＬのリザーバ溶液と混合して、２０℃で実施した。およそ６００の条件をスクリーニングした。その後、より大きな結晶を、タンパク質及びリザーバ溶液を１：１の比率で混合するハンギングドロップ法によって２０℃で得た。タンパク質溶液は、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＭｎＣｌ２、２ｍＭ ＭｇＣｌ２中に１０ｍｇ／ｍＬ〜１５ｍｇ／ｍＬのＰＡ−Ｎ−ｔｅｒを含有するものであった。ネイティブの結晶及び種々の化合物／リガンドとの共結晶化に関する改良した（refined）リザーバ組成物を表１に列挙する。共結晶化のために、化合物／リガンドｒＵＭＰ、ＥＭＢＬ−Ｒ０５−３及びＥＧＣＧをタンパク質溶液に添加して、それぞれ５ｍＭ、１．５ｍＭ及び５ｍＭの最終濃度とした。ネイティブの結晶並びにＥＭＢＬ−Ｒ０５−３及びＥＧＣＧとともに共結晶化させた結晶を、抗凍結剤として更に２５％グリセロールを有するリザーバ溶液中で液体窒素で急速凍結した。ｒＵＭＰとの共結晶を、更に濃度１０ｍＭのｒＵＭＰ及び抗凍結剤として更に２０％グリセロールを有するリザーバ溶液中で凍結した。ＥＭＢＬ−Ｒ０５−２を有する構造は、１．５ｍＭ ＥＭＢＬ−Ｒ０５−２を含有しｒＵＭＰを含有しないリザーバ溶液を用いてＰＡ−Ｎ−ｔｅｒとｒＵＭＰとの共結晶を２時間浸し（該阻害剤がｒＵＭＰを置き換える）、その後２０％グリセロール及び１．５ｍＭ ＥＭＢＬ−Ｒ０５−２を含有するリザーバ溶液中で凍結保護することによって得た。図１２は、ｒＵＭＰとの典型的な共結晶を示す。ＥＭＢＬ−Ｒ０５−１を有する構造は、該阻害剤を含有するリザーバ溶液を用いてＰＡ−Ｎ−ｔｅｒ突然変異体とｄＴＭＰとの共結晶を２時間浸し、その後２０％グリセロール及び該阻害剤を含有するリザーバ溶液中で凍結保護することによって得た。化合物／リガンドに関しては、表２も参照されたい。
表１：様々な化合物に関する結晶化条件及び結晶学的パラメータの概要
Figure 2016189772
表２：使用した化合物
Figure 2016189772
 ４−［３−［（４−クロロフェニル）メチル］−１−（フェニルメチル）−３−ピペリジニル］−２−ヒドロキシ−４−オキソ−２−ブテン酸
４−［４−［（４−クロロフェニル）メチル］−１−（シクロヘキシルメチル）−４−ピペリジニル］−２−ヒドロキシ−４−オキソ−２−ブテン酸
（リボウリジン一リン酸）
５’−ウリジル酸
４−［３−［（４−クロロフェニル）メチル］−１−（フェニルメチルスルホ）−３−ピペリジニル］−２−ヒドロキシ−４−オキソ−２−ブテン酸
（−）−エピガロカテキンガレート
［（２Ｒ，３Ｒ）−５，７−ジヒドロキシ−２−（３，４，５−トリヒドロキシフェニル）クロマン−３−イル］３，４，５−トリヒドロキシベンゾエート
１．４ 結晶構造決定
回折データを、欧州シンクロトロン放射線施設で様々なビームラインによって収集した。データセットを、ＸＤＳを用いてインテグレーションし（integrated）、ＸＳＣＡＬＥを用いてスケーリングした（scaled）。その後のデータ解析を、ＣＣＰ４ｉ ｐｒｏｇｒａｍｍｅ ｓｕｉｔｅを用いて行った。最初のＨ１Ｎ１の構造を、過去に決定されたＨ３Ｎ２のＰＡ Ｎ−ｔｅｒ構造（Dias et al., Nature 2009）を使用して、ＰＨＡＳＥＲによる分子置換を用いて解明した。その後（Subsequently）、共結晶構造を、Ｈ１Ｎ１の構造を使用して、ＰＨＡＳＥＲを用いて決定した。精密化を、ＲＥＦＭＡＣ及び／又はＣＯＯＴ若しくはＯによるモデル構築を用いて実施した。Ｃ２結晶形態及びＰ２１２１２１結晶形態中には、１つの非対称単位当たり４つの分子が存在する。しかしながら、可塑性（特に、５３〜７３領域）及び概して良好な分解能による分子間の構造変動のために、ＮＣＳ制約（restraints）は適用しなかった。
２．結果
２．１ ＰＡ（Ｈ１Ｎ１）ポリペプチド断片又はＰＡ（Ｈ１Ｎ１）ポリペプチド断片変異体の作製及び結晶化
本発明の発明者らは、インフルエンザ株Ａ／カリフォルニア／０４／２００９−Ｈ１Ｎ１（２００９パンデミック株）の配列番号２のアミノ酸１〜１９８を含むポリペプチド断片（ＰＡ（Ｈ１Ｎ１）１〜１９８）が、関連する化合物／リガンドの存在下及び非存在下で容易に結晶化することを見出した（図１〜図１０を参照されたい）。結晶化特性は、アミノ酸５２〜６４がアミノ酸グリシンによって置き換えられたインフルエンザ株Ａ／カリフォルニア／０４／２００９−Ｈ１Ｎ１（２００９パンデミック株）の配列番号２のアミノ酸１〜１９８を含むポリペプチド断片変異体（ＰＡ（Ｈ１Ｎ１）１〜１９８ Δ５２〜６４：Ｇｌｙ）を用いた場合に、更に改善することができた（図１５〜図１８を参照されたい）。
したがって、従来技術において取り組まれた多数の不首尾の試みとは対照的に、本発明の発明者らは、化合物／リガンドの存在下及び非存在下でＰＡ（Ｈ１Ｎ１）ポリペプチド断片又はＰＡ（Ｈ１Ｎ１）ポリペプチド断片変異体の構造を得ることができた。
化合物／リガンドの存在下及び非存在下におけるＰＡ（Ｈ１Ｎ１）ポリペプチド断片又はＰＡ（Ｈ１Ｎ１）ポリペプチド断片変異体の構造を以下に記載する。全てのこれらの構造によって、これらの化合物／リガンドがどのように金属イオンと直接結合し、活性部位における多数の残基と相互作用するかが詳細に示される。さらに、相互作用する残基のうちの幾つかは、リガンドの結合によって立体配座を変化させるが、この情報は過去には手に入らなかったものである。リガンドと相互作用する残基及び活性部位の可塑性の領域に関するこの三次元の知識は、その効力を改善するための既存の阻害剤に対する修飾の設計の最適化にとって、又はエンドヌクレアーゼ活性を効果的に遮断する新規な阻害剤の、構造に基づく設計及び最適化にとって重要である。
２．２ Ｈ１Ｎ１のＰＡのネイティブの構造
標準的なタンパク質データバンク（ＰＤＢ）形式におけるネイティブの（すなわち化合物／リガンドを有しない）Ｈ１Ｎ１のＰＡエンドヌクレアーゼドメイン（ＰＡ（Ｈ１Ｎ１）１〜１９８）（鎖Ａ）の構造座標を図１に示す。非対称単位由来の鎖Ａ（二価の陽イオン、すなわち１つのマグネシウムイオン及び１つのマンガンイオン、並びに水分子が会合した）のみが含まれる。鎖Ｂ、鎖Ｃ及び鎖Ｄは非常に類似している。エンドヌクレアーゼ活性部位（ＰＡポリペプチド断片（鎖Ａ））を説明する、図１の構造座標を使用する略図を図６に示す。図６は、二価の陽イオン（１つのマンガン及び１つのマグネシウム）及び主要な活性部位の残基を示す。
２．３ ＥＭＢＬ−Ｒ０５−３が結合した構造
標準的なタンパク質データバンク（ＰＤＢ）形式における４−［３−［（４−クロロフェニル）メチル］−１−（フェニルメチル）−３−ピペリジニル］−２−ヒドロキシ−４−オキソ−２−ブテン酸（ＥＭＢＬ−Ｒ０５−３）が結合したＨ１Ｎ１のＰＡエンドヌクレアーゼドメイン（ＰＡ（Ｈ１Ｎ１）１〜１９８）（鎖Ａ）の構造座標を図２に示す。非対称単位由来の鎖Ａ（二価の陽イオン、すなわち２つのマンガンイオン、及び水分子が会合した）のみが含まれる。化合物ＥＭＢＬ−Ｒ０５−３は残基記述子ｃｉ３を有する。エンドヌクレアーゼ活性部位（ＰＡポリペプチド断片（鎖Ａ））を説明する、図２の構造座標を使用する略図を図７Ａに示す。図７Ａは、結合した化合物ＥＭＢＬ−Ｒ０５−３、二価の陽イオン（２つのマンガン）、及び該化合物と相互作用する主要な活性部位の残基（とりわけＡｒｇ８４）又はその近くに存在する主要な活性部位の残基を示す。
ＥＭＢＬ−Ｒ０５−３の結合によるＴｙｒ２４の近傍におけるループの立体配座の変化を示す、図１（左側において下にある鎖）及び図２の座標を比較する略図（鎖Ａ）を図７Ｂに示す。Ｔｙｒ２４の周りのループは、ネイティブの構造においては、あまり秩序だっていない。Ｔｙｒ２４の側鎖が動いて、ＥＭＢＬ−Ｒ０５−３のクロロベンゼンと部分的に重なる。これによって、活性部位の可塑性、及びリガンドの結合の適合状態の誘導が示される。より強力な阻害剤の設計に関する重要な結論は、任意のイオン結合足場（scaffold）への伸長部（「腕」）によって１つ又は複数のポケットにおける相互作用が確実に最適化されるようにすることである。現在の化合物（そのいずれも、十分に規定された、十分な占有の結合状態を示さない）の場合でもそのようであるように、不完全な適合は、柔軟性の残存及び最適でない効力をもたらす。
さらに、標準的なタンパク質データバンク（ＰＤＢ）形式における４−［３−［（４−クロロフェニル）メチル］−１−（フェニルメチル）−３−ピペリジニル］−２−ヒドロキシ−４−オキソ−２−ブテン酸（ＥＭＢＬ−Ｒ０５−３）が結合したＨ１Ｎ１のＰＡエンドヌクレアーゼドメイン（ＰＡ（Ｈ１Ｎ１）１〜１９８）（鎖Ｄ）の構造座標を図３に示す。非対称単位由来の鎖Ｄ（二価の陽イオン、すなわち２つのマンガンイオン、及び水分子が会合した）のみが含まれる。化合物ＥＭＢＬ−０５−３は、鎖Ａにおけるもの（図２）と異なる立体配置を有する。上記化合物は残基記述子ｃｉ３を有する。エンドヌクレアーゼ活性部位（ＰＡポリペプチド断片（鎖Ｄ））を説明する、図３の構造座標を使用する略図を図８に示す。図８は、結合した化合物ＥＭＢＬ−Ｒ０５−３、二価の陽イオン（２つのマンガン）、及び該化合物と相互作用する主要な活性部位の残基（とりわけＴｙｒ２４及びＡｒｇ８４）又はその近くに存在する主要な活性部位の残基を示す。
２．４ ＥＭＢＬ−Ｒ０５−２が結合した構造
標準的なタンパク質データバンク（ＰＤＢ）形式における４−［４−［（４−クロロフェニル）メチル］−１−（シクロヘキキシルメチル）−４−ピペリジニル］−２−ヒドロキシ−４−オキソ−２−ブテン酸（ＥＭＢＬ−Ｒ０５−２）が結合したＨ１Ｎ１のＰＡエンドヌクレアーゼドメイン（ＰＡ（Ｈ１Ｎ１）１〜１９８）（鎖Ａ）の構造座標を図４に示す。非対称単位由来の鎖Ａ（二価の陽イオン、すなわち２つのマンガンイオン、及び水分子が会合した）のみが含まれる。鎖Ｂ、鎖Ｃ及び鎖Ｄは非常に類似している。化合物ＥＭＢＬ−Ｒ０５−２は残基記述子ｃｉ２を有する。エンドヌクレアーゼ活性部位（ＰＡポリペプチド断片（鎖Ａ））を説明する、図４の構造座標を使用する略図を図９に示す。図９は、結合した化合物ＥＭＢＬ−Ｒ０５−２、二価の陽イオン（２つのマンガン）、及び該化合物と相互作用する主要な活性部位の残基（とりわけＴｙｒ２４及びＰｈｅ１０５）又はその近くに存在する主要な活性部位の残基を示す。
２．５ リボウリジン一リン酸（ｒＵＭＰ）が結合した構造
標準的なタンパク質データバンク（ＰＤＢ）形式におけるリボウリジン一リン酸（ｒＵＭＰ）が結合したＨ１Ｎ１のＰＡエンドヌクレアーゼドメイン（ＰＡ（Ｈ１Ｎ１）１〜１９８）（鎖Ａ）の構造座標を図５に示す。非対称単位由来の鎖Ａ（二価の陽イオン、すなわち２つのマンガンイオン、及び水分子が会合した）のみが含まれる。鎖Ｂ、鎖Ｃ及び鎖Ｄは非常に類似している。化合物ｒＵＭＰは残基記述子Ｕを有する。
ｒＵＭＰとの共結晶化試験によって、新たな斜方晶空間群における大きく十分に秩序だった結晶が得られた（図１２及び図１４）。
エンドヌクレアーゼ活性部位（ＰＡポリペプチド断片（鎖Ａ））を説明する、図５の構造座標を使用する略図を図１０に示す。図１０は、結合した化合物ｒＵＭＰ、二価の陽イオン（２つのマンガン）、及び該化合物と相互作用する主要な活性部位の残基（とりわけＴｙｒ２４及びＬｙｓ３４）又はその近くに存在する主要な活性部位の残基を示す。ｒＵＭＰは、Ｍｎ１の配位圏を完成させ、それらのうちの１つがＭｎ２にも配位するリン酸の２つの酸素によって結合する。塩基はＴｙｒ２４上に十分に重なり、Ｌｙｓ３４は２位のＯ（O2position）と水素結合を形成している。リボースのヒドロキシル基はタンパク質と水素結合を形成せず、このことは、デオキシリボースが同等に十分に結合し、該タンパク質がＲＮＡアーゼであるのと同様にＤＮＡアーゼであるという事実｛Dias, 2009 #448｝に矛盾しない。
ｒＵＭＰに関して観察された立体配座は、過去に発表された立体配座（ＰＤＢエントリー３ｈｗ３｛Zhao,2009 #444｝）と全く異なっている。後者の構造は、マンガンの非存在下でエンドヌクレアーゼの既存の結晶中にヌクレオチドを染み込ませることによって得られたものであり、電子密度が非常に低い。この構造では、水分子がＭｎ１を置き換え、マグネシウムイオンがＭｎ２を置き換える。金属の連結におけるこの差異は、Ｇｌｕ１１９の立体配座の変化に反映される。リボース及び塩基の位置は、本明細書中で提示される構造における位置と全く異なっており、Ｌｙｓ３４又はＴｙｒ２４と相互作用することはできない。２つの構造の間の差異は、第１にマンガンが存在しないこと、第２に、共結晶化の場合でもそうである可能性がより高いように、予め成長させた結晶を浸すことは活性部位をリガンドに適合させないということを反映している可能性がある。
２．６ ＥＭＢＬ−Ｒ０５−１が結合した構造
標準的なタンパク質データバンク（ＰＤＢ）形式における４−［３−［（４−クロロフェニル）メチル］−１−（フェニルメチルスルホ）−３−ピペリジニル］−２−ヒドロキシ−４−オキソ−２−ブテン酸（ＥＭＢＬ−Ｒ０５−１）が結合したＨ１Ｎ１のＰＡエンドヌクレアーゼドメイン（ＰＡ（Ｈ１Ｎ１）１〜１９８ Δ５２〜６４：Ｇｌｙ）の構造座標を図１５に示す。非対称単位由来の鎖（二価の陽イオン、すなわち２つのマンガンイオン、及び水分子が会合した）が含まれる。化合物ＥＭＢＬ−Ｒ０５−１は残基記述子ｃｉ１を有する。エンドヌクレアーゼ活性部位（ＰＡポリペプチド断片）を説明する、図１５の構造座標を使用する略図を図１７に示す。図１７は、結合した化合物ＥＭＢＬ−Ｒ０５−１、二価の陽イオン（２つのマンガン）、及び該化合物と相互作用する主要な活性部位の残基（とりわけＴｙｒ２４及びＡｒｇ８４）又はその近くに存在する主要な活性部位の残基を示す。
２．７ ＥＧＣＧが結合した構造
エピガロカテキン３−ガレート（ＥＧＣＧ）は、エピガロカテキンと没食子酸とのエステルであり、緑茶中に最も豊富なカテキンである。ＥＧＣＧがインフルエンザエンドヌクレアーゼを阻害することが近年報告されている｛Kuzuhara, 2009 #629｝。（−）−エピガロカテキンガレートとのＰＡ（Ｈ１Ｎ１）１〜１９８ Δ５２〜６４：Ｇｌｙの共結晶化によって、２．６５Åの分解能まで回折する新たな結晶形態（表１）が得られた。化合物は、活性部位内に明らかに観察された。強い過剰（extra）密度は、結晶学的２倍軸の周囲にも存在し、結晶充填によって捕捉された他のＥＧＣＧ分子を表している可能性が極めて高い。
標準的なタンパク質データバンク（ＰＤＢ）形式におけるエピガロカテキン３−ガレート（ＥＧＣＧ）が結合したＨ１Ｎ１のＰＡエンドヌクレアーゼドメイン（ＰＡ（Ｈ１Ｎ１）１〜１９８ Δ５２〜６４：Ｇｌｙ）の構造座標を図１６に示す。非対称単位由来の鎖（二価の陽イオン、すなわち２つのマンガンイオン、及び水分子が会合した）が含まれる。化合物ＥＧＣＧは残基記述子ｔｔｅを有する。エンドヌクレアーゼ活性部位（ＰＡポリペプチド断片）を説明する、図１６の構造座標を使用する略図を図１８Ａに示す。図１８Ａは、結合した化合物ＥＧＣＧ、二価の陽イオン（２つのマンガンイオン）、及び該化合物と相互作用し、又はその近くに存在する主要な活性部位の残基を示す。図１８Ｂは、結合したＥＧＣＧ、二価の陽イオン（２つのマンガンイオン）、及び該化合物と相互作用し、又はその近くに存在する主要な活性部位の残基を示す。３．３Å未満の相互作用（灰色の点線）、４Å未満の更なる考え得る相互作用（濃灰色の点線）を示す。
２．８ 全てのジケト阻害剤化合物の重ね合わせ
ＰＡの活性部位において結合した全てのジケト阻害剤化合物（ＥＭＢＬ−Ｒ０５−１、ＥＭＢＬ−Ｒ０５−２並びにＥＭＢＬ−Ｒ０５−３Ａ及びＥＭＢＬ−Ｒ０５−３Ｄ）及びＥＧＣＧの重ね合わせを図１９に示す。図１９に示すように、（正確な位置においては或る程度の変動性が存在するものの）金属に対する３つのジケト阻害剤の結合の様式は保存されているが、各化合物の２つの「腕」がポケット１〜ポケット４の種々の組合せ中に挿入されている。ＥＭＢＬ−Ｒ０５−１はＥＭＢＬ−Ｒ０５−３Ｄと類似の立体配置を有しており、２つの腕がポケット２及びポケット３を占拠している。ＥＭＢＬ−Ｒ０５−３Ａはポケット２及びポケット４を占拠している。ピペリジニル環における置換の点でとりわけＲ０５−１及びＲ０５−３と異なる（表２）ＥＭＢＬ−Ｒ０５−２は、ポケット３及び唯一ポケット１を占拠している（図７Ｂ）。緑茶化合物ＥＧＣＧはポケット３及びポケット４を占拠している。これらのポケットのうちの３つ以上を占拠する、より強力かつ特異的な化合物を設計することができるかもしれない。
２．９ 二価の陽イオンの結合
ネイティブの構造（図１及び図６）において、活性部位内に２つの二価の陽イオンが観察される。これらは、Ｈｉｓ４１、Ａｓｐ１０８、Ｇｌｕ１１９、Ｉｌｅ１２０、及び２つの水分子（Ｗ４及びＷ５）によって連結される部位１のマンガン原子（図１３におけるＭｎ１）、並びにＧｌｕ８０及びＡｓｐ１０８、並びに４つの水分子（Ｗ１、Ｗ２、Ｗ３及びＷ４）によって連結される部位２のマグネシウムイオン（図１３におけるＭｇ２）であると同定されている（電子密度及び異常散乱の大きさを使用して。データは示していない）。他の構造（図２〜図５及び図７〜図１０並びに図１５〜図１８）においては、電子密度及び異常散乱の大きさによって同定されるように、部位１及び部位２の両方におけるイオンが、マンガンイオン（Ｍｎ１及びＭｎ２）である（例えばｒＵＭＰについて、図１４を参照されたい）。

Claims (28)

  1. エンドヌクレアーゼ活性を有するウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのＰＡサブユニットのアミノ末端断片を含むポリペプチド断片であって、前記ＰＡサブユニットが、配列番号２に示されるインフルエンザＡ２００９パンデミックＨ１Ｎ１ウイルス由来のものであり、Ｎ末端が、配列番号２に示されるＰＡサブユニットのアミノ酸配列の１位のアミノ酸と同一若しくはこれに対応するものであり、且つ、Ｃ末端が、配列番号２に示されるＰＡサブユニットのアミノ酸配列の１９０位〜１９８位から選択される位置のアミノ酸と同一若しくはこれに対応するポリペプチド断片、又は前記ポリペプチド断片の変異体であり、前記変異体は、配列番号２に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性があり、配列番号２に示されるアミノ酸位置１８６又はそれに対応するアミノ酸位置にアミノ酸セリンを含み、エンドヌクレアーゼ活性を保持している、ポリペプチド断片。
  2. 可溶性及び／又は結晶化可能なポリペプチド断片である、請求項１に記載のポリペプチド断片。
  3. ポリペプチド断片は２つの二価の陽イオンが結合するものである、請求項１又は２に記載のポリペプチド断片。
  4. 二価の陽イオンがマンガン及び／又はマグネシウムである、請求項３に記載のポリペプチド断片。
  5. （ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列のアミノ酸１〜１９８からなるポリペプチド断片からなり、（ｉ）図１に示される構造座標、（ｉｉ）図２に示される構造座標、（ｉｉｉ）図３に示される構造座標、（ｉｖ）図４に示される構造座標、若しくは（ｖ）図５に示される構造座標によって規定される構造を有するか、又は
    （ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列のアミノ酸１〜１９８のうち配列番号２に示されるアミノ酸配列のアミノ酸５２〜６４がアミノ酸グリシンによって置き換えられているアミノ酸配列からなるポリペプチド断片からなり、（ｖｉ）図１５に示される構造座標、若しくは（ｖｉｉ）図１６に示される構造座標によって規定される構造を有する、
    請求項１〜４のいずれか一項に記載のポリペプチド断片。
  6. アミノ酸配列ＭＧＳＧＭＡ（配列番号３）からなるアミノ末端リンカーを更に含む、請求項５に記載のポリペプチド断片。
  7. （ｉ）によって規定される構造を有するポリペプチド断片が、空間群Ｃ２及びａ＝２６．３６ｎｍ±０．５ｎｍ、ｂ＝６．６２ｎｍ±０．３ｎｍ、ｃ＝６．６３ｎｍ±０．３ｎｍ、α＝９０度、β＝９６度±２度、γ＝９０度の単位格子寸法を有する結晶形態を有し、
    （ｉｉ）〜（ｖ）によって規定される構造を有するポリペプチド断片が、空間群Ｐ２１２１２１及びａ＝５．４６ｎｍ±０．３ｎｍ、ｂ＝１２．２５ｎｍ±０．４ｎｍ、ｃ＝１３．０ｎｍ±０．３ｎｍ、α＝９０度、β＝９０度、γ＝９０度の単位格子寸法を有する結晶形態を有し、（ｖｉ）によって規定される構造を有するポリペプチド断片が、空間群Ｐ６２２２及びａ＝７．５０ｎｍ±０．３ｎｍ、ｂ＝７．５０ｎｍ±０．３ｎｍ、ｃ＝１２．００ｎｍ±０．５ｎｍ、α＝９０度、β＝９０度、γ＝１２０度の単位格子寸法を有する結晶形態を有し、又は
    （ｖｉｉ）によって規定される構造を有する該ポリペプチド断片が、空間群Ｐ６４２２及びａ＝９．９９ｎｍ±０．５ｎｍ、ｂ＝９．９９ｎｍ±０．５ｎｍ、ｃ＝８．２７ｎｍ±０．３ｎｍ、α＝９０度、β＝９０度、γ＝１２０度の単位格子寸法を有する結晶形態を有する、請求項４に記載のポリペプチド断片。
  8. 結晶が、２．６Å以上の分解能までＸ線を回折する、請求項７に記載のポリペプチド断片。
  9. 結晶が、２．１Å以上、若しくは１．９Å以上の分解能までＸ線を回折する、請求項８に記載のポリペプチド断片。
  10. 請求項１〜９のいずれか一項に記載の単離ポリペプチド断片をコードする単離ポリヌクレオチド。
  11. 請求項１０に記載の単離ポリヌクレオチドを含む組換えベクター。
  12. 請求項１０に記載の単離ポリヌクレオチド又は請求項１１に記載の組換えベクターを含む組換え宿主細胞。
  13. インフルエンザＡ２００９パンデミックＨ１Ｎ１ウイルス由来のＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのＰＡサブユニット又はその変異体のエンドヌクレアーゼ活性を調節する化合物を同定する方法であって、
    （ａ）（ｉ）図１に示される請求項５に記載のポリペプチド断片の構造座標、（ｉｉ）図２に示される請求項５に記載のポリペプチド断片の構造座標、（ｉｉｉ）図３に示される請求項５に記載のポリペプチド断片の構造座標、（ｉｖ）図４に示される請求項５に記載のポリペプチド断片の構造座標、（ｖ）図５に示される請求項５に記載のポリペプチド断片の構造座標、（ｖｉ）図１５に示される請求項５に記載のポリペプチド断片の構造座標、又は（ｖｉｉ）図１６に示される請求項５に記載のポリペプチド断片の構造座標によって規定される活性部位のコンピュータモデルを構築する工程、
    （ｂ）下記（ｉ）〜（ｉｉｉ）から選択される、有望な活性調節化合物を選択又は設計する工程：
    （ｉ）三次元コンピュータモデルの目視検査により前記活性部位とドッキングする分子断片又は前記化合物を選択すること、
    （ｉｉ）小分子に関するデータベースから前記活性部位に結合することができる化合物を選択すること、及び
    （ｉｉｉ）de novoリガンド設計法により前記化合物を設計すること、
    （ｃ）計算手段を利用する工程であって、活性部位における前記化合物のエネルギーを最小化した立体配置を提供するために、前記化合物と前記活性部位とのコンピュータモデル間のフィッティングプログラム操作を行う、計算手段を利用する工程、並びに
    （ｄ）前記フィッティング操作の結果を評価する工程であって、前記化合物と活性部位モデルとの間の会合を定量化することによって前記活性部位と会合する前記化合物の能力を評価する、結果を評価する工程、
    を含む、化合物を同定する方法。
  14. 活性部位が、配列番号２に示されるＰＡサブユニットのアミノ酸配列のアミノ酸Ｇｌｕ８０、Ｇｌｕ１１９、Ａｓｐ１０８、Ｉｌｅ１２０及びＨｉｓ４１、又はそれに対応するアミノ酸を含む、請求項１３に記載の方法。
  15. 活性部位が、配列番号２に示されるＰＡサブユニットのアミノ酸配列のアミノ酸Ｌｙｓ３４、Ｔｙｒ２４、Ａｒｇ８４、Ｐｈｅ１０５、Ｔｙｒ１３０、Ｉｌｅ３８及びＡｒｇ１２４、又はそれに対応するアミノ酸を更に含む、請求項１４に記載の方法。
  16. 活性部位が、配列番号２に示されるＰＡサブユニットのアミノ酸配列のアミノ酸Ｇｌｕ２６、Ｌｙｓ１３４、Ｌｅｕ１０６及びＬｙｓ１３７、又はそれに対応するアミノ酸を更に含む、請求項１５に記載の方法。
  17. 活性部位が、図１〜図５に示されるＰＡサブユニット（配列番号２）のアミノ酸Ｇｌｕ８０、Ｇｌｕ１１９、Ａｓｐ１０８、Ｉｌｅ１２０及びＨｉｓ４１の構造座標によって規定される、又は図１５若しくは図１６に示される配列番号２のアミノ酸Ｇｌｕ８０、Ｇｌｕ１１９、Ａｓｐ１０８、Ｉｌｅ１２０及びＨｉｓ４１にそれぞれ対応するＰＡサブユニットのアミノ酸Ｇｌｕ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｉｌｅ及びＨｉｓの構造座標によって規定される、請求項１３に記載の方法。
  18. 活性部位が、図１〜図５に示されるＰＡサブユニット（配列番号２）のアミノ酸Ｌｙｓ３４、Ｔｙｒ２４、Ａｒｇ８４、Ｐｈｅ１０５、Ｔｙｒ１３０、Ｉｌｅ３８及びＡｒｇ１２４の構造座標によって規定される、又は図１５若しくは図１６に示される配列番号２のアミノ酸Ｌｙｓ３４、Ｔｙｒ２４、Ａｒｇ８４、Ｐｈｅ１０５、Ｔｙｒ１３０、Ｉｌｅ３８及びＡｒｇ１２４にそれぞれ対応するＰＡサブユニットのアミノ酸Ｌｙｓ、Ｔｙｒ、Ａｒｇ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｉｌｅ及びＡｒｇの構造座標によって更に規定される、請求項１７に記載の方法。
  19. 活性部位が、図１〜図５に示されるＰＡサブユニット（配列番号２）のアミノ酸Ｇｌｕ２６、Ｌｙｓ１３４、Ｌｅｕ１０６及びＬｙｓ１３７の構造座標によって規定される、又は図１５若しくは図１６に示される配列番号２のアミノ酸Ｇｌｕ２６、Ｌｙｓ１３４、Ｌｅｕ１０６及びＬｙｓ１３７にそれぞれ対応するＰＡサブユニットのアミノ酸Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ及びＬｙｓの構造座標によって更に規定される、請求項１８に記載の方法。
  20. （ａ）請求項１３〜１９のいずれか一項に記載の方法により化合物を同定する工程、及び
    （ｂ）前記化合物を合成する工程、又は前記化合物を合成し、１つ若しくは複数の薬学的に許容可能な添加物及び／若しくは担体とともに前記化合物若しくはその薬学的に許容可能な塩を配合する工程、
    を含む組成物を生産する方法。
  21. （ｃ）化合物と請求項１〜９のいずれか一項に記載のポリペプチド断片若しくはその変異体又は請求項１２に記載の組換え宿主細胞とを接触させ、ＰＡサブユニットポリペプチド断片若しくはその変異体のエンドヌクレアーゼ活性を調節する前記化合物の能力を決定する工程、を更に含む、請求項２０に記載の方法。
  22. インフルエンザＡ２００９パンデミックＨ１Ｎ１ウイルス由来のＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのＰＡサブユニット又はその変異体のエンドヌクレアーゼ活性を調節する化合物を同定する方法であって、
    （ｉ）請求項１〜９のいずれか一項に記載のポリペプチド断片若しくはその変異体又は請求項１２に記載の組換え宿主細胞を試験化合物と接触させる工程、及び
    （ｉｉ）前記ＰＡサブユニットポリペプチド断片又はその変異体のエンドヌクレアーゼ活性を調節する前記試験化合物の能力を分析する工程、
    を含む、化合物を同定する方法。
  23. ＰＡサブユニットポリペプチド断片又はその変異体のエンドヌクレアーゼ活性を阻害する試験化合物の能力を分析する、請求項２２に記載の方法。
  24. ハイスループット設定において行う、請求項２２又は２３に記載の方法。
  25. 試験化合物が小分子及び／又はペプチド若しくはタンパク質である、請求項２２〜２４のいずれか一項に記載の方法。
  26. １つ又は複数の薬学的に許容可能な添加物及び／又は担体とともに化合物又はその薬学的に許容可能な塩を配合する工程を更に含む、請求項２２〜２５のいずれか一項に記載の方法。
  27. 配列番号２に示されるインフルエンザＡ２００９パンデミックＨ１Ｎ１ウイルスのＰＡサブユニット又はその変異体の活性部位を認識する抗体であって、前記変異体は、配列番号２に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性があり、配列番号２に示されるアミノ酸位置１８６に又はそれに対応するアミノ酸位置にアミノ酸セリンを含むものである、抗体。
  28. 抗体が、配列番号２に示されるアミノ酸配列の５個〜１５個のアミノ酸の長さのポリペプチド断片を認識し、該ポリペプチド断片が、Ｌｙｓ３４、Ｇｌｕ２６、Ｉｌｅ３８、Ｔｙｒ２４、Ｈｉｓ４１、Ｇｌｕ８０、Ａｒｇ８４、Ｌｅｕ１０６、Ａｓｐ１０８、Ｇｌｕ１１９、Ｉｌｅ１２０、Ｔｙｒ１３０、Ｌｙｓ１３４、Ｐｈｅ１０５、Ｌｙｓ１３７及びＡｒｇ１２４からなる群から選択される１つ又は複数のアミノ酸残基を含む、請求項２７に記載の抗体。
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