JP2016503295A - 抗ｉｌ−１３受容体アルファ２抗体および抗体−薬物コンジュゲート - Google Patents

Abstract

抗ＩＬ−１３−Ｒα２抗体および抗体薬物コンジュゲート、ならびにこれらを調製および使用するための方法が本明細書に開示されている。【図１】

Description

本発明は、がんを処置するための抗ＩＬ−１３受容体アルファ２（ＩＬ−１３−Ｒα２）抗体および抗体−薬物コンジュゲートに関する。

配列表
本願は、ＥＦＳを介して提出され、その全体が参照により本明細書に組み込まれている配列表を含む。

高レベルのＩＬ−１３−Ｒα２が、膵臓、乳房、卵巣、および悪性神経膠腫を含めたいくつかの腫瘍細胞内で同定されている。対照的に、ほんの数タイプの正常組織がＩＬ−１３−Ｒα２を発現し、低レベルでのみ発現する。がんの処置は、一次処置選択肢として手術、放射線療法、および化学療法を用いて過去１０年にわたって改善されてきた。このような処置は、多くの患者において生存期間を延長し、かつ／または症状を緩和することができるが、多くの患者にとって治癒をもたらしそうにない。がんのための追加の治療選択肢は、依然として大いに必要とされている。

したがって、特に、非ＩＬ−１３−Ｒα２発現細胞に対して望ましくない効果を発揮することなく、ＩＬ−１３−Ｒα２発現腫瘍細胞に対して臨床的に有用な細胞傷害性効果を発揮することができる抗ＩＬ−１３−Ｒα２抗体−薬物コンジュゲートは、様々なＩＬ−１３−Ｒα２発現腫瘍細胞の処置において未だ対処されていない臨床的必要性を満たす。

本発明は、がんを処置するための抗ＩＬ−１３−Ｒα２抗体−薬物コンジュゲート、および使用方法を提供する。

本発明は、ヒトＩＬ−１３−Ｒα２に特異的に結合する単離抗体または抗原結合性断片であって、前記抗体が、配列番号１のＶＨ配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、ならびに配列番号５のＶＬ配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む、単離抗体または抗原結合性断片を提供する。

本発明はさらに、ヒトＩＬ−１３−Ｒα２に特異的に結合する単離抗体または抗原結合性断片であって、前記抗体が、（ａ）配列番号２を含む重鎖ＣＤＲ１、（ｂ）配列番号３を含む重鎖ＣＤＲ２、（ｃ）配列番号４を含む重鎖ＣＤＲ３、（ｄ）配列番号６を含む軽鎖ＣＤＲ１、（ｅ）配列番号７を含む軽鎖ＣＤＲ２、および（ｆ）配列番号８を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む、単離抗体または抗原結合性断片を提供する。

本発明はさらに、ヒトＩＬ−１３−Ｒα２に特異的に結合する単離抗体または抗原結合性断片であって、前記単離抗体が、配列番号１の重鎖可変領域アミノ酸配列および配列番号５の軽鎖可変領域アミノ酸配列をさらに含む、単離抗体または抗原結合性断片を提供する。

本発明はさらに、ヒトＩＬ−１３−Ｒα２に特異的に結合する単離抗体または抗原結合性断片であって、前記単離抗体が、配列番号５０のアミノ酸配列を含む重鎖を含み、配列番号５１のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、単離抗体または抗原結合性断片を提供する。

本発明はさらに、ヒトＩＬ−１３−Ｒα２に特異的に結合する抗体またはその抗原結合性断片にコンジュゲートされた細胞傷害性剤を含む抗体−薬物コンジュゲートを提供する。

本発明はさらに、ヒトＩＬ−１３−Ｒα２に特異的に結合する抗体−薬物コンジュゲートであって、式：Ａｂ−（Ｌ−Ｄ）ｐを有し、式中、（ａ）Ａｂは、本発明の抗体またはその抗原結合性断片であり、（ｂ）Ｌ−Ｄは、リンカー−薬物部分であり、式中、Ｌはリンカーであり、Ｄは薬物であり、（ｃ）ｐは、１〜約８の整数である、抗体−薬物コンジュゲートを提供する。

本発明はさらに、ヒトＩＬ−１３−Ｒα２に特異的に結合する抗体−薬物コンジュゲートであって、リンカーが、マレイミドカプロイル（ｍｃ）およびマレイミドカプロイル−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＡ（ｖｃ）からなる群から選択される、抗体−薬物コンジュゲートを提供する。

本発明はさらに、ヒトＩＬ−１３−Ｒα２に特異的に結合する抗体−薬物コンジュゲートであって、リンカー−薬物部分が、実施例１４で示したｖｃ−０１０１またはｍｃ−３３７７と称される式を有する、抗体−薬物コンジュゲートを提供する。

本発明はさらに、ヒトＩＬ−１３−Ｒα２に特異的に結合する抗体−薬物コンジュゲートであって、Ａｂが、（ａ）配列番号１のＶＨ配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、ならびに（ｂ）配列番号５のＶＬ配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む、抗体−薬物コンジュゲートを提供する。

本発明はさらに、ヒトＩＬ−１３−Ｒα２に特異的に結合する抗体−薬物コンジュゲートであって、Ａｂが、（ａ）配列番号２を含む重鎖ＣＤＲ１、（ｂ）配列番号３を含む重鎖ＣＤＲ２、（ｃ）配列番号４を含む重鎖ＣＤＲ３、（ｄ）配列番号６を含む軽鎖ＣＤＲ１、（ｅ）配列番号７を含む軽鎖ＣＤＲ２、および（ｆ）配列番号８を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む、抗体−薬物コンジュゲートを提供する。

本発明はさらに、Ｌ−Ｄが、ｖｃ−０１０１、ｍｃ−３３７７、ｍｃ−０１３１、ＭａｌＰｅｇ−６１２１、ＭａｌＰｅｇ−０１３１、ｍｃ−６１２１、ｖｃ−３９０６、ｖｃ−６７８０、ｍｃ−８２６１、ｍｃ３９０６、およびＭａｌＰｅｇ−８２６１からなる群から選択される、抗体−薬物コンジュゲートを提供する。

本発明はさらに、ヒトＩＬ−１３−Ｒα２に特異的に結合する抗体−薬物コンジュゲートであって、改変されたシステイン残基に対する部位特異的コンジュゲーションを利用し、式：Ａｂ−（Ｌ−Ｄ）ｐ、またはその薬学的に許容できる塩を有し、式中、（ａ）Ａｂは、配列番号１に示したＶＨ配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；配列番号５に示したＶＬ配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；ならびに配列番号３３および配列番号３４のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸置換の少なくとも１つの対を含む改変されたＦｃ領域；または改変されたＦｃ領域ならびにＬ４４３Ｃ（配列番号２８）、Ｑ３４７Ｃ（配列番号２９）、ｋＫ１８３Ｃ（配列番号３１）、Ｌ４４３Ｃ／ｋＡ１１１Ｃ（配列番号：２８および３０）、Ｌ４４３Ｃ／ｋＫ１８３Ｃ（配列番号：２８および３１）、Ｑ３４７Ｃ／ｋＡ１１１Ｃ（配列番号：２９および３０）、およびＱ３４７Ｃ／ｋＫ１８３Ｃ（配列番号：２９および３１）からなる群から選択される少なくとも１種の改変された軽鎖定常領域を含む抗体またはその抗原結合性断片であり、（ｂ）Ｌ−Ｄは、リンカー−薬物部分であり、式中、Ｌはリンカーであり、Ｄは薬物であり、（ｃ）ｐは、１〜約８の整数である、抗体−薬物コンジュゲートを提供する。

本発明はさらに、改変されたシステイン残基に対する部位特異的コンジュゲーションを利用する上述した抗体−薬物コンジュゲートであって、リンカー−薬物部分が、実施例１４で示したｖｃ−０１０１もしくはｍｃ−３３７７と称される式、またはその薬学的に許容できる塩もしくは溶媒和物形態を有し、ｐは、約４の整数である、抗体−薬物コンジュゲートを提供する。

本発明はさらに、多官能性抗体コンジュゲート（ＭＡＣ：Ｍｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）技術を利用する本発明の抗体−薬物コンジュゲートであって、前記抗体またはその抗原結合部分が、ヒトＩＬ−１３Ｒα２に特異的に結合し、抗体が、配列番号５２に示したＬＣの１８５位で変異Ｄ１８５Ａを有し、配列番号４９のＬＣのＫ１８８の側鎖に付着したリンカーによって少なくとも１つの薬物部分に共有結合的にコンジュゲートされており、薬物部分が、実施例１３に示した０１０１もしくは３３７７と称される式、またはその薬学的に許容できる塩もしくは溶媒和物形態を有し、ｐが、下限を約１．５、約１．６、約１．７、約１．８、約１．９、および約２．０からなる群から選択することができ、上限を約２．０、約２．１、約２．２、約２．３、約２．４、約２．５からなる群から選択することができる範囲内の整数である、抗体−薬物コンジュゲートを提供する。いくつかの態様では、ｐは、約２である。

本発明はさらに、本発明の抗体−薬物コンジュゲート、および薬学的に許容できる担体を含む医薬組成物を提供する。

本発明はさらに、それを必要とする患者においてＩＬ−１３−Ｒα２発現がんを処置する方法であって、本発明の抗体−薬物コンジュゲートを前記患者に投与するステップを含む、方法を提供する。

本発明はさらに、ＩＬ−１３−Ｒα２発現がんを処置する方法であって、前記がんが、膀胱、乳房、子宮頸、大腸、悪性神経膠腫、子宮内膜、腎臓、肺、食道、卵巣、前立腺、膵臓、黒色腫、胃、および精巣の癌腫からなる群から選択される、方法を提供する。

より好ましくは、本発明は、ＩＬ−１３−Ｒα２発現がんを処置する方法であって、前記がんが、肺がん、大腸がん、胃がん、膵臓がん、卵巣がん、悪性神経膠腫、および黒色腫からなる群から選択される、方法を提供する。

本発明はさらに、療法で使用するための本発明の抗体−薬物コンジュゲートを提供する。

本発明はさらに、療法用医薬を製造するための本発明の抗体−薬物コンジュゲートの使用を提供する。

本発明はさらに、ＩＬ−１３−Ｒα２発現がんを処置するためのものである、本発明の抗体−薬物コンジュゲートの使用を提供する。

本発明はさらに、ＩＬ−１３−Ｒα２抗体をコードする核酸、前記核酸を含むベクター、および前記ベクターを含む宿主細胞を提供する。

本発明はさらに、ＩＬ−１３−Ｒα２抗体を生産するための方法であって、上述したベクターを含む宿主細胞を培養するステップと、細胞培養物から抗体を回収するステップとを含む、方法を提供する。

本発明はさらに、ＩＬ−１３−Ｒα２抗体−薬物コンジュゲートを生産するための方法であって、（ａ）マレイミドカプロイルおよびマレイミドカプロイル−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＡからなる群から選択されるリンカーを０１０１および３３７７からなる群から選択される薬物に連結し、リンカー−薬物部分をもたらすステップと、（ｂ）前記リンカー−薬物部分を上記に示したものの細胞培養物から回収した抗体にコンジュゲートするステップと、（ｃ）抗体−薬物コンジュゲートを精製するステップとを含む、方法を提供する。

本発明はさらに、本発明の抗体またはその抗原結合性断片と、ヒトＩＬ−１３−Ｒα２への特異的結合について競合する単離抗体を提供する。

本発明はさらに、ヒトＩＬ−１３−Ｒα２への特異的結合のための本発明の抗体またはその抗原結合性断片を含む抗体−薬物コンジュゲートを提供する。

本発明はさらに、がんを有する対象が本発明の抗体−薬物コンジュゲートに応答するか否かを予測するための方法であって、対象に由来する前記がんの生体試料がｈＩＬ−１３−Ｒα２を発現するか否かを判定するステップを含む、方法を提供する。

本発明はさらに、生体試料中のｈＩＬ−１３−Ｒα２のレベルを判定する方法であって、本発明の抗体を使用したイムノアッセイで、がんを有すると疑われる対象に由来する試料を試験するステップと、前記試料におけるｈＩＬ−１３−Ｒα２の細胞表面レベルを判定するステップと、ｈＩＬ−１３−Ｒα２の細胞表面レベルを参照対象または標準物質のものと比較するステップとを含む、方法を提供する。

本発明はさらに、ＩＬ−１３−Ｒα２発現がんを処置する方法であって、生体試料中のｈＩＬ−１３−Ｒα２のレベルを判定するステップと、本発明の抗体−薬物コンジュゲートを投与するステップとを含み、前記判定するステップが、本発明の抗体を使用したイムノアッセイで、がんを有すると疑われる対象に由来する試料を試験するサブステップと、前記試料におけるｈＩＬ−１３−Ｒα２の細胞表面レベルを判定するサブステップと、ｈＩＬ−１３−Ｒα２の細胞表面レベルを正常な参照対象または標準物質のものと比較するサブステップとを含む、方法を提供する。

ｈＩＬ−１３Ｒα１ではなく、ｈＩＬ−１３−Ｒα２へのキメラ抗体ｃｈ０７およびｃｈ０８の結合特異性を示す図である。 図２Ａ：ｃｈ０７、ｃｈ０８、ならびに抗体ＭＡＢ６１４およびａｂ２７４１４が、ＩＬ−１３Ｒα２への別個の結合エピトープを有することを示す図である。 図２Ｂ：ｃｈ０７、ｃｈ０８、ならびに抗体ＭＡＢ６１４およびａｂ２７４１４が、ＩＬ−１３Ｒα２への別個の結合エピトープを有することを示す図である。 図２Ｃ：ｃｈ０７およびｃｈ０８が結合における競合を欠くことを示すＢｉａｃｏｒｅ分析を示す図である。 ｃｈ０７およびｃｈ０８が非中和抗体であることを示す図である。 図４Ａ：配列番号１〜５５を示す図である。 図４Ｂ：配列番号１〜５５を示す図である。 図４Ｃ：配列番号１〜５５を示す図である。 図４Ｄ：配列番号１〜５５を示す図である。 図４Ｅ：配列番号１〜５５を示す図である。 図４Ｆ：配列番号１〜５５を示す図である。 図４Ｇ：配列番号１〜５５を示す図である。

本発明は、がんを処置するためのＩＬ−１３−Ｒα２抗体−薬物コンジュゲートを提供する。本発明がより容易に理解されるために、ある特定の用語および一般的な技法を最初に定義する。

本開示で使用されるすべてのアミノ酸の略語は、連邦規則法典第３７巻§１．８２２（ｄ）（１）に示された米国特許商標庁によって認められているものである。

本明細書で別段の定義のない限り、本発明に関連して使用される科学用語および技術用語は、当業者によって一般に理解される意味を有するものとする。さらに、脈絡による別段の要求のない限り、単数形の用語は、複数存在することを含むものとし、複数形の用語は、単数形を含むものとする。一般に、本明細書に記載の細胞および組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学、ならびにタンパク質および核酸化学、ならびにハイブリダイゼーションに関連して使用される命名法、ならびにこれらの技法は、当技術分野で周知であり、一般に使用されるものである。

本発明の方法および技法は一般に、別段の指定のない限り、当技術分野で周知であり、かつ本明細書全体にわたって引用され、論じられている様々な一般的な、およびより具体的な参考文献に記載されている従来法に従って実施される。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ．＆Ｒｕｓｓｅｌｌ Ｄ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、３版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（２０００）、Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗｉｌｅｙ，Ｊｏｈｎ＆Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．（２００２）、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（１９９８）、ならびにＣｏｌｉｇａｎら、Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｗｉｌｅｙ，Ｊｏｈｎ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（２００３）を参照。

「抗体」または「Ａｂ」は、免疫グロブリン分子であって、この免疫グロブリン分子の可変領域内に位置した少なくとも１つの抗原認識部位によって標的、例えば、炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、ポリペプチドなどに特異的に結合することができる、免疫グロブリン分子である。本明細書において、用語「抗体」は、インタクトなポリクローナルまたはモノクローナル抗体だけでなく、これらの任意の抗原結合性断片（すなわち、「抗原結合性部分」）または単鎖、抗体を含む融合タンパク質、ならびに例えば、限定することなく、ｓｃＦｖ、単一ドメイン抗体（例えば、サメおよびラクダ抗体）、マキシボディ、ミニボディ、イントラボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ｖ−ＮＡＲ、およびビス−ｓｃＦｖを含めた、抗原認識部位を含む免疫グロブリン分子の任意の他の修飾された配置を包含する（例えば、ＨｏｌｌｉｎｇｅｒおよびＨｕｄｓｏｎ、２００５、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２３（９）：１１２６〜１１３６を参照）。抗体には、任意のクラスの抗体、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、もしくはＩｇＭ（またはこれらのサブクラス）などが含まれ、抗体は、任意の特定のクラスのものである必要はない。その重鎖の定常領域の抗体アミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンは、異なるクラスに割り当てることができる。免疫グロブリンの５つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭが存在し、これらのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２にさらに分類されうる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常領域は、アルファ、デルタ、イプシロン、ガンマ、およびミューとそれぞれ呼ばれる。免疫グロブリンの異なるクラスのサブユニット構造および３次元配置は、周知である。

用語「単離された」は、その自然環境を実質的に含まない分子を指す。例えば、単離抗体は、それが由来した細胞または組織の源に由来する細胞物質または他のタンパク質を実質的に含まない。

用語の抗体の「抗原結合性断片」は、本明細書において、所与の抗原（例えば、標的ＩＬ−１３−Ｒα２）に特異的に結合する能力を保持するインタクト抗体の１つまたは複数の断片を指す。抗体の抗原結合機能は、インタクト抗体の断片によって実施されうる。用語の抗体の「抗原結合性部分」の中に包含される結合性断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片、抗体の単一アームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片、単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）断片（Ｗａｒｄら、１９８９、Ｎａｔｕｒｅ、３４１：５４４〜５４６）、ならびに単離された相補性決定領域（ＣＤＲ：ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ）がある。

抗体の「可変領域」は、単独で、または組み合わせて、抗体軽鎖の可変領域（ＶＬ）または抗体重鎖の可変領域（ＶＨ）を指す。当技術分野で公知であるように、重鎖および軽鎖の可変領域はそれぞれ、超可変領域としても公知である３つの相補性決定領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）によって接続された４つのフレームワーク領域（ＦＲ：ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｒｅｇｉｏｎ）からなり、抗体の抗原結合性部位の形成に寄与する。特にＣＤＲ領域の外側（すなわち、フレームワーク領域内）のアミノ酸残基内に置換を有する、対象可変領域のバリアントが望まれる場合、適切なアミノ酸置換、好ましくは保存的アミノ酸置換は、対象可変領域を、対象可変領域と同じカノニカルクラス内のＣＤＲ１およびＣＤＲ２配列を含有する他の抗体の可変領域と比較することによって同定することができる（ＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ、１９６（４）：９０１〜９１７、１９８７）。対象ＣＤＲに隣接するようにＦＲを選択するとき、例えば、抗体をヒト化または最適化するとき、同じカノニカルクラス内のＣＤＲ１およびＣＤＲ２配列を含有する抗体に由来するＦＲが好適である。

可変ドメインの「ＣＤＲ」は、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＫａｂａｔおよびＣｈｏｔｈｉａの両方の蓄積、ＡｂＭ、接触、ならびに／もしくはコンホメーション定義の定義、または当技術分野で周知のＣＤＲの決定の任意の方法に従って同定される可変領域内のアミノ酸残基である。抗体ＣＤＲは、Ｋａｂａｔらによって最初に定義された超可変領域として同定することができる。例えば、Ｋａｂａｔら、１９９２、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、５版、Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、ＮＩＨ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．を参照。ＣＤＲの位置は、Ｃｈｏｔｈｉａらによって最初に記載された構造的ループ構造としても同定することができる。例えば、Ｃｈｏｔｈｉａら、１９８９、Ｎａｔｕｒｅ、３４２：８７７〜８８３を参照。ＣＤＲ同定の他の手法には、ＫａｂａｔとＣｈｏｔｈｉａの折衷であり、Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ製ＡｂＭ抗体モデル化ソフトウェア（現在ではＡｃｃｅｌｒｙｓ（登録商標））を使用して導出される「ＡｂＭ定義」、またはＭａｃＣａｌｌｕｍら、１９９６、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２６２：７３２〜７４５に示された、観察される抗原接触に基づくＣＤＲの「接触定義」がある。ＣＤＲの「コンホメーション定義」として本明細書で呼ばれる別の手法では、ＣＤＲの位置は、抗原結合にエンタルピー的寄与をする残基として同定されうる。例えば、Ｍａｋａｂｅら、２００８、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２８３：１１５６〜１１６６を参照。さらに他のＣＤＲ境界定義は、上記手法の１つに厳密に従わない場合があるが、特定の残基もしくは残基の群、またはさらにはＣＤＲ全体が抗原結合に著しく影響を与えないという予測または実験的知見を踏まえて、短く、または長くなっていることがあるものの、それでもやはりＫａｂａｔ ＣＤＲの少なくとも一部と重複する。本明細書において、ＣＤＲは、手法の組合せを含めて当技術分野で公知の任意の手法によって定義されるＣＤＲを指すことができる。本明細書で使用される方法は、これらの手法のいずれかによって定義されるＣＤＲを利用することができる。１つを超えるＣＤＲを含有する任意の所与の実施形態について、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、拡張、ＡｂＭ、接触、および／またはコンホメーション定義のいずれかに従って定義されうる。

本明細書で互換的に使用される用語「ＩｇＧ Ｆｃ領域」、「Ｆｃ領域」、「Ｆｃドメイン」、および「Ｆｃ」は、ＩｇＧ分子のパパイン消化によって得られる結晶化可能断片に相関するＩｇＧ分子の一部を指す。Ｆｃ領域は、ジスルフィド結合によって連結されたＩｇＧ分子の２本の重鎖のＣ末端の半分からなる。これは、抗原結合性活性をまったく有さないが、炭水化物部分、ならびに補体およびＦｃＲｎ受容体を含めたＦｃ受容体の結合部位を含有する（以下を参照）。Ｆｃ断片は、第２の定常ドメインＣＨ２全体（Ｋａｂａｔ番号付けシステムによるヒトＩｇＧ１の残基２３１〜３４０）、および第３の定常ドメインＣＨ３（残基３４１〜４４７）を含有する。

本明細書で互換的に使用される用語「改変されたＦｃポリペプチド」、「改変されたＦｃ領域」、および「改変されたＦｃ」は、少なくとも１つの変異、例えば、アミノ酸置換を含み、コンジュゲーションのための部位を導入しているＦｃポリペプチドまたはその部分を意味する。好ましくは、変異は、その位置で天然に存在するアミノ酸残基の代わりにシステインを導入し、この場合変異は、Ｆｃに１つの部分をコンジュゲートするための反応部位（例えば、反応性スルフヒドリル基）を作り出す。

用語「モノクローナル抗体」または「ｍＡｂ」は、例えば、任意の真核生物、原核生物、またはファージクローンを含めた単一のコピーまたはクローンから得られるが、それが生成される方法から得られない抗体を指す。好ましくは、本発明のモノクローナル抗体は、均質または実質的に均質な集団内に存在する。

「ヒト化」抗体は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含有するキメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖、またはこれらの断片（Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、もしくは抗体の他の抗原結合性部分配列など）である非ヒト（例えば、マウス）抗体の形態を指す。好ましくは、ヒト化抗体は、レシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）に由来する残基が、所望の特異性、親和性、および能力を有する非ヒト種（ドナー抗体）、例えば、マウス、ラット、またはウサギなどのＣＤＲに由来する残基によって置き換えられているヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。

「ヒト抗体」または「完全ヒト抗体」は、ヒト抗体遺伝子を担持するトランスジェニックマウスまたはヒト細胞に由来する抗体を指す。

用語「キメラ抗体」は、可変領域配列が１つの種に由来し、定常領域配列が別の種に由来する抗体、例えば、可変領域配列がマウス抗体に由来し、定常領域配列がヒト抗体に由来する抗体などを指すように意図されている。

「治療剤」は、がん細胞または活性化免疫細胞に対して細胞傷害性効果、細胞増殖抑制効果、および／または免疫調節効果を発揮する作用物質である。治療剤の例としては、細胞傷害性剤、化学療法剤、細胞増殖抑制剤、および免疫調節剤がある。

「化学療法剤」は、がんの処置において有用な化学化合物である。

「細胞傷害性効果」は、標的細胞の枯渇、排除、および／または死滅を指す。「細胞傷害性剤」は、細胞に対して細胞傷害性効果および／または細胞増殖抑制効果を有する作用物質を指す。

「細胞増殖抑制効果」は、細胞増殖の阻害を指す。「細胞増殖抑制剤」は、細胞に対する細胞増殖抑制効果を有し、それによって細胞の特定のサブセットの増殖および／または拡張を阻害する作用物質を指す。

「抗体−薬物コンジュゲート」または「ＡＤＣ（ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）」は、ＩＬ−１３−Ｒα２に結合し、細胞傷害性剤、細胞増殖抑制剤、および／または治療剤とコンジュゲートされている抗体誘導体を含めた抗体またはこれらの抗体断片を指す。

「抗ＩＬ−１３−Ｒα２抗体−薬物コンジュゲート」は、リンカー（Ｌ）を介して細胞傷害性薬（Ｄ）に連結された本明細書に記載の抗ＩＬ−１３−Ｒα２抗体またはその抗原結合性断片を指す。

「リンカー（Ｌ）」は、抗体の薬物への直接的または間接的連結を記述する。リンカーのｍＡｂへの付着は、様々な方法で、例えば、表面リシン、酸化された炭水化物への還元的カップリング、および鎖間ジスルフィド連結を還元することによって遊離されたシステイン残基などによって達成されうる。ヒドラゾン、ジスルフィド、およびペプチドベース連結を含めた様々なＡＤＣ連結系が当技術分野で公知である。

「薬物（Ｄ）」は、生物学的または検出可能な活性を有する任意の物質、例えば、治療剤、検出可能標識、結合剤など、およびｉｎ ｖｉｖｏで活性剤に代謝されるプロドラッグである。薬物、薬物部分、ペイロード、および化合物という用語は、互換的に使用される。

「Ｌ−Ｄ」は、リンカー（Ｌ）に連結した細胞傷害性薬（Ｄ）から生じるリンカー薬物部分である。

用語「エピトープ」は、抗体の抗原結合性領域の１つまたは複数において抗体によって認識され得、結合されうる分子の部分を指す。エピトープは、分子の化学的に活性な表面基、例えば、アミノ酸または糖側鎖などからなり、特定の３次元構造特性および特定の帯電特性を有することが多い。用語「抗原エピトープ」は、本明細書において、当技術分野で周知の任意の方法、例えば、慣例的なイムノアッセイによって判定される場合に抗体が特異的に結合することができるポリペプチドの部分として定義される。「非直線エピトープ」または「立体構造エピトープ」は、エピトープに特異的な抗体が結合する抗原タンパク質内に非連続的なポリペプチド（またはアミノ酸）を含む。抗原上の所望のエピトープが決定されると、例えば、本明細書に記載の技法を使用してそのエピトープに対する抗体を生成することが可能である。発見プロセスの間に、抗体の生成および特徴付けにより、望ましいエピトープについての情報を解明することができる。この情報から、次いで同じエピトープへの結合について抗体を競合的にスクリーニングすることが可能である。これを実現する一手法は、競合および交差競合試験を行って、互いに競合または交差競合する抗体、例えば、抗原への結合について競合する抗体を見つけることである。

用語「結合親和性（Ｋ_Ｄ）」は、本明細書において、特定の抗原−抗体相互作用の解離速度を指すように意図されている。Ｋ_Ｄは、「オフ速度（Ｋ_ｏｆｆ）」とも呼ばれる解離の速度（Ｋ_ｄ）と結合速度（Ｋ_ａ）または「オン速度（ｋ_ｏｎ）」の比である。したがってＫ_Ｄは、ｋ_ｏｆｆ／ｋ_ｏｎに等しく、モル濃度（Ｍ）として表される。Ｋ_Ｄが小さいほど結合の親和性がより強いことになる。したがって、１μＭのＫ_Ｄは、１ｎＭのＫ_Ｄと比較して弱い結合親和性を示す。抗体のＫ_Ｄ値は、当技術分野で十分確立した方法を使用して判定されうる。抗体のＫ_Ｄを判定するための一方法は、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）システムなどのバイオセンサーシステムを一般に使用する表面プラズモン共鳴を使用することによるものである。

用語「特異的に結合する」は、抗体とＩＬ−１３−Ｒα２抗原との間の結合を参照して本明細書で使用される場合、抗体が２５℃で表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ：ｓｕｒｆａｃｅ ｐｌａｓｍｏｎ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）によって判定される場合に約３０ｎＭ未満のＫ_ＤでＩＬ−１３−Ｒα２抗原に結合することを意味する。

「薬学的に許容できる塩」は、本明細書において、分子または巨大分子の薬学的に許容できる有機塩または無機塩を指す。

用語「効力」は、生物活性の大きさであり、実施例１５に記載したようにＩＬ−１３−Ｒα２陽性細胞株の増殖を５０％阻害するのに必要とされる抗原ＩＬ−１３−Ｒα２に対する抗体または抗体薬物コンジュゲートのＩＣ_５０または阻害濃度と称されうる。

「ＥＣ５０」は、結合能力の大きさであり、ベースラインと最大の間の中間の応答を生じるのに必要とされる抗体または抗体−薬物コンジュゲートの半最大有効濃度として定義される。

語句「有効量」または「治療有効量」は、本明細書において、所望の治療結果を実現するのに必要な量（投与量で、かつ緒時間にわたる、かつ緒手段の投与についての）を指す。有効量は、対象に治療上の利益を付与するのに必要である、活性剤の少なくとも最低量であるが、有毒な量未満である。

本発明の抗体の生物活性に関して本明細書で使用される用語「阻害する」または「中和する」は、例えば、それだけに限らないが、生物活性を含めた阻害されているものの進行または重症度を実質的に相殺し、禁止し、防止し、抑制し、遅延させ、妨害し、排除し、停止させ、低減し、または後退させる抗体の能力を意味する。

抗体に関して本明細書で使用される用語「競合する」は、第１の抗体またはその抗原結合性部分が、第２の抗体またはその抗原結合性部分の結合と十分に類似した様式でエピトープに結合し、その結果、第１の抗体のその同族エピトープとの結合の結果が、第２の抗体の非存在下での第１の抗体の結合と比較して、第２の抗体の存在下で検出可能な程度に減少することを意味する。あるいは、第２の抗体のそのエピトープへの結合がまた、第１の抗体の存在下で検出可能な程度に減少してもよいが、そうである必要はない。すなわち、第１の抗体は、第２の抗体が第１の抗体のそのそれぞれのエピトープへの結合を阻害することなく、第２の抗体のそのエピトープへの結合を阻害することができる。しかし、各抗体が他の抗体のその同族エピトープまたはリガンドとの結合を、同じ程度であっても、より大きい程度であっても、より小さい程度であっても検出可能な程度に阻害する場合、抗体は、これらのそれぞれのエピトープの結合を互いに「交差競合する」と言われる。競合および交差競合抗体の両方が本発明によって包含されている。このような競合または交差競合が起こる機構（例えば、立体障害、コンホメーション変化、または共通エピトープもしくはその部分への結合）にかかわらず、当業者は、本明細書に提供される教示に基づいて、このような競合および／または交差競合抗体は、包含され、本明細書に開示の方法に関して有用でありうることを理解する。

用語「ポリヌクレオチド」または「核酸分子」は、本明細書において、ＤＮＡ分子およびＲＮＡ分子を含むように意図されている。核酸分子は、一本鎖であっても二本鎖であってもよいが、好ましくは二本鎖ＤＮＡである。

本発明の抗体をコードするポリヌクレオチドとして、以下、すなわち、バリアントのコード配列のみ、バリアントのコード配列と機能性ポリペプチドなどの追加のコード配列、あるいはシグナル配列もしくは分泌配列またはプロタンパク質配列、抗体のコード配列と非コード配列、例えば、抗体のコード配列の５’および／もしくは３’のイントロンまたは非コード配列などを挙げることができる。用語「抗体をコードするポリヌクレオチド」は、バリアントの追加のコード配列を含むポリヌクレオチドを包含するが、追加のコード配列および／または非コード配列を含むポリヌクレオチドも包含する。特定の宿主細胞／発現系について最適化されたポリヌクレオチド配列は、所望のタンパク質のアミノ酸配列から容易に得ることができることが当技術分野で公知である（ＧＥＮＥＡＲＴ ＡＧ、Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ、ドイツを参照）。

「宿主細胞」には、ポリヌクレオチドインサートを組み込むためのベクターのレシピエントでありうる、またはそれであった個々の細胞または細胞培養物が含まれる。宿主細胞には、単一宿主細胞の子孫が含まれ、子孫は、天然の、偶発的な、または意図的な変異に起因して最初の親細胞と必ずしも完全に同一でない場合がある（モルフォロジーにおいて、またはゲノムＤＮＡ補体において）。宿主細胞には、本発明のポリヌクレオチドをｉｎ ｖｉｖｏでトランスフェクトされた細胞が含まれる。

用語「ベクター」は、宿主細胞内で対象とする１種または複数の遺伝子または配列を送達し、好ましくは発現することができるコンストラクトを意味する。ベクターの例としては、それだけに限らないが、ウイルスベクター、裸のＤＮＡまたはＲＮＡ発現ベクター、プラスミド、コスミドまたはファージベクター、カチオン性縮合剤に付随したＤＮＡまたはＲＮＡ発現ベクター、リポソーム内に被包されたＤＮＡまたはＲＮＡ発現ベクター、および産生細胞などのある特定の真核細胞がある。

用語「発現制御配列」は、核酸の転写を指示する核酸配列を意味する。発現制御配列は、プロモーター、例えば、構成的プロモーターもしくは誘導プロモーターなど、またはエンハンサーでありうる。発現制御配列は、転写される核酸配列に作動可能に連結されている。

本発明の抗体をコードするポリヌクレオチドは一般に、当技術分野で公知の天然に付随した、または非相同のプロモーター領域を含む、抗体コード配列に作動可能に連結された発現制御ポリヌクレオチド配列を含むことになる。好ましくは、発現制御配列は、真核生物宿主細胞を形質転換し、またはトランスフェクトすることができるベクター内の真核生物プロモーター系であるが、原核生物宿主の制御配列も使用されうる。ベクターが適切な宿主細胞株に組み込まれると、宿主細胞は、ヌクレオチド配列を発現するのに、かつ望まれる場合、抗体の収集および精製に適した条件下で増殖される。好適な真核細胞株としては、ＣＨＯ細胞株、様々なＣＯＳ細胞株、ＨｅＬａ細胞、骨髄腫細胞株、形質転換Ｂ細胞、またはヒト胚腎臓細胞株がある。最も好適な宿主細胞は、ＣＨＯ細胞株である。

抗体
本発明の抗体は、当技術分野で周知の技法、例えば、組換え技術、ファージディスプレイ技術、合成技術、もしくはこのような技術の組合せ、または当技術分野で容易に分かる他の技術を使用して生産することができる（例えば、Ｊａｙａｓｅｎａ，Ｓ．Ｄ．、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．、４５：１６２８〜５０（１９９９）、およびＦｅｌｌｏｕｓｅ，Ｆ．Ａ．ら、Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．、３７３（４）：９２４〜４０（２００７）を参照）。

以下の表１および表２は、本発明の抗体の好適なＣＤＲを表す。

本発明の一実施形態は、
ａ）
ｉ）配列番号６および１４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１
ｉｉ）配列番号７および１５からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ２
ｉｉｉ）配列番号８および１６からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ３
を含む軽鎖可変領域
ｂ）
ｉ）配列番号２および１０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１
ｉｉ）配列番号３および１１からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２
ｉｉｉ）配列番号４および１２からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３
を含む重鎖可変領域
を含む抗体または抗原結合性断片を含む。

本発明の好適な抗体またはその抗原結合性部分は、
ａ）配列番号６のＬＣＤＲ１、配列番号７のＬＣＤＲ２、および配列番号８のＬＣＤＲ３を含むＬＣＶＲ、ならびに
ｂ）配列番号２のＨＣＤＲ１、配列番号３のＨＣＤＲ２、および配列番号４のＨＣＤＲ３を含むＨＣＶＲ
を含む。

本発明の別の好適な抗体またはその抗原結合性部分は、
ａ）配列番号１４のＬＣＤＲ１、配列番号１５のＬＣＤＲ２、および配列番号１６のＬＣＤＲ３を含むＬＣＶＲ、ならびに
ｂ）配列番号１０のＨＣＤＲ１、配列番号１１のＨＣＤＲ２、および配列番号１２のＨＣＤＲ３を含むＨＣＶＲ
を含む。

本発明の好適なモノクローナル抗体は、ｈｕ０８（ヒト化抗ＩＬ−１３−Ｒα２ ＩｇＧ１抗体）、およびｈｕ０７（ヒト化抗ＩＬ−１３−Ｒα２ ＩｇＧ１抗体）と本明細書で呼ばれる。ｍＡｂ ｈｕ０８およびｈｕ０７をコードするアミノ酸配列の配列番号を以下の表３に示す。

本発明の一実施形態は、配列番号１と少なくとも９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である第１のアミノ酸配列、および配列番号５と少なくとも９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である第２のアミノ酸配列を含む抗体と同じＩＬ−１３Ｒα２エピトープに特異的に結合する抗体または抗原結合性断片である。

本発明の別の実施形態は、配列番号４８と少なくとも９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である第１のアミノ酸配列、および配列番号４１と少なくとも９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である第２のアミノ酸配列を含む抗体と同じＩＬ−１３Ｒα２エピトープに特異的に結合する抗体または抗原結合性断片である。

いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、ＩＬ−１３Ｒα２に特異的に結合し、この抗体またはその断片は、配列番号１と少なくとも９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である第１のアミノ酸配列、および配列番号５と少なくとも９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である第２のアミノ酸を含む抗体の結合を競合的に阻害する。

いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、ＩＬ−１３Ｒα２に特異的に結合し、この抗体またはその断片は、配列番号４８と少なくとも９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である第１のアミノ酸配列、および配列番号４１と少なくとも９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である第２のアミノ酸配列を含む抗体の結合を競合的に阻害する。

本発明の代表的な材料は、２０１２年１１月６日にアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ：Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）に寄託した。ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１３３０４を有するベクターは、ｈｕ０８−ＶＬｖ１．０と称されるヒト抗ＩＬ−１３抗体軽鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドであり、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１３３０５を有するベクターは、ｈｕ０８−ＶＨｖ１．０と称されるヒト抗ＩＬ−１３抗体重鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドである。寄託は、特許手続上の微生物の寄託の国際承認に関するブダペスト条約の条項およびその下の規定（ブダペスト条約）の下で行った。これは、寄託の日付から３０年間寄託物の生存培養の維持を保証する。寄託物は、ブダペスト条約の条項の下で、かつＰｆｉｚｅｒ、Ｉｎｃ．とＡＴＣＣとの協定に準拠してＡＴＣＣによって利用可能にされ、それは、関係する米国特許の発行の後、または米国もしくは外国特許出願のいずれか早い方の公衆への公開の後に寄託物の培養の子孫の公衆への永続的かつ非制限的利用可能性を保証し、米国特許商標庁長官によって、米国特許法第１２２条およびそれに準じた長官規則（８８６ＯＧ６３８を特に参照した連邦規則法典第３７巻第１．１４条を含む）に従ってその資格を与えると決定された者への子孫の利用可能性を保証する。

薬物部分の抗体へのコンジュゲーション
薬物部分は、抗体のコンジュゲーションポイントと反応性である基を有し、またはこの基を含むように修飾されている。例えば、薬物部分は、アルキル化（例えば、抗体のイプシロン−アミノ基リシンまたはＮ末端における）、酸化された炭水化物の還元的アミノ化、ヒドロキシル基とカルボキシル基との間のエステル交換、アミノ基またはカルボキシル基におけるアミド化、およびチオールへのコンジュゲーションによって付着させることができる。いくつかの実施形態では、１抗体分子当たりにコンジュゲートされる薬物部分の数、ｐは、平均で１〜８、１〜７、１〜６、１〜５、１〜４、１〜３、または１〜２の範囲となる。いくつかの実施形態では、ｐは、平均で２〜８、２〜７、２〜６、２〜５、２〜４、または２〜３の範囲となる。他の実施形態では、ｐは、平均で１、２、３、４、５、６、７、または８である。いくつかの実施形態では、ｐは、約１〜約８、約１〜約７、約１〜約６、約１〜約５、約１〜約４、約１〜約３、または約１〜約２の範囲となる。いくつかの実施形態では、ｐは、約２〜約８、約２〜約７、約２〜約６、約２〜約５、約２〜約４、または約２〜約３の範囲となる。コンジュゲーションに使用されうる化学反応の例については、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．）、１５章（Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）を参照。

リンカー
薬物部分は、リンカーによって抗体に連結されうる。適当なリンカーとしては、例えば、切断可能および切断不可能リンカーがある。切断可能リンカーは一般に、細胞内条件下で切断に対して感受性である。適当な切断可能リンカーとしては、例えば、細胞内プロテアーゼ、例えば、リソソームプロテアーゼまたはエンドソームプロテアーゼなどによって切断可能なペプチドリンカーがある。例示的な実施形態では、リンカーは、ジペプチドリンカー、例えば、バリン−シトルリン（ｖａｌ−ｃｉｔ）、フェニルアラニン−リシン（ｐｈｅ−ｌｙｓ）リンカー、またはマレイミドカプロニック−バリン−シトルリン−ｐ−アミノベンジルオキシカルボニル（ｖｃ）リンカーなどでありうる。別のリンカーは、スルホスクシンイミジル−４−［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ｓｍｃｃ）である。スルホ−ｓｍｃｃコンジュゲーションは、スルフヒドリル（チオール、−ＳＨ）と反応するマレイミド基を介して起こり、一方、そのスルホ−ＮＨＳエステルは、一級アミンに対して反応性である（リシンおよびタンパク質またはペプチドＮ末端において見つかるように）。さらに別のリンカーは、マレイミドカプロイル（ｍｃ）である。他の適当なリンカーには、ヒドラゾンリンカーなどの特定のｐＨまたはｐＨ範囲で加水分解性のリンカーが含まれる。追加の適当な切断可能リンカーとしては、ジスルフィドリンカーがある。例えば、ｍｃリンカーなど、リンカーは、薬物が放出されるために抗体が細胞内に分解されなければならない程度に抗体に共有結合的に結合されている場合がある。

本発明の好適なリンカーは、マレイミドカプロニック−バリン−シトルリン−ｐ−アミノベンジルオキシカルボニル（ｖｃ）およびマレイミドカプロイル（ｍｃ）である。

改変されたＦｃポリペプチド
抗体の重鎖のＣＨ２もしくはＣＨ３ドメインの表面または軽鎖の定常ドメインにおそらく存在する、または別の方法でアクセス可能なある特定の残基は、天然に存在する野生型アミノ酸、例えば、システインとの置換に適しており、したがって、様々な作用物質にコンジュゲートすることができる部位を改変するのに有用であることが以前に報告されている（参照により本明細書に組み込まれている米国仮特許出願ＵＳＳＮ６１／５８０１６９を参照）。

アミノ酸修飾は、当技術分野で公知の任意の方法によって行うことができ、多くのこのような方法は、当業者にとって周知であり、常法である。例えば、限定するものではないが、アミノ酸置換、欠失、および挿入は、任意の周知のＰＣＲベースの技法を使用して達成されうる。アミノ酸置換は、部位特異的変異誘発によって行われうる（例えば、ＺｏｌｌｅｒおよびＳｍｉｔｈ、１９８２、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１０：６４８７〜６５００、ならびにＫｕｎｋｅｌ、１９８５、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ、８２：４８８を参照）。

いくつかの実施形態では、本開示の改変されたＦｃポリペプチドを、抗体またはその抗原結合性断片を調製するのに使用することができ、その結果、抗体またはその断片は、それによって改変されたＦｃ領域を含み、これは、多種多様な部分を改変された残基（すなわち、野生型無修飾Ｆｃと比較して置換されたアミノ酸）においてコンジュゲートするのに使用することができる。

いくつかの実施形態では、本開示の改変されたカッパ軽鎖定常ポリペプチドを、抗体またはその抗原結合性断片を調製するのに使用することができ、その結果、抗体またはその断片は、それによってアミノ酸変異またはその部分を含む改変されたＣＬ領域を含み、これは、多種多様な部分を改変されたアミノ酸残基においてコンジュゲートするのに使用することができる。

本発明のＩＬ−１３−Ｒα２抗体は、親、天然、または野生型抗体の、定常領域の番号方式がＫａｂａｔら（１９９１、ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ９１−３２４２、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｓｐｒｉｎｇｆｉｅｌｄ、ＶＡ、以下「Ｋａｂａｔ」）で示されたＥＵインデックスのものである抗体重鎖の３４７位、３９２位、３９８位、４２２位、および４４３位から選択される１、２、またはそれ以上のアミノ酸が、別のアミノ酸（天然および非天然／合成アミノ酸を含む）と置換された改変されたＦｃポリペプチドを包含しうる。

例えば、システイン残基のＦｃポリペプチド内の単一の置換は、通常、ＩｇＧ抗体分子のホモ二量体の性質に起因して結果として生じるＩｇＧ抗体内の２つの対応する残基をディスプレイすることに留意されるべきである。したがって、本発明の結果として生じる改変されたＩｇＧ抗体は、薬物または化合物にコンジュゲートする目的のために少なくとも１、２、３、４、またはそれ以上の反応基をディスプレイすることができる。一実施形態では、置換の１つまたは複数は、システイン残基とのものであり、得られる改変された抗体は、薬物または化合物にコンジュゲートする目的のために少なくとも１、２、３、４、またはそれ以上のチオール基をディスプレイすることができる。

他の実施形態では、本開示の改変されたＦｃポリペプチドは、抗体の重鎖の３４７位、３９２位、３９８位、４２２位、および４４３位から選択される１つまたは複数の置換を含み、ここで定常領域の番号方式は、Ｋａｂａｔら（上記）に示されたＥＵインデックスのものである。

いくつかの実施形態では、本開示の改変されたＦｃポリペプチドは、（ａ）配列番号３３のアミノ酸配列、および（ｂ）配列番号３４のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸置換の少なくとも１つの対を含む。

いくつかの実施形態では、本開示の改変されたＦｃポリペプチドは、（ａ）配列番号２８のアミノ酸配列、および（ｂ）配列番号２９のアミノ酸配列からなる群から選択される１つの置換を含む。

改変されたＣκポリペプチド
本発明のＩＬ−１３−Ｒα２抗体は、親、天然、または野生型抗体の、軽鎖定常領域の番号方式がＫａｂａｔら（１９９１、ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ９１−３２４２、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｓｐｒｉｎｇｆｉｅｌｄ、ＶＡ、以下「Ｋａｂａｔ」）で示されたＫａｂａｔ番号付けシステムのものである抗体軽鎖の１１１位、１８３位、または１８８位から選択される１、２、または３個のアミノ酸が、別のアミノ酸（天然および非天然／合成アミノ酸を含む）と置換された改変された抗体軽鎖定常領域（ＬＣ）またはその部分を包含しうる。

いくつかの実施形態では、本開示の改変されたＬＣポリペプチドは、（ａ）配列番号３０のアミノ酸配列、（ｂ）配列番号３１のアミノ酸配列、および（ｃ）配列番号３２のアミノ酸配列からなる群から選択される１つまたは複数の置換を含む。

他の実施形態では、多くの抗体の二量体の性質（例えば、ＩｇＧは、２本の軽鎖および２本の重鎖を含み、各重鎖は、Ｆｃポリペプチドを含む）に起因して、本発明の抗体は、少なくとも１つの改変されたＦｃポリペプチドを含むことができ、少なくとも１つの改変された軽鎖定常ポリペプチドをさらに含むことができ、それによって１つがＦｃポリペプチド内であり、別のものがＬＣポリペプチド内である少なくとも２つの部位特異的コンジュゲーション部位をもたらす。本発明の好適な抗体は、Ｌ４４３Ｃ／ｋＡ１１１Ｃ（配列番号２８および３０）、Ｌ４４３Ｃ／ｋＫ１８３Ｃ（配列番号２８および３１）、Ｑ３４７Ｃ／ｋＡ１１１Ｃ（配列番号２９および３０）、およびＱ３４７Ｃ／ｋＫ１８３Ｃ（配列番号２９および３１）からなる群から選択される少なくとも１つの改変されたＦｃポリペプチドおよび少なくとも１つの改変された軽鎖定常領域ポリペプチドを含む。

ＭＡＣコンジュゲーション技術
用語の多機能性抗体コンジュゲートまたはＭＡＣ（ｍｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）は、標的に対して生物学的効果を発揮する少なくとも１つの薬物部分に定常カッパ領域によって共有結合的にコンジュゲートされた本明細書で定義される抗体またはその抗原結合性部分を指す。好ましくは、抗体またはその抗原結合性部分は、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、または配列番号５５のＫ９０およびＨ９１を含み、薬物部分は、Ｋ９０でコンジュゲートされている。ＭＡＣ技術は、ＷＯ２０１２／００７８９６およびＵＳＳＮ６１／５８４，６７５に以前に記載されており、これらは、参照により本明細書に組み込まれている。

薬物部分は、標的に対して生物学的効果を発揮し、ペプチド、低分子、タンパク質、核酸分子、毒素、アプタマー、または抗原結合性抗体もしくはその断片でありうる。薬物部分は、標的細胞に対して細胞傷害活性を有する薬物であってもよい。いくつかの態様では、細胞毒は、オーリスタチンとして公知の化合物のクラス内にある。代表的なオーリスタチンは、実施例１３で本明細書に記載した化合物０１０１および３３７７である。

薬物部分の抗体の定常軽鎖ドメインとの反応は、抗体のＦｃ部分のＦｃ受容体（ＦｃγＲおよびＦｃＲｎなど）への結合、または抗体のそのそれぞれの標的への結合の任意の干渉を最小限にし、または防止するのに特に望ましい。反対に、それぞれの薬物部分の抗体のＦｃ部分へのコンジュゲーションは、ｉｎ ｖｉｖｏでの抗体半減期および／または免疫系と相互作用するその能力（エフェクター機能）を減少させる場合がある。抗体の可変重鎖（ＶＨ）または可変軽鎖（ＶＬ）領域内の薬物部分のコンジュゲーションは、抗体の結合を減少させるリスクを持つ。

ＭＡＣ技術の利点の１つは、試薬および反応条件（特に、脱離基エステル、およびリンカー抗体のモル比）に応じて、本発明の組成物および試料を、規定された数の抗体に対して規定された数の薬物部分を用いて生成することができることである。これは、薬物部分および抗体の相対的な反応性および治療ウインドウを均衡させるときに特に有用でありうる。さらに、いくつかの状況では、ある特定の閾値を越えて１抗体当たりの薬物部分の数を増やすと、標的結合または治療効果が増大しない場合がある。したがって、１抗体当たりのコンジュゲートされる薬物部分の数を制御し、そうすることにおいて、Ｆｃまたは結合部位の干渉を最小限にするようにコンジュゲーションの位置を指示することができることが有用である。したがっていくつかの状況では、ｈｕ０８ ＬＣ定常領域、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、または配列番号５５のＫ９０などの単一のリシン残基のみを優先的に装飾してコンジュゲーションを低減させる本発明の態様が有利でありうる。さらに、Ｋ９０へのコンジュゲーションは、信頼でき、ロバストである一方、それぞれがわずかに異なる反応性およびｐＩの他の抗体表面リシンへのコンジュゲーションは、時機を失したまたは不規則な時間、例えば、循環中および抗体認識による標的への薬物部分の送達の前などにコンジュゲート分子を放出しうるコンジュゲートされた抗体の不均質試料をもたらしうる。

本発明のさらなる態様は、野生型定常カッパ鎖（配列番号５５）のＤ７７のある特定の変異は、薬物コンジュゲーションのためのＫ９０部位のアクセシビリティおよび／または反応性を改善するという発見である。さらに、本発明は、カッパ鎖の４５位のＶ／Ａおよび８３位のＡ／Ｌの公知の多型を提供する（３つの同定されたヒト定常カッパ多型、Ｋｍ（１）：Ｖ４５／Ｌ８３、Ｋｍ（１，２）：Ａ４５／Ｌ８３、およびＫｍ（３）Ａ４５／Ｖ８３を与える）。したがって、本発明は、配列番号５３を含むＭＡＣを提供する。いくつかの態様では、本発明は、カッパ定常ドメインが配列番号５２、配列番号５４、および配列番号５５からなる群から選択されるＫｍ（３）多型のＭＡＣを提供する。

本発明はさらに、ヒトＩＬ−１３Ｒα２に特異的に結合する抗体であって、配列番号５２に示したＬＣ定常領域を有し、前記ＬＣ定常領域は、８０位のリシン残基（Ｋ８０）、および７７位のアスパラギン酸残基と置換されたアラニン残基（Ｄ７７Ａ）を有する、抗体を提供する。

本発明はさらに、ヒトＩＬ−１３Ｒα２に特異的に結合する抗体であって、配列番号５３に示したＬＣ定常領域を有し、４５位がＶまたはＡであり、８３位がＡまたはＬであり、７７位がＡ、Ｇ、Ｉ、Ｖ、Ｌ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｑ、Ｐ、Ｎ、Ｍ、Ｈ、およびＷからなる群から選択される、抗体を提供する。いくつかの態様では、４５位がＶである場合、８３位は、Ｌである。配列番号５３のいくつかの態様では、７７位は、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｖ、Ｌ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｑ、Ｐ、Ｎ、Ｍ、Ｈ、およびＷからなる群から選択される。配列番号５３における４５位および８３位の残基の可変性は、Ｋｍ（１）、Ｋｍ（１，２）、およびＫｍ（３）多型の任意の１つ、２つ、または３つすべてをもたらすだけであるように選択されうる。

本発明はさらに、ヒトＩＬ−１３Ｒα２に特異的に結合する抗体であって、配列番号５４に示したＬＣ定常領域を有し、７７位が、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｖ、Ｌ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｑ、Ｐ、Ｎ、Ｍ、Ｈ、およびＷからなる群から選択される、抗体を提供する。

本発明はさらに、ヒトＩＬ−１３Ｒα２に特異的に結合する抗体であって、配列番号５５に示したＬＣ定常領域を有する、抗体を提供する。

がんのための療法
腫瘍、転移を含むがそれだけに限らない、がん、または制御されていない細胞増殖を特徴とする他の疾患もしくは障害は、本発明の抗体−薬物コンジュゲートの投与によって処置または予防されうる。

例示的な抗ＩＬ−１３−Ｒα２ ＡＤＣは、ＩＬ−１３−Ｒα２が正常（例えば、非がん性組織）と比べて発現または過剰発現されるがんを処置するのに有用である。本明細書に記載の方法によるＩＬ−１３−Ｒα２発現がんの処置または予防は、このような処置を必要とする対象に有効量の抗ＩＬ−１３−Ｒα２ ＡＤＣを投与することによって実現されうる。いくつかの実施形態では、細胞傷害性剤にコンジュゲートされた抗ＩＬ−１３−Ｒα２全長抗体またはその抗原結合性断片もしくはその誘導体が投与される。いくつかの例示的な実施形態では、本発明のＡＤＣは、（ｉ）ＩＬ−１３−Ｒα２発現がん細胞に結合し、（ｉｉ）細胞傷害性効果または細胞増殖抑制効果を発揮して、例えば、ＩＬ−１３−Ｒα２発現がん細胞の増殖を阻害し、またはＩＬ−１３−Ｒα２発現がん細胞を死滅させる。

他の実施形態では、抗ＩＬ−１３−Ｒα２ ＡＤＣは、別の治療剤と同時投与され、または別の治療剤とともに順次投与される。いくつかの実施形態では、抗ＩＬ−１３−Ｒα２ ＡＤＣは、標準治療（ｓｔａｎｄａｒｄ ｏｆ ｃａｒｅ）化学療法剤を含めた化学療法剤と同時投与され、または順次投与される。

いくつかの実施形態では、他の治療剤は、処置される特定の疾患の標準治療であり、または処置される特定の疾患の救済レジメンの一部である作用物質となる。抗がん剤および化学療法レジメンとしては、例えば、抗ＣＤ５２抗体（例えば、アレムツズマブ）、抗ＣＤ２０抗体（例えば、リツキシマブ）、および抗ＣＤ４０抗体（例えば、ＳＧＮ４０）を含めた抗がん抗体、例えば、ＣＨＯＰ（シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、およびプレドニゾン）、ＣＶＰ（シクロホスファミド、ビンクリスチン、およびプレドニゾン）、ＲＣＶＰ（リツキシマブ＋ＣＶＰ）、ＲＣＨＯＰ（リツキシマブ＋ＣＨＯＰ）、ＲＩＣＥ（リツキシマブ＋イホスファミド、カルボプラチン、エトポシド）、ＲＤＨＡＰ（リツキシマブ＋デキサメタゾン、シタラビン、シスプラチン）、ＲＥＳＨＡＰ（リツキシマブ＋エトポシド、メチルプレドニゾロン、シタラビン、シスプラチン）、ゲムシタビン、アスパラギナーゼを伴った、または伴わないビンクリスチン、プレドニゾン、およびアントラサイクリンを用いた組合せ療法、ダウノルビシン、ビンクリスチン、プレドニゾン、およびアスパラギナーゼを用いた組合せ療法、テニポシドおよびＡｒａ−Ｃ（シタラビン）を用いた組合せ療法、メトトレキセートおよびロイコボリンを用いた組合せ療法、ブレオマイシン、ドキソルビシン、エトポシド、メクロレタミン、プレドニゾン、ビンブラスチン、およびビンクリスチンを用いた組合せ療法、低分子阻害剤、ならびに例えば、ボルテゾミブを含めたプロテオソーム阻害剤を含めた化学療法レジメンがある。

いくつかの実施形態では、それを必要とする患者に、放射線処置、および任意選択により別の治療剤と組み合わせて有効量の抗ＩＬ−１３−Ｒα２ ＡＤＣを投与するステップを含む、がんを処置するための方法。いくつかの実施形態では、抗ＩＬ−１３−Ｒα２ ＡＤＣは、抗がん剤（例えば、化学療法剤）および／または放射線療法とともに同時にまたは順次投与される。いくつかの実施形態では、化学療法剤または放射線療法は、本発明の化合物を投与する少なくとも１時間、５時間、１２時間、１日、１週間、１カ月、数カ月（例えば、最大３カ月）前または後に投与される。

本発明のＡＤＣは、選択された投与モード、および薬学的に許容できる賦形剤または添加剤、例えば、緩衝液、界面活性剤、防腐剤、可溶化剤、等張化剤、安定化剤、担体などにとって適切であるように製剤化された投与用医薬組成物の形態でありうる。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ Ｐａ．、１８版、１９９５には、開業医に一般に知られている製剤技法の概要が示されている。

これらの医薬組成物は、がんを処置するための一般に意図された目的を実現する当技術分野で公知の任意の手段によって投与することができる。好適な投与経路は、それだけに限らないが、静脈内、筋肉内、腹腔内、皮下、および関節内の注射および注入を含む投与モードを指すと本明細書で定義された非経口である。投与される投与量は、レシピエントの年齢、健康、および体重、もしあれば同時処置の種類、処置の頻度、ならびに望まれる効果の性質に依存する。

本発明の範囲内の組成物には、ＡＤＣが、がんを処置するための所望の医学的効果を実現するのに有効な量で存在するすべての組成物が含まれる。個々の必要性は、患者によって変動しうるが、成分のすべての有効量の最適範囲の判定は、通常の技術の臨床医の能力の範囲内である。

診断
本発明の抗体または抗体断片は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで生体試料中のｈＩＬ−１３Ｒα２を検出するのにも使用されうる。一実施形態では、本発明の抗ｈＩＬ−１３−Ｒα２抗体は、組織内または組織に由来する細胞内のｈＩＬ−１３Ｒα２のレベルを判定するのに使用される。好適な実施形態では、組織は患部組織である。本方法の好適な実施形態では、組織は、腫瘍またはその生検材料である。本方法の好適な実施形態では、組織またはその生検材料が患者から最初に切除され、次いで組織または生検材料内のｈＩＬ−１３−Ｒα２のレベルを、本発明の抗体または抗体断片を用いてイムノアッセイで判定することができる。組織またはその生検材料は、凍結乾燥または固定することができる。同じ方法を使用して、ｈＩＬ−１３−Ｒα２タンパク質の他の性質、例えば、細胞表面レベルのそのレベル、または細胞局在化などを判定することができる。

上述した方法は、がんを有することが分かっている、または有すると疑われる対象におけるがんを診断するのに使用することができ、前記患者において測定されたｈＩＬ−１３−Ｒα２のレベルが正常な参照対象または標準物質のものと比較される。次いで前記方法を使用して、腫瘍がｈＩＬ−１３−Ｒα２を発現するか否かを判定することができ、それは、腫瘍が本発明の抗体−薬物コンジュゲートを用いた処置に十分応答することを示唆しうる。好ましくは、腫瘍は、肺がん、大腸がん、胃がん、膵臓がん、卵巣がん、悪性神経膠腫、および黒色腫、またはｈＩＬ−１３−Ｒα２が発現される他の癌腫、ならびにｈＩＬ−１３−Ｒα２が主に発現される未だ判定されていない他のがんである。

本発明の一実施形態は、ＩＬ−１３−Ｒα２発現がんを処置する方法であって、生体試料中のｈＩＬ−１３−Ｒα２のレベルを判定するステップと、本発明の抗体−薬物コンジュゲートを前記対象に投与するステップとを含み、前記判定するステップが、がんを有すると疑われる対象から試料を得るサブステップと、本発明の抗体を使用したイムノアッセイで前記試料を試験するサブステップと、前記試料におけるｈＩＬ−１３−Ｒα２の細胞表面レベルを判定するサブステップと、ｈＩＬ−１３−Ｒα２の細胞表面レベルを正常な参照対象または標準物質のものと比較するサブステップとを含む、方法である。

本発明はさらに、研究用途または診断的適用で使用するためにさらに標識されるモノクローナル抗体、ヒト化抗体、およびこれらのエピトープ結合性断片を提供する。好適な実施形態では、標識は、放射標識、フルオロフォア、発色団、造影剤、または金属イオンである。

前記標識抗体またはこれらのエピトープ結合性断片ががんを有すると疑われる対象に投与され、対象の体内の標識の分布が測定または監視される、診断のための方法も提供される。

キット
本発明は、例えば、記載した細胞傷害性コンジュゲート、および特定の細胞型を死滅させるために細胞傷害性コンジュゲートを使用するための指示書を含むキットも含む。指示書は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｖｉｖｏ、またはｅｘ ｖｉｖｏで細胞傷害性コンジュゲートを使用するための指示を含みうる。一般に、キットは、細胞傷害性コンジュゲートを含有するコンパートメントを有することになる。細胞傷害性コンジュゲートは、凍結乾燥形態、液体形態、またはキット内に含められるように修正可能な他の形態でありうる。キットは、キット内の指示書に記載された方法を実行するのに必要とされる追加の要素、例えば、凍結乾燥粉末を再構成するための滅菌溶液、患者に投与する前に細胞傷害性コンジュゲートと組み合わせるための追加の作用物質、およびコンジュゲートを患者に投与するのに役立つツールなども含有しうる。

上記に、または以下の実施例において引用したすべての刊行物および特許文書は、それぞれがそのように個々に表されているのと同じ程度に、すべての目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれている。

本発明を、以下の実施例を参照してさらに記載するが、本発明は、このような実施例に限定されないことが理解されるべきである。

本発明を実施するための特定の態様の以下の実施例は、例示的な目的のみで提供されており、決して本発明の範囲を限定するように意図されていない。

（実施例１）
マウス抗ＩＬ−１３Ｒα２抗体ｍｕ０７およびｍｕ０８の生成および評価
抗ｈＩＬ−１３Ｒα２抗体を、ヒトＩＬ−１３Ｒα２抗原および免疫化のための標準方法を使用してマウス内で調製した（Ｚｈａｎｇ，Ｃ．、Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、９０１巻、ＤＯＩ １０．１００７／９７８−１−６１７７９−９３１−０＿７、（著作権）Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ＋Ｂｕｓｉｎｅｓｓ Ｍｅｄｉａ，ＬＬＣ ２０１２）。Ａ３７５細胞、細胞表面で高レベルのＩＬ−１３Ｒα２を内因的に発現する黒色腫細胞株に結合した２種のマウス抗体ｍｕ０７およびｍｕ０８が同定された。

ＡＤＣ内の抗体の重要な特徴は、その受容体に結合した後の迅速な内部移行である。抗体ｍｕ０７およびｍｕ０８を評価し、Ａ３７５細胞とともに３７℃で１時間インキュベートした後、それぞれ３８％および３１％内部移行されることが判明した。

（実施例２）
マウス抗ＩＬ−１３Ｒα２抗体ｍｕ０７およびｍｕ０８の可変領域
ｍｕ０７およびｍｕ０８抗ＩＬ−１３Ｒα２抗体重鎖および軽鎖可変領域を、ＳＭＡＲＴｅｒ（登録商標）ｃＤＮＡ合成システム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．ｏｆ Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、Ｃａｌｉｆ．）、その後、ＰＣＲ増幅を使用してクローニングした。ｃＤＮＡを標準技法によって合成し、ＰＣＲ ＳｕｐｅｒＭｉｘ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ．）を用いて、ＳＭＡＲＴｅｒ（登録商標）ＩＩＡオリゴ配列にアニールするプライマー、ならびにマウス定常領域特異的プライマー（軽鎖に関してマウスカッパおよび重鎖に関してマウスＩｇＧ１）を使用してＰＣＲによって増幅した。重鎖および軽鎖可変領域ＰＣＲ産物をｐＣＲ４−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）中にサブクローニングし、核酸配列を決定した。

ｍｕ０７およびｍｕ０８重鎖可変領域のアミノ酸配列を、それぞれ、配列番号２５のアミノ酸残基および配列番号２３のアミノ酸残基として示す。ｍｕ０７およびｍｕ０８軽鎖可変領域のアミノ酸配列を、それぞれ、配列番号２６および配列番号２４で示す。

（実施例３）
キメラ抗体ｃｈ０７およびｃｈ０８の結合特異性および結合動態
当技術分野で公知の方法を使用して、ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域およびヒトカッパ軽鎖定常領域とともにマウス重鎖および軽鎖可変領域配列を有するキメラ抗体０７および０８（ｃｈ０７およびｃｈ０８）を構築した。ｃｈ０７およびｃｈ０８の結合活性および特異性を評価するために、標準直接ＥＬＩＳＡプロトコールを、組換えｈＩＬ−１３−Ｒα２およびｈＩＬ−１３Ｒα１、ＩＬ−１３サイトカインの受容体を利用して実施した。結合は、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ：ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）コンジュゲートヤギ抗ヒトＩｇＧカッパによって検出した。図１の結果は、両キメラ抗体は、ｈＩＬ−１３Ｒα１ではなくｈＩＬ−１３Ｒα２に特異的に結合することができることを実証する。ＥＤ５０は、ｃｈ０７およびｃｈ０８についてそれぞれ、０．１５ｎＭおよび０．０７６ｎＭである。

ｃｈ０７およびｃｈ０８抗体の結合動態を評価するために、ＳＰＲ（表面プラズモン共鳴）実験を、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）ヒトＦａｂ Ｃａｐｔｕｒｅ Ｋｉｔ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用してＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）Ｔ１００またはＴ２００計測器で行った。すべてのデータは、１：１ラングミュア結合モデルとともにＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）Ｔ１００評価ソフトウェアバージョン２．０を使用して分析した。

Ｋ_ａ、Ｋ_ｄ、およびＫＤを表５で示す。ｐＨ７．４で、ｃｈ０７およびｃｈ０８の両方のｈＩＬ−１３−Ｒα２への結合親和性は、ｐＭ範囲内にあり、それぞれ６４８ｐＭおよび９６４ｐＭである。ｈＩＬ−１３−Ｒα２からのｃｈ０７の解離は、ｃｈ０８より約２倍遅い。ｐＨ６．０で、ｈＩＬ−１３−Ｒα２へのｃｈ０７およびｃｈ０８の結合親和性は、低ｎＭ範囲内にある。ｃｈ０８およびｃｈ０７の解離速度は、非常に同様である。ｐＨ７．４よりｐＨ６．０においてＫＤが高いのは、より遅い結合速度に起因する。

（実施例４）
抗体ｃｈ０７およびｃｈ０８の結合エピトープ
競合ＥＬＩＳＡを実施してｃｈ０７およびｃｈ０８が別個の結合エピトープを有するか否かを検査した。競合ＥＬＩＳＡ実験の前に、ｃｈ０７およびｃｈ０８をビオチン化した。ビオチン化されたｃｈ０７（ビオチン−ｃｈ０７）およびｃｈ０８（ビオチン−ｃｈ０８）のＥＣ５０を、直接標準ＥＬＩＳＡによって判定した。競合ＥＬＩＳＡのために、組換えｈＩＬ−１３−Ｒα２を、４℃で一晩、ＰＢＳ中２μｇ／ｍＬの５０μｌで９６ウェルプレート上に被覆した。次いでプレートを、標準ＥＬＩＳＡプロトコールに従ってブロックおよび洗浄した。３倍連続希釈したｃｈ０７およびｃｈ０８（２×最終濃度）を、それぞれ一定量のビオチン−ｃｈ０７（図２Ａ）またはビオチン−ｃｈ０８（図２Ｂ）と混合し、プレートに添加し、室温で１時間インキュベートした。結合したビオチン化キメラ抗体の量を、１：５０００のＨＲＰコンジュゲートストレプトアビジンによって、１時間にわたって検出した。結果を図２に示す。非標識キメラｃｈ０７は、ビオチン−ｃｈ０７とｈＩＬ−１３−Ｒα２への結合において競合する一方、非標識ｃｈ０８は、競合の徴候をまったく示さない（図２Ａ）。同じセットの抗体をビオチン−ｃｈ０８と競合するのに使用したとき、同様の結果が得られる（図２Ｂ）。これは、抗体ｃｈ０７およびｃｈ０８がｈＩＬ−１３Ｒα２への別個の結合エピトープを有することを明らかに実証する。

競合ＥＬＩＳＡを、２種の市販抗体、モノクローナルマウスＩｇＧ１、ＭＡＢ６１４（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）およびモノクローナルマウスＩｇＧ１、ａｂ２７４１４（Ａｂｃａｍ）でも実施した。図２Ａおよび図２Ｂは、両市販抗体がＩＬ−１３Ｒα２への結合についてビオチン−ｃｈ０７またはビオチン−ｃｈ０８のいずれとも競合しないことを示し、抗体ｃｈ０７およびｃｈ０８が２種の市販抗体と異なる結合エピトープを有することを示す。

この結果をＢｉａＣｏｒｅ実験によって確認した。約１００ＲＵのｈＩＬ−１３−Ｒα２を、アミンカップリング化学反応を使用してＣＭ５チップに固定化した。ｃｈ０７（１００ｎＭおよび２００ｎＭ）ならびにｃｈ０８（１００ｎＭおよび２００ｎＭ）を、１５０秒にわたって１０μｌ／分の流量でｈＩＬ−１３−Ｒα２実験チャネルおよび対照チャネル上に順次注射した。１００ｎＭ ｃｈ０７を固定化されたｈＩＬ−１３Ｒα２に注射したとき、５０ＲＵに到達した。ｃｈ０７濃度を２００ｎＭに増大させたときＲＵはさらに増大せず、ｃｈ０７についてのｈＩＬ−１３−Ｒα２の結合部位が飽和していることを示した。１００ｎＭ ｃｈ０８の注射では、１００ＲＵが加えられた。この正の結合信号は、２つの抗体は、競合がないことを示す。この結果により、抗体ｃｈ０７およびｃｈ０８が異なる結合エピトープを有することがさらに確認される（図２Ｃ）。

（実施例５）
ｃｈ０７およびｃｈ０８中和試験
ｃｈ０７およびｃｈ０８がＩＬ−１３機能を中和することができるか否かを評価するために、競合ＥＬＩＳＡを実施した。抗Ｆｌａｇ Ａｂを９６ウェルプレート上に被覆し、４℃で一晩インキュベートした。次いでプレートを標準ＥＬＩＳＡプロトコールに従ってブロックおよび洗浄した。マウス抗体、キメラ抗体、陽性対照の裸のＩＬ−１３Ｒα２、および陰性対照ｈＩＬ−２１Ｒの３倍連続希釈液を、一定量のビオチン化ＩＬ−１３Ｒα２−Ｆｃ（４×ＥＤ５０）および一定量のＩＬ−１３（４×ＥＤ５０）とともにＲＴで１時間インキュベートした。複合体１００μｌをＥＬＩＳＡプレートに添加し、室温で１時間インキュベートした。結合したビオチン−ＩＬ−１３−Ｒα２の量を、１：５０００のＨＲＰコンジュゲートストレプトアビジンによって１時間検出した。結果を図３に示す。抗体０７および０８（マウス形態およびキメラ形態）はともに、ＩＬ−１３−Ｒα２結合部位についてＩＬ−１３と競合しない一方、裸のＩＬ−１３−Ｒα２は、ビオチン化ＩＬ−１３Ｒα２と競合する。これは、抗体０７および０８（マウス形態およびキメラ形態）が非中和抗体であることを示す。

（実施例６）
ｍｕ０８のヒト化
モノクローナルマウス抗体ｍｕ０８（配列番号２３および２４）を、ヒト受容体フレームワークとしてＤＰ−５４およびＤＰＫ９を利用してヒト化した。ヒト化０８抗体（ｈｕ０８）は、復帰突然変異を用いて、または用いないでＣＤＲ移植によって調製した。マウスｍｕ０８抗体のＣＤＲは、Ｋａｂａｔスキームを使用して同定した。

ｈｕ０８重鎖可変領域（ＶＨバージョン１．０）は、ヒトＤＰ−５４フレームワーク領域にｍｕ０８のＣＤＲを直接移植することによって構築した。バージョン１．１は、Ａ４０Ｔ位、Ｇ４２Ｄ位、Ｇ４４Ｒ位、およびＮ８３Ｓ位でのフレームワークＤＰ−５４の復帰突然変異によって作製した。ｖ１．０およびｖ１．１の両方を、ｈＩｇＧ１定常領域を含有するｐＳＭＥＤ２ベクター内にクローニングした。ヒト化ｈｕ０８重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列は、ｖ１．０について配列番号１７であり、ｖ１．１について配列番号２０である。ｈｕ０８重鎖可変領域をコードするアミノ酸配列は、ｖ１．０について配列番号１であり、ｖ１．１について配列番号１９である。

ｈｕ０８軽鎖可変領域（ＶＫバージョン１．０）は、ヒトＤＰＫ９フレームワーク領域にマウスｍｕ０８のＣＤＲを直接移植することによって構築した。バージョン１．１は、Ｋ３９Ｉ位、Ｓ６０Ｄ位、Ｔ７２Ｓ位、Ｔ７３Ｆ位、およびＴ７４Ｉ位でのフレームワークＤＰＫ９の復帰突然変異によって作製した。バージョンｖ１．０およびｖ１．１の両方を、ｈＩｇカッパ定常領域を含有するｐＳＭＥＮ３ベクター内にクローニングした。ｈｕ０８軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列は、ｖ１．０について配列番号１８であり、ｖ１．１について配列番号２２である。ｈｕ０８軽鎖可変領域をコードするアミノ酸配列は、ｖ１．０について配列番号５であり、ｖ１．１について配列番号２１である。

（実施例７）
ヒト化ｈｕ０８の特徴付け
組換えｈＩＬ−１３−Ｒα２へのヒト化ｈｕ０８の結合を標準直接ＥＬＩＳＡによって評価した。組換えｈＩＬ−１３−Ｒα２を９６ウェルプレート上に被覆した。バージョン１．０および１．１の重鎖および軽鎖の組合せでの連続希釈したキメラ抗体またはヒト化抗体、例えば、ｈｕ０８ ｖ１．０ ＨＣ／１．０ ＬＣ、ｈｕ０８ ｖ１．０ ＨＣ／ｖ１．１ ＬＣ、ｈｕ０８ ｖ１．１ ＨＣ／ｖ１．０ ＬＣ、およびｈｕ０８ ｖ１．１ ＨＣ／ｖ１．１ ＬＣをプレートに添加し、室温で１〜２時間インキュベートした。結合をＨＲＰコンジュゲートヤギ抗ヒトＩｇカッパによって検出した。結果は、以下の表６に示されており、ヒト化抗体の４つすべての組合せは、組換えｈＩＬ−１３−Ｒα２に結合することができ、ＥＤ５０は、ｃｈ０８に匹敵することを実証する。

標準的なＦＡＣＳ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｓｏｒｔｅｒ、蛍光活性化セルソーター）分析を実施して、抗体の細胞表面ＩＬ−１３Ｒα２への結合活性を評価した。Ａ３７５細胞を、１％ウシ血清アルブミンおよび０．００１％アジ化ナトリウムを含有する氷冷ＰＢＳで洗浄した。細胞を、抗体ｈｕ０８ ｖ１．０およびｈｕ０８ ｖ１．１の連続希釈液、例えば、ｈｕ０８ ｖ１．０ ＨＣ／１．０ ＬＣ、ｈｕ０８ ｖ１．０ ＨＣ／ｖ１．１ ＬＣ、ｈｕ０８ ｖ１．１ ＨＣ／ｖ１．０ ＬＣ、およびｈｕ０８ ｖ１．１ ＨＣ／ｖ１．１ ＬＣとともに、４℃で３０分間インキュベートし、次いでホスファチジルエタノールアミン標識ヤギ抗ヒトＩｇＧで染色し、４％パラホルムアルデヒドを含有するＰＢＳ中で固定し、ＦＡＣＳｃａｎ（登録商標）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で分析した。データは、組換え受容体への結合と一致し、４つすべての組合せについての細胞表面抗原への結合は、ｃｈ０８に匹敵することを例示する（表６）。

競合ＥＬＩＳＡを実施して、ｈｕ０８ １．０およびｈｕ０８ ｖ１．１がＩＬ−１３−Ｒα２結合をｃｈ０８と競合するか否かを評価した。組換えｈＩＬ−１３−Ｒα２を、ＰＢＳ中２μｇ／ｍｌの５０μｌで９６ウェルプレート上に４℃で一晩被覆した。次いでプレートを標準ＥＬＩＳＡプロトコールに従ってブロックおよび洗浄した。３倍連続希釈したｃｈ０８、ｈｕ０８ １．０、およびｈｕ０８ ｖ１．１、ならびに陰性対照ｃｈ０７（２×最終濃度）を、ビオチン化ｃｈ０８（２×ＥＣ_５０）と混合した。抗体とビオチン−ｃｈ０８の混合物５０μｌをプレートに添加し、室温で１時間インキュベートした。結合したビオチン−ｃｈ０８の量をＨＲＰコンジュゲートストレプトアビジンによって検出した。結果を表６に示す。ヒト化抗体の４つすべての組合せは、ビオチン化ｃｈ０８との競合においてキメラ抗体ｃｈ０８と同様であり、ｈｕ０８ １．０およびｈｕ０８ ｖ１．１がｃｈ０８と同じ結合エピトープを保持し、可溶性および細胞表面ＩＬ−１３−Ｒα２に対して同様の親和性を有することを示す。

ｈｕ０８ ｖ１．０ ＨＣ／ｖ１．０ＬＣおよびｈｕ０８ ｖ１．１ＨＣ／ｖ１．１ＬＣをスケールアップして精製タンパク質を生成した。両抗体をＨＥＫ２９３Ｆ浮遊細胞内に一過性に発現させた。驚くべきことに、０８をヒト化すると、ｃｈ０８の収率と比較して５〜６倍抗体産生収率が改善された（表７）。

タンパク質またはタンパク質ドメインの熱安定性とタンパク質またはタンパク質ドメインの全体的な安定性との間に直接相関がある。タンパク質またはタンパク質ドメインの融点がより高いと、製造可能性が改善され、保存可能期間／安定性がより長くなることが多い。ｃｈ０８およびｈｕ０８（ｖ１．０およびｖ１．１）の熱安定性を、示差走査熱量測定（ＤＳＣ：Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ Ｓｃａｎｎｉｎｇ Ｃａｌｏｒｉｍｅｔｒｙ）によって検査した。ＤＳＣによるキメラおよびヒト化抗体の熱アンフォールディングは、ＭｉｃｒｏＣａｌ ＶＰ−ＤＳＣ計測器で標準プロトコールを使用して実施した。ヒト化抗体、ｈｕ０８ ｖ１．０／１．０およびｈｕ０８ ｖ１．１／１．１はともに、キメラバージョンｃｈ０８より高いＴｍ２（Ｆａｂ）を示す（表８）。これは、ｃｕ０８をヒト化すると、この抗体の熱安定性が改善されることを実証する。

ｈｕ０８抗体の結合動態を、上述したＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）Ｔ１００で行った。結果を表９に示す。

（実施例８）
ｍｕ０７のヒト化
モノクローナルマウス抗体ｍｕ０７をヒト化する一般的なストラテジーは、実施例６でｍｕ０８について記載したのと同じである。ヒト化ｈｕ０７重鎖可変領域（ＶＨバージョン１．０）は、ヒトＤＰ−５４フレームワーク領域にｍｕ０７のＣＤＲを直接移植することによって構築した。バージョン１．１〜１．５は、様々な位置でのフレームワークＤＰ−５４の復帰突然変異によって作製した（表１０）。すべてのバージョンを、ｈＩｇＧ１定常領域を含有するｐＳＭＥＤ２ベクター内にクローニングした。

ｈｕ０７軽鎖可変領域（ＶＫバージョン１．０）は、ヒトＤＰＫ９フレームワーク領域にｍｕ０７のＣＤＲを直接移植することによって構築した。バージョン１．１〜１．７は、様々な位置でのフレームワークＤＰＫ９の復帰突然変異によって作製した（表１０）。すべてのバージョンは、ｈＩｇカッパ定常領域を含有するｐＳＭＥＮ３ベクター内にクローニングした。ｈｕ０７可変領域をコードするアミノ酸配列の配列番号を表１０に列挙する。

（実施例９）
ヒト化ｈｕ０７の特徴付け
ｈｕ０の様々なバージョンの結合／競合性質を評価するために、ｈｕ０７重鎖および軽鎖の１９の組合せを用いた一過性トランスフェクションをＣＯＳ−１ Ｍ６細胞内で実施した。６本の重鎖および３本の軽鎖、すなわちキメラ重鎖、ヒト化ｖ１．０〜１．５重鎖、キメラ軽鎖、およびヒト化ｖ１．０〜１．１軽鎖を含めた。馴化培地（ＣＭ；ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ ｍｅｄｉａ）をトランスフェクトして２日後に回収し、当技術分野で公知のプロトコールを利用して、標準ＥＬＩＳＡによる組換えＩＬ−１３−Ｒα２への直接結合、Ａ３７５細胞を使用する細胞ベースＥＬＩＳＡによる細胞表面受容体結合、およびビオチン化ｃｈ−７との競合ＥＬＩＳＡに付した。

ＣＭからの最初のスクリーニングデータに基づいて、重鎖ｖ１．５をさらなる試験のために選択した。重鎖ｖ１．５を、キメラヒト化ｖ１．０およびｖ１．１軽鎖と対形成させた。表１１にｈｕ０７抗体の結合活性、競合性質、および細胞傷害性を要約する。キメラ軽鎖Ｋｃと対形成したｈｕ０７ ｖ１．５は、キメラ抗体と同様のＥＤ５０およびＩＣ５０を実証する。Ａ３７５細胞および組換えタンパク質に対する競合活性は、この重鎖ｖ１．５が軽鎖ｖ１．０およびｖ１．１と対形成されたとき減少した。

ｈｕ０７重鎖ｖ１．５を軽鎖最適化のために使用した。ｈｕ０７重鎖および軽鎖の１０の組合せを用いた一過性トランスフェクションをＣＯＳ−１ Ｍ６細胞内で実施した。重鎖ｖ１．５をキメラ軽鎖およびヒト化バージョンｖ１．０〜１．７と対形成させた。ＣＭを回収し、実験で使用して、ＥＬＩＳＡによる組換えｈＩＬ−１３α２（ｒｈＩＬ−１３α２）への結合親和性、および競合ＥＬＩＳＡよるビオチン化ｃｈ０７に対する競合活性を判定した。データは、重鎖ｖ１．５および軽鎖ｖ１．７の組合せが最適であることを示す。この結果を精製タンパク質で確認した（表１２）。

（実施例１０）
ｃｈ０７、ｈｕ０７、ｃｈ０８、およびｈｕ０８の種交差反応性
カニクイ（ｃｙｎｏ）ザルＩＬ−１３−Ｒα２（細胞外ドメイン（ＥＣＤ：ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｏｍａｉｎ））および膜貫通ドメイン（ＴＭ：ｔｒａｎｓｅｍｅｍｂｒａｎｅ ｄｏｍａｉｎ）を、ＲＴ−ＰＣＲによってｃｙｎｏザルの精巣および脂肪組織から単離した。ｃｙｎｏ ＩＬ−１３−Ｒα２のアミノ酸配列を配列番号２７に示す。同一性は、ヒトとｃｙｎｏ ＩＬ−１３Ｒα２との間で９４％である。

Ｃ末端でＦｌａｇタグと融合したｃｙｎｏ ＩＬ−１３−Ｒα２のＥＣＤ／ＴＭドメインをｐＳＭＥＤ２発現ベクター内にクローニングした。ＨＥＫ２９３浮遊細胞に、プラスミドおよびｐＳＭＥＤ２ベクターを含有するｃｙｎｏ−ＩＬ−１３−Ｒα２を一過性にトランスフェクトした（モックトランスフェクションとして）。細胞を７２時間後に回収し、ＦＡＣＳ分析に付した。ｃｈ０７、ｃｈ０８、ｈｕ０８ｖ１．０／１．０、およびｈｕ０８ｖ１．１／１．１を含む４抗体を試験した。細胞表面ｃｙｎｏ−ＩＬ−１３−Ｒα２に対する結合を、Ｒ−フィコエリトリン標識ヤギ抗ヒトまたはマウスＩｇＧを用いて検出した。データは、ｃｈ０７、ｃｈ０８、ｈｕ０８ｖ１．０／１．０、およびｈｕ０８ｖ１．１／１．１が細胞表面ｃｙｎｏ−ＩＬ−１３−Ｒα２に結合することができ、同様の結合親和性（ＥＤ５０）を有することを実証する（表１３）。

ｈｕ０７およびｈｕ０８のマウスＩＬ−１３−Ｒα２への結合を直接ＥＬＩＳＡによって評価した。アミノ酸レベルでのヒトとマウスＩＬ−１３−Ｒα２との間の同一性は、およそ６４％である。組換えｍＩＬ−１３−Ｒα２またはｈＩＬ−１３−Ｒα２（陽性対照として）を９６ウェルプレート上に被覆した。精製キメラｃｈ０７およびｃｈ０８を連続希釈し、抗原が被覆されたプレートに添加した。結合した抗体を、ＨＲＰコンジュゲートヤギ抗ヒトＩｇＧＦｃ特異的二次抗体によって検出した。ｍＩＬ−１３−Ｒα２結合の検出可能シグナルはない一方、陽性対照ｈＩＬ−１３−Ｒα２への結合は強く、ｈｕ０７およびｈｕ０８は、マウスｍＩＬ−１３Ｒα２と交差反応しないことを示した。

（実施例１１）
ＩＬ１３Ｒ−α２を発現するヒト細胞株への結合
ＩＬ−１３−Ｒα２抗原を発現する細胞株、および陰性対照細胞を、９６ディープウェルプレートの１ウェル当たり２００，０００細胞の密度で蒔き、氷上で保持した。ダルベッコリン酸緩衝溶液（ＤＰＢＳ：Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ）中の３％ウシ血清アルブミンＢＳＡ（ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ）中で調製したマウスモノクローナル抗体ｍｕ０７またはｍｕ０８を、１０μｇ／ｍＬの最終濃度でプレートに添加した。次いでプレートを氷上で１時間インキュベートし、その後２回洗浄した。二次抗体、ＰＥ（ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ、フィコエリトリン）コンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧ Ｆｃをウェルに添加した。４℃で３０分インキュベートした後、次いで平均蛍光強度をＦＡＣＳｃａｎ（商標）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）でＦＡＣＳによって分析した。

表１４中のデータは、ｍｕ０７およびｍｕ０８抗体が様々な疾患の徴候に由来するＩＬ−１３Ｒ−α２陽性細胞株の多様なパネルに結合することを示す。

（実施例１２）
内部移行
抗体内部移行は、ＩＬ−１３−Ｒα２発現細胞内で細胞傷害性のためにＡＤＣを送達するための極めて重要な特徴である。ＩＬ−１３−Ｒα２に結合した後の抗体の内部移行を、４種の細胞株（ＰＣ３ＭＭ２、Ａ３７５、Ｈｓ７６６Ｔ、およびＨ４６０Ｒ）で、ｍｕ０７およびｍｕ０８抗体ならびに陽性対照マウスモノクローナル抗体（ａｂ２７４１４）を使用して検査した。抗体（１０μｇ／ｍＬ）を様々な細胞とともに氷上で１時間インキュベートし、非結合抗体を冷培地で２回洗浄することによって除去した。細胞培養プレートを３７℃でインキュベートした。細胞の試料を１５分および４時間に固定した。異なる時点でのパーセント内部移行を表１５に示す。データは、ｍｕ０７およびｍｕ０８がＩＬ−１３−Ｒα２発現細胞内に容易に内部移行されることを示す。

（実施例１３）
化合物０１０１および３３７７の合成
化合物０１０１および３３７７を、参照により本明細書に組み込まれている米国特許出願第１３／６７０，６１２号に記載されている方法に従って調製した。

化合物０１０１（スキーム中の＃５４）についての実験
２−メチルアラニル−Ｎ−［（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−３−メトキシ−１−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−｛［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］アミノ｝プロピル］ピロリジン−１−イル｝−５−メチル−１−オキソヘプタン−４−イル］−Ｎ−メチル−Ｌ−バリンアミド（＃５４）の調製

ステップ１． Ｎ−［（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシ）カルボニル］−２−メチルアラニル−Ｎ−［（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−３−メトキシ−１−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−｛［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］アミノ｝プロピル］ピロリジン−１−イル｝−５−メチル−１−オキソヘプタン−４−イル］−Ｎ−メチル−Ｌ−バリンアミド（＃５３）の合成。一般的な手順Ｄに従って、ジクロロメタン（２０ｍＬ、０．１Ｍ）、およびＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（３ｍＬ）、アミン＃１９（２．５ｇ、３．４ｍｍｏｌ、１．２当量）、ＨＡＴＵ（１．２９ｇ、３．３８ｍｍｏｌ、１．２当量）、およびトリエチルアミン（１．５７ｍＬ、１１．３ｍｍｏｌ、４当量）中の＃３２（２．０５ｇ、２．８３ｍｍｏｌ、１当量）から所望の粗材料を合成し、これをシリカゲルクロマトグラフィー（勾配：ヘプタン中０％〜５５％のアセトン）によって精製し、＃５３（２．４２ｇ、７４％）を固体として生成した。ＬＣ−ＭＳ：ｍ／ｚ ９６５．７［Ｍ＋Ｈ^＋］、９８７．６［Ｍ＋Ｎａ^＋］、保持時間＝１．０４分；ＨＰＬＣ（プロトコールＡ）：ｍ／ｚ ９６５．４［Ｍ＋Ｈ^＋］、保持時間＝１１．３４４分（純度＞９７％）；^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ_６）、回転異性体の混合物であると推定、特性信号：δ 7.86-7.91 (m, 2H), [7.77 (d, J=3.3 Hz)および7.79
(d, J=3.2 Hz), 計1H], 7.67-7.74 (m, 2H), [7.63 (d, J=3.2
Hz)および7.65 (d, J=3.2 Hz), 計1H],
7.38-7.44 (m, 2H), 7.30-7.36 (m, 2H), 7.11-7.30 (m, 5H), [5.39 (ddd, J=11.4,
8.4, 4.1 Hz)および5.52 (ddd, J=11.7, 8.8, 4.2 Hz), 計1H], [4.49 (dd, J=8.6, 7.6 Hz)および4.59 (dd,
J=8.6, 6.8 Hz), 計1H], 3.13, 3.17, 3.18および3.24 (4 s, 計6H), 2.90および3.00 (2 br s, 計3H), 1.31および1.36 (2 br s, 計6H), [1.05 (d, J=6.7 Hz)および1.09 (d, J=6.7 Hz), 計3H].

ステップ２． ２−メチルアラニル−Ｎ−［（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−３−メトキシ−１−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−｛［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］アミノ｝プロピル］ピロリジン−１−イル｝−５−メチル−１−オキソヘプタン−４−イル］−Ｎ−メチル−Ｌ−バリンアミド（＃５４）の合成
一般的な手順Ａに従って、ジクロロメタン（１０ｍＬ、０．０７Ｍ）中の＃５３（７０１ｍｇ、０．７２６ｍｍｏｌ）から、所望の粗材料を合成し、これをシリカゲルクロマトグラフィーによって精製した（勾配：ジクロロメタン中０％〜１０％のメタノール）。残渣をジエチルエーテルおよびヘプタンで希釈し、真空で濃縮して、＃５４（４０６ｍｇ、７５％）を白色固体として得た。ＬＣ−ＭＳ：ｍ／ｚ ７４３．６［Ｍ＋Ｈ^＋］、保持時間＝０．７０分；ＨＰＬＣ（プロトコールＡ）：ｍ／ｚ ７４３．４［Ｍ＋Ｈ^＋］、保持時間＝６．９０３分、（純度＞９７％）；^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ_６）、回転異性体の混合物であると推定、特性信号：δ [8.64 (br d, J=8.5 Hz)および8.86 (br d, J=8.7
Hz), 計1H], [8.04 (br d, J=9.3 Hz)および8.08 (br d, J=9.3 Hz), 計1H], [7.77 (d, J=3.3
Hz)および7.80 (d, J=3.2 Hz), 計1H],
[7.63 (d, J=3.3 Hz)および7.66 (d, J=3.2 Hz), 計1H], 7.13-7.31 (m, 5H), [5.39 (ddd, J=11, 8.5, 4 Hz)および5.53 (ddd, J=12, 9, 4 Hz), 計1H], [4.49 (dd,
J=9, 8 Hz)および4.60 (dd, J=9, 7 Hz), 計1H], 3.16, 3.20, 3.21および3.25 (4 s, 計6H), 2.93および3.02 (2 br s, 計3H), 1.21 (s, 3H), 1.13および1.13 (2 s, 計3H), [1.05 (d, J=6.7 Hz)および1.10 (d, J=6.7
Hz), 計3H], 0.73-0.80 (m, 3H).

化合物３３７７（スキーム中の＃１１５）についての実験
Ｎ，２−ジメチルアラニル−Ｎ−｛（１Ｓ，２Ｒ）−４−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−３−｛［（１Ｓ）−１−カルボキシ−２−フェニルエチル］アミノ｝−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソプロピル］ピロリジン−１−イル｝−２−メトキシ−１−［（１Ｓ）−１−メチルプロピル］−４−オキソブチル｝−Ｎ−メチル−Ｌ−バリンアミド、トリフルオロ酢酸塩（＃１１５）の調製

ステップ１． メチルＮ−｛（２Ｒ，３Ｒ）−３−［（２Ｓ）−１−｛（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−４−［｛Ｎ−［（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシ）カルボニル］−Ｌ−バリル｝（メチル）アミノ］−３−メトキシ−５−メチルヘプタノイル｝ピロリジン−２−イル］−３−メトキシ−２−メチルプロパノイル｝−Ｌ−フェニルアラニネート（＃１１３）の合成。窒素下でジクロロメタン７５ｍＬ中の二量体酸＃５（１２．１ｇ、２３．０ｍＭ）および＃６７（１１．５ｇ、２３．０ｍＭ）の撹拌中の混合物に、ＨＡＴＵ（１０．８ｇ、２７．６ｍＭ）を添加し、その後ヒューニッヒ塩基（１２．１ｍＬ、６９．０ｍＭ）を添加した。反応物を室温で１５時間撹拌した。反応物を濃縮してより小さい体積にし、酢酸エチルで吸収し、１Ｎ ＨＣｌで２回洗浄した。次いで有機層をブラインで洗浄し、硫酸ナトリウムで脱水し、濾過し、真空で濃縮した。次いで残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（勾配：ヘプタン中０％〜７０％のアセトン）によって精製し、＃１１３（１２．３ｇ、６２％）を白色固体として生成した。ＬＣ−ＭＳ（プロトコールＱ）：ｍ／ｚ ８５５．３［Ｍ＋Ｈ^＋］、８７７．２［Ｍ＋Ｎａ^＋］、保持時間＝２．３２分；ＨＰＬＣ（プロトコールＲ）：ｍ／ｚ ８５５．５［Ｍ＋Ｈ^＋］、保持時間＝９．５９６分（純度＞９７％）。

ステップ２． メチルＮ−｛（２Ｒ，３Ｒ）−３−メトキシ−３−［（２Ｓ）−１−｛（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−３−メトキシ−５−メチル−４−［メチル（Ｌ−バリル）アミノ］ヘプタノイル｝ピロリジン−２−イル］−２−メチルプロパノイル｝−Ｌ−フェニルアラニネート（＃１１４）の合成。一般的な手順Ａに従って、＃１１３（１２ｇ、１４ｍｍｏｌ、１当量）、ジクロロメタン（６０ｍＬ、０．２４Ｍ）、およびジエチルアミン（４０ｍＬ、３９０ｍＭ）から、シリカゲルクロマトグラフィー（勾配：ジクロロメタン中０％〜２５％のメタノール）によって精製した後、＃１１４（５．９ｇ、６７％）白色／淡黄色固体を合成した。ＬＣ−ＭＳ（プロトコールＱ）：ｍ／ｚ ６３３．０［Ｍ＋Ｈ^＋］、保持時間＝１．１９分。ＨＰＬＣ（プロトコールＡ）：ｍ／ｚ ６３３．５［Ｍ＋Ｈ^＋］、保持時間＝７．１４２分（純度＞９８％）。

ステップ３． Ｎ，２−ジメチルアラニル−Ｎ−｛（１Ｓ，２Ｒ）−４−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−３−｛［（１Ｓ）−１−カルボキシ−２−フェニルエチル］アミノ｝−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソプロピル］ピロリジン−１−イル｝−２−メトキシ−１−［（１Ｓ）−１−メチルプロピル］−４−オキソブチル｝−Ｎ−メチル−Ｌ−バリンアミド−トリフルオロ酢酸塩（＃１１５）の合成。ジクロロメタン１０ｍＬ中のＮ−［（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシ）カルボニル］−Ｎ，２−ジメチルアラニン（１６７ｍｇ、０．４９３ｍＭ）、＃１１４（２６０ｍｇ、０．４１１ｍＭ）、およびＨＡＴＵ（１８８ｍｇ、０４９３ｍＭ）の撹拌中の混合物に、ヒューニッヒ塩基（０．１４ｍｌ、０．８２ｍＭ）を添加した。反応物を室温で１時間２０分間撹拌した。反応物の量を減らした。ＴＨＦ（９ｍＬ）を粗材料に添加し、この撹拌中の混合物に、水３ｍＬ中に溶解した水酸化リチウム（４９．２ｍｇ、２．０６ｍＭ）を添加した。反応物を室温で４時間撹拌した。反応物を濃縮し、その後、＃１１５（２１８ｍｇ、６４％）白色固体を中圧逆相Ｃ１８クロマトグラフィー（勾配：各相において０．０２％ＴＦＡを含むアセトニトリル中５％〜４５％の水）によって精製した。ＬＣ−ＭＳ（プロトコールＱ）：ｍ／ｚ ７１８．７［Ｍ＋Ｈ^＋］、７４０．６［Ｍ＋Ｎａ^＋］、保持時間＝１．２１分。ＨＰＬＣ（４５℃でプロトコールＡ）：ｍ／ｚ ７１８．４［Ｍ＋Ｈ^＋］、保持時間＝６．９０３分。

（実施例１４）
抗ＩＬ−１３−Ｒα２ ＡＤＣの調製
本発明のＡＤＣは、化学化合物に結合するための反応部位を有するリンカーのセクションを使用し、抗体のための反応部位を有するリンカーの別のセクションを導入して調製することができる。一態様では、リンカーは、抗体などの抗体単位に存在する求核基と反応性である求電子基を有する反応部位を有する。抗体の有用な求核基としては、それだけに限らないが、スルフヒドリル、ヒドロキシル、およびアミノ基がある。抗体の求核基のヘテロ原子は、リンカーの求電子基と反応性であり、リンカーへの共有結合を形成する。有用な求電子基としては、それだけに限らないが、マレイミドおよびハロアセトアミド基がある。

リンカーは、抗体単位に存在する求電子基と反応性である求核基を有する反応部位を有する。抗体の求電子基は、リンカーに付着するための好都合な部位を提供する。抗体の有用な求電子基としては、それだけに限らないが、アルデヒドおよびケトンカルボニル基がある。リンカーの求核基のヘテロ原子は、抗体の求電子基と反応し、抗体への共有結合を形成することができる。リンカーの有用な求核基としては、それだけに限らないが、ヒドラジド、オキシム、アミノ、ヒドラジン、チオセミカルバゾン、ヒドラジンカルボキシレート、およびアリールヒドラジドがある。

本明細書において、「ｍｃ−」は、

を指す。本明細書において、「ｖｃ−」は、

を指す。

抗ＩＬ−１３−Ｒα２ ＡＤＣは、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ：ｔｒｉｓ（２−ｃａｒｂｏｘｙｅｔｈｙｌ）ｐｈｏｓｐｈｉｎｅ）を用いたｍＡｂの部分的還元を介し、その後、還元されたシステイン残基を所望のマレイミド末端リンカー−ペイロードと反応させることによって調製した。特に、ｈｕ０８は、１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ（４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸緩衝液）、ｐＨ７．０、および１ｍＭジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）中の２．２モル過剰のトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）を、３７℃で２時間にわたって添加することによって部分的に還元した。次いで所望のリンカー−ペイロードを、７．０のマレイミドカプロニック−バリン−シトルリン−ｐ−アミノベンジルオキシカルボニル−オーリスタチン−０１０１［ｖｃ−０１０１、以下を参照］）、または７．０のマレイミドカプロニック−オーリスタチン−３３７７［ｍｃ−３３７７、以下を参照］のリンカー−ペイロード／ｍＡｂモル比で反応混合物に添加し、１５％ ｖ／ｖのジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）の存在下で、２５℃でさらに１時間反応させた。１時間のインキュベーション期間の後、Ｎ−エチルマレイミド（ｖｃ−０１０１およびｍｃ−３３７７について３倍過剰）を添加して未反応チオールをキャップし、１５分間反応させ、その後、６倍過剰のＬ−Ｃｙｓを添加していずれの未反応リンカー−ペイロードもクエンチした。反応混合物を、リン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）、ｐＨ７．４中で、４℃で一晩透析し、ＳＥＣ（ＡＫＴＡエクスプローラー、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ １０／３０ＧＬカラム）を介して精製した。ＡＤＣを、純度用サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、および液体クロマトグラフィーエレクトロスプレーイオン化タンデム質量分析法（ＬＣ−ＥＳＩ ＭＳ）を介してさらに特徴付けて、薬物−抗体比（ローディング）を計算した。タンパク質濃度は、ＵＶ分光光度計を介して判定した。
ｍｃ−３３７７（システイン残基による抗体Ｘへのコンジュゲーション）

ｖｃ−０１０１（システイン残基による抗体Ｘへのコンジュゲーション）

（実施例１５）
ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞傷害性アッセイ
ＩＬ−１３−Ｒα２抗原を発現する細胞株および陰性対照細胞株を、漸増濃度の抗ＩＬ−１３−Ｒα２ ＡＤＣとともに培養した。４日後、各培養物の生存能を評価する。ＩＣ_５０値をロジスティック非線形回帰によって計算し、ｎｇ Ａｂ／ｍＬとして提示した。好適なリンカーペイロードは、ｖｃ−０１０１およびｍｃ−３３７７であった。

ヒト化抗ＩＬ−１３Ｒα２抗体ｈｕ０８を、表１６に示した様々なリンカー−ペイロード組合せにコンジュゲートした。抗体薬物コンジュゲートを、参照により本明細書に組み込まれている米国特許出願第１３／６７０，６１２号に記載された方法に従って調製し、対応する命名法および実験的化学合成スキーム番号を表１６に示した。

さらに、ｈｕ０８の変異体バージョン（ｈｕ０８ＭＡＣ）を、実施例２１に記載したように、かつ標準プロトコールに従って生成した。化合物０１０１を切断可能リンカーにコンジュゲートして構造：

を形成し、その後、本明細書に記載の技法に従ってｈｕ０８ＭＡＣにコンジュゲートしてｈｕ０８ＭＡＣ−０１０１を形成した。

データは、６つの異なるオーリスタチンペイロードにコンジュゲートした抗ＩＬ−１３−Ｒα２抗体ｈｕ０８ｖ１．０／１．０は、試験したＩＬ−１３−Ｒα２陽性細胞株の両方（ＰＣ３ＭＭ２およびＡ３７５）に対して有効であり、１．１〜４．９ｎｇ Ａｂ／ｍＬまたは７．３〜３２．７ｐＭ）の範囲のＩＣ_５０を有したことを実証する（表１７）。さらに、ｈｕ０８ＭＡＣ−０１０１は、試験したＩＬ−１３Ｒα２陽性細胞株の両方（ＰＣ３ＭＭ２およびＡ３７５）に対して有効であり、７．９ｎｇ Ａｂ／ｍＬのＩＣ_５０を有した。すべてのＡＤＣは、ＩＬ−１３−Ｒα２陰性細胞株、Ｈ４６０に対して活性でなく、非ＩＬ−１３−Ｒα２結合対照ＡＤＣ、ｈＩｇＧ８．８−ｖｃ−０１０１およびｈＩｇＧ８．８−ｍｃ−３３７７は、試験した細胞株のいずれに対しても活性でなかった。

（実施例１６）
皮下異種移植片モデル
雌の胸腺欠損（ヌード）マウスに、ＰＣ３ＭＭ２またはＡ３７５腫瘍細胞をｓ．ｃ．注射した。およそ０．２〜０．８ｇの病期分類された腫瘍を有するマウス（ｎ＝８〜１０匹のマウス／処置群）に、生理食塩水（ビヒクル）、リンカー−ペイロードｖｃ−０１０１、ｖｃ−６７８０、ｖｃ−３９０６、ｍｃ−８２６１、ｍｃ−０１３１、ｍｃ−６１２１、ｍｃ−３３７７、ＭａｌＰｅｇ−８２６１、ＭａｌＰｅｇ−０１３１、ＭａｌＰｅｇ−６１２１、およびＭａｌＰｅｇ−３９０６を有するｈｕ０８ｖ１．０／１．０ ＡＤＣ、ならびにｖｃ−０１０１またはｍｃ−３３７７とコンジュゲートした非結合Ａｂ（ｈＩｇＧ８．８）を、２または３ｍｇのＡｂ／ｋｇの用量で、ｑ４ｄ×４で静脈内に投与した。ＡＤＣは、Ａｂ含量に基づいて投薬した。腫瘍は、少なくとも１週間に１回測定した。これらのサイズをｍｍ^３＝０．５×（腫瘍幅^２）×（腫瘍長さ）として計算する。

表１８に列挙したｉｎ ｖｉｖｏ有効性の結果は、試験した様々なＡＤＣでの一連の抗腫瘍活性を示す。効力の相対的順序は、ｈｕ０８−ｖｃ−０１０１＞ｈｕ０８−ｖｃ−６７８０≧ｈｕ０８−ｍｃ−０１３１＞ｈｕ０８−ｍｃ−６１２１＞ｈｕ０８−ｍｃ−３９０６＞ｈｕ０８−ＭａｌＰｅｇ−０１３１＞ｈｕ０８−ＭａｌＰｅｇ−６１２１＞ｈｕ０８−ＭａｌＰｅｇ−３９０６＞ｈｕ０８−ｍｃ−８２６１である。

表１９中のデータは、ＡＤＣ ｈｕ０８−ｖｃ−０１０１およびｈｕ０８−ｍｃ−３３７７は、ＰＣ３ＭＭ２における腫瘍増殖の低減において３ｍｇ／ｋｇで効果的であったことを示す。大きいサイズの腫瘍（一部の動物から２５００ｍｍ^３超）のために１５日目で終了したビヒクル対照群と比較して、ｈｕ０８−ｖｃ−０１０１およびｈｕ０７−ｍｃ−３３７７は、７６日目で測定可能な腫瘍を有さない動物がそれぞれ８匹のうち５匹、または８匹のうち３匹である。ビヒクル対照群と同様に、３ｍｇ／ｋｇのｈＩｇＧ８．８−ｖｃ−０１０１および１０ｍｇ／ｋｇのｈＩｇＧ８．４−ｍｃ−３３７７の無関係のＡＤＣ対照群は、それぞれ群内の大きいサイズの腫瘍のために、それぞれ１５日目および１９日目に終了した。これらの結果は、ｈｕ０８−ｖｃ−０１０１およびｈｕ０７−ｍｃ−３３７７に由来する大きな治療有効性（一部の動物は疾患が治癒した）は、ＩＬ−１３−Ｒα２標的が媒介したことを実証する。

表２０ａ中のデータは、ｈｕ０８−ｖｃ−０１０１およびｈｕ０８−ｍｃ−３３７７のＡＤＣは、Ａ３７５細胞を使用する第２のｉｎ ｖｉｖｏ異種移植片モデルにおいて３ｍｇ／ｋｇで効果的であったことを示す。ビヒクル対照群、ならびにｈＩｇＧ８．８−ｖｃ−０１０１およびｈＩｇＧ８．８−ｍｃ−３３７７の無関係のＡＤＣ対照群は、それぞれ１９、２２、２７日目に大きい腫瘍サイズのために終了した。３ｍｇ／ｋｇのｈｕ０８−ｖｃ−０１０１およびｈｕ０８−ｍｃ−３３７７で処置すると、すべての動物において腫瘍が退縮し、有意な生存優位性がもたらされた。ｈｕ０８−ｍｃ−３３７７で処置したすべての動物において、１９〜２２日目で測定可能な腫瘍はまったく観察されなかった。いくつかの腫瘍が再発したが、７１日目で測定可能な腫瘍を有さない動物が１０匹のうち５匹であった。ｈｕ０８−ｖｃ−０１０１で処置した群を１００日にわたって監視し、動物のうち８匹が１９〜１００日目で測定可能な腫瘍をまったく有さなかった。これらの結果は、ＩＬ−１３−Ｒα２陽性腫瘍に対するｈｕ０８−ｖｃ−０１０１およびｈｕ０８−ｍｃ−３３７７の強力な抗腫瘍活性を実証する。

表２０ｂおよび表２０ｃ中のデータは、ＡＤＣ ｈｕ０８−ｖｃ−０１０１およびｈｕ０８−ｍｃ３３７７は、ＨＥＹ−Ｃ２卵巣がん細胞株を使用する第３のｉｎ ｖｉｖｏ異種移植片モデルにおいて効果的であったことを示す。ビヒクル対照群ならびに陰性ＡＤＣ対照群のｈＩｇＧ８．８−ｖｃ０１０１（３ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇ）およびｈＩｇＧ８．８−ｍｃ−３３７７（１０ｍｇ／ｋｇ）は、ＧＴと指定して示したように大きい腫瘍サイズのために終了した。１、３、および１０ｍｇ／ｋｇの用量レベルでｈｕ０８−ｖｃ−０１０１およびｈｕ０８−ｍｃ−３３７７で処置すると、用量依存的な応答がもたらされた。３ｍｇ／ｋｇのｈｕ０８−ｖｃ−０１０１で処置した９匹のうちの５匹の動物および１０ｍｇ／ｋｇのｈｕ０８−ｖｃ−０１０１で処置した９匹のうちの７匹の動物が、試験の最後（１０３日目）まで生存した。同様に、３ｍｇ／ｋｇのｈｕ０８−ｍｃ−３３７７で処置した９匹のうちの５匹の動物および１０ｍｇ／ｋｇのｈｕ０８−ｍｃ−３３７７で処置した９匹のうちの９匹の動物が、試験の最後（１０３日目）まで生存した。

（実施例１７）
部位特異的コンジュゲーションのためのシステイン変異体の生成
リンカー−ペイロードの抗体への部位特異的コンジュゲーションを行って、均質な薬物装填を改善し、かつ慣例的なコンジュゲーション法によって観察されることが多い抗原結合性が変化した、または薬物動態が変化したＡＤＣ亜集団を回避した。１つのこのような部位特異的コンジュゲーション法は、標的抗体のアミノ酸配列中の特定部位でシステイン残基を導入することである。定常重鎖および定常軽鎖中のいくつかのアミノ酸位置が以前に同定されており（特許出願ＵＳＳＮ６１／５８０，１６９を参照）、ｈｕ０８ｖ１．０／１．０抗体中の特定のアミノ酸位置でシステイン残基と置換された。すべてのシステイン変異は、ｐＳＭＥＤ−ｈｕ０８ｖ１．０およびｐＳＥＭＮ３−ｈｕ０８ｖ１．０に基づいて部位特異的変異誘発またはオーバーラッピングＰＣＲによって構築した。以下は、ｈｕ０８ｖ１．０／１．０に由来するシステイン変異体のリストおよびそれぞれの配列番号である（表２１）。

（実施例１８）
システイン変異体の特徴付け
ｈｕ０８ｖ１．０／１．０のシステイン変異体を、フリースタイル２９３発現培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ｃａｌｓｄａｄ、ＣＡ）中の一過性にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３浮遊細胞培養物内、またはＣＨＯ細胞培養安定プール内で発現させた。抗体は、標準条件下でプロテインＡ（ＰｒｏＡ）クロマトグラフィーによって細胞培養培地から単離した。カラム画分をプールし、３０，０００ＭＷＣＯ膜を備えたＭｉｌｌｉｐｏｒｅスピンチューブを使用して濃縮した。次いでタンパク質を、ＰＢＳ−ＣＭＦ、ｐＨ７．２を備えたサイズ排除カラム（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００）に装填した。ピーク画分をプールし、３０，０００ＭＷＣＯ膜を備えたＭｉｌｌｉｐｏｒｅスピンチューブを使用して濃縮し、最後に０．２２μｍフィルターに通して濾過した。一過性発現からのデータを表２２に、およびＣＨＯ細胞安定プールからのデータを表２３に示す。野生型ｈｕ０８ｖ１．０／１．０およびそのシステイン誘導体は、ＰｒｏＡ捕捉後に同等の最終的な収率および純度を有し、ＳＥＣ後に最大９９％の純度に到達し、２〜３サイクルの凍結および解凍後に安定である。このデータは、システイン変異体は、ｈｕ０８ｖ１．０／１．０と比較して、これらの発現プロファイルおよび精製特性を維持することを実証する。

ｈｕ０８ｖ１．０／１．０システイン変異体の結合特性。
システイン変異体のｈＩＬ−１３−Ｒα２への結合特性を、標準ＥＬＩＳＡおよび競合ＥＬＩＳＡによって評価した。結果は、Ｃｙｓ変異体のすべてが野生型ｈｕ０８ｖ１．０／１．０と比較して同様のＥＤ５０を有することを示す（表２３）。この結論は、ビオチン化ｃｈ０８を用いた競合ＥＬＩＳＡによって確認された。表２４は、すべてのＣｙｓ変異体が野生型ｈｕ０８と同様のＩＣ５０を有することを実証し、結合親和性は、野生型ｈｕ０８と同じであることを示す。ｃｈ０７を陰性対照として使用した。

ｈｕ０８ｖ１．０／１．０システイン変異体の熱安定性。
抗ＩＬ−１３−Ｒα２システイン変異体ｍＡｂの熱安定性を、オートサンプラー（Ｎｏｒｔｈａｍｐｔｏｎ、ＭＡ）を備えたＭｉｃｒｏＣａｌ製Ｃａｐｉｌｌａｒｙ−ＤＳＣシステムを使用してキャピラリー示差走査熱量測定（ＤＳＣ）によって分析した。標準プロトコールを利用した。試料細胞と参照細胞との間の熱容量差を記録し、Ｏｒｉｇｉｎ７．０ ソフトウェア（ＯｒｉｇｉｎＬａｂ、Ｎｏｒｔｈａｍｐｔｏｎ、ＭＡ）内の３つの熱転移にフィットさせた非２状態モデルを使用して分析した。ベースラインサーモグラムも、試料細胞および参照細胞の両方においてＰＢＳ緩衝液を用いて作成し、タンパク質変性に関連しない任意のシステムの熱を差し引くのに使用した。表２５中の結果は、２種の単一および３種の二重システイン変異体抗体が親ｈｕ０８ｖ１．０／１．０と同等のＴｍを有することを示す。

ｈｕ０８ｖ１．０／１．０システイン変異体ＡＤＣの熱安定性
野生型ｈｕ０８ｖ１．０／１．０および５種のシステイン変異体を、ＵＳ仮特許出願第６１／５８０，１６９号に記載されたようにｖｃ−０１０１とコンジュゲートした。すべてのＡＤＣの熱安定性は、キャピラリー示差走査熱量測定（ＤＳＣ、上記の詳細を参照）によって測定した。表２６で以下に示したように、野生型ｈｕ０８ｖ１．０／１．０ ｖｃ−０１０１コンジュゲートのＴｍ１は、その裸の抗体より有意に低い（≧５℃）（表８を参照）。ＡＤＣのＴｍ２は、裸の抗体より約１〜２℃低い一方、Ｔｍ３は、同等である。ｈｕ０８ｖ１．０／１．０システイン変異体に関して、ｖｃ−０１０１コンジュゲートのＴｍ１、Ｔｍ２、およびＴｍ３は、その対応する裸の抗体と同様であるか、それよりわずかに低い（≦１〜２℃）（表２５を参照）。これは、システイン変異体がコンジュゲーション後に野生型抗体より熱的に安定であることを示す。

ｖｃ−０１０１とコンジュゲートしたｈｕ０８ｖ１．０／１．０システイン変異体の血漿およびグルタチオン安定性。
ＧＳＨ安定性のための試料調製：ＰＢＳ中のｈｕ０８−ｖｃ−０１０１ ＡＤＣまたはｈｕ０８−ｃｙｓ変異体−ｖｃ−０１０１ ＡＤＣ ３０μｇをグルタチオン（ＧＳＨ）溶液と混合して、０．５ｍＭの最終濃度のＧＳＨを生じさせた。０．５ｍＭ ＧＳＨ中のＡＤＣおよび対照ＡＤＣ（０ｍＭ ＧＳＨ）を３７℃でインキュベートし、０、３、および６日にサンプリングした。ＴＣＥＰ（トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン）を還元のために使用した。

マウス血漿安定性のための試料調製：ＰＢＳ中のＡＤＣ試料９０μｇをマウス血漿と混合し、２０％ ＭＰＥＲ（Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ、哺乳動物タンパク質抽出試薬）で１：１に希釈した。ＡＤＣ／血漿試料を３７℃でインキュベートし、一定量を０、１、および２日に採取し、ビオチン化組換えｈＩＬ−１３−Ｒα２タンパク質で免疫沈降させた。ＡＤＣを０．１５％ギ酸溶液で溶出し、濃縮されたＴｒｉｓ ＨＣｌ緩衝液で中和してｐＨ７．８にした。試料をＰＮＧａｓｅＦ（ペプチド：Ｎ−グリコシダーゼＦ）を添加することによって脱グリコシル化し、ＴＣＥＰで還元した。

ＬＣ／ＭＳ分析手順：ＡＤＣ／血漿およびＡＤＣ／ＧＳＨ安定性試料の一定量を、１０％アセトニトリルを含む０．１％ギ酸溶液を添加することによって酸性化し、その後、Ｗａｔｅｒ Ｘｅｖｏ Ｇ２ Ｑ−ＴＯＦ質量分析計とカップリングしたＡｇｉｌｅｎｔ １１００キャピラリーＨＰＬＣでＬＣ／ＭＳ分析を行った。分析物を、０．１％ギ酸を含むＺｏｒｂａｘ Ｐｏｒｏｓｈｅｌｌ ３００ＳＢ Ｃ８カラム（０．５ｍｍ×７５ｍｍ、８０℃で維持）に装填し、５．５分にわたって２０μｌ／分の流量で、２０〜４０％緩衝液Ｂ（８０％アセトニトリル、１８％ １−プロパノール、０．１％ギ酸を含む２％水）の勾配を使用して溶出した。質量分析検出は、キャピラリー電圧を３．３ｋＶに設定して正、感受性モードで実施した。データ分析は、ＭａｓｓＬｙｎｘ中のＭａｘＥｎｔ１機能を用いて実施し、強度を、以下の式：
ローディング＝２^＊［ＬＣ１／（ＬＣ０＋ＬＣ１）］＋２^＊ＨＣ１／（ＨＣ０＋ＨＣ１＋ＨＣ２）］＋４^＊ＨＣ２／（ＨＣ０＋ＨＣ１＋ＨＣ２）］
に基づいてローディングを計算するのに使用した。

ｈｕ０８およびｖｃ−０１０１とコンジュゲートしたそのｃｙｓ変異体のＡＤＣ（表２６からの）を、血漿およびＧＳＨ安定性アッセイに付した。結果は、システイン変異体に由来するＡＤＣは、慣例的なコンジュゲーション技術に由来するＡＤＣより安定であることを実証する（表２７）。

（実施例１９）
Ｃｙｓ変異体ＡＤＣのｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞傷害性アッセイ
ＩＬ−１３−Ｒα２抗原を発現する細胞株、またはＩＬ−１３−Ｒα２陰性細胞株、Ｈ４６０を、ｖｃ−０１０１またはｍｃ−３３７７とコンジュゲートした漸増濃度のｈｕ０８ｖ１．０／１．０システイン変異体とともに培養した。４日後、各培養物の生存能を評価した。ＩＣ_５０値をロジスティック非線形回帰によって計算した。これらをｎｇ／ｍＬで提示する（表２８ａおよび表２８ｂ）。

（実施例２０）
Ｃｙｓ変異体ＡＤＣの皮下異種移植片モデル
雌の胸腺欠損（ヌード）マウスに、ＰＣ３ＭＭ２腫瘍細胞をｓ．ｃ．注射した。およそ０．２〜０．５ｇの病期分類された腫瘍を有するマウス（ｎ＝８〜１０匹のマウス／処置群）に、生理食塩水（ビヒクル）、システイン変異体Ｌ４４３Ｃ−ｖｃ−０１０１、Ｋ３９２Ｃ／Ｌ４４３Ｃ−ｖｃ−０１０１、Ｌ４４３Ｃ／Ｋ１８３Ｃ−ｖｃ−０１０１、Ｑ３４７Ｃ−ｖｃ−０１０１、もしくはｈＡＢ−ｖｃ−０１０１を静脈内に１．５もしくは４．５ｍｇ／ｋｇで単一用量を、または３、６、および１２ｍｇ／ｋｇのＬ４４３Ｃ−ｍｃ−３３７７、Ｋ３９２Ｃ／Ｌ４４３Ｃ−ｍｃ−３３７７、Ｌ４４３Ｃ／Ｋ１８３Ｃ−ｍｃ−３３７７を投与した。すべてのＡＤＣは、Ａｂ含量に基づいて投薬した。腫瘍は、少なくとも１週間に１回測定し、これらのサイズ（ｍｍ^３±標準誤差）をｍｍ^３＝０．５×（腫瘍幅^２）×（腫瘍長さ）として計算した。

表２９中のデータは、Ｌ４４３Ｃ−ｖｃ−０１０１、Ｋ３９２Ｃ／Ｌ４４３Ｃ−ｖｃ−０１０１、Ｌ４４３Ｃ／Ｋ１８３Ｃ−ｖｃ−０１０１、およびｈｕ０８−ｖｃ−０１０１は、１．５ｍｇ／ｋｇおよび４．５ｍｇ／ｋｇの両方で、すべて、ビヒクル対照群と比較してＰＣ３ＭＭ２異種移植片の増殖を阻害することを示す。Ｌ４４３Ｃ／Ｋ１８３−ｖｃ−０１０１は、４．５ｍｇ／ｋｇの用量レベルの群の終了前の７０日目の最も長い監視時間で示されるように、実験で試験した最も強力な化合物である。

表３０中のデータは、Ｑ３４７Ｃ−ｖｃ−０１０１およびＱ３４７Ｃ／Ｋ１８３Ｃ−ｖｃ−０１０１はすべて、ビヒクル対照群と比較して１．５ｍｇ／ｋｇおよび４．５ｍｇ／ｋｇの両方でＰＣ３ＭＭ２異種移植片の増殖を阻害することを示す。さらに、データは、ｈｕ０８ＭＡＣ−０１０１は、ビヒクル対照群と比較して１．５ｍｇ／ｋｇでＰＣ３ＭＭ２異種移植片の増殖を阻害することを実証する。最も強力な化合物は、７７日目の最長監視時間を伴った４．５ｍｇ／ｋｇの用量レベルで示されたように、Ｑ３４７Ｃ／Ｋ１８３Ｃ−ｖｃ−０１０１であった。これらの結果は、部位特異的ｖｃ−０１０１コンジュゲートが、野生型ｈｕ０８−ｖｃ−０１０１コンジュゲートと有効性において同等であり、またはそれより優れていることを示す。

表３１ａおよび表３１ｂ中のデータは、Ｌ４４３Ｃ−ｍｃ−３３７７、Ｋ３９２Ｃ／Ｌ４４３Ｃ−ｍｃ−３３７７、Ｌ４４３Ｃ／Ｋ１８３Ｃ−ｍｃ−３３７７、およびｈｕ０８−ｍｃ−３３７７が、ビヒクル対照群と比較して用量依存的に腫瘍退縮を引き起こしたことを示す。Ｌ４４３Ｃ／Ｋ１８３Ｃ−ｍｃ−３３７７は、他の化合物と比較して１２ｍｇ／ｋｇの用量レベルにおいて小さい平均腫瘍サイズで示されるように、実験で試験した最も強力な化合物であった。さらに、６０日目に、１２ｍｇ／ｋｇのＬ４４３Ｃ／Ｋ１８３Ｃ−ｍｃ３３７７で処置された群から、測定可能な腫瘍を有さない動物が８匹のうち６匹あった。

（実施例２１）
ＭＡＣ技術を用いた部位特異的コンジュゲーション
抗体またはその抗原結合性断片を含む多機能性抗体コンジュゲート（ＭＡＣ）を調製する方法は、以前に記載されている（ＷＯ２０１２／００７８９６およびＵＳＳＮ６１／５８４，６７５）。本発明の一態様は、ヒトＩＬ−１３Ｒα２に特異的に結合する抗体またはその抗原結合性断片を利用してＭＡＣを調製する方法であって、抗体は、配列番号５２に示したＬＣの１８５位で変異Ｄ１８５Ａを有し、配列番号４９のＬＣのＫ１８８の側鎖に付着されたリンカーによって少なくとも１つの薬物部分に共有結合的にコンジュゲートされており、前記方法は、ＰＦＰ（Ｐｅｎｔａｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ、ペンタフルオロフェニル）エステルを使用して薬物部分を共有結合的に付着させるステップと、そのように形成されたエフェクター部分−リンカー−脱離基複合体を、約３．５：１から約４．５：１の間の薬物部分：抗体のモル比で抗体と反応させるステップとを含む、方法である。いくつかの態様では、モル比は、約３．７：１〜約４．３：１である。本明細書に記載のＭＡＣは、ｈｕ０８ＭＡＣ−０１０１として指定され、配列番号５２のＬＣの変異Ｄ１８５Ａ、および配列番号５２のＬＣの１８８位（Ｋ１８８）でリシン残基の側鎖にコンジュゲートされた薬物部分０１０１（実施例１３）を含む。ｈｕ０８ＭＡＣ−０１０１のｉｎ ｖｉｔｒｏ活性は、表１７に示されている（実施例１５）。ＰＣ３ＭＭ２異種移植片モデルにおけるｉｎ ｖｉｖｏ活性は、表３０に示されている（実施例２０）。

Claims (28)

1. ヒトＩＬ−１３−Ｒα２に特異的に結合する単離抗体またはその抗原結合性断片であって、前記抗体が、配列番号１のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、ならびに配列番号５のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む、単離抗体またはその抗原結合性断片。
2. ヒトＩＬ−１３−Ｒα２に特異的に結合する単離抗体またはその抗原結合性断片であって、前記抗体が、
   （ａ）配列番号２を含む重鎖ＣＤＲ１、
   （ｂ）配列番号３を含む重鎖ＣＤＲ２、
   （ｃ）配列番号４を含む重鎖ＣＤＲ３、
   （ｄ）配列番号６を含む軽鎖ＣＤＲ１、
   （ｅ）配列番号７を含む軽鎖ＣＤＲ２、および
   （ｆ）配列番号８を含む軽鎖ＣＤＲ３
   を含む、単離抗体またはその抗原結合性断片。
3. 前記単離抗体が、配列番号１の重鎖可変領域アミノ酸配列をさらに含む、請求項２に記載の単離抗体またはその抗原結合性断片。
4. 前記単離抗体が、配列番号５の軽鎖可変領域アミノ酸配列をさらに含む、請求項２または３に記載の単離抗体またはその抗原結合性断片。
5. 前記抗体が、配列番号５０のアミノ酸配列を含む重鎖を含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の単離抗体またはその抗原結合性断片。
6. 前記抗体が、配列番号５１のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の単離抗体またはその抗原結合性断片。
7. 請求項１から６のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合性断片にコンジュゲートされた細胞傷害性剤を含む、抗体−薬物コンジュゲート。
8. 式：
   Ａｂ−（Ｌ−Ｄ）ｐ
   の抗体−薬物コンジュゲートであって、
   式中、
   （ａ）Ａｂは、請求項１から６のいずれか一項に記載の単離抗体またはその抗原結合性断片であり、
   （ｂ）Ｌ−Ｄは、リンカー−薬物部分であり、式中、Ｌはリンカーであり、Ｄは薬物であり、
   （ｃ）ｐは、１〜約８の整数である、
   抗体−薬物コンジュゲート。
9. Ｌ−Ｄが、ｖｃ−０１０１およびｍｃ−３３７７からなる群から選択される、請求項８に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
10. Ａｂが、（ａ）配列番号１のＶＨ配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、ならびに（ｂ）配列番号５のＶＬ配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む、請求項８または９に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
11. Ａｂが、（ａ）配列番号２を含む重鎖ＣＤＲ１、（ｂ）配列番号３を含む重鎖ＣＤＲ２、（ｃ）配列番号４を含む重鎖ＣＤＲ３、（ｄ）配列番号６を含む軽鎖ＣＤＲ１、（ｅ）配列番号７を含む軽鎖ＣＤＲ２、および（ｆ）配列番号８を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む、請求項８から１０のいずれか一項に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
12. 式：
    Ａｂ−（Ｌ−Ｄ）ｐ
    の抗体−薬物コンジュゲートであって、
    式中、
    （ａ）Ａｂは、請求項１から６のいずれか一項に記載の単離抗体またはその抗原結合性断片であり、
    （ｂ）Ｌ−Ｄは、リンカー−薬物部分、ｖｃ−０１０１であり、
    （ｃ）ｐは、１〜約４の整数である、
    抗体−薬物コンジュゲート。
13. 式：
    Ａｂ−（Ｌ−Ｄ）ｐ
    の抗体−薬物コンジュゲートであって、
    式中、
    （ａ）Ａｂは、請求項１から６のいずれか一項に記載の単離抗体またはその抗原結合性断片であり、
    （ｂ）Ｌ−Ｄは、リンカー−薬物部分、ｍｃ−３３７７であり、
    （ｃ）ｐは、１〜約４の整数である、
    抗体−薬物コンジュゲート。
14. 請求項１から６のいずれか一項に記載の抗体もしくはその抗原結合性断片、および／または請求項７から１３のいずれか一項に記載の抗体−薬物コンジュゲート、および薬学的に許容できる担体を含む医薬組成物。
15. それを必要とする患者においてＩＬ−１３−Ｒα２発現がんを処置する方法であって、請求項７から１３のいずれか一項に記載の抗体−薬物コンジュゲートを前記患者に投与するステップを含む、方法。
16. 前記がんが、肺がん、大腸がん、胃がん、膵臓がん、卵巣がん、悪性神経膠腫、および黒色腫からなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。
17. 療法で使用するための請求項７から１３のいずれか一項に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
18. 療法用医薬の製造における請求項７から１３のいずれか一項に記載の抗体−薬物コンジュゲートの使用。
19. ＩＬ−１３−Ｒα２発現がんを処置するためのものである、請求項１７に記載の抗体−薬物コンジュゲートの使用または１８に記載の使用。
20. 前記がんが、肺がん、大腸がん、胃がん、膵臓がん、卵巣がん、悪性神経膠腫、および黒色腫からなる群から選択される、請求項１９に記載の使用。
21. 請求項１から６のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合性断片をコードする核酸。
22. 請求項２１に記載の核酸を含むベクター。
23. 請求項２２に記載のベクターを含む宿主細胞。
24. 抗体を生産するための方法であって、請求項２３に記載の宿主細胞を培養するステップと、細胞培養物から抗体を回収するステップとを含む、方法。
25. 請求項９に記載の抗ＩＬ−１３−Ｒα２抗体−薬物コンジュゲートを生産するための方法であって、
    （ａ）マレイミドカプロイルおよびマレイミドカプロイル−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＡからなる群から選択されるリンカーを薬物に連結するステップと、
    （ｂ）前記リンカー−薬物部分を請求項２４に記載の細胞培養物から回収した抗体にコンジュゲートするステップと、
    （ｃ）抗体−薬物コンジュゲートを精製するステップと
    を含む、方法。
26. 請求項１から６のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合性断片と、ヒトＩＬ−１３−Ｒα２への特異的結合について競合する単離抗体。
27. がんを有する対象が、請求項７から１３のいずれか一項に記載の抗体−薬物コンジュゲートに応答するか否かを予測するための方法であって、対象に由来する前記がんの生体試料が、ヒトＩＬ−１３−Ｒα２を発現するか否かを判定するステップを含む、方法。
28. 生体試料中のヒトＩＬ−１３−Ｒα２のレベルを判定する方法であって、
    （ａ）請求項１から６のいずれか一項に記載の抗体を使用したイムノアッセイで、がんを有すると疑われる対象に由来する試料を試験するステップと、
    （ｂ）前記試料におけるヒトＩＬ−１３−Ｒα２の細胞表面レベルを判定するステップと、
    （ｃ）ヒトＩＬ−１３−Ｒα２の細胞表面レベルを参照対象または標準物質のものと比較するステップと
    を含む、方法。

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