JP2016509206A - 携帯型蛍光検出システムおよびマイクロアッセイカートリッジ - Google Patents

携帯型蛍光検出システムおよびマイクロアッセイカートリッジ Download PDF

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Abstract

液体試料における蛍光分析検定のための小型マイクロプロセッサ制御機器であって、マイクロ流体カートリッジを受け取るためのドッキングベイを伴う浮動ステージと、検出器ヘッド内の孤立した低雑音・高利得環境でソースＬＥＤ、放射信号増幅、およびフィルタリングを制御するための検出器ヘッド内に常駐するＯＤＡＰデーモンの制御下で操作される、内蔵組み込みマイクロプロセッサを伴う走査検出器ヘッドとを有する、機器が開示される。複数の光学チャネルが走査ヘッドに組み込まれてもよい。好ましい構成では、検定は、標的被分析物と関連付けられる第１のフルオロフォア、および対照と関連付けられる第２のフルオロフォアを監視するための二重チャネル光学部を使用して、妥当性を立証される。用途は、一般に、標的核酸のＰＣＲ増幅および蛍光分析検定に基づく分子生物学的検定を含み、その多くは、検出中に温度制御を必要とする。

Description

本発明は、概して、マイクロアッセイカートリッジで行われる診断検定で使用するための光学、熱、機械、および空気液圧システムを伴う小型蛍光検出機器に関する。
（関連技術の説明）
生体外診断分析法用のプローブとしてのフルオロフォアの使用の有益性が周知であるが、そのような分析法用の最も一般的に入手可能な形式の機器は、大型で、使用が複雑で、比較的遅く、高価な共焦点光学部に依存する。これらの属性により、機器は、遠隔場所、および診療時の現場での完全一体型「サンプルツーアンサー」検査にとって不適切になり、そのような機器は、頑健、高速、コンパクト、安価、および使用容易であるよう要求される。マイクロ流体カートリッジの中の自動核酸増幅が、数年前に最初に提案された（Ｗｉｌｄｉｎｇ、米国特許第５３０４４８７号および同第５６３５３５８号を参照）が、制御された実験室条件外での蛍光分析法標的の検出は依然として、携帯用の頑丈な機器の不足によって妨げられている。これらの開始以来２０年、分子診断学は、これらおよび他の未解決の問題により、先進実験室施設がない場合には依然として比較的珍しい。
分子診断学へのより広範なアクセスを推進するために、特殊実験室施設外で動作するように設計されている、内蔵型分析システムが必要とされる。核酸分析法は、より高い感度および特異性の両方を提供するため、感染症を含む多くの異なる疾患の種類の検出に対する「ゴールドスタンダード」に急速になりつつある。そのような分析法は、広範囲の病原状態に極めて特異的であることが証明されており、例えば、Ｈ５Ｎ１鳥インフルエンザと他の種類のインフルエンザＡおよびＢを区別する際、特定の病原体標的が薬物抵抗性箘であるか否かを決定する際、および大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７等の腸内分離株の毒素産生菌を検出する際に、疫学に必須であるように、特定の疾患の遺伝子株を追跡するために有用である。蛍光ベースの分析法はまた、一般的に糖尿病、心臓病、凝血障害、免疫学的検定等の状態を監視するため、および、例えば、食物または製剤中の内毒素の検出のために有用であることも示されている。改良型機器は、医療へのアクセスが限定されており、多くの感染症が風土病であり、健康および平均余命が不良である、開発途上国内の多数の遠隔診療所のために特に必要とされている。
典型的な蛍光分析システムでは、蛍光プローブまたはフルオロフォアが、波長または一連の波長を有する光を吸収して励起され、次いで、フルオロフォアは、蛍光信号を発する。フルオロフォアの活性または不活性は、分析法結果を示す。発光信号は、概して励起光よりも長い（しかし「上方変換フルオロフォア」の場合のように短くてもよい）波長または一連の波長を有する。次いで、二色性ビームスプリッタまたは帯域通過フィルタ、あるいはそれらの組み合わせが、他の光から蛍光信号を分離するために使用され、信号はセンサに送られる。センサはしばしば、フォトダイオードであり、分析を採点するために使用することができる電気信号を生成する。リアルタイムまたは終点蛍光法を使用する定性および定量分析法が実行可能である。
そのようなシステムでは、液体試料が、マイクロ流体チャネルを介して、マイクロ流体カートリッジの検出チャンバまたはチャネルの中へ運ばれ、その場合、試料と混合された、または試料に固有の蛍光プローブが、励起源によって励起される。制御が並行して実行されるか、または分析チャネルで多重化されてもよい。発光した光は、標的の有無を決定するように測定される。複数の検出チャネルが、マイクロ流体カートリッジの検出領域中で配設されてもよい。分析法は、１回以上の蛍光の測定を行うことを含んでもよく、フルオロフォアが、増幅ステップで形成される核酸アンプリコンに対する、またはより一般的には蛍光分析法標的の有無に対するマーカーとして使用されてもよい。リアルタイム蛍光法、ＦＲＥＴ、ｑＰＣＲ、熱融解曲線、分析法採点および検証のための動態および速度終点も、当技術分野で知られている。
既知の蛍光検出器は、典型的には、マイクロ流体カートリッジまたはマイクロアレイ内に存在する蛍光放射を取り上げて局所化するために、比較的高価な光学構成要素（共焦点光学部、レーザ、および非球面レンズ等）を採用する。Ｊｕｎｃｏｓａへの国際公開第ＷＯ ９８／０４９５４３号は、例えば、単一の光学列内の３つの二色性ビームスプリッタを教示し、１つは励起源電力を制御するためのものであり、もう１つは反射信号を制御するためのものであり、第３の二色性ビームスプリッタは、プローブ特有の蛍光放射を判別するために使用される。１つ以上のレンズは、試料に励起ビームを集束させる働きをする。Ｊｕｎｃｏｓａはさらに、光電子増倍管の入口における開口、および約５０ミクロンでの「マイクロロケーション」の分解能で撮像ビームを制御するための共焦点顕微鏡の光学対物レンズ構成要素の使用を教示する。「好ましくは開口の使用を通して、検出器の視野を照射の領域に制限することを加味して、照射の範囲を所与のマイクロロケーションの領域またはそのわずかに制限することによって、信号対雑音比の有意な向上が達成され得る。」［ページ７、行１０〜１５］。これらの教示は、Ｍｉｎｓｋｙへの米国特許第３０１３４６７号、Ｔｓｉｅｎへの米国特許第５２９６７０３号、Ｄｉｘｏｎへの第５１９２９８０号、Ｓｔｅｒｎへの第５６３１７３４号、Ｋａｍｂａｒａへの第５７３０８５０号によって予測され、とりわけ、Ｍａｈｅｒへの米国特許第６６１４０３０号およびＳｈａｍｓへの第６７３１７８１号で繰り返される。Ｍａｈｅｒは、マイクロ流体チャンバの中心における１０ミクロンサイズのスポットで集束および放射を最適化するために、ミニ共焦点光学システムとともに、レーザ、光ファイバ、水晶板、および非球面レンズを使用する。
同様に、米国特許第６６３５４８７号では、Ｌｅｅは、試料の平面に励起ビームの円錐を集束させることにより、「検定チップ上の分析検出測定を増進するように最大強度を提供する」ことを肯定している。したがって、この教示は従来技術を要約する。
より近年の出願では、Ｋｉｍへの米国特許出願第２００８／０２９７７９２号は、マイクロ流体チップにおいて蛍光検出のための光源としての機能を果たすＬＥＤの画像が、対物レンズによって「光スポット」として試料上に投影されることを教示する。光スポットは、マイクロ流体チップ内のチャンバ中の流体の深度の中央で集束させられる。試料によって放射される蛍光は、対物レンズによって可能な限りほぼ平行な光線に平行にされ、アバランシェフォトダイオード上に集束させられる。周知であるように、阻止帯域が４５°角度で鏡に入射しない光線のために偏移されるであろうため、整合における高精度のための要件は、ダイクロイックミラーに関する。したがって、Ｋｉｍの教示は、一般的に認識されている最先端技術を反映する。
単一の光路内で複数の励起および検出波形を多重化するための蛍光検出器ヘッドが説明されている、ＧｒｕｌｅｒへのＰＣＴ公開第ＷＯ２００８／１０１７３２号では、「共焦点測定は、照明光学部または照明源の焦点が、それぞれ本質的に、それぞれ、検出光学部またはセンサの焦点と同一であることを意味する」と記述されている。Ｇｒｕｌｅｒは続けて、「（本発明の）共焦点光学部は・・・共焦点設計の最高信号および最低背景固有特徴を確保する」と記述し、すなわち、Ｇｒｕｌｅｒによると、可能な限り最高の信号および最低の雑音が共焦点光学部を用いて得られる。
従来技術の合意教示は、落射蛍光顕微鏡法用の共焦点光学部の特殊な使用から生じたが、該教示は、マイクロ流体、側方流動、キャピラリー電気泳動、およびマイクロアレイ用途に、幅広くかつ無批判に適用されている。しかしながら、我々は、このアプローチが、流体充填チャネル内の１つ以上の分子プローブの検出が必要とされる、液相マイクロ流体診断分析法に適していないことを見出した。光消光、熱対流、および流体充填チャネル内の気泡または勾配の時折の気泡の存在等の影響により、試料チャンバの平面内の励起ビームおよび発光円錐の焦点を共同局在化することは、結果において、許容し難い不安定性、信号の損失、消光、雑音、再生不可能性、および感度の全体的損失につながり得る。ＰＣＲのより高い温度により、例えば、試薬および試料のガス放出は珍しい問題ではなく、液体試料に混入された気泡からの干渉は頻繁な問題である。従来のアプローチはまた、より効果な光学構成要素を必要とし、したがって、先進臨床検査室外の幅広い用途にとって不利である。
第２の問題は、分析法検証である。例えば、ＰＣＲによる感染症分析法の検証に対する現在の基準は、スパイク核酸テンプレートの使用、または、より好ましくは、内因性正常細菌叢、例えば、チフス菌あるいは大腸菌Ｏ１５７等の病原体が疑われる、便の中の偏在的な非病原性大腸菌の共検出に依存するようになってきている。別の偏在的な内因性テンプレートは、より高い質の呼吸および血液試料と関連付けられる、ヒト１８Ｓ ｒＲＮＡである。内因性テンプレートの共増幅および検出は、分析法結果への信頼を確保するが、マーカーとして使用されるフルオロフォア間の起こり得るクロストークにより、実践において達成することが困難である。高利得増幅を使用する時に、多重ＰＣＲのために一般的に選択されるフルオロフォアの励起および発光のスペクトル内のあるレベルのクロスオーバーが典型的であり、予期される。したがって、下流処理用の共有低雑音電子機器を有する走査検出器ヘッド内で別個の光チャネルを使用することによって、スペクトルが重複する段部を有する蛍光信号を隔離する解決法が、当技術分野での有益性の技術的進歩となるであろう。
第３の問題は、携帯性である。共有試薬貯留部および共有流体含有表面による交差汚染が回避されるため、使い捨てカートリッジの使用が有益であることが分かっている。しかしながら、使い捨てカートリッジを受け入れるための精密光学器具プラットフォームを構成することが問題である。問題は、カートリッジ整列および検出器ヘッド設置に影響を及ぼす、機械公差における不正確性および蓄積、器具の中のプラスチック使い捨てカートリッジと加熱源との間に高伝導性熱インターフェースを形成する必要性、装置上の制御サーボとカートリッジ上のマイクロ弁との間の空気圧インターフェースを密閉する必要性、およびマイクロ流体カートリッジ（典型的には、約１ミリメートルまたはそれ未満）の中で利用可能な必然的により短い光路を含み、それは、最適化しなければ、感度の損失につながり得る。これらの相互に連動する問題の同時解決は、ほとんどの場合、この極めて予測不可能な技術分野で試行錯誤によって誘導される、広範な実験および開発によってのみ達成される。従って、多数の改良に対する技術上の必要があり、この改良の要素が本明細書における開示の目的である。
米国特許第５３０４４８７号明細書 米国特許第５６３５３５８号明細書 国際公開第９８／０４９５４３号 米国特許第３０１３４６７号明細書 米国特許第５２９６７０３号明細書 米国特許第５１９２９８０号明細書 米国特許第５６３１７３４号明細書 米国特許第５７３０８５０号明細書 米国特許第６６１４０３０号明細書 米国特許第６７３１７８１号明細書 米国特許第６６３５４８７号明細書 国際公開第２００８／１０１７３２号
本発明は、本発明の第１の側面では、液体試料を含有する検出チャネルまたはチャンバの裏面上の熱光学ウィンドウと接触して連動する、加熱ブロック上に形成される反射鏡面を提供することによって、液体試料中の気泡および他の連動不均質性の存在下のマイクロ流体カートリッジの中の蛍光プローブ、タグ、フルオロフォア、および被分析物の確実かつ高感度な検出の問題に対処する。鏡面は、加熱ブロックの頂面上に形成され、使用中に検出チャンバの下部光ウィンドウに接触し、各使い捨てカートリッジの底面上に一体型鏡を製造する複雑性および経費を回避し、カートリッジの熱光学ウィンドウに、熱伝達に対するより低い抵抗および透過性光学特性を有する、より薄く柔軟なフィルムを使用することを可能にする。鏡面は、随意で、熱伝達および蛍光発光捕捉の両方を向上させるように、平坦であり、磨かれている。走査対物レンズが、マイクロ流体カートリッジの上の上部光ウィンドウよりも上側に設置される。励起光は、鏡に衝打し、後方反射する前に、上部光ウィンドウおよび下部熱光学ウィンドウの両方を通して伝達される。直接および反射発光は、対物レンズによって収集され、フォトダイオード、光電池、光起電デバイス、ＣＭＯＳ、またはＣＣＤチップ等の検出センサ上で集束される。
また、従来技術の教示と全く対照的に、蛍光検出の問題は、励起光学部が共通光学経路上の放射光学部から分断されるように、光学部を構成することによって解決されることが示されている。好ましい実施形態では、試行錯誤により、バックミラーを使用するときに、我々は、反射鏡の付近または後ろに励起円錐の焦点を配置すること、および放射が優先的に検出センサに集束させられるように放射円錐を独立して位置付けることが有利であると見出した。随意に、励起円錐は、収束源ビームを対物レンズ上に指向することによって、近距離場内で再集束させることができる。驚くべきことには、分断は、感度を増加させ、検出限界を向上させ、試料中の気泡および他の不均質性の雑音または干渉を低減させる。
従来技術の教示に反して、我々は、励起および放射信号の従来の共焦点局所化が、広範囲の試料および動作条件にわたって堅調な信号を生成することにおいてあまり効果的ではないことを見出した。したがって、本発明の１つの側面では、マイクロ流体蛍光検定とともに使用するための低費用光学部の分野での技術的進歩である、試料の平面から試料の後ろの点までの励起光の焦点の変位によって、信号検出の最適化が向上させられ得ることを見出した。励起および放射光学部の分断（すなわち、励起光および放射信号のための異なる焦点）は、共焦点顕微鏡法、落射蛍光検出、およびマイクロ流体蛍光検定における従来の実践の基礎を形成する原理（最初に米国特許第３０１３４６７号でＭｉｎｓｋｙによって取り入れられた）に専念した何十年もの従来技術に対抗する。従来技術の教示は、非球面レンズ、レーザダイオード、および励起光学部との検出光学部の精密な同焦点整合の使用につながっている。対照的に、本明細書で説明されるような励起円錐の非局在化焦点に必要とされる光学部は、偶然にも、非常に低費用であり、低費用の携帯用機器を製造するために望ましいような精密組立または保守を必要としない。
検出チャンバの下の加熱ブロックの頂面上の鏡面は、対物レンズの集光能力を向上させることによって、感度を増加させるために使用される。対物レンズが検出チャンバのより近くに配置されるにつれて、定義された開口角および開口数のレンズは、発光を収集するのにより効率的となる。バックミラーがないと、従来技術の典型的なシステムの収集効率は、２．５％未満である（例えば、５ｍｍの平凸レンズを仮定する）。バックミラーを追加することにより、これを２００％ほども、理論的には４００％ほども向上させることができる。試料チャンバの後に励起ビームを集束させることは、鏡を使用することにより励起路長を増加させることによって、感度の利得を相乗的に増大させることができる。これは、標準光学キュベットと比べて有意な低減である、カートリッジのｚ軸上の光路長が典型的にはミリメートル未満の長さである、低アスペクト比マイクロ流体カートリッジにおいて特に有利であることを、我々は見出した。幸いにも、この組み合わせが、小さな気泡等の試料チャンバ中の不規則性による干渉を低減することも分かった。
１つの実施形態では、鏡は、アルミニウムまたは銅加熱ブロック上のクロムめっきまたは研磨した金属表面であり、また、温度制御された検定のための熱または冷却を伝達するためにも使用され、したがって、設計の別の相乗効果を達成する。好ましい実施形態では、鏡は、光学的に平坦なアルミニウムブロック上の電解研磨したクロム表面であり、アルミニウムは、その優れた熱伝達特性および拡張可能な熱慣性のために選択される。ブロックは、ブロックの基部と接触している抵抗加熱要素によって加熱される。鏡面の平滑性および平坦性は、最適な熱伝達に有利に働く。本発明の本側面では、鏡面は、例えば、ＰＣＲアンプリコンのための蛍光プローブのＦＲＥＴ検出または熱融解分析に使用される、加熱要素の上面である。１つの実施形態では、鏡面加熱ブロックの光学および熱性質の複合適用は、検定流体の温度を傾斜させながら蛍光を監視することによって得られる、ＦＲＥＴ融解曲線の構築によって図示される。別の実施形態では、鏡面加熱ブロックは、カートリッジが蛍光放射について走査されている間に、マイクロ流体カードの検出チャンバ中の反応温度を調整または制御するために使用される。リアルタイムおよび温度変調蛍光検定でマイクロ流体カートリッジとともに使用するための鏡面加熱ブロックは、当技術分野での技術的進歩を実証する。
本発明の別の側面によれば、我々は、走査ヘッドの中にコンパクトに載置された下流信号処理ファームウェアの使用を通して増大させられる雑音排除をとともに、高利得多段増幅器を採用している。励起光円錐の非常に高利得の増幅および面外非局在化は、液体試料の後の鏡面からの正反射を乱す気泡の存在下でさえも、分析法の区別および感度を最適化するのに相乗的であることが分かり、幸いにも費用の増加を伴わずに実装された。
完全光路は、光源からの励起を平行にするための第１のレンズ、鏡の上に励起源を投影するため、および平行発光として試料中のフルオロフォアからの蛍光発光を収集するための第２のレンズ、検出器上で発光を集束させるための第３のレンズといった、３つのレンズを使用する。各フルオロフォアは、測定のために別個の光チャネルによって光学的に隔離される。スペクトル特異的ＬＥＤ、二色性鏡、およびバリアフィルタの組み合わせが、各光チャネル中の近単色励起光を達成するために使用される。励起および発光波長を分離するための光路に交差する二色性鏡およびフィルタを含む、レンズおよび関連光学構成要素は、検出チャンバにわたって横方向に移動するガイドレール載置走査ヘッドの中に提供される。雑音を最小化するために、ヘッドはまた、信号を増幅するための全ての電子構成要素と、アナログおよびデジタル信号処理のためのオンボード組込みマイクロプロセッサとを含む。信号平均化およびデータ収集の基準減算方法を無効にする気泡干渉の存在下でさえも、各チャネルからの分析走査データは、正確に評価され、単一ビット出力（すなわち、１または０）への変換によって報告されてもよい。これは、検出器ヘッドが１つまたは複数の検出チャンバ上で、および鏡面にわたって走査されている間の、液体試料混合物中の特定のフルオロフォアからの信号の有無に対する定性採点のための単純かつ著しく効果的な手段であることが分かっている。
走査ヘッドおよびレールは、走査中の正確な空間分解能のためにステッパモータに連結される駆動チェーンによって構成される。マイクロ流体カートリッジドッキングベイおよび光学ベンチ全体は、勾配角度で器具筐体の中に載置され、それは、気泡混入を減少させ、マイクロ流体カートリッジ上の搭載、ウェットアウト、および混合動作中に通気を向上させるのに有利であることが分かっている。好ましい実施形態では、光学ベンチ全体は、気泡がマイクロ流体回路から変位されるように、約１５度の角度で載置され、浮動光学ベンチおよびドッキングベイ用の完全懸垂架台、およびバネ付勢された締付け機構を必要として、カートリッジが器具に搭載される時に、光学ベンチアセンブリの底面上のドッキングベイの中に載置されたオンボード発熱体と、挿入可能なカートリッジとの間の熱伝導性インターフェースの能動形成を確保する。角度付きカートリッジとガスケット付き空気圧インターフェースポートとの間の密閉インターフェースも、ドッキング中に確立されなければならない。
検出器ヘッドは、検出チャンバにわたって走査されてもよく、または逆に、マイクロ流体カートリッジは、検出器にわたって走査されてもよい。ここで実装されるように、検出器は、２つの対を成すガイドレール上のステッパモータの制御下にある、ウオームギアまたはラックおよびピニオン駆動台座を伴って搭載される。試料は、データ収集をモータ制御と同期させることによって、要求に応じて走査されてもよく、これは、検出器ヘッドの中の組込みマイクロプロセッサと連通しているオンボードまたは外部ホストコントローラを使用して行われてもよい。意外にも、オンザフライで測定値をサンプリングし、フィルタにかけ、平均化するための直線運動台上に搭載された一体型コプロセッサを有する、そのような検出器ヘッドは、多くの潜在的干渉にもかかわらず、分析法結果を認証し、報告するシステムの能力を向上させた。
幅が１ミリメートル〜数ミリメートルであり得る、試料ウェル、検出チャンバ、検出チャネルまたは場にわたる蛍光強度の変動が生じるであろうことが期待された。これらの変動は、例えば、ウェル厚の差異から、光学ウィンドウの不完全性から、わずかな温度変動（例えば、検出されているアンプリコンのハイブリダイゼーション依存性蛍光の付随変動を引き起こし得る）から、ならびに脱ガスおよび混合から生じ得る気泡または発泡体から、混合の不均質性の結果として生じる。これらの変動は、検出チャンバを横断するサンプリング横断にわたって信号デジタル化によって最小限化できることが見出された。以下でさらに説明されるように、正および負の試験結果を判別するために、閾値が使用され得る。
さらに雑音排除を提供するために、ＡＣ線変動による干渉および他の周囲電気またはＲＦ干渉を防止することが知られている周波数で励起ビームをストローブすることによって、外部雑音が除去され、より清浄な信号変調をもたらし、器具筐体の中へ漏出する周囲光の影響を除去するようにフィルタにかけることができる変調信号をもたらす。我々は、専用コプロセッサを有する光学部のプリント回路基板を構成し、ホスト器具に接続されたデータバス上のトラフィックを効果的に最小化する、独立クロック周波数およびファームウェアを使用することによって、この結果を達成した。オンボード光学信号プロセッサは、光学部のカード上に常駐するＥＥＰＲＯＭに記憶された専用命令を有し、電磁干渉を制限するように選択された周波数で、光源ＬＥＤに送信されたパルスをセンサフォトダイオードの問い合せと同期させる。ファームウェアは、ストローブバースト間の励起光のストローブ照明バーストと背景との間の信号の違いを評価するように設計されており、周囲または外部光による背景は、この方法によって容易に差し引かれる。
結果として生じる光学モジュールは、密閉された検出器筐体の中に包装され、直列または並列で複数の試料またはフルオロフォアを同時に走査するための複数の光学チャネルを伴う一連の光学モジュールとして拡張することができる。信号処理は、検出器ヘッドに組み込まれた自律コプロセッサに送られ、そこから、ホスト機器コントローラに送られる。したがって、本発明は、単一ヘッド／単一チャネル実施形態、二重ヘッド／二重チャネル実施形態、および多重ヘッド／多重チャネル実施形態を備え、単一の試料上で、または並行して複数の試料上で、単一および多重検定を行ってもよい。
一般に、検定システムは、試料にわたって検出器ヘッドを走査するために有効にされる機械システムを備え、検出器ヘッドは、少なくとも１つの検出チャネル、より優先的には複数の検出チャネルを収納し、各検出チャネルは、対物レンズと、対物レンズによって受信される光学信号を捕捉して増幅するように構成される光電子回路要素とを備え、機械システムは、検出器ヘッドの外部のコントローラおよび回路によって操作され、光電子要素は、検出器ヘッド内に組み込まれたマイクロプロセッサと関連付けられるファームウェアに常駐する自律デーモンの制御下にある。有利なことには、全ての構成要素が近接近している遮蔽検出器ヘッド内の光学信号取得および処理の分離は、検出器ヘッドの外側のホスト機器で起こる、アナログ機能と別様に関連付けられるであろう、ごくわずかな信号雑音を伴う多段増幅のためのシステムを実現する。光電子回路要素は、ホスト機器内で任意の外部回路から電子的に絶縁して操作され、自律デーモンの制御下の信号処理および／または信号デジタル化のために構成される、光電子要素を含む。これは、当技術分野での進歩であると考えられる。
検出器は、二重ヘッドおよび多重ヘッド検出器として収納される時に十分機能することが分かり、その場合、単一の筐体中の２つ以上のチャネルが、完全独立光学部、フルオロフォア特異的フィルタ、二色性鏡、および光源ＬＥＤによって構成され、複数のフルオロフォア間のクロストークを低減した。したがって、ヘッドは、随意で、第１の回路基板上に載置される複数の光源と、第２の回路基板上に載置される複数の対物レンズおよび関連検出器とを含有し、共有信号処理能力および検出器ヘッドに埋め込まれたファームウェアを使用して、複数のフルオロフォアのそれぞれに対する信号を独立して収集する。雑音を低減するために、いずれのアナログ信号も検出器ヘッドからホスト器具に伝送されない。
このようにして、各チャネル内の励起のための光源を、個々のフルオロフォアに合致させることができる。試料に衝打する励起光の狭通過ビームを確保するように、白色光および励起フィルタを提供する必要がもはやなくなる。この簡略化は、「バイプレックス」または多重標的および対照信号の対合収集を要求とする、検定プロトコルにおいて有用であることが証明された。ＦＤＡ ＣＬＩＡ放棄要件に関して、標的および対照テンプレートの両方が増幅される場合、試験試料についての検定結果を報告または請求することができる前に、陽性対照信号が存在しなければならない。検出可能な対照信号が存在しない場合、検出される任意の標的信号は有効結果ではない。ＣＬＩＡ放棄要件を満たすために、蛍光検出器が、例えば、ＰＣＲによって増幅される標的感染性微生物の存在だけでなく、標的とともに共存し、同一のＰＣＲ反応、または例えば、機器において並行して行われるＰＣＲ反応によって増幅される、内因性ヒト対照有機体の存在も検出できる必要がある。
そのようなアプローチは、好ましくは、蛍光検出器が、共通検出チャンバ中の「バイプレックス」（「二重」）増幅反応混合物として標的および対照フルオロフォアの両方の存在を判定する能力を有することを要求する。典型的には、標的フルオロフォアの蛍光励起および放射スペクトルから選択的帯域通過フィルタによって（波長が）良好に分解されるように偏移させられる、蛍光励起および放射スペクトルを有する、陽性増幅対照フルオロフォアが使用される（例えば、図２５参照）。しかしながら、本発明によると、二重ヘッド検出器を使用することによって、および各光学チャネルを用いて１回、各検出チャンバを連続して２回走査し、最初に対照蛍光シグネチャ、次いで、試験試料蛍光シグネチャを検出することによって、優れた分解能を達成することが可能であり、各走査通過は、上記で説明されるように別個の励起および放射光学部を利用することが証明された。
完全に分離された独立光路を伴ってこれらの検出器を構成することによって、有益性が見出された。本発明のこの側面では、二重ヘッド設計の使用は、試料中の増幅対照フルオロフォアの存在が、「クロストーク」により標的チャネル中で信号を不注意に生成しないことを確実にする。そのような状況は、「誤検出」として分類される試料をもたらす。逆に、複数の信号が共通光路を共有する時に起こり得る、標的チャネルから対照チャネルへのクロストークがないことも重要である。そのような状況は、不注意に存在すると見なされる正の増幅対照をもたらし得て、このような場合が当てはまらない時は、許容し難い結果である、無効な分析法の報告につながる。
これらの原理は、標的のための分子プローブとしてのフルオレセインまたは同等フルオロフォア、および対照のための分子プローブとしてのテキサスレッドまたは同等フルオロフォアの使用によって例示される。それぞれ別個の励起および検出光学部を伴う、一方の検出チャネルがフルオレセインの検出のために最適化され、他方の検出チャネルがテキサスレッドのために最適化される、二重ヘッド検出器は、驚くほど敏感で正確かつ堅調であることが分かった。検出器ヘッドは、順に、試料を覆って各光学チャネルを位置付けるように移動させられ、別個の蛍光読取が行われた。驚くべきことに、これは、分解能を向上させ、クロストークを最小限化したが、ヘッドを移動させる力学による、より高い雑音または感度の損失に寄与しなかった。励起が白色光を用いて行われないが、代わりに、個別フルオロフォアに特有の波長で行われるため、第２のフルオロフォアの消光は問題ではない。
本発明の別の側面では、我々は、複数の試料ウェルを横断するマルチヘッド検出器の連続横断によって複数のマイクロ流体チャネルを走査することができ、各ヘッドは、単一のフルオロフォアの励起および放射のための独立光学部を伴って構成されることを見出した。励起および検出光学部は、各光学チャネルのために分離されるが、信号処理は、検出器ヘッド内で共有される回路で行われる。検出器ヘッドが、外部コントローラの制御下で走査を行う一方で、検出器ヘッド内のデーモンは、走査中に遭遇する試料ウェルのマップを自律的に構築し、マップは、少なくとも１つの基準点に対する場所の関数として、信号強度を表すデータペアを有する。ある場合において、基準点は、検出器ヘッドによって取られる、画定された走査経路上の空間座標であり、基準点は、該カートリッジ本体の位置合わせ特徴と関連付けられ、例えば、機械、電気、または光学スイッチをトリガする特徴と関連付けられてもよい。試料ウェルは、ウェルの壁または縁、あるいはウェル縁を識別する他の基準と関連付けられる、光学信号強度の変化によって検出される。場合によっては、基準点は、第１のウェルの第１の縁と見なされ、マップは、液体が導入されたときに、試料と関連付けられる任意の光学信号から各マップ点の背景走査を差し引くことができるように、ウェルのそれぞれの第１の縁から第２の縁までの幅についての情報を含む。
したがって、さらに別の実施形態では、本発明は、共通または並列検出チャンバ中に共存する標的および核酸増幅対照の両方の存在に向けられた高度な特異性を有する、診療点分子診断検定のための堅調なマルチヘッド独立チャネル蛍光検出システムを提供する。よりクリーンな信号は、信号対雑音比の対応する減少を伴わずに、より高い利得の電子増幅を可能にする。本発明での第１の実施形態は、例えば、単一の検出チャンバ中で混合させられる標的および対照を検出するように、２つより多くのチャネルを有し、かつ複数の標的の検出のための複数の検定チャネルを有する、蛍光検出システムを実現する。随意に、ヘッドは、円筒のように、並んで、アレイの中で、または半径方向に位置付けられてもよい。
独立光路の使用は、レンズ、二色性ビームスプリッタ、および関連フィルタ要素の組立における精度の低減した必要性を偶発的にもたらし、装置の製造可能性を向上させた。本発明の実施形態は、安価な非精密光学部、プラスチックレンズ、試料ウィンドウの後の加熱ブロック上の鏡、可動台要素、ストローブした励起および発光、雑音抑制、可動検出域上のオンボード連続信号処理、ならびに対を成す標的および対照フルオロフォアの使用によるバイプレックス分析法検証のための１つより多くの光チャネルを組み込む。その高い増幅利得にかかわらず、器具は、電気雑音および検出チャンバ中の気泡等の干渉に対して有利に抵抗性があることが証明されている。
図１は、本発明の器具およびドッキングベイの中のマイクロ流体カートリッジの斜視図である。 図２は、ドッキングベイの中のマイクロ流体カートリッジの挿入を示す、動画図である。
図３は、装置の機能ユニット、ソフトウェア、およびファームウェアの概観を提供する、ブロック図である。
図４Ａは、ドッキングベイ、光学ベンチ、およびマイクロ流体カートリッジをヒータモジュールと熱的に接触させ、マイクロ流体カートリッジを走査するための締め付け機構を伴う、浮動ステージの簡略化表現である。
図４Ｂは、浮動ステージ、ドッキングベイ、光学ベンチ、およびマイクロ流体カートリッジが、接地板に対する画定された角度「シータ」で機器シャーシの中に載置され、接地板が水平であることを概念的に明示する。
図５Ａおよび５Ｂは、ドッキングベイ、光学ベンチ、および走査検出器ヘッドを伴う懸垂載置ステージを示す、上方および下方からの正面および後面内部斜視図である。
図６Ａは、下面ヒータモジュールおよび冷却ファンを示す、ドッキングベイの下方からの正面内部斜視図である。
図６Ｂは、加熱ブロック要素および鏡面を伴うヒータモジュールの詳細である。
図７Ａおよび７Ｂは、ドッキングベイ内の定位置に挿入可能カートリッジを伴う浮動ステージの斜視図である。明確にするために、ドッキングサドルおよび付属載置要素は除去されている。
図８は、ドッキングサドルの下面から懸垂されたドッキングベイおよび浮動ステージの詳細図である。浮動ステージは、４点ばね懸垂を装着される。
図９Ａおよび９Ｂは、締め付け機構の前サブアセンブリ図である。図９Ｂは、締め付け歯車ラック上のウォーム駆動動作を図示する。
図１０Ａおよび１０Ｂは、締め付け機構の後サブアセンブリ図である。図１０Ｂは、締め付け歯車ラックおよびプラテンアーム上のウォーム駆動動作を図示する。
図１１Ａおよび１１Ｂは、本発明の検出システムとともに使用するための挿入可能マイクロアッセイカートリッジの斜視図である。
図１２は、マイクロアッセイカートリッジの内部構成要素を示す分解図である。
図１３Ａおよび１３Ｂは、本発明の検出システムとともに使用するための挿入可能マイクロアッセイカートリッジの平面および立面図である。
図１４Ａは、内部空気圧マニホールド、空気圧インターフェースマルチポート、およびヒータモジュールを伴う載置プレートを単離し、図１４Ｂは、使用されているときのマイクロアッセイカートリッジによって占有される位置を描写する。
図１５は、中心空気圧入口ポートアレイを伴うマイクロアッセイカートリッジ突出部の分解図である。
図１６は、空気圧インターフェースマルチポートを通した断面図の位置を示す、マイクロアッセイカートリッジを伴う載置プレートの平面図である。
図１７は、空気圧インターフェースマルチポートを通した断面図である。
図１８は、カートリッジおよびヒータモジュールを通した断面図の位置を示す、マイクロアッセイカートリッジを伴う載置プレートの平面図である。
図１９は、加熱マニホールドおよびマイクロアッセイカートリッジを通した断面図である。
図２０は、分解図でヒータモジュールアセンブリを示す。
図２１は、ドッキングベイ内のカートリッジに及ぼされたばね力の概略図である。
図２２は、カートリッジおよびヒータモジュールの突出部に指向されたファン出口を伴うケース載置送風機を示す、装置の部分アセンブリである。
図２３は、二重光学チャネル、ならびに励起および放射検出のための電子的に絶縁された回路基板を伴う、検出器ヘッドの斜視図である。筐体の一方の半分は、内部構成要素を視認するために除去されている。
二重光学チャネル、加熱ブロック載置鏡、およびマイクロ流体カートリッジを伴う蛍光検出器の内部光学構成要素の概略図である。雑音干渉を低減するように、励起光学部は、１つの回路基板上に載置され、検出光学部は、別の回路基板上に載置される。
図２５Ａおよび２５Ｂは、液体試料中の２つのフルオロフォアの放射および励起波長を示し、クロストークの除去のための二重ヘッド光学単離を図示する。
図２６Ａ−２６Ｄは、対照および標的信号を用いた検定条件下の検出器ヘッドの増幅器からの電子トレースの図である。 図２６Ａ−２６Ｄは、対照および標的信号を用いた検定条件下の検出器ヘッドの増幅器からの電子トレースの図である。 図２６Ａ−２６Ｄは、対照および標的信号を用いた検定条件下の検出器ヘッドの増幅器からの電子トレースの図である。 図２６Ａ−２６Ｄは、対照および標的信号を用いた検定条件下の検出器ヘッドの増幅器からの電子トレースの図である。
図２７は、蛍光励起を制御し、蛍光放射信号を受信し、処理し、ホスト機器にデジタルで伝達するために使用される、検出器ヘッド電子機器のブロック図である。
図２８Ａおよび２８Ｂは、気泡干渉のデジタル除去を示す、未加工入力およびデジタル化出力の表現である。
図２９Ａは、カートリッジ検出チャンバおよび鏡面加熱ブロックに対する励起円錐および平凸対物レンズの表現である。
図２９Ｂは、カートリッジ検出チャンバおよび鏡面加熱ブロックに対する短い作業距離で平凸対物レンズを用いた放射収集の表現である。一次および反射蛍光放射が示されている。
図３０は、Ｌ１’＜Ｌ１であり、ソースビームが発散している、分断した励起および放射光学部を伴う光学経路の概略図である。
図３１は、Ｌ１’＞Ｌ１であり、ソースビームが収束している、分断した励起および放射光学部を伴う光学経路の概略図である。
図３２Ａは、鏡の上方の対物レンズの高度を変動させることによって信号出力の増進を実証する、実験結果を描写する。図３２Ｂは、バックミラーを伴う、および伴わない、統合出力信号強度をグラフに描く。出力信号は、図２９Ａに示されるように鏡の後ろの焦点で励起ビームを集束させること、および図２９Ｂに示されるようにより短い作業距離で放射を収集することによって最適化されることが分かった。
図３３Ａは、温度の関数としてアンプリコンに交雑される分子ビーコンに起因する蛍光を示す、陽性検定結果および対照のネスト化した熱融解曲線データを明示する。図３３Ｂおよび３３Ｃは、Ｔｍを示す一次導関数を計算する、熱融解プロファイルを分析する。 図３３Ａは、温度の関数としてアンプリコンに交雑される分子ビーコンに起因する蛍光を示す、陽性検定結果および対照のネスト化した熱融解曲線データを明示する。図３３Ｂおよび３３Ｃは、Ｔｍを示す一次導関数を計算する、熱融解プロファイルを分析する。 図３３Ａは、温度の関数としてアンプリコンに交雑される分子ビーコンに起因する蛍光を示す、陽性検定結果および対照のネスト化した熱融解曲線データを明示する。図３３Ｂおよび３３Ｃは、Ｔｍを示す一次導関数を計算する、熱融解プロファイルを分析する。
以下の発明を実施するための形態は、例示の目的で具体的な詳細を含有するが、当業者であれば、以下の詳細に対する多くの変化例および改変例が、請求された発名の範囲内であることを理解するであろう。以下の定義は、請求されるような本発明を説明する際の補助として記載される。
定義
「デーモン」とは、本明細書では、対話ユーザの直接制御下で、またはホストコントローラによって実行されるよりもむしろ、自律背景プロセスとして組み込みマイクロプロセッサによって実行される、ファームウェアに記憶される光学データ取得および処理（ＯＤＡＰ）のためのプログラム可能命令セットを指す。デーモンは、雑音から電子的に絶縁され、検出器ヘッドの中で局所化される、電子回路を操作して制御する、仮想マシンと見なすことができる。検出光学部と関連付けられる複数の増幅器からの調節された出力は、３段増幅器において調節および増幅され、３つの増幅器出力のうちの１つは、位置データを用いた信号処理および表形式化が後に続く、デジタル化のために選択される。次いで、デーモンは、光学データを背景走査と比較し、ユーザに表示するためにデータをホストシステムに報告する前に、蛍光が陽性検定結果であるかどうかに関する複雑な判定を行う。動作中、ホストシステムは、温度および空気圧制御、検出器ヘッド走査、ユーザインターフェース操作性、および故障監視等の種々の検定機能を果たすようにマルチタスクを行い、放射信号取得および処理に関係付けられるタスクは、本明細書では「ＯＤＡＰデーモン」と称されるデーモンに委託される。
「開口角」は、対物レンズに進入し、画像形成に関与することができる、単一の点からの最も多くの発散光線の間の角度である。
「背面焦点距離」は、レンズの背面から集束光の円錐の焦点までの距離Ｌとして、レンズに入射する平行光の入射ビームを用いてレンズについて定義される。「背面焦点位置」は、非平行光線が、レンズの天然焦点距離から光学部を分断することによって、レンズの背面からの代替的な距離で集束され得ることを示す。
標的被分析物：または「関心の被分析物」、あるいは「標的分子」は、核酸、タンパク質、抗原、抗体、炭水化物、細胞成分、脂質、受容体リガンド、薬物等の小分子等を含んでもよい。標的核酸は、遺伝子、遺伝子の一部、遺伝子の調節配列、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｃＤＮＡを含み、一本鎖、二本鎖、または三本鎖であってもよい。いくつかの核酸標的は、多型、欠失、および代替スプライス配列を有する。複数の標的ドメインは、単一分子中に存在してもよく、例えば、免疫原は、複数の抗原決定基を含んでもよい。抗体は、可変領域、定常領域、および抗体を固定化するのに有用であるＦｃ領域を含む。標的被分析物は、概して、製造される際にカートリッジが提供されないが、分析される液体試料の中に含有され、対照的に、「対照被分析物」は、典型的には、カートリッジが提供され、分析法の適正な性能を確保するために分析される。当技術分野で周知であるように、標的分析法を含有するスパイク試料が、ある品質管理検査で、および較正に使用されてもよい。
増幅するための手段： 既得権技法は、米国特許第４，６８３，１９５号、第４，６８３，２０２号、および第４，８００，１５９号、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍｄ．（１９８９）、およびＩｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ．，（“ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ”，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ Ｃａｌｉｆ．，１９９０）で詳細に説明されている。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲと呼ばれる）であった。ポリメラーゼ連鎖反応の方法論は、熱循環を必要とし、当技術分野で周知である。簡潔に言えば、ＰＣＲにおいて、標的配列の逆相補鎖上の領域に相補的である２個のプライマー配列が調製される。過剰なデオキシヌクレオシド三リン酸が、ＤＮＡポリメラーゼ、例えば、Ｔａｑポリメラーゼと共に反応混合物に添加される。標的配列が試料中に存在する場合、プライマーは標的に結合し、ポリメラーゼは、ヌクレオチドを添加することによって、マーカー配列に沿ってプライマーを伸張させる。反応混合物の温度を上昇および低下させることによって、伸張プライマーは、テンプレートから解離し反応生成物を形成し、過剰なプライマーは、テンプレートおよび反応生成物に結合し、過程が繰り返される。蛍光挿入剤を添加することによって、ＰＣＲ生成物をリアルタイムで検出することができる。
他の増幅プロトコルは、ＬＡＭＰ（ＤＮＡのループ媒介等温増幅）逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（「ＬＣＲ」）、核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ）を含む転写に基づく増幅システム（ＴＡＳ）、「ローリングサークル」、「ＲＡＣＥ」、および「非対称ＰＣＲ」とも称される「片側ＰＣＲ」を含み、検出可能なプローブに相補的である鎖が過度に合成されるという利点を有して使用されてもよい。
これらの種々の非ＰＣＲ増幅プロトコルは、診断分析法において種々の利点を有するが、ＰＣＲは、分子生物学研究所および臨床診断において依然主力のままである。マイクロ流体ＰＣＲに関して本明細書に開示される実施形態は、１つまたは種々の増幅プロトコルを実行することができるマイクロ流体デバイスの一般的な種類の代表および例示とみなされるべきである。
典型的には、核酸増幅または拡張は、増幅反応を行うために、異なる配列を有することができる１つ以上の標的核酸を、反応構成要素を含有する「マスター混合」と混合し、この反応混合物に、標的核酸の増幅を可能にする温度条件を受けさせることを有する。マスター混合中の反応構成要素は、反応混合物のｐＨを調節する緩衝剤と、核酸の合成に必要なエネルギーおよびヌクレオチドを提供する、天然ヌクレオチド（しばしば等濃度で存在する、Ａ、Ｃ、Ｇ、およびＴまたはＵに対応する）のうちの１つ以上、核酸合成の開始を促進するためにテンプレートに結合するプライマーまたはプライマーペア、合成されている相補核酸鎖にヌクレオチドを添加するポリメラーゼとを含むことができる。しかしながら、増幅のための手段はまた、核酸標的の検出の補助として、Ｐｒｕｄｅｎｔの第ＵＳ ７５１４２１２号ならびにＭａｒｓｈａｌｌの第ＵＳ ７５１７６５１号および第７５４１１４７号で説明されているような、修飾または「非標準」あるいは「非天然」塩基の使用も含む。
本明細書で使用されるような「検出のための手段」とは、終点、すなわち、検定の結果を表示するための装置を指し、分光光度計、蛍光光度計、照度計、光電子増倍管、フォトダイオード、比濁計、光子カウンタ、電圧計、電流計、ｐＨ計、容量センサ、高周波伝送機、磁気抵抗計、またはホール効果デバイスを装備した機器を含んでもよい。カバープレート、光学フィルタ、着色流体、および標識プローブにおける拡大レンズが、検定結果の検出および解釈を向上させるために使用されてもよい。「標識」または「タグ」は、発色団およびフルオロフォア等の染料、および当技術分野で公知であるような化学発光を含むが、それらに限定されない。磁気ビーズ上で装飾される、ＺｎＳでコーティングされたＣｄＳｅ等のＱＤｏｔ、またはＱＤｏｔおよび常磁性Ｆｅ３Ｏ４微粒子の融合が、本発明の検定の感度を向上させる便利な方法である。蛍光消光検出終点も予想される。酵素結合免疫測定法と関連付けられる、種々の基板および生成物発色団も当技術分野で周知であり、検定の感度を向上させるように検出信号を増幅する、例えば、フルオロフォアを「上方調節」するための手段を提供する。蛍光および光学検出器は、フォトダイオード、光起電デバイス、フォトトランジスタ、アバランシェフォトダイオード、フォトレジスタ、ＣＭＯＳ、ＣＣＤ、ＣＩＤ（電荷注入デバイス）、光電子増倍管、および逆バイアスＬＥＤを含み得る。検出システムは、随意に、定性的、定量的、または半定量的である。
「分子ビーコン」は、溶液中の特定の核酸の存在を報告するように設計される、一本鎖ヘアピン形状オリゴヌクレオチドプローブである。分子ビーコンは、４つの構成要素、すなわち、幹部、ヘアピンループ、端部標識フルオロフォア、および反対端標識消光剤から成る。ヘアピン様ビーコンが標的に結合されないとき、フルオロフォアおよび消光剤は、ともに近くに位置し、蛍光は、抑制される。相補的標的ヌクレオチド配列の存在下で、ビーコンの幹部は、標的に交雑するように開放する。これは、フルオロフォアおよび消光剤を分離し、フルオロフォアが蛍光を発することを可能にする。代替として、分子ビーコンはまた、端部標識ドナーに近接して放射するフルオロフォアも含む。「波長偏移分子ビーコン」は、フルオロフォアがより強く放射することを可能にする、付加的なハーベスタフルオロフォアを組み込む。分子ビーコンの現在の批評は、Ｗａｎｇ Ｋ ｅｔ ａｌ， ２００９， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ ＤＮＡ：ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｅａｃｏｎｓ． Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ Ｉｎｔ Ｅｄ Ｅｎｇｌ， ４８（５）：８５６−８７０、Ｃｉｓｓｅｌｌ ＫＡ ｅｔ ａｌ， ２００９， Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｅｎｅｒｇｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ ＲＮＡ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ， Ａｎａｌ Ｂｉｏａｎａｌ Ｃｈｅｍ ３９３（１）：１２５−３５、およびＬｉ Ｙ， ｅｔ ａｌ， ２００８， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｅａｃｏｎｓ： ａｎ ｏｐｔｉｍａｌ ｍｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｐｒｏｂｅ， Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍ ３７３（４）：４５７−６１を含む。近年の進歩は、Ｃａｄｙ ＮＣ， ２００９， Ｑｕａｎｔｕｍ ｄｏｔ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｅａｃｏｎｓ ｆｏｒ ＤＮＡ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ． Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ５５４：３６７−７９を含む。
蛍光核酸分析法は、タグ付きプライマーを用いた増幅と、プローブベースの検出化学反応とを含む。蛍光生成物は、分析法の終了時に、またはリアルタイムで増幅生成物の量を測定することによって、分析することができる。限定的ではないが、とりわけ、３’消光剤構築物を有する５’レポーター染料の変位およびポリメラーゼ媒介加水分解に依存するＴａｑＭａｎプローブ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、ＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブ、二重オリゴＦＲＥＴベースのプローブ（Ｒｏｃｈｅ）、副溝結合剤共役ハイブリダイゼーションプローブ（ＭＧＢプローブ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、Ｅｃｌｉｐｓｅプローブ、Ｌｏｃｋｅｄ ＮＡプローブ（Ｅｘｉｑｏｎ／Ｒｏｃｈｅ）、アンプリフルア（Ａｍｐｌｉｆｌｕｏｒ）プライマー化学反応、スコーピオン（Ｓｃｏｒｐｉｏｎｓ）プライマー化学反応、ＬＵＸプライマー、Ｑｚｙｍｅプライマー、ＲＴ−ＰＣＲが、全て本発明で好適である。インターカレーション染料も使用されてもよい。逆転写は、ＲＮＡ標的を分析するために使用され、ｃＤＮＡを形成するために別個のステップを必要とする。近年の進歩は、Ｋｒａｓｎｏｐｅｒｏｖ ＬＮ ｅｔ ａｌ．２０１０．Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｂｅｓ ｆｏｒ ｕｌｔｒａｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ Ｃｈｅｍ ２０１０ Ｊａｎ １９ ｅｐｕｂを含む。
化学染料に加えて、プローブは、緑色蛍光タンパク質、量子ドット、およびナノドットを含み、その全ては蛍光性である。核酸および抗体等の分子、分析法標的に対する親和性を有する他の分子は、本発明の蛍光分析で有用なプローブを形成するようにフルオロフォアでタグ付けされてもよい。
「ＦＲＥＴ」（蛍光共鳴エネルギー移動）は、分子相互作用の調査を可能にする蛍光技法である。これは、交雑されるとき等の２つの分子が近接近しているときに、１つのフルオロフォアから別のフルオロフォア（すなわち、ドナーおよび消光剤）へのエネルギーの移動に依存する。近年の進歩は、Ｃａｒｍｏｎａ ＡＫら［２００９， Ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｅｎｅｒｇｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ （ＦＲＥＴ） ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｆｏｒ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ ｃｌｉｎｉｃａｌｌｙ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ ｅｎｚｙｍｅｓ， Ａｎ Ａｃａｄ Ｂｒａｓ Ｃｉｅｎｃ ８１（３）：３８１−９２］を含む。
文脈上他の意味に解するべき場合を除き、本明細書および後に続く特許請求の全体を通して、「備える（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という用語、ならびに「備える（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「〜を備える（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」等のその変化形は、広く包括的な意味で、すなわち、「〜を含むがそれに限定されない」と解釈されるものとする。本明細書の全体を通した「１つの実施形態」、「実施形態」、「１つの側面」、または「側面」への言及は、実施形態または側面との関連で説明される特定の特徴、構造、または特性が、１つの実施形態に含まれてもよいが、必ずしも本発明の全ての実施形態に含まれるわけではないことを意味する。さらに、ここで開示される本発明の特徴、構造、または特性は、１つ以上の実施形態において任意の好適な方式で組み合わせられてもよい。「従来の」は、本発明が関連する先行技術分野において既知であるものを指定する用語である。「約」および「概して」は、不正確さの広い表現であり、変化がわずか、明らか、または同等の有用性および機能である場合、「ほぼ」の意味での「おおよそ」、「およそ」、または「ほとんど」である状態を表し、基準、規定、制限に対する明らかに小規模な例外の存在をさらに示す。
「クロストーク」は、蛍光撮像において、試料ウェル中の２つ以上のフルオロフォア（および／または基板の自己蛍光）の励起および／または放射スペクトルが重複するときに起こり、１つのフルオロフォアのみの活動を単離することを困難にする。
ここで図を参照すると、図１は、ドッキングベイの中のマイクロ流体カートリッジ２００を伴う機器１００の斜視図である。膜パネル１０４、およびタッチスクリーンディスプレイ表面１０８、および小型シャーシまたは筐体１０６が示されている。全ての試薬がマイクロ流体カートリッジの中で提供されるため、機器は、完全な独立型操作性を有する。図２は、ドッキングベイ１０３の中へのマイクロ流体カートリッジの前突出部１０５の挿入を動画にすることによって、この外部図を補完する。ドッキングベイは、懸垂載置され、以下でさらに詳細に議論されるように、機器基部に対する角度で傾転されてもよい。
図３は、検定装置の機能ユニット、ソフトウェア、およびファームウェアの概観を提供する、ブロック図である。機械、空気液圧、温度制御、光学、および入力／出力（Ｉ／Ｏ）システムは、２つのデジタルプロセッサによって協調させられ、第１のプロセッサは、ユーザコマンドを受信して検定結果を出力し、また、検定の機械、熱、および空気液圧プロセスステップを指図する、「ホストコントローラ」と称され、第２のプロセッサは、検出器ヘッド内の信号取得および処理を含む、光学システムを経由した局所化制御を及ぼし、デジタルデータをホストコントローラに伝達する、「組み込みマイクロプロセッサ」と称される。組み込みプロセッサによって制御される光学システムは、装置筐体内の雑音が多いアナログ回路から検出器ヘッド内で保護され、比較的雑音がない環境で高利得増幅を可能にする。各プロセッサは、別個のクロック、揮発性および不揮発性メモリを提供され、他方から自律して機能する。
概説すると、機器内の浮動ステージ（１０００、点線）は、マイクロ流体カートリッジを受け取って可逆的に締め付けるためのドッキングベイ（ここでは１００１）を支持し、走査検出器ヘッド３１１を提供される。検出器ヘッドは、ホストコントローラの制御下でマイクロ流体カートリッジの光学ウィンドウにわたって走査される。検出器ヘッドは、励起光を提供するためのサブアセンブリと、組み込みマイクロプロセッサ１８４１と関連付けられるファームウェアに常駐するデーモンの制御下で蛍光放射信号を検出、増幅、および処理するためのセンサとを含有する。浮動ステージは、静止ベースプレートおよび機器スタンドに載置されたばね懸垂上に乗る。
ホストコントローラ１００３の制御下で別々に制御可能な加熱ブロックを伴うヒータモジュール、空気圧分配マニホールドとしての機能も果たす、ベースプレート３３０上に載置された空気圧サーボに接続される空気圧インターフェース、ステッパモータおよびホストコントローラを接続するワイヤハーネス、ならびにクランプおよびマイクロ流体カートリッジの位置を測定するための圧力スイッチ、バーコード読取機、および温度モニタを含む、クランプモータおよび関連センサのための配線ハーネスが、静止ベースプレートに添着され、浮動ステージと界面接触するために位置付けられている。電力は、機器スタンド内に載置された再充電可能バッテリから、ＡＣ変換器または自動車等のＤＣ電源への直接接続によって、全てのシステムへ分配される。
ホストコントローラ１００３は、機器の操作のためのタッチパッドパネル、およびＬＣＤ表示パネルも含有する、マザーボード上に載置される。機器は、無線ネットワーキングカードまたは他の遠隔通信デバイスを含む、種々のデジタルシリアル入出力リンクを介して、データを外部ネットワークまたはデバイスに伝送してもよい。特殊デジタル接合点が、ソリッドステートＲＯＭで符号化されるソフトウェアである、ＲＡＭレジスタおよびプログラミングへのサービスアクセスのために提供される。
液体試料から特定の疾患または病理を診断する能力を有する、特定のマイクロアッセイカードを操作するために必要とされる、空気圧パルス列および弁論理等の機器の操作のための一般命令が、検定を実行するための揮発性および不揮発性メモリを供給されるホストコントローラと関連付けられる、プログラム可能ソフトウェアによって提供される。例えば、バーコード読取機が特定のマイクロアッセイカートリッジを検出する場合、本デバイスは、そのバーコードから認識される特定の検定を行うように、および結果を解釈して指定された形式で表示するようにプログラムされる。
しかしながら、光源強度の変調、信号増幅、およびフィルタリングを含む、信号取得光学部の動作は、検出器ヘッド３１１内のセンサＰＣＢ上の組み込みマイクロプロセッサ１８４１に常駐するデーモンの制御下にある。したがって、雑音に高度に敏感である電気信号は、ホスト機器のより雑音が多い環境から検出器ヘッド内で保護され、検出器ヘッドからホストＡ／Ｄ変換器へのアナログ信号の伝送は、完全に回避される。この非従来的な機能の分離は、幸いにも、完全な携帯性および現場操作に必要とされるように、機器の雑音感受性を低減させることにおいて高度に有利であることが証明されており、予想外に、雑音が多い電子環境であることが期待されるであろうものにおいて、高利得３段増幅器の使用を可能にする。
機械システム
内蔵光学ベンチおよびドッキングベイを伴う浮動ステージは、機器の独特の特徴である。この特徴は、図４で概念的に紹介される。図４Ａは、機器の一次光熱機械サブシステムの概念的表現である。浮動ステージ３００は、４点ばね載置懸垂（３０２、３０３によって示される）によって傾斜面上で懸垂され、マイクロ流体カートリッジ２００を受け取るためのドッキングベイ１０３を支持する、トレイ様シャーシ３０１（鎖線のボックス）から成る。また、浮動ステージ３００上には、対合ガイドレール（３０８、３０９）上に載置された走査検出器ヘッド３１１が支持される。カートリッジは、機器１００の一部ではないが、浮動ドッキングベイ１０３の中へ挿入した後に機器と界面接触する。
動作中に、浮動ステージは、載置プレート（３３０）に対して締め付けられ（３２０によって示される）、ヒータモジュール３４０のゾーン加熱ブロック（３４１、３４２、３４３、３４４）ならびに関連抵抗加熱要素および回路の接触表面に係合する。ファン３４５が、冷却中に過剰な熱を放散するように提供される。傾斜載置プレートはまた、マイクロ流体カートリッジの基部に密閉してドッキングするための空気圧インターフェースポート３５０も提供される。空気圧は、空気圧インターフェースポートを通して、傾斜載置プレート３３０に組み込まれる一体空気圧分配「マニホールド」またはシステムからカートリッジに送達される。空気圧マニホールドは、傾斜載置プレート上に載置される圧力源から陰圧および陽圧を供給する。マザーボード載置型プログラム可能ホストコントローラは、ベースプレート３３０および空気圧インターフェースポート３５０内の内部マニホールドを介して、空気圧駆動圧力、真空、および制御パルスをカートリッジ上のポンプおよび弁に指向する。
検出器ヘッド３１１は、電動式であり、カートリッジの走査は、ホストコントローラの制御下で行われる。対合ガイドレール（３０８、３０９）に沿って検出器ヘッドを走査するために、ホストコントローラは、ステッパモータ３０７によって駆動されるウォーム歯車に係合する。検出器ヘッドは、マイクロ流体カートリッジの前突出部内の光学ウィンドウを走査し、未加工光学信号を収集する対物レンズ３１５を伴う外部ウィンドウを装着される。検出器ヘッド３１１は、光学信号取得のためにホストコントローラから独立して機能する常駐デーモンとともに、独自の組み込みマイクロプロセッサ１８４１を有する。ホストコントローラはまた、ヒータモジュール３４０の加熱要素（３４１、３４２、３４３、３４４）において温度を調節し、空気圧インターフェースに連結された一式のソレノイド弁ならびに陽圧および真空ポンプ貯留部を制御する。機器は、ユーザ相互作用のための表示パネルおよびタッチパネルを供給される。電力入力は融通性があり、随意に、ＡＣアダプタ、自動車アダプタによって、または機器の下に載置された再充電可能バッテリから供給される。また、随意的な無線入出力およびデジタル入出力ポートも含まれる。
図４Ｂは、浮動ステージ３０１、ドッキングベイ１０３、検出器ヘッド３１１、およびマイクロ流体カートリッジ２００が、接地板に対する画定された角度で機器シャーシ１０６の中に載置され得ることを概念的に明示する。接地板からの角度でカートリッジを傾転させることにより、流体装填中の通気を向上させ、湿潤および混合動作中の空気同伴を最小限化する。熱伝達および検定結果の光学調査に干渉する、気泡の蓄積は、これと本明細書で開示される他の革新とによって回避される。傾斜載置プレート３３０は、浮動ステージ３０１、カートリッジ２００、ならびに締め付け８００および光学走査３１０サブアセンブリの機械的構成要素の角度を確立する。我々は、気泡の蓄積が核酸増幅に干渉し、ステージの角度マウントによって制限されたことを見出した。この角度「シータ」は、接地板から１０〜４５度、より好ましくは１０〜２０度の範囲内、最も好ましくは約１５度で有利であることが分かっている。
図４Ｂに示されるように、検出器ヘッド３１１は、噛合する半分のシェル（３１２、３１３）を伴うクラムシェル筐体を含む。検出器ヘッドは、外側ガイドレール３０８および３０９上で摺動し、ウォーム駆動を伴うステッパモータ３０７のホスト制御下にある。浮動ステージシャーシ３０１は、４点懸垂でばねによって載置され、締め付けられるまで傾斜載置プレート３３０への直接接続を有さない。締め付け機構は、矢印３２０によってここで比喩的に示され、以下でより詳細に議論されるであろう。
２つの走査ガイドレール３０８のうちの１つは、この図で容易に可視的であり、浮動ステージシャーシまたはトレイ３０１によっていずれか一方の端部で支持される。ドッキングベイは、鎖線のボックス（１０３）によって示され、示されるように左右に（両方向矢印）走査することを可能にさせられる、検出器ヘッド３１１の下のマイクロ流体カートリッジの突出部の挿入のための開口部を印付ける。ここではドッキングベイの下の隆起プラットフォームとして示される、空気圧インターフェースポート３５０は、ドッキングベイの直下で、かつそれに沿って位置する、ヒータモジュール３４０および加熱ブロック３４１−３４４の視認を遮断する。電力調節、ＡＣアダプタ、およびバッテリ貯蔵機能は、平面上に静置するように設計されている、機器スタンド３２９の下面の上方の傾斜載置プレート３３０の下に載置される。
図５Ａおよび５Ｂは、光学ベンチおよび検出器ヘッド３１１、ならびにマイクロ流体カートリッジ２００によって占有されたドッキングベイを伴う、浮動シャーシ３０１とともに懸垂載置ステージを示す、上方からの正面および後面内部ＣＡＤ図である。浮動ステージは、傾斜載置プレート３３０に堅くボルト留めされる、サドル形状支持体、すなわち、ドッキングサドル４００から懸垂される。また、以下でさらに詳細に説明されるように、締め付け圧力を提供する歯車ラック４０１も示されている。図５Ｂでは、光学ベンチのガイドレール（３０８、３０９）およびステッパモータ３０７が、容易に認識される。傾斜載置プレート３３０は、カートリッジドッキング機構および走査検出器ヘッドを明確に提示するために示されていない、ポンプ、真空および圧力貯蔵タンク、ソレノイド、ならびに空気圧制御回路を装着される。
図６Ａは、下面ヒータモジュール３４０および冷却ファン３４５を示す、ドッキングベイの下方からの正面内部斜視図である。ドッキングベイの中へのマイクロ流体カートリッジ２００の挿入時に、ヒータモジュール３４０は、図６Ｂに示されるように、整合ピン５１０上でカートリッジの下面と整合させられ、ステップ５１１上で静置することが分かる。
加熱システム
図６Ｂは、加熱ブロック要素（「熱要素」３４１、３４２、３４３、３４４）および鏡面（５００）を伴うヒータアセンブリ３４０の詳細である。ヒータモジュールの上面は、１つ以上の加熱ブロックから成り、そのそれぞれは、検定中にカートリッジの封入チャネルおよびチャンバ中で起こる生化学または分子生物学的反応の適正な操作のために、マイクロ流体カートリッジの下面上の画定されたゾーンと熱インターフェースを形成する。これらの反応は、免疫結合またはハイブリダイゼーションと同じくらい単純、またはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドおよびアデノシン三リン酸あるいは連鎖凝固因子の形成または消費と結合した、核酸増幅または酵素脱水素化と同じくらい複雑であり、概して、最適な反応性および特異性のために比較的厳密な温度制御を必要とし得る。加熱ブロック（３４１、３４２、３４３、３４４、但し、本発明は、この構成に限定されない）は、ばね載置されてもよく、熱伝達のための高熱拡散率接触ゾーンを確立するように、締め付け機構の下向きの圧力に反して上向きに押勢される。各加熱ブロックは、概して、良好な熱拡散率の柔軟熱パッドによって、抵抗（クーロン）加熱要素と熱的に接触している。各加熱ブロックは、マイクロ流体カートリッジ内の熱ウィンドウに接触する。各ウィンドウは、概して、可撓性プラスチックフィルムの薄い層であり、厚さが３ミル未満であり、最も一般的に、ポリエチレンテレフタレート（Ｍｙｌａｒ(R)）等の柔軟な透明材料であり得るが、随意に、良好な光透過性を伴う環状ポレオレフィンまたはポリイミドであるが、それに限定されず（同一出願人による米国特許第７４１６８９２号を参照）、良好な熱拡散率も有する。したがって、１つの実施形態では、本発明は、検出チャンバ中の液体試料の温度を制御または変調しながら、マイクロ流体カード内の検出チャンバの反射徹照のための熱光学インターフェースである。この特徴は、被分析物と関連付けられる光学信号を監視しながら、被分析物と関連付けられる１つまたは複数の反応を行うために有益である。１つの例示的な用途では、熱融解曲線が、ＦＲＥＴハイブリダイゼーション結果を検証するために使用される。
また、加熱ブロックの下方のヒートシンクから熱を放散するため、および抵抗加熱回路（図２０）と組み合わせたブロック内の温度のＰＩＤ制御のための補助として使用される、ファン筐体３４５も示されている。第２のファン（図２２）が、以下で説明されるように、検定カートリッジの反応チャンバを冷却するために使用される。
この場合の加熱ブロック３４１は、分析中にマイクロ流体カード２００の中の熱光学ウィンドウと接触し、それと整列する、上面上の研磨クロム鏡面５００を有する製造によって修正される。この場合の熱光学ウィンドウは、カートリッジ本体に取り囲まれた検出チャンバに対応する。鏡面は、カートリッジに走査して光を通過させる検出器ヘッド３１１から、対物レンズ３１５の中へ戻って光を反射し、また、以下でより詳細に論議されるように、カートリッジ検出チャンバから検出器ヘッドの中へ戻って、および、そこから典型的にはフォトダイオードである検出センサまで、蛍光発光を反射する。この実施例の加熱ブロック３４１は、他の加熱ブロックとは異なり、概して、アルミニウムから機械加工され、次いで、研磨され、クロム鏡面の適用前にニッケルの下の銅の下層で被覆される。クロム表面上に高反射性光学仕上げを形成するために、電解研磨および／またはバフ研磨が使用されてもよい。ブロックの光学的に平坦な上面は、熱伝達を補助し、蛍光分析法の感度を向上させる。幸いにも、鏡の使用は、例えば、融解曲線を光学的に分析する際に有用であるような、検出チャンバの流体内容物の同意加熱および光学的問い合せを可能にする。
他の加熱ゾーンが、同時温度制御または変調とともに光学監視を可能にするように、同様に修正されてもよい。加熱ゾーンおよび鏡の構成は、特定の検定／カートリッジ要件のために修正または適合されてもよく、ここで示される構成に限定されない。
図６Ｂはまた、それぞれ、独立してホスト機器の空気圧分配マニホールドから陽圧または陰圧源に向けられ、かつ独立してプログラム可能ホストコントローラの制御下にある、ここでは１０個の出口とともに、空気圧インターフェースポート３５０も示す。これらの出口は、マイクロ流体カードの下面内の噛合入口に界面接触して密閉し、空気圧、真空、および圧力パルスを相互伝達する時限パターンは、カートリッジ内で検定を駆動して制御するように、空気圧インターフェースを通して送られる。
図７Ａおよび７Ｂは、ドッキングベイ１０３内の定位置に挿入可能カートリッジを伴う浮動ステージサブアセンブリ３００の斜視図である。明確にするために、ドッキングサドル４００および付属載置要素は除去されている。図７Ａでは、図６Ｂのヒータモジュール３４０の噛合上面と接触させられるように、マイクロ流体カートリッジ２００の下面がどのように成形されるかが分かる。カートリッジは、定位置でボルト留めされて挿入を誘導する、２つの取り付けられた外側フランジ６０９および６１０によって、浮動ステージ３０１の下で固着および支持される。
締め付け機構
図７Ｂでは、４点懸垂６００の雄型要素を形成する４本の垂直柱（６０１、６０２、６０３、６０４）が、浮動ステージ３００の前方区分で明白である。これらの柱は、コイルばね（図８の６０３ａ）を装着され、ドッキングサドル部材４００の一部として形成される円筒懸垂筐体（６０５、６０６、６０７、６０８）に挿入される。懸垂６００は、次の図である図８でさらに詳細に説明されるように、浮動ステージ３００および光学走査アセンブリを懸垂する働きをする。光学ベンチおよびドッキングベイサブアセンブリ全体（図７Ａおよび７Ｂに示される）は、この懸垂上で浮動し、図９および１０で説明されるように、締め付け機構の下向きの作用時のみ、機器の他の部分と堅く接触させられる。
図８は、ドッキングサドル４００の下面から懸垂された検出器ヘッド３１１およびドッキングベイ１０３を伴う浮動ステージ３００の分解図である。浮動ステージは、４本の支持柱（６０１、６０２、６０３、６０４）のそれぞれの上にコイルばね（６０３ａの複製）を伴う４点ばね懸垂を装着される。各柱は、ドッキングサドルの噛合懸垂筐体（６０５、６０６、６０７、６０８）の中で受け取られる。マイクロ流体カートリッジ２００は示されていないが、この図では、カートリッジが下外側フランジ（６０９、６１０）上に静置するように、ドッキングベイがドッキングベイの突出穴縁５１５においてカートリッジの突出部を受け取るために構成されることが分かる。整合ピン（６１６、６１７）は、ヒータモジュール３４０に下方に押し付けられるときにドッキングベイが正確に着座することを確実にする。ガイドレール（３０８、３０９）および蛍光走査のための検出器ヘッド３１１を含有する、浮動ステージの後方区分は、ドッキングサドル以外でいかなる支持体も含まず、動作中にドッキングサドルからカンチレバー操作される。走査検出器ヘッド３１１の運動を支持することにおけるガイドレールの役割が、この図で明白である。
ドッキングサドルは、以下で議論されるように締め付け機構８００を取り付けるためのブラケット７１２および７１３、ならびに自動動作で有用であるようなバーコード読取機を提供される。スロット７１１を伴うリンカアーム７１０が、以下で議論されるような締め付け歯車機構、および単一のアセンブリとして上昇および下降される浮動ステージ３００によって係合される。リンカアーム７１０は、加熱ブロックにカートリッジを動作可能に押し付ける。
図９Ａは、締め付け機構の正面図である。ドッキングサドル４００の架橋形状は、浮動ドッキングベイ１０３の前突出部５１５の上方に静置することが分かる。ドッキングベイの口の直下には、マイクロ流体カートリッジ２００を受け取るためのチャネルを形成する外側フランジ６０９および６１０の間で可視的である、空気圧インターフェースポート３５０がある。搭載されたカートリッジのドッキング中に、締め付け機構の機能は、上記で説明されるように、挿入されたカートリッジを伴う浮動ステージおよびばね載置シャーシ３０１を、空気圧インターフェースポートおよびヒータモジュール上に下向きに押勢することである。
ドッキングサドル４００は、載置プレート３３０上にボルト留めされ、浮動ステージシャーシ３０１は、４点懸垂６００上で懸垂される。懸垂ばねは、上昇位置にあるときに締め付けアセンブリ８００の懸垂作用によって対抗される、下向きの圧力を浮動ステージに印加する。次いで、カートリッジを締め付けるときに、クランプ歯車部品８０４が、ウォーム歯車８０１およびウォーム歯車モータ８０２によって駆動され、下向きの弧で移動車軸８０３を駆動する。車軸ピン８０３ａが、カムブロック（９０１、図９Ｂで可視的である）に取り付けられる。リンカアーム（７１０、図８および１０Ａで可視的である）は、４点懸垂上で上方または下方に、締め付け歯車４０１およびスライダブロック９０１のカム作用に従う。カートリッジを係脱するときに、作用が逆転させられる。ウォーム歯車モータ８０２は、時計回りに作動させられ、ピン８０３ａおよびカムブロック９０１を上昇させ、したがって、ステージシャーシアセンブリ３０１の一部であるリンカアーム７１０を持ち上げ、次いで、逆転させられる（両方向矢印）。ステージシャーシが最上静置位置にあるとき、マイクロ流体カートリッジを機器から除去することができる。機械的基準または整合ピンが、検定中に機器ドッキングベイの中でカートリッジを位置合わせするために使用される。
図９Ｂは、歯車の位置を監視し、ホストコントローラによる協調的な機械的機能を作動させるために、圧力スイッチによって使用される、歯車部材の前縁上のカムフォロワ表面８０５および８０６も示す、歯車コーム８０４ａおよびウォーム駆動歯車８０１を伴うクランプギア部品８０４の正面図の詳細図である。簡単にするために、圧力スイッチは示されていない。車軸８１０は、部品の回転中心であり、ピン８１０ａ上で回転する。車軸８０３は、歯車部品の回転中に移動し、次の図で示されるようにステージシャーシと係合するスライダブロックを駆動する。
図１０Ａおよび１０Ｂは、締め付け機構アセンブリ８００の作用を示す、機械製図である。クランプ歯車駆動型カムの目的は、浮動ステージ３０１を上昇および下降させることである。締め付け歯車部品８０４は、移動車軸８０３が上向きまたは下向きに弧を描き、リンカアーム７１０を垂直に上方または下方に（両方向矢印）推進するように、静止車軸８１０上で枢動する。ピン８０３ａ上で捕捉されたスライダブロック９０１は、浮動ステージ３００を上昇または下降させながら、クランプ歯車の運動の外側ベクトルに適応するように、リンカアーム（７１０、図８参照）内のスロット７１１の中で左から右に摺動する。浮動ステージの上向きの移動は、先行図で示されるようなばね６０３ａによって対抗される。図１０Ｂは、中心車軸８１０ａおよび偏心カムブロック車軸８０３ａ、ならびにカムスライダブロック（９０１）を示す、クランプ歯車部品８０４およびウォーム駆動歯車８０１の後側の詳細図である。
代替的な方法で、例えば、上から下よりもむしろ底部から締め上げることによって、または機械的に締め付けるよりもむしろ磁気的に締め付けることによって、本発明を実現できる限り、ここで図示される機構は非限定的である。他のばね手段が、コイルばね、板ばね、ねじりばね、らせんばね、ならびに空気圧キャニスタ（例えば、ガスばね）およびエラストマー材料等の代替案、または当技術分野で公知である他の同等の手段から選択されてもよい。
図１１Ａおよび１１Ｂは、本発明の装置とともに使用するための挿入可能マイクロアッセイカートリッジ１１００の斜視図である。ここで示されるカートリッジは、内部の仕組みを伴う筐体１１０２およびカバープレート１１０３から成る。ポート１１０４は、液体試料を受け取るためのものであり、前突出部１１０５は、ホスト機器のドッキングベイに挿入するためのものである。カートリッジ筐体内のウィンドウ１１０１は、図１３に示されるように、試料ウェル１２０１を覆って形成される光学ウィンドウである。ガスケット１１０６は、ホスト機器の空気圧インターフェースマルチポート３５０と密閉して界面接触するためのものである。下から、内蔵回路カード１２００および外部回路カード１２０４が示されている。
空気液圧システム
図１２は、マイクロアッセイカートリッジ１１００の内部構成要素を示す、分解図である。この特定のカートリッジ１１００は、ＦＲＥＴまたは分子ビーコン検出を伴うＰＣＲのために設計されている。好ましくは、診断用途および満たされるべき具体的要件に従って、採用されるカートリッジ設計および分析反応の詳細を判定することは、当業者に委ねられ、以下の詳細な説明は、例証のために供給されるにすぎない。
試料は、入口ポート１１０４を通し追加される。筐体突出部１１０５の突出部上の光学ウィンドウ１１０１は、ホスト機器に挿入され、マイクロアッセイ内蔵回路カード１２００のＦＲＥＴまたは分子ビーコン検出チャンバ１２０１のウィンドウが、光学ウィンドウを縦に横断する線形経路を辿る検出器ヘッドによって走査されるように整合させられる。試料調製に関係付けられる追加処理が、外部カード１２０４上で供給される。全ての液体試薬は、密閉された破裂可能パウチ１２０６に封入され、空気圧制御下で必要なときに分注される。他の試薬は、乾燥形態でカード上に提供される。流体廃棄物は、プラスチックカバープレート１１０３の下の定位置で密閉される、吸収性の詰め物１２０７の中で隔離される。任意の特定の生化学または分子マイクロアッセイの詳細は、本範囲を超えるが、核酸標的を熱循環させて増幅するための内部マイクロアッセイチャネルおよびウェルを伴うマイクロアッセイ回路１２００は、任意の結果として生じたアンプリコンのＦＲＥＴ検出のための検出チャンバ１２０１を含む。
ガスケット１１０６内の１０個のポートを通して供給される空気圧供給は、両方のカード１２００および１２０４内の回路に流体的に接続される。カード１２０４内の初期試料処理中に、カード１２００内の空気圧要素が作動させられるが、カードが空であるため無効である。次いで、処理された試料が分析のためにカード１２００に移送されるとき、カード１２０４内の空気圧要素が作動させられるが、カードがもはや必要とされないため無効である。意外にも、これは、余分な空気圧ポートが２枚のカード１２００、１２０４を別々に制御する必要なく、多重弁論理を達成する。１０個のポートが、ほとんどの検定のために十分であることが分かっており、ベースプレート３３０に含有される外部空気圧供給マニホールドにおける付加的な複雑性および冗長性を必要とすることなく、陽圧および吸引圧の両方を含む、ポンプ、弁、および通気孔のための別個の圧力と個別に関連付けられる。
図１３Ａおよび１３Ｂは、本発明の装置とともに使用するための挿入可能マイクロアッセイカートリッジ１１００の平面および立面図である。カートリッジの前突出部１１０５上の光学ウィンドウ１１０１が示されている（突出部はホスト機器に挿入され、光学ウィンドウは検出器光学部によって走査される）。また、ヒータアセンブリ３４０およびガスケット付き空気圧制御インターフェースポート３５０に対してカートリッジを圧迫するためのプラテン表面１１０７も示されている。
示されるようなカートリッジは、使用中であるときにホスト機器内のドッキングベイ１０３に挿入される、使い捨てカートリッジ１１００である。カートリッジ筐体の外側リブ１１１０は、構造的補強およびドッキングプロセスの補助のためのものである。図１４Ａは、封入された内部空気圧マニホールド、ヒータモジュール３４０、および空気圧インターフェースマルチポート３５０を伴う傾斜載置プレート３３０の斜視図であり、図１４Ｂは、ホスト機器の中にドッキングされたときのマイクロアッセイカートリッジを描写する。この図では、カートリッジは、空気圧制御インターフェースマルチポート上に流体的に係合させられ、ヒータモジュール３４０の４つのゾーンヒータと熱的に接触させられる。プラテン表面１１０７上の圧力は、熱および空気圧インターフェースに対してカートリッジを押勢する。載置プレートは、空気圧インターフェースマルチポート３５０を通して調節された空気圧をカートリッジに供給する、内部空気圧制御マニホールドを含む。完成した機器では、載置プレート３３０は、カード空気力学を制御するための圧力調節器、アキュムレータ、およびソレノイドを装着される。
図１５は、マイクロアッセイカートリッジ１１００の突出部１１０５であって、光学ウィンドウ１１０１および内蔵カード部材１２００を含有する突出部の分解図である。ネスト化した内蔵１２００および外部回路カード１２０４は、ここでは密閉ガスケット１１０６と整合する、共通空気圧制御インターフェース（１１１１ａ、１１１１ｂ）を共有し、ビアを通して入力を内蔵および外部流体回路に流体的に接続することによってポートを共有する。この場合の外側流体回路は、試料処理に関与し、内蔵回路は、再処理された試料を受け取り、標的被分析物のためにそれを分析する。内蔵および外部カードの間の空気圧インターフェース内の空気圧供給ポートを多重化することによって、インターフェースの複雑性の低減を達成することができる。空気力学は、最初に、外部回路内の流体動作に、次いで、内蔵回路内の流体動作に使用されてもよく、これは、複雑な回路を経済的に管理するという問題に対する驚異的な解決策である。
より一般的には、空気圧インターフェースアレイは、複数の空気圧ポートが、プログラム可能命令に従って印加される複数の空気圧パルスを受け取ること、およびこれらの空気圧パルスを第１の回路カードおよび第２の回路カードの流体回路要素に多重送信することを可能にさせられ、それによって、該第１および該第２の液圧回路を操作するために必要とされるポートの数を削減するように、第１の回路カード内の空気圧回路を第２の回路カード内の空気圧回路に流体的に接合するビアによって流体的に接続される、複数の空気圧ポートを備える。例えば、第１のビアにおいて空気圧インターフェースに印加される空気圧パルスは、以下でさらに詳細に説明されるように、第１のカードが試料から核酸を抽出するために設計され、第２のカードが分子標的を増幅および検出するために設計されるときに有用であるように、流体接合点を通して外部回路カードから内蔵回路カードへ処理された液体試料を押勢する。
突起１１０８は、内蔵カード内の不要な熱伝達を制限するように狭い断面を有し、また、より大型の空気圧ダイヤフラム部材の周囲の画定された円周に圧縮荷重を伝達する働きもする。ピン受け取り穴１１０９ａ、１１０９ｂは、ホスト機器の中へ新しいカートリッジを搭載するときに、ピン５１０ａ、５１０ｂ上でドッキングベイ１０３内のカートリッジを整合させるために使用される。
図示される特定のカートリッジは、熱循環およびＦＲＥＴ検出を伴うＰＣＲのために設計されている。外部カード１２０４は、試料から核酸分画を単離するために意図されている。核酸標的を熱循環させて増幅するための内部チャネルおよびチャンバ（１１１５、１１１６）を伴う流体回路カード１２００は、任意の結果として生じたアンプリコンのＦＲＥＴ検出のための試料ウェル１２０１を含む。また、ｃＤＮＡ合成のためのチャンバ１１１４も描写されている。３つの平行検定チャネルが示されている。他の回路構成が、本発明のマイクロアッセイ検出システムとともに使用されてもよく、検定は、３つのチャネル、またはＰＣＲによる核酸検出に限定されない。
図１６は、空気圧インターフェースマルチポート３５０を通した断面図の位置を示す、マイクロアッセイカートリッジがない載置プレート３３０の平面図である。また、カートリッジおよびヒータアセンブリ３４０を受け取るための整合ピン５１０も示されている。他の穴は、例えば、溶剤溶接によって融合されているか、または３次元印刷のプロセスによって作製されている、層状アクリルで作製され得る、載置プレートを通って延在する空気圧マニホールドと流体的に連通している空気圧システム構成要素を載置する際に使用するために意図されているポートである。
図１７は、内蔵カード１２００内の空気圧チャネルに至るビア（例えば、１１２０ａ、１１２０ｂ）に係合するためのポートを示す、図１６で切断された区分において空気圧制御インターフェース３５０を通した断面図である。１０個のポート３５１は、ビアを通して、空気圧チャネル１１２１が代表的である、載置プレート３３０に封入された空気圧マニホールドに接続する。また、カード空気圧制御インターフェース３５０に対してカードの空気圧インターフェースポートを据付するためのカートリッジ位置合わせピン５１０ａ、５１０ｂも示されている。
ここではブロック輪郭で示されるカード１２００は、空気圧インターフェースマルチポート３５０を介して空気圧分配マニホールド３３０から印加される加圧ガスパルスに応答して動作する、内部空気圧加工物を有する。カード内の内部空気圧加工物は、ホストコントローラによって供給される弁論理の制御下で動作可能な弁ツリーと、回路を通して流体を移動させるためのダイヤフラムポンプと、空気圧制御下で流体を分注するための流体貯留部とを含む。複数のポートの必要性は、弁論理がカード上でレイアウトされる方法、および複数の圧力の必要性に関する。陽圧および陰圧の両方における空気圧供給が、概して必要とされ、いくつかの中間圧力レベルが有利であることが分かっている。有用であることが分かっている圧力は、ポンプを操作するための＋１０ｐｓｉｇ、弁（ＷＯ公開第２００２／０８１９３４号で説明されるダイヤフラム弁等）を開放するための−５ｐｓｉｇ、およびゼロ圧力通気孔を含むが、それらに限定されない。ここで示されるように、カートリッジとの１０個もの空気圧相互接続が係合されてもよい。カートリッジの複雑性に応じて、所望であれば空気圧インターフェースを再寸法決定または再構成することによって、より少ないまたはより多いポートが使用されてもよい。
カートリッジが機器の中に搭載され、ばね圧力が印加されるときに、圧縮下で空気圧相互接続を密閉する、シリコンゴムガスケット１１０６または略柔軟エラストマーガスケットが、マイクロアッセイカートリッジ１１００の空気圧チャネル、および空気圧マニホールド３５０の対応するポートを分離している。ガスケット１１０６は、単回使用密閉ガスケットとしての機能を果たし、有利なことには、従来知識のように機器の一部としてではなく、使い捨てカートリッジを供給される。使い捨てカートリッジ１１００とともにガスケットを含むことによって、空気圧インターフェースにおけるより良好かつ清潔なシールが得られ、ガスケットを周期的に交換する必要性が排除される。ガスケットは、概して、シリコーンゴムまたは他の柔軟材料で形成される。
本発明の空気圧回路を使用して、回路はまた、ホスト機器内で複数の空気圧源を供給することによって多重化されてもよく、接続マニホールド３５０内の空気圧供給回路は、付加的な空気圧回路を必要とすることなく、陽圧から陰圧に等、１つの空気圧から別の空気圧に切り替えられてもよい。したがって、ベースプレート３５０内の各マニホールド副次回路は、複数の圧力状態で操作されてもよい。このようにして、共通空気圧インターフェースポートアレイを介して、より強い空気圧を用いて動作する回路要素へのより強い空気圧「状態」、およびより弱い空気圧を用いて動作する回路要素へのより弱い空気圧状態の分配を多重化することが可能である。同様に、共通空気圧インターフェースポートアレイを介して、より強い空気圧を用いて動作する回路要素へのより強い空気圧「状態」、および真空圧カードを用いて動作する回路要素への真空圧空気圧状態の分配を多重化することが可能である。第１の回路カードおよび第２の回路カードを共通空気圧インターフェースと接合することによって、空気圧回路の二重機能性が達成される。
圧力状態は、概して、−５ｐｓｉ、＋１０ｐｓｉ、＋１２ｐｓｉ、＋１５ｐｓｉ、＋２０ｐｓｉ、＋７ｐｓｉ、および０ｐｓｉを含むが、それらに限定されない、一連の陽圧および陰圧から選択され、より高い圧力は、例えば、試薬パックを破裂させるために使用され、陰圧は、弁を開放するため等に使用される。これらの圧力は、緩衝圧力貯留部から供給されてもよい。ダイヤルアップ可変圧力供給も使用されてもよい。空気圧状態は、マイクロプロセッサ制御下でマニホールド副次回路を通してカートリッジに供給される。各検定は、液圧回路を通して流体を移動させるために必要とされる空気圧弁およびポンプ論理に従って実行される、一連のステップから成る。通気孔も回路の必要な部分であり、加圧、圧力の逆転、および通気は全て、各個別検定タイプの要件に従った機器および関連マイクロアッセイ回路の能力の範囲内である。
図１８は、カートリッジおよびヒータモジュールを通して切断された断面図の位置を示す、使用のための位置に重ね合わせたカートリッジ１１００を伴う載置プレート３３０の平面図である（マイクロアッセイカートリッジ１１００の下面に接触するヒータモジュール３４０および空気圧インターフェース３５０は、カートリッジの下にある）。
温度制御システム
図１９は、図１８で印付けられた断面位置を参照する、断面でのヒータモジュールおよびカートリッジ１１００の突出部１１０５の図である。カートリッジは、標識の目的で加熱ブロック３４１−３４４の上方に上昇させられる。空気圧相互接続モジュール３５０（２列のポートが示されている）は、図１７および１５を参照して機能的に説明された、カートリッジの使い捨てガスケット１１０６に係合する。また、核酸増幅回路の個々のチャンバに接触するように構成される、４つの抵抗ゾーン加熱ブロック（３４１、３４２、３４３、３４４）も示されている。対合位置合わせピン５１０は、ブロックの熱表面が流体部に適正に係合するように、カートリッジ筐体を整合させる。ステップ５１１は、カートリッジの突出部１１０５を支持する。
ゾーン加熱ブロック３４１は、熱光学インターフェースであり、流体回路部材に接触する鏡面５００を備える。カートリッジ筐体内の光学ウィンドウ１１０１は、鏡面と整合し、検出器ヘッドは、検出器ヘッド３１１の対物レンズアセンブリ３１５が加熱ブロック３４１の長軸の中央の下方へ動くように、レール３０８、３０９（図４）に沿って摺動する。回路内の検出ウェルは、光学ウィンドウの下の熱ブロックおよび鏡面上に並ぶように位置付けられる。
ブロック３４１は、ＦＲＥＴ判定のために温度制御される。抵抗加熱ブロック３４２は、検定が開始される前に２本鎖核酸変性温度に調整され、ブロック３４３は、焼鈍温度に設定される。焼鈍ブロック３４３は、変性チャンバから運搬される高温流体を急速に冷却することができ、したがって、熱循環時間を加速するように、冷却フィン３４３ａおよび送風機３４５を提供される。ブロック３４４は、必要であればｃＤＮＡ合成に使用される。
流体回路は、加熱ブロック３４２および３４３を覆って位置する、一対の流体チャンバを含んでもよい。対合チャンバは、熱循環による核酸の増幅に有用であるように、変性および焼鈍温度の間で流体を往復させるために、米国特許第７９５５８３６号および第７７６３４５３号（同一出願人による）で説明されるように協調的に操作される空気圧作動型ダイヤフラムを含む。各加熱ブロックは、ばね荷重され、流体回路の下面を圧迫する。ここで示されるばねは、それらの小型性のため選択されるワイヤばねである。
図２０は、ヒータモジュールの分解図である。４つの加熱ブロックが示されており、各ブロックは、抵抗加熱要素（３４７ａ）および中心に位置付けられたサーミスタ（３４７ｂ）を有する、プリント回路ストリップ３４７と関連し、抵抗ヒータは、ＰＩＤ型フィードバックループ制御下にある。プリント回路上の支持回路が概略的にレンダリングされ、ホストコントローラから制御される。
各ブロックは、ばね支持体３４８上で浮動し、限定された垂直範囲内で自由に移動するように柔軟な電気接続を提供される。ブロックは、切り抜きポケットを伴う絶縁体ジャケット３４６によって相互のために熱的に絶縁される。加熱ブロックは、支持載置プレート３４９に形成されたスロットの中へ入れられる。ワイヤばね３４８は、熱伝達に対する抵抗を減少させるように軽微な力で、カード１２００（図１５）の柔軟プラスチック下面に対してブロックを押勢するように構成される。
図２１は、カートリッジと加熱ブロックとの間の熱接触に関与する、締め付け力およびばね力の均衡を描写する概略図である。図５−１０を参照して示されるように、浮動ステージ３０１のドッキングベイ１０３は、いったんカートリッジが据付されると、カートリッジを押し下げるよう４本の隅柱（６０１、６０２、６０３、６０４）のそれぞれの上に載置されたばねがバイアスをかけられるように、４点懸垂６００を用いて載置される。締め付け機構８００は、ウォーム歯車駆動型であり、ヒータモジュールの中で位置合わせピン５１０およびステップ５１１に対してカートリッジを圧搾する。各加熱ブロックは、各ブロックの下の独立ばね部材によって、内蔵回路カードの下面に対して上向きに押勢される、浮動部材である。ヒータモジュールの中に載置されるワイヤばねは、空気圧分配マニホールド３３０上に載置されたマルチポート３５０に対してカード空気圧インターフェースを密閉するように、内蔵流体部材１２００およびガスケット１１０６の下面に対してブロックを上方に押し付ける。このようにして、カートリッジは、締め付けアセンブリのより強い懸垂ばねによって定位置で係止され、加熱ブロックは、製造においてより少ない精度を必要とする、ヒータモジュールアセンブリのより弱いばねによって内蔵カードと熱的に接触させられる。カートリッジは、２つの対向ばね力によってドッキングベイの中で挟持される。外側補強リブ１１１０は、カートリッジを強化し、より柔軟であるほど内蔵回路カードが加熱部材と熱的に接触していることを確実にする。下向きのばね懸垂力は、約５ｐｓｉであり、上向きのばね力は、加熱部材の表面にわたって約１ｐｓｉであり、ばねは、カートリッジを締め付けるように、および加熱が意図される内蔵カードの下面に加熱ブロックを押し付けるように、協調的に作用する。また、例証のために、ｃＤＮＡウェル１１１４、焼鈍ウェル１１１５、変性ウェル１１１６、および光学ウィンドウ１１０１の下で整合させられた検出ウェル１２０１を含む、カード１２００の特徴も示されている。
また、図２１に示されるように、突起１１０８が、流体チャンバに隣接するカートリッジ筐体の内面上に形成される。突起は、回路の流体内容物と下層の加熱ブロックとの間の低い熱抵抗を確保するために圧縮が必要とされる、流体ダイヤフラム要素の周囲でばね荷重力を集中させる。これらの突起１１０８は、低熱断面のために構成され、ｃＤＮＡ合成および熱循環チャンバの周囲の寄生熱損失および熱キャパシタンスを別様に増加させるであろう、質量を筐体から除去することによって形成される。内蔵流体部材が、増幅回路の上方に空隙を伴うカートリッジ筐体の下で懸垂され、したがって、ゾーンヒータの間の伝導熱損失および熱クロストークを低減させるため、低熱断面は、横方向にも提示される。加熱ブロックの間に挿入される絶縁ジャケット３４６もまた、各熱ゾーンを単離し、正しい温度で維持して、抵抗加熱要素の間の対流熱クロストークを回避するために使用される。
試料ウェルを含有するマイクロアッセイカートリッジの突出部１１０５はまた、過剰な熱質量を回避するように薄く形成される。図２２に示される送風機３６０は、バッフルダクト３６１を介してカートリッジの突出部上に指向され、ＦＲＥＴ判定のために有用である。ＦＲＥＴでは、分子ビーコンは、標的被分析物種の融解温度を上回る温度において検出チャンバ中で１本鎖アンプリコンと混合させられる。次いで、蛍光放射が収集されている間に、強制冷気を使用して温度が低下させられる。送風機は、機器シャーシの外壁３５９上に載置される。
１つの例証的実施形態では、混合物が冷却すると、分子ビーコンは、標的配列に焼鈍し、プローブにおいて蛍光を消光する。蛍光のリアルタイム監視は、標的アンプリコンの同一性の妥当性を立証するために使用することができる融解曲線をもたらす。試験を行うために、ゾーンヒータ３４１は、標的種の融点を上回る温度に引き上げられ、ヒータは、オフにされ、送風機３６０は、オンにされて、光学ウィンドウ１１０１の周囲および下のカートリッジの突出部１１０５に指向される。反応混合物中の温度および蛍光が監視される。温度は、蛍光の変化が光学的に監視されている間に、循環空気に応答して非常に急速に下降し、複製ＦＲＥＴ判定が各試料ウェルで急速に行われることを可能にする。
したがって、１つの実施形態では、本発明は、ａ）ＦＲＥＴプローブおよび標的核酸配列を含有する試料チャンバを、二重プローブの融解温度を上回る温度まで加熱するステップと、ｂ）該加熱をオフにするステップと、ｃ）ファンをオンにし、周囲空気流を試料チャンバ上に指向することによって引き起こされる、試料チャンバの温度の変化に応答して、自律ＯＤＡＰデーモンを有する遮蔽検出器ヘッドを使用して、ＦＲＥＴプローブの蛍光の変化を監視しながら、試料チャンバにわたって検出器ヘッドを走査し、それによって、蛍光を監視しながら該試料チャンバを急速に冷却するステップとを含む、ＦＲＥＴ融解曲線判定を行うための方法である。温度の関数としての蛍光強度の導関数の分析は、目的とするアンプリコンの特性を示す融点をもたらす。本発明のカートリッジの低い熱質量を使用して、１分未満でこれらの判定を行うことが可能であることが証明されている。加熱ブロック３４１は、冷却フィンを提供され、所望であれば測定を加速するように独立して空冷されてもよいが、概して、これは必要とされていない。
光学システム
図２３は、それぞれ、励起のため、および放射検出のために、２つの光学チャネルおよび電子的に絶縁された回路基板（１３０１、１３０２）を伴う、二重のチャネル検出器ヘッド１３００の斜視図である。この図では、検出器ヘッドの内部構成要素を示すために筐体１３０３の上半分が除去されている。二重チャネルは、対物レンズ（１３１０、１３３０）、ならびに光学経路ＡおよびＢ（ＡおよびＢと印付けられた白い矢印）によって印付けられる。ＳＭＤ ＬＥＤ励起光源（１３１１、１３３１）は、縁型抵抗ピンコネクタ（１３０４）を介して直角でセンサＰＣＢ（１３０２）に接続される、ソースＬＥＤプリント回路基板（１３０１）上に載置される。光検出構成要素が、センサＰＣＢ（１３０２）上に載置される。ファラデー箱要素（１３０６）が、フォトダイオード（１３１７）および（１３３７）、ならびに周辺高利得増幅回路を遮蔽するために使用される。
蛍光励起は、標的フルオロフォアの励起スペクトルに合致するように選択される、表面載置型ＬＥＤ（１３３１）によって標的チャネル内で提供される（矢印Ａ）。ソースＬＥＤ（１３３１）は、発散光線を発し、次いで、放射光線は、ソース励起レンズ（１３３２）によって平行にされる。ソースレンズ（１３３２）は、ＬＥＤに対面するその平面を有する、平凸レンズである。次いで、平行光線は、励起帯域通過フィルタ（１３３３）を通過させられてもよく、その目的は図２０と関連付けられる説明でさらに説明される。次いで、平行なフィルタにかけられた励起光線が、入射光線に対して４５度の角度で設置されるダイクロイックミラー要素またはビームスプリッタ（１３３４）から反射され、平凸対物レンズ（１３３０）、および検出器筐体内の外部ウィンドウを通過させられる（矢印Ａ）。レンズ１３３０を通過した後、励起光は、任意の標的フルオロフォアを伴う試料液体を含有する、マイクロアッセイカートリッジに組み込まれた検出チャンバ（図示せず、図１４−１７参照）を通して集束させられる。試料液体を通る励起光の経路長は、マイクロアッセイカートリッジの後ろのバックミラーの使用によって倍増される。標的フルオロフォアは、入射光線によって励起させられる。フルオロフォアの放射は、概して、励起波長より長い波長にあり、標的フルオロフォアのストークス偏移に等しい量だけ偏移される。
検出チャンバ内の標的フルオロフォアからの帰還放射の一部分は、平凸サンプリングレンズ１３３０によって収集され、ダイクロイックミラー１３３４に衝打する前に平行にされる。随意に、レンズと試料との間の作業距離をさらに短縮して、検出チャンバの後ろの加熱ブロック上に載置されたバックミラーによってさらに増進される放射光の収集を最適化するために、フレネルレンズが使用されてもよい。二色性ビームスプリッタ１３３４が励起および放射波長の間の波長カットオフを有するため、ダイクロイックミラー１３３４は、放射蛍光光線のための通過帯域ビームスプリッタ、および励起光のための阻止帯域フィルタの役割を果たす。これは、対物レンズウィンドウを通って光路に入射する反射励起光および任意の周囲光を反射しながら、放射蛍光を伝送する。次いで、二色性ビームスプリッタ１３３４を通過する放射光は、放射フィルタ１３３５を通過し、その目的は図２０と関連付けられる説明でさらに説明される。次いで、放射フィルタ１３３５から退出する光は、平凸センサレンズ１３３６を通過し、そこで、ＰＣＢ１３０２に表面載置され、ファラデー箱１３０６によって電気雑音から保護される、光センサ１３３７の表面上に集束させられる。
上記の光路は、対照励起ＬＥＤ１３１１、平凸励起レンズ１３１２、励起フィルタ１３１３、二色性ビームスプリッタ１３１４、対物レンズ１３１０、対照発光フィルタ１３１５、平凸センサレンズ１３１６、および対照フォトダイオード１３１７を有する、第２の（対照）チャネルの中で反復される。両方のフォトダイオードからの出力は、フォトダイオードの隣で基板に内蔵され、増幅器からの慎重に遮蔽されたピンを介して、センサＰＣＢ上の埋め込みマイクロプロセッサに接地される、３段トランスインピーダンス増幅器によって増幅される。
１つの実施形態では、フルオロフォアとしてのフルオレセインおよびテキサスレッドの使用によって例示されるように、励起ＬＥＤ １３３１は、標的チャネルに使用される４８５±１２ｎｍの本質的に単色の光を送達するための帯域通過励起フィルタ１３３３を伴う４７０ｎｍ ＬＥＤであり、帯域通過フィルタ１３１３を伴う５９０ｎｍ ＬＥＤ１３１１が、対照チャネルに使用された。励起ＬＥＤは、５０〜６０Ｈｚで、かつ蛍光頭上照明と関連付けられる調和周波数で、ＡＣ電力関連雑音をフィルタにかけるように、１３０Ｈｚのストロボ速度を使用して変調されるか、または「ストロボ」をオンおよびオフにされ、また、３０または６０Ｈｚで存在し得る周囲迷光および電気雑音に関係付けられるファントム信号をフィルタにかける。局所フィードバックセンサが、ソースＬＥＤ出力強度を監視して安定させるために使用される。フルオロフォア放射の検出監視は、ホストコントローラによって制御されるステッパモータの電力下で検出器ヘッドのレール上の移動と協調させられる。検出器ヘッド内の組み込みマイクロプロセッサおよび関連回路は、ＲＡＭメモリ、ＲＯＭメモリ、Ａ／Ｄ変換器、３段トランスインピーダンス増幅器、ならびにこれらの機能を取り扱う信号処理およびコマンドシーケンスファームウェアを提供される。
光センサ１３１７および１３３７のそれぞれは、共通ＰＣＢ １３０２上に載置される。これらの光センサのそれぞれからの出力信号レッグは、それぞれの３段トランスインピーダンス増幅器（図示せず）の前置増幅または第１の段階に直接接続される。ＰＣＢ １３０２は、入力信号に及ぼす任意のＲＦまたは電磁干渉の不要な影響を最小限化するように、ハードウェア雑音低減構成要素、具体的には、組み込み接地板およびファラデー箱１３０６を広く利用する。増幅器は、ファラデー箱、バイパスコンデンサ、信号調節前置増幅器、別個の接地板、金属化検出器ヘッド筐体、またはそれらの組み合わせによって電子雑音から保護され、増幅器は、センサと電気的に近接近している。光学信号取得、事前調節、増幅、およびデジタル化は、遮蔽環境で動作する自律デーモンによって制御される。検出ヘッド内の局所制御下にある光学データ取得、デジタル化、および処理方法とのこれらのハードウェア雑音低減要素の組み合わせは、不要な雑音の効果から本質的に免れる検出器設計につながる。３段増幅器は、最大１０１４の利得のために構成されてもよく、所望に応じて、１０２、１０３、１０６、１０１０、または１０１２の利得のために選択的に構成される。
我々は、驚くべきことに、信号経路長を最小限化し、必要である場合に、センサダイオードリード線の周囲、ならびに励起およびセンサ回路基板の間の接合点等で、ファラデー遮蔽の効果的な使用を可能にすることによって、走査ヘッド内の信号処理のパッケージ化が、向上した信号対雑音比および感度を伴う隔離低雑音環境を達成することを見出した。随意に、検出器筐体は、アルミニウムから加工され、または伝導性ポリマーでコーティングされ、不要な干渉から内部電子機器をさらに保護するように接地されてもよい。有利なことには、より高い信号増幅がこの環境で実現される。
図２４Ａおよび２４Ｂは、カートリッジに封入された検出チャンバ中の温度を制御するか、または傾斜させるために使用される、加熱ブロック１４１０の表面上でカートリッジの後ろに載置されるマイクロアッセイカートリッジ１４０２およびバックミラー１４００内の光学ウィンドウとの外部光学インターフェースを示す、蛍光検出器ヘッド１３００の内部光学構成要素の概略図である。非従来的に、複数の独立光学経路または「チャネル」が、単一の検出ヘッドの中に形成され、電子ＰＣＢおよび下流信号処理回路を共有するが、雑音干渉を低減させるように、励起光学部は、１つの回路基板上に載置され、検出光学部は、別の回路基板上に載置される。２つの基板は、隅載置型ピン接合点１３０４によって電気的に連結され、別個の接地板上に載置されるバイパスコンデンサを使用して、電気的に絶縁される。
図２４Ａには、マイクロアッセイカートリッジ１４０２内に組み込まれた検出または試料ウェル（１４０３ａまたは１４０３ｂ）中のフルオロフォアの励起のための光学遷移が示されている。ヘッドは、走査ヘッドであり、マイクロアッセイカートリッジ１４０２にわたって移動する（両方向矢印）。ＰＣＢ １３０１上の励起ＬＥＤ １３３１からの光は、レンズ１３３２によって平行にされ、帯域通過フィルタ１３３３によって本質的に単色にされる。検出ウェル１４０３ａ中の１つまたは複数の任意のフルオロフォア（対照または標的フルオロフォア）は、対物レンズ１３３０によって試料に集束させられる入射光１４２０によって励起される。図２４Ｂでは、フルオロフォアの放射は、対物レンズ１３３０によって収集され、二色性ビームスプリッタ１３３４、放射フィルタ１３３５、およびセンサレンズ１３３６を通過した後にセンサ１３３７に伝送される。センサ１３３７は、出力信号を増幅し、ファラデー箱１３０６の中で遮蔽される、高利得トランジスタの基部と直接電気的に接触している。放射蛍光は、概して、フルオロフォアのストークス偏移に従って、より長い波長にあり、損失を伴わずに放射光が二色性帯域通過鏡１３３４および放射帯域通過フィルタ１３３５を通過することを可能にする。鏡面１４００は、標的上の励起光の量を増加させ、励起経路長を倍増するため、および放射収集効率を向上させるために使用される。したがって、試料チャンバ１４０３ａから対物レンズ１３３０に返還される光は、放射および反射蛍光１４２１ならびに反射励起光１４２０の混合物である。光トラップ（図示せず）が、漂遊反射を捕捉するように提供される。反射光１４２０は、ダイクロイックミラー１３３４を通過せず、光源に返還され、センサ１３３７における放射強度の測定に干渉しない。励起源、ソース平行レンズ、励起フィルタ、ダイクロイックミラー、対物レンズ、励起フィルタ、センサレンズ、および増幅器を伴う検出器を含む、単一のチャネルの光学要素は、本質的に単色のソース波長を有する光学モジュール、および標的（または対照）フルオロフォアの特性を示す特定の波長で蛍光を検出するための高度に特異的なセンサを構成する。一方の光学モジュールまたはチャネルは、検定標的に使用されてもよく、他方のモジュールは、対照チャネルに使用されてもよい。タンデム載置型光学チャネルが、複数のフルオロフォアについてのデータを収集するために使用されてもよく、電気的処理は、ホスト機器への伝送の前に、常駐デーモンの制御下で組み込みマイクロプロセッサを通して多重化される。示されるように、２つのチャネルのそれぞれは、２つの回路基板のそれぞれの上の回路を共有するが、別個の光学部を有する。随意に、付加的なチャネルが、示される光学要素の複製のプロセスによって検出器ヘッドに組み込まれてもよい。
マイクロアッセイカートリッジ１４０２は、検出器ヘッド１３００に対して移動可能（両方向矢印）であり、検出器ヘッドまたはカートリッジトレイ、あるいは載置シャーシの動力化が、走査を可能にする。カートリッジ１４０２にわたる横断は、例えば、試料チャンバ１４０３ａおよび１４０３ｂ上で測定が行われることを可能にする。検出器ヘッドの中で並んで載置された複数の検出光学モジュールを使用することによって、試料チャンバを複数のフルオロフォアについて連続して走査することができる。
１つの実施形態によると、励起電子機器は、プリント回路基板（１３０１）上に載置され、検出電子機器は、第２のＰＣＢ（１３０２）上に載置される。縁コネクタ１３０４が、基板を電気的に接合する。ファラデー箱１３０６は、漂遊電磁雑音からセンサおよび関連高利得増幅器を保護する。鏡１４００は、熱伝達においても機能し、検定中に試料流体の温度を制御する、加熱ブロック１４１０の上面の上で加工される。例えば、ホストコントローラの制御下での温度および運動機能を伴うＦＲＥＴ融解判定のように、加熱ブロック１４１０の温度を走査中に傾斜させることができる一方で、自律プロセスで検出ヘッド内の組み込みプロセッサによって光学データが取得される。
図２５Ａおよび２５Ｂは、ここではフルオレセインおよびテキサスレッドによって図示される、標的および対照のための混合フルオロフォアの典型的なシステムの励起および放射スペクトルを示す。図２５Ａに示されるように、曲線２００１は、フルオレセインの励起スペクトル（鎖線）であり、曲線２００２は、放射スペクトル（実線）である。図２５Ｂに示されるように、曲線２００３は、テキサスレッドの励起スペクトル（鎖線）であり、曲線２００４は、対応する放射スペクトル（実線）である。ここで、対照は、チャネルＢ（図２５Ｂ）であり、標的は、チャネルＡ（図２５Ａ）であるが、割当は恣意的である。
ボックス領域ＥｘＡは、標的励起帯域通過フィルタ１３３３を通過することを可能にされる、波長帯域を示す。ボックスＥｍＡは、標的放射帯域通過フィルタ１３３５を通過することを可能にされる、放射通過帯域を示す。ボックスＥｘＢは、対照励起帯域通過フィルタ１３１３を通過することを可能にされる、波長帯域を示す。ボックスＥｍＢは、対照放射帯域通過フィルタ１３１５を通過することを可能にされる、放射通過帯域を示す。ボックスは、最大値の両側の阻止帯域の存在を示す。図２５Ａおよび２５Ｂから、これら２つのフルオロフォアのスペクトル、および示されるように構成される通過帯域特性を有する光学フィルタを考慮すると、以下のエラー状態が補正されることが分かる。ａ）ＬＥＤ励起フィルタ１３３３によって断絶されている、これらの長い波長により、標的ＬＥＤ １３３１からの長波長励起光（ＬＥＤピーク励起の波長より大きい）を標的蛍光放射と誤って混同することができない。ｂ）ＬＥＤ励起フィルタ１３１３によって断絶されている、これらの長い波長により、対照ＬＥＤ１３１１からの長波長励起光（ＬＥＤピーク励起の波長より大きい）を対照蛍光放射と誤って混同することができない。ｃ）標的蛍光放射を（励起フィルタにかけられた）対照ＬＥＤ１３１１によって不注意にトリガすることができない。このエラー状態は、別様に、標的および対照フルオロフォアから不要な同時信号を対照光センサ１３１７に受信させるであろう。ｄ）対照蛍光放射を（励起フィルタにかけられた）標的ＬＥＤ１３３１によって不注意にトリガすることができない。このエラー状態は、別様に、標的および対照フルオロフォアの両方から不要な同時信号を標的光センサ１３３７に受信させるであろう。
検定検証
意外にも、各チャネルが、励起光を照射するためのＬＥＤと、画定された通過帯域内でフルオロフォアからの放射の検出を可能にするように調節される、励起フィルタ、放射フィルタ、ダイクロイックミラーを有する少なくとも１つの光路と、該励起光を濃縮するため、および該放射を収集するための対物レンズと、任意の通過帯域放射を受け取るためのセンサと、センサからの出力を増幅するための高利得増幅器とを備えるように、自律検出器ヘッド機能は、個々のフルオロフォアの検出のための別個の光学チャネルを含有する、二重ヘッドおよびマルチヘッド検出器において多重化することができ、各ＬＥＤは、チャネルの照射周波数が重複しないような周波数範囲で光を照射するように構成され、各光学チャネルは、チャネルの放射通過帯域が重複しないように構成され、該複数のチャネルの該増幅器の出力は、検出器ヘッド内に組み込まれたマイクロプロセッサによって実行されるファームウェアに常駐する自律デーモンの制御下で、多重化してデジタル化され、揮発性メモリの中で一覧にされる。
検定検証のために、２つ（以上）のセンサチャネルが、２つ以上のフルオロフォアを監視するために提供され、２つのセンサチャネルは、各フルオロフォアからの放射通過帯域が重複しないように構成される。好ましい実施形態では、第１の検出チャネルは、標的信号を検出する目的のためであり、第２の検出チャネルは、対照信号を検出する目的のためのであり、検定結果は、有効な対照信号が報告される場合、かつその場合に限り、報告される。
このシステムは、「バイプレックス」または多重標的および対照信号の対合収集を要求とする、検定プロトコルの検証において有用であることが証明されている。ＦＤＡ ＣＬＩＡ放棄要件に関して、標的および対照テンプレートの両方が並行して増幅される場合、試験試料についての検定結果を報告または請求することができる前に、陽性対照信号が存在しなければならない。検出可能な対照信号が存在しない場合、検出される任意の標的信号は有効結果ではない。この要件が満たされる場合、１９８８年のＣｌｉｎｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ Ａｍｅｎｄｍｅｎｔｓ（ＣＬＩＡ）の下で、単純な低リスク試験を統制する規制を放棄することができ、医師の診察室および種々の他の場所で、監視を伴わずに試験を行うことができる。これらのＣＬＩＡ放棄要件を満たすために、蛍光検出器が、例えば、ＰＣＲによって増幅される標的感染性微生物の存在だけでなく、標的とともに共存し、同一のＰＣＲ反応、または機器において並行して行われるＰＣＲ反応によって増幅される、内因性ヒト対照有機体の存在も検出できる必要がある。
そのようなアプローチは、そのような分子診断検定に使用される蛍光検出器が、共通検出チャンバ中の「バイプレックス」増幅反応混合物として標的および対照フルオロフォアの両方の存在を判定する能力を有し得ることを要求する。１つの側面では、標的フルオロフォアの蛍光励起および放射スペクトルから選択的帯域通過フィルタによって（波長が）良好に分解されるように位置付けられる、蛍光励起および放射スペクトルを有する、陽性増幅対照フルオロフォアが使用される（例えば、図２５Ａ−２５Ｂ参照）。しかしながら、本発明によると、二重ヘッド検出器を使用することによって、および各ヘッドを用いて１回、各検出チャンバを２回走査し、最初に対照蛍光シグネチャ、次いで、標的試料蛍光シグネチャを検出することによって、優れた分解能を達成することが可能であることが証明され、各走査通過は、別個の励起および放射光学部を必要とする。完全に分離した独立光路を伴って、これらの検出器を構成することによって、利益が見出された。本発明の本側面では、二重ヘッド設計の使用は、試料中の増幅対照フルオロフォアの存在が、「クロストーク」により、標的チャネル中で信号を不注意に生成しないことを確実にする。そのような状況は、試料を「偽陽性」として分類させるであろう。逆に、複数の信号が共通共学経路を共有するときに起こり得る、標的チャネルから対照チャネルへのクロストークがないことも重要である。そのような状況は、陽性増幅対照が存在し得ないときに、存在していると不注意に見なし得る。
これらの原理は、標的のための分子プローブとしてのフルオレセインまたは同等フルオロフォア、および対照のための分子プローブとしてのテキサスレッドまたは同等フルオロフォアの使用によって例示される。それぞれ別個の励起および検出光学部を伴う、一方の検出チャネルがフルオレセインの検出のために最適化され、他方の検出チャネルがテキサスレッドのために最適化される、二重ヘッド検出器は、バイプレックス増幅混合物を分析するために驚くほど敏感で正確かつ堅調であることが分かった。別個の蛍光読取が、各光学チャネルについて常駐デーモンによって行われる。驚くべきことに、この手順は、分解能を向上させるとともに、クロストークを最小限化したが、検出器ヘッドを移動させる力学による、より高い雑音または感度の損失に寄与しなかった。
図２６Ａは、蛍光標的（この場合、分子診断検定からのマラリア核酸の存在を示す）が、マイクロ流体カートリッジ内に埋め込まれた検出チャンバ中に存在する場合において、検出器の標的チャネルによって受信される信号レベルのプロットである。この場合、トレースから、標的チャネルが９００ｍＶ範囲内で検出チャンバから蛍光信号を受信することが分かる。標的チャネルからのこの場合の「マラリア陽性」信号は、空の検出チャンバの「背景」信号レベルの約１４倍に等しい。トレースは、平滑であり、遮蔽検出器ヘッド内の増幅回路における低レベルの電子雑音を示す。
図２６Ｂは、蛍光標的（この場合、分子診断検定からのマラリアの存在を示す）が検出チャンバ中に存在する場合において、検出器の対照チャネルによって受信される信号レベルのプロットである。この場合、トレースから、標的信号のみを有し、対照フルオロフォアを有さない検出ウェルを走査するときに、標的光学チャネルと対照光学チャネルとの間のごくわずかなレベルのクロストークを示すように、対照チャネルが走査前基準に本質的に等しい４０〜５０ｍＶ範囲内の出力を有することが分かる。
図２６Ｃは、蛍光標的（マラリア、テキサスレッドフルオロフォア）および蛍光対照（内因性ヒト対照、フルオレセインフルオロフォア）が、マイクロ流体カートリッジ内に組み込まれた単一の検出チャンバ中で混合物としてともに増幅される場合において、検出器の標的光学チャネルによって受信される信号レベルのプロットである。この場合、上のトレースは、約６８０ｍＶの標的信号レベルが第１の光学チャネル中で受信されたことを示し、標的信号は、テキサスレッドでタグ付けされたマラリアアンプリコンと関連付けられる。これは、空の検出チャンバからの信号（下のトレース）の約１０．５倍のレベルと同等である。これは、検出器がバイプレックス試料の「マラリア陽性」成分の存在を識別することにおいて正しく機能することを示す。
図２６Ｄは、蛍光標的（マラリア）および蛍光対象（内因性ヒト対照）がマイクロ流体カートリッジ内に埋め込まれた検出チャンバ中でともに存在する場合において、検出器の第２の光学チャネルによって受信される信号レベルのプロットである。バイプレックス試料混合物は、図２６Ｃと同一であり、信号は、フルオレセインでタグ付けされた内因性対照アンプリコンと関連付けられ、標的アンプリコンからのクロストークがなく、良好な信号安定性、および電気雑音を含まないことを実証する。
この場合、トレースは、約１６０ｍＶの信号レベルが対照光学チャネルによって受信されたことを示す。これは、空の検出チャンバからの信号の約３．６倍のレベルと同等である。これは、別個の光学チャネル中のバイプレックス試料の「対照陽性」成分の存在を識別することに関して、検出器が正しく機能することを示す。したがって、標的アンプリコンおよび対照アンプリコンは、ＣＬＩＡ放棄要件による成功した「バイプレックス」検定を示すように、単一のウェル中で検出される。
励起は、白色光を用いて行われないが、代わりに、個別フルオロフォアに特有の波長で行われるため、第２のフルオロフォアの消光は問題ではない。本明細書で説明されるシステムは、臨床研究室の制御された環境外での確実な動作のために必要とされるような堅調な検定性能を達成するために、物理的方法および信号処理方法の組み合わせを使用する。
図２７は、蛍光励起を制御するため、および蛍光放射信号を受信し、処理し、ホスト機器にデジタルで伝達するために使用される、検出器ヘッド１３００電子機器および光学のブロック図である。光学チャネルは、再度、白い矢印ＡおよびＢによって識別され、センサ１８１７および１８３７で終端する。チャネルＡは、対照チャネルと見なされ、チャネルＢは、標的被分析物チャネルと見なされるが、役割は交換可能である。各チャネル中の電子機能ブロック、すなわち、ソース（１８１１、１８３１、および関連回路ブロック）およびセンサ（１８１７、１８３７、および関連回路ブロック）は、同一である（チャネルＡおよびＢが異なる波長のために構成されることを除いて）。
検出システムは、紫外線、可視領域、および近赤外線スペクトル内の波長のために構成することができる。近単色出力、フィルタ、発色団、およびフルオロフォアを有する、利用可能な光源は、３００〜９００ｎｍの範囲内の励起および放射通過帯域を同調させることを可能にする。本発明の好ましい動作モードのうちの１つである、蛍光検出モードでの用途については、本装置は、紫外線および可視スペクトル内の励起スペクトルを伴う特定の蛍光染料のために、ならびに紫外線、可視光、および近赤外線スペクトル内の放射のために構成することができる。赤方偏移がより典型的であるが、上方調節フルオロフォアも使用されてもよい。
検出器ヘッド１３００内では、ソース励起回路（１８１１、１８３１）と関連付けられるＬＥＤのそれぞれは、１３０Ｈｚの周波数で方形波によって変調される。この変調の理由は、以下の潜在的な雑音源、すなわち、１）５０／６０Ｈｚ ＡＣ主電源、２）蛍光からの１００／１２０Ｈｚの第２の主電源高調波、３）５０／６０Ｈｚ ＡＣの第３のより高い調波、４）１３０Ｈｚ以上の差分周波数（ランブル）、および５）フォトダイオードセンサ、第１段階フィードバック抵抗器、および増幅器からの広帯域白色雑音からの雑音低減対策に関係付けられる。雑音が多い信号源から有用な信号を取り出すために、以下の軽減方法、すなわち、１）エイリアシングを回避し、同時に雑音帯域幅を制限するための取り込まれたデータの高速サンプリングおよび平均化、２）全ての非相関成分を拒絶するための１３０ＨｚでのＬＥＤ光の変調および１３０Ｈｚでの検出された蛍光信号との相関（５０／６０Ｈｚ主電源からの少なくとも１０Ｈｚの差異、ならびに１００、１２０、１５０、および１８０Ｈｚ以上での高調波を提供するように、１３０Ｈｚ変調周波数が選択された）、および３）５０Ｈｚまたは６０Ｈｚのいずれか一方、あるいはそれらの高調波の主電源供給から電磁雑音を排除するための相関データのさらなるフィルタリングおよび処理が採用される。励起ＬＥＤは、ＦＡＮ５６１２ ＬＥＤドライバによって駆動される１３０Ｈｚ方形波を使用してオンおよびオフにされる。各ドライバは、必要周波数で電流を最大１２０ｍＡ（３つの出力のそれぞれで４０ｍＡ）まで減衰させることが可能である。検出器ヘッドマイクロプロセッサのクロック周波数は、励起ＬＥＤをストロボ動作させるため、およびセンサダイオードにおけるパルス収集を同期化するために使用される。これらの特徴は、特定の蛍光信号が存在しない場合にセンサから静出力を生成し、より高い増幅を可能にすることが分かった。
ソースＬＥＤのための回路基板１８０１は、複数のＬＥＤを支持することができ、センサ回路のための回路基板１８０２は、複数のフォトダイオードを支持することができる。励起および検出回路は、ピン接合点１８０４を通して任意の起こり得るクロストークをさらに低減させるように、別個の接地板上の別個のＰＣＢ基板（１８０１、１８０２）上でバイパスコンデンサを使用して、電子的に絶縁される。各フォトダイオードは、遮蔽され、多段高利得増幅器（１８１８、１８３８）と密接に関連付けられ、２つの回路基板は、別個の接地板を用いて電子的に絶縁される。検出器ヘッドでは、センサ光学部からの電気出力は、前置増幅器において調節され、３段増幅器の中へ供給される。増幅器からの３つの出力のそれぞれは、多重対数尺度利得を有し、最高増幅係数は最大で１０１４である。３つの出力は、組み込みマイクロプロセッサに組み込まれたＡ／Ｄ変換器の中へ供給され、１つのデジタル出力（ファームウェアによって選択される出力）は、デジタル化スコアとしてメモリにバスで送られる。
有利なことには、遮蔽検出ヘッド内のアナログおよびデジタル信号処理回路の単離は、最大で１０１４、選択された実施形態では、３段階で１０１２〜１０１４の非常に驚異的に高い利得係数を可能にする、低雑音状態を実現する。センサの隣で検出ヘッド内にデジタル化電子機器を局所化することによって、雑音干渉の驚異的な欠如とともに、高利得を有する増幅された信号を達成する。組み込みマイクロプロセッサ１８４１と関連付けられるＡ／Ｄ変換器においてデジタル化される、増幅された信号出力の最大安定性を確保するように、緩衝されてフィルタにかけられた基準電圧もオペアンプに供給され、したがって、デジタル化は、走査検出器ヘッド内で起こる。
上記はハードウェアの説明であるが、増幅器の電気光学部および検出器ヘッド内の信号処理アルゴリズムの実際の動作は、「仮想マシン」として機能する、ファームウェアでコード化される「ＯＤＡＰデーモン」によって行われる。デーモンは、本質的に、一式の命令であるが、組み込みマイクロプロセッサとデジタルで関連付けられる不揮発性メモリの中で検出器ヘッドに常駐し、いったん呼び出されると、ホストコントローラから独立して動作する。ファームウェア、すなわち、走査検出器ヘッドの信号取得および光電子機能を制御するための専用内蔵命令は、典型的には、ソケット付きＥＥＰＲＯＭチップ１８４２に常駐する。デーモンは、検出器ヘッド内の組み込みマイクロプロセッサ１８４１を制御する。増幅された信号のデジタル化の後に、デーモンは、さらなる信号処理、例えば、光学データを背景走査と比較すること、および／またはユーザに表示するためにデータをホストシステムに報告する前に、蛍光が陽性検定結果であるかどうかに関する複雑な判定を行うことが可能である。
驚くべきことに、我々は、検出器ヘッドがホストコントローラの外部制御下で移動させられている間に、ＯＤＡＰデーモンが試料領域の空間マップを構築することができるように、２つのプロセッサ、ホストコントローラ、および検出器ヘッド内の組み込みマイクロプロセッサを協調させることができることを見出した。ホストコントローラルーチンにおける検定の再プログラミングが、デーモンの制御下でのデータ取得および報告の動作に影響を及ぼさない、または影響を与えないように、例えば、ホストコントローラが検出チャンバ中の温度に融解／焼鈍サブルーチンを行っている間に、ＯＤＡＰ機能は、自律的に信号データを収集することを進め、これは、検定カートリッジから読み取られるバーコードに応じて、いくつかの検定プロトコルのうちのいずれかがホストコントローラによって行われ得る、顕著な利点である。
検出器ヘッドの内側の組み込みマイクロプロセッサ１８４１を使用することの１つの利点は、クリーンなデジタル化信号をホストコントローラに転送する前に雑音を排除するように、「光学データ取得および処理」（ＯＤＡＰ）の独自方法が、検出器ヘッド内のファームウェアにプログラムされ得ることである。したがって、ＯＤＡＰデーモンは、必要とされるときにホストプロセッサによって呼び出される、１つまたは複数の独立サブルーチンであるが、いったん開始されると、デーモンおよび関連光電子部は、組み込みファームウェアの独立制御下で自律的に作動する。実践では、検出器ヘッド内で分析全体を完了すること、および単純に概要スコアまたは検定結果をホスト機器に伝達することが可能であることが証明されている。アナログ信号と異なり、検出器ヘッドからホスト機器へのデジタル伝送は、機器筐体内で起こる雑音が多いアナログ策略によって引き起こされる干渉の影響を受けない。
現在実現されているように、ＯＤＡＰデーモンは、検出ヘッドがカートリッジにわたって直線的に走査されると、連続的かつ自律的に作動する。「デーモン」とは、本明細書では、対話ユーザの直接制御下で、またはホストコントローラによって実行されるよりもむしろ、自律背景プロセスとして組み込みマイクロプロセッサによって実行される、ファームウェアに記憶される光学データ取得および処理のためのプログラム可能命令セットの動作を指す。デーモンは、部分的に、ホスト動作と関連付けられる外部電子雑音から保護することができるように、検出器ヘッドの中で局所化される電子回路を操作して制御する、仮想マシンである。
したがって、本発明は、検定を、ホストコントローラによって制御される流体、電気化学、および熱プロセス、ならびに走査検出ヘッドに常駐する自律デーモンによって制御される光電子プロセスに動作可能に分割するステップを含む、マイクロアッセイを自動化するための方法を含み、走査検出ヘッドの運動は、ホストコントローラによって制御され、任意の光学信号取得および処理は、自律デーモンによって制御される。
例証および一例として、それぞれ液体試料を分析するための３つの検出チャンバが、検出ヘッドによって走査される光学ウィンドウの中に配置される。走査時間は、約３０秒であり、走査長は、約５００ステップに分割される。検出器は、１３０Ｈｚで動作しているが、デジタル化速度は、各走査中に蛍光の１２０００回〜２４０００回の測定が行われ得るように、より高い。センサダイオード出力は、非特異的フォトダイオード出力を排除するようにＬＥＤが１３０Ｈｚでストロボ動作させられると、暗半周期を明半周期から差し引くことができるように、記憶されて平均化される。データセットは、１００ミリ秒インクリメントにおいて内蔵ファームウェアの制御下でさらに処理される。したがって、検出ヘッド内のローカルメモリの中で一覧にされるデジタル化スコアは、１００ミリ秒にわたって取得される処理信号から成り、ステッパモータの特性および走査長に応じて、線形走査における１つまたはいくつかのみのステップに対応する。したがって、信号に対応する「スポットサイズ」は、極めて小さいが、高解像度デジタル画素ほど細かくない。各デジタルスコアは、ＬＥＤオフ時間間隔中の任意の周囲信号を差し引いた、ＬＥＤオン時間間隔中に蓄積される全ての増幅電流に対応する値を有する。
デーモンは、ステッパモータ作動を追跡するように同期化され、光学ウィンドウの幅にわたる走査距離（位置）と対比した蛍光出力スコアの表を蓄積する。検定に先立って基線走査を行うことによって、次いで、検定反応と関連付けられる染料、色原体、またはフルオロフォアに起因する任意の「新しい」信号（すなわち、基準と比べた任意の変化）が定量化される。背景減算が完了した後、閾値もまた、所望であれば、基準と比べた信号変化をさらにフィルタにかけるために使用されてもよい。
データサンプリング、フィルタリング、デジタル平滑化、および調節は、ハードウェアおよびファームウェア手段の組み合わせによって達成されてもよく、ファームウェアは、デーモン命令セットを参照する。試料ウェルにわたる走査中に取得されるデジタルスコアのプログラム可能な統計分析は、パラメトリックまたは非パラメトリックであり得る。各試料ウェルに特有の各データセットから、走査横断にわたるスコアの分布は、ウェルにわたって得られる平均値、中央値、またはモード値よりも良好な検定真理値（標的被分析物または対照に対する「陽性」または「陰性」）の予測因子である。多くの点を有する分布関数に基づく結果もまた、低分解能でウェルを調査することによって得られる、光学的平均信号より優れている。平均値が誤陰性につながり得る一方で、我々は、たとえウェルの特定の一部に局所化されたとしても、高信号スパイクのパターンが陽性検定に対応する可能性が極めて高いことを見出した。ファームウェアは、デジタルスコアの強度および信号スパイクの周波数を査定し、陽性対陰性検定結果の期待範囲と相関させるように構成される。データセットは、例えば、強度に従ってランク付けられる、３０の測定値の人口が、変動の統計的分析に従った帰無仮説に従って期待される分布と比較される、人口統計と見なされてもよい。非パラメトリックにデータを査定するための統計的ツールも適用可能であり、ファームウェアで符号化されてもよい。したがって、好ましい実施形態では、検出ヘッドの内蔵能力は、被分析物が検出されたか、または真あるいは偽であるかどうかに対応する、デジタル「１」または「０」としての検定結果、また、対応する対照の状態を出力することを包含する。驚くべきことに、我々は、概して、組み込みファームウェアを伴うデーモンの制御下で、１ビットデジタルスコアへの変換によって、気泡および他の不規則性によるデータセットの異常を管理できることを見出した。
組み込みマイクロプロセッサへの入力は、いくつかの標的被分析物および対照が同時に分析され得るように多重化される。検出器ヘッドは、離散波長で動作する独立励起光学部および放射光学部をそれぞれ有する、少なくとも２つ以上の光学チャネルを提供される。白色励起光は、標的フルオロフォアおよび内部対照フルオロフォアが共通液体試料中で混合させられるとき等に、多重化検定において異なるフルオロフォア間の起こり得るクロストークを排除するために使用されない。陽性対照信号のための条件を証明する必要性からの標的および対照結果のための「１スポット」条件の使用は、各試料ウェル中に存在する（誤陰性を回避する）。しかし、標的および対照チャネル光学部を分離することによって、無効対照結果による誤陽性試験または試験拒否につながり得る、クロストークが排除された。
比較のために、ホストコントローラ１８００は、結果の表示を含む、オペレータインターフェースに、ならびにカートリッジ上検定および検出器ヘッド走査を行うために必要とされる機械および空気圧機能の動作に関与する。ホストコントローラ内の別個のクロックが、走査中にステッパモータを駆動するために使用される。検出器ヘッド位置を走査中に取得される蛍光信号と相関させるために、ステッパモータ活動が検出器ヘッド内のファームウェアによって監視される。
ウェル位置認識は、走査検出器ヘッド内の組み込みデーモンの制御下で操作される、「縁検出」プロセスによって達成される。第１の場合において、一対の機械スイッチが、組み込みコントローラにデジタルで通信するリード線を伴う検出器ヘッドの下面の上に載置される。空のカートリッジの第１の走査では、検出器ヘッドは、ステッパモータのホスト機器制御下でそのレールに沿って滑動し、第１の機械スイッチがレールとともに機器シャーシに形成された戻り止めによって始動されるとき、次いで、電子信号がデーモンに送信される。デーモンは、その活動を開始するようにプログラムされ、ホスト機器からステッパモータデータを捕捉し、カートリッジの光学ウィンドウにわたってｘ軸横断をマップするためにこのデータを使用し始め、モータの各ステップは、基準点ｘ０からの任意の距離ｘｉについて（ｘｉ＝ｘ０＋（ｎｉ））であるように、ステッパモータによって画定される位置および距離インクリメントｎに対応する。デーモンはまた、第１の走査中に光学出力を記憶する。したがって、デーモンは、位置ｘ０および強度Ｉ０データペアを一覧にし、ステッパモータが検出器ヘッドを前進させるにつれて、ｘｉをインクリメントし続ける。試料ウェルと関連付けられるカートリッジ光学部の不連続性により、ｘ横断に沿ったカートリッジの光学走査は、ウェル縁検出のために有用である信号をもたらす。これらの信号は、正の傾斜がピーク条件ｄｘ／ｄｔ＝０によって負の傾斜から分離されるピークによって、または検出ヘッドがウェルの近い側の縁にわたって横断する際の基準光学出力の突然の段階変化（降下または上昇）によって特徴付けられる。閾値を横断した場合には、ウェルの中への入力と関連付けられる縁効果が、線形マップまたはｘ横断上のｘ座標（モータステップ数）を有するウェル開始位置として、デーモンによって採点される。検出器ヘッドが剛性ガイドウェイ上に載置されるため、ｘ横断経路を逆転させることができ、走査ヘッドは、同一の始点ｘ０からウェルにわたる後続の走査において、その経路を正確に再び辿ることができる。このようにして、機械戻り止めがウェル縁に対して始動された、レール上の位置からのマッピングプロセスによって、確定された物理的距離が確立される。同様に、ウェルの遠い側の縁が識別される。次いで、近い側の縁の位置と遠い側の縁の位置との間の空のウェルの背景光学示度値が、処理され、代表的な背景信号として記憶される。このプロセスは、全てのウェルについて繰り返され、検出器ヘッド内の各光学チャネルについて再度繰り返される。適切なオフセットを用いると、ｘ横断が単一の走査中に各光学チャネルについて収集されるように、機械スイッチが１つより多くのチャネルに使用されてもよい。同様に、走査ヘッドが光学ウィンドウに沿って走査すると、複数のウェルが１度に１つ走査されてもよい。
次いで、検出器ヘッドは、その静置位置に戻り、コマンドに応じて、ウェルを充填する試料と関連付けられる光学出力の任意の変化を検出するであろう走査を開始する。デーモンは、メモリ内の事前に定義された縁位置に従って検出ウェルからデータを収集し、ウェルの内容物と関連付けられる蛍光（または他の光学信号）の変化を評価するように計算を行う。これらのデータは、デーモンによって操作される信号処理アルゴリズムによってさらに処理される。試料の導入後のウェルのそれぞれの中の蛍光の変化または変化の欠如は、検定設計に応じて、対照信号の存在および／または標的被分析物信号の存在あるいは非存在を示し得る。
縁検出は、当技術分野で公知である三角フィルタまたは他の信号フィルタ等のフィルタを含んでもよい。カートリッジウェルの縁と関連付けられる基準は、当技術分野で公知であるように、ウェルの周囲に堆積させられるか、またはレイアウトされる着色層、光学散乱をもたらす物理的な縁、自己蛍光を有するカセット材料等を含んでもよい。したがって、マッピングルーチンは、代替として、初期基準点が光学的、電気的、または機械的に確立されるように、カートリッジ本体または試料ウェルと関連付けられる基準にインデックス化されてもよい。初期位置ｘ０および関連強度Ｉ０の一式のデータペアが記録される。後続のデータペア（ｘｉ，Ｉｉ）は、ｎがステッパモータのステップの数であり、ｉがステップ距離である、段階的な（ｘｉ＝ｘ０＋（ｎｉ））をウェルマッピングが進めるにつれて収集される。アルゴリズムが、試料ウェル縁の特性を示す信号変化を検出するために使用され、これらは、操作横断における１つ以上の試料ウェルがインデックス化されるようにインデックス化される。したがって、事前走査が行われてもよく、デジタル化基準光学信号データが収集されてもよい。次いで、試料ウェルは、目的とする被分析物を含有する液体が溢れ、第２の走査が行われ、２つの走査の間の差異は、目的とする標的被分析物および／または対照被分析物を表す。信号処理およびデジタル化、ならびに後続の分析は、検出器ヘッド内の自律デーモンの制御下で行われる。
図２８Ａおよび２８Ｂは、未加工入力およびデジタル化出力の表現の表現であり、デーモンによる気泡干渉のデジタル除去のための方法を明示する。図２８Ａでは、増幅後のフォトダイオードからの出力（１９００）が表される。雑音のレベルは、概して低いが、信号は、例証のために、検出チャンバ中の２つの小さい気泡の存在により、１９０１および１９０２で劣化する（１５０１、図２９参照）。デーモンは、閾値を出力信号に適用し、信号が閾値を上回る場合は信号を「高」（すなわち、１）、信号が閾値を下回る場合は「低」（すなわち、０）と採点する。放射光学部およびフィルタと合致したフルオロフォアの存在下を除いて、いかなる信号出力も閾値を上回ることができないため、任意の陽性信号（１９０３）が、フルオロフォアの存在に対する陽性検定である。検定における臨床試料の経験に基づいて、閾値コンパレータを調整することができる。したがって、走査画像データの「１ビット」デジタル変換は、気泡から任意の干渉を除去する。我々は、驚くべきことに、フルオロフォアが存在するが、複数の気泡がチャンバを充填するとき、気泡の周囲で、または気泡を通して屈折させられる光が、陽性信号をもたらすであろうことを見出した。したがって、本システムは、感染症に対する診断検定で必要とされるように、定量的試験のために非常にエラーに耐性があり、かつ堅調である。信号コンパレータは、検出器ヘッドに組み込まれたマイクロプロセッサおよびファームウェアのデジタル機能であり、ホストコントローラ機能から独立している。
ホストコントローラ機能
再度、図２７を参照すると、ホストコントローラ１８００は、デーモンを作動させることに関与するが、その動作を制御しない。デーモンの動作中に、ホストシステムは、温度および空気圧制御、検出器ヘッド走査、ユーザインターフェース操作性、および故障監視等の種々の検定機能を果たすようにマルチタスクを行う。
いくつかある機能の中でもとりわけ、ホストコントローラは、マイクロアッセイカートリッジ内の弁およびダイヤフラムポンプ、試料の熱循環と関連付けられる任意の抵抗またはペルチェ型加熱要素を含む、検定を行うために必要とされる空気圧論理およびパルス列ルーチンを制御するためのシステムハードウェアを作動させ、随意に、融解中に抵抗加熱要素および冷却中に送風機を作動させることによって、検出チャンバ中で融解曲線を実施してもよい（図２２）。ホストコントローラと連動する光学構成要素は、挿入可能マイクロアッセイカートリッジ上に印刷された情報を感知するためのバーコード読取機を含む。
ホストコントローラは、不揮発性メモリと、検定プロセスのステップを協調させるため、および組み込みデーモンからの信号、結果、または他のデータを、ユーザに利用可能となるであろう形態の機械可読またはグラフィック表示可能レポートに変換してフォーマットするためのプログラム可能命令とを提供される。試験データを表示するためのグラフィカルユーザインターフェース１８２０は、本明細書で示されるような検出システムに組み込むことができ、またはネットワーク、イントラネット、あるいはインターネットの一部として、データラインまたは無線インターフェースを通してそれに接続することができる。概して、シリアル非同期通信インターフェースが、機器マザーボード上または外部ネットワーク上のホストコントローラとの通信のために提供される。
同様に、結果、データ、エラーコード、状態更新等は、ＵＳＢ、ＲＳ２３２、またはＦｉｒｅＷｉｒｅ等の共通電子インターフェースおよびデータラインを介して、ならびにＩＲ伝送、Ｂｌｕｅｔｏｏｔｈ（登録商標）、ＧＳＭ（登録商標）、ＧＰＲＳ、およびＲＳＩＤ等の無線伝送システムを介して、送信することができる。プログラミング、再プログラミング、較正、および再較正、ならびにデバイスのシステム診断は、ＵＳＢ、ＲＳ２３２、またはＦｉｒｅＷｉｒｅ等の共通電子インターフェースおよびデータラインを介して、ならびにＩＲ伝送、Ｂｌｕｅｔｏｏｔｈ（登録商標）、ＧＳＭ（登録商標）、ＧＰＲＳ、ＲＳＩＤ等の無線伝送システムを介して、可能である。
分断光学部
図２９Ａは、励起モードの平凸対物レンズ１５００の表現である。励起円錐１５０１が、カートリッジ検出チャンバ１４０３、および鏡面１４００を伴う加熱ブロック１４１０に対して示されている。収束励起円錐は、光源から対物レンズを照射する発散光線によって形成され、焦点位置距離Ｌ２’は、レンズの天然焦点距離Ｌ２より大きい。慣例により、レンズの背面焦点距離Ｌ２は、平行光を使用して判定される。焦点位置を偏移させることは、「分断」と称され、この場合、ソースレンズのより近くに光源を移動させることによって達成されたが、より一般的には、分断は、非平行光を使用することによって達成することができる。
レンズ１５００と鏡面１４００との間には、検出チャンバ１４０３を伴うマイクロアッセイカートリッジ２００が間置される。検出チャンバは、上部光学ウィンドウ１５０２および下部熱光学ウィンドウ１５０３によって境界される。動作中に、介在容積は、ここでは２つの混入気泡１５０５を伴って示される、液体試料によって占有される。焦点円錐は、鏡面から反射し、検出チャンバ中で光源の実像（１５１０、実線の光線）、および鏡面の下方で光源の虚像（１５１１、鎖線の光線）を形成することが分かる。したがって、背面焦点位置Ｌ２’は、概して、レンズと鏡との間の距離以上である。鏡に衝打する励起光は、検出チャンバの流体体積中で集束ビームとして反射され、したがって、試料を通る励起光の光路の長さを倍増し、励起蛍光収率を増加させる。背面焦点位置Ｌ２’は、レンズ１５００の背面焦点距離Ｌ２に等しくなく、２つは、概して、光源１５１２からの発散ビームでレンズを照射することによって分断される。
図２９Ｂは、放射収集モードの図２８の対物レンズの表現である。一次および反射蛍光放射（実像１５１０および虚像１５１１からの実線および鎖線）が示されている。再度、チャンバ１４０３中の気泡が示されている。対物レンズ１５００の平面的な裏面に衝打する光線は、平行にされ（１５２２）、検出器に伝送されるであろう。捕捉される蛍光信号の量は、レンズの開口角および開口数に依存する。レンズ１５００の天然背面焦点距離は、Ｌ２である。レンズの背面焦点位置は、図３０および３１に示されるように光源を再配置することによって、またはソースレンズの形状または屈折率を変化させることによって、レンズの天然焦点距離に対して（Ｌ２対Ｌ２’）操作または「分断」することができる。
図３０は、分断励起および放射光学部を伴う光学経路１７００の概略図である。この図では、励起光線は実線として示され、放射光線は鎖線として示されている。ここでは、光源１７０１は、示されるようなＬＥＤ、レンズ筐体および反射体リングがないＳＭＤ ＬＥＤ、ＳＬＥＤ、ポンピングレーザダイオード、リッジ導波管（ファブリペロー）レーザダイオード、同調可能レーザ等であってもよく、そのような照射源は、好ましくは、狭い帯域幅を有する。例えば、６３０ｎｍ（赤）、４７０ｎｍ（青）、５２５ｎｍ（緑）、６０１ｎｍ（橙）、５８８ｎｍ（黄）等でピーク放射を伴う、種々の狭い帯域幅のＬＥＤが利用可能である。白色光ＬＥＤが、所望であれば使用されてもよいが、概して、ＬＥＤ出力は、検定における標的のフルオロフォアと合致させられ、光学励起障壁フィルタ（図示せず）が、必要に応じて帯域通過をはっきりさせるために使用されてもよい。光源１７０１の光出力は、ここでは平凸レンズとして示されるソースレンズ１７０２によって伝送されるが、励起ビームが対物レンズ１７０５上に反射される、ダイクロイックミラー要素１７０４に衝打する前に、成形非球面レンズも使用されてもよい。マイクロアッセイカートリッジ１４０２中の試料流体体積１７２０に衝打する励起円錐が、実線で示されている。非従来的に、励起円錐の焦点は、ソースレンズ１７０２のより近くに光源１７０１を移動させること（すなわち、距離Ｌ１がレンズ１７０２の天然背面焦点距離であろう、距離Ｌ２’を増加させるために距離Ｌ１’を短縮すること）によって試料チャンバおよびバックミラー１４００を通り過ぎて投影されている。距離Ｌ１’が短縮されると、対物レンズに衝打するソース光線は、ソースレンズによって平行にされず、発散させられ、したがって、距離Ｌ２’を増加させる。対物レンズ１７０５の天然背面焦点距離は、Ｌ２であり、試料チャンバ中のフルオロフォアからの任意の放射、および鏡でフルオロフォアの虚像を形成する任意の反射放射が、対物レンズに入射するように、Ｌ２は、対物レンズの裏および鏡を分離する距離以下であり、すなわち、好ましくは、試料チャンバの平面内にある。放射円錐は、（鏡の後ろで集束させられる）励起光の焦点から分断される焦点を有する。焦点面Ｌ２内の蛍光放射、および焦点面内で生じる光の任意の虚像は、対物レンズによって効果的に平行にされ、ダイクロイックミラー１７０４、帯域通過フィルタ１７０６を通して効果的に伝送され、次いで、典型的には、ＰＣＢまたは固体支持体１７０９上に載置されるセンサ１７０８上にセンサレンズ１７０７によって集束させられる。レンズ１７０７は、概して、対物レンズ１７０５の背面焦点距離Ｌ２に等しい背面焦点距離Ｌ３を有する。しかしながら、例えば、フォトダイオードまたはＣＣＤチップであるセンサ１７０７の表面積をより良好に利用するため、より大型のレンズ１７０７が使用されてもよい。信号の最適化は、本明細書で概説される分断光学システムの原理に従って、各レンズの独立調整を必要とし得、従来技術の教示に反して、非平行励起光を使用し得る。
共通光軸上の対物レンズ１７０５から出現する励起光の円錐および対物レンズ１７０５に入射する放射光の円錐は、（それぞれ、焦点位置Ｌ２’対Ｌ２によって示される）異なる焦点で動作可能に分断される。距離が、励起光の実際の焦点面および対物レンズの天然焦点距離を分離する。対物レンズは、鏡および励起円錐１５０１の拡張焦点位置を使用して励起されるときに、蛍光放射の広い起源面内で光を捕捉するであろう。「分断」と称される、この現象は、バックミラーが使用されるときに蛍光放射の捕捉を増加させることが分かり、従来技術の共焦点アプローチを支持する以前の教示を否定する。
従来技術の教示は、励起および放射を共焦点にすることを強く支持するが、実際には、放射円錐から光源の焦点を分断すること、およびバックミラー１４００を使用することにおいて、今まで見られなかった利点がある。放射光は、試料カートリッジの全体を通して、より大きい領域および深度から生じ、したがって、小気泡、未混合領域、または消光プローブによるものであるようなデッドスポットまたは不均質性からの任意の信号の欠如を克服する。焦点で生じる励起に対するある選択性を犠牲にして、より優れた信頼性が達成されるが、励起に対する空間的選択性は、実際には検定デバイスでは望ましくない。これは、当技術分野での技術的進歩である。
要約すると、ある実施形態では、Ｌ２’は、Ｌ２およびＬ３より大きくあり得る。Ｌ１は、有利なことには、励起光の円錐が試料チャンバ１４０３の後ろ、最も好ましくは、バックミラー１４００の近く、またはその後ろに収まるように、構成されてもよい。好ましい実施形態では、励起円錐の焦点は、バックミラーの上または後ろに収まる。対物レンズは、概して、放射光が、センサレンズ１７０７からの放射光の対称円錐によって検出センサ上に投影するために効率的に収集されて平行にされるように、構成される（すなわち、Ｌ２＝Ｌ３）。
したがって、別の実施形態では、本発明の装置は、励起光学部および放射光学部が分断されるように構成されるレンズを採用する。この装置の第１の実施形態では、光源は、Ｌ１’＜Ｌ１である、ソースレンズからの距離Ｌ１’に位置付けられ、励起光学部および放射光学部は、Ｌ２’＞Ｌ２であるように、励起円錐を鏡面またはその後ろにある焦点位置Ｌ２’に遷移させることによって分断される。より一般的には、ソースレンズは、対物レンズに入射する光の発散ビームを形成するように構成され、それによって、焦点位置Ｌ２’に励起円錐を位置付け、Ｌ２’＞Ｌ２である。
有利に、Ｌ２は、検出器１７０８の動作が最適化され、堅調であるように、Ｌ３と対称を成すように構成される（すなわち、Ｌ２＝Ｌ３）。センサフォトダイオードは、好ましくは、分析法の有効性の損失を伴わずに、ある程度の不整列に適応するように、レンズ１７０５および１７０７の焦点の円錐に関して十分大きく構成される。
分断光学部の代替実施形態では、対物レンズの天然焦点および励起光の実際の焦点は、Ｌ２＞Ｌ２’であるような距離によって分離される。これは、レンズの天然背面焦点距離が超えられる（Ｌ１’＞Ｌ１）ように、光源１７０１がソースレンズ１７０２から離れて移動させられる、図３１で図示されている。そのような再配置の効果は、示されるように対物レンズ１７０５に接近するにつれて、ソースレンズから放射される光線を収束させることであり、最終的な効果は、Ｌ２’を短縮することである。光学ウィンドウ１５０２および１５０３の間の試料チャンバ１４０３の中央に直接的に励起円錐焦点位置を配置することによって、および鏡１４００を使用することによって、試料液体中のフルオロフォアの励起が達成される。しかし、この分断光学部の使用の場合、対物レンズはまた、試料チャンバにより近く移動させられ、レンズの天然背面焦点距離Ｌ２は、鏡の後ろに位置付けられる。これの効果は、レンズの見掛け開口角を増加させることであり、すなわち、フルオロフォアのより近くにレンズを移動させることによって、より多くの光が収集され、センサに方向転換される。以前のように、対物レンズからの平行出力は、センサ１７０８上に集束させられ、したがって、典型的には、Ｌ２はＬ３に等しくあり得る。したがって、分断の原理は、本発明の側面でもある鏡面熱光学インターフェースとともに使用されるときに、信号収集効率を最適化するために、非平行励起光を使用するための２つの相補的方法を包含することが、図３０および３１で示される。
分断は、陽性または陰性検定結果の区別が必要とされる検定だけでなく、例えば、熱帯熱マラリア原虫の場合はシゾントまたはメロゾイトコピーとして、あるレベルの定量が必要とされる検定でも有用である。１９５７年にその発明者Ｍｉｎｓｋｙ（米国特許第３０１３４６７号）によって明確に述べられたような共焦点光学部の元の目的は、励起円錐が任意の所与の時間に集束させられる検体の領域からの放射のみを監視しながら、検体にわたって、および検定を通して励起の焦点をラスタリングすること（ｚｙｘ軸ラスタリング）によって、厚い固体検体の３次元画像を作成することであったことを思い返されたい。対照的に、略均質である流体混合検体では、可能な限り最高の蛍光捕捉で検体の全体的蛍光を測定する反対の効果が所望される。複数の測定が検定の横断中に行われるシステムでは、気泡によって引き起こされるような干渉を克服するために、統計的方法を使用することができ、強い陽性信号は、それが試料チャンバ中で生じる場所にかかわらず、陽性検定結果を示す可能性が高い。したがって、問題を再公式化することによって、我々は、時折の干渉の存在下で蛍光検出がより敏感かつより堅調であるという満足な結果を伴って、励起および放射の焦点面の分断とともに、バックミラーを伴う新規の光学システムを設計することが可能となっている。
図３２Ａは、鏡の上方の対物レンズの高度を変動させることによって蛍光信号出力の増進を実証する、実験結果を描写する。簡潔には、蛍光ビーズ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、部品番号Ｇ０３００、 Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇ ＰＡ）が、マイクロアッセイ検出チャンバに挿入され、検出チャンバが、検出器の対物レンズ３１５の下に載置された。次いで、デジタルマイクロメータを使用して、マイクロアッセイカートリッジの上方の検出器ヘッドの高度が、プロットを構築するように変動させられた。第２の対合実験では、鏡面が除去された。実線（２１００）は、加熱ブロックの鏡の存在下でレンズ高度を変動させることの効果を示し、鎖線（２１０１）は、バックミラーが存在しない場合にレンズ高度を変動させることの効果を示す。示されるように、鏡の存在は、鏡面の後ろの最適発光極大（すなわち、レンズで捕捉される実際および仮想の蛍光放射の複合物）を偏移させると考えられる。
図３２Ｂは、バックミラーを伴う（２１０３）、および伴わない（２１０２）、出力信号強度を示す棒グラフである。出力信号は、図２９Ａに示されるように鏡の後ろの焦点で励起ビームを集束させること、および図２９Ｂおよび３０に示されるようにより短い作業距離で放射を収集することによって最適化されることが分かった。
第２の実験では、検出チャンバは、可溶性フルオロフォアを含有し、消光アーチファクトを回避するように一定の速度でチャンバを通して送出される、液体試料で充填される。次いで、検出器ヘッド高度が以前のように変動させられ、最適な検出器高度が判定される。関連実験では、ソースレンズからの光源の作業距離もまた、検出の感度および限界を最適化するために変動させられる。我々は、対物レンズが検出チャンバ中で中心に置かれ、他のレンズが共焦点にされるときに、最適な構成が達成されないことを習得した。鏡が使用されるとき、分断光学部は、有利な結果を達成し、当技術分野での技術的進歩である。
図３３Ａは、アンプリコンに交雑される分子ビーコンについて収集された走査データを示す。走査軸は、それぞれ、陽性および陰性試験条件を表す検出ウェル（２２００、２２０１）を横断し、信号が検出ウェルに限定されることが分かる。試料は、検出または試料チャンバ中の温度が系統的に変動させられるにつれて反復して走査される。走査は、データの空間分解能を例証するようにプロットで重ね合わせられている。３５℃、６５℃、７０℃、７５℃、および８０℃試験条件に対する蛍光走査が印付けられている。４０、４５、５０、５５、および６０℃での試験プロット、ならびに８５および９０℃のプロットは、期待通りに良好に区別されず、個別に印付けられていない。蛍光信号は温度の関数であることが分かる。蛍光消光は、２本鎖プローブ・標的が融解させられるにつれて増加することが観察され、すなわち、信号は、３５℃で最大であり、８０℃で本質的に存在しない。図３３Ｂでは、データが、陽性（２３０１、実線）および陰性（２３０２、鎖線）試験条件に対する信号対温度について描画されている。図３３Ｃでは、約７０℃のＦＲＥＴ融解温度を示す、一次導関数が描画されている。
実施例
本実施例では、本発明の装置は、血液等のヒト試料中の病原体の核酸の検出による、感染症の診断において有用であることが示されている。内蔵乾燥および液体試薬を使用して、血液試料が処理され、熱帯熱マラリア原虫と関連付けられるＤＮＡが約３０分以下で検出される。試料から精製されるＤＮＡは、同一出願人による、米国特許第７５４４５０６号、第７７６３４５３号、および第７９５５８３６号で説明されるように、二重温度ゾーンを伴う２つのチャンバを使用してＰＣＲを受ける。次いで、増幅標的に指向された、ＦＡＭ蛍光でタグ付けされた分子ビーコンを使用して、アンプリコンが検出される。随意に、多重化増幅を伴って、カリフォルニアレッドでタグ付けされたリボヌクレアーゼＰ白血球エクソン配列から成る対照が、検定の妥当性を立証するために使用される。本発明の熱光学インターフェースを使用して取得される代表的な熱融解曲線が、図３３Ｂに示されている。
本発明の装置は、凝血障害の診断において有用である。内蔵乾燥および液体試薬を使用して、ＡＮＳＮが、染料とペプチドとの間のアミド結合が開裂されるときに光を発する、フルオロフォア６−アミノ−１−ナフタレン−スルホンアミドである、（Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ＡＮＳＮＨ−シクロヘキシル−２ＨＣｌ、Ｆ．Ｗ．＝７７７．８１、 Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｅｓｓｅｘ Ｊｕｎｃｔｉｏｎ ＶＴ）等の蛍光発生基質を用いて血漿を培養することによって、血液試料が凝固因子ＶＩＩａ欠乏症について分析される。組織因子（ＴＦ）が、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ（ＬａＪｏｌｌａ ＣＡ）から入手され、使用前にホスファチジルコリンまたはホスファチジルセリン媒介物に組み込まれる。ＴＦは、過度に使用される。５ｎＭ ＴＦとともに、ｐＨ７．４、０．１５Ｍ ＮａＣｌの２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ緩衝剤から成り、２０ｕＭ ＥＤＴＡを含有する、１００ｕＬ基質反応混合物が、活性酵素複合体を形成するように血漿試料を用いて１０分間培養される。次いで、ＡＮＳＨ基質が添加される。基質の加水分解の速度は、因子ＶＩＩａの通常の範囲にわたって直線的であり、標準曲線から判定することができる。検定開発の説明は、米国特許出願公開第２００９／０３２５２０３号および他の実験文献で見出され得る。
上記は、本発明のある実施形態の説明であるが、種々の代替案、修正、および均等物を使用することが可能である。したがって、本発明の範囲は、上記の説明を参照して判定されるべきでないが、代わりに、均等物の全範囲とともに添付の請求項を参照して判定されるべきである。添付の請求項は、そのような制限が「するための手段」という語句を使用して所与の請求項で明示的に記載されない限り、手段および機能の制限を含むものとして解釈されるものではない。
米国特許出願第６１／７４５，３２９号を含むが、それに限定されない、本明細書で参照される、および／または付随出願データシートで引用される、米国特許、米国特許出願公開、米国特許出願、外国特許、外国特許出願、および非特許出版物の全ては、それらの全体で参照することにより本明細書に組み込まれる。さらなる実施形態を提供するために種々の特許、出願、および出版物の概念を採用することが必要である場合、実施形態の側面を修正することができる。

Claims (73)

  1. 試料において光学信号を検出するためのマイクロアッセイシステムであって、前記システムは、前記試料にわたって検出器ヘッドを走査するために有効にされる機械システムを備え、前記検出器ヘッドは、少なくとも１つの検出チャネルを備え、前記検出チャネルは、対物レンズと、前記対物レンズによって受信される光学信号を捕捉して増幅するように構成される光電子回路要素とを備え、前記機械システムは、前記検出器ヘッドの外部のコントローラおよび回路によって操作され、前記光電子要素は、前記検出器ヘッド内に組み込まれたマイクロプロセッサと関連付けられるファームウェアに常駐する自律デーモンの制御下にある、マイクロアッセイシステム。
  2. 前記光電子回路要素は、前記外部回路から電子的に絶縁している動作のために構成される、請求項１に記載のマイクロアッセイシステム。
  3. 前記光電子要素は、前記デーモンの制御下の信号処理または信号デジタル化のために構成される、請求項１または２のいずれか１項に記載のマイクロアッセイシステム。
  4. 前記検出器ヘッドは、デジタル形態で前記信号を前記外部コントローラに伝送することを可能にさせられる少なくとも１つのデジタル伝送機を備える、請求項１〜３のいずれか１項に記載のマイクロアッセイシステム。
  5. 前記検出器ヘッドは、前記外部コントローラの制御下で前記試料にわたって走査を行うことを可能にさせられ、前記検出器ヘッド内の前記デーモンは、前記走査中に捕捉される任意の光学信号のマップを自律的に構築するように構成され、前記マップは、少なくとも１つの基準点に対する場所の関数として、信号強度を表すデータペアを有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載のマイクロアッセイシステム。
  6. 前記検出器ヘッドは、カートリッジ本体にわたる画定された経路上で試料ウェルを走査するように構成され、前記少なくとも１つの基準点は、前記カートリッジ本体の位置合わせ特徴と関連付けられる前記画定された経路上の空間座標である、請求項５に記載のマイクロアッセイシステム。
  7. 前記位置合わせ特徴は、前記マップの前記基準点を初期化するように、機械、電気、または光学スイッチをトリガする、請求項６に記載のマイクロアッセイシステム。
  8. 前記試料ウェルの場所は、前記画定された経路に沿った前記基準点からの距離として判定され、光学信号の第１の変化が検出され、前記光学信号の第１の変化は、空の試料ウェルの第１の縁と相関し、光学信号の第２の変化が検出され、前記第２の変化は、前記自律デーモンの制御下で空の試料ウェルの第２の縁と相関する、請求項５に記載のマイクロアッセイシステム。
  9. 前記カートリッジ本体にわたる前記走査は、前記試料ウェル中の試料を用いて繰り返され、前記第１の縁と前記第２の縁との間の前記マップ座標と関連付けられる光学信号の変化は、前記自律デーモンの制御下で検定結果を示す信号の変化について分析される、請求項８に記載のマイクロアッセイシステム。
  10. 前記信号の変化は、前記自律デーモンの制御下でデジタル化信号を生成するように、デジタル化に先立って電子調節および増幅を受ける、請求項９に記載のマイクロアッセイシステム。
  11. 前記信号の変化は、デジタル化に先立って閾値減算を受ける、請求項９に記載のマイクロアッセイシステム。
  12. 前記信号の変化は、単一ビットデジタル化を受ける、請求項９に記載のマイクロアッセイシステム。
  13. 前記デジタル化信号は、前記ウェルにわたる前記走査中に一連のデータペアとしてレジスタに蓄積され、前記走査のための信号の総和は、前記外部コントローラに報告される、請求項１０に記載のマイクロアッセイシステム。
  14. 前記デジタル信号は、前記外部コントローラに報告される、請求項１０に記載のマイクロアッセイシステム。
  15. 前記検出器ヘッドは、カートリッジ本体にわたる画定された経路上で試料ウェルを走査するように構成され、前記少なくとも１つの基準点は、前記試料ウェルの位置合わせ特徴と関連付けられる前記画定された経路上の空間座標である、請求項５に記載のマイクロアッセイシステム。
  16. 前記デーモンは、試料ウェルの第１の縁と関連付けられる光学信号の変化を検出することによって、前記マップ上の前記基準点を取得するように構成され、前記試料ウェルの場所は、前記画定された経路に沿った前記基準点から光学信号の第２の変化が検出される点までの距離として判定され、前記第２の変化は、空の試料ウェルの第２の縁と相関する、請求項１５に記載のマイクロアッセイシステム。
  17. 前記カートリッジ本体にわたる前記走査は、前記試料ウェル中の試料を用いて繰り返され、前記第１の縁と前記第２の縁との間の前記マップ座標と関連付けられる光学信号の変化は、前記自律デーモンの制御下で検定結果を示す信号の変化について分析される、請求項８に記載のマイクロアッセイシステム。
  18. 前記信号の変化は、前記自律デーモンの制御下でデジタル化信号を生成するように、デジタル化に先立って電子調節および増幅を受ける、請求項１７に記載のマイクロアッセイシステム。
  19. 前記信号の変化は、デジタル化に先立って閾値減算を受ける、請求項１７に記載のマイクロアッセイシステム。
  20. 前記信号の変化は、単一ビットデジタル化を受ける、請求項１７に記載のマイクロアッセイシステム。
  21. 前記デジタル化信号は、前記ウェルにわたる前記走査中に一連のデータペアとしてレジスタに蓄積され、前記走査のための信号の総和は、前記外部コントローラに報告される、請求項１８に記載のマイクロアッセイシステム。
  22. 前記デジタル信号は、前記外部コントローラに報告される、請求項１８に記載のマイクロアッセイシステム。
  23. 前記位置合わせ特徴は、自己蛍光を有する縁であり、前記縁は、前記試料ウェルを境界する、請求項１５に記載のマイクロアッセイシステム。
  24. 前記光学信号は、蛍光信号であり、前記検出器チャネルは、励起光で前記混合物を照射するためのＬＥＤと、画定された通過帯域内でフルオロフォアからの放射の検出を可能にするように調節される励起フィルタ、放射フィルタ、ダイクロイックミラーを有する光路と、前記励起光を濃縮するため、および前記放射を収集するための前記対物レンズと、前記通過帯域放射を受け取るためのセンサレンズを伴うセンサと、前記センサからの出力を増幅するための遮蔽前置増幅器および多段増幅器回路とを備える、請求項１〜２３のいずれか１項に記載のマイクロアッセイシステム。
  25. 前記増幅器は、３段増幅器であり、前記増幅器は、ファラデー箱、バイパスコンデンサ、信号調節前置増幅器、別個の接地板、金属化検出器ヘッド筐体、またはそれらの組み合わせによって電子雑音から遮蔽され、前記増幅器は、前記センサに電気的に近接している、請求項２４に記載のマイクロアッセイシステム。
  26. 前記３段増幅器は、最大１０１４の利得を有する、請求項２５に記載のマイクロアッセイシステム。
  27. 前記３段増幅器は、１０１２〜１０１４の利得を有する、請求項２５に記載のマイクロアッセイシステム。
  28. 前記対物レンズは、フルオロフォアの混合物を有する液体試料に前記励起光を集束させるために構成され、前記励起光は、前記試料ウェルより小さいスポットに集束させられる、請求項２５に記載のマイクロアッセイシステム。
  29. 前記検出器ヘッドは、複数の検出器チャネルを備え、各前記検出器チャネルは、励起光で前記試料ウェルを照射するためのソースＬＥＤと、画定された通過帯域内でフルオロフォアからの放射の検出を可能にするように調節される励起フィルタ、放射フィルタ、ダイクロイックミラーを有する光路と、前記励起光を濃縮するため、および前記放射を収集するための前記対物レンズと、前記通過帯域放射を受け取るためのセンサレンズを伴うセンサと、前記センサからの出力を増幅するための遮蔽前置増幅器および多段増幅器回路とを備え、前記デーモンは、２つのソースＬＥＤが同時にオンではないような周波数で各前記ソースＬＥＤをストロボ動作させるため、および対応するＬＥＤがオンであるか、またはオフであるかに従って、前記複数の検出器チャネルの各チャネルからの前記信号を多重化分析するために構成される、請求項２８に記載のマイクロアッセイシステム。
  30. 各前記ＬＥＤは、１３０Ｈｚの周波数でオンおよびオフにされる、請求項２９に記載のマイクロアッセイシステム。
  31. 前記対物レンズは、フルオロフォアの混合物を含有する液体試料に励起光を集束させるために構成される、請求項３０に記載のマイクロアッセイシステム。
  32. 前記デーモンは、前記検出器ヘッド内の揮発性メモリの中でデジタル化増幅器出力および走査位置を一覧にするように構成される、請求項２９に記載のマイクロアッセイシステム。
  33. 前記デーモンは、前記試料ウェルの基線走査を、前記混合物を含有する前記試料ウェルの走査と比較し、少なくとも１つのフルオロフォア特有の放射の検出と関連付けられる検出事象を示す差異を報告するための命令を備える、請求項２９に記載のマイクロアッセイシステム。
  34. 前記デーモンは、前記検出事象を前記ホストコントローラにデジタルで報告することを可能にさせられる、請求項３３に記載のマイクロアッセイシステム。
  35. 前記システムは、グラフィカルユーザインターフェースと、前記外部コントローラの制御下で前記検出事象を表示するための不揮発性メモリ内のプログラム可能命令とを備える、請求項２９に記載のマイクロアッセイシステム。
  36. 前記システムは、入出力ポートと、前記外部コントローラの制御下で前記検出事象を遠隔デバイスに伝達するための不揮発性メモリ内のプログラム可能命令とを備える、請求項２９に記載のマイクロアッセイシステム。
  37. 前記フルオロフォアの混合物は、標的被分析物を検出するための第１のフルオロフォアと、対照被分析物を検出するための第２のフルオロフォアとを含み、さらに、前記標的被分析物および前記対照被分析物は、前記混合物中にともに存在する、請求項２９に記載のマイクロアッセイシステム。
  38. 前記センサは、フォトダイオードである、請求項１〜３７のいずれか１項に記載のマイクロアッセイシステム。
  39. 前記対物レンズによって受け取られる前記照射光は、それを通した遷移のための発散ビーム、収束ビーム、または平行ビームとして形成される、請求項２４に記載のマイクロアッセイシステム。
  40. マイクロアッセイを自動化するための方法であって、前記方法は、前記マイクロアッセイシステムを、ホストコントローラによって制御される流体電気機械および熱プロセス、および走査検出ヘッドに常駐する自律デーモンによって制御される光電子プロセスに動作可能に分割するステップを含み、試料にわたる前記走査検出ヘッドの運動は、前記ホストコントローラによって制御され、前記試料において生成される信号の任意の光学信号取得、事前調節、増幅、およびデジタル化は、前記自律デーモンによって制御される、方法。
  41. マイクロアッセイを行うための装置であって、前記装置は、ホストコントローラによって制御される流体電気機械および熱プロセス、および走査検出ヘッドに常駐する自律デーモンによって制御される光電子プロセスに動作可能に分割される検定システムを備え、試料にわたる前記走査検出ヘッドの運動は、前記ホストコントローラによって制御され、走査中に前記試料から収集される１つ以上の信号の任意の光学信号取得、事前調節、増幅、およびデジタル化は、前記自律デーモンによって制御される、装置。
  42. 前記デーモンは、複数の光学チャネルを通して前記１つ以上の信号を多重化収集することを可能にさせられる、請求項４１に記載の装置。
  43. 前記デーモンは、前記走査中に前記信号を調節してデジタル化することを可能にさせられ、位置または時間の関数として単一のビットデータを記録する、請求項４２に記載の装置。
  44. 前記デーモンは、前記複数の光学チャネルからのデジタル化光学信号を調節して統計的に評価すること、および前記試料における対照信号の検出による前記走査の検証後に検出事象を報告することを可能にさせられる、請求項４３に記載の装置。
  45. 前記デーモンは、前記検出事象を外部デバイスに報告することを可能にさせられる、請求項４４に記載の装置。
  46. 前記複数の光学チャネルは、標的被分析物を検出するための第１のフルオロフォアと、対照被分析物を検出するための第２のフルオロフォアとを含む、複数のフルオロフォアを検出するために構成され、さらに、前記標的被分析物および前記対照被分析物は、前記試料中にともに存在する、請求項４５に記載の装置。
  47. 試料検定を行うためのマイクロアッセイカートリッジであって、前記カートリッジは、
    ａ）その中に封入された液圧回路を有する第１の回路カードであって、前記第１の回路カードの前記液圧回路は、第１の試料処理ステップを行うように構成される、第１の回路カードと、
    ｂ）その中に封入された液圧回路を有する第２の回路カードであって、前記第１の回路カードの前記液圧回路は、第２の試料分析ステップを形成するように構成される、第２の回路カードと、
    ｃ）前記第１の回路カード内の前記液圧回路と前記第２の回路カード内の前記液圧回路との間の少なくとも１つの流体接合点と、
    ｄ）空気圧インターフェースを画定する空気圧ポートのアレイであって、各ポートは、それに印加される空気圧パルスを受け取るためのものであり、少なくとも１つの前記ポートは、前記第２の回路カード内の空気圧回路を前記第１の回路カード内の空気圧回路に流体的に接合するビアを有し、前記第１の回路カード内の前記空気圧回路は、その中の前記液圧回路を操作するためのものであり、前記第２のカード内の前記空気圧回路は、その中の前記液圧回路を操作するためのものである、空気圧ポートのアレイと
    を備え、
    前記カートリッジは、前記第１のビアにおいて前記空気圧インターフェースに印加される空気圧パルスが、前記流体接合点を通して前記外部回路カードから前記内蔵回路カードへ前記処理された試料を押勢するように有効にされる、
    マイクロアッセイカートリッジ。
  48. 前記アレイは、複数の空気圧ポートが、プログラム可能命令に従って印加される複数の空気圧パルスを受け取ること、およびこれらの空気圧パルスを前記第１の回路カードおよび前記第２の回路カードの流体回路要素に多重送信することを可能にさせられ、それによって、前記第１および前記第２の液圧回路を操作するために必要とされるポートの数を削減するように、前記第１の回路カード内の空気圧回路を前記第２の回路カード内の空気圧回路に流体的に接合するビアによって流体的に接続される前記複数の空気圧ポートを備える、請求項４７に記載のマイクロアッセイカートリッジ。
  49. 前記空気圧インターフェースは、より強い空気圧を用いて動作する回路要素へのより強い空気圧パルス、および前記第１の回路カードおよび前記第２の回路カード内のより弱い空気圧を用いて動作する回路要素へのより弱い空気圧パルスの多重化分配を可能にするように構成される、請求項４８に記載のマイクロアッセイカートリッジ。
  50. 前記空気圧インターフェースは、正の空気圧を用いて動作する回路要素への陽圧空気圧パルス、および真空空気圧を用いて動作する回路要素への真空圧空気圧パルスの多重化分配を可能にするように構成される、請求項４８に記載のマイクロアッセイカートリッジ。
  51. 前記空気圧インターフェースをホスト機器に接合するように構成される単回使用密閉ガスケットを備える、請求項４７〜５０のいずれか１項に記載のマイクロアッセイカートリッジ。
  52. 前記カートリッジは、空気圧状態を前記空気圧回路に印加することによって制御されるために構成され、前記空気圧状態は、一連の陽圧および陰圧から選択される、請求項４７〜５１のいずれか１項に記載のマイクロ流体カートリッジ。
  53. 前記空気圧状態は、約−５ｐｓｉ、＋１０ｐｓｉ、＋１２ｐｓｉ、＋２０ｐｓｉ、＋７ｐｓｉ、および０ｐｓｉから選択される、請求項５２に記載のマイクロ流体カートリッジ。
  54. 前記第１のカードの少なくとも１つの空気圧回路および前記第２のカードの少なくとも１つの空気圧回路は、前記空気圧インターフェースポートアレイの共通ポートに接続され、前記第１のカード内の前記少なくとも１つの空気圧回路は、前記第１のカードが前記試料を受け取るときに前記試料に作用し、前記第２のカードの前記少なくとも１つの空気圧回路は、前記試料が前記第１のカードから前記第２のカードへ移送された後に前記試料に作用する、請求項５２に記載のマイクロ流体カートリッジ。
  55. 前記第１のカードは、試料から核酸抽出物を抽出するように構成され、前記第２のカードは、標的被分析物について前記核酸抽出物を分析するように構成される、請求項５４に記載のマイクロ流体カートリッジ。
  56. 試料検定を行うためのマイクロアッセイ装置であって、
    ａ）ホスト機器とドッキングするために構成される使い捨てマイクロアッセイカートリッジであって、前記カートリッジは、その中に配置された少なくとも１つの液圧回路を有し、前記少なくとも１つの液圧回路は、それに界面接触させられた少なくとも１つの空気圧回路の制御下で動作するように構成される、カートリッジと、
    ｂ）空気圧インターフェースポートアレイを画定する１つ以上の空気圧ポートのアレイであって、各ポートは、前記ホスト機器から空気圧回路に空気圧状態を伝えることを可能にさせられる、アレイと、
    ｃ）前記ホスト機器内に配置される少なくとも１つのマニホールドであって、前記マニホールドは、それに流体的に連結される複数の空気圧源を有し、第１の圧力源は、検定順序で第１の時間間隔において前記マニホールド内の第１の圧力状態を定義するように操作され、第２の圧力源は、前記検定順序で第２の時間間隔において前記マニホールド内の第２の圧力状態を定義するように操作され、前記マニホールドは、前記空気圧インターフェースポートアレイのポートを通して前記空気圧回路に流体的に接続される、マニホールドと、
    ｄ）前記少なくとも１つの液圧回路を空気圧で制御するための命令であって、前記命令は、１つ以上のメモリ要素を有するマイクロプロセッサの制御下で実行され、前記命令は、前記検定順序に従って前記第１の圧力源および前記第２の圧力源を作動させるためのステップを含む、命令と
    を備える、マイクロアッセイ装置。
  57. 前記カートリッジは、それに界面接触させられた複数の空気圧回路の制御下で動作するように構成される少なくとも１つの液圧回路を備え、前記空気圧インターフェースポートアレイは、前記少なくとも１つのマニホールドへの流体接続を有し、前記少なくとも１つのマニホールドは、複数の圧力状態で操作されるように構成される、請求項５６に記載のマイクロアッセイ装置。
  58. 前記少なくとも１つの液圧回路は、複数の空気圧回路によって伝えられる圧力状態の空気圧制御下で操作されるように構成され、前記空気圧回路のうちの少なくとも１つは、複数の圧力状態を有する、請求項５７に記載のマイクロアッセイ装置。
  59. 前記カートリッジの前記空気圧インターフェースポートアレイを前記ホスト機器に接合するように構成される単回使用密閉ガスケットを備える、請求項５６〜５８のいずれか１項に記載のマイクロアッセイ装置。
  60. マイクロアッセイカートリッジを取り外し可能に受け取るためのホスト機器であって、前記機器は、
    ａ）支持ベースプレートと、
    ｂ）マイクロアッセイカートリッジを受け取るためのドッキングベイであって、前記ドッキングベイは、前記ベースプレート上に載置される、ドッキングベイと、
    ｃ）前記ベースプレート内に配置される空気圧制御マニホールドであって、前記マニホールドは、前記ドッキングベイ内でその上に配置された空気圧インターフェースポートアレイを有する、空気圧制御マニホールドと、
    ｄ）前記ドッキングベイ内で前記ベースプレートに取り付けられる、ばねマウントを伴い、かつ前記カートリッジの下面と界面接触するために寸法決定される上面を伴う、少なくとも１つの加熱部材を備えるヒータアセンブリと
    を備え、
    前記ドッキングベイは、前記空気圧インターフェースポートアレイの上方の第１の位置から、前記カートリッジが前記空気圧インターフェースポートアレイと動作可能に係合させられる第２の位置へ、前記ドッキングベイ内の前記カートリッジを再配置するように構成される締め付け機構を備え、さらに、前記ばねマウントは、前記加熱部材の前記上面に前記第２の位置における前記マイクロ流体カートリッジの下面を押し付けるように構成される、
    ホスト機器。
  61. 前記ばねマウントは、前記カートリッジおよび前記加熱部材に可逆的に接触する熱伝達表面にわたって約１ｐｓｉのばね力を及ぼす、請求項６０に記載の装置。
  62. 締め付け機構を伴う前記ドッキングベイは、同時に、前記ベースプレートの前記空気圧インターフェースポートアレイを前記マイクロアッセイカートリッジの噛合ポートと係合させるように、および少なくとも１つのばね載置加熱部材に前記カートリッジを押し付けるように構成される、請求項６０〜６１のいずれか１項に記載のホスト機器。
  63. 前記ホスト機器は、前記加熱部材に対して前記ドッキングベイの中で締め付けられている間に、前記空気圧制御マニホールドを介して前記マイクロアッセイカートリッジの動作を空気圧で制御するために構成される、請求項６０〜６２のいずれか１項に記載のホスト機器。
  64. 前記締め付け機構は、前記カートリッジが前記ドッキングベイから除去され得るように、前記ベースプレートの前記空気圧インターフェースポートアレイおよび前記カートリッジを係脱するために構成される、請求項６０〜６３のいずれか１項に記載のホスト機器。
  65. 前記カートリッジは、前記カートリッジを前記ドッキングベイの前記空気圧インターフェースポートアレイに密閉して接合するように構成される単回使用ガスケットを備える、請求項６４に記載のホスト機器。
  66. 前記加熱部材は、電解研磨およびクロムめっきされる、請求項６０〜６５のいずれか１項に記載のホスト機器。
  67. 前記加熱部材は、抵抗加熱される、請求項６０〜６６のいずれか１項に記載のホスト機器。
  68. 前記加熱部材上に配置される冷却部材から熱を対流的に放散するための第１のファンをさらに備える、請求項６０〜６６のいずれか１項に記載のホスト機器。
  69. 前記マイクロアッセイカートリッジ内に配置される試料ウェルを対流的に冷却するための第２のファンをさらに備える、請求項６０〜６７のいずれか１項に記載のホスト機器。
  70. 前記第２のファンは、前記試料が蛍光監視されている間に前記試料ウェルを冷却することによって熱焼鈍機能を果たすために構成される、請求項６９に記載のホスト機器。
  71. 病原性条件と関連付けられる標的蛍光信号、および前記試料の内因性非病原性成分と関連付けられる対照蛍光信号について、試料を同時検定するための方法であって、
    ａ）請求項１に記載の検出器ヘッドを用いて試料ウェルを走査するステップであって、前記標的蛍光信号は、存在する場合、前記検出器ヘッドの第１の光学チャネルの中で検出され、前記対照蛍光信号は、存在する場合、前記検出器ヘッドの第２の光学チャネルの中で検出される、ステップと、
    ｂ）前記第２の蛍光信号が検出される場合、かつその場合に限り、前記検定の有効結果を報告するステップと
    を含む、方法。
  72. ＦＲＥＴ融解曲線判定を行うための方法であって、
    ａ）ＦＲＥＴプローブおよび標的核酸配列を含有する試料チャンバを、前記二重プローブの融解温度を上回る温度まで加熱するステップと、
    ｂ）前記加熱をオフにするステップと、
    ｃ）ファンをオンにし、周囲空気流を前記試料チャンバ上に指向することによって引き起こされる前記試料チャンバの温度の変化に応答して、請求項１に記載の検出器ヘッドを使用して前記ＦＲＥＴプローブの蛍光の変化を監視し、それによって、蛍光を監視しながら前記試料チャンバを急速に冷却するステップと
    を含む、方法。
  73. 前記融解曲線は、１分未満に完成させられる、請求項７２に記載の方法。
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