JP2017018061A

JP2017018061A - 形質転換体の製造方法

Info

Publication number: JP2017018061A
Application number: JP2015140526A
Authority: JP
Inventors: 三宅　英雄; Hideo Miyake; 英雄三宅; 昌子岡田; Masako Okada
Original assignee: Mie University NUC
Current assignee: Mie University NUC
Priority date: 2015-07-14
Filing date: 2015-07-14
Publication date: 2017-01-26

Abstract

【課題】クロストリジウムセルロボランスの形質転換体の製造方法、及び該製造方法により製造されたクロストリジウムセルロボランスの形質転換体の提供。
【解決手段】クロストリジウムセルロボランスの増殖を抑制し得る抗生物質を選択し、該抗生物質の耐性遺伝子を含むプラスミドを作製する。該プラスミドをクロストリジウムセルロボランスに導入する工程を経ることにより、クロストリジウムセルロボランスの形質転換体を製造する方法。
【選択図】なし

Description

本発明はクロストリジウムセルロボランス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｃｅｌｌｕｌｏｖｏｒａｎｓ）の形質転換体、およびその製造方法に関する。

クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属）にはクロストリジウムアセトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）やクロストリジウムベイジェリンキ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ）のように、ブタノール、アセトン、エタノール等のソルベントを生産するブタノール生産性クロストリジウム属が存在する。また、クロストリジウムセルロボランスやクロストリジウムサーモセラム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ）のように、セルロソームと呼ばれる超タンパク質複合体を形成し、リグノセルロースを分解することのできるセルロソーム生産性クロストリジウム属も存在する。

クロストリジウムセルロボランスは稲わらなどのソフトバイオマスを直接分解することができる微生物であり、近年、ゲノム解析やバイオマス分解に関与する糖質分解酵素の諸性質の解析が行われてきた（特許文献１、非特許文献１、２、参照）。
クロストリジウムセルロボランスの主な代謝産物はギ酸、酢酸、酪酸、乳酸等の有機酸であり、既存の技術において、乳酸からポリ乳酸等の石油系プラスチックに近い特性を持つ化成品の原料を作製することが可能である。
また、クロストリジウムセルロボランスは再生可能なセルロース系バイオマスから直接乳酸を生産できるが、生産量が少なく遺伝子改変による生産量増大が期待されている。

近年、次世代型の遺伝子改変方法として脚光を浴びているゲノム編集は、細胞種や生物種を問わず、ゲノム情報を自在に書き換えることのできる技術として急速に広がっている。中でも、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼを用いた第３世代のゲノム編集ツールであるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９（ｃｌｕｓｔｅｒｅｄｒｅｇｕｌａｒｌｙｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄｓｈｏｒｔｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃｒｅｐｅａｔｓ／ＣＲＩＳＰＲ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎ９）の開発により、ゲノム編集の敷居は格段に低くなった（非特許文献３、参照）。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９は元来真正細菌や古細菌が有する外来ＤＮＡの排除機構であるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの一部をゲノム編集に応用したものである。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを用いた遺伝子編集の研究はＨｕｍａｎ細胞やマウス細胞にはじまり、コオロギや小型魚類に至るまで、幅広く報告されている（非特許文献４、５、参照）。元来排除機構として持っている細菌類についても、近年いくつかの細菌についてはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムの利用が報告されている。

目的遺伝子の遺伝子改変を行うためには宿主となる菌に遺伝子を導入する手法、すなわち形質転換法が必要である。クロストリジウム属で初めに形質転換方法を確立したのはブタノール生産菌であるクロストリジウムアセトブチリカムであり、Ｏｕｌｔｒａｍらによってクロストリジウムアセトブチリカムのホスト−ベクター系である大腸菌−クロストリジウムアセトブチリカム（Ｅ．ｃｏｌｉ−Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）のシャトルベクターが作製された（非特許文献６、参照）。
その後クロストリジウムアセトブチリカムにセルロース分解能力を付与させるために、クロストリジウムセルロボランス由来のエンドβ−１，４−Ｄ−グルカナーゼの発現をさせることがＫｉｍらによって行われた（非特許文献７、参照）。また、Ｍｉｎｔｏｎらのグループは、ＣｌｏｓＴｒｏｎというベクターを開発し、クロストリジウムアセトブチリカムをはじめ、いくつかのクロストリジウム属の微生物において、形質転換が可能となった（非特許文献８、参照）。

同じブタノール生産菌であるクロストリジウムベイジェリンキではＬｏｐｅｚ−Ｃｏｎｔｒｅｒａｓらによってクロストリジウムアセトブチリカムと同種のシャトルベクターを用いて、クロストリジウムベイジェリンキにカビ由来のセルラーゼを形質転換させることに成功している（非特許文献９、参照）。さらにＢｌａｓｃｈｅｋのグループでは、クロストリジウムベイジェリンキにおいて、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムによるゲノム編集を成功させている（非特許文献１０、参照）。

一方で、セルロソーム生産性クロストリジウム属では、クロストリジウムサーモセラムにおいてＬｙｎｄらによってホスト−ベクター系の作製が行われ、形質転換方法が確立されている（非特許文献１１、参照）。その後、その形質転換方法を応用しＴｒｉｐａｔｈｉらによってクロストリジウムサーモセラムの標的遺伝子の破壊が報告された（非特許文献１２、参照）。これらの経緯から、セルロソーム生産性クロストリジウム属においても形質転換方法の確立によって遺伝改変を行うことが期待できる。

なお、特許文献２においても、クロストリジウムアセトブチリカム等のブタノール生産性クロストリジウム属や、クロストリジウムサーモセラム等のセルロソーム生産性クロストリジウム属のいずれをも対象として、ＤＮＡ配列を置換する方法として、クロストリジウム菌で複製可能な複製起点と標的ＤＮＡ配列のまわりの選択された領域と相同な２つの配列に挟まれた第１のマーカー遺伝子を含んでなる置換カセット、および第２のマーカー遺伝子を含むベクターで形質転換する方法等も開示されている。

しかし、これらの従来の技術においてはクロストリジウムセルロボランスを形質転換することについて報告されておらず、クロストリジウムセルロボランスの形質転換を目的とするホスト−ベクター系も確立していない。そこで、本願発明者らは、クロストリジウムセルロボランスのホスト−ベクター系の構築と形質転換方法の確立を試みた。

国際公開第２０１０／５３３６３号パンフレット特許第５２３３７５号

Ｔａｍａｒｕ，Ｙ．，Ｍｉｙａｋｅ，Ｈ．，Ｋｕｒｏｄａ，Ｋ．，Ｎａｋａｎｉｓｈｉ，Ａ．，Ｋａｗａｄｅ，Ｙ．，Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｋ．，Ｕｅｍｕｒａ，Ｍ．，Ｆｕｊｉｔａ，Ｙ．，Ｄｏｉ，Ｒ．Ｈ．，Ｕｅｄａ，Ｍ． "Ｇｅｎｏｍｅｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆｔｈｅｃｅｌｌｕｌｏｓｏｍｅ−ｐｒｏｄｕｃｉｎｇｍｅｓｏｐｈｉｌｉｃｏｒｇａｎｉｓｍＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｃｅｌｌｕｌｏｖｏｒａｎｓ７４３Ｂ．" Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１９２（３），９０１−９０２．（２０１０）Ｔａｍａｒｕ，Ｙ．，Ｍｉｙａｋｅ，Ｈ．，Ｋｕｒｏｄａ，Ｋ．，Ｕｅｄａ，Ｍ．，Ｄｏｉ，Ｒ．Ｈ． "Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅｇｅｎｏｍｉｃｓｏｆｔｈｅｍｅｓｏｐｈｉｌｉｃｃｅｌｌｕｌｏｓｏｍｅ−ｐｒｏｄｕｃｉｎｇＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｃｅｌｌｕｌｏｖｏｒａｎｓａｎｄｉｔｓａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｔｏｂｉｏｆｕｅｌｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｖｉａｃｏｎｓｏｌｉｄａｔｅｄｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ．" Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．，３１（８−９），８８９−９０３．（２０１０）Ｌｅ，Ｃ．，Ｆ．Ａｎｎ，Ｒ．，Ｄａｖｉｄ，Ｃ．，Ｓｈｕａｉｌｉａｎｇ，Ｌ．，ａｎｄＦｅｎｇ，Ｚ． "ＭｕｌｔｉｐｌｅｘＧｅｎｏｍｅＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇＵｓｉｎｇＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓＳｙｓｔｅｍｓ．" Ｓｃｉｅｎｃｅ３３９，８１９−８２３．（２０１３）Ｆｕｊｉｈａｒａ，Ｙ．，ａｎｄＩｋａｗａ，Ｍ． "ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９−ＢａｓｅｄＧｅｎｏｍｅＥｄｉｔｉｎｇｉｎＭｉｃｅｂｙＳｉｎｇｌｅＰｌａｓｍｉｄＩｎｊｅｃｔｉｏｎ．" ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ５４６，３１９−３３６．（２０１４）Ａｎｓａｉ，Ｓ．，ａｎｄＫｉｎｏｓｈｉｔａ，Ｍ． "ＴａｒｇｅｔｅｄｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓｕｓｉｎｇＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓｓｙｓｔｅｍｉｎｍｅｄａｋａ．" Ｂｉｏｌｏｇｉｓｔｓ３，３６２−３７１．（２０１４）Ｏｕｌｔｒａｍ，Ｊ．，Ｌｏｕｇｈｌｉｎ，Ｍ．，Ｓｗｉｎｆｉｅｌｄ，Ｔ−Ｊ．，Ｂｒｅｈｍ，Ｊ．Ｋ．，Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｄ．Ｅ．，Ｍｉｎｔｏｎ，Ｎ．Ｐ． "ＩｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆｐｌａｓｍｉｄｓｉｎｔｏｗｈｏｌｅｃｅｌｌｓｏｆＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍｂｙｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ．" ＦＥＭＳＭｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔｅｒｓ５６，８３−８８．（１９９８）Ｋｉｍ，Ａ．Ｙ．，Ａｔｔｗｏｏｄ，Ｇ．Ｔ．，Ｈｏｌｔ，Ｓ．Ｍ．，Ｗｈｉｔｅ，Ｂ．Ａ．，Ｂｌａｓｃｈｅｋ，Ｈ．Ｐ． "Ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｅｎｄｏ−β−１，４−Ｄ−ｇｌｕｃａｎａｓｅｆｒｏｍＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｃｅｌｌｕｌｏｖｏｒａｎｓｉｎＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍＡＴＣＣ８２４ｆｏｌｌｏｗｉｎｇｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｅｎｇＢｇｅｎｅ．" ＡｐｐｌＥｎｖｉｒｏｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌ６０，３３７−３４０．（１９９３）Ｈｅａｐ，Ｊ．Ｔ．，Ｐｅｎｎｉｎｇｔｏｎ，Ｏ．Ｊ．，Ｃａｒｔｍａｎ，Ｓ．Ｔ．，ａｎｄＭｉｎｔｏｎ，Ｎ．Ｐ． "ＡｍｏｄｕｌａｒｓｙｓｔｅｍｆｏｒＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｓｈｕｔｔｌｅｐｌａｓｍｉｄｓ．" ＪＭｉｃｒｏｂｉｏｌＭｅｔｈｏｄｓ．７８（１）７９−８５．（２００９）Ｌｏｐｅｚ−Ｃｏｎｔｒｅｒａｓ，Ａ．Ｍ．，Ｓｍｉｄｔ，Ｈ．，ｖａｎｄｅｒＯｏｓｔ，Ｊ．，Ｃｌａａｓｓｅｎ，Ｐ．Ａ．，Ｍｏｏｉｂｒｏｅｋ，Ｈ．，ａｎｄｄｅＶｏｓ，Ｗ．Ｍ． "ＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉｃｅｌｌｓｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇＮｅｏｃａｌｌｉｍａｓｔｉｘｐａｔｒｉｃｉａｒｕｍｇｌｙｃｏｓｉｄｅｈｙｄｒｏｌａｓｅｓｓｈｏｗｅｎｈａｎｃｅｄｌｉｃｈｅｎａｎｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎａｎｄｓｏｌｖｅｎｔｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．" ＡｐｐｌＥｎｖｉｒｏｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌ６７，５１２７−５１３３．（２００１）Ｗａｎｇ，Ｙ．，ＺｈａｎｇＺ．Ｔ．，Ｓｅｏ，Ｓ．Ｏ．，Ｃｈｏｉ，Ｋ．，Ｌｕ，Ｔ．，Ｊｉｎ，Ｙ．Ｓ．，ａｎｄＢｌａｓｃｈｅｋ，Ｈ．Ｐ． "ＭａｒｋｅｒｌｅｓｓｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌｇｅｎｅｄｅｌｅｔｉｏｎｉｎＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉｕｓｉｎｇＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ｓｙｓｔｅｍ．" ＪＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００１−５．（２０１５）Ｔｙｕｒｉｎ，Ｍ．Ｖ．，Ｄｅｓａｉ，Ｓ．Ｇ．，Ｌｙｎｄ，Ｌ．Ｒ． "ＥｌｅｃｔｒｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ．" ＡｐｐｌＥｎｖｉｒｏｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌ７０，８８３−８９０．（２００４）Ｔｒｉｐａｔｈｉ，Ｓ．Ａ．，Ｏｌｓｏｎ，Ｄ．Ｇ．，Ａｒｇｙｒｏｓ，Ｄ．Ａ．，Ｍｉｌｌｅｒ，Ｂ．Ｂ．，Ｂａｒｒｅｔｔ，Ｔ．Ｆ．，Ｍｕｒｐｈｙ，Ｄ．Ｍ．，ＭｃＣｏｏｌ，Ｊ．Ｄ．，Ｗａｒｎｅｒ，Ａ．Ｋ．，Ｒａｉｇａｒｈｉａ，Ｖ．Ｂ．，Ｌｙｎｄ，Ｌ．Ｒ．，Ｈｏｇｓｅｔｔ，Ｄ．Ａ．，Ｃａｉａｚｚａ，Ｎ．Ｃ． "ＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆｐｙｒＦ−ｂａｓｅｄｇｅｎｅｔｉｃｓｙｓｔｅｍｆｏｒｔａｒｇｅｔｅｄｇｅｎｅｄｅｌｅｔｉｏｎｉｎＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍａｎｄｃｒｅａｔｉｏｎｏｆａｐｔａｍｕｔａｎｔ．" ＡｐｐｌＥｎｖｉｒｏｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌ７６，６５９１−６５９９．（２０１０）

本発明は、クロストリジウムセルロボランスの形質転換体の製造方法、および該製造方法により製造されたクロストリジウムセルロボランスの形質転換体の提供を課題とする。

本発明者らは、上記課題の解決を目的として鋭意検討を行い、様々な抗生物質の中からクロストリジウムセルロボランスの増殖を抑制し得る抗生物質を選択し、該抗生物質の耐性遺伝子を含むプラスミドを作製した。そして、該プラスミドをクロストリジウムセルロボランスに導入する工程を経ることにより、クロストリジウムセルロボランスの形質転換体を製造できることを見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は、次の（１）〜（６）に示される、クロストリジウムセルロボランスの形質転換体を製造する方法等に関する。
（１）クロストリジウムセルロボランスの増殖を抑制し得る抗生物質の耐性遺伝子を含むプラスミドをクロストリジウムセルロボランスに導入する工程を含む、クロストリジウムセルロボランスの形質転換体を製造する方法。
（２）クロストリジウムセルロボランスの増殖を抑制し得る抗生物質が、クロラムフェニコール、スペクチノマイシンまたはチアンフェニコールから選ばれるいずれか一種以上である上記（１）に記載の方法。
（３）クロストリジウムセルロボランスの増殖を抑制し得る抗生物質の耐性遺伝子がクロストリジウム属由来である上記（１）または（２）に記載の方法。
（４）クロストリジウムセルロボランスの増殖を抑制し得る抗生物質の耐性遺伝子が配列表配列番号１に示されるクロラムフェニコール耐性遺伝子である上記（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。
（５）上記（１）〜（４）のいずれかに記載の方法によって製造されるクロストリジウムセルロボランスの形質転換体。
（６）クロストリジウムセルロボランスの形質転換用であるクロストリジウムセルロボランスの増殖を抑制し得る抗生物質の耐性遺伝子を含むプラスミド。

本発明により、クロストリジウムセルロボランスの形質転換体を製造することが可能となった。クロストリジウムセルロボランスは、セルロース系バイオマスを直接糖化できることから、本発明により、クロストリジウムセルロボランスに目的とする遺伝子を導入することによって代謝関連酵素の改変等を行うことが可能となる。これによって、バイオ燃料や化成品の原料として有用なブタノールやコハク酸などの化合物をセルロース系バイオマスから直接製造することも可能となる。

クロラムフェニコール添加培地におけるクロストリジウムセルロボランスの増殖の状態を示した図である（実施例１）。クロストリジウムセルロボランス用プラスミドｐＭＴＬ５００Ｃの概要を示した図である（実施例１）。クロラムフェニコール添加培地におけるクロストリジウムセルロボランスの形質転換体のコロニーの検出を確認した図である（実施例１）。クロストリジムセルロボランスの形質転換体における、クロラムフェニコール耐性遺伝子の検出を確認した図である（実施例１）。

本発明の「クロストリジウムセルロボランスの形質転換体を製造する方法」とは、クロストリジウムセルロボランスに外来遺伝子等を導入することにより、クロストリジウムセルロボランスの形質転換を行い、その形質転換体を得る方法のことをいう。
この方法は、クロストリジウムセルロボランスの増殖を抑制し得る抗生物質の耐性遺伝子を含むプラスミドをクロストリジウムセルロボランスに導入する工程を含むことを必須とする。本発明の「クロストリジウムセルロボランスの形質転換体を製造する方法」は、この工程とともに、例えば、目的とする遺伝子を該プラスミドに導入し、その上でこのプラスミドをクロストリジウムセルロボランスに導入する工程等、クロストリジウムセルロボランスの形質転換体の製造にあたり有用な他の方法を含むものであっても良い。

ここで、「クロストリジウムセルロボランスの増殖を抑制し得る抗生物質」とは、これらの抗生物質が存在しない成育環境と比較して、これらの抗生物質が存在する成育環境におけるクロストリジウムセルロボランスの増殖が抑制される作用を示す抗生物質のことをいう。
このような抗生物質として、クロラムフェニコール、スペクチノマイシンまたはチアンフェニコール等が挙げられる。これらのいずれか一種以上、または２つ以上を組み合わせて、本発明の抗生物質としても良い。

これらの抗生物質の耐性遺伝子は、クロストリジウムセルロボランスの形質転換体の選択マーカーとして使用し得るものであれば、従来知られているいずれの塩基配列からなる耐性遺伝子であっても良いが、クロストリジウム属由来の耐性遺伝子であることが好ましい。
例えば、クロラムフェニコールの耐性遺伝子であれば、クロストリジウムパーフリンゲンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）由来のクロラムフェニコール耐性遺伝子であって、配列表配列番号１に示されるもの等を用いることが好ましい。

本発明の「クロストリジウムセルロボランスの増殖を抑制し得る抗生物質の耐性遺伝子を含むプラスミド」は、上述のような抗生物質の耐性遺伝子が、クロストリジウムセルロボランスの形質転換に有用な発現ベクターに組み込まれたプラスミドのことをいう。このような発現ベクターには、従来知られているいずれの発現ベクターを用いることもできるが、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ-Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ用のシャトルベクターであるｐＭＴＬ５００Ｅ（非特許文献６、参照）等を用いることもできる。

本発明の「クロストリジウムセルロボランスの増殖を抑制し得る抗生物質の耐性遺伝子を含むプラスミド」は、例えば、ｐＭＴＬ５００Ｅからクロストリジウムセルロボランスの増殖を抑制しない抗生物質の耐性遺伝子を除き、そこにクロストリジウムセルロボランスの増殖を抑制し得る抗生物質の耐性遺伝子を組み込むことによって作製することができる。
このようなプラスミドとして、ｐＭＴＬ５００Ｅからエリスロマイシン耐性遺伝子を除き、そこに配列表配列番号１で示されるクロラムフェニコール耐性遺伝子を組み込んだｐＭＴＬ５００Ｃ等を挙げることができる。

本発明の「クロストリジウムセルロボランスの形質転換体」とは、本願発明のクロストリジウムセルロボランスの形質転換体を製造する方法によって製造されるクロストリジウムセルロボランスの形質転換体のことをいう。

以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明がこれらに限定されないことは言うまでもない。

〔実施例１〕
１．クロストリジウムセルロボランスの抗生物質耐性の検討
複数の抗生物質耐性遺伝子から、クロストリジウムセルロボランスの形質転換体の製造に当たり遺伝子組換えのスクリーニングの目印として最適な選択マーカーを検討した。

１）試料
（１）宿主細胞
クロストリジウムセルロボランス７４３Ｂ（ＡＴＣＣ３５２９６）を宿主細胞とした。
この宿主細胞の培養にあたり、Ｓｌｅａｔらの方法（参考文献１）を参考として、炭素源に３ｇ／Ｌのセロビオース、４ｇ／Ｌの酵母エキス、１２ｇ／ＬのＮａＣｌ、種々の微量元素をリン酸緩衝液に溶解し培地を作製した。
作製した培地を嫌気培養用の１６×１２５ｍｍの試験管に１０ｍＬ入れ、嫌気培養装置（三紳工業株式会社）を用いて二酸化炭素を約３分間吹き込み、試験管内を二酸化炭素で置換した。その後、ブチルゴム栓とスクリューキャップを施し、１２１℃、４０分間オートクレーブし滅菌した。
クロストリジウムセルロボランスの植菌も嫌気培養装置を用いて行った。二酸化炭素発射口から１ｍＬ容の注射器内を二酸化炭素に置換し、０．２ｍＬの二酸化炭素を満たした状態で種菌の入った試験管に注射針を刺し、二酸化炭素を試験管内に出した。その後０．２ｍＬの種菌を取り出し、作製した試験管培地に迅速に植菌し、３７℃で培養した。
参考文献１：Ｓｌｅａｔ，Ｒ．，Ｍａｈ，Ｒ．Ａ．，ａｎｄＲｏｂｉｎｓｏｎ，Ｒ． “ＩｓｏｌａｔｉｏｎａｎｄＣｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆａｎＡｎａｅｒｏｂｉｃ，ＣｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃＢａｃｔｅｒｉｕｍ，Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｃｅｌｌｕｌｏｖｏｒａｎｓｓｐ．Ｎｏｖ．” ＡｐｐｌｅＥｎｖｉｒｏｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌ４８，８８−９３．（１９８４）

（２）抗生物質
クロラムフェニコール、エリスロマイシン、スペクチノマイシンまたはチアンフェニコール（全て、和光純薬工業株式会社）を抗生物質として使用した。このうち、クロラムフェニコールとエリスロマイシンは９９．５％エタノールに溶解させ、使用時まで冷凍保存した。また、スペクチノマイシンとチアンフェニコールは蒸留水に溶解させ、使用時まで冷凍保存した。

２）クロストリジウムセルロボランスの培養
上記１）（２）にて調製した各抗生物質のストック溶液を使用時に解凍し、表１に示された濃度となるように嫌気チャンバー内で１０ｍＬの液体培地に加えた。その後、上記（１）にて培養したクロストリジウムセルロボランスの培養液０．２ｍＬを植菌し、３７℃で培養を行った。
また、クロラムフェニコールについては培地中の最終濃度が１μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、１５μｇ／ｍＬ、２０μｇ／ｍＬ、３０μｇ／ｍＬ、４０μｇ／ｍＬまたは５０μｇ／ｍＬとなるようにそれぞれ液体培地に加え、培養を行った。

３）結果
抗生物質耐性下で培養を行った結果、クロラムフェニコール、スペクチノマイシンまたはチアンフェニコールを加えた液体培地では、クロストリジウムセルロボランスは増殖できなかった。従って、これらの結果より、クロストリジウムセルロボランスはクロラムフェニコール、スペクチノマイシンまたはチアンフェニコールの抗生物質耐性を保持していないことが推測された。
このうち特に、クロラムフェニコールを添加した液体培地では、図１に示したように、１０μｇ／ｍＬ、１５μｇ／ｍＬという低い濃度であってもクロストリジウムセルロボランスは増殖できなかった（図１、クロラムフェニコールの添加量、Ａ：１μｇ／ｍＬ、Ｂ：１０μｇ／ｍＬ、Ｃ：１５μｇ／ｍＬ）。

２．クロストリジウムセルロボランス用プラスミドの構築
上記１．の結果より、クロストリジウムセルロボランスの増殖を抑制する抗生物質であるクロラムフェニコール、スペクチノマイシンまたはチアンフェニコールの中から、クロラムフェニコールを選択し、これをクロストリジウムセルロボランスの形質転換体のスクリーニングのために用いることとした。

１）試料
（１）ｐＭＴＬ５００Ｅ
アンピシリン耐性遺伝子とエリスロマイシン耐性遺伝子を選択マーカーとして含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ-Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ用のシャトルベクターであるｐＭＴＬ５００Ｅをクロストリジウムセルロボランス用プラスミドのベースとして使用した。ｐＭＴＬ５００Ｅの増幅には大腸菌を用い、アンピシリンによるセレクションを行った。

（２）クロラムフェニコール耐性遺伝子
クロラムフェニコール耐性遺伝子は、クロストリジウムパーフリンゲンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）のクロラムフェニコール耐性遺伝子が含まれるｐＪＩＲ４１８（参考文献２、参照）からクローニングした。
クロラムフェニコール耐性遺伝子の塩基配列を配列表配列番号１に示した。
参考文献２：Ｓｌｏａｎ，Ｊ．，Ｗａｒｎｅｒ，Ｔ．Ａ．，ＳｃｏｔｔＰ．Ｔ．，Ｂａｎｎａｍ，Ｔ．Ｌ．，Ｂｅｒｒｙｍａｎ，Ｄ．，ａｎｄＲｏｏｄＪＩ． “ＣｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｏｆａｓｅｑｕｅｎｃｅｄＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ−Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉｓｈｕｔｔｌｅｐｌａｓｍｉｄ．” Ｐｌａｓｍｉｄ．２７，２０７−２１９．（１９９２）

２）クロストリジウムセルロボランス用プラスミドの構築
ｐＭＴＬ５００Ｅに含まれるエリスロマイシン耐性遺伝子をクロラムフェニコール耐性遺伝子に置き換え、クロストリジウムセルロボランス用プラスミドを構築した。
即ち、ｐＭＴＬ５００Ｅのエリスロマイシン耐性遺伝子以外の領域を含む線状化ベクターをＰＣＲによって作製した。この時、５’末端、３’末端にＰｍｅＩとＦｓｅＩの制限酵素サイトが付加するようにプライマーを設計し線状化ベクターを作製した。
また、ｐＪＩＲ４１８（参考文献２、参照）からＰｍｅＩおよびＦｓｅＩの制限酵素サイトが付加するようにプライマーを設計し、上流のプロモーター領域を含めクロラムフェニコール耐性遺伝子を増幅した。
これらのｐＭＴＬ５００Ｅ線状化ベクターと、クロラムフェニコール耐性遺伝子をＰｍｅＩおよびＦｓｅＩで制限処理し、それぞれの遺伝子をアガロースゲルで分画し、精製した。
精製したＤＮＡ断片と線状化ベクターについて、Ｌｉｇａｔｉｏｎｈｉｇｈ（ＴＯＹＯＢＯ）を用いて１６℃で一晩ライゲーション反応を行った。その後、ライゲーション産物を大腸菌ＤＨ５α株へ形質転換させ、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に植菌し、３７℃で一晩静置培養した。

ＬＢ寒天培地に生じたコロニーに選択マーカーであるクロラムフェニコール耐性遺伝子が挿入されているかを確認するためにコロニーＰＣＲを行い、アガロース電気泳動を用いてＰＣＲ産物を確認することでクロラムフェニコール耐性遺伝子が挿入されているコロニーを選択した。そのコロニーをＬＢ液体培地で培養し、その後、プラスミドＤＮＡを抽出し、このクロストリジウムセルロボランス用プラスミドをｐＭＴＬ５００Ｃとした（図２）。図２のＡｐ^Ｒはアンピシリン耐性遺伝子を示し、Ｃｍ^Ｒはクロストリジウムパーフリンゲンス由来のクロラムフェニコール耐性遺伝子を示している。

３．形質転換体の製造方法
上記１、２の工程を経て作製したｐＭＴＬ５００Ｃを、エレクトロポレーション法によりクロストリジウムセルロボランス７４３Ｂ（ＡＴＣＣ３５２９６）に形質転換した。
即ち、１０ｍＬのクロストリジウムセルロボランス７４３Ｂ（ＡＴＣＣ３５２９６）の培養液を５ｍＬ容のチューブに入れ、５分間遠心分離を行った。その後、上清を取り除き、沈殿させた菌体に対して冷えたエレクトロポレーション緩衝液（２７０ｍＭスクロース，１０ｍＭＭｇＣｌ_２，０．６ｍＭＮａ_２ＨＰＯ_４，４．４ｍＭＮａＨ_２ＰＯ_４，ｐＨ６．０）を１ｍＬ加えて菌体を懸濁し、再び５分間遠心分離を行った。再び上清を取り除き、１０ｍＭＭｇＣｌ_２の含まれていない冷えたエレクトロポレーション緩衝液を０．２ｍＬ加えて懸濁させ、氷上で１０分間静置した。

滅菌済みの１．５ｍＬ容エッペンチューブに２０μＬの菌体懸濁液と４４０ｎｇのｐＭＴＬ５００Ｃを加え、氷上で１０分間静置した。その後、この混合液２０μＬを氷上で冷やした０．１ｃｍ滅菌済みエレクトロポレーションキュベット（ＢＩＯ−ＲＡＤ）に移し、混合液をキュベット底に流し入れ、キュベット外側の水滴を拭き取った。
キュベットをＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒＸｃｅｌｌ（登録商標）エレクトロポレーションシステム（ＢＩＯ−ＲＡＤ）に設置し、６００Ｖ，２００Ω，２５μＦの条件で形質転換を行った。形質転換後、キュベットごと氷上で１０分間静置した。その後、培地１７０μＬを加え、混合し、２ｍＬ容のクライオチューブに移し、３７℃で２時間静置培養を行った。この培養液を転倒混和させ菌体を懸濁させた後、試験管に培養液が入った状態で濁度測定し、ＯＤ５９０＝０．５に到達した時に培養した試験管を嫌気チャンバーに入れた。

嫌気チャンバーから培養液の入ったクライオチューブを取り出し、７ｍＬの培地に１．５％Ａｇａｒを含んだ培地を一度溶解させた。嫌気培養装置から出た二酸化炭素を培地に吹き込みながら終濃度が１５μｇ／ｍＬとなるようにクロラムフェニコールを培地に加え、その後、クライオチューブに入っている培養液を、二酸化炭素を吹き込みながら素早く植菌した。ブチル栓を施し、ロールチューブ作成器（三紳工業株式会社）でロールチューブを作製した。作製したロールチューブを３７℃で静置培養した。その結果、培養開始から４日後にコロニーを検出することができた（図３、右、丸で囲った箇所）。

このロールチューブに生じたコロニーに目的遺伝子が挿入されているか確認するために、コロニーダイレクトＰＣＲを行った。プライマーはクロラムフェニコールを含む領域で設計し、コロニーを鋳型としてＰＣＲを行った。その結果、図４に示されるように、クロラムフェニコール耐性遺伝子を検出することができた。
図４のＬａｎｅＭは１００ｂｐＤＮＡＬａｄｄｅｒ（ＢｉｏＬａｂｓ）を示し、Ｌａｎｅ１は野生株クロストリジウムセルロボランス（ネガティブコントロール）を示し、Ｌａｎｅ２はｐＭＴＬ５００Ｃ形質転換体クロストリジウムセルロボランスを示し、また、Ｌａｎｅ３はｐＭＴＬ５００Ｃ（ポジティブコントロール）を示す。

従って、この結果より、クロストリジウムセルロボランスの形質転換用であるクロラムフェニコール耐性遺伝子の塩基配列を含むプラスミドを用いることにより、クロストリジウムセルロボランスの形質転換体を製造することが可能となった。

本発明により、クロストリジウムセルロボランスの形質転換体を製造することが可能となった。本発明により、クロストリジウムセルロボランスに目的とする遺伝子導入をすることにより、代謝関連酵素の改変等を行うことが可能となる。これによって、バイオ燃料や化成品の原料として有用なブタノールやコハク酸などの化合物をセルロース系バイオマスから直接製造することも可能となる。

Claims

クロストリジウムセルロボランスの増殖を抑制し得る抗生物質の耐性遺伝子を含むプラスミドをクロストリジウムセルロボランスに導入する工程を含む、クロストリジウムセルロボランスの形質転換体を製造する方法。
クロストリジウムセルロボランスの増殖を抑制し得る抗生物質が、クロラムフェニコール、スペクチノマイシンまたはチアンフェニコールから選ばれるいずれか一種以上である請求項１に記載の方法。
クロストリジウムセルロボランスの増殖を抑制し得る抗生物質の耐性遺伝子がクロストリジウム属由来である請求項１または２に記載の方法。
クロストリジウムセルロボランスの増殖を抑制し得る抗生物質の耐性遺伝子が配列表配列番号１に示されるクロラムフェニコール耐性遺伝子である請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
請求項１〜４のいずれかに記載の方法によって製造されるクロストリジウムセルロボランスの形質転換体。
クロストリジウムセルロボランスの形質転換用であるクロストリジウムセルロボランスの増殖を抑制し得る抗生物質の耐性遺伝子を含むプラスミド。