JP2017108650A - 家畜視床下部繁殖中枢由来不死化神経細胞株 - Google Patents

Abstract

【課題】家畜の生殖・繁殖活動を制御するヤギや牛等の反芻家畜の視床下部由来のＫＮＤｙニューロン、ＧｎＲＨニューロンから不死化細胞株を樹立する方法。
【解決手段】ＳＶ４０Ｔ-ａｎｔｉｇｅｎを発現させることにより、神経細胞の不死化を図り、さらに、各ニューロンのマーカーの発現を指標として細胞クローンを選抜した床下部由来不死化神経細胞株、好ましくは、ＫＮＤｙニューロン由来もしくはＧｎＲＨニューロン由来不死化神経細胞株。不死化神経細胞株に、候補化合物を接触させる反芻家畜の繁殖に効果を有する薬剤のスクリーニング方法。
【選択図】図１

Description

哺乳類の生殖・繁殖活動を制御する中枢である視床下部において中心的な役割を果たすＫＮＤｙニューロンとＧｎＲＨニューロンの２種類の神経細胞から樹立した不死化神経細胞株に関する。特に、これまで樹立されていなかったウシ、ヤギのような反芻動物の家畜から樹立した視床下部由来の神経細胞株に関する。

家畜の繁殖制御技術は畜産の発展とともに発達を遂げている。わが国では家畜増進法の制定や凍結精液の普及により、人工授精技術が日本全土に広く普及している。中でもウシの人工授精技術の発展は目覚しく、現在では凍結精液を用いた人工授精が肉用牛、及び乳用牛の繁殖のほぼ１００％で実施されている。

しかし、近年では人工授精による受胎率の低下が報告されているほか、微弱発情や卵巣静止などの繁殖障害による空胎期の延長が問題視されている。空胎期の延長は、畜産物の生産効率を低下させる原因となるからである。さらに、世界的に畜産物の需要が増加しており、家畜を効率的に繁殖し生産する技術の開発が待たれている。

雌性動物の生殖周期は性成熟から始まり、発情、排卵、受精、着床、分娩、哺乳のサイクルを繰り返す。その生殖周期のいずれかの段階に異常が起こり、繁殖が停止する状態を繁殖障害と呼ぶ。繁殖障害は家畜の空胎期間の延長につながり、家畜は次世代の個体を産むことなく無為に飼料を消費することになる。繁殖障害は、ホルモン分泌の異常、微生物感染、先天性の遺伝子変異、飼養管理状況の不良など様々な要因によって起こることが知られている。

このうちホルモン分泌の異常によって起こる繁殖障害については詳しいメカニズムは解明されていない。そのため、ウシ等の家畜のホルモン分泌の異常によって繁殖障害が起こるメカニズムや、繁殖を最も上位で制御する機構（繁殖中枢）の解明が待たれている。繁殖中枢を制御するメカニズムが解明されることにより、より効率的に家畜を繁殖させることが可能となるからである。

現在までにホルモンによる繁殖制御については以下のような機構が明らかにされている。哺乳類の繁殖機能は、視床下部−下垂体−性腺が一連の単位となって制御されている。視床下部から下垂体門脈系に分泌される性腺刺激ホルモン放出ホルモン（ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｉｎ−ｒｅｌｅａｓｉｎｇ ｈｏｒｍｏｎｅ、ＧｎＲＨ）は、下垂体前葉からの黄体形成ホルモン（ｌｕｔｅｉｎｉｚｉｎｇ ｈｏｒｍｏｎｅ、ＬＨ）及び卵胞刺激ホルモン（ｆｏｌｌｉｃｌｅ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｈｏｒｍｏｎｅ、ＦＳＨ）からなる性腺刺激ホルモン（ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｉｎ，ＧＴＨ）の分泌を促進する。ＧｎＲＨは血中に律動的に放出され、ＧｎＲＨの分泌動態に対応してＧＴＨも血中に律動的に分泌される。これらはそれぞれＧｎＲＨパルス、ＧＴＨパルスとよばれ、雌性動物における卵胞発育に必要であることが知られている（非特許文献１）。卵胞の発育が十分に進むと、ＧｎＲＨの一過性大量分泌（ＧｎＲＨサージ）が起こり、それに引き続いて起こるＬＨサージによって排卵が誘起される。

ＧｎＲＨニューロンは、パルス状、サージ状のＧｎＲＨ分泌により卵胞発育、排卵をそれぞれ誘起し、性周期を制御している。すなわち、卵巣内での卵胞発育や排卵のタイミングはＧｎＲＨの分泌動態によって制御されている。このように、ＧｎＲＨニューロンは繁殖中枢として重要な役割を果たしているが、どのような機構によってＧｎＲＨニューロンが制御されているかは不明である。

近年、ＧｎＲＨニューロンを上位で制御するキスペプチン（ｋｉｓｓｐｅｐｔｉｎ）と呼ばれる神経ペプチドが発見された（非特許文献２）。特に、弓状核に局在するキスペプチンニューロンは、キスペプチンだけでなくニューロキニンＢ（ｎｅｕｒｏｋｉｎｉｎ Ｂ、ＮＫＢ）及びダイノルフィンＡ（ｄｙｎｏｒｐｈｉｎ Ａ）と呼ばれる神経ペプチドも分泌することから、ＫＮＤｙニューロンと呼ばれている。このＫＮＤｙニューロンがＧｎＲＨパルスジェネレーターであることが示唆されている。ＧｎＲＨパルスジェネレーターとは、ＧｎＲＨのパルス状の分泌パターン、特にパルス頻度を制御する神経内分泌機構をいう。

ＧｎＲＨニューロンは視床下部において他の細胞と混じって散在し、さらにその細胞数が限られていることから、その詳細な機能についての研究が困難であった。繁殖機能を制御するメカニズムを研究するためには、細胞レベルでの解析が不可欠である。そのため、げっ歯類（マウス）ではＧｎＲＨニューロン細胞株が樹立されている（非特許文献３）。また、げっ歯類（マウス、ラット）においては、視床下部の様々なニューロンに由来すると考えられる視床下部由来不死化神経細胞株も樹立されている（非特許文献４、５）。

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これまでに報告されている哺乳類の視床下部由来神経細胞株は、上述のようにげっ歯類由来のもののみである。げっ歯類とウシ、ヤギ等の家畜には形態学的、生理学的に様々な違いがある。

げっ歯類は「不完全性周期動物」に分類され、卵巣で卵胞発育、排卵、黄体形成が繰り返されるが、交尾刺激がなければ黄体が機能しない。一方、ヤギ、ウシ、ヒトなどは「完全性周期動物」に分類され、交尾の有無に関係なく、卵巣で卵胞発育、排卵、機能黄体の形成が繰り返される。このような性周期の違いから、ＫＮＤｙニューロンとＧｎＲＨニューロンの制御機構がヤギ、ウシのような反芻動物とマウス、ラットのようなげっ歯類とでは異なる可能性が考えられる。そのため、家畜の繁殖制御メカニズムを解明するためには、家畜の視床下部由来神経細胞株が不可欠である。したがって、家畜の視床下部由来の神経細胞株の樹立が待たれている。

また、ＧｎＲＨパルスジェネレーターとしての機能が示唆されているＫＮＤｙニューロン由来の細胞株はあらゆる動物種において報告がない。そのため、生殖、繁殖活動の制御の研究に有用なＫＮＤｙニューロンの細胞株の樹立が必要であると考えられている。

本発明は、反芻動物、とくに家畜として有用なウシ、ヤギのＫＮＤｙニューロンやＧｎＲＨニューロンに由来する細胞株を樹立し、提供することを課題とする。樹立した神経細胞株は、家畜の繁殖制御メカニズムを研究するために役立つだけでなく、繁殖を効率的に行うための薬剤のスクリーニングに利用することができる。

本発明は、以下に示す不死化神経細胞株、及びこれを用いた薬剤のスクリーニング方法に関する。
（１）反芻家畜の視床下部神経細胞に由来し、
ＮＳＥ発現陽性、ＧＦＡＰ発現陰性であることを特徴とする視床下部由来不死化神経細胞株。
（２）前記反芻家畜が、ヤギ、又はウシであることを特徴とする（１）記載の視床下部由来不死化神経細胞株。
（３）（１）又は（２）記載の視床下部由来不死化神経細胞株が、
ＴＡＣ３、ＥＳＲ１、ＫＩＳＳ１、ＰＤＹＮ、ＴＡＣＲ３、ＰＧＲを少なくとも１つ発現していることを特徴とするＫＮＤｙニューロン由来不死化神経細胞株。
（４）（１）又は（２）記載の視床下部由来不死化神経細胞株が、
ＧＮＲＨ１、及び／又はＫＩＳＳ１Ｒ陽性であることを特徴とするＧｎＲＨニューロン由来不死化神経細胞株。
（５）（４）記載の視床下部由来不死化神経細胞株が、
さらに、ＥＳＲ１陰性であることを特徴とするＧｎＲＨニューロン由来不死化神経細胞株。
（６）受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−０２０８１で寄託されているヤギＫＮＤｙニューロン由来不死化神経細胞株ＧＡ２８。
（７）受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−０２０８２で寄託されているウシＫＮＤｙニューロン由来不死化神経細胞株ＣＡ２。
（８）受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−０２０８３で寄託されているウシＫＮＤｙニューロン由来不死化神経細胞株ＣＡ３８。
（９）受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−０２０８４で寄託されているウシＧｎＲＨニューロン由来不死化神経細胞株ＣＰ３。
（１０）受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−０２０８５で寄託されているウシＧｎＲＨニューロン由来不死化神経細胞株ＣＰ２２。
（１１）受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−０２０８６で寄託されているウシＧｎＲＨニューロン由来不死化神経細胞株ＣＰ２８。
（１２）（１）〜（１１）に記載の不死化神経細胞株に、
候補化合物を接触させることを特徴とする反芻家畜の繁殖に効果を有する薬剤のスクリーニング方法。

本発者らは、今まで樹立されたことのなかった反芻家畜の視床下部神経細胞由来の細胞株を樹立した。特に、ＫＮＤｙニューロン由来の不死化細胞株は、今まで動物種を問わず樹立されておらず、本発明者らが初めて樹立に成功した。これら細胞株は、今まで不明な点が多かったＧｎＲＨの制御機構を明らかにする有用なツールとして使用することができる。

また、今までげっ歯類でしか樹立されていないＧｎＲＨニューロン由来の不死化細胞株を、反芻家畜であるヤギ、ウシから樹立することができた。げっ歯類とこれら反芻動物では生理学的・解剖学的に違いがあることから、繁殖制御機構も異なっているものと推測される。今後これらの細胞株を用いて、反芻家畜の繁殖制御機構が明らかになるものと考えられる。その結果、家畜の繁殖をより効率的に制御可能な技術を提供することができるとともに、薬剤の開発効率を大きく向上させることができる。

不死化細胞株作製の過程を模式的に示した図。 ＲＴ−ＰＣＲによる不死化細胞クローンの神経細胞マーカーの発現結果を示す図。 図３ＡはＲＴ−ＰＣＲによる不死化細胞クローンのＫＮＤｙニューロンマーカーの発現を示す。図３Ｂは、ＫＮＤｙニューロンの遺伝子発現パターンを示す細胞ＧＡ２８の形態を示す顕微鏡写真。 ＲＴ−ＰＣＲによる不死化細胞クローンの神経細胞マーカーの発現結果を示す図。 ＲＴ−ＰＣＲによる不死化神経細胞クローンのＫＮＤｙニューロンマーカーの発現を示す図。 ＲＴ−ＰＣＲによる不死化細胞クローンの神経細胞マーカーの発現結果を示す図。 ＲＴ−ＰＣＲによる不死化神経細胞クローンのＧｎＲＨマーカーの発現を示す図。 ヤギＴＡＣ３の５´上流領域の配列を示す図。 種の異なる細胞株でのヤギＴＡＣ３の５´上流領域の転写活性を示す図。 ＫＮＤｙニューロン不死化細胞株ＣＡ３８におけるｓｅｎｋｔｉｄｅのＴＡＣ３発現に対する効果を示す図。

本発明で反芻動物とは複数の胃を有する反芻行動を行う動物のことであり、具体的には反芻亜目に分類される動物をいう。特に、家畜として有用なウシ、ヤギ、ヒツジを反芻家畜という。

視床下部由来の神経細胞とは、視床下部から樹立された細胞株であって、神経細胞マーカーであるｎｅｕｒｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｅｎｏｌａｓｅ（ＮＳＥ）発現陽性であり、グリア細胞マーカーであるｇｌｉａｌ ｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ ａｃｉｄｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＧＦＡＰ）発現陰性である細胞株をいうものとする。反芻家畜に関して、ＫＮＤｙニューロン、ＧｎＲＨニューロンがどのような遺伝子を発現しているかは限られた遺伝子で検討されているだけである（非特許文献６〜１１）。したがって、本発明では、少なくとも下記の遺伝子発現特性を備えているものであると定義する。

視床下部神経細胞由来細胞株のうち、ＫＮＤｙニューロン由来の細胞株とは、上記神経細胞マーカーの遺伝子発現特性に加え、少なくともキスペプチンをコードする遺伝子であるＫＩＳＳ１発現陽性、ニューロキニンＢをコードする遺伝子であるＴＡＣ３発現陽性、ダイノルフィンをコードする遺伝子であるＰＤＹＮ発現陽性、ｅｓｔｒｏｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ α（ＥＲα）をコードする遺伝子であるＥＳＲ１発現陽性である細胞株をいう。さらに、ニューロキニンＢ受容体であるＮＫ３Ｒをコードする遺伝子であるＴＡＣＲ３発現陽性、ｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＰＲ）をコードする遺伝子であるＰＧＲ発現陽性であることが好ましい。

また、ＧｎＲＨニューロン由来の細胞株とは、上記神経細胞マーカーの遺伝子発現特性、すなわちＮＳＥ発現陽性、ＧＦＡＰ発現陰性であることに加え、ゴナドトロピン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）をコードする遺伝子であるＧＮＲＨ１発現陽性である細胞株をいう。さらに、キスペプチン受容体をコードする遺伝子であるＫＩＳＳ１Ｒ発現陽性、ＥＳＲ１発現陰性であることが好ましい。

本発明において遺伝子の発現は、ＲＴ−ＰＣＲで解析を行っているが、発現を確認できるのであればどのような方法を用いてもよい。遺伝子の発現はＲＮＡを検出することにより行うことができる。ＲＮＡを検出することにより遺伝子発現を解析する方法としては、ノーザンブロット法、ドットブロット法、スロットブロット法等、公知の方法を用いることができる。さらに、遺伝子発現をＲＮＡを検出することにより行うのではなく、タンパク質発現を抗体によって検出してもよい。タンパク質を検出する方法としては、ウェスタンブロット法、ＥＬＩＳＡ等公知の方法を用いることができる。

本発明の細胞株を用いた新しい薬剤を得るためのスクリーニング方法は、例えば、下記のような方法で行うことができる。例えば、ＮＫ３Ｒ作動薬、ＥＲα作動薬のようなＫＮＤｙニューロンに直接作用すると考えられる薬剤をスクリーニングする場合には、ＫＮＤｙニューロン由来不死化細胞株を単独で用いてスクリーニングを行えばよい。具体的には候補物質をＫＮＤｙニューロン細胞株に添加後、シグナル伝達に関わる分子や、性腺刺激に関与するペプチドの放出を測定し、これらを指標とすることによりスクリーニングを行うことができる。シグナル伝達に関わる分子としては、例えば、細胞内カルシウムイオンが挙げられこれを測定すればよい。また、性腺刺激に関与するペプチドとしては、キスペプチンが挙げられ、キスペプチンの分泌量の測定を行うことによって薬剤の効果を評価することができる。

また、ＫＮＤｙニューロン由来不死化細胞株とＧｎＲＨニューロン由来不死化細胞株の共培養系も、上記の薬剤のスクリーニングに使用することができる。ＫＮＤｙニューロン由来不死化細胞株とＧｎＲＨニューロン由来不死化細胞株を共培養し、候補物質を共培養系に添加する。この場合、薬効評価はＧｎＲＨ分泌量の測定により行えばよい。

また、キスペプチン受容体作動薬のようにＧｎＲＨニューロンに直接作用すると考えられる薬剤のスクリーニングを行う場合には、ＧｎＲＨニューロン由来不死化細胞株を単独で用いればよい。薬剤を細胞株に添加後、細胞内カルシウムイオン濃度の測定、ＧｎＲＨ分泌量の測定等によって、薬剤の効果を評価することができる。上記に記載したスクリーニング方法は一例であり、これらの方法に限らず、公知のスクリーニング方法を適用できることはいうまでもない。

［シバヤギＫＮＤｙニューロン細胞株の樹立］
１．動物及び組織採取
非特許文献４の方法を改変し、シバヤギ視床下部から神経細胞株を樹立した。妊娠雌シバヤギを麻酔下で帝王切開してメス胎子（胎齢１１８日）を摘出し、頭皮と頭骨を切断して、脳を取り出した。氷上のシャーレ上で脳から視床下部弓状核領域を目視で切り出し、約５ｍｍ角にカミソリでトリミングした。採取した弓状核組織は、氷冷した無血清培地（１× Ｂ−２７ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｇｉｂｃｏ社製）、０．５ｍＭ Ｌ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ社製）、１００Ｕ/ｍＬ ペニシリン‐１００μｇ／ｍＬ ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ社製）を含むＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地（Ｇｉｂｃｏ社製））に浸漬した。

２．不死化細胞の選抜
（１）初代培養
図１に不死化細胞株樹立の過程を模式的に示す。採取した弓状核（Ａｒｃｕａｔｅ ｎｕｃｌｅｕｓ、ＡＲＣ）組織を無血清培地で洗浄後、培地を除去した。弓状核組織は、１ｍｍ角程度になるようにカミソリで切断した。切断後の組織に３７℃に加温したパパイン溶液（１５Ｕ/ｍＬ パパイン（フナコシ株式会社製）、１．１４ｍＭ Ｌ−システイン塩酸塩一水和物（関東化学株式会社製）、２０％（ｗ/ｖ）ウシ血清アルブミン（和光純薬株式会社製）、２７．８ｍＭ Ｄ（+）−グルコース（和光純薬株式会社製））を添加して、３７℃で１５分間静置した。

その後、無血清培地で洗浄し、再度パパイン溶液で同様に処理を行った後、ピペッティングにより視床下部組織の細胞間接着を十分に解離した。７０μｍセルストレイナー（ベクトン・ディッキンソン社製）に通して細胞塊を除き、８００ｒｐｍで５分間遠心し、細胞を集めた。集めた細胞は、基本培地（１５％非動化ウシ胎児血清（株式会社ニチレイバイオサイエンス製）、１× Ｂ−２７ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、０．５ｍＭ Ｌ−グルタミン、１００Ｕ/ｍＬ ペニシリン‐１００μｇ／ｍＬ ストレプトマイシン、５ｎｇ／ｍＬ ｂａｓｉｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を含むＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地）に懸濁し、再度遠心分離を行った。

上清除去後、ポリ−Ｌ−リジンコーティングした２４ウェルプレート（ＩＷＡＫＩ社製）に基本培地で細胞懸濁液の段階希釈液を作って播種した。播種した細胞は３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーターで２４時間培養し、適切な細胞数のウェルを選択し、下記の不死化処理を実施した。

（２）不死化処理及び不死化細胞の選択
細胞の不死化はＳＶ４０ ｌａｒｇｅ Ｔ−ａｎｔｉｇｅｎ遺伝子をレンチウイルスによって導入することにより行った。２４時間培養した初代培養細胞をＰＢＳで洗浄後、基本培地を５００μＬ／ウェル加えた。細胞不死化用レンチウイルスとして、Ｔ−ａｎｔｉｇｅｎ（Ｎｅｏ）ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ（ＧｅｎＴａｒｇｅｔ社製）を５０μＬ／ウェル添加し、７２時間培養した。その後、８００μｇ/ｍＬ Ｇ４１８（ロシュ・ダイアグノスティクス株式会社製）を含む基本培地によって、不死化細胞を選抜した。不死化細胞の選抜は、８００μｇ/ｍＬ Ｇ４１８を含む基本培地を３〜４日毎に交換し、２週間かけて行った。選抜後は２００μｇ/ｍＬ Ｇ４１８を含む基本培地で継代した。

３．細胞のクローニング及び神経由来不死化細胞株の同定
Ｇ４１８で選抜を行った不死化細胞集団は、２００μｇ/ｍＬ Ｇ４１８を含む基本培地で希釈してポリ−Ｌ−リジンコーティングした９６ウェルプレート（ＩＷＡＫＩ社製）に播種し、単一細胞から増殖したＧＡ１〜ＧＡ７０までの７０クローンを得た。これら７０クローンのうち、安定して増殖したクローンは６１クローンであった。これら細胞のＳＶ４０ Ｔ−ａｎｔｉｇｅｎ、神経細胞マーカーであるＮＳＥ、グリア細胞マーカーであるＧＦＡＰのｍＲＮＡ発現をＲＴ−ＰＣＲによって調べた。ＳＶ４０ Ｔ−ａｎｔｉｇｅｎの発現は、不死化がＳＶ４０ Ｔ−ａｎｔｉｇｅｎに起因するものであることを示す。また、ＮＳＥ陽性かつＧＦＡＰ陰性であれば、樹立した細胞株が、視床下部神経由来の細胞であることを示す。以下にＲＴ−ＰＣＲを行うためのＲＮＡの抽出、ｃＤＮＡの作製方法、ＲＴ−ＰＣＲの方法等について述べる。

細胞は、ＴｒｉＰｕｒｅ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社製）で溶解後、クロロホルム（和光純薬工業株式会社製）を加えて混合し、室温で１５分間放置した後、４℃、１２，０００ｇで１５分間遠心分離し、上清の水層を回収した。回収した水層にイソプロパノール（和光純薬工業株式会社製）を加え混合した後、４℃、１２，０００ｇで１０分間遠心分離し、上清を除去した。次に、７５％エタノール２００μＬを添加して混合し、４℃、７，５００ｇで５分間遠心分離し、上清を完全に除去した。得られたＲＮＡペレットはＲＮａｓｅ−ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒ １５μＬに溶解し、６０℃で１５分間静置して完全に溶解させた。

次に、ゲノムＤＮＡの分解処理を行った。抽出したｔｏｔａｌ ＲＮＡ １μｇにＤＮａｓｅＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を加え、室温で１５分間静置し、ゲノムＤＮＡを分解した。その後、２５ｍＭ ＥＤＴＡを加え、６５℃で１０分間静置しＤＮａｓｅＩを失活させた。ｃＤＮＡ合成はＨｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて行った。

各細胞クローンにおけるマーカー遺伝子の発現をＲＴ−ＰＣＲ法で解析し、性質の決定を行った。上述したＳＶ４０ ｌａｒｇｅ Ｔ−ａｎｔｉｇｅｎ（Ｔ-Ａｇ）、ＮＳＥ、ＧＦＡＰの３遺伝子と、コントロールとしてｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（ＧＡＰＤＨ）の計４遺伝子の解析を行った。安定して増殖したこれら６１クローンは、すべて、ＧＡＰＤＨ及びＳＶ４０ Ｔ−ａｎｔｉｇｅｎを発現していた。そのうち、神経細胞マーカーであるＮＳＥ陽性、かつグリア細胞マーカーであるＧＦＡＰ陰性のクローンは３９クローンであった。用いたプライマー配列、及びＰＣＲ条件を表１に、結果を表２に示す。ＲＴ−ＰＣＲはＴａＫａＲａ Ｅｘ−Ｔａｑ（タカラバイオ株式会社製）を用い、ＰＣＲ装置（Ｂｉｏｍｅｔｒａ社製）を用いて行った。

また、図２は、神経細胞として選抜された上記３９クローンのうち、代表的な８クローンについてのＲＴ−ＰＣＲの結果である。ＡＲＣはポジティブコントロールとして用いたヤギ弓状核組織の結果を示す。ＮＣはネガティブコントロールであり、ｃＤＮＡを入れずにＰＣＲを行った試料である。図２に示すように、選択したクローンはすべてＴ−Ａｇ陽性であり、神経細胞マーカーであるＮＳＥ陽性、かつグリア細胞マーカーＧＦＡＰが陰性である。ここでは８クローンのみ示しているが、選択した３９クローンはすべて同様の発現型を示した。

次に、不死化した神経細胞クローン３９のうち、ＫＮＤｙニューロンに由来するものを同定した。まず、ヤギのＫＮＤｙニューロンで発現が報告されているニューロキニンＢ（ＴＡＣ３より発現）の発現を確認した（非特許文献６）。

ヤギＫＮＤｙニューロンは、キスペプチン（ＫＩＳＳ１）、ニューロキニンＢ（ＴＡＣ３）、及びダイノルフィンＡ（ＰＤＹＮ）を発現していることが報告されている（非特許文献６）。また、ＥＲα（ＥＳＲ１）、ＮＫ３Ｒ（ＴＡＣＲ３）、ＰＲ（ＰＧＲ）は、ヤギＫＮＤｙニューロンでの発現の報告はないが、ヒツジ、マウス、ラットでは発現が報告されている（非特許文献９〜１５）。そこで、これらの発現をＲＴ−ＰＣＲで解析した。用いたプライマー配列とＰＣＲ条件は表３に、結果を表４に示す。

得られた３９の神経細胞クローンのうち、ＧＡ１９、ＧＡ２８、ＧＡ３５、ＧＡ４２、ＧＡ５７、ＧＡ６０、ＧＡ６４の７クローンがＴＡＣ３陽性であった。これら７クローンについて、次に、ＥＲαをコードする遺伝子ＥＳＲ１の発現を確認した。ＧＡ２８、ＧＡ４２、ＧＡ６４の３クローンでＥＳＲ１の発現が確認された。なお、表において空欄は遺伝子発現解析を行わなかったことを示す。

ＴＡＣ３及びＥＳＲ１発現陽性の上記３クローンのＫＩＳＳ１、ＰＤＹＮ、ＴＡＣＲ３、ＰＧＲの発現を解析した。結果を図３Ａに示す。クローンＧＡ２８は、ＫＩＳＳ１、ＴＡＣ３、ＰＤＹＮ、ＥＳＲ１、ＴＡＣＲ３、ＰＧＲの発現が認められた。他方、クローンＧＡ４２、ＧＡ６４は、ＫＩＳＳ１の発現が認められなかった。したがって、クローンＧＡ２８が、ＫＮＤｙニューロンの遺伝子発現パターンに最も近い細胞株であると考えられる。クローンＧＡ２８の顕微鏡写真を図３Ｂに示す。

なお、ここで得られた不死化神経細胞株は、ＧＡ２８として独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許生物寄託センター（〒292-0818日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8）に２０１５年８月５日付で寄託され、受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−０２０８１が付与されている。

［ウシＫＮＤｙニューロン細胞株の樹立］
１．動物、組織採取、不死化細胞の選抜
妊娠中の黒毛和種雌ウシを深麻酔下で心停止させ、開腹して子宮を摘出した。子宮内から雌胎子（胎齢２１８日）を摘出し、頭皮と頭骨を切断して、脳を摘出し組織を採取した。その他は、実施例１と同様にして不死化細胞を樹立し、クローン選抜を行った。

２．細胞のクローニング及び神経由来不死化細胞株の同定
細胞のクローニングは、実施例１と同様に行い、不死化細胞から５２クローンを得た。さらに、実施例１と同様にして、ＧＡＰＤＨ、Ｔ−Ａｇ，ＮＳＥ、ＧＦＡＰの発現をＲＴ−ＰＣＲにより解析し、神経細胞由来クローンを得た。なお、動物種は異なるが、ＧＡＰＤＨのＦＯＲＷＡＲＤ ＰＣＲプライマーとして、下記配列番号２１のプライマーを用いた他は、ＰＣＲ条件も実施例１と同様に解析を行った。
ＧＡＰＤＨ Ｆ：ＡＧＴＴＣＡＡＣＧＧＣＡＣＡＧＴＣＡＡＧ（配列番号２１）

５２個の不死化細胞クローンのうち、神経細胞マーカーであるＮＳＥ陽性、かつグリア細胞マーカーであるＧＦＡＰ陰性の細胞３１クローンを同定した。結果を表５に、神経細胞として選抜された代表的な３クローンについてのＲＴ−ＰＣＲの結果を図４に示す。図４では３クローンしか示していないが、上記３１クローンの遺伝子発現パターンは、Ｔ-Ａｇ発現陽性であり、ＮＳＥ発現陽性、ＧＦＡＰ発現陰性であることを確認した。

次に、不死化神経細胞クローン３１のうち、ＫＮＤｙニューロンに由来するものを同定した。ＫＩＳＳ１、ＴＡＣ３、ＰＤＹＮ、ＴＡＣＲ３、ＥＳＲ１、ＰＧＲの発現解析を行った。ＲＴ−ＰＣＲは、ＴＡＣＲ３はＫＯＤ−Ｐｌｕｓ-Ｎｅｏ（東洋紡株式会社製）を、その他はＴａＫａＲａ Ｅｘ−Ｔａｑ（タカラバイオ株式会社製）を用いて増幅を行った。ＰＣＲのプライマー、ＰＣＲ条件を表６に示す。結果を表７、及び図５に示す。

表7に示すように、神経細胞マーカーであるＮＳＥ陽性３１クローンのうち、ＫＩＳＳ１及びＴＡＣ３を発現する細胞は、ＣＡ２、ＣＡ２５、ＣＡ２７、ＣＡ３８の４クローンであった。これら４クローンはすべてＰＤＹＮを発現していたが、ＣＡ２５及びＣＡ２７はＴＡＣＲ３発現が認められなかった。そこで、ＣＡ２及びＣＡ３８について、さらにＥＳＲ１、ＰＧＲの発現を解析した。その結果、ＣＡ２及びＣＡ３８ではこれらすべての遺伝子の発現が確認された。

クローンＣＡ２、ＣＡ３８は、遺伝子発現がＫＮＤｙニューロンの遺伝子発現パターンに最も近い細胞であると考えられる。なお、ここで得られた不死化神経細胞株は、ＣＡ２、ＣＡ３８として独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに２０１５年８月５日付で寄託され、受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−０２０８２、ＮＩＴＥ Ｐ−０２０８３が付与されている。

［ウシＧｎＲＨニューロン細胞株の樹立］
１．動物、組織採取、不死化細胞の選抜
６ヶ月齢黒毛和種去勢雄ウシを深麻酔下で心停止させ、頭骨をノコギリで切断して、脳を摘出し視床下部視索前野（ｐｒｅｏｐｔｉｃ ａｒｅａ、ＰＯＡ）組織を採取した。細胞培養には、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ（Ｇｉｂｃｏ社製）の代わりにＮｅｕｒｏｂａｓａｌ-Ａ（Ｇｉｂｃｏ社製）を使用した。その他は、実施例１と同様にして不死化細胞を樹立し、クローンとして選抜を行った。

２．細胞のクローニング及び神経由来不死化細胞株の同定
細胞のクローニングは、実施例１と同様に行い、不死化細胞から７３個の細胞クローンを得た。さらに、実施例２と同様にして、ＧＡＰＤＨ、Ｔ−Ａｇ、ＮＳＥ、ＧＦＡＰの発現をＲＴ−ＰＣＲにより解析した。内部標準であるＧＡＰＤＨを発現しているものが５８クローン、うち、Ｔ-Ａｇを発現するものが５７クローンであった。さらに、神経細胞マーカーであるＮＳＥ陽性、かつグリア細胞マーカーであるＧＦＡＰ陰性の細胞株、３８クローンを同定した。結果を表８に、神経細胞として選抜された代表的なクローンについてのＲＴ−ＰＣＲの結果を図６に示す。図６中、ＰＯＡはポジティブコントロールを表し、ウシ視索前野組織から抽出したＲＮＡから合成したｃＤＮＡを用いてＲＴ−ＰＣＲを行った試料である。ＮＣはネガティブコントロールを表し、ｃＤＮＡを用いずにＲＴ−ＰＣＲを行った試料である。

次に、不死化したＮＳＥ陽性、かつＧＦＡＰ陰性神経細胞の３８クローンのＧＮＲＨ１、ＫＩＳＳ１Ｒ、ＥＳＲ１の発現解析を行った。ＧＮＲＨ１、ＫＩＳＳ１Ｒ、ＥＳＲ１のプライマー配列、ＰＣＲ条件は表９に示す。結果を表１０に示す。強いバンドが見られたものを＋、比較的弱いがバンドが認められたものを±、バンドが見られなかったものを−と表記した。

ＧＮＲＨ１、ＫＩＳＳ１Ｒの発現が陽性であり、ＥＳＲ１発現陰性のものをＧｎＲＨニューロンと定義した。ＣＰ３、ＣＰ２２、ＣＰ２８の３クローンでＧＮＲＨ１陽性、ＫＩＳＳ１Ｒ陽性、ＥＳＲ１陰性であった。図７に、ＲＴ−ＰＣＲで増幅したＧＮＲＨ１、ＫＩＳＳ１Ｒ、ＥＳＲ１のフラグメントの電気泳動による解析結果を示す。クローンＣＰ３、ＣＰ２２、ＣＰ２８は、遺伝子発現がＧｎＲＨニューロンの遺伝子発現パターンに近い細胞であると考えられる。

なお、ここで得られた不死化神経細胞株は、ＣＰ３、ＣＰ２２、ＣＰ２８として独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに２０１５年８月５日付で寄託され、受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−０２０８４、ＮＩＴＥ Ｐ−０２０８５、ＮＩＴＥ Ｐ−０２０８６が付与されている。

［種特異的な転写活性］
ＫＮＤｙニューロンの活動に対して促進的に働くニューロキニンＢは、現時点でＧｎＲＨパルス発生機構の最上位因子であると考えられている。したがって、ニューロキニンＢの遺伝子であるＴＡＣ３の転写機構を解明することは繁殖機能を理解するうえで極めて重要である。実施例１で得られたシバヤギＫＮＤｙニューロン細胞株ＧＡ２８を用いて、ＴＡＣ３の転写制御機構を解析した。

最初にヤギＴＡＣ３ ５´上流領域の配列を同定した。ヤギのゲノムはＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ ＆ Ｔｉｓｓｕｅ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、７ヶ月齢雌シバヤギ血液から抽出した。Ｇｅｎｏｍｅ ｗａｌｋｅｒ ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｋｉｔｓ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用い、ゲノムウォーキング法によってヤギＴＡＣ３の翻訳領域より５´上流の配列を得た。得られたヤギＴＡＣ３ ５´側上流３４００塩基の配列は、日本ＤＮＡデータバンク（ＤＤＢＪ）に登録した（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ ＡＢ７９７２１６、配列番号３７、図８）。５´ＲＡＣＥ法により推定されたヤギＴＡＣ３の転写開始点は、翻訳開始点の６９４塩基上流に位置し、「＋１」と表示している。

転写活性評価はルシフェラーゼレポーターを用いて行った。転写開始点から上流２７０６ｂｐ、１８３７ｂｐ、８３４ｂｐ、３３５ｂｐ、１９７ｂｐの各々から下流１６６ｂｐまでをＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲ産物は５´末端、３´末端に夫々ＸｈｏＩ、ＨｉｎｄＩＩＩの制限酵素認識配列を持つように設計し、ｐＧＬ４−ｂａｓｉｃベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）に挿入した。作製したベクターは、ｐＧＬ−２７０６、ｐＧＬ−１８３７、ｐＧＬ−８３４、ｐＧＬ−３３５、ｐＧＬ−１９７と命名した。

実施例１で樹立したヤギＫＮＤｙニューロン細胞株ＧＡ２８、マウス視床下部神経細胞株Ｎ７（コスモ・バイオ社）、ヒト神経芽細胞腫細胞株ＳＫ-Ｎ-ＡＳ（住商ファーマインターナショナル社）を用いて、ＴＡＣ３上流域の転写活性を解析した。

ルシフェラーゼ活性は、Ｄｕａｌ-Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて測定した。ルシフェラーゼレポーターベクターをトランスフェクションしてから４８時間後に細胞を溶解しアッセイに用いた。結果を図９に示す。なお、*はｐ＜０．０５でコントロールであるｐＧＬ−ｂａｓｉｃに対して有意差があることを示している。

ヤギＴＡＣ３の５´上流領域を含むすべてのルシフェラーゼレポーターベクターは、コントロールベクターｐＧＬ−ｂａｓｉｃと比較して、高いルシフェラーゼ活性を示した。いずれの細胞株においてもＴＡＣ３の上流領域を欠失させるにつれてルシフェラーゼ活性が上昇する傾向が認められる。しかしながら、用いる細胞によって、転写活性が異なる点も明らかとなった。例えば、転写開始点から上流１９７ｂｐを含むフラグメントはいずれの細胞株でも高い転写活性を示すが、さらにその上流の配列を含むフラグメントｐＧＬ−３３５を用いるとＫＮＤｙニューロン細胞株ＧＡ２８とヒト神経芽細胞腫細胞株ＳＫ-Ｎ-ＡＳでは転写活性が減少するが、マウス視床下部神経細胞株Ｎ７では転写活性は変化しない。ｐＧＬ−３３５とさらに上流の配列を含むフラグメントｐＧＬ−８３４を比べると、マウス視床下部神経細胞株Ｎ７とヒト神経芽細胞腫細胞株ＳＫ-Ｎ-ＡＳでは転写活性が半分以下に減少するが、ＫＮＤｙニューロン細胞株ＧＡ２８では転写活性は変化しない。

転写活性においても細胞間で違いが認められることから、その他の機能についても細胞間で違いが生じる可能性が示唆される。したがって、ＫＮＤｙニューロンの機能を理解するうえで、本発明で開示しているこれら細胞は重要なツールになるものと考えられる。

［アゴニストの効果］
ウシＫＮＤｙニューロン不死化細胞株ＣＡ３８を用いて、ニューロキニンＢ−ＮＫ３ＲシグナリングがＴＡＣ３の発現に及ぼす影響を解析した。ＫＮＤｙニューロンは、ニューロキニンＢの受容体であるＮＫ３Ｒを発現しており、ニューロキニンＢの刺激を受けてＧｎＲＨのパルス状分泌を制御していることが示唆されている。本発明者らは、ウシ個体を用いて、ＮＫ３Ｒ選択的作動薬であるｓｅｎｋｔｉｄｅの末梢投与が血中ＬＨ濃度を上昇させることを確認している。しかし、このｓｅｎｋｔｉｄｅによるＬＨ濃度上昇を、ＫＮＤｙニューロンの活性化が介しているのかは明らかでない。そこで、本発明で樹立した細胞株ＣＡ３８を用いて、神経ペプチドの遺伝子レベルでの発現解析を行った。

ＣＡ３８細胞株をポリ−Ｌ−リジンコーティングした１００ｍｍディッシュ（ＩＷＡＫＩ社製）で培養した後、定法により細胞を剥離し、アッセイ用培地（１５％ＦＢＳ、１× Ｂ−２７ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、０．５ｍＭ Ｌ−グルタミン、５ｎｇ／ｍｌ ｂＦＧＦを含むＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地）で細胞数を調整し、３．０ｘ１０^４ｃｅｌｌｓ／ウェルとなるようにポリ−Ｌ−リジンコーティングした２４ウェルプレートに播種し、３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーター内で培養した。

２４時間後、培地を除去し、溶媒またはｓｅｎｋｔｉｄｅ（１０ｎＭ、１００ｎＭ、１μＭ、１０μＭ）を含むアッセイ用培地を５００μＬ／ウェルずつ加え、３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーター内で培養を継続した。２４時間後、培地を除き、２００μｌ／ウェルのＴｒｉＰｕｒｅ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔを加え細胞を溶解させた。その後、上述と同様の方法でｔｏｔａｌ ＲＮＡ抽出、ｃＤＮＡ合成を行い、次の操作まで−２０℃で保存した。

Ｓｅｎｋｔｉｄｅ添加から２４時間後のＣＡ３８におけるＴＡＣ３発現量はｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＲＴ−ＰＣＲを用いて以下のようにして解析した。内部標準としてβ−ａｃｔｉｎ遺伝子（ＡＣＴＢ）を用いた。ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅは、Ｐｏｗｅｒ ＳＹＢＲ（登録商標） Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いた。使用したプライマー配列とＰＣＲ条件は表１１に示す。

ｍＲＮＡ量は以下のように算出した。ＰＣＲ産物がある一定量に達した時のサイクル数をＣｔ値とした。各サンプルについて、ＴＡＣ３のＣｔ値からＡＣＴＢのＣｔ値を引き、この値と対照群である溶媒添加群との差（ΔＣｔ値）を求めた。２のΔＣｔ乗を求めることで、ＡＣＴＢ ｍＲＮＡ発現量に対するＴＡＣ３ ｍＲＮＡ発現量を算出し、３回繰り返した実験の平均値±標準誤差で示した。また解離曲線より、目的の遺伝子が増幅されたことを確認した。

統計解析は以下のようにして、ｓｅｎｋｔｉｄｅがＴＡＣ３発現量へ及ぼす影響を検定した。対照群及びｓｅｎｋｔｉｄｅ添加群でのＴＡＣ３発現量を１元配置分散分析（ｏｎｅ−ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）にて解析した後、ｐｏｓｔ−ｈｏｃ検定としてＤｕｎｎｅｔｔ’ｓ検定を行い、対照群と比較した。有意水準は５％とした。結果を図１０に示す。

ＣＡ３８では、ｓｅｎｋｔｉｄｅが濃度依存的にＴＡＣ３発現量を増加させ、１０ｎＭ以上のｓｅｎｋｔｉｄｅ添加群で、対照群と比較してＴＡＣ３発現量が有意に増加していた。

ＳｅｎｋｔｉｄｅがＫＮＤｙニューロンで、ＴＡＣ３あるいはその他の遺伝子の発現に影響を及ぼすことはどのような動物種においても報告されていない。Ｓｅｎｋｔｉｄｅの効果は本細胞株を用いて初めて解析できたことである。ＴＡＣＲ３を発現するＣＡ３８において、ｓｅｎｋｔｉｄｅが濃度依存的にＴＡＣ３発現を促進したことから、ウシＫＮＤｙニューロンにおいてニューロキニンＢがＴＡＣ３発現を促進するポジティブフィードバックの作用を持つ可能性が示された。以上示してきたように、本発明の細胞株を用いることによって、反芻家畜の繁殖制御機構を分子レベルで解析することが可能となる。

本発明の細胞株は家畜視床下部由来の神経細胞株であり、家畜の繁殖機能制御を司るＫＮＤｙニューロン、ＧｎＲＨニューロン由来の細胞株である。家畜の繁殖機能制御機構の解明に有用であり、畜産現場における生産性向上に寄与する研究開発のツールとして使用できる。

ＮＩＴＥ Ｐ−０２０８１
ＮＩＴＥ Ｐ−０２０８２
ＮＩＴＥ Ｐ−０２０８３
ＮＩＴＥ Ｐ−０２０８４
ＮＩＴＥ Ｐ−０２０８５
ＮＩＴＥ Ｐ−０２０８６

Claims (12)

1. 反芻家畜の視床下部神経細胞に由来し、
   ＮＳＥ発現陽性、ＧＦＡＰ発現陰性であることを特徴とする視床下部由来不死化神経細胞株。
2. 前記反芻家畜が、ヤギ、又はウシであることを特徴とする請求項１記載の視床下部由来不死化神経細胞株。
3. 請求項１又は２記載の視床下部由来不死化神経細胞株が、
   ＴＡＣ３、ＥＳＲ１、ＫＩＳＳ１、ＰＤＹＮ、ＴＡＣＲ３、ＰＧＲを少なくとも１つ発現していることを特徴とするＫＮＤｙニューロン由来不死化神経細胞株。
4. 請求項１又は２記載の視床下部由来不死化神経細胞株が、
   ＧＮＲＨ１、及び／又はＫＩＳＳ１Ｒ陽性であることを特徴とするＧｎＲＨニューロン由来不死化神経細胞株。
5. 請求項４記載の視床下部由来不死化神経細胞株が、
   さらに、ＥＳＲ１陰性であることを特徴とするＧｎＲＨニューロン由来不死化神経細胞株。
6. 受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−０２０８１で寄託されているヤギＫＮＤｙニューロン由来不死化神経細胞株ＧＡ２８。
7. 受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−０２０８２で寄託されているウシＫＮＤｙニューロン由来不死化神経細胞株ＣＡ２。
8. 受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−０２０８３で寄託されているウシＫＮＤｙニューロン由来不死化神経細胞株ＣＡ３８。
9. 受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−０２０８４で寄託されているウシＧｎＲＨニューロン由来不死化神経細胞株ＣＰ３。
10. 受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−０２０８５で寄託されているウシＧｎＲＨニューロン由来不死化神経細胞株ＣＰ２２。
11. 受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−０２０８６で寄託されているウシＧｎＲＨニューロン由来不死化神経細胞株ＣＰ２８。
12. 請求項１〜１１に記載の不死化神経細胞株に、
    候補化合物を接触させることを特徴とする反芻家畜の繁殖に効果を有する薬剤のスクリーニング方法。