JP2017118841A - 免疫療法の効果予測マーカー - Google Patents

Abstract

【課題】技術的に簡単で、コストが安く、しかも感度および精度が優れた、癌の免疫療法の臨床効果予測方法を開発する。【解決手段】癌の免疫療法の臨床効果を予測するための方法およびキットであって、対象から得られた試料中のシンデカン−４遺伝子またはタンパクの発現レベルが低いほど、癌の免疫療法の臨床効果が高いと予測する方法およびキット。【選択図】なし

Description

本発明は、癌の免疫療法の臨床効果を予測する方法およびそのためのキットに関する。

近年、癌の免疫療法は標準的な治療の選択肢となってきている。免疫療法の有効性を高めるためには、生物学的な活性を高めるだけでなく、接種前に有効無効を予測する指標（バイオマーカー）が重要である。

癌の免疫療法には癌抗原ペプチドがよく用いられる。癌抗原ペプチドの１つであるＷＴ１ペプチドは、ＷＴ１遺伝子（Wilms' tumor gene 1）によってコードされるＷＴ１タンパク質の一部分である。現在、ＷＴ１ペプチドを用いて種々の癌の免疫療法が行われている。これまで、ＷＴ１ペプチドを用いる癌の免疫療法（WT1ワクチン）の臨床効果を予測することに関し、いくつかの報告がある。高ＷＴ１発現レベルを有する悪性神経膠芽腫患者は、低ＷＴ１発現レベルの者より長く生存したことが報告されている（非特許文献１）。より高いＷＴ１特異的ＣＴＬ（細胞障害性Tリンパ球）の頻度がWT1ワクチンが奏功することの指標であることが報告されている（非特許文献２〜４）。ＷＴ１ワクチン接種の繰り返し治療の際に、ＷＴ１特異的ＣＴＬを維持するために重要であるエフェクターメモリーサブセット（ＥＭｓ）の頻度の増加もまた、WT1ワクチンが有効であることの予測因子であることが報告されている（非特許文献４）。末梢血リンパ球数および免疫後の腫瘍抗原に対する遅延型過敏反応（ＤＴＨ）もまた、様々な免疫療法で報告されているように臨床効果に関する予後因子であることが報告されている（非特許文献５）。しかし、上記報告に基づいて臨床効果を予測するためには、技術的難易度、コストおよび予測感度の面で問題のある場合があった。

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本発明の解決すべき課題は、技術的に簡単で、コストが安く、しかも感度および精度が優れた、癌の免疫療法の臨床効果を予測する方法を開発することであった。具体的には、本発明の解決すべき課題は、癌の免疫療法が有効と予想される患者を選択するための適切なバイオマーカーを見出すことであった。

本発明者らは、癌抗原ペプチドの一例としてＷＴ１ペプチドを用いた癌の免疫療法を受けた脳腫瘍患者の末梢血単核球の網羅的遺伝子発現解析を行ったところ、シンデカン−４遺伝子またはタンパクの低発現が臨床効果と相関することを見出し、本発明を完成するに至った。かくして本発明は以下のものを提供する。

（１）癌の免疫療法の臨床効果を予測するための方法であって、対象から得られた試料中のシンデカン−４遺伝子またはタンパクの発現レベルを測定することを特徴とし、シンデカン−４遺伝子またはタンパクの発現レベルが低いほど、臨床効果が高いと予測する方法。
（２）シンデカン−４遺伝子の発現レベルを内部標準遺伝子の発現レベルと比較することを特徴とする、（１）記載の方法。
（３）内部標準遺伝子がベータアクチンであり、シンデカン−４遺伝子の発現レベルが、ベータアクチンの発現レベルを１とした場合に、０．００１以下である場合に臨床効果が高いと予測する、（２）記載の方法。
（４）試料が末梢血試料である（１）〜（３）のいずれか記載の方法。
（５）癌の免疫療法の臨床効果を予測するためのキットであって、シンデカン−４遺伝子またはタンパクの発現レベルを測定するための試薬を含み、シンデカン−４遺伝子またはタンパクの発現レベルが低いほど、臨床効果が高いと予測するキット。
（６）内部標準遺伝子の発現レベルを測定するための試薬を含む、（５）記載のキット。
（７）内部標準遺伝子がベータアクチンであり、シンデカン−４遺伝子の発現レベルが、ベータアクチンの発現レベルを１とした場合に、０．００１以下である場合に臨床効果が高いと予測する、（６）記載のキット。
（８）試料が末梢血試料である（５）〜（７）のいずれか記載のキット。

本発明によれば、癌の免疫療法の臨床効果を治療前に予測することができる。本発明の方法は、１個の遺伝子またはタンパクの発現を調べるだけで臨床効果を予測できるので、技術的に非常に簡単、安価である。本発明の方法は予測感度および予測精度も高い。

図１は、ＤＮＡマイクロアレイ分析による候補遺伝子の選択について説明する図である。図１ａは、本発明のバイオマーカーを見出すための方法を説明する図式である。先ず、発現に差のある遺伝子（ＤＥＧｓ）をｃＤＮＡマイクロアレイによってスクリーニングし、スクリーニングされた遺伝子の発現レベルが異なる測定方法でも成り立つことを、ディスカバリーセットの３０人の神経膠芽腫患者を用いる定量的ＲＴ−ＰＣＲによって確認した。次に、確認されたＤＥＧｓを、バリデーションセットの２３人の神経膠芽腫患者（ディスカバリーセットの患者とは異なる）を用いて検証した。最終的にシンデカン−４をバイオマーカーとして選択した。図１ｂは、ボルカノプロットを示す。各ドットは１個の遺伝子に対応する。Ｘ軸およびＹ軸は、それぞれ、個々の遺伝子の長期生存者と短期生存者間のシグナル強度の変化倍率の対数値（ｌｏｇ_２［ｓｈｏｒｔ／ｌｏｎｇ］）、および長期生存者と短期生存者間の個々の遺伝子のシグナル強度の相違の統計学的有意差の対数値（−ｌｏｇ_１０［Ｐ ｖａｌｕｅ］）を示す。破線は ｙ＝｜ｘ｜−１，ｙ＝１ および ｜ｘ｜＝０．５を示す。図１ｃは、実施例にて説明するように抽出した３２個の候補ＤＥＧｓに関するボルカノプロットである。遺伝子名と統計学的評価を表３に示す。 図２は、本発明のバイオマーカーとしてのシンデカン−４（ＳＤＣ−４）の効果を示す図である。図２ａはＡＵＣ（曲線下面積）を最大化するようにＯＳ（全生存期間）の閾値を選んだときのＲＯＣ曲線を示す。ＳＤＣ−４発現レベルのカットオフ値０．００１により、長期生存者（ＯＳ≧２５６日）と短期生存者（ＯＳ＜２５６日）は最もよく弁別できる。長期生存者のＳＤＣ−４発現レベルは０．００１以下である。バイオマーカーとしての性能は、７０．４％の感度、７６．０％の特異度、７６．０％の陽性適中率、７０．４％の陰性適中率、および７３．１％の精度であり、カイ二乗検定では有意差が認められた（Ｐ＜０．００１）。この解析ではディスカバリーセットおよびバリデーションセット中のすべての患者を用いた。 図２ｂは、ＳＤＣ−４低発現（０．００１以下）患者とＳＤＣ−４高発現（０．００１より大きい）患者のＯＳ（日）のカプラン−マイヤー曲線を示す。ログランク検定を用いて２群間の比較を行ったところ、２群間でＯＳに統計学的有意差が認められた（ｐ＜０．００１）。一年生存率は、ＳＤＣ−４低発現患者とＳＤＣ−４高発現患者で、それぞれ、６４．０％と１８．５％であった。 図３は、本発明のバイオマーカーとしてのシンデカン−４（ＳＤＣ−４）の末梢血単核球中のタンパクの発現を示す図である。ＭＦＩは平均蛍光強度である。黒いバーは長期生存者、白いバーは短期生存者のＭＦＩを示す。

本発明は、第１の態様において、癌の免疫療法の臨床効果を予測するための方法であって、対象から得られた試料中のシンデカン−４遺伝子またはタンパクの発現レベルを測定することを特徴とし、シンデカン−４（ＳＤＣ−４）遺伝子またはタンパクの発現レベルが低いほど、臨床効果が高いと予測する方法に関するものである。癌の免疫療法は、いかなる癌抗原を用いるものであってもよく、一例としてＷＴ１ペプチドを用いる癌の免疫療法が挙げられる。

本発明により臨床効果が予測される癌の免疫療法に用いられる標的抗原を投与する場合、抗原となる遺伝子産物の部分アミノ酸を含むペプチド、あるいはその改変ペプチドであって、免疫原として対象に投与した場合に抗癌作用を有するものであればいずれのペプチドであってもよい。癌の免疫療法に用いることのできる様々なペプチド（癌抗原ペプチド）が公知であり、一例としてＷＴ１ペプチドが挙げられる。そのようなＷＴ１ペプチドとしては、改変型ＷＴ１_２３５ペプチド（配列番号：１）、ＷＴ１_２３５ペプチド（配列番号：２）、ＷＴ１_１２６ペプチド（配列番号：３）、ＷＴ１_１８７ペプチド（配列番号：４）、ＷＴ１_３３２ヘルパーペプチド（配列番号：５）などが挙げられるがこれらに限定されない。

癌の免疫療法は、治療および予防を包含する。したがって、対象は、癌を有しているヒトであってもよく、癌を有するおそれのあるヒトであってもよく、あるいは健常なヒトであってもよい。癌の免疫療法を予定している対象において、癌の免疫療法が有効かどうかを本発明により予測してもよい。他の癌治療を受けている対象において、癌の免疫療法が有効であるかどうかを本発明により予測してもよい。あるいは、対象において免疫療法によって癌を予防することが有効であるかどうかを本発明により予測してもよい。

癌抗原ペプチドが対象において癌の治療または予防効果を発揮するかどうかは、癌抗原ペプチドが対象のＨＬＡ型に対応するかどうかによる。多くの癌抗原ペプチドに関して、どのＨＬＡ型に適合するのか知られているので、本発明に用いる癌抗原ペプチドを、対象のＨＬＡ型に応じて選択することができる。かかる観点から、癌抗原ペプチドによる癌の免疫療法が適用される対象はいずれのＨＬＡ型を有する者であってもよい。

免疫療法の対象となる癌はいずれの種類の癌であってもよく、例えば、慢性骨髄性白血病などの白血病、骨髄異形成症候群、多発性骨髄腫、悪性リンパ腫などの造血器腫瘍、または食道癌、胃癌、大腸癌、膵臓癌、肺癌、乳癌、胚細胞癌、肝癌、胆道癌、頭頸部癌、皮膚癌、肉腫、腎臓癌、膀胱癌、前立腺癌、精巣癌、子宮癌、子宮頸癌、卵巣癌、甲状腺癌、カルチノイド、肺芽腫、肝芽腫、脳腫瘍あるいは胸腺癌などの固形癌などが例示されるが、これらに限定されない。

本発明の実施に際して、対象から得られた試料中のＳＤＣ−４遺伝子またはタンパクの発現レベルを調べる。試料は、対象のいずれの組織、部位から採取されたものであってもよく、好ましくは末梢血試料であり、その中のリンパ球または単核球におけるＳＤＣ−４遺伝子またはタンパクの発現レベルを調べることが好ましい。

ＳＤＣ−４遺伝子またはタンパクの発現レベルを調べるために、ノーザンブロット法やＰＣＲ法、ウェスタンブロット法やフローサイトメトリー、ＥＬＩＳＡなどの公知の遺伝子・タンパク発現レベルの測定方法を用いることができる。好ましくは定量的ＰＣＲ法、特に好ましくは定量的リアルタイムＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）法を用いる。定量的ＲＴ−ＰＣＲ法は、当業者に広く用いられており、感度、特異度が高く、微量の遺伝子発現レベルでも定量できる。

本発明において、対象から得られた試料中のシンデカン−４遺伝子またはタンパクの発現レベルが低いほど、癌抗原ペプチドによる癌の免疫療法の臨床効果が高いと予測する。好ましくは、ＳＤＣ−４遺伝子の発現レベルを内部標準遺伝子の発現レベルと比較することにより、シンデカン−４遺伝子の発現レベルが低いかどうかを決定する。

内部標準遺伝子としては、組織や実験処理あるいは発生段階によって発現レベルが変動せず安定している遺伝子を用いる。内部標準遺伝子としては、ベータアクチンやグリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）などのハウスキーピング遺伝子が例示されるが、これらの遺伝子に限定されない。

例えば、対象の末梢血由来の試料中のＳＤＣ−４遺伝子の発現レベルを測定するための内部標準遺伝子としてベータアクチンを用いる場合、ベータアクチンの発現レベルを１とすると、ＳＤＣ−４の発現レベルが０．００１以下である場合に、対象においてＷＴ１ペプチドによる癌の免疫療法が有効であると予測することができる。当業者は、内部標準遺伝子や試料の種類に応じて、本発明におけるカットオフ値を適切に定めうる。

本発明は、もう１つの態様において、癌の免疫療法の臨床効果を予測するためのキットであって、ＳＤＣ−４遺伝子またはタンパクの発現レベルを測定するための試薬を含むキットに関するものである。好ましくは定量的ＲＴ−ＰＣＲ法を用いて、とりわけ好ましくは定量的ＲＴ−ＰＣＲ法を用いてＳＤＣ−４遺伝子の発現レベルを測定する。

ＳＤＣ−４遺伝子の発現レベルを測定するための試薬としては、例えば、定量的ＰＣＲを用いる場合には、ＳＤＣ−４遺伝子増幅用プライマーおよび／または定量的ＲＴ−ＰＣＲを行うための酵素類などが挙げられるが、これらに限らない。好ましくは、本発明のキットは、ＳＤＣ−４遺伝子増幅用プライマーのほかに内部標準遺伝子増幅用プライマーおよび／または定量的ＰＣＲを行うための酵素類などを含んでいてもよい。ＳＤＣ−４増幅用のプライマーは、当業者が公知のＳＤＣ−４ヌクレオチド配列に基づいて設計することができる。定量的ＴＲ−ＰＣＲを用いるＳＤＣ−４増幅用プライマーの例として、GGCAGGAATCTGATGACTTTG（フォワード、配列番号：５２）およびGCCGATCATGGAGTCTTCC（リバース、配列番号：５３）が挙げられるが、これらに限定されない。また、内部標準遺伝子としてベータアクチンを用いる場合には、定量的ＴＲ−ＰＣＲを用いるベータアクチン増幅用プライマーの例として、CCAACCGCGAGAAGATGA（フォワード、配列番号：７０）およびCCAGAGGCGTACAGGGATAG（リバース、配列番号：７１）が挙げられるが、これらに限定されない。ＳＤＣ−４遺伝子またはタンパクの発現レベルを測定するための試薬としては、ノーザンブロット法や他のＰＣＲ法、ウェスタンブロット法やフローサイトメトリー、ＥＬＩＳＡなどの公知の遺伝子・タンパク発現レベルの測定方法に用いる試薬であってもよい。このような試薬は、当業者が適宜選択して用いることができる。

以下に実施例を示して本発明をさらに具体的かつ詳細に説明するが、本発明の範囲が実施例に限定されると解すべきではない。

１．材料および方法
（１）ＷＴ１ペプチドワクチン
ＷＴ１ペプチドワクチンは、ＷＴ１−ＣＴＬエピトープペプチドとモンタナイドＩＳＡ５１アジュバントから構成される。本研究で用いられたこのペプチドは改変型９量体ＷＴ１ペプチド（２３５-２４３ ＣＹＴＷＮＱＭＮＬ（配列番号：１）；ｍＷＴ１_２３５）であり、天然ＷＴ１_２３５ペプチド（２３５-２４３ ＣＭＴＷＮＱＭＮＬ（配列番号：２）；ＷＴ１_２３５）のＨＬＡ−Ａ^＊２４：０２に対するアンカー位置である、第二のアミノ酸位置のＹがＭに置き換わっている。ＨＬＡ−Ａ^＊２４：０２分子へのｍＷＴ１_２３５の結合親和性はＷＴ１_２３５よりも高く、ｍＷＴ１_２３５はＷＴ１_２３５よりもＷＴ１を発現する腫瘍細胞に対する非常に強力なＣＴＬ応答を誘導することが実証されている。ＧＭＰグレードのＷＴ１ペプチドは、Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）およびＰｅｐｔｉｄｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（大阪、日本）から購入した。

（２）患者
悪性神経膠芽腫（ＧＢＭ）に対するＷＴ１ペプチドワクチンの第ＩＩ相試験に６０人の患者が登録された。再発または進行ＧＢＭ患者は、その病気が従来の化学療法や放射線療法に抵抗性であった場合に、第ＩＩ相試験に登録される対象であった。他の選択基準は本発明者らの以前の研究と同様であった。簡単には、１）年齢が１６歳から８０歳の間、２）免疫組織化学的解析によって決定された神経膠腫細胞におけるＷＴ１の発現、３）ＨＬＡ−Ａ^＊２４０２陽性、４）推定生存が３ヶ月以上、５）ＥＣＯＧパフォーマンスステータスグレード０−２、６）重篤な臓器機能障害がない、および７）患者の書面によるインフォームドコンセント。すべての登録患者は、ＷＨＯの基準に基づいて、ＧＢＭ（グレード４）を有すると組織学的に証明されていた。

第ＩＩ相試験に登録されていた６０人の患者のうち５３人から、ＷＴ１ワクチン接種の前にＰＢＭＣサンプルが入手可能であった。５３人の患者のうち、１５人の患者が全生存期間（ＯＳ）≧４６０日（中央値：１１３３日、範囲：４８０から２６７８日）である長期生存者として、他の１５人の患者がＯＳ＜４６０日（中央値：２１６日、範囲：１３８−４５８日）として、無作為に選択された、ここで、ＯＳは、再発または疾患の進行から死亡または評価時点（censored time）までの日と定義した。これら３０人の患者（１５人の長期生存者および１５人の短期生存者）がディスカバリーセット（discovery set）の患者と定義され、残りの２３人の患者がバリデーションセット（validation set）の患者と定義された。

ＷＴ１ペプチドワクチン接種と血液サンプルのｃＤＮＡマイクロアレイ解析の第ＩＩ相試験は、大阪大学医学部附属病院の倫理審査委員会によって承認された。

（３）ＷＴ１ペプチドワクチン接種スケジュール
インフォームドコンセントを得た後、３．０ｍｇのモンタナイドＩＳＡ５１アジュバントで乳化したＨＬＡ−Ａ^＊２４：０２拘束性ｍＷＴ１_２３５ペプチドの皮内注射を開始した。スケジュールとしては週１回の接種を１２週連続で行うこととした。応答は、ＲＥＣＩＳＴ（固形腫瘍における応答評価基準）の基準に従って、初期ワクチン接種後１２週で、磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）を使用して、完全寛解（ＣＲ）、部分寛解（ＰＲ）、安定（ＳＤ）及び増悪（ＰＤ）として評価した。臨床応答が明らかになった場合、ＷＴ１ワクチン接種を次の数ヶ月間、２週間間隔で、次いで１〜３ヶ月間隔で、明白な腫瘍の進行や患者の健康状態の悪化が観察されるまで継続した。

（４）血液サンプル
患者から末梢血を得、続いてＬｙｍｐｈｏｃｙｔｅ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ナカライテスク、京都、日本）を用いる密度勾配遠心分離でＰＢＭＣを分離した。分離したＰＢＭＣは使用するまで液体窒素中で保存した。

（５）ＰＢＭＣからのＲＮＡ単離およびｃＤＮＡマイクロアレイ解析
凍結したＰＢＭＣを融解し、ＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いて総ＲＮＡを単離し、クロロホルムを用いて精製し、次いでイソプロパノールおよびエタノール沈殿を行った。精製した総ＲＮＡの量を、ｎａｎｏＤｒｏｐ ＮＤ−１０００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を用いて測定した。

ディスカバリーセット（discovery set）の患者のＰＢＭＣからのＲＮＡを外部メーカー（Ｔｏｒａｙ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）に送付し、ＲＮＡベースのｃＤＮＡマイクロアレイ解析を、Ｈｕｍａｎ ｏｌｉｇｏ ｃｈｉｐ ２５ｋ ｖｅｒ１．００（Ｔｏｒａｙ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を用いてそこで実施した。

マイクロアレイ解析データを、ｇｌｏｂａｌ ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ、続いてｑｕａｎｔｉｌｅ ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎを用いて変換した（Shippy R. et al. Nature biotechnology, 24(9), 1123-1131 2006））。最初に、［（ブランクスポットの平均強度）＋１０×（ブランクスポットの強度の標準偏差）］未満の強度を有する遺伝子を除外した。長期生存者および短期生存者の間で発現に差のある遺伝子（Differentially Expressed Gene, ＤＥＧ）を同定するために、ｌｏｇ_２（２群間の比すなわちｆｏｌｄ−ｃｈａｎｇｅ）（ｘ軸）および二群間のＷｅｌｃｈのｔ検定の−ｌｏｇ_１０（ｐ値）（ｙ軸）で構成されるｖｏｌｃａｎｏ ｐｌｏｔを作成した（Allison DB. et al. Nature reviews. Genetics, 7(1), 55-65 (2006)）。二群間の比の対数値は、以下の式によって計算した：ｌｏｇ_２［（長期生存者における平均シグナル強度）／（短期生存者における平均シグナル強度）］。ＤＥＧは、このｖｏｌｃａｎｏ ｐｌｏｔを用いて以下の条件により選択した：ｙ＞｜ｘ｜^−１、｜ｘ｜＞０．５、およびｙ＞１．０。ＤＥＧの偽陽性の確率を下げるために、個々の遺伝子の発現強度と、無増悪生存期間（ＰＦＳ）またはＲＥＣＩＳＴ基準に従った治療効果判定のいずれかの間の相関を、それぞれ、ＰｅａｒｓｏｎおよびＳｐｅａｒｍａｎの相関係数によって調べた。有意なｐ値を示さなかった遺伝子（ここでは偽陰性を避けるためにアルファレベルは、Ｐｅａｒｓｏｎの相関係数について０．１、かつＳｐｅａｒｍａｎの相関係数について０．２と厳格ではない閾値を設けた）をさらなる解析から除外した。最終的に、以下の６つの条件を満たした遺伝子で次のステップの解析を行った；１） 個々の遺伝子の平均強度≧［（ブランクスポットの平均強度）＋１０×（ブランクスポットの強度の標準偏差）］；２）−ｌｏｇ_１０（長期ＯＳ群および短期ＯＳ群間のｔ検定による差のｐ値）＝｜ｌｏｇ２（倍差（ｆｏｌｄ−ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ））｜^−１；３）｜ｌｏｇ２（倍差）｜＞０．５；４）−ｌｏｇ_１０（長期ＯＳ群および短期ＯＳ群間のｔ検定による差のｐ値）＞１．０；５）ＰＦＳとマイクロアレイのシグナル強度間のＰｅａｒｓｏｎの相関係数のｐ値が＜０．１；かつ治療効果判定およびマイクロアレイのシグナル強度間のＳｐｅａｒｍａｎの相関係数のｐ値＜０．２。

（６）定量的ＲＴ−ＰＣＲ
ＰＢＭＣからのＲＮＡをＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＶＩＬＯ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ＫｉｔおよびＭａｓｔｅｒ Ｍｉｘ （Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いて一本鎖ｃＤＮＡ（ｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ）へ逆転写した。ＲＴ−ＰＣＲのためのプライマー配列を表１に列挙した。標的配列は、ＮＣＢＩヌクレオチドデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｎｕｃｃｏｒｅ）において入手可能である。サンプルｃＤＮＡを、ＢｉｏＭａｒｋ ４８．４８ ｄｙｎａｍｉｃ ａｒｒａｙ ｎａｎｏｆｌｕｉｄｉｃ ｃｈｉｐ （Ｆｌｕｉｄｉｇｍ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）にロードする前に、希釈プライマー混合物と共に１５サイクル、事前に増幅を行った。次いで、ＢｉｏＭａｒｋ ＨＤ （Ｆｌｕｉｄｉｇｍ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いて製造業者のプロトコルに従ってＲＴ−ＰＣＲを行った。ベータアクチン（ＡＣＴＢ）を内部コントロールとして使用し、ΔＣＴを［（各遺伝子のＣＴ値）−（ＡＣＴＢのＣＴ値）］として計算した。遺伝子発現レベルに関するデータはすべて、ｌｏｇ_２（１＋２^−ΔＣＴ）に変換し、統計学的解析を行った。

（７）フローサイトメトリーによるタンパク発現の定量
上記GBM患者と同様に、WT1ペプチドワクチン第II相臨床試験に参加した卵巣癌の患者のうち、ワクチン接種後の生存期間が最も長かった患者3名、最も短かった患者3名の末梢血単核球で解析を行った。抗体はFITC標識抗シンデカン４抗体（5G9）（Santa Cruz, Dallas, Texas, USA）を用いた。タンパク発現はmean fluorescent intensity (MFI)で評価し、染色されていない検体のMFIを減算した値を解析に用いた。

（８）統計解析
ＲＴ−ＰＣＲの統計解析は、ＷＴ１ワクチン接種の開始の日から死亡または打ち切り時点までの生存時間と定義したＯＳを用いて実施した。Ｊａｒｑｕｅ−Ｂｅｒａ検定を用いて変数の正規分布を評価し、かつＦ検定を用いて等分散性（ｈｏｍｏｇｅｎｅｉｔｙ ｏｆ ｖａｒｉａｎｃｅ）を確認した。

ディスカバリーセット（discovery set）とバリデーションセット（validation set）における長期生存者および短期生存者の間の患者の特性の違いを評価するために、年齢、性別、カルノフスキーパフォーマンスステータス（ＫＰＳ）、放射線療法での総吸収線量、外科治療歴の有無、化学療法歴の有無をＣｏｘ比例ハザードモデルで解析した。

ＯＳと定量的ＲＴ−ＰＣＲによって測定された個々の遺伝子発現レベル間の相関を調べるために、個々の遺伝子が正規性（normality）の要件を満たすように、対数、平方根、立方根、または四乗根変換を含む適切な変換を実施した。全ての正規分布した変数を等分散性（ｈｏｍｏｇｅｎｅｉｔｙ ｏｆ ｖａｒｉａｎｃｅ）について確認し、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定により解析した。正規分布ではない変数はＭａｎｎ−ＷｈｉｔｎｅｙのＵ検定を用いて解析した。

治療の有効群・無効群を予測するためのＳＤＣ−４発現レベルのカットオフ値を、Ｙｏｕｄｅｎ’ｓ ｉｎｄｅｘ（Ｙｏｕｄｅｎ’ｓ Ｊ ｓｔａｔｉｓｔｉｃ＝感度＋特異度−１として定義される）が最大になるように、ＲＯＣ曲線を用いて決定した。感度、特異度、陽性および陰性適中率、ならびにＳＤＣ−４の発現レベルによるＯＳの予測の精度は、公式を用いて計算した。ＲＯＣ曲線によって求められたＳＤＣ−４発現レベルのカットオフ値で有効群・無効群の２群に分け、Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ曲線と両側ｌｏｇ−ｒａｎｋ検定を用いて、評価した。統計解析は、ＭＰ Ｐｒｏ １０．０（ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｉｎｃ． Ｃａｒｙ，ＮＣ）およびＲ−ｃｏｍｍａｎｄｅｒなどの、統計用ソフトウェアを使用して実行した。

２．結果
（１）ディスカバリーセット（discovery set）を用いて、ＷＴ１ワクチン接種の前にＰＢＭＣにおいて発現に差のある遺伝子を同定するための探索的ｃＤＮＡマイクロアレイ解析を行った。
ＷＴ１ペプチドワクチンを投与された再発性または従来治療抵抗性の悪性神経膠芽腫患者を、この解析のためのコホートとして選択した。ＷＴ１ワクチン接種前のＰＢＭＣを、このワクチンの臨床試験にエントリーした５３人から採取した。治療効果の予測に有用なバイオマーカーを探索するためのストラテジーの概略を図１ａに示した。５３人の患者のうち、３０人を無作為にディスカバリーセット（discovery set）に登録し、２３人をバリデーションセット（validation set）に登録した。ディスカバリーセット（discovery set）では、ＯＳ≧４６０日（中央値：１１３３日、範囲：４８０から２６７８日）である１５人の患者が長期生存者として、ＯＳ＜４６０日（中央値：２１６日、範囲：１３８−４５８日）である１５人の患者が短期生存者として、選択された（表２）。コックスハザードモデルを用いた解析では、年齢、性別、脳腫瘍に対する外科治療の既往の有無、または脳腫瘍に対する放射線療法の総吸収線量において、治療効果との関連は認められなかったが、パフォーマンスステータスが低いことと化学療法の既往は治療効果を落とすリスクが高い傾向にあった。尚、すべての短期生存者は解析時の打ち切り時点で原病の悪化により死亡している（表３）。

KPS, カルノフスキーのパフォーマンスステータス; RT, 放射線療法 (全照射線量) ;
SD, 標準偏差; OS, 全生存期間; PFS, 無増悪生存期間

†OSの起算日は腫瘍再発もしくは増悪した日
‡OSの起算日はワクチン接種を開始した日

長期生存者および短期の生存者との間で発現に差のある候補遺伝子を発見するために、ＷＴ１ワクチン接種の前にＰＢＭＣを用いてｃＤＮＡマイクロアレイ解析を実施した。ｌｏｇ_２（２群間の比すなわちｆｏｌｄ−ｃｈａｎｇｅ）をｘ軸、統計的有意性の対数値（−ｌｏｇ_１０ｐ値）をｙ軸としてｖｏｌｃａｎｏ ｐｌｏｔ（ここでは、ドットは合計２５，０００遺伝子のそれぞれ１つを示す）を図１ｂに示した。次いで、発現に差のある遺伝子（ＤＥＧ）を以下のように抽出した。最初に、［（ブランクスポットの平均強度）＋１０×（ブランクスポットの強度の標準偏差）］未満の強度を有する遺伝子を除外し、次いで、残りの３，０３７遺伝子を３つの基準、ｙ＞｜ｘ｜^−１、｜ｘ｜＞０．５、およびｙ＞１．０に従って、７４個に絞り込んだ。さらに候補遺伝子を絞り込むために、個々の遺伝子のシグナル強度とＰＦＳまたは臨床応答のいずれかとの間の相関を、それぞれ、ＰｅａｒｓｏｎおよびＳｐｅａｒｍａｎの順位相関解析によって評価し、前者の解析について０．１以上のｐ値、かつ後者の解析について０．２以上のｐ値を有する遺伝子を除外した。最後に、３２遺伝子を候補遺伝子（表４および図１ｃ）として選択した。これらの３２個の候補遺伝子のうち、１１個は長期生存者において高発現し（表４、上段）、２１個は短期生存者において高発現していた（表４、下段）。

† log₂(長期/短期)，‡ two-tailed Welch's t-test

（２）定量的ＲＴ−ＰＣＲによるｃＤＮＡマイクロアレイで選択された候補遺伝子の検証
３０人のディスカバリーセット（discovery set）患者由来のＰＢＭＣにおける、ｃＤＮＡマイクロアレイ解析によって選択された３２個の候補遺伝子の発現レベルを、定量的ＲＴ−ＰＣＲによって確認した。
厳密な統計解析を行うために、定量的ＲＴ−ＰＣＲにより得られた個々の遺伝子の発現レベルを、正規性（normality）の要件を満たすように適切に変換し、Ｊａｒｑｕｅ−Ｂｅｒａ検定によって正規分布について、Ｆ検定によって等分散性（ｈｏｍｏｇｅｎｅｉｔｙ ｏｆ ｖａｒｉａｎｃｅ）について、片側Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定によって有意性の同一傾向（same trend of significance）について確認した（表５）。正規分布に変換できなかった場合には、片側Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定を使用した。これらの統計解析の結果、３２個の候補遺伝子のうち、１５個の遺伝子が長期生存者と短期生存者の間で差があることが再度確認され(表５でVerifiedと表記）、１７個が除外された（表５でExcludedと表記）。

†log₂(長期生存／短期生存)

（３）バリデーションセット（validation set）患者を用いる１５個の候補遺伝子の検証
さらに異なる患者集団でもこれらの候補遺伝子が長期生存者・短期生存者間で差があるか再現性を確認するために、ディスカバリーセット（discovery set）における患者と同じプロトコルでＷＴ１ペプチドワクチンを投与された他の悪性神経膠芽腫の患者２３名をバリデーションセット（validation set）として検証を行った。バリデーションセット（validation set）における患者の特徴を表６に示した。ＯＳと年齢、性別、パフォーマンスステータス、外科治療の有無もしくは化学療法の有無、および先の放射線療法の総吸収線量との間に交絡は認めなかった。バリデーションセット（validation set）患者を用いて、これらの１５遺伝子の発現レベルがＯＳに相関したかどうかを確認した（表７）。これらの解析は、ディスカバリーセット（discovery set）で使用されたものと同一の統計的手法によって行った。結果として、ＳＤＣ−４遺伝子発現レベルがＯＳに対して有意かつ負の相関を有していた（表７）。

KPS, カルノフスキーのパフォーマンスステータス; RT, 放射線療法 (全照射線量) ; SD, 標準偏差; OS, 全生存期間; PFS, 無増悪生存期間

†log₂(長期/短期)
‡表５に示したのと同じ統計学的方法を用いた。

（４）ＳＤＣ−４の発現レベルによるＷＴ１ペプチドワクチンで処置されたＧＢＭ患者の予後の予測
ＷＴ１ワクチン接種前のＰＢＭＣにおけるＳＤＣ−４の発現レベルを用いる、ＷＴ１ペプチドワクチンで処置されたＧＢＭ患者の予後を予測する能力を調べた。
まず、受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線をディスカバリーセット（discovery set）およびバリデーションセット（validation set）の合計５３人の患者を用いて描いた（図２ａ）。OSのカットオフ値として、２５６日と設定したとき「有効群」および「無効群」を最も的確に予測でき、そのときのＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ）は０．７２と最大値となった。有効群（OSが２５６日以上）と無効群（OSが２５６日未満）を予測するための最適なカットオフ値は、Ｙｏｕｄｅｎ’ｓ ｉｎｄｅｘにより０．００１と求められ、有効群では０．００１以下、無効群では０．００１より大きかった。治療効果予測の性能は、７０．４％の感度、７６．０％の特異度、７６．０％の陽性適中率、７０．４％の陰性適中率、および７３．１％の精度であり、カイ二乗検定では有意差が認められた（Ｐ＜０．００１）。

生存率とＳＤＣ−４の発現レベルの間の相関をさらに実証するために、患者を２群、ＳＤＣ−４−低発現（ＳＤＣ−４≦０．００１）群およびＳＤＣ−４−高発現（ＳＤＣ−４＞０．００１）群に分けた（図２ｂ）。その後、両群間のＯＳの差を、Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ曲線、次いでｌｏｇ−ｒａｎｋ検定により評価した。結果は、ＳＤＣ−４−低発現群の患者がＳＤＣ−４−高発現群よりも有意に長く生存することを示した。一年ＯＳ率は、ＳＤＣ−４−低発現患者とＳＤＣ−４−高発現患者で、それぞれ、６４．０％と１８．５％であった。

さらに、コックスハザードモデルを用いて患者特性との交絡を検討した。年齢やパフォーマンスステータスは悪性神経膠芽腫における既知の予後因子であり、またディスカバリーセットでは低いパフォーマンスステータスと化学療法の既往の存在が予後を短くするリスクである傾向にあったが、この解析によりこれらの予後因子との交絡を調整することができる。表８に示す結果からわかるように、SDC-4高発現は独立した臨床効果予測因子であり、有意に臨床効果を低下させていた。（ハザード比13.8、９５％信頼区間1.35〜84.2、ｐ＝０．０２７）

KPS, カルノフスキーのパフォーマンスステータス; RT, 放射線療法 (全照射線量)
†時間変数として免疫療法開始からのＯＳを用いるコックスハザードモデルを使用した。

（５）フローサイトメトリーによるタンパク発現の定量
WT1ペプチドワクチン第II相臨床試験に参加した卵巣癌の患者のうち、ワクチン接種後の生存期間が最も長かった患者3名、最も短かった患者3名の末梢血単核球で解析を行った。蛍光標識した抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ４抗体および抗ＣＤ８抗体で染色し、フローサイトメトリーで、ＣＤ３^＋T細胞、ＣＤ４^＋Ｔ細胞およびＣＤ８^＋Ｔ細胞のＳＤＣ−４タンパクの発現を解析した。ＳＤＣ−４タンパクの検出にはFITC標識抗シンデカン４抗体（5G9）（Santa Cruz, Dallas, Texas, USA）を用いた。タンパク発現はmean fluorescent intensity (MFI)で評価し、染色されていない検体のMFIを減算した値を解析に用いた。マルチカラー解析では、ＣＤ３^＋T細胞、ＣＤ４^＋Ｔ細胞およびＣＤ８^＋Ｔ細胞において長期生存者ではSyndecan-4タンパクの発現が低く、ＳＤＣ−４ ｍＲＮＡデータと一致した。結果を図３に示す。

以上の実験および解析データから、ＳＤＣ−４遺伝子またはタンパクの発現レベルが低いほど、癌の免疫療法の臨床効果が高いと予測できることが確認された。

本発明は、診断薬、検査薬、研究試薬等の分野において使用可能である。

Claims (8)

1. 癌の免疫療法の臨床効果を予測するための方法であって、対象から得られた試料中のシンデカン−４遺伝子またはタンパクの発現レベルを測定することを特徴とし、シンデカン−４遺伝子またはタンパクの発現レベルが低いほど、臨床効果が高いと予測する方法。
2. シンデカン−４遺伝子の発現レベルを内部標準遺伝子の発現レベルと比較することを特徴とする、請求項１記載の方法。
3. 内部標準遺伝子がベータアクチンであり、シンデカン−４遺伝子の発現レベルが、ベータアクチンの発現レベルを１とした場合に、０．００１以下である場合に臨床効果が高いと予測する、請求項２記載の方法。
4. 試料が末梢血試料である請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
5. 癌の免疫療法の臨床効果を予測するためのキットであって、シンデカン−４遺伝子またはタンパクの発現レベルを測定するための試薬を含み、シンデカン−４遺伝子またはタンパクの発現レベルが低いほど、臨床効果が高いと予測するキット。
6. 内部標準遺伝子の発現レベルを測定するための試薬を含む、請求項５記載のキット。
7. 内部標準遺伝子がベータアクチンであり、シンデカン−４遺伝子の発現レベルが、ベータアクチンの発現レベルを１とした場合に、０．００１以下である場合に臨床効果が高いと予測する、請求項６記載のキット。
8. 試料が末梢血試料である請求項５〜７のいずれか１項記載のキット。

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