JP2017141222A - パーキンソン病に併発した認知障害の治療剤及びそのスクリーニング方法 - Google Patents

Abstract

【課題】パーキンソン病に併発した認知障害に対して有用な治療剤及びそのスクリーニング方法を提供する。
【解決手段】パーキンソン病に併発した認知障害の治療剤は、ホスホジエステラーゼ阻害薬、アデニル酸シクラーゼ活性化薬又はｃＡＭＰ誘導体を有効成分とする。
【選択図】図３

Description

本発明は、パーキンソン病に併発した認知障害の治療剤及びそのスクリーニング方法に関する。

パーキンソン病は黒質の変性を主病変とする神経変性疾患の１つであり、脳内のドパミン不足とアセチルコリンの相対的増加とを病態とする。パーキンソン病はアルツハイマー病についで頻度の高い疾患であり、有病率は１０万人あたり１００人である。症状としては振戦、固縮、無動、姿勢反射障害等を認めるとともに、様々な全身症状や精神症状も合併する。症状がゆっくりと進行するため、本人の自覚症状がないまま症状が悪化することもある。パーキンソン病の約９５％は孤発例であり、遺伝的な影響は低いとされている。パーキンソン病患者の約４０％に認知症が併発するといわれている。

パーキンソン病の治療法としては、ドパミンの前駆物質であるレボドパ等の投与、運動療法、脳の一定の部位に電極を埋め込む脳深部刺激療法などが試みられており、ｉＰＳ細胞による再生医療にも期待が寄せられているが、現在のところ根本的な治療法は確立されていない。

ドパミンは精神運動機能を調節する神経伝達物質であり、ドパミン情報伝達系においては、ｃＡＭＰ／ＰＫＡシグナルが中心的役割を担う。

そこで、ｃＡＭＰ濃度を上昇させるホスホジエステラーゼ阻害剤を用いた神経性疾患の治療方法が、いくつか報告されている。

特許文献１には、ホスホジエステラーゼ４型（ＰＤＥ４）のインヒビターを用いて神経系の再生及び修復を刺激するための方法が記載されている。特許文献１には、ＰＤＥ４のインヒビターとしてロリプラムが例示され、神経変性疾患として、筋萎縮性側索硬化症、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンティングトン病等が例示されている。

非特許文献１には、スコポラミンにより空間認識障害を発症したラットに対する標記薬物（ＲＯ）による治療効果を迷路試験及び受動回避試験を用いて評価したことが記載され、ＲＯの学習及び記憶改善作用は、ホスホジエステラーゼ４の阻害作用に伴うｃＡＭＰの増加により間接的に中枢のコリン系及びノルアドレナリン系を増強した結果と推定されたと記載されている。

非特許文献２には、ｃＡＭＰに特異的なホスホジエステラーゼ阻害剤であるロリプラムが、ラットの走行試験及びマウスの受動回避試験で、記憶障害に起因する誤りの増加を減少させたことが記載され、この結果はロリプラムがｃＡＭＰ濃度を上昇させて学習及び記憶障害を改善することを示唆したとされている。

非特許文献３には、ホスホジエステラーゼ４（ＰＤＥ４）の選択的阻害剤であるロリプラムを恐怖関連記憶想起直後に背側海馬に投与した場合に、記憶増強が可能であることが記載されている。

特表２００４−５３２８０９号公報

ＥＧＡＷＡ Ｔ ｅｔ．ａｌ，Ｒｏｌｉｐｒａｍ ａｎｄ Ｉｔｓ Ｏｐｔｉｃａｌ Ｉｓｏｍｅｒｓ，Ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒａｓｅ ４ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ，Ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ ｔｈｅ Ｓｃｏｐｏｌａｍｉｎｅ−Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｉｍｐａｉｒｍｅｎｔｓ ｏｆ Ｌｅａｒｎｉｎｇ ａｎｄ Ｍｅｍｏｒｙ ｉｎ Ｒａｔｓ．Ｊｐｎ Ｊ ＰｈａｒｍａｃｏｌＶｏｌ．７５，Ｎｏ．３，Ｐａｇｅ．２７５−２８１（１９９７．１１） ＩＭＡＮＩＳＨＩ Ｔ，ｅｔ．ａｌ，Ａｍｅｌｉｏｒａｔｉｎｇ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｒｏｌｉｐｒａｍ ｏｎ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｌｙ ｉｎｄｕｃｅｄ ｉｍｐａｉｒｍｅｎｔｓ ｏｆ ｌｅａｒｎｉｎｇ ａｎｄ ｍｅｍｏｒｙ ｉｎ ｒｏｄｅｎｔｓ．Ｅｕｒ Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｖｏｌ．３２１，Ｎｏ．３， Ｐａｇｅ．２７３−２７８（１９９７．０３．０５） ＲＯＥＳＬＥＲ Ｒａｆａｅｌ ｅｔ．ａｌ，Ａ ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒａｓｅ ４−ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｓｗｉｔｃｈ ｂｅｔｗｅｅｎ ｍｅｍｏｒｙ ｅｘｔｉｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｔｒｅｎｇｔｈｅｎｉｎｇ ｉｎ ｔｈｅ ｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓ，Ｆｒｏｎｔ Ｂｅｈａｖ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｖｏｌ．２０１４，Ｎｏ．Ｍａｒ，Ｐａｇｅ．ＷＥＢ ＯＮＬＹ（２０１４．０３）

しかしながら、パーキンソン病に併発する認知障害に対して有効な治療剤については報告がなされていなかった。

発明者らは、ホスホジエステラーゼ阻害薬、アデニル酸シクラーゼ活性化薬又はｃＡＭＰ誘導体によって、パーキンソン病に起因する認知障害を治療できることを新たに見出したことにより、本発明を完成させた。本発明は、パーキンソン病に併発した認知障害に対して有用な治療剤及びそのスクリーニング方法を提供することを目的とする。

上記目的を達成するため、本発明の第１の観点に係るパーキンソン病に併発した認知障害の治療剤は、ホスホジエステラーゼ阻害薬、アデニル酸シクラーゼ活性化薬又はｃＡＭＰ誘導体を有効成分とする。

例えば、ロリプラム又はその薬学的に許容可能な塩を有効成分とする。

本発明の第２の観点に係るパーキンソン病に併発した認知障害の治療剤のスクリーニング方法は、
候補物質を被検動物に投与する工程と、
前記被検動物の海馬歯状回におけるｃＡＭＰレベル上昇の度合を測定する工程と、
を含む。

本発明によれば、パーキンソン病に併発した認知障害に対して有用な治療剤及びそのスクリーニング方法を提供することができる。

消去トレーニング後の海馬、扁桃体及び前頭前皮質におけるｃ−ｆｏｓ陽性細胞数の測定結果を示す図である。 消去トレーニング後の海馬歯状回における活性型リン酸化ＣＲＥＢ陽性細胞数の測定結果を示す図である。 パーキンソン病モデルマウス（ＰＤマウス）における認知障害に対するロリプラムによる治療効果を示すグラフ図である。 ＰＤマウスの記憶消失前後における海馬のｃＡＭＰレベルを測定した結果を示すグラフ図である。 ＰＤマウスの海馬歯状回の活性型リン酸化ＣＲＥＢの発現を調べた結果を示すグラフ図である。

まず、本実施形態によるパーキンソン病に併発した認知障害の治療剤について詳細に説明する。

本実施形態によるパーキンソン病に併発した認知障害の治療剤は、ホスホジエステラーゼ阻害薬、アデニル酸シクラーゼ活性化薬又はサイクリックＡＭＰ（ｃＡＭＰ）誘導体を有効成分とする。

本発明は、パーキンソン病に併発した認知障害、つまりパーキンソン病に起因する認知障害に治療効果を有するものであって、パーキンソン病自体には治療効果を有しない。本明細書において、認知障害とは、主に学習、記憶、理解、問題解決に障害をきたしている状態であり、記憶障害、記憶消去亢進、認知症、せん妄、意識障害、過度の眠気、抑うつ、不安、アパシー（無気力、無感動）等を包含する概念である。

ホスホジエステラーゼ阻害薬としては、ロリプラム（４−（３−シクロペンチルオキシ−４−メトキシフェニル）ピロリジン−２−オン）、テオフィリン、イソブチルメチルキサンチン、パパベリン、８−メトキシメチル−イソブチルメチルキサンチン、ミルリノン、クアジノン、トレキンジン、ジピリダモール、イソブチルメチルキサンチン、アミノフィリン、ジプロフィリン、プロキシフィリン、コリンテオフィリン、アムリノン、オルプリノン、ピモベンダン、シロスタゾール等又はそれらの薬学的に許容可能な塩を例示することができる。ホスホジエステラーゼ阻害薬は好ましくは、ホスホジエステラーゼ（特にＰＤＥ−ＩＶＢ）の選択的阻害薬であるロリプラム又はその薬学的に許容可能な塩である。

ロリプラムの構造式を以下に示す。

アデニル酸シクラーゼ活性化薬としては、コルホルシンダロパート等又はそれらの薬学的に許容可能な塩を例示することができる。

ｃＡＭＰ（サイクリックＡＭＰ）誘導体としては、ブクラデシン（ジブチリルサイクリックＡＭＰ）等又はそれらの薬学的に許容可能な塩を例示することができる。

本明細書において「薬学的に許容可能な塩」とは、開示された化合物の誘導体を意味し、そこにおいて、親化合物は、塩にするために、酸又は塩基部分の交換によって修飾される。薬学的に許容可能な塩の例は、非限定的ではあるが、アミン、アルカリのような塩基性残基の鉱物若しくは有機酸塩、又はカルボキシル酸などのような酸性残基の有機塩が含まれる。本明細書において、薬学的に許容可能な塩は、例えば非中毒性の無機又は有機酸から形成される親化合物の従来の非中毒性塩を含む。本明細書において、薬学的に許容可能な塩は、従来の化学的方法によって塩基性又は酸性部分を含む親化合物から合成されることがある。通常、このような塩は、水中又は有機溶媒中または２つの混合溶液中において適切な塩基又は酸の化学量論的な量で、これらの化合物の遊離酸又は遊離塩基を反応させることで調製されることがある。一般的には、エーテル、酢酸エチル、エタノール、イソプロパノール、アセトニトリル（ＡＣＮ）等のような非水系媒体が好適である。適当な塩のリストは、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１７ｔｈ ｅｄ．、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐａ．、１９８５、ｐ．１４１８及びＪｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ、６６、２（１９７７）に記載されている。

本実施形態による治療剤の投与方法は、経口投与、局所投与（例えば、脳への局所投与、特には海馬歯状回への局所投与）、静脈内投与、腹腔内投与、皮内投与、舌下投与等、適宜選択され得る。投与剤型も任意であってよく、例えば、錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤等の経口用固形製剤、内服液剤、シロップ剤等の経口用液体製剤、注射剤などの非経口用液体製剤等に適宜調製することができる。また、適切なドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）（例えば、脳血液関門を通過するためのＤＤＳ）を用いてもよい。

本実施形態による治療剤の投与量は、患者の年齢、体重、適応症状等によって適宜設定することができるが、例えば、ロリプラム又はその薬学的に許容可能な塩である場合、経口投与で、例えば０．０２〜２００ｍｇ／日、例えば０．１〜２．０ｍｇ×３／ｋｇ／日であってもよい。また、本実施形態による治療剤の投与量は、食事中投与、食後投与、食前投与、食間投与、就寝前投与等のいずれも可能である。

本実施形態による治療剤は、海馬歯状回におけるｃＡＭＰ濃度を上昇させることにより、パーキンソン病に併発した認知障害に対して治療効果を奏するものと考えられる。パーキンソン病の原因は黒質ドパミン性神経細胞の変性で、それによる線条体ドパミン低下がほとんどの症状の責任病巣と考えられているのに対し、本発明者らは、パーキンソン病に併発した認知障害において、海馬歯状回のｃＡＭＰ濃度を上昇させることで認知障害が改善されることを見出した。本実施形態による治療剤がパーキンソン病自体に治療効果を有しないのは、該治療剤が（パーキンソン病患者の破壊された）中脳黒質及び黒質−線条体のドパミン神経に影響を与えないからである。従来のロリプラムをはじめとするホスホジエステラーゼ阻害薬による認知障害の治療は、血流促進等を意図したものであり、海馬歯状回をターゲットとする本実施形態による治療剤とは異なるものである。

次に、本実施形態によるパーキンソン病に併発した認知障害の治療剤のスクリーニング方法について説明する。

本実施形態によるパーキンソン病に併発した認知障害の治療剤のスクリーニング方法は、
（ａ）候補物質を被検動物に投与する工程と、
（ｂ）前記被検動物の海馬歯状回におけるｃＡＭＰレベル上昇の度合を測定する工程と、
を含む。

上記工程（ａ）において、候補物質は、パーキンソン病に併発した認知障害の治療剤の候補物質であり、例えば、化合物、タンパク質、ペプチド、これらの混合物等である。

上記工程（ａ）において、被検動物は、例えば、マウス、ラット、ウサギ、イヌ等である。候補物質の投与方法は、例えば、腹腔内投与、局所投与（例えば、脳への局所投与、特には海馬歯状回への局所投与）、経口投与、静脈内投与、皮内投与、舌下投与等、適宜選択され得る。

上記工程（ｂ）において、被検動物の海馬歯状回におけるｃＡＭＰレベルを測定する方法としては、被検動物の海馬歯状回由来の試料を作製し、該試料中のｃＡＭＰ濃度を、例えばｃＡＭＰ定量ＥＩＡキットを用いて測定する方法等が例示されるが、海馬歯状回におけるｃＡＭＰレベルを測定することができる限り、測定方法は限定されない。

上記工程（ｂ）において、海馬歯状回のｃＡＭＰレベルを測定し、そのｃＡＭＰレベルを、候補物質投与前のｃＡＭＰレベル又はｃＡＭＰ濃度の標準値と比較することで、海馬歯状回のｃＡＭＰレベル上昇の度合を測定することができる。海馬歯状回のｃＡＭＰ濃度が、候補物質投与前のｃＡＭＰ濃度の値又は標準値より高い場合には、候補物質がパーキンソン病に併発した認知障害の治療剤として使用可能であることが判明する。

なお、他の実施形態による治療剤のスクリーニング方法では、ＭＰＴＰ誘発性パーキンソン病モデルマウス（下記の実施例にて詳述）から作製された急性海馬スライス標本が使用される。より具体的には、上記の急性海馬スライス標本に候補物質を添加し、電気生理学的に長期抑圧（Ｌｏｎｇ Ｔｅｒｍ Ｄｅｐｒｅｓｓｉｏｎ：ＬＴＤ）、長期増強（Ｌｏｎｇ Ｔｅｒｍ Ｐｏｔｅｎｔｉａｔｉｏｎ：ＬＴＰ）等を評価して、候補物質の添加によってこれらの改善がみられる場合、その候補物質がパーキンソン病に併発した認知障害の治療剤として使用可能であることが判明する。

以上説明したように、本実施形態による治療剤は、パーキンソン病に併発した認知障害に対して特異的に治療効果を発揮することができる。

以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明する。ただし、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

パーキンソン病モデルマウス（以下、「ＰＤマウス」と称する）を用いて、文脈的恐怖条件付けテストによって、パーキンソン病に併発した認知障害に対するロリプラムの治療効果について検証した。

ＰＤマウスは、中脳黒質のドパミン神経細胞を特異的に破壊する１−ｍｅｔｈｙｌ−４−ｐｈｅｎｙｌ−１，２，３，６−ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｐｙｒｉｄｉｎｅ（ＭＰＴＰ）を腹腔内投与することで作出した。より具体的には、８週令のｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに、生理食塩水に溶解したＭＰＴＰ（２０ｍｇ／Ｋｇ［１００μＬ］）を４回（２時間の投与間隔）腹腔内に投与することで作出した。なお、ＭＰＴＰによる病態はほぼ黒質線条体に限局され、海馬等の神経細胞に直接的な毒性は示さないとされている。ＰＤマウスの作製については、Ｋｉｎｏｓｈｉｔａ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．１３７：２８−３６を参照した。なお、図１−５において、「Ｃｏｎｔｒｏｌ」とは、ＭＰＴＰの代わりに生理食塩水を投与した正常ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスを表す。

文脈的恐怖条件付けテストについて以下に説明する。このテストは、装置にマウスを入れ（条件刺激：ＣＳ）、嫌悪刺激となる電気刺激を与える（無条件刺激：ＵＳ）ことで、その装置内に置かれた環境に対する恐怖を学習・記憶させるテストである。近年、獲得後固定された記憶は想起とともに一度不安定な状態となり、再固定という過程を経て長期記憶となることや、不安定な記憶は他の記憶と塗り替えられることで記憶の消去につながることが示唆されている。このテストでは、記憶の固定（装置にマウスを入れ（条件刺激：ＣＳ）、嫌悪刺激となる電気刺激を与える（無条件刺激：ＵＳ））の後、３０分間のＣＳ暴露（消去トレーニング）を再度行い、記憶の消去を誘導する。記憶の評価は、マウスの恐怖行動の指標であるフリージング行動を測定することで行った。フリージング行動の割合が低いほど、記憶の消去が亢進していることを表す。

まず、ロリプラムの治療効果の検証に先立ち、上記のＰＤマウスにおいて、ＭＰＴＰ投与後７日目に、記憶の消去学習を誘導した際に活性化する脳領域を特定するため、神経活性のマーカーであるｃ−ｆｏｓの発現量を調べた。より具体的には、記憶の固定（０日目）後、１〜２日目の間、毎日、３０分間ＣＳ暴露（消去トレーニング）を行い、消去トレーニング３０分後の各脳領域（海馬、扁桃体及び前頭前皮質）におけるｃ−Ｆｏｓ陽性細胞数を測定した（各群ｎ＝３）。

ｃ−ｆｏｓの発現量の評価を、免疫染色により行った。以下に免疫染色の方法を説明する。
（１）４％パラホルムアルデヒドにて固定した脳を４０μｍの厚さで薄切した。海馬はブレグマ後方１．５８，１．７０，１．８２，１．９４，２．０６，２．１８ｍｍ、扁桃体はブレグマ後方１．５８，１．７０，１．８２，１．９４ｍｍ、前頭頭前皮質はブレグマ前方１．９４，１．８２，１．７０，１．５８，１．３４ｍｍの切片を用いた。
（２）０．５％ ＴｒｉｔｏｎＸ添加ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ（以下Ｔ−ＰＢＳ）にて切片を１時間反応させた。
（３）ＰＢＳにて１００倍希釈した過酸化水素に４０分間反応させた。
（４）Ｔ−ＰＢＳにて１００倍希釈したヤギ血清に１時間反応させた。
（５）Ｔ−ＰＢＳにて５０００倍希釈した一次抗体ａｎｔｉ−ｃ−ｆｏｓ ｒａｂｂｉｔ ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ抗体（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）を２４時間反応させた。
（６）Ｔ−ＰＢＳにて５００倍希釈した２次抗体ビオチン化ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ（Ｖｅｃｔｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）に２時間反応させた。
（７）Ｔ−ＰＢＳにて５００倍希釈したａｖｉｄｉｎｅ−ｂｉｏｔｉｎ−ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄｅ（Ｖｅｃｔｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）混合液に２時間反応させた。
（８）５０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ緩衝液（ｐＨ ７．６）、０．０２５％ ３，３−Ｄｉａｍｍｉｎｏｂｅｎｚｉｄｉｎｅ、０．０７５％過酸化水素水を含む発色液にて発色させた。
（９）５０％グリセロールにて封入後、光学顕微鏡下で観察、各脳領域における細胞数を測定した。海馬はＣＡ１、歯状回（Ｄｅｎｔａｔｅ Ｇｙｒｕｓ：ＤＧ）；扁桃体は外側核（Ｌａｔｅｒａｌ Ａｍｙｇｄａｌａ：ＬＡ）、外側基底核（Ｂａｓｏｌａｔｅｒａｌ Ａｍｙｇｄａｌａ：ＢＬＡ）；前頭前皮質は前辺縁皮質（Ｐｒｅｌｉｍｂｉｃ Ｃｏｒｔｅｘ：ＰＬ）、下辺縁皮質（Ｉｎｆｒａｌｉｍｂｉｃ Ｃｏｒｔｅｘ：ＩＬ）において細胞数の計測を行った。全ての切片において左右ｃ−ｆｏｓ陽性細胞数を計測し、合計数をグラフに示した。

結果を図１に示す。ｃ−ｆｏｓは海馬、扁桃体及び前頭前皮質の３つの脳領域のすべての領域で発現しており、これらの脳領域が記憶の消去に機能していることが分かったが、その発現量はＰＤマウスとｃｏｎｔｒｏｌマウス間で差はなかった。

また、上記のＰＤマウスにおいて、ＭＰＴＰ投与後７日目に、記憶形成に寄与する転写因子の１つとして知られているｃＡＭＰ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｅｌｅｍｅｎｔ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＣＲＥＢ）の活性型リン酸化ＣＲＥＢの発現量を調べた。より具体的には、記憶の固定（０日目）後、１〜２日目の間、毎日、３０分間ＣＳ暴露（消去トレーニング）を行い、消去トレーニング３０分後の海馬歯状回におけるリン酸化ＣＲＥＢ陽性細胞数を測定した（各群ｎ＝５）。

活性型リン酸化ＣＲＥＢの発現量の評価を、蛍光免疫染色により行った。以下に蛍光免疫染色の方法を説明する。
（１）４％パラホルムアルデヒドにて固定した脳を４０μｍの厚さで薄切した。ブレグマ後方１．８２，１．９４，２．０６ｍｍの切片を用いた。
（２）Ｔ−ＰＢＳにて切片を１時間反応させた。
（３）Ｔ−ＰＢＳにて１００倍希釈したヤギ血清に１時間反応させた。
（４）Ｔ−ＰＢＳにて５００倍希釈した１次抗体ａｎｔｉ−ｐ−ＣＲＥＢ ｒａｂｂｉｔ ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ社）を４８時間反応させた。
（５）Ｔ−ＰＢＳにて５０００倍希釈した２次抗体ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）５６８ ｇｏａｔ ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を２時間反応させた。
（６）ＶＥＣＴＡ ＳＨＩＬＤ ｍｏｕｎｔｉｎｇ ｓｅｒｕｍにて封入後、共焦点レーザー顕微鏡にて観察し、海馬歯状回領域の活性型リン酸化ＣＲＥＢ陽性細胞数を評価した。３枚の切片において左右の活性型リン酸化ＣＲＥＢ陽性細胞数を計測し、合計数をグラフに示した。

結果を図２に示す。活性型リン酸化ＣＲＥＢは、ＰＤマウスの海馬歯状回でｃｏｎｔｒｏｌマウスと比べ有意な減少が認められた（ｐ＜０．０５ ｖｓ．ｃｏｎｔｒｏｌ）。

以上より、ＰＤマウスの認知機能の低下において、海馬の特定機能に何らかの障害が生じている可能性が示唆された。

記憶消去誘導時に活性型リン酸化ＣＲＥＢの発現誘導が減少したＰＤマウスの海馬歯状回において、薬理学的手法を用いて活性型リン酸化ＣＲＥＢの発現誘導を促進すると、記憶障害が改善されることが予想されたため、以下の実験を行った。

上記のＰＤマウスにおいて、ＭＰＴＰ投与後７日目に、ホスホジエステラーゼを阻害するロリプラムの腹腔内投与を行い、ＰＤマウスが示す記憶の消去亢進及び記憶の保持能力の低下が改善されるか否かについて解析した。記憶の保持能力は、記憶の固定（０日目）後、１〜３日目の間、毎日、３０分間ＣＳ暴露（消去トレーニング）を行い、その際のフリージング行動を測定する（３０分間のＣＳ暴露中の、始めの３分間及び終わりの３分間）ことで、毎日の連続的な消去誘導後にどの程度記憶が保持されているのか、すなわち記憶の保持能力を解析した。

フリージング行動の測定について説明する。“フリージング”を、１秒間以上、呼吸以外のすべての動きが無いことと定義し、マウスをビデオカメラで撮影記録し、低速で再生しながらフリージングの総時間を計測した。図３の縦軸において、３分間内でフリージングした総時間（秒）を３分（１８０秒）で割り算して求めた割合を％で表した。

ロリプラムの腹腔内投与について以下に説明する。上記１〜３日目における３０分間のＣＳ暴露の２時間前に、１ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ又は３ｍｇ／ｋｇの用量で、１％ＤＭＳＯに溶解したロリプラムをＰＤマウスに腹腔内投与した（図３）。なお、対照群には１％ＤＭＳＯを投与した。

結果を図３に示す。３０分間のＣＳ暴露によって、２日目及び３日目の始めの３分間、１日目及び２日目の終わりの３分間では、１日目の始めの３分間に比して、ＰＤマウスのフリージング行動の顕著な減少、すなわち記憶の消去亢進が観察された。しかしながら、ロリプラムは、用量依存的に、ＰＤマウスのフリージング行動の減少（記憶の消去亢進）をｃｏｎｔｒｏｌマウスのレベルにまで回復させた。このロリプラムによる記憶の消去亢進の回復効果について、ロリプラムは消去トレーニング（３０分間のＣＳ暴露）前に単回投与されたにすぎないので、黒質のドパミン神経細胞を補修したことに起因するとは考えられず、ロリプラムが記憶消去に関わる脳領域（特に海馬歯状回）のｃＡＭＰ濃度を上昇させたことが、パーキンソン病に併発した認知障害の改善につながったものと考えられた。

次に、記憶消失前後における海馬のｃＡＭＰレベルを測定することで、ロリプラム投与によるＰＤマウスの恐怖記憶の消去改善効果を検討した。

上記のＰＤマウスにおいて、ＭＰＴＰ投与後７日目に、ロリプラムの腹腔内投与を行い、海馬のｃＡＭＰレベルを測定した。より具体的には、記憶の固定（０日目）後、１〜２日目における３０分間のＣＳ暴露（消去トレーニング）の２時間前に、３ｍｇ／ｋｇの用量で１％ＤＭＳＯに溶解したロリプラムをＰＤマウスに腹腔内投与した（対照群には１％ＤＭＳＯを投与）。記憶の固定（０日目）後、毎日、３０分間ＣＳ暴露（消去トレーニング）を行い、消去前群では消去トレーニングの前に海馬サンプルを摘出し、消去後群では消去トレーニングの直後に海馬サンプルを摘出した（各群ｎ＝６〜８）。海馬サンプルのｃＡＭＰ濃度測定は、Ｃｙｃｌｉｃ ＡＭＰ ＥＩＡ ｋｉｔ（Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ）を用いて行われ、タンパク質量の調整は、ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓａｙ ｋｉｔ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて行われた。

結果を図４に示す。ＭＰＴＰを投与したＰＤマウスでは恐怖記憶消去時、海馬におけるｃＡＭＰが減少していることが示された。一方で、ロリプラム３ｍｇ／ｋｇを投与することで、ＰＤマウスにおける海馬ｃＡＭＰ減少が改善された。以上より、ロリプラムは、記憶消去に関わる海馬のｃＡＭＰ濃度を上昇させることによって、記憶消失を改善することが示唆された。

次に、海馬歯状回の活性型リン酸化ＣＲＥＢの発現を調べることで、ロリプラム投与によるＰＤマウスの恐怖記憶の消去改善効果を検討した。

上記のＰＤマウスにおいて、ＭＰＴＰ投与後７日目に、ロリプラムの腹腔内投与を行い、海馬歯状回の活性型リン酸化ＣＲＥＢの発現量を調べた。より具体的には、記憶の固定（０日目）後、１〜２日目における３０分間のＣＳ暴露（消去トレーニング）の２時間前に、３ｍｇ／ｋｇの用量で１％ＤＭＳＯに溶解したロリプラムをＰＤマウスに腹腔内投与した（対照群には１％ＤＭＳＯを投与）。記憶の固定（０日目）後、１〜２日目の間、毎日、３０分間ＣＳ暴露（消去トレーニング）を行い、消去トレーニング３０分後の海馬歯状回におけるリン酸化ＣＲＥＢ陽性細胞数を測定した（各群ｎ＝７〜９）。活性型リン酸化ＣＲＥＢの発現量の評価については、上述同様の蛍光免疫染色により行った。

結果を図５に示す。ＭＰＴＰを投与したＰＤマウスの海馬歯状回において、ｃｏｎｔｒｏｌマウスに比して、活性型リン酸化ＣＲＥＢの発現の有意な減少が認められた。一方で、ロリプラム３ｍｇ／ｋｇを投与することで、ＰＤマウスの海馬歯状回における活性型リン酸化ＣＲＥＢの発現の有意な増加がみられた。以上より、ロリプラムは、ＰＤマウスにおける海馬歯状回のｐ−ＣＲＥＢ発現減少を改善させることで、記憶消失を改善することが示唆された。

以上より、ロリプラムは、パーキンソン病に併発した認知障害に対して治療効果を有することが示された。

Claims (3)

1. ホスホジエステラーゼ阻害薬、アデニル酸シクラーゼ活性化薬又はｃＡＭＰ誘導体を有効成分とするパーキンソン病に併発した認知障害の治療剤。
2. ロリプラム又はその薬学的に許容可能な塩を有効成分とする、
   ことを特徴とする請求項１に記載の認知障害の治療剤。
3. 候補物質を被検動物に投与する工程と、
   前記被検動物の海馬歯状回におけるｃＡＭＰレベル上昇の度合を測定する工程と、
   を含むパーキンソン病に併発した認知障害の治療剤のスクリーニング方法。