JP2017145221A - Ｔａｕタンパク質凝集阻害剤 - Google Patents

Abstract

【課題】リン酸化されたＴａｕタンパク質の凝集は、アルツハイマー型認知症の原因の一つと考えられている。Ｔａｕタンパク質の凝集を阻害する天然素材は未だ見出されていない。そこで、本発明は、リン酸化されたＴａｕタンパク質の凝集を阻害する天然素材を見出し、その抽出物を有効成分とするＴａｕタンパク質凝集阻害剤を提供することを課題とする。【解決手段】上記課題を解決するために、黒ガリンガル（Kaempheria parviflora）抽出物を有効成分として含有するＴａｕタンパク質凝集阻害剤及び当該Ｔａｕタンパク質凝集阻害剤を含有する食品等を提供する。【選択図】図１

Description

本発明は、アルツハイマー型認知症の原因の一つと考えられているＴａｕタンパク質の凝集を阻害するＴａｕタンパク質凝集阻害剤及び、当該Ｔａｕタンパク質凝集阻害剤を含有する医薬品などに関する。

アルツハイマー型認知症は、脳が委縮し、記憶、思考、運動障害などをもたらす認知症の一種である。高齢者ほど発症率が高く、高齢化社会へ進行する日本において社会的な課題である。

アルツハイマー型認知症の患者の脳における特徴的な病理変化として、Ａβタンパク質タンパク質（以下、Ａβタンパク質）というペプチドの凝集体である老人斑や、異常にリン酸化されたＴａｕタンパク質の凝集体である神経原線維化が認められる。

かつてアルツハイマー型認知症は対する有効な薬剤は存在しなかったが、近年の研究によりドネペジルやリバスチグミンなどの薬剤が開発され実用されるようになってきた。しかしながら、これらの薬剤は神経賦活作用が主たるものであり、根本から治すというものではない。

このような現状を鑑みると、Ａβタンパク質やリン酸化されたＴａｕタンパク質の凝集を阻害することが予防の観点から有効である。Ａβタンパク質の凝集阻害作用を示す天然素材として、例えば、牡丹皮エキスや桂皮エキスが示されている（特許文献１）。

特開２００６−２０６５８４号公報

ところが、リン酸化されたＴａｕタンパク質の凝集を阻害する天然素材は未だ見出されていない。そこで、本発明は、リン酸化されたＴａｕタンパク質の凝集を阻害する天然素材を見出し、その抽出物を有効成分とするＴａｕタンパク質凝集阻害剤を提供することを課題とする。

上記課題を解決するための手段として、以下の発明などを提供する。すなわち、黒ガリンガル（Kaempheria parviflora）抽出物を有効成分として含有するＴａｕタンパク質凝集阻害剤を提供する。

また、さらにＡβタンパク質の凝集抑制作用を有する上記のＴａｕタンパク質凝集阻害剤を提供する。

また、上記のＴａｕタンパク質凝集阻害剤を含有する食品、食品添加物、医薬品、医薬部外品及び化粧品を提供する。

本発明により、アルツハイマー型認知症の原因の一つと考えられるリン酸化したＴａｕタンパク質の凝集を阻害するＴａｕタンパク質凝集阻害剤などを提供することができる。

試験１における各試料の凝集阻害率を示すグラフ 試験２における各試料の凝集阻害率を示すグラフ

以下、本発明の実施の形態について説明する。なお、本発明は、これらの実施形態に何ら限定されるべきものではなく、その要旨を逸脱しない範囲において、種々なる態様で実施し得る。
＜実施形態１＞
＜概要＞

本実施形態のＴａｕタンパク質凝集阻害剤は、黒ガリンガル（Kaempheria parviflora）抽出物を有効成分として含有するものである。
＜構成＞

本実施形態において、「Ｔａｕタンパク質凝集阻害剤」とは、リン酸化されたＴａｕタンパク質の凝集を阻害することができる剤を意味する。

「黒ガリンガル（Kaempheria parviflora）」は、ショウガ科ケンペリア属の植物である。また、「クラチャイ・ダム（(Krachai dam）」や「黒ショウガ（Black Ginger）」などとも称される。タイやラオスなど東南アジアでは古来より塊茎を薬用としてきた。また、近年では、乾燥及び粉末化し滋養強壮などの健康用途に日本でも使用されている。

黒ガリンガル抽出物は、主に塊茎を原料とし精製水、エタノール、メタノール、プロピルアルコール、イソプロピルアルコール、ブタノール、プロピレングリコールなどの溶媒を用いて抽出する。抽出は、塊茎を破砕したものを溶媒に浸漬してもよいし、破砕し粉体としてから浸漬してもよい。また、塊茎だけでなく葉や茎を用いてもよい。また、液体として抽出物を得た後にさらに乾燥等を施し粉体や粒体として得てもよい。

黒ガリンガルの抽出物を有効成分とする本実施形態のＴａｕタンパク質凝集阻害剤は、さらに既知の方法を用いることにより、当該Ｔａｕタンパク質凝集阻害を含有する食品、食品添加物、医薬品、医薬部外品、化粧品などとして提供することが可能である。

例えば、医薬品とする場合には、本実施形態のＴａｕタンパク質凝集阻害剤を粉体や粒体としカプセルに充填したり、あるいは、賦形剤、結合剤、崩壊剤などを添加して打錠機等を用いて錠剤とすることができる。また、食品とする場合には、黒ガリンガルを適宜乾燥や破砕等を施してから湯で煮出すことで提供できる。また、医薬品のようにカプセルや錠剤のような形態で提供してもよいし、他の飲料、調味料、菓子等の各種の食品にＴａｕタンパク質凝集阻害剤を添加した態様で提供することもできる。

また、美容液、クリーム、ローションなどの化粧品とすることもできる。例えば、美容液とする場合には、本実施形態のTauタンパク質凝集阻害剤の他、水、コメヌカ油、ペンチレングリコール、グリセリン、スクワラン、パルミチン酸セチル、ダイマージリノール酸などを主成分とし、ヒアルロン酸Ｎａ、水添ナタネ油アルコール、カルボマー、キサンタンガム、水酸化Ｋ、ジメチコン、ポリソルベート−６０、ステアリン酸グリセリル、水添ヒマシ油、フェノキシエタノール、尿素、アルギニン、アルブチン、クエン酸などを添加剤とする。そして、各成分を水溶性原料・油溶性原料に分けて溶解してから、それらを加熱して混合・乳化する。これを冷却しながらエキスなどの添加物を配合し、さらに低温になったところで精油や香料などの揮発性の高いものを添加する。その後、所定の安全性の検査（菌、ｐＨ、温度安定性、粘度等）を行い、瓶などに充填して製品として提供することができる。上述した種々の応用は、実施形態２のＴａｕタンパク質凝集阻害剤についても同様に適用できる。
＜試験＞

≪１．黒ガリンガル抽出液の調製≫
低温真空法によって得た黒ガリンガル乾燥粉末2gを40mLの50%エタノール水溶液（50%EtOH）に懸濁し、80℃のウォーターバス中で1時間抽出した。その後、10,000rpmで15分間, 20℃で遠心分離後、上清を回収し各抽出液とした。50%EtOH抽出液中のエキス固形分濃度は、7.40 mg/mL（50%EtOH）であった。

≪２．試験系≫
Ｔａｕタンパク質は、His-tag融合タンパク質として発現するプラスミドベクター(3R MBD: 3repeat-microtubule binding domain)を用いて培養、精製したものを用いる。チオフラビンT(ThT)蛍光強度を測定することにより、Ｔａｕタンパク質凝集を評価する。

≪３．試験系選択の理由≫
Ｔａｕタンパク質は凝集するとβ-sheet構造を形成するとされている。チオフラビンT(ThT)はタンパク質のβ-sheet構造を認識して蛍光を発するため、この特徴を利用してＴａｕタンパク質の凝集が確認できる。さらに蛍光強度を比較することにより、凝集の程度を比較することができる。（参考文献１「Okuyama K, Nishiura C, Mizushima F, Minoura K, Sumida M, Taniguchi T, et al (2008).Linkage-dependent contribution of repeat peptides to self-aggregation of three- or four-repeat microtubule-binding domains in tau protein. FEBS J. 275(7): 1529-39」、参考文献２「Sugino E, Nishiura C, Minoura K, In Y, Sumida M, Taniguchi T, et al (2009).Three-/four-repeat-dependent aggregation profile of tau microtubule-binding domain clarified by dynamic light scattering analysis. Biochem Biophys Res Commun. 385(2): 236-40」）

≪４．手順≫
≪４．−１リコンビナントＴａｕタンパク質(3R-MBD)の準備≫
≪４．−１−１ Ｔａｕ(3R MBD)の培養≫

表１の条件の下、培地を調製した後、オートクレーブで滅菌する。冷却後、Ampicillin sodium salt (RO水で100 mg/mLに調製した液)を終濃度50 μg/mLとなるよう加える。

≪方法≫
プラスミドベクターをタンパク質大量発現用大腸菌BL21(DE3)に形質転換し、作成したグリセロールストックを用いる。（参考文献３「Yao TM, Tomoo K, Ishida T, Hasegawa H, Sasaki M, Taniguchi T (2003).Aggregation analysis of the microtubule binding domain in tau protein by spectroscopic methods. J Biochem. 134(1): 91-9」）

前培養として本培養の1/10のスケールの2×YT培地にグリセロールストックを添加し、37℃、130 rpm、15時間培養する。この培養液を本培養の2×YT培地に加えてスケールアップし、OD₆₀₀＝0.5に達するまで37℃、160 rpmで培養する。OD₆₀₀＝0.5に達したところでIPTG（終濃度1 mM）を添加して発現誘導を行い、さらに37℃、160 rpm、4時間培養する。その後培養液を遠心分離して菌体を回収し、-30℃で保存する。

≪４．−１−２．Ｔａｕ(3R MBD)の精製≫
≪方法≫
培養・回収した菌体を、菌体量1Lあたり10 mLのBuffer（50 mM Tris-HCl、50 mM NaCl pH7.6）で懸濁し、超音波破砕を行う（超音波破砕：1秒＋氷冷：2秒 を40回）。この懸濁液を遠心分離した後、上清を回収し、アフィニティークロマトグラフィー（Ni Chelating）を用いて単離精製を行う。
・結合Buffer：50 mM Tris-HCl/500 mM NaCl/10 mM Imidazole、pH7.6
・溶出Buffer：50 mM Tris-HCl/500 mM NaCl/100 mM Imidazole、pH7.6

オープンカラムに樹脂を2 mL充填し、Ni（0.1M硫酸ニッケル溶液）を添加する。ここに遠心分離後の上清を添加し、ステップワイズ法により、溶出Bufferで目的Ｔａｕタンパク質を溶出させる。

アフィニティークロマトグラフィーで得られた溶出画分はBuffer（100 mM酢酸アンモニウム）で透析する（4℃、一晩）。透析後のサンプルを-30℃で予備凍結させた後、凍結乾燥器で乾燥させる。

≪４．−２ ThT蛍光測定≫
凝集反応：
1.5 mlマイクロチューブ（BIO-BIK）に、以下の順に試薬及びＴａｕ溶液を添加する。
（１）50 mM Tris-HCl (pH7.6) 150 μL
（２）被験物質、陰性対照(Waterまたは50%EtOH) 10 μL
（３）100 μM Tau (3R-MBD) 20 μL
（４）100 μM Heparin 20 μL
Total 200 μL
上記を添加後、ボルテックスミキサーで撹拌し、アルミホイルで覆って遮光後37℃、16時間インキュベートする。

測定：
インキュベート終了後、各反応液を96 well plateへ135 μLずつ添加し(n=3)、Perkin Elmer ARVO Wallac1420にて自家蛍光を測定する。（励起波長：440nm、測定波長：486 nm）さらにこの反応液に100 μM ThT溶液を15 μLずつ添加し、プレートミキサーにかけた後、同波長で測定する。

≪５．データ解析≫
陰性対照の測定値を100%として各被験物質の測定値を%換算し、さらに100%からこの％換算値を引いて凝集阻害率とする。

≪６．結果≫
下記の表２は、蒸留水（ＤＷ）で抽出した黒ガリンガル抽出液の濃度を200 mg/mLから30 mg/mLまで下げながら得た３つの試料についての凝集阻害率を示している。また、図１の上のグラフは、各試料の凝集阻害率を示したものである。いずれの濃度においてもＴａｕタンパク質凝集阻害作用を確認することができる。

下記の表３は、50％エタノールで抽出した黒ガリンガル抽出液の濃度を30 mg/mLから6.25 mg/mLまで下げながら得た３つの試料についての凝集阻害率を示している。また、図１の下のグラフは、各試料の凝集阻害率を示したものである。いずれの濃度においてもＴａｕタンパク質凝集阻害作用を確認することができる。

＜効果＞

上述した試験結果より、黒ガリンガル抽出物にＴａｕタンパク質の凝集を阻害する作用があることが分かった。この抽出物によりＴａｕタンパク質凝集阻害剤などを提供することができる。
＜実施形態２＞
＜概要＞

Ａβタンパク質の凝集は、上述したようにアルツハイマー型認知症の原因の一つと考えられている。また、Ａβタンパク質とＴａｕタンパク質との関連についても研究が進められている。Ａβタンパク質の凝集体とＴａｕタンパク質の凝集体がいずれもアルツハイマー型認知症の原因物質であるならば、両者の凝集を阻害する物質は極めて有用である。そこで、黒ガリンガル抽出物のＡβタンパク質凝集阻害能を試験により明らかにする。
＜試験＞

≪１．試験系≫
チオフラビンT(ThT)蛍光強度を測定することにより、Ａβタンパク質凝集を評価する。

≪２．試験系選択の理由≫
Ａβタンパク質は凝集するとβ-sheet構造を形成するとされている。チオフラビンT(ThT)はタンパク質のβ-sheet構造を認識して蛍光を発するため、この特徴を利用してＡβタンパク質の凝集が確認できる。さらに蛍光強度を比較することにより、凝集の程度を比較することができる。（参考文献４「Hudson SA, Ecroyd H, Kee TW, Carver JA. (2009) The thioflavin T fluorescence assay for amyloid fibril detection can be biased by the presence of exogenous compounds FEBS J.; 276 (20): 5960-72.」、参考文献５「HARRY LEVINE. (1992) Thioflavine T interaction with synthetic Alzheimer's disease β-amyloid peptides:Detection of amyloid aggregation in solution. Department of Neuroscience Pharmacology, Parke-Davis Pharmaceutical Research Division, Warner-Lambert Company, Ann Arbor, Michigan 48106-1047」）

≪３．手順≫
≪３．１ Ａβタンパク質の準備≫
Ａβタンパク質1-42：
インキュベート直前にＡβタンパク質1-42(ペプチド研 大阪 4349-v Lot:611204)に0.1% NH₃水を240 μL加え溶解後(500 μM)、PBSを960μL加える。この溶液をPBSにて20 μMに希釈する。

≪３．２ ThT蛍光測定≫
凝集反応：
反応系終濃度の100倍の被験物質溶液を蒸留水または50%EtOHで希釈し作成し、これをPBSにて50倍希釈する。384well plateに調製した各被験物質溶液を25μL添加し、さらに希釈したＡβタンパク質1-42を25uLずつ添加する(n=3)。撹拌後アルミホイルで遮光し、37 ℃で24 時間インキュベートする。なお、黒ガリンガル抽出物は実施形態１の試験と同様に抽出した。また、溶媒としてエタノールの他に摂氏80度の蒸留水（ＤＷ）による抽出も行った。

測定：
インキュベート終了後、Perkin Elmer ARVO Wallac1420にて自家蛍光を測定する（励起389 nm、測定488 nm）。さらに反応液に6 μM ThT溶液を50 μLずつ添加し、プレートミキサーに30秒かけた後、同波長で測定する。

≪４．データ解析≫
陰性対照の測定値を100％として各被験物質の測定値を％換算し、さらに100％からこの％換算値を引いて凝集阻害率とする。

≪５．結果≫
下記の表４は、蒸留水（ＤＷ）で抽出した黒ガリンガル抽出液の濃度を200 mg/mLから10 mg/mLまで下げながら得た４つの試料についての凝集阻害率を示している。表５は50％エタノールで抽出した場合の凝集阻害率である。また、図２は、各試料の凝集阻害率をグラフとして示したものである。

表及びグラフが示すように、黒ガリンガル抽出物にＡβタンパク質の凝集阻害作用があることが示されている。また、50％エタノールで抽出した黒ガリンガル抽出液の方が凝集阻害作用に優れていることも分かった。
＜効果＞

上述した試験結果より、黒ガリンガル抽出物にＴａｕタンパク質の凝集を阻害する作用だけでなく、Ａβタンパク質の凝集を阻害する作用もあることが分かった。

Claims (7)

1. 黒ガリンガル（Kaempheria parviflora）抽出物を有効成分として含有するＴａｕタンパク質凝集阻害剤。
2. Ａβタンパク質の凝集抑制作用を有する請求項１に記載のＴａｕタンパク質凝集阻害剤。
3. 請求項１又は２に記載のＴａｕタンパク質凝集阻害剤を含有する医薬品。
4. 請求項１又は２に記載のＴａｕタンパク質凝集阻害剤を含有する食品。
5. 請求項１又は２に記載のＴａｕタンパク質凝集阻害剤を含有する医薬部外品。
6. 請求項１又は２に記載のＴａｕタンパク質凝集阻害剤を含有する食品添加物。
7. 請求項１又は２に記載のＴａｕタンパク質凝集阻害剤を含有する化粧品。

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