JP2017167535A - ライトフィールド顕微鏡および照明方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】観察範囲以外の領域への励起光の照射を抑えて、試料の褪色を防止する。
【解決手段】試料Ｘに励起光を照射する照明光学系２と、照明光学系２により励起光が照射されることにより試料Ｘにおいて発生した蛍光を集光する対物レンズ９、対物レンズ９により集光された蛍光を撮影する撮像素子１３および撮像素子１３と対物レンズ９との間に配置されたマイクロレンズアレイ１２を備える検出光学系３とを備え、照明光学系２が、対物レンズ９の焦点面Ａを含みかつ対物レンズ９の光軸方向に所定の幅を有する励起光の光束を、光軸に略直交する方向に沿って試料Ｘに照射するライトフィールド顕微鏡１を提供する。
【選択図】図１
【解決手段】試料Ｘに励起光を照射する照明光学系２と、照明光学系２により励起光が照射されることにより試料Ｘにおいて発生した蛍光を集光する対物レンズ９、対物レンズ９により集光された蛍光を撮影する撮像素子１３および撮像素子１３と対物レンズ９との間に配置されたマイクロレンズアレイ１２を備える検出光学系３とを備え、照明光学系２が、対物レンズ９の焦点面Ａを含みかつ対物レンズ９の光軸方向に所定の幅を有する励起光の光束を、光軸に略直交する方向に沿って試料Ｘに照射するライトフィールド顕微鏡１を提供する。
【選択図】図１
Description
本発明は、ライトフィールド顕微鏡および照明方法に関するものである。
従来、試料の深部に焦点を合わせて１回の画像取得を行うことにより、試料の３次元画像データを構築することができるライトフィールド顕微鏡が知られている（例えば、特許文献１参照。）。
しかしながら、従来のライトフィールド顕微鏡は、落射照明あるいは透過照明のように対物レンズの光軸に沿う方向から励起光を入射させると、対物レンズの焦点面から離れた観察範囲以外の領域にも励起光が照射されるために試料が褪色してしまうという不都合がある。
本発明は、上述した事情に鑑みてなされたものであって、観察範囲以外の領域への励起光の照射を抑えて、試料の褪色を防止することができるライトフィールド顕微鏡および照明方法を提供することを目的としている。
本発明は、上述した事情に鑑みてなされたものであって、観察範囲以外の領域への励起光の照射を抑えて、試料の褪色を防止することができるライトフィールド顕微鏡および照明方法を提供することを目的としている。
上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明の一態様は、試料に励起光を照射する照明光学系と、該照明光学系により前記励起光が照射されることにより前記試料において発生した蛍光を集光する対物レンズ、該対物レンズにより集光された蛍光を撮影する撮像素子および該撮像素子と前記対物レンズとの間に配置されたマイクロレンズアレイを備える検出光学系とを備え、前記照明光学系が、前記対物レンズの焦点面を含みかつ該対物レンズの光軸方向に所定の幅を有する前記励起光の光束を、前記光軸に略直交する方向に沿って前記試料に照射するライトフィールド顕微鏡を提供する。
本発明の一態様は、試料に励起光を照射する照明光学系と、該照明光学系により前記励起光が照射されることにより前記試料において発生した蛍光を集光する対物レンズ、該対物レンズにより集光された蛍光を撮影する撮像素子および該撮像素子と前記対物レンズとの間に配置されたマイクロレンズアレイを備える検出光学系とを備え、前記照明光学系が、前記対物レンズの焦点面を含みかつ該対物レンズの光軸方向に所定の幅を有する前記励起光の光束を、前記光軸に略直交する方向に沿って前記試料に照射するライトフィールド顕微鏡を提供する。
本態様によれば、照明光学系により試料に対して励起光が照射されると、試料において発生した蛍光が対物レンズにより集光され、マイクロレンズアレイを通過した後に撮像素子によって撮影される。これにより、試料内における対物レンズの焦点面のみならず、励起光が通過した試料の各部の情報を撮像素子により取得することができ、取得された画像情報に基づいて、試料の３次元画像を取得することができる。
この場合において、照明光学系が、対物レンズの光軸方向に所定の幅を有する励起光の光束を光軸に略直交する方向に沿って試料に照射するので、試料の３次元画像の取得に必要な領域のみに効率的に励起光を照射することができ、それ以外の領域における試料の褪色を防止することができる。したがって、対物レンズの光軸方向に焦点面をずらした位置で観察を行う場合にも褪色を生じていないため、試料の良好な３次元画像を取得することができる。
上記態様においては、前記照明光学系が、前記励起光の光束の幅を変更する光束幅調節部を備えていてもよい。
このようにすることで、光束幅調節部の作動により励起光の光束の幅を調節することにより、対物レンズとマイクロレンズアレイとの組み合わせにより決定される３次元画像の深度に応じて、必要な領域のみに励起光を照射して、試料の褪色を抑制することができる。
このようにすることで、光束幅調節部の作動により励起光の光束の幅を調節することにより、対物レンズとマイクロレンズアレイとの組み合わせにより決定される３次元画像の深度に応じて、必要な領域のみに励起光を照射して、試料の褪色を抑制することができる。
また、上記態様においては、前記試料を前記検出光学系の光軸方向に、前記対物レンズと前記マイクロレンズアレイとの組み合わせに応じて決定される所定の距離だけ順次移動させて撮影してもよい。
また、上記態様においては、前記照明光学系が、前記励起光を射出する光源と、該光源からの前記励起光の一部を通過させるスリットとを備え、前記光束幅調節部が、前記スリットの開口幅を変更してもよい。
このようにすることで、光束幅調節部がスリットの開口幅を変更することにより、試料に入射させる励起光の光束の幅を簡易に調節することができる。
また、上記態様においては、前記照明光学系が、前記励起光を射出する光源と、該光源からの前記励起光の一部を通過させるスリットとを備え、前記光束幅調節部が、前記スリットの開口幅を変更してもよい。
このようにすることで、光束幅調節部がスリットの開口幅を変更することにより、試料に入射させる励起光の光束の幅を簡易に調節することができる。
また、上記態様においては、前記照明光学系が、前記励起光を射出する光源と、該光源からの前記励起光を集光するズーム光学系とを備え、前記光束幅調節部が、前記ズーム光学系によるズーム倍率を変更してもよい。
このようにすることで、光束幅調節部がズーム光学系によるズーム倍率を変更することにより、試料に入射させる励起光の光束の幅を簡易に調節することができる。
このようにすることで、光束幅調節部がズーム光学系によるズーム倍率を変更することにより、試料に入射させる励起光の光束の幅を簡易に調節することができる。
また、上記態様においては、前記照明光学系が、前記励起光を射出する光源と、該光源からの前記励起光の光路に択一的に挿入されて前記励起光を集光する倍率の異なる複数の光学系とを備え、前記光束幅調節部が、複数の前記光学系を切り替えてもよい。
このようにすることで、光束幅調節部が倍率の異なる光学系を択一的に切り替えることにより、試料に入射させる励起光の光束の幅を簡易に調節することができる。
このようにすることで、光束幅調節部が倍率の異なる光学系を択一的に切り替えることにより、試料に入射させる励起光の光束の幅を簡易に調節することができる。
また、上記態様においては、前記対物レンズおよび前記マイクロレンズアレイの少なくとも１つが切替可能に設けられ、前記対物レンズおよび前記マイクロレンズアレイの少なくとも１つが切り替えられたときに前記光束幅調節部を制御する制御部を備えていてもよい。
このようにすることで、対物レンズとマイクロレンズアレイとの組み合わせにより決定される３次元画像の深度に応じて、制御部が、必要な領域のみに励起光を照射する適切な励起光の光束の幅に調節し、試料の褪色を抑制することができる。
このようにすることで、対物レンズとマイクロレンズアレイとの組み合わせにより決定される３次元画像の深度に応じて、制御部が、必要な領域のみに励起光を照射する適切な励起光の光束の幅に調節し、試料の褪色を抑制することができる。
また、本発明の他の態様は、試料に励起光を照射する照明光学系と、該照明光学系により前記励起光が照射されることにより前記試料において発生した蛍光を集光する対物レンズ、該対物レンズにより集光された蛍光を撮影する撮像素子および該撮像素子と前記対物レンズとの間に配置されたマイクロレンズアレイを備える検出光学系とを備え、前記照明光学系が、前記対物レンズの光軸に略直交する方向に沿うシート状の光束を生成して前記光軸に略直交する方向に沿って前記試料に照射するシート照明光生成部と、該シート照明光生成部により生成されたシート状の光束を、前記撮像素子による１枚の画像の露光時間内に、前記対物レンズの焦点面を含む所定範囲にわたって前記光軸方向に走査させる走査部とを備えるライトフィールド顕微鏡を提供する。
本態様によれば、シート照明光生成部により生成されて、対物レンズの光軸に略直交する方向に沿って試料に照射されるシート状の光束を、走査部の作動によって光軸方向に走査させることにより、焦点面を含む所定範囲の幅を有する励起光を照射したのと同等の効果を得ることができる。
上記態様においては、前記対物レンズおよび前記マイクロレンズアレイの少なくとも１つが切替可能に設けられ、前記対物レンズおよび前記マイクロレンズアレイの少なくとも１つが切り替えられたときに前記走査部による前記シート状の光束の走査幅を制御する制御部を備えていてもよい。
このようにすることで、対物レンズとマイクロレンズアレイとの組み合わせにより決定される３次元画像の深度に応じて、制御部が、必要な領域のみに励起光を照射することができ、試料の褪色を抑制することができる。
このようにすることで、対物レンズとマイクロレンズアレイとの組み合わせにより決定される３次元画像の深度に応じて、制御部が、必要な領域のみに励起光を照射することができ、試料の褪色を抑制することができる。
また、上記態様においては、前記走査部による前記シート状の光束の走査幅の一部に開口幅を有するスリットを備えていてもよい。
このようにすることで、走査部によるシート状の光束の走査幅の中央付近に、走査速度が略等速となる領域が存在するため、その等速で走査されるシート状の光束のみをスリットによって切り出して試料に照射することができる。
このようにすることで、走査部によるシート状の光束の走査幅の中央付近に、走査速度が略等速となる領域が存在するため、その等速で走査されるシート状の光束のみをスリットによって切り出して試料に照射することができる。
また、上記態様においては、前記スリットの前記開口幅を変更する開口幅変更部を備えていてもよい。
このようにすることで、対物レンズとマイクロレンズアレイとの組み合わせにより決定される３次元画像の深度に応じた必要な領域のみに励起光を照射することができ、試料の褪色を抑制することができる。
このようにすることで、対物レンズとマイクロレンズアレイとの組み合わせにより決定される３次元画像の深度に応じた必要な領域のみに励起光を照射することができ、試料の褪色を抑制することができる。
また、上記態様においては、前記励起光が極短パルスレーザ光であってもよい。
このようにすることで、試料における多光子吸収効果によって蛍光を発生させることができる。
このようにすることで、試料における多光子吸収効果によって蛍光を発生させることができる。
また、上記態様においては、前記マイクロレンズアレイとリレーレンズとが、前記撮像素子と前記対物レンズとの間に択一的に挿脱可能に設けられていてもよい。
このようにすることで、マイクロレンズアレイを挿入することにより、試料の３次元画像を取得することができる一方、マイクロレンズアレイを離脱させ、リレーレンズを光路に入れ、走査部を停止してシート状の光束を対物レンズの焦点面近傍に固定することによって、シート状の光束に沿う２次元画像を取得することができる。
このようにすることで、マイクロレンズアレイを挿入することにより、試料の３次元画像を取得することができる一方、マイクロレンズアレイを離脱させ、リレーレンズを光路に入れ、走査部を停止してシート状の光束を対物レンズの焦点面近傍に固定することによって、シート状の光束に沿う２次元画像を取得することができる。
また、上記態様においては、前記マイクロレンズアレイと像位置補正手段とが、前記撮像素子と前記対物レンズとの間に択一的に挿脱可能に設けられていてもよい。
また、本発明の他の態様は、照明光学系と、該照明光学系により励起光が照射されることにより試料において発生した蛍光を集光する対物レンズと、該対物レンズにより集光された蛍光を撮影する撮像素子と、該撮像素子と前記対物レンズとの間に配置されたマイクロレンズアレイとを備えたライトフィールド顕微鏡を用いた照明方法であって、前記照明光学系が、前記対物レンズの焦点面を含みかつ該対物レンズの光軸方向に所定の幅を有する前記励起光の光束を、前記光軸に略直交する方向に沿って前記試料に照射する照明方法を提供する。
上記態様においては、前記励起光の所定の幅を、前記対物レンズと前記マイクロレンズアレイの組み合わせに基づいて調節してもよい。
また、本発明の他の態様は、照明光学系と、該照明光学系により励起光が照射されることにより試料において発生した蛍光を集光する対物レンズと、該対物レンズにより集光された蛍光を撮影する撮像素子と、該撮像素子と前記対物レンズとの間に配置されたマイクロレンズアレイとを備えたライトフィールド顕微鏡を用いた照明方法であって、前記照明光学系が、前記対物レンズの光軸の近辺で集光し当該光軸に略直交する方向に沿うシート状の励起光の光束を、前記光軸に略直交する方向に沿って前記試料に照射するとともに、このシート状の光束を、前記撮像素子における１枚の画像の露光時間内に前記対物レンズの焦点面を含む所定範囲にわたって前記対物レンズの光軸方向に走査させる照明方法を提供する。
上記態様においては、前記シート状の光束の前記対物レンズの光軸方向への走査幅を、前記対物レンズと前記マイクロレンズアレイの組み合わせに基づいて制御してもよい。
また、上記態様においては、前記励起光として極短パルスレーザ光を使用してもよい。
また、上記態様においては、前記励起光として極短パルスレーザ光を使用してもよい。
本発明によれば、観察範囲以外の領域への励起光の照射を抑えて、試料の褪色を防止することができるという効果を奏する。
以下に、本発明の第１の実施形態に係るライトフィールド顕微鏡１について図１を参照して説明する。
本実施形態に係るライトフィールド顕微鏡１は、図１に示されるように、ステージ（図示略）に載置された試料Ｘに対して励起光を照射する照明光学系２と、試料Ｘにおいて発生した蛍光を検出する検出光学系３とを備えている。
本実施形態に係るライトフィールド顕微鏡１は、図１に示されるように、ステージ（図示略）に載置された試料Ｘに対して励起光を照射する照明光学系２と、試料Ｘにおいて発生した蛍光を検出する検出光学系３とを備えている。
照明光学系２は、励起光を発生する光源４と、該光源４から発せられた励起光を略平行光にするコリメートレンズ５と、該コリメートレンズ５によって略平行光に変換された励起光の一部を通過させるスリット６を有するスリット部材（光束幅調節部）７とを備えている。図中、符号８は励起光を導光する光ファイバである。
光ファイバ８の射出端から射出された励起光は、スリット６の開口幅によって制限された一定の厚さ寸法を有する平板状に形成されて、後述する対物レンズ９の焦点面Ａに沿って、試料Ｘに照射されるようになっている。
励起光の厚さ寸法は、後述する対物レンズ９およびマイクロレンズアレイ１２の組み合わせにより決定される３次元画像の深度より若干大きく設定されている。
励起光の厚さ寸法は、後述する対物レンズ９およびマイクロレンズアレイ１２の組み合わせにより決定される３次元画像の深度より若干大きく設定されている。
検出光学系３は、励起光の入射方向に略直交する光軸を有し、試料Ｘにおいて発生した蛍光を集光する対物レンズ９と、該対物レンズ９により集光された蛍光内に含まれる励起光を除去するエミッションフィルタ１０と、該エミッションフィルタ１０を通過した蛍光を集光する結像レンズ１１と、該結像レンズ１１の焦点位置近傍に配置されたマイクロレンズアレイ１２と、該マイクロレンズアレイ１２により集光された蛍光を撮影する撮像素子１３とを備えている。
このように構成された本実施形態に係るライトフィールド顕微鏡１の作用について以下に説明する。
本実施形態に係るライトフィールド顕微鏡１を用いた照明方法は、試料Ｘの３次元画像を取得するために、照明光学系２の光源４から励起光を射出させる。光源４から射出され光ファイバ８により導光された励起光は、スリット部材７のスリット６を通過することにより、一定の厚さ（幅）寸法を有する平板状に形成された試料Ｘに対して側方から略水平方向に入射される。
本実施形態に係るライトフィールド顕微鏡１を用いた照明方法は、試料Ｘの３次元画像を取得するために、照明光学系２の光源４から励起光を射出させる。光源４から射出され光ファイバ８により導光された励起光は、スリット部材７のスリット６を通過することにより、一定の厚さ（幅）寸法を有する平板状に形成された試料Ｘに対して側方から略水平方向に入射される。
試料Ｘには予め蛍光標識をしておくことにより、照射された励起光によって試料Ｘ内の蛍光物質が励起され、蛍光が発生する。試料Ｘにおいて発生した蛍光は、対物レンズ９により集光され、エミッションフィルタ１０を通過させられることにより、励起光が除去された後に、結像レンズ１１によって集光され、マイクロレンズアレイ１２を通過して撮像素子１３により撮影される。
撮像素子１３により取得された蛍光画像には、マイクロレンズアレイ１２によって試料Ｘ内の焦点面Ａ内のみならず、対物レンズ９の光軸に沿う方向の各位置の情報が含まれている。したがって、取得された蛍光画像に対して、ソフトウェアによるデコンボリューション処理を行うことにより、３次元的な各位置とその位置から発せられた蛍光強度とを対応づけて抽出することが可能となり、試料Ｘの３次元の蛍光画像を生成することができる。
この場合において、本実施形態に係るライトフィールド顕微鏡１および照明方法によれば、試料Ｘ内の深部に配置される対物レンズ９の焦点面Ａに沿って所定の厚さ寸法を有する励起光を入射させるので、３次元画像の構築に不必要な領域への励起光の入射を防止して、試料Ｘの褪色を防止することができるという利点がある。
すなわち、３次元画像の深度は、対物レンズ９とマイクロレンズアレイ１２との組み合わせによって決定されるので、その深度を超える領域に励起光を入射しても有効な情報を得ることはできない。
すなわち、３次元画像の深度は、対物レンズ９とマイクロレンズアレイ１２との組み合わせによって決定されるので、その深度を超える領域に励起光を入射しても有効な情報を得ることはできない。
したがって、上記３次元画像の深度内から発せられる蛍光を効率的に取得するために、その領域を含む最小限の領域に励起光を入射させることにより、試料Ｘの褪色を防ぐことができるという利点がある。さらに深い深度の３次元画像の構築を望む場合には、照明光学系２と検出光学系３の相対位置を維持したままで、試料Ｘを対物レンズ９の光軸方向に移動させることにより、試料Ｘ内において対物レンズ９の焦点面Ａを移動させればよい。
これにより、新たな焦点面Ａに沿って励起光の厚さ寸法に対応する３次元画像を構築することができる。この場合に、新たな領域には、それ以前に励起光が照射されていないので、試料Ｘが褪色しておらず、良好な３次元画像を取得することができるという利点がある。更に試料Ｘを検出光学系３の光軸方向に、深度に相当する距離だけ順次移動させてそれぞれ撮像し、３次元画像を取得して、それらを結合することにより試料Ｘ全体の３次元画像を得ることもできる。
なお、本実施形態においては、励起光の厚さ寸法は、対物レンズ９とマイクロレンズアレイ１２との組み合わせにより決定される３次元画像の深度に応じて決められていたが、単に、対物レンズ９とマイクロレンズアレイ１２との組み合わせに応じて決めてもよい。
また、本実施形態のように静的な光束で試料Ｘを照明する場合、試料Ｘ内部に強い光散乱物質や蛍光吸収物質があると、照明方向からみたこれらの物質の後方に励起光が届かなくなり、結果として取得画像に影が生じることがある。このような影の発生を抑制するために、平板状に形成された励起光をその面内で走査する走査手段を照明光学系２に設けて、試料Ｘに対して略検出光軸周りに異なる角度で励起光を照射するようにしてもよい。
また、本実施形態のように静的な光束で試料Ｘを照明する場合、試料Ｘ内部に強い光散乱物質や蛍光吸収物質があると、照明方向からみたこれらの物質の後方に励起光が届かなくなり、結果として取得画像に影が生じることがある。このような影の発生を抑制するために、平板状に形成された励起光をその面内で走査する走査手段を照明光学系２に設けて、試料Ｘに対して略検出光軸周りに異なる角度で励起光を照射するようにしてもよい。
次に、本発明の第２の実施形態に係るライトフィールド顕微鏡１４について、図２を参照して以下に説明する。
本実施形態の説明において、上述した第１の実施形態に係るライトフィールド顕微鏡１と構成を共通とする箇所には同一符号を付して説明を省略する。
本実施形態の説明において、上述した第１の実施形態に係るライトフィールド顕微鏡１と構成を共通とする箇所には同一符号を付して説明を省略する。
本実施形態に係るライトフィールド顕微鏡１４は、図２に示されるように、スリット部材７のスリット６が開口幅を調節可能に設けられ、倍率の異なる複数の対物レンズ１５と、該対物レンズ１５を交換するレボルバ１６と、レンズピッチの異なる複数のマイクロレンズアレイ１７と、該マイクロレンズアレイ１７のいずれか１つを択一的に光軸上に配置するターレット１８と、対物レンズ９とマイクロレンズアレイ１７との組み合わせに応じてスリット部材７を制御する制御部１９とを備えている点で、第１の実施形態に係るライトフィールド顕微鏡１と相違している。
レボルバ１６およびターレット１８には図示しないセンサが配置されており、光軸上に配置されている対物レンズ１５およびマイクロレンズアレイ１７の種類を制御部１９に送信するようになっている。
このように構成された本実施形態に係るライトフィールド顕微鏡１４および照明方法によれば、目的とする３次元画像の深度を得るために、レボルバ１６を操作して倍率の異なる複数の対物レンズ１５からいずれかの倍率の対物レンズ１５を選択して光軸上に配置するとともに、ターレット１８を操作してピッチの異なるマイクロレンズアレイ１７からいずれかのピッチのマイクロレンズアレイ１７を選択して光軸上に配置する。
レボルバ１６に設けられたセンサにより、光軸上に配置された対物レンズ１５の倍率が検出され、ターレット１８に設けられたセンサにより、光軸上に配置されたマイクロレンズアレイ１７のピッチが検出されるので、制御部１９が、選択された対物レンズ１５の倍率とマイクロレンズアレイ１７のピッチとに基づいて、３次元画像の深度を決定し、該深度に対応する厚さ寸法の励起光が試料Ｘに照射されるようにスリット部材７のスリット６の開口幅を調節する。
これにより、観察者が必要とする撮影倍率や解像度に応じて所望の対物レンズ９およびマイクロレンズアレイ１７を選択すると、選択された対物レンズ１５とマイクロレンズアレイ１７との組み合わせに最も適合する厚さ寸法の励起光を試料Ｘに照射することができ、不必要な領域への励起光の照射を防止して、試料Ｘの褪色を効果的に防ぐことができるという利点がある。
なお、本実施形態においては、試料Ｘに照射する励起光の厚さ寸法をスリット部材７のスリット６の開口幅を変更することによって調節することとしたが、これに代えて、図３に示されるように、照明光学系２の光ファイバ８から射出される励起光をコリメートレンズ５とシリンドリカルレンズ２０ａ，２０ｂとにより平坦な平板状に形成した後に、このように形成された励起光をズーム光学系（光束幅調節部）２１に入射させ、該ズーム光学系２１によって、試料Ｘに照射する励起光の厚さ寸法を連続的に変更することにしてもよい。
また、ズーム光学系２１に代えて、図４に示されるように、異なる倍率を有する複数のビームエキスパンダ（光学系）２２のいずれかを択一的に、シリンドリカルレンズ２０ｂと試料Ｘとの間に配置可能なターレット（光束幅調節部）２３を採用してもよい。これにより、試料Ｘに照射する励起光の厚さ寸法を段階的に変更することができる。
次に、本発明の第３の実施形態に係るライトフィールド顕微鏡２４について、図５および図６を参照して説明する。
本実施形態の説明において、上述した第２の実施形態に係るライトフィールド顕微鏡１４と構成を共通とする箇所には同一符号を付して説明を省略する。
本実施形態の説明において、上述した第２の実施形態に係るライトフィールド顕微鏡１４と構成を共通とする箇所には同一符号を付して説明を省略する。
本実施形態に係るライトフィールド顕微鏡２４は、照明光学系２５、およびマイクロレンズアレイ１７とリレーレンズ（像位置補正手段）３１とが結像レンズ１１と撮像素子１３との間に択一的に挿脱可能に設けられている点において、第２の実施形態に係るライトフィールド顕微鏡１４と相違している。
照明光学系２５は、光源４（シート照明光生成部）と、コリメートレンズ（シート照明光生成部）５とシリンドリカルレンズ（シート照明光生成部）２６ａ，２６ｂとによりシート状に形成された励起光を１次元的に走査するガルバノミラー（走査部）２７とリレーレンズ２８ａ，２８ｂと、ガルバノミラー２７による走査によって変化する射出角度を略水平に変換する集光レンズ２９とを備えている。また、集光レンズ２９の後段には、スリット部材（開口幅変更部）７が設けられ、ガルバノミラー２７による走査範囲の略中央部分の一部のみを通過させて試料Ｘに入射させるようになっている。図中、符号３０は光路形成用のミラーである。
このように構成された本実施形態に係るライトフィールド顕微鏡２４の作用について以下に説明する。
本実施形態に係るライトフィールド顕微鏡２４を用いた照明方法は、光ファイバ８から射出された励起光が、コリメートレンズ５およびシリンドリカルレンズ２６ａ，２６ｂによって、薄い平行光束が形成され、ガルバノミラー２７によって走査され、リレーレンズ２８ａ，２８ｂによってリレーされた後に、集光レンズ２９によって集光され、スリット部材７を通過したものが試料Ｘに照射される。
本実施形態に係るライトフィールド顕微鏡２４を用いた照明方法は、光ファイバ８から射出された励起光が、コリメートレンズ５およびシリンドリカルレンズ２６ａ，２６ｂによって、薄い平行光束が形成され、ガルバノミラー２７によって走査され、リレーレンズ２８ａ，２８ｂによってリレーされた後に、集光レンズ２９によって集光され、スリット部材７を通過したものが試料Ｘに照射される。
集光レンズ２９の焦点位置は、対物レンズ１５の光軸に略一致している。これにより、対物レンズ１５の光軸に略直交する平面に沿って入射されたシート状の励起光は、対物レンズ１５の光軸近辺で光軸方向に集光して最も薄くなっている。このように形成されたシート状の励起光は、ガルバノミラー２７の揺動によって、対物レンズ１５の光軸方向に走査させられる。
ガルバノミラー２７による励起光の走査速度は撮像素子１３の露光時間に対して十分に速く、露光時間内に少なくともスリット６の開口幅分の走査を行うことができるようになっている。
これにより、スリット６の開口幅よりも十分に薄いシート状の励起光によっても、スリット６の開口幅によって決定される厚さ寸法の励起光を照射したのと同様に、３次元画像を取得するための蛍光信号を取得することができる。
これにより、スリット６の開口幅よりも十分に薄いシート状の励起光によっても、スリット６の開口幅によって決定される厚さ寸法の励起光を照射したのと同様に、３次元画像を取得するための蛍光信号を取得することができる。
ガルバノミラー２７を高速に揺動させる場合に、駆動波形は正弦波であることが好ましく、この場合に、正弦波はガルバノミラー２７の走査角度に対して各速度が一定ではない。本実施形態においては、試料Ｘに射出される励起光を、スリット部材７によってガルバノミラー２７による走査範囲の中央近傍に制限することにより、シート状の励起光を擬似的に等速度で試料Ｘ内に走査させることができる。
なお、スリット部材７は、試料Ｘの近傍に配置するか、リレーレンズ２８ａの焦点位置または焦点位置近傍に配置するのが好ましい。
なお、スリット部材７は、試料Ｘの近傍に配置するか、リレーレンズ２８ａの焦点位置または焦点位置近傍に配置するのが好ましい。
なお、走査速度の補正については、例えば、励起光を光ファイバ８に入射させる前に音響光学変調器のようなモジュレータによって変調することにより行ってもよい。
また、本実施形態に係るライトフィールド顕微鏡２４によれば、図６に示されるように、ガルバノミラー２７による走査を停止して、シート状の励起光を対物レンズ１５の焦点面Ａに沿う位置に固定するとともに、マイクロレンズアレイ１７を光軸上から離脱させ、リレーレンズ３１を光路に挿入することにより、シート照明顕微鏡として利用することができる。観察者は目的に応じてライトフィールド顕微鏡２４とシート照明顕微鏡とを切り替えて使用することができる。
また、本実施形態においては、焦点を有するシート光を走査および非走査から選択することによってライトフィールド顕微鏡２４とシート照明顕微鏡とを切り替えているが、例えば扁平な平行光束にシリンドリカルレンズのような非対象光学素子を光路に挿脱することによりライトフィールド顕微鏡２４とシート照明顕微鏡とを切り替えてもよい。
また、シート照明顕微鏡に切り替える際の、結像位置を補正する手段（像位置補正手段）として、リレーレンズ３１に代えて、平行平面ガラスを配置してもよい。
また、本実施形態においては、焦点を有するシート光を走査および非走査から選択することによってライトフィールド顕微鏡２４とシート照明顕微鏡とを切り替えているが、例えば扁平な平行光束にシリンドリカルレンズのような非対象光学素子を光路に挿脱することによりライトフィールド顕微鏡２４とシート照明顕微鏡とを切り替えてもよい。
また、シート照明顕微鏡に切り替える際の、結像位置を補正する手段（像位置補正手段）として、リレーレンズ３１に代えて、平行平面ガラスを配置してもよい。
また、本実施形態に係るライトフィールド顕微鏡２４では、十分に薄いシート状の励起光を試料Ｘに照射するので、励起光として極短パルスレーザ光を使用し、多光子吸収効果によって蛍光を発生させることにしてもよい。
また、シート光は対物レンズ１５の略光軸位置で集光する線状の光束がシート光の面内方向に光走査されてもよい。このようにすることで、集光位置での光密度を上げることができるので、より高い多光子吸収効果によって蛍光を発生させることができる。
また、第２の実施形態と同様にして、対物レンズ１５の倍率とマイクロレンズアレイ１７のピッチとの組み合わせに応じて、スリット部材７のスリット６の開口幅を調節することにしてもよい。
また、シート光は対物レンズ１５の略光軸位置で集光する線状の光束がシート光の面内方向に光走査されてもよい。このようにすることで、集光位置での光密度を上げることができるので、より高い多光子吸収効果によって蛍光を発生させることができる。
また、第２の実施形態と同様にして、対物レンズ１５の倍率とマイクロレンズアレイ１７のピッチとの組み合わせに応じて、スリット部材７のスリット６の開口幅を調節することにしてもよい。
１，１４，２４ ライトフィールド顕微鏡
２，２５ 照明光学系
３ 検出光学系
４ 光源（シート照明光生成部）
５ コリメートレンズ（シート照明光生成部）
６ スリット
７ スリット部材（光束幅調節部、開口幅変更部）
９，１５ 対物レンズ
１２，１７ マイクロレンズアレイ
１３ 撮像素子
１９ 制御部
２１ ズーム光学系（光束幅調節部）
２２ ビームエキスパンダ（光学系）
２６ａ，２６ｂ シリンドリカルレンズ（シート照明光生成部）
２７ ガルバノミラー（走査部）
３１ リレーレンズ（像位置補正手段）
Ａ 焦点面
Ｘ 試料
２，２５ 照明光学系
３ 検出光学系
４ 光源（シート照明光生成部）
５ コリメートレンズ（シート照明光生成部）
６ スリット
７ スリット部材（光束幅調節部、開口幅変更部）
９，１５ 対物レンズ
１２，１７ マイクロレンズアレイ
１３ 撮像素子
１９ 制御部
２１ ズーム光学系（光束幅調節部）
２２ ビームエキスパンダ（光学系）
２６ａ，２６ｂ シリンドリカルレンズ（シート照明光生成部）
２７ ガルバノミラー（走査部）
３１ リレーレンズ（像位置補正手段）
Ａ 焦点面
Ｘ 試料
Claims (19)
- 試料に励起光を照射する照明光学系と、
該照明光学系により前記励起光が照射されることにより前記試料において発生した蛍光を集光する対物レンズ、該対物レンズにより集光された蛍光を撮影する撮像素子および該撮像素子と前記対物レンズとの間に配置されたマイクロレンズアレイを備える検出光学系とを備え、
前記照明光学系が、前記対物レンズの焦点面を含みかつ該対物レンズの光軸方向に所定の幅を有する前記励起光の光束を、前記光軸に略直交する方向に沿って前記試料に照射するライトフィールド顕微鏡。 - 前記照明光学系が、前記励起光の光束の幅を変更する光束幅調節部を備える請求項１に記載のライトフィールド顕微鏡。
- 前記試料を前記検出光学系の光軸方向に、前記対物レンズと前記マイクロレンズアレイとの組み合わせに応じて決定される所定の距離だけ順次移動させて撮影する請求項１に記載のライトフィールド顕微鏡。
- 前記照明光学系が、前記励起光を射出する光源と、該光源からの前記励起光の一部を通過させるスリットとを備え、
前記光束幅調節部が、前記スリットの開口幅を変更する請求項２に記載のライトフィールド顕微鏡。 - 前記照明光学系が、前記励起光を射出する光源と、該光源からの前記励起光を集光するズーム光学系とを備え、
前記光束幅調節部が、前記ズーム光学系によるズーム倍率を変更する請求項２に記載のライトフィールド顕微鏡。 - 前記照明光学系が、前記励起光を射出する光源と、該光源からの前記励起光の光路に択一的に挿入されて前記励起光を集光する倍率の異なる複数の光学系とを備え、
前記光束幅調節部が、複数の前記光学系を切り替える請求項２に記載のライトフィールド顕微鏡。 - 前記対物レンズおよび前記マイクロレンズアレイの少なくとも１つが切替可能に設けられ、
前記対物レンズおよび前記マイクロレンズアレイの少なくとも１つが切り替えられたときに前記光束幅調節部を制御する制御部を備える請求項２および請求項４から請求項６のいずれかに記載のライトフィールド顕微鏡。 - 試料に励起光を照射する照明光学系と、
該照明光学系により前記励起光が照射されることにより前記試料において発生した蛍光を集光する対物レンズ、該対物レンズにより集光された蛍光を撮影する撮像素子および該撮像素子と前記対物レンズとの間に配置されたマイクロレンズアレイを備える検出光学系とを備え、
前記照明光学系が、前記対物レンズの光軸に略直交する方向に沿うシート状の光束を生成して前記光軸に略直交する方向に沿って前記試料に照射するシート照明光生成部と、該シート照明光生成部により生成されたシート状の光束を、前記撮像素子による１枚の画像の露光時間内に、前記対物レンズの焦点面を含む所定範囲にわたって前記光軸方向に走査させる走査部とを備えるライトフィールド顕微鏡。 - 前記対物レンズおよび前記マイクロレンズアレイの少なくとも１つが切替可能に設けられ、
前記対物レンズおよび前記マイクロレンズアレイの少なくとも１つが切り替えられたときに前記走査部による前記シート状の光束の走査幅を制御する制御部を備える請求項８に記載のライトフィールド顕微鏡。 - 前記走査部による前記シート状の光束の走査幅の一部に開口幅を有するスリットを備える請求項８に記載のライトフィールド顕微鏡。
- 前記スリットの前記開口幅を変更する開口幅変更部を備える請求項１０に記載のライトフィールド顕微鏡。
- 前記励起光が極短パルスレーザ光である請求項８から請求項１１のいずれかに記載のライトフィールド顕微鏡。
- 前記マイクロレンズアレイとリレーレンズとが、前記撮像素子と前記対物レンズとの間に択一的に挿脱可能に設けられている請求項８から請求項１２のいずれかに記載のライトフィールド顕微鏡。
- 前記マイクロレンズアレイと像位置補正手段とが、前記撮像素子と前記対物レンズとの間に択一的に挿脱可能に設けられている請求項８から請求項１２のいずれかに記載のライトフィールド顕微鏡。
- 照明光学系と、該照明光学系により励起光が照射されることにより試料において発生した蛍光を集光する対物レンズと、該対物レンズにより集光された蛍光を撮影する撮像素子と、該撮像素子と前記対物レンズとの間に配置されたマイクロレンズアレイとを備えたライトフィールド顕微鏡を用いた照明方法であって、
前記照明光学系が、前記対物レンズの焦点面を含みかつ該対物レンズの光軸方向に所定の幅を有する前記励起光の光束を、前記光軸に略直交する方向に沿って前記試料に照射する照明方法。 - 前記励起光の所定の幅を、前記対物レンズと前記マイクロレンズアレイの組み合わせに基づいて調節する請求項１５に記載の照明方法。
- 照明光学系と、該照明光学系により励起光が照射されることにより試料において発生した蛍光を集光する対物レンズと、該対物レンズにより集光された蛍光を撮影する撮像素子と、該撮像素子と前記対物レンズとの間に配置されたマイクロレンズアレイとを備えたライトフィールド顕微鏡を用いた照明方法であって、
前記照明光学系が、前記対物レンズの光軸の近辺で集光し当該光軸に略直交する方向に沿うシート状の励起光の光束を、前記光軸に略直交する方向に沿って前記試料に照射するとともに、このシート状の光束を、前記撮像素子における１枚の画像の露光時間内に前記対物レンズの焦点面を含む所定範囲にわたって前記対物レンズの光軸方向に走査させる照明方法。 - 前記シート状の光束の前記対物レンズの光軸方向への走査幅を、前記対物レンズと前記マイクロレンズアレイの組み合わせに基づいて制御する請求項１７に記載の照明方法。
- 前記励起光として極短パルスレーザ光を使用する請求項１７に記載の照明方法。
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