JP2017176074A - アンチセンスオリゴ核酸化合物およびその配列決定法 - Google Patents

Abstract

【課題】本発明は、優れた効果を有するアンチセンスオリゴ核酸化合物、およびその配列決定法を提供することを主な課題とする。【解決手段】本発明として、例えば、標的遺伝子（例、ＧＳＫ３β）のｍＲＮＡにおけるｍｉＲＮＡ結合サイトと相補的な二重鎖を形成し、かかる二重鎖形成部における当該ｍＲＮＡのｍｉＲＮＡ結合サイトをＲＮａｓｅＨにより切断することができる、修飾または改変されていてもよい一本鎖核酸を含むアンチセンスオリゴ核酸化合物、それを有効成分として含有する癌治療剤等の医薬組成物、およびアンチセンスオリゴ核酸化合物の効果的配列決定法を挙げることができる。【選択図】なし

Description

本発明は、アンチセンス核酸に係る技術分野に属する。詳しくは、本発明は、アンチセンスオリゴ核酸化合物に関するものであって、ＧＳＫ３β等のｍＲＮＡにおけるｍｉＲＮＡ結合サイトと相補的二重鎖を形成しうるアンチセンスオリゴ核酸化合物、かかるアンチセンスオリゴ核酸化合物を有効成分とする医薬組成物、またはアンチセンスオリゴ核酸化合物の配列決定法に関するものである。

癌、すなわち悪性腫瘍は、生体自身から発生した細胞塊が生体の制御を脱し、自律的に異常に増殖し続け、周囲の組織や遠くの臓器にまでの浸潤と転移に至り、最終的には生体を死に至らしめる疾病である。現在の日本において、癌は、全死亡原因のうち約３０％を占める第一位の死亡原因である。その中でも胃癌、大腸癌、膵臓癌等の消化器系の癌の比率が日本においては死亡原因の半数以上を占め、世界と比較して非常に高くなっている。

癌を引き起こす主な原因は、遺伝的要因、または発癌性物質等による環境的要因または細菌・ウィルス感染等によって引き起こされる遺伝子変異等であり、その結果として人体の組織に存在する細胞の無秩序な増殖を引き起こす。遺伝子変異等により、その機能が亢進した結果、癌を引き起こす遺伝子を「癌促進遺伝子」と呼び、現在Ｓｒｃ、Ｒａｓ等の２００種類以上が知られている。これらの「癌促進遺伝子」の多くは細胞増殖に関する機能を有する遺伝子である。一方、その機能が低下すると、癌を引き起こす遺伝子を「癌抑制遺伝子」と呼び、Ｐ５３、ＢＲＣＡ１およびＧＳＫ３β等が知られている。これらの遺伝子は、細胞周期チェックポイント制御、転写因子制御等の機能を有している遺伝子である。

これらの「癌関連遺伝子」に対して、その遺伝子産物そのものを標的とする分子標的医薬が近年盛んに開発されている。分子標的医薬は、癌細胞の増殖等に関わる特定の分子に狙いを定めて攻撃する薬であり、癌細胞の特定の分子を標的としているため、従来の薬と比較して正常細胞への副作用が少なく治療効果が高いことが特徴である。分子標的医薬の標的としては、今までに、ＥＧＦＲ（上皮成長因子受容体）、ＨＥＲ２、ｍＴＯＲ、ＡＬＫなどが知られている。これらはいずれも癌の増殖に関係するタンパク質である。

ＧＳＫ３β（グリコーゲン・シンターゼ・キナーゼ・３ベータ）は、当初はグリコーゲン代謝に関与するセリン／スレオニンタンパク質キナーゼとして発見されたが、その後、その機能に加えて、細胞内のシグナル伝達経路であるＷｎｔ経路における重要な制御因子であることが解明されてきた。このＷｎｔ経路において、ＧＳＫ３βは細胞増殖に重要な転写促進因子であるβカテニンをリン酸化することにより、ユビキチン−プロテアソーム分解系に誘導、そして分解させる機能を有している。以上の機能からＧＳＫ３βは「癌抑制遺伝子」の一つであると考えられている。

本発明者らのグループは、ＧＳＫ３βが、従来、「癌抑制遺伝子」であるという知見に反して、癌化した細胞において機能が亢進していること、および、その機能の抑制により、癌を抑制できることを報告し、ＧＳＫ３βを癌治療の標的とすることを提案している（非特許文献１）。これは、Ｗｎｔ経路抑制機能とは全く異なり、ＧＳＫ３βの過剰発現やそのリン酸化による酵素活性の調節不全が、癌細胞の生存や増殖を維持、および促進するという病的作用である。

しかし、現在のところ、ＧＳＫ３βの働きを効果的に阻害する分子標的医薬は未だ開発されておらず、ＧＳＫ３βの機能を調節するために、化学阻害剤等以外にも抗体、アンチセンス核酸等の開発が試みられている。特許文献１においては、ゲムシタビン、シメチジンおよびバルプロ酸を組み合わせた膵臓癌治療剤が開示されている。当該治療剤においては、従来使用されていた薬物からの、ドラッグリポジショニングの手法によるスクリーニングにおいてＧＳＫ３β阻害活性が見いだされた３種の薬剤を、組み合わせて投与することにより、ＧＳＫ３βの機能に起因する癌の治療を試みている。

また、特許文献２には、ＧＳＫ３βに対するアンチセンス核酸医薬が開示されている。当該アンチセンス医薬は、ＧＳＫ３β遺伝子、ｍＲＮＡ、またはプレｍＲＮＡに対するものであり、糖尿病、アルツハイマーおよび双極性障害等のＧＳＫ３βの機能と関連した症状の治療を目的としている。
このような遺伝子を標的としたアンチセンス核酸医薬は、効果的な分子標的医薬が存在しない場合においては、直接目的の遺伝子の働きを抑制するためには非常に有効な戦略である。アンチセンス核酸化合物の化学構造の修飾技術の進歩により、従来の課題であったアンチセンス核酸化合物の安定性は達成されつつあるが（非特許文献２）、目的の達成のために効果的なアンチセンス核酸化合物の設計方法、および目的とする組織の細胞内へ効率的な送達等においては、未だ十分には確立されておらず課題が多い状況である。

アンチセンス核酸化合物の設計上の問題は、その効果の予測が困難なところである。原理上は、標的となる配列の候補は、設計の標的となるｍＲＮＡが数千塩基〜数万塩基からなるため非常に多い。しかし、実際のところ、標的となるｍＲＮＡは高次構造をとるため、アンチセンスオリゴ核酸化合物が実際に接近できる配列は限られ、しかもその高次構造は、核酸結合タンパク質との相互作用によって変化するため、標的ｍＲＮＡに対し接近可能なアンチセンスオリゴ核酸化合物の配列を、合理的に決定することは非常に困難である。そのため、これまで活性のあったアンチセンスオリゴ核酸配列から、共通のモチーフを統計的に選びだし、モチーフを含む配列を選択する方法（非特許文献３）や、網羅的にアンチセンスオリゴ核酸配列をスクリーニングする方法などが用いられてきた。

ところで、近年、ヒト等の高等哺乳動物の細胞内における、１８〜２５塩基程度の長さを有する一本鎖の小分子ＲＮＡであるｍｉＲＮＡ（マイクロＲＮＡ）の働きが徐々に明らかになってきている。ｍｉＲＮＡは、タンパク質には翻訳されない非翻訳領域のＲＮＡであり、ｍＲＮＡの分解、発現調節等の様々な機能を有している。ｍｉＲＮＡは、ＲＩＳＫ（ＲＮＡ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｃｏｍｐｌｅｘ、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体）と結合することによりｍｉＲＩＳＫ（ｍｉＲＮＡ−ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体）を形成し、標的とする遺伝子のｍＲＮＡ等に結合し作用することにより、当該ｍＲＮＡ等の発現を制御するという生命現象において重要な働きを担っている。ＧＳＫ３β遺伝子の発現も、このようなｍｉＲＮＡによって制御されていることが報告されている（非特許文献４）。

特開２０１４−２１４１２６号公報 特表２００３−５２００４１号公報

島崎猛夫，石垣靖人，源利成，元雄良治 膵臓，（２０１０），Ｖｏｌ．２５，ｐｐ．３５〜４５ Ｊｅｎｓ Ｋｕｒｒｅｃｋ，Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ Ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，（２００３），Ｖｏｌ．２７０，ｐｐ．１６２８〜１６４４ Ｏ．Ｖ．Ｍａｔｖｅｅｖａ，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，（２０００），Ｖｏｌ．２８（１５），ｐｐ．２８６２〜２８６５ Ｙｕｅｇｕａｎｇ Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，（２０１１），Ｖｏｌ．４０８，ｐｐ．２５９〜２６４

ＧＳＫ３βのような、効果的な分子標的医薬が存在しない遺伝子ないし遺伝子産物に対しては、アンチセンスオリゴ核酸医薬を構築することは有効な戦略であると考えられる。しかし、従来は、効果的なアンチセンスオリゴ核酸を、合理的に設計することは非常に困難であった。

ｍｉＲＮＡの主要な機能は、ｍｉＲＮＡとＲＩＳＣとがＲＩＳＣ複合体（ｍｉＲＩＳＣ）を形成し、当該ｍｉＲＩＳＣがｍＲＮＡの非翻訳領域である３’−ＵＴＲ等に結合することにより、翻訳開始阻害を含めた遺伝子の発現抑制を行うことである。すなわち、ｍＲＮＡのｍｉＲＮＡ結合サイトは、ｍｉＲＩＳＣが接近可能な部位であるといえる。また、通常、疾患で発現量が増えている転写産物は、ｍｉＲＮＡによる発現抑制を受けていないと考えられることから、ｍｉＲＮＡ結合サイトにはｍｉＲＮＡまたはｍｉＲＩＳＫがあまり結合していない状態にある。

本発明は、ＧＳＫ３β等のｍＲＮＡのｍｉＲＮＡ結合サイトを利用した、標的遺伝子の発現を効果的に抑制しうるアンチセンスオリゴ核酸、それを有効成分として含有する医薬組成物、またはアンチセンスオリゴ核酸を効率的に設計することができる新規な配列決定法などを提供することを主な課題とする。
なお、本明細書に掲げる各文献に記載された内容は、本明細書の一部として援用される。

本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究した結果、標的遺伝子のｍＲＮＡにおけるｍｉＲＮＡ結合サイトと相補的二重鎖を形成し、かかる二重鎖形成部における当該ｍＲＮＡのｍｉＲＮＡ結合サイトをＲＮａｓｅＨにより切断することができるアンチセンスオリゴ核酸化合物が、優れた標的遺伝子発現抑制効果を有すること、およびその配列決定法を見出し本発明に到達した。

本発明として、例えば、以下のものを挙げることができる。
［１］標的遺伝子のｍＲＮＡにおけるｍｉＲＮＡ結合サイトと相補的二重鎖を形成し、かかる二重鎖形成部における当該ｍｉＲＮＡ結合サイトをＲＮａｓｅＨにより切断することができる、修飾または改変されていてもよい一本鎖核酸を含むアンチセンスオリゴ核酸化合物。
［２］前記一本鎖核酸が４〜３５塩基長からなる、上記［１］に記載のアンチセンスオリゴ核酸化合物。

［３］前記標的遺伝子がＧＳＫ３βである、上記［１］または［２］に記載のアンチセンスオリゴ核酸化合物。
［４］前記一本鎖核酸が、次のいずれかの塩基配列を有するものか、または当該効果を損なわない範囲でその一部が欠失、置換もしくは付加したものである、上記［３］に記載のアンチセンスオリゴ核酸化合物。
配列番号１：5'-CTCAAGTGTATCTTTCCAAG-3'
配列番号２：5'-TTCAAGTAGTAATAATGTTA-3'
配列番号３：5'-CTCAAGTGATCTTTAAATGT-3'
配列番号４：5'-CTCAAGTAACTGGTGGTTTT-3'
配列番号５：5'-TACAGTACCAGTTAACTATT-3'
（各塩基配列中、Ａ、Ｇ、Ｃ、ＴはＤＮＡを表す。）

［５］前記一本鎖核酸がギャップマー型である、上記［１］〜［４］のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴ核酸化合物。
［６］前記一本鎖核酸が、５’末端の５塩基配列および３’末端の５塩基配列においてＲＮＡ型であって、その中のチミン（Ｔ）がウラシル（Ｕ）であるものか、または次のいずれかの塩基配列を有するものか、もしくは当該効果を損なわない範囲でその一部が欠失、置換もしくは付加したものである、上記［５］に記載のアンチセンスオリゴ核酸化合物。
配列番号６：5'-CUCAAGTGTATCTTTCCAAG-3'
配列番号７：5'-UUCAAGTAGTAATAAUGUUA-3'
配列番号８：5'-CUCAAGTGATCTTTAAAUGU-3'
配列番号９：5'-CUCAAGTAACTGGTGGUUUU-3'
配列番号１０：5'-UACAGTACCAGTTAACUAUU-3'
（各塩基配列中、Ａ、Ｇ、Ｃ、ＴはＤＮＡを、Ａ、Ｇ、Ｃ、ＵはＲＮＡを、それぞれ表す。）

［７］前記一本鎖核酸が、次の（１）および／または（２）の構造を有するものである、上記［１］〜［６］のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴ核酸化合物。
（１）糖リン酸バックボーンにホスホロチオエート結合を有する構造
（２）ＲＮＡ型の２’水酸基が修飾されている構造
［８］前記一本鎖核酸が、次のいずれかの塩基配列を有し、当該核酸におけるリン酸結合部分がホスホロチオエート結合であるものか、または当該効果を損なわない範囲でその一部が欠失、置換もしくは付加したものである、上記［７］に記載のアンチセンスオリゴ核酸化合物。
配列番号６：5'-CUCAAGTGTATCTTTCCAAG-3'
配列番号７：5'-UUCAAGTAGTAATAAUGUUA-3'
配列番号８：5'-CUCAAGTGATCTTTAAAUGU-3'
配列番号９：5'-CUCAAGTAACTGGTGGUUUU-3'
配列番号１０：5'-UACAGTACCAGTTAACUAUU-3'
（各塩基配列中、Ａ、Ｇ、Ｃ、ＴはＤＮＡを、Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｕは２’−ＯＣＨ_３ ＲＮＡを、それぞれ表す。）
［９］５’末端および／または３’末端に直接またはリンカーを介して糖化合物を有する、上記［１］〜［８］のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴ核酸化合物。
［１０］前記リンカーが、炭素数２〜３０のアルキレン、炭素数２〜２４のオキサアルキレン、炭素数２〜２４のアザアルキレン、またはチアアルキレンである、上記［９］に記載のアンチセンスオリゴ核酸化合物。
［１１］前記リンカーが、トリエチレングリコールリンカー、テトラエチレングリコールリンカー、または炭素数６〜１２のオキサアルキレンである、上記［９］または［１０］に記載のアンチセンスオリゴ核酸。
［１２］前記糖化合物が、グルコース、ガラクトース、Ｎ−アセチルガラクトサミン、フコース、またはシアル酸である、上記［９］〜［１１］のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴ核酸化合物。

［１３］上記［１］〜［１２］のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴ核酸化合物もしくはその医薬上許容される塩、またはそれらの水和物を有効成分として含有することを特徴とする、医薬組成物。
［１４］前記医薬組成物が癌治療剤または予防剤である、上記［１３］に記載の医薬組成物。
［１５］前記癌が消化器系癌である、上記［１４］に記載の医薬組成物。
［１６］前記消化器系癌が、胃癌、膵臓癌、または大腸癌である、上記［１５］に記載の医薬組成物。

［１７］次の各工程を含むことを特徴とする、標的遺伝子の発現を抑制するためのアンチセンスオリゴ核酸配列決定法。
１）標的遺伝子のｍＲＮＡにおけるｍｉＲＮＡ結合サイトを選び出す工程、
２）選び出したｍｉＲＮＡ結合サイトに基づき、当該ｍｉＲＮＡが結合する位置で標的遺伝子のｍＲＮＡを分解しうるアンチセンスオリゴ核酸配列を設計する工程、
３）選び出したｍｉＲＮＡ結合サイトを含む部位と、設計したアンチセンスオリゴ核酸配列との相互作用エネルギーを計算し、その計算結果から候補となるアンチセンスオリゴ核酸配列を選び出す工程、
４）選び出した候補アンチセンスオリゴ核酸配列を有するオリゴ核酸化合物について、標的遺伝子の発現抑制効果を評価する工程。

［１８］前記アンチセンスオリゴ核酸配列が、ＲＮａｓｅＨ依存アンチセンスオリゴ核酸配列またはｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖核酸配列である、上記［１７］に記載のアンチセンスオリゴ核酸配列決定法。
［１９］前記ＲＮａｓｅＨ依存アンチセンスオリゴ核酸配列がギャップマー型である、上記［１８］に記載のアンチセンスオリゴ核酸配列決定法。
［２０］前記標的遺伝子がＧＳＫ３βである、上記［１７］〜［１９］のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴ核酸配列決定法。

本発明によれば、ＧＳＫ３β等の遺伝子の発現を効果的に抑制することができ、その結果、抗腫瘍効果等を得ることができる。また、適当なリンカーを介して糖化合物で修飾した本発明に係るアンチセンスオリゴ核酸化合物を用いれば、癌等の腫瘍組織へ効率的に送達させることができる。加えて、ＧＳＫ３β等の遺伝子の発現を効果的に抑制することができるアンチセンスオリゴ核酸化合物の配列を効率的に設計することができる。

陰イオン交換ＨＰＬＣ分析のクロマトグラムを表す。縦軸は吸光度（Ａｂｓ）を、横軸は溶出時間（分）を、それぞれ示す。 ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析結果を表す。縦軸はシグナルの強度、横軸は質量（ｍ）と電荷（ｚ）の比の値を、それぞれ示す。 陰イオン交換ＨＰＬＣ分析のクロマトグラムを表す。縦軸は吸光度（Ａｂｓ）を、横軸は溶出時間（分）を、それぞれ示す。 ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析結果を表す。縦軸はシグナルの強度、横軸は質量（ｍ）と電荷（ｚ）の比の値を、それぞれ示す。 陰イオン交換ＨＰＬＣ分析のクロマトグラムを表す。縦軸は吸光度（Ａｂｓ）を、横軸は溶出時間（分）を、それぞれ示す。 ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析結果を表す。縦軸はシグナルの強度、横軸は質量（ｍ）と電荷（ｚ）の比の値を、それぞれ示す。 陰イオン交換ＨＰＬＣ分析のクロマトグラムを表す。縦軸は吸光度（Ａｂｓ）を、横軸は溶出時間（分）を、それぞれ示す。 ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析結果を表す。縦軸はシグナルの強度、横軸は質量（ｍ）と電荷（ｚ）の比の値を、それぞれ示す。

ＭＴＴアッセイの測定結果を表す。縦軸はコントロールに対する細胞増殖抑制率を示す。

膵癌培養細胞への核酸化合物の取り込みの程度を表す写真である。左写真は糖化合物を付加していない核酸化合物の結果を、右写真は糖化合物（グルコース）を付加した核酸化合物の結果を、それぞれ表す。 膵癌培養細胞への核酸化合物の取り込み量を表す。左カラムは糖化合物を付加していない核酸化合物の結果を、右カラムは糖化合物（グルコース）を付加した核酸化合物の結果を、それぞれ表す。縦軸は平均輝度を示す。 各種膵癌培養細胞等への核酸化合物の取り込みの程度を表す写真である。 膵癌培養細胞への核酸化合物の取り込みの程度を表す写真である。 膵癌培養細胞（ＰＡＮＣ−１）への核酸化合物の取り込みの程度を表す写真である。 膵癌培養細胞（ＢｘＰＣ３）への核酸化合物の取り込みの程度を表す写真である。 膵管正常培養細胞への核酸化合物の取り込みの程度を表す写真である。 膵癌培養細胞または膵管正常培養細胞に対する、６時間後の核酸化合物の取り込み率を表す。縦軸は、膵管正常培養細胞に対する、糖化合物を付加していない核酸化合物の取り込み量を１００とした場合の割合（％）を示す。

１ 本発明に係るアンチセンスオリゴ核酸化合物
本発明に係るアンチセンスオリゴ核酸化合物（以下、「本発明核酸化合物」という。）は、標的遺伝子のｍＲＮＡにおけるｍｉＲＮＡ結合サイトと相補的二重鎖を形成し、かかる二重鎖形成部における当該ｍｉＲＮＡ結合サイトをＲＮａｓｅＨにより切断することができる、修飾または改変されていてもよい一本鎖核酸を含むものである。

１．１ 標的遺伝子のｍＲＮＡにおけるｍｉＲＮＡ結合サイトについて
本発明核酸化合物は、標的遺伝子のｍＲＮＡにおけるｍｉＲＮＡ結合サイトと相補的二重鎖を形成するものである。

本発明核酸化合物が標的とする遺伝子は、そのｍＲＮＡがｍｉＲＮＡ結合サイトを有するものであれば特に制限されない。具体的には、癌関連遺伝子、例えば、ＧＳＫ３β、ＥＧＦＲ、ＶＥＧＦ、Ｒａｓ、Ｒａｆ、Ｍｙｃ、Ｂｃｒ−Ａｂｌ、Ｋｉｔ、ＥＧＦＲ、Ｈｅｒ２、ＡＬＫ、ＪＡＫ、Ｂｔｋを挙げることができる。この中、ＧＳＫ３βを標的とすることが好ましい。標的遺伝子のｍＲＮＡは、例えば、非翻訳領域である３’−ＵＴＲまたは５’−ＵＴＲにｍｉＲＮＡ結合サイトを有するものを挙げることができる。

ｍｉＲＮＡ結合サイトは、生体内において１８〜２５塩基程度の長さを有する一本鎖の小分子ＲＮＡであるｍｉＲＮＡが、例えばｍＲＮＡの転写後の発現を調節するために結合する部位である。通常、ｍｉＲＮＡとＲＩＳＫとからなるｍｉＲＩＳＣ（ｍｉＲＮＡ−ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体）が、ｍＲＮＡの非翻訳領域である３’−ＵＴＲ等に存在するｍｉＲＮＡ結合サイトに結合することにより、翻訳開始阻害、ｍＲＮＡの分解を含めた、遺伝子の発現抑制が行われる。このことからも当該結合サイトはｍｉＲＩＳＣが接近可能な部位であることが好ましい。また、疾患で発現量が増えているｍＲＮＡの転写産物は、ｍｉＲＮＡによる発現抑制を受けていないと考えられ、ｍｉＲＮＡ結合サイトにｍｉＲＮＡまたはｍｉＲＩＳＫがあまり結合していないため、本発明核酸化合物の結合は容易であると推測される。

１．２ ＲＮａｓｅＨによる切断について
本発明核酸化合物は、上記相補的二重鎖形成部における当該ｍｉＲＮＡ結合サイトをＲＮａｓｅＨにより切断することができるものである。
ＲＮａｓｅＨは、生体の細胞核に存在する周知の核酸分解酵素であり、ＤＮＡ−ＲＮＡの相補的二重鎖形成部位のＲＮＡを特異的に消化する機能を有している。本発明核酸化合物は、標的遺伝子のｍＲＮＡにおけるｍｉＲＮＡ結合サイトと相補的二重鎖を形成し、かかる二重鎖を形成している部分のｍＲＮＡの配列をＲＮａｓｅＨの機能により消化することができる。その結果、ｍＲＮＡ全体が分解され、当該遺伝子の発現が抑制される。

なお、本明細書中、「相補的二重鎖」とは、対象となる塩基配列とワトソン・クリック対を形成する塩基配列との相補的二重鎖に制限されるものではなく、揺らぎ塩基対（Ｗｏｂｂｌｅｂａｓｅ ｐａｉｒ）を形成による相補的二重鎖も含む。ここで、ワトソン・クリック対とは、アデニン−チミン、アデニン−ウラシルおよびグアニン−シトシン間に水素結合が形成される塩基対を意味し、揺らぎ塩基対とは、グアニン−ウラシル、イノシン−ウラシル、イノシン−アデニンおよびイノシン−シトシン間に水素結合が形成される塩基対を意味する。また、対象となる塩基配列と１００％の相補性を有していなくてもよく、例えば、対象となる塩基配列に対して、１〜３個、１〜２個または１個の非相補的塩基が含まれていてもよい。

１．３ 一本鎖核酸について
本発明核酸化合物は、修飾または改変されていてもよい一本鎖核酸を含むものである。
本発明核酸化合物に含まれる一本鎖核酸は、通常、ＲＮＡまたはＤＮＡであり、糖とリン酸が交互に結合された糖リン酸バックボーンに核酸塩基が結合した鎖状構造を有している。本発明において修飾または改変とは、天然の核酸（ＲＮＡまたはＤＮＡ）を構成する核酸塩基、糖部分、およびリン酸結合部分の全部または一部を変更することをいう。通常、修飾ないし改変することにより、活性の向上や生体内での安定性等を図りうる。

１．３．１ 核酸塩基について
本発明に係る一本鎖核酸を構成する核酸塩基は、通常、ＲＮＡにおいてはアデニン（Ａ）、ウラシル（Ｕ）、グアニン（Ｇ）、およびシトシン（Ｃ）であり、ＤＮＡにおいては、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、グアニン（Ｇ）、およびシトシン（Ｃ）であるが、本発明核酸化合物においては上記以外にヒポキサンチン（Ｉ）、または修飾塩基であってもよい。かかる修飾塩基としては、ピリミジン、プリン、デアザプリンから水素原子ひとつを取り除いて得られる基であれば特に制限されないが、例えば、シュードウラシル、３−メチルウラシル，ジヒドロウラシル、５−アルキルシトシン（例えば、５−メチルシトシン）、５−アルキルウラシル（例えば、５−エチルウラシル）、５−ハロウラシル（５−ブロモウラシル）、６−アザピリミジン、６−アルキルピリミジン（６−メチルウラシル）、２−チオウラシル、４−チオウラシル、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル、５’−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、１−メチルアデニン、１−メチルヒポキサンチン、２，２−ジメチルグアニン、３−メチルシトシン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、Ｎ６−メチルアデニン、７−メチルグアニン、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メチルカルボニルメチルウラシル、５−メチルオキシウラシル、５−メチル−２−チオウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸、２−チオシトシン、プリン、２，６−ジアミノプリン、２−アミノプリン、イソグアニン、インドール、イミダゾール、キサンチン、チミン−１−イル、ウラシル−３―イル、２−チオチミン−１イル、２−チオウラシル−１イル、ウラシル−５−イル、１−メチルウラシル−５―イル、シトシン−１−イル、５―メチルシトシン−１−イル、グアニン−９−イル、７−デアザグアニン−９−イル、アデニン−９―イル、および７−デアザアデニン−９−イルが挙げられる。これらの核酸塩基は、さらに１以上の置換基を有してもよい。

１．３．２ 糖リン酸バックボーンについて
本発明に係る一本鎖核酸は、例えば、生体内での安定性等の向上を図るため、糖リン酸バックボーン部分が修飾ないし改変されていてもよい。糖リン酸バックボーンに含まれるリン酸結合部分の修飾ないし改変としては、例えば、ホスホジエステル結合をホスホロチオエート結合、ホスホロジチオエート結合、アルキルホスホネート結合、ホスホロアミデート結合、ボラノフォスフェート結合（Ｅｎｙａ ｅｔ ａｌ：Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，（２００８），Ｖｏｌ．１８，ｐｐ．９１５４〜９１６０）に置換することを挙げることができる（例えば、特許再公表公報第２００６／１２９５９４号、および第２００６／０３８６０８号を参照）。これらの中でも、ホスホロチオエート結合に置換することが好ましい。

糖リン酸バックボーンに含まれる糖部分は、通常、ＲＮＡにおいてはリボースであり、ＤＮＡにおいてはデオキシリボースであるが、本発明に係る一本鎖核酸においては修飾ないし改変されていてもよい。当該糖部分の修飾としては、例えば、リボースの２’位の修飾、その他の部分の修飾を挙げることができる。リボースの２’位の修飾としては、例えば、リボースの２’位の−ＯＨ基をハロゲン原子、アルキル基、アリール基、アルキレン基、アシル基、アルコキシ基、シクロアルキル基、アルキル基にアルコキシが結合したアルコキシ基、アミノ基、アルキル基を１つ有するアルキルアミノ基、ジアルキル基を１つ有するジアルキルアミノ基、アルキル基上にカルバモイル基が結合したカルバモイルアルキル基、アルキル基上にアルキルアミノカルボニル基が結合したＮ―アルキルカルバモイルアルキル基、またはアルキル基上にジアルキルアミノカルボニル基が結合したＮ―アルキルカルバモイルアルキル基に置換する修飾を挙げることができるが、これらに制限されるものではない。これらの中でも−ＯＨ基をメトキシ基にする修飾ないし改変が好ましい。糖のその他の部分の修飾としては、例えば、リボースまたはデオキシリボースの４’位のＯをＳに置換すること、糖の２’位と４’位を架橋すること、例えば、ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）またはＥＮＡ（２’−０，４’−Ｃ−Ｅｔｈｙｌｅｎｅ−ｂｒｉｄｇｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ）が挙げられるが、これらに制限されるものではない。

ここで、リボースの２’位の修飾に係る「ハロゲン」としては、例えば、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素を挙げることができる。

リボースの２’位の修飾に係る「アルキル基」としては、例えば、直鎖状または分枝鎖状の炭素数１〜６のアルキルを挙げることができる。具体的には、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ｔｅｒｔ−ペンチル、ｎ−ヘキシル、イソヘキシルが挙げられる。当該アルキルは置換されていてもよく、かかる置換基としては、例えば、ハロゲン、シクロアルキル、アルコキシ、シアノ、ニトロを挙げることができ、これらが１〜３個置換されていてもよい。

リボースの２’位の修飾に係る「アリール基」としては、例えば、炭素数６〜１２のアリールを挙げることができる。具体的には、例えば、フェニル、α−ナフチル、β−ナフチルを挙げることができる。とりわけフェニルが好ましい。当該アリールは置換されていてもよく、かかる置換基としては、例えば、アルキル、ハロゲン、アルコキシ、シアノ、ニトロを挙げることができ、これらが１〜３個置換されていてもよい。

リボースの２’位の修飾に係る「アルキレン基」としては、例えば、直鎖状または分枝鎖状の炭素数１〜６のアルキレンを挙げることができる。具体的には、例えば、メチレン、エチレン、トリメチレン、テトラメチレン、ペンタメチレン、ヘキサメチレン、２−（エチル）トリメチレン、１−（メチル）テトラメチレンを挙げることができる。当該アルキレンは置換されていてもよく、かかる置換基としては、例えば、アルキル、ハロゲン、アルコキシ、シアノ、ニトロを挙げることができ、これらが１〜３個置換されていてもよい。

リボースの２’位の修飾に係る「アシル基」としては、例えば、直鎖状若しくは分枝鎖状の炭素数１〜１２のアルカノイルまたはアロイルを挙げることができる。アルカノイルとしては、例えば、ホルミル、アセチル、２−メチルアセチル、２，２−ジメチルアセチル、プロピオニル、ブチリル、イソブチリル、ペンタノイル、２，２−ジメチルプロピオニル、ヘキサノイル等が挙げられる。アロイルとしては、例えば、ベンゾイル、トルオイル、ナフトイルを挙げることができる。かかるアロイル基は置換可能な位置において置換されていてもよく、アルキル基で置換されていてもよい。

リボースの２’位の修飾に係る「アルコキシ基」としては、例えば、直鎖状または分枝鎖状の炭素数１〜６のアルコキシを挙げることができる。具体的には、例えば、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、イソプロポキシ、ｎ−ブトキシ、イソブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシ、ｎ−ペンチルオキシ、イソペンチルオキシ、ｎ−ヘキシルオキシ、イソヘキシルオキシ等を挙げることができるが、これらに制限されるものではない。とりわけ、炭素数１〜３のアルコキシが好ましい。

リボースの２’位の修飾に係る「シクロアルキル基」としては、例えば、炭素数５〜１２のシクロアルキルを挙げることができる。具体的には、例えば、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、シクロデシル、シクロドデシルが挙げられる。

糖リン酸バックボーン部の改変例としては、糖部分のリボースまたはデオキシリボースがモルホリノ骨格と置換されているモルホリノ核酸、糖リン酸バックボーン全体がアミド結合されたＮ−（２−アミノエチル）グリシンに置換されたペプチド核酸（ＰＮＡ）を挙げることができる。

本発明に係る一本鎖核酸の好ましい糖リン酸バックボーンは、リボースの２’位の−ＯＨ基がメトキシ基で置換され、リン酸結合部分がホスホロチオエート結合である、下記一般式（１）で表される基を構成単位とするものである。ｎｕｃｌｅｏｂａｓｅは、核酸塩基または修飾核酸塩基を表す。また、本発明に係る一本鎖核酸は、さらに、使用する目的や用途等に応じて、任意の位置に任意の修飾を有することができる。例えば、ＦＡＭ等の蛍光物質による修飾を有してもよい。

１．３．３ 鎖長、塩基配列について
本発明に係る一本鎖核酸の鎖長は、特に制限されないが、例えば、４〜３５ｍｅｒ（塩基長）の範囲内であることが適当であり、１５〜２５ｍｅｒの範囲内であることが好ましい。また、本発明に係る一本鎖核酸の塩基配列は、標的遺伝子のｍＲＮＡのｍｉＲＮＡ結合サイトと相補的二重鎖を形成し、ＲＮａｓｅＨで当該ｍＲＮＡを切断することができるものであれば特に制限はされないが、上述のＧＳＫ３βを標的遺伝子とする配列番号１〜５のＤＮＡ塩基配列を基本とするものが好ましい。より好ましくは、配列番号３のＤＮＡ塩基配列を基本とするものである。配列番号１〜５の一本鎖核酸は、本発明の効果を損なわない範囲でその一部が欠失、置換または付加していてもよい。配列番号１〜５を基本とする塩基配列を有する一本鎖核酸は、ＧＳＫ３βのｍＲＮＡの３’−ＵＴＲの４１〜４７、９７５〜９８１、１６５９〜１６６５、４６３６〜４６４２または４７８２〜４７８８に存在するｍｉＲＮＡ結合サイトと相補的な二重鎖を形成し、ＲＮａｓｅＨで標的ｍＲＮＡを効果的に切断することができる。

配列番号１：5'-CTCAAGTGTATCTTTCCAAG-3'
配列番号２：5'-TTCAAGTAGTAATAATGTTA-3'
配列番号３：5'-CTCAAGTGATCTTTAAATGT-3'
配列番号４：5'-CTCAAGTAACTGGTGGTTTT-3'
配列番号５：5'-TACAGTACCAGTTAACTATT-3'

本発明に係る一本鎖核酸は、ＲＮＡおよびＤＮＡの複合核酸であるギャップマー型であることが好ましい。ギャップマー型の一本鎖核酸は、例えば、中央部の７〜８塩基以上のＤＮＡ配列部位を残し、両端の塩基配列をＲＮＡとしたものである。ギャップマー型の一本鎖核酸は、強い結合能を有する両端のＲＮＡ部位、およびＲＮａｓｅＨ消化を引き起こすための中心部分のＤＮＡ配列部位から構成される。本発明に係る一本鎖核酸をギャップマー型とすることにより、より高い標的ｍＲＮＡの抑制効果を得ることができる。好ましいギャップマー型の本発明に係る一本鎖核酸としては、５’末端の５塩基配列および３’末端の５塩基配列がＲＮＡ型であって、その中のチミン（Ｔ）がウラシル（Ｕ）であるものを挙げることができる。より好ましくは、配列番号１〜５において、５’末端の５塩基配列および３’末端の５塩基配列がＲＮＡ型であって、その中のチミン（Ｔ）がウラシル（Ｕ）であるものである。

好ましい本発明に係る一本鎖核酸としては、例えば、配列番号１〜５（特に配列番号３）において、５’末端の５塩基配列および３’末端の５塩基配列がＲＮＡ型であって、その中のチミン（Ｔ）がウラシル（Ｕ）である次の配列番号６〜１０の塩基配列を有するもの（ギャップマー型）を挙げることができる。さらに好ましくは、それらのリン酸結合部分がホスホロチオエート結合であり、リボースの２’水酸基がメトキシ基などのアシル基に改変されている構造のものを挙げることができる。

配列番号６：5'-CUCAAGTGTATCTTTCCAAG-3'
配列番号７：5'-UUCAAGTAGTAATAAUGUUA-3'
配列番号８：5'-CUCAAGTGATCTTTAAAUGU-3'
配列番号９：5'-CUCAAGTAACTGGTGGUUUU-3'
配列番号１０：5'-UACAGTACCAGTTAACUAUU-3'

本発明に係る一本鎖核酸は、公知の合成方法により製造することができる。また、各種自動合成装置、例えば、ＤＮＡ／ＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ３９２（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社製）またはｎＳ−８ＩＩ（ジーンデザイン社製）を用いて容易に合成することができる。あるいは第三者機関（例えば、Ｐｒｏｍｅｇａ社またはＴａｋａｒａ社）等に委託して合成することもできる。

１．４ 糖化合物による修飾
本発明核酸化合物は、本発明に係る一本鎖核酸の末端に直接または適当なリンカーを介して糖化合物を有していてもよい。当該糖化合物は、本発明に係る一本鎖核酸の５’末端または３’末端のどちらにでも、また両方にあってもよい。当該糖化合物の修飾は、一本鎖核酸に直接でもよいが、例えば、標的遺伝子のｍＲＮＡにおけるｍｉＲＮＡ結合サイトへの結合が立体障害等により阻害されることを避けるため、適当なリンカーを介することが好ましい。
以下、本発明に係る一本鎖核酸が当該糖化合物で修飾された本発明核酸化合物を、単に本発明核酸化合物ともいう。

１．４．１ 糖化合物
当該糖化合物としては、例えば、Ｄ−リボース、Ｄ−アラビノース、Ｄ−キシロース、Ｄ−リキソース、Ｄ−アロース、Ｄ−アルトロース、Ｄ−グルコース、Ｄ−マンノース、Ｄ−グロース、Ｄ−イドース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−タロースなどのＤ−アルドース；Ｄ−リブロース、Ｄ−キシルロース、Ｄ−プシコース、Ｄ−フルクトース、Ｄ−ソルボース、Ｄ−タガソースなどのＤ−ケトース、およびフコース、シアル酸を挙げることができる。また、単糖が、例えば２〜１０個グリコシド結合で連結した二糖以上のオリゴ糖や多糖であってもよい。さらに、これらの糖の水酸基が、例えばアミノ基に置換したアミノ糖やアシルアミノ基に置換したアシルアミノ糖なども挙げることができる。アシルアミノ基の例としては、アセチルアミノ基などが挙げられるが、これらに制限されるものではない。この中、グルコース、ガラクトース、Ｎ−アセチルガラクトサミン、フコース、シアル酸であることが好ましい。

１．４．２ リンカー
本発明に係る一本鎖核酸と上記糖化合物とを介するリンカーとしては、通常、当該リンカーとして用いられるものであれば特に制限されないが、例えば、炭素数２〜３０のアルキレン、アルキレン中の複数の炭素原子が酸素原子に置き換わった炭素数２〜２４のオキサアルキレン（エチレングリコールリンカー、エチレングリコール重合体リンカーなど）、アルキレン中の複数の炭素原子が窒素原子に置き換わった、または炭素原子、窒素原子、酸素原子の全てを含む炭素数２〜２４のアザアルキレン、アルキレン中の複数の炭素原子が硫黄原子に置き換わった、または炭素原子、窒素原子、酸素原子、硫黄原子の全てを含む炭素数２〜２４のチアアルキレンが挙げられるが、これらに制限されるものではない。アザアルキレンの窒素原子においては炭素数２〜６のアシル基で保護されていてもよい。この中、エチレングリコール（ＥＧ）リンカー、ジエチレングリコールリンカー、トリエチレングリコール（ＴＥＧ）リンカー、テトラエチレングリコールリンカーが好ましく、また比較的長鎖のエチレングリコール重合体リンカー、例えばトリエチレングリコール（ＴＥＧ）リンカー、テトラエチレングリコールリンカー、炭素数６〜１２のオキサアルキレンがより好ましい。

５’末端のリン酸基にリンカーを介して糖化合物で修飾された本発明核酸化合物の糖化合物修飾部分は、例えば、下記一般式（２）で表すことができる。式中、Ｇは糖を、Ｌはリンカーを、Ｊ^０はＯＨまたはＳＨを、それぞれ表す。具体的な当該糖化合物修飾部分としては、例えば、下記構造式（３）のものを挙げることができる。糖化合物で修飾された本発明核酸化合物は、糖の取り込みが多い増殖が活発な組織である癌等の腫瘍組織などに効率的に送達されうる。

上記の糖化合物で修飾された本発明核酸化合物は、例えば、Ｒｅｎ，Ｔ．，Ｌｉｕ Ｄ． Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，（１９９９），Ｖｏｌ．４０，ｐｐ．７６２１〜７６２５に記載の合成方法に従って合成した２，３，４，６−Ｔｅｔｒａ−Ｏ−ａｃｅｔｙｌ−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｅをもとに、例えば、下記構造式（４）の化合物である３，６−Ｄｉｏｘａ−８−ｈｙｄｒｏｘｙｏｃｔｙｌ ２，３，４，６−ｔｅｔｒａ−Ｏ−ａｃｅｔｙｌ−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｅ（Ｓｚｕｒｍａｉ，Ｚ．，Ｓｚａｂｏ，Ｌ．，Ｌｉｐｔａｋ，Ａ． Ａｃｔａ Ｃｈｉｍ．Ｈｕｎｇ．，（１９８９），Ｖｏｌ．１２６，ｐｐ．２５９〜２６９参照）、または下記構造式（５）の化合物である２−Ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ ２，３，４，６−ｔｅｔｒａ−Ｏ−ａｃｅｔｙｌ−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｅ（Ｍｏｒａｌｅｓ，ＪＣ．，ＲｅｉｎａＪＪ．，Ｄｉａｚ，Ｉ．，Ａｖｉｎｏ，Ａ．，Ｎｉｅｔｏ，ＰＭ．，Ｅｒｉｔｊａ，Ｒ．Ｃｈｅｍ．Ｅｕｒ．Ｊ．，（２００８），Ｖｏｌ．１４，ｐｐ．７８２８〜７８３５参照）を合成し、これらと本発明に係る一本鎖核酸とを常法によりカップリングすることにより製造することができる。

２ 本発明に係る医薬組成物
本発明には、本発明核酸化合物もしくはその医薬上許容される塩、またはそれらの水和物を有効成分として含有することを特徴とする医薬組成物（以下、「本発明組成物」という。）も含まれる。

本発明核酸化合物の医薬上許容される塩としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩のようなアルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩のようなアルカリ土類金属塩、アルミニウム塩、鉄塩、亜鉛塩、銅塩、ニッケル塩、コバルト塩などの金属塩、アンモニウム塩、ｔ−オクチルアミン塩、ジベンジルアミン塩、モルホリン塩、グルコサミン塩、フェニルグリシンアルキルエステル塩、エチレンジアミン塩、Ｎ−メチルグルカミン塩、グアニジン塩、ジエチルアミン塩、トリエチルアミン塩、ジシクロヘキシルアミン塩、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン塩、クロロプロカイン塩、プロカイン塩、ジエタノールアミン塩、Ｎ−ベンジル−フェネチルアミン塩、ピペラジン塩、テトラメチルアンモニウム塩、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩のような有機アミン塩；弗化水素酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、沃化水素酸塩のようなハロゲン化水素酸塩、硝酸塩、過塩素酸塩、硫酸塩、リン酸塩などの無機酸塩、メタンスルホン酸塩、トリフルオロメタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩のような低級アルカンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩のようなアリールスルホン酸塩、酢酸塩、りんご酸塩、フマール酸塩、コハク酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、シュウ酸塩、マレイン酸塩などの有機酸塩、グリシン塩、リジン塩、アルギニン塩、オルニチン塩、グルタミン酸塩、アスパラギン酸塩のようなアミノ酸塩などが挙げられる。これらの塩は、常法により製造することができる。

本発明組成物は、本発明核酸化合物またはその医薬上許容される塩の水和物を含んでいてもよい。当該水和物も常法により製造することができる。

２．１ 用途
本発明組成物の用途としては、標的とする遺伝子のｍＲＮＡの種類などにより異なり特に制限されないが、例えば、癌等の治療剤や予防剤、副作用防止剤、合併症予防剤を挙げることができる。この中、本発明組成物を癌治療剤ないし予防剤として用いることが好ましい。癌治療剤等として用いる場合の癌の種類としては、特に制限されないが、例えば、消化器系の癌、例えば、胃癌、膵臓癌、大腸癌を挙げることができる。

また、本発明組成物は、ＧＳＫ３βを標的としてその発現を抑制することによる癌治療剤ないし癌予防剤（特に、膵臓癌治療剤等）として用いることが好ましい。ＧＳＫ３βは過剰発現やそのリン酸化による酵素活性の調節不全が、過剰発現やそのリン酸化による酵素活性の調節不全が癌を引き起こすことがわかってきている。本発明組成物によりＧＳＫ３βの遺伝子の発現を抑制することにより、生体内の癌（特に膵臓癌）を効果的に治療することができる。

２．２ 配合物
本発明組成物には、本発明の効果を損なわない限り、医薬上許容される担体等を含みうる。このような担体としては、例えば、カチオン性リポソーム、カチオン性ポリマー等のカチオン性担体、またはウイルスエンベロープを利用した担体を挙げることができる。本発明組成物中、当該担体と本発明核酸化合物との重量比（担体／本発明核酸化合物）は、本発明核酸化合物の性質や該担体の種類等によって異なるが、０．１〜１００の範囲内が適当であり、１〜５０の範囲内が好ましく、１０〜２０の範囲内がより好ましい。

また、本発明組成物には、上記担体以外に、本発明の効果を損なわない限り、医薬上許容される添加剤、賦形剤などを配合することができる。かかる添加剤ないし賦形剤として、例えば、乳化補助剤（例えば、炭素数６〜２２の脂肪酸やその医薬的に許容可能な塩、アルブミン、デキストラン）、安定化剤（例えば、コレステロール、ホスファチジン酸）、等張化剤（例えば、塩化ナトリウム、グルコース、マルトース、ラクトース、スクロース、トレハロース）、ｐＨ調整剤（例えば、塩酸、硫酸、リン酸、酢酸、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、トリエタノールアミン）を挙げることができる。これらを一種または二種以上使用することができる。本発明組成物中の当該添加剤等の含有量は、９０重量％以下が適当であり、７０重量％以下が好ましく、５０重量％以下がより好ましい。

２．３ 投与
本発明組成物は、通常、動物（生体）内に投与される。投与しうる動物は特に制限されないが、例えば、ヒト又は非ヒト動物が挙げられる。非ヒト動物としては特に制限されないが、ヒト以外の哺乳類、具体的には例えば、霊長類、齧歯類（マウス、ラット等）、ウサギ、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、ヒツジ、及びウマ等が挙げられる。

動物（生体内）への投与の方法としては特に制限されず、当業者が治療方法等に応じて適宜決定することができる。投与の方法としては、全身投与又は局所投与のいずれでもよい。本発明組成物の投与は、注射（針有型、針無型）、内服、外用のいずれの方法によっても行うことができる。投与経路は、治療等に効果的な経路を選択することが好ましい。例えば、全身的に投与する場合は、経口投与の他、静脈内投与、動脈内投与、皮下投与、筋肉内投与、組織内投与等の非経口投与により投与される。局所的に投与する場合は、例えば、皮膚、粘膜、肺、気管支、鼻腔、鼻粘膜、眼等に投与される。好ましくは、非経口投与、より好ましくは静脈内投与が挙げられる。

本発明組成物の投与量は、本発明核酸化合物の種類；疾患の種類；患者の状態、年齢、体重、性別；担体や添加剤等の種類などに応じて適宜選択することができる。具体的には、例えば、本発明核酸化合物の量として、成人１日当たり、０．１ｎｇ〜１０００ｍｇの範囲内が適当であり、１ｎｇ〜５００ｍｇの範囲内が好ましく、１０ｎｇ〜２００ｍｇの範囲内がより好ましい。これ以上必要とする場合もあれば、これ以下で足りる場合もある。また、かかる投与量を１日１回〜複数回に分割して投与することができる。

２．４ 剤型
本発明組成物の剤型としては、特に制限されず投与方法等に応じて適宜選択されるが、非経口投与のための製剤として、例えば、注射剤、軟膏剤、ゲル剤、クリーム剤、貼付剤、リニメント剤、座薬、噴霧剤、吸入剤、スプレー剤、点眼剤、点鼻剤が挙げられる。経口投与のための製剤としては、例えば、粉末、顆粒、錠剤、カプセル剤、シロップ剤、液剤を挙げることができる。この中、注射剤が好ましい。

３ 本発明に係るアンチセンスオリゴ核酸配列決定法
本発明には、また、次の各工程を含むことを特徴とする、標的遺伝子の発現を抑制するためのアンチセンスオリゴ核酸配列決定法（以下、「本発明配列決定法」という。）も含まれる。
１）標的遺伝子のｍＲＮＡにおけるｍｉＲＮＡ結合サイトを選び出す工程、
２）選び出したｍｉＲＮＡ結合サイトに基づき、当該ｍｉＲＮＡが結合する位置で標的遺伝子のｍＲＮＡを分解しうるアンチセンスオリゴ核酸配列を設計する工程、
３）選び出したｍｉＲＮＡ結合サイトを含む部位と、設計したアンチセンスオリゴ核酸配列との相互作用エネルギーを計算し、その計算結果から候補となるアンチセンスオリゴ核酸配列を選び出す工程、
４）選び出した候補アンチセンスオリゴ核酸配列を有するオリゴ核酸化合物について、標的遺伝子の発現抑制効果を評価する工程。

本発明核酸化合物は、本発明配列決定法を用いて設計することができる。本発明配列決定法は、後述する試験例から明らかな通り、アンチセンスオリゴ核酸化合物の従来の配列決定法と比較して、より有効なアンチセンスオリゴ核酸（本発明核酸化合物など）を効率的に設計することができる。
以下、各工程について詳述する。

３．１ 第一工程
第一工程は、標的遺伝子のｍＲＮＡにおけるｍｉＲＮＡ結合サイトを選び出す工程である。
第一工程は、例えば、ｍｉＲＮＡ結合サイトを予測することができる公知のウェブ・ツール：ＴａｒｇｅｔＳｃａｎ ６．２（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｔａｒｇｅｔｓｃａｎ．ｏｒｇ／）、または学術文献等から取得した当該ｍＲＮＡにおけるｍｉＲＮＡの結合サイトの情報を用いて行うことができる。実験等の手段により新たに決定された、当該ｍＲＮＡにおけるｍｉＲＮＡ結合サイトの情報を用いて行うこともできる。

３．２ 第二工程
第二工程は、第一工程で選び出したｍｉＲＮＡ結合サイトに基づき、当該ｍｉＲＮＡが結合する位置で標的遺伝子のｍＲＮＡを分解しうるアンチセンスオリゴ核酸配列を設計する工程である。
この第二工程は、選び出したｍｉＲＮＡ結合サイトやその周囲の配列状況、三次元構造などを考慮しながら当業者が自身の経験などを踏まえ適宜行うことができる。

３．３ 第三工程
第三工程は、選び出したｍｉＲＮＡ結合サイトを含む部位と、設計したアンチセンスオリゴ核酸配列との相互作用エネルギーを計算し、その計算結果から候補となるアンチセンスオリゴ核酸配列を選び出す工程である。
上記相互作用エネルギー計算は、例えば、公知のソフトウェアであるＮｕｐａｃｋ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｕｐａｃｋ．ｏｒｇ／）等を用いて行うことができる。当該相互作用エネルギーは、例えば、分子間相互作用のギブスエネルギー値から、それぞれの単分子の高次構造のエネルギー値を引くことで求めることができる。そして、例えば、相互作用エネルギーの計算結果に基づき、マイナスの値を示した領域をｍｉＲＮＡが相互作用している可能性のある領域と判断することができ、かかる判断基準で選ばれたアンチセンスオリゴ核酸を候補配列とすることができる。

３．４ 第四工程
第四工程は、第三工程で選び出した候補アンチセンスオリゴ核酸配列を有するオリゴ核酸化合物について、標的遺伝子の発現抑制効果を評価する工程である。
当該評価は、例えば、選び出したアンチセンスオリゴ核酸を合成し、それを、生体、細胞、または試験管内の実験系等を用いて行うことができる。具体的な評価方法として、例えば、ＭＴＴアッセイ、ＲＴ−ＰＣＲ、ウエスタンブロットを挙げることができる。これらの中でも、簡便さからＭＴＴアッセイが好ましい。

本発明配列決定法は、従来の方法、例えば、モチーフ解析によって決定した配列と比較して、高いｍＲＮＡの機能抑制、または高い細胞増殖抑制作用を示すアンチセンスオリゴ核酸を設計することができる。

以下、実施例、試験例等を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれら実施例等に何ら限定されるものではない。

［実施例１］本発明配列決定法による、ＧＳＫ３βに対するアンチセンスオリゴ核酸配列の決定
本発明配列決定法を用いて、ＧＳＫ３βに対する優れたアンチセンスオリゴ核酸の塩基配列を探索した。

まず、ｍｉＲＮＡ結合サイトを予測できるウェブ・ツール：ＴａｒｇｅｔＳｃａｎ ６．２（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｔａｒｇｅｔｓｃａｎ．ｏｒｇ／）、および文献（Ｙｕｅｇｕａｎｇ Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，（２０１１），Ｖｏｌ．４０８，ｐｐ．２５９〜２６４）から得られた情報からＧＳＫ３βの発現抑制に関わっていると報告されたｍｉＲＮＡ（ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ａ，２６ｂ，２９ｂ，１０１，１２４，１２９７，４４６７）を、ＧＳＫ３βの発現抑制に関わるｍｉＲＮＡとして選択した。つづいて、ＧＳＫ３βの転写産物として最長の長さを有しているＥＮＳＴ０００００２６４２３５の３’非翻訳領域の配列を用いて、それぞれのｍｉＲＮＡのシード配列（２ｎｔ−７ｎｔ）に対し相補的な部位（ｍｉＲＮＡ結合サイト）を候補として選び出した（第一工程）。それぞれの候補から、対応するｍｉＲＮＡの長さに加えフランク領域として前後３５塩基の加えた領域を、ｍｉＲＮＡが相互作用しうる領域として抜き出した（第二工程）。

それぞれの領域においてｍｉＲＮＡとの相互作用の可能性を評価するために、公知のソフトウェアであるＮｕｐａｃｋ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｕｐａｃｋ．ｏｒｇ／）を用いて相互作用エネルギーを計算した。相互作用エネルギーは、分子間相互作用のギブスエネルギー値から、それぞれの単分子の高次構造のエネルギー値を引くことで求めた。そして、かかる計算結果に基づき、マイナスの値を示した領域をｍｉＲＮＡが相互作用している可能性のある領域と判断し、それぞれの領域の中のシード配列を含む２０塩基長の配列に対し、完全に相補的な配列を有するギャップマー型オリゴ核酸を候補として選び出した（第三工程）。続いて、後述する試験例に記載の実験により、標的遺伝子の発現抑制効果の評価した（第四工程）。

以上により選び出し、後述する細胞増殖抑制効果を評価した候補配列を下記表１に示す。なお、かかる候補核酸はＧＳＫ３βのｍＲＮＡにおける３’非翻訳領域の４１〜４７、９７５〜９８１、１６５９〜１６６５、４６３６〜４６４２に存在するｍｉＲＮＡ（hsa-miR-4465, hsa-miR-1297, hsa-miR-26b-5p）の結合サイト、４７８２〜４７８８に存在するｍｉＲＮＡ（hsa-miR-101-3p）に対する結合サイトと相補的二重鎖を形成するアンチセンスオリゴ核酸配列（ギャップマー型）である

（各塩基配列中、Ａ、Ｇ、Ｃ、ＴはＤＮＡを、Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｕは２’−ＯＭｅ ＲＮＡを、それぞれ表す。リン酸結合部分はホスホロチオエート結合である。Ｍｅはメチル基を表す。以下、記号の定義は同じ。）

［実施例２］本発明核酸化合物の合成
（ａ）原料ホスホロアミダイトユニットｘｘの合成
Ｒｅｎ，Ｔ．，Ｌｉｕ Ｄ． Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．（１９９９），Ｖｏｌ.４０，ｐｐ．７６２１〜７６２５に記載の合成方法に従って合成した２，３，４，６−Ｔｅｔｒａ−Ｏ−ａｃｅｔｙｌ−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｅ（４．４５ｇ，１２．８ｍｍｏｌ）を脱水ジクロロメタン（２５ｍＬ）に溶解させた。溶液を氷浴内で冷却し、炭酸セシウム（８３５ｍｇ，２．５６ｍｍｏｌ）、トリクロロアセトニトリル（３．８４ｍＬ，３８．４ｍｍｏｌ）を順に加え、反応溶液を氷浴から出して室温で３０分間撹拌した。ＴＬＣにより反応終了を確認し、反応溶液を吸引濾過した後、得られた濾液を減圧留去した。得られた残渣を脱水ジクロロメタンに溶解させ氷浴内で冷却し、トリエチレングリコール（１５．６ｍＬ，１２８ｍｍｏｌ）、三フッ化ホウ素ジエチルエーテル錯体（１．５７ｍＬ，１４．１ｍｍｏｌ）を順に加え、反応溶液を氷浴から出して室温で３０分間撹拌した。反応溶液を酢酸エチルに加え、炭酸水素ナトリウム水溶液で３回、飽和食塩水で１回分液操作を行い、有機層を分取して減圧留去した。得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（Ｃ−２００、展開溶媒：ジクロロメタン−エタノール）によって精製し、無色油状の３，６−Ｄｉｏｘａ−８−ｈｙｄｒｏｘｙｏｃｔｙｌ ２，３，４，６−ｔｅｔｒａ−Ｏ−ａｃｅｔｙｌ−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｅ（２．００ｇ，３４％）を得た。

上記で得られた３，６−Ｄｉｏｘａ−８−ｈｙｄｒｏｘｙｏｃｔｙｌ ２，３，４，６−ｔｅｔｒａ−Ｏ−ａｃｅｔｙｌ−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｅ（２．０ｇ，４．１７ｍｍｏｌ）を脱水ピリジン、脱水トルエン、脱水アセトニトリルで共沸した。その後、アルゴン雰囲気下で脱水アセトニトリル（４０ｍＬ）に溶解させ、ジイソプロピルアミン（４７５μＬ，３．３４ｍｍｏｌ）、１Ｈ−テトラゾール（１９４ｍｇ，３．３４ｍｍｏｌ）、２−シアノエトキシ［ビス（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ）］ホスフィン（１．９７ｍＬ，６．７１ｍｍｏｌ）を順に加えて室温で３時間攪拌した。ＴＬＣにより反応終了を確認し、反応溶液を酢酸エチルに加え、炭酸水素ナトリウム水溶液で３回、飽和食塩水で１回分液操作を行い、有機層を分取して減圧留去した。得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（Ｃ−２００、展開溶媒：ｎ−ヘキサン−酢酸エチル（０．５％ピリジン））によって精製し、下記構造式（４）に示す無色油状のホスホロアミダイトユニットｘｘ（２．２１ｇ，７８％）を得た。生成物の^１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３）、および^３１Ｐ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３）の測定値は、Ｓｚｕｒｍａｉ，Ｚ．，Ｓｚａｂｏ，Ｌ．，Ｌｉｐｔａｋ，Ａ．Ａｃｔａ Ｃｈｉｍ．Ｈｕｎｇ．，（１９８９），Ｖｏｌ．１２６，ｐｐ．２５９〜２６９に記載の値と一致し、目的の化合物が得られた。

^１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３）：δ１．０８−１．１８（ｍ，１２Ｈ），１．９４−２．０７（ｍ，１２Ｈ），２．５９−２．６５（ｍ，２Ｈ），３．５０−３．９５（ｍ，１７Ｈ），４．０８−４．１３（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．７，１１．９），４．２０−４．２６（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．７，１２．３），４．５５−４．６０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．０），４．９２−４．９９（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．２，９．４），５．０２−５．０８（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．５），５．１４−５．２０（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．７）；^３１Ｐ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３）：δ１４９．５．

（ｂ）ギャップマー型本発明核酸化合物の合成
オリゴヌクレオチドの固相合成は、のＤＮＡ／ＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ３９２（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社製）またはｎＳ−８ＩＩ（ジーンデザイン社製）を用いて行った。使用したＤＮＡホスホロアミダイトユニット、２’−ＯＭｅＲＮＡホスホロアミダイトユニット、ＣＰＧおよびその他必要な試薬はＧｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社より購入し、同社に推奨されるホスホロチオエート合成方法（Ａｎｄｒｅｉ Ｐ．Ｇｕｚａｅｖ Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ，（２０１１），Ｖｏｌ．５２，ｐｐ．４３４〜４３７，Ｓ．Ｌ．Ｂｅａｕｃａｇｅ ａｎｄ Ｍ．Ｈ．Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ，（１９８１），Ｖｏｌ．２２，ｐｐ．１８５９〜１８６２参照）に従って合成を行った。鎖伸長反応後、５’末端のＤＭＴｒ基を残したまま、２８％ＮＨ_３ａｑ（アンモニア水）を用いてＣＰＧからの切り出しおよび脱保護を行った。遠心エバポレーターを用いて脱保護溶液からアンモニア水を除いた後、Ｓｅｐ−ｐａｋ Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ（１８Ｃ）を用いてＤＭＴｒ基の脱保護および簡易的なオリゴヌクレオチドの精製を行い、さらに陰イオン交換ＨＰＬＣによる精製を行った。

ＨＰＬＣ装置の構成は、Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＳＣＬ−１０−ＡにＬＣ−１０ＡＤ、ＣＴＯ−１０Ａ、ＳＰＤ−Ｍ１０Ａを接続して用い、カラムはＤＮＡＰａｃＰＡ−１００（ＤＩＯＮＥＸ，９×２５０ｍｍ）を用いた。ＨＰＬＣの条件は、カラム温度：５０°Ｃ、測定波長：２５４ｎｍ、展開溶媒：２５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）（Ａ−Ｂｕｆｆｅｒ）および１Ｍ塩化ナトリウム−２５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）（Ｂ−Ｂｕｆｆｅｒ）であって、Ａ−ＢｕｆｆｅｒにＢ−Ｂｕｆｆｅｒを加え濃度勾配をかけて溶離した。

ＨＰＬＣ精製後にさらにＳｅｐ−ｐａｋ Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ（１８Ｃ）を用いて脱塩操作を行ったものを最終製造物とした。最終製造物をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳで分析し、得られた分子量の実測値を目的化合物の分子量の計算値と比較することにより、目的のオリゴヌクレオチドが得られたことを確認した。

（ｃ）トリエチレングリコールリンカーを介してグルコースを修飾したギャップマー型本発明核酸化合物（ＴＥＧオリゴヌクレオチド）の合成
配列番号８のオリゴ核酸を有する下構造式（６）で示されるＴＥＧオリゴヌクレオチドの合成を行った。前記（ａ）で合成したホスホロアミダイトユニットｘｘを脱水ピリジン、脱水トルエン、脱水アセトニトリルを用いて共沸し、脱水アセトニトリルに０．１Ｍになるように溶解させた後、自動合成機を用いて目的の化合物を合成した。ホスホロアミダイトユニットｘｘを用いたカップリング反応は、１０分間の反応を８回に渡って行った。それ以外の操作は、上記（ｂ）のギャップマー合成の方法に従った。精製段階の製造物の陰イオン交換ＨＰＬＣによる測定結果を図１に、目的の最終製造物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析結果を図２に示す（計算値７０６０．７、実測値７０６１．５）。

（ｄ）ＦＡＭ（６−ＣａｒｂｏｘｙＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ−Ａｍｉｎｏｈｅｘｙ）標識ＴＥＧオリゴヌクレオチド（２１Ｅ）の合成
蛍光物質ＦＡＭ（下記構造式（７）、Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）で修飾された、下記構造式（８）のＦＡＭ標識ＴＥＧオリゴヌクレオチドを、３’−（６−Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ） ＣＰＧ（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｃｈ社製）を用いて自動合成機により固相合成した。それ以外の操作は、上記（ｃ）のＴＥＧオリゴヌクレオチドの合成方法および上記（ｂ）のギャップマー合成の方法に従った。精製段階の製造物の陰イオン交換ＨＰＬＣの測定結果を図３に、目的の最終製造物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析結果を図４に示す（計算値７６４４．３、実測値７６４６．２）。

また、上記２１Ｅの合成方法と同様にして、リンカーは有するがグルコースは有しない下記構造式９のＦＡＭ標識ＴＥＧオリゴヌクレオチド（２０Ｅ）を合成した。

［実施例３］本発明核酸化合物の合成
（ａ）原料ホスホロアミダイトユニットｙｙの合成
実施例１（ａ）で合成した２，３，４，６−Ｔｅｔｒａ−Ｏ−ａｃｅｔｙｌ−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｅ（５００ｍｇ，１．４５ｍｍｏｌ）を脱水ジクロロメタン（１４．５ｍＬ）に溶解させた。溶液を氷浴内で冷却し、炭酸セシウム（１０３ｍｇ，０．３１ｍｍｏｌ）、トリクロロアセトニトリル（４４０μＬ，４．３５ｍｍｏｌ）を順に加え、反応溶液を氷浴から出して室温で２時間撹拌した。ＴＬＣにより反応終了を確認し、反応溶液をＣｅｌｉｔｅ５４５で吸引濾過した後、得られた濾液を減圧留去した。得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（Ｃ−３００、展開溶媒：ｎ−ヘキサン−酢酸エチル）によって精製した。得られた化合物を脱水ジクロロメタンに溶解させ氷浴内で冷却し、エチレングリコール（１．６ｍＬ，２９ｍｍｏｌ）、三フッ化ホウ素ジエチルエーテル錯体（１９１μＬ，１．５２ｍｍｏｌ）を順に加え、４５分間撹拌した。反応溶液を炭酸水素ナトリウム水溶液にあけ、有機層を分取して減圧留去した。得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（Ｃ−３００、展開溶媒：ｎ−ヘキサン−酢酸エチル）によって精製し、無色油状の２−Ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ ２，３，４，６−ｔｅｔｒａ−Ｏ−ａｃｅｔｙｌ−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｅ（２３７ｍｇ，４２％）を得た。

上記で得られた２−Ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ ２，３，４，６−ｔｅｔｒａ−Ｏ−ａｃｅｔｙｌ−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｅ（２０２ｍｇ，０．５１ｍｍｏｌ）を脱水ピリジン、脱水トルエン、脱水ジクロロメタンで共沸した。その後、アルゴン雰囲気下で脱水ジクロロメタン（５．１ｍＬ）に溶解させ、ジイソプロピルアミン（６３０μＬ，３．６１ｍｍｏｌ）、２−シアノエトキシ［ビス（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ）］ホスフィン（１７２μＬ，０．７７ｍｍｏｌ）を順に加えて室温で２時間攪拌した。ＴＬＣにより反応終了を確認し、反応溶液を酢酸エチルに加え、飽和食塩水で３回分液操作を行い、有機層を分取して減圧留去した。得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（Ｃ−２００、展開溶媒：ｎ−ヘキサン−酢酸エチル（１％トリエチルアミン））によって精製し、下記構造式（５）に示す無色油状のホスホロアミダイトユニットｙｙ（２００ｍｇ，６６％）を得た。^１Ｈ−ＮＭＲの測定値は過去のＭｏｒａｌｅｓ，ＪＣ．，ＲｅｉｎａＪＪ．，Ｄｉａｚ，Ｉ．，Ａｖｉｎｏ，Ａ．，Ｎｉｅｔｏ，ＰＭ．，Ｅｒｉｔｊａ，Ｒ．Ｃｈｅｍ．Ｅｕｒ．Ｊ．，（２００８），Ｖｏｌ．１４，ｐｐ．７８２８〜７８３５に記載の値と一致した。

^３１Ｐ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３）：δ１４９．４，１４９．６．

（ｂ）リンカーとしてエチレングリコールを介してグルコースを修飾したギャップマー型本発明核酸化合物（ＥＧオリゴヌクレオチド）の合成
下記構造式（１０）で示されるＥＧオリゴヌクレオチドの合成を行った。上記（ａ）で合成したホスホロアミダイトユニットｙｙを脱水ピリジン、脱水トルエン、脱水アセトニトリルを用いて共沸し、脱水アセトニトリルに０．１Ｍになるように溶解させた後、自動合成機を用いて目的の化合物を合成した。ホスホロアミダイトユニットｙｙを用いたカップリング反応は、１０分間の反応を８回に渡って行った。それ以外の操作は、実施例２（ｂ）のギャップマー合成の方法に従った。精製段階の製造物の陰イオン交換ＨＰＬＣの測定結果を図５に、目的の最終製造物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析結果を図６に示す（計算値６９７１．６、実測値６９７４．８）

（ｃ）ＦＡＭ標識ＥＧオリゴヌクレオチド（ＳＬｐ）の合成
下記構造式（１１）で示されるＦＡＭ標識ＥＧオリゴヌクレオチドを、３’−（６−Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ） ＣＰＧ（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社）を用いて自動合成機により固相合成した。それ以外の操作は、上記（ｂ）のＥＧオリゴヌクレオチドの合成方法および実施例２（ｂ）のギャップマー合成の方法に従った。精製段階の製造物の陰イオン交換ＨＰＬＣの測定結果を図７に、目的の最終製造物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析結果を図８に示す（計算値７５５７．２、実測値７５５８．７）

［試験例１］本発明核酸化合物の細胞増殖抑制効果
配列番号６〜１０の塩基配列を有する本発明核酸化合物、および従来法であるアンチセンスデザインにより設計された、下記表２に示すＡＤ１〜４核酸化合物、およびモチーフ検索により設計されたＭＳ１〜４核酸化合物について、膵癌培養細胞ＰＡＮＣ−１における細胞増殖抑制効果を調べた。当該実験は、製品プロトコルに従い、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）と複合体を形成し，上記培養細胞に投与することにより行った。

まず、投与開始時に９６ｗｅｌｌサイズのプレートにおいて７０％のコンフルエンスになるように事前に調製した上記培養細胞を用意した。そして、マイクロチューブにＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００ ２μＬとＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地１００μＬを入れタッピングにて軽く混ぜた溶液、およびもう１本別のマイクロチューブにＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地１００μＬに対してそれぞれの上記核酸化合物の最終濃度を１μＭになるように調製し，室温に５分静置した。その後、それら２本のマイクロチューブから溶液を２５μＬずつ取り出し、別のマイクロチューブに入れピペッティングにて混ぜ合わせ、室温で２０分静置したものを投与サンプルとした。投与は、１９０μＬのメディウムの入った細胞にＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００と上記核酸化合物の混合物１０μＬを加え、ディッシュをゆすって拡散させることにより行った。上記核酸化合物の投与サンプルにおける最終濃度は５０ｎＭで使用した。投与後、７２時間後に細胞の生存数をＭＴＴａｓｓａｙにより確認した。

その結果を図９に示す。図９に示すように、配列番号８の本発明核酸化合物（図中、配列８）が、評価した核酸化合物の中で最も細胞増殖抑制効果を示した。即ち、本発明配列決定法によって、従来の方法よりも優れたアンチセンスオリゴ核酸化合物を設計することができた。また、全体的にも、本発明配列決定法で設計した核酸化合物の方が、従来の方法で設計した核酸化合物（ＡＤ１〜４およびＭＳ１〜４）と比較して細胞増殖抑制効果において優る傾向にあった。このように、本発明配列決定法は、従来の方法よりも優れていることが明らかである。

［試験例２］糖化合物で修飾した本発明核酸化合物の細胞内への取り込み
試験例１において特に高い効果を示した配列番号８の塩基配列を有する本発明核酸化合物について、糖化合物修飾の効果を確認した。カチオン性リポソームのような担体は用いずに、実施例２（ｄ）で合成したＦＡＭ標識ＴＥＧオリゴヌクレオチド（２０Ｅ、２１Ｅ）の培養細胞への取り込みを評価した。当該実験はヒト膵癌培養細胞（ＰＡＮＣ−１）を培養し、その細胞培養液に当該ＦＡＭ標識ＴＥＧオリゴヌクレオチドを５０ｎＭの濃度になるように投与することにより行った。

まず、投与開始時に９６ｗｅｌｌサイズのプレートにおいて７０％のコンフルエンスになるように事前に調製した。そして、培養液をＦａｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ）無しの培養液に交換後、それぞれの培養細胞に対して核酸化合物を投与した。投与の２４時間後に培養液を取り除きＰＢＳにて洗浄し、培養液をＦｌｕｏｒｏＢｒｉｔｅ ＤＭＥＭ Ｍｅｄｉａに交換した。その後、１時間後、３時間後、６時間後の細胞内に取り込まれた蛍光色素の量を、肉眼、および顕微鏡写真撮影で確認、および平均輝度を測定した。

その結果を図１０および図１１に示す。図１０に見られるように、２０Ｅ、２１Ｅの細胞内への取り込みが観察されたが、図１１に示すように、蛍光を数値化した結果の平均輝度の比較では、糖化合物修飾を有する本発明核酸化合物（２１Ｅ）において、より高い細胞内への取り込みが観察された。

［試験例３］
実施例２（ｄ）で合成したＦＡＭ標識ＴＥＧオリゴヌクレオチド（２０Ｅ、２１Ｅ）について、様々な細胞における取り込みを評価した。当該実験は各種ヒト膵癌培養細胞（ＰＡＮＣ−１、ＢＸＰＣ３、Ｃａｐａｎ−２、ＭｉａＰＡＣＡ）、および膵管正常培養細胞（ＰＥ）を用い、試験例２と同様に行った。培養液をＦｌｕｏｒｏＢｒｉｔｅ ＤＭＥＭ Ｍｅｄｉａに交換し、７２時間後の細胞内に取り込まれた蛍光色素の量を、肉眼、および顕微鏡写真撮影で確認、および平均輝度を測定した。

その結果を図１２に示す。図中、ＡＳＯは核酸化合物のみを投与したことを意味しており、Ｇ（＋）は糖化合物（グルコース）を付加した核酸化合物（２１Ｅ）の投与を示し、Ｇ（−）は糖化合物（グルコース）を付加していない核酸化合物（２０Ｅ）を投与したことを示している。左側の時間表示は、核酸化合物を投与してから撮影するまでの時間を表す。下段の２ＤＧ＋ＡＳＯは、細胞への糖の取り込み阻害剤である２−デオキシ−Ｄ−グルコース（２−Ｄｅｏｘｙ−Ｄ−ｇｌｕｃｏｓｅ：以下、単に「２ＤＧ」という。）と核酸化合物を同時に投与した結果である。

図１２から明らかなように、各種ヒト膵癌培養細胞（ＰＡＮＣ−１、ＢＸＰＣ３、Ｃａｐａｎ−２、ＭｉａＰＡＣＡ）においては、糖化合物修飾を有する２１Ｅが、２０Ｅと比較して細胞内への高い取り込みが観察された。一方、膵管正常培養細胞（ＰＥ）においては、糖化合物修飾の有無で取り込みに変化は生じなかった。また、２ＤＧを同時投与した場合、いずれの細胞でも蛍光強度が減弱していることから、糖化合物を付加した本発明核酸化合物は、通常の細胞が糖を取り込む経路を介して取り込まれているものと考えられる。

［試験例４］
実施例３（ｃ）で合成した、配列番号８の塩基配列を有するＦＡＭ標識ＥＧオリゴヌクレオチド（ＳＬｐ）について、細胞における取り込みを評価した。当該実験はヒト膵癌培養細胞（ＰＡＮＣ−１）を用い、当該核酸化合物の濃度を０．８ｎＭ、４ｎＭ、２０ｎＭ、１００ｎＭの４条件とした以外は試験例２と同様に行った。培養液をＦｌｕｏｒｏＢｒｉｔｅ ＤＭＥＭ Ｍｅｄｉａに交換し、６時間後の細胞内に取り込まれた蛍光色素の量を、肉眼、および顕微鏡写真撮影で確認、および平均輝度を測定した。

その結果を図１３に示す。図１３から明らかなように、濃度量依存的に、ＦＡＭ標識ＥＧオリゴヌクレオチド（ＳＬｐ）の細胞内への取り込みが観察された。２４時間後のものでは観察中に細胞が剥がれてしまったため観察できなかった。

［試験例５］
実施例２（ｄ）で合成したＦＡＭ標識ＴＥＧオリゴヌクレオチド（２０Ｅ、２１Ｅ）、および実施例３（ｃ）で合成したＦＡＭ標識ＥＧオリゴヌクレオチド（ＳＬｐ）について、細胞における取り込みを評価した。当該実験は各種ヒト膵癌培養細胞（ＰＡＮＣ−１、ＢＸＰＣ３）、および膵管正常培養細胞（ＰＥ）を用い、試験例２と同様に行った。培養液をＦｌｕｏｒｏＢｒｉｔｅ ＤＭＥＭ Ｍｅｄｉａに交換し、１，３、６時間後および２４時間後の細胞内に取り込まれた蛍光色素の量を、肉眼、および顕微鏡写真撮影で確認、および平均輝度を測定した。

その結果を図１４〜１７に示す。各図（特に図１７）から明らかなように、培養細胞の平均輝度の比較により、正常培養細胞であるＰＥに対して、悪性化した膵癌細胞では、いずれの核酸化合物の取り込み量も増加していること、糖化合物修飾を有する核酸化合物（ＳＬｐ、２１Ｅ）は糖化合物修飾を有しない核酸化合物（２０Ｅ）と比較して、正常細胞で取り込み量が少なく、癌細胞において取り込み量が多く見られることがわかった。このことは、糖付加を行った本発明核酸化合物の場合、癌細胞に選択的に送達できることを示しており、癌細胞のみに効果を発揮したい治療薬として有効な手段であると考えられる。さらには、ＳＬｐと比較して２１Ｅは、癌細胞への取り込み率が高くなっていることから、癌細胞に対する治療を考えた場合、２１Ｅがより有効であると考えられる。つまり、癌細胞に対する治療方法において、糖付加核酸化合物は、正常細胞への副作用をより少なくし、癌細胞への取り込みを増加させるということで有効であり、さらには、２１Ｅのような比較的長鎖リンカーによる糖付加化合物は、癌細胞への取り込み効果を増加させるということでより有効である。

本発明核酸化合物やそれを有効成分として含有する本発明組成物ないし本発明抑制剤等は、癌等の疾患の治療剤等として有用である。また、本発明配列決定法は、標的遺伝子の発現を抑制しうる有効なアンチセンスオリゴ核酸を効率的に設計する上で有用である。

配列番号１〜５：いずれもアンチセンスオリゴ核酸である。
配列番号６〜１８：いずれもギャップマー型のアンチセンスオリゴ核酸である。

Claims (20)

1. 標的遺伝子のｍＲＮＡにおけるｍｉＲＮＡ結合サイトと相補的二重鎖を形成し、かかる二重鎖形成部における当該ｍｉＲＮＡ結合サイトをＲＮａｓｅＨにより切断することができる、修飾または改変されていてもよい一本鎖核酸を含むアンチセンスオリゴ核酸化合物。
2. 前記一本鎖核酸が４〜３５塩基長からなる、請求項１に記載のアンチセンスオリゴ核酸化合物。
3. 前記標的遺伝子がＧＳＫ３βである、請求項１または２に記載のアンチセンスオリゴ核酸化合物。
4. 前記一本鎖核酸が、次のいずれかの塩基配列を有するものか、または当該効果を損なわない範囲でその一部が欠失、置換もしくは付加したものである、請求項３に記載のアンチセンスオリゴ核酸化合物。
   配列番号１：5'-CTCAAGTGTATCTTTCCAAG-3'
   配列番号２：5'-TTCAAGTAGTAATAATGTTA-3'
   配列番号３：5'-CTCAAGTGATCTTTAAATGT-3'
   配列番号４：5'-CTCAAGTAACTGGTGGTTTT-3'
   配列番号５：5'-TACAGTACCAGTTAACTATT-3'
   （各塩基配列中、Ａ、Ｇ、Ｃ、ＴはＤＮＡを表す。）
5. 前記一本鎖核酸がギャップマー型である、請求項１〜４のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴ核酸化合物。
6. 前記一本鎖核酸が、５’末端の５塩基配列および３’末端の５塩基配列においてＲＮＡ型であって、その中のチミン（Ｔ）がウラシル（Ｕ）であるものか、または次のいずれかの塩基配列を有するものか、もしくは当該効果を損なわない範囲でその一部が欠失、置換もしくは付加したものである、請求項５に記載のアンチセンスオリゴ核酸化合物。
   配列番号６：5'-CUCAAGTGTATCTTTCCAAG-3'
   配列番号７：5'-UUCAAGTAGTAATAAUGUUA-3'
   配列番号８：5'-CUCAAGTGATCTTTAAAUGU-3'
   配列番号９：5'-CUCAAGTAACTGGTGGUUUU-3'
   配列番号１０：5'-UACAGTACCAGTTAACUAUU-3'
   （各塩基配列中、Ａ、Ｇ、Ｃ、ＴはＤＮＡを、Ａ、Ｇ、Ｃ、ＵはＲＮＡを、それぞれ表す。）
7. 前記一本鎖核酸が、次の（１）および／または（２）の構造を有するものである、請求項１〜６いずれか一項に記載のアンチセンスオリゴ核酸化合物。
   （１）糖リン酸バックボーンにホスホロチオエート結合を有する構造
   （２）ＲＮＡ型の２’水酸基が修飾されている構造
8. 前記一本鎖核酸が、次のいずれかの塩基配列を有し、当該核酸におけるリン酸結合部分がホスホロチオエート結合であるものか、または当該効果を損なわない範囲でその一部が欠失、置換もしくは付加したものである、請求項７に記載のアンチセンスオリゴ核酸化合物。
   配列番号６：5'-CUCAAGTGTATCTTTCCAAG-3'
   配列番号７：5'-UUCAAGTAGTAATAAUGUUA-3'
   配列番号８：5'-CUCAAGTGATCTTTAAAUGU-3'
   配列番号９：5'-CUCAAGTAACTGGTGGUUUU-3'
   配列番号１０：5'-UACAGTACCAGTTAACUAUU-3'
   （各塩基配列中、Ａ、Ｇ、Ｃ、ＴはＤＮＡを、Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｕは２’−ＯＣＨ_３ ＲＮＡを、それぞれ表す。）
9. ５’末端および／または３’末端に直接またはリンカーを介して糖化合物を有するものである、請求項１〜８のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴ核酸化合物。
10. 前記リンカーが、炭素数２〜３０のアルキレン、炭素数２〜２４のオキサアルキレン、炭素数２〜２４のアザアルキレン、または炭素数２〜２４のチアアルキレンである、請求項９に記載のアンチセンスオリゴ核酸化合物。
11. 前記リンカーが、トリエチレングリコールリンカー、テトラエチレングリコールリンカー、炭素数６〜１２のオキサアルキレンである、請求項９または１０に記載のアンチセンスオリゴ核酸。
12. 前記糖化合物が、グルコース、ガラクトース、Ｎ−アセチルガラクトサミン、フコース、またはシアル酸である、請求項９〜１１のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴ核酸化合物。
13. 請求項１〜１２のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴ核酸化合物もしくはその医薬上許容される塩、またはそれらの水和物を有効成分として含有することを特徴とする、医薬組成物。
14. 前記医薬組成物が癌治療剤または予防剤である、請求項１３に記載の医薬組成物。
15. 前記癌が消化器系癌である、請求項１４に記載の医薬組成物。
16. 前記消化器系癌が、胃癌、膵臓癌、または大腸癌である、請求項１５に記載の医薬組成物。
17. 次の各工程を含むことを特徴とする、標的遺伝子の発現を抑制するためのアンチセンスオリゴ核酸配列決定法。
    １）標的遺伝子のｍＲＮＡにおけるｍｉＲＮＡ結合サイトを選び出す工程、
    ２）選び出したｍｉＲＮＡ結合サイトに基づき、当該ｍｉＲＮＡが結合する位置で標的遺伝子のｍＲＮＡを分解しうるアンチセンスオリゴ核酸配列を設計する工程、
    ３）選び出したｍｉＲＮＡ結合サイトを含む部位と、設計したアンチセンスオリゴ核酸配列との相互作用エネルギーを計算し、その計算結果から候補となるアンチセンスオリゴ核酸配列を選び出す工程、
    ４）選び出した候補アンチセンスオリゴ核酸配列を有するオリゴ核酸化合物について、標的遺伝子の発現抑制効果を評価する工程。
18. 前記アンチセンスオリゴ核酸配列が、ＲＮａｓｅＨ依存アンチセンスオリゴ核酸配列またはｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖核酸配列である、請求項１７に記載のアンチセンスオリゴ核酸配列決定法。
19. 前記ＲＮａｓｅＨ依存アンチセンスオリゴ核酸配列がギャップマー型である、請求項１８に記載のアンチセンスオリゴ核酸配列決定法。
20. 前記標的遺伝子がＧＳＫ３である、請求項１７〜１９のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴ核酸配列決定法。