JP2017181525A - 肺癌マーカーとその使用 - Google Patents

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Abstract

【課題】肺癌マーカーとその使用の提供。【解決手段】肺癌マーカー（ＬＣＭ）を用いて、疾患、特に癌、とりわけ肺癌を評価（例えば、診断）、処置および予防するための方法および組成物が提供される。個別のＬＣＭおよび複数のＬＣＭを含むパネルが、これらおよび他の用途のために提供される。ＬＣＭを用いて、処置の有効性を判定するため、もしくは予測するため、または処置を選択するための、方法および組成物もまた提供される。ＬＣＭを用いて細胞機能を調節するための方法および組成物がさらに提供される。ＬＣＭを調節する組成物（例えば、アンタゴニストまたはアゴニスト）（例えば、抗体、タンパク質、小分子化合物および核酸物質（例えば、ＲＮＡｉおよびアンチセンス剤））ならびにその薬学的組成物も提供される。ＬＣＭを調節する薬剤についてスクリーニングする方法およびこれらのスクリーニング方法によって同定される薬剤が、さらに提供される。【選択図】なし

Description

発明の分野
本発明は、疾患の評価および治療の分野に関する。本発明は、疾患、特に癌、とりわけ肺癌を評価するためおよび処置するための組成物および方法を提供する。
発明の背景
癌は、世界中の主要な死因の１つであり、癌、特に肺癌は、効果的に診断し、処置することが困難である。したがって、様々な癌、とりわけ肺癌を評価および処置するための新規の組成物および方法が当該分野において必要とされている。
本発明の好ましい実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
個体における肺癌を検出する方法であって、該方法は、該個体由来のサンプル中のＴＦＰＩのレベルを検出する工程を包含し、高レベルのＴＦＰＩは、該個体が肺癌を有することを示す、方法。
（項目２）
前記個体由来のサンプル中の、Ｃｙｆｒａ、ＳＬＰＩ、ＴＩＭＰ１、ＳＣＣ、ＣＥＡＣＡＭ５、ＭＭＰ２、ＯＰＮおよびＭＤＫからなる群から選択される少なくとも１つのマーカーのレベルを検出する工程をさらに包含し、ここで高レベルの該マーカーは、該個体が肺癌を有することを示す、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記方法が、前記マーカーＣｙｆｒａ、ＳＬＰＩ、ＴＩＭＰ１、ＣＥＡＣＡＭ５およびＭＤＫのレベルを検出する工程を包含し、高レベルの複数の該マーカーは、該個体が肺癌を有することを示す、項目２に記載の方法。
（項目４）
前記方法が、前記マーカーＳＣＣ、ＭＭＰ２およびＯＰＮのレベルを検出する工程をさらに包含し、ここで高レベルの複数の該マーカーは、前記個体が肺癌を有することを示す、項目３に記載の方法。
（項目５）
個体における肺癌を検出する方法であって、該方法は、表５に提供されるパネルからなる群から選択されるマーカーのパネルのレベルを検出する工程を包含し、ここで高レベルの複数の該マーカーは、該個体が肺癌を有することを示す、方法。
（項目６）
表４に提供されるマーカーからなる群から選択されるマーカーのレベルを検出する工程をさらに包含する、項目１〜５のいずれか１項に記載の方法。
（項目７）
前記方法が、表６に提供されるパネルからなる群から選択されるマーカーのパネルのレベルを検出する工程を包含し、ここで高レベルの複数の該マーカーは、前記個体が肺癌を有することを示す、項目６に記載の方法。
（項目８）
表１〜２（配列番号１〜６５ならびに炭水化物抗原ＣＡ２４２、ＣＡ１９−９およびＣＡ７２−４）、表４、図１および図１２に提供されるマーカーからなる群から選択される少なくとも１つのマーカーのレベルを検出する工程をさらに包含する、項目１〜５のいずれか１項に記載の方法。
（項目９）
個体における肺癌が、腺癌であるか、または扁平上皮癌であるかを判定する方法であって、該方法は、該個体由来のサンプル中の、表７に提供されるパネルからなる群から選択されるマーカーのパネルのレベルを検出する工程を包含し、ここで異なるレベルの該マーカーは、該肺癌が腺癌または扁平上皮癌のどちらかであることを示す、方法。
（項目１０）
個体における肺癌の病期を判定する方法であって、該方法は、該個体由来のサンプル中の、表８に提供されるパネルからなる群から選択されるマーカーのパネルのレベルを検出する工程を包含し、ここで異なるレベルの該マーカーは、該肺癌の病期を示す、方法。
（項目１１）
前記病期が、第Ｉ期または第ＩＩＩ期である、項目１０に記載の方法。
（項目１２）
個体における肺癌が、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）であるか、または非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）であるかを判定する方法であって、該方法は、該個体由来のサンプル中の、表９に提供されるパネルからなる群から選択されるマーカーのパネルのレベルを検出する工程を包含し、ここで異なるレベルの該マーカーは、該肺癌がＳＣＬＣまたはＮＳＣＬＣのどちらかであることを示す、方法。
（項目１３）
前記マーカーのパネルが、前記マーカーＯＰＮを含む、項目１２に記載の方法。
（項目１４）
個体における肺の病変が、悪性腫瘍であるか、または良性の病変であるかを判定する方法であって、該方法は、該個体由来のサンプル中の、表１０に提供されるパネルからなる群から選択されるマーカーのパネルのレベルを検出する工程を包含し、ここで異なるレベルの該マーカーは、該肺の病変が悪性腫瘍または良性の病変のどちらかであることを示す、方法。
（項目１５）
前記肺の病変が、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）スクリーニングによって観察されたものである、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
個体において小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）または非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）を検出する方法であって、該方法は、該個体由来のサンプル中の、表１１および１２に提供されるパネルからなる群から選択されるマーカーのパネルのレベルを検出する工程を包含し、ここで異なるレベルの表１１における該マーカーは、該個体がＳＣＬＣを有することを示し、そして異なるレベルの表１２における該マーカーは、該個体がＳＣＬＣまたはＮＳＣＬＣを有することを示す、方法。
（項目１７）
個体において肺癌の後退または再発についてモニターする方法であって、該方法は、前の時点および後の時点における該個体由来のサンプル中の、図１９に提供されるマーカーからなる群から選択される１つ以上のマーカーのレベルを検出する工程を包含し、ここで該前の時点と比べて該後の時点における該レベルの上昇は、肺癌の再発を示し、そして該前の時点と比べて該後の時点における該レベルの低下は、肺癌の後退を示す、方法。
（項目１８）
前記検出工程が、イムノアッセイによって前記マーカーを検出する工程を包含する、項目４に記載の方法。
（項目１９）
前記イムノアッセイが、ＥＬＩＳＡである、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
検出される前記マーカーが、ポリペプチドである、項目４に記載の方法。
（項目２１）
検出される前記マーカーが、ｍＲＮＡ分子である、項目４に記載の方法。
（項目２２）
前記検出工程が、前記サンプルを、前記マーカーに選択的に結合する抗体と接触させる工程および該マーカーへの該抗体の結合を検出する工程を包含する、項目２０に記載の方法。
（項目２３）
前記検出工程が、前記サンプルを、前記マーカーをコードする核酸分子に選択的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドと接触させる工程、および該核酸分子への該オリゴヌクレオチドの結合を検出する工程を包含する、項目２１に記載の方法。
（項目２４）
Ｃｙｆｒａ、ＳＬＰＩ、ＴＩＭＰ１、ＳＣＣ、ＴＦＰＩ、ＣＥＡＣＡＭ５、ＭＭＰ２、ＯＰＮおよびＭＤＫを含む複数の肺癌マーカーを検出するための基質および検出試薬を含む組成物であって、ここで該検出試薬が、該基質に結合されている、組成物。
（項目２５）
前記検出試薬が、前記マーカーに選択的に結合する抗体である、項目２４に記載の組成物。
（項目２６）
前記検出試薬が、マーカーポリペプチドまたはその抗原性フラグメントである、項目２４に記載の組成物。
（項目２７）
前記検出試薬が、前記マーカーをコードする核酸分子に選択的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドである、項目２４に記載の組成物。
（項目２８）
Ｃｙｆｒａ、ＳＬＰＩ、ＴＩＭＰ１、ＳＣＣ、ＴＦＰＩ、ＣＥＡＣＡＭ５、ＭＭＰ２、ＯＰＮおよびＭＤＫを含む複数の肺癌マーカーを検出するための少なくとも１つの容器および検出試薬を備えたキットであって、ここで該検出試薬が、該容器の１つ以上の中に保存されている、キット。
（項目２９）
前記検出試薬が、イムノアッセイにおいて使用するための抗体または抗原である、項目２８に記載のキット。
（項目３０）
前記検出試薬のうちの少なくとも１つが、検出可能部分で標識されている、項目２８に記載のキット。
（項目３１）
前記イムノアッセイが、ＥＬＩＳＡである、項目２９に記載のキット。
（項目３２）
前記検出試薬が、抗体であり、該抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、完全ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体および抗イディオタイプ抗体のうちの少なくとも１つである、項目２８に記載のキット。
（項目３３）
前記検出試薬が、抗体であり、該抗体は：
ａ）Ｆａｂフラグメント；
ｂ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメント；および
ｃ）Ｆｖフラグメント
からなる群から選択される抗体フラグメントを含む、項目２８に記載のキット。
（項目３４）
前記サンプルが、血清サンプルである、項目４に記載の方法。
（項目３５）
前記個体に対して予後判定を提供する工程をさらに包含する、項目４に記載の方法。
（項目３６）
前記方法が、肺癌の処置後に行われる、項目４に記載の方法。
（項目３７）
複数の前記マーカーのレベルに基づいて、個体に適用するための肺癌の処置を選択する工程、および該個体に該処置を適用する工程をさらに包含する、項目４に記載の方法。
（項目３８）
治療薬の臨床試験に含めるための前記個体を選択する工程をさらに包含する、項目４に記載の方法。
（項目３９）
個体における肺癌を検出する方法であって、該方法は、サンプル中の少なくとも１つの肺癌マーカーを検出する工程を包含し、該マーカーは、表１〜２（配列番号１〜６５ならびに炭水化物抗原ＣＡ２４２、ＣＡ１９−９およびＣＡ７２−４）、表４、図１および図１２に示されるマーカーからなる群から選択され、そして異なるレベルの該マーカーは、肺癌の存在を示す、方法。
（項目４０）
前記異なるレベルは、高レベルであることを特徴とする、項目３９に記載の方法。
（項目４１）
前記高レベルが、肺癌を有しない個体における前記マーカーの平均レベルよりも少なくとも２標準偏差高い、項目４０に記載の方法。
（項目４２）
肺癌の進行または後退についてモニターする方法であって、該方法は、前の時点および後の時点におけるサンプル中の少なくとも１つの肺癌マーカーを検出する工程を包含し、該マーカーは、表１〜２（配列番号１〜６５ならびに炭水化物抗原ＣＡ２４２、ＣＡ１９−９およびＣＡ７２−４）、表４、図１および図１２に示されるマーカーからなる群から選択され、該前の時点と比べて該後の時点における該レベルの上昇が、肺癌の進行を示し、そして該前の時点と比べて該後の時点における該レベルの低下が、肺癌の後退を示す、方法。
（項目４３）
前記マーカーが、図１９に提供されるマーカーからなる群から選択される少なくとも１つのマーカーを含む、項目４２に記載の方法。
（項目４４）
前記方法が、肺癌の処置と併せて行われる、項目４２に記載の方法。
（項目４５）
前記前の時点が、肺癌の処置の前であり、そして前記後の時点が、該肺癌の処置の後である、項目４４に記載の方法。
（項目４６）
前記肺癌の処置が、治療薬の投与、肺の腫瘍の少なくとも一部の外科的切除または放射線治療のうちの少なくとも１つを含む、項目４４に記載の方法。
（項目４７）
肺癌を処置する方法であって、該方法は、表１〜２（配列番号１〜６５ならびに炭水化物抗原ＣＡ２４２、ＣＡ１９−９およびＣＡ７２−４）、表４、図１および図１２に示されるマーカーからなる群から選択されるマーカーを調節する、治療有効量の薬剤を個体に投与する工程を包含する、方法。
（項目４８）
肺癌細胞の増殖を阻害するか、または肺癌細胞のアポトーシスを刺激する方法であって、該方法は、肺癌細胞を、表１〜２（配列番号１〜６５ならびに炭水化物抗原ＣＡ２４２、ＣＡ１９−９およびＣＡ７２−４）、表４、図１および図１２に示されるマーカーからなる群から選択されるマーカーを調節する薬剤と接触させる工程を包含する、方法。
（項目４９）
前記肺癌が、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）である、項目３９に記載の方法。
（項目５０）
前記マーカーのうちの少なくとも２つのレベルが上昇していることが、前記個体が肺癌を有していることを示す、項目２〜４のいずれか１項に記載の方法。
（項目５１）
前記高レベルが、所定のカットオフレベルよりも高いか、または所定のカットオフレベル以上である、項目５２に記載の方法。
（項目５２）
前記パネルが、少なくとも２つのマーカーを含み、該マーカーのうちの少なくとも２つのレベルが上昇していることが、該個体が肺癌を有することを示す、項目５に記載の方法。
（項目５３）
前記パネルが、以下のパネル：
９マーカーパネル（Ｃｙｆｒａ、ＳＬＰＩ、ＴＩＭＰ１、ＳＣＣ、ＴＦＰＩ、ＣＥＡＣＡＭ５、ＭＭＰ２、ＯＰＮおよびＭＤＫ）を含むパネル；および
該９マーカーパネルのうちの６マーカーサブセット（Ｃｙｆｒａ、ＳＬＰＩ、ＴＩＭＰ１、ＴＦＰＩ、ＣＥＡＣＡＭ５およびＭＤＫ）を含むパネル
からなる群から選択される、項目５２に記載の方法。
（項目５４）
前記パネルが、表４に提供されるマーカーからなる群から選択される少なくとも１つのマーカーをさらに含む、項目５２または５３のどちらかに記載の方法。
肺癌
肺癌は、米国における男性と女性の両方に対して２番目に最も一般的な癌のタイプであり、男性と女性の両方における癌による死亡の最も共通する原因である。肺癌に対する５年生存率は、たった約８〜１５％という不良なものであり続けている。この低生存率は、肺癌が、肺を超えて広がるまで通常検出されないことが理由である。米国においてたった１６％の肺癌の新しい症例しか、その癌がまだ肺に限局されている前初期段階において検出されていない。この初期段階では、生存率は、かなり高く、７０〜８０％と見積もられている。ゆえに、肺癌を検出するための手順が、死亡率を低下させる可能性を有しているので、これらの手順は、患者の予後にとって非常に重要である。それゆえ、初期の肺癌を検出するために、より感度が高く、かつ特異的である、新規の診断的な組成物および方法が必要とされている。
さらに、患者の疾患の病期を判定するための新規の診断的な組成物および方法も必要とされている。病期判定は、有望な予後値をもたらし、そして最適な治療を計画するための基準を提供する。様々な病期の肺癌を示唆する生物学的マーカーは、肺癌の病期分類を容易にするために有用であり得る。
肺癌患者は、典型的には、最初の治療後および補助療法中にモニターされることにより、治療に対する応答が判定され、また、疾患が持続しているか、もしくは再発しているか、または転移していることが検出される。したがって、肺癌、その再発および進行の検出において感度が高く、かつ特異的である肺癌マーカーが明らかに必要である。
肺癌の早期検出に役立たせるために、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）スクリーニングなどのイメージング様式が研究されているが、これらの方法が死亡率に影響を与える能力に関する論争が残っている（Ｉ−ＥＬＣＡＰ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒｓ，ＮＥＪＭ ２００６（３５５）：１７６３−７１およびＢａｃｈら、２００７．ＪＡＭＡ ２９７：９５３−９６１）。さらに、研究中の最先端のイメージング技術は、高価であり、広く利用可能ではない。これらのＣＴイメージング試験は、肺癌の過剰診断をもたらすことがあり、その結果、これらのＣＴイメージング試験によって観察された肺結節を有する患者を管理する医療制度に対して著しい支出が発生する。さらに、その結節が悪性であるか良性であるかを確かめようとする肺結節の管理に関連した有意な病的状態が存在する。高リスク群の１０〜５０％の喫煙者が、イメージング研究において肺結節を有すると推定される（ＣＨＥＳＴ ２００７ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ−Ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｐａｔｉｅｎｔｓ Ｗｉｔｈ Ｐｕｌｍｏｎａｒｙ Ｎｏｄｕｌｅｓ：Ｗｈｅｎ Ｉｓ Ｉｔ Ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ？：ＡＡＣＰ Ｅｖｉｄｅｎｃｅ−Ｂａｓｅｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｒａｃｔｉｃｅ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ）。したがって、肺癌を有する患者の早期診断および管理改善のために、独立して使用され得るか、またはイメージング様式とともに使用され得る、新規の診断法が非常に必要とされる。例えば、肺癌を検出するための高機能（例えば、高感度および高特異性）を有する生物学的マーカーについての血液試験は、癌を初期に検出するためのＣＴ試験を補完する低コストの試験をもたらし得る。生物学的マーカー試験の性能が十分に高いと、そのような試験は、ＣＴまたはＸ線試験に対するより低コストの代替物として機能し得る。例えば、生物学的マーカー試験において陽性と判断された患者だけが、その後、より高価なイメージング試験を受ける必要があり得る。さらに、生物学的マーカー試験は、例えば、肺癌に対する年１回のスクリーニングレジメンにおいて使用され得る。
肺癌において使用される可能性のある循環腫瘍マーカーおよび抗原に関する報告が存在するが（概説としてＳｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｊ．２００６．Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ，４２：１−４１を参照のこと）、現在、一般に使用されているマーカーは、特に喫煙者において低感度および望ましさに満たない特異性に悩まされており（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，２００６）、典型的には、肺癌の再発についてモニターするためにだけ使用されている。したがって、肺癌の検出などのために、高感度（および臨床的適応に応じて、様々な特異性）を有するマーカーのパネルが当該分野において必要とされている。さらに、肺癌を検出するために個別に、またはパネルの一部として、有用である新規マーカーも必要とされている。そのようなマーカーおよびマーカーのパネルは、例えば肺癌を有する患者の管理を容易にし得る。
生物学的腫瘍マーカーならびにＣＴスクリーニングの使用をはじめとした肺癌の診断法に関するさらなる概説としては、以下の引用：Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，“Ｔｕｍｏｒ ｍａｒｋｅｒｓ ｉｎ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ”，Ａｄｖ Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ．２００６；４２：１−４１；Ｂａｃｈら、“Ｃｏｍｐｕｔｅｄ ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ａｎｄ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ ｏｕｔｃｏｍｅｓ”，ＪＡＭＡ．２００７ Ｍａｒ ７；２９７（９）：９５３−６１；およびＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅａｒｌｙ Ｌｕｎｇ Ｃａｎｃｅｒ Ａｃｔｉｏｎ Ｐｒｏｇｒａｍ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒｓら、“Ｓｕｒｖｉｖａｌ ｏｆ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｓｔａｇｅ Ｉ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｏｎ ＣＴ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ”，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．２００６ Ｏｃｔ ２６；３５５（１７）：１７６３−７１を参照のこと。Ｐｅｐｅら、“Ｐｈａｓｅｓ ｏｆ ｂｉｏｍａｒｋｅｒ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｆｏｒ ｅａｒｌｙ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ”，Ｊ Ｎａｔ’ｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．２００１．９３（１４）：１０５４−１０６１も参照のこと。
表１〜２の説明
表１および２は、肺癌マーカー（「ＬＣＭ」）についてのさらなる情報（それらの名称、記号（代替の記号が括弧内に記載される）、Ｇｅｎｂａｎｋタンパク質アクセッション番号、および各マーカー（各々について代表的な引用刊行物が提供される炭水化物抗原（ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ ａｎｔｉｇｅｎ）ＣＡ２４２、ＣＡ１９−９およびＣＡ７２−４を除く）についての例示的なタンパク質配列を含む）を提供している。例示的なＬＣＭタンパク質配列は、配列番号１〜６５として提供される（さらに、炭水化物抗原ＣＡ２４２、ＣＡ１９−９およびＣＡ７２−４もまた提供される）。各マーカーについての核酸配列（例えば、ｍＲＮＡ転写物配列およびゲノムＤＮＡ）および代替のタンパク質配列は、当該分野で周知であり、例えば表１〜２に提供される情報を用いて容易に得ることができる。
表１に提供されるＬＣＭは、以下の通りである（代替の名称／記号が、括弧内に記載される）：ＳＬＰＩ、ＭＩＦ、ＴＩＭＰ１、ＴＦＰＩ、ＥＮＯ２（ＮＳＥ）、ＣＥＡ（ＣＥＡＣＡＭ５）、ＭＭＰ２、ＡＭＢＰ、Ｃｙｆｒａ２１−１（Ｃｙｆｒａ、ＫＲＴ１９）、ＳＣＣ（ＳＥＲＰＩＮＢ３）、ＯＰＮ、ディフェンシン（ＤＥＦＡ１、ＨＮＰ−１、ＨＮＰ１−３）、ＣＡ２４２、ＣＡ１９−９、ＣＡ７２−４、ＭＮ／ＣＡＩＸ（ＣＡ９）、ＰｒｏＧＲＰ（ＧＲＰ）、ＫＲＴ１８（ＴＰＳ）、ＥＣＡＤ（ＣＤＨ１）、ＴＩＭＰ２、ＣＤ４４、ＬＧＡＬＳ３ＢＰ、ＥＲＢＢ２（ＨＥＲ−２）、ＵＰＡ（ＰＬＡＵ）、ＤＫＫ（ＤＫＫ１）、ＣＨＧＡ、ＶＥＧＦ、ＫＩＴＬＧ、ＰＢＥＦ（ビスファチン（ｖｉｓｆａｔｉｎ））、ＳＯＲＴ１（ソルチリン（ｓｏｒｔｉｌｉｎ））、ＭＤＫ（ミッドカイン）、ＩＧＦＢＰ３、ＩＧＦＢＰ４、ＣＴＳＣ、ＩＣＡＭ３、ＣＴＧＦ、ＬＣＮ２、ＥＧＦＲ、ＢＧＮ、ＴＩＭＰ３、ＨＧＦ、ＭＵＣ１６（ＣＡ１２５）、ＮＣＡＭ、ＣＲＰ、ＳＥＲＰＩＮＡ１（ＡＴＴ）、ＰＫＭ２、ＲＢＰ、ＫＬＫ１１、ＫＬＫ１３、ＳＡＡおよびＡＰＯＣ３。
表２に提供されるＬＣＭ（自己抗体マーカーとして特に有用であるもの）は、以下のとおりである（代替の名称／記号が、括弧内に記載される）：ＴＰ５３（ｐ５３）、ＫＬＫＢ１、ＣＦＬ１（ＣＦＬＮ）、ＥＥＦ１Ｇ、ＨＳＰ９０α（ＨＳＰ９０ＡＡ１）、ＲＴＮ４、ＡＬＤＯＡ、ＧＬＧ１、ＰＴＫ７、ＥＦＥＭＰ１、ＳＬＣ３Ａ２（ＣＤ９８）、ＣＨＧＢ、ＣＥＡＣＡＭ１、ＡＬＣＡＭ、ＨＳＰＢ１（ＨＳＰ２７）、ＬＧＡＬＳ１およびＢ７Ｈ３。
低レベルが肺癌を示唆するソルチリン（ＳＯＲＴ１）を除いて、高レベルのこれらのＬＣＭの各々は、肺癌を示唆する。
表３〜１２の説明
表３は、肺癌を検出するために少なくとも９８％の特異性および８２％の感度を有する１１個のマーカーの３５個の異なるパネルを提供している（各横列の１１個のマーカーが１つのパネルである）。これらの３５個の１１マーカーパネルにおける各マーカーの存在の総数は、表３の下に記載されている。７個のマーカー（ＳＬＰＩ、ＴＩＭＰ１、ＴＦＰＩ、ＳＣＣ、ＯＰＮ、ＣＥＡおよびＣＡ２４２）が、これらのパネルの３５個すべてにおいて見られ、ＧＲＰは、これらの３５個のパネルのうち３３個において見られ、ＭＩＦは、これらの３５個のパネルのうち２９個において見られ、そしてＮＳＥおよびＨＮＰ−１の各々は、これらの３５個のパネルのうち１５個において見られる。ＡＭＢＰ、Ｃｙｆｒａ、ＭＭＰ２、Ｃａ７２−４、Ｃａ１９−９およびＣＡＩＸの各々は、表３に記載されているように、これらのパネルのうち７〜９個において見られる。
表４は、本明細書中に開示されるパネルのいずれかに含まれ得るマーカーを提供している。例えば、表４中のマーカーは、本明細書中に開示されるパネルのいずれかに加えられ得、そして／または本明細書中に開示されるパネルのいずれかの１つ以上のメンバーを置き換え得る。具体的な例として、表４中のマーカーは、表５に開示されるパネルのいずれかに加えられ得、そして／または表５に開示されるパネルのいずれかの１つ以上のメンバーを置き換え得る。表４に開示されるマーカーは、表２にも開示されている。
表５〜１２は、様々な肺癌の用途（例えば、肺癌を診断／検出するためなどの正常サンプルに対して肺癌サンプルを識別するため）（例えば、表５〜６および１１〜１２）、ならびにある具体的な用途（「指標」または肺癌の「特徴」の判定もしくは評価と本明細書中で称されることがあるこれらの具体的な用途は、例えば、表７〜１０に提供される）において様々なパネルを解析するためのデータを提供している。表５〜１２では、各横列は、パネルを表している（パネルは、個別のマーカーを含み得る）。表５〜１２における各パネルについて、データは、ロジスティック回帰および／またはスプリットポイント（ｓｐｌｉｔ ｐｏｉｎｔ）解析に基づいて示されている（各表において記載されるように）。曲線下面積（ＡＵＣ）、９５％特異性での感度および９５％感度での特異性が、記載されている。「サイズ」（２番目の縦列）は、所与のパネルにおけるマーカーの数を示している。各解析において使用されるサンプルセットの特徴に関するさらなる情報（「５４×５３」、「５０×５０」および「４４×４４」サンプルセット）は、図１６に提供されている（表８において使用されている「１０４×１０３」サンプルセットは、「５４×５３」サンプルセットと「５０×５０」サンプルセットと組み合わせたものである）。表５〜１２および本明細書中の他の箇所において、「トレーニング（ｔｒａｉｎｅｄ）」とは、カットオフレベルを公式化するために使用されたサンプルセット（「トレーニングセット（ｔｒａｉｎｉｎｇ ｓｅｔ）」と称されることがある）のことを指し、そして「テスト（ｔｅｓｔｅｄ）」とは、これらのカットオフレベルが適用されたサンプルセット（「テストセット（ｔｅｓｔｉｎｇ ｓｅｔ）」と称されることがある）のことを指す（例えば、トレーニングセットから確立されたカットオフレベルよりもマーカーのレベルが高いかまたは低いかに基づいて、サンプルを肺腫瘍サンプルもしくは正常サンプルと分類するため、または他の具体的な用途のため）。
表５は、肺癌を診断／検出するなどのために正常（すなわち、コントロール／健常）サンプルに対して肺腫瘍サンプルを識別する際の、Ｃｙｆｒａ、ＳＬＰＩ、ＴＩＭＰ１、ＳＣＣ、ＴＦＰＩ、ＣＥＡＣＡＭ５、ＭＭＰ２、ＯＰＮおよびＭＤＫの９マーカーパネルならびにそのすべての部分組み合わせ（個別のマーカーを含む）のロジスティック回帰およびスプリットポイント解析についてのデータを提供している。表５中の各パネルについて、データは、ロジスティック回帰およびスプリットポイント解析に基づいて示されており、また、同じ５４×５３（５４個のコントロールおよび５３個の症例）サンプルセットに対するトレーニングおよびテストの解析、または５４×５３サンプルセットに対するトレーニングならびに５０×５０（５０個のコントロール×５０個の症例）サンプルセットに対するテストの解析に基づいて示されている（これらのサンプルセットの特徴については図１６を参照のこと）。曲線下面積（ＡＵＣ）、９５％特異性における感度および９５％感度における特異性が記載されている。それらのパネルは、３番目の縦列に記載されているＡＵＣに基づいて並べられている。「サイズ」（２番目の縦列）は、所与のパネルにおけるマーカーの数を示している。したがって、表５は、Ｃｙｆｒａ、ＳＬＰＩ、ＴＥＭＰ１、ＳＣＣ、ＴＦＰＩ、ＣＥＡＣＡＭ５、ＭＭＰ２、ＯＰＮおよびＭＤＫの９マーカーパネル、ならびにこれらの９つのマーカーの各々を個別に含むそのすべてのパネル部分組み合わせを提供している（各横列は、パネルを表している）。
表６は、肺癌を診断／検出するなどのために正常（すなわち、コントロール／健常）サンプルに対して肺腫瘍サンプルを識別する際の、表５に提供されるパネルにおける９つのマーカーのいずれかおよび／または様々な他のマーカー（表５に提供されるパネルにないもの）を含むパネル（個別のマーカーを含む）のスプリットポイント解析についてのデータを提供している。
表７は、扁平上皮癌型の肺癌に対して腺癌を識別する際の、Ｃｙｆｒａ、ＳＬＰＩ、ＴＩＭＰ１、ＳＣＣ、ＴＦＰＩ、ＣＥＡＣＡＭ５、ＭＭＰ２、ＯＰＮおよびＭＤＫの９マーカーパネルならびにその部分組み合わせ（個別のマーカーを含む）のロジスティック回帰分析についてのデータを提供している。
表８は、第ＩＩＩ期の肺癌に対して第Ｉ期の肺癌を識別する際の、Ｃｙｆｒａ、ＳＬＰＩ、ＴＩＭＰ１、ＳＣＣ、ＴＦＰＩ、ＣＥＡＣＡＭ５、ＭＭＰ２、ＯＰＮおよびＭＤＫの９マーカーパネルならびにその部分組み合わせ（個別のマーカーを含む）のスプリットポイント解析についてのデータを提供している。初期の肺癌と後期の肺癌とを識別する（例えば、第ＩＩＩ期または第ＩＶ期に対して第Ｉ期または第ＩＩ期）際の有用性に加えて、表８に提供されるパネルは、他の任意の病期の肺癌（例えば、第Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩおよびＩＶ期のいずれか）を識別するためにも有用である。
表９は、他のタイプの肺癌（例えば、非小細胞肺癌、ＮＳＣＬＣ）に対して小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）を識別する際の様々なパネルのスプリットポイント解析についてのデータを提供している。表９の左側では、マーカーレベルは、ＮＳＣＬＣにおいて高い（ＳＣＬＣと比べて）。表９の右側では、マーカーレベルは、ＳＣＬＣにおいて高い（ＮＳＣＬＣと比べて）。
表１０は、良性の肺の病変に対して悪性の肺腫瘍を識別する際の、Ｃｙｆｒａ、ＳＬＰＩ、ＴＩＭＰ１、ＳＣＣ、ＴＦＰＩ、ＣＥＡＣＡＭ５、ＭＭＰ２、ＯＰＮおよびＭＤＫの９マーカーパネルならびにその部分組み合わせ（個別のマーカーを含む）のスプリットポイント解析についてのデータを提供している。
表１１は、正常（すなわち、コントロール／健常）サンプルに対して小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）を識別する際の様々なパネルのスプリットポイント解析についてのデータを提供している。
表１２は、正常（すなわち、コントロール／健常）サンプルに対して肺癌（小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）と非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）の両方を含む）を識別する際の様々なパネルのスプリットポイント解析についてのデータを提供している。
図１は、１２個の肺腫瘍サンプルおよび１２個の正常血清サンプルのサンプルセットにおけるＥＬＩＳＡによってスクリーニングされた例示的な肺癌マーカー（ＬＣＭ）に対する相対的な発現レベルを示している。図１に示される表の左部分は、組織学および腫瘍の状態によって同定される腫瘍サンプルを提供しており（腫瘍サンプルに対する組織学の省略形は、「ＡＳ」＝腺扁平上皮、「Ａ」＝腺癌、「ＳＣ」＝扁平上皮癌および「ＢＡＣ」＝気管支肺胞上皮癌である）、そして表の右部分は、正常サンプルを示している（組織学について「Ｎ」と同定されている）。この表は、各サンプルの平均濃度値に基づくものであり、カットオフとして、正常の平均値よりも２標準偏差（２ＳＤ）高い値を使用する；その値は、正常の平均値からの倍率変化として表現される（したがって、正常の平均値よりも２ＳＤ高い任意の倍率変化が、カットオフよりも高い）。「ＣＲＡ ＭＳ」と表示されている縦列は、差次的に発現された肺腫瘍サンプルの数およびこれらのサンプルの質量特異的中央値比率（ｍｅｄｉａｎ ｍａｓｓ ｓｐｅｃ ｒａｔｉｏ）を示す質量分析データの要約である（過剰発現の数値的表現は、２．０以上で示されるのに対し、過小発現の数値的表現は、０．５以下で示される）（質量分析に対する肺腫瘍サンプルの省略形は、「ＣＬ ＬＵ」＝肺癌細胞株、「ＴＳ ＬＵ」＝肺癌組織、および「ＣＭ ＬＵ」＝肺癌培養上清である）。 図２は、８つのマーカーＴＦＰＩ、ＳＣＣ（ＳＳＣと交換可能に称される）、ＣＥＡ、ＣＡ２４２、ＭＮＣＡＩＸ、ＯＰＮ、Ｃｙｆｒａ２１−１およびＭＩＦ（図１にも示されている）に対する、１２個の肺腫瘍（上部）サンプルおよび１２個の正常（下部）血清サンプルのサンプルセットのＥＬＩＳＡスクリーニングに基づく相対的な発現レベルを示している。この表は、各サンプルの平均濃度値に基づくものであり、カットオフとして、正常の平均値よりも２標準偏差（２ＳＤ）高い値を使用する；その値は、正常の平均値からの倍率変化として表現される（したがって、正常の平均値よりも２ＳＤ高い任意の倍率変化が、カットオフよりも高い）。カットオフよりも低い任意の値が、０と記録されている。これらの８マーカーのうちのいずれかまたはすべてが、肺癌評価のためにパネルとして組み合わせて使用され得、そしてそのパネルは、必要に応じて、追加のマーカーを含み得る。 図３は、ＴＦＰＩ、ＳＣＣ、ＣＥＡ、ＣＡ２４２、ＭＮＣＡＩＸ、ＯＰＮ、Ｃｙｆｒａ２１−１およびＭＩＦの８マーカーパネルの性能を示している。２標準偏差以上のマーカーが「陽性」とスコア付けされるアルゴリズムを用いたとき、この８マーカーのパネルは、肺癌患者由来の１２個の血清および健常コントロール由来の１２個の血清において９２％の感度および１００％の特異性を有した（「ＦＰ」＝偽陽性、「ＴＰ」＝真陽性、「ＦＮ」＝偽陰性および「ＴＮ」＝真陰性）。 図４は、マーカーＳＬＰＩ、ＴＦＰＩ、ＯＰＮ、ＭＩＦ、ＴＩＭＰ１およびＭＭＰ２のパネルを含むＬＣＭの代替パネルに対する１２個の肺腫瘍サンプル（左部分；組織学（「Ｈｉｓｔ」）の省略形は、「ＡＳ」＝腺扁平上皮、「Ａ」＝腺癌、「ＳＣ」＝扁平上皮癌、「ＯＣ」＝燕麦細胞癌および「ＢＡＣ」＝気管支肺胞上皮癌である）および１２個の正常（右部分；組織学について「Ｎ」と同定されている）血清サンプルのサンプルセットのＥＬＩＳＡスクリーニングに基づいた相対的な発現レベルを示している。これらのマーカーのうちのいずれかまたはすべてが、図４に示されているような以下のマーカー：ＣＡ２４２、ＳＣＣ、ＣＥＡ、ＮＳＥ、ＣＡ７２−４、ＣＡ１９−９、Ｃｙｆｒａ２１−１およびＭＮ／ＣＡＩＸのいずれかまたはすべてと任意の組み合わせでも使用され得る。この表は、各サンプルの平均濃度値に基づくものであり、カットオフとして、正常の平均値よりも２標準偏差（２ＳＤ）高い値を使用する；その値は、正常の平均値からの倍率変化として表現される（したがって、正常の平均値よりも２ＳＤ高い任意の倍率変化が、カットオフよりも高い）。カットオフよりも低い任意の値が、０と記録されている。 図５は、４４個の正常サンプルおよび４４個の肺腫瘍サンプルにおける６つのマーカーＣＥＡ、ＴＦＰＩ、ＭＩＦ、ＴＥＭＰ１、ＯＰＮおよびＣｙｆｒａ２１−１に対するＥＬＩＳＡデータの散布図を示しており、例示的なカットオフが示されている（点線）。例えば、パネルの感度を最大にするが特異性を損なわないカットオフが、適用され得る。 図６は、３９個のコントロール（正常）サンプル（左部分、「コントロール」と表示されている）および３９個の肺腫瘍サンプル（右部分、「腫瘍」と表示されている）における１１個のマーカーＣｙｆｒａ２１−１、ＭＩＦ、ＴＥＭＰ１、ＴＦＰＩ、ＣＥＡ、ＯＰＮ、ＳＣＣ、ＳＬＰＩ、ＨＮＰ−１、ＧＲＰおよびＣＡ２４２に対するＥＬＩＳＡ解析の結果を示している。示されている値は、濃度（ｎｇ／ｍＬ）である。手動で定義されたカットオフが、各マーカーの名称のすぐ下に示されている。「＃＞カットオフ」と表示されている縦列は、所与の血清サンプルにおいて高発現（すなわち、手動で定義されたカットオフより高い濃度）のマーカーの総数を示している。「病期」は、肺癌の病期を示しており、そして「Ｈｉｓｔ Ｔｙｐｅ」は、組織学タイプを示している。これらの１１マーカーのうちのいずれかまたはすべてが、肺癌評価のためにパネルとして組み合わせて使用され得、そしてそのパネルは、必要に応じて、追加のマーカーを含み得る。 図７は、マーカーの例示的なパネルの性能を示しており、追加のマーカーを含めることによって高感度が達成され得ることを証明している。マーカーＣＥＡは、５５％の感度および９０％の特異性を提供し、２つのマーカーＣＥＡおよびＯＰＮは、６０％の感度および９０％の特異性を提供し、３つのマーカーＴＦＰＩ、ＣＥＡおよびＯＰＮは、６７％の感度および９０％の特異性を提供し、そして４つのマーカーＴＩＭＰ１、ＴＦＰＩ、ＣＥＡおよびＯＰＮは、６９％の感度および９０％の特異性を提供する。スコアは、腫瘍の濃度と正常血清中の平均濃度との比のｌｏｇ２の合計である。ＲＯＣ曲線は、サンプルを腫瘍と呼ぶために必要なスコアのカットオフを変更することによって作成され得る。 図８は、様々なマーカー（Ｃｙｆｒａ２１−１、ＭＩＦ、ＳＬＰＩ、ＴＩＭＰ１、ＳＣＣ、ＮＳＥ、ＴＦＰＩ、ＣＥＡ、ＭＭＰ２、ＯＰＮおよびＡＭＢＰが示されている）に対して望ましい性能を提供するカットオフをそのマーカーに対して適用する例を示している。丸印は、左上角に最も近い曲線上の点である、各マーカーに対する例示的なカットオフの近似の位置を示している。様々な基準を使用することもでき、例えば、偽陰性は、偽陽性よりも大きく重みづけられ得る。 図９〜１０は、マーカーＭＩＦ、ＴＩＭＰ１、ＴＦＰＩ、ＣＥＡおよびＯＰＮに対するＡＵＣ（曲線下面積）＝０．８５４３（図９）、ならびにマーカーＴＩＭＰ１、ＮＳＥ、ＣＥＡおよびＯＰＮに対するＡＵＣ＝０．８５１８を示している。スコアは、各マーカーについて腫瘍サンプルと正常サンプルとを最もうまく区別するカットオフより高いマーカーの数である。ＲＯＣ曲線は、サンプルを腫瘍と呼ぶために必要なスコアのカットオフを変更することによって作成され得る。 図９〜１０は、マーカーＭＩＦ、ＴＩＭＰ１、ＴＦＰＩ、ＣＥＡおよびＯＰＮに対するＡＵＣ（曲線下面積）＝０．８５４３（図９）、ならびにマーカーＴＩＭＰ１、ＮＳＥ、ＣＥＡおよびＯＰＮに対するＡＵＣ＝０．８５１８を示している。スコアは、各マーカーについて腫瘍サンプルと正常サンプルとを最もうまく区別するカットオフより高いマーカーの数である。ＲＯＣ曲線は、サンプルを腫瘍と呼ぶために必要なスコアのカットオフを変更することによって作成され得る。 図１１は、ある特定の自己抗体マーカー（下表）、ならびにある特定の他の肺癌マーカー（上表）に対する解析の結果を示している。下表（自己抗体マーカー）において、「肺ＭＳデータ」と表示されている縦列は、差次的な発現が質量分析によって観察された場合の要約を示しており（ＣＬ＝細胞株、ＴＳ＝組織、ＣＭ＝培養上清およびＩＰ＝免疫沈降）、「ＳＥＲＥＸデータ」と表示されている縦列は、高力価ＩｇＧ抗体を誘発するマーカーを同定するＳｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（ＳＥＲＥＸ）データベースと重複する自己抗体マーカーを示しており、そして「Ｒｅｃタンパク質」と表示されている縦列は、自己抗体解析に使用された組換えタンパク質の供給源を示している（「売主」は、外部の商業的供給源を示しており、そして「ＣＲＡ」は、内部の供給源を示している）。上表における腫瘍サンプルに対する組織学の省略形は、「ＡＳ」＝腺扁平上皮、「Ａ」＝腺癌、「ＳＣ」＝扁平上皮癌，および「ＳＭ」＝小細胞癌である。 図１２は、単独で、または他のＬＣＭと併用して使用され得る例示的な自己抗体ＬＣＭを示している。これらの自己抗体ＬＣＭのうちのある特定のものは、他の自己抗体ＬＣＭとともに表２にも提供されている。 図１３は、肺癌および正常の血清サンプルにおいて観察された、自己抗体マーカーＫＬＫＢ１、コフィリンおよびＬＧＡＬＳ１ならびにｐ５３についての自己抗体応答を示している。横軸に沿って、Ｔ１からＴ１２は、腫瘍サンプルを示しており、Ｎ１からＮ１２は、正常サンプルを示している。 図１４は、肺癌および正常の血清サンプルにおける、自己抗体マーカーＣＡ１２、ＫＬＫＢ１、ＣＦＬＮ、ＬＧＡＬＳ１およびＥＥＦ１Ｇ、ならびにｐ５３に対する自己抗体の検出を示している。この表は、各サンプルの平均濃度値に基づくものであり、カットオフとして、正常の平均値よりも２ＳＤ高い値を使用する。カットオフよりも低い任意の値が、０と記録されている。 図１５は、３つの追加のＬＣＭ：ビスファチン（ＰＢＥＦ）、ソルチリン（ＳＯＲＴ−１）およびミッドカイン（ＭＤＫ）を示している。これらの３つのＬＣＭのうちのいずれかまたはすべてが、例えば、肺癌診断のためのマーカーのパネルにおいて実行され得る。図１５は、ＥＬＩＳＡ解析に基づいた、１２個の正常肺サンプルおよび１２個の肺腫瘍サンプルにおけるこれらの３つのマーカーの存在量レベル（ｎｇ／ｍＬ）を示している。ソルチリン（ＳＯＲＴ−１）については、２２個の正常肺サンプルおよび２３個の肺腫瘍サンプルのｍＲＮＡ発現解析に基づいたこのマーカーの存在量レベル（相対的コピー数による）もまた提供される。ソルチリンについては、肺腫瘍サンプルは、正常肺サンプルと比べてこのマーカーの低い存在量レベルを有する。 図１６は、本明細書中に開示される様々な解析において使用される肺癌血清サンプルの臨床病理学的特徴を示している。 図１７は、手動で定義されたカットオフを適用するスプリットポイント解析を用いた、５０個のコントロール（正常）サンプル（左部分、「正常」と表示されている）および５０個の肺腫瘍サンプル（右部分、「腫瘍」と表示されている）におけるＣｙｆｒａ、ＳＬＰＩ、ＴＩＭＰ１、ＳＣＣ、ＴＦＰＩ、ＣＥＡＣＡＭ５、ＭＭＰ２、ＯＰＮおよびＭＤＫの９マーカーパネルに対するＥＬＩＳＡ解析の結果を示している。手動で定義されたカットオフは、各マーカーの名称のすぐ下に記載されている。示されている値は、濃度（ｎｇ／ｍＬ）である。「≧カットオフ」と表示されている縦列は、所与の血清サンプルにおいて高発現（すなわち、手動で定義されたカットオフ以上の濃度）のマーカーの総数を示している。「組織学」は、組織学タイプを示している（「ａｄｅｎｏ」＝腺癌、「ｓｑｕ」＝扁平上皮癌、「ｎｓｍ」または「ｎ−ｓｍ」＝非小細胞癌、「ｂｒｏ」＝細気管支肺胞上皮癌、「ＬＧ」＝大細胞癌および「ｎｅｕｒｏ」＝神経内分泌）。これらの９つのマーカーのうちのいずれかまたはすべてが、肺癌評価のためにパネルとして組み合わせて使用され得、そしてそのパネルは、必要に応じて、追加のマーカーを含み得る。 図１８は、例としてＣＥＡおよびＣｙｆｒａを用いて肺腫瘍の退縮／再発をモニターするためのマーカーの解析を記載している。特に、手術の２〜４週間後の患者血清における生物学的マーカーのレベルを手術前のマーカーレベルと比較した。 図１９は、肺腫瘍の退縮／再発についてモニターするためのマーカーの解析を示している。手術前のレベルと比較したときの、手術の２〜４週間後の患者血清における生物学的マーカーのレベルの変化のパーセンテージが示されている。 図２０は、以下の併存症肺疾患：喘息、気管支炎および良性の肺疾患におけるＣｙｆｒａ、ＳＬＰＩ、ＴＩＭＰ１、ＳＣＣ、ＴＦＰＩ、ＣＥＡＣＡＭ５、ＭＭＰ２、ＯＰＮおよびＭＤＫの９マーカーパネルの発現レベルの解析を示している。示されている値は、濃度（ｎｇ／ｍＬ）である。「＃＞カットオフ」と表示されている縦列は、所与の血清サンプルにおいて高発現（すなわち、手動で定義されたカットオフより高い濃度）のマーカーの総数を示している。手動で定義されたカットオフは、各マーカーの名称のすぐ下に記載されている（「カットオフ」と表示されている横列）。 図２１は、例示的な補足的な生物医学的パラメータ（喫煙歴）を例示的なＬＣＭパネル（ＴＩＭＰ１、ＴＦＰＩ、ＣＥＡＣＡＭ５およびＣａ７２−４）＋パックイヤー（「パックイヤー」：１日に喫煙するタバコの数に、この割合で喫煙してきた年数を乗算した値）と統合する解析を示している。
本発明の例示的な実施形態の詳細な説明
本発明は、添付の表および／または図面と併せて、以下の例示的な実施形態の詳細な説明を参照することにより、最もよく理解されるだろう。以下の討議は、例示的なものであって、特許請求の範囲によって定義される範囲を限定すると考慮されるべきでない。
本発明の例示的な実施形態は、以下のマーカー（表１〜２を参照のこと）、これらのマーカーの組み合わせ、特に肺癌に関連する用途、とりわけ肺癌を診断するためにこれらのマーカーを使用する方法を提供する（代替の名称／記号は、括弧内に記載される）：ＳＬＰＩ、ＭＩＦ、ＴＩＭＰ１、ＴＦＰＩ、ＥＮＯ２（ＮＳＥ）、ＣＥＡ（ＣＥＡＣＡＭ５）、ＭＭＰ２、ＡＭＢＰ、Ｃｙｆｒａ２１−１（Ｃｙｆｒａ、ＫＲＴ１９）、ＳＣＣ（ＳＥＲＰＩＮＢ３）、ＯＰＮ、ディフェンシン（ＤＥＦＡ１、ＨＮＰ−１、ＨＮＰ１−３）、ＣＡ２４２、ＣＡ１９−９、ＣＡ７２−４、ＭＮ／ＣＡＩＸ（ＣＡ９）、ＰｒｏＧＲＰ（ＧＲＰ）、ＫＲＴ１８（ＴＰＳ）、ＥＣＡＤ（ＣＤＨ１）、ＴＩＭＰ２、ＣＤ４４、ＬＧＡＬＳ３ＢＰ、ＥＲＢＢ２（ＨＥＲ−２）、ＵＰＡ（ＰＬＡＵ）、ＤＫＫ（ＤＫＫ１）、ＣＨＧＡ、ＶＥＧＦ、ＫＩＴＬＧ、ＰＢＥＦ（ビスファチン）、ＳＯＲＴ１（ソルチリン）、ＭＤＫ（ミッドカイン）、ＩＧＦＢＰ３、ＩＧＦＢＰ４、ＣＴＳＣ、ＩＣＡＭ３、ＣＴＧＦ、ＬＣＮ２、ＥＧＦＲ、ＢＧＮ、ＴＩＭＰ３、ＨＧＦ、ＭＵＣ１６（ＣＡ１２５）、ＮＣＡＭ、ＣＲＰ、ＳＥＲＰＩＮＡ１（ＡＴＴ）、ＰＫＭ２、ＲＢＰ、ＫＬＫ１１、ＫＬＫ１３、ＳＡＡ、ＡＰＯＣ３、ＴＰ５３（ｐ５３）、ＫＬＫＢ１、ＣＦＬ１（ＣＦＬＮ）、ＥＥＦ１Ｇ、ＨＳＰ９０α（ＨＳＰ９０ＡＡ１）、ＲＴＮ４、ＡＬＤＯＡ、ＧＬＧ１、ＰＴＫ７、ＥＦＥＭＰ１、ＳＬＣ３Ａ２（ＣＤ９８）、ＣＨＧＢ、ＣＥＡＣＡＭ１、ＡＬＣＡＭ、ＨＳＰＢ１（ＨＳＰ２７）、ＬＧＡＬＳ１およびＢ７Ｈ３（これらは、ひとまとめにして「ＬＣＭ」（「肺癌マーカー」）と本明細書中で称される）。低レベルが肺癌を示唆するソルチリン（ＳＯＲＴ１）を除いて、高レベルのこれらのＬＣＭの各々は、肺癌を示唆する。表１および２は、名称、記号、Ｇｅｎｂａｎｋタンパク質アクセッション番号、および各マーカーについての例示的なタンパク質配列（各々について代表的な引用刊行物が提供される炭水化物抗原ＣＡ２４２、ＣＡ１９−９およびＣＡ７２−４を除く）をはじめとしたこれらのＬＣＭの各々についてのさらなる情報を提供している。例示的なＬＣＭタンパク質配列は、配列番号１〜６５として提供されている（さらに、炭水化物抗原ＣＡ２４２、ＣＡ１９−９およびＣＡ７２−４もまた提供される）。各マーカーについての核酸配列（例えば、ｍＲＮＡ転写物配列およびゲノムＤＮＡ）および代替のタンパク質配列は、当該分野で周知であり、例えば表１〜２に提供される情報を用いて容易に得ることができる。表２に提供されるマーカーは、自己抗体マーカーとして特に有用である。
本発明のある特定の実施形態は、以下の９個のＬＣＭを含む組み合わせ、それらからなる組み合わせ、およびそれらから本質的になる組み合わせ、ならびにその部分組み合わせ（ｓｕｂｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）を提供する（これらの９個のＬＣＭは、例えば図１７および表５に示される「９マーカーパネル」と本明細書中で称されることがある）：Ｃｙｆｒａ、ＳＬＰＩ、ＴＩＭＰ１、ＳＣＣ、ＴＦＰＩ、ＣＥＡＣＡＭ５、ＭＭＰ２、ＯＰＮおよびＭＤＫ。本発明のある特定の実施形態は、この９マーカーパネルおよびその部分組み合わせに基づいた組成物、ならびに特に肺癌に関連する用途（例えば、肺癌の検出）のために、この９マーカーパネルを使用する方法を提供する。ある特定の実施形態において、この９マーカーパネルの１つ以上のメンバーは、表４に示される１つ以上のマーカーによって置き換えられ、そして／または表４に示される１つ以上のマーカーは、この９マーカーパネルに加えられる。その９個のマーカーＣｙｆｒａ、ＳＬＰＩ、ＴＩＭＰ１、ＳＣＣ、ＴＦＰＩ、ＣＥＡＣＡＭ５、ＭＭＰ２、ＯＰＮおよびＭＤＫに関して、高レベルが、肺癌を示唆する（低レベルが肺癌を示唆するソルチリン（ＳＯＲＴ１）を除いて、本明細書中に開示されるＬＣＭのすべてについて、高レベルが、肺癌を示唆する）。ある特定の実施形態において、その９マーカーパネルの２つ以上のマーカー（すなわち、「複数」）のレベルが、個体由来のサンプル（例えば、血清サンプル）中で上昇している場合、これは、その個体が肺癌を有することを示唆する。他の様々な実施形態において、９マーカーパネルのうちの１つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、７つ以上、８つ以上または９つすべてのマーカーのレベルが、個体由来のサンプル中で上昇している場合、これは、その個体が肺癌を有することを示唆する。ある特定の実施形態において、マーカーは、そのレベルが所定のカットオフレベルよりも高い（またはそれ以上である）場合、上昇していると分類される。
さらに、本発明のある特定の実施形態は、以下の６個のＬＣＭ（その各々は、上記の９マーカーパネルにも含まれる）を含む組み合わせ、それらからなる組み合わせ、およびそれらから本質的になる組み合わせ、ならびにその部分組み合わせを提供する（これらの６個のＬＣＭは、表５に示される「９マーカーパネルの６マーカーサブセット」と本明細書中で称されることがある）：Ｃｙｆｒａ、ＳＬＰＩ、ＴＩＭＰ１、ＴＦＰＩ、ＣＥＡＣＡＭ５およびＭＤＫ。本発明のある特定の実施形態は、この９マーカーパネルの６マーカーサブセットおよびその部分組み合わせに基づいた組成物、ならびに特に肺癌に関連する用途（例えば、肺癌の検出）のために、この９マーカーパネルの６マーカーサブセットを使用する方法を提供する。ある特定の実施形態において、この９マーカーパネルの６マーカーサブセットの１つ以上のメンバーは、表４に示される１つ以上のマーカーによって置き換えられ、そして／または表４に示される１つ以上のマーカーが、この９マーカーパネルの６マーカーサブセットに加えられる。その６個のマーカーＣｙｆｒａ、ＳＬＰＩ、ＴＩＭＰ１、ＴＦＰＩ、ＣＥＡＣＡＭ５およびＭＤＫに関して、高レベルが、肺癌を示唆する（低レベルが肺癌を示唆するソルチリン（ＳＯＲＴ１）を除いて、本明細書中に開示されるＬＣＭのすべてについて、高レベルが、肺癌を示唆する）。ある特定の実施形態において、その９マーカーパネルの６マーカーサブセットの２つ以上のマーカー（すなわち、「複数」）のレベルが、個体由来のサンプル（例えば、血清サンプル）中で上昇している場合、これは、その個体が肺癌を有することを示唆する。他の様々な実施形態において、９マーカーパネルの６マーカーサブセットのうちの１つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つすべてのマーカーのレベルが、個体由来のサンプル中で上昇している場合、これは、その個体が肺癌を有することを示唆する。ある特定の実施形態において、マーカーは、そのレベルが所定のカットオフレベルよりも高い（またはそれ以上である）場合、上昇していると分類される。
本発明の例示的な実施形態は、ＬＣＭおよびＬＣＭの組み合わせ（ＬＣＭの組み合わせは、本明細書中においてパネルと交換可能に称されることがある）ならびにそれらの用途、特に肺癌に関連する用途を提供する。例えば、本発明の例示的な実施形態は、ＬＣＭを用いて、疾患、とりわけ癌、特に肺癌を評価する（例えば、診断／検出する、予後判定する、または薬物反応を予測する）ため、処置するため、および予防するための方法および組成物を提供する。さらに、本発明の組成物および方法は、他のタイプの癌、特に他の上皮細胞に関連する癌および固形腫瘍、ならびに他の肺疾患に対して適当であり得る。
ＬＣＭタンパク質およびそのフラグメント（ＬＣＭペプチド）、ＬＣＭ炭水化物抗原およびそのフラグメント、ならびにＬＣＭタンパク質およびペプチドをコードするＬＣＭ核酸分子およびそのフラグメントは、ひとまとめにして「ＬＣＭ」または「マーカー」と称される（「生物学的マーカー」、「抗原」または「標的」と交換可能に称されることがある）。
用語「タンパク質」および「ポリペプチド」は、本明細書中で交換可能に使用される。さらに、本明細書中でのタンパク質／ポリペプチドに対する言及は、典型的には、炭水化物抗原（「ＣＡ」）も包含し得る；例えば、ＬＣＭタンパク質／ポリペプチドに対する言及は、典型的には、炭水化物抗原ＣＡ２４２、ＣＡ１９−９およびＣＡ７２−４も包含し得る。例示的なＬＣＭタンパク質／ポリペプチド配列は、配列番号１〜６５として提供される（さらに、炭水化物抗原ＣＡ２４２、ＣＡ１９−９およびＣＡ７２−４もまた提供される）。「ペプチド」とは、典型的には、タンパク質／ポリペプチドのフラグメントのことを指す。したがって、ペプチドは、フラグメントと交換可能に称される。本明細書中でのタンパク質、ペプチド、炭水化物抗原、核酸分子および抗体に対する言及は、典型的には、フルサイズまたは完全長の分子に限定されるのではなく、これらの分子のフラグメントも包含し得る（特定の配列または構造が明示的に述べられていない限り）。
本明細書中で使用されるとき、「病変」（例えば、肺の病変）は、「結節」（例えば、肺結節）と交換可能に称されることがあり、そして「肺」は、「肺の」と称されることがある。
本明細書中で使用されるとき、（ＬＣＭの）「部分組み合わせ」は、（ＬＣＭの）「サブセット」と交換可能に称されることがある。
「存在量レベル」は、本明細書中で「発現レベル」または単に「レベル」または「存在量」と交換可能に称されることがある。ＬＣＭレベルの決定は、ＬＣＭを「定量化する」ことまたはＬＣＭの「定量化」と本明細書中で称されることがある。
「異なる」存在量レベルは、対応するコントロールサンプルもしくは正常サンプルまたはコントロール／正常サンプルの群（例えば、サンプルセットまたは集団）中のマーカー（例えば、ＬＣＭタンパク質または核酸）の正常な存在量レベルよりも高いかまたは低い、試験サンプル（例えば、疾患サンプル）中の同じマーカーのレベルである。したがって、例えば、「異なる」存在量レベルは、「高い」（または「増加した」）または「低い」（または「低下した」）存在量レベルを包含し得る。ＬＣＭに対する正常な存在量レベルの例は、肺癌を有しない個体におけるそのマーカーの平均存在量レベルであり、それは、例えば、特定のコントロールサンプルセットまたは肺癌を有しない個体の集団における、そのマーカーの平均存在量であり得る。正常な存在量は、対応する疾患細胞（例えば、肺癌細胞）におけるマーカーの代表的な存在量レベルと比較される、正常な細胞（例えば、正常な肺細胞）におけるマーカーの代表的な存在量レベルでもあり得る。
ＬＣＭに対する「高い」、「増加した」または「上昇した」（これらの用語は、本明細書中で交換可能に使用される）存在量レベルの例は、そのマーカーの正常な存在量レベル（例えば、肺癌を有しない個体におけるそのマーカーの平均存在量レベル）よりも少なくとも２標準偏差高い存在量レベルである。ＬＣＭに対する「低い」または「低下した」存在量レベルの例は、そのマーカーの正常な存在量レベル（例えば、肺癌を有しない個体におけるそのマーカーの平均存在量レベル）よりも少なくとも２標準偏差低い存在量レベルである。したがって、この特定の例では、肺癌を有しない個体におけるそのマーカーの平均存在量レベルよりも２標準偏差高い存在量レベルと２標準偏差低い存在量レベルとの間の存在量レベルが、正常な存在量レベルの範囲内であると考えられ得る。これらは、マーカーの存在量レベルを「高い」／「増加した」または「低い」／「低下した」と分類するために使用され得る単なる例示的なカットオフである。
代替の例示的な実施形態において、「高い」／「増加した」または「低い」／「低下した」存在量に対するカットオフは、正常な存在量レベルよりも１標準偏差超高いもしくは低い、または正常な存在量レベルよりも３標準偏差超高いもしくは低い、存在量レベル、または他の任意の所望の標準偏差であり得る。さらに代替の例示的な実施形態において、「高い」／「増加した」または「低い」／「低下した」存在量に対するカットオフは、発現比または倍率差異（ｆｏｌｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ）、例えば、２倍増加／低下、３倍増加／低下もしくは４倍増加／低下、または他の任意の所望の増加／低下の程度に直接基づき得る。さらに、正常な存在量レベルは、例えば、（例えば、所与のコントロールサンプルセットの）平均値または中央値の存在量レベルに基づき得る。「高い」／「増加した」または「低い」／「低下した」存在量レベルに対するカットオフを発展させるための他の例示的な方法は、正常な存在量レベルの範囲を決定する工程（例えば、正常な肺組織サンプルのコントロールサンプルセットにおいてマーカーのパネルを試験することによって）、およびこの正常範囲よりも高いまたは低い（またはこの正常範囲に対して所望の閾値よりも高い／低い、例えば、正常範囲内のサンプルの９５％よりも高いまたは低いなどのこの正常範囲内のサンプルの特定のパーセンテージの外側である）任意の試験サンプルを、それぞれ「高い」／「増加した」または「低い」／「低下した」と分類する工程を包含する。
マーカーの存在量レベルを「高い」／「増加した」または「低い」／「低下した」と分類するための多岐にわたるさらなるカットオフおよびこれらのカットオフを公式化するための方法は、当該分野で公知であり、そして／または当業者によって実行され得る。所与のマーカーまたはマーカーのパネルについて、様々なカットオフ（例えば、所望の特異性を維持しつつ感度を最大にするカットオフまたは所望の感度を維持しつつ特異性を最大にするカットオフ）が、適用され得る。例えば、試験サンプルを分類するために（例えば、肺癌を診断するために）使用され得るモデルをもたらすトレーニングデータセットを使用して、関与し得る種々の方法を用いることにより、サンプルを腫瘍サンプルまたは正常サンプルと分類することが、達成され得る。腫瘍／正常カットオフは、トレーニングデータセットから複数のマーカーを手動で調査することによって選択され得、そしてこれらのカットオフを適用することにより、試験サンプルが分類され得る（例えば、患者サンプルを肺癌に関して特徴づけるために）。例示的な方法としては、スプリットポイント解析（例えば、Ｍｏｒら、“Ｓｅｒｕｍ ｐｒｏｔｅｉｎ ｍａｒｋｅｒｓ ｆｏｒ ｅａｒｌｙ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ”，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２００５ Ｍａｙ ２４；１０２（２１）：７６７７−８２，本明細書中で参考として援用される）、ロジスティック回帰分析（例えば、Ｐｌａｎｑｕｅら、“Ａ ｍｕｌｔｉｐａｒａｍｅｔｒｉｃ ｓｅｒｕｍ ｋａｌｌｉｋｒｅｉｎ ｐａｎｅｌ ｆｏｒ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ ｎｏｎ−ｓｍａｌｌ ｃｅｌｌ ｌｕｎｇ ｃａｒｃｉｎｏｍａ”，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００８ Ｍａｒ １；１４（５）：１３５５−６２，本明細書中で参考として援用される）、ナイーブベイズ、多変量解析、決定木モデリング（例えば、Ｐａｔｚら、“Ｐａｎｅｌ ｏｆ ｓｅｒｕｍ ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ”，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ（２００７），２５，５５７８−５５８３）および他の分類方法（例えば、Ｄｕｄｏｉｔら、“Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ”，Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ Ｄａｔａ，２００３，Ｃｈａｐｍａｎ ＆ Ｈａｌｌ／ＣＲＣ：９３−１５８を参照のこと、本明細書中で参考として援用される）が挙げられるが、これらに限定されない。
用語「感度」および「特異性」は、本明細書中において、１つ以上のマーカーがサンプルをそれぞれ腫瘍サンプルまたは非腫瘍サンプル（非腫瘍サンプルは、「正常」、「コントロール」または「健常」サンプルと交換可能に称されることがある）と正確に分類する能力に関して使用される。「感度」は、腫瘍サンプルを正確に分類することに関するマーカーの性能を示す。「特異性」は、非腫瘍サンプルを正確に分類することに関するマーカーの性能を示す。例えば、コントロールサンプルおよび腫瘍サンプルのセットを試験するために使用されるマーカーのパネルについての９８％特異性および８５％感度は、コントロールサンプルの９８％が、そのパネルによってコントロールサンプルと正確に分類され、そして腫瘍サンプルの８５％が、そのパネルによって腫瘍サンプルと正確に分類されたことを示す。
曲線下面積（ＡＵＣ）とは、当該分野で周知である受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線の曲線下面積のことを指す（例えば、Ｐｌａｎｑｕｅら、“Ａ ｍｕｌｔｉｐａｒａｍｅｔｒｉｃ ｓｅｒｕｍ ｋａｌｌｉｋｒｅｉｎ ｐａｎｅｌ ｆｏｒ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ ｎｏｎ−ｓｍａｌｌ ｃｅｌｌ ｌｕｎｇ ｃａｒｃｉｎｏｍａ”，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００８ Ｍａｒ １；１４（５）：１３５５−６２を参照のこと、本明細書中で参考として援用される）。ＡＵＣ基準は、その完全なデータ範囲にわたって分類アルゴリズムの正確さを比較するために有用である。より大きいＡＵＣを用いる分類アルゴリズムは、不明なものを目的の２群（例えば、肺癌サンプルおよび正常サンプル）に正確に分類するより大きな能力を有する。ＲＯＣ曲線は、２集団（例えば、肺癌を有する症例および肺癌を有しないコントロール）を識別する際に特定の特色（例えば、ＬＣＭおよび／または補足的な生物医学的パラメータ）の性能をプロットするために有用である。典型的には、その集団全体（例えば、上記の症例およびコントロール）にわたる特色データを、単一の特色の値に基づいて昇順で選別する。次いで、その特色についての各値について、そのデータに対する真陽性率および偽陽性率が計算する。真陽性率は、その特色に対する値よりも大きい症例の数を数え、次いで症例の総数で除することによって決定される。偽陽性率は、その特色に対する値よりも大きいコントロールの数を数え、次いでコントロールの総数で除することによって決定される。この定義は、コントロールと比べて特色が高いシナリオのことを指すが、この定義は、コントロールと比べて特色が低いシナリオにも適用される（そのようなシナリオでは、その特色に対する値よりも低いサンプルが数えられ得る）。ＲＯＣ曲線は、単一の特色ならびに他の単一の出力について作成され得、例えば、２つ以上の特色の組み合わせが、数学的に組み合わせられる（例えば、加算、減算、乗算されるなど）ことにより、単一の合計値がもたらされ得、そしてこの単一の合計値が、ＲＯＣ曲線にプロットされ得る。さらに、複数の特色の任意の組み合わせ（ここで、この組み合わせは単一の出力値をもたらす）が、ＲＯＣ曲線にプロットされ得る。これらの特色の組み合わせが、試験結果を構成し得る。ＲＯＣ曲線は、その試験の偽陽性率（特異性）に対する試験の真陽性率（感度）のプロットである。
下記でより詳細に論じられる本発明の例示的な実施形態は、抗体、タンパク質、炭水化物抗原、免疫原性ペプチド（例えば、Ｔ細胞応答を誘導するペプチド）または他の生体分子、ならびに小分子、核酸薬剤（例えば、ＲＮＡｉおよびアンチセンス核酸薬剤）、および例えば、マーカーに結合することによって、または別途マーカーと相互作用することによって、もしくは別途マーカーに影響することによって、マーカーを調節する他の組成物（例えば、アゴニストおよびアンタゴニスト）を提供する。これらの組成物は、疾患、とりわけ癌、特に肺癌を評価、処置および予防するため、ならびに他の用途のために使用され得る。さらに、本発明は、特にこれらの組成物を用いることによって肺癌などの疾患を評価、処置および予防するための方法を提供する。ＬＣＭの機能、活性および／または発現レベルに影響することなどによってＬＣＭを調節する薬剤についてスクリーニングする方法、およびこれらのスクリーニング方法によって同定される薬剤がさらに提供される。
本発明の例示的な実施形態は、細胞の機能、とりわけ肺細胞の機能を調節する方法も提供する。特に、本発明は、細胞増殖および／またはアポトーシスを調節する方法を提供する。例えば、癌／腫瘍細胞に対して、本発明は、細胞増殖を阻害する方法および／またはアポトーシスを刺激する方法を提供する。そのような方法は、疾患、とりわけ癌、特に肺癌の処置に適用され得る。ある特定の例示的な実施形態において、本発明は、ＬＣＭを標的化することにより、肺癌細胞の増殖を阻害することによって、および／または肺癌細胞のアポトーシスを刺激することによって、肺癌を処置する方法を提供する。
本発明の例示的な実施形態は、特定の処置に対する有効性または応答を判定するかまたは予測する方法、および個体のための処置、特に肺癌の処置を選択する方法をさらに提供する。例えば、癌の処置などの特定の処置に対しておおよそ応答性（感受性）であるか、または抵抗性である細胞（例えば、肺癌細胞）によって差次的に発現されるマーカーは、その処置に対する有効性または応答を判定するためもしくは予測するために、または個体に対する処置を選択するために、有用である。
本発明の例示的な実施形態は、治療薬の臨床試験、特に肺癌または他の癌に対する臨床試験のための個体を選択する方法も提供する。例えば、上記マーカーを用いることにより、特定の治療薬に反応する可能性が高い、臨床試験に含めるための個体が同定され得る。あるいは、上記マーカーを用いることにより、特定の治療薬に反応する可能性が低いか、または特定の治療薬から毒性の副作用もしくは他の望ましくない副作用を経験する可能性が高い個体が臨床試験から排除され得る。さらに、特定の治療薬に反応する可能性が低いと判定されるそのような個体は、潜在的に彼らの利益になり得る異なる治療薬の臨床試験に含めるために選択され得る。
ある特定の例示的な実施形態において、本明細書中に記載される様々な個別のＬＣＭおよびＬＣＭパネルは、組成物として提供される。例えば、ある特定の実施形態において、ＬＣＭパネルのメンバーの各々、および／またはこれらのメンバーの各々を検出するための試薬は、例えば、ＥＬＩＳＡアッセイによってＬＣＭパネルの各メンバーを検出するための試薬の形態で、個別の組成物として提供される（これは、「ＥＬＩＳＡ試薬」と本明細書中で称されることがある）。さらに、ある特定の実施形態において、パネルの複数のメンバーまたはパネル全体（および／またはこれらの複数のメンバーの各々を検出するための試薬）を含む組成物は、例えば、パネルの複数のメンバーまたはパネル全体を検出するための試薬（例えば、ＥＬＩＳＡ試薬）を含むキットの形態で、提供される。本発明の他の組成物は、アレイ、または複数のＬＣＭ、もしくは基質に結合された複数のＬＣＭを検出するための複数の試薬（例えば、抗体）を有する他のプラットフォームを含む。本発明の様々な組成物において、ＬＣＭまたはＬＣＭを検出するための試薬（例えば、抗体）は、検出可能部分（例えば、蛍光標識）で標識される。
例示的なＬＣＭの組み合わせ／パネル
例えば、１２人の肺癌患者および１２人の健常コントロール個体由来の血清のパネルを用いたとき、ＴＦＰＩ、ＳＣＣ、ＣＥＡ、ＣＡ２４２、ＭＮ／ＣＡＩＸ、ＯＰＮ、Ｃｙｆｒａ２１−１およびＭＩＦから構成される８つのマーカーの群（図２）は、細気管支肺胞上皮癌サンプル（これは、そのパネル内の他のサンプルと生物学的に異なる）を除くすべての癌サンプルを検出し、そしてこれらのマーカーのうちのいくつかだけが、健常コントロールサンプルにおいて閾値より高いレベルで検出された。簡易アルゴリズムを適用したとき（すなわち、２標準偏差以上のマーカーが、上で述べた判定基準を用いて「陽性」とスコア付けされたとき）、この８つのマーカーの群は、肺癌患者由来の１２個の血清および健常コントロール由来の１２個の血清の間において９２％の感度および１００％の特異性を有した（偽陽性なし、１１個の真陽性、１つの偽陰性および１２個の真陰性）（図３）。
以下のマーカー：ＳＬＰＩ、ＴＦＰＩ、ＯＰＮ、ＭＩＦ、ＴＩＭＰ１およびＭＭＰ２（図４）から構成される代替パネルを設定した。これらのマーカーのいずれかまたはすべては、以下のマーカー：ＣＡ２４２、ＳＣＣ、ＣＥＡ、ＮＳＥ、ＣＡ７２−４、ＣＡ１９−９、Ｃｙｆｒａ２１−１およびＭＮ／ＣＡＩＸ（図４）のいずれかまたはすべてとの任意の組み合わせにおいても使用され得る。
さらに、Ｃｙｆｒａ２１−１、ＴＩＭＰ−１、ＭＩＦ、ＴＦＰＩ、ＣＥＡおよびＯＰＮから構成される６マーカーパネルも設定した（図５）。この６マーカーパネルは、４４個の肺腫瘍血清および４４個の正常血清のより大きな群に対して試験されたとき、９５％特異性において７５％感度をもたらした。
さらに、Ｃｙｆｒａ、ＭＩＦ、ＴＩＭＰ１、ＴＦＰＩ、ＣＥＡ、ＯＰＮ、ＳＣＣ、ＳＬＰＩ、ＨＮＰ−１、ＧＲＰおよびＣＡ２４２から構成される１１マーカーパネルも設計した（図６）。この１１マーカーパネルは、３９個の肺腫瘍血清および３９個の正常血清の群に対して試験されたとき、コントロールに対して９８％特異性（３８／３９コントロール）をもたらし、腫瘍血清に対して８５％感度（３３／３９腫瘍）をもたらした（図６）。
表３は、様々な１１マーカーパネルのさらなる例を示している。具体的には、表３は、肺癌を検出するために少なくとも９８％の特異性および８２％の感度を有する１１マーカーの３５個の異なるパネルを提供している（各横列の１１マーカーがパネルを表している）。７個のマーカー（ＳＬＰＩ、ＴＩＭＰ１、ＴＦＰＩ、ＳＣＣ、ＯＰＮ、ＣＥＡおよびＣＡ２４２）が、これらのパネルの３５個すべてに見られ、ＧＲＰは、この３５個のパネルのうちの３３個に見られ、ＭＩＦは、この３５個のパネルのうちの２９個に見られ、そしてＮＳＥおよびＨＮＰ−１の各々は、この３５個のパネルのうちの１５個に見られる。ＡＭＢＰ、Ｃｙｆｒａ、ＭＭＰ２、Ｃａ７２−４、Ｃａ１９−９およびＣＡＩＸの各々は、表３に示されるように、これらのパネルの７〜９個に見られる。
さらに、Ｃｙｆｒａ、ＳＬＰＩ、ＴＩＭＰ１、ＳＣＣ、ＴＦＰＩ、ＣＥＡＣＡＭ５、ＭＭＰ２、ＯＰＮおよびＭＤＫから構成される９マーカーパネルも設計した（例えば、図１７および表５）。この９マーカーパネルは、９８％の特異性（４９／５０コントロール）および９６％感度（４８／５０腫瘍）を証明した（図１７）。さらに、Ｃｙｆｒａ、ＳＬＰＩ、ＴＩＭＰ１、ＴＦＰＩ、ＣＥＡＣＡＭ５およびＭＤＫ（表５）から構成されるこの９マーカーパネルの６マーカーサブセットも設計した。
本明細書中でＬＣＭと称され、そして単独で、または本明細書中に記載される他のＬＣＭのいずれかと任意の組み合わせで併用して使用され得る、他のマーカーは、「自分で作った（ｓｅｌｆ−ｍａｄｅ）」抗原の群を含むか、または「自己抗体」は、様々な疾患、特に癌を有する患者の循環中にしばしば見られる（表２および図１１〜１４）。これらの自己抗体マーカーの例としては、以下：ＫＬＫＢ１、ＣＦＬ１、ＬＧＡＧＳ１、ＥＥＦ１Ｇ、ＲＴＮ４、ＡＬＤＯＡ、ＨＳＰＣＡ、ＰＡＢＰＣ４、ＮＡＧＫ、ＣＦＨＬ１、ＣＳＦ１ＲおよびＲＡＮＢＰ２（図１２）、ならびに表２に示されているような他の自己抗体マーカーが挙げられる。これらのような自己抗体ＬＣＭの検出は、他のＬＣＭを補完し得、そして特に肺癌を評価するためのＬＣＭパネルの性能を高め得る。
以下は、ＬＣＭの例示的なパネルである。本発明の様々な例示的な実施形態は、例えば、これらのパネルに基づいた組成物、および肺癌の診断などの特に肺癌に関連する用途のためにこれらのパネルを使用する方法（例えば、コントロール／正常レベルと比べて、異なるレベル（例えば、高レベルまたは低レベル）の、パネル内の複数のマーカーまたはパネル内のすべてのマーカーが、肺癌の存在を示唆し得る）を提供する。これらの例示的なパネルは、以下のマーカーの組み合わせからなり得るか、それらから本質的になり得るか、またはそれらを含み得る：
１）Ｃｙｆｒａ、ＳＬＰＩ、ＴＩＭＰ１、ＳＣＣ、ＴＦＰＩ、ＣＥＡＣＡＭ５、ＭＭＰ２、ＯＰＮおよびＭＤＫ（これらは、本明細書中で「９マーカーパネル」と称されることがあり、図１７および表５に示されている）。
２）Ｃｙｆｒａ、ＳＬＰＩ、ＴＩＭＰ１、ＴＦＰＩ、ＣＥＡＣＡＭ５およびＭＤＫ（これらは、本明細書中で「９マーカーパネルの６マーカーサブセット」と称されることがあり、表５に示されている）。
３）１つ以上の他のマーカーと必要に応じて併用され得る、Ｃｙｆｒａ、ＳＬＰＩ、ＴＩＭＰ１、ＳＣＣ、ＴＦＰＩ、ＣＥＡＣＡＭ５、ＭＭＰ２、ＯＰＮおよびＭＤＫ（「９マーカーパネル」）（その１つ以上の他のマーカーは、この９マーカーパネルに加えられ得、そして／またはこの９マーカーパネルの１つ以上のメンバーを置き換え得る）。これらの他のマーカーは、表１〜２（配列番号１〜６５ならびに炭水化物抗原ＣＡ２４２、ＣＡ１９−９およびＣＡ７２−４）、表４、図１および図１２に示されるマーカー、特に表４に示されるマーカーからなる群から必要に応じて選択され得る。
４）１つ以上の他のマーカーと必要に応じて併用され得る、Ｃｙｆｒａ、ＳＬＰＩ、ＴＩＭＰ１、ＴＦＰＩ、ＣＥＡＣＡＭ５およびＭＤＫ（「９マーカーパネルの６マーカーサブセット」）（その１つ以上の他のマーカーは、この９マーカーパネルの６マーカーサブセットに加えられ得、そして／またはこの９マーカーパネルの６マーカーサブセットの１つ以上のメンバーを置き換え得る）。これらの他のマーカーは、表１〜２（配列番号１〜６５ならびに炭水化物抗原ＣＡ２４２、ＣＡ１９−９およびＣＡ７２−４）、表４、図１および図１２に示されるマーカー、特に表４に示されるマーカーからなる群から必要に応じて選択され得る。
５）表５に提供されるパネル（単一マーカーを含み得る）のうちのいずれか（これは、９マーカーパネルおよびそのすべての部分組み合わせを提供する；表５の各横列が、異なるパネルを表す）。これらは、１つ以上の他のマーカーと必要に応じて併用され得（これらの１つ以上の他のマーカーは、表５における任意のパネルに加えられ得、そして／または表５における任意のパネルの１つ以上のメンバーを置き換え得る）、ここで、これらの他のマーカーは、表１〜２（配列番号１〜６５ならびに炭水化物抗原ＣＡ２４２、ＣＡ１９−９およびＣＡ７２−４）、表４、図１および図１２に示されるマーカー、特に表４に示されるマーカーからなる群から必要に応じて選択され得る。
６）特に、正常（すなわち、コントロール／健常）サンプルに対して肺腫瘍サンプルを識別するための方法において使用するための、表５または表６に提供されるパネルのうちのいずれか（特に、Ｃｙｆｒａ、ＳＬＰＩ、ＴＩＭＰ１、ＳＣＣ、ＴＦＰＩ、ＣＥＡＣＡＭ５、ＭＭＰ２、ＯＰＮおよびＭＤＫの９マーカーパネルならびにそのサブセット、そして表６に示されるパネルなどの１つ以上の追加のマーカーをさらに含むこの９マーカーパネルまたはそのサブセットを含むパネル）。これらのパネルは、例えば、個体が肺癌を有するか否かを判定する（すなわち、肺癌を検出する）ために特に有用である。
７）特に扁平上皮癌に対して腺癌を識別するための方法において使用するための、表７に提供されるパネルのうちのいずれか（特に、Ｃｙｆｒａ、ＳＬＰＩ、ＴＩＭＰ１、ＳＣＣ、ＴＦＰＩ、ＣＥＡＣＡＭ５、ＭＭＰ２、ＯＰＮおよびＭＤＫの９マーカーパネルならびにそのサブセット）。これらのパネルは、例えば、個体の肺癌が、腺癌であるか、または扁平上皮癌であるかを判定するために特に有用である。
８）特に、任意の病期の肺癌（例えば、第Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩおよびＩＶ期のいずれか）、特に、肺癌の初期（第Ｉ期または第ＩＩ期）と後期（第ＩＩＩ期または第ＩＶ期）とを識別するための、とりわけ、第Ｉ期の肺癌と第ＩＩＩ期の肺癌とを識別するための方法において使用するための、表８に提供されるパネルのうちのいずれか（特に、Ｃｙｆｒａ、ＳＬＰＩ、ＴＩＭＰ１、ＳＣＣ、ＴＦＰＩ、ＣＥＡＣＡＭ５、ＭＭＰ２、ＯＰＮおよびＭＤＫの９マーカーパネルならびにそのサブセット）。これらのパネルは、例えば、個体の肺癌の病期を判定するために特に有用である。
９）特に、他のタイプの肺癌（例えば、ＮＳＣＬＣ）に対してＳＣＬＣを識別するための方法において使用するための、表９に提供されるパネルのうちのいずれか。これらのパネルは、例えば、個体の肺癌がＳＣＬＣであるか、またはＮＳＣＬＣであるかを判定するために特に有用である。
１０）特に、良性の肺の病変に対して悪性の肺腫瘍を識別するための方法において使用するための、表１０に提供されるパネルのうちのいずれか（特に、Ｃｙｆｒａ、ＳＬＰＩ、ＴＩＭＰ１、ＳＣＣ、ＴＦＰＩ、ＣＥＡＣＡＭ５、ＭＭＰ２、ＯＰＮおよびＭＤＫの９マーカーパネルならびにそのサブセット）。これらのパネルは、例えば、個体において同定された肺の病変（例えば、ＣＴスクリーニングによって）が、悪性腫瘍であるか、または良性の病変であるかを判定するために特に有用である。
１１）特に、正常（すなわち、コントロール／健常）サンプルに対してＳＣＬＣを識別するための方法において使用するための、表１１に提供されるパネルのうちのいずれか。これらのパネルは、例えば、個体がＳＣＬＣを有するか否かを判定するために特に有用である。
１２）特に、正常（すなわち、コントロール／健常）サンプルに対して肺癌（ＳＣＬＣとＮＳＣＬＣの両方を含む）を識別するための方法において使用するための、表１２に提供されるパネルのうちのいずれか。これらのパネルは、例えば、個体が、ＳＣＬＣまたはＮＳＣＬＣなどの肺癌を有するか否かを判定するために特に有用である。
１３）特に、肺腫瘍の退縮および／または再発をモニターする方法において使用するための、図１９に提供される１１マーカーのいずれかまたはすべてを含むパネル（およびそのサブセット、ならびにこれらの１１マーカーまたは１つ以上の追加のマーカーをさらに含むそのサブセットを含むパネル）。これらのパネルは、例えば、肺腫瘍の退縮および／または再発をモニターするために特に有用である。
１４）Ｃｙｆｒａ２１−１、ＭＩＦ、ＴＩＭＰ１、ＴＦＰＩ、ＣＥＡ、ＯＰＮ、ＳＣＣ、ＳＬＰＩ、ＨＮＰ−１、ＧＲＰおよびＣＡ２４２（これらは、本明細書中で「１１マーカーパネル」と称されることがあり、図６に示されている）。
１５）ＴＦＰＩ、ＣＥＡ、ＭＩＦ、ＴＩＭＰ１、ＯＰＮおよびＣｙｆｒａ２１−１（これらは、本明細書中で「６マーカーパネル」と称されることがあり、図５に示されている）。
１６）ＴＦＰＩ、ＳＣＣ、ＣＥＡ、ＣＡ２４２、ＭＮ／ＣＡＩＸ、ＯＰＮ、Ｃｙｆｒａ２１−１およびＭＩＦ（これらは、本明細書中で「８マーカーパネル」と称されることがあり、図２〜３に示されている）。１７）ＴＦＰＩ、ＳＬＰＩ、ＯＰＮ、ＭＩＦ、ＴＩＭＰ１およびＭＭＰ２（これらのいずれかまたはすべては、必要に応じて、以下の追加のマーカー：ＣＡ２４２、ＳＣＣ、ＣＥＡ、ＮＳＥ、ＣＡ７２４、ＣＡ１９９、Ｃｙｆｒａ２１−１およびＭＮ／ＣＡＩＸのいずれかまたはすべてと併用して使用され得る（図４を参照のこと））。
１８）ＴＦＰＩ、ＴＩＭＰ１、ＣＥＡおよびＯＰＮ（図７を参照のこと）。
１９）ＴＦＰＩ、ＣＥＡおよびＯＰＮ（図７を参照のこと）。
２０）ＣＥＡおよびＯＰＮ（図７を参照のこと）。
２１）ＴＦＰＩ、ＭＩＦ、ＴＩＭＰ１、ＣＥＡおよびＯＰＮ（図９を参照のこと）。
２２）ＴＩＭＰ１、ＮＳＥ、ＣＥＡおよびＯＰＮ（図１０を参照のこと）。
２３）ＴＦＰＩ、ＣＥＡ、ＴＩＭＰ−１、ＮＳＥ、ＳＬＰＩ、ＳＣＣ、Ｃｙｆｒａ２１−１およびＭＩＦ（これらのいずれかまたはすべては、必要に応じて、以下の自己抗体マーカー：ｐ５３、ＫＬＫＢ１、ＬＧＡＬＳ１、ＣＦＬＮ、ＥＥＦ１Ｇ、ＨＳＰ９０α、ＲＴＮ４、ＡＬＤＯＡ、ＧＬＧ１、ＰＴＫ７、ＥＦＥＭＰ１、ＣＤ９８、ＣＨＧＢ、Ｂ７Ｈ３およびＣＥＡＣＡＭ１のいずれかまたはすべてと併用され得る（図１１を参照のこと）。２４）ＴＦＰＩ、ＳＬＰＩ、ＴＦＰＩ２、ＣＥＡおよびＴＩＭＰ１。
２５）ＴＦＰＩ、ＳＬＰＩおよびＴＩＭＰ１。
２６）ＫＬＫＢ１およびコフィリン（ＣＦＬＮ）（図１３を参照のこと）。
２７）ＫＬＫＢ１、コフィリン（ＣＦＬＮ）およびＣＡ１２（図１４を参照のこと）。
２８）単独の、または表１〜２（配列番号１〜６５ならびに炭水化物抗原ＣＡ２４２、ＣＡ１９−９およびＣＡ７２−４）、表４、図１および図１２に示されるマーカーからなる群から必要に応じて選択され得る１つ以上の他のマーカーと組み合わされる、ＴＦＰＩ。２９）単独で、または表１〜２（配列番号１〜６５ならびに炭水化物抗原ＣＡ２４２、ＣＡ１９−９およびＣＡ７２−４）、表４、図１および図１２に示されるマーカーからなる群から必要に応じて選択され得る１つ以上の他のマーカーと組み合わされる、ディフェンシン（ＤＥＦＡ１、ＨＮＰ−１）、ＩＣＡＭ３、ＣＴＧＦ、ＬＣＮ２、バイグリカンおよびＨＧＦからなる群から選択される１つ以上のマーカー。
３０）単独で、または表１〜２（配列番号１〜６５ならびに炭水化物抗原ＣＡ２４２、ＣＡ１９−９およびＣＡ７２−４）、表４、図１および図１２に示されるマーカーからなる群から必要に応じて選択され得る１つ以上の他のマーカーと組み合わされる、ＴＦＰＩ、ディフェンシン、ＩＣＡＭ３、ＣＴＧＦ、ＬＣＮ２、バイグリカンおよびＨＧＦからなる群から選択される２つ以上のマーカー。
３１）表２（配列番号３９〜５５）および／または図１２に示される１つ以上の自己抗体マーカーと併用される、表１（配列番号１〜３８および５６〜６５ならびに炭水化物抗原ＣＡ２４２、ＣＡ１９−９およびＣＡ７２−４）および／または図１に示される１つ以上のマーカー。
３２）表３に提供される１１マーカーパネルのうちのいずれか（表３の各横列は、異なる１１マーカーパネルを表している）。
３３）必要に応じてＧＲＰおよび／またはＭＩＦと併用され得る、ＳＬＰＩ、ＴＩＭＰ１、ＴＦＰＩ、ＳＣＣ、ＯＰＮ、ＣＥＡおよびＣＡ２４２（表３を参照のこと）。
３４）ＳＬＰＩ、ＴＩＭＰ１、ＴＦＰＩ、ＳＣＣ、ＯＰＮ、ＣＥＡおよびＣＡ２４２（これらは、必要に応じて、ＧＲＰおよび／またはＭＩＦと併用され得、そして必要に応じてさらにＨＮＰ−１および／またはＮＳＥと併用され得る（表３を参照のこと）。
３５）ＧＲＰ、ＭＩＦ、ＨＮＰ−１およびＮＳＥのいずれかまたはすべてと必要に応じて併用され得、そしてさらに、ＣＡＩＸ、Ｃａ１９−９、Ｃａ７２−４、ＭＭＰ２、Ｃｙｆｒａ２１−１およびＡＭＢＰのいずれかまたはすべてと必要に応じて併用され得る、ＳＬＰＩ、ＴＩＭＰ１、ＴＦＰＩ、ＳＣＣ、ＯＰＮ、ＣＥＡおよびＣＡ２４２（表３を参照のこと）。
３６）必要に応じてＧＲＰ、ＭＩＦ、ＨＮＰ−１、ＮＳＥおよびＣｙｆｒａ２１−１のいずれかまたはすべてと併用され得る、ＳＬＰＩ、ＴＩＭＰ１、ＴＦＰＩ、ＳＣＣ、ＯＰＮ、ＣＥＡおよびＣＡ２４２。
３７）単独で、または表１〜２（配列番号１〜６５ならびに炭水化物抗原ＣＡ２４２、ＣＡ１９−９およびＣＡ７２−４）、表４、図１および図１２に示されるマーカーからなる群から必要に応じて選択され得る１つ以上の他のマーカーと組み合わされる、ビスファチン、ソルチリンおよびミッドカインからなる群から選択される１つ以上のマーカー。
ＬＣＭの例示的な用途
本発明のある特定の例示的な実施形態は、免疫学的方法または他の方法によって血清中などの循環中のＬＣＭの量を測定することによって個体における肺癌の存在を検出する方法に関する。これらのＬＣＭは、例えば、肺癌を有しない個体（肺癌を有しない個体は、本明細書中で「正常」、「コントロール」または「健常」個体と交換可能に称される）と比べて、肺癌を有する個体において差次的に発現される（過剰発現されるか、または過小発現される）。「正常」発現レベルからの変動または差次的な発現の検出は、例えば、肺癌の早期診断のために、良性肺の病変と悪性の肺の病変（例えば、ＣＴスキャンにおいて観察された病変）を識別するために、肺癌の再発をモニターするために、または他の臨床的適応のために、使用され得る。
ＬＣＭは、肺癌に対する種々の臨床的適応において使用され得、その臨床的に適用としては、肺癌の検出（例えば、高リスクの個体または集団において）、肺癌の特徴付け（例えば、肺癌のタイプ、サブタイプまたは病期の判定）（例えば、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）と小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）との識別および／または腺癌と扁平上皮癌との識別（または、別途、組織病理学を容易にすること））、肺の病変が良性の病変であるかまたは悪性の肺腫瘍であるかの判定、肺癌の予後判定、肺癌の進行または緩解のモニター、肺癌の再発についてのモニター、転移のモニター、処置の選択、治療薬または他の処置に対する応答のモニター、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）スクリーニングに対する患者の層別化（例えば、肺癌のリスクが高く、それによりおそらくスパイラルＣＴスクリーニングの恩恵を受ける患者を同定するので、ＣＴの陽性予測値が上昇する）、ＬＣＭ試験と、喫煙歴などの補足的な生物医学的パラメータまたは結節のサイズ、形態などとの組み合わせ（例えば、それにより、ＣＴ試験のみまたはＬＣＭ試験のみと比べて診断能の高いアッセイが提供される）、肺結節を悪性または良性と診断することの促進、肺癌病変がＣＴにおいて観察されたときになされる臨床判断の促進（例えば、その病変が、低リスクであると考えられる場合に、例えば、病変のサイズのカテゴリー化を伴うかもしくは伴わないＬＣＭに基づいた試験が、陰性である場合に、ＣＴスキャンの反復を命ずること、またはその病変が、中〜高リスクであると考えられる場合に、例えば、病変のサイズのカテゴリー化を伴うかもしくは伴わないＬＣＭに基づいた試験が、陽性である場合に、生検を考慮すること）、および臨床経過観察に関する判断（例えば、ＣＴにおいて非石灰化病変を観察した後に、ＣＴスキャンの反復、細針生検または開胸術を実施するか否か）の促進が挙げられるが、これらに限定されない。ＬＣＭ試験は、ＣＴスクリーニングのみに対して陽性予測値（ＰＰＶ）を改善し得る。ＣＴスクリーニングと併せた有用性に加えて、ＬＣＭは、胸部Ｘ線などの肺癌に対して用いられる他の任意のイメージング様式と併せても使用され得る。さらに、ＬＣＭは、肺癌の徴候がイメージング様式もしくは他の臨床上相関するものによって検出される前または症状が現れる前に、ある特定のこれらの用途が達成されることを可能にするために有用であり得る。
どのようにＬＣＭが肺癌の診断に有用であり得るのかという例として、肺癌を有すると知られていない個体における１つ以上のＬＣＭの高いまたは低い存在量レベル（すなわち、「異なる」存在量レベル）が、その個体が肺癌を有することを示唆し得ることにより、処置が最も効果的である疾患の初期において、あるいは、肺癌が他の手段によって検出される前または症状が現れる前に、肺癌の早期の検出が可能になる。肺癌の経過中の１つ以上のＬＣＭの存在量の増加は、肺癌の進行、例えば、肺腫瘍が、成長および／または転移していること（したがって、不良な予後）を示唆し得るのに対し、１つ以上のＬＣＭの存在量の減少は、肺癌の緩解、例えば、肺腫瘍が縮んでいる（したがって、良好な予後）を示唆し得る。同様に、肺癌の処置の過程における１つ以上のＬＣＭの存在量の増加は、その肺癌が進行していることを示唆し得、ゆえに、その処置が効果的でないことを示唆し得るのに対し、肺癌の処置の過程における１つ以上のＬＣＭの存在量の減少は、肺癌の緩解を示唆し得、ゆえに、その処置がうまく作用していることを示唆し得る。さらに、個体の肺癌が見かけ上治癒した後の１つ以上のＬＣＭの存在量の増加または減少は、肺癌の再発を示唆し得る。このような状況では、例えば、肺癌の再発が後に検出される場合よりも早い段階で、その個体における治療が再開され得る（または、その患者の治療が維持されている場合は、例えば投薬の量および／または頻度を高めるように治療レジメンが改変される）。さらに、個体における１つ以上のＬＣＭの異なる存在量レベルは、特定の治療薬に対する個体の応答を予測し得る。肺癌の再発または進行についてモニターする際、ＬＣＭレベルの変化は、肺癌の活性を測定するためなどのイメージングの反復（例えば、ＣＴスキャンの反復）の必要性、または処置の変更の必要性を示唆し得る。
ＬＣＭの検出は、例えば、処置の成功を評価するため、または処置後の肺癌の緩解、再発および／もしくは進行（転移を含む）をモニターするために、肺癌の処置の後に、または肺癌の処置と同時に、特に有用であり得る。肺癌の処置としては、例えば、患者への治療薬の投与、手術（例えば、肺腫瘍の少なくとも一部の外科的切除）、放射線治療、または当該分野において用いられる他の任意のタイプの肺癌の処置、およびこれらの処置の任意の組み合わせが挙げられ得る。例えば、ＬＣＭは、処置後に少なくとも一度検出され得るか、もしくは処置後に複数回（例えば、定期的な間隔で）検出され得るか、または処置の前と後の両方において検出され得る。ＬＣＭの異なる存在量レベル（例えば、処置前のＬＣＭの存在量レベルと比べたときの処置後のＬＣＭの存在量レベルの増加もしくは減少、または処置後に前の時点におけるＬＣＭの存在量レベルと比べたときの処置後の後の時点におけるＬＣＭの存在量レベルの増加もしくは減少、またはＬＣＭの正常レベルと比べたときの処置後の単一の時点におけるＬＣＭの異なる存在量レベル）は、肺癌の進行、緩解または再発を示唆し得る。
具体的な例として、手術前および手術後（例えば、手術の２〜４週間後）の血清サンプルにおけるＬＣＭレベルのＥＬＩＳＡ解析が行われ得る。手術前サンプルと比べて手術後サンプルにおけるＬＣＭのレベルの上昇は、肺癌の進行（例えば、手術の失敗）を示唆し得るのに対し、手術前サンプルと比べて手術後サンプルにおけるＬＣＭのレベルの低下は、肺癌の後退（例えば、その手術が首尾よく肺腫瘍を除去したこと）を示唆し得る。ＬＣＭレベルの同様の解析は、他の形態の処置の前および後（例えば、放射線治療または治療薬もしくは癌ワクチンの投与の前および後）に行われ得る。
独立型のスクリーニング試験としてＬＣＭレベルを試験する有用性に加えて、ＬＣＭレベルの試験は、ＣＴスクリーニングと併せて行われ得る。例えば、ＬＣＭは、肺癌のリスクのある大きな無症候集団（例えば、喫煙者）をスクリーニングするなどのために、ＣＴスクリーニングの実行についての医学的および経済的な正当化を容易にし得る。例えば、ＬＣＭレベルの「ＣＴ前」試験は、ＣＴスクリーニングに備えて高リスク個体を層別化するために（例えば、ＬＣＭレベルに基づいて肺癌のリスクが最も高い個体およびＣＴスクリーニングについて優先させるべき個体を同定するために）使用され得る。ＣＴ試験が実行される場合、１つ以上のＬＣＭのＬＣＭレベル（例えば、血清サンプルのイムノアッセイによって測定される）が、測定され得、そしてそのスコアが、補足的な生物医学的パラメータ（例えば、ＣＴ試験によって測定される腫瘍パラメータ）に対するスコアに加えられることにより、例えばＣＴ試験単独またはＬＣＭ試験単独よりも陽性予測値（ＰＰＶ）を高めるために、複合スコアが作成され得る。ＬＣＭレベルを測定するための「ＣＴ後」イムノアッセイパネルは、ＣＴ（または他のイメージング様式）によって観察された肺の病変が悪性または良性である可能性を判定するために使用され得る。
ＬＣＭの検出は、ＣＴ後試験に有用であり得る。例えば、ＬＣＭ試験は、ＣＴ単独よりも、かなりの数の偽陽性試験結果を排除し得る。さらに、ＬＣＭ試験は、患者の処置を促進し得る。例として、肺腫瘍が５ｍｍ未満のサイズである場合、ＬＣＭ試験の結果によって、より早い時点で患者は「経過観察（ｗａｔｃｈ ａｎｄ ｗａｉｔ）」から生検に移され得、肺腫瘍が、５〜９ｍｍである場合、ＬＣＭ試験によって、偽陽性スキャンから生検または開胸術が排除され得、そして肺腫瘍が１０ｍｍより大きい場合、ＬＣＭ試験によって、良性の病変を有するこれらの患者の部分集団から手術が排除され得る。結節の生検に関連した有意な罹患率が存在し、また、結節の部位に応じて結節組織を得ることが困難であるので、ＬＣＭ試験に基づいて一部の患者において生検の必要性を排除することは、有益であり得る。同様に、実際は良性である病変を有する患者などの一部の患者において手術の必要性を排除することは、手術に関連する不必要なリスクおよびコストを回避し得る。
ＣＴスクリーニングと併せたＬＣＭレベルの試験（例えば、ＣＴスキャンにおいて観察された肺結節のサイズまたは他の特徴と併せてＬＣＭレベルを評価すること）に加えて、ＬＣＭに関連する情報は、他のタイプのデータ、特に、肺癌に対する個体のリスク（例えば、患者の病歴、症状、癌の家族歴、その個体が喫煙者であるか否かなどの危険因子および／または他の生物学的マーカーの状態など）を示唆するデータと併せて評価され得る。これらの様々なデータは、コンピュータまたは他の装置／デバイスに組み入れられ得るコンピュータプログラム／ソフトウェアなどの自動化された方法によって評価され得る。
本明細書中に記載される様々な方法（例えば、個体中のＬＣＭレベルを肺癌について変化した（例えば、増加または減少した）リスク（または変化しないリスク）と相関させること）は、自動化された方法によって（例えば、本明細書中に記載される方法のいずれかを実施するようにプログラムされたコンピュータ（または他の装置／デバイス（例えば、生物医学的デバイス、研究室の器具類またはコンピュータプロセッサを有する他の装置／デバイス））を使用することによって）行われ得る。例えば、コンピュータソフトウェア（これは、本明細書中でコンピュータプログラムと交換可能に称されることがある）は、個体中のＬＣＭのレベルを、その個体に対する肺癌の変化した（例えば、増加または減少した）リスク（または変化しないリスク）と相関させる工程を実施し得る。したがって、本発明のある特定の実施形態は、本明細書中に記載される方法のいずれかを実施するようにプログラムされたコンピュータ（または他の装置／デバイス）を提供する。
ＬＣＭは、イメージング試験においても使用され得る。例えば、イメージング剤がＬＣＭに結合され得、それを使用することにより、他の用途の中でも、肺癌の診断に役立ち得るか、疾患の進行／緩解または転移がモニターされ得るか、疾患の再発がモニターされ得るか、または治療に対する応答がモニターされ得る。
ＬＣＭは、種々のプラットフォームを用いて検出され得る。例えば、ＬＣＭは、シングルプレックス（ｓｉｎｇｌｅｐｌｅｘ）ＥＬＩＳＡ、超高感度検出技術、マルチプレックス（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ）フォーマットおよび／または自動免疫アナライザーを用いて検出され得る。
血清中のＬＣＭの検出に加えて、ＬＣＭは、例えば、血漿および気管支洗浄液（ｂｒｏｎｃｈｉａｌ ｌａｖａｇｅ）中でも検出され得る。
ＬＣＭは、ファーマコプロテオミクスまたはファーマコゲノミクスの適用のために使用され得る；例えば、ＬＣＭの検出は、処置の選択または層別化のために使用され得る。例えば、処置（例えば、特定の治療薬）に対して抵抗性である腫瘍細胞および処置に対して感受性である腫瘍細胞におけるＬＣＭの差次的な発現は、その処置に対する個体の肺癌の抵抗性または感受性を予測するために使用され得る。具体的な例として、ＣＴＧＦは、化学療法剤のトポテカンに対して抵抗性である細胞株によって高レベルで分泌される。対照的に、ＴＩＭＰ１、ＴＦＰＩおよびＴＩＭＰ２は、化学療法剤のイレッサ（Ｉｒｅｓｓａ）に対して感受性である細胞株によって高レベルで分泌される。ＬＣＭは、特定の治療薬に対する処置応答マーカーとしても使用され得る。例えば、ある特定のＬＣＭは、シスプラチンまたはイレッサの処置応答の代用マーカーとして使用され得る。
したがって、肺癌を有する個体のＬＣＭプロファイルを用いることにより、その特定の個体に対してどの処置が最も適しているかを判定することができる。例えば、ある個体に対して、その個体の肺癌が抵抗性であると予測される処置ではなく、その個体の肺癌が感受性であると予測される処置が選択され得る。さらなる例として、ＬＣＭレベルは、治療の選択肢を適合させるために（例えば、肺癌のその特定のサブタイプにとって最も適する特定の治療薬または特定の形態の処置（例えば、化学療法、手術または放射線治療）を選択するために）、肺癌のタイプ（例えば、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）に対して非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、扁平上皮癌に対して腺癌、異なる病期の肺癌または他の肺癌の特徴）を識別するために医療従事者によって使用され得る。
表５〜６および１１〜１２は、他の肺癌に関連する用途の中でも、肺癌の診断／検出に特に適切なパネルを提供している。例えば、表５および６は、正常（すなわち、コントロール／健常）サンプルに対する肺腫瘍サンプルの識別に特に適切なＬＣＭパネルを提供しており、表１１は、正常サンプルに対するＳＣＬＣの識別に特に適切なＬＣＭパネルを提供しており、表１２は、正常サンプルに対する肺癌（ＳＣＬＣとＮＳＣＬＣの両方を含む）の識別に特に適切なＬＣＭパネルを提供している。
本明細書中に開示されるＬＣＭおよび様々な例示的なＬＣＭパネルのいずれか（例えば、表５〜６に提供されるパネル（例えば、９マーカーパネルまたはこの９マーカーパネルの６マーカーサブセット）ならびに表１〜２（配列番号１〜６５ならびに炭水化物抗原ＣＡ２４２、ＣＡ１９−９およびＣＡ７２−４）、表４、図１および図１２に提供される任意のＬＣＭ、およびこれらのＬＣＭの１つ以上を含む任意のパネル、特に、表４に提供される１つ以上のマーカーを含むパネルのうちのいずれか）が、本明細書中に開示される様々な肺癌に関連する用途のいずれかのために使用され得る。しかしながら、ある特定のＬＣＭパネルは、ある特定の具体的な肺癌に関連する用途（「指標」）に特に適切である；これらの具体的な用途は、本明細書中で、肺癌の様々な「特徴」の判定または評価と称されることがある。ある特定の具体的な肺癌に関連する用途に特に適切であるそのようなＬＣＭパネルの例は、表７〜１０および図１９に提供される。例えば、表７は、肺癌の扁平上皮癌に対して腺癌を識別するために特に適切であるＬＣＭパネルを提供しており、表８は、患者における肺癌の病期を判定するなど、異なる病期の肺癌を識別する（例えば、初期の肺癌と後期の肺癌とを識別する（例えば、第ＩＩＩ期の肺癌に対して第Ｉ期の肺癌を識別する、または他の任意の第Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩおよびＩＶ期を識別する））ために特に適切であるＬＣＭパネルを提供しており、表９は、他のタイプの肺癌（例えば、ＮＳＣＬＣ）に対してＳＣＬＣを識別するために特に適切であるＬＣＭパネルを提供しており、表１０は、良性の肺の病変に対して悪性の肺腫瘍を識別するために特に適切であるＬＣＭパネルを提供しており、そして図１９は、肺腫瘍の退縮および／または再発をモニターするために特に適切であるＬＣＭを提供している。
表５〜１２は、種々の例示的なＬＣＭパネルを、各パネルに対する性能の特徴（ＡＵＣ、感度および特異性）とともに提供している。ある特定の実施形態において、９５％の特異性において少なくとも７０％の感度または９５％の感度において少なくとも７０％の特異性を有するＬＣＭパネルが提供される。ある特定の実施形態において、９５％の特異性において少なくとも８５％の感度または９５％の感度において少なくとも８５％の特異性を有するＬＣＭパネルが提供される。さらなる実施形態において、少なくとも９０％の感度もしくは少なくとも９０％の特異性を有するか、または少なくとも９５％の感度もしくは少なくとも９５％の特異性を有するＬＣＭパネルが提供される。なおもさらなる実施形態において、少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％（または他の任意の中間のパーセンテージ）の感度および７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％（または他の任意の中間のパーセンテージ）の特異性を有するＬＣＭパネルが提供される。なおもさらなる実施形態において、少なくとも０．７、０．７５、０．８、０．８５、０．９、０．９１、０．９２、０．９３、０．９４、０．９５、０．９６、０．９７、０．９８または０．９９（または他の任意の中間の値）のＡＵＣ値を有するＬＣＭパネルが提供される。これらのパネルのいずれかは、臨床行為などにおける本明細書中に記載される用途（例えば、肺癌の診断）などの肺癌に関連する用途に特に有用である。しかしながら、アッセイを臨床上使用するための所望の性能は、特定の用途、実行の点のような因子または他の因子に応じて変動し得る。
ＮＳＣＬＣおよびＳＣＬＣの識別
以下のＬＣＭのパネルは、互いおよび／または正常（すなわち、コントロール／健常）サンプルから非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）および小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）を識別する（これは、「解明する」と交換可能に称されることがある）ために特に有用である。これらのパネルは、以下のマーカーの組み合わせ：
１）特に、ＳＣＬＣに対してＮＳＣＬＣを識別するための、表９に提供されるパネルのいずれか
２）特に、正常サンプルに対してＳＣＬＣを識別するための、表１１に提供されるパネルのいずれか
３）特に、正常サンプルに対してＳＣＬＣおよびＮＳＣＬＣを識別するための、表１２に提供されるパネルのいずれか
４）特に、ＳＣＬＣからＮＳＣＬＣを識別するためおよびＮＳＣＬＣからＳＣＬＣを識別するための、ＯＰＮ（単独または１つ以上の他のマーカーとの併用）
５）特に、ＳＣＬＣからＮＳＣＬＣを識別するための、ＳＣＣ、ＯＰＮ、ＡＭＢＰおよびＣａ７２−４（これらのＬＣＭのレベルは、ＳＣＬＣに比べてＮＳＣＬＣにおいて高い）６）特に、ＮＳＣＬＣからＳＣＬＣを識別するための、ＥＮＯ２、ＭＭＰ２、Ｃａ１９−９、ＣＡＩＸおよびＧＲＰ（これらのＬＣＭのレベルは、ＮＳＣＬＣに比べてＳＣＬＣにおいて高い）
７）特に、正常サンプルからＳＣＬＣを識別するための（特に、スプリットポイント解析を用いることによって）、Ｃｙｆｒａ、ＳＬＰＩ、ＴＩＭＰ１、ＴＦＰＩ、ＣＥＡＣＡＭ５、ＭＭＰ２およびＣＡ２４２
８）特に、正常サンプルからＳＣＬＣを識別するための（特に、スプリットポイント解析を用いることによって）、ＳＬＰＩ、ＴＩＭＰ１、ＴＦＰＩ、ＣＥＡＣＡＭ５、ＭＭＰ２、ＯＰＮおよびＣＡ２４２
９）特に、正常サンプルからＮＳＣＬＣおよびＳＣＬＣを識別するための（特に、スプリットポイント解析を用いることによって）、Ｃｙｆｒａ、ＴＩＭＰ１、ＥＮＯ２、ＴＦＰＩ、ＣＥＡＣＡＭ５、ＭＭＰ２、ＯＰＮおよびＤＥＦＡ１
１０）特に、正常サンプルからＮＳＣＬＣおよびＳＣＬＣを識別するための（特に、スプリットポイント解析を用いることによって）、Ｃｙｆｒａ、ＭＩＦ、ＴＩＭＰ１、ＳＣＣ、ＴＦＰＩ、ＣＥＡＣＡＭ５、ＯＰＮおよびＤＥＦＡ１
１１）特に、正常サンプルからＮＳＣＬＣおよびＳＣＬＣを識別するための（特に、スプリットポイント解析を用いることによって）、ＴＩＭＰ１、ＥＮＯ２、ＴＦＰＩ、ＣＥＡＣＡＭ５、ＭＭＰ２、ＯＰＮ、ＡＭＢＰおよびＤＥＦＡ１からなり得るか、この組み合わせから本質的になり得るか、またはこの組み合わせを含み得る。
補足的な生物医学的パラメータ
用語「補足的な生物医学的パラメータ」とは、肺癌のリスクに関連する、ＬＣＭ以外の個体の１つ以上の評価のことを指す。「補足的な生物医学的パラメータ」としては、患者の身体的記述子（ｐｈｙｓｉｃａｌ ｄｅｓｃｒｉｐｔｏｒｓ）、ＣＴイメージングによって観察された肺結節の身体的記述子、患者の身長および／または体重、患者の性別、喫煙歴、職業歴、発癌性物質に対する曝露、副流煙に対する曝露、肺癌（または他の癌）の家族歴、肺結節の存在、結節のサイズ、結節の位置、結節の形態（例えば、結節はＣＴイメージングによって観察され得る）などが挙げられるが、これらに限定されない。喫煙歴は、通常、「パックイヤー（ｐａｃｋ ｙｅａｒｓ）」に関して数量化され、パックイヤーとは、喫煙してきた年数に、１日に喫煙するタバコの箱の平均数を乗算した値のことを指す。例えば、平均して１日１箱のタバコを３５年間にわたって喫煙していた者は、３５パックイヤーの喫煙歴を有すると称される。補足的な生物医学的パラメータは、当該分野で公知の通例の手法を用いて個体から（例えば、通例の患者質問票または健康状態の履歴質問票などを使用することによって個体自身から）または医療従事者などから得ることができる。あるいは、補足的な生物医学的パラメータは、ＣＴイメージング（例えば、低線量ＣＴイメージング）およびＸ線を含む通例のイメージング手法から入手され得る。
補足的な生物医学的パラメータの評価と併用されるＬＣＭの試験は、ＬＣＭ試験単独または補足的な生物医学的パラメータの評価単独（例えば、ＣＴイメージング単独）と比べて、肺癌を検出するための（または他の肺癌に関連する用途のための）、例えば、感度、特異性および／またはＡＵＣを改善し得る。
したがって、任意のＬＣＭおよびＬＣＭのパネルは、補足的な生物医学的パラメータと併用して使用され得る。さらに、補足的な生物医学的パラメータは、パネルの１つ以上のマーカーを置き換えるように（例えば、同様の性能（例えば、肺癌を検出するための感度、特異性および／またはＡＵＣ）を保持しつつ、より小さいパネル（すなわち、より少ない生物学的マーカーを含むパネル）の使用を可能にするように）機能し得る。したがって、補足的な生物医学的パラメータは、あるパネルに加えて、もしくはあるパネルの１つ以上のマーカーに加えて、またはあるパネルの１つ以上のマーカーに対する代用物として使用され得る。具体的な例として、１つ以上の補足的な生物医学的パラメータは、Ｃｙｆｒａ、ＳＬＰＩ、ＴＩＭＰ１、ＳＣＣ、ＴＦＰＩ、ＣＥＡＣＡＭ５、ＭＭＰ２、ＯＰＮおよびＭＤＫの９マーカーパネルまたはこの９マーカーパネルの６マーカーサブセット（Ｃｙｆｒａ、ＳＬＰＩ、ＴＩＭＰ１、ＴＦＰＩ、ＣＥＡＣＡＭ５およびＭＤＫ）に加えて使用され得る。別の具体的な例として、１つ以上の補足的な生物医学的パラメータは、Ｃｙｆｒａ、ＳＬＰＩ、ＴＩＭＰ１、ＳＣＣ、ＴＦＰＩ、ＣＥＡＣＡＭ５、ＭＭＰ２、ＯＰＮおよびＭＤＫの９マーカーパネル、またはこの９マーカーパネルの６マーカーサブセット（Ｃｙｆｒａ、ＳＬＰＩ、ＴＩＭＰ１、ＴＦＰＩ、ＣＥＡＣＡＭ５およびＭＤＫ）のうちの１つ以上のメンバーを置き換え得る。さらに、１つ以上の補足的な生物医学的パラメータは、表５に提供されるパネルのいずれかに加えて使用され得、そして／または表５に提供される任意のパネルの１つ以上のメンバーを置き換え得る。さらに、１つ以上の補足的な生物医学的パラメータは、本明細書中に提供されるマーカーもしくはパネルのいずれかに加えて使用され得、そして／または本明細書中に提供される任意のパネルの１つ以上のメンバー（表１〜２（配列番号１〜６５ならびに炭水化物抗原ＣＡ２４２、ＣＡ１９−９およびＣＡ７２−４）、表４、図１、１２および１９に提供されるマーカーならびに表３および６〜１２に提供されるパネルを含む）を置き換え得る。さらに、補足的な生物医学的パラメータは、肺癌を評価する（例えば、肺癌を診断する）ために、生物学的マーカーの評価（例えば、生物学的マーカーのレベル）とともにアルゴリズムおよびスコアリングシステム／分類子に組み込まれ得る。
補足的な生物医学的パラメータの例としては、以下のもののうちのいずれかが挙げられるが、これらに限定されない。これらの補足的な生物医学的パラメータのいずれかまたはすべてが、本明細書中に開示されるＬＣＭおよびＬＣＭパネルのいずれかと任意の組み合わせで使用され得る。例えば、本明細書中に開示されるＬＣＭおよびＬＣＭパネルのいずれかは、単独で（補足的な生物医学的パラメータを考慮することなく）評価され得るか、もしくはＣＴの結果（例えば）と組み合わせて評価され得るか、もしくは他の任意の補足的な生物医学的パラメータと組み合わせて評価され得るか、もしくはＣＴの結果＋他の任意の補足的な生物医学的パラメータと組み合わせて評価され得るか、または補足的な生物医学的パラメータの他の任意の組み合わせが、本明細書中に開示されるＬＣＭおよびＬＣＭパネルのいずれかと組み合わせて評価され得る。これらの補足的な生物医学的パラメータのいずれかは、肺癌を評価する（例えば、肺癌を診断する）などのために、生物学的マーカーの評価（例えば、生物学的マーカーのレベル）とともに、アルゴリズムまたはスコアリングシステム／分類子の一部として評価され得る。
１）年齢、性別および／または民族性；
２）肺癌または他のタイプの癌の家族歴；
３）喫煙歴（例えば、個体が、以前および／または現在、喫煙しているか否か）；
４）喫煙レベル（例えば、「パックイヤー」：１日に喫煙するタバコの数に、この割合で喫煙してきた年数を乗算した値）；
５）病変のサイズ；
６）病変の位置；
７）病変の形態（すりガラス状陰影（ＧＧＯ）、固体、非固体）；
８）病変の縁の特徴（滑らか、分葉状（ｌｏｂｕｌａｔｅｄ）、鮮明かつ滑らか、針骨状（ｓｐｉｃｕｌａｔｅｄ）、浸潤状（ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ）；
９）コンピュータ断層撮影（ＣＴ）スクリーニングから測定される他の任意のパラメータ；
１０）副流煙に対する曝露；および
１０）任意の公知の発癌性物質の曝露（例えば、アスベスト、ラドンガス、化学物質、火事からの煙および大気汚染（これらは、静止した供給源または移動性の供給源からの排出（例えば、工業的／工場または車／船舶／航空機の排出）を含み得る）のいずれかに対する曝露が挙げられるが、これらに限定されない）。
ＬＣＭを補足的な生物医学的パラメータと組み合わせる例示的な方法は、少なくとも１つの補足的な生物医学的パラメータ（例えば、喫煙歴）についての値を個体から得る工程、その補足的な生物医学的パラメータの各々の値を１つ以上の所定のカットオフと比較する工程、前記比較に基づいて、補足的な生物医学的パラメータの各々についてスコアを割り当てる工程、補足的な生物医学的パラメータの各々についての割り当てられたスコアを各ＬＣＭについて割り当てられたスコアと組み合わせることにより、前記個体についての合計スコアを得る工程、合計スコアを所定の合計スコアカットオフと比較する工程、およびその個体の合計スコアが所定の合計スコアカットオフよりも大きいかまたは小さいか（または等しいか）に基づいて、前記個体を、肺癌を有するかまたは有しない（またはその可能性）と分類する工程を包含し得る。ある特定の実施形態において、個体の合計スコアが、所定の合計スコアカットオフよりも大きい（または等しい）場合、その個体は、肺癌を有すると分類される。
さらなる例示的な方法は、以下の工程：
ａ）個体の少なくとも１つの補足的な生物医学的パラメータについての値を得る工程；
ｂ）補足的な生物医学的パラメータの各々の値を１つ以上の所定のカットオフと比較し、そして前記比較に基づいて補足的な生物医学的パラメータの各々についてスコアを割り当てる工程；
ｃ）その個体から得られた試験サンプル中の１つ以上のＬＣＭまたはＬＣＭパネル（例えば、Ｃｙｆｒａ、ＳＬＰＩ、ＴＩＭＰ１、ＳＣＣ、ＴＦＰＩ、ＣＥＡＣＡＭ５、ＭＭＰ２、ＯＰＮおよびＭＤＫの９マーカーパネルまたはＣｙｆｒａ、ＳＬＰＩ、ＴＩＭＰ１、ＴＦＰＩ、ＣＥＡＣＡＭ５およびＭＤＫの６マーカーサブセット）のレベルを定量化する工程；
ｄ）定量化された各ＬＣＭの量を所定のカットオフと比較し、そして前記比較に基づいて各ＬＣＭについてスコアを割り当てる工程；
ｅ）工程ｂにおいて決定された補足的な生物医学的パラメータの各々に対して割り当てられたスコアを、工程ｄにおいて決定されたＬＣＭに対して割り当てられたスコアと組み合わせることにより、前記個体についての合計スコアを得る工程；
ｆ）工程ｅにおいて決定された合計スコアを所定の合計スコアカットオフと比較する工程；および
ｇ）その個体の合計スコアが所定の合計スコアカットオフよりも高いかまたは低いか（または等しいか）に基づいて、その個体（または個体由来の試験サンプル）を、肺癌を有するまたは有しない（またはその可能性）と分類する工程（ある特定の実施形態において、個体の合計スコアが、所定の合計スコアカットオフよりも高い（または等しい）場合、その個体は、肺癌を有すると分類される）
を包含し得る。
上記の例示的な方法において、個体から得られた補足的な生物医学的パラメータは、例えば、個体の喫煙歴、年齢、発癌性物質の曝露、性別、結節のサイズ、結節の形態および／または結節の位置であり得る（結節の特徴（例えば、サイズ、形態および／または位置）は、ＣＴイメージングならびにＸ線または他のイメージング方法によって測定され得る）。好ましくは、補足的な生物医学的パラメータは、結節の形態と関連する。
例示的なスコアリングシステムおよびカットオフ
種々の方法論を用いることにより、本明細書中に開示される１つ以上のＬＣＭのアッセイに基づいてサンプルを分類することができる。サンプルの分類は、本明細書中に開示される１つ以上のＬＣＭを、必要に応じて１つ以上の補足的な生物医学的パラメータ（例えば、前述の項に開示された補足的な生物医学的パラメータが挙げられるが、これらに限定されない）と組み合わせて評価することによって得られたスコアに基づき得る。スコアまたは他の分類体系は、例えば、１つ以上のＬＣＭのレベルが、カットオフレベル（「カットオフ値」または単に「カットオフ」と称されることがある）よりも高いかもしくは低いか、またはある特定の量だけ（例えば、２標準偏差などのある特定の数の標準偏差だけ）カットオフ値よりも高いかもしくは低いか、あるいは１つ以上のＬＣＭのレベルがどれくらい高いかまたは低いかの大きさ／程度（これは、必要に応じてカットオフ値と関連し得る）を判定することに基づき得る。カットオフ値を確立するための多岐にわたるスコアリングシステムおよび方法論が、当該分野で公知であり、当業者は、１つ以上のＬＣＭまたはＬＣＭパネルに基づく肺癌の評価（必要に応じて１つ以上の補足的な生物医学的パラメータと組み合わせて）などの意図される用途に最も適するカットオフ値を確立する公知のスコアリングシステムまたは方法の実行の仕方を知っているだろう（またはカットオフ値を確立するための新規のスコアリングシステムまたは方法を考案するだろう）。したがって、当業者は、意図される用途に適するカットオフ値を確立し得、調整し得、そしてこれらのカットオフ値を任意の望ましいスコアリングシステムに組み込み得る。例えば、高い感度（腫瘍サンプルを検出するためおよび偽陰性を回避するため）がより重要であると考えられるのか、または高い特異性（偽陽性を回避するため）がより重要であると考えられるのかに基づいて、カットオフ値は調整され得る。例えば、カットオフは、例えば、９５％の特異性において少なくとも７０％の感度、または９５％の感度において少なくとも７０％の特異性、または９５％の特異性において少なくとも８５％の感度、または９５％の感度において少なくとも８５％の特異性、または少なくとも９０％もしくは９５％の感度、または少なくとも９０％もしくは９５％の特異性、あるいは他の任意の所望の感度および／または特異性（例えば、上に記載した感度および特異性の値）を達成するように選択され得る。別の例として、サンプルを腫瘍サンプルと分類するためには、カットオフレベルよりも高いマーカーがそのパネル内により多く必要とされつつ、カットオフが、より低く設定され得るか、またはサンプルを腫瘍サンプルと分類するためには、カットオフレベルよりも高いマーカーがそのパネル内により少なく必要とされつつ、カットオフが、より高く設定され得る。カットオフ値が設定され、試験に適用されるとき、そのカットオフ値は、本明細書中で「所定の」または「確立された」カットオフ値と交換可能に称されることがある。さらに、様々な解析方法が適用され得、その解析方法としては、スプリットポイント解析（例えば、別個のカットオフを設定する場合）、ロジスティック回帰分析（例えば、マーカーレベルが高いまたは低い大きさ／程度を要因として考慮する場合）、ナイーブベイズ、多変量解析、決定木モデリングなどが挙げられるが、これらに限定されない。
Ｃｙｆｒａ、ＳＬＰＩ、ＴＩＭＰ１、ＳＣＣ、ＴＦＰＩ、ＣＥＡＣＡＭ５、ＭＭＰ２、ＯＰＮおよびＭＤＫの９マーカーパネルについての代表的な例が図１７に示されている。図１７では、これらの９マーカーの各々に対する例示的なカットオフが、各マーカー記号のすぐ下に以下のとおり示されている（レベル／濃度（単位ｎｇ／ｍｌ）はＥＬＩＳＡによって測定された）：Ｃｙｆｒａ＝１．２０ｎｇ／ｍｌ、ＣＥＡ＝５．００ｎｇ／ｍｌ、ＳＬＰＩ＝５２ｎｇ／ｍｌ、ＯＰＮ＝３２ｎｇ／ｍｌ、ＭＤＫ＝０．１５ｎｇ／ｍｌ、ＴＦＰＩ＝１５０ｎｇ／ｍｌ、ＴＩＭＰ１＝３８５ｎｇ／ｍｌ、ＭＭＰ２＝２１０ｎｇ／ｍｌおよびＳＣＣ＝２．２ｎｇ／ｍｌ。これらのカットオフ値は、５０×５０サンプルセット内の正常（コントロール）サンプルと肺腫瘍サンプルの両方におけるこれらのマーカーのレベルを調べ、そして正常サンプルに対して肺腫瘍を最もうまく識別し得る適切なカットオフ値を決定することによって確立された（例えば、感度および特異性を最大にするために、大部分の肺腫瘍サンプルのレベルが高くかつ大部分の正常サンプルのレベルが低いカットオフ値が選択された）。次いで、これらのカットオフを、同じ５０×５０サンプルセットに適用した（すなわち、この例において、５０×５０サンプルセットは、トレーニングと試験の両方のために使用された）。この例では、９マーカーのうちの２つ以上のレベルが、各マーカーについて確立されたカットオフ値以上である場合、そのサンプルを、肺腫瘍サンプルと分類した（したがって、９マーカーのうちのすべてのレベルが、各マーカーについて確立されたカットオフ以上でなかったか、または１つのレベルだけしか各マーカーについて確立されたカットオフ値以上でない場合、そのサンプルは、正常サンプルと分類された）。この例示的なサンプルセットにおいてこの例示的なスコアリングシステムを用いると、５０個の腫瘍サンプルのうち４８個が正確に分類されたのに対し、４２番目および４３番目に列挙されたサンプルの各々において９つのマーカーのうちの１つだけの（２つ以上という最小値ではなく）レベルが、そのカットオフレベル以上だったので、これらの２つのサンプルセットは、腫瘍サンプルでないと誤分類された（９６％感度；図１７の右側）。同様に、この例示的なサンプルセットにおいてこの例示的なスコアリングシステムを用いると、５０個の正常（コントロール）サンプルうち４９個が正確に分類されたのに対し、２番目に列挙されたサンプルセットにおいて９つのマーカーのうち３つの（２つ以上という最小値を満たす）レベルがカットオフレベル以上だったので、このサンプルは、腫瘍サンプルであると誤分類された（９８％の特異性；図１７の左側）。しかしながら、当業者は、アッセイが、すべての単一のサンプルを正確に分類すると予想されない；むしろ、当該分野では、いくつかの誤分類が予想されることを認識するだろう。目的は、一般に、誤分類を排除するのではなく、最小にすることである。さらに、アッセイ（例えば、ＬＣＭレベルのアッセイ）を他のタイプの試験（例えば、ＣＴスクリーニング）と併用することにより、誤分類をさらに最小限することができる。
他の例示的なスコアリングシステムにおいて、Ｃｙｆｒａ、ＳＬＰＩ、ＴＩＭＰ１、ＳＣＣ、ＴＦＰＩ、ＣＥＡＣＡＭ５、ＭＭＰ２、ＯＰＮおよびＭＤＫの９マーカーパネルのうちの１つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、７つ以上、８つ以上または９つすべてのマーカーのレベルが、各マーカーについて、確立されたカットオフ値以上である場合、そのサンプルは、肺腫瘍サンプルと分類され得る。ある特定の例示的なスコアリングシステムにおいて、あるマーカーのレベルが、そのマーカーについて、確立されたカットオフ値以上である場合、それは、１という値が割り当てられ得（例えば）、そしてあるマーカーのレベルが、そのマーカーについて、確立されたカットオフ値未満である場合、それは、０という値が割り当てられ得る（例えば）。しかしながら、任意の所望の値が、様々な結果に割り当てられ得る。さらに、これらの値は、共に加算され得る（または別途併され得る）ことにより、サンプルに対する合計スコアが確定し、そしてこの合計スコアに基づいて、そのサンプルの腫瘍サンプルまたは正常サンプル（例えば）との分類が、割り当てられ得る。例えば、上に記載され、図１７に示される例において、確立されたカットオフ値以上である各マーカーのレベルに１という値を割り当てる場合、２以上のスコアを用いることにより、サンプルが腫瘍サンプルと分類され得る（また、２未満のスコアを用いることにより、サンプルが正常サンプルと分類され得る）。他の任意のスコアリングシステムが使用され得、当業者は、意図される用途に最も適するスコアリングシステムを選択するかまたは考案する仕方を知っているだろう。
図１７に例示されるものなどのスコアリングシステムおよびカットオフ値または他の任意の望ましいスコアリングシステムおよびカットオフ値は、本明細書中に開示される他のＬＣＭおよびＬＣＭパネルのいずれか（例えば、９マーカーパネルの６マーカーサブセット（Ｃｙｆｒａ、ＳＬＰＩ、ＴＩＭＰ１、ＴＦＰＩ、ＣＥＡＣＡＭ５およびＭＤＫ）および表５に提供されている他のパネルのいずれか）に適用され得、そして必要に応じて任意の補足的な生物医学的パラメータを組み込み得る。例えば、任意の補足的な生物医学的パラメータは、あるスコアリングシステムにおいてある値が割り当てられ得（例えば、喫煙歴は、１という値または他の値が割り当てられ得、そして喫煙歴なしは、０という値、マイナス１という値または他の値が割り当てられ得る）、そのような値は、所定のカットオフレベルよりも高いマーカーレベル（例えば）に割り当てられた値と合計され得る（例えば、サンプルを肺腫瘍サンプルまたは正常サンプルと分類するための合計スコアを生成するために）。さらに、これらの様々なスコアリングシステムおよびカットオフ値は、表７〜１０に開示される用途などの特定の用途をはじめとした、本明細書中に開示される肺癌に関連する用途のいずれかに適用され得る。
本明細書中に開示されるか、もしくは当該分野で公知の、または当業者によって考案され得る、任意のスコアリングシステムは、コンピュータプログラムに組み込まれ得、そのようなコンピュータプログラムは、コンピュータ読み取り可能媒体上で具体化され得る。例えば、コンピュータプログラムは、例えば、ＣＴスクリーニングからのパラメータ（例えば、腫瘍の体積／サイズ、腫瘍の形態、腫瘍の位置および／または他の腫瘍の特徴など）および／または他の補足的な生物医学的パラメータ（例えば、喫煙歴、個体の年齢など）とともに、レベルが所定のカットオフレベルよりも高いパネル内のマーカーの数に基づいてサンプルから合計スコアを生成し得、そしてこの合計スコアを用いることにより、サンプルを例えば肺腫瘍サンプルまたは正常サンプルと分類することができる。複数の異なるタイプの評価の組み合わせ（例えば、ＬＣＭレベルと補足的な生物医学的パラメータとの組み合わせ）である単一の合計スコアが生成され得るか、または複数の個別のスコアが、個別に評価するために生成され得る（例えば、ＬＣＭレベルの評価に基づいたスコア、および補足的な生物医学的パラメータに基づいた１つ以上の別個のスコア）。ＬＣＭレベルを（ＴＩＭＰ１、ＴＦＰＩ、ＣＥＡＣＡＭ５およびＣａ７２−４の例示的なパネルを用いる）補足的な生物医学的パラメータ（「パックイヤー」によって示されるような喫煙歴）と組み合わせるこのタイプの統合型アプローチの例が、図２１に示されている。
キット
ＬＣＭおよびＬＣＭパネル（ならびに補足的な生物医学的パラメータ）の任意の組み合わせは、本明細書中に開示される方法を行う際に使用するためなどの、キットの形態で提供され得る。さらに、任意のキットは、蛍光部分などの１つ以上の検出可能な標識（例えば、抗体などの検出可能に標識された試薬）を備え得る。
例えば、キットは、（ａ）試験サンプル中の１つ以上のＬＣＭを定量化するための少なくとも１つの抗体を含む試薬（ここで、前記ＬＣＭは：Ｃｙｆｒａ、ＳＬＰＩ、ＴＩＭＰ１、ＳＣＣ、ＴＦＰＩ、ＣＥＡＣＡＭ５、ＭＭＰ２、ＯＰＮおよびＭＤＫ（またはＣｙｆｒａ、ＳＬＰＩ、ＴＥＭＰ１、ＴＦＰＩ、ＣＥＡＣＡＭ５およびＭＤＫだけ；または本明細書中に開示される他の任意のＬＣＭもしくはＬＣＭパネル（例えば、表５〜１２に開示されるパネル）を含む）、および必要に応じて（ｂ）その試験サンプル中で定量化された各ＬＣＭの量を１つ以上の所定のカットオフと比較し、そして前記比較に基づいて定量化された各ＬＣＭについてスコアを割り当てる工程、定量化された各ＬＣＭについて割り当てられたスコアを併せることにより、合計スコアを得る工程、その合計スコアを所定の合計スコアと比較する工程、および前記比較を用いることにより、個体が肺癌を有しているか否かを判定する工程を行うための１つ以上のアルゴリズムまたはコンピュータプログラムを備え得る。あるいは、１つ以上のアルゴリズムまたはコンピュータプログラムではなく、人間が上記工程を手動で行うための１つ以上の指示が提供され得る。
ある特定の実施形態において、キットは：（ａ）試験サンプル中の１つ以上のＬＣＭを定量化するための少なくとも１つの抗体を含む試薬（ここで、前記ＬＣＭは、Ｃｙｆｒａ、ＳＬＰＩ、ＴＩＭＰ１、ＳＣＣ、ＴＦＰＩ、ＣＥＡＣＡＭ５、ＭＭＰ２、ＯＰＮおよびＭＤＫである）、および（ｂ）試験サンプル中の少なくとも１つの抗体を定量化するための１つ以上のＬＣＭを含む試薬；ここで、前記抗体は：ＴＰ５３（ｐ５３）、ＫＬＫＢ１、ＣＦＬ１（ＣＦＬＮ）、ＥＥＦ１Ｇ、ＨＳＰ９０α（ＨＳＰ９０ＡＡ１）、ＲＴＮ４、ＡＬＤＯＡ、ＧＬＧ１、ＰＴＫ７、ＥＦＥＭＰ１、ＳＬＣ３Ａ２（ＣＤ９８）、ＣＨＧＢ、ＣＥＡＣＡＭ１、ＡＬＣＡＭ、ＨＳＰＢ１（ＨＳＰ２７）、ＬＧＡＬＳ１およびＢ７Ｈ３である、および必要に応じて（ｃ）その試験サンプル中で定量化されたＬＣＭおよび抗体の各々の量を１つ以上の所定のカットオフと比較し、そして前記比較に基づいて定量化されたＬＣＭおよび抗体の各々についてスコアを割り当てる工程、定量化されたＬＣＭおよび抗体の各々について割り当てられたスコアを併せることにより、合計スコアを得る工程、その合計スコアを所定の合計スコアと比較する工程、および前記比較を用いることにより、個体が肺癌を有しているか否かを判定する工程を行うための１つ以上のアルゴリズムまたはコンピュータプログラムを備え得る。あるいは、１つ以上のアルゴリズムまたはコンピュータプログラムではなく、人間が上記工程を手動で行うための１つ以上の指示が提供され得る。
ＬＣＭの評価から肺癌の評価への変換、およびそのためのシステム
個体由来の血清サンプル（または他のサンプル）をアッセイすることによって測定されたＬＣＭレベルなどの個体におけるＬＣＭの評価は、その個体に対する肺癌の評価に変換され得る。例えば、複数のＬＣＭ（例えば、Ｃｙｆｒａ、ＳＬＰＩ、ＴＩＭＰ１、ＳＣＣ、ＴＦＰＩ、ＣＥＡＣＡＭ５、ＭＭＰ２、ＯＰＮおよびＭＤＫの９マーカーパネルにおけるＬＣＭの各々）のレベルは、例えば個体が肺癌を有するか否かを示す（または個体が肺癌を有する可能性を示す）スコアまたは他の識別子に変換され得る。同様に、スコアまたは他の識別子は、特定のタイプの肺癌の評価（例えば、本明細書中に記載される様々な肺癌の特徴の評価、この評価としては、個体の肺癌が腺癌であるかまたは扁平上皮癌であるかの判定、個体の肺癌の病期の判定（例えば、第Ｉ期の肺癌と第ＩＩＩ期の肺癌との識別）、個体の肺癌がＳＣＬＣであるかまたはＮＳＣＬＣであるかの判定、個体において同定された（例えば、ＣＴスクリーニングによって）肺の病変が悪性腫瘍であるかまたは良性の病変であるかの判定、ならびに肺腫瘍の退縮および／または再発の判定が挙げられる（がこれらに限定されない））を示し得る。これらの任意の判定は、例えば、別個の（例えば、絶対的な）または連続的な（例えば、可能性の）様式で表現され得る。
さらに、ＬＣＭレベルなどの個体におけるＬＣＭの評価は、実体的なレポートに変換され得る。したがって、肺癌の評価を示すスコアまたは他の識別子は、実体的なレポートの形態で提供され得る。
さらに、ＬＣＭレベルから肺癌の評価（例えば、スコアまたは他の識別子）への変換などの変換は、コンピュータによって行われ得る。さらに、ある特定の実施形態は、ＬＣＭレベルを肺癌の評価に変換するために具現化されるコンピュータプログラムコードを有するコンピュータ読み取り可能媒体を提供する。
ある特定の実施形態において、本発明は、１つ以上のＬＣＭ、特に、複数のＬＣＭのレベルを評価するため、およびこのＬＣＭの評価を肺癌の評価（例えば、個体が肺癌を有する（または有する可能性がある）か否かの判定（スコアまたは他の識別子によって示され得る））に変換するためのシステムを提供する。ある特定の実施形態において、これらのシステムは、ＬＣＭの評価を受け取り、そのＬＣＭの評価を肺癌の評価に変換し、そしてその肺癌の評価を（例えば、スコアまたは他の識別子として）出力する、１つ以上のコンピュータを備える。これらのシステムは、インターネット（またはコンピュータ間通信についての分野において使用される他の任意の通信様式）を介して通信する複数のコンピュータを必要に応じて備え得る。
したがって、本発明のある特定の実施形態は、ＬＣＭの評価（例えば、ＬＣＭレベル）を肺癌の評価（例えば、個体が肺癌を有するか否かもしくは肺癌を有する可能性を有するか否かのスコアまたは他の表示あるいは他の具体的な肺癌の評価）に変換する方法を提供する。ある特定の実施形態において、この肺癌の評価は、実体的なレポートの形態で提供される。ある特定の実施形態において、この変換は、コンピュータによって行われる。さらに、本発明のある特定の実施形態は、ＬＣＭの評価を肺癌の評価に変換するようにプログラムされたコンピュータを提供する。ある特定の実施形態は、ＬＣＭレベルを肺癌の評価に変換するために具現化されるコンピュータプログラムコードを有するコンピュータ読み取り可能媒体を提供する。ある特定の実施形態において、ＬＣＭの評価を受け取り、そのＬＣＭの評価を肺癌の評価に変換し、そしてその肺癌の評価を（例えば、スコアまたは他の識別子として）出力するためのシステムが提供される。様々な実施形態において、そのシステムは、１つ以上のコンピュータ（必要に応じてインターネットまたは他の通信様式を介して通信し得るコンピュータ）を備える。
レポート、レポートの伝送およびプログラムされたコンピュータ
試験の結果（例えば、本明細書中に開示される１つ以上のＬＣＭのレベルもしくは他のアッセイに基づいた個体に対する肺癌の診断、または腫瘍の進行／後退／再発、肺癌の病期、肺癌のタイプ（例えば、ＳＣＬＣに対してＮＳＣＬＣまたは扁平上皮癌に対して腺癌、良性の肺の病変に対して悪性腫瘍など）の評価）および／または試験に関係する他の任意の情報（例えば、明確な疾患または診断情報の非存在下において必要に応じて提供され得る個体由来のサンプル中の本明細書中に開示される１つ以上のＬＣＭのレベル）が、本明細書中で「レポート」と称されることがある。実体的なレポートは、必要に応じて試験プロセスの一部として生成され得る（これは、本明細書中で「レポートする」またはレポートを「提供する」、レポートを「もたらす」またはレポートを「生成する」と交換可能に称されることがある）。
実体的なレポートの例としては、紙（例えば、コンピュータによって生成される試験結果の印刷出力）または等価な形式でのレポート、およびコンピュータ読み取り可能媒体（例えば、ＣＤ、ＵＳＢフラッシュドライブもしくは他のリムーバブル記憶装置デバイス、コンピュータハードドライブまたはコンピュータネットワークサーバーなど）上に格納されたレポートが挙げられ得るが、これらに限定されない。レポート、特に、コンピュータ読み取り可能媒体上に格納されたレポートは、データベースの一部であり得、これは、必要に応じてインターネットを介してアクセス可能であり得る（例えば、コンピュータネットワークサーバー上に格納された患者の記録または生物医学的な情報のデータベース（これは、レポートへのアクセスを制限する安全性の特色を有する（例えば、他の権限のない個体がレポートを閲覧することを防止しつつ、その患者だけおよび患者の医療従事者だけがレポートを閲覧することができる）「安全なデータベース」であり得る））。実体的なレポートを生成することに加えて、またはその代替として、レポートは、コンピュータスクリーン（または別の電子デバイスまたは電子機器のディスプレイ）上にも表示され得る。
レポートは、例えば、試験された個体、医療従事者（例えば、医師、看護士、臨床検査室の従事者など）、保健機関、臨床検査室、および／またはレポートを閲覧することまたは入手することを目的とした他の任意の団体もしくは依頼者に対して、さらに「伝送され得る」かまたは「通信され得る」（これらの用語は、本明細書中で交換可能に使用され得る）。レポートを「伝送する」または「通信する」という行為は、レポートの形式に基づいて当該分野で公知の任意の手段によることができる。さらに、レポートを「伝送する」ことまたは「通信する」ことは、レポートを送達すること（「プッシュすること（ｐｕｓｈｉｎｇ）」）および／またはレポートを引き出すこと（「プルすること（ｐｕｌｌｉｎｇ）」）を含み得る。例えば、レポートは、１つの団体から別の団体に物理的に送達されること、または電子的にもしくはシグナルの形態で（例えば、電子メールを介して、もしくはインターネットによって、ファクシミリによって、および／または当該分野で公知の任意の有線もしくは無線の通信方法によって）伝送されることなどによって（例えば、コンピュータネットワークサーバー上に格納されたデータベースから引き出されることによって）、団体間で物理的に転送されること（例えば、紙の形態でのレポートの場合）をはじめとした様々な手段によって伝送／通信され得る。
ある特定の例示的な実施形態において、本発明は、本明細書中に記載される方法を実施するようにプログラムされたコンピュータ（または生物医学的なデバイスまたは研究室の機器などの他の装置／デバイス）を提供する。例えば、ある特定の実施形態において、本発明は、本明細書中に開示される１つ以上のＬＣＭのレベルを受け取り（すなわち、入力として）、そして肺癌の診断または他の結果（例えば、１つ以上のＬＣＭのレベルに基づいた、腫瘍の進行／後退／再発、肺癌の病期、肺癌のタイプ（例えば、ＳＣＬＣに対してＮＳＣＬＣまたは扁平上皮癌に対して腺癌、良性の肺の病変に対して悪性腫瘍など）の評価）を提供する（すなわち、出力として）ようにプログラムされたコンピュータを提供する。そのような出力（例えば、肺癌の診断の通信など）は、例えば、コンピュータ読み取り可能媒体上のレポートの形式、紙に印刷された形態においてであり得、そして／またはコンピュータスクリーンまたは他のディスプレイ上に表示され得る。
本発明のさらに例示的な実施形態が、以下で詳細に説明される。
１．ＬＣＭタンパク質
本発明の例示的な実施形態は、配列番号１〜６５のアミノ酸配列（さらに、炭水化物抗原ＣＡ２４２、ＣＡ１９−９およびＣＡ７２−４もまた提供され、これらもまた、タンパク質／ポリペプチドに対する本明細書中の言及によって包含され得る）ならびにこれらのタンパク質のすべての公知のバリアントおよびフラグメント、そして作製する技術および使用する技術の範囲内である核酸分子からなるか、それらから本質的になるか、またはそれらを含む、ＬＣＭタンパク質を提供する。そのような明らかなバリアントの例としては、天然に存在する対立遺伝子バリアント、タンパク質のプロセシング前の形態またはプロセシングされた成熟した形態、天然に存在しない組換え的に得られるバリアント、オルソログおよびパラログが挙げられるが、これらに限定されない。そのようなバリアントは、組換え核酸技術およびタンパク質生化学の分野において公知の手法を用いて容易に作製され得る。
タンパク質は、細胞性の材料を実質的に含まないか、または化学前駆体もしくは他の化学物質を含まないとき、「単離されている」または「精製されている」と言われる。ＬＣＭタンパク質は、均一または他の程度の純度に精製され得る。精製のレベルは、意図される用途に基づき得る。主として考慮されることは、かなりの量の他の成分が存在していたとしても、その調製が、そのタンパク質の所望の機能を可能にすることである。
いくつかの用途において、「細胞性の材料を実質的に含まない」は、約３０％（乾燥重量基準）未満の他のタンパク質、約２０％未満の他のタンパク質、約１０％未満の他のタンパク質または約５％未満の他のタンパク質を有する（すなわち、タンパク質を含む）タンパク質の調製物を含む。タンパク質が、組換え的に生成されるとき、そのタンパク質は、培養液も実質的に含まず、すなわち、培養液は、そのタンパク質調製物の体積の約２０％未満であり得る。
言語「化学前駆体または他の化学物質を実質的に含まない」は、タンパク質がそのタンパク質の合成に関与する化学前駆体または他の化学物質から分離されている、タンパク質の調製物を包含する。１つの実施形態において、言語「化学前駆体または他の化学物質を実質的に含まない」は、約３０％（乾燥重量基準）未満の化学前駆体もしくは他の化学物質、約２０％未満の化学前駆体もしくは他の化学物質、約１０％未満の化学前駆体もしくは他の化学物質、または約５％未満の化学前駆体もしくは他の化学物質を有するＬＣＭタンパク質の調製物を包含する。
単離されたＬＣＭタンパク質は、天然にそれを発現する細胞から精製され得るか、それを発現するように変更された細胞（組換え）から精製され得るか、または公知のタンパク質合成法（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．３ｒｄ．ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，（２００１））を用いて合成され得る。例えば、ＬＣＭタンパク質をコードする核酸分子が、発現ベクター内にクローニングされ得、その発現ベクターが、宿主細胞に導入され得、そしてそのタンパク質が、その宿主細胞内で発現され得る。次いで、そのタンパク質は、標準的なタンパク質精製手法を用いる適切な精製スキームによってその細胞から単離され得る。
ＬＣＭタンパク質またはそのフラグメントが、異種性配列に付着されることにより、キメラタンパク質または融合タンパク質が形成され得る。そのようなキメラタンパク質および融合タンパク質は、そのタンパク質と実質的に相同でないアミノ酸配列を有する異種タンパク質に作動可能に連結されたタンパク質を含む。「作動可能に連結された」は、そのタンパク質および異種タンパク質が、インフレームで融合されていることを示す。その異種タンパク質は、タンパク質のＮ末端またはＣ末端に融合され得る。
いくつかの用途において、融合タンパク質は、タンパク質自体の活性に影響しない。例えば、融合タンパク質としては、ベータ−ガラクトシダーゼ融合物、酵母ツーハイブリッドＧＡＬ融合物、ポリ−Ｈｉｓ融合物、ＭＹＣ−タグ化物、ＨＩ−タグ化物およびＩｇ融合物が挙げられ得るが、これらに限定されない。そのような融合タンパク質、特に、ポリ−Ｈｉｓ融合物は、組換えＬＣＭタンパク質の精製を容易にし得る。ある特定の宿主細胞（例えば、哺乳動物宿主細胞）において、タンパク質の発現および／または分泌は、異種シグナル配列を用いることによって増加し得る。
キメラまたは融合ＬＣＭタンパク質は、標準的な組換えＤＮＡ手法によって生成され得る。例えば、異なるタンパク質配列をコードするＤＮＡフラグメントは、従来の手法に従って、共にインフレームで連結され得る。別の実施形態では、融合遺伝子は、自動ＤＮＡ合成装置をはじめとした従来の手法によって合成され得る。あるいは、遺伝子フラグメントのＰＣＲ増幅は、２つの連続した遺伝子フラグメント間に相補的なオーバーハングをもたらすアンカープライマーを用いて行われ得、それらは、その後、アニールし、再増幅されることにより、キメラ遺伝子配列を生成し得る（Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、１９９２−２００６）。さらに、融合部分（例えば、ＧＳＴタンパク質）をすでにコードしている多くの発現ベクターが市販されている。ＬＣＭをコードする核酸は、融合部分がＬＣＭタンパク質にインフレームで連結されるように、そのような発現ベクター内にクローニングされ得る。
２つのアミノ酸配列間または２つの核酸配列間の同一性パーセントを決定するために、それらの配列は、最適な比較の目的でアラインメントされ得る（例えば、最適なアラインメントのために、第１および第２のアミノ酸配列または核酸配列の一方または両方にギャップが導入され得、非相同配列は、比較の目的で無視され得る）。例示的な実施形態において、少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％もしくは９０％またはそれ以上の長さの参照配列が、比較の目的でアラインメントされ得る。次いで、対応するアミノ酸の位置またはヌクレオチドの位置におけるアミノ酸残基またはヌクレオチドが、比較され得る。第１配列における位置が、第２配列における対応する位置において同じアミノ酸残基またはヌクレオチドによって占められている場合、その分子は、その位置において同一である（本明細書中で使用されるとき、アミノ酸または核酸の「同一性」は、アミノ酸または核酸の「相同性」と等価である）。２つの配列間の同一性パーセントは、その２つの配列の最適なアラインメントのために導入されるギャップの数および各ギャップの長さを考慮に入れた、それらの配列によって共有される同一の位置の数の関数である。
配列の比較ならびに２つの配列間の同一性パーセントおよび類似性の決定は、数学的アルゴリズムを用いて達成され得る（Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８８；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９３；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ １，Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，ｅｄｓ．，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ，１９９４；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９８７；およびＳｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ，Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｄｓ．，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９１）。例示的な実施形態において、２つのアミノ酸配列間の同一性パーセントは、Ｂｌｏｓｓｏｍ６２行列またはＰＡＭ２５０行列のいずれか、１６、１４、１２、１０、８、６または４のギャップの重みおよび１、２、３、４、５または６の長さの重みを使用するＧＣＧソフトウェアパッケージにおけるＧＡＰプログラムに組み込まれているＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（４８）：４４４−４５３（１９７０））アルゴリズムを用いて決定される。別の例示的な実施形態において、２つのヌクレオチド配列間の同一性パーセントは、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰ行列、ならびに４０、５０、６０、７０または８０のギャップの重みおよび１、２、３、４、５または６の長さの重みを用いるＧＣＧソフトウェアパッケージにおけるＧＡＰプログラム（Ｄｅｖｅｒｅｕｘら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２（１）：３８７（１９８４））を用いて決定され得る。別の例示的な実施形態において、２つのアミノ酸配列間またはヌクレオチド配列間の同一性パーセントは、ＰＡＭ１２０重み付き残基表（ｗｅｉｇｈｔ ｒｅｓｉｄｕｅ ｔａｂｌｅ）、１２のギャップ長ペナルティ（ｇａｐ ｌｅｎｇｔｈ ｐｅｎａｌｔｙ）および４のギャップペナルティ（ｇａｐ ｐｅｎａｌｔｙ）を用いるＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれている、Ｅ．ＭｙｅｒｓおよびＷ．Ｍｉｌｌｅｒのアルゴリズム（ＣＡＢＩＯＳ，４：１１−１７（１９８９））を用いて決定される。
本発明のタンパク質および核酸分子の配列を、「クエリー配列」としてさらに使用することにより、配列データベースに対して検索を実行すること、例えば、他のタンパク質ファミリーメンバーまたは関連配列を同定することができる。そのような検索は、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−１０（１９９０））のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）を用いて行われ得る。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索を、ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、ワード長＝１２を用いて行うことにより、クエリー核酸分子に相同なヌクレオチド配列を得ることができる。ＢＬＡＳＴタンパク質検索を、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３を用いて行うことにより、クエリータンパク質に相同なアミノ酸配列を得ることができる。比較する目的でギャップ入りのアラインメントを得るためには、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５（１７）：３３８９−３４０２（１９９７））に記載されているようなＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴを利用することできる。ＢＬＡＳＴおよびｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを利用するときは、それぞれのプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトのパラメータが、使用され得る。
本明細書中で使用されるとき、２つのタンパク質のアミノ酸配列が、典型的には、少なくとも約７０〜８０％、８０〜９０％、９０〜９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるとき、それらの２つのタンパク質（またはそれらのタンパク質の領域またはドメイン）は、有意な相同性／同一性（実質的な相同性／同一性とも称される）を有する。有意に相同なアミノ酸配列は、以下でより十分に説明されるように、ストリンジェントな条件下でＬＣＭタンパク質をコードする核酸分子にハイブリダイズする核酸分子によってコードされ得る。
ＬＣＭタンパク質のオルソログは、典型的には、ＬＣＭタンパク質の少なくとも一部に対していくらかの程度の有意な配列相同性を有し、別の生物由来の遺伝子によってコードされる。好ましいオルソログは、ヒト治療マーカーおよび治療薬剤の開発のために、哺乳動物、好ましくは、非ヒト霊長類から単離される。そのようなオルソログは、以下でより十分に説明されるように、それらのタンパク質を得る２つの生物の関連性の程度に従って中程度からストリンジェントな条件下において、ＬＣＭタンパク質をコードする核酸分子にハイブリダイズする核酸分子によってコードされ得る。
ＬＣＭタンパク質の天然に存在しないバリアントは、組換え手法を用いて容易に作製され得る。そのようなバリアントとしては、ＬＣＭタンパク質のアミノ酸配列における欠失、付加および置換が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、１つのクラスの置換は、保存アミノ酸置換である。そのような置換は、ＬＣＭタンパク質における所与のアミノ酸を同様の特性の別のアミノ酸で置き換えるものである。脂肪族アミノ酸Ａｌａ、Ｖａｌ、ＬｅｕおよびＩｌｅのうちの１つを別のもので置き換える置換；ヒドロキシル残基ＳｅｒとＴｈｒとの交換；酸性残基ＡｓｐとＧｌｕとの交換；アミド残基ＡｓｎとＧｌｎとの置換；塩基性残基ＬｙｓとＡｒｇとの交換；ならびに芳香族残基ＰｈｅとＴｙｒとの置換が、保存的置換として代表的に見られる。どのアミノ酸の変更が表現型的に無変化である可能性があるのかに関する指針は、Ｂｏｗｉｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７：１３０６−１３１０（１９９０）に見られる。
バリアントＬＣＭタンパク質は、完全に機能的であり得るか、または１つ以上の活性における機能、例えば、基質に結合する能力、基質をリン酸化する能力、シグナル伝達を媒介する能力などを喪失していることがある。完全に機能的なバリアントは、典型的には、保存的なバリエーションまたは重大でない残基もしくは重大でない領域におけるバリエーションだけを含む。
非機能的バリアントは、典型的には、１つ以上の非保存的なアミノ酸の置換、欠失、挿入、逆位もしくは切断、または重大な残基または重大な領域における置換、挿入、逆位もしくは欠失を含む。
機能するために不可欠なアミノ酸は、部位特異的突然変異誘発またはアラニンスキャニング突然変異誘発（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１０８１−１０８５（１９８９））などの当該分野で公知の方法によって同定され得る。後者の手順は、その分子内のすべての残基に単一のアラニン変異を導入するものである。次いで、得られた変異体分子を生物学的活性について試験するか、またはインビトロ増殖活性などのアッセイにおいて試験する。結合パートナー／基質の結合にとって重大な部位は、構造解析（例えば、結晶化、核磁気共鳴または光親和性標識（Ｓｍｉｔｈら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２４：８９９−９０４（１９９２）；ｄｅ Ｖｏｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５５：３０６−３１２（１９９２）））によっても決定され得る。
本発明のＬＣＭは、ＬＣＭのフラグメント、ならびにそのようなフラグメントを含むペプチドおよびそのようなフラグメントからなるペプチドを含む。ＬＣＭのそのようなフラグメントは、ヒトの体内に天然に存在し得る。例示的なフラグメントは、典型的には、ＬＣＭタンパク質の少なくとも約５、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０個以上連続したアミノ酸残基を含む。そのようなフラグメントは、ＬＣＭの生物学的活性の１つ以上を保持する能力に基づいて選択され得るか、または機能を発揮する能力、例えば、基質に結合する能力もしくは免疫原として作用する能力について選択され得る。特に重要なフラグメントは、例えば、約８アミノ酸長以上のペプチドなどの生物学的に活性なフラグメントである。そのようなフラグメントは、ＬＣＭのドメインまたはモチーフ、例えば、活性部位、膜貫通ドメインまたは結合ドメインを含み得る。さらに、可能性のあるフラグメントとしては、可溶性ペプチドフラグメント、および免疫原性の構造を含むフラグメントが挙げられるが、これらに限定されない。ドメインおよび機能的部位は、例えば、当業者に周知であり、かつ容易に入手可能なコンピュータプログラム（例えば、ＰＲＯＳＩＴＥ解析）によって容易に同定され得る。
タンパク質は、２０個の天然に存在するアミノ酸と通常称される２０個のアミノ酸以外のアミノ酸を含み得る。さらに、末端のアミノ酸を含む多くのアミノ酸は、プロセシングおよび他の翻訳後修飾などの天然のプロセス、または当該分野で周知の化学修飾手法によって改変され得る。タンパク質に天然に存在する通常の改変は、当業者に周知である。
公知の改変としては、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトールの共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合性の架橋の形成、シスチンの形成、ピログルタメートの形成、ホルミル化、ガンマカルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク分解性プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化（ｓｅｌｅｎｏｙｌａｔｉｏｎ）、硫酸化、アルギニン化などのタンパク質に対するアミノ酸のｔＲＮＡ媒介性付加、およびユビキチン化が挙げられるが、これらに限定されない。
そのような改変は、当業者に周知であり、科学文献に記載されている。いくつかの特に一般的な改変である、例えば、グリコシル化、脂質付着、硫酸化、グルタミン酸残基のガンマ−カルボキシル化、ヒドロキシル化およびＡＤＰ−リボシル化は、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ−Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，２ｎｄ Ｅｄ．，Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９３）などの最も基本的なテキストに記載されている。この個別のものに対して、多くの詳細な概説（例えば、Ｗｏｌｄ（Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｖａｌｅｎｔ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｂ．Ｃ．Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ １−１２（１９８３））；Ｓｅｉｆｔｅｒら（Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８２：６２６−６４６（１９９０））；およびＲａｔｔａｎら（Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６６３：４８−６２（１９９２）））が入手可能である。
したがって、本発明の例示的なＬＣＭタンパク質およびそのフラグメントは、例えば、置換されたアミノ酸残基が遺伝暗号によってコードされるものでない誘導体またはアナログも包含し得、ここで、置換基が含められているか、成熟ＬＣＭが別の組成物（例えば、ＬＣＭの半減期を延長する組成物（例えば、ポリエチレングリコールまたはアルブミン））と融合されているか、または追加のアミノ酸（例えば、リーダー配列もしくは分泌配列あるいは成熟ＬＣＭまたはプロタンパク質配列を精製するための配列）が成熟ＬＣＭに融合されている。
２．ＬＣＭタンパク質に対する抗体
本発明の例示的な実施形態は、ＬＣＭタンパク質に対する抗体を提供し、その抗体としては、例えば、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体；キメラ抗体、ヒト化抗体および完全ヒト抗体；ならびにそれらの抗原結合フラグメントおよびバリアント、そして他の実施形態が挙げられる。
ＬＣＭタンパク質に選択的に結合する抗体は、当業者に公知の標準的な手順を用いて作製され得る。用語「抗体」は、最も広い意味において使用され、具体的には、例えば、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、キメラ抗体、ヒト化抗体、完全ヒト抗体、およびＬＣＭ結合活性を示す限り抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、ＦｖおよびＦｖ含有結合タンパク質）を包含する。抗体（Ａｂ’ｓ）と免疫グロブリン（Ｉｇ ’ｓ）とは、典型的には同じ構造特性を有する糖タンパク質である。抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤおよびＩｇＡクラス、またはそれらのサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）であり得る。抗体は、「ＬＣＭ結合分子」と交換可能に称されることがある。
用語「モノクローナル抗体」とは、本明細書中で使用されるとき、実質的に均一な抗体の集団から得られた抗体のことを指し、すなわち、その集団を構成する個別の抗体は、微量で存在し得る天然に存在する可能性のある変異を除いて実質的に同一である。モノクローナル抗体は、高度に特異的であり、典型的には、単一の抗原性部位に対するものである。さらに、典型的には異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は、典型的には、抗原上の単一の決定基に対するものである。モノクローナル抗体は、特異性に加えて、実質的に相同な抗体が、他の免疫グロブリンまたは抗体によって汚染されていないハイブリドーマ培養物によって産生され得るという点において都合がよい。修飾語「モノクローナル」抗体は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体の性質を示すものであり、任意の特定の方法による抗体の作製が必要とされると解釈されるべきでない。例えば、モノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５−４９７（１９７５）によって記載されているようなハイブリドーマ法、組換え法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号に記載されているような）よって作製され得るか、またはＣｌａｃｋｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ３５２：６２４−６２８（１９９１）もしくはＭａｒｋｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７（１９９１）に記載されている手法を用いることなどによってファージ抗体ライブラリーから単離され得る。
非ヒト（例えば、マウスまたはウサギ）抗体の「ヒト化」型は、非ヒト免疫グロブリンから得られる最小配列を含む、キメラの免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖またはそのフラグメント（例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２または抗体の他の抗原結合部分配列）である。典型的には、ヒト化抗体は、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）であり、ここで、そのレシピエントの相補性決定領域（「ＣＤＲ」）由来の残基は、所望の特異性、親和性および能力を有する非ヒト種（ドナー抗体）（例えば、マウス、ラットまたはウサギ）のＣＤＲ由来の残基によって置換されている。いくつかの場合において、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基は、対応する非ヒト残基によって置換される。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、移入されるＣＤＲまたはフレームワーク領域（ＦＲ）配列にも、見られない残基を含み得る。これらの改変がなされることにより、抗体の性能をさらに洗練し、最適化することができる。通常、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的にすべてを含み得、ここで、そのＣＤＲのすべてまたは実質的にすべては、非ヒト免疫グロブリンのＣＤＲに対応し、ＦＲのすべてまたは実質的にすべては、ヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のＦＲである。ヒト化抗体は、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部、典型的には、ヒト免疫グロブリンの少なくとも一部も含み得る。ヒト化抗体に関するさらなる詳細については：Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｅｉｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３−３２７（１９８８）；Ｐｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３−５９６（１９９２）；Ｑｕｅｅｎら、米国特許第５，５３０，１０１号；同第５，５８５，０８９号；同第５，６９３，７６２号；および同第６，１８０，３７０号；ならびにＷｉｎｔｅｒ，米国特許第５，２２５，５３９号を参照のこと。
抗体は、本明細書中で使用されるとき、抗体フラグメント、特に抗原結合フラグメント、ならびに他の改変された抗体構造および抗原結合骨格（例えば、代表的な天然に存在する完全サイズのヒト抗体よりも小さいか、またはそのすべてではないドメインもしくは鎖を有する、改変された抗体構造）を含む。抗体フラグメントおよび他の改変された抗体構造および抗原結合骨格の例は、ミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｉｅｓ）（例えば、米国特許第５，８３７，８２１号）、ナノボディ（Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ）（ラマ重鎖抗体；Ａｂｌｙｎｘ，Ｇｈｅｎｔ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）、アドネクチン（Ａｄｎｅｃｔｉｎｓ）（フィブロネクチンドメイン；Ａｄｎｅｘｕｓ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）、アフィボディ（Ａｆｆｉｂｏｄｉｅｓ）（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓプロテインＡのタンパク質結合ドメイン；Ａｆｆｉｂｏｄｙ，Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ，Ｓｗｅｄｅｎ）、ペプチドアプタマー（合成ペプチド；Ａｐｔａｎｏｍｉｃｓ，Ｌｙｏｎ，Ｆｒａｎｃｅ）、アビマー（Ａｖｉｍｅｒｓ）（細胞表面レセプターから得られたＡドメイン；Ａｖｉｄｉａ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ（Ａｍｇｅｎによって獲得））、トランスボディ（Ｔｒａｎｓｂｏｄｉｅｓ）（トランスフェリン；ＢｉｏＲｅｘｉｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｋｉｎｇ ｏｆ Ｐｒｕｓｓｉａ，ＰＡ（Ｐｆｉｚｅｒによって獲得））、三量体化テトラネクチンドメイン（Ｂｏｒｅａｎ Ｐｈａｒｍａ，Ａａｒｈｕｓ，Ｄｅｎｍａｒｋ）、ドメイン抗体（重鎖または軽鎖抗体；Ｄｏｍａｎｔｉｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅによって獲得））、エビボディ（Ｅｖｉｂｏｄｉｅｓ）（Ｔ細胞レセプターＣＴＬＡ−４、ＣＤ２８および誘導性Ｔ細胞共刺激分子のＶ様ドメイン由来；ＥｖｏＧｅｎｉｘ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｓｙｄｎｅｙ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）、ｓｃＦＶフラグメント（安定な一本鎖抗体フラグメント；ＥＳＢＡＴｅｃｈ，Ｚｕｒｉｃｈ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、ユニボディ（Ｕｎｉｂｏｄｉｅｓ）（一価ＩｇＧ４ｍＡｂフラグメント；Ｇｅｎｍａｂ，Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ，Ｄｅｎｍａｒｋ）、ＢｉＴＥｓ（二重特異性Ｔ細胞活性化一本鎖抗体フラグメント；Ｍｉｃｒｏｍｅｔ，Ｍｕｎｉｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、ＤＡＲＰｉｎｓ（設計されたアンキリン反復タンパク質；Ｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｐａｒｔｎｅｒｓ，Ｚｕｒｉｃｈ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、アンチカリン（Ａｎｔｉｃａｌｉｎｓ）（リポカリン由来；Ｐｉｅｒｉｓ，Ｆｒｅｉｓｉｎｇ−Ｗｅｉｈｅｎｓｔｅｐｈａｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、アフィリン（Ａｆｆｉｌｉｎｓ）（ヒト水晶体タンパク質ガンマクリスタリン由来；Ｓｃｉｌ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｈａｌｌｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）およびＳＭＩＰｓ（小モジュール免疫薬剤（ｓｍａｌｌ ｍｏｄｕｌａｒ ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）；Ｔｒｕｂｉｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ）（Ｓｈｅｒｉｄａｎ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００７ Ａｐｒ；２５（４）：３６５−６）などの用語によって当該分野で公知である。
「単離された」または「精製された」抗体は、同定されており、かつそれが作製された環境の成分から分離されているおよび／または回収されている、抗体である。その作製環境の汚染成分は、その抗体に対する診断的または治療的な用途を妨害し得る材料であり、それらとしては、酵素、ホルモンおよび他のタンパク質性または非タンパク質性の溶質が挙げられ得る。例示的な実施形態において、抗体は、少なくとも３つの異なる方法のいずれかによって測定可能であるように：１）Ｌｏｗｒｙ法によって測定されるとき、９５重量％超、好ましくは、９９重量％超の抗体に；２）スピニングカップ配列決定装置を使用することによって、Ｎ末端または内部のアミノ酸配列の少なくとも１５残基を得るのに十分高い程度に；または３）クマシーブルー染色もしくは銀染色を用いる還元状態下もしくは非還元状態下におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥによって均一に、精製され得る。抗体の天然環境の少なくとも１つの成分が存在しないので、単離された抗体は、組換え細胞内のインサイチュの抗体を含み得る。しかしながら、通常、単離された抗体は、少なくとも１つの精製工程によって調製され得る。
「抗原性領域」、「抗原決定基」または「エピトープ」は、抗体に特異的に結合することができる任意のタンパク質決定基を含む。これは、異なる抗体分子の各々が結合する抗原上の部位である。エピトープ決定基は、アミノ酸または糖側鎖などの分子の活性表面グループ分けであり得、特異的な３次元構造特性または電荷特性を有し得る。
「抗体特異性」とは、第２の個別種由来の抗原のホモログに対する結合親和性よりも第１の個別種由来の抗原に対して強い結合親和性を有する抗体のことを指す。典型的には、抗体は、ヒト抗原に「特異的に結合する」（例えば、わずか約１×１０−７Ｍ、好ましくは、わずか約１×１０−８Ｍ、最も好ましくは、わずか約１×１０−９Ｍの結合親和性（Ｋｄ）値を有する）が、そのヒト抗原に対する結合親和性よりも少なくとも約５０倍、または少なくとも約５００倍、または少なくとも約１０００倍弱い第２の個別種由来の抗原のホモログに対する結合親和性を有する。それらの抗体は、本明細書中に記載されるような様々なタイプの抗体（例えば、ヒト化抗体または完全ヒト抗体）のいずれかであり得る。
抗体が、マーカータンパク質に結合し、かつ、無関係のタンパク質に有意に結合しないとき、その抗体は、そのマーカータンパク質に「選択的に」または「特異的に」結合する。抗体が、マーカータンパク質と実質的に相同的でない他のタンパク質にも結合するとしても、そのようなタンパク質が、そのマーカータンパク質のフラグメントまたはドメインと相同性を共有する限り、その抗体は、なおもそのマーカータンパク質に選択的または特異的に結合すると考えられ得る。この場合、そのマーカータンパク質に対する抗体結合性は、いくらかの程度の交差反応性にもかかわらず、なおも選択的であると理解され得る。
本発明の例示的な実施形態は、「抗体バリアント」を提供し、その抗体バリアントとは、アミノ酸残基の１つ以上が改変されている、抗体のアミノ酸配列バリアントのことを指す。そのようなバリアントは、必然的に、その抗体のアミノ酸配列と１００％未満の配列同一性を有し、そしてその抗体の重鎖または軽鎖の可変ドメインのいずかのアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％のアミノ酸配列同一性を有する。
用語「抗体フラグメント」とは、抗原結合領域もしくは可変領域またはその抗原結合部分を含む完全長抗体の一部のことを指す。抗体フラグメントの例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖフラグメントが挙げられる。典型的には、抗体のパパイン消化によって、Ｆａｂフラグメントと呼ばれる２つの同一の抗原結合フラグメントが生成され、その各々は、単一の抗原結合部位および残りの「Ｆｃ」フラグメントを有する。ペプシン処理によって、典型的には、抗原を架橋することができる２つの抗原結合フラグメントを有するＦ（ａｂ’）２フラグメントおよび残りの他のフラグメント（ｐＦｃ’と呼ばれる）が得られる。さらなる抗原結合フラグメントの例としては、ダイアボディ、トリアボディ（ｔｒｉａｂｏｄｉｅｓ）、テトラボディ（ｔｅｔｒａｂｏｄｉｅｓ）、一本鎖Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ−Ｆｃ、ＳＭＩＰｓおよび抗体フラグメントから形成された多重特異性抗体が挙げられ得る。抗体に関して、「機能的なフラグメント」とは、典型的には、Ｆｖ、Ｆ（ａｂ）、Ｆ（ａｂ’）２、または抗体と同じ抗原結合特異性を実質的に有する１つ以上のＣＤＲを含む他の抗原結合フラグメントのことを指す。
「Ｆｖ」フラグメントは、完全な抗原認識部位および結合部位を含む抗体フラグメントの例である。この領域は、典型的には、堅固な非共有結合での１つの重鎖可変ドメインと１つの軽鎖可変ドメインとの二量体からなる（ＶＨ−ＶＬ二量体）。この配置では、各可変ドメインの３つのＣＤＲが、ＶＨ−ＶＬ二量体の表面上に抗原結合部位を定義するように相互作用する。その６つのＣＤＲは、集団的に、抗体に抗原結合特異性を付与する。しかしながら、単一の可変ドメイン（または抗原に特異的な３つだけのＣＤＲを含む、Ｆｖの半分）でさえも、抗原を認識し、結合する能力を有する。
「Ｆａｂ」フラグメント（「Ｆ（ａｂ）」とも表される）も、軽鎖の定常ドメインおよび重鎖の第１定常ドメイン（ＣＨ１）を含む。Ｆａｂ’フラグメントは、重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシル末端においていくつかの残基（抗体ヒンジ領域由来の１つ以上のシステインを含む）が付加されていることによってＦａｂフラグメントと異なる。Ｆａｂ’−ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基が遊離チオール基を有するＦａｂ’に対する名称である。Ｆ（ａｂ’）フラグメントは、Ｆ（ａｂ’）２ペプシン消化産物のヒンジシステインにおいてジスルフィド結合を切断することによって生成される。抗体フラグメントのさらなる化学結合は、当業者に公知である。
「一本鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」抗体フラグメントは、ＶＨドメインおよびＶＬドメインを含み、ここで、これらのドメインは、単一のポリペプチド鎖に存在する。典型的には、Ｆｖポリペプチドは、ｓｃＦｖが抗原結合のために所望の構造を形成することができるポリペプチドリンカーをＶＨドメインとＶＬドメインとの間にさらに含む。ｓｃＦｖに関する概説として、Ｐｌｕｅｃｋｔｈｕｎ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ ａｎｄ Ｍｏｏｒｅ ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６９−３１５（１９９４）を参照のこと。一本鎖Ｆｖ−Ｆｃは、Ｆｃ領域に結合したｓｃＦｖである。
「ダイアボディ」は、２つの抗原結合部位を有する小さい抗体フラグメントであり、このフラグメントは、同じポリペプチド鎖において可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）に接続された可変重鎖ドメイン（ＶＨ）を含む。同じ鎖におけるそれらの２つのドメイン間で対形成することができないくらい短いリンカーを用いることによって、それらのドメインは、別の鎖の相補的なドメインと対形成せざるを得なくなり、２つの抗原結合部位が形成される。ダイアボディは、例えば、ＥＰ０４０４０９７；ＷＯ９３／１１１６１；およびＨｏｌｌｉｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：６４４４−６４４８（１９９３）においてより十分に説明されている。トリアボディ、テトラボディおよび他の抗原結合抗体フラグメントは、Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ ａｎｄ Ｈｕｄｓｏｎ，２００５，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２３：１１２６によって説明されている。
「小モジュラー免疫医薬（ｓｍａｌｌ ｍｏｄｕｌａｒ ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ）」（または「ＳＭＩＰ」）は、結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖまたは抗体の抗原結合部分）、ヒンジ領域およびエフェクタードメイン（例えば、抗体Ｆｃ領域またはその一部）を含む一本鎖ポリペプチドである。ＳＭＩＰは、公開されている米国特許出願番号２００５０２３８６４６に記載されている。
所与のマーカータンパク質に対する抗体を作製するためおよび／または同定するための多くの方法が知られている。いくつかのそのような方法は、Ｋｏｈｌｅｒら、１９７５，Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５−４９７；Ｌａｎｅ，１９８５，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．８１：２２３−２２８；Ｈａｒｌｏｗら、１９８８，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ；Ｈａｒｌｏｗら、１９９８，Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ；Ｚｈｏｎｇら、１９９７，Ｊ．Ｉｎｄｕｓｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１９（１）：７１−７６；およびＢｅｒｒｙら、２００３，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ａｎｄ Ｈｙｂｒｉｄｏｍｉｃｓ ２２（１）：２３−３１によって説明されている。
ポリクローナル抗体は、任意の公知の方法、またはこれらの方法の変法（患者から抗体を得ることを含む）によって調製され得る。ポリクローナル抗体などの抗体を作製するためのある特定の例示的な方法において、単離されたタンパク質は、哺乳動物の生物（例えば、ラット、ウサギまたはマウス）に投与される免疫原として使用され得る。例えば、ＬＣＭタンパク質（またはそのフラグメント）などの免疫原とキャリアタンパク質との複合体が、調製され得、そしてその複合体が動物に免疫され得る。そのタンパク質に対する抗体を含む血清または血漿が、免疫された動物から回収され、そしてその抗体が分離され、精製され得る（例えば、モノクローナル抗体に対する様式と同じ様式で）。ガンマグロブリン画分またはＩｇＧ抗体は、例えば、飽和硫酸アンモニウムもしくはＤＥＡＥ ＳＥＰＨＡＤＥＸを使用することによって、または当業者に公知の他の手法によって、得ることができる。抗血清における抗体価は、ハイブリドーマ培養物の上清における様式と同じ様式で測定され得る。
マーカー（例えば、完全長ＬＣＭタンパク質、抗原ペプチドフラグメント、その融合タンパク質または炭水化物抗原もしくはそれらのフラグメント）が、免疫原として使用され得る。免疫原として使用されるマーカーは、任意の特定のタイプの免疫原に限定されない。１つの局面において、抗体は、ＬＣＭの領域または別個のフラグメント（例えば、機能ドメイン、細胞外ドメインまたはそれらの一部）から調製され得る。抗体は、本明細書中に記載されるようなマーカーの任意の領域から調製され得る。特に、マーカーは、配列番号１〜６５、炭水化物抗原ＣＡ２４２、ＣＡ１９−９およびＣＡ７２−４ならびにそれらのフラグメントからなる群から選択され得る。抗原性フラグメントは、典型的には、例えば、少なくとも８、１０、１２、１４、１６個またはそれ以上連続したアミノ酸残基を含み得る。そのようなフラグメントは、マーカーの表面上に位置する領域（例えば、親水性領域）に対応するフラグメントなどの物理特性に基づいて選択され得るか、または配列独自性に基づいて選択され得る。
抗体は、リンパ球集団における産生を誘導することによって、またはＯｒｌａｎｄｉら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８６：３８３３−３８３７（１９８９））もしくはＷｉｎｔｅｒら（Ｎａｔｕｒｅ ３４９：２９３−２９９（１９９１））に開示されているような、抗体ライブラリーもしくは高度に特異的な結合試薬のパネルをスクリーニングすることによっても、作製され得る。ファージミドまたはＢリンパ球免疫グロブリンライブラリーのスクリーニングアッセイにおいてタンパク質を使用することにより、所望の特異性を有する抗体が同定され得る。確立された特異性を有するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を用いる競合的結合またはイムノアッセイについての多数のプロトコルが、当該分野で周知である（例えば、Ｓｍｉｔｈ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２：６６８−６７３（１９９１））。
抗体は、当該分野で公知の様々なファージディスプレイ法を用いても作製され得る。代表的なファージディスプレイ法において、機能的な抗体ドメインは、抗体ドメインをコードする核酸分子を有するファージ粒子の表面上にディスプレイされる。特に、そのようなファージは、レパートリーまたはコンビナトリアル抗体ライブラリー（例えば、ヒトまたはマウス）から発現される抗原結合ドメインをディスプレイするために利用され得る。目的の抗原に結合する抗原結合ドメインを発現するファージは、その抗原を用いて、例えば、標識された抗原、または固体表面もしくはビーズに結合されているか、もしくは捕捉されている抗原を用いて、選択され得るか、または同定され得る。これらのような方法において使用されるファージは、典型的には、ファージ遺伝子ＩＩＩまたは遺伝子ＶＩＩＩタンパク質に組換え的に融合されたＦａｂ、Ｆｖまたはジスルフィド安定化Ｆｖ抗体ドメインを有するファージから発現されるｆｄおよびＭ１３結合ドメインを含む繊維状ファージであり得る。抗体を作製するために使用され得るファージディスプレイ法の例としては、Ｂｒｉｎｋｍａｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １８２：４１−５０（１９９５）；Ａｍｅｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １８４：１７７−１８６（１９９５）；Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：９５２−９５８（１９９４）；Ｐｅｒｓｉｃら、Ｇｅｎｅ １８７：９−１８（１９９７）；Ｂｕｒｔｏｎら、Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ５７：１９１−２８０（１９９４）；ＰＣＴ公開番号ＰＣＴ／ＧＢ９１／０１１３４；ＰＣＴ公開ＷＯ９０／０２８０９；ＷＯ９１／１０７３７；ＷＯ９２／０１０４７；ＷＯ９２／１８６１９；ＷＯ９３／１１２３６；ＷＯ９５／１５９８２；ＷＯ９５／２０４０１；ならびに米国特許第５，６９８，４２６号；同第５，２２３，４０９号；同第５，４０３，４８４号；同第５，５８０，７１７号；同第５，４２７，９０８号；同第５，７５０，７５３号；同第５，８２１，０４７号；同第５，５７１，６９８号；同第５，４２７，９０８号；同第５，５１６，６３７号；同第５，７８０，２２５号；同第５，６５８，７２７号；同第５，７３３，７４３号および同第５，９６９，１０８号；（これらの各々は、その全体が本明細書中で参考として援用される）に記載されている方法が挙げられる。
抗体、抗原結合フラグメントおよび／または抗体バリアントは、当該分野で周知の組換え法および遺伝子操作法によって作製され得る。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて重鎖遺伝子および軽鎖遺伝子を発現させる方法は、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９０１４４３、ＷＯ９０１４４３およびＷＯ９０１４４２４ならびにＨｕｓｅら、１９８９ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５−１２８１に記載されている。抗体バリアントを作製するなどのために組換え手法を用いるとき、その抗体バリアントは、細胞内、細胞周辺腔に産生され得るか、または培地中に直接分泌され得る。抗体バリアントが細胞内に産生される場合、第１工程として、その粒状の残骸、宿主細胞または溶解されたフラグメントを、例えば、遠心分離または限外濾過によって取り出し得る。Ｃａｒｔｅｒら（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：１６３−１６７（１９９２））は、Ｅ．ｃｏｌｉの細胞周辺腔に分泌された抗体を単離するための手順を記載している。簡潔には、細胞ペーストを約３０分間にわたって酢酸ナトリウム（ｐＨ３．５）、ＥＤＴＡおよびフッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）の存在下において融解する。遠心分離によって細胞残屑を除去する。抗体バリアントが培地に分泌される場合、そのような発現系からの上清を、市販のタンパク質濃縮フィルター（例えば、ＡｍｉｃｏｎまたはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ ＰＥＬＬＩＣＯＮ限外濾過ユニット）を用いてまず濃縮する。ＰＭＳＦなどのプロテアーゼインヒビターを前述の任意の工程において含めることにより、タンパク質分解を阻害することができ、そして抗生物質を含めることにより、汚染微生物の成長を防止することができる。
細胞から調製された抗体組成物は、例えば、アフィニティークロマトグラフィ、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィ、ゲル電気泳動および／または透析を用いて、精製され得る。親和性リガンドとしてのプロテインＡの適合性は、典型的には、抗体の免疫グロブリンＦｃドメインの種類およびアイソタイプに依存する。プロテインＡは、ヒトデルタ１、デルタ２またはデルタ４重鎖に基づいて抗体を精製するために使用され得る（Ｌｉｎｄｍａｒｋら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈ．６２：１−１３（１９８３））。プロテインＧは、すべてのマウスアイソタイプおよびヒトデルタ３に対して使用され得る（Ｇｕｓｓら、ＥＭＢＯ Ｊ．５：１５６７−１５７５（１９８６））。親和性リガンドが付着されるマトリックスは、例えば、アガロース、またはコントロールドポアガラス（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｐｏｒｅ ｇｌａｓｓ）もしくはポリ（スチレンジビニル）ベンゼンなどの機械的に安定しているマトリックスであり得る。抗体がＣＨ３ドメインを含む場合、ＢＡＫＥＲＢＯＮＤ ＡＢＸＴＭ樹脂（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ，Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ，Ｎ．Ｊ．）が、精製に使用され得る。抗体精製のための他の例示的な手法としては、イオン交換カラムにおける分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカにおけるクロマトグラフィ、ヘパリンセファロースにおけるクロマトグラフィ、陰イオンまたは陽イオン交換樹脂（例えば、ポリアスパラギン酸カラム）によるクロマトグラフィ、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび硫安塩析が挙げられるが、これらに限定されない。
任意の予備的な精製工程の後、目的の抗体を含む混合物中の夾雑物は、約２．５〜４．５のｐＨの溶出緩衝液を用いる、好ましくは、低塩濃度（例えば、約０〜０．２５Ｍの塩）において行われる、低ｐＨ疎水性相互作用クロマトグラフィによって除去され得る。
完全長抗体ならびに抗体フラグメントは、Ｍａｚｏｒら、“Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ，ｆｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｒｏｍ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ”，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００７ Ｍａｙ；２５（５）：５６３−５およびＳｉｄｈｕ，“Ｆｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｏｎ ｄｉｓｐｌａｙ”，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００７ Ｍａｙ；２５（５）：５３７−８などに記載されているように、Ｅ．ｃｏｌｉなどの細菌から発現され得、単離され得る。
抗体に関するさらなる詳細は、以下の米国特許：第６，２４８，５１６号（Ｗｉｎｔｅｒら）；第６，２９１，１５８号（Ｗｉｎｔｅｒら）；第５，８８５，７９３号（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら）；第５，９６９，１０８号（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら）；第５，９３９，５９８号（Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉら）；第４，８１６，３９７号（Ｂｏｓｓら）；第４，８１６，５６７号（Ｃａｂｉｌｌｙら）；第６，３３１，４１５号（Ｃａｂｉｌｌｙら）；第５，７７０，４２９号（Ｌｏｎｂｅｒｇら）；第５，６３９，９４７号（Ｈｉａｔｔら）；および第５，２６０，２０３号（Ｌａｄｎｅｒら）（これらの各々は本明細書中で参考として援用される）、そして以下の公開されている米国特許出願：ＵＳ２００４０１３２１０１（Ｌａｚａｒら）、ＵＳ２００５００６４５１４（Ｓｔａｖｅｎｈａｇｅｎら）、ＵＳ２００４０２６１１４８（Ｄｉｃｋｅｙら）およびＵＳ２００５００１４９３４（Ｈｉｎｔｏｎら）（これらの各々は本明細書中で参考として援用される）において説明されている。抗体工学は、Ｊａｉｎら、“Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｏｒ ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００７ Ｊｕｌ；２５（７）：３０７−１６にさらに説明されている。
３．ＬＣＭタンパク質に対する抗体−薬物結合体
ＬＣＭに対する抗体は、適当な治療薬（本明細書中でさらに考察されるような）と、直接または間接的に（例えば、リンカー基を介して）連結され得る（例えば、共有結合的に結合され得る）。抗体および治療薬の各々が、他方と反応することができる置換基を有するとき、その抗体と治療薬との直接的な反応が可能である。例えば、一方の分子上のアミノ基またはスルフヒドリル基などの求核基は、他方の分子上の、カルボニル含有基（例えば、無水物または酸ハロゲン化物）または優良な脱離基（例えば、ハロゲン化物）を含むアルキル基と反応することができることがある。
あるいは、リンカー基を介して治療薬と抗体とを連結させることが望ましい場合がある。リンカー基は、結合能の妨害を避けるために、抗体と薬剤とに間隔をおくスペーサーとして機能し得る。リンカー基は、薬剤上または抗体上の置換基の化学反応性を高めるためにも働き得るがゆえに、連結効率が高まる。化学反応性の増大は、薬剤または薬剤上の官能基の使用を容易にもし得、これは、他の方法では不可能であり得る。
種々の二官能性または多官能性の試薬、ホモ官能性とヘテロ官能性（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌ．のカタログに記載されているようなもの）の両方が、リンカー基として使用され得る。結合は、例えば、アミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基または酸化型炭水化物残基を介して行われ得る（例えば、米国特許第４，６７１，９５８号）。
治療薬が、免疫複合体の抗体部分を含まないときにより強力である場合、細胞内への内部移行中または内部移行時に切断可能なリンカー基を使用することが望ましい場合がある。いくつかの異なる切断可能なリンカー基が、報告されている。これらのリンカー基からの薬物の細胞内放出についての機序としては、ジスルフィド結合の還元（例えば、米国特許第４，４８９，７１０号）、光性（ｐｈｏｔｏｌａｂｉｌｅ）結合の照射（例えば、米国特許第４，６２５，０１４号）、誘導体化されたアミノ酸側鎖の加水分解（例えば、米国特許第４，６３８，０４５号）、血清補体媒介性の加水分解（例えば、米国特許第４，６７１，９５８号）、プロテアーゼ切断可能リンカー（例えば、米国特許第６，２１４，３４５号）および酸触媒加水分解（例えば、米国特許第４，５６９，７８９号）による切断が挙げられる。
抗体に２以上の薬剤を連結させることが望ましい場合がある。複数の薬剤の分子が、１つの抗体分子に連結され得、そして２以上のタイプの薬剤が、同じ抗体に連結され得る。例えば、約１、２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０または２２個（または他の任意の中間の数）の分子の治療薬が、抗体に連結され得る。結合体化反応物の調製における抗体分子１つあたりの治療薬分子の平均数または定量的な分布は、従来の手段（例えば、質量分析、ＥＬＩＳＡまたはＨＰＬＣ）によって測定され得る。結合体化されるある特定の数の治療薬を有する均一な抗体−薬物結合体の分離、精製および特徴付けは、逆相ＨＰＬＣまたは電気泳動などの手段によって達成され得る（例えば、Ｈａｍｂｌｅｔｔら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１０：７０６３−７０（２００４）を参照のこと）。
抗体に結合体化され得る適当な治療薬の例としては、化学療法剤（例えば、細胞傷害剤もしくは細胞分裂抑制剤または免疫調節剤）、放射性治療薬、治療抗体、小分子薬物、ペプチド薬物、免疫調節剤、分化誘導剤およびトキシンが挙げられるが、これらに限定されない。
細胞傷害剤または免疫調節剤の有用なクラスの例としては、抗チューブリン剤、アウリスタチン（ａｕｒｉｓｔａｔｉｎｓ）、ＤＮＡ副溝結合剤、ＤＮＡ複製阻害剤、アルキル化剤（例えば、白金錯体（例えば、シスプラチン、モノ（白金）、ビス（白金）および三核クラスター白金錯体）およびカルボプラチン）、アントラサイクリン、抗生物質、抗葉酸剤、代謝拮抗物質、化学療法増感剤、デュオカルマイシン、エトポシド、フッ化ピリミジン、イオノフォア、レキシトロプシン（ｌｅｘｉｔｒｏｐｓｉｎｓ）、ニトロソ尿素、プラチノール（ｐｌａｔｉｎｏｌｓ）、予備成形化合物、プリン代謝拮抗物質、ピューロマイシン、照射増感剤、ステロイド、タキサン、トポイソメラーゼインヒビター、ビンカアルカロイドなどが挙げられるが、これらに限定されない。
個別の細胞傷害剤または免疫調節剤の例としては、アンドロゲン、アントラマイシン（ＡＭＣ）、アスパラギナーゼ、５−アザシチジン、アザチオプリン、ブレオマイシン、ブスルファン、ブチオニンスルホキシミン、カリケアマイシンまたはカリケアマイシン誘導体、カンプトテシンまたはカンプトテシン誘導体、カルボプラチン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）、ＣＣ−１０６５、クロラムブシル、シスプラチン、コルヒチン、シクロホスファミド、シチジンアラビノシド（シタラビン）、サイトカラシンＢ、ダカルバジン、ダクチノマイシン（以前はアクチノマイシン）、ダウノルビシン、ダカルバジン、ドセタキセル、ドキソルビシン、エトポシド、エストロゲン、５−フルオロデオキシウリジン、５−フルオロウラシル、ゲムシタビン、グラミシジンＤ、ヒドロキシ尿素、イダルビシン、イホスファミド、イリノテカン、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、メイタンシン、メクロレタミン、メルファラン、６−メルカプトプリン、メトトレキサート、ミトラマイシン、マイトマイシンＣ、ミトキサントロン、ニトロイミダゾール、パクリタキセル、パリトキシン、プリカマイシン、プロカルビジン（ｐｒｏｃａｒｂｉｚｉｎｅ）、リゾキシン、ストレプトゾトシン、テノポシド（ｔｅｎｏｐｏｓｉｄｅ）、６−チオグアニン、チオＴＥＰＡ、トポテカン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビノレルビン、ＶＰ−１６およびＶＭ−２６が挙げられるが、これらに限定されない。
他の適当な細胞傷害剤の例としては、ＤＮＡ副溝結合剤（例えば、エンジインおよびレキシトロプシン、ＣＢＩ化合物；米国特許第６，１３０，２３７号もまた参照のこと）、デュオカルマイシン、タキサン（例えば、パクリタキセルおよびドセタキセル）、ピューロマイシン、ビンカアルカロイド、ＣＣ−１０６５、ＳＮ−３８、トポテカン、モルホリノ−ドキソルビシン、リゾキシン、シアノモルホリノ−ドキソルビシン、エキノマイシン、コンブレタスタチン（ｃｏｍｂｒｅｔａｓｔａｔｉｎ）、ネトロプシン、エポチロンＡおよびＢ、エストラムスチン、クリプトフィシン（ｃｒｙｐｔｏｐｈｙｓｉｎｓ）、セマドチン（ｃｅｍａｄｏｔｉｎ）、メイタンシノイド、ディスコデルモリド（ｄｉｓｃｏｄｅｒｍｏｌｉｄｅ）、エレウセロビン（ｅｌｅｕｔｈｅｒｏｂｉｎ）ならびにミトキサントロンが挙げられるが、これらに限定されない。
他の適当な薬剤の例としては、放射性核種、分化誘導剤、薬物、トキシンおよびそれらの誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。例示的な放射性核種としては、９０Ｙ、１２３Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、２１１Ａｔおよび２１２Ｂｉが挙げられる。例示的な薬物としては、メトトレキサートならびにピリミジンアナログおよびプリンアナログが挙げられる。例示的な分化誘導剤としては、ホルボールエステルおよび酪酸が挙げられる。例示的なトキシンとしては、リシン、アブリン、ジフテリア毒素、コレラ毒素、ゲロニン（ｇｅｌｏｎｉｎ）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素、Ｓｈｉｇｅｌｌａ毒素およびアメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質が挙げられる。
いくつかの実施形態において、抗体−薬物結合体において使用される治療薬は、抗チューブリン剤である。抗チューブリン剤の例としては、タキサン（例えば、Ｔａｘｏｌ（登録商標）（パクリタキセル）、Ｔａｘｏｔｅｒｅ（登録商標）（ドセタキセル））、Ｔ６７（Ｔｕｌａｒｉｋ）およびビンカアルカロイド（例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシンおよびビノレルビン）が挙げられるが、これらに限定されない。他の抗チューブリン剤としては、例えば、バッカチン誘導体、タキサンアナログ（例えば、エポチロンＡおよびＢ）、ノコダゾール、コルヒチンおよびコルセミド、エストラムスチン、クリプトフィシン、セマドチン、メイタンシノイド、コンブレタスタチン、ディスコデルモリドおよびエレウセロビン（ｅｌｅｕｔｈｅｒｏｂｉｎ）が挙げられる。
ある特定の実施形態において、細胞傷害剤は、別の群の抗チューブリン剤であるメイタンシノイドである。例えば、特定の実施形態において、メイタンシノイドは、メイタンシン、ＤＭ−１（ＩｍｍｕｎｏＧｅｎ，Ｉｎｃ．；Ｃｈａｒｉら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５２：１２７−１３１（１９９２）もまた参照のこと）またはＤＭ−４である。
いくつかの実施形態において、治療薬は、アウリスタチンＥ（ドラスタチン−１０としても当該分野で公知）などのアウリスタチンまたはその誘導体である。典型的には、アウリスタチンＥ誘導体は、例えば、アウリスタチンＥとケト酸との間で形成されるエステルである。例えば、アウリスタチンＥは、パラアセチル安息香酸またはベンゾイル吉草酸と反応することにより、それぞれＡＥＢおよびＡＥＶＢが生成され得る。他の代表的なアウリスタチン誘導体としては、ＡＦＰ、ＭＭＡＦおよびＭＭＡＥが挙げられる。アウリスタチン誘導体の合成および構造は、米国特許出願公開番号２００３−００８３２６３、２００５−０２３８６４９および２００５−０００９７５１；ＰＣＴ公開番号ＷＯ０４／０１０９５７およびＷＯ０２／０８８１７２、ならびに米国特許第６，３２３，３１５号；同第６，２３９，１０４号；同第６，０３４，０６５号；同第５，７８０，５８８号；同第５，６６５，８６０号；同第５，６６３，１４９号；同第５，６３５，４８３号；同第５，５９９，９０２号；同第５，５５４，７２５号；同第５，５３０，０９７号；同第５，５２１，２８４号；同第５，５０４，１９１号；同第５，４１０，０２４号；同第５，１３８，０３６号；同第５，０７６，９７３号；同第４，９８６，９８８号；同第４，９７８，７４４号；同第４，８７９，２７８号；同第４，８１６，４４４号；および同第４，４８６，４１４号に記載されている。
４．ＬＣＭ核酸分子
本発明の例示的な単離されたＬＣＭ核酸分子は、例えば、本発明のＬＣＭタンパク質、その対立遺伝子バリアントまたはそれらのオルソログもしくはパラログをコードするヌクレオチド配列からなるか、それらから本質的になるか、またはそれらを含む。本明細書中で使用されるとき、「単離された」核酸分子は、その核酸の天然の起源に存在する他の核酸から分離されたものである。好ましくは、「単離された」核酸は、その核酸が由来する生物のゲノムＤＮＡにおいてその核酸と天然に隣接する配列（すなわち、その核酸の５’および３’末端に位置する配列）を含まない。しかしながら、いくつかの隣接するヌクレオチド配列、例えば、最大約５キロベース（ＫＢ）、４ＫＢ、３ＫＢ、２ＫＢまたは１ＫＢ以下、特に連続したタンパク質コード配列、および同じ遺伝子内であるがそのゲノム配列内のイントロンで分断されていないタンパク質コード配列、ならびに調節エレメントを含む隣接するヌクレオチド配列が存在し得る。主に考慮されることは、その核酸が、離れていて、かつ重要でない隣接配列から単離されていることであり、その結果、その核酸は、本明細書中に記載される特定の操作（例えば、組換え発現、プローブおよびプライマーの調製ならびに核酸分子に特異的な他の用途）に対して個性化され（ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｅｄ）得る。さらに、転写物／ｃＤＮＡ分子などの「単離された」核酸分子は、他の細胞性材料もしくは培養液（組換え手法によって生成されるとき）または化学前駆体もしくは他の化学物質（化学的に合成されるとき）を実質的に含まないだろう。
核酸分子は、他のコード配列または制御配列に融合され得、そしてそれはなおも単離されていると考えられ得る。単離された核酸分子は、組換え手法によって核酸分子に融合される異種ヌクレオチド配列などの異種ヌクレオチド配列を含み得る。例えば、ベクター内に含まれる組換えＤＮＡ分子は、単離されていると考えられる。単離されたＤＮＡ分子のさらなる例としては、異種宿主細胞内に維持されている組換えＤＮＡ分子、または溶液中の精製された（部分的または実質的に）ＤＮＡ分子が挙げられる。単離されたＲＮＡ分子には、単離されたＤＮＡ分子のインビボまたはインビトロでのＲＮＡ転写物が含まれる。単離された核酸分子は、合成的に生成されたそのような分子をさらに含む。
単離された核酸分子は、成熟タンパク質＋追加のアミノ末端もしくはカルボキシル末端のアミノ酸または成熟タンパク質の内部のアミノ酸（例えば成熟型が２個以上のペプチド鎖を有するとき）をコードし得る。そのような配列は、とりわけ、前駆体から成熟型へのタンパク質のプロセシングに関与し得、タンパク質輸送を促進し得、タンパク質半減期を延長し得るか、もしくは短縮し得、またはアッセイもしくは生成に対するタンパク質の操作を容易にし得る。一般にインサイチュである場合、追加のアミノ酸は、細胞の酵素によって成熟タンパク質からプロセシングされ得る。
単離された核酸分子としては、ＬＣＭタンパク質だけをコードする配列、追加のコード配列を有する成熟タンパク質をコードする配列（例えば、リーダー配列または分泌配列（例えば、プレプロまたはプロタンパク質配列））、および成熟タンパク質をコードする配列（追加のコード配列を含むかまたは含まない）＋追加の非コード配列（例えば、イントロンならびに非コード５’および３’配列（例えば、転写、ｍＲＮＡプロセシング（スプライシングシグナルおよびポリアデニル化シグナルを含む）、リボソーム結合および／またはｍＲＮＡの安定性に関与する転写されるが翻訳されない配列））が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、核酸分子は、例えば、精製を容易にするペプチドをコードするマーカー配列に融合され得る。
単離された核酸分子は、ｍＲＮＡなどのＲＮＡの形態、またはクローニングによって得られるか、もしくは化学的な合成手法によって生成されるｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡを含むＤＮＡの形態、あるいはそれらの組み合わせであり得る。核酸分子、とりわけＤＮＡは、二本鎖または一本鎖であり得る。一本鎖核酸は、コーディング鎖（センス鎖）または非コーディング鎖（アンチセンス鎖）であり得る。
本発明の例示的な実施形態は、ＬＣＭタンパク質のフラグメントをコードする単離された核酸分子ならびにＬＣＭタンパク質の明らかなバリアントをコードする核酸分子をさらに提供する。そのような核酸分子は、天然に存在し得る（例えば、対立遺伝子バリアント（同じ遺伝子座）、パラログ（異なる遺伝子座）およびオルソログ（異なる生物））か、または組換えＤＮＡ法もしくは化学合成によって構築され得る。そのような天然に存在しないバリアントは、突然変異誘発手法（核酸分子、細胞または生物に適用されるものを含む）によって作製され得る。したがって、核酸分子バリアントは、ヌクレオチドの置換、欠失、逆位および／または挿入を含み得る。バリエーションは、コード領域もしくは非コード領域のいずれか、またはそれら両方に存在し得、バリエーションは、保存的および／または非保存的なアミノ酸置換をもたらし得る。
核酸分子のフラグメントは、典型的には、少なくとも８、１０、１２、１５、１６、１８、２０、２２、２５、３０、４０、５０、１００、１５０、２００、２５０、５００ヌクレオチド長（または他の任意の中間の数）またはそれ以上連続したヌクレオチド配列を含む。フラグメントの長さは、その意図される用途に基づき得る。例えば、フラグメントは、タンパク質のエピトープ保有領域をコードし得るか、またはＤＮＡプローブおよびプライマーとして使用され得る。単離されたフラグメントは、例えば、公知の手法を用いてオリゴヌクレオチドプローブを合成することによって生成され得、必要に応じて標識されて使用されることにより、例えば、ｃＤＮＡライブラリー、ゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡをスクリーニングすることができる。プライマーは、遺伝子の特異的領域をクローニングするＰＣＲ反応において使用され得る。
プローブ／プライマーは、典型的には、精製されたオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド対を実質的に含む。オリゴヌクレオチドは、典型的には、少なくとも約８、１０、１２、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、４０、５０（または他の任意の中間の数）またはそれ以上連続したヌクレオチドにストリンジェントな条件下においてハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む。
対立遺伝子バリアント、オルソログおよびホモログは、当該分野で周知の方法を用いて同定され得る。これらのバリアントは、ヌクレオチド配列と典型的には６０〜７０％、７０〜８０％、８０〜９０％、９０〜９５％、９６％、９７％、９８％または９９％相同である、タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み得る。そのような核酸分子は、配列表に示されるヌクレオチド配列またはそのフラグメントに中程度からストリンジェントな条件下においてハイブリダイズすることができるとき、容易に同定され得る。
本明細書中で使用されるとき、用語「ストリンジェントな条件下においてハイブリダイズする」は、互いに少なくとも６０〜７０％相同なタンパク質をコードするヌクレオチド配列が、典型的には、互いにハイブリダイズされたままである、ハイブリダイゼーションおよび洗浄についての条件を説明すると意図される。それらの条件は、互いに少なくとも約６０％、少なくとも約７０％もしくは少なくとも約８０％またはそれ以上相同である配列が、典型的には、互いにハイブリダイズされたままであるような条件であり得る。そのようなストリンジェントな条件は、当業者に公知であり、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９−２００６），６．３．１−６．３．６に見られる。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の１つの例は、約４５℃での６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中のハイブリダイゼーションの後の、５０〜６５℃での０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中の１回以上の洗浄である。中程度から低いストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件の例は、当該分野で周知である。
本発明の例示的な実施形態は、生物学的サンプル中のＬＣＭ核酸（例えば、ＤＮＡまたはｍＲＮＡ）の存在を検出するためのキットも含む。例えば、キットは、生物学的サンプル中のＬＣＭ核酸を検出することができる、標識されたもしくは標識可能な核酸および／または他の薬剤などの試薬；サンプル中のＬＣＭ核酸の量を測定するための手段；およびサンプル中のＬＣＭ核酸の量を標準物質と比較するための手段を備え得る。その核酸および／または他の薬剤は、１つ以上の適当な容器内に包装され得る。そのキットは、ＬＣＭ核酸を検出するキットを使用するための指示をさらに備え得る。
５．ベクターおよび宿主細胞
本発明の例示的な実施形態は、ＬＣＭ核酸分子を含むベクターも提供する。用語「ベクター」とは、ＬＣＭ核酸分子を輸送し得る核酸分子などのビヒクルのことを指す。ベクターが核酸分子であるとき、ＬＣＭ核酸分子は、そのベクター核酸に共有結合的に連結される。ベクターは、例えば、プラスミド、一本鎖もしくは二本鎖ファージ、一本鎖もしくは二本鎖ＲＮＡもしくはＤＮＡウイルスベクター、または人工染色体（例えば、ＢＡＣ、ＰＡＣ、ＹＡＣまたはＭＡＣ）であり得る。
ベクターは、追加のコピーのＬＣＭ核酸分子を複製し、生成する場合、染色体外エレメントとして宿主細胞内で維持され得る。あるいは、ベクターは、宿主細胞が複製するとき、追加のコピーのＬＣＭ核酸分子を宿主細胞ゲノム内に組み込み得、生成し得る。
本発明の例示的な実施形態は、例えば、核酸分子を維持するためのベクター（クローニングベクター）および発現させるためのベクター（発現ベクター）を提供する。発現ベクターは、タンパク質配列の一部または全部を発現し得る。ベクターは、原核細胞もしくは真核細胞またはその両方において機能し得る（シャトルベクター）。ベクターには、ある核酸分子を細胞ゲノムなどの別の核酸分子に組み込む（例えば、インサイチュでの遺伝子および／または遺伝子産物の発現を変化させるために）挿入ベクターも含まれる。例えば、内在性のタンパク質コード配列は、１つ以上の特異的に導入された変異を含むタンパク質コード配列で、相同組換えを介して全体的または部分的に置換され得る。
発現ベクターは、核酸分子の転写が宿主細胞内で可能になるように、ベクター内において核酸分子に作動可能に連結されたシス作用性調節領域を含み得る。その核酸分子は、転写に影響することができる離れた核酸分子とともに宿主細胞内に導入され得る。その離れた核酸分子は、ベクターからの核酸分子の転写を可能にするシス調節の制御領域と相互作用する例えばトランス作用因子を提供し得る。あるいは、トランス作用因子は、宿主細胞によって供給され得る。したがって、トランス作用因子は、ベクター自体から生成され得る。しかしながら、核酸分子の転写および／または翻訳が無細胞系において生じ得ることが理解される。
ＬＣＭ核酸分子が作動可能に連結され得る制御配列には、例えば、ｍＲＮＡ転写を指示するためのプロモーターが含まれる。これらとしては、バクテリオファージ由来のレフト（ｌｅｆｔ）プロモーター、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のｌａｃ、ＴＲＰおよびＴＡＣプロモーター、ＳＶ４０由来の初期および後期プロモーター、ＣＭＶ前初期プロモーター、アデノウイルス初期および後期プロモーター、ならびにレトロウイルス末端反復配列が挙げられるが、これらに限定されない。
転写を促進する制御領域に加えて、発現ベクターは、リプレッサー結合部位およびエンハンサーなどの転写を調節する領域も含み得る。例としては、ＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス前初期エンハンサー、ポリオーマエンハンサー、アデノウイルスエンハンサーおよびレトロウイルスＬＴＲエンハンサーが挙げられる。
転写の開始および制御のための部位を含むことに加えて、発現ベクターは、転写終結に必要な配列、および転写される領域では翻訳のためのリボソーム結合部位も含み得る。発現のための他の調節性の制御領域としては、開始コドンおよび終始コドンならびにポリアデニル化シグナルが挙げられる。発現ベクターにおいて有用な数多くの制御配列が、当該分野で周知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．３ｒｄ．ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（２００１））。
種々の発現ベクターが、核酸分子を発現するために使用され得る。そのようなベクターとしては、染色体ベクター、エピソームベクターおよびウイルス由来ベクター、例えば、細菌プラスミド、バクテリオファージ、酵母エピソーム、酵母染色体エレメント（酵母人工染色体を含む）、ウイルス（例えば、バキュロウイルス、ＳＶ４０などのパポバウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、ポックスウイルス、偽狂犬病ウイルスおよびレトロウイルス）に由来するベクターが挙げられる。ベクターは、これらの起源の組み合わせ（例えば、プラスミド由来のものおよびバクテリオファージの遺伝的エレメント、例えば、コスミドおよびファージミド）にも由来し得る。原核生物宿主および真核生物宿主に対する適切なクローニングベクターおよび発現ベクターは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．３ｒｄ．ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（２００１）に記載されている。
制御配列は、１つ以上の宿主細胞において構成的発現を提供し得る（例えば、組織特異的）か、または温度、栄養素添加物もしくは外来性因子（例えば、ホルモンまたは他のリガンド）などによって１つ以上の細胞型において誘導性発現を提供し得る。原核生物宿主および真核生物宿主において構成的発現および誘導性発現を提供する種々のベクターが、当該分野で周知である。
核酸分子は、周知の方法によってベクター核酸内に挿入され得る。例えば、最終的に発現されるＤＮＡ配列は、１つ以上の制限酵素を用いてＤＮＡ配列および発現ベクターを切断し、次いでそれらのフラグメントを共にライゲーションすることによって、発現ベクターにつなげられ得る。制限酵素消化およびライゲーションについての手順は、当該分野で周知である。
目的の核酸分子を含むベクターは、周知の手法を用いて増殖または発現のために適切な宿主細胞内に導入され得る。細菌細胞としては、Ｅ．ｃｏｌｉ、ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓおよびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍが挙げられるが、これらに限定されない。真核細胞としては、酵母、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａなどの昆虫細胞、ＣＯＳおよびＣＨＯ細胞などの動物細胞（例えば、ＤＧ４４またはＣＨＯ−ｓ）ならびに植物細胞が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書中に記載されるように、タンパク質を融合タンパク質として発現することが望ましい場合がある。したがって、本発明の例示的な実施形態は、融合タンパク質の生成を可能にする融合ベクターを提供する。融合ベクターは、例えば、組換えタンパク質の発現を増加させ得る；組換えタンパク質の溶解性を増加させ得る、および／または親和性精製のためのリガンドとして作用することなどによってタンパク質の精製を助け得る。タンパク分解性の切断部位は、所望のタンパク質が最終的に融合部分から分離され得るように、融合部分の接合点に導入され得る。タンパク分解性酵素としては、Ｘａ因子、トロンビンおよび腸酵素（ｅｎｔｅｒｏｅｎｚｙｍｅ）が挙げられるが、これらに限定されない。代表的な融合発現ベクターとしては、ｐＧＥＸ（Ｓｍｉｔｈら、Ｇｅｎｅ ６７：３１−４０（１９８８））、ｐＭＡＬ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）およびｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）が挙げられ、これらは、それぞれグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合タンパク質またはプロテインＡを組換えマーカータンパク質に融合させるものである。適当な誘導性の非融合Ｅ．ｃｏｌｉ発現ベクターの例としては、ｐＴｒｃ（Ａｍａｎｎら、Ｇｅｎｅ ６９：３０１−３１５（１９８８））およびｐＥＴ １１ｄ（Ｓｔｕｄｉｅｒら、Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５：６０−８９（１９９０））が挙げられる。
組換えタンパク質発現は、遺伝的背景を提供することによって宿主細菌において最大にされ得、ここで、その宿主細胞は、組換えタンパク質をタンパク分解性に切断する能力を損なっている（Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ，Ｓ．，Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ（１９９０），ｐｐ．１１９−１２８）。あるいは、目的の核酸分子の配列は、Ｅ．ｃｏｌｉなどの特定の宿主細胞に対して優先的なコドン使用頻度を提供するように変更され得る（Ｗａｄａら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０：２１１１−２１１８（１９９２））。
ＬＣＭ核酸分子は、例えば、酵母宿主において発現ベクターによって発現され得る。酵母（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）における発現のためのベクターの例としては、ｐＹｅｐＳｅｃ１（Ｂａｌｄａｒｉら、ＥＭＢＯ Ｊ．６：２２９−２３４（１９８７））、ｐＭＦａ（Ｋｕｒｊａｎら、Ｃｅｌｌ ３０：９３３−９４３（１９８２））、ｐＪＲＹ８８（Ｓｃｈｕｌｔｚら、Ｇｅｎｅ ５４：１１３−１２３（１９８７））およびｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）が挙げられる。核酸分子は、例えば、バキュロウイルス発現ベクターを使用することにより、昆虫細胞においても発現され得る。培養昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９細胞）におけるタンパク質の発現に利用可能なバキュロウイルスベクターとしては、ｐＡｃシリーズ（Ｓｍｉｔｈら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．３：２１５６−２１６５（１９８３））およびｐＶＬシリーズ（Ｌｕｃｋｌｏｗら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７０：３１−３９（１９８９））が挙げられる。核酸分子は、哺乳動物発現ベクターを使用することにより、哺乳動物細胞においても発現され得る。哺乳動物発現ベクターの例としては、ｐＣＤＭ８（Ｓｅｅｄ，Ｂ．Ｎａｔｕｒｅ ３２９：８４０（１９８７））、ｐＭＴ２ＰＣ（Ｋａｕｆｍａｎら、ＥＭＢＯ Ｊ．６：１８７−１９５（１９８７））およびＣＨＥＦ（米国特許第５，８８８，８０９号）が挙げられる。
本明細書中に列挙される発現ベクターは、ＬＣＭ核酸分子を発現させるために有用であり得る、当業者が利用可能な周知のベクターの例としてのみ提供される。当業者は、ＬＣＭ核酸分子の維持、増殖および／または発現に適した他のベクターを承知しているだろう（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．３ｒｄ．ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（２００１）。
本発明の例示的な実施形態は、ＬＣＭ核酸分子が逆向きにベクター内にクローニングされているが、アンチセンスＲＮＡの転写を可能にする制御配列に作動可能に連結された、ベクターも包含する。したがって、コード領域および非コード領域を含むＬＣＭ核酸分子の全部または一部に対するアンチセンス転写物が生成され得る。このアンチセンスＲＮＡの発現は、センスＲＮＡの発現（例えば、制御配列、構成的発現または誘導性発現、組織特異的発現）に関して上に記載されたパラメータの各々に対して独特であり得る。
本発明の例示的な実施形態は、本明細書中に記載されるベクターを含む組換え宿主細胞を提供する。宿主細胞としては、例えば、原核細胞、酵母などの下等真核細胞、昆虫細胞などの他の真核細胞、および哺乳動物細胞などの高等真核細胞が挙げられる。
組換え宿主細胞は、当業者が容易に利用可能な手法によって、本明細書中に記載されるようなベクター構築物を細胞に導入することによって調製され得る。これらの手法としては、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介性トランスフェクション、陽イオン性脂質媒介性トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、感染、リポフェクション、マイクロインジェクションおよびＳａｍｂｒｏｏｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．３ｒｄ．ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（２００１）に見られるような他の手法が挙げられるが、これらに限定されない。
例えば、これらのような手法を用いて、レトロウイルスベクターまたは他のウイルスベクターが哺乳動物細胞内に導入され得る。レトロウイルスベクターが導入され得る哺乳動物細胞の例としては、初代哺乳動物培養物または継続的な哺乳動物培養物、ＣＯＳ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３、２９３細胞（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ１５７３）および樹状細胞が挙げられるが、これらに限定されない。
宿主細胞は、２個以上のベクターを含み得る。したがって、異なるヌクレオチド配列を同じ細胞の異なるベクターに対して導入することができる。同様に、目的の核酸分子は、単独で、または他の無関係な核酸分子（例えば、発現ベクターに対してトランス作用因子を提供するもの）とともに、導入され得る。２個以上のベクターが細胞に導入されるとき、それらのベクターは、独立して導入され得るか、同時に導入され得るか、または核酸分子ベクターに連結され得る。
バクテリオファージおよびウイルスベクターは、感染および形質導入についての標準的な手順によって、パッケージウイルスまたはカプセル化ウイルスとして細胞内に導入され得る。ウイルスベクターは、増殖性（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ−ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）または複製欠損であり得る。ウイルスの複製が欠損している場合、複製は、その欠損を補完する機能を提供する宿主細胞内で起き得る。
ベクターは、組換えベクター構築物を含む細胞の部分集団の選択を可能にする選択マーカーを含み得る。マーカーは、目的の核酸分子を含む同じベクター内に含められ得るか、または別個のベクター上に存在し得る。例示的なマーカーとしては、原核生物宿主細胞に対するテトラサイクリンまたはアンピシリン耐性遺伝子、および真核生物宿主細胞に対するジヒドロ葉酸還元酵素またはネオマイシン耐性が挙げられる。しかしながら、表現型形質についての選択を提供する任意のマーカーが使用され得る。
成熟タンパク質が、適切な制御配列の支配下において細菌、酵母、哺乳動物細胞および他の細胞内で生成され得るが、無細胞の転写系および翻訳系を使用することによってもまた、本明細書中に記載されるＤＮＡ構築物から得られるＲＮＡを用いて、これらのタンパク質を生成することができる。
タンパク質の分泌が望まれる場合、適切な分泌シグナルが、ベクターに組み込まれ得る。そのシグナル配列は、そのタンパク質に対して内在性または異種性であり得る。
タンパク質が培地中に分泌されない場合、そのタンパク質は、凍結／融解、超音波処理、機械的破砕、溶解剤の使用などをはじめとした標準的な破壊手順によって宿主細胞から単離され得る。次いで、タンパク質は、回収され得、そして例えば、硫安塩析、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィ、ホスホセルロースクロマトグラフィ、疎水性相互作用クロマトグラフィ、アフィニティークロマトグラフィ、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィ、レクチンクロマトグラフィまたは高速液体クロマトグラフィをはじめとした周知の精製方法によって精製され得る。
タンパク質の組換え生成において使用される宿主細胞に応じて、タンパク質は、様々なグリコシル化パターンを有し得るか、または細菌において生成されるときなどは、グリコシル化され得ないことも理解される。さらに、タンパク質は、いくつかの場合において宿主媒介性プロセスの結果として開始修飾メチオニンを含み得る。
ＬＣＭタンパク質を発現する組換え宿主細胞は、種々の用途を有する。例えば、そのような宿主細胞は、ＬＣＭタンパク質の生成に有用であり、それらが、さらに精製されることにより、所望の量のタンパク質またはそのフラグメントがもたらされ得る。したがって、発現ベクターを含む宿主細胞は、タンパク質の生成に有用である。
宿主細胞は、ＬＣＭタンパク質またはそのフラグメントに関する細胞ベースのアッセイを行うことためにも有用である。例えば、ＬＣＭタンパク質を発現する組換え宿主細胞を使用することにより、タンパク質の機能を刺激するかまたは阻害する化合物をアッセイすることができる。
宿主細胞は、タンパク質の機能が影響される変異ＬＣＭタンパク質を同定するためにも有用である。変異タンパク質を発現する宿主細胞は、特に、変異タンパク質が天然に存在し、かつ病理を生じる場合、その変異タンパク質に対して所望の効果（例えば、機能の刺激または阻害）を有する化合物をアッセイするために有用である。
６．通常の診断および処置
以下の用語は、本明細書および特許請求の範囲において使用されるとき、別段記載されない限り、以下に定義されるような意味を有すると意図される。
本明細書中で使用されるとき、「生物学的サンプル」（または単に「サンプル」）は、例えば、組織、血液、血清、細胞、細胞株または生体液（例えば、血漿、間質液、尿、脳脊髄液）などを含み得る。生物学的サンプルは、典型的には、必ずではないが、医療従事者によって個体から得られる。
本明細書中で使用されるとき、「個体」は、哺乳動物個体または非哺乳動物個体、好ましくは、哺乳動物個体であり得る。哺乳動物個体は、ヒトまたは非ヒト、好ましくは、ヒトであり得る。用語「個体」、「個体」および「患者」は、本明細書中で交換可能に使用される。
「健常」または「正常」な個体または生物学的サンプルは、従来の診断方法を用いることによって確かめられるとき、目的の疾患（例えば、肺癌）が検出可能でない個体または生物学的サンプルである（そのような生物学的サンプルは、「コントロール」サンプルと交換可能に称されることがある）。
本明細書中で使用されるとき、「疾患」には、癌、とりわけ、気道消化器癌、特に肺癌、ならびに関連の疾患および病状（例えば、他の肺疾患）が含まれる。
用語「診断する（ｄｉａｇｎｏｓｅ）」（または「診断する（ｄｉａｇｎｏｓｉｎｇ）」など）とは、疾患状態の現在の状況または現状（例えば、存在／非存在または特徴）を判定する（例えば、まず、疾患の存在を検出するか、疾患を特徴付ける／分類するか、または疾患の進行、緩解もしくは再発を検出する）ことを指す。
用語「予後判定する（ｐｒｏｇｎｏｓｅ）」（または「予後判定する（ｐｒｏｇｎｏｓｉｎｇ）」など）とは、疾患を有する患者におけるその疾患の未来の経過を予測する（例えば、患者の生存を予測する）ことを指す。
用語「評価する（ａｓｓｅｓｓ）」（または「評価する（ａｓｓｅｓｓｉｎｇ）」など）は、「診断する」および「予後判定する」を包含し得るが、疾患を有していない個体においてその疾患についての未来の判定／予測を行うこと、または見かけ上は疾患が治癒している個体においてその疾患が再発する可能性の判定／予測を行うことも包含し得る。用語「評価する」は、治療に対する個体の応答の評価を行うこと（例えば、個体が治療薬に対して好ましく応答する可能性があるか否か、または治療薬に対して応答する可能性がないか否か（または例えば毒性もしくは他の望ましくない副作用を起こすか）を予測すること、個体に投与するための治療薬を選択すること、または個体に適用されている治療に対する個体の応答をモニターすることもしくは判定することも包含し得る。
したがって、肺癌を「評価する」には、例えば、肺癌の未来の経過を予後判定すること；見かけ上は肺癌が治癒している個体における肺癌の再発を予測すること；および／あるいは個体のＬＣＭプロファイル（すなわち、その個体における１つ以上のＬＣＭの異なる存在量レベル）に基づいて、肺癌の処置に対する個体の応答を判定することもしくは予測すること、または個体に適用する肺癌の処置を選択することが含まれ得る。
以下の例は、肺癌を「診断する」または「評価する」のいずれかと称されることがある：まず、肺癌の存在を検出すること；肺癌の特定の病期、タイプもしくはサブタイプまたは他の分類もしくは特徴を判定すること；肺の病変が良性の病変であるか、または悪性の肺腫瘍であるかを判定すること；および／または肺癌の進行（例えば、肺腫瘍の成長または転移拡散をモニターする）、緩解もしくは再発を検出する／モニターすること。
ゆえに、ＬＣＭは、他の用途の中でも「予後判定マーカー」（例えば、疾患の進行を予測する）および「予測マーカー」（例えば、薬物応答を予測する）として有用である。
疾患を「処置する（Ｔｒｅａｔ）」、「処置する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」または「処置」には：（１）その疾患を阻害すること、すなわち、疾患またはその臨床症状の発生を停止することもしくは減少させること、または（２）疾患を軽減すること、すなわち、疾患またはその臨床症状の後退を引き起こすことが含まれる。
用語「予防」は、「処置」と区別するために使用され、そして「防止する」と「抑制する」の両方が包含される。最終的な誘導性の事象が不明であり得るか、不顕性であり得るか、またはその事象の発生後、十分な時間が経過するまでその患者を確かめられないので、必ずしも「防止する」と「抑制する」とを区別することができるわけではない。ゆえに、用語「保護」は、本明細書中で使用されるとき、「予防」を含むと意味される。
「治療有効量」は、疾患を処置するために個体に投与されるとき、その疾患に対してそのような処置をもたらすのに十分な薬剤の量を意味する。「治療有効量」は、薬剤、疾患およびその重症度、ならびに処置される個体の年齢、体重などのような因子に応じて変動し得る。
本発明の例示的な実施形態は、疾患、とりわけ癌、特に肺癌を処置するための方法を提供し、その方法は、患者に治療有効量のアンタゴニスト、アゴニストまたはそれらの薬学的組成物を投与する工程を包含する。本発明の例示的な実施形態は、ＬＣＭタンパク質に対するアゴニストおよびアンタゴニスト、ならびに薬学的に許容可能な賦形剤などの適当なキャリアとともにアゴニストまたはアンタゴニストを含む薬学的組成物をさらに提供する。
例示的なアゴニストまたはアンタゴニストは、ＬＣＭタンパク質に特異的に結合する抗体を含む。抗体は、単独で、または１つ以上の他の治療薬と併用して（例えば、抗体−薬物結合体または併用療法として）使用され得る。アンタゴニストとして使用され得る分子のさらなる例としては、ＬＣＭの機能または存在量レベルを阻害する小分子、およびＬＣＭ核酸に特異的にハイブリダイズするＲＮＡｉまたはアンチセンス核酸分子などの阻害性核酸分子が挙げられるが、これらに限定されない。
本発明の例示的な実施形態は、本明細書中に記載されるスクリーニングアッセイなどのＬＣＭを用いるスクリーニングアッセイによって同定される新規薬剤、ならびに処置または診断などの目的のためにこれらの薬剤を使用する方法をさらに包含する。例えば、本明細書中に記載されるように同定される薬剤（例えば、ＬＣＭ調節剤、ＲＮＡｉもしくはアンチセンス分子などのＬＣＭ特異的核酸分子、ＬＣＭ特異的抗体、ＬＣＭ特異的抗体−薬物結合体、またはＬＣＭ−結合パートナー）は、動物モデルまたは他のモデルにおいて、その薬剤を用いる処置の有効性、毒性または副作用を判定するなどのために使用され得る。
本明細書中に記載される薬物スクリーニングアッセイに従って同定される調節因子（ｍｏｄｕｌａｔｏｒｓ）などのＬＣＭタンパク質活性の調節因子は、例えば、異なるレベルでＬＣＭを発現する細胞または組織を処置することによって、ＬＣＭによって媒介される障害を有する個体を処置するために使用され得る。処置の方法は、薬学的組成物中のＬＣＭ活性の調節因子を、そのような処置の必要のある個体に投与する工程を包含し得る。
ある特定の例示的な実施形態において、タンパク質の発現または活性の低下が望まれる場合、そのタンパク質に対する抗体もしくはインヒビター／アンタゴニストなど、またはこれらの分子の１つ以上を含む医薬品が、個体に投与され得る。他の例示的な実施形態において、タンパク質の発現または活性の増加が望まれる場合、そのタンパク質自体もしくはアゴニスト／エンハンサーなど、またはこれらの分子の１つ以上を含む医薬品が投与され得る。投与は、当該分野で周知の方法によってもたらされ得、その投与としては、そのタンパク質に対して特異的に標的化された抗体による送達が挙げられ得る。タンパク質の発現または活性の低下が望まれるとき、二量体形成を阻害する中和抗体が、使用され得る。
調節剤は、純粋または実質的に純粋な形態で投与され得るが、調節剤は、キャリアを含む薬学的組成物、処方物または調製物としても投与され得る。ヒトまたは動物において使用するためなどの本発明の例示的な処方物は、１つ以上の薬学的に許容可能なキャリア、および必要に応じて、他の治療的な成分とともに、適当な活性なＬＣＭ調節剤を含む。そのキャリアは、処方物の他の成分と適合性であり、そのレシピエントにとって有害でないという意味において「許容可能である」。処方物は、単位剤形で存在し得、そして当業者に公知の任意の方法によって調製され得る。
適当な薬学的キャリアの例としては、アルブミンなどのタンパク質（例えば、米国特許第４，５０７，２３４号）、ペプチドおよびアミノデキストランなどの多糖（例えば、米国特許第４，６９９，７８４号）ならびに水が挙げられる。キャリアは、非共有結合、またはリポソームベシクル内などへのカプセル封入（例えば、米国特許第４，４２９，００８号および同第４，８７３，０８８号）によっても薬剤を保有し得る。放射性核種物質に特異的なキャリアとしては、放射性ハロゲン化（ｒａｄｉｏｈａｌｏｇｅｎａｔｅｄ）小分子およびキレート化合物が挙げられる。例えば、米国特許第４，７３５，７９２号には、代表的な放射性ハロゲン化小分子およびその合成が開示されている。放射性核種キレートは、金属、金属酸化物、放射性核種と結合するためのドナー原子として窒素原子および硫黄原子を含むキレート化合物を包含するキレート化合物から形成され得る。例えば、米国特許第４，６７３，５６２号には、代表的なキレート化合物およびその合成が開示されている。
薬学的処方物を調製する方法は、典型的には、活性成分を、１つ以上の副成分を構成するキャリアと会合させる工程を包含する。処方物は、活性成分を液体キャリアもしくは微粉化された固体キャリアまたはその両方と一様かつ緊密に会合させ、次いで、必要であればその生成物を所望の処方物に成形することによって調製され得る。
静脈内、筋肉内、皮下または腹腔内の投与に適した処方物は、レシピエントの血液と等張性であり得る溶液とともに活性成分の滅菌水溶液を含み得る。そのような処方物は、塩化ナトリウム（例えば、０．１〜２．０Ｍ）、グリシンなどの生理的に適合性の物質を含みかつ生理学的状態と適合性の緩衝ｐＨを有する水に固体の活性成分を溶解することにより水溶液をもたらし、そしてその溶液を滅菌にすることによって調製され得る。これらは、単位用量または複数回用量の容器、例えば、密閉されたアンプルまたはバイアル内に入れられ得る。
本発明の例示的な処方物は、安定剤を組み込み得る。例示的な安定剤としては、ポリエチレングリコール、タンパク質、糖類、アミノ酸、無機酸、界面活性剤および有機酸が挙げられ、これらは、単独で、または混合物として、使用され得る。これらの安定剤は、例えば、薬剤の１重量部あたり０．１１〜１０，０００重量部の量で組み込まれ得る。２つ以上の安定剤が使用されるべきである場合、それらの総量は、上で特定された範囲内であり得る。これらの安定剤は、適切な濃度およびｐＨにおいて水溶液として使用され得る。そのような水溶液の特定の浸透圧は、０．１〜３．０オスモルの範囲、好ましくは、０．８〜１．２の範囲であり得る。この水溶液のｐＨは、５．０〜９．０の範囲内、好ましくは、６〜８の範囲内であるように調整され得る。抗体または抗体−薬物結合体を製剤化する際、抗吸着剤が使用され得る。
追加の薬学的方法を使用することにより、作用の持続時間が制御され得る。放出制御は、タンパク質またはそれらの誘導体を複合体化させるかまたは吸収するポリマーを使用することによって、達成され得る。制御送達は、放出を制御するために、適切な高分子（例えば、ポリエステル、ポリアミノ酸、ポリビニル、ピロリドン、エチレン酢酸ビニル、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースまたは硫酸プロタミン）および高分子の濃度ならびに組み込む方法を選択することによって達成され得る。放出制御調製物によって作用の持続時間を制御する別の可能な方法は、抗ＬＣＭ抗体をポリマー材料（例えば、ポリエステル、ポリアミノ酸、ヒドロゲル、ポリ（乳酸）またはエチレン酢酸ビニル共重合体）の粒子に組み込むことである。あるいは、これらの薬剤をポリマー粒子に組み込む代わりに、これらの材料を、例えばコアセルベーション手法もしくは界面重合によって調製されたマイクロカプセル（例えば、それぞれヒドロキシメチルセルロースマイクロカプセルまたはゼラチンマイクロカプセルおよびポリ（メチルメタシレート）マイクロカプセル）内またはコロイド薬物送達系、例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセル、またはマクロエマルジョン内に封入することが可能である。
経口調製物が望まれるとき、組成物は、代表的なキャリア（例えば、とりわけ、ラクトース、スクロース、デンプン、タルク、ステアリン酸マグネシウム、結晶性セルロース、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、グリセリン、アルギン酸ナトリウムまたはアラビアゴム）と組み合わされ得る。
本明細書中に提供される任意の治療薬が、他の治療薬と併用して投与され得る。併用療法において使用するための薬剤の選択は、従来の薬学的原理に従って当業者によって行われ得る。治療薬の併用は、相乗的に作用することにより、低投与量の各薬剤で特定の障害の処置に影響し得る。
７．ＬＣＭタンパク質に基づく検出および診断の方法
ＬＣＭタンパク質は、疾患、特に、そのタンパク質が過剰発現しているかまたは過小発現している疾患、とりわけ癌、特に肺癌を診断するために有用である。その診断方法は、処置を受けている患者における疾患の進行をモニターするため、または例えば、以前、ある疾患について処置された患者における疾患の再発について試験するために、さらに適当であり得る。したがって、本発明の例示的な実施形態は、生物学的サンプル中のＬＣＭタンパク質の存在または存在量レベルを検出するための方法を提供する。
タンパク質を検出するためのインビトロの手法としては、抗体またはタンパク質結合剤などの検出試薬を用いる、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、ウエスタンブロット、免疫沈降および免疫蛍光法が挙げられるが、これらに限定されない。あるいは、タンパク質は、タンパク質マーカーに特異的な標識された抗体（または他のタイプの検出剤）を個体に導入することによって、個体においてインビボで検出され得る。例えば、抗体は、放射性マーカーで標識され得、そのマーカーの個体内の存在および位置は、標準的なイメージング手法によって検出され得る。タンパク質のバリアント（例えば、対立遺伝子バリアントまたは変異）を検出する方法およびサンプル中のタンパク質のフラグメントを検出する方法もまた有用である。
本発明の例示的な実施形態に従って使用され得るイムノアッセイの例としては、ウエスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ、「サンドイッチ」イムノアッセイ、免疫沈降アッセイ、沈降反応、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、補体結合アッセイ、イムノラジオメトリックアッセイ、蛍光イムノアッセイおよびプロテインＡイムノアッセイ、ならびに蛍光偏光イムノアッセイ（ＦＰＩＡ）、蛍光イムノアッセイ（ＦＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）および比濁分析阻害イムノアッセイ（ＮＩＡ）などの手法を用いる競合的および非競合的アッセイが挙げられるが、これらに限定されない。これらのようなイムノアッセイは、当該分野で周知であり、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９９２−２００６に記載されている。
例えば、ＥＬＩＳＡは、１つ以上のＬＣＭを検出するためまたは定量化するために使用され得る。例えば、ＥＬＩＳＡ（または他のタイプのＬＣＭアッセイ）は、例えば、高リスクの個体もしくは集団、肺癌を有すると疑われる個体、または肺癌を有するという疑いのない個体（例えば、肺癌に対する通例のスクリーニングを受けている個体）において、ＬＣＭを検出するために使用され得る。
ある特定の例示的なＥＬＩＳＡ法では、ＬＣＭ抗原に特異的に結合する抗体を、適当な容器（例えば、９６ウェルマイクロタイタープレート）のウェルにコーティングし得、患者サンプル（例えば、血清サンプル）をそのウェルに加え得、ある時間にわたってインキュベートし得、そしてそのウェルにコーティングされている抗体に患者サンプル中のＬＣＭ抗原が結合した際に、その患者サンプル中のＬＣＭ抗原の存在が検出され得る。この場合、コーティングされたウェルに患者サンプルを加えた後に、検出可能な部分に結合体化された２次抗体が必要に応じて加えられ得る。これらのようなＥＬＩＳＡ法は、所望のとおりに改変されてもよいし、最適化されてもよい。
さらに、ＬＣＭ抗原に対する抗体でウェルをコーティングする代わりに、そのＬＣＭ抗原自体をウェルにコーティングしてもよい。したがって、ある特定の例示的なＥＬＩＳＡ法では、ＬＣＭ抗原を適当な容器（例えば、９６ウェルマイクロタイタープレート）のウェルにコーティングし得、ＬＣＭ抗原に対する抗体（必要に応じて、西洋ワサビペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼのような酵素の基質などの検出可能部分に結合体化され得る）をそのウェルに加え得、ある時間にわたってインキュベートし得、そしてＬＣＭ抗原の存在を検出し得る。ＬＣＭ抗原に対する抗体は、検出可能部分に結合体化されなくてもよく；例えば、検出可能な部分に結合体化された２次抗体（ＬＣＭ抗原に対する抗体を認識する抗体）が、ウェルに加えられ得る。これらのようなＥＬＩＳＡ法は、所望のとおりに改変されてもよいし、最適化されてもよい。
タンパク質は、生物学的サンプルから（例えば、疾患を有する患者から）単離され得、そして変異の存在についてアッセイされ得る。変異には、例えば、１つ以上のアミノ酸の置換、欠失、挿入、転位（例えば、異常なスプライシング事象からの）または不適当な翻訳後修飾が包含され得る。タンパク質内の変異を検出するために有用な分析方法の例としては、電気泳動移動度の変化、トリプシンペプチド消化物の変化、細胞ベースのアッセイまたは無細胞アッセイにおけるタンパク質活性の変化、基質または抗体に結合するパターンの変化、等電点の変化、および直接的なアミノ酸配列決定が挙げられるが、これらに限定されない。
タンパク質を検出することによって得られる情報を用いることにより、例えば、予後および疾患に対する処置の適切な経過が判定され得る。例えば、特定のＬＣＭ発現レベルまたは疾患の病期を有する個体は、所与の処置に対して、ＬＣＭ発現を欠く個体またはＬＣＭを過剰発現もしくは過小発現している個体と異なって反応し得る。本発明の診断方法から得られる情報は、診断および処置の個性化を提供し得る。
例示的な実施形態において、本発明は、個体における疾患を診断する（例えば、処置の応答または処置後の疾患の再発をモニターすること含む）ための方法を提供し、その方法は：その個体由来の試験サンプル中のＬＣＭ（例えば、ＬＣＭタンパク質もしくは核酸またはそのタンパク質フラグメントもしくは核酸フラグメント）の存在量レベルを測定する工程を包含し；ここで、健常個体由来の試験サンプル中のＬＣＭの存在量レベルまたは健常個体に対して確立されたレベルとのＬＣＭの存在量レベルの差異は、疾患を示唆する。
本発明の例示的な実施形態は、異なるタンパク質発現を有する疾患を診断するための方法を提供する。例えば、正常値、コントロール値または標準値（例えば、健常個体におけるタンパク質の代表的な発現レベルを表す値）は、正常で健常な哺乳動物またはヒトの個体から採取された体液、組織または細胞の抽出物を、タンパク質に対する特異的な抗体と、複合体形成のための条件下において組み合わせることなどによって確立され得る。正常組織および疾患組織における複合体形成のための標準的な値は、測光的手段などの様々な方法によって確立され得る。複合体形成は、それが試験サンプル中で発現されるとき、標準的な値と比較され得る。正常基準からの逸脱および疾患基準に向かう逸脱は、疾患の診断または予後についてのパラメータを提供し得るが、疾患基準からの逸脱および正常基準に向かう逸脱は、例えば、処置の有効性を評価するために使用され得る。
特異的なポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のいずれかを使用して、タンパク質発現の尺度として複合体形成を検出するためおよび測定するための免疫学的方法は、当該分野で公知である。そのような手法の例としては、ＥＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡｓ）、フローサイトメトリー（蛍光励起細胞分取、すなわちＦＡＣＳとも称される）および抗体アレイが挙げられる。そのようなイムノアッセイは、典型的には、タンパク質とその特異的抗体との複合体形成の測定を含む。精製され標識された標準物質に対するこれらのアッセイおよびその定量化は、当該分野で周知である（Ａｕｓｕｂｅｌ，前出，ｕｎｉｔ１０．１−１０．６）。例えば、２つの非妨害エピトープに反応性である抗体を利用する２部位モノクローナルベースのイムノアッセイが、利用され得、そして競合結合アッセイもまた、利用され得る（Ｐｏｕｎｄ（１９９８）Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ Ｎ．Ｊ．）。
診断的に適用するために、抗体は、様々なイメージング方法による検出を容易にするなどのために、検出可能部分（「標識」または「検出可能物質」と交換可能に称される）で標識され得る。標識を検出するための方法としては、蛍光顕微鏡観察、光学顕微鏡観察、共焦点顕微鏡観察および電子顕微鏡観察；磁気共鳴画像法および分光法；透視、コンピュータ断層撮影およびポジトロン放出断層撮影が挙げられるが、これらに限定されない。適当な標識の例としては、フルオレセイン、ローダミン、エオシンおよび他のフルオロフォア、放射性同位体、金、ガドリニウムおよび他のランタニド、常磁性鉄、フッ素−１８ならびに他の陽電子放出放射性核種が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、標識は、二機能または多機能性であり得、そして列挙される２個以上の方法によって検出可能であり得る。抗体は、直接または間接的に標識され得る。抗体への標識の付着としては、当該分野で周知の他のものの中でも、標識の共有結合、抗体内への標識の組み込み、および標識を結合するためのキレート化合物の共有結合が挙げられる。
数多くの検出可能部分が、抗体を標識するために利用可能であり、それらとしては、以下のカテゴリーの中のものが挙げられるが、これらに限定されない：
（ａ）放射性同位体（例えば、３６Ｓ、１４Ｃ、１２５Ｉ、３Ｈおよび１３１Ｉ）。抗体は、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ １−２，Ｃｏｌｉｇｅｎら、Ｅｄ．，Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｐｕｂｓ．（１９９１−２００６）に記載されている手法を用いて放射性同位体で標識され得、放射能は、シンチレーション測定法を用いて測定され得る。
（ｂ）蛍光標識（例えば、希土類キレート（ユウロピウムキレート）またはフルオレセインおよびその誘導体、ローダミンおよびその誘導体、ダンシル、リサミン、フィコエリトリンならびにテキサスレッド）が利用可能である。蛍光標識は、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，前出に開示されている手法を用いて、抗体に結合体化され得る。蛍光は、蛍光光度計を用いて定量化され得る。
（ｃ）様々な酵素−基質標識が利用可能である（例えば、米国特許第４，２７５，１４９号および同第４，３１８，９８０号）。酵素は、通常、様々な手法を用いて測定され得る色素生産性基質の化学変化を触媒する。例えば、酵素は、基質における色の変化を触媒し得、それは、分光光度的に測定され得る。あるいは、酵素は、基質の蛍光または化学発光を変化させ得る。蛍光の変化を定量化するための手法は、本明細書中に記載され、また、当該分野で周知である。化学発光基質は、化学反応によって電子的に励起され、次いで、測定可能な（例えば、ケミルミノメーターを用いて）測定可能な光を放射し得るか、または蛍光アクセプターにエネルギーを供与する。酵素的標識の例としては、ルシフェラーゼ（例えば、ホタルルシフェラーゼおよび細菌ルシフェラーゼ；米国特許第４，７３７，４５６号）、ルシフェリン、２，３−ジヒドロフタラジンジオン、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ウレアーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）などのペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、糖類酸化酵素（例えば、グルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼおよびグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ）、複素環式オキシダーゼ（例えば、ウリカーゼおよびキサンチンオキシダーゼ）、ラクトペルオキシダーゼ、マイクロペルオキシダーゼなどが挙げられる。酵素を抗体に結合体化するための手法は、Ｏ’Ｓｕｌｌｉｖａｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｅ−Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ｆｏｒ Ｕｓｅ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｅ．（Ｅｄ．Ｊ．Ｌａｎｇｏｎｅ ＆ Ｈ．Ｖａｎ Ｖｕｎａｋｉｓ），Ａｃａｄｅｍｉｃ ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，７３：１４７−１６６（１９８１）に記載されている。
標識は、抗体と間接的に結合体化され得る。当業者は、これを達成するための様々な手法を承知しているだろう。例えば、抗体を、ビオチンと結合体化し得、そして上で述べた３つの広範なカテゴリーの標識のうちのいずれかをアビジンと結合体化し得るか、またはその逆を行う。ビオチンは、アビジンに選択的に結合するので、上記標識は、この間接的な様式で上記抗体と結合体化され得る。あるいは、標識と抗体との間接的な結合体化を達成するために、抗体を小さいハプテン（例えば、ジゴキシン）と結合体化し得、そして上で述べた異なるタイプの標識のうちの１つを抗ハプテン抗体（例えば、抗ジゴキシン抗体）と結合体化し得る。したがって、標識と抗体との間接的な結合体化が達成され得る。
抗体は、標準的な手法（例えば、アフィニティークロマトグラフィまたは免疫沈降）によってＬＣＭタンパク質を単離するために使用され得、そして抗体は、細胞からの天然タンパク質および宿主細胞において発現される組換え的に生成されるタンパク質の精製を容易にし得る。生物学的サンプルは、アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡまたはラジオイムノアッセイ）および形式（例えば、国際特許公開ＷＯ９３／０３３６７に記載されているようなマイクロウェル、計深棒など）によってＬＣＭタンパク質の存在について直接試験され得る。あるいは、サンプル中のタンパク質は、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）の存在下または非存在下においてサイズ分離され得（例えば、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）によって）、そしてＬＣＭの存在が、免疫ブロット法（例えば、ウエスタンブロッティング）によって検出され得る。
抗体の結合は、「サンドイッチ」イムノアッセイ、イムノラジオメトリックアッセイ、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、インサイチュイムノアッセイ（例えば、コロイド金、酵素または放射性同位体標識を使用して）、沈降反応、凝集アッセイ（例えば、ゲル凝集アッセイ、血球凝集アッセイなど）、補体結合アッセイ、免疫蛍光アッセイ、プロテインＡアッセイおよび免疫電気泳動アッセイなどによっても検出され得る。
ある特定の例示的な実施形態において、抗体の結合は、１次抗体上の標識を検出することによって検出され得る。他の例示的な実施形態において、１次抗体は、１次抗体への２次抗体または試薬の結合を検出することによって検出され得る。さらなる例示的な実施形態において、２次抗体が標識される。イムノアッセイにおいて結合を検出するための数多くの手段が、当該分野で公知であり、それらは、本発明の範囲内である。いくつかの実施形態において、自動化された検出アッセイが利用される。イムノアッセイを自動化するための方法は、当該分野で周知である（例えば、米国特許第５，８８５，５３０号：同第４，９８１，７８５号：同第６，１５９，７５０号：および同第５，３５８，６９１号（これらの各々が本明細書中で参考として援用される））。いくつかの実施形態において、結果の解析および表示もまた、自動化される。例えば、いくつかの実施形態において、１つ以上の抗原の存在または非存在に基づいて予後判定をもたらすソフトウェアが実行され得る。
競合結合アッセイは、典型的には、標識された標準物質が、限られた量の抗体との結合について試験サンプルと競合する能力に依存する。試験サンプル中の抗原の量は、抗体に結合した標準物質の量に反比例する。結合した標準物質の量の決定を容易にするために、抗体は、通常、競合の前または後に不溶化される。結果として、抗体に結合している標準物質および試験サンプルが、未結合のままの標準物質および試験サンプルから分離され得る。
サンドイッチアッセイは、典型的には、２つの抗体（各々が、検出されるタンパク質の異なる免疫原性部分、すなわちエピトープに結合することができる）の使用を含む。代表的なサンドイッチアッセイでは、解析される試験サンプルは、固体支持体上に固定化された第１抗体によって結合され、その後、第２抗体が、その試験サンプルに結合するので、不溶性の３部複合体が形成される（例えば、米国特許第４，３７６，１１０号）。第２抗体は、それ自体が検出可能部分で標識され得る（直接サンドイッチアッセイ）か、または検出可能部分で標識された抗免疫グロブリン抗体を用いて測定され得る（間接サンドイッチアッセイ）。例えば、サンドイッチアッセイの１つのタイプが、ＥＬＩＳＡアッセイであり、この場合、検出可能部分は、酵素である。
抗体は、インビボ診断アッセイにも使用され得る。通常、抗体は、放射性核種（例えば、１１１Ｉｎ、９９Ｔｃ、１４Ｃ、１３１Ｉ、３Ｈ、３２Ｐまたは３５Ｓ）で標識され得、疾患細胞または疾患組織は、例えば、免疫シンチグラフィを用いて局在化され得る。ある特定の実施形態において、抗体またはそのフラグメントは、２つ以上のＬＣＭタンパク質の細胞外ドメインに結合し、親和性の値（Ｋｄ）は、１×１０８Ｍ未満である。
免疫組織化学の場合、疾患組織サンプルは、例えば、新鮮なものであってもよいし、凍結されているものでもよいし、パラフィン内に包埋されていてもよいし、ホルマリンなどの保存剤で固定されていてもよい。固定されているかまたは包埋されている切片は、標識された１次抗体および２次抗体と接触され得、ここで、その抗体は、ＬＣＭタンパク質の発現をインサイチュで検出するために使用される。
抗体は、存在量および発現のパターンを評価するために、マーカータンパク質をインサイチュ、インビトロ、または細胞溶解産物中もしくは上清中で検出するために使用され得る。また、抗体は、生物学的状態の発生中または進行中の異常な組織分布または異常な発現を評価するために使用され得る。ＬＣＭタンパク質に対する抗体は、ある生物内の様々な組織間における、およびその生物の発生の経過における、そのタンパク質の発現のパターンを測定するために、細胞内または組織内のそのタンパク質の存在を検出するために有用であり得る。
さらに、抗体は、疾患状態における（例えば、疾患の活性な病期、またはそのタンパク質の機能に関する疾患に対する素因を有する個体における）発現を評価するために使用され得る。障害が、タンパク質の不適当な組織分布、発生過程での発現もしくは発現レベル、または発現された形態／プロセシングされた形態によって引き起こされるとき、例えば、抗体は、正常なタンパク質に対して調製され得る。障害が、タンパク質における特定の変異を特徴とする場合、変異タンパク質に特異的な抗体を使用することにより、特定の変異タンパク質の存在についてアッセイすることができ、そして治療的な目的で変異タンパク質を標的化することができる。抗体は、診断ツールとして、すなわち、電気泳動移動度、等電点、トリプシンペプチド消化、および当該分野で公知の他の物理的アッセイによって解析される異常なタンパク質に対する免疫学的マーカーとしても有用である。
本発明のある特定の例示的な診断方法は、処置の様式をモニターする工程も包含し得る。したがって、処置が、最終的に、例えば、タンパク質の機能、活性、発現レベル、組織分布または発生過程での発現を修正することを目指している場合、そのタンパク質に対する抗体を使用することにより、治療的な有効性がモニターされ得、そして必要に応じて処置レジメンが改変され得る。
さらに、マーカータンパク質に対する抗体は、薬理ゲノミクス解析において有用である。例えば、多型タンパク質に対して調製された抗体を使用することにより、改変された処置様式を必要とする個体を同定することができる。さらに、そのマーカータンパク質およびそれに対する抗体は、臨床試験のために（例えば、含められるべき個体（例えば、治療に対して応答する可能性がより高い個体）または臨床試験から除外されるべき個体（例えば、治療に対して応答する可能性が低い個体または治療によって有害な副作用を起こす可能性の高い個体）を同定するために）使用され得る。
本発明は、生物学的サンプル中のマーカータンパク質の存在を検出するために抗体を使用するためのキットも包含する。例示的なキットは、生物学的サンプル中のタンパク質を検出するための抗体（例えば、標識されている抗体または標識可能な抗体）および化合物または薬剤；サンプル中のタンパク質の量を測定するための手段；サンプル中のタンパク質の量を標準物質と比較するための手段；および使用するための指示書を備え得る。そのようなキットは、単一のマーカータンパク質またはエピトープを検出するために形成され得るか、または抗体検出アレイなどにおける多数のエピトープのうちの１つを検出するために形成され得る。
ＬＣ／ＭＳおよびＩＣＡＴ
ある特定の例示的な実施形態において、本発明は、ＬＣ／ＭＳを用いることによるＬＣＭの検出方法または診断方法を提供する。タンパク質は、当該分野で公知の方法によって細胞から調製され得る（例えば、Ｚｈａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２１（６）：６６０−６６６（２００３））。疾患および健常（または、例えば薬物耐性および薬剤感受性）サンプル中のタンパク質の差次的な発現は、当該分野で公知である質量分析およびＩＣＡＴ（同位体コードアフィニティータグ（Ｉｓｏｔｏｐｅ Ｃｏｄｅｄ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｔａｇ））標識を用いて定量化され得る。ＩＣＡＴは、タンパク質の２つの集団（例えば、健常サンプルおよび疾患サンプル）を識別することを可能にする同位体標識手法である。ＩＣＡＴによって測定されるＬＣＭタンパク質の過剰発現または過小発現は、例えば、疾患または関連する病状を有しているか、または発症する可能性を示唆し得る。
ＬＣ／ＭＳスペクトルは、標識されたサンプルについて回収され得、そして以下の通り処理され得る。ＬＣ／ＭＳ装置からの生スキャン（ｒａｗ ｓｃａｎｓ）は、ピーク検出およびノイズリダクションソフトウェアに対して個性化され得る。次いで、選別されたピークリストを使用することにより、元のサンプルからの特定のペプチドに対応する「特色」が検出され得る。特色は、例えば、質量／電荷比、電荷、保持時間、同位体パターンおよび／または強度によって特徴付けられる。
健常サンプルと疾患サンプルの両方に存在するペプチドの強度を用いることにより、そのペプチドの差次的な発現、すなわち相対存在量を計算することができる。もっぱら一方のサンプル中に見られるペプチドの強度を用いることにより、そのペプチド（シングルトン）に対する理論上の発現比を計算することができる。発現比は、アッセイまたは実験において各ペプチドについて計算され得る。
統計的検定を行うことにより、データの頑健性を評価することができ、そして統計学的有意差を選択することができる。データの正確度を確実にするために、以下の工程が行われ得る：ａ）実験のすべての反復において同様の特色が検出されることを保証する工程；ｂ）すべてのペプチドの対数比の分布を評価する工程（ガウス分布が期待される）；ｃ）ＩＣＡＴ ＬＣ／ＭＳマップ間の全体的な対相関を計算することにより、そのペプチドに対する発現比が複数の反復にわたって再現性があることを保証する工程；およびｄ）複数の疾患または疾患サンプルにおけるペプチドの発現比を比較するために、複数の実験結果を集計する工程。
８．ＬＣＭタンパク質に基づいた処置の方法
ａ．抗体療法
本発明の抗体は、治療目的のために使用され得る。本発明の抗体は、疾患、特に癌、とりわけ肺癌を有する哺乳動物、好ましくは、ヒトを処置するために使用され得ると企図される。本抗体は、単独で送達され得るか、薬学的組成物として（例えば、キャリアとともに）送達され得るか、または例えば１つ以上の治療薬に結合体化され得る。
抗体は、治療目的などのためにタンパク質の機能を調節する（例えば、アゴナイズする（ａｇｏｎｉｚｉｎｇ）またはアンタゴナイズする（ａｎｔａｇｏｎｉｚｉｎｇ））ために有用であり得る。抗体は、例えば、基質などの結合パートナーへのＬＣＭタンパク質の結合を阻止することによって、タンパク質の機能を阻害するためにも有用であり得、これは、治療的に有用であり得る。抗体は、例えば、タンパク質の機能に必要なドメインを含むタンパク質の特異的な部分、または細胞膜と会合しているインタクトなタンパク質に対して、調製され得る。
本発明の抗体は、免疫応答を増強するためにも使用され得る。本抗体は、抗体の他の治療的な投与のために使用される量と類似の量で投与され得る。例えば、プールされたガンマグロブリンは、患者１人あたり約１ｍｇ〜約１００ｍｇの範囲で投与され得る。
ＬＣＭタンパク質と反応性の抗体は、単独で、または抗癌治療などの他の治療と併用して、癌または他の疾患に苦しんでいる哺乳動物に投与され得る。抗癌治療の例としては、化学療法、放射線治療およびＴＩＬ（腫瘍浸潤リンパ球）を用いた養子免疫療法が挙げられるが、これらに限定されない。
治療のための抗体サブクラスの選択は、作用を受ける抗原の性質に依存し得る。例えば、その抗原が疾患マーカーに対して高度に特異的であり、そしてめったに正常細胞上に存在しない場合においては、ＩｇＭが好ましいことがある。しかしながら、疾患関連抗原が、低レベルであっても正常組織にも発現される場合は、ＩｇＧサブクラスが好ましいことがある。典型的には近接した少なくとも２つのＩｇＧ分子の結合が補体を活性化させるために必要であるので、少量の抗原を発現するがゆえに少ないＩｇＧ抗体分子が結合する正常組織では、補体媒介性の損傷が生じることは少ないので、これらの場合においてＩｇＧサブクラスが好ましいことがある。さらに、ＩｇＧ分子は、より小さいことによって、ＩｇＭ分子よりも罹患組織に局在化させることができる場合がある。
抗体療法についての機序は、治療用抗体が、疾患細胞において発現されている（好ましくは、過剰発現されている）可溶性または細胞表面のマーカータンパク質を認識することであり得る。ＮＫ細胞もしくは補体の活性化、または免疫毒素もしくは放射標識と抗体の結合体化によって、マーカータンパク質と抗体の相互作用は、例えば、リガンド／レセプター相互作用またはアポトーシスの活性化を抑止し得る。
罹患細胞の抗体媒介性細胞傷害の潜在的な機序としては、食細胞（抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ））、補体（補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ））、裸の抗体（レセプター架橋アポトーシスおよび成長因子阻害）、または治療薬（例えば、放射性核種、免疫毒素または免疫化学療法剤もしくは他の治療薬）で標識された標的化ペイロードが挙げられる。
ある特定の例示的な実施形態において、抗体は、例えば、前臨床データを得る目的のために非ヒト哺乳動物に投与される。処置される例示的な非ヒト哺乳動物としては、前臨床試験が行われる、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、げっ歯類および他の哺乳動物が挙げられる。そのような哺乳動物は、疾患に対して確立された動物モデルであり得るか、または例えば目的の抗体の毒性を研究するために使用され得る。例えば、用量漸増研究が、哺乳動物において行われ得る。
抗体は、非経口、皮下、腹腔内、肺内および鼻腔内投与、そして局所的な免疫調節性の処置のために所望であれば病巣内投与をはじめとした任意の適当な手段によって個体に投与され得る。非経口注入としては、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内または皮下投与が挙げられる。さらに、抗体は、特に抗体の用量を低下させながらのパルス注入によって投与され得る。その投薬は、静脈内または皮下注射などの注射によって行われ得、それは、その投与が短時間であるか長時間であるかに部分的に依存し得る。
疾患の予防または処置に対して、抗体の適切な投薬量は、処置される疾患のタイプ、疾患の重症度および経過、その抗体が予防目的で投与されるのか治療目的で投与されるのか、以前の治療、患者の病歴および抗体に対する応答、ならびに主治医の裁量に依存し得る。
疾患のタイプおよび重症度に応じて、例えば、１回以上の別個の投与によるか持続注入によるかに関わらず、約１μｇ／ｋｇ〜１５０ｍｇ／ｋｇ（例えば、０．１〜２０ｍｇ／ｋｇ）の抗体が、患者への投与に対する最初の候補投薬量であり得る。代表的な１日投薬量は、上で述べたような因子に応じて、約１μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇまたはそれ以上の範囲であり得る。抗体−薬物結合体は、例えば、１回以上の別個の投与によるか持続注入によるかに関わらず、約１μｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ、典型的には、約０．１〜２０ｍｇ／ｋｇで投与され得る。代表的な１日投薬量は、上で述べたような因子に応じて、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇまたは約０．３ｍｇ／ｋｇ〜約７．５ｍｇ／ｋｇの範囲であり得る。数日間またはそれ以上にわたる反復投与の場合、状態に応じて、処置は、疾患症状の所望の抑制が生じるまで継続され得る。しかしながら、他の投与レジメンも有用であり得る。治療の進捗は、従来の手法およびアッセイによってモニターされ得る。
抗体組成物は、優良な医療行為と一致する様式で、製剤化、投薬および投与され得る。この文脈において考慮する因子としては、処置される特定の障害、処置される特定の哺乳動物、個別の患者の臨床状態、障害の原因、薬剤の送達部位、投与方法、投与のスケジューリングおよび医療従事者に公知の他の因子が挙げられる。
抗体は、必要に応じて、問題となっている障害を予防するためまたは処置するために使用される１つ以上の治療薬とともに、製剤化され得るかまたは投与され得る。例えば、抗体は、処置される特定の疾患に対して治療的な患者管理の標準物質とともに、同時治療として投与され得る。
ｂ．他の免疫療法
「免疫原性ペプチド」は、対立遺伝子特異的モチーフを含むペプチドであり、そのペプチドは、典型的には、ＭＨＣ対立遺伝子（ヒトにおけるＨＬＡ）に結合し、そしてＣＴＬ（細胞傷害性Ｔリンパ球）応答を誘導することができる。したがって、免疫原性ペプチドは、典型的には、適切なクラスＩまたはＩＩ ＭＨＣ分子に結合することができ、そしてその免疫原性ペプチドが由来する抗原に対する細胞傷害性Ｔ細胞応答またはＴヘルパー細胞応答を誘導することができる。
ＬＣＭタンパク質に由来するペプチドは、そのペプチドを提示するＭＨＣ分子へのそのペプチドの結合を増強することなどによって、免疫原性を増大させるように改変され得る。そのペプチドまたは改変ペプチドは、そのペプチドの抗原性を高めるためにキャリア分子に結合体化され得る。キャリア分子の例としては、ヒトアルブミン、ウシアルブミン、リポタンパク質およびキーホールリンペットヘモシアニン（“Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”（１９９１）Ｓｔｉｔｅｓ ａｎｄ Ｔｅｒｒ（ｅｄｓ）Ａｐｐｌｅｔｏｎ ａｎｄ Ｌａｎｇｅ，Ｎｏｒｗａｌｋ Ｃｏｎｎ．，Ｓａｎ
Ｍａｔｅｏ，Ｃａｌｉｆ．）が挙げられるが、これらに限定されない。
さらに、ペプチドのアミノ酸配列バリアントは、そのペプチドをコードするＤＮＡの核酸配列を変更させることまたはペプチド合成などによって調製され得る。遺伝子レベルでは、これらのバリアントは、例えば、そのペプチドをコードするＤＮＡにおけるヌクレオチドの部位特異的突然変異誘発によって、バリアントをコードするＤＮＡが生成され、その後、組換え細胞培養物においてそのＤＮＡが発現されることによって、調製され得る。そのバリアントは、非バリアントペプチドと同じ質的な生物学的活性を示し得る。
本発明の例示的な実施形態は、疾患において差次的に発現されるＬＣＭタンパク質に由来するペプチドまたは改変ペプチドを提供する。ペプチドの改変の例としては、所与の免疫原性ペプチド配列における１つ以上のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加、または所与の免疫原性ペプチド配列内の既存のアミノ酸の変異、または所与の免疫原性ペプチド配列内の既存のアミノ酸の誘導体化が挙げられるが、これらに限定されない。免疫原性ペプチド配列における任意のアミノ酸が、改変され得る。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのアミノ酸が、所与の免疫原性ペプチド配列内において置換され得るか、または置き換えられ得る。任意のアミノ酸が、免疫原性ペプチド配列内の所与のアミノ酸を置換するか、または置き換えるために使用され得る。改変ペプチドは、差次的に発現されるタンパク質から得られる任意の免疫原性ペプチドを含み得、その免疫原性ペプチドは、改変されており、それがＴ細胞に対して提示されるときに会合するＭＨＣ分子に対して高い結合性を示す。これらの改変ペプチドは、例えば、従来の方法によって合成的または組換え的に生成され得る。
本発明のある特定の例示的な実施形態において、上記ペプチドは、免疫原性である（すなわち、個体に注射されたときに免疫応答を誘導することができる）約５〜３０アミノ酸長の配列を含むか、またはその配列からなる。
ある特定の例示的な実施形態において、上記ペプチドは、例えば、Ｔ細胞媒介性の病状を処置するために使用され得る。用語「Ｔ細胞媒介性の病状」とは、不適当なＴ細胞応答が、その病状の構成要素である任意の状態のことを指す。この用語は、Ｔ細胞媒介性疾患と、制御されていないクローンＴ細胞複製に起因する疾患との両方を包含すると意図される。
改変された（例えば、組換え）もしくは天然のＬＣＭタンパク質またはそのフラグメントは、予防的または治療的にワクチンとして使用され得る。予防的に提供されるとき、ワクチンは、疾患の任意のエビデンスより先に提供され得る。疾患ワクチンの予防的な投与は、ヒトなどの哺乳動物において疾患を予防するかまたは減弱するように働き得る。
例示的なワクチン処方物は、ＬＣＭタンパク質などの疾患関連抗原に対する免疫応答を誘導する免疫原を含み得る。例えば、実質的または部分的に精製されたＬＣＭタンパク質またはそのフラグメントが、薬学的に許容可能なキャリア中のワクチンとして投与され得る。免疫原は、純粋もしくは実質的に純粋な形態で投与され得るか、または薬学的組成物、処方物もしくは調製物として投与され得る。投与され得るタンパク質の例示的な用量は、約０．００１〜約１００ｍｇ／患者または約０．０１〜約１００ｍｇ／患者である。免疫化は、必要に応じて、十分な力価の抗免疫原抗体または免疫細胞が得られるまで反復され得る。
ワクチンは、例えば、組換えタンパク質、またはＬＣＭタンパク質の全部もしくは一部をコードする核酸配列を含む発現ベクターを用いて調製され得る。ワクチンにおいて使用され得るベクターの例としては、欠損レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、鶏痘ウイルスベクターまたは他のウイルスベクター（Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｒ．Ｃ，（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６０：９２６−９３２）が挙げられるが、これらに限定されない。それらのベクターは、疾患に苦しんでいる哺乳動物において疾患の任意のエビデンスの前に、または疾患の後退が媒介される前に、哺乳動物（例えば、ヒト）に導入され得る。哺乳動物にウイルスベクターを投与するための方法の例としては、細胞をエキソビボでウイルスに曝露させること、またはレトロウイルスもしくはそのウイルスの産生細胞株を罹患組織に注射すること、またはウイルスの静脈内投与が挙げられるが、これらに限定されない。あるいは、上記ベクターは、薬学的に許容可能なキャリア中で、疾患病変への直接的な注射または局所的適用によって局所的に投与され得る。投与されるウイルスベクターの量は、ウイルス粒子の力価に基づき得る。例示的な範囲は、約１０６〜約１０１１ウイルス粒子／哺乳動物であり得る。
免疫化の後、ワクチンの有効性は、特定の溶解活性、特定のサイトカイン産生または疾患の後退によって評価されるとき、例えば、抗原を認識する抗体または免疫細胞の産生によって評価され得、それは、従来の方法を用いて測定され得る。免疫される哺乳動物が、すでに疾患に苦しんでいる場合、ワクチンは、他の治療的な処置と併せて投与され得る。他の治療的な処置の例としては、養子Ｔ細胞免疫療法およびサイトカインまたは他の治療的な薬物の同時投与が挙げられるが、これらに限定されない。
ある特定の実施形態において、疾患、とりわけ癌に対して高リスクである哺乳動物、好ましくは、ヒトは、本発明のワクチンで予防的に処置される。例としては、疾患の家族歴を有する個体、自身が疾患（例えば、以前に切除された癌および再発のリスクのある癌）の履歴を有する個体、またはすでに疾患に苦しんでいる個体が挙げられるが、これらに限定されない。ワクチンは、治療的に提供されるとき、疾患抗原に対する患者自身の免疫応答を増強するように提供され得る。免疫原として作用する例示的なワクチンは、例えば、細胞、組換え発現ベクターでトランスフェクトされた細胞からの細胞溶解産物、または発現されたタンパク質を含む培養上清であり得る。あるいは、免疫原は、例えば、部分的または実質的に精製された組換えタンパク質、ペプチドもしくはそれらのアナログ、または改変されたタンパク質、ペプチドもしくはそれらのアナログであり得る。それらのタンパク質またはペプチドは、例えば、リポタンパク質と結合体化され得るか、またはリポソーム型で、もしくはアジュバントとともに投与され得る。
ワクチン接種は、従来の方法を用いて行われ得る。例えば、免疫原は、適当な希釈剤（例えば、食塩水または水）または完全もしくは不完全アジュバント中において使用され得る。さらに、免疫原は、その免疫原の免疫原性を高めるキャリアを含むキャリアに結合されていてもよいし、そうでなくてもよい。キャリア分子の例としては、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、破傷風トキソイドなどが挙げられるが、これらに限定されない。免疫原はまた、リポタンパク質と結合され得るか、またはリポソーム型で、もしくはアジュバントとともに投与され得る。免疫原は、抗体産生にとって適切な任意の経路（例えば、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下など）によって投与され得る。免疫原は、有意な力価の抗ＬＣＭ免疫細胞または抗ＬＣＭ抗体が産生されるまで、１回または定期的な間隔で投与され得る。抗ＬＣＭ免疫細胞の存在は、ＣＴＬ前駆体解析アッセイ（Ｃｏｕｌｉｅら、１９９２，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ Ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ ５０：２８９−２９７）によって免疫化の前および後にＬＣＭ抗原に対する前駆体ＣＴＬ（細胞傷害性Ｔリンパ球）の出現率を測定することによって評価され得る。イムノアッセイを用いることによって、血清中の抗体を検出することができる。
ワクチンの安全性は、免疫された動物の全般的な健康状態（例えば、体重の変化、発熱、食欲または行動の変化など）に対する免疫化の作用を調べること、および剖検中の病理学的変化を探すことによって判定され得る。ワクチンは、最初に動物において試験された後、目的の疾患を有する患者において試験され得る。従来の方法を用いることにより、患者の免疫応答を評価して、そのワクチンの有効性を判定することができる。
本発明のある特定の例示的な実施形態において、ＬＣＭタンパク質もしくはそのフラグメント、または改変ＬＣＭタンパク質は、インビトロにおいて培養された樹状細胞に曝露され得る。その培養樹状細胞は、樹状細胞によって改変された抗原または抗原をパルスされた樹状細胞を含むＴ細胞依存性抗原を産生する手段を提供し、ここで、その抗原は、プロセシングされて、そしてその抗原によって活性化された樹状細胞上に提示される。抗原によって活性化された樹状細胞またはプロセシングされた樹状細胞抗原は、ワクチンまたは疾患の処置のための免疫原として使用され得る。それらの樹状細胞は、抗原が内部移行されることおよび樹状細胞の表面上に提示されることを可能にするのに十分な時間にわたって抗原に曝露され得る。次いで、得られた樹状細胞または樹状細胞がプロセシングした抗原が、治療の必要のある個体に投与され得る。そのような方法は、Ｓｔｅｉｎｍａｎら（ＷＯ９３／２０８１８５）およびＢａｎｃｈｅｒｅａｕら（ＥＰＯ出願０５６３４８５Ａ１）に記載されている。
本発明のある特定の例示的な実施形態において、個体から単離されたＴ細胞が、インビトロにおいてＬＣＭタンパク質もしくはそのフラグメント、または改変ＬＣＭタンパク質に曝露され得、次いで、そのような処置の必要のある患者に治療有効量で投与され得る。Ｔリンパ球が単離され得る例としては、末梢血細胞リンパ球（ＰＢＬ）、リンパ節または腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）が挙げられるが、これらに限定されない。そのようなリンパ球は、処置される個体またはドナーから当該分野で公知方法によって単離され得、そしてインビトロにおいて培養され得る（Ｋａｗａｋａｍｉら、１９８９，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４２：２４５３−３４６１）。リンパ球は、１〜１０週間にわたって培地（例えば、ＲＰＭＩまたはＲＰＭＩ１６４０またはＡＩＭ Ｖ）中で培養され得る。生存能は、トリパンブルー色素排除アッセイによって評価され得る。どのようにこれらの感作Ｔ細胞が哺乳動物に投与され得るかの例としては、静脈内、腹腔内または病巣内が挙げられるが、これらに限定されない。これらの感作Ｔリンパ球の有効性を判定するために評価され得るパラメータとしては、処置される哺乳動物における免疫細胞の産生、または腫瘍退縮が挙げられるが、これらに限定されない。従来の方法を用いることにより、これらのパラメータを評価することができる。そのような処置は、例えば、サイトカインまたは遺伝子改変細胞と併せて適用され得る（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら、１９９２，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，３：７５−９０；Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら、１９９２，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，３：５７−７３）。
９．ＬＣＭタンパク質を用いるスクリーニング方法
本発明の例示的な実施形態は、ＬＣＭタンパク質活性（タンパク質の機能と交換可能に称される）を調節する薬剤（候補薬剤、化合物または候補化合物などの用語によって交換可能に称される）についてスクリーニングする方法を提供する。候補薬剤の例としては、タンパク質、ペプチド、抗体、核酸（例えば、アンチセンスおよびＲＮＡｉ核酸分子）および小分子が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の例示的な実施形態は、これらのスクリーニング方法によって同定される薬剤、ならびに疾患、特に癌、とりわけ肺癌の処置などのためにこれらの薬剤を使用する方法をさらに提供する。
例示的なスクリーニング方法は、典型的には、（ｉ）ＬＣＭタンパク質を候補薬剤と接触させる工程、および（ｉｉ）ＬＣＭタンパク質活性についてアッセイする工程を包含し得、ここで、その薬剤の非存在下におけるタンパク質活性と比べて、その薬剤の存在下におけるタンパク質活性の変化は、その薬剤が、ＬＣＭタンパク質活性を調節することを示唆する。
他の例示的なスクリーニング方法は、候補薬剤がＬＣＭ発現を調節する能力を判定し得る。例示的な方法は、典型的には、（ｉ）候補薬剤を、ＬＣＭタンパク質またはＬＣＭ ｍＲＮＡを発現することができる系と接触させる工程、および（ｉｉ）ＬＣＭタンパク質またはＬＣＭ ｍＲＮＡのレベルについてアッセイする工程を包含し得、ここで、その薬剤の非存在下におけるレベルと比べて、その薬剤の存在下におけるレベルの変化は、その薬剤が、ＬＣＭ発現レベルを調節することを示唆する。
本発明の例示的な実施形態は、ＬＣＭタンパク質に結合する薬剤についてスクリーニングする方法をさらに提供する。例示的な方法は、典型的には、ＬＣＭタンパク質を試験薬剤と接触させる工程、およびＬＣＭタンパク質へのその薬剤の結合の程度を測定する工程を包含し得る。
ＬＣＭタンパク質は、その天然の状態または特定の疾患もしくは病状を引き起こす変更された形態におけるタンパク質の活性を調節する薬剤を同定するために使用され得る。ＬＣＭタンパク質ならびに適切なバリアントおよびフラグメントが、ＬＣＭに結合する能力について候補化合物をアッセイするハイスループットスクリーニングにおいて使用され得る。これらの化合物は、機能的ＬＣＭタンパク質に対してさらにスクリーニングされることにより、そのタンパク質の活性に対する化合物の作用が判定され得る。さらに、これらの化合物は、動物または無脊椎動物の系において試験されることにより、活性／有効性が判定され得る。所望の程度にＬＣＭタンパク質を活性化する化合物（アゴニスト）または不活性化する化合物（アンタゴニスト）が、同定され得る。
ＬＣＭタンパク質は、ＬＣＭタンパク質と、ＬＣＭタンパク質と正常に相互作用する標的分子（例えば、基質、細胞外結合リガンド、またはＬＣＭタンパク質がサイトゾルのシグナルタンパク質などと正常に相互作用するシグナル経路の構成要素）との相互作用を刺激するかまたは阻害する能力について薬剤をスクリーニングするために使用され得る。例示的なアッセイは、ＬＣＭタンパク質（またはそのフラグメント）が標的分子と相互作用することを可能にする条件下で、ＬＣＭタンパク質またはそのフラグメントを候補化合物と混合する工程、およびそのＬＣＭタンパク質と標的分子との複合体の形成を検出する工程、またはＬＣＭタンパク質と標的分子との相互作用の生化学的な結果（例えば、シグナル伝達の関連作用のいずれか（例えば、タンパク質リン酸化、ｃＡＭＰ代謝回転、アデニル酸シクラーゼ活性化など））を検出する工程を包含し得る。ＬＣＭタンパク質によって媒介される任意の生物学的または生化学的な機能は、エンドポイントアッセイとして使用されることにより、ＬＣＭ活性を調節する薬剤が同定され得る。
候補化合物または候補薬剤としては、１）可溶性ペプチドなどのペプチド（Ｉｇテイル化融合ペプチド、ならびにランダムペプチドライブラリー（例えば、Ｌａｍら、Ｎａｔｕｒｅ ３５４：８２−８４（１９９１）；Ｈｏｕｇｈｔｅｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３５４：８４−８６（１９９１）を参照のこと）ならびにＤ−および／またはＬ−配置アミノ酸で作られているコンビナトリアルケミストリー由来の分子ライブラリーのメンバーを含む）；２）リンペプチド（例えば、ランダムおよび部分的縮重の定方向リンペプチドライブラリーのメンバー、例えば、Ｓｏｎｇｙａｎｇら、Ｃｅｌｌ ７２：７６７−７７８（１９９３）を参照のこと）；３）抗体（例えば、ポリクローナル、モノクローナル、ヒト化、抗イディオタイプ、キメラおよび一本鎖抗体、ならびに抗体のＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ発現ライブラリーフラグメントおよびエピトープ結合フラグメント）；および４）有機小分子および無機小分子（例えば、コンビナトリアルライブラリーおよび天然物ライブラリーから得られる分子）が挙げられるが、これらに限定されない。
例示的な候補化合物または候補薬剤は、基質結合について競合するＬＣＭの可溶性フラグメントである。他の例示的な候補化合物としては、変異ＬＣＭタンパク質、またはＬＣＭの機能に影響するがゆえに基質に対して競合する変異を含む適切なフラグメントが挙げられる。したがって、例えば高親和性で基質に対して競合するフラグメント、または基質に結合するが放出させないフラグメントが、本発明によって包含される。
タンパク質の任意の部分（例えば、アミノ末端の細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン（例えば、膜貫通セグメントまたは細胞内もしくは細胞外のループ）またはカルボキシ末端の細胞内ドメイン）が、全部または一部において異種性のドメインまたは小領域によって置き換えられていることがあるキメラタンパク質を使用することによってもまた、化合物がスクリーニングされ得る。例えば、天然のマーカータンパク質によって認識される基質とは異なる基質と相互作用する基質結合領域が使用され得る。したがって、異なるセットのシグナル伝達構成要素が、活性化についてのエンドポイントアッセイとして利用可能であり得、それにより、マーカーが由来する特定の宿主細胞以外においてアッセイを行うことが可能になる。
マーカータンパク質と相互作用する化合物（例えば、結合パートナーおよび／またはリガンド）についてスクリーニングするために、競合結合アッセイもまた使用され得る。例えば、試験化合物がマーカータンパク質に結合すること、または別途そのマーカータンパク質と相互作用することを可能にする条件下で、試験化合物をそのマーカータンパク質に曝露し得る。その混合物に可溶性マーカータンパク質も加え得る。試験化合物が可溶性マーカータンパク質と相互作用する場合、その試験化合物は、形成される複合体の量またはマーカータンパク質の活性を減少させ得る。このタイプのアッセイは、マーカータンパク質の特定の領域と相互作用する化合物を探している場合に特に有用である。したがって、マーカータンパク質と競合する可溶性マーカータンパク質は、目的のマーカー領域に対応するペプチド配列を含み得る。
無細胞の薬物スクリーニングアッセイを行うために、ＬＣＭタンパク質（またはそのフラグメント）またはＬＣＭタンパク質に結合する分子（本明細書中で「結合パートナー」と称される）を固定化することにより、複合体を形成していない形態からの複合体の分離を促進すること、ならびにアッセイの自動化を促進することが望ましい場合がある。
マトリックス上にタンパク質を固定化するための手法は、例示的な薬物スクリーニングアッセイにおいて利用され得る。例示的な実施形態において、タンパク質がマトリックスに結合されることを可能にするドメインが付加されている融合タンパク質が提供され得る。例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ融合タンパク質は、グルタチオンＳＥＰＨＡＲＯＳＥビーズ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）上またはグルタチオン誘導体化マイクロタイタープレート上に吸着され得、次いで、それらは細胞溶解産物（例えば、３５Ｓ−標識されたもの）および候補化合物と混合され、そしてその混合物を複合体形成に資する条件（例えば、塩およびｐＨについての生理学的条件）下でインキュベートされる。インキュベートの後、ビーズを洗浄することにより、任意の未結合の標識を除去し得、そしてその固定化されたマトリックスおよび放射標識を直接測定するか、または複合体を解離した後の上清において測定する。あるいは、複合体をマトリックスから解離し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、そしてビーズ画分に見られる結合パートナーのレベルを、標準的な電気泳動的手法を用いてゲルから定量化し得る。例えば、当該分野で周知の手法を用いて、マーカータンパク質または結合パートナーのいずれかをビオチンおよびストレプトアビジンの結合体化によって固定化し得る。あるいは、マーカータンパク質と反応性であるが結合パートナーへのマーカータンパク質の結合を妨害しない抗体を、プレートのウェルに誘導体化し得、そしてそのマーカータンパク質を抗体結合体化によってウェル内に捕捉し得る。結合パートナーおよび候補化合物の調製は、マーカータンパク質を提示するウェル内でインキュベートされ得、そしてそのウェル内に捕捉された複合体の量が定量化され得る。そのような複合体を検出するための方法としては、ＧＳＴに固定化された複合体について記載された方法に加えて、結合パートナーと反応性である抗体、またはマーカータンパク質と反応性であり、かつ結合パートナーと競合する抗体を用いる複合体の免疫検出、ならびに結合パートナーに関連する酵素活性の検出に依存するマーカータンパク質結合アッセイが挙げられる。
本発明の例示的な実施形態では、ツーハイブリッドアッセイまたはスリーハイブリッドアッセイ（例えば、米国特許第５，２８３，３１７号；Ｚｅｒｖｏｓら（１９９３）Ｃｅｌｌ ７２：２２３−２３２；Ｍａｄｕｒａら（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１２０４６−１２０５４；Ｂａｒｔｅｌら（１９９３）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １４：９２０−９２４；Ｉｗａｂｕｃｈｉら（１９９３）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ８：１６９３−１６９６；およびＢｒｅｎｔ ＷＯ９４／１０３００を参照のこと）においてＬＣＭタンパク質を「ベイト（ｂａｉｔ）タンパク質」として使用することにより、ＬＣＭタンパク質と結合するかまたは相互作用し、かつそのタンパク質活性に関与する、他のタンパク質を同定することができる。ツーハイブリッドシステムは、典型的には、分離可能なＤＮＡ結合ドメインおよび活性化ドメインからなるほとんどの転写因子のモジュラー性質に基づくものである。例示的な実施形態において、ツーハイブリッドアッセイは、２つの異なるＤＮＡ構築物を利用し得る。一方の構築物では、ＬＣＭタンパク質をコードする遺伝子が、公知の転写因子（例えば、ＧＡＬ−４）のＤＮＡ結合ドメインをコードする遺伝子に融合され得る。他方の構築物では、未同定のタンパク質（「プレイ（ｐｒｅｙ）」または「サンプル」）をコードするＤＮＡ配列のライブラリーからのＤＮＡ配列が、公知の転写因子の活性化ドメインをコードする遺伝子に融合され得る。「ベイト」タンパク質と「プレイ」タンパク質とが、インビボにおいて相互作用することができることにより、ＬＣＭ依存性複合体が形成される場合、転写因子のＤＮＡ結合ドメインおよび活性化ドメインは、近接するようになる。この近接によって、転写因子に対して応答性である転写制御部位に作動可能に連結され得るレポーター遺伝子（例えば、ＬａｃＺ）の転写が可能となる。そのレポーター遺伝子の発現が検出され得、そして機能性の転写因子を含む細胞コロニーが単離され得、それを用いることにより、ＬＣＭタンパク質と相互作用するタンパク質をコードするクローニングされた遺伝子を得ることができる。
ＬＣＭタンパク質を調節する薬剤は、上記のアッセイの１つ以上を、単独でまたは組み合わせて用いることにより同定され得る。例えば、細胞ベースの系または無細胞系が、薬剤の最初の同定のために使用され得、次いで、その薬剤の活性が、動物または他のモデル系において確かめられ得る。そのようなモデル系は、当該分野で周知であり、この文脈において容易に使用され得る。
１０．ＬＣＭ核酸分子を用いた診断、処置およびスクリーニングの方法
本発明の核酸分子は、例えば、プローブ、プライマー、化学中間体として、および生物学的アッセイにおいて、有用である。それらの核酸分子は、ＬＣＭタンパク質をコードする完全長ｃＤＮＡおよびゲノムクローンまたはそのバリアントを検出または単離するためのメッセンジャーＲＮＡ、転写物／ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡに対するハイブリダイゼーションプローブとして有用である。それらの核酸分子は、核酸分子の任意の所与の領域を増幅するＰＣＲに対するプライマーとしても有用であり、また、所望の長さおよび配列のアンチセンス分子を合成するために有用である。それらの核酸分子は、本明細書中に記載される核酸分子から生成されるｍＲＮＡの全部または一部に対応するリボザイムを生成するためにも有用である。
上記核酸分子は、組換えベクターを構築するためにも有用である。例示的なベクターとしては、ＬＣＭタンパク質の一部または全部を発現する発現ベクターが挙げられる。それらの核酸分子は、そのタンパク質の抗原性部分を発現するためにも有用である。それらの核酸分子は、そのタンパク質の一部または全部を発現する宿主細胞を構築するためにも有用である。それらの核酸分子は、そのタンパク質の全部または一部を発現するトランスジェニック動物を構築するためにも有用である。
プライマーまたはプローブは、ＬＣＭをコードする核酸分子の全体の長さの任意の配列に対応し得る。したがって、プライマーまたはプローブは、例えば、５’非コード領域、コード領域または３’非コード領域に由来し得る。
ｍＲＮＡを検出するための例示的なインビトロ手法としては、ノーザンハイブリダイゼーションおよびインサイチュハイブリダイゼーションが挙げられる。ＤＮＡを検出するための例示的なインビトロ手法としては、サザンハイブリダイゼーションおよびインサイチュハイブリダイゼーションが挙げられる。逆転写酵素ＰＣＲ増幅（ＲＴ−ＰＣＲ）などもまた、ＲＮＡ発現を検出するために使用され得る。検出の特定の例示的な方法は、ＴａｑＭａｎ技術（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を用いる工程を包含する。
ａ．核酸を用いた診断の方法
本発明の核酸分子は、例えば、核酸発現の存在、レベル、形態および／または分布を測定するためのハイブリダイゼーションプローブとして有用である。例示的なプローブは、細胞、組織および生物内の特定の核酸分子の存在を検出するため、またはそのレベルを測定するために使用され得る。したがって、本明細書中に記載されるＬＣＭに対応するプローブは、所与の細胞、組織または生物内の発現および／または遺伝子コピー数を評価するために使用され得、それらは、例えば、正常なＬＣＭタンパク質発現レベルと比べてＬＣＭタンパク質発現の増加または減少に関与する障害の診断に応用され得る。
プローブは、個体由来の細胞のサンプル中のＬＣＭをコードする核酸（例えば、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡ）のレベルを測定するか、またはＬＣＭをコードする核酸が変異しているかを判定することなどによって、ＬＣＭタンパク質を差次的に発現する細胞または組織を同定するための診断テストキットの一部として使用され得る。
本発明の例示的な実施形態は、生物学的サンプル中のＬＣＭをコードする核酸（例えば、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡ）の存在を検出するためのキットを包含する。例えば、例示的なキットは、試薬（例えば、標識されているかもしくは標識可能な核酸、または生物学的サンプル中のＬＣＭ核酸を検出することができる薬剤）；そのサンプル中のＬＣＭ核酸の量を測定するための手段；およびそのサンプル中のＬＣＭ核酸の量を標準物質と比較するための手段を備え得る。その化合物または薬剤は、適当な容器内に包装され得る。そのキットは、キットを使用してＬＣＭ核酸を検出するための指示書をさらに備え得る。
上記核酸分子は、ＬＣＭ核酸発現の定性的変化、特に病状をもたらす定性的変化についての診断アッセイにおいて有用である。それらの核酸分子は、ＬＣＭ遺伝子およびｍＲＮＡなどの遺伝子発現産物内の変異を検出するために使用され得る。それらの核酸分子は、ＬＣＭ遺伝子内の天然に存在する遺伝子変異を検出するため、およびその変異を有する個体がその変異によって引き起こされる障害に対してリスクがあるか否かを判定するためにハイブリダイゼーションプローブとしても使用され得る。変異の例としては、遺伝子内の１つ以上のヌクレオチドの欠失、付加または置換、染色体再編成（例えば、逆位または転位）、およびゲノムＤＮＡの改変（例えば、異常なメチル化パターンまたは遺伝子コピー数の変化（例えば増幅））が挙げられる。機能不全に関連する変異型のＬＣＭ遺伝子の検出は、活性な疾患について、またはその疾患が例えばＬＣＭタンパク質の過剰発現、過小発現または発現の変化に起因する場合は、疾患に対する感受性についての、診断ツールを提供し得る。
ＬＣＭ遺伝子内の変異は、種々の手法によって核酸レベルにおいて検出され得る。例えば、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡまたはｃＤＮＡが、直接解析され得るか、または解析の前に増幅され得る（例えば、ＰＣＲを用いて）。ある特定の例示的な実施形態において、変異の検出は、アンカーＰＣＲまたはＲＡＣＥ ＰＣＲなどのＰＣＲ反応（例えば、米国特許第４，６８３，１９５号および同第４，６８３，２０２号を参照のこと）、あるいは、ライゲーション連鎖反応（ＬＣＲ）（例えば、Ｌａｎｄｅｇｒａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：１０７７−１０８０（１９８８）およびＮａｋａｚａｗａら、ＰＮＡＳ ９１：３６０−３６４（１９９４）を参照のこと）（後者は、遺伝子内の点変異を検出するために特に有用であり得る（Ａｂｒａｖａｙａら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２３：６７５−６８２（１９９５）を参照のこと））におけるプローブ／プライマーの使用を含む。これらのような例示的な方法は、患者から細胞のサンプルを回収する工程、そのサンプルの細胞から核酸（例えば、ゲノム、ｍＲΝＡまたはその両方）を単離する工程、その核酸を、マーカー核酸（存在する場合）のハイブリダイゼーションおよび増幅が生じるような条件下でそのマーカー核酸に特異的にハイブリダイズする１つ以上のプライマーと接触させる工程、および増幅産物の存在もしくは非存在を検出する工程、または増幅産物のサイズを検出して、コントロールサンプルと長さを比較する工程を包含し得る。欠失および挿入は、正常な遺伝子型と比べたときの増幅産物のサイズの変化によって検出され得る。点変異は、例えば、増幅されたＤΝＡを正常なＲΝＡまたはアンチセンスＤΝＡ配列とハイブリダイズすることによって同定され得る。
あるいは、ＬＣＭ遺伝子内の変異は、例えば、ゲル電気泳動によって測定されるときの制限酵素消化パターンの変化によって同定され得る。さらに、配列特異的リボザイム（米国特許第５，４９８，５３１号）を使用することにより、リボザイム切断部位の発生または喪失によって特定の変異の存在が同定され得る。完全にマッチする配列は、ヌクレアーゼ切断消化アッセイまたは融解温度の差によって、ミスマッチの配列と識別され得る。
特定の位置における配列の変化は、ＲＮアーゼおよびＳ１保護などのヌクレアーゼ保護アッセイまたは化学切断法によって評価され得る。さらに、変異ＬＣＭ遺伝子と対応する野生型遺伝子との間の配列の差は、直接的なＤＮＡ配列決定によって決定され得る。種々の自動化された配列決定手順は、質量分析による配列決定（例えば、ＰＣＴ国際公開番号ＷＯ９４／１６１０１；Ｃｏｈｅｎら、Ａｄｖ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．３６：１２７−１６２（１９９６）；およびＧｒｉｆｆｉｎら、Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３８：１４７−１５９（１９９３））を含む診断アッセイ（Ｎａｅｖｅ，ＣＷ．，（１９９５）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １９：４４８）を行う際に利用され得る。
核酸内の変異を検出するための他の方法としては、切断剤からの保護を用いることにより、ＲＮＡ／ＲＮＡまたはＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖内のミスマッチ塩基を検出する方法（Ｍｙｅｒｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０：１２４２（１９８５））；Ｃｏｔｔｏｎら、ＰＮＡＳ ８５：４３９７（１９８８）；Ｓａｌｅｅｂａら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：２８６−２９５（１９９２））、変異核酸および野生型核酸の電気泳動移動度を比較する方法（Ｏｒｉｔａら、ＰＮＡＳ ８６：２７６６（１９８９）；Ｃｏｔｔｏｎら、Ｍｕｔａｔ．Ｒｅｓ．２８５：１２５−１４４（１９９３）；およびＨａｙａｓｈｉら、Ｇｅｎｅｔ．Ａｎａｌ．Ｔｅｃｈ．Ａｐｐｌ．９：７３−７９（１９９２））、および変性剤の勾配を含むポリアクリルアミドゲル内の変異フラグメントまたは野生型フラグメントの移動度を、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）を用いてアッセイする方法（Ｍｙｅｒｓら、Ｎａｔｕｒｅ ３１３：４９５（１９８５））が挙げられる。点変異を検出するための他の手法の例としては、選択的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション、選択的増幅および選択的プライマー伸長が挙げられる。
ｂ．処置をモニターする方法および核酸を用いた薬理ゲノミクス方法
本発明の核酸分子は、臨床試験または処置レジメンなどにおいてＬＣＭ遺伝子の発現または活性に対する調節剤の有効性をモニターするためにも有用である。例えば、ＬＣＭ遺伝子の遺伝子発現パターンは、化合物、特に患者が耐性を起こし得る化合物を用いた処置の継続する有効性についてのバロメーターとして働き得る。遺伝子発現パターンは、その化合物に対する罹患細胞の生理反応を示唆するマーカーとしても働き得る。例えば、核酸発現のモニターに基づいて、化合物の投与が増加され得るか、または患者が耐性になっていない代替化合物が代わりに投与され得る。同様に、核酸発現のレベルが望ましいレベルよりも低下している場合は、その化合物の投与を比例して減少させ得る。
上記核酸分子は、必ずしも疾患を引き起こさないにもかかわらず処置の様式に影響する遺伝子型について個体を試験するためにも有用である。したがって、その核酸分子は、処置のために使用された化合物に対する個体の遺伝子型と個体の応答との関係（薬理ゲノミクス関係）を研究するために使用され得る。したがって、本明細書中に提供される核酸分子を使用することにより、処置のために適切な化合物または投与レジメンを選択するために、個体におけるマーカー遺伝子の変異の内容を評価することができる。例えば、処置に影響する遺伝的変異を有するマーカー核酸分子は、処置を個体に合わせるために使用され得る診断マーカーを提供し得る。したがって、これらの遺伝的変異を有する組換え細胞および組換え動物の作出は、例えば、処置化合物および投与レジメンの有効な臨床設計を可能にする。
ｃ．核酸を用いた処置の方法
本発明の核酸分子は、細胞、組織および生物においてＬＣＭ遺伝子発現を制御するアンチセンス構築物を設計するために有用である。アンチセンス核酸分子は、典型的には、配列特異的様式でマーカーｍＲＮＡにハイブリダイズすることによってｍＲＮＡをＬＣＭタンパク質に翻訳することを阻止する。本発明の核酸分子は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）などの方法によって遺伝子発現を特異的に抑制するためにも使用され得る。ＲＮＡｉおよびアンチセンスベースの遺伝子抑制は、当該分野で周知である（例えば、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８８：１３７０−１３７２，２０００）。ＲＮＡｉは、典型的には転写後レベルで作動し、配列特異的である。ＲＮＡｉおよびアンチセンス核酸分子は、疾患、とりわけ癌を処置するために有用である。ＲＮＡｉフラグメント、特に二本鎖（ｄｓ）ＲＮＡｉならびにアンチセンス核酸分子は、遺伝子発現を抑制することによって機能喪失表現型をもたらすためにも使用され得る。したがって、本発明の例示的な実施形態は、ＲＮＡｉおよびアンチセンス核酸分子、ならびに治療または細胞機能の調節などのためにこれらのＲＮＡｉおよびアンチセンス核酸分子を使用する方法を提供する。例えば遺伝子にハイブリダイズすることによって転写を妨害する、転写に関与する遺伝子の領域に相補的な核酸分子もまた生成され得る。
本発明の例示的な実施形態は、約１７〜約２９ヌクレオチド（ｎｔ）長、より詳細には約２１〜約２５ｎｔ長である、単離されたＲＮＡ分子（二本鎖；一本鎖）に関し、そのＲＮＡ分子は、ＲＮＡｉを媒介する（例えば、ｍＲＮＡの分解、そのようなｍＲＮＡは、本明細書中で、分解されるｍＲＮＡと称されることがある）。ＲＮＡｉに関して、用語ＲＮＡ、ＲＮＡ分子、ＲＮＡセグメントおよびＲＮＡフラグメントは、ＲＮＡｉを媒介するＲＮＡのことを指すために交換可能に使用される。これらの用語には、二本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、単離されたＲＮＡ（例えば、部分的に精製されたＲＮＡ、本質的に純粋なＲＮＡ、合成ＲＮＡ、組換え的に生成されたＲＮＡ）、ならびに１つ以上のヌクレオチドの付加、欠失、置換および／または変更によって天然に存在するＲＮＡと異なる変更されたＲＮＡが含まれる。そのような変更は、例えば、２１〜２５ｎｔのＲＮＡの末端または内部などへの非ヌクレオチド材料の付加（そのＲＮＡの１つ以上のヌクレオチドにおいて）を含み得る。本発明の例示的なＲＮＡ分子中のヌクレオチドは、天然に存在しないヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドをはじめとした非標準的なヌクレオチドも含み得る。そのような変更されたＲＮＡのすべては、ひとまとめにして、アナログまたは天然に存在するＲＮＡのアナログと称される。２１〜２５ｎｔのＲＮＡは、典型的には、ＲＮＡｉを媒介する能力を有する程度に天然のＲＮＡと十分に類似していることだけが必要である。本明細書中で使用されるとき、句「ＲＮＡｉを媒介する」とは、どのＲＮＡがＲＮＡｉプロセスによって分解されるべきか識別する能力のことを指す。ＲＮＡｉを媒介するＲＮＡは、ＲＮＡｉプロセスによって特定のｍＲＮＡの分解を指示する。そのようなＲＮＡは、短いヘアピンＲＮＡをはじめとした様々な構造のＲＮＡを含み得る。
ある特定の例示的な実施形態において、本発明は、配列に対応する特定のｍＲＮＡの切断を指示する２１〜約２５ｎｔのＲＮＡ分子に関する。配列の完全な対応（すなわち、マッチ）である必要はないが、その対応は、ＲＮＡがマーカーｍＲＮＡのＲＮＡｉ切断の指示を可能にするのに十分でなければならない（Ｈｏｌｅｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３３：４７０４−４７１０（２００５））。例示的な実施形態において、本発明の２１〜２５ｎｔのＲＮＡ分子は、３’ヒドロキシル基を含む。
本発明のある特定の例示的な実施形態は、化学合成または組換えＤＮＡ手法によって生成された、ＲＮＡｉを媒介する特定の遺伝子の２１〜２５ｎｔのＲＮＡに関する。本明細書中で使用されるとき、用語「単離されたＲＮＡ」は、例えば、ｄｓＲＮＡのプロセシングまたは切断、化学合成法による生成、および組換えＤＮＡ手法による生成をはじめとした任意の手段によって得られたＲＮＡを含む。本発明の例示的な実施形態は、さらに、治療的または予防的な処置などのための２１〜２５ｎｔのＲＮＡの使用、ならびに２１〜２５ｎｔのＲＮＡおよび適切なキャリアを含む薬学的組成物などのＲＮＡｉを媒介する２１〜２５ｎｔのＲＮＡを含む組成物に関する。
本発明のさらに例示的な実施形態は、患者の遺伝子のＲＮＡｉを媒介する方法に関する。例えば、分解される特定のｍＲＮＡを標的化する約２１〜約２５ｎｔのＲＮＡが、患者の細胞内に導入され得る。それらの細胞は、そのｍＲＮＡの分解を可能にする条件下で維持され得、その結果、患者の細胞内においてその遺伝子のｍＲＮＡのＲＮＡ媒介性干渉がもたらされる。例えばＲＮＡｉを用いた癌患者の処置は、癌の成長および伝播を阻害し得、また、腫瘍サイズを減少させ得る。ＲＮＡｉを用いた患者の処置は、他の治療とも併用され得る。例えば、ＲＮＡｉは、他の処置様式（例えば、化学療法、放射線治療および他の処置）と併用して使用され得る。例示的な実施形態において、化学療法剤がＲＮＡｉと併用して使用される。さらに例示的な実施形態において、ＧＥＭＺＡＲ（ゲムシタビンＨＣｌ）化学療法が、ＲＮＡｉとともに用いられる。
ＲＮＡｉによるある特定の疾患の処置は、疾患細胞へのＲＮＡの導入を必要とし得る。ＲＮＡは、例えば、細胞に直接導入され得るか、または腔、間質腔に、患者の循環中に細胞外に導入され得るか、または経口的に導入され得る。細胞内への直接的な注射または患者への細胞外の注射などの核酸を導入する物理的な方法もまた使用され得る。ＲＮＡは、例えば、脈管もしくは脈管外の循環中、血液もしくはリンパ系、または脳脊髄液に導入され得る。ＲＮＡは、患者に由来し得る胚性幹細胞または別の多分化能細胞に導入され得る。核酸を導入する物理的方法としては、ＲＮＡを含む溶液の注射、ＲＮＡによってコーティングされた粒子による照射、ＲＮＡの溶液中への細胞もしくは組織の浸漬、またはＲＮＡの存在下での細胞膜のエレクトロポレーションが挙げられる。ウイルス粒子内にパッケージされたウイルス構築物は、細胞内に発現構築物を導入するために使用され得る（その構築物はＲＮＡを発現する）。核酸を細胞に導入するための当該分野で公知の他の方法（例えば、脂質媒介性のキャリア輸送、化学物質媒介性の輸送など）が使用され得る。ＲＮＡは、以下の活性：細胞によるＲＮＡ取り込みの増強、二重鎖のアニーリングの促進、アニールした鎖の安定化、または別の方法によるマーカー遺伝子の阻害の増大のうちの１つ以上を行う成分とともに導入され得る。
本発明の例示的なＲＮＡは、単独で、またはインビトロもしくはインビボにおいて細胞、組織／体液もしくは患者にＲＮＡを導入するための少なくとも１つの試薬を有するキットの構成要素として、使用され得る。キットの例示的な構成要素としては、ｄｓＲＮＡおよびそのｄｓＲＮＡの導入を促進するビヒクルが挙げられる。キットは、そのキットを使用するための指示書も備え得る。
本発明のある特定の例示的な実施形態は、ｍＲＮＡ中の１つ以上の領域に相補的なヌクレオチド配列を含むリボザイムによってｍＲＮＡを切断することにより、そのｍＲＮＡの翻訳を減弱するための組成物および方法を提供する。リボザイムによって標的化され得るｍＲＮＡ中の領域の例としては、コード領域、特に基質結合などのマーカータンパク質の触媒活性または他の機能活性に対応するコード領域が挙げられる。これらの組成物および方法は、異常な、または望まれないマーカー核酸発現を特徴とする障害を処置するために使用され得る。
ある特定の例示的な実施形態において、本発明の核酸分子は、マーカーの遺伝子発現が異常である細胞を有する個体における遺伝子治療のために使用され得る。例えば、細胞が所望のマーカータンパク質を産生することによって個体が処置される場合に、エキソビボにおいて操作された組換え細胞（個体自身の細胞を含み得る）がその個体に導入され得る。
ｄ．核酸を用いたスクリーニング方法
核酸発現アッセイは、ＬＣＭ核酸発現を調節する化合物を同定する薬物スクリーニングのために有用である。
したがって、本発明の例示的な実施形態は、ＬＣＭ遺伝子の差次的な発現に関連する疾患、とりわけ癌を処置するために使用され得る化合物を同定するための方法を提供する。例示的な方法は、典型的には、化合物がマーカー核酸の発現を調節する能力をアッセイすることにより、望まれないマーカー核酸の発現を特徴とする障害を処置するために使用され得る化合物を同定する工程を包含し得る。そのアッセイは、細胞ベースの系または無細胞系において行われ得る。細胞ベースのアッセイの例としては、マーカー核酸を天然に発現する細胞、または特定のマーカー核酸配列を発現するように遺伝的に操作された組換え細胞が挙げられる。
マーカー核酸発現についてのアッセイは、ｍＲＮＡレベルなどのマーカー核酸レベルの直接的なアッセイ、またはシグナル経路に関与する副次的な化合物に対する直接的なアッセイを含み得る。さらに、シグナル経路に応答してアップレギュレートまたはダウンレギュレートされる遺伝子の発現もまたアッセイされ得る。これらの実施形態において、これらの遺伝子の制御領域は、ルシフェラーゼなどのレポーター遺伝子に作動可能に連結され得る。
したがって、例示的な実施形態において、マーカーの遺伝子発現の調節因子は、細胞を候補薬剤と接触させ、そしてマーカーｍＲＮＡの発現を測定する方法において同定され得る。候補薬剤の存在下でのマーカーｍＲＮＡの発現レベルを、その候補薬剤の非存在下でのマーカーｍＲＮＡの発現レベルと比較する。次いで、この比較に基づいて、その候補薬剤を、マーカー核酸発現の調節因子として同定し得、そしてそれらを、例えば、異常なマーカー核酸発現を特徴とする障害を処置するために使用し得る。マーカーｍＲＮＡの発現が、候補薬剤の非存在下よりも存在下のほうが統計学的に有意に高いとき、その候補薬剤は、核酸発現の刺激物質（アゴニスト）と同定される。核酸発現が、候補薬剤の非存在下よりも存在下のほうが統計学的に有意に低いとき、その候補化合物は、核酸発現のインヒビター（アンタゴニスト）と同定される。
１１．アレイおよび発現解析
「アレイ」（「マイクロアレイ」と交換可能に称される）とは、典型的には、少なくとも１つであるが、より典型的には、少なくとも２つの核酸分子、タンパク質または抗体が基材上に配置されたもののことを指す。ある特定の例示的な配置において、核酸分子、タンパク質または抗体の少なくとも１つは、典型的には、コントロールまたは標準物質であり、そして他の核酸分子、タンパク質または抗体は、診断的または治療的に関心のあるものである。例示的な実施形態において、その核酸分子、タンパク質または抗体が基材上に配置されたものは、標識された複合体（例えば、各核酸分子と相補的な核酸との間に形成されたもの、または各タンパク質とリガンドもしくは抗体との間に形成されたもの、または各抗体とその抗体が特異的に結合するタンパク質との間に形成されたもの）の各々のサイズおよびシグナル強度が個別に識別可能である。
「発現プロファイル」は、サンプル中のマーカー発現の表現である。核酸発現プロファイルは、例えば、サンプル由来の核酸に対するアレイ、配列決定、ハイブリダイゼーションまたは増幅の技術を用いて、生成され得る。タンパク質発現プロファイルは、例えば、アレイ、ゲル電気泳動、質量分析、またはタンパク質に特異的に結合する抗体（および必要に応じて、標識部分）を用いて、生成され得る。核酸、タンパク質または抗体は、基材に付着され得るか、または溶液として提供され得、それらの検出は、当該分野で周知の方法に基づき得る。
基材としては、ガラス、紙、ナイロンもしくは他のタイプのメンブレン、フィルター、チップ、金属または他の任意の適当な固体もしくは半固体（例えば、ゲル）の支持体が挙げられるが、これらに限定されない。
例示的なアレイは、米国特許第５，８３７，８３２号；ＰＣＴ出願ＷＯ９５／１１９９５；Ｌｏｃｋｈａｒｔら、１９９６，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１４：１６７５−１６８０；Ｓｃｈｅｎａら、１９９６；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９３：１０６１４−１０６１９；および米国特許第５，８０７，５２２号に記載されている方法に従って調製され得、使用され得る。本発明の例示的な実施形態は、抗体アレイも提供する（例えば、ｄｅ Ｗｉｌｄｔら（２０００）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８：９８９−９４を参照のこと）。
本発明のある特定の例示的な実施形態は、マーカー発現をアッセイするための核酸アレイを提供し、そのアレイは、固体支持体に固定された、一本鎖核酸分子、通常、合成アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはｃＤＮＡのフラグメントから構成され得る。それらのオリゴヌクレオチドは、例えば、約６〜６０ヌクレオチド長、約１５〜３０ヌクレオチド長、または約２０〜２５ヌクレオチド長であり得る。
アレイ用のマーカー核酸分子に対するオリゴヌクレオチドを生成するために、目的のマーカー核酸分子は、典型的には、コンピュータアルゴリズムを使用して調べられることにより、その核酸分子にとって独特であり、ハイブリダイゼーションに適した範囲内のＧＣ含有量を有し、かつハイブリダイゼーションを妨害し得ると予測される二次構造を有しない、規定の長さのオリゴヌクレオチドが同定される。ある特定の場合において、アレイ上のオリゴヌクレオチドの対を使用することが望ましいことがある。例示的な実施形態において、「対」は、１つのヌクレオチド（例えば、その配列の中心に位置し得るもの）を除いて同一であり得る。その対の第２のオリゴヌクレオチド（１つがミスマッチのもの）は、コントロールとして働く。任意の数のオリゴヌクレオチド対が利用され得る。
オリゴヌクレオチドは、例えば、光指向性（ｌｉｇｈｔ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ）化学プロセスを用いることによって、または化学的結合手順およびインクジェット応用装置（例えば、ＰＣＴ出願ＷＯ９５／２５１１１６）を用いることによって、基材の表面上において合成され得る。
いくつかの例示的な実施形態において、アレイは、例えば、マーカー発現をアッセイすることによって、疾患の進行を診断またはモニターするために使用され得る。
例えば、マーカーに特異的なオリゴヌクレオチドプローブは、標準的な方法によって標識され得、そしてハイブリダイゼーション複合体の形成を可能にする条件下で患者由来の生物学的サンプルに加えられ得る。インキュベート期間の後、サンプルを洗浄し得、そしてハイブリダイゼーション複合体と会合している標識（またはシグナル）の量を定量化し得、標準的な値と比較し得る。患者サンプル中の複合体形成が、正常（例えば、健常）な標準物質と比較して、有意に変化している（高いかまたは低い）か、または疾患標準物質と同様である場合、この差次的な発現は、障害の診断となり得る。
マーカー発現のパターンの変化を解析することによって、患者が症候性になる前の早期の段階において疾患が診断され得る。本発明の例示的な実施形態において、アレイまたはマーカー発現解析方法は、診断もしくは予後判定を考案するため、処置レジメンを設計するため、および／または処置の有効性をモニターするために使用され得る。例えば、処置の成功を示唆するマーカー発現パターンを変化させる処置投与量が確立され得、そして望ましくない副作用の発生に関連するマーカー発現パターンを避けることができる。さらに例示的な実施形態において、マーカー発現のアッセイは、患者におけるマーカー発現のレベルが、正常個体において観察されるレベルに近づき始めているか否かを判定するために定期的な基準に基づいて反復され得る。継続的なアッセイから得られた結果を用いることにより、例えば、数日から数年の期間にわたる処置の有効性が示され得る。
本発明の例示的なアレイは、例えば、公知の治療薬によって引き起こされるものと同様のマーカー発現プロファイルを生成する薬剤を同定するために候補薬剤をスクリーニングするためにも使用され得、同様のマーカー発現プロファイルを引き起こす薬剤は、そのマーカーに対して類似の治療効果および／または作用様式を有し得ると見込まれる。
本発明の例示的な実施形態は、以下の実施例においてさらに説明されるが、それらは本発明の範囲を限定するものではない。
１．組織サンプルおよび細胞株
組織の処理および組織からの単一細胞懸濁液の調製
組織サンプル（例えば、正常組織、または外科的に切除された新生物性もしくは転移性の病変などの疾患組織）は、臨床施設から得ることができ、輸送緩衝液中において輸送され得る。組織は、癌（または他の疾患）組織の外科的切除後に残余組織として回収され得る。残余組織は、患者への配慮についての適正な規範に従って、病理学的診断のために処理された後に供給される。正常組織検体は、腫瘍切除中に回収される腫瘍（または他の疾患組織）に隣接した正常組織であり得る。例えば正常な隣接組織に存在し得る新生物発生前の変化からの関与を減少させるために、癌（または他の目的の疾患）を有しない健常患者からの正常組織もまた含まれ得る。組織サンプルの調達は、連邦政府により義務付けられた倫理的および法的なガイドライン（ＨＩＰＡＡ）に応じて、ならびに臨床機関倫理審査委員会（ｃｌｉｎｉｃａｌ ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ ｅｔｈｉｃａｌ ｒｅｖｉｅｗ ｂｏａｒｄ）および内部機関審査委員会（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ ｒｅｖｉｅｗ ｂｏａｒｄ）のガイドラインに従って、匿名の様式で行われる。
組織を粗く刻み、そして酵素組み合わせ物＃１（２００単位のコラゲナーゼ、ｃａｔ＃Ｃ５８９４ Ｓｉｇｍａ；１２６μｇのＤＮＡｓｅ Ｉ、ｃａｔ＃Ｄ４５１３ Ｓｉｇｍａ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ ｐＨ７．５中）；５０ｍＭ ＮａＣｌ；１０ｍＭ ＭｇＣｌ２；０．０５％エラスターゼ、ｃａｔ＃Ｅ７８８５ Ｓｉｇｍａ）（さらに、ヒアルロニダーゼ酵素も利用され得る）中、３７℃において定期的に撹拌しながら２０〜３０分間インキュベートし得る。その酵素組み合わせ物の３×体積のＤ−ＰＢＳを加え、組織を細かく刻み、そして解離させた細胞を２００μｍフィルターに通す。それらの細胞をＤ−ＰＢＳで２回洗浄する。必要であればＰｈａｒＭＬｙｓｅ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて赤血球を溶解する。細胞の数および生存度をＰＩ排除（ＧＵＡＶＡ）によって測定する。２０×１０６よりも多い全細胞数の細胞を、高速選別機（ＭｏＦｌｏ Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ）を用いて上皮細胞（ＥｐＣＡＭ陽性）について選別する。
残った未消化の組織を、酵素組み合わせ物＃２（１×Ｌｉｂｅｒａｓｅ Ｂｌｅｎｄｚｙｍｅ １、ｃａｔ＃９８８−４１７ Ｒｏｃｈｅ；１×Ｌｉｂｅｒａｓｅ Ｂｌｅｎｄｚｙｍｅ ３、ｃａｔ＃８１４−１８４ Ｒｏｃｈｅ；０．０５％エラスターゼ、ｃａｔ＃Ｅ７８８５Ｓｉｇｍａ）中、３７℃にて定期的に撹拌しながら２０〜３０分間インキュベートする。その酵素組み合わせ物の３×体積のＤ−ＰＢＳを加え、組織が完全に解離するまで組織を細かく刻む。それらの細胞を２００μｍフィルターに通し、Ｄ−ＰＢＳで２回洗浄し、そして酵素組み合わせ物＃１消化物からの細胞とともにプールする。
細胞を単一細胞懸濁液のために７０μｍフィルターに通し、細胞の数および生存度をＰＩ排除（ＧＵＡＶＡ）によって測定する。必要であればＰｈａｒＭＬｙｓｅ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて赤血球を溶解する。細胞を、Ｄ−ＰＢＳ中の２０ｍｌの１×ＰｈａｒＭＬｙｓｅにおいて穏やかに撹拌しながら３０秒間インキュベートし、そして細胞を４℃で５分間３００×ｇにおいてペレットにする。細胞をＤ−ＰＢＳ中で１回洗浄し、細胞の数および生存度を、ＧＵＡＶＡを用いてＰＩ排除によって再度計算する。２０×１０６よりも多い全細胞数の細胞を、高速選別機（ＭｏＦｌｏ Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ）を用いて上皮細胞（ＥｐＣＡＭ陽性）について選別する。
単一細胞懸濁液はまた、以下のとおり組織サンプルから調製され得る：検体をＤＴＴ中で１５分間洗浄し、Ｄｉｓｐａｓｅで消化し（３０〜６０分間）、次いで、２回濾過した（３８０μｍ／７４μｍ）後、ＡＣＫ溶解緩衝液を加えることによって、赤血球を除去する。上皮（ＥｐＣＡＭ）および白血球（ＣＤ４５）含有量ならびに細胞生存度（ＰＩ排除）を、フローサイトメトリー解析（ＬＳＲ Ｉ，ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）によって測定し得る。
疾患検体と正常検体の両方の上皮内容物が、ビーズ捕捉による上皮細胞表面抗原（ＥＣＳＡ／ＥｐＣａｍ）陽性細胞のフローサイトメトリーまたは精製による、ＣＤ４５陽性免疫細胞の枯渇によって濃縮され得る。
上皮細胞のビーズ捕捉は、以下のとおりＤｙｎａｌ ＣＥＬＬｅｃｔｉｏｎ Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ Ｅｎｒｉｃｈキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いて行われ得る。２×１０８ビーズという濃度のＤｙｎａｌ ＣＥＬＬｅｃｔｉｏｎビーズを、１０％ウシ胎仔血清を含むＨＢＳＳ中で１×１０８個の細胞とともに４℃において３０分間インキュベートする。細胞およびビーズを、磁石システムＤｙｎａｌ ＭＰＣに２分間置く。ビーズ／細胞複合体を、１％ウシ胎仔血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地中で洗浄する。１％ウシ胎仔血清を含むＲＰＭＩ中で撹拌しながら、ＤＮアーゼと１５分間インキュベートすることによって、細胞をビーズ複合体から放出させる。
ＣＤ４５細胞のＤｙｎａｌＢｅａｄ細胞枯渇は、以下のとおり行われ得る。ＤｙｎａｌＢｅａｄ Ｍ−４５０ ＣＤ４５ビーズおよび細胞を、２５０μｌビーズ／２×１０７細胞の濃度において、４℃にて３０分間インキュベートする。ビーズ／細胞複合体を、２％ウシ胎児血清を含むＤＰＢＳ緩衝液中で洗浄する。細胞およびビーズを、磁石システムＤｙｎａｌ ＭＰＣに２分間置く。その上清は、ＥｐＣＡＭ濃縮細胞を含んでいる。
細胞株の培養
細胞株は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から入手することができる。例えば、肺癌細胞株および正常コントロール肺細胞株（例えば、Ｂｅａｓ２Ｂ細胞は、正常コントロール肺細胞株として使用され得る）は、例えば、正常な肺細胞と比較して肺癌細胞におけるマーカー（例えば、タンパク質またはコードｍＲＮＡ転写物）の発現レベルを測定するために、使用され得る。細胞株は、特定の細胞株の各々に対するＡＴＣＣのガイドラインに従って必要に応じて成長因子および血清が補充された培養培地中で生育され得る。培養物は、細胞が凍結培地に懸濁され（１０％ＤＭＳＯ［ｖ／ｖ］を含む細胞培養液）、液体窒素中で急凍された凍結貯蔵物から確立される。このように調製された凍結貯蔵物は、液体窒素蒸気中で保存される。細胞培養物は、３７℃において凍結貯蔵物を急速に解凍することによって確立される。解凍された貯蔵物の培養物は、大量の補充された培養液を含む培養容器にゆっくりと移される。培養物を維持するために、細胞を１×１０５細胞／ｍｌで培地中に播種し、そしてその培養容器内の細胞のコンフルエンスが面積について５０％を超えるまで３７℃でインキュベートする。この時点において、必要であれば酵素またはＥＤＴＡを用いて、細胞を培養容器から回収する。回収された生細胞の密度を血球計算法によって推定し、そして培養物を上記のように再度播種する。この種類の継代は、２５回だけ繰り返し、その時点で培養物は廃棄し、そして上に記載したように、凍結貯蔵物を再度確立する。
あるいは、分泌タンパク質を解析する場合は、約１５００万細胞／ローラーボトルという最初の播種密度で、４９０ｃｍ２のローラーボトル内において通例の組織培養条件下で細胞を生育し得る。その細胞が約７０〜８０％コンフルエンスに達したら、培養培地を除去し、細胞をＤ−ＰＢＳで３回、およびＣＤ２９３無タンパク質培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ｃａｔ＃１１９１３−０１９）で１回洗浄し、そして馴化培地をもたらすために、培養培地をＣＤ２９３で置き換える。細胞をＣＤ２９３中で７２時間インキュベートし、そして培地を、分泌タンパク質の質量分析などの解析のために回収する（３０〜３００ｍｌ）。５分間の３００ｇにおける遠心分離によって、細胞残屑をその馴化培地から除去し、そして解析の前に０．２ミクロンフィルターで濾過する。
２．マーカータンパク質のクローニングおよび発現
ｃＤＮＡ回収
関連するタンパク質配列データベースに対するＢＬＡＳＴアルゴリズムを用いてペプチド配列を検索することにより、対応する完全長タンパク質（参照配列）が同定され得る。次いで、各完全長タンパク質配列を、ＢＬＡＳＴアルゴリズムを用いてヒトｃＤＮＡクローンコレクションに対して検索し得る。目的の各配列について、クローンを得て、そしてＬＢ／アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）プレート上に画線し得る。Ｑｉａｇｅｎスピンミニプレップキットを用いてプラスミドＤＮＡを単離し、制限消化により確認する。続いて、単離されたプラスミドＤＮＡの配列を、参照完全長タンパク質配列に対して確認する。Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＢｉｇＤｙｅターミネーターキットを用いて配列決定の反応を行った後、エタノール沈殿を行う。Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ３７００Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒを用いて配列データを回収し、そしてそのデータを、Ｃｌｏｎｅ Ｍａｎａｇｅｒアラインメントツールを用いて参照完全長タンパク質配列とのアラインメントによって解析する。
ＰＣＲ
ＰＣＲプライマーは、完全長タンパク質をコードする領域および／または発現について興味深いタンパク質の任意の領域（例えば、Ｃｌｏｎｅ Ｍａｎａｇｅｒ配列解析ツールによって判定されるような抗原性または親水性の領域）を増幅するように設計される。プライマーは、５’および３’オーバーハングも含むことにより、クローニングが促進される（以下を参照のこと）。ＰＣＲ反応物は、２．５単位のＰｌａｔｉｎｕｍ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼＨｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、５０ｎｇのｃＤＮＡプラスミド鋳型、１μＭの順方向および逆方向プライマー、８００μＭ ｄＮＴＰ混合物（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）および２ｍＭ ＭｇＳＯ４を含む。２０〜３０サイクル（９４℃３０秒、５５℃１分および７３℃２分）の後、得られた産物を配列解析によって確認し、そしてアガロースゲル電気泳動によって定量化する。
エントリークローンの構築
Ｇａｔｅｗａｙ組換えベースクローニングシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とともに使用するために、ＰＣＲ産物をエントリーベクターにクローニングする。これらのベクターとしては、ｐＤｏｎｒ２２１、ｐＤｏｎｒ２０１、ｐＥｎｔｒ／Ｄ−ＴＯＰＯまたはｐＥｎｔｒ／ＳＤ／Ｄ−ＴＯＰＯが挙げられ、以下のクローニング方法に記載されるように使用される。
ｐＥｎｔｒ／Ｄ−ＴＯＰＯまたはｐＥｎｔｒ／ＳＤ／Ｄ−ＴＯＰＯへのＴＯＰＯクローニング
この方法を用いたクローニングのために、順方向ＰＣＲプライマーは、配列「ＣＡＣＣ」を含む５’オーバーハングを含む。ＰＣＲ産物は、上に記載したように生成され、そしてＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＴＯＰＯ（登録商標）クローニングキットを用いてエントリーベクターにクローニングされる。反応は、典型的には、室温において１０分間行われ、続いてＴＯＰ１０ケミカリーコンピテントセル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）に形質転換される。候補クローンを拾い、Ｑｉａｇｅｎスピンミニプレップキットを用いてプラスミドＤＮＡを調製し、そして制限酵素消化によってスクリーニングする。続いて、上に記載したように挿入断片の配列を確認する。
ｐＤｏｎｒ２０１またはｐＤｏｎｒ２２１へのＧａｔｅｗａｙクローニング
この方法を用いたクローニングのために、ＰＣＲプライマーは、順方向および逆方向５’オーバーハングを含む。ＰＣＲ産物を、上に記載したように生成する。タンパク質をコードする核酸分子を、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｇａｔｅｗａｙ ＢＰ Ｃｌｏｎａｓｅ 酵素混合物を用いてエントリーベクターに組み換える。反応は、典型的には、２５℃において１時間行われ、３７℃において１０分間プロテイナーゼＫで処理し、そしてＬｉｂｒａｒｙ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ＤＨ５αケミカリーコンピテントセル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）に形質転換する。候補クローンを拾い、Ｑｉａｇｅｎスピンミニプレップキットを用いてプラスミドＤＮＡを調製し、そして制限酵素消化によってスクリーニングする。続いて、上に記載したように挿入断片の配列を確認する。
発現クローンの構築
Ｇａｔｅｗａｙ ＬＲ Ｃｌｏｎａｓｅ酵素混合物を用いて、タンパク質をコードする核酸分子をエントリー構築物から一連の発現ベクターに移す。反応は、典型的には、２５℃において１時間行われ、３７℃において１０分間プロテイナーゼＫで処理し、続いてＬｉｂｒａｒｙ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ＤＨ５αケミカリーコンピテントセル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に形質転換する。候補クローンを拾い、Ｑｉａｇｅｎスピンミニプレップキットを用いてプラスミドＤＮＡを調製し、そして制限酵素消化によってスクリーニングする。発現ベクターとしては、ｐＤｅｓｔ１４、ｐＤｅｓｔ１５、ｐＤｅｓｔ１７、ｐＤｅｓｔ８、ｐＤｅｓｔ１０およびｐＤｅｓｔ２０が挙げられるが、これらに限定されない。これらのベクターは、Ｅ．ｃｏｌｉおよび組換えバキュロウイルスなどの系において発現を可能にする。ここに列挙されていない他のベクターは、酵母、哺乳動物細胞またはインビトロにおける発現を可能にする。
Ｅ．ｃｏｌｉにおける組換えタンパク質の発現
構築物を以下の宿主菌株：ＢＬ２１ ＳＩ、ＢＬ２１ ＡＩ、（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｏｒｉｇａｍｉ Ｂ（ＤＥ３）、Ｏｒｉｇａｍｉ Ｂ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）、Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、Ｒｏｓｅｔｔａ−Ｇａｍｉ（ＤＥ３）、Ｒｏｓｅｔｔａ−Ｇａｍｉ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳまたはＲｏｓｅｔｔａ−Ｇａｍｉ Ｂ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（Ｎｏｖａｇｅｎ）のうちの１つ以上に形質転換する。それらの形質転換体を、２０〜３７℃の範囲の温度において通気しながら、ＮａＣｌを含むかまたは含まず、かつ適切な抗生物質を含むＬＢ中で生育する。細胞が中期対数増殖期のときに、ＩＰＴＧ（０．０３〜０．３０ｍＭ）またはＮａＣｌ（７５〜３００ｍＭ）を加えることによって、発現を誘導する。誘導後１〜２４時間にわたって増殖を継続する。Ｈ６０００Ａローターを備えたＳｏｒｖａｌｌ ＲＣ−３Ｃ遠心機における、４℃、３０００ｒｐｍでの１０分間にわたる遠心分離によって細胞を回収する。細胞ペレットを−８０℃で保存する。
バキュロウイルスを用いた組換えタンパク質の発現
組換えタンパク質は、Ｓｆ２１ヨトウガ（ｆａｌｌ ａｒｍｙ ｗｏｒｍ）卵巣細胞においてバキュロウイルスを用いて発現される。組換えバキュロウイルスは、製造者の指示書に従ってＢａｃ−ｔｏ−Ｂａｃシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて調製される。タンパク質は、１０Ｌバイオリアクタータンク内のＳｆ９００ＩＩ無血清培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で大規模に発現される（４８時間にわたる、２７℃、１３０ｒｐｍ、５０％溶存酸素）。
３．組換えタンパク質精製
組換えタンパク質は、種々の標準的なクロマトグラフィ方法を用いて、Ｅ．ｃｏｌｉおよび／または昆虫細胞から精製され得る。簡潔には、超音波処理または界面活性剤を用いて細胞を溶解する。不溶性材料を１５分間の１０，０００×ｇでの遠心分離によってペレットにする。上清を適切なアフィニティーカラムに適用する。例えば、Ｈｉｓタグ化タンパク質は、事前に充填されたキレーティングセファロースカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて分離されるか、またはＧＳＴタグ化タンパク質は、グルタチオンセファロースカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて分離される。アフィニティーカラムを使用した後、タンパク質は、電荷に基づいて分離するイオン交換クロマトグラフィ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ製のカラム）または分子量、サイズおよび形状に基づいて分離するサイズ排除クロマトグラフィ（Ｔｏｓｏｈａａｓ製のカラム）などの様々な手法を用いてさらに分離される。
タンパク質の発現および精製は、哺乳動物細胞発現系または昆虫細胞発現系を用いても達成され得る。ｐＵＢ６／Ｖ５−Ｈｉｓベクターシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）を用いることにより、ＣＨＯ細胞においてｃＤＮＡが発現され得る。そのベクターは、選択可能なｂｓｄ遺伝子、マルチクローニングサイト、ヒトユビキチンＣ遺伝子由来のプロモーター／エンハンサー配列、抗Ｖ５抗体を用いる抗体検出用のＣ末端Ｖ５エピトープ、およびＰＲＯＢＯＮＤ樹脂（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣＡ）における迅速精製用のＣ末端ポリヒスチジン（６×Ｈｉｓ）配列を含む。形質転換された細胞は、ブラストサイジンを含む培地において選択される。
Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（Ｓｆ９）昆虫細胞に組換えＡｕｔｏｇｒａｐｈｉｃａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体病ウイルス（バキュロウイルス）を感染させる。ポリヘドリン遺伝子が、相同組換えによってそのｃＤＮＡで置き換えられ、そしてポリヘドリンプロモーターが、ｃＤＮＡ転写を駆動する。そのタンパク質は、上に記載したような精製を可能にする６×Ｈｉｓとの融合タンパク質として合成される。精製されたタンパク質は、抗体を作製するために使用され得る。
４．タンパク質の化学合成
タンパク質またはその一部は、組換え方法（例えば、上に記載したもの）だけでなく、当該分野で周知の化学方法を用いることによっても生成され得る。固相ペプチド合成は、バッチ式で、またはリンカー基を介してα−アミノおよび側鎖が保護されたアミノ酸残基を不溶性のポリマー支持体に連続的に付加する連続フロープロセスにおいて、行われ得る。メチルアミン誘導体化ポリエチレングリコールなどのリンカー基が、ポリ（スチレン−コ−ジビニルベンゼン）に付着されることにより、支持体樹脂が形成される。上記アミノ酸残基は、酸不安定性Ｂｏｃ（ｔ−ブチルオキシカルボニル）または塩基不安定性Ｆｍｏｃ（９−フルオレニルメトキシカルボニル）基によってＮ−ａ−保護される。保護されたアミノ酸のカルボキシル基は、リンカー基のアミンに結合されることにより、その残基が固相支持体樹脂に固着される。ＢｏｃまたはＦｍｏｃの場合において、それぞれトリフルオロ酢酸またはピペリジンを用いることにより、保護基が除去される。カップリング剤または事前に活性化されたアミノ酸誘導体を用いて、固着された残基に各追加アミノ酸を付加し、そしてその樹脂を洗浄する。脱保護、誘導体化アミノ酸の結合、ならびにジクロロメタンおよび／またはＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドによる洗浄の連続によって、完全長ペプチドが合成される。ペプチドのカルボキシ末端とリンカー基との間でそのペプチドを切断することにより、ペプチドの酸またはアミドが得られる（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ １９９７／９８ Ｃａｔａｌｏｇ ａｎｄ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ Ｃａｌｉｆ，ｐｐ．Ｓ１−Ｓ２０）。
４３１Ａペプチド合成装置（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）などの機械において、自動化された合成も行われ得る。タンパク質またはその一部は、分取高速液体クロマトグラフィによって精製され得、そしてその組成は、アミノ酸解析または配列決定によって確認され得る（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，１９８４，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｗ Ｈ Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｎ．Ｙ．）。
５．抗体の作製
ポリクローナル抗体
組換えタンパク質に対するポリクローナル抗体は、ウサギ（Ｇｒｅｅｎ Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＶＴ）において産生され得る。簡潔には、２匹のニュージーランドウサギをフロイント完全アジュバント中の０．１ｍｇの抗原で免疫する。続いて、１４、２１および４９日目にフロイント不完全アジュバント中の０．０５ｍｇの抗原を用いて免疫化を行う。血液を回収し、固相ＥＬＩＳＡおよびウエスタンブロット解析によって抗原の認識についてスクリーニングする。ＩｇＧ画分を、２０分間の２０，０００×ｇでの遠心分離によって分離した後、５０％硫酸アンモニウムで切断する。ペレットになったタンパク質を５ｍＭ Ｔｒｉｓに再懸濁し、イオン交換クロマトグラフィによって分離する。ＩｇＧ含有量に基づいて画分をプールする。抗原特異的抗体は、適切な抗原に結合されたＰｉｅｒｃｅ ＡｍｉｎｏＬｉｎｋ樹脂を用いて親和性精製される。
ｓｃＦｖのライブラリーからのマーカータンパク質に対する抗体フラグメントの単離
ヒトＰＢＬから単離された天然に存在するＶ遺伝子は、マーカータンパク質（ドナーに曝露されていてもよいし、曝露されていなくてもよい）に対して反応性を有する抗体フラグメントのライブラリーに構築され得る（例えば、米国特許第５，８８５，７９３号を参照のこと。その全体が本明細書中で参考として援用される）。
ライブラリーのレスキュー：ｓｃＦｖのライブラリーは、ＰＣＴ公開ＷＯ９２／０１０４７に記載されているようにヒトＰＢＬのＲＮＡから構築される。抗体フラグメントをディスプレイするファージをレスキューするために、ファージミドを有する約１０９個のＥ．ｃｏｌｉを使用して、１％グルコースおよび１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む５０ｍｌの２×ＴＹ（２×ＴＹ−ＡＭＰ−ＧＬＵ）に接種し、そしてＯ．Ｄ．が０．８になるまで振盪しながら生育させる。５ｍｌのこの培養物を使用して、５０ｍｌの２×ＴＹ−ＡＭＰ−ＧＬＵに接種し、２×１０８ＴＵのデルタ遺伝子３ヘルパー（Ｍ１３デルタ遺伝子ＩＩＩ、ＰＣＴ公開ＷＯ９２／０１０４７を参照のこと）を加え、そしてその培養物を、３７℃で４５分間、振盪せずにインキュベートし、次いで、３７℃で４５分間振盪しながらインキュベートする。その培養物を４０００ｒｐｍで１０分間遠心し、そしてペレットを１００μｇ／ｍｌアンピシリンおよび５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含む２リットルの２×ＴＹに再懸濁し、一晩生育させる。ファージは、ＰＣＴ公開ＷＯ９２／０１０４７に記載されているように調製される。
Ｍ１３デルタ遺伝子ＩＩＩの調製：Ｍ１３デルタ遺伝子ＩＩＩヘルパーファージは、遺伝子ＩＩＩタンパク質をコードしないので、そのファージ（ｍｉｄ）がディスプレイする抗体フラグメントは、抗原に対して高いアビディティーの結合性を有する。感染性Ｍ１３デルタ遺伝子ＩＩＩ粒子は、ファージ形態形成中に野生型遺伝子ＩＩＩタンパク質を供給するｐＵＣ１９誘導体を有する細胞内でヘルパーファージを増殖することによって生成される。その培養物を、振盪せずに３７℃で１時間、次いで、振盪しながら３７℃でさらに１時間インキュベートする。細胞を遠心し（ＩＥＣ−Ｃｅｎｔｒａ ８，４００ｒｐｍ、１０分間）、１００μｇアンピシリン／ｍｌおよび２５μｇカナマイシン／ｍｌを含む３００ｍｌの２×ＴＹブロス（２×ＴＹ−ＡＭＰ−ＫＡＮ）に再懸濁し、そして３７℃において振盪しながら一晩生育する。ファージ粒子を、２回のＰＥＧ沈殿によって培養液から精製し、濃縮し（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、２００１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．３ｒｄ．ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）、２ｍｌのＰＢＳに再懸濁し、そして０．４５μｍフィルター（Ｍｉｎｉｓａｒｔ ＮＭＬ；Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）に通すことによって、約１０１３形質導入単位／ｍｌという最終濃度が得られる（アンピシリン耐性クローン）。
ライブラリーのパニング：イムノチューブ（Ｎｕｎｃ）を、４ｍｌの１００μｇ／ｍｌまたは１０μｇ／ｍｌの目的のマーカータンパク質で、ＰＢＳにおいて一晩コーティングする。チューブを、３７℃において２時間、２％Ｍａｒｖｅｌ−ＰＢＳでブロッキングし、次いで、ＰＢＳ中で３回洗浄する。約１０１３ＴＵのファージをそのチューブに適用し、上下回転台上で回転させながら室温で３０分間インキュベートし、次いで、さらに１．５時間、静置する。チューブをＰＢＳ０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０で１０回、そしてＰＢＳで１０回洗浄する。１ｍｌの１００ｍＭトリエチルアミンを加え、上下回転台上で１５分間回転させることによって、ファージを溶出した後、直ちにその溶液を０．５ｍｌの１．０Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．４で中和する。次いで、ファージを使用して、溶出されたファージを細菌とともに３７℃で３０分間インキュベートすることによって１０ｍｌの対数中期のＥ．ｃｏｌｉＴＧ１に感染させる。次いで、そのＥ．ｃｏｌｉを、１％グルコースおよび１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＴＹＥプレート上にプレーティングする。次いで、得られた細菌ライブラリーを、上に記載したようにデルタ遺伝子３ヘルパーファージを用いてレスキューすることにより、その後の選択の段階のためのファージが調製される。次いで、このプロセスを親和性精製のために合計４回繰り返し、３および４回目では、ＰＢＳ、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０でのチューブの洗浄を２０回、そしてＰＢＳでの洗浄を２０回に増やす。
結合物質の特徴付け：３回目および４回目の選択から溶出されたファージを使用することによりＥ．ｃｏｌｉ ＨＢ２１５１に感染させ、そして可溶性ｓｃＦｖが、アッセイのためにシングルコロニーから産生される（Ｍａｒｋｓら、１９９１，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７）。５０ｍＭ炭酸水素塩ｐＨ９．６中の１０μｇ／ｍｌの目的のマーカータンパク質でコーティングされたマイクロタイタープレートを用いてＥＬＩＳＡを行う。ＥＬＩＳＡにおいて陽性のクローンをＰＣＲフィンガープリンティング（例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９２／０１０４７を参照のこと）、次いで配列解析によってさらに特徴付ける。
モノクローナル抗体
ａ）材料：
１．ミエローマおよび脾臓細胞を洗浄するための無血清完全培地（ＣＭＮＳ）；融合後のハイブリドーマをプレーティングするために使用される、ハイブリドーマ培地ＣＭ−ＨＡＴ（Ｃｅｌｌ Ｍａｂ（ＢＤ）、１０％ＦＢＳ（またはＨＳ）；４ｍＭ Ｌ−グルタミンおよび抗生物質を含む５％Ｏｒｉｇｅｎ ＨＣＦ（ハイブリドーマクローニング因子））
２．融合維持のために使用されるハイブリドーマ培地ＣＭ−ＨＴ（無アミノプテリン）（Ｃｅｌｌ Ｍａｂ（ＢＤ）、１０％ＦＢＳ、４ｍＭ Ｌ−グルタミンおよび抗生物質を含む５％Ｏｒｉｇｅｎ ＨＣＦ）は、４〜６℃の冷蔵庫内で保存される。それらの融合物には、第４、８および１２日目ならびにその後の継代において供給される。不活性化され、そして予め濾過された市販のウシ胎児血清（ＦＢＳ）またはウマ血清（ＨＳ）を解凍し、４℃の冷蔵庫内で保存し、そして使用する前に、単一細胞からのミエローマ増殖について予備試験される。
３．−２０℃で保存されていたＬ−グルタミン（２００ｍＭ，１００×溶液）を解凍し、完全に溶液になるまで温める。増殖を補うために、Ｌ−グルタミンを培地に分注する。Ｌ−グルタミンは、ミエローマに対しては２ｍＭ、およびハイブリドーマ培地に対しては４ｍＭになるように加えられる。さらに、ペニシリン、ストレプトマイシン、アンホテリシン（−２０℃で保存されている抗菌剤−抗真菌剤）を解凍し、１％になるようにＣｅｌｌ Ｍａｂ Ｍｅｄｉａに加える。
４．ミエローマ増殖培地は、２ｍＭになるようにＬ−グルタミン、および１％になるように抗生物質／抗真菌剤が加えられたＣｅｌｌ Ｍａｂ Ｍｅｄｉａ（Ｃｅｌｌ Ｍａｂ
Ｍｅｄｉａ，Ｑｕａｎｔｕｍ Ｙｉｅｌｄ、ＢＤ製、４℃の冷蔵庫内の暗黒下で保存される）であり、ＣＭＮＳと呼ばれる。
５．Ｈｅｐｅｓ中のＰＥＧ１５００（Ｒｏｃｈｅ，ＮＪ）が１本調製される。
６．８−アザグアニンは、ＳＩＧＭＡによって供給される乾燥粉末として、必要になるまで−７００℃において保存される。１本のバイアル／５００ｍｌの培地を再構成し、そしてすべての内容物を５００ｍｌの培地に加える（例えば、２本のバイアル／リットル）。
７．ミエローマ培地は、４℃の冷蔵庫内で保存される１０％ＦＢＳ（またはＨＳ）および８−アザ（１×）を有するＣＭである。
８．クローン細胞培地Ｄ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ）は、融合物からの半固体直接クローニングのためにＨＡＴおよびメチルセルロースを含む。これは、ＣｏＡを含む９０ｍｌの瓶の中に入っており、融合の日の朝に３７℃のウォーターバス内で融解される。キャップを緩め、その瓶をＣＯ２恒温器内に置くことにより、十分に培地Ｄにガスが供給され、ｐＨが低下する。
９．クローニング段階を通して、それぞれハイブリドーマの選択およびハイブリドーマの維持のための培地において使用される、ハイブリドーマ補充物ＨＴ［ヒポキサンチン、チミジン］。
１０．Ｏｒｉｇｅｎ ＨＣＦは、Ｉｇｅｎから直接入手することができ、それは、マクロファージ様細胞株から産生された細胞上清である。それは、解凍され、１５ｍｌチューブに５ｍｌ／チューブで等分され、そして−２０℃で凍結保存され得る。陽性ハイブリドーマには、最初のサブクローニングにおいてＨＣＦが供給され、そして徐々に離脱させる（必要であれば、個別のハイブリドーマは、補給され続け得る）。このおよび他の添加物は、典型的には、新しいハイブリドーマの増殖を促進する際に、従来のフィーダー層よりも有効である。
ｂ）手順：
モノクローナル抗体を作製するために、腹腔内（ｉ．ｐ．）または尾静脈への静脈内注射（ｉ．ｖ．）によって、５〜５０μｇの抗原でマウスを免疫する。使用される抗原は、例えば、目的の組換えマーカータンパク質であり得る。マウスから脾細胞を回収する２ヶ月前に１次免疫を行い、そして典型的には、２週間ごとに５〜５０μｇの抗原のｉ．ｖ．注射によって追加免疫する。予想される融合日の少なくとも１週間前に、ミエローマ細胞の新しいバイアルを解凍し、培養する。融合時に最適密度で培養することが確実になるように、異なる密度のいくつかのフラスコを維持し得る。最適密度は、例えば、３〜６×１０５細胞／ｍｌであり得る。予定される融合の２〜５日前に、ＰＢＳ中の約５μｇの抗原の最後の免疫が投与される（ｉ．ｐ．またはｉ．ｖ）。
ミエローマ細胞を、４℃、５分間の５００ｇでの遠心分離によって３０ｍｌの無血清培地で洗浄する。再懸濁された細胞中の生細胞の密度を、血球計算法および生体染色を用いて測定する。完全増殖培地中に再懸濁された細胞を、脾細胞の調製中、３７℃で保存する。一方、アミノプテリン感度を試験するために、１×１０６ミエローマ細胞を１５ｍｌコニカルチューブに移し、そして４℃において５分間、５００ｇで遠心する。得られたペレットを１５ｍｌのＨＡＴ培地中に再懸濁し、細胞を９６ウェルプレート上に２滴／ウェルでプレーティングする。
免疫されたマウスから脾細胞を調製するために、その動物を安楽死させ、そして７０％エタノール中に沈める。滅菌条件下において、脾臓を外科的に取り出し、ペトリ皿内の２０％ウシ胎仔血清が補充された１０ｍｌのＲＰＭＩ培地中に入れる。２１ｇ注射器を用いて５０回超、脾臓に培地を注入することによって、その器官から細胞を脱する。
細胞を回収し、３０ｍｌの培地を用いる遠心分離（４℃において５分間の５００ｇ）によって洗浄する。細胞を１０ｍｌの培地に再懸濁し、生体染色を用いる血球計算法によって生細胞の密度を測定する。その脾細胞を５：１（脾臓細胞：ミエローマ細胞）の比でミエローマ細胞と混合する。ミエローマ細胞と脾臓細胞の両方を、３０ｍｌのＲＰＭＩ−ＣＭＮＳで２回以上洗浄し、それらの細胞を８００ｒｐｍで１２分間遠心する。
上清を除去し、細胞を５ｍｌのＲＰＭＩ−ＣＭＮＳに再懸濁し、プールすることによって、３０ｍｌまで容積を満たし、そして前述のとおり遠心する。次いで、ペレットを層流フード（ｆｌｏｗ ｈｏｏｄ）面上で軽くたたくことによって破壊し、そして１分間にわたって１ｃｃ針を用いて１ｍｌのＢＭＢ ＲＥＧ１５００（予め３７℃に温めておいたもの）の液滴に再懸濁する。
ＰＥＧ細胞に対するＲＰＭＩ−ＣＭＮＳおよびＲＰＭＩ−ＣＭＮＳを加えることにより、ＰＥＧをゆっくりと希釈する。細胞を遠心し、そして５ｍｌの完全培地および９５ｍｌのＣｌｏｎａｃｅｌｌ Ｍｅｄｉｕｍ Ｄ（ＨＡＴ）培地（５ｍｌのＨＣＦを含む）に希釈する。その細胞を小さいペトリプレート１枚あたり１０ｍｌでプレーティングする。
ミエローマ／ＨＡＴコントロールは、以下のとおり調製される：約１０００個のＰ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３ミエローマ細胞を１ｍｌの培地Ｄに希釈し、そして２４ウェルプレートの１つのウェルに移す。プレートを恒温器内に入れるが、２枚のプレートを大きなペトリプレートの中に入れ、さらに、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下においてペトリプレートを１０〜１８日間、蒸留水で満たす。クローンを半固体アガロースから１５０〜２００μｌのＣＭ−ＨＴが入った９６ウェルプレートに拾う。４日後、上清をＥＬＩＳＡにおいてスクリーニングし、そして陽性のクローンを２４ウェルプレートに移す。おびただしい増殖には、８日目に培地（＋／−１５０ｍｌ）の交換が必要である。ＨＣＦは、クローニングプレートにおいて０．５％（徐々に、２％、次いで１％、次いで０．５％）までさらに減少され得る。
６．液体クロマトグラフィおよび質量分析（ＬＣ／ＭＳ）
ＬＣ／ＭＳ解析のために、タンパク質を、２．５ｍＭ ＤＴＴ中において３７℃で１時間還元し、そして製造者（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ，ＭＡ）が推奨する手順に従ってＩＣＡＴＴＭ試薬を用いてアルキル化する。過剰量のＤＴＴを加えることによって、その反応をクエンチする。シークエンシンググレードの修飾トリプシンを用いて３７℃において一晩、タンパク質を消化した後、３ｃｃのＯａｓｉｓ ＨＬＢ固相抽出カラム（Ｗａｔｅｒｓ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）および真空乾燥を用いて脱塩する。システイン含有ペプチドは、アビジンカラム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ，ＭＡ）によって精製される。そのペプチドを緩衝液Ａ（０．１％ギ酸水溶液）中で再構成し、そしてトラップカラムを用いてＣ１８モノマーカラム（１５０ｍｍ，１５０μｍ ｉ．ｄ．，Ｇｒａｃｅ Ｖｙｄａｃ ２３８ＥＶ５，５μｍ）において１．５μｌ／分という流速で分離する。そのカラムから、２１５分間、３％〜３０％の勾配の緩衝液Ｂ（９０％アセトニトリル中の０．１％ギ酸）、３０分間、３０％〜９０％緩衝液Ｂを用いてペプチドを溶出する。溶出されたペプチドを、オンラインＱＳＴＡＲ ＸＬシステム（ＭＤＳ／Ｓｃｉｅｘ，Ｔｏｒｏｎｔｏ，ＯＮ）を用いて解析する。そのマップのペプチドイオンピークは、ＲＥＳＰＥＣＴＴＭ（ＰＰＬ Ｉｎｃ．，ＵＫ）によって自動的に検出される。
例えば、隣接正常組織（または薬物感受性サンプル）よりも疾患サンプル（または薬物耐性サンプル）において高レベルで検出されたペプチドの配列組成は、タンデム質量分析およびデータベース解析によって解明され得る。データ解析のために、正常サンプルおよび疾患サンプルからのＬＣ／ＭＳマップのペプチドイオンピークを、質量電荷比（ｍ／ｚ）、保持時間（Ｒｔ）および電荷状態（ｚ）に基づいて整列させ得る。整列されたペプチドイオンのリストをＳｐｏｔｆｉｒｅＴＭ（Ｓｐｏｔｆｉｒｅ Ｉｎｃ．Ｓｏｍｅｒｖｉｌｌｅ，ＭＡ）にロードする。疾患サンプルと正常サンプルとのさらなる判別解析の前に、強度を正規化し得る。差次的に発現されたイオンを手動で確認した後、タンパク質／タンパク質同定のためにＬＣ−ＭＳ／ＭＳベースのペプチド配列決定およびデータベース検索を行う。
強度の正規化および発現の解析のために、疾患サンプルにおける平均強度と正常サンプルの平均強度との比によって横列を選別することによって、ヒートマップが作成され得る。横列におけるイオンのうち少なくとも１つのＭＳ／ＭＳ同定が存在する場合、その横列が含められる。表示色は、その横列における中間の強度に対して黒色、その横列における最低の強度に対して緑色、そして最高の強度に対して赤色を割り当てることによって各横列について別々に決められる。
このような質量分析手順を用いて、正常細胞（または例えば薬物に応答性／感受性の細胞）と比較される疾患細胞（または例えば薬物耐性細胞）によって差次的に発現されるタンパク質の網羅的解析が行われ得る。
７．ｍＲＮＡ発現解析
マーカーｍＲＮＡの発現は、ＴａｑＭａｎ（登録商標）技術を用いるＲＴ−ＰＣＲによって定量化され得る。Ｔａｑｍａｎ（登録商標）システムは、リアルタイム定量化のために５’蛍光発生ヌクレアーゼアッセイをＰＣＲと対にしたものである。プローブを用いることにより、増幅産物の形成がモニターされる。
全ＲＮＡは、ＤＮアーゼ処理を含むＲＮＥａｓｙ ｋｉｔ（登録商標）（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて（製造者の指示書に従って）疾患モデル細胞株から単離され得る。正常ヒト組織ＲＮＡは、業者（例えば、Ａｍｂｉｏｎ，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ；ＢｉｏＣｈａｉｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｎｅｗｉｎｇｔｏｎ，ＮＨ）から入手することができ、ならびに一致する疾患／正常組織からのＲＮＡが入手される。
マーカー転写物の配列は、ＢＬＡＳＴなどの検索アルゴリズムを用いたデータベースの検索によって、差次的に発現されるペプチドについて同定され得る。それらの転写物に特異的なＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイ（ＰＣＲプライマー／プローブセット）は、ＤｅｍａｎｄＴＭ製品ラインに対するアッセイの一部として、またはＤｅｓｉｇｎＳＭサービスによるＡＢ Ａｓｓａｙｓへの注文設計によって、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（ＡＢ）から入手することができる。所望であれば、それらのアッセイは、ゲノムＤＮＡを増幅しないように、エキソン−エキソン境界に及ぶように設計され得る。
ＲＴ−ＰＣＲは、Ｏｎｅ Ｓｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ試薬キット（ＡＢ）におけるＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ（登録商標）およびＭｕｌｔｉＳｃｒｉｂｅＴＭ逆転写酵素を用いて（製造者の指示書に従って）達成され得る。プローブおよびプライマーの濃度は、１５μｌの反応物中、それぞれ２５０ｎＭおよび９００ｎＭである。各実験について、上記の成分のマスターミックスを調製し、光学的な反応ウェルの各々に分注する。８ナノグラムの全ＲＮＡを鋳型として使用する。定量的ＲＴ−ＰＣＲは、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ（登録商標）７９００ＨＴ配列検出システム（ＳＤＳ）を用いて行われ得る。以下のサイクリングパラメータが使用される：４８℃３０分を１サイクル；９５℃１０分を１サイクル；および９５℃１５秒、６０℃１分を４０サイクル。
ＳＤＳソフトウェアを利用することにより、各反応についての閾値サイクル（ＣＴ）が計算され得、そしてＣＴ値を用いて、反応物中の出発鋳型の相対量を定量化する。反応物の各セットに対するＣＴ値は、その後のすべての計算について平均され得る。
データを解析することにより、１細胞あたりの推定コピー数を決定することができる。遺伝子発現は、１８Ｓ ｒＲＮＡ発現に対して定量化され得、コピー数は、１細胞あたり５×１０６コピーの１８Ｓ ｒＲＮＡと推定される。あるいは、データは、正規化用の内在性コントロールを用いて発現の倍率差異について解析され得、そして正常組織または正常細胞株の参照に対して表され得る。内在性コントロールの選択は、細胞株に対する様々な候補および組織ＲＮＡパネルを試験し、そして最も発現の変動が小さいものを選択することによって、経験的に決定され得る。発現の相対変化が、２−ΔΔＣＴ法（Ｌｉｖａｋら、２００１，Ｍｅｔｈｏｄｓ ２５：４０２−４０８；Ｕｓｅｒ ｂｕｌｌｅｔｉｎ ＃２：ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ７７００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ）を用いて定量化され得る。あるいは、全ＲＮＡは、製造者の指示書に従ってＲｉｂｏＧｒｅｅｎ ＲＮＡ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いて定量化され得、そしてｍＲＮＡ発現のパーセンテージが、正規化のために全ＲＮＡを用いて計算され得る。次いで、ノックダウンのパーセンテージが、添加無しのコントロールに対して計算され得る。
８．フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）解析 フローサイトメトリーは、蛍光励起細胞分取（ＦＡＣＳ）と交換可能に称される。定量的フローサイトメトリーは、例えば、疾患細胞上のタンパク質の発現レベルを正常細胞上で見られるレベルと比較するために使用され得る。
主要な組織サンプル上のマーカータンパク質の発現レベルは、Ｑｕａｎｔｕｍ Ｓｉｍｐｌｙ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂａｎｇｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｆｉｓｈｅｒｓ，ＩＮ）およびマーカー特異的抗体を用いて定量化され得る。上に記載されたように正常隣接組織および疾患組織を単一細胞懸濁液に処理し得、それを様々なマーカー（例えば、上皮マーカーＥｐＣａｍ）およびマーカー特異的抗体に対して染色し得る。典型的には、各解析について少なくとも０．５×１０６細胞が使用される。細胞をＦｌｏｗ Ｓｔａｉｎｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｄ−ＰＢＳ中、０．５％ＳＡ、０．０５％ＮａＮ３）で１回洗浄する。その細胞に、２０μｌの各マーカー特異的抗体を加える。選別されていない細胞を用いるときは、ＡＰＣに結合体化されたさらに５μｌの抗ＥｐＣａｍ抗体を加えてもよい。細胞を抗体とともに４℃において３０分間インキュベートする。細胞をＦｌｏｗ Ｓｔａｉｎｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒで１回洗浄し、直ちにＬＳＲフローサイトメトリー装置において解析するか、または１％ホルムアルデヒド中で固定し、そしてＬＳＲ解析まで４℃において保存する。マーカーを検出するために使用される抗体は、ＰＥに結合体化され得る。アイソタイプコントロール抗体としてＰＥ結合体化されたマウスＩｇＧ１ｋが使用され得る。フローサイトメトリーによって細胞が解析され、そしてエピトープコピー数およびマーカー発現が陽性である生存上皮細胞のパーセンテージが測定され得る。細胞数および生存率は、正常組織と疾患組織の両方から単離された細胞に対するＰＩ排除（ＧＵＡＶＡ）によって測定され得る。ＬＳＲ Ｉ（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ ＣＡ）フローサイトメーターにおいて検量線およびサンプルが解析され得る。各系列集団についての抗体結合能は、幾何平均および線形回帰を用いて計算され得る。
マーカータンパク質の発現レベルは、マーカーに対する１次抗体を使用するＱＩＦＩＫＩＴフローサイトメトリー間接免疫蛍光法アッセイ（Ｄａｋｏ Ａ／Ｓ）を用いて、細胞株において定量され得る。簡潔には、ヴェルセン（ｖｅｒｓｅｎｅ）またはトリプシンを用いて細胞を剥離し、そして完全培地、次いで、ＰＢＳで１回洗浄する。５×１０５細胞／サンプルを、飽和濃度（１０μｇ／ｍｌ）の１次抗体とともに４℃において６０分間インキュベートする。洗浄後、ＦＩＴＣ−結合体化された２次抗体（１：５０希釈）を４℃において４５分間加える。ＱＩＦＩＫＩＴ標準ビーズをその２次抗体で同時に標識する。抗体の結合をフローサイトメトリーによって解析し、そして特異的な抗原密度を、対数抗原結合能に対する対数平均蛍光強度の検量線に基づいて、抗体結合能からバックグラウンド抗体等価物を減算することによって計算する。
細胞はまた、以下のとおり、フローサイトメトリー解析（ならびに他のタイプの解析）のために調製される：細胞を、培養培地中で１：１００希釈のＢｒｄＵとともに２〜４時間インキュベートする（ＢｒｄＵ Ｆｌｏｗ Ｋｉｔ，ｃａｔ＃５５９６１９ ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）。細胞をＤ−ＰＢＳで３回洗浄し、ヴェルセンを用いてフラスコから解離する。細胞数および生存率は、ＰＩ排除（ＧＵＡＶＡ）によって測定され得る。細胞をＦｌｏｗ Ｓｔａｉｎｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｄ−ＰＢＳ中、０．５％ＢＳＡ、０．０５％ＮａＮ３）で１回洗浄する。細胞を、４００μｌのＣｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ Ｂｕｆｆｅｒ（ＢｒｄＵ Ｆｌｏｗ Ｋｉｔ，ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）とともに４℃において１５〜３０分間インキュベートする。細胞をＦｌｏｗ Ｓｔａｉｎｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒで１回洗浄し、そして４００μｌのＣｙｔｏｐｅｒｍ Ｐｌｕｓ Ｂｕｆｆｅｒ（ＢｒｄＵ Ｆｌｏｗ Ｋｉｔ ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に再懸濁する。細胞を４℃において１０分間インキュベートし、そして１×Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ（ＢｒｄＵ Ｆｌｏｗ Ｋｉｔ，ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で１回洗浄する。細胞を、ＤＮＡｓｅ溶液（ＢｒｄＵ Ｆｌｏｗ Ｋｉｔ，ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中において光から保護して３７℃において１時間インキュベートする。細胞を１×Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒで１回洗浄し、抗ＢｒｄＵ ＦＩＴＣ結合体化抗体（ＢｒｄＵ Ｆｌｏｗ Ｋｉｔ，ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＰＥ結合体化活性カスパーゼ３（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ｃａｔ＃５５０８２１）およびＰＥマウスＩｇＧ２Ｂアイソタイプコントロールとともに室温において２０分間インキュベートする。細胞を１×Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒで１回洗浄し、そしてＬＳＲフローサイトメトリー解析のためにＤＡＰＩに再懸濁する。
９．免疫組織化学（ＩＨＣ）
組織切片のＩＨＣ
固定されたパラフィン包埋組織切片（例えば、固形腫瘍または他の癌組織などの疾患組織サンプル由来）は、正常組織、ならびに同じ正常隣接組織を含む腫瘍（または他の疾患）サンプルのパネルから、多くの切片とともに（所望であれば）得ることができる。例えば、マーカー発現の最初の調査のために、通常の癌のホルマリン固定されたパラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織マイクロアレイ（ＴＭＡｓ）のパネルが解析に使用され得、そのようなＴＭＡは、商業的供給源（ＴｒｉＳｔａｒ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ；ＵＳＢｉｏｍａｘ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ；Ｉｍｇｅｎｅｘ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ；Ｐｅｔａｇｅｎ／Ａｂｘｉｓ，Ｓｅｏｕｌ，Ｋｏｒｅａ）から入手することができる。切片をヘマトキシリンおよびエオシンで染色し得、そして、組織学的に調べることにより、各組織切片における細胞型の適切な表現が確実になり得る。
固定された切片に適した抗体を作製することができない場合において使用するために、同一の組織セットを凍結切片から得ることができる。凍結組織は、抗原賦活工程を必要としない。
組織切片のパラフィン固定
パラフィン包埋され固定された組織切片をヘマトキシリンおよびエオシン染色するための例示的なプロトコルは、以下のとおりである。キシレンまたはキシレン代替物中で３回（各２〜５分）、切片を脱パラフィン処理する（ｄｅｐａｒａｆｆｉｎｉｚｅｄ）。切片を無水アルコール中で２回（各１〜２分）、９５％アルコール中で１分、その後８０％アルコール中で１分、すすぐ。スライドを流水中で洗浄し、Ｇｉｌｌ溶液３ヘマトキシリン中で３〜５分間染色する。流水中で１分間激しく洗浄した後、切片をＳｃｏｔｔ溶液中で２分間染色する。切片を流水中で１分間洗浄し、次いで、所望の染色強度に応じて２〜３分間エオシン溶液中で対比染色する。９５％アルコールで軽く洗浄した後、切片を、無水アルコールで３回（各１分）およびキシレンまたはキシレン代替物で３回（各１〜２分）脱水する。スライドにカバーガラスを載せ、解析のために保存する。
抗体染色の最適化
各抗体について、疾患細胞株または組織のＩＣＡＴ解析からのデータを用いて、ポジティブおよびネガティブコントロールサンプルを作製し得る。ＩＣＡＴデータから測定されたときに低レベルの特定のマーカーを発現することが知られている細胞を選択し得、そしてこの細胞株を参照正常コントロールとして使用し得る。同様に、マーカーを過剰発現すると判定されている疾患細胞株も選択し得る。
抗原賦活
切片を脱パラフィン処理し、そしてキシレン中で５分間を３回、１００％エタノール中で５分間を２回、９５％エタノール中で５分間を２回、および８０％エタノール中で５分間を１回によって、洗浄することによって再水和する。次いで、切片を内因性ブロッキング溶液（メタノール＋２％過酸化水素）中に入れ、そして室温において２０分間インキュベートする。切片を脱イオン水中で２回、それぞれ５分間すすぎ、そしてリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ），ｐＨ７．４中で２回、５分間すすぐ。
あるいは、必要であれば、以下のとおりＨｉｇｈ Ｅｎｅｒｇｙ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｒｅｔｒｉｅｖａｌによって切片を脱パラフィン処理する：切片を、キシレン中で５分間を３回、１００％エタノール中で５分間を２回、９５％エタノール中で５分間を２回、および８０％エタノール中で５分間を１回によって洗浄する。切片を、希釈抗原賦活溶液（１０ｍＭクエン酸，ｐＨ６）が入ったコプリンジャーに入れる。スライドが入ったそのコプリンジャーを、水で満たされた容器内に入れ、２〜３分間、強でマイクロ波を照射した（７００ワットのオーブン）。２〜３分間冷却した後、工程３および４を４回繰り返した（組織に応じて）後、室温において２０分間冷却した。次いで、切片を脱イオン水中で（５分間２回）すすぎ、改変された内因性酸化ブロッキング溶液（ＰＢＳ＋２％過酸化水素）に入れ、ＰＢＳ中で５分間すすいだ。
あるいは、ホルマリン固定されたパラフィン包埋組織を脱パラフィン処理し得、そしてＥＺレトリーバーシステム（ＢｉｏＧｅｎｅｘ，Ｓａｎ Ｒａｍｏｎ，ＣＡ）を用いて抗原賦活のために処理し得る。ＥＺ抗原賦活通常溶液を脱パラフィン処理のために使用し、ＥＺ賦活クエン酸ベース緩衝液を抗原賦活のために使用する。サンプルを非血清タンパク質ブロック（Ｄａｋｏ Ａ／Ｓ，Ｇｌｏｓｔｒｕｐ，Ｄｅｎｍａｒｋ）で１５分間予めブロッキングする。１次抗体（例えば、２．５〜５．０μｇ／ｍｌ）を室温で一晩インキュベートする。Ｅｎｖｉｓｉｏｎ ＰｌｕｓシステムＨＲＰ（Ｄａｋｏ Ａ／Ｓ）を、西洋ワサビペルオキシダーゼに対する基質としてジアミノベンジジン（ＤＡＢ）を用いる検出のために使用する。
ブロッキングおよび染色
切片を、室温において１時間、ＰＢＳ／１％ウシ血清アルブミン（ＰＢＡ）でブロッキングした後、ＰＢＡ（２％）に希釈された通常の血清中で室温において３０分間インキュベートすることにより、抗体の非特異的結合を減少させる。密閉された加湿チャンバー内でインキュベートを行うことにより、組織切片の乾燥を防ぐ。ブロッキング血清の選択は、典型的には、ビオチン化された２次抗体の種類と同じである。過剰量の抗体は、振盪することによって穏やかに除去され、切片を、ＰＢＡに希釈された１次抗体で覆い、そして室温において１時間または４℃において一晩インキュベートする（インキュベート中に切片に接触しないように注意を払う）。切片を、穏やかに振盪しながらＰＢＳ中で５分間２回すすぐ。穏やかに振盪することによって過剰なＰＢＳを除去する。その切片を、ＰＢＡ中のビオチン化された希釈２次抗体で覆い、加湿チャンバー内で室温において３０分間〜１時間インキュベートする。モノクローナル１次抗体を用いる場合、２％ラット血清を添加することにより、ラット組織切片に対するバックグラウンドが減少し得る。インキュベートした後、切片を、穏やか振盪しながらＰＢＳ中で５分間を２回によってすすぐ。過剰なＰＢＳを除去し、切片を、Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ ＡＢＣ試薬（キットの指示書のとおり）中で室温において１時間インキュベートする。すべてのインキュベート中、加湿チャンバーの蓋をしっかり締めることにより、湿潤な環境を確実にする。切片を穏やかに振盪しながらＰＢＳ中で５分間２回すすぐ。
発色および対比染色
使用する直前に、以下のとおり調製されたペルオキシダーゼ基質溶液：１０ｍｌの５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液，ｐＨ７．４に溶解された１０ｍｇのジアミノベンジジン（ＤＡＢ）；脱イオン水中、１２．５マイクロリットルの３％ＣｏＣｌ２／ＮｉＣｌ２；および１．２５マイクロリットルの過酸化水素中で２分間、切片をインキュベートする。
スライドを脱イオン水中で１０分間、３回十分にすすぎ、所望の対比染色の強度に応じて、０．０１％酢酸で酸性化された０．０１％Ｌｉｇｈｔ Ｇｒｅｅｎで１〜２分間対比染色する。
スライドを脱イオン水で５分間、３回すすぎ、９５％エタノール中で２分間、２回；１００％エタノール中で２分間、２回；そしてキシレン中で２分間、２回、脱水する。顕微鏡によって可視化するために、染色されたスライドをマウントする。
Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏｖｅｒｔ ２００Ｍ顕微鏡（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ Ｍｉｃｒｏｉｍａｇｉｎｇ，Ｔｈｏｒｎｗｏｏｄ，ＮＹ）などの顕微鏡を用いて手動でスライドをスコア付けする。４０×対物レンズ（４００×倍率）を用いて、代表的な像を取得する。
凍結組織切片のＩＨＣ染色
凍結組織切片をＩＨＣ染色するために、組織の周囲に気泡が入らないように、プラスチック型において新鮮組織をＯＣＴ内に包埋する。そのブロックの７０〜８０％が白色を呈するまでその型を液体窒素の上に置くことによって、組織を凍結し、その時点においてその型をドライアイス上に置く。凍結ブロックを−８０℃で保存する。−１０℃超に温まらないように注意を払いながらクライオスタットを用いてブロックを切片にする。まず、ブロックをそのクライオスタットにおいて約５分間平衡化させ、そして６〜１０ｍｍの切片に連続的に切断する。切片を室温において少なくとも３０分間乾燥させる。乾燥させた後、短時間貯蔵の場合は４℃において、および長期間貯蔵の場合は、−８０℃において、組織を保存する。
切片を、室温において１〜２分間、アセトン広口瓶内に浸漬することによって固定した後、室温において乾燥させる。組織が完全に覆われるようにその切片を液滴で覆うことによって、その切片に１次抗体（０．０５Ｍ Ｔｒｉｓ−食塩水［０．０５Ｍ Ｔｒｉｓ、０．１５Ｍ ＮａＣｌ，ｐＨ７．４］、２．５％血清中に希釈されたもの）を直接加える。室温において１時間、チャンバー内でインキュベートすることによって結合を行う。その切片を完全に乾燥させないで、２次抗体（Ｔｒｉｓ−食塩水／２．５％血清中に希釈されたもの）を、１次抗体と類似の様式で加え、そして前述の通り（少なくとも４５分間）インキュベートする。
インキュベートの後、切片をＴｒｉｓ−食塩水中で穏やかに３〜５分間洗浄し、次いで、Ｔｒｉｓ−食塩水／２．５％血清中でさらに３〜５分間洗浄する。ビオチン化された１次抗体を使用する場合、２次抗体とインキュベートする代わりに、スライドを１００μｌの希釈アルカリホスファターゼ結合体化ストレプトアビジンで覆い、室温において３０分間インキュベートし、上記のように洗浄する。切片をアルカリホスファターゼ基質（Ｔｒｉｓ−食塩水ｐＨ８．５中の、１ｍｇ／ｍｌ Ｆａｓｔ Ｖｉｏｌｅｔ；０．２ｍｇ／ｍｌ Ｎａｐｔｈｏｌ ＡＳ−ＭＸホスフェート）とともに１０〜２０分間、所望の陽性染色が達成されるまでインキュベートし、その時点において、Ｔｒｉｓ−食塩水で２回洗浄することによって反応を停止する。スライドをＭａｙｅｒのヘマトキシリンで３０秒間対比染色し、そして２〜５分間、水道水で洗浄する。切片にＭｏｕｎｔカバーガラスおよびマウンティングメディアを載せる。
１０．細胞株におけるＲＮＡｉアッセイ
ＲＮＡｉトランスフェクション
マーカーの発現は、そのマーカーに対する低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）によるトランスフェクションによってノックダウンされ得る。合成ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドは、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ（Ｌａｆａｙｅｔｔｅ，ＣＯ）またはＱｉａｇｅｎ（Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）から入手され得る。ｓｉＲＮＡトランスフェクションのために、細胞（例えば、疾患細胞）を、トランスフェクションの２４時間前に、２，５００細胞／ウェルの密度で９６ウェル組織培養プレートに播種し得る。培養液を除去し、そしてＯｐｔｉ−ＭＥＭ中に希釈されたｓｉＲＮＡ（最終濃度１〜１００ｎＭ）および０．４μｌのＤｈａｒｍａＦＥＣＴ４（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ，Ｌａｆａｙｅｔｔｅ，ＣＯ）を含む５０μｌの反応混合物を各ウェルに加える。続いて等体積の完全培地を加え、次いで、細胞を５％ＣＯ２、３７℃において１〜４日間インキュベートする。
あるいは、最初のスクリーニング段階において、１００ｎＭ（最終）のＳｍａｒｔｐｏｏｌｓ（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ，Ｌａｆａｙｅｔｔｅ，ＣＯ）、４−ｆｏｒ Ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｓｉＲＮＡ二重鎖のプール（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）または非標的化ネガティブコントロールｓｉＲＮＡ（ＤｈａｒｍａｃｏｎまたはＱｉａｇｅｎ）を用いてＲＮＡｉを行うことができる。破壊段階において、個別の二重鎖の各々は、１００ｎＭ（最終）において用いられる。滴定段階において、個別の二重鎖は、０．１〜１００ｎＭ（最終）において用いられる。Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）製のＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００またはＧｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）製のＧｅｎｅＳｉｌｅｎｃｅｒを用いて、一過性のトランスフェクションを行う（以下を参照のこと）。トランスフェクションの１日後に、製造者の指示書に従ってＲＮｅａｓｙ９６Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて全ＲＮＡを単離し、そしてＴａｑＭａｎ技術を用いてｍＲＮＡの発現を定量化する。Ａｐｏｐ−ｏｎｅ均一カスパーゼ−３／７キットおよびＡｌａｍａｒ ＢｌｕｅまたはＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６ ＡＱｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙｓを用いて、アポトーシスアッセイおよび細胞増殖アッセイを毎日行う（以下を参照のこと）。
ＲＮＡｉトランスフェクション−Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００およびＧｅｎｅＳｉｌｅｎｃｅｒ
一過性のＲＮＡｉトランスフェクションは、別途説明されているように（Ｅｌｂａｓｈｉｒら、２００１，Ｎａｔｕｒｅ ４１１：４９４−４９８；Ｃａｐｌｅｎら、２００１，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９８：９７４２−９７４７；Ｓｈａｒｐ，２００１，Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １５：４８５−４９０）サブコンフルエントな疾患細胞株などに対して、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）またはＧｅｎｅＳｉｌｅｎｃｅｒ（Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いて行われ得る。製造者の指示書に従ってＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００またはＧｅｎｅＳｉｌｅｎｃｅｒを用いて、目的の遺伝子に対する合成ＲＮＡまたは非標的化ネガティブコントロールｓｉＲＮＡをトランスフェクトする。細胞を、抗生物質非含有培地が入った９６ウェルプレートにプレーティングする。翌日、以下のとおり、トランスフェクションのためにトランスフェクション試薬およびｓｉＲＮＡを調製する。
０．１〜１００ｎＭのｓｉＲＮＡを、各ウェル（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００の場合、Ｐｌｕｓを含む）内の２０〜２５μｌの無血清培地に再懸濁し、そして室温で１５分間インキュベートする。０．１〜１μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００または１〜１．５μｌのＧｅｎｅＳｉｌｅｎｃｅｒも、最終容積が２０〜２５μｌ／ウェルとなるように無血清培地に再懸濁する。インキュベートした後、希釈されたｓｉＲＮＡと、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００またはＧｅｎｅＳｉｌｅｎｃｅｒとを混合し、そして室温で１５分間（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００）または５〜２０分間（ＧｅｎｅＳｉｌｅｎｃｅｒ）インキュベートする。次いで、培地を細胞から除去し、そして混合したｓｉＲＮＡ−Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００試薬またはｓｉＲＮＡ−ＧｅｎｅＳｉｌｅｎｃｅｒ試薬を、最終容積が５０μｌ／ウェルとなるように加える。３７℃で４時間さらにインキュベートした後、５０μｌの血清含有培地を細胞に戻す。トランスフェクションの１〜４日後、ＴａｑＭａｎ技術を用いるＲＴ−ＰＣＲによってｍＲＮＡの発現を定量化し得、そしてフローサイトメトリーによってタンパク質発現レベルを測定し得る。アポトーシスアッセイおよび増殖アッセイは、Ａｐｏｐ−ｏｎｅ均一カスパーゼ−３／７キットおよびＡｌａｍａｒ ＢｌｕｅまたはＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６ ＡＱｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙｓ（以下を参照のこと）を用いて毎日行われ得る。
ｍＲＮＡおよびタンパク質ノックダウン
マーカーｍＲＮＡレベルのノックダウンは、ＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を用いることによって、ｓｉＲＮＡトランスフェクションの１日後にＱ−ＰＣＲによってモニターされ得る。ＲＴ−ＰＣＲは、Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）およびＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ（登録商標）（ＡＢＩ）を用いることによって１工程反応において達成され、そしてＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ（登録商標）７９００ＨＴ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＡＢＩ）において解析される。相対的な遺伝子発現は、内在性コントロールとして働く１８Ｓ ｒＲＮＡを用いたΔΔＣｔ法（Ｕｓｅｒ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ ＃２，ＡＢＩ）によって定量化され得る。
タンパク質ノックダウンは、マーカーに対する抗体を用いることによってトランスフェクションの４日後にＦＡＣＳによってモニターされ得る。サンプルは、ＬＳＲフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）にかけられ得、そして生細胞は、ＰＩ排除（Ｄ−ＰＢＳ中の、５０μｇ／ｍｌ ＰＩ、２．５単位／ｍｌ
ＲＮａｓｅＡ、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）を用いることによってモニターされ得る。データは、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェアを用いて解析され得る。
細胞増殖−Ａｌａｍａｒ Ｂｌｕｅ
細胞増殖は、１：１０希釈のＡｌａｍａｒブルー試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡまたはＢｉｏｓｏｕｒｃｅ，Ｃａｍａｒｉｌｌｏ，ＣＡ）を加えることによってトランスフェクションの４日後に評価され得、そして３７℃において２時間インキュベートされ得る。解析は、５３０ｎｍの励起波長および５９５ｎｍの発光波長に設定されたＳｐｅｃｔｒａｆｌｕｏｒ Ｐｌｕｓ（Ｔｅｃａｎ，Ｄｕｒｈａｍ，ＮＣ）において行われ得る。
細胞増殖−ＭＴＳ
あるいは、細胞増殖アッセイは、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６ ＡＱｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ
Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙキット（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用いて行われ得る。２０μｌのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６ ＡＱｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎを１００μｌの培養液に加える。次いで、そのプレートを、加湿された５％ＣＯ２恒温器内において３７℃で１〜４時間インキュベートする。インキュベートした後、吸光度の変化を４９０ｎｍにおいて読み出す。
アポトーシス
アポトーシスアッセイは、Ａｐｏｐ−ｏｎｅ均一カスパーゼ−３／７キット（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用いて行われ得る。簡潔には、カスパーゼ−３／７基質を室温に解凍し、そして緩衝液で１：１００希釈する。次いで、その希釈された基質を細胞、コントロールまたはブランクに１：１で加える。次いで、そのプレートを３００〜５００ｒｐｍのプレートシェーカー上に３０分間〜１８時間にわたって置く。次いで、各ウェルの蛍光を、４８５＋／−２０ｎｍの励起波長および５３０＋／−２５ｎｍの発光波長を用いて測定する。
１１．細胞株における抗体アッセイ
細胞傷害アッセイ
リザズリン（Ｓｉｇｍａ，ＭＯ）色素還元アッセイ（ＭｃＭｉｌｌｉａｎら、２００２，Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．１８：１５７−１７３）を用いて、細胞傷害が測定され得る。簡潔には、細胞を、９６ウェルプレートに１，０００〜５，５００細胞／ウェルでプレーティングして、そのプレートに１８時間にわたって付着させた後、抗体を含むかまたは含まない新鮮培地を加える。抗体への曝露の９６〜１４４時間後、５０μＭの最終濃度になるように細胞にリザズリンを加える。細胞株の色素の変換に応じて細胞を２〜６時間インキュベートし、そしてそれぞれ５３０ｎｍおよび５９０ｎｍの励起波長および発光波長を用いるＦｕｓｉｏｎ ＨＴ蛍光プレートリーダー（Ｐａｃｋａｒｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｍｅｒｉｄｉｅｎ，ＣＴ）において、色素の還元を測定する。ここでは、ＩＣ５０値は、増殖または生存能を未処理のコントロール培養物と比べて５０％減少させる薬物濃度と定義される。
抗体依存性細胞傷害についてのアッセイ
抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）アッセイは、以下のとおり行われ得る。培養された疾患細胞（例えば、腫瘍細胞）を１００μＣｉの５１Ｃｒで１時間標識する（Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎら、１９９７，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．４３，３２４−３３０）。培養液で３回洗浄した後、細胞を１０５／ｍｌで再懸濁し、そして９６ウェル丸底プレートに１００μｌ／ウェルでプレーティングする。ある範囲の抗体濃度を、１００：１および５０：１比でプレーティングされるドナー末梢血単核球とともにアイソタイプコントロールを含むそれらのウェルに適用する。３７℃で１８時間インキュベートした後、上清（３０μｌ／ウェル）を回収し、Ｌｕｍａｐｌａｔｅ ９６（Ｐａｃｋａｒｄ）に移し、乾燥させ、そしてＰａｃｋａｒｄ Ｔｏｐ−Ｃｏｕｎｔ ＮＸＴ γカウンターにおいて読み出す。自然放出は、培地とともにインキュベートされた疾患細胞のｃｐｍによって測定され、そして最大放出は、疾患細胞＋１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（Ｓｉｇｍａ）のｃｐｍによって測定される。特異的な溶解は：％特異的溶解＝［（実験的放出−自然放出）／（最大放出−自然放出）］×１００と定義される。パーセントＡＤＣＣは、免疫前のパーセント特異的溶解が減算された免疫後のピーク特異的溶解として表現される。２０％を超えるＡＤＣＣの倍増は、典型的には、有意であると考えられ得る。
補体依存性細胞傷害についてのアッセイ
補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を評価するクロム放出アッセイが、以下のとおり行われ得る（Ｄｉｃｋｌｅｒら、１９９９，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５，２７７３−２７７９）。培養された疾患細胞（例えば、腫瘍細胞）を無ＦＣＳ培地中で２回洗浄し、５００μｌの培地に再懸濁し、そして１０００万個の細胞あたり１００μＣｉの５１Ｃｒとともに３７℃で２時間インキュベートする。次いで、それらの細胞を２時間にわたって１５分ごとに振盪し、培地中で３回洗浄することにより、約２０，０００細胞／ウェルの濃度が達成され、次いで、丸底プレートにプレーティングする。そのプレートは、５０μｌ細胞＋５０μｌモノクローナル抗体、５０μｌ細胞＋血清（治療前および治療後）、またはコントロールとして５０μｌ細胞＋マウス血清のいずれかを含む。そのプレートを冷室内のシェーカー上で４５分間インキュベートする。１：５希釈のヒト補体（１ｍｌの氷冷水に再懸濁され、そして３％ヒト血清アルブミンで希釈されたもの）を１００μｌの体積で各ウェルに加える。コントロールウェルは、１０％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（Ｓｉｇｍａ）における同位体の最大放出に対するもの、および培地だけを含み補体の非存在下における自然放出に対するものを含む。そのプレートを３７℃で２時間インキュベートし、３分間遠心し、次いで、放射能のカウントのために１００μｌの上清を取り出す。特異的溶解のパーセンテージは、以下のとおり計算される：％細胞傷害性＝［（実験的放出−自然放出）／（最大放出−自然放出）］×１００。２０％を超えるＣＤＣの倍増は、典型的には、有意であると考えられ得る。
細胞増殖アッセイ
細胞増殖を測定するために、細胞を、９６ウェルプレートにおいて細胞傷害アッセイ（上記）に対するようにプレーティングし、生育し、そして処理し得る。処理の９６〜１４４時間後に、０．５μＣｉ／ウェルの３Ｈ−チミジン（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，６．７Ｃｉ／ｍｍｏｌ）を細胞に加え、恒温器内において３７℃、５％ＣＯ２で４〜６時間インキュベートする。細胞を溶解するために、プレートを−２０℃で一晩凍結し、次いで、ＦｉｌｔｅｒＭａｔｅ（Ｐａｃｋａｒｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ，Ｍｅｒｉｄｉｅｎ，ＣＴ）を用いて細胞溶解産物を９６ウェルフィルタープレートに回収する。細胞に関連する放射能をＴｏｐＣｏｕｎｔ（Ｐａｃｋａｒｄ）シンチレーションカウンターにおいて測定する。
他の細胞アッセイ（例えば、ＡｌａｍａｒブルーおよびＭＴＳなどの増殖アッセイ、ならびにアポトーシスアッセイ）が、ＲＮＡｉについて上に記載したように抗体を用いて行われ得る。
機能阻止抗体の試験
機能阻止抗体を試験するために、サブコンフルエントな疾患細胞株を一晩、血清飢餓にする。翌日、血清含有培地を５〜５０ｎｇ／ｍｌの機能阻止抗体の存在下においてその細胞に戻す。３７℃、５％ＣＯ２において２または５日間インキュベートした後に、フローサイトメトリーによって抗体結合を調べ、アポトーシスおよび増殖を測定する。
細胞浸潤
細胞浸潤アッセイは、９６ウェル細胞浸潤アッセイキット（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）を用いて行われ得る。細胞浸潤チャンバープレートを室温に調整した後、１００μｌの無血清培地をインサートの内側に加える。１〜２時間後、１×１０６細胞／ｍｌの細胞懸濁液を調製する。次いで、そのインサートから培地を慎重に除去し、そして１００μｌの調製された細胞をそのインサート＋／−０〜５０ｎｇの機能阻止抗体に加える。その細胞を３７℃で１５分間、予めインキュベートした後、１０％ＦＢＳを含む１５０μｌの培地を下部のチャンバーに加える。次いで、その細胞を３７℃で４８時間インキュベートする。インキュベートした後、インサートの上側から細胞を廃棄し、次いで、浸潤チャンバープレートを、ウェル内に１５０μｌの予め温められた細胞剥離溶液を含む新しい９６ウェルフィーダートレイ上に置く。そのプレートを３７℃で３０分間インキュベートし、そして定期的に振盪する。溶解緩衝液／色素溶液（４μｌのＣｙＱｕａｎｔ Ｄｙｅ／３００μｌの４×溶解緩衝液）を調製し、そしてフィーダートレイ上の解離緩衝液／細胞の各ウェルに加える。そのプレートを室温で１５分間インキュベートした後、１５０μｌを新しい９６ウェルプレートに移す。次いで、浸潤細胞の蛍光を４８０ｎｍの励起および５２０ｎｍの発光において読み出す。
レセプターインターナリゼーション
レセプターインターナリゼーションを定量化するために、本質的には、Ｄａｕｎｔらによって記載されているように（Ｄａｕｎｔら、１９９７，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５１，７１１−７２０）、ＥＬＩＳＡアッセイが行われ得る。細胞株を、０．１ｍｇ／ｍｌポリ−Ｌ−リジンで事前にコーティングされた２４ウェル組織培養皿において６×１０５細胞でプレーティングする。翌日、その細胞をＰＢＳで１回洗浄し、３７℃において数分間、ＤＭＥＭ中でインキュベートする。次いで、目的の細胞表面マーカーに対するアゴニストを、予め温められたＤＭＥＭ中において所定の濃度でそのウェルに加える。次いで、その細胞を様々な時間にわたって３７℃でインキュベートし、そして培地を除去し、細胞を３．７％ホルムアルデヒド／ＴＢＳ中で室温において５分間固定することによって、反応を停止させる。次いで、それらの細胞をＴＢＳで３回洗浄し、非特異的な結合を、１％ＢＳＡを含むＴＢＳで室温において４５分間ブロッキングする。１次抗体を、室温において１時間にわたってＴＢＳ／ＢＳＡ中の所定の希釈で加える。その後ＴＢＳで３回洗浄し、細胞を室温で１５分間、軽く再度ブロッキングする。ＴＢＳ／ＢＳＡ中に１：１０００希釈されたヤギ抗マウス結合体化アルカリホスファターゼ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）とのインキュベートを、室温において１時間行う。その細胞をＴＢＳで３回洗浄し、そして比色定量のアルカリホスファターゼ基質を加える。適切な色の変化に達したら、１００μｌのサンプルを比色定量の読み出しのために取り出す。
１２．抗体による処理
モノクローナル抗体による疾患細胞の処理
疾患細胞（例えば、癌細胞）、または目的のマーカーを発現するＮＩＨ ３Ｔ３細胞などの細胞を、９６ウェルマイクロタイタープレートにおいて４×１０４細胞／ウェルの密度で播種し、そして２時間にわたって接着させる。次いで、その細胞を、様々な濃度の、目的のマーカータンパク質に特異的なモノクローナル抗体（Ｍａｂ）または無関係のアイソタイプ一致（例えば、抗ｒＨｕＩＦＮ−ガンマ）Ｍａｂで０．０５、０．５または５．０μｇ／ｍｌにおいて処理する。７２時間インキュベートした後、コントロール（未処理）細胞に対して相対的なパーセント生存率（ＲＰＶ）を決定するために、細胞単層をクリスタルバイオレット色素で染色する。各処理群は、再現を有し得る。細胞増殖の阻害をモニターする。
モノクローナル抗体によるインビボにおける処置
目的のマーカーを発現する発現プラスミドまたはｎｅｏ−ＤＨＦＲベクターでトランスフェクトされたＮＩＨ ３Ｔ３細胞を、ｎｕ／ｎｕ（無胸腺）マウスの皮下に、０．１ｍｌのリン酸緩衝食塩水中、１０６細胞の用量で注射する。０、１、５日目およびその後４日おきに、１００μｇ（ＰＢＳ中０．１ｍｌ）の、目的のマーカータンパク質に特異的なＩｇＡ２サブクラスのＭａｂまたは無関係なＭａｂを腹腔内注射する。疾患の進行（例えば、腫瘍の出現およびサイズ）を、例えば、処置の１ヶ月間にわたってモニターし得る。
１３．ＬＣＭの同定
分泌タンパク質および排出（ｓｈｅｄ）タンパク質（分泌タンパク質および排出タンパク質は、ひとまとめにして、本明細書中で可溶性タンパク質と称される）ならびに細胞表面抗原を同定するために、質量分析（ＭＳ）ベースのプロテオミクスプラットフォーム（手術によって切除されたヒト肺腫瘍検体からの、および肺癌細胞株のパネルにおける、生物学的マーカー候補の発見の後、患者血清中の発現レベルを確認（ＥＬＩＳＡなどを用いることによって）することと組み合わされる）を用いた。例えば、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＴＯＦ ＬＣ／ＭＳベースのタンパク質発現解析などのプロテオミクス解析手法を用いて、肺腫瘍組織および／または肺癌細胞株（組織および細胞株は、ひとまとめにして本明細書中で「サンプル」と称されることがある）ならびに正常組織および／または正常細胞株における、ある特定のタンパク質の発現レベルを決定したところ、正常サンプルと比べて肺癌サンプルにおいて差次的に発現される（例えば、過剰発現されるかまたは過小発現される）タンパク質が同定された。
肺腫瘍、肺癌細胞株の細胞表面上で差次的に発現されるか、または細胞株の馴化培地中に分泌されるある特定の候補マーカーを、質量分析ベースの方法によって同定した。質量分析によって差次的に発現されると同定されたある特定のこれらの候補マーカー、ならびにある特定の他の候補マーカーは、ＥＬＩＳＡによってアッセイされ、そして肺癌患者の血清および肺癌を有しない個体（肺癌を有しない個体は、本明細書中で「正常」、「コントロール」または「健常」個体と称される）由来の血清のパネルにおいてスコア付けされた。その値が規定の閾値を超えた（例えば、試験された「正常」サンプルの群に対する平均値よりも２標準偏差以上高い）場合、個々のマーカーが、所与の癌サンプルについて「陽性」とスコア付けされた。これらの候補マーカーから、特に組み合わせて使用されるときに肺癌サンプルと健常コントロールサンプルとを様々な程度の感度および特異性で識別した肺癌マーカー（「ＬＣＭ」）が同定された。
ＬＣＭの最適なパネル／組み合わせを選択するために、いくつかの方法およびアルゴリズムを適用し、それらには、腫瘍濃度と正常濃度の平均値との比の対数を合計すること、各マーカーに対する濃度カットオフを手動で定義することにより、感度および特異性を最適化すること、およびナイーブベイズを用いることにより各マーカーの発現レベルに基づいてサンプルが腫瘍である見込みを割り当てることが包含される。したがって、各パネルに対してＲＯＣ曲線が作成され得、そしてそれらの有効性が、いくつかの方法（例えば、ＲＯＣ曲線のＡＵＣを最大にすること、ならびに所望の特異性において感度を最大にすること、または所望の感度において特異性を最大にすること）において評価され得る。
ある特定のパネルの特異性をさらに確かめるために、肺癌以外の他の肺疾患サンプル、特に慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、喘息、気管支炎および他の良性の肺疾患を用いて併存症研究を行うことにより、ある特定のパネルを検証した（図２０）。ＣＯＰＤ／喘息の有病率は、喫煙者において１０〜２５％である。まず３０個の気管支炎／喘息／良性の肺疾患サンプルのパネルを試験した。結果から、これらの併存症が、５４個のコントロールサンプルにおいて偽陽性と無関係であると考えられる場合、特異性をほんのわずかに低下させ得ることが示唆された（５４正常／５３肺腫瘍サンプルセットにおけるＣｙｆｒａ、ＳＬＰＩ、ＴＩＭＰ１、ＳＣＣ、ＴＦＰＩ、ＣＥＡＣＡＭ５、ＭＭＰ２、ＯＰＮおよびＭＤＫの９メンバーパネルの特異性は、喫煙コントロールからのサンプルに対して９８％だった）。
１４．ＥＬＩＳＡイムノアッセイ
本明細書中に開示される様々なＬＣＭに対する、ＥＬＩＳＡアッセイなどを行うためのイムノアッセイキットは、市販されている。例えば、イムノアッセイキットは、以下のような種々の商業的供給源から入手することができる：ＳＬＰＩ、ＭＭＰ２、ＭＩＦおよびＯＰＮイムノアッセイキットは、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）から入手することができ；ＣＹＦＲＡ２１−１およびＳＣＣイムノアッセイキットは、ＤＲＧ−Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（Ｍｏｕｎｔａｉｎｓｉｄｅ，ＮＪ）から入手することができ；ＤＥＦＡ１イムノアッセイキットは、Ｃｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｃａｎｔｏｎ，ＭＡ）から入手することができ；ＴＩＭＰ１イムノアッセイキットは、Ｓｉｅｍｅｎｓ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）から入手することができ；ＣＥＡおよびＧＲＰイムノアッセイキットは、ＩＢＬ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（Ｔｏｒｏｎｔｏ，Ｏｎｔａｒｉｏ）から入手することができ；ＴＦＰＩイムノアッセイキットは、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ（Ｓｔａｍｆｏｒｄ，ＣＴ）から入手することができ；そしてＭＤＫイムノアッセイキットは、ＢｉｏＶｅｎｄｏｒ（Ｃａｎｄｌｅｒ，ＮＣ．）またはＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ．）から入手することができる。アッセイは、製造者の指示書に従って行われ得る。プレートは、Ｓｐｅｃｔｒａ Ｍａｘ Ｍ２マイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）において読みだされ得、各アッセイに対して適切なベースライン補正が行われる。
ＨＮＰ１−３（ディフェンシン、ＤＥＦＡ１）は、ＬＣＭの解析のために使用され得る以下の例示的なＥＬＩＳＡプロトコルにおいて代表的なマーカーとして使用される。サンドイッチ原理に基づいた固相酵素結合免疫吸着測定法であるＨＮＰ１−３ＥＬＩＳＡ試験キットが使用され得る。サンプルおよび標準物質を、ヒトＨＮＰ１−３を認識する抗体でコーティングされたマイクロタイターウェル中でインキュベートする。このインキュベート中に、ヒトＨＮＰ１−３は、固体に結合された抗体によって捕捉される。サンプル中に存在する未結合の材料は、洗浄することによって除去される。次いで、ヒトＨＮＰ１−３に対するビオチン化された２次抗体（トレーサー）をそのウェルに加える。ＨＮＰ１−３がサンプル中に存在する場合、トレーサー抗体は、捕捉されたＨＮＰ１−３に結合する。過剰量のトレーサーは、洗浄することによって除去される。次いで、検出されるＨＮＰ１−３上に結合されたビオチン化トレーサー抗体と特異的に反応するストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ結合体をそのウェルに適用する。過剰量のストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ結合体は、洗浄することによって除去され、そして基質のテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）をそのウェルに加える。サンプル中に存在するヒトＨＮＰ１−３の量に比例して色が発色する。クエン酸を加えることによってその酵素反応を停止し、そして４５０ｎｍにおける吸収を、分光光度計を用いて測定する。その吸収を既知の標準物質の対応する濃度に対してプロットすることによって検量線を得る。標準物質と同時に行われた試験サンプル中のヒトＨＮＰ１−３の濃度は、その検量線から決定され得る。
１５．ＬＣＭレベルのスコア付け
この実施例では、スプリットポイント解析を用いてＬＣＭレベルをスコア付けする例示的な方法を説明する。
用語「スプリットポイント解析」とは、Ｍｏｒら、ＰＮＡＳ，（２００５）１０２，７６７７−７６８２から適応された方法のことを指す。この例示的な方法では、すべてのサンプルにおいて各マーカーに対する測定を行う。各マーカーに対するカットオフ値が決定される。このカットオフ値は、例えば、目的の群（例えば、腫瘍サンプル群とコントロールサンプル群）の正しい分類の正確性を最大にするように設定され得るか、または１つの群の感度もしくは特異性を最大にするように設定され得る。各マーカーについて、そのマーカーの値がカットオフ値の疾患側（例えば、カットオフについての、肺腫瘍サンプルに対応する側）に見られるときはいつでもそのサンプルに対してスコアを割り当てる。１つのサンプルに対してすべての測定が行われた後に、スコアを合計することにより、マーカーのパネルに対する合計スコアが生成される。すべてのマーカーが等しく重みづけられ得ることにより、例えば、９マーカーのパネルは、９という最大スコア（各マーカーが、１または０のスコアを有する）および０という最小スコアを有し得る。あるいは、マーカーは、不均等に重みづけられ得、より重大な測定に対してはより高い個別のスコアがつけられる。
ロジスティック回帰（例えば、Ｐｌａｎｑｕｅら、Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ（２００８），１４，１３５５−１３６２を参照のこと）および決定木モデリング（例えば、Ｐａｔｚら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ（２００７），２５，５５７８−５５８３を参照のこと）などの他のより洗練された統計学的モデリング方法も適用され得る。
ＬＣＭパネルにスプリットポイント解析を適用する例示的な方法は、例証する目的で説明される。
９つの生物学的マーカーＣｙｆｒａ、ＣＥＡ、ＳＬＰＩ、ＯＰＮ、ＭＤＫ、ＴＦＰＩ、ＴＩＭＰ１、ＭＭＰ２およびＳＣＣを含むパネル、ならびにスプリットおよびスコア方法を用いて、患者サンプルを試験することにより、患者が肺癌を有する可能性が判定され得る。そのパネルに対する所定の合計スコア（または閾値）は、１（または他の値）に設定され得る。
患者から試験サンプルを得た後、患者の試験サンプル中の９つの生物学的マーカー（Ｃｙｆｒａ、ＣＥＡ、ＳＬＰＩ、ＯＰＮ、ＭＤＫ、ＴＦＰＩ、ＴＩＭＰ１、ＭＭＰ２、ＳＣＣ）の各々の量を定量化する。この実施例の目的のために、試験サンプル中の９つの生物学的マーカーの各々の量は、以下のとおり測定される（値は、ｎｇ／ｍｌの単位で表される）：Ｃｙｆｒａ＝０．８９１、ＣＥＡ＝４．０８７、ＳＬＰＩ＝６２．９４、ＯＰＮ＝２１．５１４、ＭＤＫ＝０．１７４、ＴＦＰＩ＝１０４．５０３、ＴＩＭＰ１＝３９８．７、ＭＭＰ２＝１９４．４１およびＳＣＣ＝１．３５。次いで、これらの生物学的マーカーの各々の量を、対応する所定のカットオフ（またはスプリットポイント）と比較する。この実施例の目的のために、生物学的マーカーの各々についての所定のカットオフは、以下のとおりである：Ｃｙｆｒａ＝１．２０、ＣＥＡ＝５．００、ＳＬＰＩ＝５２、ＯＰＮ＝３２、ＭＤＫ＝０．１５、ＴＦＰＩ＝１５０、ＴＩＭＰ１＝３８５、ＭＭＰ２＝２１０およびＳＣＣ＝２．２。対応する所定のカットオフ（スプリットポイント）よりも高い量を有する各生物学的マーカーに対して、１というスコアが割り当てられ得る。対応する所定のカットオフ以下の量を有する各生物学的マーカーに対しては、０というスコアが割り当てられ得る。そこで、前記比較に基づいて、各生物学的マーカーは、以下のとおりスコアを割り当てられ得る：Ｃｙｆｒａ＝０、ＣＥＡ＝０、ＳＬＰＩ＝１、ＯＰＮ＝０、ＭＤＫ＝１、ＴＦＰＩ＝０、ＴＩＭＰ１＝１、ＭＭＰ２＝０およびＳＣＣ＝０。
次いで、その９つの生物学的マーカーの各々に対するスコアは、数学的に合算される（例えば、生物学的マーカーのスコアの各々を共に加算することによって）ことにより、その患者に対する合計スコアに達し得る。この特定の実施例において、その患者に対する合計スコアは、３である（合計スコアは、以下のとおり計算される：０＋０＋１＋０＋１＋０＋１＋０＋０＝３）。その患者に対する合計スコアを、この特定の実施例では１である所定の合計スコアと比較する。１という所定の合計スコアよりも高い合計スコアは、その患者に対して陽性の結果を示唆し得る（すなわち、この特定の実施例において、２以上の合計スコアは、その患者が肺癌を有すると示唆し得る）。１以下の合計スコアは、その患者に対して陰性の結果を示唆し得る。この実施例では、患者の合計スコアが１より高いので、この患者は、陽性の結果を有すると考えられ得る（ゆえに、肺癌の徴候または疑いについてさらなる試験が勧められ得る）。対照的に、患者の合計スコアが、１または０であったなら、患者は、陰性の結果を有すると考えられ得る（ゆえに、いかなるさらなる試験も勧められることはないだろう）。
上記の明細書において言及されたすべての刊行物および特許は、本明細書中で参考として援用される。本発明の記載された方法および組成物の様々な改変およびバリエーションが、本発明の範囲および精神から逸脱することなく当業者に明らかであろう。本発明は、特定の例示的な実施形態に関連して説明されてきたが、特許請求されるような本発明は、そのような特定の実施形態に不当に限定されるべきでないと理解されるべきである。実際に、分子生物学の分野または関連分野の当業者に明らかである、本発明を実施するための上記の様式の様々な改変が、以下の請求項の範囲内であると意図される。
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Claims (1)

  1. 本願図面に記載された発明。
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