JP2017192350A - マイコプラズマニューモニエの溶菌方法及び検出方法 - Google Patents

Abstract

【課題】 本発明は、生体試料から特殊な装置を用いなくても、簡単、短時間に阻害物質の溶出を防ぎながらマイコプラズマニューモニエを溶菌し、核酸鎖を損ねることなく放出させる方法を提供する。【解決手段】 喀痰中に含まれるマイコプラズマニューモニエにイオン性界面活性剤（好ましくはラウリル硫酸ナトリウム）を共存させて、マイコプラズマニューモニエを溶菌し、次いでマイコプラズマニューモニエのＲＮＡを精製し、精製されたマイコプラズマニューモニエのＲＮＡを増幅し検出する。【選択図】 なし

Description

本発明は、マイコプラズマニューモニエの溶菌方法およびそれを用いた検査方法に関する。

マイコプラズマニューモニエは、世界的に蔓延する細菌性疾患であり、その治療方法のみならず診断方法は極めて重要である。マイコプラズマニューモニエは人に感染すると気管支炎と肺炎（以下マイコプラズマ肺炎）といった疾患を引き起こす。異形肺炎の多くがマイコプラズマ肺炎であり、市中肺炎としての頻度も高い。日本では晩秋から早春にかけて報告数が多くなり、罹患年齢は幼児期、学童期、青年期が中心である。

マイコプラズマニューモニエのもっと確定的な診断法は培養法であるが、マイコプラズマニューモニエの増殖速度は極めて遅く、診断の遅れ、ひいては二次感染の拡大および発生につながりかねない。そこで、時間のかかる培養法と並行して、迅速に結果が得られる検査法が開発されている。なかでも注目されているのは、マイコプラズマニューモニエに特異的な核酸鎖の増幅・検出法である。この方法は、検査の対象とする菌の核酸（ＤＮＡやＲＮＡなど）に特異的なプライマーを用い、菌の核酸鎖を増幅して検出することにより、 菌の有無を判定する方法である。

前記核酸増幅法を適用した診断法では、その前処理としてマイコプラズマニューモニエを溶菌して核酸鎖を抽出する必要がある。従来の溶菌方法としては、例えば、有機溶媒等や界面活性剤を用いた化学的方法（特許文献１）、酵素を用いる生物学的方法、および、超音波処理もしくは微粒子存在下での超音波破砕、凍結・融解の繰り返すといった物理的方法等がある。しかし、従来の方法は時間がかかり、またマイコプラズマニューモニエの含まれる生体試料が過度に分解され、生体試料由来成分によりその後の反応を阻害するなどの問題があった。

特開２０１４−９７０５１号公報

本発明は、生体試料から特殊な装置を用いなくても、簡単、短時間に阻害物質の溶出を防ぎながらマイコプラズマニューモニエを溶菌する方法を提供し、さらには核酸鎖、特にＲＮＡを損ねることを最小限として放出させる方法を提供することを、その目的とする。

前記目的を達成するために、本発明者は鋭意検討した結果、本発明に到達した。即ち本発明は以下のとおりである。
（１）マイコプラズマニューモニエにイオン性界面活性剤を共存させることを特徴とする、マイコプラズマニューモニエの溶菌方法。
（２）前記イオン性界面活性剤がラウリル硫酸ナトリウムである（１）に記載の方法。
（３）喀痰中に含まれるマイコプラズマニューモニエである（１）又は（２）に記載の方法。
（４）（１）から（３）のいずれかに記載の方法によってマイコプラズマニューモニエを溶菌し、次いでマイコプラズマニューモニエのＲＮＡを精製することを特徴とする、マイコプラズマニューモニエのＲＮＡの精製方法。
（５）（４）に記載の方法によってマイコプラズマニューモニエのＲＮＡを精製し、次いで精製されたマイコプラズマニューモニエのＲＮＡを増幅し検出することを特徴とするマイコプラズマニューモニエの検出方法。

以下に本発明をさらに詳細に説明する。

本発明はマイコプラズマニューモニエにイオン性界面活性剤を共存させ、溶菌させる。本発明においてマイコプラズマニューモニエの存在形態としては特に限定されるものではなく、例えば生体試料中に含まれるものがあげられる。前記生体試料としては、喀痰、咽頭拭い液、鼻咽頭拭い液、培養液があげられるが、本発明の一態様として、前記生体試料としては喀痰が想定される。本発明の方法は喀痰中の阻害成分をあまり可溶化せず、喀痰中のマイコプラズマニューモニエを溶菌し、かつ核酸の分解を防止することができる。

本発明に用いられるイオン性界面活性剤としては、マイコプラズマニューモニエを溶菌できるものなら特に限定されず、陽イオン性界面活性剤又は陰イオン性界面活性剤のいずれでもよい。例えばラウリル硫酸ナトリウム、コール酸ナトリウム、臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム、塩化ベンザルコニウム、塩化セチルピリジニウムなどが使用でき、好ましくはラウリル硫酸ナトリウム、塩化ベンザルコニウム、塩化セチルピリジニウムであり、更に好ましくはラウリル硫酸ナトリウムである。イオン性界面活性剤の濃度には特に限定はないが、好ましくは１〜２０ｗ／ｖ％、更に好ましくは２．５〜１０ｗ／ｖ％である。

本発明はこのようにして溶菌した後、さらにＲＮＡの精製工程を含んでもよい。精製の方法としては特に限定しないが、一般的に核酸増幅に適用できるもの好ましく、たとえば、ＡＧＰＣ法（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ，Ｐ．，ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１６２，１５６−１５９．）、ＢＯＯＭ法（特許２６８０４６２号公報）、などの方法があげられる。ＢＯＯＭ法の好ましい態様として検体を少なくともグアニジン塩酸塩、２−プロパノールを含む溶液に添加し、シリカを含有する固相と接触させ、シリカを含有する固相に核酸を吸着させたのち、核酸がシリカを含有する固相から解離しにくい条件下で洗浄し、グアニジン非存在下で核酸を溶出させる方法があげられる。精製されるマイコプラズマニューモニエのＲＮＡとしては特に限定はされないが、好ましくはリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）をあげることができる。

本発明ではこのように精製されたＲＮＡに対して、当業者が適宜核酸増幅法を選択して、マイコプラズマニューモニエの検出が可能である。前記核酸増幅法としては特に限定されないが、ＰＣＲ法、ＮＡＳＢＡ法、ＴＭＡ法があげられ、好適には一定温度・一段階・リアルタイムにＲＮＡを増幅かつ測定可能なＴＲＣ法（例えば特開２０００−１４４００号公報、特開２００１−３７５００号公報、特開２００１−３５３０００号公報、Ｉｓｈｉｇｕｒｏ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．（２００３）Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．，３１４，１２４７−１２５２．）が使用できる。

本発明により、操作者は簡単に、短時間に、マイコプラズマニューモニエを溶菌し、ＲＮＡを含む核酸を精製・抽出でき、諸検査に適用できる。

［実施例１］インターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドの調製
下記（Ａ）に示す、インターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドプローブ（以下、ＩＮＡＦプローブと記載する）を特開２０００−３１６５８７号公報で開示の方法に基づき作製した。
（Ａ）配列番号１（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＮＲ＿０７７０５６．１の２０９５番目から２１１２番目までの塩基配列）からなるオリゴヌクレオチドの５’末端から１５番目のチミンと１６番目のアデニンとの間に、リンカーを介してチアゾールオレンジを標識したもの。

［実施例２］（イオン性界面活性剤による溶菌効率、阻害の検討）
各種イオン性界面活性剤を用いた場合のマイコプラズマニューモニエ溶菌効率、核酸増幅工程での反応阻害を検討した。終濃度１ｗ／ｖ％のラウリル硫酸ナトリウム、終濃度０．５ｗ／ｖ％コール酸ナトリウムそれぞれ３５０μＬに対し、喀痰５０μＬ又は水５０μＬ、マイコプラズマニューモニエ培養液５μＬを加え、１５秒激しく撹拌した。撹拌後１００００ｇ、５分間の遠心分離を行い、その上清１００μＬを２．４Ｍ グアニジンチオシアネート、１５ｍＭ クエン酸ナトリウム、６０％ ２−プロパノール、からなる変性試薬に添加した。その後、変性試薬をガラスフィルターと接触させ、核酸をガラスフィルターに捕捉し、ガラスフィルターを２００ｍＭ 塩化カリウム、４０％ ２−プロパノールからなる洗浄液１で洗浄した。次に７０％エタノールからなる洗浄液２でガラスフィルターを洗浄した。最後にガラスフィルターを乾燥させたのち、１０ｍＭ ２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール、１ｍＭ エチレンジアミン四酢酸二水素二ナトリウム二水和物、０．０１％ アジ化ナトリウムからなる溶出試薬５０μＬとガラスフィルターとを接触させ溶出液５０μＬを得た。得られた溶出液（以下、ＲＮＡ試料とする）を下記の方法で測定した。

（１）以下の組成からなる反応液を蒸発乾燥用チューブに分注し、蒸発乾燥させた。
反応液の組成：濃度は後述のようにＲＮＡ試料及び開始液を添加後（３０μＬ中）の最終濃度
６０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．３５）
３００ｍＭ トレハロース
各０．４８ｍＭ ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ
各１．８ｍＭ ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ
１．３ｍＭ ＧＴＰ
２．９ｍＭ ＩＴＰ
０．２μＭ 第一のプライマー：配列番号２（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＮＲ＿０７７０５６．１の２１７１番目から２２９７番目までの塩基配列の相補配列の５’末端にＴ７プロモーターを付加したもの）
０．２μＭ 第二のプライマー：配列番号３（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＮＲ＿０７７０５６．１の１８６５番目から１８９０番目までの塩基配列）
５０ｎＭ ＩＮＡＦプローブ（実施例１で調製したもの）
０．０２５ｍｇ／ｍＬ 牛血清アルブミン
１４２Ｕ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ
６．４Ｕ ＡＭＶ逆転写酵素。

（２）上記の蒸発乾燥後にＲＮＡ試料を１５μＬ添加後、４６℃で５分間保温し、その後、以下の組成からなる開始液１５μＬを添加し撹拌した。
開始液の組成：反応時（３０μＬ中）の最終濃度
１０．０７％ ジメチルスルホキシド
２１ｍＭ 塩化マグネシウム
１０５ｍＭ 塩化カリウム。

（３）引き続き蒸発乾燥用チューブを直接測定可能な温調機能付き蛍光分光光度計を用い、４６℃で反応させると同時に反応溶液の蛍光強度を経時的に２０分間測定した。開始液を加え撹拌を終えた時点を０分として、反応液の蛍光強度比（所定時間の蛍光強度値をバックグラウンドの蛍光強度比で割った値）が１．２を超えた場合を陽性判定とし、そのときの時間を陽性時間とした。結果を表１に示す。表１の「Ｎ．Ｄ．」は反応開始後２０分後の蛍光強度比が１．２以下（陰性判定）であったことを意味する。

喀痰の代わりに水を加えた場合、ラウリル硫酸ナトリウム、コール酸ナトリウムのいずれも同程度の陽性時間で検出された。一方喀痰を加えた場合、コール酸ナトリウムではマイコプラズマニューモニエが検出されず、ラウリル硫酸ナトリウムのみで検出された。コール酸ナトリウムでは喀痰が過度に分解され、喀痰由来成分が核酸精製、核酸増幅を阻害したと考えられる。

［実施例３］（イオン性界面活性剤による溶菌効率の検討）
各種イオン性界面活性剤を用いた場合のマイコプラズマニューモニエ溶菌効率、核酸増幅工程での反応阻害を検討した。終濃度５ｗ／ｖ％のラウリル硫酸ナトリウム、塩化ベンザルコニウム、塩化セチルピリジニウムそれぞれ４００μＬに対し喀痰１００μＬ、マイコプラズマニューモニエ培養液１０μＬを加え、１５秒激しく撹拌した。撹拌後１００００ｇ、５分間の遠心分離を行い、その上清１００μＬについて、実施例２と同様の方法で測定した。

ラウリル硫酸ナトリウムによる溶菌の効率が最も良好であることがわかる。

［実施例４］（ラウリル硫酸ナトリウム濃度の検討）
終濃度２.５ｗ／ｖ％、５ｗ／ｖ％、１０ｗ／ｖ％のラウリル硫酸ナトリウム４００μＬに対し喀痰１００μＬ、マイコプラズマニューモニエ培養液１０μＬを加え、１５秒激しく撹拌した。撹拌後１００００ｇ、５分間の遠心分離を行い、その上清１５０μＬについて、実施例２と同様の方法で測定した。

どの濃度でもマイコプラズマニューモニエを検出出来ていることがわかる。

Claims (5)

1. マイコプラズマニューモニエにイオン性界面活性剤を共存させることを特徴とする、マイコプラズマニューモニエの溶菌方法。
2. 前記イオン性界面活性剤がラウリル硫酸ナトリウムである請求項１に記載の方法。
3. 喀痰中に含まれるマイコプラズマニューモニエである請求項１又は請求項２に記載の方法。
4. 請求項１から請求項３いずれかに記載の方法によってマイコプラズマニューモニエを溶菌し、次いでマイコプラズマニューモニエのＲＮＡを精製することを特徴とする、マイコプラズマニューモニエのＲＮＡの精製方法。
5. 請求項４に記載の方法によってマイコプラズマニューモニエのＲＮＡを精製し、次いで精製されたマイコプラズマニューモニエのＲＮＡを増幅し検出することを特徴とするマイコプラズマニューモニエの検出方法。