JP2017195901A - 肌の色調改善剤のスクリーニング法 - Google Patents

Abstract

【課題】新たな作用機序に基づく肌の色調改善剤として有効な成分を探索することを目的とし、そのための新たなスクリーニング法を確立することを課題とする。【解決手段】細胞における細胞内小胞輸送関連因子の活性を指標として、肌の色調改善剤をスクリーニングする方法、及びそれにより肌の色調を改善すると判定された物質を含有する組成物。【選択図】図３

Description

本発明は、肌の色調改善剤をスクリーニングする方法に関する。

皮膚における日焼け後の色素沈着、シミ、肝斑、老人性色素斑等は、皮膚に存在するメラノサイト（色素細胞）の活性化によりメラニン生成が著しく亢進した状態である。これらの皮膚色素沈着に関連するトラブルの発生や悪化は肌の美しさを妨げるものであるため、従来これらを防止又は改善する作用を有する成分に関する研究が盛んになされており、様々な作用機序に基づく美白成分が創出されている。
例えば、アスコルビン酸類、過酸化水素、コロイド硫黄、グルタチオン、ハイドロキノン、カテコール等（非特許文献１）が、美白成分としてよく知られている。さらに近年、新たな作用機序に基づいた美白成分が種々開発されている。メラニン生成抑制を標的とするものとしては、チロシナーゼ関連蛋白阻害剤（特許文献１）、エンドセリン作用抑制剤（特許文献２）、プロトンポンプ阻害剤（特許文献３）、ステムセルファクター結合阻害剤（特許文献４）等がある。また、生成したメラニンの表皮への移動抑制を標的とするものとしては、メラノサイトのデンドライト伸張抑制剤（特許文献５）、メラニン移送又は放出抑制剤（特許文献６）等がある。また、表皮ターンオーバー促進を標的とするものとして、インテグリン産生促進剤（特許文献７）等も報告されている。

ところで、皮膚において表皮の最下部である基底層に位置するメラノサイトで合成されたメラニンは、隣接するケラチノサイト（表皮角化細胞）に受け渡される。ケラチノサイトでは受け渡されたメラニンが微小管上を移動して細胞核の上方に集まり、メラニンキャップ（核帽）と呼ばれるメラニン集合体を形成している。ここで、ケラチノサイトにおいてメラニンを細胞核周辺へ運ぶ役割は、細胞内の小胞輸送機構が担っており、この機構には種々の輸送関連因子が関与していることが知られている（非特許文献２）。
これに関連して、ケラチノサイトにおいてメラニンを輸送するタンパク質であるダイニンの発現を調節することにより、皮膚状態を改善する方法が開示されている（特許文献８）。

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メラニン色素の制御と美白剤の開発（フレグランスジャーナル社、臨時増刊）、Ｎｏ．１４、Ｐ．１１８−１２６（１９９５） The Journal of investigative dermatology, vol.121, No 4, Oct., 2003, 813-820

前述のような既知の作用機序に基づいた美白成分では、ある程度の肌色の色調改善効果は認められるものの、十分に満足のいく効果が得られているとは言い難いのが現状である。また、より高い美白効果を得るため、異なる作用機序に基づく成分をひとつの組成物に含有させることも一般的であることから、新たな作用機序に基づく美白成分も求められている。
そのため、今なおより高い効果が得られる美白用化粧料の開発を目指して、肌の色調改善に有効な新たな成分の探索や、肌の色調改善剤の標的となり得る新たな作用機序の検討がなされている。
本発明は、かかる状況に鑑み、新たな作用機序に基づく肌の色調改善剤として有効な成分を探索することを目的とし、そのための新たなスクリーニング法を確立することを課題とする。

本発明者は上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、分化が進んでいる皮膚上層においては色調が薄いという既知の事実に基づいて、メラニンを取り込んだケラチノサイトの分化を促進させると細胞内にメラニンが拡散するという細胞レベルでの新たな知見を得た。さらに、ケラチノサイトにおいて細胞内小胞輸送関連因子の活性を調節すると、細胞内にメラニンが拡散するという新たな知見も得た。そして、これらの知見に基づいて、分化関連因子及び／又は細胞内小胞輸送関連因子の活性調節剤が肌の色調改善剤となり得ることを見出して、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は以下の通りである。
［１］細胞における分化関連因子及び／又は細胞内小胞輸送関連因子の活性を指標として、肌の色調改善剤をスクリーニングする方法（以下、「本発明のスクリーニング方法」とも記す）。
［２］前記分化関連因子の活性が、分化関連因子を構成するタンパク質をコードする遺伝子の発現量であり、
被験物質を添加した細胞における前記遺伝子の発現量が、被験物質を添加しなかった細胞における該遺伝子の発現量と比較して小さい又は大きい場合に、前記被験物質は肌の色調を改善する作用を有すると判定する、［１］に記載の方法。
［３］前記細胞内小胞輸送関連因子の活性が、細胞内小胞輸送関連因子を構成するタンパク質をコードする遺伝子の発現量であり、
被験物質を添加した細胞における前記遺伝子の発現量が、被験物質を添加しなかった細胞における該遺伝子の発現量と比較して小さい又は大きい場合に、前記被験物質は肌の色調を改善する作用を有すると判定する、［１］に記載の方法。
［４］前記前記分化関連因子が、ｉｎｖｏｌｕｃｒｉｎ、ｋｅｒａｔｉｎ １、ｋｅｒａ
ｔｉｎ ５、ｋｅｒａｔｉｎ １０、ｋｅｒａｔｉｎ １４、ｆｉｌａｇｇｒｉｎ、ｌｏｒ
ｉｃｒｉｎ、ｄｅｓｍｏｇｌｅｉｎ １、ｄｅｓｍｏｇｌｅｉｎ ２、ｄｅｓｍｏｇｌｅｉｎ ３、ｄｅｓｍｏｃｏｌｉｎ １、ｔｒａｎｓｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅ １、及びｔｒａ
ｎｓｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅ ３から選択される、［１］又は［２］に記載の方法。
［５］前記細胞内小胞輸送関連因子が、ｓｙｎｔａｘｉｎ−２、ｓｙｎｔａｘｉｎ−３、ｓｙｎｔａｘｉｎ−４、ａｎｎｅｘｉｎ−１、ａｎｎｅｘｉｎ−２、ＶＡＭＰ−１、ＶＡＭＰ−２、ＶＡＭＰ−３、ＶＡＭＰ−４、ＶＡＭＰ−５、ＶＡＭＰ−７、ＶＡＭＰ−８、Ｓｅｃ２２ｂ、Ｙｋｔ６、ＳＮＡＰ−２３、ｍｙｏｓｉｎ Ｖ、ｍｙｏｓｉｎ−１０、ｍ
ｙｏｓｉｎ２ａ、ｕＫＨＣ、ｎＫＨＣ、ｋｉｎｅｃｔｉｎ、ＫＩＦＣ３、Ｒａｂ７、ＲＩＬＰ、ＰＬＥＫＨＡ７、Ｎｅｚｈａ、１２０ｃａｔｅｎｉｎ、α−ｔｕｂｕｌｉｎ、及びβ−ｔｕｂｕｌｉｎから選択される、［１］又は［３］に記載の方法。
［６］前記細胞内小胞輸送関連因子がＶＡＭＰ−１である、［５］に記載の方法。
［７］前記被験物質を添加した細胞における分化関連因子を構成するタンパク質をコード
する遺伝子及び／又は細胞内小胞輸送関連因子を構成するタンパク質をコードする遺伝子の発現量が、被験物質を添加しなかった細胞における該遺伝子の発現量に対して１０％以上変動がある場合に、前記被験物質は肌の色調を改善する作用を有すると判定する、［２］〜［６］のいずれかに記載の方法。
［８］前記肌の色調改善作用が、細胞内にメラニンを拡散させる作用である、［１］〜［７］のいずれかに記載の方法。
［９］［１］〜［８］のいずれかに記載の方法により肌の色調を改善する作用を有すると判定された物質を含有する組成物（以下、「本発明の組成物」とも記す）。
［１０］皮膚外用剤である、［９］に記載の組成物。
［１１］化粧料（ただし、医薬部外品を含む）である、［９］又は［１０］に記載の組成物。
［１２］美白用である、［９］〜［１１］のいずれかに記載の組成物。
［１３］［１］〜［８］のいずれかに記載の方法により肌の色調を改善する作用を有すると判定された物質を組成物に配合する工程を含むことを特徴とする組成物の製造方法。

本発明により、新たな作用機序に基づく肌の色調改善剤として有効な成分を探索することができる、スクリーニング法が提供される。

分化誘導の有無による、細胞におけるメラニン分布への影響を表す明視野観察像。 分化誘導の有無による、単位細胞数当たりのメラニン集合体の面積比を表すグラフ。 ＶＡＭＰ−１ ｍＲＮＡ発現の阻害の有無による、細胞におけるメラニン分布への影響を表す明視野観察像。 ＶＡＭＰ−１ ｍＲＮＡ発現の阻害の有無による、単位細胞数当たりのメラニン集合体の面積比を表すグラフ。

本発明のスクリーニング方法は、細胞における分化関連因子及び／又は細胞内小胞輸送関連因子の活性を指標として、肌の色調改善剤をスクリーニングすることを特徴とする。
本発明における分化関連因子とは、細胞の分化に伴い発現低下又は発現亢進するタンパク質をいう。また、本発明における細胞内小胞輸送関連因子とは、ケラチノサイトにおいてメラニンを細胞核周辺へ運ぶ小胞輸送に関与するタンパク質をいう。本発明者は、ケラチノサイトの分化を促進すること及び／又は細胞内小胞輸送関連因子の活性を調節することにより、メラニンキャップ構造の形成が抑制され、細胞内でメラニンが細胞内に拡散することに着目した。ここで、ケラチノサイトの分化促進は、細胞内小胞輸送関連因子の活性に何らかの影響を与えることが推測される。また、本発明者は、細胞内においては同じ量のメラニンであっても、集合体の大きさが小さく拡散している状態の方が、明るく薄い色となることをも見出した。したがって、分化促進剤及び／又は細胞内小胞輸送関連因子の活性調節剤は、肌の色調改善剤となり得る。

本発明の好ましい態様において、前記分化関連因子及び／又は細胞内小胞輸送関連因子の活性とは、分化関連因子及び／又は細胞内小胞輸送関連因子を構成するタンパク質をコードする遺伝子の発現量である。ここで、遺伝子の発現量とは、該遺伝子のｍＲＮＡの転写量と、該遺伝子がコードするタンパク質の翻訳量との何れかを指すものとする。

本発明のスクリーニング方法の好ましい態様においては、被験物質を添加した細胞における分化関連因子を構成するタンパク質をコードする遺伝子の発現量が、被験物質を添加
しなかった細胞における該遺伝子の発現量と比較して変動する場合に、前記被験物質は細胞分化を促進させ、肌の色調を改善する作用を有すると判定される。ここで、発現量の変動は、細胞の分化に伴い発現低下する遺伝子については発現量が小さくなること、及び細胞の分化に伴い発現亢進する遺伝子については発現量が大きくなることを含む。
ここで、分化関連因子は、ｉｎｖｏｌｕｃｒｉｎ、ｋｅｒａｔｉｎ １、ｋｅｒａｔｉ
ｎ ５、ｋｅｒａｔｉｎ １０、ｋｅｒａｔｉｎ １４、ｆｉｌａｇｇｒｉｎ、ｌｏｒｉｃ
ｒｉｎ、ｄｅｓｍｏｇｌｅｉｎ １、ｄｅｓｍｏｇｌｅｉｎ ２、ｄｅｓｍｏｇｌｅｉｎ
３、ｄｅｓｍｏｃｏｌｉｎ １、ｔｒａｎｓｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅ １、及びｔｒａｎｓｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅ ３が好ましく挙げられる。これらのうち、ｋｅｒａｔｉｎ ５、ｋｅｒａｔｉｎ １４等は、被験物質を添加した時にその遺伝子の発現量が被験物質を添
加しなかった時に比較して小さい場合に、前記被験物質は肌の色調を改善する作用を有すると判定される。また、ｉｎｖｏｌｕｃｒｉｎ、ｋｅｒａｔｉｎ １、ｋｅｒａｔｉｎ １０、ｆｉｌａｇｇｒｉｎ、ｌｏｒｉｃｒｉｎ、ｄｅｓｍｏｇｌｅｉｎ １、ｄｅｓｍｏｇ
ｌｅｉｎ ２、ｄｅｓｍｏｇｌｅｉｎ ３、ｄｅｓｍｏｃｏｌｉｎ １、ｔｒａｎｓｇｌｕ
ｔａｍｉｎａｓｅ １、及びｔｒａｎｓｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅ ３等は、被験物質を添加した時にその遺伝子の発現量が被験物質を添加しなかった時に比較して大きい場合に、前記被験物質は肌の色調を改善する作用を有すると判定される。

また、本発明のスクリーニング方法の別の好ましい態様においては、被験物質を添加した細胞における細胞内小胞輸送関連因子を構成するタンパク質をコードする遺伝子の発現量が、被験物質を添加しなかった細胞における該遺伝子の発現量と比較して変動する場合に、前記被験物質は肌の色調を改善する作用を有すると判定される。ここで、発現量の変動は、細胞核周辺への小胞輸送を促進する方向に関与する遺伝子については発現量が小さくなること、及び細胞核周辺への小胞輸送を抑制する方向に関与する遺伝子については発現量が大きくなることを含む。
ここで、細胞内小胞輸送関連因子は、ｓｙｎｔａｘｉｎ−２、ｓｙｎｔａｘｉｎ−３、ｓｙｎｔａｘｉｎ−４、ａｎｎｅｘｉｎ−１、ａｎｎｅｘｉｎ−２、ＶＡＭＰ−１、ＶＡＭＰ−２、ＶＡＭＰ−３、ＶＡＭＰ−４、ＶＡＭＰ−５、ＶＡＭＰ−７、ＶＡＭＰ−８、Ｓｅｃ２２ｂ、Ｙｋｔ６、ＳＮＡＰ−２３、ｍｙｏｓｉｎ Ｖ、ｍｙｏｓｉｎ−１０、ｍ
ｙｏｓｉｎ２ａ、ｕＫＨＣ、ｎＫＨＣ、ｋｉｎｅｃｔｉｎ、ＫＩＦＣ３、Ｒａｂ７、ＲＩＬＰ、ＰＬＥＫＨＡ７、Ｎｅｚｈａ、１２０ｃａｔｅｎｉｎ、α−ｔｕｂｕｌｉｎ、及びβ−ｔｕｂｕｌｉｎが好ましく挙げられる。これらのうち、ＶＡＭＰ−１、ＶＡＭＰ−２、ＶＡＭＰ−３、ＶＡＭＰ−４、ＶＡＭＰ−５、ＶＡＭＰ−７、ＶＡＭＰ−８、Ｓｅｃ２２ｂ、Ｙｋｔ６、ＫＩＦＣ３、Ｒａｂ７、及びＲＩＬＰ等は、被験物質を添加した時にその遺伝子の発現量が被験物質を添加しなかった時に比較して小さい場合に、前記被験物質は肌の色調を改善する作用を有すると判定される。また、ｕＫＨＣ、ｎＫＨＣ、及びｋｉｎｅｃｔｉｎ等は、被験物質を添加した時にその遺伝子の発現量が被験物質を添加しなかった時に比較して大きい場合に、前記被験物質は肌の色調を改善する作用を有すると判定される。

上記の細胞小胞輸送関連因子のうち、小胞結合膜タンパク質であるＶＡＭＰがさらに好ましく、具体的にはＶＡＭＰ−１／Ｓｙｎａｐｔｏｂｒｅｖｉｎ１、ＶＡＭＰ−２／Ｓｙｎａｐｔｏｂｒｅｖｉｎ２、ＶＡＭＰ−３／Ｃｅｌｌｕｂｒｅｖｉｎ、ＶＡＭＰ−４、ＶＡＭＰ−５、ＶＡＭＰ−７／Ｔｉ−ＶＡＭＰ、ＶＡＭＰ−８／Ｅｎｄｏｂｒｅｖｉｎ、Ｓｅｃ２２ｂ、Ｙｋｔ６等が挙げられ、特にＶＡＭＰ−１が好ましい。
ＶＡＭＰ−１は、ヒトケラチノサイトにおける発現、およびケラチノサイトでの小胞輸送に関与することが報告されている。ヒトＶＡＭＰ−１遺伝子の塩基配列及びコードされるアミノ酸配列をそれぞれ配列番号１及び２に示す。

分化関連因子及び／又は細胞内小胞輸送関連因子を構成するタンパク質をコードする遺
伝子の発現量は、任意の方法を用いて測定することができる。例えば、当該遺伝子の配列に特異的に結合する配列を有するＤＮＡ断片をプライマーとして用いてＰＣＲを行い、定量的な検出を行う。なお、上述した種々の因子をコードする遺伝子配列はそれぞれ公開されており、当業者は適宜プライマーを設計してＰＣＲに供することができる。とりわけ、ＶＡＭＰ−１の発現量を指標としてスクリーニングを行う場合は、検出のためのプライマーキットが市販されており好適に使用できる。
また、例えば、当該タンパク質の細胞内存在量を、常法で定量的に測定して、遺伝子の発現量としてもよい。

スクリーニングに用いる細胞の種類は、分化関連因子及び／又は細胞内小胞輸送関連因子を発現し得る細胞であれば特に限定されないが、ケラチノサイト又はファイブロブラストが好ましく、ケラチノサイトがより好ましく、ヒト由来ケラチノサイトがさらに好ましい。細胞の培養の条件としては、通常の培養条件、例えば市販のＫＧ２培地を用いる他、本発明のスクリーニング方法の実行を妨げない、具体的には分化関連因子及び／又は細胞内小胞輸送関連因子を構成するタンパク質をコードする遺伝子の発現量の測定を妨げない培養条件であれば、特段の限定なく適用することができる。

本発明のスクリーニング方法が対象とする被験物質は、純物質、動植物由来の抽出物、またはそれらの混合物等のいずれであってもよい。
動植物由来の抽出物は、動物又は植物由来の抽出物自体のみならず、抽出物の画分、精製した画分、抽出物乃至は画分、精製物の溶媒除去物の総称を意味するものとし、植物由来の抽出物は、自生若しくは生育された植物、漢方生薬原料等として販売されるものを用いた抽出物、市販されている抽出物等が挙げられる。
抽出操作は、植物部位の全草を用いるほか、植物体、地上部、根茎部、木幹部、葉部、茎部、花穂、花蕾等の部位を使用することできるが、予めこれらを粉砕あるいは細切して抽出効率を向上させることが好ましい。抽出溶媒としては、水、エタノール、イソプロピルアルコール、ブタノールなどのアルコール類、１，３−ブタンジオール、ポリプロピレングリコールなどの多価アルコール類、アセトン、メチルエチルケトンなどのケトン類、ジエチルエーテル、テトラヒドロフランなどのエーテル類等の極性溶媒から選択される１種乃至は２種以上が好適なものとして例示することができる。具体的な抽出方法としては、例えば、植物体等の抽出に用いる部位乃至はその乾燥物１質量に対して、溶媒を１〜３０質量部加え、室温であれば数日間、沸点付近の温度であれば数時間浸漬し、室温まで冷却し後、所望により不溶物及び／又は溶媒除去し、カラムクロマトグラフィー等で分画精製する方法が挙げられる。

本発明のスクリーニング方法における手順の一例を以下に挙げるが、本発明の趣旨を逸脱しない限り以下の内容に限定されるものではなく、適宜変更して実施することができる。
まず、細胞に被験物質を添加し、２４時間インキュベーションする。その後、該細胞からｍＲＮＡを抽出し、指標とする分化関連因子及び／又は細胞内小胞輸送関連因子をコードする遺伝子の発現量を、該遺伝子を特異的に検出するプライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲを行い、定量的に測定する。コントロールとして被験物質を添加しなかった細胞においても該遺伝子の発現量を測定する。被験物質を添加した細胞における該遺伝子の発現量が、被験物質を添加しなかった細胞における該の発現量（コントロール）に対して小さく又は大きくなった場合、好ましくはコントロールに対して１０％以上、より好ましくは１５％以上、さらに好ましくは２０％以上変動した場合に、前記被験物質は肌の色調を改善する作用を有すると判定する。該判定された物質は、肌の色調改善剤となり得る。

本発明において、「肌の色調」とは、肌の色みの濃淡や明暗の程度をいう。「色調が改善された」とは、色みが未処置の状態よりも薄く、明るくなることをいう。
色調が改善されたことは、細胞レベルでは、細胞内のメラニン集合体として測定される面積がコントロールに比して小さくなったことを、顕微鏡の明視野画像を解析することにより確認することができる。すなわち、細胞内のメラニン集合体の大きさがコントロールに比して小さくなり、微粒子化した状態で細胞内に拡散しており、見かけ上メラニン集合体が減少または消失している場合、その細胞は色調が改善された細胞であるといえる。この場合、実際の細胞内のメラニン総量の増減については問わない。
また、肌組織レベルでは、色彩色差計、分光測色計等の周知の測色計による測定や、目視評価等により色調が改善されたことを確認することができる。

本発明のスクリーニング方法により肌の色調を改善すると判定された物質（肌の色調改善剤）は、任意の調製方法により組成物に含有させることができる。
組成物としては、化粧料、医薬部外品、医薬品などが好適に例示でき、日常的に使用できることから、化粧料、医薬部外品がより好ましい。その投与経路としては、特に限定されるものではないが、肌の色調改善作用を発揮するために皮膚への貯留性、標的部位への到達効率等を考慮し、経皮投与を採用して皮膚外用剤とすることが好ましい。

本発明の肌の色調改善剤を含有する組成物は、美白用途に好適に用いることができる。
従来の美白剤や美白用皮膚外用剤は、チロシナーゼ合成成阻害などにより、メラニンの生成を抑制して肌を美白へと導くものであった。
それに対して、本発明のスクリーニングにより肌の色調を改善すると判定された物質（肌の色調改善剤）は、前述のように細胞の分化状態に起因すると推測されるメラニンキャップ構造の形成を抑制することで、メラニン集合体を微粒子化して細胞内へ拡散させる作用を有するため、新しいメカニズムによる美白剤となり得る。

本発明の組成物中における、肌の色調改善剤の含有量（配合量）は、通常、０．００００１質量％以上、好ましくは０．０００１質量％以上、より好ましくは０．００１質量％以上であり、通常１５質量％以下、好ましくは１０質量％以下、より好ましくは５質量％である。肌の色調改善剤の含有量（配合量）が少なすぎると所望の効果が得られにくい場合があり、多すぎると効果が頭打ちになるばかりか組成物の処方の自由度を損なう場合があるからである。
また、組成物に含有させる肌の色調改善剤の種類は、１種類のみでなく２種類以上であってもよい。

組成物の製造に際しては、化粧料、医薬部外品、医薬品などの製剤化で通常使用される任意成分を配合することができる。例えば、スクワラン、ワセリン、マイクロクリスタリンワックスなどの炭化水素類、ホホバ油、カルナウバワックス、オレイン酸オクチルドデシルなどのエステル類、オリーブ油、牛脂、椰子油などのトリグリセライド類、ステアリン酸、オレイン酸、レチノイン酸などの脂肪酸、オレイルアルコール、ステアリルアルコール、オクチルドデカノール等の高級アルコール、スルホコハク酸エステルやポリオキシエチレンアルキル硫酸ナトリウム等のアニオン界面活性剤類、アルキルベタイン塩等の両性界面活性剤類、ジアルキルアンモニウム塩等のカチオン界面活性剤類、ソルビタン脂肪酸エステル、脂肪酸モノグリセライド、これらのポリオキシエチレン付加物、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル等の非イオン界面活性剤類、ポリエチレングリコール、グリセリン、１，３−ブタンジオール等の多価アルコール類、増粘・ゲル化剤、酸化防止剤、紫外線吸収剤、色剤、防腐剤、粉体等を任意に配合することができる。

また、本発明の組成物には、本発明の肌の色調改善剤以外の、美白用成分も配合してもよい。例えば、アスコルビン酸類、過酸化水素、コロイド硫黄、グルタチオン、ハイドロキノン、カテコール等の美白成分、チロシナーゼ関連蛋白阻害剤、エンドセリン作用抑制
剤、プロトンポンプ阻害剤、ステムセルファクター結合阻害剤等のメラニン生成抑制剤、デンドライト伸張抑制剤、メラニン移送又は放出抑制剤、インテグリン産生促進剤などが挙げられる。
組成物の製造は、常法に従ってこれらの成分を処理・配合することにより、困難なく行うことができる。

以下、本発明を実施例により更に詳細に説明するが、本発明は、その要旨を超えない限り、以下の実施例に限定されるものではない。

＜参考例１＞分化促進によるメラニン分布への影響の検討
以下の手順で、高カルシウム条件で分化を促進した場合の、細胞におけるメラニンの分布を検討した。
トリプシン処理によりＢ１６マウスメラノーマ細胞５×１０⁶ ｃｅｌｌｓを回収し、ＰＢＳ ３ｍＬで懸濁した。遠心（１０００ｒｐｍ、２分）し上清を除いた後、冷ホモジナ
イズバッファー（０．２５Ｍ ｓｕｃｒｏｓｅ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１０ｍＭ ＫＣｌ）
２．５ｍＬを加え細胞を懸濁した。氷浴上で、２．５mＬ注射筒と２５Ｇ注射針で２０回
ホモジナイズした後、遠心（７００ｇ、１０分、４℃）した。上清を回収し、９０％ ｐ
ｅｒｃｏｌｌを３６１．３μＬ、上清を８００μＬ加え懸濁した（最終濃度２８％ ｐｅ
ｒｃｏｌｌ）。遠心（２００００ｇ、４５分、４℃）し、エッペンの底近くに見える黒い層を回収し、単離メラノソームとした。

新生児ヒト正常ケラチノサイトを、ＫＧ２培地で４穴チャンバースライドに１．０×１０⁵個／ウェルとなるように播種した。播種２時間後、最終濃度０．０１％となるように
単離メラノソームを添加したＫＧ２培地（５００μＬ／ウェル）に交換した。その２４時間後、ＰＢＳで十分にピペッティングして細胞膜に付着したメラノソームを除去し、次いで１．０ｍＭカルシウムを含有するＫＧ２培地（２５０μＬ／ウェル）に交換し分化を誘導した。２４時間後、ケラチノサイトを４％パラホルムアルデヒドで細胞固定した後、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２（同仁化学研究所）で細胞核を蛍光染色した。封入後、蛍光顕微鏡の蛍光観察と明視野観察で細胞核及びメラニン分布画像を取得し、画像解析ソフトＩｍａｇｅＪ（アメリカ国立衛生研究所）を用いて、二値化したメラニン分布画像の黒色領域の総面積、粒子毎の平均面積及び細胞数を測定し、これらから単位細胞数当たりのメラニン集合体の平均面積を算出した。

明視野で撮影したケラチノサイト内のメラニン分布画像を図１に、算出した単位細胞数当たりのメラニン集合体の平均面積比を図２に示す。分化を促進したことにより、メラニン集合体の平均面積はコントロールの６２％に抑制された。なお、細胞を溶解し、吸光度測定により細胞内メラニン量を定量したところ、分化誘導の有無で細胞内メラニンの総量は変わらないことも確認された。
したがって、メラニンは細胞外に排出されたのではなく、メラニン集合体が微粒子化して細胞内に拡散したためメラニンが見かけ上減少・消失し、その結果細胞レベルで色調が改善したと推察された。

＜実施例１＞ｋｅｒａｔｉｎ １０ ｍＲＮＡ発現量を指標としたスクリーニング
以下の手順で、分化関連因子であるｋｅｒａｔｉｎ １０の活性を指標とした肌の色調
改善剤のスクリーニングを行った。なお、ヒトｋｅｒａｔｉｎ １０遺伝子の塩基配列及
びコードされるアミノ酸配列をそれぞれ配列番号３及び４に示す。
新生児ヒト正常ケラチノサイトを、ＫＧ２培地で２４穴プレートおよび４穴チャンバースライドにそれぞれ１．０×１０⁵個／ウェルとなるように播種した。播種２時間後、最
終濃度０．０１％となるように単離メラノソームを添加したＫＧ２培地（５００μＬ／ウ
ェル）に交換した。その２４時間後、ＰＢＳで十分にピペッティングして細胞膜に付着したメラノソームを除去し、次いでＫＧ２培地（２５０μＬ／ウェル）に交換した。さらに、被験物質として種々の植物抽出エキスを添加した（２．５μＬ／ウェル）。２４時間後、培地を除きＰＢＳで洗浄し、２４穴プレートのケラチノサイトにＲＮｅａｓｙＭｉｎｉＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）のＲＬＴ ｂｕｆｆｅｒを添加しｍＲＮＡを抽出し、Ｑｕａｎ
ｔｉＴｅｃｔ Ｐｒｉｍｅｒ Ａｓｓａｙ（ＱＩＡＧＥＮ社、カタログＮｏ．ＱＴ０００１７０４５）を用いてＲＴ−ＰＣＲを行いｋｅｒａｔｉｎ １０のｍＲＮＡ量を測定した。
ｋｅｒａｔｉｎ １０のｍＲＮＡ発現量は、β−ａｃｔｉｎを内在性コントロールとして
比較ＣＴ法により算出し、エキス非添加の角化細胞におけるｋｅｒａｔｉｎ １０ｍＲＮ
Ａ発現量を「１」とした場合の相対値で示した。また、４穴チャンバースライドのケラチノサイトは、４％パラホルムアルデヒドで細胞固定した後、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２（同仁化学研究所）で細胞核を蛍光染色した。封入後、蛍光顕微鏡の蛍光観察と明視野観察で細胞核及びメラニン分布画像を取得し、画像解析ソフトＩｍａｇｅＪを用いて、二値化したメラニン分布画像の黒色領域の総面積、粒子毎の平均面積及び細胞数を測定し、これらから単位細胞数当たりのメラニン集合体の平均面積を算出した。

結果を表１に示す。シャクヤク根エキス、水溶性プロテオグリカン、オリーブ葉エキス、ゲットウ葉エキスにｋｅｒａｔｉｎ １０発現亢進作用および有意な細胞内メラニン拡
散作用を見出した。

＜参考例２＞細胞内小胞輸送関連因子の発現阻害によるメラニン分布への影響の検討
以下の手順でｓｉＲＮＡを用いてＶＡＭＰ−１の発現を阻害した場合の、細胞におけるメラニンの分布を検討した。
トリプシン処理によりＢ１６マウスメラノーマ細胞５×１０⁶ ｃｅｌｌｓを回収し、ＰＢＳ ３ｍＬで懸濁した。遠心（１０００ｒｐｍ、２分）し上清を除いた後、冷ホモジナ
イズバッファー（０．２５Ｍ ｓｕｃｒｏｓｅ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１０ｍＭ ＫＣｌ）
２．５ｍＬを加え細胞を懸濁した。氷浴上で、２．５mＬ注射筒と２５Ｇ注射針で２０回
ホモジナイズした後、遠心（７００ｇ、１０分、４℃）した。上清を回収し、９０％ ｐ
ｅｒｃｏｌｌを３６１．３μＬ、上清を８００μＬ加え懸濁した（最終濃度２８％ ｐｅ
ｒｃｏｌｌ）。遠心（２００００ｇ、４５分、４℃）し、エッペンの底近くに見える黒い層を回収し、単離メラノソームとした。

新生児ヒト正常ケラチノサイトを、ＫＧ２培地で２４穴プレートおよび４穴チャンバー
スライドにそれぞれ１．０×１０⁵個／ウェルとなるように播種した。播種２時間後、最
終濃度０．０１％となるように単離メラノソームを添加したＫＧ２培地（５００μＬ／ウェル）に交換した。その２４時間後、ＰＢＳで十分にピペッティングして細胞膜に付着したメラノソームを除去し、次いで抗生物質無添加のＫＧ２培地（２５０μＬ／ウェル）に交換した。別途、トランスフェクション試薬（Ｏｐｔｉ−Ｍｅｍ ５０μＬ＋Ｔｒａｎｓ
ＩＴ-ＴＫＯ（Ｍｉｒｕｓ社） １μＬ）を調製し、よく混和した後、１０分間インキュベートした。このトランスフェクション試薬にＦｌｅｘｉＴｕｂｅ ＶＡＭＰ−１ ｓｉＲＮＡ（ＱＩＡＧＥＮ社、カタログNo. ＳＩ０３１５１３６５）を最終濃度２５ｎＭになるように添加し、よく混和した後、１０分間インキュベートした。このｓｉＲＮＡ添加トランスフェクション試薬を、前記ケラチノサイトに添加した（５０μＬ／ウェル）。２４時間後、培地を除きＰＢＳで洗浄し、２４穴プレートのケラチノサイトにＲＮｅａｓｙＭｉｎｉＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）のＲＬＴ ｂｕｆｆｅｒを添加しｍＲＮＡを抽出し、J Invest Dermatol. 2001 Feb;116(2):296-304.を参照して設計したカスタムＤＮＡプライマー（配列番号５及び６、ライフテクノロジーズジャパン株式会社）を用いてＲＴ−ＰＣＲを行いＶＡＭＰ−１のｍＲＮＡ量を測定した。また、４穴チャンバースライドのケラチノサイトは、４％パラホルムアルデヒドで細胞固定した後、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２（同仁化学研究所）で細胞核を蛍光染色した。封入後、蛍光顕微鏡の蛍光観察と明視野観察で細胞核及びメラニン分布画像を取得し、画像解析ソフトＩｍａｇｅＪ（アメリカ国立衛生研究所）を用いて、二値化したメラニン分布画像の黒色領域の総面積、粒子毎の平均面積及び細胞数を測定し、これらから単位細胞数当たりのメラニン集合体の平均面積を算出した。

ｓｉＲＮＡを添加したケラチノサイトにおけるＶＡＭＰ−１のｍＲＮＡ量はコントロールの３８％であり、該細胞ではＶＡＭＰ−１の活性が阻害されたことが確認された。明視野で撮影したケラチノサイト内のメラニン分布画像を図３に、算出した単位細胞数当たりのメラニン集合体の平均面積比を図４に示す。ＶＡＭＰ−１の発現を阻害したことにより、メラニン集合体の平均面積はコントロールの８６％に抑制された。なお、細胞を溶解し、吸光度測定により細胞内メラニン量を定量したところ、ＶＡＭＰ−１のｍＲＮＡ発現の阻害の有無で細胞内メラニンの総量は変わらないことも確認された。
したがって、メラニンは細胞外に排出されたのではなく、メラニン集合体が微粒子化して細胞内に拡散したためメラニンが見かけ上減少・消失し、その結果細胞レベルで色調が改善したと推察された。

＜実施例２＞ＶＡＭＰ−１ ｍＲＮＡ発現量を指標としたスクリーニング
以下の手順で、細胞内小胞輸送関連因子であるＶＡＭＰ−１の活性を指標とした肌の色調改善剤のスクリーニングを行った。
新生児ヒト正常ケラチノサイトを、ＫＧ２培地で２４穴プレートおよび４穴チャンバースライドにそれぞれ１．０×１０⁵個／ウェルとなるように播種した。播種２時間後、最
終濃度０．０１％となるように単離メラノソームを添加したＫＧ２培地（５００μＬ／ウェル）に交換した。その２４時間後、ＰＢＳで十分にピペッティングして細胞膜に付着したメラノソームを除去し、次いでＫＧ２培地（２５０μＬ／ウェル）に交換した。さらに、被験物質として種々の植物抽出エキスを添加した（２．５μＬ／ウェル）。２４時間後、培地を除きＰＢＳで洗浄し、２４穴プレートのケラチノサイトにＲＮｅａｓｙＭｉｎｉＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）のＲＬＴ ｂｕｆｆｅｒを添加しｍＲＮＡを抽出し、カスタム
ＤＮＡプライマー（配列番号５及び６、ライフテクノロジーズジャパン株式会社）を用いてＲＴ−ＰＣＲを行いＶＡＭＰ−１のｍＲＮＡ量を測定した。ＶＡＭＰ−１のｍＲＮＡ発現量は、β−ａｃｔｉｎを内在性コントロールとして比較ＣＴ法により算出し、前記エキス非添加の角化細胞におけるＶＡＭＰ−１ ｍＲＮＡ発現量を「１」とした場合の相対値
で示した。また、４穴チャンバースライドのケラチノサイトは、４％パラホルムアルデヒドで細胞固定した後、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２（同仁化学研究所）で細胞核を蛍光染色した。封入後、蛍光顕微鏡の蛍光観察と明視野観察で細胞核及びメラニン分布画像を取得
し、画像解析ソフトＩｍａｇｅＪを用いて、二値化したメラニン分布画像の黒色領域の総面積、粒子毎の平均面積及び細胞数を測定し、これらから単位細胞数当たりのメラニン集合体の平均面積を算出した。

結果を表２に示す。ビワ葉エキス、ポリグルタミン酸、カッコンエキス、アロエベラ葉エキス、クロレラエキス、ビルベリー葉エキス、加水分解黒豆エキス、シーグラスエキスの８エキスにＶＡＭＰ−１発現抑制作用および有意な細胞内メラニン拡散作用を見出した。

本発明のスクリーニング法により、新たな作用機序に基づく肌の色調改善剤として有効な成分を探索することができるため、産業上非常に有用である。

Claims (10)

1. 細胞における細胞内小胞輸送関連因子の活性を指標として、肌の色調改善剤をスクリーニングする方法。
2. 前記細胞内小胞輸送関連因子の活性が、細胞内小胞輸送関連因子を構成するタンパク質をコードする遺伝子の発現量であり、
   被験物質を添加した細胞における前記遺伝子の発現量が、被験物質を添加しなかった細胞における該遺伝子の発現量と比較して小さい又は大きい場合に、前記被験物質は肌の色調を改善する作用を有すると判定する、請求項１に記載の方法。
3. 前記細胞内小胞輸送関連因子が、ＶＡＭＰ−１、ＶＡＭＰ−２、ＶＡＭＰ−３、ＶＡＭＰ−４、ＶＡＭＰ−５、ＶＡＭＰ−７、ＶＡＭＰ−８、ｓｙｎｔａｘｉｎ−２、ｓｙｎｔａｘｉｎ−３、ｓｙｎｔａｘｉｎ−４、ａｎｎｅｘｉｎ−１、ａｎｎｅｘｉｎ−２、Ｓｅｃ２２ｂ、Ｙｋｔ６、ＳＮＡＰ−２３、ｍｙｏｓｉｎ Ｖ、ｍｙｏｓｉｎ−１０、ｍｙｏ
   ｓｉｎ２ａ、ｕＫＨＣ、ｎＫＨＣ、ｋｉｎｅｃｔｉｎ、ＫＩＦＣ３、Ｒａｂ７、ＲＩＬＰ、ＰＬＥＫＨＡ７、Ｎｅｚｈａ、１２０ｃａｔｅｎｉｎ、α−ｔｕｂｕｌｉｎ、及びβ−ｔｕｂｕｌｉｎから選択される、請求項１又は２に記載の方法。
4. 前記細胞内小胞輸送関連因子がＶＡＭＰ−１である、請求項３に記載の方法。
5. 前記被験物質を添加した細胞における細胞内小胞輸送関連因子を構成するタンパク質をコードする遺伝子の発現量が、被験物質を添加しなかった細胞における該遺伝子の発現量に対して１０％以上変動がある場合に、前記被験物質は肌の色調を改善する作用を有すると判定する、請求項２〜４のいずれか一項に記載の方法。
6. 前記肌の色調改善作用が、細胞内にメラニンを拡散させる作用である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
7. 請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法により肌の色調改善剤をスクリーニングする工程、及び前記工程で肌の色調を改善する作用を有すると判定された物質を組成物に配合する工程を含むことを特徴とする組成物の設計方法。
8. 前記組成物が皮膚外用剤である、請求項７に記載の設計方法。
9. 前記組成物が化粧料（ただし、医薬部外品を含む）である、請求項７又は８に記載の設計方法。
10. 前記組成物が美白用である、請求項７〜９のいずれか一項に記載の設計方法。

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