JP2017201954A - Fluorescence labeled probe, reagent for nucleic acid amplification reaction, and nucleic acid amplification reaction method - Google Patents
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Abstract
【課題】蛍光を高感度で検出することができる蛍光標識プローブを提供する。
【解決手段】オリゴヌクレオチドと、前記オリゴヌクレオチドに結合されたレポーター色素と、前記オリゴヌクレオチドに結合されたクエンチャーと、を含み、前記レポーター色素および前記クエンチャーのうち少なくとも一方は、前記オリゴヌクレオチドに複数結合されている、蛍光標識プローブ。
【選択図】図１A fluorescently labeled probe capable of detecting fluorescence with high sensitivity is provided.
An oligonucleotide, a reporter dye bound to the oligonucleotide, and a quencher bound to the oligonucleotide, wherein at least one of the reporter dye and the quencher is attached to the oligonucleotide. A plurality of fluorescently labeled probes that are bound together.
[Selection] Figure 1
Description
本発明は、蛍光標識プローブ、核酸増幅反応用試薬、および核酸増幅反応方法に関する。 The present invention relates to a fluorescently labeled probe, a reagent for nucleic acid amplification reaction, and a method for nucleic acid amplification reaction.
近年、遺伝子の利用技術の発展により、遺伝子診断や遺伝子治療など遺伝子を利用した医療が注目されている他、農畜産分野においても品種判別や品種改良に遺伝子を用いた手法が多く開発されている。遺伝子を利用するための技術として、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法などの技術が広く普及している。今日では、ＰＣＲ法は生体物質の情報解明において必要不可欠な技術となっている。 In recent years, gene-based medical care such as gene diagnosis and gene therapy has attracted attention due to the development of gene utilization technology, and many methods using genes for variety discrimination and variety improvement have been developed in the field of agriculture and livestock. . As a technique for utilizing a gene, a technique such as a PCR (Polymerase Chain Reaction) method is widely used. Today, PCR has become an indispensable technique for elucidating information on biological materials.
ＰＣＲ法は、増幅の対象とする核酸（標的核酸）および試薬を含む溶液（反応液）に熱サイクルを施すことで、標的核酸を増幅させる手法である。熱サイクルは、２段階以上の温度を周期的に反応液に施す処理である。ＰＣＲ法においては、２段階または３段階の熱サイクルを施す手法が一般的である。 The PCR method is a method of amplifying a target nucleic acid by subjecting a solution (reaction solution) containing a nucleic acid (target nucleic acid) to be amplified and a reagent to thermal cycling. The thermal cycle is a process in which two or more stages of temperature are periodically applied to the reaction solution. In the PCR method, a method of applying a two-stage or three-stage thermal cycle is common.
例えば特許文献１には、オリゴヌクレオチドにレポーター蛍光色素およびクエンチャー色素が結合したプローブを用いて、反応液からの蛍光をリアルタイムに測定するリアルタイム検出ＰＣＲ法が記載されている。 For example, Patent Document 1 describes a real-time detection PCR method in which fluorescence from a reaction solution is measured in real time using a probe in which a reporter fluorescent dye and a quencher dye are bound to an oligonucleotide.
しかしながら、特許文献１に記載のプローブでは、例えば、ＰＣＲの反応時間（変性反応のための時間や、アニーリング反応／伸長反応のための時間）を短縮させると（ＰＣＲを高速化させると）、核酸と十分にハイブリダイゼーションせず、反応液からの蛍光を高感度で検出することができない場合があった。 However, in the probe described in Patent Document 1, for example, when the PCR reaction time (time for denaturation reaction or time for annealing / extension reaction) is shortened (when the speed of PCR is increased), nucleic acid In some cases, the fluorescence from the reaction solution could not be detected with high sensitivity.
本発明のいくつかの態様に係る目的の１つは、蛍光を高感度で検出することができる蛍光標識プローブを提供することにある。また、本発明のいくつかの態様に係る目的の１つは、蛍光を高感度で検出することができる核酸増幅反応用試薬を提供することにある。また、本発明のいくつかの態様に係る目的の１つは、蛍光を高感度で検出することができる核酸増幅反応方法を提供することにある。 One of the objects according to some embodiments of the present invention is to provide a fluorescently labeled probe capable of detecting fluorescence with high sensitivity. Another object of some aspects of the present invention is to provide a reagent for nucleic acid amplification reaction that can detect fluorescence with high sensitivity. Another object of some aspects of the present invention is to provide a nucleic acid amplification reaction method capable of detecting fluorescence with high sensitivity.
本発明に係る蛍光標識プローブは、
オリゴヌクレオチドと、
前記オリゴヌクレオチドに結合されたレポーター色素と、
前記オリゴヌクレオチドに結合されたクエンチャーと、
を含み、
前記レポーター色素および前記クエンチャーのうち少なくとも一方は、前記オリゴヌクレオチドに複数結合されている。
The fluorescently labeled probe according to the present invention comprises:
An oligonucleotide;
A reporter dye bound to the oligonucleotide;
A quencher attached to the oligonucleotide;
Including
At least one of the reporter dye and the quencher is bonded to the oligonucleotide.
このような蛍光標識プローブでは、蛍光を高感度で検出することができる。 With such a fluorescently labeled probe, fluorescence can be detected with high sensitivity.
本発明に係る蛍光標識プローブにおいて、
前記クエンチャーは、前記オリゴヌクレオチドに複数結合されていてもよい。
In the fluorescently labeled probe according to the present invention,
A plurality of the quenchers may be bound to the oligonucleotide.
このような蛍光標識プローブでは、クエンチャーが１つしかオリゴヌクレオチドに結合されていない場合に比べて、クエンチング効果（消光効果）を高めることができる。したがって、このような蛍光標識プローブでは、蛍光を高感度で検出することができる。 In such a fluorescently labeled probe, the quenching effect (quenching effect) can be enhanced as compared with the case where only one quencher is bound to the oligonucleotide. Therefore, with such a fluorescently labeled probe, fluorescence can be detected with high sensitivity.
本発明に係る蛍光標識プローブにおいて、
前記レポーター色素は、前記オリゴヌクレオチドに複数結合されていてもよい。
In the fluorescently labeled probe according to the present invention,
A plurality of the reporter dyes may be bound to the oligonucleotide.
このような蛍光標識プローブでは、レポーター色素が１つしかオリゴヌクレオチドに結合されていない場合に比べて、リアルタイムＰＣＲにおいて蛍光を測定した場合に蛍光強度を大きくすることができる。したがって、このような蛍光標識プローブでは、蛍光を高感度で検出することができる。 In such a fluorescently labeled probe, the fluorescence intensity can be increased when fluorescence is measured in real-time PCR, compared to the case where only one reporter dye is bound to the oligonucleotide. Therefore, with such a fluorescently labeled probe, fluorescence can be detected with high sensitivity.
本発明に係る蛍光標識プローブにおいて、
前記オリゴヌクレオチドに対する前記クエンチャーの結合数は、前記オリゴヌクレオチドに対する前記レポーター色素の結合数よりも多くてもよい。
In the fluorescently labeled probe according to the present invention,
The number of bonds of the quencher to the oligonucleotide may be greater than the number of bonds of the reporter dye to the oligonucleotide.
このような蛍光標識プローブでは、例えばクエンチャーの結合数とレポーター色素の結合数とが同じである場合に比べて、クエンチング効果を高めることができる。 In such a fluorescently labeled probe, for example, the quenching effect can be enhanced as compared with the case where the number of binding of the quencher and the number of binding of the reporter dye are the same.
本発明に係る蛍光標識プローブにおいて、
前記オリゴヌクレオチドにおいて、前記レポーター色素と前記クエンチャーとは、交互に配置されていてもよい。
In the fluorescently labeled probe according to the present invention,
In the oligonucleotide, the reporter dye and the quencher may be alternately arranged.
このような蛍光標識プローブでは、レポーター色素とクエンチャーと間の距離を小さくすることができ、クエンチング効果を高めることができる。 In such a fluorescently labeled probe, the distance between the reporter dye and the quencher can be reduced, and the quenching effect can be enhanced.
本発明に係る蛍光標識プローブにおいて、
前記オリゴヌクレオチドにおいて、隣り合う前記レポーター色素と前記クエンチャーとの間の塩基数は、１０塩基以下であってもよい。
In the fluorescently labeled probe according to the present invention,
In the oligonucleotide, the number of bases between the adjacent reporter dye and the quencher may be 10 bases or less.
このような蛍光標識プローブでは、オリゴヌクレオチドにおいて、隣り合うレポーター色素とクエンチャーとの間の距離を小さくすることができ、クエンチング効果を高めることができる。 In such a fluorescently labeled probe, in the oligonucleotide, the distance between the adjacent reporter dye and the quencher can be reduced, and the quenching effect can be enhanced.
本発明に係る核酸増幅反応用試薬は、
本発明に係る蛍光標識プローブを含む。
The reagent for nucleic acid amplification reaction according to the present invention comprises:
A fluorescently labeled probe according to the present invention is included.
このような核酸増幅反応用試薬では、本発明に係る蛍光標識プローブを含むため、蛍光を高感度で検出することができる。 Since such a reagent for nucleic acid amplification reaction includes the fluorescently labeled probe according to the present invention, fluorescence can be detected with high sensitivity.
本発明に係る核酸増幅反応方法は、
本発明に係る核酸増幅反応用試薬と核酸とを含む反応液に、熱サイクルを付与する。
The nucleic acid amplification reaction method according to the present invention comprises:
A thermal cycle is applied to the reaction solution containing the nucleic acid amplification reaction reagent and the nucleic acid according to the present invention.
このような核酸増幅反応方法では、本発明に係る核酸増幅反応用試薬を用いるため、蛍光を高感度で検出することができる。 In such a nucleic acid amplification reaction method, since the reagent for nucleic acid amplification reaction according to the present invention is used, fluorescence can be detected with high sensitivity.
本発明に係る核酸増幅反応方法は、
前記熱サイクルにおいて、アニーリング反応および伸長反応のための加熱時間は、１秒以上１０秒以下である。
The nucleic acid amplification reaction method according to the present invention comprises:
In the thermal cycle, the heating time for the annealing reaction and the extension reaction is 1 second or more and 10 seconds or less.
このような核酸増幅反応方法では、ＰＣＲの反応時間の短縮化（ＰＣＲの高速化）を図ることができる。 In such a nucleic acid amplification reaction method, the PCR reaction time can be shortened (PCR speed-up).
以下、本発明の好適な実施形態について、図面を用いて詳細に説明する。なお、以下に説明する実施形態は、特許請求の範囲に記載された本発明の内容を不当に限定するものではない。また、以下で説明される構成の全てが本発明の必須構成要件であるとは限らない。 DESCRIPTION OF EMBODIMENTS Hereinafter, preferred embodiments of the present invention will be described in detail with reference to the drawings. The embodiments described below do not unduly limit the contents of the present invention described in the claims. In addition, not all of the configurations described below are essential constituent requirements of the present invention.
１． 蛍光標識プローブ
まず、本実施形態に係る蛍光標識プローブについて説明する。図１は、本実施形態に係る蛍光標識プローブ１を説明するための図である。
1. Fluorescently labeled probe First, the fluorescently labeled probe according to this embodiment will be described. FIG. 1 is a diagram for explaining a fluorescently labeled probe 1 according to this embodiment.
蛍光標識プローブ１は、ＰＣＲにおいて、核酸の増幅量を定量するために用いられる。具体的には、蛍光標識プローブ１は、反応液からの蛍光をリアルタイムに測定するリアルタイムＰＣＲに用いられる。蛍光標識プローブ１は、例えば、加水分解プローブである。蛍光標識プローブ１は、図１に示すように、オリゴヌクレオチド２と、レポーター色素４Ｒと、クエンチャー４Ｑと、を含む。 The fluorescently labeled probe 1 is used for quantifying the amount of nucleic acid amplification in PCR. Specifically, the fluorescently labeled probe 1 is used for real-time PCR that measures fluorescence from a reaction solution in real time. The fluorescently labeled probe 1 is, for example, a hydrolysis probe. As shown in FIG. 1, the fluorescently labeled probe 1 includes an oligonucleotide 2, a reporter dye 4R, and a quencher 4Q.
オリゴヌクレオチド２は、複数のヌクレオチドがホスホジエステル結合で重合したものである。オリゴヌクレオチドを構成するヌクレオチドは、ｄＡＴＰ（Ｄｅｏｘｙａｄｅｎｏｓｉｎｅ ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、ｄＣＴＰ（Ｄｅｏｘｙｃｙｔｉｄｉｎｅ ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、ｄＧＴＰ（Ｄｅｏｘｙｇｕａｎｏｓｉｎｅ ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、またはｄＴＴＰ（Ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）である。 Oligonucleotide 2 is obtained by polymerizing a plurality of nucleotides with phosphodiester bonds. Nucleotides constituting the oligonucleotide are dATP (Deoxyadenosine triphosphate), dCTP (Deoxycydine triphosphate), dGTP (Deoxyguanosine triphosphate), or dTTP (Thymidine triphosphate).
オリゴヌクレオチド２は、標的核酸となる鋳型核酸と相補的塩基対を構成することができる塩基配列を有している。鋳型核酸は、ＤＮＡ（Ｄｅｏｘｙｒｉｂｏ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）、またはＲＮＡ（Ｒｉｂｏ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）である。 Oligonucleotide 2 has a base sequence that can form a complementary base pair with a template nucleic acid serving as a target nucleic acid. The template nucleic acid is DNA (Deoxyribo Nucleic Acid) or RNA (Ribo Nucleic Acid).
オリゴヌクレオチド２の塩基数（オリゴヌクレオチド２を構成するヌクレオチドの数）は、例えば、１０塩基以上５０塩基以下であり、好ましくは、１５塩基以上４０塩基以下である。塩基数を１５塩基以上とすることにより、ＰＣＲにおける蛍光強度を大きくすることができる。塩基数を４０塩基以下とすることにより、蛍光標識プローブ１が鋳型核酸の意図せぬ部分にハイブリダイゼーションすることを抑制することができる。 The number of bases of oligonucleotide 2 (the number of nucleotides constituting oligonucleotide 2) is, for example, 10 bases to 50 bases, and preferably 15 bases to 40 bases. By setting the number of bases to 15 bases or more, the fluorescence intensity in PCR can be increased. By setting the number of bases to 40 bases or less, hybridization of the fluorescently labeled probe 1 to an unintended portion of the template nucleic acid can be suppressed.
レポーター色素４Ｒおよびクエンチャー４Ｑは、オリゴヌクレオチド２に結合している。レポーター色素４Ｒは、例えば、一本鎖ＤＮＡにハイブリダイゼーション（アニーリング）して二本鎖構造を形成していている間、レポーター色素４Ｒに近接しているクエンチャー４Ｑによって（クエンチング効果によって）、発光が抑制されている。しかし、ポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性によって蛍光標識プローブ１が加水分解されると、クエンチング効果が解消し、レポーター色素４Ｒは、発光する。この発光により、核酸の増幅量を定量することができる。 Reporter dye 4R and quencher 4Q are bound to oligonucleotide 2. The reporter dye 4R is, for example, by a quencher 4Q that is close to the reporter dye 4R (by a quenching effect) while hybridizing (annealing) to single-stranded DNA to form a double-stranded structure, Luminescence is suppressed. However, when the fluorescently labeled probe 1 is hydrolyzed by the exonuclease activity of the polymerase, the quenching effect is eliminated and the reporter dye 4R emits light. By this luminescence, the amount of nucleic acid amplification can be quantified.
レポーター色素４Ｒおよびクエンチャー４Ｑは、オリゴヌクレオチド２を構成するヌクレオチドのうちｄＴＴＰに結合する。なお、レポーター色素４Ｒおよびクエンチャー４Ｑは、オリゴヌクレオチド２の５´末端および３´末端に限り、ｄＡＴＰにも結合することができる。図示の例では、レポーター色素４Ｒは、オリゴヌクレオチド２のうちレポーター結合ヌクレオチド２Ｒに結合し、クエンチャー４Ｑは、オリゴヌクレオチド２のうちクエンチャー結合ヌクレオチド２Ｑに結合している。 The reporter dye 4R and the quencher 4Q bind to dTTP among the nucleotides constituting the oligonucleotide 2. In addition, the reporter dye 4R and the quencher 4Q can bind to dATP only at the 5 ′ end and 3 ′ end of the oligonucleotide 2. In the illustrated example, the reporter dye 4R binds to the reporter binding nucleotide 2R of the oligonucleotide 2, and the quencher 4Q binds to the quencher binding nucleotide 2Q of the oligonucleotide 2.
レポーター色素４Ｒおよびクエンチャー４Ｑのうち少なくとも一方は、オリゴヌクレオチド２に複数結合している。図示の例では、レポーター色素４Ｒおよびクエンチャー４Ｑの各々は、オリゴヌクレオチド２に複数結合している。具体的には、オリゴヌクレオチド２に対するレポーター色素４Ｒおよびクエンチャー４Ｑの結合数は、それぞれ２である。 At least one of the reporter dye 4R and the quencher 4Q is bound to the oligonucleotide 2. In the illustrated example, each of the reporter dye 4R and the quencher 4Q is bound to the oligonucleotide 2. Specifically, the number of bonds of the reporter dye 4R and the quencher 4Q to the oligonucleotide 2 is 2, respectively.
複数のレポーター色素４Ｒのうちの１つは、５´末端のヌクレオチドに結合している。複数のクエンチャー４Ｑのうちの１つは、３´末端のヌクレオチドに結合している。なお、図示はしないが、レポーター色素４Ｒは、５´末端のヌクレオチドに結合していなくてもよいし、クエンチャー４Ｑは、３´末端のヌクレオチドに結合していなくてもよい。 One of the plurality of reporter dyes 4R is bonded to the 5 ′ terminal nucleotide. One of the plurality of quenchers 4Q is bound to the nucleotide at the 3 ′ end. Although not shown, the reporter dye 4R may not be bonded to the 5 ′ terminal nucleotide, and the quencher 4Q may not be bonded to the 3 ′ terminal nucleotide.
オリゴヌクレオチド２において、例えば、レポーター色素４Ｒとクエンチャー４Ｑとは、交互に配置されている。すなわち、オリゴヌクレオチド２において５´末端から３´末端に向かうに連れて、レポーター結合ヌクレオチド２Ｒとクエンチャー結合ヌクレオチド２Ｑとは、交互に登場する。図示の例では、オリゴヌクレオチド２において、３´末端側のレポーター結合ヌクレオチド２Ｒは、２つのクエンチャー結合ヌクレオチド２Ｑの間に位置している。５´末端側のクエンチャー結合ヌクレオチド２Ｑは、２つのレポーター結合ヌクレオチド２Ｒの間に位置している。 In the oligonucleotide 2, for example, the reporter dye 4R and the quencher 4Q are alternately arranged. That is, in the oligonucleotide 2, the reporter binding nucleotide 2R and the quencher binding nucleotide 2Q appear alternately from the 5 ′ end toward the 3 ′ end. In the illustrated example, in the oligonucleotide 2, the 3 ′ terminal reporter binding nucleotide 2R is located between two quencher binding nucleotides 2Q. The quencher-binding nucleotide 2Q on the 5 ′ end side is located between the two reporter-binding nucleotides 2R.
オリゴヌクレオチド２において、レポーター結合ヌクレオチド２Ｒと、クエンチャー４Ｑが結合するクエンチャー結合ヌクレオチド２Ｑとは、等間隔で配置されていなくてもよいが、図示の例では、等間隔で配置されている。 In the oligonucleotide 2, the reporter binding nucleotide 2R and the quencher binding nucleotide 2Q to which the quencher 4Q binds do not have to be arranged at equal intervals, but in the example shown in the figure, they are arranged at equal intervals.
オリゴヌクレオチド２において、隣り合うレポーター色素４Ｒとクエンチャー４Ｑとの間の塩基数は、例えば、１０塩基以下である。すなわち、オリゴヌクレオチド２において、レポーター結合ヌクレオチド２Ｒとクエンチャー結合ヌクレオチド２Ｑとの間には、レポーター色素４Ｒおよびクエンチャー４Ｑが結合していない未結合ヌクレオチドが８個以下存在し、レポーター結合ヌクレオチド２Ｒと、クエンチャー結合ヌクレオチド２Ｑと、ヌクレオチド２Ｒ，２Ｑ間の未結合ヌクレオチドと、の数の合計は、１０である。図示の例では、オリゴヌクレオチド２において、５´末端側のレポーター結合ヌクレオチド２Ｒと、５´末端側のクエンチャー結合ヌクレオチド２Ｑと、の間の塩基数は、１０塩基以下である。５´末端側のクエンチャー結合ヌクレオチド２Ｑと、３´末端側のレポーター結合ヌクレオチド２Ｒと、の間の塩基数は、１０塩基以下である。３´末端側のレポーター結合ヌクレオチド２Ｒと、３´末端側のクエンチャー結合ヌクレオチド２Ｑと、の間の塩基数は、１０塩基以下である。 In the oligonucleotide 2, the number of bases between the adjacent reporter dye 4R and the quencher 4Q is, for example, 10 bases or less. That is, in the oligonucleotide 2, between the reporter binding nucleotide 2R and the quencher binding nucleotide 2Q, there are 8 or less unbound nucleotides to which the reporter dye 4R and the quencher 4Q are not bound, The sum of the number of quencher bound nucleotides 2Q and unbound nucleotides between nucleotides 2R and 2Q is 10. In the illustrated example, in the oligonucleotide 2, the number of bases between the reporter binding nucleotide 2R on the 5 ′ end side and the quencher binding nucleotide 2Q on the 5 ′ end side is 10 bases or less. The number of bases between the quencher-binding nucleotide 2Q on the 5 ′ end side and the reporter-binding nucleotide 2R on the 3 ′ end side is 10 bases or less. The number of bases between the 3 ′ terminal reporter-binding nucleotide 2R and the 3 ′ terminal quencher-binding nucleotide 2Q is 10 bases or less.
なお、図示はしないが、オリゴヌクレオチド２において、レポーター結合ヌクレオチド２Ｒとクエンチャー結合ヌクレオチド２Ｑとは、隣り合っていてもよい。すなわち、レポーター結合ヌクレオチド２Ｒとクエンチャー結合ヌクレオチド２Ｑとの間の塩基数は、ゼロであってもよい。なお、１つのヌクレオチドに、レポーター色素４Ｒおよびクエンチャー４Ｑの両方を結合させてもよいが、このような結合は、蛍光強度の低下の要因になる可能性があるため、好ましくない。 Although not shown, in the oligonucleotide 2, the reporter binding nucleotide 2R and the quencher binding nucleotide 2Q may be adjacent to each other. That is, the number of bases between the reporter binding nucleotide 2R and the quencher binding nucleotide 2Q may be zero. Note that both the reporter dye 4R and the quencher 4Q may be bound to one nucleotide, but such binding is not preferable because it may cause a decrease in fluorescence intensity.
レポーター色素４Ｒとしては、例えば、ＦＡＭ、ＶＩＣ、ＨＥＸ、ＴＥＴ、ＦＩＴＣ等を用いる。クエンチャー４Ｑとしては、例えば、ＢＨＱ１、ＢＨＱ２、ＴＡＭＲＡ、ＤＡＢＣＹＬ等を用いる。 As the reporter dye 4R, for example, FAM, VIC, HEX, TET, FITC or the like is used. As the quencher 4Q, for example, BHQ1, BHQ2, TAMRA, DABCYL, or the like is used.
蛍光標識プローブ１は、例えば、以下の特徴を有する。 The fluorescently labeled probe 1 has the following features, for example.
蛍光標識プローブ１では、クエンチャー４Ｑは、オリゴヌクレオチド２に複数結合されている。そのため、蛍光標識プローブ１は、クエンチャー４Ｑが１つしかオリゴヌクレオチド２に結合されていない場合に比べて、クエンチング効果（消光効果）を高めることができる。これにより、蛍光標識プローブ１では、リアルタイムＰＣＲにおいて蛍光を測定した場合に蛍光強度のベースライン（バックグラウンド）を低下させることができる。したがって、蛍光標識プローブ１では、蛍光を高感度で検出することができる。蛍光標識プローブ１によって、例えば、迅速かつ高感度な検査（臨床診断）を行うことができる。 In the fluorescently labeled probe 1, a plurality of quenchers 4Q are bound to the oligonucleotide 2. Therefore, the fluorescence-labeled probe 1 can enhance the quenching effect (quenching effect) compared to the case where only one quencher 4Q is bound to the oligonucleotide 2. As a result, the fluorescence labeled probe 1 can reduce the baseline (background) of fluorescence intensity when fluorescence is measured in real-time PCR. Therefore, the fluorescence-labeled probe 1 can detect fluorescence with high sensitivity. With the fluorescently labeled probe 1, for example, a rapid and highly sensitive test (clinical diagnosis) can be performed.
なお、「蛍光強度のベースライン」とは、リアルタイムＰＣＲにおいて、標的核酸が増幅していない状態における蛍光強度（例えば熱サイクルを１回だけ付与した場合の蛍光強度）のことである。 The “baseline of fluorescence intensity” refers to fluorescence intensity in a state where the target nucleic acid is not amplified in real-time PCR (for example, fluorescence intensity when only one thermal cycle is applied).
蛍光標識プローブ１では、レポーター色素４Ｒは、オリゴヌクレオチド２に複数結合されている。そのため、蛍光標識プローブ１では、レポーター色素４Ｒが１つしかオリゴヌクレオチド２に結合されていない場合に比べて、リアルタイムＰＣＲにおいて蛍光を測定した場合に蛍光強度を大きくすることができる。したがって、蛍光標識プローブ１では、蛍光を高感度で検出することができる。 In the fluorescently labeled probe 1, a plurality of reporter dyes 4R are bound to the oligonucleotide 2. Therefore, in the fluorescence-labeled probe 1, the fluorescence intensity can be increased when fluorescence is measured in real-time PCR, compared to the case where only one reporter dye 4R is bound to the oligonucleotide 2. Therefore, the fluorescence-labeled probe 1 can detect fluorescence with high sensitivity.
蛍光標識プローブ１では、オリゴヌクレオチド２において、レポーター色素４Ｒとクエンチャー４Ｑとは、交互に配置されている。そのため、蛍光標識プローブ１では、レポーター色素４Ｒとクエンチャー４Ｑと間の距離を小さくすることができる。これにより、蛍光標識プローブ１は、クエンチング効果を高めることができる。例えば、後述する図４に示すように、レポーター色素４Ｒとクエンチャー４Ｑとが交互に配置されていない場合は、５´末端のレポーター色素４Ｒと、クエンチャー４Ｑと、の間の距離が大きくなってしまう場合がある。 In the fluorescently labeled probe 1, in the oligonucleotide 2, the reporter dye 4R and the quencher 4Q are alternately arranged. Therefore, in the fluorescently labeled probe 1, the distance between the reporter dye 4R and the quencher 4Q can be reduced. Thereby, the fluorescence-labeled probe 1 can enhance the quenching effect. For example, as shown in FIG. 4 described later, when the reporter dye 4R and the quencher 4Q are not alternately arranged, the distance between the 5 ′ end reporter dye 4R and the quencher 4Q is increased. May end up.
蛍光標識プローブ１では、オリゴヌクレオチド２において、隣り合うレポーター色素４Ｒとクエンチャー４Ｑとの間の塩基数は、１０塩基以下である。そのため、蛍光標識プローブ１では、オリゴヌクレオチド２において、隣り合うレポーター色素４Ｒとクエンチャー４Ｑとの間の距離を小さくすることができ、クエンチング効果を高めることができる。オリゴヌクレオチド２において、隣り合うレポーター色素４Ｒとクエンチャー４Ｑとの間の塩基数が１０塩基より大きいと、隣り合うレポーター色素４Ｒとクエンチャー４Ｑとの間の距離が大きくなり、クエンチング効果が低下する場合がある。 In the fluorescently labeled probe 1, in the oligonucleotide 2, the number of bases between the adjacent reporter dye 4R and the quencher 4Q is 10 bases or less. Therefore, in the fluorescently labeled probe 1, in the oligonucleotide 2, the distance between the adjacent reporter dye 4R and the quencher 4Q can be reduced, and the quenching effect can be enhanced. In oligonucleotide 2, if the number of bases between adjacent reporter dye 4R and quencher 4Q is greater than 10 bases, the distance between adjacent reporter dye 4R and quencher 4Q increases and the quenching effect decreases. There is a case.
なお、レポーター色素４Ｒおよびクエンチャー４Ｑのうち少なくとも一方がオリゴヌクレオチド２に複数結合していれば、オリゴヌクレオチド２に対するレポーター色素４Ｒおよびクエンチャー４Ｑの結合数は、特に限定されない。例えば図２に示すように、オリゴヌクレオチド２に対するレポーター色素４Ｒおよびクエンチャーの各々の結合数は、３であってもよい。 In addition, as long as at least one of the reporter dye 4R and the quencher 4Q is bonded to the oligonucleotide 2, the number of bonds of the reporter dye 4R and the quencher 4Q to the oligonucleotide 2 is not particularly limited. For example, as shown in FIG. 2, the number of each binding of the reporter dye 4R and the quencher to the oligonucleotide 2 may be three.
また、図３に示すように、オリゴヌクレオチド２において、レポーター色素４Ｒとクエンチャー４Ｑとは、交互に配置されていなくてもよい。 In addition, as shown in FIG. 3, in the oligonucleotide 2, the reporter dye 4R and the quencher 4Q do not have to be arranged alternately.
２． 蛍光標識プローブの変形例
次に、本実施形態の変形例に係る蛍光標識プローブについて説明する。図４は、本実施形態の変形例に係る蛍光標識プローブ１１を説明するための図である。以下、本実施形態の変形例に係る蛍光標識プローブ１１において、上述した本実施形態に係る蛍光標識プローブ１の構成部材と同様の機能を有する部材については同一の符号を付し、その詳細な説明を省略する。
2. Next, a fluorescently labeled probe according to a modified example of this embodiment will be described. FIG. 4 is a view for explaining a fluorescently labeled probe 11 according to a modification of the present embodiment. Hereinafter, in the fluorescent labeling probe 11 according to the modification of the present embodiment, members having the same functions as those of the constituent members of the fluorescent labeling probe 1 according to the present embodiment described above are denoted by the same reference numerals, and detailed description thereof is provided. Is omitted.
上述した蛍光標識プローブ１は、図１に示すように、オリゴヌクレオチド２に対するレポーター色素４Ｒの結合数と、オリゴヌクレオチド２に対するクエンチャー４Ｑの結合数とは、同じであった。 In the fluorescently labeled probe 1 described above, as shown in FIG. 1, the number of binding of the reporter dye 4R to the oligonucleotide 2 and the number of binding of the quencher 4Q to the oligonucleotide 2 were the same.
これに対し、蛍光標識プローブ１１では、図４に示すように、オリゴヌクレオチド２に対するクエンチャー４Ｑの結合数は、オリゴヌクレオチド２に対するレポーター色素４Ｒの結合数よりも多い。図示の例では、クエンチャー４Ｑの結合数は、３であり、レポーター色素４Ｒの結合数は、２である。蛍光標識プローブ１１では、オリゴヌクレオチド２において、レポーター色素４Ｒとクエンチャー４Ｑとは、交互に配置されていない。 On the other hand, in the fluorescently labeled probe 11, the binding number of the quencher 4Q to the oligonucleotide 2 is larger than the binding number of the reporter dye 4R to the oligonucleotide 2 as shown in FIG. In the illustrated example, the number of bonds of the quencher 4Q is 3, and the number of bonds of the reporter dye 4R is 2. In the fluorescently labeled probe 11, the reporter dye 4R and the quencher 4Q are not alternately arranged in the oligonucleotide 2.
蛍光標識プローブ１１では、オリゴヌクレオチド２に対するクエンチャー４Ｑの結合数は、オリゴヌクレオチド２に対するレポーター色素４Ｒの結合数よりも多い。そのため、蛍光標識プローブ１１では、例えばクエンチャー４Ｑの結合数とレポーター色素４Ｒの結合数とが同じである場合に比べて、クエンチング効果を高めることができる。 In the fluorescently labeled probe 11, the number of bindings of the quencher 4Q to the oligonucleotide 2 is larger than the number of bindings of the reporter dye 4R to the oligonucleotide 2. Therefore, in the fluorescence labeled probe 11, for example, the quenching effect can be enhanced as compared with the case where the number of bonds of the quencher 4Q and the number of bonds of the reporter dye 4R are the same.
３． 核酸増幅反応用試薬
次に、本実施形態に係る核酸増幅反応用試薬について説明する。本実施形態に係る核酸増幅反応用試薬は、本発明に係る蛍光標識プローブを含む。本実施形態に係る核酸増幅反応用試薬は、例えば、核酸増幅反応用カートリッジに収容されている。図５は、本実施形態に係る核酸増幅反応用カートリッジ１０を模式的に示す断面図である。
3. Next, the reagent for nucleic acid amplification reaction according to this embodiment will be described. The reagent for nucleic acid amplification reaction according to this embodiment includes the fluorescently labeled probe according to the present invention. The reagent for nucleic acid amplification reaction according to this embodiment is accommodated in, for example, a cartridge for nucleic acid amplification reaction. FIG. 5 is a cross-sectional view schematically showing the nucleic acid amplification reaction cartridge 10 according to the present embodiment.
核酸増幅反応用カートリッジ１０は、図５に示すように、容器１２と、キャップ１４と、を含む。 As shown in FIG. 5, the cartridge 10 for nucleic acid amplification reaction includes a container 12 and a cap 14.
容器１２は、図５に示すように、例えば、円筒状の側壁部１２ａと、半球状の底部１２ｂと、を有している。容器１２は、流路１６を有する。流路１６は、容器１２によって形成されている。流路１６は、円筒状の側壁部１２ａの中心軸（図示せず）に沿って延在している。キャップ１４は、容器１２の底部１２ｂに対向する端部の開口を塞ぐ。キャップ１４は、容器１２に対して、着脱可能である。容器１２およびキャップ１４の材質は、例えば、ガラス、高分子、金属などである。 As shown in FIG. 5, the container 12 has, for example, a cylindrical side wall portion 12a and a hemispherical bottom portion 12b. The container 12 has a flow path 16. The flow path 16 is formed by the container 12. The channel 16 extends along the central axis (not shown) of the cylindrical side wall portion 12a. The cap 14 closes the opening at the end facing the bottom 12 b of the container 12. The cap 14 can be attached to and detached from the container 12. The material of the container 12 and the cap 14 is, for example, glass, polymer, metal or the like.
容器１２の底部１２ｂに、例えば、凍結乾燥された核酸増幅反応用試薬２４が固定されている。このような核酸増幅反応用カートリッジ１０に、図６に示すようにキャップ１４を外してピペット８等を用いて鋳型核酸溶液２２を導入すると、導入された鋳型核酸溶液２２は、図７に示すように底部１２ｂまで沈降し、核酸増幅反応用試薬２４と接触する。核酸増幅反応用試薬２４は、鋳型核酸溶液２２の水分によって凍結乾燥が溶けて鋳型核酸溶液２２に取り込まれ、図８に示すように反応液２０となる。したがって、反応液２０は、鋳型核酸および核酸増幅反応用試薬２４を含むこととなり、核酸の増幅反応を進行させる場となる。 For example, a freeze-dried nucleic acid amplification reaction reagent 24 is fixed to the bottom 12 b of the container 12. When the template nucleic acid solution 22 is introduced into the cartridge 10 for nucleic acid amplification reaction 10 by removing the cap 14 and using the pipette 8 or the like as shown in FIG. 6, the introduced template nucleic acid solution 22 is as shown in FIG. To the bottom 12b and contact with the nucleic acid amplification reaction reagent 24. The nucleic acid amplification reaction reagent 24 is lyophilized by the moisture of the template nucleic acid solution 22 and taken into the template nucleic acid solution 22 to become a reaction solution 20 as shown in FIG. Accordingly, the reaction solution 20 contains the template nucleic acid and the nucleic acid amplification reaction reagent 24, and serves as a place for advancing the nucleic acid amplification reaction.
反応液２０は、核酸増幅反応用カートリッジ１０に収容され、流路１６に配置される。反応液２０は、液体３０中に液滴の状態で保持される。図示の例では、反応液２０の形状は、球状である。反応液２０は、例えば、液体３０よりも比重が大きい。反応液２０は、核酸増幅反応用カートリッジ１０の移動に伴い、流路１６を、容器１２に対して相対的に移動する。 The reaction solution 20 is accommodated in the cartridge 10 for nucleic acid amplification reaction and is disposed in the flow path 16. The reaction liquid 20 is held in the liquid 30 in the form of droplets. In the illustrated example, the shape of the reaction solution 20 is spherical. For example, the reaction liquid 20 has a specific gravity greater than that of the liquid 30. The reaction solution 20 moves relative to the container 12 through the flow path 16 as the nucleic acid amplification reaction cartridge 10 moves.
鋳型核酸溶液２２は、鋳型核酸を含む溶液である。鋳型核酸溶液２２を容器１２内に導入するときは、キャップ１４は、容器１２から取り外され、鋳型核酸溶液２２の導入後に再び容器１２に取り付けられる。 The template nucleic acid solution 22 is a solution containing a template nucleic acid. When the template nucleic acid solution 22 is introduced into the container 12, the cap 14 is removed from the container 12 and attached to the container 12 again after the template nucleic acid solution 22 is introduced.
鋳型核酸溶液２２は、例えば、次のようにして得られる。すなわち、綿棒などの採取具によって、ヒト・細菌などの生物由来の細胞あるいはウイルスなどの検体が採取され、既知の抽出手法を用いて検体から鋳型核酸が抽出される。その後、既知の精製手法を用いて、所定濃度となるように鋳型核酸溶液が精製される。なお、鋳型核酸溶液２２における溶液は、例えば、水（蒸留水、滅菌水）や、Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ（ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）溶液（ＴＥ）である。 The template nucleic acid solution 22 is obtained as follows, for example. That is, specimens such as cells or viruses derived from organisms such as humans and bacteria are collected using a collection tool such as a cotton swab, and a template nucleic acid is extracted from the specimen using a known extraction technique. Thereafter, the template nucleic acid solution is purified to a predetermined concentration using a known purification method. In addition, the solution in the template nucleic acid solution 22 is, for example, water (distilled water, sterilized water) or a Tris-EDTA (ethylenediamine acetic acid) solution (TE).
核酸増幅反応用試薬２４は、核酸増幅反応用カートリッジ１０に収容され、例えば、容器１２の底部１２ｂに凍結乾燥（フリーズドライ）されている。核酸増幅反応用試薬２４は、核酸の（標的核酸の）増幅反応に使用される試薬である。核酸増幅反応用試薬２４は、本発明に係る蛍光標識プローブ、プライマー、ポリメラーゼ、およびｄＮＴＰを含む。 The nucleic acid amplification reaction reagent 24 is accommodated in the nucleic acid amplification reaction cartridge 10, and is freeze-dried (freeze-dried) on the bottom 12b of the container 12, for example. The nucleic acid amplification reaction reagent 24 is a reagent used for a nucleic acid (target nucleic acid) amplification reaction. The nucleic acid amplification reaction reagent 24 includes the fluorescently labeled probe, primer, polymerase, and dNTP according to the present invention.
蛍光標識プローブとしては、例えば、上記の蛍光標識プローブ１や蛍光標識プローブ１１を用いる。反応液２０に含まれる蛍光標識プローブの濃度は、例えば、０．５μＭ以上５０μＭ以下であり、好ましくは３μＭ以上５０μＭ以下である。 As the fluorescently labeled probe, for example, the fluorescently labeled probe 1 or the fluorescently labeled probe 11 described above is used. The concentration of the fluorescently labeled probe contained in the reaction solution 20 is, for example, 0.5 μM or more and 50 μM or less, preferably 3 μM or more and 50 μM or less.
プライマーは、鋳型核酸にアニールするよう設計されている。核酸増幅反応用試薬２４は、二本鎖構造の鋳型核酸（二本鎖ＤＮＡ）が変性した後に、一方の一本鎖構造の鋳型核酸（一本鎖ＤＮＡ）にアニーリングするフォワードプライマー（Ｆｏｒｗａｒｄ Ｐｒｉｍｅｒ）と、他方の一本鎖ＤＮＡにアニーリングするリバースプライマー（Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｐｒｉｍｅｒ）と、を含む。反応液２０に含まれるフォワードプライマーおよびリバースプライマーの濃度は、それぞれ、例えば、０．４μＭ以上３．２μＭ以下であり、好ましくは０．８μＭ以上３．２μＭ以下である。反応液２０に含まれるフォワードプライマーの濃度とリバースプライマーの濃度とは、例えば、同じである。 The primer is designed to anneal to the template nucleic acid. The reagent for nucleic acid amplification reaction 24 is a forward primer that anneals to one of the single-stranded template nucleic acids (single-stranded DNA) after the double-stranded template nucleic acid (double-stranded DNA) is denatured. And a reverse primer (Reverse Primer) that anneals to the other single-stranded DNA. The concentration of the forward primer and the reverse primer contained in the reaction solution 20 is, for example, 0.4 μM or more and 3.2 μM or less, preferably 0.8 μM or more and 3.2 μM or less. For example, the concentration of the forward primer and the concentration of the reverse primer contained in the reaction solution 20 are the same.
ポリメラーゼとしては、特に限定されないが、ＤＮＡ（Ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）ポリメラーゼが挙げられる。ＤＮＡポリメラーゼは、一本鎖構造の鋳型核酸（一本鎖ＤＮＡ）にアニーリングしたプライマーの末端に、鋳型核酸の塩基と相補的なヌクレオチドを重合する。ＤＮＡポリメラーゼとしては、耐熱性の酵素やＰＣＲ用酵素が好ましく、例えば、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｔｆｉポリメラーゼ、Ｔｔｈポリメラーゼ、あるいはそれらの改良型など、非常に多数の市販品があるが、ホットスタートを行えるＤＮＡポリメラーゼが好ましい。反応液２０に含まれるポリメラーゼの量は、例えば、０．５Ｕ以上４Ｕ以下であり、好ましくは１Ｕ以上４Ｕ以下である。 Although it does not specifically limit as a polymerase, DNA (Deoxyribonucleic Acid) polymerase is mentioned. The DNA polymerase polymerizes a nucleotide complementary to the base of the template nucleic acid at the end of the primer annealed to the template nucleic acid having a single-stranded structure (single-stranded DNA). As the DNA polymerase, a heat-resistant enzyme or a PCR enzyme is preferable. For example, there are a large number of commercially available products such as Taq polymerase, Tfi polymerase, Tth polymerase, or improved versions thereof. Is preferred. The amount of polymerase contained in the reaction solution 20 is, for example, 0.5 U or more and 4 U or less, preferably 1 U or more and 4 U or less.
ｄＮＴＰは、４種類のデオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）の混合物を表す。すなわち、ｄＮＴＰは、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰの混合物を表す。ＤＮＡポリメラーゼは、アニーリングしたプライマーの末端に、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰをつなぎ合わせて、新たなＤＮＡを形成する。反応液２０に含まれるｄＮＴＰの濃度は、例えば、０．１２５ｍＭ以上１ｍＭ以下であり、好ましくは０．２５ｍＭ以上１ｍＭ以下である。 dNTP represents a mixture of four types of deoxyribonucleotide triphosphates. That is, dNTP represents a mixture of dATP, dCTP, dGTP, and dTTP. The DNA polymerase joins dATP, dCTP, dGTP, and dTTP to the ends of the annealed primers to form new DNA. The concentration of dNTP contained in the reaction solution 20 is, for example, 0.125 mM or more and 1 mM or less, preferably 0.25 mM or more and 1 mM or less.
なお、反応液２０は、さらに、水や緩衝液を含んでいてもよい。緩衝液に用いられる塩としては、例えば、トリス、ヘペス、ピペス、リン酸などの塩が挙げられる。 The reaction solution 20 may further contain water or a buffer solution. Examples of the salt used for the buffer include salts of Tris, Hepes, Pipes, phosphoric acid and the like.
また、鋳型核酸としてＲＮＡを用いる場合、反応液２０は、さらに、逆転写酵素を含んでいてもよい。逆転写酵素としては、例えば、アビアンミエロブラストウイルス（Ａｖｉａｎ Ｍｙｅｌｏｂｌａｓｔ Ｖｉｒｕｓ）、ラスアソシエーテッドウイルス２型（Ｒａｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ２型）、マウスモロニーミュリーンリューケミアウイルス（Ｍｏｕｓｅ Ｍｏｌｏｎｙ Ｍｕｒｉｎｅ Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｖｉｒｕｓ）、ヒト免疫不全ウイルス１型（Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｖｉｒｕｓ１型）由来の逆転写酵素を用いる。 In addition, when RNA is used as the template nucleic acid, the reaction solution 20 may further contain a reverse transcriptase. Examples of the reverse transcriptase include Avian Myeloblast Virus, Ras Associated Virus Type 2 (Ras Associated Virus Type 2), Mouse Moloney Murine Leukemia Virus (Mouse Molly Murine Leukemia Immunodeficiency) Reverse transcriptase derived from virus type 1 (Human Immunodefective Virus type 1) is used.
液体３０は、核酸増幅反応用カートリッジ１０に収容され、流路１６に配置されている。図示の例では、流路１６は、反応液２０および液体３０で充填されている（満たされている）。液体３０は、反応液２０とは混和しない、すなわち混ざり合わない液体である。液体３０は、さらに鋳型核酸溶液２２および核酸増幅反応用試薬２４とも混和しない。液体３０は、反応液２０とは比重が異なる。具体的には、液体３０は、反応液２０よりも比重が小さい。そのため、反応液２０は、重力の作用によって、重力の作用する方向に移動する。液体３０は、例えば、ジメチルシリコーンオイル、パラフィンオイルなどである。 The liquid 30 is housed in the nucleic acid amplification reaction cartridge 10 and is disposed in the flow path 16. In the illustrated example, the flow path 16 is filled (filled) with the reaction liquid 20 and the liquid 30. The liquid 30 is a liquid that is not miscible with the reaction liquid 20, that is, does not mix. The liquid 30 is not miscible with the template nucleic acid solution 22 and the nucleic acid amplification reaction reagent 24. The liquid 30 has a specific gravity different from that of the reaction liquid 20. Specifically, the liquid 30 has a specific gravity smaller than that of the reaction liquid 20. Therefore, the reaction liquid 20 moves in the direction in which gravity acts by the action of gravity. The liquid 30 is, for example, dimethyl silicone oil or paraffin oil.
なお、上記では、凍結乾燥された核酸増幅反応用試薬２４が容器１２の底部１２ｂに固定されおり、鋳型核酸溶液２２を容器１２内に導入して、鋳型核酸溶液２２が核酸増幅反応用試薬２４と接触することにより反応液２０が形成される例について説明した。しかしながら、鋳型核酸と核酸増幅反応用試薬２４とを含む溶液を、容器１２外で調製し、該溶液を、液体３０によって充填された容器１２内に導入されることで、容器１２内に反応液２０が配置されてもよい。 In the above, the freeze-dried nucleic acid amplification reaction reagent 24 is fixed to the bottom 12b of the container 12, the template nucleic acid solution 22 is introduced into the container 12, and the template nucleic acid solution 22 becomes the nucleic acid amplification reaction reagent 24. An example in which the reaction liquid 20 is formed by contacting with the liquid has been described. However, a solution containing the template nucleic acid and the nucleic acid amplification reaction reagent 24 is prepared outside the container 12, and the solution is introduced into the container 12 filled with the liquid 30, whereby the reaction solution is contained in the container 12. 20 may be arranged.
核酸増幅反応用試薬２４は、本発明に係る蛍光標識プローブを含む。そのため、核酸増幅反応用試薬２４は、蛍光を高感度で検出することができる。 The reagent for nucleic acid amplification reaction 24 includes the fluorescently labeled probe according to the present invention. Therefore, the nucleic acid amplification reaction reagent 24 can detect fluorescence with high sensitivity.
４． 核酸増幅反応装置
次に、本実施形態に係る核酸増幅反応装置について、図面を参照しながら説明する。図９および図１０は、本実施形態に係る核酸増幅反応装置１００を模式的に示す斜視図であり、図９は、蓋体６０を開いた状態を示し、図１０は、蓋体６０を閉じた状態を示している。図１１は、本実施形態に係る核酸増幅反応装置１００の本体部５０を模式的に示す分解斜視図である。図１２および図１３は、本実施形態に係る核酸増幅反応装置１００を模式的に示す図１０のＡ−Ａ線断面図である。図１４は、本実施形態に係る核酸増幅反応装置１００の機能ブロック図である。
4). Next, the nucleic acid amplification reaction apparatus according to the present embodiment will be described with reference to the drawings. 9 and 10 are perspective views schematically showing the nucleic acid amplification reaction apparatus 100 according to the present embodiment. FIG. 9 shows a state in which the lid body 60 is opened, and FIG. 10 shows the lid body 60 being closed. Shows the state. FIG. 11 is an exploded perspective view schematically showing the main body 50 of the nucleic acid amplification reaction device 100 according to the present embodiment. 12 and 13 are cross-sectional views taken along line AA of FIG. 10 schematically showing the nucleic acid amplification reaction apparatus 100 according to this embodiment. FIG. 14 is a functional block diagram of the nucleic acid amplification reaction apparatus 100 according to this embodiment.
なお、便宜上、図９では、核酸増幅反応用カートリッジ１０を簡略化して図示している。また、図９および図１０では、蛍光測定器８０の図示を省略している。また、図１２および図１３においては、矢印ｇの方向は、重力の作用する方向（重力作用方向）を示し、矢印Ｒの方向は、加熱部５２，５３の回転方向を示している。図１２では、加熱部５２，５３の配置が第１配置である状態を示し、図１３では、加熱部５２，５３の配置が第２配置である状態を示している。なお、図１４では、加熱部５２，５３以外の本体部５０、および蓋体６０の図示を省略している。 For convenience, FIG. 9 shows the nucleic acid amplification reaction cartridge 10 in a simplified manner. 9 and 10, the fluorescence measuring instrument 80 is not shown. 12 and 13, the direction of the arrow g indicates the direction in which gravity acts (the direction of gravity action), and the direction of the arrow R indicates the rotation direction of the heating units 52 and 53. FIG. 12 shows a state where the arrangement of the heating units 52 and 53 is the first arrangement, and FIG. 13 shows a state where the arrangement of the heating units 52 and 53 is the second arrangement. In addition, in FIG. 14, illustration of the main-body part 50 other than the heating parts 52 and 53 and the cover body 60 is abbreviate | omitted.
核酸増幅反応装置１００は、図９〜図１４に示すように、本体部５０と、蓋体６０と、移動機構７０と、蛍光測定器８０と、処理部９０と、操作部９２と、表示部９４と、記憶部９６と、を含む。核酸増幅反応装置１００は、さらに、核酸増幅反応用カートリッジ１０を含んでもよい。核酸増幅反応装置１００は、例えば、昇降式ＰＣＲ装置である。 As shown in FIGS. 9 to 14, the nucleic acid amplification reaction apparatus 100 includes a main body 50, a lid 60, a moving mechanism 70, a fluorescence measuring device 80, a processing unit 90, an operation unit 92, and a display unit. 94 and a storage unit 96. The nucleic acid amplification reaction apparatus 100 may further include a nucleic acid amplification reaction cartridge 10. The nucleic acid amplification reaction apparatus 100 is, for example, an elevating PCR apparatus.
本体部５０は、図１１に示すように、例えば、装着部５１と、第１加熱部５２と、第２加熱部５３と、スペーサー５４と、底板５５と、フランジ５６と、固定板５７と、を有している。 As shown in FIG. 11, the main body 50 includes, for example, a mounting part 51, a first heating part 52, a second heating part 53, a spacer 54, a bottom plate 55, a flange 56, a fixing plate 57, have.
装着部５１は、核酸増幅反応用カートリッジ１０を装着可能な構造を有している。具体的には、装着部５１は、図９に示すように、核酸増幅反応用カートリッジ１０を差し込んで（挿入して）装着する構造を有している。図１１に示す例では、装着部５１は、第１加熱部５２の第１ヒートブロック５２ｂ、スペーサー５４、および第２加熱部５３の第２ヒートブロック５３ｂを貫通する貫通孔である。装着部５１の数は、複数であってもよく、図示の例の例では、２０個である。 The mounting portion 51 has a structure in which the nucleic acid amplification reaction cartridge 10 can be mounted. Specifically, as shown in FIG. 9, the mounting portion 51 has a structure in which the cartridge 10 for nucleic acid amplification reaction is inserted (inserted). In the example shown in FIG. 11, the mounting portion 51 is a through hole that passes through the first heat block 52 b of the first heating portion 52, the spacer 54, and the second heat block 53 b of the second heating portion 53. The number of mounting parts 51 may be plural, and is 20 in the example of the illustrated example.
第１加熱部５２は、核酸増幅反応用カートリッジ１０が装着部５１に装着された場合に、図１２および図１３に示すように、流路１６の第１領域１６ａを第１温度に加熱する。図示の例では、第１加熱部５２は、第２加熱部５３よりも蓋体６０側に位置している。 When the cartridge 10 for nucleic acid amplification reaction is attached to the attachment part 51, the first heating part 52 heats the first region 16a of the flow path 16 to the first temperature as shown in FIGS. In the illustrated example, the first heating unit 52 is located closer to the lid body 60 than the second heating unit 53.
第１加熱部５２は、例えば、熱を発生させる機構と、発生した熱を核酸増幅反応用カートリッジ１０に伝える部材と、を有している。図１１に示す例では、第１加熱部５２は、第１ヒーター５２ａと、第１ヒートブロック５２ｂと、を有している。第１ヒーター５２ａは、例えば、カートリッジヒーターであり、導線５８によって図示しない外部電源に接続されている。第１ヒーター５２ａは、第１ヒートブロック５２ｂに設けられた穴に挿入されており、第１ヒーター５２ａが発熱することで第１ヒートブロック５２ｂが加熱される。第１ヒートブロック５２ｂは、第１ヒーター５２ａから発生した熱を核酸増幅反応用カートリッジ１０に伝える部材である。第１ヒートブロック５２ｂは、例えば、アルミニウム製のブロックである。流路１６の第１領域１６ａは、第１ヒートブロック５２ｂによって囲まれる領域である。 The first heating unit 52 includes, for example, a mechanism that generates heat, and a member that transmits the generated heat to the cartridge 10 for nucleic acid amplification reaction. In the example illustrated in FIG. 11, the first heating unit 52 includes a first heater 52a and a first heat block 52b. The first heater 52 a is, for example, a cartridge heater, and is connected to an external power source (not shown) by a conducting wire 58. The 1st heater 52a is inserted in the hole provided in the 1st heat block 52b, and the 1st heat block 52b is heated when the 1st heater 52a generates heat. The first heat block 52b is a member that transfers heat generated from the first heater 52a to the cartridge 10 for nucleic acid amplification reaction. The first heat block 52b is, for example, an aluminum block. The first region 16a of the flow path 16 is a region surrounded by the first heat block 52b.
第２加熱部５３は、核酸増幅反応用カートリッジ１０が装着部５１に装着された場合に、流路１６の第２領域１６ｂを、第１温度とは異なる第２温度に加熱する。第２加熱部５３は、第２ヒーター５３ａと、第２ヒートブロック５３ｂと、を有している。第２加熱部５３は、加熱する核酸増幅反応用カートリッジ１０の領域および加熱する温度が第１加熱部５２と異なる以外は、第１加熱部５２と同様の構造および機能を有している。流路１６の第２領域１６ｂは、第２ヒートブロック５３ｂによって囲まれる領域である。 The second heating unit 53 heats the second region 16b of the flow channel 16 to a second temperature different from the first temperature when the nucleic acid amplification reaction cartridge 10 is mounted to the mounting unit 51. The second heating unit 53 includes a second heater 53a and a second heat block 53b. The second heating unit 53 has the same structure and function as the first heating unit 52 except that the region of the nucleic acid amplification reaction cartridge 10 to be heated and the heating temperature are different from those of the first heating unit 52. The second region 16b of the flow path 16 is a region surrounded by the second heat block 53b.
第１加熱部５２および第２加熱部５３の温度は、図示しない温度センサー（例えば熱電対）および処理部９０によって制御される。処理部９０は、例えば、第１加熱部５２を第１温度に、第２加熱部５３を第２温度に制御することで、核酸増幅反応用カートリッジ１０の第１領域１６ａを第１温度に、第２領域１６ｂを第２温度に加熱することができる。 The temperatures of the first heating unit 52 and the second heating unit 53 are controlled by a temperature sensor (for example, a thermocouple) and a processing unit 90 (not shown). For example, the processing unit 90 controls the first heating unit 52 to the first temperature and the second heating unit 53 to the second temperature, so that the first region 16a of the nucleic acid amplification reaction cartridge 10 is set to the first temperature. The second region 16b can be heated to the second temperature.
スペーサー５４は、第１加熱部５２と第２加熱部５３との間に設けられている。スペーサー５４は、第１加熱部５２と第２加熱部５３との間を断熱する機能を有している。 The spacer 54 is provided between the first heating unit 52 and the second heating unit 53. The spacer 54 has a function of insulating between the first heating unit 52 and the second heating unit 53.
底板５５は、核酸増幅反応用カートリッジ１０を保持する部材である。底板５５は、核酸増幅反応用カートリッジ１０の高さ方向の位置を決定する。すなわち、核酸増幅反応用カートリッジ１０を底板５５に接触する位置まで差し込むことで、加熱部５２，５３に対して核酸増幅反応用カートリッジ１０を所定の位置に保持することができる。底板５５には、蛍光測定器８０からの励起光、および反応液２０の蛍光を通すための貫通孔５５ａが設けられている。 The bottom plate 55 is a member that holds the nucleic acid amplification reaction cartridge 10. The bottom plate 55 determines the position of the cartridge 10 for nucleic acid amplification reaction in the height direction. That is, the nucleic acid amplification reaction cartridge 10 can be held at a predetermined position with respect to the heating units 52 and 53 by inserting the nucleic acid amplification reaction cartridge 10 to a position where it contacts the bottom plate 55. The bottom plate 55 is provided with a through hole 55a through which excitation light from the fluorescence measuring instrument 80 and fluorescence of the reaction solution 20 pass.
フランジ５６および固定板５７は、加熱部５２，５３およびスペーサー５４を固定するための部材である。図示の例では、２枚の固定板５７がフランジ５６に嵌め合わされており、加熱部５２，５３、スペーサー５４、および底板５５は、固定板５７に固定されている。 The flange 56 and the fixing plate 57 are members for fixing the heating units 52 and 53 and the spacer 54. In the illustrated example, two fixing plates 57 are fitted to the flange 56, and the heating units 52 and 53, the spacer 54, and the bottom plate 55 are fixed to the fixing plate 57.
蓋体６０は、装着部５１を覆っている。図９に示す例では、固定板５７には磁石部６２が設けられ、蓋体６０は、磁石部６２によって本体部５０に固定されることができる。なお、スペーサー５４、底板５５、フランジ５６、固定板５７、および蓋体６０の材質は、例えば、断熱材である。 The lid 60 covers the mounting part 51. In the example shown in FIG. 9, the fixing plate 57 is provided with a magnet portion 62, and the lid body 60 can be fixed to the main body portion 50 by the magnet portion 62. The material of the spacer 54, the bottom plate 55, the flange 56, the fixing plate 57, and the lid body 60 is, for example, a heat insulating material.
移動機構７０は、処理部９０からの入力信号に基づいて、本体部５０を回転させる機構である。これにより、移動機構７０は、加熱部５２，５３を第１配置（図１２参照）と第２配置（図１３参照）とに切換えることができる。その結果、移動機構７０は、反応液２０に、核酸を増幅するための熱サイクルを付与するように、反応液２０を移動させることができる。第１配置では、第１加熱部５２が第２加熱部５３よりも、重力作用方向において下方に位置している。第２配置では、第２加熱部５３が第１加熱部５２よりも、重力作用方向において下方に位置している。移動機構７０は、例えば、図示しないモーターおよび駆動軸を有している。駆動軸は、本体部５０のフランジ５６に接続されている。駆動軸は、核酸増幅反応用カートリッジ１０の長手方向に対して垂直に設けられており、モーターを動作させると駆動軸を回転の軸として本体部５０が回転する。 The moving mechanism 70 is a mechanism that rotates the main body 50 based on an input signal from the processing unit 90. Thereby, the moving mechanism 70 can switch the heating parts 52 and 53 between the first arrangement (see FIG. 12) and the second arrangement (see FIG. 13). As a result, the moving mechanism 70 can move the reaction solution 20 so as to give the reaction solution 20 a thermal cycle for amplifying the nucleic acid. In the first arrangement, the first heating unit 52 is located below the second heating unit 53 in the direction of gravity action. In the second arrangement, the second heating unit 53 is located below the first heating unit 52 in the direction of gravity action. The moving mechanism 70 has, for example, a motor and a drive shaft (not shown). The drive shaft is connected to the flange 56 of the main body 50. The drive shaft is provided perpendicular to the longitudinal direction of the cartridge 10 for nucleic acid amplification reaction. When the motor is operated, the main body 50 rotates with the drive shaft as a rotation axis.
蛍光測定器８０は、核酸増幅反応用カートリッジ１０に収容される反応液２０の蛍光強度（蛍光輝度）を測定する測定器である。蛍光測定器８０は、図１３に示すように第２配置において、核酸増幅反応用カートリッジ１０の底部１２ｂに対して、所定距離を隔てて対向して配置されている。蛍光測定器８０は、処理部９０からの入力信号に基づいて、反応液２０に含まれる蛍光標識プローブの蛍光色素に対応する励起光Ｌを反応液２０に照射し、反応液２０で発光する蛍光強度を測定する。なお、蛍光測定器８０は、１つの蛍光色素に対応する蛍光強度を測定してもよいし、複数の蛍光色素に対応する蛍光強度を測定してもよい。 The fluorescence measuring instrument 80 is a measuring instrument that measures the fluorescence intensity (fluorescence luminance) of the reaction solution 20 accommodated in the nucleic acid amplification reaction cartridge 10. As shown in FIG. 13, the fluorescence measuring instrument 80 is arranged to face the bottom 12b of the nucleic acid amplification reaction cartridge 10 with a predetermined distance in the second arrangement. The fluorescence measuring device 80 irradiates the reaction solution 20 with excitation light L corresponding to the fluorescent dye of the fluorescently labeled probe contained in the reaction solution 20 based on the input signal from the processing unit 90, and the fluorescence emitted from the reaction solution 20. Measure strength. The fluorescence measuring instrument 80 may measure the fluorescence intensity corresponding to one fluorescent dye, or may measure the fluorescence intensity corresponding to a plurality of fluorescent dyes.
処理部９０は、図１４に示すように、例えば記憶部９６に記憶されているプログラムに従って、移動機構７０や蛍光測定器８０を制御するための処理を行う。処理部９０は、例えば、ＣＰＵ（Ｃｅｎｔｒａｌ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ Ｕｎｉｔ）などのプロセッサー等により実現される。 As illustrated in FIG. 14, the processing unit 90 performs processing for controlling the moving mechanism 70 and the fluorescence measuring device 80 according to a program stored in the storage unit 96, for example. The processing unit 90 is realized by a processor such as a CPU (Central Processing Unit), for example.
操作部９２は、ユーザーによる操作に応じた操作信号を取得し、操作信号を処理部９０に送る処理を行う。操作部９２は、例えば、ボタン、キー、タッチパネル型ディスプレイ、マイク等により実現される。 The operation unit 92 performs a process of acquiring an operation signal corresponding to an operation by the user and sending the operation signal to the processing unit 90. The operation unit 92 is realized by, for example, a button, a key, a touch panel display, a microphone, or the like.
表示部９４は、処理部９０によって生成された画像を表示する。表示部９４は、例えば、ＬＣＤ（Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｒｙｓｔａｌ Ｄｉｓｐｌａｙ）、ＣＲＴ（Ｃａｔｈｏｄｅ Ｒａｙ Ｔｕｂｅ）等により実現される。 The display unit 94 displays the image generated by the processing unit 90. The display unit 94 is realized by, for example, an LCD (Liquid Crystal Display), a CRT (Cathode Ray Tube), or the like.
記憶部９６は、処理部９０が各種の計算処理や制御処理を行うためのプログラムやデータ等を記憶している。また、記憶部９６は、処理部９０の作業領域として用いられ、処理部９０が各種プログラムに従って実行した算出結果等を一時的に記憶するためにも使用される。記憶部９６は、例えば、ＲＡＭ（Ｒａｎｄｏｍ Ａｃｃｅｓｓ Ｍｅｍｏｒｙ）等によって実現される。 The storage unit 96 stores programs, data, and the like for the processing unit 90 to perform various calculation processes and control processes. The storage unit 96 is used as a work area of the processing unit 90, and is also used for temporarily storing calculation results and the like executed by the processing unit 90 according to various programs. The storage unit 96 is realized by, for example, a RAM (Random Access Memory).
５． 核酸増幅反応方法
次に、本実施形態に係る核酸増幅反応方法について、図面を参照しながら説明する。図１５は、本実施形態に係る核酸増幅反応方法を説明するためのフローチャートである。以下では、一例として、核酸増幅反応装置１００を用いて、本発明に係る核酸増幅反応用試薬と標的核酸とを含む反応液２０において、核酸を増幅させる方法について説明する。
5. Nucleic Acid Amplification Reaction Method Next, a nucleic acid amplification reaction method according to this embodiment will be described with reference to the drawings. FIG. 15 is a flowchart for explaining the nucleic acid amplification reaction method according to this embodiment. Hereinafter, as an example, a method for amplifying a nucleic acid in the reaction solution 20 containing the nucleic acid amplification reaction reagent and the target nucleic acid according to the present invention using the nucleic acid amplification reaction apparatus 100 will be described.
まず、核酸増幅反応用カートリッジ１０を、核酸増幅反応装置１００の装着部５１に装着する（ステップＳ２）。具体的には、液体３０が充填された容器１２に反応液２０を導入した後、核酸増幅反応用カートリッジ１０を装着部５１に装着する。例えば、装着部５１に核酸増幅反応用カートリッジ１０を装着したら、蓋体６０によって装着部５１を覆う。 First, the nucleic acid amplification reaction cartridge 10 is attached to the attachment portion 51 of the nucleic acid amplification reaction apparatus 100 (step S2). Specifically, after introducing the reaction solution 20 into the container 12 filled with the liquid 30, the nucleic acid amplification reaction cartridge 10 is attached to the attachment portion 51. For example, when the nucleic acid amplification reaction cartridge 10 is attached to the attachment part 51, the attachment part 51 is covered with the lid 60.
ここで、加熱部５２，５３の配置は、図１２に示すように、第１配置である。第１配置においては、重力作用方向における流路１６の最下部に第１領域１６ａが位置する。そのため、液体３０よりも比重の大きい反応液２０は、第１領域１６ａに位置する。 Here, the arrangement of the heating units 52 and 53 is the first arrangement as shown in FIG. In the first arrangement, the first region 16a is located at the lowest part of the flow path 16 in the direction of gravity action. Therefore, the reaction liquid 20 having a higher specific gravity than the liquid 30 is located in the first region 16a.
次に、処理部９０は、操作部９２から熱サイクル処理を開始する旨の信号を受けると、加熱部５２，５３を制御して、核酸増幅反応用カートリッジ１０の第１領域１６ａおよび第２領域１６ｂを加熱させ、流路１６に温度勾配を形成する処理を行う（ステップＳ４）。具体的には、処理部９０の処理によって、第１加熱部５２は、第１領域１６ａを第１温度に加熱し、第２加熱部５３は、第２領域１６ｂを第１温度よりも低い第２温度に加熱する。これにより、流路１６の第１領域１６ａと第２領域１６ｂとの間には、第１温度と第２温度との間で温度が漸次変化する温度勾配が形成される。ここでは、加熱部５２，５３は、第１領域１６ａから第２領域１６ｂに向けて温度が低くなる温度勾配を形成する温度勾配形成部である。 Next, when the processing unit 90 receives a signal indicating that the thermal cycle processing is started from the operation unit 92, the processing unit 90 controls the heating units 52 and 53 so as to control the first region 16 a and the second region of the nucleic acid amplification reaction cartridge 10. The process which heats 16b and forms a temperature gradient in the flow path 16 is performed (step S4). Specifically, by the processing of the processing unit 90, the first heating unit 52 heats the first region 16a to the first temperature, and the second heating unit 53 sets the second region 16b lower than the first temperature. Heat to 2 temperatures. Thereby, a temperature gradient in which the temperature gradually changes between the first temperature and the second temperature is formed between the first region 16 a and the second region 16 b of the flow path 16. Here, the heating units 52 and 53 are temperature gradient forming units that form a temperature gradient in which the temperature decreases from the first region 16a toward the second region 16b.
第１温度は、２本鎖ＤＮＡの解離（変性反応）に適した温度であり、例えば、９５℃以上１１０℃以下である。第２温度は、アニーリング反応および伸長反応に適した温度であり、例えば、５０℃以上７５℃以下である。加熱部５２，５３の配置は、第１配置であるので、核酸増幅反応用カートリッジ１０を加熱すると、反応液２０は、第１温度に加熱される。 The first temperature is a temperature suitable for the dissociation (denaturation reaction) of double-stranded DNA, and is, for example, 95 ° C. or higher and 110 ° C. or lower. The second temperature is a temperature suitable for the annealing reaction and the extension reaction, and is, for example, 50 ° C. or higher and 75 ° C. or lower. Since the arrangement of the heating units 52 and 53 is the first arrangement, when the cartridge 10 for nucleic acid amplification reaction is heated, the reaction solution 20 is heated to the first temperature.
次に、処理部９０は、第１加熱部５２が第１温度に到達して第１の時間（第１の期間）が経過したら、移動機構７０を制御して、加熱部５２，５３の配置を、第１配置から第２配置へ切換える処理を行う（ステップＳ６）。処理部９０は、タイマーを内蔵していてもよい。第１の時間は、変性反応のための加熱時間であり、例えば、１秒以上１０秒以下である。具体的には、処理部９０は、移動機構７０を制御して本体部５０を１８０°回転させる。これにより、加熱部５２，５３の配置が第１の配置から第２の配置へ切換えられる。 Next, when the first heating unit 52 reaches the first temperature and the first time (first period) has elapsed, the processing unit 90 controls the moving mechanism 70 to arrange the heating units 52 and 53. Is switched from the first arrangement to the second arrangement (step S6). The processing unit 90 may incorporate a timer. The first time is a heating time for the denaturation reaction, and is, for example, 1 second or more and 10 seconds or less. Specifically, the processing unit 90 controls the moving mechanism 70 to rotate the main body 50 by 180 degrees. Thereby, arrangement | positioning of the heating parts 52 and 53 is switched from 1st arrangement | positioning to 2nd arrangement | positioning.
第２の配置は、図１３に示すように、第２領域１６ｂを重力作用方向において流路１６の最下部に位置させる配置である。第２配置では、第１領域１６ａと第２領域１６ｂとの重力作用方向における位置関係が第１配置とは逆になる。そのため、反応液２０は、重力の作用によって第１領域１６ａから第２領域１６ｂへと移動する。処理部９０は、加熱部５２，５３の配置を第２配置とした後に移動機構７０の動作を第２の時間（第２の期間）停止させる。これにより、加熱部５２，５３の配置は、第２の時間、第２配置に保持される。第２の時間は、アニーリング反応および伸長反応のための加熱時間であり、１秒以上１０秒以下である。 As shown in FIG. 13, the second arrangement is an arrangement in which the second region 16b is positioned at the lowest part of the flow path 16 in the direction of gravity action. In the second arrangement, the positional relationship between the first area 16a and the second area 16b in the direction of gravity is opposite to that in the first arrangement. Therefore, the reaction solution 20 moves from the first region 16a to the second region 16b by the action of gravity. The processing unit 90 stops the operation of the moving mechanism 70 for the second time (second period) after the arrangement of the heating units 52 and 53 is changed to the second arrangement. Thereby, arrangement | positioning of the heating parts 52 and 53 is hold | maintained to 2nd arrangement | positioning for 2nd time. The second time is a heating time for the annealing reaction and the extension reaction, and is 1 second or more and 10 seconds or less.
次に、処理部９０は、第１配置から第２配置へ切換えた回数（サイクル数）が、予め記憶部９６に記憶されている所定の回数に達したか否か判定する処理を行う（ステップＳ８）。処理部９０は、第１配置から第２配置への切換えを行うたびに、サイクル数を記憶部９６に記憶させ、該サイクル数と、予め記憶部９６に記憶されている所定の回数と、を比較する。 Next, the processing unit 90 performs a process of determining whether or not the number of times of switching from the first arrangement to the second arrangement (the number of cycles) has reached a predetermined number stored in the storage unit 96 in advance (step) S8). Each time the processing unit 90 switches from the first arrangement to the second arrangement, the processing unit 90 stores the number of cycles in the storage unit 96, and the number of cycles and a predetermined number of times stored in the storage unit 96 in advance. Compare.
処理部９０は、ステップＳ８においてサイクル数が所定の回数に達したと判定した場合（図１５において「Ｙｅｓ」の場合）、処理を終了する。 If the processing unit 90 determines in step S8 that the number of cycles has reached a predetermined number (in the case of “Yes” in FIG. 15), the processing unit 90 ends the processing.
一方、処理部９０は、ステップＳ８においてサイクル数が所定の回数に達していないと判定した場合（図１５において「Ｎｏ」の場合）、ステップＳ１０に移行する。ステップＳ１０では、処理部９０は、移動機構７０を制御して、加熱部５２，５３の配置を、第２配置から第１配置へ切換える処理を行う。処理部９０は、加熱部５２，５３の配置を第１配置とした後に移動機構７０の動作を、第１の時間停止させる。 On the other hand, when determining that the number of cycles has not reached the predetermined number in step S8 (in the case of “No” in FIG. 15), the processing unit 90 proceeds to step S10. In step S10, the processing unit 90 controls the moving mechanism 70 to perform processing for switching the arrangement of the heating units 52 and 53 from the second arrangement to the first arrangement. The processing unit 90 stops the operation of the moving mechanism 70 for the first time after the heating units 52 and 53 are arranged in the first arrangement.
そして、処理部９０は、再び、ステップＳ６へ移行し、加熱部５２，５３の配置を第１配置から第２配置へ切換える。 And the process part 90 transfers to step S6 again, and switches arrangement | positioning of the heating parts 52 and 53 from 1st arrangement to 2nd arrangement.
以上のように、処理部９０は、サイクル数が所定の回数となるまで、第１配置と第２配置との位置を入れ替えながら加熱部５２，５３を（本体部５０を）回転させることにより、反応液２０を流路１６において往復運動させる。これにより、核酸増幅反応装置１００は、反応液２０に、核酸を増幅するための熱サイクルを付与することができる。 As described above, the processing unit 90 rotates the heating units 52 and 53 (the main body unit 50) while exchanging the positions of the first arrangement and the second arrangement until the number of cycles reaches a predetermined number. The reaction solution 20 is reciprocated in the flow path 16. Thereby, the nucleic acid amplification reaction apparatus 100 can give the reaction solution 20 a thermal cycle for amplifying the nucleic acid.
処理部９０は、さらに、上記の熱サイクル処理と同時期に増幅解析処理を行う。これにより、核酸増幅反応装置１００では、リアルタイムＰＣＲを行うことができる。具体的には、処理部９０は、加熱部５２，５３の配置を第２配置に保持するごとに蛍光測定器８０に対して測定指示を与えるための信号を入力する。そして、処理部９０は、蛍光測定器８０の測定結果として蛍光測定器８０から蛍光強度を取得し、該蛍光強度を記憶部９６に記憶する。 The processing unit 90 further performs an amplification analysis process at the same time as the thermal cycle process. Thereby, in the nucleic acid amplification reaction apparatus 100, real-time PCR can be performed. Specifically, the processing unit 90 inputs a signal for giving a measurement instruction to the fluorescence measuring instrument 80 every time the arrangement of the heating units 52 and 53 is held in the second arrangement. Then, the processing unit 90 acquires the fluorescence intensity from the fluorescence measuring device 80 as a measurement result of the fluorescence measuring device 80 and stores the fluorescence intensity in the storage unit 96.
さらに、処理部９０は、操作部９２から入力される信号に基づいて、繰り返すべきサイクル数として設定される回数分の蛍光強度を記憶部９６から読み出し、該蛍光強度に基づいてサイクル数に対する蛍光強度の推移を示す増幅曲線を生成してもよい。処理部９０は、該増幅曲線に基づいて核酸の増幅効率に対する良否を判定し、判定結果や増幅曲線を表示部９４に表示させてもよい。 Further, the processing unit 90 reads out the fluorescence intensity for the number of cycles set as the number of cycles to be repeated based on the signal input from the operation unit 92 from the storage unit 96, and based on the fluorescence intensity, the fluorescence intensity with respect to the cycle number An amplification curve indicating the transition of the number may be generated. The processing unit 90 may determine whether the nucleic acid amplification efficiency is acceptable based on the amplification curve, and may display the determination result and the amplification curve on the display unit 94.
なお、上記では、ステップＳ８において、処理部９０は、サイクル数が所定の回数に達したか否かを判定したが、処理部９０は、取得した蛍光強度が、予め記憶部９６に記憶された所定値に達しか否かを判定してもよい。そして、処理部９０は、取得した蛍光強度が所定値に到達したと判定した場合は、処理を終了し、取得した蛍光強度が所定値に到達していないと判定した場合は、ステップＳ１０に移行してもよい。 In the above description, in step S8, the processing unit 90 determines whether or not the number of cycles has reached a predetermined number. However, the processing unit 90 stores the acquired fluorescence intensity in the storage unit 96 in advance. It may be determined whether or not a predetermined value is reached. If the processing unit 90 determines that the acquired fluorescence intensity has reached a predetermined value, the processing unit 90 ends the process. If the processing unit 90 determines that the acquired fluorescence intensity has not reached the predetermined value, the process proceeds to step S10. May be.
また、上記では、第２温度をアニーリング反応および伸長反応のための温度としたが、第２温度を、アニーリング反応および伸長反応のいずれか一方の反応のための温度とし、第２の時間を、アニーリング反応および伸長反応のいずれか一方の反応のための加熱時間としてもよい。この場合、図示はしないが、核酸増幅反応装置１００は、流路１６の第３領域（第１領域および第２領域と異なる領域）を、第３温度（第１温度および第２温度と異なる温度）に加熱する第３加熱部を有している。第３温度は、アニーリング反応および伸長反応の他方の反応のための温度であり、第３の時間は、アニーリング反応および伸長反応の他方の反応のための加熱時間である。ただし、ＰＣＲの高速化のためには、第２温度を、アニーリング反応および伸長反応のための温度とすることが好ましい。 In the above description, the second temperature is the temperature for the annealing reaction and the extension reaction. However, the second temperature is the temperature for one of the annealing reaction and the extension reaction, and the second time is The heating time for either the annealing reaction or the extension reaction may be used. In this case, although not shown, the nucleic acid amplification reaction apparatus 100 causes the third region (a region different from the first region and the second region) of the flow path 16 to be moved to a third temperature (a temperature different from the first temperature and the second temperature). ) Has a third heating section for heating. The third temperature is a temperature for the other reaction of the annealing reaction and the extension reaction, and the third time is a heating time for the other reaction of the annealing reaction and the extension reaction. However, in order to increase the speed of PCR, the second temperature is preferably set to a temperature for the annealing reaction and the extension reaction.
本実施形態に係る核酸増幅反応方法では、本発明に係る核酸増幅反応用試薬（例えば核酸増幅反応用試薬２４）と標的核酸（鋳型核酸）とを含む反応液２０に熱サイクルを付与する。そのため、本実施形態に係る核酸増幅反応方法では、反応液２０からの蛍光を高感度で検出することができる。 In the nucleic acid amplification reaction method according to the present embodiment, a thermal cycle is applied to the reaction solution 20 containing the nucleic acid amplification reaction reagent (for example, the nucleic acid amplification reaction reagent 24) and the target nucleic acid (template nucleic acid) according to the present invention. Therefore, in the nucleic acid amplification reaction method according to this embodiment, the fluorescence from the reaction solution 20 can be detected with high sensitivity.
ここで、図１６は、鋳型核酸をアデノウィルスとしたＰＣＲの結果を示すグラフである。本実験では、オリゴヌクレオチドに、レポーター色素およびクエンチャーが１つずつ結合した蛍光標識プローブ（参考例に係る蛍光標識プローブ）を用いた。本実験では、第１の時間（変性反応のための時間）を５秒、第２の時間（アニーリング反応および伸長反応のための時間）を２０秒とした標準条件と、第１の時間を４秒、第２の時間を６秒とした高速条件と、の２種類の条件において、リアルタイムＰＣＲを行った。図１６に示すように、高速条件および標準条件で４回ずつＰＣＲを行った。図１６において、横軸は、熱サイクルのサイクル数を示し、縦軸は、蛍光測定器で測定した蛍光強度を示している。 Here, FIG. 16 is a graph showing the results of PCR using the template nucleic acid as an adenovirus. In this experiment, a fluorescently labeled probe (fluorescently labeled probe according to a reference example) in which a reporter dye and a quencher are bonded to the oligonucleotide one by one was used. In this experiment, a standard condition in which the first time (time for denaturation reaction) was 5 seconds, the second time (time for annealing reaction and extension reaction) was 20 seconds, and the first time was 4 Real-time PCR was performed under two types of conditions: a second and a high-speed condition where the second time was 6 seconds. As shown in FIG. 16, PCR was performed 4 times each under high speed conditions and standard conditions. In FIG. 16, the horizontal axis indicates the number of thermal cycles, and the vertical axis indicates the fluorescence intensity measured with a fluorescence measuring instrument.
図１７は、図１６におけるＰＣＲにおいて、高速条件の熱サイクルを５０回付与した反応液と、標準条件の熱サイクルを５０回付与した反応液と、の電気泳動の結果である。 FIG. 17 shows the results of electrophoresis of the reaction solution given 50 high-speed thermal cycles and the reaction solution given 50 standard thermal cycles in the PCR of FIG.
図１６に示すように、高速条件では、標準条件に比べて、蛍光強度が低下した。一方、図１７に示すように、高速条件と標準条件とにおいて、電気泳動評価における差異は確認できなかった。このことから、高速条件の蛍光強度が標準条件の蛍光強度よりも低いことは、核酸が増幅されていないのではなく、核酸と蛍光標識プローブとが十分にハイブリダイゼーションできていないことが要因であると考えられる。 As shown in FIG. 16, the fluorescence intensity decreased under the high speed condition as compared with the standard condition. On the other hand, as shown in FIG. 17, no difference in electrophoretic evaluation could be confirmed between the high speed condition and the standard condition. From this, the fluorescence intensity under the high speed condition is lower than the fluorescence intensity under the standard condition because the nucleic acid is not amplified and the nucleic acid and the fluorescently labeled probe are not sufficiently hybridized. it is conceivable that.
本実施形態に係る核酸増幅反応方法では、本発明に係る核酸増幅反応用試薬を用いるので、第２の時間（アニーリング反応および伸長反応のための時間）が１秒以上１０秒以下という高速条件において、核酸と蛍光標識プローブとが十分にハイブリダイゼーションできていなくても、反応液からの蛍光を高感度で検出することができる。したがって、本実施形態に係る核酸増幅反応方法では、高速条件のＰＣＲにおいて、特に有効であるといえる。 In the nucleic acid amplification reaction method according to this embodiment, since the reagent for nucleic acid amplification reaction according to the present invention is used, the second time (time for annealing reaction and extension reaction) is 1 second to 10 seconds at high speed. Even if the nucleic acid and the fluorescently labeled probe are not sufficiently hybridized, the fluorescence from the reaction solution can be detected with high sensitivity. Therefore, it can be said that the nucleic acid amplification reaction method according to the present embodiment is particularly effective in high-speed PCR.
さらに、本実施形態に係る核酸増幅反応方法では、第２の時間を１０秒以下とすることで、ＰＣＲの反応時間の短縮化を図ることができる。また、第２の時間を１秒以上とすることで、核酸増幅反応装置や核酸増幅反応用カートリッジの設計が容易となり、設計の自由度を高めることができる。第２の時間を１秒未満とすると、核酸増幅反応装置や核酸増幅反応用カートリッジの設計が困難となる場合がある。 Furthermore, in the nucleic acid amplification reaction method according to the present embodiment, the PCR reaction time can be shortened by setting the second time to 10 seconds or less. In addition, by setting the second time to 1 second or longer, the design of the nucleic acid amplification reaction apparatus and the cartridge for nucleic acid amplification reaction is facilitated, and the degree of design freedom can be increased. If the second time is less than 1 second, it may be difficult to design a nucleic acid amplification reaction apparatus or a cartridge for nucleic acid amplification reaction.
本発明は、本願に記載の特徴や効果を有する範囲で一部の構成を省略したり、各実施形態や変形例を組み合わせたりしてもよい。 In the present invention, a part of the configuration may be omitted within a range having the characteristics and effects described in the present application, or each embodiment or modification may be combined.
本発明は、実施の形態で説明した構成と実質的に同一の構成（例えば、機能、方法及び結果が同一の構成、あるいは目的及び効果が同一の構成）を含む。また、本発明は、実施の形態で説明した構成の本質的でない部分を置き換えた構成を含む。また、本発明は、実施の形態で説明した構成と同一の作用効果を奏する構成又は同一の目的を達成することができる構成を含む。また、本発明は、実施の形態で説明した構成に公知技術を付加した構成を含む。 The present invention includes configurations that are substantially the same as the configurations described in the embodiments (for example, configurations that have the same functions, methods, and results, or configurations that have the same objects and effects). In addition, the invention includes a configuration in which a non-essential part of the configuration described in the embodiment is replaced. In addition, the present invention includes a configuration that exhibits the same operational effects as the configuration described in the embodiment or a configuration that can achieve the same object. Further, the invention includes a configuration in which a known technique is added to the configuration described in the embodiment.
１…蛍光標識プローブ、２…オリゴヌクレオチド、２Ｑ…クエンチャー結合ヌクレオチド、２Ｒ…レポーター結合ヌクレオチド、４Ｑ…クエンチャー、４Ｒ…レポーター色素、８…ピペット、１０…核酸増幅反応用カートリッジ、１１…蛍光標識プローブ、１２…容器、１２ａ…側壁部、１２ｂ…底部、１４…キャップ、１６…流路、１６ａ…第１領域、１６ｂ…第２領域、２０…反応液、２２…鋳型核酸溶液、２４…核酸増幅反応用試薬、３０…液体、５０…本体部、５１…装着部、５２…第１加熱部、５２ａ…第１ヒーター、５２ｂ…第１ヒートブロック、５３…第２加熱部、５３ａ…第２ヒーター、５３ｂ…第２ヒートブロック、５４…スペーサー、５５…底板、５５ａ…貫通孔、５６…フランジ、５７…固定板、５８…導線、６０…蓋体、６２…磁石部、７０…移動機構、８０…蛍光測定器、９０…処理部、９２…操作部、９４…表示部、９６…記憶部、１００…核酸増幅反応装置 DESCRIPTION OF SYMBOLS 1 ... Fluorescent label probe, 2 ... Oligonucleotide, 2Q ... Quencher binding nucleotide, 2R ... Reporter binding nucleotide, 4Q ... Quencher, 4R ... Reporter dye, 8 ... Pipette, 10 ... Nucleic acid amplification reaction cartridge, 11 ... Fluorescent label Probe, 12 ... Container, 12a ... Side wall, 12b ... Bottom, 14 ... Cap, 16 ... Channel, 16a ... First region, 16b ... Second region, 20 ... Reaction solution, 22 ... Template nucleic acid solution, 24 ... Nucleic acid Reagent for amplification reaction, 30 ... liquid, 50 ... main body part, 51 ... mounting part, 52 ... first heating part, 52a ... first heater, 52b ... first heat block, 53 ... second heating part, 53a ... second Heater, 53b ... second heat block, 54 ... spacer, 55 ... bottom plate, 55a ... through hole, 56 ... flange, 57 ... fixing plate, 58 ... conductor, 60 ... Body, 62 ... magnet portion, 70 ... moving mechanism, 80 ... fluorometer, 90 ... processing unit, 92 ... operation unit, 94 ... display unit, 96 ... storage unit, 100 ... nucleic acid amplification reaction device
Claims (9)
前記オリゴヌクレオチドに結合されたレポーター色素と、
前記オリゴヌクレオチドに結合されたクエンチャーと、
を含み、
前記レポーター色素および前記クエンチャーのうち少なくとも一方は、前記オリゴヌクレオチドに複数結合されている、蛍光標識プローブ。 An oligonucleotide;
A reporter dye bound to the oligonucleotide;
A quencher attached to the oligonucleotide;
Including
A fluorescently labeled probe in which at least one of the reporter dye and the quencher is bound to the oligonucleotide.
前記クエンチャーは、前記オリゴヌクレオチドに複数結合されている、蛍光標識プローブ。 In claim 1,
A fluorescence-labeled probe in which a plurality of the quenchers are bound to the oligonucleotide.
前記レポーター色素は、前記オリゴヌクレオチドに複数結合されている、蛍光標識プローブ。 In claim 1 or 2,
A fluorescently labeled probe, wherein a plurality of the reporter dyes are bound to the oligonucleotide.
前記オリゴヌクレオチドに対する前記クエンチャーの結合数は、前記オリゴヌクレオチドに対する前記レポーター色素の結合数よりも多い、蛍光標識プローブ。 In any one of Claims 1 thru | or 3,
The fluorescently labeled probe, wherein the number of binding of the quencher to the oligonucleotide is greater than the number of binding of the reporter dye to the oligonucleotide.
前記オリゴヌクレオチドにおいて、前記レポーター色素と前記クエンチャーとは、交互に配置されている、蛍光標識プローブ。 In any one of Claims 1 thru | or 4,
The fluorescently labeled probe in which the reporter dye and the quencher are alternately arranged in the oligonucleotide.
前記オリゴヌクレオチドにおいて、隣り合う前記レポーター色素と前記クエンチャーとの間の塩基数は、１０塩基以下である、蛍光標識プローブ。 In claim 5,
In the oligonucleotide, the number of bases between the adjacent reporter dye and the quencher is 10 or less bases.
前記熱サイクルにおいて、アニーリング反応および伸長反応のための加熱時間は、１秒以上１０秒以下である、核酸増幅反応方法。 In claim 8,
The nucleic acid amplification reaction method, wherein a heating time for the annealing reaction and the extension reaction is 1 second or more and 10 seconds or less in the thermal cycle.
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