JP2017203822A - 照明設定方法、シート照明顕微鏡装置、及びプログラム - Google Patents

Abstract

【課題】光シート照明のための適切な照明設定を容易に行うことができる技術を提供する。【解決手段】照明光学系から出射した光シートが照射された試料の画像を取得する。取得した試料の画像に基づいて、照明光学系から出射される光シートの幅方向についての従属光線角度を決定する。さらに、決定した従属光線角度に従って、照明光学系の設定を行う。【選択図】図２

Description

本発明の開示は、照明設定方法、シート照明顕微鏡装置、及びプログラムに関する。

蛍光顕微鏡の分野では、検出光学系の光軸に直交する方向から試料にレーザ光を照射して、試料中に検出光学系の光軸と直交する光シートを形成する技術が知られている。この技術は、試料に与えるダメージを抑えることができる、高い縦分解能を実現できるなどのメリットがあり、近年、注目を集めている。

上記の技術では、試料を検出光学系の光軸方向とは異なる方向から照明するため、試料中に吸収により光が透過しにくい部分や光が散乱する部分（以降、これらをまとめて遮光部分と記す）が含まれている場合には、その遮光部分の後方に光が入射せず、視野内に縞状の影ができてしまう。

関連技術は、例えば、特許文献１に記載されている。特許文献１には、ウォブル板やスイング・ミラーの振動運動により、時間によって異なる角度で標本物質にシート光の放射成分を照射する技術が記載されている。

特開２００８−２５０３０３号公報

縞を効果的に抑制し得る照明設定は、縞の原因物質（つまり、遮光部分）の大きさによって異なる。縞を抑制する効果（以降、縞消し効果と記す）に着目すると、大きな原因物質が存在するほど大きな角度で試料が照明されるように、照明設定を行うことが望ましい。一方で、照明設定は基本的な照明性能にも当然に影響する。例えば、大きな角度で試料を照明するほど、照明効率、照明の均一性などが低下する傾向にある。従って、照明設定は、照明性能と縞消し効果のバランスを取りながら、観察対象に応じて適宜設定されることが望ましい。

以上のような実情を踏まえ、本発明の一側面は、光シート照明のための適切な照明設定を容易に行うことができる技術を提供することを目的とする。

本発明の一側面に係る照明設定方法は、照明光学系から出射した光シートが照射された試料の画像を取得することと、取得した前記試料の画像に基づいて、前記照明光学系から出射される光シートの幅方向についての従属光線角度を決定することと、決定した前記従属光線角度に従って、前記照明光学系の設定を行うことを含む。

本発明の別の一側面に係る照明設定方法は、照明光学系により光シートが照射された試料の画像を取得することと、取得した前記試料の画像に基づいて、前記照明光学系から出射される光シートの主光線が前記試料に入射する入射角度を決定することと、決定した前記入射角度に従って、前記照明光学系の設定又は前記試料の向きの設定の少なくとも一方を行うことを含む。

本発明の更に別の一側面に係る照明設定方法は、コンピュータが、照明光学系により光シートが照射された試料の画像を撮像装置から取得し、前記撮像装置から取得した前記試料の画像に基づいて、前記照明光学系から出射される光シートの幅方向についての従属光線角度を決定し、決定した前記従属光線角度に応じた前記照明光学系の設定を指示する制御信号を出力する。

本発明の更に別の一側面に係るシート照明顕微鏡装置は、試料に光シートを照射する照明光学系と、前記照明光学系で光シートが照射された前記試料の画像を取得する撮像装置と、前記撮像装置で取得した前記試料の画像に基づいて、前記照明光学系から出射される光シートの幅方向についての従属光線角度を決定する制御装置と、前記制御装置で決定した前記従属光線角度に従って、前記照明光学系の設定を行う設定装置と、を備える。

本発明の更に別の一側面に係るプログラムは、コンピュータに、照明光学系により光シートが照射された試料の画像を撮像装置から取得する処理と、前記撮像装置から取得した前記試料の画像に基づいて、前記照明光学系から出射される光シートの幅方向についての従属光線角度を決定する処理と、決定した前記従属光線角度に応じた前記照明光学系の設定を指示する制御信号を出力する処理と、を実行させる。

本発明の一側面によれば、光シート照明のための適切な照明設定を容易に行うことができる。

第１の実施形態に係るシート照明顕微鏡装置の概略構成を例示した図である。 第１の実施形態に係る照明処理の手順を示すフローチャートである。 従属光線角度が小さな光シートを照射するときの走査範囲を例示した図である。 従属光線角度が大きな光シートを照射するときの走査範囲を例示した図である。 第１の実施形態に係るシート照明顕微鏡装置と照明光束を光シートの厚さ方向から見た図である。 第１の実施形態に係るシート照明顕微鏡装置と照明光束を光シートの幅方向から見た図である。 第１の実施形態に係る制御装置のハードウェアの構成を例示した図である。 第１の実施形態に係る制御装置の機能構成を例示した図である。 第１の実施形態に係る照明設定処理の手順を示すフローチャートである。 第１の実施形態に係る画像取得処理の手順を示すフローチャートである。 第２の実施形態に係る制御装置の機能構成を例示した図である。 第２の実施形態に係る照明設定処理の手順を示すフローチャートである。 第２の実施形態に係る照明設定処理の別の手順を示すフローチャートである。 第２の実施形態に係る幅算出処理の別の手順を示すフローチャートである。 第３の実施形態に係る制御装置の機能構成を例示した図である。 第３の実施形態に係る照明設定処理の手順を示すフローチャートである。 第３の実施形態に係る縞特定処理の手順を示すフローチャートである。 第３の実施形態に係る縞特定処理の別の手順を示すフローチャートである。 第４の実施形態に係る制御装置の機能構成を例示した図である。 第４の実施形態に係る照明設定処理の手順を示すフローチャートである。 第５の実施形態に係る制御装置の機能構成を例示した図である。 第５の実施形態に係る照明設定処理の手順を示すフローチャートである。 第５の実施形態に係る照明設定処理中に表示される画面例を示した図である。 第６の実施形態に係るシート照明顕微鏡装置と照明光束を光シートの厚さ方向から見た図である。 第６の実施形態に係るシート照明顕微鏡装置と照明光束を光シートの幅方向から見た図である。 第６の実施形態に係る照明設定処理の手順を示すフローチャートである。 第６の実施形態に係る入射角決定処理の手順を示すフローチャートである。

［第１の実施形態］
図１は、第１の実施形態に係るシート照明顕微鏡装置１の概略構成を例示した図である。シート照明顕微鏡装置１は、例えば、生体標本などの試料Ｓからの蛍光を検出する蛍光顕微鏡であり、光シートで試料Ｓを照明するように構成されている。

シート照明顕微鏡装置１は、試料Ｓに光シートを照射する照明光学系１０と、試料Ｓからの検出光（例えば、蛍光）を撮像装置３０へ導く検出光学系２０と、試料Ｓの画像を取得する撮像装置３０と、シート照明顕微鏡装置１を制御する制御装置４０と、照明光学系１０の設定を行う設定装置６０を備えている。試料Ｓは、照明光学系１０の光軸と検出光学系２０の光軸が交わる位置の辺りに配置される。

照明光学系１０は、検出光学系２０の光軸と略直交するシート形状を有する光シートを形成し、その光シートを検出光学系２０の光軸と略直交する方向から試料Ｓに照射するように構成されている。照明光学系１０の詳細については、後述する。

ここで、光シートとは、シート形状の照明領域を形成する照明光のことである。シート形状とは、照明光の進行方向（照明光学系１０の射出側の光軸方向）に対して直交する照明光の断面（以降、光束断面と記す）が、互いに直交する一方向に長く他方向に短い二次元形状を有する形状をいう。以降では、光束断面内での長さが長い方向を光シートの幅方向、短い方向を光シートの厚さ方向と記す。また、検出光学系２０の光軸と略直交するシート形状とは、進行方向と幅方向で定義される光シート面が検出光学系２０の光軸と略直交するようなシート形状をいう。また、略直交するとは、直交した状態から当業者が設定上又は製造上の誤差と認識し得るような範囲をいう。本実施形態では、進行方向はｘ軸方向、幅方向はｙ軸方向、厚さ方向はｚ軸方向と定義する。この点は他の実施形態でも同様である。

検出光学系２０は、試料Ｓからの光（例えば、蛍光など。以降、検出光と記す）を集光して、試料Ｓの光学像を撮像装置３０の受光面に形成する光学系である。撮像装置３０は、ＣＣＤ（Charge Coupled Device）、ＣＭＯＳ（Complementary Metal Oxide Semiconductor）などの２次元イメージセンサを備えたデジタルカメラであり、照明光学系１０によって光シートが照射された試料Ｓの画像を取得し、試料Ｓの画像データを制御装置４０へ出力する。

制御装置４０は、シート照明顕微鏡装置１を制御する顕微鏡コントローラである。制御装置４０は、シート照明顕微鏡装置１の顕微鏡本体に設けられた各種電動機構に制御信号を出力するように構成されている。設定装置６０は、制御装置４０からの制御信号に従って動作する顕微鏡本体の電動機構の一つであり、照明光学系１０の設定を行う装置である。
図２は、第１の実施形態に係る照明処理の手順を示すフローチャートである。図２を参照しながら、シート照明顕微鏡装置１が行う照明処理について概説する。

シート照明顕微鏡装置１は、まず、照明光学系１０から出射した光シートが照射された試料Ｓの画像を取得する（ステップＳ１）。ここでは、照明光学系１０が試料Ｓに光シートを照射し、撮像装置３０が試料Ｓを撮像し試料Ｓの画像データを生成する。生成された試料Ｓの画像データは、制御装置４０へ出力される。

次に、シート照明顕微鏡装置１は、取得した画像に基づいて、光シートの幅方向についての従属光線角度を決定する（ステップＳ２）。なお、従属光線角度とは、照明光学系１０の射出側の光軸と照明光学系１０から出射した光シートの従属光線とがなす最大角度のことである。また、幅の方向についての従属光線角度とは、光シートの幅方向と進行方向を含む断面における従属光線角度のことである。

光シート照明では、試料Ｓが照明領域内に遮光部分を有していると、その後方に縞状の影ができてしまう。しかしながら、光シートの従属光線角度が０度以上であれば、遮光部分の後方の領域に光が回り込むことができるため、縞状の影を抑制することができる。そして、光シートが大きな従属光線角度を有しているほど、遮光部分により近い領域にまで光が回り込むことができるため、縞状の影をより効果的に抑制することができる。

一方で、図３及び図４に示すように、観察範囲Ｒに対して均一な照明を実現するためには、従属光線角度が大きな光シートＬ２を照射する場合には、従属光線角度が小さな光シートＬ１を照射する場合に比べて、走査幅が広くなってしまう。このため、照明効率が低下し、画像取得に時間がかかってしまう。

従って、従属光線角度は、縞消し効果と照明性能とのバランスを考慮して決定されることが望ましく、縞消し効果を重視する場合であっても、縞状の影を観察者が許容できる程度に抑制する限りにおいて、小さな角度に設定することが望ましい。

ただし、縞状の影の大きさは遮光部分の大きさによって異なり、遮光部分の大きさは試料（より詳細には、試料中の観察部分）によって異なる。このため、観察者の要求を満たすことができる従属光線角度も、試料に応じて異なる。そこで、ステップＳ２では、制御装置４０が、撮像装置３０で取得した光シートが照射された試料Ｓの画像に基づいて、照明光学系１０から出射される光シートの幅方向についての従属光線角度を決定する。さらに、制御装置４０は、決定した従属光線角度に応じた照明光学系１０の設定を指示する制御信号を、設定装置６０に出力する。なお、従属光線角度の決定方法の詳細については後述する。

従属光線角度が決定されると、シート照明顕微鏡装置１は、決定した従属光線角度に従って、照明光学系１０の設定を行い（ステップＳ３）、光シートを試料に照射する（ステップＳ４）。ここでは、設定装置６０が、制御装置４０から出力された制御信号に従って、照明光学系１０の設定を行う。即ち、設定装置６０は、制御装置４０で決定した従属光線角度に従って、照明光学系１０の設定を行う。

シート照明顕微鏡装置１によれば、画像に基づいて従属光線角度を決定することで、照明性能の低下を抑制しつつ十分な縞消し効果を得る設定を行うことができる。また、制御装置４０が画像に基づいて従属光線角度を決定し、設定装置６０が決定した従属光線角度に従って設定を行うため、顕微鏡操作に不慣れな利用者であっても、適切な設定を容易に行うことができる。

以下、図５Ａから図９を参照しながら、本実施形態について更に詳細に説明する。図５Ａ及び図５Ｂは、シート照明顕微鏡装置１の構成を例示した図である。図５Ａ、図５Ｂには、光シートの厚さ方向（ｚ軸方向）、幅方向（ｙ軸方向）から見たシート照明顕微鏡装置１と照明光束とが示されている。

シート照明顕微鏡装置１は、上述した、照明光学系１０、検出光学系２０、撮像装置３０、制御装置４０、及び設定装置６０に加えて、制御装置４０に接続された表示装置５１、及び入力装置（キーボード５２、マウス５３）を備えている。

照明光学系１０は、レーザ１１を備えている。レーザ１１は、光シートに変換されるレーザ光（照明光）を出射する光源である。照明光学系１０は、さらに、レーザ１１側から順に、第１の光学系１２と、スキャナ１６と、走査光学系１７を備えている。

第１の光学系１２は、レーザ１１とスキャナ１６との間に配置された、レーザ光をスキャナ１６に照射する光学系である。第１の光学系１２は、レンズ１３、レンズ１４、シリンドリカルレンズ１５を含んでいる。シリンドリカルレンズ１５は、光軸方向に移動自在に配置された移動レンズであり、ｘｙ平面内で屈折力を有し、ｘｚ平面内で屈折力を有しないように配置されている。

スキャナ１６は、光シートで試料Ｓを光シートの幅方向に走査する走査手段であり、例えば、ガルバノミラー、レゾナントミラーなどの、光を偏向させる偏向面を有する回転自在なミラーである。また、スキャナ１６は、例えば、ＡＯＤ（Acousto-optic deflector）、ＥＯＤ（Electro-optic deflector）であってもよい。なお、図５Ａ及び図５Ｂでは、図面を簡略化するために、スキャナ１６で偏向される前後の光の光路上の光学素子を一直線上に並べて記載している。

走査光学系１７は、シリンドリカルレンズ１８とシリンドリカルレンズ１９とを含み、スキャナ１６で偏向された光を試料に照射する。シリンドリカルレンズ１８は、ｘｙ平面内で屈折力を有し、ｘｚ平面内で屈折力を有しないように配置されている。シリンドリカルレンズ１９は、ｘｚ平面内で屈折力を有し、ｘｙ平面内で屈折力を有しないように配置されている。即ち、シリンドリカルレンズ１８とシリンドリカルレンズ１９は、シリンドリカルレンズ１８が屈折力を有する平面とシリンドリカルレンズ１９が屈折力を有する平面とが互いに直交するように配置されている。また、シリンドリカルレンズ１９は、シリンドリカルレンズ１９の後側焦点位置が検出光学系２０の視野の範囲内に位置するように配置されることが望ましく、検出光学系２０の光軸上に位置するように配置されることがさらに望ましい。

走査光学系１７は、さらに、スキャナ１６が走査光学系１７の光シート面（ｘｙ平面）における前側焦点位置に位置するように、配置されている。これは、スキャナ１６が走査光学系１７の最も物体側に配置されているシリンドリカルレンズ１８の前側焦点位置に位置するように、走査光学系１７が配置されている、と言い換えることができる。なお、シリンドリカルレンズ１８の前側焦点位置とは、試料側からシリンドリカルレンズ１８に平行光束を入射したときに光が直線状に集光する位置のことである。

検出光学系２０は、試料Ｓ側から順に、対物レンズ２１と、波長選択素子２２と、結像レンズ２３を含んでいる。波長選択素子２２は、例えば、レーザ光が撮像装置３０に入射することを防止するためのバリアフィルタである。

設定装置６０は、照明光学系１０の設定を行う装置であり、具体的には、シリンドリカルレンズ１５の光軸方向の位置を変更する装置である。設定装置６０は、シリンドリカルレンズ１５をシリンドリカルレンズ１５の光軸方向に動かす構造として、ボールネジ６１、ボールネジ６１に螺合したナット６２、シリンドリカルレンズ１５を保持する保持部６３、及び、ボールネジ６１を回転させるモータ６４を備える。設定装置６０がシリンドリカルレンズ１５を光軸方向に移動することで、第１の光学系１２の焦点距離が変化し、図５Ａに示すように、照明光学系１０から出射される光シートの幅方向についての従属光線角度が変化する。

以上のように構成されたシート照明顕微鏡装置１では、レーザ１１から出射したレーザ光は、レンズ１３及びレンズ１４で光束径（ビーム径）が調整された後、シリンドリカルレンズ１５を介してスキャナ１６に入射する。その後、スキャナ１６で偏向されたレーザ光は、シリンドリカルレンズ１８及びシリンドリカルレンズ１９を介して試料Ｓに照射される。

シリンドリカルレンズ１５及びシリンドリカルレンズ１８は、ｘｚ平面内においては、屈折力を有しないためレーザ光に対して実質的に作用しない。また、幅方向に光を偏向するスキャナ１６も、ｘｚ平面内においてはレーザ光に対して実質的に作用しない。このため、図５Ｂに示すように、幅方向（ｙ軸方向）から見たとき、レーザ光は、シリンドリカルレンズ１５の位置及びスキャナ１６の振り角によらず、シリンドリカルレンズ１９によって一定の位置に集光する。

また、シリンドリカルレンズ１５及びシリンドリカルレンズ１８は、ｘｙ平面内においては屈折力を有している。このため、図５Ａに示すように、厚さ方向（ｚ軸方向）から見たとき、レーザ光は、シリンドリカルレンズ１５の位置に応じて幅方向について異なる従属光線角度を有する状態でシリンドリカルレンズ１８から出射し、シリンドリカルレンズ１９を介して試料Ｓに照射される。ただし、スキャナ１６がシリンドリカルレンズ１８の前側焦点位置に配置されているため、レーザ光の主光線の方向は、スキャナ１６の角度によらず一定である。

従って、シート照明顕微鏡装置１によれば、シリンドリカルレンズ１５の位置に応じて光シートの幅の方向についての従属光線角度を変更することができる。また、主光線の方向を維持しながら試料を走査することができるため、照明範囲を均一に照明することができる。

図６は、制御装置４０のハードウェアの構成を例示した図である。制御装置４０は、例えば、標準的なコンピュータであり、プロセッサ４１、メモリ４２、入出力インターフェース４３、ストレージ４４、及び、可搬記録媒体４６が挿入される可搬記録媒体駆動装置４５を備え、これらがバス４７によって相互に接続されている。なお、図６は、制御装置４０のハードウェア構成の一例であり、制御装置４０はこの構成に限定されるものではない。

プロセッサ４１は、例えば、ＣＰＵ（Central Processing Unit）、ＭＰＵ（Micro Processing Unit）、ＤＳＰ（Digital Signal Processor）などであり、プログラムを実行してプログラムされた処理を行う。メモリ４２は、例えば、ＲＡＭ（Random Access Memory）であり、プログラムの実行の際に、ストレージ４４または可搬記録媒体４６に記録されているプログラムまたはデータを一時的に記憶する。

入出力インターフェース４３は、制御装置４０以外の装置（例えば、撮像装置３０、表示装置５１、設定装置６０など）と信号をやり取りする回路である。ストレージ４４は、例えば、ハードディスク、フラッシュメモリであり、主に各種データやプログラムの記録に用いられる。可搬記録媒体駆動装置４５は、光ディスクやコンパクトフラッシュ（登録商標）等の可搬記録媒体４６を収容するものである。可搬記録媒体４６は、ストレージ４４を補助する役割を有する。

図７は、制御装置４０の機能構成を例示した図である。制御装置４０は、画像取得手段４０ａ、画像比較手段４０ｂ、角度決定手段４０ｃ、出力手段４０ｄを備える。これらの手段の少なくとも１つは、ストレージ４４又は可搬記録媒体４６に記録されているプログラムをプロセッサ４１がメモリ４２にロードして実行することで、メモリ４２上に構成されてもよい。または、これらの手段の少なくとも１つは、例えば、ＦＰＧＡ（Field-Programmable Gate Array）、ＡＳＩＣ（Application Specific Integrated Circuit）などの集積回路などのハードウェアで構成されてもよい。

画像取得手段４０ａは、撮像装置３０で取得した試料の画像を撮像装置３０から取得する。画像比較手段４０ｂは、撮像装置３０で取得した試料の複数の画像を比較する。角度決定手段４０ｃは、画像比較手段４０ｂで比較した結果に基づいて、光シートの幅方向についての従属光線角度を決定する。出力手段４０ｄは、角度決定手段４０ｃで決定した従属光線角度に応じた照明光学系１０の設定を指示する制御信号を設定装置６０へ出力する。

図８は、照明設定処理の手順を示すフローチャートである。図９は、画像取得処理の手順を示すフローチャートである。以下、図８及び図９を参照しながら、シート照明顕微鏡装置１で行われる照明設定処理について具体的に説明する。

シート照明顕微鏡装置１は、まず、照明光学系１０から出射する光シートの従属光線角度の初期設定を行う（ステップＳ１００）。ここでは、光シートの幅方向についての従属光線角度が既定の角度になるように、制御装置４０が設定装置６０へ制御信号を出力し、設定装置６０が制御信号に従って照明光学系１０の設定を行う。既定の角度は、遮光部分の後方に縞が生じるような角度であればよく、例えば、従属光線が光軸と平行になる０度である。

次に、シート照明顕微鏡装置１は、ステップＳ１００で行った設定で、試料Ｓの画像を取得する（ステップＳ１１０）。この画像取得処理では、図９に示すように、シート照明顕微鏡装置１は、スキャナ１６を用いて試料Ｓを照明光学系１０から出射した光シートで光シートの幅方向に走査し（ステップＳ１１１）、光シートが照射された試料Ｓを撮像装置３０で撮像する（ステップＳ１１２）。これにより、撮像装置３０が試料Ｓの画像データを生成し、制御装置４０へ出力し、制御装置４０が試料Ｓの画像を取得する。ここで取得される画像は、均一な明るさに照明された試料Ｓの画像である。これは、スキャナ１６が走査光学系１７の前側焦点位置に配置されているため、走査期間中、光シートの主光線の向きが維持されて光シートが幅方向に平行移動するからである。

その後、シート照明顕微鏡装置１は、光シートの従属光線角度の設定を変更し（ステップＳ１２０）、変更後の設定で試料Ｓの画像を取得する（ステップＳ１３０）。ステップＳ１２０では、従属光線角度が現在設定されている角度（以降、現在角度）とは異なる角度になるように、制御装置４０が設定装置６０へ制御信号を出力し、設定装置６０が制御信号に従って照明光学系１０の設定を行う。ステップＳ１２０で設定する角度は、縞が現在と同じ又は現在よりも小さくなるような角度であればよく、例えば、現在角度よりも既定値だけ大きな角度に設定してもよい。ステップＳ１３０については、ステップＳ１１０と同様である。

シート照明顕微鏡装置１は、試料Ｓの複数の画像を比較する（ステップＳ１４０）。ここでは、制御装置４０が異なる従属光線角度を有する光シートが照射された試料Ｓの複数の画像を比較し、画像の変化を評価する。具体的には、画像中の画素値を一軸方向（例えば、ｘ軸方向又はｙ軸方向）に積算した値を比較することで画像の変化を評価してもよい。また、画像中の一軸方向（例えば、ｙ軸方向）に隣接する画素間の差分を積算した値を比較することで画像の変化を評価してもよい。さらに、画像をフーリエ変換して空間周波数分布を比較することで画像の変化を評価してもよい。

その後、シート照明顕微鏡装置１は、画像の変化が小さいかどうかを判定する（ステップＳ１５０）。ここでは、制御装置４０は、ステップＳ１４０での比較結果に基づいて、画像の変化を代表する値が既定値よりも小さいか否かを判定する。画像の変化を代表する値は、例えば、ステップＳ１４０において、画像間で比較した値の差分値であってもよく、又は、その差分を従属光線角度の変化量を用いて規格化した値であってもよい。

画像の変化が小さくないと判定されると、シート照明顕微鏡装置１は、再びステップＳ１２０からステップＳ１５０の処理を行う。そして、ステップＳ１５０で画像の変化が小さいと判定されるまでそれらの処理を繰り返す。

画像の変化が小さいと判定されると、シート照明顕微鏡装置１は、従属光線角度を決定する（ステップＳ１６０）。ここでは、制御装置４０は、例えば、変化が小さいと判定された複数の画像に対応する複数の角度のうちの最も小さな角度を、照明光学系１０に設定すべき従属光線角度に決定する。即ち、従属光線角度は、複数の画像を比較した結果に基づいて決定される。

最後に、シート照明顕微鏡装置１は、従属光線角度をステップＳ１６０で決定した角度に設定し（ステップＳ１７０）、照明設定処理を終了する。ここでは、従属光線角度がステップＳ１６０で決定した角度になるように、制御装置４０が設定装置６０へ制御信号を出力し、設定装置６０が制御信号に従って照明光学系１０の設定を行う。
その後、観察者は、ステップＳ１７０で行われた設定で光シートを試料Ｓに照射し、試料Ｓの画像を取得することで、試料Ｓを観察する。

シート照明顕微鏡装置１が上述した照明設定処理を実行することで、それ以上大きくしても画像に変化が生じない従属光線角度が特定され、照明光学系１０から出射する光シートの従属光線角度がその特定された角度になるように照明光学系１０の設定が行われる。なお、従属光線角度を変更しても画像に変化が生じない状態は、遮光部分の後方に延びる縞が十分に小さくなり、目立たない状態である。上述した照明設定処理によれば、従属光線角度を過度に大きく設定することがないため、照明性能の低下を抑制しつつ十分な縞消し効果を得る設定を行うことが可能である。従って、光シート照明のための適切な照明設定を容易に行うことができる。

なお、図８に示す照明設定処理では、画像に変化が生じなくなるまで従属光線角度を徐々に大きくする例を示したが、シート照明顕微鏡装置１は、画像に変化が生じるようになるまで従属光線角度を徐々に小さくしてもよい。この場合、従属光線角度の初期設定は、縞が生じないような又は縞が目立たないような十分に大きな角度であることが望ましい。

また、図８に示す照明設定処理では、撮像装置３０で取得した画像そのものを比較する例を示したが、蛍光物質の褪色等に起因する画像の変化を排除して従属光線角度の変化に起因する画像の変化を評価してもよい。このため、画像を比較する前に比較する画像を補正してもよい。例えば、複数の画像中における縞が生じていない同一の領域の明るさを揃えるように画像を補正してから、画像を比較してもよい。

［第２の実施形態］
第２の実施形態に係るシート照明顕微鏡装置は、制御装置４０の代わりに制御装置７０を備える点が、シート照明顕微鏡装置１とは異なる。その他の点は、シート照明顕微鏡装置１と同様である。

図１０は、制御装置７０の機能構成を例示した図である。制御装置７０は、画像取得手段７０ａ、幅算出手段７０ｂ、角度決定手段７０ｃ、出力手段７０ｄを備える。なお、制御装置７０のハードウェア構成については、制御装置４０と同様である。上記の手段の少なくとも１つは、プログラムをプロセッサ４１がメモリ４２にロードして実行することで、メモリ４２上に構成されてもよく、例えば、ＦＰＧＡ、ＡＳＩＣなどの集積回路などのハードウェアで構成されてもよい。

画像取得手段７０ａは、撮像装置３０で取得した試料Ｓの画像を撮像装置３０から取得する。幅算出手段７０ｂは、撮像装置３０で取得した試料Ｓの画像に基づいて、試料Ｓの画像に表れる縞の幅を算出する。角度決定手段７０ｃは、幅算出手段７０ｂで算出した縞の幅に基づいて、光シートの幅方向についての従属光線角度を決定する。出力手段７０ｄは、角度決定手段７０ｃで決定した従属光線角度に応じた照明光学系１０の設定を指示する制御信号を設定装置６０へ出力する。なお、縞の幅とは、光シートの幅方向についての縞の長さのことをいう。

図１１は、照明設定処理の手順を示すフローチャートである。以下、図１１を参照しながら、本実施形態に係るシート照明顕微鏡装置で行われる照明設定処理について、図８に示す照明設定処理との違いに注目して説明する。

シート照明顕微鏡装置は、まず、照明光学系１０から出射する光シートの従属光線角度の初期設定を行い（ステップＳ２００）、初期設定で、試料Ｓの画像を取得する（ステップＳ２１０）。ステップＳ２００とステップＳ２１０は、図８に示すステップＳ１００とステップＳ１１０と同様である。

画像が取得されると、シート照明顕微鏡装置は、縞の幅を算出する（ステップＳ２２０）。ここでは、制御装置７０が、ステップＳ２１０で取得した画像に基づいて、その画像に表れる縞の幅を算出する。具体的には、画像中の画素値をｘ軸方向に積算し、積算値が所定値以下となる画像中の画素列を特定する。そして、特定された画素列のうち隣接して存在する列の数から縞の幅を算出する。この算出方法は、縞が生じた列の積算値は縞が生じていない列の積算値に比べて小さくなることを利用したものである。なお、隣接して存在する列の集合が複数存在する場合には、最も多くの列から構成される列の集合を特定し、その集合に含まれる列の数から縞の幅を算出することが望ましい。

縞の幅が算出されると、シート照明顕微鏡装置は、従属光線角度を決定する（ステップＳ２３０）。ここでは、制御装置７０は、ステップＳ２２０で算出した縞の幅に基づいて、従属光線角度を決定する。具体的には、従属光線角度は、例えば、ステップＳ２２０で算出した縞の幅と、予め設定された許容される縞の長さに基づいて、幾何学的に算出されてもよい。なお、許容される縞の長さは、照明光学系１０の光軸方向についての縞の長さである。

最後に、シート照明顕微鏡装置は、従属光線角度をステップＳ２３０で決定した角度に設定し（ステップＳ２４０）、照明設定処理を終了する。ステップＳ２４０は、図８に示すステップＳ１７０と同様である。その後、観察者は、ステップＳ２４０で行われた設定で光シートを試料Ｓに照射し、試料Ｓの画像を取得することで、試料Ｓを観察する。

シート照明顕微鏡装置が図１１に示す照明設定処理を実行することで、画像から縞の幅が算出され、縞の幅に基づいて従属光線角度が決定される。これにより、第１の実施形態と同様に、従属光線角度を過度に大きくすることがないため、照明性能の低下を抑制しつつ十分な縞消し効果を得る設定を行うことが可能である。従って、光シート照明のための適切な照明設定を容易に行うことができる。

また、図１１に示す照明設定処理では、画像は１枚あれば十分である。このため、本実施形態によれば、複数の画像を取得して比較を繰り返す第１の実施形態に比べて、より短時間で照明設定を行うことが可能である。また、照明設定のために試料に与えるダメージも抑えることができる。

なお、縞の幅は遮光部分の幅に相当するため、遮光部分の近くではほとんど変化しない。しかしながら、従属光線が光軸に対して角度を持つ場合、遮光部分から離れるほど縞の幅は小さくなる。したがって、画素値をｘ方向の積算した値で縞の幅を算出するような場合には、従属光線の角度が大きいと縞以外の要因による積算値の低下と縞に起因する積算値の低下とを誤認する可能性がある。これを防止するためには、ステップＳ２００で設定する従属光線角度は、より小さな角度であることが望ましい。特に、従属光線が光軸と平行になる０度に設定することが望ましい。

図１２は、照明設定処理の別の手順を示すフローチャートである。図１３は、幅算出処理の別の手順を示すフローチャートである。本実施形態に係るシート照明顕微鏡装置は、図１１に示す照明設定処理の代わりに、図１２及び図１３に示す照明設定処理を行ってもよい。

シート照明顕微鏡装置は、まず、照明光学系１０から出射する光シートの従属光線角度の初期設定を行い（ステップＳ３００）、初期設定で、試料Ｓの画像を取得する（ステップＳ３１０）。ステップＳ３００とステップＳ３１０は、図１１に示すステップＳ２００とステップＳ２１０と同様である。

次に、シート照明顕微鏡装置は、光シートの従属光線角度の設定を変更し（ステップＳ３２０）、変更後の設定で試料Ｓの画像を取得する（ステップＳ３３０）。ステップＳ３２０で設定される角度は、遮光部分の後方に縞が生じにくくなるような角度であればよく、比較的大きな角度に設定することが望ましい。

その後、シート照明顕微鏡装置は、縞の幅を算出する（ステップＳ３４０）。ここでは、制御装置７０が、ステップＳ３１０とステップＳ３３０で取得した２画像に基づいて、その画像に表れる縞の幅を算出する。この幅算出処理では、制御装置７０は、２画像を比較し（ステップＳ３４１）、比較結果に基づいて縞の幅を算出する（ステップＳ３４２）。具体的には、画像中の各画素値の差を取り、差が既定値以上の画素の分布から縞の幅を算出してもよい。また、画像中の画素値をｘ軸方向に積算し、２画像間で積算値の差が所定値以上となる画素列を特定する。そして、特定された画素列のうち隣接して存在する列の数から縞の幅を算出してもよい。

縞の幅が算出されると、シート照明顕微鏡装置は、従属光線角度を決定し（ステップＳ３５０）、決定した角度に従属光線角度を設定し（ステップＳ３６０）、照明設定処理を終了する。ステップＳ３５０、ステップＳ３６０は、図１１に示すステップＳ２３０、ステップＳ２４０と同様である。その後、観察者は、ステップＳ３５０で行われた設定で光シートを試料Ｓに照射し、試料Ｓの画像を取得することで、試料Ｓを観察する。

図１２に示す照明設定処理によっても、図１１に示す照明設定処理と同様の効果を得ることができる。即ち、従属光線角度を過度に大きくすることなく、照明性能の低下を抑制しつつ十分な縞消し効果を得る設定を行うことができる。

［第３の実施形態］
第３の実施形態に係るシート照明顕微鏡装置は、制御装置４０の代わりに制御装置８０を備える点が、シート照明顕微鏡装置１とは異なる。その他の点は、シート照明顕微鏡装置１と同様である。

図１４は、制御装置８０の機能構成を例示した図である。制御装置８０は、画像取得手段８０ａ、縞特定手段８０ｂ、幅算出手段８０ｃ、角度決定手段８０ｄ、出力手段８０ｅを備える。なお、制御装置８０のハードウェア構成については、制御装置４０と同様である。上記の手段の少なくとも１つは、プログラムをプロセッサ４１がメモリ４２にロードして実行することで、メモリ４２上に構成されてもよく、例えば、ＦＰＧＡ、ＡＳＩＣなどの集積回路などのハードウェアで構成されてもよい。

画像取得手段８０ａ、角度決定手段８０ｄ、出力手段８０ｅは、第２の実施形態に係る制御装置７０の、画像取得手段７０ａ、角度決定手段７０ｃ、出力手段７０ｄと同様である。縞特定手段８０ｂは、撮像装置３０で取得した試料Ｓの画像に基づいて、試料Ｓの画像に表れる縞を特定する。幅算出手段８０ｃは、撮像装置３０で取得した試料Ｓの画像に基づいて、より詳細には、縞特定手段８０ｂから出力される縞情報に基づいて、試料Ｓの画像に表れる縞の幅を算出する。

図１５は、照明設定処理の手順を示すフローチャートである。図１６は、縞特定処理の手順を示すフローチャートである。以下、図１５及び図１６を参照しながら、本実施形態に係るシート照明顕微鏡装置で行われる照明設定処理について、図１１に示す照明設定処理との違いに注目して説明する。

シート照明顕微鏡装置は、まず、照明光学系１０から出射する光シートの従属光線角度の初期設定を行う（ステップＳ４００）。ここで設定される角度は、遮光部分の後方に縞が生じるような角度である点は、図１１に示すステップＳ２００と同様である。ただし、０度以外の角度に設定される。その後、シート照明顕微鏡装置は、初期設定で、試料Ｓの画像を取得する（ステップＳ４１０）。ステップＳ４１０は、図１１に示すステップＳ２１０と同様である。

画像が取得されると、シート照明顕微鏡装置は、縞を特定する（ステップＳ４２０）。こここでは、制御装置８０が、ステップＳ４１０で取得した画像に基づいて、その画像に表れる縞を特定する。この縞特定処理では、図１６に示すように、制御装置８０は、まず、画像に基づいて、画素値（即ち、画像信号の強度）が既定値以下の画像中の領域を特定する（ステップＳ４２１）。さらに、ステップＳ４２１で特定した領域に基づいて縞を特定する（ステップＳ４２２）。ステップＳ４２２では、例えば、特定した領域のうち、光シートが進む向きに幅が狭くなるテーパー形状を有する領域を、縞として特定してもよい。

縞が特定されると、シート照明顕微鏡装置は、縞の幅を算出する（ステップＳ４３０）。ここでは、制御装置８０が、ステップＳ４２０で特定された縞の幅を画像上で測定することで、縞の幅を算出する。

縞の幅が算出されると、シート照明顕微鏡装置は、従属光線角度を決定し（ステップＳ４４０）、決定した角度に従属光線角度を設定し（ステップＳ４５０）、照明設定処理を終了する。ステップＳ４４０、ステップＳ４５０は、図１１に示すステップＳ２３０、ステップＳ２４０と同様である。その後、観察者は、ステップＳ４５０で行われた設定で光シートを試料Ｓに照射し、試料Ｓの画像を取得することで、試料Ｓを観察する。

シート照明顕微鏡装置が図１５に示す照明設定処理を実行することで、画像から縞の幅が算出され、縞の幅に基づいて従属光線角度が決定される。このため、第１の実施形態と同様に、従属光線角度を過度に大きくすることなく、照明性能の低下を抑制しつつ十分な縞消し効果を得る設定を行うことが可能である。従って、光シート照明のための適切な照明設定を容易に行うことができる。また、画像は１枚あれば十分であるので、第２の実施形態と同様に、短時間で照明設定を行うこと、及び、照明設定のために試料に与えるダメージを抑えることができる。

なお、縞を特定する方法として、図１６に示す縞特定処理を例示したが、図１７に示す縞特定処理が行われてもよい。即ち、制御装置８０は、予め設定されている縞パターンに基づいて、画像に対してパターンマッチング処理を行い（ステップＳ４２３）、パターンマッチング結果に基づいて縞を特定してもよい（ステップＳ４２４）。

［第４の実施形態］
第４の実施形態に係るシート照明顕微鏡装置は、制御装置４０の代わりに制御装置９０を備える点が、シート照明顕微鏡装置１とは異なる。その他の点は、シート照明顕微鏡装置１と同様である。

図１８は、制御装置９０の機能構成を例示した図である。制御装置９０は、画像取得手段９０ａ、縞特定手段９０ｂ、画像比較手段９０ｃ、角度決定手段９０ｄ、出力手段９０ｅを備える。なお、制御装置９０のハードウェア構成については、制御装置４０と同様である。上記の手段の少なくとも１つは、プログラムをプロセッサ４１がメモリ４２にロードして実行することで、メモリ４２上に構成されてもよく、例えば、ＦＰＧＡ、ＡＳＩＣなどの集積回路などのハードウェアで構成されてもよい。

画像取得手段９０ａ、出力手段９０ｅは、第１の実施形態に係る制御装置４０の、画像取得手段４０ａ、出力手段４０ｄと同様である。縞特定手段９０ｂは、撮像装置３０で取得した試料Ｓの画像に基づいて、試料Ｓの画像に表れる縞を特定する。画像比較手段９０ｃは、撮像装置３０で取得した試料の複数の画像を、より詳細には、複数の画像中の特定された縞を含む小領域を、比較する。なお、小領域は画像全体ではなく画像の一部の領域である。角度決定手段９０ｄは、画像比較手段９０ｃで比較した結果に基づいて、より詳細には、上述した小領域を比較した結果に基づいて、光シートの幅方向についての従属光線角度を決定する。

図１９は、照明設定処理の手順を示すフローチャートである。以下、図１９を参照しながら、本実施形態に係るシート照明顕微鏡装置で行われる照明設定処理について、図８に示す照明設定処理との違いに注目して説明する。

シート照明顕微鏡装置は、まず、照明光学系１０から出射する光シートの従属光線角度の初期設定を行い（ステップＳ５００）、初期設定で、試料Ｓの画像を取得する（ステップＳ５１０）。ステップＳ５００とステップＳ５１０は、図８に示すステップＳ１００とステップＳ１１０と同様である。

画像が取得されると、シート照明顕微鏡装置は、縞を特定する（ステップＳ５２０）。ステップＳ５２０は、図１５に示すステップＳ４２０と同様である。その後、シート照明顕微鏡装置は、光シートの従属光線角度の設定を変更し（ステップＳ５３０）、変更後の設定で試料Ｓの画像を取得する（ステップＳ５４０）。ステップＳ５３０とステップＳ５４０は、図８に示すステップＳ１２０とステップＳ１３０と同様である。

次に、シート照明顕微鏡装置は、試料Ｓの複数の画像を比較する（ステップＳ５５０）。ここでは、制御装置９０が異なる従属光線角度を有する光シートが照射された試料Ｓの複数の画像のうちの、ステップＳ５２０で特定された縞を含む小領域を比較し、画像中のその小領域の変化を評価する。

その後、シート照明顕微鏡装置１は、画像の変化が小さいかどうかを判定する（ステップＳ５６０）。ここでは、制御装置９０は、ステップＳ５５０での小領域の比較結果に基づいて、小領域の変化を代表する値が既定値よりも小さいか否かを判定する。

画像（の小領域）の変化が小さくないと判定されると、シート照明顕微鏡装置は、再びステップＳ５３０からステップＳ５６０の処理を行う。そして、ステップＳ５６０で画像の変化が小さいと判定されるまでそれらの処理を繰り返す。

画像（の小領域）の変化が小さいと判定されると、シート照明顕微鏡装置は、従属光線角度を決定し（ステップＳ５７０）、決定した角度に従属光線角度を設定し（ステップＳ５８０）、照明設定処理を終了する。ステップＳ５７０、ステップＳ５８０は、図８に示すステップＳ１６０、ステップＳ１７０と同様である。その後、観察者は、ステップＳ５８０で行われた設定で光シートを試料Ｓに照射し、試料Ｓの画像を取得することで、試料Ｓを観察する。

シート照明顕微鏡装置が図１９に示す照明設定処理を実行することで、第１の実施形態と同様に、従属光線角度を過度に大きくすることなく、照明性能の低下を抑制しつつ十分な縞消し効果を得る設定を行うことが可能である。従って、光シート照明のための適切な照明設定を容易に行うことができる。また、図１９に示す照明設定処理では、縞を含む小領域が比較されるため、縞の変化に起因する画像の変化を感度良く検出することが可能となる。また、画像全体を比較する場合よりも計算量を抑えることもできる。

［第５の実施形態］
第５の実施形態に係るシート照明顕微鏡装置は、制御装置４０の代わりに制御装置１００を備える点が、シート照明顕微鏡装置１とは異なる。その他の点は、対物レンズ１と同様である。

図２０は、制御装置１００の機能構成を例示した図である。制御装置１００は、画像取得手段１００ａ、縞特定手段１００ｂ、表示制御手段１００ｃ、縞指定手段１００ｄ、幅算出手段１００ｅ、角度決定手段１００ｆ、出力手段１００ｇを備える。なお、制御装置１００のハードウェア構成については、制御装置４０と同様である。上記の手段の少なくとも１つは、プログラムをプロセッサ４１がメモリ４２にロードして実行することで、メモリ４２上に構成されてもよく、例えば、ＦＰＧＡ、ＡＳＩＣなどの集積回路などのハードウェアで構成されてもよい。

画像取得手段１００ａ、出力手段１００ｇは、制御装置４０の、画像取得手段４０ａ、出力手段４０ｄと同様である。縞特定手段１００ｂは、撮像装置３０で取得した試料Ｓの画像に基づいて、試料Ｓの画像に表れる縞を特定する。表示制御手段１００ｃは、表示装置５１に、縞特定手段１００ｂで特定された縞の部分に印を付けた試料の画像を表示させる。縞指定手段１００ｄは、観察者からの入力に従って縞消し対象とすべき縞を指定する。幅算出手段１００ｅは、縞指定手段１００ｄで指定された縞の幅を算出する。角度決定手段１００ｆは、制御装置８０の角度決定手段８０ｄと同様である。

図２１は、照明設定処理の手順を示すフローチャートである。以下、図２１を参照しながら、本実施形態に係るシート照明顕微鏡装置で行われる照明設定処理について、図１５に示す照明設定処理との違いに注目して説明する。

シート照明顕微鏡装置は、まず、照明光学系１０から出射する光シートの従属光線角度の初期設定を行い（ステップＳ６００）、初期設定で、試料Ｓの画像を取得する（ステップＳ６１０）。さらに、取得した画像に基づいて、縞を特定する（ステップＳ６２０）。ステップＳ６００からステップＳ６２０は、図１５に示すステップＳ４００からステップＳ４２０と同様である。

縞が特定されると、シート照明顕微鏡装置は、ステップＳ６２０で特定された縞の部分に印を付けた画像を表示する（ステップＳ６３０）。ここでは、制御装置１００は、表示装置５１に、特定された縞の部分に印を付けた試料の画像を表示させる。換言すると、試料の画像とともに特定された縞の位置を表示装置５１に表示する。例えば、制御装置１００は、図２２に示すように、表示装置５１に表示中の画像を、縞部分に印が付いていない試料の画像５１ａから縞部分に印（マークＭ１、マークＭ２、マークＭ３）が付いた試料の画像５１ｂに更新する。

その後、観察者は、表示装置５１に表示された画像を見ながら、入力装置（キーボード５２、マウス５３）を用いて縞消し対象とすべき縞を画面上で選択する。なお、観察者は、縞消し対象とすべき縞を全て選択してもよく、縞消し対象とすべき縞のうち最も大きな縞のみを選択してもよい。

画像を表示している間、シート照明顕微鏡装置は、観察者によって縞の指定が行われたかどうかを判定する（ステップＳ６４０）。ここでは、制御装置１００は、入力装置（キーボード５２、マウス５３）からの信号に基づいて縞の指定が行われたか否かを判定する。

縞の指定が行われたと判定すると、シート照明顕微鏡装置は、縞の幅を算出する（ステップＳ６５０）。ここでは、制御装置１００が、ステップＳ６４０で指定された縞の幅を画像上で測定することで、縞の幅を算出する。なお、複数の縞が指定されている場合には、各縞の幅を算出する。

縞の幅が算出されると、シート照明顕微鏡装置は、従属光線角度を決定する（ステップＳ６６０）。ここでは、制御装置９０は、ステップＳ６５０で算出した縞の幅に基づいて、従属光線角度を決定する。なお、複数の縞の幅が算出されている場合には、最も大きな縞の幅に基づいて従属光線角度を決定することが望ましい。

最後に、シート照明顕微鏡装置は、決定した角度に従属光線角度を設定し（ステップＳ６７０）、照明設定処理を終了する。ステップＳ６７０は、図１５に示すステップＳ４５０と同様である。その後、観察者は、ステップＳ６７０で行われた設定で光シートを試料Ｓに照射し、試料Ｓの画像を取得することで、試料Ｓを観察する。

シート照明顕微鏡装置が図２１に示す照明設定処理を実行することで、画像から縞の幅が算出され、縞の幅に基づいて従属光線角度が決定される。このため、第１の実施形態と同様に、従属光線角度を過度に大きくすることなく、照明性能の低下を抑制しつつ十分な縞消し効果を得る設定を行うことが可能である。従って、光シート照明のための適切な照明設定を容易に行うことができる。また、画像は１枚あれば十分であるので、第２の実施形態と同様に、短時間で照明設定を行うこと、及び、照明設定のために試料に与えるダメージを抑えることができる。さらに、本実施形態では、少なくとも観察者が選択した縞に対して縞消し効果が得られるように、従属光線角度が決定されるため、観察者の要求を満たす縞消し効果を発揮しつつ、照明性能の低下を更に抑制し得る。

［第６の実施形態］
図２３Ａ及び図２３Ｂは、シート照明顕微鏡装置２の構成を例示した図である。シート照明顕微鏡装置２は、シート照明顕微鏡装置１と同様に、例えば、生体標本などの試料Ｓからの蛍光を検出する蛍光顕微鏡であり、光シートで試料Ｓを照明するように構成されている。

シート照明顕微鏡装置２は、照明光学系１０の代わりに照明光学系２００を備える点、制御装置４０の代わりに制御装置１１０を備える点、設定装置６０の代わりに設定装置６５を備える点が、シート照明顕微鏡装置１とは異なっている。

照明光学系２００は、検出光学系２０の光軸と略直交するシート形状を有する光シートを形成し、その光シートを検出光学系２０の光軸と略直交する方向から試料Ｓに照射するように構成されている。照明光学系２００は、観察範囲Ｒを一度に照明できるように、照明光学系１０に比べて幅の広い光シートを形成する。

照明光学系２００は、レーザ２０１を備えている。レーザ２０１は、光シートに変換されるレーザ光（照明光）を出射する光源である。照明光学系２００は、さらに、レーザ２０１側から順に、レンズ２０２、レンズ２０３、シリンドリカルレンズ２０４、ミラー２０５、シリンドリカルレンズ２０６、シリンドリカルレンズ２０７を備える。

シリンドリカルレンズ２０４及びシリンドリカルレンズ２０６は、ｘｙ平面内で屈折力を有し、ｘｚ平面内で屈折力を有しないように配置されている。シリンドリカルレンズ２０７は、ｘｚ平面内で屈折力を有し、ｘｙ平面内で屈折力を有しないように配置されている。

ミラー２０５は、ｚ軸周りに回転することで入射光に対する角度を変更可能な回動ミラーであり、ミラー２０５の角度は、設定装置６５によって変更される。なお、ミラー２０５は、照明光学系２００の瞳面内に配置されることが望ましい。

制御装置１１０は、シート照明顕微鏡装置２を制御する顕微鏡コントローラである。制御装置１１０は、シート照明顕微鏡装置２の顕微鏡本体に設けられた各種電動機構に制御信号を出力するように構成されていて、例えば、制御装置４０と同様のハードウェア構成を有している。

設定装置６５は、照明光学系２００の設定を行う装置であり、制御装置１１０からの制御信号に従って動作する顕微鏡本体の電動機構の一つである。設定装置６５は、具体的には、ミラー２０５の角度を変更するモータなどの駆動装置である。設定装置６５がミラー２０５の角度を変更することで、照明光学系２００から出射される光シートの主光線の角度が変化する。

以上のように構成されたシート照明顕微鏡装置２では、シリンドリカルレンズ２０４及びシリンドリカルレンズ２０６は、ｘｚ平面内においては、屈折力を有しないためレーザ光に対して実質的に作用しない。また、ｚ軸回りに回転するミラー２０５も、ｘｚ平面内においてはレーザ光に対して実質的に作用しない。このため、図２３Ｂに示すように、幅方向（ｙ軸方向）から見たとき、レーザ光は、ミラー２０５の角度によらず、シリンドリカルレンズ２０７によって一定の位置に集光する。

また、シリンドリカルレンズ２０４及びシリンドリカルレンズ２０６は、ｘｙ平面内において屈折力を有している。このため、図２３Ａに示すように、厚さ方向（ｚ軸方向）から見たとき、レーザ光は、レンズ２０２及びレンズ２０３の組み合わせで幅が調整され、さらにシリンドリカルレンズ２０４及びシリンドリカルレンズ２０６の組み合わせで更に幅が調整される。シリンドリカルレンズ２０７は、ｘｙ平面内においては屈折力を有しないため、シリンドリカルレンズ２０６から出射したレーザ光は、そのままの幅で試料に照射される。ただし、レーザ光の主光線の向きは、ミラー２０５の角度に依存する。

従って、シート照明顕微鏡装置２によれば、ミラー２０５の角度に応じて、照明光学系２００から出射する光シートの主光線の向きを変更することができる。このため、ミラー２０５の角度を変更することで、光シートの主光線が試料に入射する入射角度を変更することができる。そして、撮像装置３０の露光時間中に入射角度を変更して様々な方向から試料を照明することで、縞消し効果を得ることができる。

図２４は、照明設定処理の手順を示すフローチャートである。図２５は、入射角決定処理の手順を示すフローチャートである。以下、図２４及び図２５を参照しながら、シート照明顕微鏡装置２で行われる照明設定処理について具体的に説明する。

シート照明顕微鏡装置２は、まず、照明光学系２００から出射した光シートが照射された試料Ｓの画像を取得する（ステップＳ７００）。ここでは、照明光学系２００が試料Ｓに光シートを照射し、撮像装置３０が試料Ｓを撮像し試料Ｓの画像データを生成する。生成された試料Ｓの画像データは、制御装置１１０へ出力される。

次に、シート照明顕微鏡装置２は、取得した画像に基づいて、光シートの主光線が試料に入射する入射角度を決定する（ステップＳ７１０）。ここでは、制御装置１１０は、図２５に示す入射角度設定処理を実行し、撮像装置３０から取得した画像に基づいて、照明光学系２００から出射される光シートの主光線が試料に入射する入射角度を決定する。なお、図２５のステップＳ７１１からステップＳ７１４は、図２１のステップＳ６２０からステップＳ６５０と同様である。制御装置１１０は、算出された縞の幅に基づいて、入射角度を決定する（ステップＳ７１５）。入射角度は、例えば、ステップＳ７１４で算出した縞の幅と、予め設定された許容される縞の長さに基づいて、幾何学的に決定されてもよい。

入射角度が決定されると、シート照明顕微鏡装置２は、決定した入射角度に従って、照明光学系２００の設定を行い（ステップＳ７２０）、光シートを試料に照射する（ステップＳ７３０）。ここでは、シート照明顕微鏡装置２は、設定装置６５が制御装置１１０から出力された制御信号に従って、照明光学系２００の設定を繰り返し行いながら、光シートを試料に照射する。具体的には、シート照明顕微鏡装置２は、０度からステップＳ７１０で決定した角度まで入射角度を変更しながら、光シートを照射する。

シート照明顕微鏡装置２が図２４に示す照明設定処理を実行することによっても、従属光線角度を過度に大きくすることなく、照明性能の低下を抑制しつつ十分な縞消し効果を得る設定を行うことが可能である。従って、光シート照明のための適切な照明設定を容易に行うことができる。

なお、図２４に示す照明設定処理では、決定した入射角度に従って照明光学系２００の設定を行う例を示したが、入射角度が制御されればよい。このため、照明光学系２００の設定を行う代わりに、試料を載せたステージ等を回転させることによって、試料の向きの設定を行ってもよい。また、これらの少なくとも一方を行えばよいため、照明光学系２００の設定と試料の向きの設定の両方を行ってもよい。

上述した実施形態は、発明の理解を容易にするための具体例を示したものであり、本発明の実施形態はこれらに限定されるものではない。照明設定方法、シート照明顕微鏡装置、及びプログラムは、特許請求の範囲に記載された発明を逸脱しない範囲において、さまざまな変形、変更が可能である。

１、２・・・シート照明顕微鏡装置、１０、２００・・・照明光学系、１１、２０１・・・レーザ、１２・・・第１の光学系、１３、１４、２０２、２０３・・・レンズ、１５、１８、１９、２０４、２０６、２０７・・・シリンドリカルレンズ、１６・・・スキャナ、１７・・・走査光学系、２０・・・検出光学系、２１・・・対物レンズ、２２・・・波長選択素子、２３・・・結像レンズ、３０・・・撮像装置、４０、７０、８０、９０、１００、１１０・・・制御装置、４１・・・プロセッサ、４２・・・メモリ、４３・・・入出力インターフェース、４４・・・記憶装置、４５・・・可搬記録媒体駆動装置、４６・・・可搬記録媒体、４７・・・バス、４０ａ、７０ａ、８０ａ、９０ａ、１００ａ・・・画像取得手段、４０ｂ、９０ｃ・・・画像比較手段、４０ｃ、７０ｃ、８０ｄ、９０ｄ、１００ｆ・・・角度決定手段、４０ｄ、７０ｄ、８０ｅ、９０ｅ、１００ｇ・・・出力手段、５１・・・表示装置、５１ａ、５１ｂ・・・画像、５２・・・キーボード、５３・・・マウス、６０、６５・・・設定装置、６１・・・ボールネジ、６２・・・ナット、６３・・・保持部、６４・・・モータ、７０ｂ、８０ｃ、１００ｅ・・・幅算出手段、８０ｂ、９０ｂ、１００ｂ・・・縞特定手段、１００ｃ・・・表示制御手段、１００ｄ・・・縞指定手段、２０５・・・ミラー、Ｓ・・・試料、Ｌ１、Ｌ２・・・光シート、Ｒ・・・観察範囲、Ｍ１、Ｍ２、Ｍ３・・・マーク

Claims (19)

1. 照明光学系から出射した光シートが照射された試料の画像を取得することと、
   取得した前記試料の画像に基づいて、前記照明光学系から出射される光シートの幅方向についての従属光線角度を決定することと、
   決定した前記従属光線角度に従って、前記照明光学系の設定を行うことと、を含む
   ことを特徴とする照明設定方法。
2. 請求項１に記載の照明設定方法において、
   前記試料の画像を取得することは、
   前記照明光学系から出射した前記光シートで前記試料を前記光シートの幅方向に走査することと、
   前記照明光学系から出射した光シートが照射された前記試料を撮像装置で撮像することと、を含む
   ことを特徴とする照明設定方法。
3. 請求項２に記載の照明設定方法において、
   前記走査することは、前記光シートの主光線の向きを維持しながら前記光シートを前記幅方向に平行移動することを含む
   ことを特徴とする照明設定方法。
4. 請求項１乃至請求項３のいずれか１項に記載の照明設定方法において、
   前記従属光線角度を決定することは、
   取得した前記試料の画像に基づいて、前記試料の画像に表れる縞の幅を算出することと、
   算出した前記縞の幅に基づいて、前記従属光線角度を決定することと、を含む
   ことを特徴とする照明設定方法。
5. 請求項４に記載の照明設定方法において、
   前記従属光線角度を決定することは、さらに、前記縞の幅を算出することの前に、取得した前記試料の画像に表れる縞を特定することを含む
   ことを特徴とする照明設定方法。
6. 請求項４又は請求項５に記載の照明設定方法において、
   前記従属光線角度は、算出した前記縞の幅と許容される縞の長さに基づいて算出される
   ことを特徴とする照明設定方法。
7. 請求項１乃至請求項３のいずれか１項に記載の照明設定方法において、
   前記試料の画像を取得することは、前記試料の複数の画像を取得することであり、
   前記複数の画像の各々は、異なる前記従属光線角度を有する光シートが照射された前記試料の画像であり、
   前記従属光線角度を決定することは、取得した前記複数の画像を比較することを含み、
   前記従属光線角度は、前記複数の画像を比較した結果に基づいて決定される
   ことを特徴とする照明設定方法。
8. 請求項７に記載の照明設定方法において、
   前記従属光線角度を決定することは、さらに、前記複数の画像を比較する前に、前記試料の画像に表れる縞を特定することを含み、
   前記複数の画像を比較することは、前記複数の画像中の特定された前記縞を含む小領域を比較することであり、
   前記従属光線角度は、前記複数の画像中の前記小領域を比較した結果に基づいて決定される
   ことを特徴とする照明設定方法。
9. 請求項５又は請求項８に記載の照明設定方法において、
   前記縞を特定することは、
   前記試料の画像に基づいて、画像信号の強度が既定値以下の領域を特定することと、
   特定した前記領域に基づいて、前記縞を特定することと、を含む
   ことを特徴とする照明設定方法。
10. 請求項５又は請求項８に記載の照明設定方法において、
    前記縞を特定することは、
    異なる既定の前記従属光線角度を有する光シートが照射された前記試料の複数の画像を比較することと、
    前記複数の画像を比較した結果に基づいて、前記縞を特定することと、を含む
    ことを特徴とする照明設定方法。
11. 請求項５又は請求項８に記載の照明設定方法において、
    前記縞を特定することは、前記試料の画像に対してパターンマッチング処理を行うことを含む
    ことを特徴とする照明設定方法。
12. 請求項５又は請求項８乃至請求項１１のいずれか１項に記載の照明設定方法において、さらに、
    特定された前記縞の位置を表示装置に表示する
    ことを特徴とする照明設定方法。
13. 照明光学系により光シートが照射された試料の画像を取得することと、
    取得した前記試料の画像に基づいて、前記照明光学系から出射される光シートの主光線が前記試料に入射する入射角度を決定することと、
    決定した前記入射角度に従って、前記照明光学系の設定又は前記試料の向きの設定の少なくとも一方を行うことと、を含む
    ことを特徴とする照明設定方法。
14. コンピュータが、
    照明光学系により光シートが照射された試料の画像を撮像装置から取得することと、
    前記撮像装置から取得した前記試料の画像に基づいて、前記照明光学系から出射される光シートの幅方向についての従属光線角度を決定することと、
    決定した前記従属光線角度に応じた前記照明光学系の設定を指示する制御信号を出力することと、を含む
    ことを特徴とする照明設定方法。
15. 試料に光シートを照射する照明光学系と、
    前記照明光学系で光シートが照射された前記試料の画像を取得する撮像装置と、
    前記撮像装置で取得した前記試料の画像に基づいて、前記照明光学系から出射される光シートの幅方向についての従属光線角度を決定する制御装置と、
    前記制御装置で決定した前記従属光線角度に従って、前記照明光学系の設定を行う設定装置と、を備える
    ことを特徴とするシート照明顕微鏡装置。
16. 請求項１５に記載のシート照明顕微鏡装置において、
    前記照明光学系は、
    前記光シートで前記試料を前記光シートの幅方向に走査するスキャナと、
    前記スキャナが前記光シートの幅方向の前側焦点位置に位置するように配置された、前記スキャナで偏向された光を前記試料に照射する走査光学系と、を備える
    ことを特徴とするシート照明顕微鏡装置。
17. 請求項１５又は請求項１６に記載のシート照明顕微鏡装置において、
    前記制御装置は、
    前記撮像装置で取得した前記試料の画像に基づいて、前記試料の画像に表れる縞の幅を算出する幅算出手段と、
    前記幅算出手段で算出した前記縞の幅に基づいて、前記従属光線角度を決定する角度決定手段と、
    前記角度決定手段で決定した前記従属光線角度に応じた前記照明光学系の設定を指示する制御信号を前記設定装置へ出力する出力手段と、を含む
    ことを特徴とするシート照明顕微鏡装置。
18. 請求項１５又は請求項１６に記載のシート照明顕微鏡装置において、
    前記制御装置は、
    前記撮像装置で取得した、各々が異なる前記従属光線角度を有する光シートが照射された前記試料の画像である、前記試料の複数の画像を比較手段と、
    前記比較手段で比較した結果に基づいて、前記従属光線角度を決定する角度決定手段と、
    前記角度決定手段で決定した前記従属光線角度に応じた前記照明光学系の設定を指示する制御信号を前記設定装置へ出力する出力手段と、を含む
    ことを特徴とするシート照明顕微鏡装置。
19. コンピュータに、
    照明光学系により光シートが照射された試料の画像を撮像装置から取得する処理と、
    前記撮像装置から取得した前記試料の画像に基づいて、前記照明光学系から出射される光シートの幅方向についての従属光線角度を決定する処理と、
    決定した前記従属光線角度に応じた前記照明光学系の設定を指示する制御信号を出力する処理と、を実行させる
    ことを特徴とするプログラム。

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