JP2017209048A - 標的生体分子の濃度算出方法、標的生体分子濃度算出用ビーズ、ビーズのセット、及び標的生体分子濃度算出装置 - Google Patents

Abstract

【課題】試料中の標的生体分子の濃度を、精度よく定量する方法を提供する。【解決手段】標的生体分子の濃度算出方法であって、（ａ）生体分子を含む試料を、標的生体分子と結合し得るリガンドを含む、複数の画分に分割する工程と、（ｂ）前記画分に、核酸増幅に必要な試薬を添加する工程と、（ｃ）前記画分毎に、核酸伸長反応を行う工程と、（ｄ）前記核酸伸長反応中の各画分のプロトン発生量を測定する工程と、（ｅ）測定された前記プロトン発生量に基づいて、前記画分毎に核酸伸長の有無を判定する工程と、（ｆ）核酸伸長有と判定された画分の数に基づいて、前記試料中の標的生体分子の濃度を算出する工程と、を含む。【選択図】図３

Description

本発明は、標的生体分子の濃度算出方法、標的生体分子濃度算出用ビーズ、ビーズのセット、及び標的生体分子濃度算出装置に関する。

ハイスループットで核酸分析を行う方法としては、光切断部位を介してビーズにプライマーを結合し、プライマーに試料中の核酸を捕捉させた後、プライマーを光誘導切断してＰＣＲを行い、標的核酸を増幅して増幅産物を分析する技術が知られている（特許文献１参照）。しかしながら、特許文献１の技術では、増幅産物の分析を行う場合には、ビーズエマルジョンを回収して配列解析等を行う必要があった。

米国特許出願公開第２０１３／０１９０１９１号明細書

本発明の一実施態様は、標的生体分子の濃度算出方法であって、
（ａ）生体分子を含む試料を、標的生体分子と結合し得るリガンドを含む、複数の画分に分割する工程と、
（ｂ）前記画分に、核酸伸長に必要な試薬を添加する工程と、
（ｃ）前記画分毎に、核酸伸長反応を行う工程と、
（ｄ）前記核酸伸長反応中の各画分のプロトン発生量を測定する工程と、
（ｅ）測定された前記プロトン発生量に基づいて、前記画分毎に核酸伸長の有無を判定する工程と、
（ｆ）核酸伸長有と判定された画分の数に基づいて、前記試料中の標的生体分子の濃度を算出する工程と、
を含む標的生体分子の濃度算出方法である。

また、本発明の一実施態様は、所定の電気特性を有するビーズ体に当該電気特性に対応する種類のリガンドが固定化された、標的生体分子濃度算出用ビーズである。

また、所定の電気特性を有するビーズ体に当該電気特性に対応する種類のリガンドが固定化された、標的生体分子濃度算出用ビーズを複数含む、標的生体分子の濃度を算出するためのビーズのセットである。

また、本発明の一実施態様は、複数の画分に分割された生体分子を含む試料の前記画分毎に行われる核酸伸長反応中の各画分のプロトンを検出する検出部と、前記検出部が検出するプロトンの発生量に基づいて、前記画分毎に核酸増幅の有無を判定する核酸伸長判定部と、前記核酸伸長判定部が核酸伸長有と判定する画分の数に基づいて、前記試料中の標的生体分子の濃度を算出する標的生体分子濃度算出部と、を備える標的生体分子濃度算出装置である。

第１実施形態におけるビーズ体の一例の模式図である。 第１実施形態におけるビーズ体に標的核酸配列がアニーリングした状態の一例の模式図である。 本実施形態における反応槽へのビーズ体の配置の一例の模式図である。 本実施形態における反応槽へのビーズ体の配置の変形例の模式図である。 本実施形態におけるセンサの一例の模式図である。 本実施形態における標的核酸配列濃度算出装置の構成の一例を示す図である。 第２実施形態におけるビーズ体の一例を示す模式図である。

＜＜第１実施形態＞＞
一例として、本実施形態の方法における標的生体分子は、所望の標的核酸配列を有する核酸である。また、標的生体分子に結合し得るリガンドは、標的核酸配列にアニーリングし得るプライマー（以下、「標的核酸用プライマー」という）である。本実施形態においては、標的生体分子が核酸である場合について説明する。

本実施形態の標的核酸配列の濃度算出方法は、（ａ１）核酸を含む試料を、標的核酸配列とアニーリングし得る標的核酸用プライマーを含む、複数の画分に分割する工程と、（ｂ１）前記画分に、核酸伸長に必要な試薬を添加する工程と、（ｃ１）前記画分毎に、標的核酸配列の核酸伸長反応を行う工程と、（ｄ１）前記核酸伸長反応中の各画分のプロトン発生量を測定する工程と、（ｅ１）測定された前記プロトン発生量に基づいて、前記画分毎に核酸伸長の有無を判定する工程と、（ｆ１）核酸伸長有と判定された画分の数に基づいて、前記試料中の標的核酸配列の濃度を算出する工程と、の各工程を有する。以下、各工程について説明する。

＜実施形態１＞
［複数画分への試料の分割］
本実施形態における工程（ａ１）は、核酸を含む試料を、複数の画分に分割する工程である。本実施形態では、核酸を含む試料を、標的核酸配列にアニーリングし得るプライマーを固定化した複数のビーズと接触させ、ビーズを１つずつ反応槽に配置することにより、試料を複数の画分に分割する。
［標的核酸用プライマーとのアニーリング］
本実施形態においては、核酸を含む試料を、標的核酸用プライマーが固定化された複数のビーズと接触させる工程を有する。

まず、本実施形態で用いるビーズについて、図１を参照して説明する。図１中、１はビーズ、２は標的核酸用プライマー、１００はビーズ１に標的核酸用プライマー２が固定化されたビーズ体を示す。

本実施形態において、ビーズ１は、標的核酸用プライマー２が固定化するための担体として用いられる。一例として、ビーズ１の形状は、球状又はそれに近い形状である。ビーズ１の形状は、これにかぎるものではない。一例として、ビーズ１の大きさは、平均直径１〜２５０μｍである。また一例として、ビーズ１の大きさは、平均直径３０〜８０μｍである。

ビーズ１の材質は、特に限定されないが、例えば、ケイ素、二酸化チタン、酸化アルミニウム、ガラス、ポリスチレン、セルロース、ポリアミド等を挙げることができる。また、反応槽への配置の観点から、磁性ビーズを用いてもよい。ビーズ１は、１種類の物質のみならず、２種類以上の物質からなるものであってもよい。また、ビーズ１は、表面コーティングされたものであってもよい。なお、反応槽へのビーズ体１００の配置に、誘電泳動を利用する場合には、ビーズ１の材質には、高い誘電率を有する強誘電体材料が用いられる。そのような強誘電体材料の例としては、例えば、チタン酸バリウム、リン酸二水素カリウム等を挙げることができる。

図１に示すように、ビーズ１には、標的核酸用プライマー２が固定化されている。これらの核酸のビーズ１への固定化は、公知の方法を用いて行うことができる。例えば、標的核酸用プライマー２をビオチン修飾し、ビーズ１の表面をアビジンでコーティングすることにより、アビジン−ビオチン結合を利用して、ビーズ１への両核酸の固定化を行うことができる。また、標的核酸用プライマー２をアミノ基、ホルミル基、ＳＨ基などの官能基で修飾し、ビーズ１をアミノ基、ホルミル基、エポキシ基などを有するシランカップリング剤で表面処理することにより、固定化を行ってもよい。

標的核酸用プライマー２は、目的とする標的核酸配列にアニーリングし得る配列を有する。一例として、標的核酸用プライマー２は、標的核酸配列の一部に相補的な配列を有する核酸である。一例として、標的核酸用プライマー２は、ＤＮＡである。標的核酸用プライマー２は、標的核酸配列にアニーリングし、標的核酸配列を鋳型とした核酸伸長反応を誘導する。標的核酸用プライマー２の配列は、目的とする標的核酸に応じて、適宜選択することができる。

なお、図１では、ビーズ１に対して、標的核酸用プライマー２が１分子ずつしか固定化されていないが、ビーズ１に対して固定化される標的核酸用プライマー２の分子数は１つに限定されず、２分子以上を固定化することができる。一例として、本実施形態では、標的核酸用プライマー２は、２分子以上固定化される。標的核酸用プライマー２は、ビーズ１の表面積に応じて、標的核酸のアニーリング及び伸長反応を妨げない程度の密度で、固定化されていればよい。なお、ビーズ１に対して、２分子以上の標的核酸用プライマー２を固定化する場合、固定化される標的核酸用プライマー２は、全て同一の標的核酸配列を標的とする。

本工程では、ビーズ１に標的核酸用プライマー２が固定化されたビーズ体１００を、核酸を含む試料と接触させる。本実施形態において、核酸を含む試料は、特に限定されず、例えば、生体サンプルや環境サンプルからの核酸抽出物等を含む試料等を使用することができる。一例として、試料に含まれる核酸は、ＤＮＡである。ＤＮＡの例としては、ｃＤＮＡやゲノムＤＮＡを挙げることができる。試料に含まれる核酸は、ＤＮＡに限定されず、ＲＮＡや修飾核酸であってもよい。

ビーズ体１００と核酸を含む試料との接触は、例えば、ビーズ体１００と核酸を含む試料とを混合することにより行うことができる。このとき、試料と接触させるビーズ体１００の個数は、試料中に含まれると予測される標的核酸配列数に対して、十分に多いことが必要である。一例として、混合物は、標的核酸用プライマー２が標的核酸とアニーリングし得る条件に置かれる。アニーリング条件は、標的核酸用プライマー２の長さ等に応じて、適宜設定することができる。試料中に標的核酸用プライマー２の標的核酸が含まれている場合には、図２に示すように、標的核酸用プライマー２が標的核酸配列３にアニーリングし、ビーズ体１００に標的核酸配列３が捕捉される。ただし、ビーズ体１００の個数が標的核酸配列数に対して十分に多い場合、標的核酸用プライマー２は、標的核酸配列３にアニーリングするものと、アニーリングしないものとが混在するようになる。試料中の標的核酸配列３の濃度が高い場合には、標的核酸配列３にアニーリングする標的核酸用プライマー２の数は多くなる。一方、試料中の標的核酸配列３の濃度が低い場合には、標的核酸配列３にアニーンリグする標的核酸用プライマー２の数は少なくなる。なお、試料と接触させるビーズ体１００の数は、試料の種類に応じて、適宜選択することができる。試料中に含まれる標的核酸濃度が高いと予想される場合には、試料を希釈してもよい。

［反応槽へのビーズの配置］
次に、核酸を含む試料と接触させたビーズ体１００を、ビーズ毎に、個別の反応槽に配置する。反応槽へのビーズの配置について、図３を参照して、説明する。図３中、２０はビーズ配置用基板であり、２１は反応槽である。この一例においては、ビーズ配置用基板２０は、ｍ×ｎ個（ｍ、ｎはいずれも自然数。）の反応槽２１を備える。この反応槽２１をウエルＷともいう。

また、反応槽２１は、水素濃度を検知するためのセンサ３０を備えている。反応槽２１のうち、例えば、ウエルＷ１１は、センサ３０−１１を備える。ウエルＷｍｎは、センサ３０−ｍｎを備える。一例として、センサ３０は、反応槽２１の底面に配設され。また、一例として、センサ３０は、イオン感応性電界効果トランジスタ（Ｉｏｎ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ｆｉｅｌｄ Ｅｆｆｅｃｔ Ｔｒａｎｓｉｓｔｏｒ；ＩＳＦＥＴ）である。

本実施形態において、ビーズ配置用基板２０の材質は、特に限定されないが、ガラス、シリコン、ポリマー等とすることができる。なお、ビーズ配置用基板２０にエラストラマー材料を用いる場合、微小なゴミなどの粒子が反応槽２１とビーズ配置用基板２０との間に挟まれたときに生じる反応槽２１全体のビーズ配置用基板２０との密着性に及ぼす悪影響がエラストラマーの局所的な変形により回避される利点がある。

ビーズ配置用基板２０には、複数の反応槽２１が配設されている。配設される反応槽２１の数は、標的核酸用プライマーとのアニーリング工程で使用したビーズ体１００の数以上である必要がある。一例として、反応槽２１のサイズは、ビーズ１よりも若干大きいサイズである。一例として、反応槽２１のサイズは、ビーズ１のサイズの１〜２倍程度であり、１個のビーズ１を収納可能な程度の大きさとなっている。なお、ビーズ配置用基板２０の表面や反応槽２１の内壁は、核酸等の非特異的吸着を防止するブロッキング剤、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）や２−メテクリオイルオキシエチルホスホリルコリン（ＭＰＣ）等でコーティングされていてもよい。このようなコーティングが施してあることで、ビーズ配置用基板２０の表面や反応槽２１の内壁への核酸の非特異的吸着を抑制することができる。また、一例として、反応槽２１の内壁は、親水化されている。内壁が親水化されていることにより、ビーズ体１００の分散液をビーズ配置用基板２０上に滴下した際、反応槽２１内部へのビーズ体１００の充填効率が向上する。

本実施形態の工程（ａ１）では、図３に示すように、核酸を含む試料と接触させた複数のビーズ体１００を、反応槽２１に、１個ずつ配置する。反応槽２１に、ビーズ体１００を配置する方法は、特に限定されず、例えば、ビーズ体１００を分散させた液体を、ビーズ配置用基板２０上に滴下し、撹拌、振盪、遠心分離等の手段により、ビーズ体１００を反応槽２１に誘導してもよい。あるいは、ビーズ体１００の分散液にビーズ配置用基板２０を浸漬し、撹拌、振盪、遠心分離等の手段を用いてもよい。
反応槽２１のうち、例えば、ウエルＷ１１には、ビーズ体１００−１１が配置される。ウエルＷｍｎには、ビーズ体１００−ｍｎが配置される。

また、ビーズ１に磁気ビーズを用いた場合には、ビーズ配置用基板２０の基板材料下に磁性体板と磁石を配置し、該磁石による磁力によりビーズ体１００を反応槽に誘導することもできる。この場合、基板材料下の磁石をビーズ配置用基板２０に対して平行方向に動かすことで、ビーズ体が分散し、反応槽２１へのビーズ体の充填効率が向上する。磁石によりビーズ配置用基板２０に印加する磁場の強さは、特に限定されないが、１００〜１００００ガウスである。また、磁石を取り除いた後も磁性体板の磁化は残るため、ビーズ体１００は安定した配置を保持し続けることが可能となる。かかる磁性体の材料としては、ニッケル、ニッケル合金、鉄および鉄合金などの金属を用いることができる。

［反応槽へのビーズの配置：変形例］
この変形例では、ビーズ体１００は、標的核酸用プライマー２の配列の種類ごとに異なる電気特性を有している。この電気特性には、インピーダンス、誘電率、導電率などが含まれる。この変形例では、「誘電率」を電気特性の一例として説明する。この一例の場合、反応槽２１にビーズ体１００を配置する工程において、図４に示すように誘電泳動によるソーティングを行ってもよい。例えば、ビーズ体１００Ａの誘電率は、誘電率εＡ、ビーズ体１００Ｂの誘電率は、誘電率εＢ、ビーズ体１００Ｃの誘電率は、誘電率εＣ、ビーズ体１００Ｄの誘電率は、誘電率εＤである。
互いに異なる誘電率を持つビーズを作製する方法としては、例えば、ビーズ材料に占める強誘電体の含有率が異なるビーズを作製することで実現可能である。

ここで、誘電泳動を用いて誘電率に応じたソーティングを行う方法について説明する。誘電体粒子に働く誘電泳動力は、印加される外部電界の強度、周波数、粒子の誘電率に依存する。電極間に一定の電圧および周波数が印加される場合を考えると、異なる誘電率を持つビーズには異なる大きさの誘電泳動力が働くことになる。適切な周波数に設定すれば、強電界部分から排除される方向に誘電泳動力が働く（負の誘電泳動）。誘電泳動理論の詳細については「AC Electrokinetic: Colloids and Nanoparticles, Research Studies Pr」等を参照されたい。そこで、図４のように、流路中に電極対を配置し、負の誘電泳動力が働くような周波数を印加すると、ビーズには流れに対して斜め方向に力が働くことになり、結果としてビーズの流路中での軌跡が変わることとなる。さらには、ビーズの誘電率によって働く誘電泳動力の大きさが変わるため、ビーズの種類毎に異なる軌跡で移動させることが可能となるため、結果としてビーズ種毎にソーティングが可能となる。この時、異なる電圧、周波数を印加する電極対を複数設ける（例えば、電極対ＥＰＡ及び電極対ＥＰＢを設ける）ことによって、ソーティング可能なビーズの種類を増やすことができる。
つまり、この変形例によれば、ビーズ体１００に固定されている標的核酸用プライマー２の配列の種類を、誘電率によって選別することができる。

誘電泳動を利用して、標的核酸用プライマー２の種類ごとにビーズ体１００を反応槽２１に配置することにより、複数の標的核酸配列を同時に定量することが可能になる。

［核酸伸長反応に必要な試薬の添加］
工程（ｂ１）は、前記画分に、核酸伸長反応に必要な試薬を添加する工程である。
本実施形態においては、核酸伸長反応に必要な試薬として、ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシヌクレオシド三リン酸、適切なバッファ等を挙げることができる。一例として、ＤＮＡポリメラーゼは、Ｔａｑポリメラーゼ等の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼである。核酸伸長反応に必要な試薬は、後述の工程（ｄ１）で行う核酸伸長反応の方法に応じて、適宜選択することができる。なお、一例として、ＤＮＡポリメラーゼなどの一部の試薬は、本工程で添加せず、あらかじめ反応槽２１の内壁に結合させておいてもよい。

一例として、核酸伸長反応としてＰＣＲ法や等温増幅法等の核酸増幅反応を行う場合は、本工程において、リバースプライマーを添加するもできる。なお、上記［反応槽へのビーズの配置：変形例］のように、誘電泳動を利用してビーズ体１００を反応槽２１に配置する場合には、ビーズ１の誘電率に対応した複数種類の標的核酸用プライマーが、ビーズ１に固定化されている。すなわち、この場合には、標的核酸配列が、ビーズ１の誘電率に対応して複数存在する。このように、標的核酸配列が複数存在する場合、リバースプライマーは、全ての標的核酸配列に共通なユニバーサルプライマーとしてもよく、各標的核酸配列に特異的なプライマーとしてもよい。

リバースプライマーは、一例として、ビーズ１に固定化しておくこともできる。また、標的核酸配列が１種類である場合には、リバースプライマーは、反応槽２１の内壁に固定化しておくこともできる。また、標的核酸配列が複数存在する場合であっても、リバースプライマーが、ユニバーサルプライマーである場合には、一例として、当該ユニバーサルリバースプライマーは、反応槽２１の内壁に固定化しておくこともできる。リバースプライマーをビーズ１又は反応槽２１の内壁に固定化する場合、リバースプライマーは、一例として、ビーズ１側又は反応槽２１の内壁側に光切断部位を有する。光切断部位とは、紫外線などの光を照射すると切断される性質を有する基をいい、かかる基を用いたものとしては、例えば、ＰＣ Ｌｉｎｋｅｒ Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ（Ｇｌｅｎ ｒｅｓｅａｒｃｈ社）、フラーレンを含有してなる核酸の光切断用組成物（核酸の光切断用組成物：特開２００５−２４５２２３）、特許文献１に記載のものなどを挙げることができる。あるいは、リバースプライマーは、１本鎖核酸切断酵素切断部位を有していてもよい。１本鎖核酸切断酵素切断部位とは、デオキシリボヌクレアーゼ、リボヌクレアーゼなどの１本鎖核酸切断酵素により切断されることができる核酸基をいい、ヌクレオチドおよびその誘導体が含まれる。そのような核酸基としては、例えば、エンドヌクレアーゼＶに認識されるデオキシイオシンなどを挙げることができる。核酸増幅反応開始前に、光照射又は１本鎖核酸切断酵素処理を行って、リバースプライマーをビーズ１から切り離すことにより、核酸増幅反応を効率よく行うことが可能になる。

［核酸伸長反応］
工程（ｃ１）は、前記画分毎に、核酸伸長反応を行う工程である。
核酸伸長反応は、ＤＮＡポリメラーゼ等を用いた公知の方法により行うことができる。核酸伸長反応の条件は、用いる方法に応じて、適宜設定することができる。例えば、反応槽２１内の温度を５５〜７０℃程度に維持して、核酸伸長反応を行ってもよい。

反応槽２１には、ビーズ体１００が1個ずつ配置されている。標的核酸用プライマー２が標的核酸配列３にアニーリングしているビーズ体１００では、標的核酸配列３を鋳型として、核酸伸長反応が起こる。一方、標的核酸用プライマー２が標的核酸配列３にアニーリングしていないビーズ体１００では、核酸伸長反応は起こらない。

本実施形態において、核酸伸長反応は、必ずしも核酸増幅反応である必要はない。ビーズ１に固定化された標的核酸用プライマー２の密度が高い場合には、１度の伸長反応で検出に十分なプロトンが発生する。核酸伸長反応を１回しか行わない場合には、反応槽２１にリバースプライマーを添加する必要はない。

一方、本実施形態では、核酸増幅反応を行うこともできる。核酸増幅反応の方法には、公知の方法を用いることができる。一例として、核酸増幅反応の方法には、ＰＣＲ法が用いられる。また、他の例として、ＬＡＭＰ法等の等温増幅法が用いられる。また、一例として、核酸増幅反応の方法には、デジタルＰＣＲ又はデジタル等温増幅法が用いられる。なお、核酸増幅反応を行う場合には、上記のとおり、反応槽２１内にリバースプライマーを存在させておく必要がある。

［プロトン発生量の測定］
工程（ｄ１）は、核酸伸長反応中の各画分のプロトン発生量を測定する工程である。核酸伸長反応によって核酸が１塩基伸長すると、１分子のプロトンが発生する。反応槽２１内のプロトン発生量は、センサ３０によって検出される。一例として、センサ３０は、ＩＳＦＥＴである。本実施形態に使用可能なＩＳＦＥＴとしては、例えば、国際公開公報ＷＯ２００８／１０７０１４号に記載のもの等を挙げることができる。

センサ３０がＩＳＦＥＴである場合の、プロトン発生量の測定例について説明する。図５に、各反応槽２１に備えられるセンサ３０の構成を示す。センサ３０は、ゲート絶縁膜ＧＩＦと、Ｎ型半導体ＳＮ（ソースｓｒｃ）と、ソース端子ＴＳと、Ｎ型半導体ＳＮ（ドレインｄｒｎ）と、ドレイン端子ＴＤと、Ｐ型半導体ＳＰと、参照電極ＥＲと、ゲート電源ＶＧと、バイアス電源ＶＢと、電流検出器ＣＤとを備える。これら各部の構成については、既知のＩＳＦＥＴと同様であるため、説明を省略する。センサ３０は、溶液とゲート絶縁膜ＧＩＦとの間に発生する界面電位に応じた電流値のドレイン電流を電流検出器ＣＤによって検出することにより、プロトン発生量を測定する。

［核酸伸長の有無の判定］
工程（ｅ１）は、測定された前記プロトン発生量に基づいて、画分毎に核酸伸長の有無を判定する工程である。センサ３０による反応槽２１内のプロトン発生量の測定値が上昇したか否かに基づいて、反応槽２１内での核酸伸長の有無を判定する。反応槽２１内のプロトン発生量が上昇した場合には、核酸伸長が生じたと判定され、反応槽２１内のプロトン発生量の上昇が検出されない場合には、核酸伸長が生じていないと判定される。

本実施形態においては、反応槽２１毎に配置されたセンサ３０によって、個々の反応槽２１内のプロトン発生量の変化を検出し、反応槽２１毎に、核酸伸長の有無を判定する。
なお、センサ３０は、電流検出器ＣＤによって検出されるドレイン電流の大きさに応じて、反応槽２１内に存在する核酸伸長が生じたビーズ体１００の数を検出する構成であってもよい。

［標的核酸配列の濃度の算出］
工程（ｆ１）は、核酸増幅有と判定された画分の数に基づいて、試料中の標的核酸配列の濃度を算出する工程である。工程（ａ１）において各反応槽２１には、１つのビーズ体１００が配置される。つまり、反応槽２１の数と、ビーズ体１００の数とは対応している。ビーズ体１００が配置された反応槽２１の数に対する、核酸増幅有と判定された反応槽２１の数を求めることにより、核酸を含む試料と接触させたビーズ体１００の数に対する、核酸増幅有と判定されたビーズ体１００の割合を求めることができる。核酸を含む試料と接触させたビーズ体１００の数に対する、核酸増幅有と判定されたビーズ体１００の割合は、試料中の標的核酸配列の濃度を示している。すなわち、工程（ｅ１）において核酸増幅有と判定された反応槽２１の数を計数することにより、試料中の標的核酸配列の濃度を求めることができる。

なお、［反応槽へのビーズの配置：変形例］のように、誘電泳動を利用してビーズ体１００を反応槽２１に配置する場合には、ビーズ１の誘電率に対応した複数種類の標的核酸用プライマーが、ビーズ１に固定化されている。すなわち、この場合には、標的核酸配列が、ビーズ１の誘電率に対応して複数存在する。このように、標的核酸配列が複数存在する場合には、標的核酸配列の種類毎に、試料中の標的核酸配列の濃度の算出を行う。例えば、図４の例では、ビーズ体１００Ａ、１００Ｂ、１００Ｃ、１００Ｄには、それぞれ異なる標的核酸配列３にアニーリングし得る標的核酸用プライマー２が固定化されている。ここで、ビーズ体１００Ａ、１００Ｂ、１００Ｃ、１００Ｄに固定化された標的核酸用プライマー２がアニーリングし得る標的核酸配列３を、それぞれ標的核酸配列３Ａ、３Ｂ、３Ｃ、３Ｄとする。この場合、試料中の標的核酸配列３Ａの濃度は、ビーズ体１００Ａが配置された全反応槽２１の中で、核酸増幅有と判定された反応槽２１の数の割合を求めることにより、算出することができる。同様に、試料中の標的核酸配列３Ｂの濃度は、ビーズ体１００Ｂが配置された全反応槽２１の中で、核酸増幅有と判定された反応槽２１の数の割合を求めることにより、算出することができる。試料中の標的核酸配列３Ｃ及びＤの濃度についても、同様に、ビーズ体１００Ｃ及び１００Ｄが配置されたそれぞれの全反応槽２１の中で、それぞれ核酸増幅有と判定された反応槽２１の数の割合を求めることにより、算出することができる。

＜実施形態２＞
実施形態１では、試料の分割の際に、ビーズ１を使用したが、試料の分割は、ビーズ１を用いることなく行ってもよい。例えば、核酸を含む試料に、標的核酸用プライマー２を添加し、アニーリング反応を行った後、各反応槽２１に分配することにより、試料の分割を行うこともできる。あるいは、予め各反応槽２１に、標的核酸用プライマー２を固定化しておき、試料を各反応槽２１に分配するようにしてもよい。この場合、反応槽２１の容量は、１ｆＬ〜１ｍＬとすることができ、１ｐＬ〜１μＬとすることができる。

核酸伸長反応、プロトン発生量の測定、核酸増幅の有無の判定及び標的核酸配列濃度の算出は、実施形態１と同様に行うことができる。

本実施形態の方法において、試料の分割、核酸伸長反応、標的核酸配列の濃度算出は、標準的なデジタルＰＣＲ又はデジタル等温増幅の手法を用いて行ってもよい。

本実施形態の方法によれば、核酸を含む試料の標的核酸配列の濃度を、例えば蛍光染色などの手法を用いなくても精度よく測定することができる。

本実施形態の方法は、感染症の原因となる病原体遺伝子の検出・同定や癌などの疾患関連遺伝子の検出・同定、疾患関連遺伝子の発現解析等に利用することができ、感染症や癌などの疾患の診断や治療効果のモニタリング等に有用である。

＜＜第２実施形態＞＞
一例として、本実施形態の方法における標的生体分子は、所望のタンパク質である。また、標的生体分子に結合し得るリガンドは、標的タンパク質に結合し得る抗体（以下、「標的抗原検出用抗体」という）である。本実施形態においては、標的生体分子がタンパク質である場合について説明する。

本実施形態の標的タンパク質の濃度算出方法は、（ａ２）タンパク質を含む試料を、標的タンパク質に結合し得る抗体を含む、複数の画分に分割する工程と、（ｂ２）前記画分に、核酸伸長に必要な試薬を添加する工程と、（ｃ２）前記画分毎に、標的核酸配列の核酸伸長反応を行う工程と、（ｄ２）前記核酸伸長反応中の各画分のプロトン発生量を測定する工程と、（ｅ２）測定された前記プロトン発生量に基づいて、前記画分毎に核酸伸長の有無を判定する工程と、（ｆ２）核酸伸長有と判定された画分の数に基づいて、前記試料中の標的タンパク質の濃度を算出する工程と、の各工程を有する。以下、各工程について説明する。
＜実施形態１＞
［複数画分への試料の分割］
本実施形態における工程（ａ２）は、タンパク質を含む試料を、複数の画分に分割する工程である。本実施形態では、タンパク質を含む試料を、標的タンパク質に結合し得る抗体を固定化した複数のビーズと接触させ、ビーズを１つずつ反応槽に配置することにより、試料を複数の画分に分割する。
［標的タンパク質との抗原抗体反応］
本実施形態においては、タンパク質を含む試料を、標的抗原検出用抗体が固定化された複数のビーズと接触させる工程を有する。

まず、本実施形態で用いるビーズについて、図７を参照して説明する。図７中、１はビーズ、５は標的抗原検出用抗体、１００ａはビーズ１に標的抗原検出用抗体５が固定化されたビーズ体、４００は標的タンパク質を示す。

本実施形態においては、第１実施形態の標的核酸用プライマー２に替り、標的抗原検出用抗体５がビーズ１に固定化されている。標的抗原検出用抗体５は、目的とする標的タンパク質に特異的に結合し得る抗体である。標的抗原検出用抗体５は、公知の抗体取得方法により、得ることができる。また、標的抗原検出用抗体５は、どのような動物由来のものであってもよい。マウス抗体、ニワトリ抗体、ウサギ抗体等、当技術分野で一般的に用いられる抗体を使用することができる。また、標的抗原検出用抗体５は、キメラ抗体、ヒト化抗体等の組み換え抗体であってもよい。また、標的抗原検出用抗体５は、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）_２断片、Ｆｖ断片、一本鎖抗体等の抗体断片であってもよい。本明細書において、「抗体」という用語は、抗原に対する特異性及び結合性が維持されるこれらの抗体断片を包含する。

標的抗原検出用抗体５のビーズ１への固定化は、公知の方法を用いて行うことができる。例えば、第１実施形態の標的核酸用プライマー２と同様に、アビジン-ビオチン結合を利用した固定化することができる。また、標的抗原検出用抗体５をアミノ基、ホルミル基、ＳＨ基などの官能基で修飾し、ビーズ１をアミノ基、ホルミル基、エポキシ基などを有するシランカップリング剤で表面処理することにより、固定化を行ってもよい。

標的抗原検出用抗体５は、ビーズ１に対して、複数分子を固定化することができる。一例として、標的抗原検出用抗体５は、２分子以上がビーズ１に固定化される。標的抗原検出用抗体５は、ビーズ１の表面積に応じて、標的タンパク質４００との結合を妨げない程度の密度で、固定化されていればよい。なお、ビーズ１に対して、２分子以上の標的抗原検出用抗体５を固定化する場合、１つのビーズ１に固定化される標的抗原検出用抗体５は、全て同一のタンパク質を標的とする。

ビーズ１については、第１実施形態と同様である。なお、誘電泳動を利用してビーズ体１００ａを反応槽に配置する場合には、固定化する標的抗原検出用抗体５の種類毎に、ビーズ１が異なる誘電率を有するようにしてもよい。

本実施形態の工程（ａ２）では、ビーズ１に標的抗原検出用抗体５が固定化されたビーズ体１００ａを、タンパク質を含む試料と接触させる。本実施形態において、タンパク質を含む試料は、特に限定されず、例えば、生体サンプルや環境サンプルからのタンパク質抽出物等を含む試料等を使用することができる。試料に含まれるタンパク質は、天然タンパク質に限定されず、修飾タンパク質や組み換えタンパク質等であってもよい。

ビーズ体１００ａとタンパク質を含む試料との接触は、例えば、ビーズ体１００ａとタンパク質を含む試料とを混合することにより行うことができる。一例として、ビーズ体１００とタンパク質を含む試料との混合物は、標的抗原検出用抗体５が標的タンパク質に結合し得る条件に置かれる。結合条件は、標的抗原検出用抗体５の種類等に応じて、適宜設定することができる。

図７において、ビーズ体１００ａをタンパク質を含む試料と接触させると、該試料に標的タンパク質４００が含まれている場合、標的抗原検出用抗体５は、標的タンパク質４００に結合する。すなわち、標的タンパク質４００は、標的抗原検出用抗体５に結合し、ビーズ体１００ａに捕捉される。一方、試料中に標的タンパク質４００が含まれていない場合には、標的抗原検出用抗体５には何も結合しない。したがって、複数のビーズ体１００ａを試料と接触させた場合、標的抗原検出用抗体５が標的タンパク質４００に結合しているビーズ体１００ａと、標的抗原検出用抗原５が標的タンパク質４００に結合していないビーズ体１００ａとの混合物が形成される。なお、試料と接触させるビーズ体１００ａの数は、検出したい標的タンパク質の数に応じて、適宜選択することができる。

［反応槽へのビーズの配置］
次に、タンパク質を含む試料と接触させたビーズ体１００ａを、ビーズ毎に、個別の反応槽に配置する。ビーズ体１００ａの反応槽への配置は、第１実施形態の工程（ａ１）と同様に行うことができる。第１実施形態の工程（ａ１）で記載した変形例についても同様に行うことができる。

［核酸伸長反応に必要な試薬の添加］
工程（ｂ２）は、前記画分に、核酸伸長反応に必要な試薬を添加する工程である。

本実施形態の工程（ｂ２）では、第１実施形態の工程（ｂ１）で添加する試薬に加えて、シグナル生成用核酸３１０を結合させた２次抗体３０１を添加する。２次抗体３０１は、標的タンパク質４００に特異的に結合し得る抗体である。２次抗体３０１は、標的抗原検出用抗体５と同じ抗体であってもよく、違う抗体であってもよい。一例として、２次抗体３０１は、標的抗原検出用抗体５と同一のタンパク質に結合し、異なるエピトープを有する抗体である。

２次抗体３０１には、一例として、図７に示すように、シグナル生成用核酸３１０が結合されている。２次抗体３０１とシグナル生成用核酸３１０との結合は、一例として、アビジン-ビオチン結合を利用して行うことができる。

シグナル生成用核酸３１０は、一例として、図７に示すように、プライマーアニーリング領域３１１とシグナル生成用配列３１２とを含む。プライマーアニーリング領域３１１は、シグナル生成用核酸３１０の３’側に位置している。シグナル生成用核酸３１０は、一例として、全ての種類の２次抗体に対して、同じ配列であることができる。また、シグナル生成用核酸３１０は、一例として、プライマーアニーリング領域３１１が、全ての種類の２次抗体に対して、同じ配列である。シグナル生成用核酸３１０の配列は、特に限定されず、適宜選択することができる。なお、図７において、３００は、２次抗体３０１にシグナル生成用核酸３１０を結合させた複合体プローブを示す。

本工程では、一例として、複合体プローブ３００は、核酸伸長反応に必要な他の試薬を添加する前に、反応槽２１に添加される。この場合、一例として、ビーズ１が磁気ビーズであれば、ビーズ１を反応槽２１に固定して、反応槽２１を洗浄することにより、標的タンパク質４００に結合していない複合体プローブ３００を反応槽２１から除去することができる。なお、複合体プローブ３００は、後述する工程（ｄ２）の核酸伸長反応の前であれば、どのようなタイミングで、試料又は反応槽２１に添加してもよい。

本工程においては、複合体プローブ３００に加えて、さらに、シグナル生成用プライマー３２０を添加する。シグナル生成用プライマー３２０は、複合体プローブ３００の添加後に反応槽２１に添加される。一例として、シグナル生成用プライマー３２０の添加前に、標的タンパク質４００に結合していない複合体プローブ３００は、洗浄により反応槽２１から除去される。シグナル生成用プライマー３２０の反応槽２１への添加は、一例として、他の核酸伸長に必要な試薬と共に行うことができる。

上記以外の核酸伸長反応に必要な試薬については、第１実施形態の工程（ｂ１）と同じである。

［核酸伸長反応］
工程（ｃ２）は、前記画分毎に、核酸伸長反応を行う工程である。
本工程は、第１実施形態の工程（ｃ１）と同様に行うことができる。なお、本工程では、図７に示すように、シグナル生成用配列３１２を鋳型とする核酸伸長反応が起こる。第１実施形態と同様に、標的抗原検出用抗体５に標的タンパク質４００が結合していない場合には、核酸伸長反応は起こらない。

［プロトン濃度の検出］
工程（ｄ２）は、核酸伸長反応の各反応槽におけるプロトン発生量の測定をする工程である。本工程は、第１実施形態の工程（ｅ１）と同様に行うことができる。

［標的核酸配列の濃度の算出］
工程（ｆ２）は、核酸伸長有と判定された画分の数に基づいて、前記試料中の標的タンパク質の濃度を算出する工程である。本工程は、第１実施形態の工程（ｆ１）と同様に行うことができる。すなわち、ビーズ体１００ａが配置された反応槽２１の数に対する、核酸増幅有と判定された反応槽２１の数を求めることにより、タンパク質を含む試料と接触させたビーズ体１００の数に対する、核酸増幅有と判定されたビーズ体１００の割合を求めることができる。タンパク質を含む試料と接触させたビーズ体１００ａの数に対する、核酸増幅有と判定されたビーズ体１００の割合は、試料中の標的タンパク質の濃度を示している。すなわち、工程（ｅ２）において核酸増幅有と判定された反応槽２１の数を計数することにより、試料中の標的タンパク質の濃度を求めることができる。

なお、第１実施例で記載した［反応槽へのビーズの配置：変形例］のように、誘電泳動を利用してビーズ体１００を反応槽２１に配置する場合には、ビーズ１の誘電率に対応した複数種類の標的抗原検出用抗体５が、ビーズ１に固定化されている。すなわち、この場合には、標的タンパク質が、ビーズ１の誘電率に対応して複数存在する。このように、標的核酸配列が複数存在する場合には、第１実施例の標的核酸配列と同様に、標的抗原検出用抗体５の種類毎に、試料中の標的タンパク質の濃度の算出を行う。

＜実施形態２＞
第１実施形態と同様に、試料の分割は、ビーズ１を用いることなく行ってもよい。例えば、タンパク質を含む試料に、標的抗原検出用抗体５を添加し、抗原抗体反応を行った後、各反応槽２１に分配することにより、試料の分割を行うこともできる。あるいは、予め各反応槽２１に、標的抗原検出用抗体５を固定化しておき、試料を各反応槽２１に分配するようにしてもよい。この場合、反応槽２１の容量は、１ｆＬ〜１ｍＬとすることができ、また一例として、１ｐＬ〜１μＬとすることができる。

核酸伸長反応に必要な試薬の添加、核酸伸長反応、プロトン発生量の測定、核酸増幅の有無の判定及び標的タンパク質濃度の算出は、実施形態１と同様に行うことができる。

本実施形態の方法において、試料の分割、核酸伸長反応、標的タンパク質の濃度算出は、標準的なデジタルＥＬＩＳＡの手法に準じた方法で行ってもよい。

本実施形態の方法によれば、タンパク質を含む試料の標的タンパク質の濃度を、例えば蛍光染色などの手法を用いなくても精度よく測定することができる。

本実施形態の方法は、感染症の原因となる病原体遺伝子の検出・同定や癌などの疾患関連遺伝子の検出・同定、疾患関連遺伝子の発現解析等に利用することができ、感染症や癌などの疾患の診断や治療効果のモニタリング等に有用である。

＜標的生体分子濃度算出装置＞
［標的核酸配列濃度算出装置の構成例］
上述した第１実施形態の方法を実現する標的核酸配列濃度算出装置２００の構成の一例について、図６を参照して説明する。
図６は、本実施形態における標的核酸配列濃度算出装置２００の構成の一例を示す図である。標的核酸配列濃度算出装置２００は、ビーズ配置用基板２０と、演算装置２１０とを備える。
ビーズ配置用基板２０は、反応槽２１と、センサ３０とをそれぞれ複数備える。この反応槽２１は、複数の画分に分割され、生体分子を含む試料が配置される。センサ３０とは、核酸増幅反応中の各画分、すなわち反応槽２１のプロトンを検出する検出部の一例である。
１つの反応槽２１には、１つのビーズ１が配置される。このビーズ１には、上述した標的核酸用プライマー２が固定化されている。

演算装置２１０は、例えばＣＰＵ（Ｃｅｎｔｒａｌ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ Ｕｎｉｔ）を備えており、その機能部としての核酸増幅判定部２１１と、標的核酸配列濃度算出部２１２とを備えている。
核酸増幅判定部２１１は、センサ３０が検出する反応槽２１毎のプロトンの発生量に基づいて、反応槽２１内における核酸増幅の有無を反応槽２１毎に判定する。つまり、核酸増幅判定部２１１とは、検出部が検出するプロトンの発生量に基づいて、画分毎に核酸増幅の有無を判定する核酸増幅判定部の一例である。具体的には、核酸増幅判定部２１１は、センサ３０の出力電流値と、プロトンの発生量との対応を示す情報を予め有している。核酸増幅判定部２１１は、センサ３０の出力電流値を取得し、取得した出力電流値に基づいて、プロトンの発生量を推定する。核酸増幅判定部２１１は、推定したプロトンの発生量に基づいて、核酸増幅の有無を判定する。ここで、センサ３０は反応槽２１毎に備えられている。核酸増幅判定部２１１は、反応槽２１毎にセンサ３０の出力電流値を取得することにより、核酸増幅の有無を反応槽２１毎に判定する。

標的核酸配列濃度算出部２１２は、核酸増幅判定部２１１が核酸増幅有と判定する反応槽２１の数に基づいて、試料中の標的核酸配列の濃度を算出する。つまり、標的核酸配列濃度算出部２１２とは、核酸増幅判定部２１１が核酸増幅有と判定する画分の数に基づいて、試料中の標的生体分子の濃度を算出する標的生体分子濃度算出部の一例である。ビーズ特定用核酸１０の配列の特定の具体的な手順については、上述の［標的核酸配列の濃度の算出］において詳細に説明したため、ここでの説明を省略する。

本実施形態の標的核酸配列濃度算出装置２００によれば、核酸を含む試料の標的核酸配列の濃度を、例えば蛍光染色などの手法を用いなくても精度よく測定することができる。

［標的タンパク質濃度算出装置の構成例］
上述した第２実施形態の方法を実現する標的タンパク質濃度算出装置２００−２の構成は、上述の標的核酸配列濃度算出装置２００において、標的核酸配列濃度算出部２１２に替えて標的タンパク質濃度算出部を備えたものとすることができる。

なお、本発明の実施形態における標的核酸配列濃度算出装置２００及び標的タンパク質濃度算出装置２００−２の各処理を実行するためのプログラムをコンピュータ読み取り可能な記録媒体に記録して、当該記録媒体に記録されたプログラムをコンピュータシステムに読み込ませ、実行することにより、上述した種々の処理を行ってもよい。

なお、ここでいう「コンピュータシステム」とは、ＯＳや周辺機器等のハードウェアを含むものであってもよい。また、「コンピュータシステム」は、ＷＷＷシステムを利用している場合であれば、ホームページ提供環境（あるいは表示環境）も含むものとする。また、「コンピュータ読み取り可能な記録媒体」とは、フレキシブルディスク、光磁気ディスク、ＲＯＭ、フラッシュメモリ等の書き込み可能な不揮発性メモリ、ＣＤ−ＲＯＭ等の可搬媒体、コンピュータシステムに内蔵されるハードディスク等の記憶装置のことをいう。

さらに「コンピュータ読み取り可能な記録媒体」とは、インターネット等のネットワークや電話回線等の通信回線を介してプログラムが送信された場合のサーバやクライアントとなるコンピュータシステム内部の揮発性メモリ（例えばＤＲＡＭ（Dynamic Random Access Memory））のように、一定時間プログラムを保持しているものも含むものとする。また、上記プログラムは、このプログラムを記憶装置等に格納したコンピュータシステムから、伝送媒体を介して、あるいは、伝送媒体中の伝送波により他のコンピュータシステムに伝送されてもよい。ここで、プログラムを伝送する「伝送媒体」は、インターネット等のネットワーク（通信網）や電話回線等の通信回線（通信線）のように情報を伝送する機能を有する媒体のことをいう。また、上記プログラムは、前述した機能の一部を実現するためのものであっても良い。さらに、前述した機能をコンピュータシステムにすでに記録されているプログラムとの組み合わせで実現できるもの、いわゆる差分ファイル（差分プログラム）であってもよい。

以上、本発明の実施形態について図面を参照して詳述したが、具体的な構成はこの実施形態に限られるものではなく、この発明の要旨を逸脱しない範囲の設計等も含まれる。

１…ビーズ、２…標的核酸用プライマー、３…標的核酸配列、５…標的抗原検出用抗体、２０…ビーズ配置用基板、２１…反応槽、３０…センサ、１００…ビーズ体、２００…標的核酸配列濃度算出装置、２１１…核酸増幅判定部、２１２…標的核酸配列濃度算出部、３００…複合体プローブ、３０１…２次抗体、３１０…シグナル生成用核酸、３１１…プライマーアニーリング領域、３１２…シグナル生成用配列、３２０…シグナル生成用プライマー、４００…標的タンパク質

Claims (11)

1. 標的生体分子の濃度算出方法であって、
   （ａ）生体分子を含む試料を、標的生体分子と結合し得るリガンドを含む、複数の画分に分割する工程と、
   （ｂ）前記画分に、核酸増幅に必要な試薬を添加する工程と、
   （ｃ）前記画分毎に、核酸伸長反応を行う工程と、
   （ｄ）前記核酸伸長反応中の各画分のプロトン発生量を測定する工程と、
   （ｅ）測定された前記プロトン発生量に基づいて、前記画分毎に核酸伸長の有無を判定する工程と、
   （ｆ）核酸伸長有と判定された画分の数に基づいて、前記試料中の標的生体分子の濃度を算出する工程と、
   を含む標的生体分子の濃度算出方法。
2. 前記標的生体分子が核酸であり、前記リガンドが標的生体分子である核酸とアニーリングし得るプライマーである、請求項１に記載の標的生体分子の濃度算出方法。
3. 前記標的生体分子がタンパク質であり、前記リガンドが前記標的生体分子であるタンパク質と結合し得る抗体である、請求項１に記載の標的生体分子の濃度算出方法。
4. 工程（ａ）が、
   （ａ−１）ビーズに固定化されたプライマーの標的核酸配列、及びビーズの誘電率が互いに異なる複数群のビーズと、前記試料とを接触させる工程と、
   （ａ−２）前記複数群のビーズを、誘電泳動により、ビーズ毎に、所定の反応槽に配置する工程と、
   を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の標的生体分子の濃度算出方法。
5. 同一の電気特性を有するビーズには、同一の配列を有するプライマーが固定化されている
   請求項１〜４のいずれか一項に記載の標的生体分子の濃度算出方法。
6. 前記工程（ｃ）の核酸増幅反応が、ＰＣＲ法又は等温増幅法により行われる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の標的生体分子の濃度算出方法。
7. 前記工程（ｃ）の核酸増幅反応が、デジタルＰＣＲ又はデジタル等温増幅法により行われる、請求項６に記載の標的生体分子の濃度算出方法。
8. 前記工程（ｄ）のプロトン発生量の測定が、ＩＳＦＥＴにより行われることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか一項に記載の標的生体分子の濃度算出方法。
9. 所定の電気特性を有するビーズ体に当該電気特性に対応する種類のリガンドが固定化された、標的生体分子濃度算出用ビーズ。
10. 所定の電気特性を有するビーズ体に当該電気特性に対応する種類のリガンドが固定化された、標的生体分子濃度算出用ビーズを複数含む、標的生体分子の濃度を算出するためのビーズのセット。
11. 複数の画分に分割された生体分子を含む試料の前記画分毎に行われる核酸増幅反応中の各画分のプロトンを検出する検出部と、
    前記検出部が検出するプロトンの発生量に基づいて、前記画分毎に核酸増幅の有無を判定する核酸増幅判定部と、
    前記核酸増幅判定部が核酸増幅有と判定する画分の数に基づいて、前記試料中の標的生体分子の濃度を算出する標的生体分子濃度算出部と、
    を備える標的生体分子濃度算出装置。

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