JP2017500892A - インビトロ精子形成を実施するための方法及び関連するデバイス - Google Patents

Abstract

本発明は、雄胚組織からインビトロで精子を形成するための方法であって、前記胚組織が配置される少なくとも１つの凹部を含む、生体材料からなるバイオリアクター内で、生殖細胞を含む精巣組織を成熟させ、伸長精細胞及び／又は精子を回収することを含む方法。【選択図】なし

Description

本発明は、インビトロ精子形成を実施するための方法及び関連するデバイスに関する。

世界で毎年１６０，０００人の子供が小児癌に罹っている。過去３０年間における腫瘍学の進歩によって、小児癌は大きな恩恵を受け、発展途上国における治癒率は７５〜８０％にも達している。しかし、幼小児期に癌を克服した男児のうち、成人してから通常の質の精子を産生できるのは３３％にすぎない。実のところ、癌治療剤は配偶子毒性作用を有し、不妊を生じうることが知られている。成人であればその受胎可能性を保存すべく、治療（例えば癌治療）の開始前に精子を冷凍保存するよう薦められるが、小児ではもちろんこれは不可能である。こうした男児達にとって現在実現可能な唯一の保存プロトコールは、その精巣組織を採取して凍結保存するというものである。しかし、医療補助を伴う家族計画との関係では、今のところ将来の科学の進歩によって受胎能が回復する保証はない。

従って、将来の家族計画を実現させるために、斯かる小児の受胎能を保存する技術の開発が必要とされている。

幼小児期又は成人期に実施される癌治療の他に、不妊の原因としては、遺伝的又は後天的非閉塞性無精子症、両側性停留精巣、重篤な鎌状細胞疾患等も挙げられる。

従って、受胎能を回復するべく、精巣組織から精子を産生することを可能とする方法の提供が必要とされている。

生殖生物学者は数十年に亘って、哺乳類における精子形成をインビトロ（in vitro）（エクスビボ（ex vivo））で達成する技術を開発する試みを続けてきた。精子形成（spermatogenesis）は、数段階の細胞分裂及び細胞分化を含み、伸長精細胞及び精子の形成に至る独自の複雑なプロセスである。精子形成の完全なサイクルには、マウスで約３０日、ラットで５４日、ヒトで７２日かかる。精子形成は精細管内で生じるが、ここで生殖細胞は、本プロセスの完遂に必要な体細胞であるセルトリ（Sertoli）細胞と密接な関連を生じる。精子形成を制御する局所的（精巣内）機序は依然としてよく分かっていない。このためもあり、研究への投資が続けられているにもかかわらず、ヒトにおける該プロセス全体をインビトロ（又はエクスビボ）で再現する方法が未だに存在しない。本分野で最も目覚ましい進展があったのは最近のことである。器官型培養法を開発した日本の研究チームが、最近、未成熟マウスの精原細胞からインビトロで受精する精子を得たと発表した（Takuya Sato等, Nature, 2011, 471, 504-508）。未成熟の雄生殖細胞を機能的な精子に成熟させることが可能な培養条件を特定したのは大きな進展であるが、依然として注意すべき点が幾つか残っている。当然ながら、大きな懸案事項の一つは効率である。彼らの系では、４０日間の培養の後、睾丸断片の末梢領域のみが精子形成の進行を示した一方、中心部は正常な形態を損なってしまい、変性した細胞も多数に上った。現在利用可能なインビトロ系を用いた場合、当初の未成熟雄生殖細胞の数に対する、産生される伸長精細胞及び精子の数の割合は、インビボでの正常な睾丸と比較すると遙かに少なかった。有鞭毛精子が観察されたのは、新生児睾丸２由来の１１の培養外植片のうちわずか５つ、ＳＳＣ移植睾丸由来の１７の培養外植片のうちわずか３つに過ぎなかった（Sato等, Nat Commun., 2011, 2, 472）。つい最近では、ドイツ及びイスラエルの研究チームが、３Ｄ培養系における単離精巣細胞の共培養を用いた。しかし、得られた精子に子孫を産生する能力があるか否かについては報告していない。更に、これらの技術は実施が困難で、大量の生体組織を必要とするという難点があり、ヒトへの適応は極めて難しいように思われる。

また、Staub等（Experimental Cell Research, 2000, 260, 85-95）、Godet等（Developmental Biology, 2008, 315, 173-188）、及びPerrard等（Molecular Reproduction and Development, 2003, 65, 86-95）に示すように、精子形成の実施における二室型チャンバー（bicameral chamber）の使用が知られている。しかし、これらの方法は、受精可能な精細胞又は受精可能な精子を得ることを可能とするものではない。

凝固多糖類ヒドロゲルからなる中空繊維、例えばキトサン系の中空繊維は、組織工学、生体膜、又は徐放性ベクターに使用可能なバイオリアクターとして記載され、提案されてきた。ヒドロゲルは高分子網目構造、好ましくは３Ｄ弾性高分子網目構造であり、含水率が高いため、水和された天然の組織を模倣することができる。N.M.S. Bettahalli等（Acta Biomaterialia 7, 2011, 3312-3324）は、骨格に細胞又は生体分子を組み合わせてなる三次元組織コンストラクトに基づく組織損傷の治療のための組織工学コンストラクトの分野において、栄養供給を改善するために中空繊維膜を用いることを開示する。Wang等（Membr. Sci. 2000, 166, 31-39）は、環状中空繊維を開示する。国際公開第２００９／０４４０５３号は、キトサン等の凝固多糖類ヒドロゲルからなる単層又は多層膜中空繊維を開示する。Robert E. Chapin及びKim Boekelheide （Reproductive Toxicology 39, 2013, 63-68）は、精子形成分野でヒト細胞を用いた組織のインビトロモデルの作成に言及し、多区画の開発を支援しうる一部の新たなヒドロゲル及び／又は３Ｄマトリックスを用いて、睾丸細胞の評価を行うべきであると示唆している。著者等は、セルトリ（Sertoli）細胞及び生殖細胞の存在こそが、インビトロでの睾丸組織の再建の鍵ではないかとし指している。

ヒト及び動物のためにインビトロで精子形成を実行する方法を提供することが依然として求められている。

本発明の目的は、受精可能な伸長精細胞又は受精しうる精子を得るための、インビトロでの精子形成の方法を提供することである。

本発明の別の目的は、少量の胚組織を用いた場合でも効率的に実施しうる、斯かる方法を提供することである。

本発明の別の目的は、インビトロでの受精の方法を提供することである。他の目的については以下の説明を読めば明らかになるであろう。

上述の課題及び従来技術の欠点は、驚くべきことに、本発明によって解決される。本発明は、雄胚組織からインビトロ（エクスビボ）で精子を形成する方法であって、前記胚組織が配置される少なくとも１つの凹部を含む生体材料からなるバイオリアクター内で、該胚組織を成熟させることを含む方法に関する。成熟プロセス又は成熟期間の終了時に、伸長精細胞及び／又は精子が回収される。

図１は、３９日間の培養後の２０日齢のラットの生殖細胞を示す。 図２は、３９日間の培養後の２０日齢のラットの生殖細胞を示す。 図３は、６１日間の培養後の８日齢のラットの生殖細胞を示す。 図４は、６１日間の培養後の８日齢のラットの生殖細胞を示す。 図５は、６１日間の培養後の８日齢のラットの睾丸断面を示す。 図６は、６１日間の培養後の６０日齢のラットの睾丸断面を示す。 図７は、６１日間の培養後の８日齢のラットの生殖細胞を示す。 図８は、６１日間の培養後の８日齢のラットの生殖細胞を示す。 図９は、３９日間の培養後の２０日齢のラットの生殖細胞を示す。 図１０は、３９日間の培養後の２０日齢のラットの生殖細胞を示す。 図１１は、５４日間の培養後の１．５歳齢のカニクイザルの生殖細胞を示す。 図１２は、５４日間の培養後の１．５歳齢のカニクイザルの生殖細胞を示す。 図１３は、５４日間の培養後の１．５歳齢のカニクイザルの生殖細胞を示す。 図１４は、３４日間の培養後の男性から女性への性転換ヒトの生殖細胞を示す。 図１５は、３４日間の培養後の男性から女性への性転換ヒトの生殖細胞を示す。

本発明によれば、「生体材料」（biomaterial）とは生体適合性材料、即ち細胞又は組織に毒性を示さない材料を意味すると解すべきである。

本発明は、雄胚組織を用いて３Ｄ生体適合性構造内に拘束すべきである、という知見に基づく。胚組織は生殖細胞を含む精巣組織である。より好ましくは、精細管又は精細管の断片である。一般的には、細管の断片を操作する方が簡便であり、また、異なる段階の細胞（生殖細胞及び／又はセルトリ（Sertoli）細胞）を含められるという点では、数個の異なる細管の断片を混合して用いることが有利である。また、細管又はその断片に対し、前記精細管又はその断片から回収された生殖細胞又は他の輸精細胞を加えて用いることも興味深い。細管は、その他の精巣組織、特に周辺の組織又はライディッヒ（Leydig）細胞から、例えば機械的又は化学的処置により解離又は分離される。

即ち、本発明は、インビトロでの雄胚組織からの精子形成方法であって、前記胚組織が配置される少なくとも１つの凹部を含む生体材料からなるバイオリアクター内で、生殖細胞を含む精巣組織を成熟させ、次いで伸長精細胞及び／又は精子を回収することを含む方法に関する。

本発明によれば、前記精巣組織は、少なくとも１つの精細管又は少なくとも１つの精細管の断片、好ましくは数個の精細管又は数個の精細管の断片、より好ましくは２、３、４、好ましくは５から、１０、２０、３０、４０又は５０までの精細管に由来する断片を含む（全ての組み合わせが包含される）。例えば、前記精巣組織は、２〜５０、３〜４０、４〜３０、５〜２０の精細管からの断片を含む。これらの細管は、同一の患者又はドナーの睾丸に由来するものでもよく、異なるドナーの睾丸に由来するものでもよい。

前記精細管は、当業者に公知の各種方法により、睾丸から分離され得る。斯かる方法は、細管をその他の睾丸及びライディッヒ（Leydig）細胞から、機械的又は酵素的に分離、例えばコラゲナーゼを用いて分離する方法であってよい。また機械的分離、例えば外科用メス等を用いた方法であってもよい。本発明において「断片」（fragments）とは、精細管の部分を意味する。前記の精細管の断片は、その操作及び凹部内への配置を容易にするようなサイズを有していてもよい。典型的には、そのサイズは約１から約５ｍｍの範囲であるが、これは細管の一部の長さを意味する。前記断片は、その元となる細管と同様、生殖細胞、セルトリ（Sertoli）細胞、及び（特に筋様型の）細管周囲細胞を含むことが好ましく、典型的には無傷の細管内における天然の構成と同様或いは類似の構成を有することが好ましい。前記睾丸は１人の患者に由来するものでも、１又は数人のドナーに由来するものでもよい。本発明の方法において、前記胚組織の由来となる患者は、ヒトでも非ヒトでもよい。好ましくは、前記患者はヒト又は非ヒト哺乳類である。

本発明によれば、前記精巣組織は、生殖細胞、セルトリ（Sertoli）細胞、及び細管周囲細胞を含む。更にライディッヒ（Leydig）細胞が存在していてもよい。

本発明によれば、生殖細胞、セルトリ（Sertoli）細胞、及び細管周囲細胞、並びにこれらの混合物からなる群より選択される細胞が、精巣組織に加えられる。

好ましくは、前記胚組織は：
ａ）生殖細胞；セルトリ（Sertoli）細胞；（特に筋様型の）細管周囲細胞を含み；更にライディッヒ（Leydig）細胞を含んでいてもよい、精細管又は精細管の断片を含む患者の試料；或いは
ｂ）患者から得られた生殖細胞を含む精細管又は精細管の断片と、１又は２以上のドナーの少なくともセルトリ（Sertoli）細胞；（特に筋様型の）細管周囲細胞を含み；更にライディッヒ（Leydig）細胞を含んでいてもよい細胞群との混合物
であってよい。

上記ａ）及びｂ）に加えて、精細管又はその断片から回収された生殖細胞及び／又はセルトリ（Sertoli）細胞を加えてもよい。斯かる細管は、例えば機械的又は化学的処置により脱離され、更に生殖細胞及び／又はセルトリ（Sertoli）細胞を回収するべく処理されたものでもよい。

前記雄胚組織は思春期前又は思春期後患者から得ることができる。例えば：
− 性腺毒性処置又は手術、例えば癌治療等を近々受ける予定の、健常な思春期前又は思春期後患者；
− 胚組織を有するが、例えば遺伝的若しくは後天的非閉塞性無精子症、幼小児期の両側性停留精巣、又は重篤な鎌状細胞疾患等により、精子を産生しない思春期後患者；
− 両側性停留精巣又は重篤な鎌状細胞疾患を有する思春期前患者；
− 絶滅危惧種；
− 医療又は手術的処置、例えば去勢等に供する予定のウマ、ラクダ、ヒトコブラクダ、又は愛玩動物；
− 家畜
から得ることができる。

好ましくは、胚組織は：
− 性腺毒性処置又は手術、例えば癌治療等を近々受ける予定の、健常思春期前又は思春期後ヒト又は動物；
− 胚組織を有するが、例えば遺伝的若しくは後天的非閉塞性無精子症、幼小児期の両側性停留精巣、又は重篤な鎌状細胞疾患等により、精子を産生しない思春期後ヒト又は動物；
− 両側性停留精巣又は重篤な鎌状細胞疾患を有する思春期前ヒト
から得られる。

本発明のバイオリアクターは、生体材料からなると共に、前記胚組織を配置又は包有するための、少なくとも１つの凹部を有する。本発明によれば、「胚組織を配置又は包囲するための、少なくとも１つの凹部を有するバイオリアクター」（a bioreactor comprises at least one cavity wherein the germinal tissue is placed or confined）とは、前記バイオリアクターが予め構成されていて、胚組織を導入するための凹部を含んでいてもよく、或いは前記バイオリアクターが胚組織の廻りに形成されることにより、前記バイオリアクター形成に伴い胚組織周囲に形成された凹部に胚組織が包囲されてもよい旨を意味すると解される。従って、「バイオリアクターの少なくとも１つの凹部の中に、胚組織を配置（又は導入又は充填）する」（place (or introduce or fill) the germinal tissue into at least one cavity of the bioreactor）という表現は、バイオリアクターの少なくとも１つの凹部内に胚組織を配置すること、或いは、胚組織の周囲にバイオリアクターを形成することによりこれを包有させること、の何れかを意味すると解される。典型的には、凹部が胚組織で充填される、或いは実質的に充填されることが好ましい。典型的には、胚組織が凹部に包囲される、或いは実質的に包囲されることが好ましい。斯かる包囲状態は、成熟が完了するまで維持されることが有利である。必要な場合には、内包作用を補助するために、生体材料の断片を胚組織と共に管孔内に導入してもよい。ある特徴によれば、成熟プロセスにおいて凹部を閉鎖又は封止してもよい。

有利な態様によれば、精細管のインビボ構造に類似した三次元構造を維持することが可能な凹部内に、胚組織を包有させる。精細管又はその断片を（以下に述べるように）胚組織として使用する場合、斯かる包有によって、その構造を成熟プロセスに沿った状態に維持することが可能となる。反対に、一般的な細胞成熟のための実際のデバイスや、単離細胞に基づき示唆される方法では、インビボのアーキテクチャを精細管に導入することができず、期間内に細胞成熟を実施することができない。

有利な態様によれば、前記バイオリアクターは比較的柔軟であり、これによって、より硬直な既存のデバイスとは反対に、精子形成プロセスにおける精細管の成長を許容する。これは前記バイオリアクターに使用される材料によって実現される。

前記凹部の体積は、使用される胚組織の量に依存する。また、本明細書で説明するように、凹部内への包有を補助するための材料、例えば生体材料を加えてもよい。典型的には、前記凹部の体積は、約１〜約１５０ｍｍ^３、好ましくは約０．５〜約１００ｍｍ^３、例えば約１〜約３０ｍｍ^３であってよい。

一態様によれば、前記バイオリアクターは、予め形成された管孔（又は管孔の形態の区画）を含む。これは例えば、本分野で周知のような、管状バイオリアクター又は管又は中空繊維の生体材料からなる。従って、管孔の直径は、本発明の概念に従って胚組織が管孔内に配置され、包囲されうるように、胚組織の量及び／又はサイズに適合される。言い換えれば、管孔の体積は、胚組織が管孔内に包囲されうるように、導入される胚組織の量に応じて決められる。当業者であれば、管孔の直径及び／又は長さを調整することにより、管孔の体積を調整することが可能である。その直径は、当業者であれば決定可能であるが、典型的には約１００μｍ〜約５ｍｍ、好ましくは約１ｍｍ〜約４ｍｍである。前記バイオリアクターの長さは、典型的には約０．３〜約５ｃｍ、好ましくは約０．５〜約３ｃｍである。こうして胚組織は管孔内に配置される。

一態様によれば、硬化性（例えば凝固性、架橋性、網状化（reticulable）等）の溶液又は材料が、胚組織の周囲に配置され、硬化される。胚組織の周囲に形成される材料の量及びその性質は、胚組織の包有に適したように決定される。斯かる組織包有を、追加の固体構造によって支援してもよい。斯かる追加の固体構造は、硬化時のみに使用してもよいが、或いは成熟時に構造の維持を補助するべく維持してもよい（網、格子、壁、型、容器、例えばペトリ皿、管・・・）。

好適且つ有利な態様によれば、前記生体材料はヒドロゲルである。ヒドロゲルは、高分子からなる、好ましくは弾性の、高含水量の網目構造であり、水和された天然の組織の細胞外マトリックスを模倣することができる。本発明によれば「ヒドロゲル」（hydrogel）とは、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０重量％の水、例えば９４〜９９重量％の水、例えば９６〜９８．５重量％の水を含む、粘弾性の集合物を意味する。本発明のヒドロゲルは、化学的ヒドロゲル（鎖間架橋を行う相互作用が共有結合型であるもの）又は物理的ヒドロゲル（鎖間架橋を行う相互作用が物理的作用、例えば水素結合及び／又は疎水性相互作用、静電相互作用、結晶化、又はナノ結晶化の物理的架橋であるもの）である。中でも、共有架橋剤の毒性を避ける観点からは、本発明のヒドロゲルは物理的ヒドロゲルであることが好ましい。本発明のヒドロゲルは、化学的（共有結合型）又は物理的（静電作用型）架橋剤を含まなくてもよい。

好ましくは、前記バイオリアクターは、生体材料の構造及び微細構造、特に生体材料の多孔性に関連する構造及び微細構造、成熟に使用される培地、そして空気（Ｏ_２及びＮ_２）及び二酸化炭素と比較して、有効な透過性（多孔性及び／又は拡散性）を有する生体材料であることが好ましい。一態様によれば、凹部は成熟プロセス時に閉鎖される。例えば、管を用いる場合には、その端部が封止される。別の態様によれば、バイオリアクターは、成熟に用いられる培地、空気及び二酸化炭素に対し、透過性を有する生体材料で封止される。例えば成熟に用いられる培地、空気及び二酸化炭素に対し、透過性を有する生体材料のシートで封止される。

本発明に係る生体材料は、天然生体材料でも合成生体材料でもよい。

例えば、前記生体材料は、多糖類、好ましくは天然多糖類（修飾体、特に化学修飾体を含む）又は複合多糖類、又は構造タンパク質（例えばケラチン又はコラーゲン、好ましくはコラーゲン）、又はこれらの混合物を含む。好ましくは、前記生体材料は、多糖類（好ましくは天然多糖類であり、修飾体、特に化学修飾多糖類を含む）又はコラーゲン、又はこれらの混合物を含む。ここで「多糖類又はコラーゲンを含む」（comprises polysaccharides or collagen）とは、前記生体材料が、ヒドロゲルの基となる原料化合物として、少なくとも１種の多糖類又はコラーゲンを含んでいてもよい旨を意味する。前記生体材料は更に、ヒドロゲルを産生するのに必要な成分、例えば凝固剤、水等、及び他の成分を含んでいてもよい。ここで前記生体材料は、多糖類又は構造タンパク質（好ましくはコラーゲン）でもよく、これらから形成されてもよく、これらを基にしたものでもよいと言うことができる。

好ましくは、前記生体材料は、天然多糖類（特にキトサン、ヒアルロン酸、アルギン酸、ペクチン）及び修飾天然多糖類（例えばカルボキシメチルセルロース（carboxymethylcellulose：ＣＭＣ）等）を、単独又は複数混合で含む。例示すると、前記生体材料は、キトサン又はアルギン酸を単独又は複数混合で（例えばキトサン等）を含む。

一般的に、前記キトサンは、少なくとも一精子形成プロセスの所要時間に亘る安定性を前記バイオリアクターに付与するのに適したアセチル化度を有する。係るアセチル化度は、例えば０〜５０％である。ここで留意すべきは、アセチル化度が高まるほど、生体材料の機械特性が低下するという点である。成熟プロセス全体に亘って構造を維持するためには、低度又は中度のアセチル化度、典型的には０〜３０％、好ましくは０〜１５％を選択することが好ましい。より好ましくは、アセチル化度は０〜５％である。キトサンのモル質量は、５００，０００ｇ／ｍｏｌのオーダーであることが好ましい。

前記生体材料中（好ましくはヒドロゲル中）における多糖類又はコラーゲン（例えばキトサン等）の濃度は、１〜２０％、好ましくは１〜６％であることが好ましい。中でも、ヒドロゲルの重量に対して、例えば１．５〜４重量％である。

有利な態様によれば、前記生体材料、特にその内部構造又は微細構造は、空気、二酸化炭素、及び前記バイオリアクターが成熟のために配置される培地の成分を、特異的に拡散させることが可能に構成される。特に、空気、二酸化炭素、及び培地の成分を、拡散させて胚組織又はその近傍まで到達させうるように構成される。好ましくは、前記生体材料の凹部周辺の厚さは、上述の異なる成分の拡散を可能とする厚みとする必要があるため、前記生体材料、特に前記生体材料の種類及びその微細構造に応じて異なる。前記生体材料の厚さは、約０．１〜約１０ｍｍ、好ましくは約０．１〜約５ｍｍ、好ましくは約０．５〜約２ｍｍであることが好ましい。

好ましくは、前記バイオリアクターは、凹部を含む生体材料からなる。即ち、前記生体材料には、前記胚組織が配置され、包囲される凹部が存在する。

前記バイオリアクターは、中空繊維、好ましくは中空微細繊維であることが好ましい。適切な中空繊維及び調製方法の例は、国際公開第２００９／０４４０５３号に記載されている。当業者であれば本文献を参照することができる。

本明細書に記載するように、本発明に係る方法によれば、前記バイオリアクターの少なくとも１つの管孔又は凹部の内部に、胚組織を導入することができる。その後、管孔の両端又は開放端を閉止することが好ましい。例えば、中空繊維の場合、両端又は開放端で結紮を行ってもよく、或いは上述のように、透過可能な生体材料を用いてもよい。両端又は開放端で結紮を行うことが好ましい。

有利な態様によれば、本発明の方法は、従来実施されていた方法（Sato等, Nat Commun., 2011, 2, 472）と比較して、大量の胚組織を必要としない。好ましくは、前記バイオリアクターに導入される胚組織の量は、約１〜約１５０ｍｍ^３、好ましくは約０．５〜約１００ｍｍ^３、例えば約１〜約３０ｍｍ^３である。これは、より少量の生殖細胞から伸長精細胞又は精子を産生できる点で有利である。係る特徴ゆえに、本発明の方法は、生殖細胞数が非常に少ない患者に有用である。上述のように、管孔の体積は、導入される前記胚組織の体積に応じて決定される。

有利な態様によれば、胚組織をバイオリアクター中に導入する前に、バイオリアクターを培地と共にインキュベートする。

前記バイオリアクターは、胚組織が管孔から漏出するのを防止するべく、両端を封止してから、伸長精細胞又は精子への成熟のための培地に配置してもよい。

本発明及びその種々の態様によれば、培地が使用される。培地の組成は、当業者であれば技術常識に基づいて決定することができる。前記培地は、成長因子、ホルモン、ビタミン、抗生物質、代謝産物等を、単独又は複数混合で含むことが好ましい。例えば、ホルモンは、インシュリン、テストステロン、ＦＳＨ（例えば羊／ヒトＦＳＨ）から、単独又は複数混合で選択することができる。例えば、ビタミンは、ビタミンＣ、ビタミンＥ、ビタミンＡ（レチノイン酸、レチノール）から、単独又は複数混合で選択される。例えば、代謝産物は、トランスフェリン、ピルビン酸から、単独又は複数混合で選択することができる。

前記プロセスの間に、培地にテストステロンを加えることが好ましい。添加するテストステロンの量は、約１０^−８〜約１０^−５Ｍが好ましい。

胚組織を含むバイオリアクターは、前記培地を含むタンク内に配置することが好ましい。前記バイオリアクターは、培地に浸漬されるか、空気と培地との界面に配置される。前記バイオリアクターは、空気と培地との界面に配置されることが好ましい。

一態様によれば、前記バイオリアクターを培地内に浸漬する場合には、成熟のために十分な酸素を供給するべく、空気のバブリングを実施することが好ましい。

更に別の態様によれば、前記バイオリアクターが、空気と培地との界面に配置される。これは、当業者に周知の任意の方法によって達成することができ、例えば、前記培地を含むタンク内に支持体を、好ましくは穿孔支持体等、例えば格子を、空気と培地との界面に追加することにより達成できる。これにより、有利なことに酸素供給が改善され、その結果、本発明に係る方法の成熟及び効率が改善される。

上述のように、有利な態様によれば、前記バイオリアクターは、培地と胚組織を含む管孔との間の交換を可能とする程度の透過性を有する。これにより、胚組織と培地との接触が確保される。

本発明の方法は、胚組織の成熟を可能とすることが当業者に知られた温度条件で、例えば約３０〜約３７℃の間の温度で実施される。

一態様によれば、本発明は、インビトロ（エクスビボ）での精子形成のための方法であって：
ａ）胚組織の試料を提供し；
ｂ）本発明に係る、生体材料からなり少なくとも１つの凹部を含むバイオリアクターを提供し、該胚組織を該バイオリアクターの前記少なくとも１つの凹部に導入し；任意により前記バイオリアクターを密閉し；又は、前記バイオリアクターを前記胚組織の周囲に形成し；
ｃ）該胚組織を含む該バイオリアクターを、特に先に定義したような、培地を含むタンク内に配置し；
ｄ）伸長精細胞及び／又は精子が産生されるまで、前記胚組織を成熟させ；
ｅ）伸長精細胞及び／又は精子を前記バイオリアクターから回収する
工程を含む、方法に関する。

好ましくは、工程ｆ）が：
− 前記バイオリアクターを開口し；
− 微細操作により、１又は２以上の精子及び／又は伸長精細胞を回収する
ことにより実施される。

好ましくは、本発明は、インビトロ（エクスビボ）での精子形成のための方法であって：
ａ）胚組織の試料を提供し；
ｂ）ヒドロゲル材料（特に、好ましくは物理的にヒドロゲル状態にある、多糖類又はコラーゲン）からなる少なくとも１つの中空繊維を含むバイオリアクター；
ｃ）胚組織を中空繊維の中央管孔内に導入し；任意により中空繊維を封止し；
ｄ）該胚組織を含む該中空繊維を、培地を含むタンク内に配置し；
ｅ）伸長精細胞及び／又は精子が産生されるまで、前記胚組織を成熟させ；
ｆ）伸長精細胞及び／又は精子を中空繊維から回収する
工程を含む、方法に関する。

一態様によれば、前記バイオリアクター（又は前記中空繊維）は、培地内に浸漬され、成熟のために十分な酸素供給を実施するために、空気のバブリングが実施される。

更に別の態様によれば、前記バイオリアクター（又は前記中空繊維）は、空気と培地との界面に配置される。これは、当業者に周知の任意の方法によって達成することができ、例えば、前記培地を含むタンク内に支持体を追加することにより達成できる。これにより、有利なことに酸素供給が改善され、その結果、本発明に係る方法の成熟及び効率が改善される。

本発明の方法の一態様によれば、前記培地は、成長因子、ホルモン、ビタミン、抗生物質、代謝産物等を、単独又は複数混合で含む。例えば、ホルモンは、インシュリン、テストステロン、ＦＳＨ（例えば羊／ヒトＦＳＨ）から、単独又は複数混合で選択することができる。例えば、ビタミンは、ビタミンＣ、ビタミンＥ、ビタミンＡ（レチノイン酸、レチノール）から、単独又は複数混合で選択される。例えば、代謝産物は、トランスフェリン、ピルビン酸から、単独又は複数混合で選択することができる。

更に別の態様によれば、前記培地は、成長因子、ホルモン、ビタミン、抗生物質、代謝産物等を、単独又は複数混合で含む。例えば、ホルモンは、インシュリン、ＦＳＨ（例えば羊／ヒトＦＳＨ）から、単独又は複数混合で選択することができる。例えば、ビタミンは、ビタミンＣ、ビタミンＥ、ビタミンＡ（レチノイン酸、レチノール）から、単独又は複数混合で選択される。例えば、代謝産物は、トランスフェリン、ピルビン酸から、単独又は複数混合で選択することができる。その後、当該プロセスの過程において、テストステロンを加えてもよい。有利な態様によれば、成熟の第一波の終期において、胚組織内に円形精細胞が存在し、当該方法を更に少なくとも１回実施する。

一態様によれば、回収された伸長精細胞及び／又は精子を、医療補助を伴う将来の家族計画のために凍結保存してもよい。

本発明の方法における胚組織は、新鮮なものでもよく、患者から過去に得られた凍結保存胚組織断片でもよい。

本発明の方法は、不妊治療としても、及び／又は、受胎能保存の方法としても解することができる。また、本発明の方法は、医療補助を伴う繁殖のための方法としても解することができる。

また、本発明は、インビトロでの受精の方法であって、
ａ）前述の方法に従って、伸長精細胞及び／又は精子を調製し；又は、前述の方法により、伸長精細胞及び／又は精子を提供し；
ｂ）得られた前記伸長精細胞及び／又は精子により、卵母細胞を受精させる
工程を含む方法に関する。

また、本発明は、生体材料からなり、少なくとも１つの凹部を含むバイオリアクターのインビトロ精子形成のための、好ましくは伸長精細胞及び／又は精子の産生のための使用に関する。

前記バイオリアクターは、前述のものであることが好ましく、前述の中空繊維、好ましくは中空大繊維であることが好ましい。

また、本発明は、前述したような、生体材料からなり、少なくとも１つの管孔又は凹部を含むバイオリアクターであって、この凹部又は管孔内に、前述したような胚組織を含むバイオリアクターに関する。例として、本発明は、その中央管孔内に胚組織を含む中空繊維に関する。前記バイオリアクターは、本明細書に定義されるようなヒドロゲルであってよい。

また、本発明は、前述したような、生体材料からなり、少なくとも１つの管孔又は凹部を含むバイオリアクターであって、その管孔又は凹部内に伸長精細胞及び／又は精子を含むバイオリアクターに関する。例として、本発明は、前述のような中空繊維であって、その中央管孔内に伸長精細胞及び／又は精子を含む中空繊維に関する。

また、本発明は、雄胚組織からインビトロで精子形成を実施するためのキットであって、胚組織が配置される少なくとも１つの凹部を含む、生体材料からなるバイオリアクターを含むキットに関する。前記バイオリアクター、前記生体材料、前記凹部、及び前記胚組織は、先に定義したとおりである。

本発明を以下に実施例に則して説明する。

患者s
本発明に係る方法を、８又は２０日齢雄Sprague−Dawleyラット、２頭の１．５歳齢カニクイザル、及び、男性から女性への性転換ヒトに実施した。麻酔後、ラットを断頭して殺し、即時に睾丸を除去した。カニクイザルの睾丸及び男性から女性への性転換ヒトの睾丸は、手術により採取した。睾丸をハムＦ−１２／ダルベッコ変法イーグル培地（Ham's F-12/Dulbecco's Modified Eagle's Medium：Ｆ１２／ＤＭＥＭ、１：１）に浸漬した。

精細管の調製
睾丸の白膜を機械的に除去し、コラゲナーゼ、２ｍｇ／ｍｌのリママメ・トリプシン阻害剤、及び１０ｍｇ／ｍｌのＤＮａｓｅを含むＦ１２／ＤＭＥＭ（１：１）中で、３３℃で１０分間穏やかに攪拌して消化することにより、精細管を単離した。精細管を低速遠心分離で収集し、Ｆ１２／ＤＭＥＭ（１：１）で二度洗浄した。

バイオリアクターの一般調製例：
生体材料（例えばキトサン等）の溶液を、脱イオン水を用いて調製した。該調製は密閉反応器内で、機械的攪拌の下で実施した。ポリマーの溶解後、溶液をシリンジに入れ、遠心分離（５０００ｇ、１０分間）により泡を除去した。シリンジポンプを用いて溶液を押し出した。直径３ｍｍの押出穴を有する押出用円錐にシリンジを連結した。押し出しは凝固浴槽（濃度１ＭのＮａＯＨ水溶液）内で実施し、物理的ヒドロゲル、好ましくは物理的キトサンヒドロゲルの形成を誘導した。円筒状押出物の外縁から中央へのＮａＯＨ放射状拡散により、管形の外膜を取得した。凝固時間（例：２分間）に応じて、凝固ヒドロゲル管の厚さを、所望の値（例：１ｍｍ）に調整することができる。所与の凝固時間の後、依然としてポリマーを含有する管状ヒドロゲル、例えばキトサン溶液を、大容量の脱イオン水に投入し、ゲル化を停止する。水又は空気流を管内に導入して、ゲル化していない内部溶液を除去することにより、長さ１〜１００ｃｍの管の内腔を形成した。この予調製管から、所望の長さ（約３ｃｍ）のバイオリアクターを切り出すことができる。続いて、バイオリアクターを蒸留水浴で洗浄し、水中オートクレーブ処理（１２１℃、２０分間）にて滅菌した。

実施例で使用したバイオリアクターの調製：
前記バイオリアクターは、国際公開第２００９／０４４０５３号公報に記載の方法で得られたキトサン単層膜中空繊維である。前記バイオリアクターは、イカ甲キチン由来のキトサンに基づく（Mahtaniキトサン、ベラーバル、インド；Mahtaniバッチ指数１１４）。そのアセチル化度は４％（国際公開第２００９／０４４０５３号公報に記載のHirai法により決定）であり、これは分子質量Ｍｗ５５０ｋｇ／ｍｏｌ（国際公開第２００９／０４４０５３号公報に記載の、屈折率測定及び多角度光散乱を組み合わせたサイズ排除クロマトグラフィーにより決定）に相当する。得られた管孔内容積は２０〜５０ｍｍ^３である。

キトサンのアミン部分に対する化学量論量の酢酸を用いて、脱イオン水中のポリマー濃度２％ｗ／ｗのキトサン酢酸溶液を調製した。該調製は密閉反応器内で、機械的攪拌の下で実施した。ポリマーの溶解後、溶液をシリンジに入れ、遠心分離（５０００ｇ、１０分間）で泡を除去した。

精子形成
２０〜５０ｍｍ^３の精細管をキトサン管内に導入した。続いて、キトサン管の両端を密閉し、約８ｍＬの培地を含む従来の培養ウェル内に配置した。２日おきに培地を交換した。培地の組成は、抗生物質を追加した１５ｍＭのHepes緩衝化Ｆ１２／ＤＭＥＭ、１．２ｇ／ＬのＮａＨＣＯ_３、１０μｇ／ｍＬのインシュリン、１０μｇ／ｍＬのトランスフェリン、１０^−４ＭのビタミンＣ、１０μｇ／ｍＬのビタミンＥ、３．３×１０^−７Ｍのレチノイン酸、３．３×１０^−７Ｍのレチノール、１０^−３Ｍのピルビン酸（何れもSigma社製）、１０^−７Ｍのテストステロン、及び５０ｎｇ／ｍＬのブタＦＳＨであった。８日齢ラット、１．５歳齢カニクイザル、及び男性から女性への性転換ヒトの各試料について、培養開始数日後に培地にテストステロンを加えた。

組織学的試験
選択された日数の培養の後、キトサン管から精細管を押し出し、２枚の顕微鏡用スライドガラスで挟んで潰した。続いて、ハリスのヘマトキシリン溶液（Harris's hematoxylin solution）で核を染色した。実施された方法の結果を図に示す。

２０日齢のラットの結果
２０日齢のラットでは、培養開始当初、最も分化が進んでいた生殖細胞はパキテン期精母細胞（段階Ｘ）であった。

培養中の複数の異なる日に、生殖細胞の観察を行った。細胞はインビボではその外観が類似していた。円形精細胞（精子形成の段階１〜４）及び伸長精細胞（精子形成の段階９）を培養１１日目に可視化した。３９日間の培養後、鞭毛を有する伸長精細胞のクラスターが観察された（図１）。より高い倍率では、伸長精細胞（elongated spermatids：ＥＳ）（精子形成の段階１５〜１７）の頭部（図２のＨ）及び鞭毛（図２のＦ）も観察される（図２）。

３９日目には、大きな細胞クラスターが観察された（図９及び１０）。依然として初期減数分裂細胞、前細糸期（Preleptotene：Prl）及びレプトテン期（Leptotene：Lept）精母細胞が豊富に存在していたが、若パキテン期精母細胞を含む新たな世代の円形精細胞（round spermatids：ＲＳ）も存在していた。

８日齢のラットの結果
睾丸内に精原細胞のみを有する思春期前雄幼生と比較しながら、８日齢ラットの精細管培養を実施した。実際に、８日齢のラットはその睾丸内に精原細胞のみを有していた。

６１日間の培養後、培養された精細管を潰して広げ、細胞を採取した。

図３は、細管の基底部（Ｂ）と内腔（Ｌ）とが細胞結合してなる輸精上皮の一部を示す。培養された精細管の内腔内に鞭毛を有する伸長精細胞／精子のクラスター（図３のＥＳ／ＳＺ）が観察された。

輸精上皮の境界内における細胞の組織化を図４に示す。セルトリ（Ｓｅｒｔｏｌｉ）細胞核（ＳＣｎ）及び／又は精原細胞核（Ｇｎ）、パキテン期精母細胞（ＰＳ）、円形精細胞（ＲＳ）、及びＥＳ／ＳＺが、上皮内の精細管の基底部（Ｂ）から内腔（Ｌ）に掛けて、レベルが上がるに従って連続的に同定された。留意すべきは、前細糸期精母細胞が存在しなかった点である。ＥＳ／ＳＺの頭部（Ｈ）及び鞭毛（Ｆ）が観察された（図４）。これらの結果は、インビボでは８日齢ラットの精細管には内腔が存在しない（図５は８日齢ラットの睾丸の断面を示す）のに比較して、６１日間の培養期間で培養精細管が成長したことを示している。図５は、セルトリ（Sertoli）細胞（ＳＣ）、精細管の基底部（Ｂ）、及び精原細胞のクラスター（Ｇ）を示している。

６１日間培養後の精細管（図４）のサイズは、インビボでの６０日齢ラットの精細管（図６は、６０日齢ラットの睾丸の断面を示す。精細管の基底部（Ｂ）及び内腔（Ｌ）、精原細胞（Ｇ）、パキテン期精母細胞（ＰＳ）、円形精細胞（ＲＳ）、及び精子（ＳＺ）も示す。）のサイズよりも、僅かに小さかった。

図７は、単離された精子（ＳＺ）（精子形成の段階１９）を示す。より高い倍率では（図８）、ＳＺの精子頭部（Ｈ）、細胞質葉（ＣＬ）、及び鞭毛（Ｆ）が観察された。

これらの結果は、本発明に係る方法によって、胚組織からの精子形成、即ち精原細胞から伸長精細胞又は精子への精子形成が可能であることを示している。

１．５歳齢カニクイザルでの結果
睾丸内に精原細胞のみを有する思春期前雄幼生と比較しながら、２頭の１．５歳齢カニクイザルの精細管を培養した。実際に、１．５歳齢サルはその睾丸内に精原細胞のみを有していた。５４日間の培養後、培養された精細管を潰して広げ、細胞を採取した。

図１１は、精子の鞭毛（Ｆ）を示す。

図１２は、ＥＳの頭部（Ｈ）及び鞭毛（Ｆ）を、より大きな倍率で示す。パキテン期精母細胞（ＰＳ）はＥＳの側に存在する。

図１３：若年精母細胞（矢印で示す）は、新たな世代の減数分裂生殖細胞が、精子へと分化しようとしていることを示す。

男性から女性への性転換ヒトでの結果
男性から女性への性転換ヒトの精細管を培養した。精子形成を阻害するホルモン処理の後、この患者の精細管内には精原細胞しか存在せず、前細糸期精母細胞及びセルトリ（Sertoli）細胞は殆ど見られなかった。この患者は、睾丸内に精原細胞のみを有する少年と近い状態であった。

３４日間の培養後、培養された精細管を潰して広げ、細胞を採取した。

図１４は精子の鞭毛（Ｆ）（矢印で示す）を示す。

図１５は、より大きな倍率で、精子の頭部（Ｈ）及び鞭毛（Ｆ）を示す。

Claims (19)

1. 雄胚組織（male germinal tissue）からのインビトロ（in vitro）での精子形成の方法であって、前記胚組織が配置される少なくとも１つの凹部（cavity）を含む、生体材料からなるバイオリアクター内で、生殖細胞（germ cells）を含む精巣組織を成熟させ、伸長精細胞及び／又は精子を回収することを含む方法。
2. 胚組織、好ましくは精巣組織が、少なくとも１つの精細管又は少なくとも１つの精細管の断片、好ましくは数個の精細管又は数個の精細管の断片を含む、請求項１に記載の方法。
3. 前記胚組織、好ましくは精巣組織が、２〜５０、３〜４０、４〜３０、又は５〜２０個の精細管の断片を含む、請求項２に記載の方法。
4. 前記細管及び／又はその断片が、精細管の機械的分離又は酵素的分離により得られる、請求項２に記載の方法。
5. 前記の精細管の断片が、約１ｍｍから約５ｍｍの範囲のサイズを有する、請求項２〜４の何れか一項に記載の方法。
6. 前記胚組織、好ましくは精巣組織が、生殖細胞、セルトリ（Sertoli）細胞、及び細管周囲細胞を含み、任意により更にライディッヒ（Leydig）細胞を含む、請求項１〜５の何れか一項に記載の方法。
7. 生殖細胞、セルトリ（Sertoli）細胞、及び細管周囲細胞、並びにこれらの混合物からなる群より選択される細胞を、前記胚組織、好ましくは精巣組織に加える、請求項１〜６の何れか一項に記載の方法。
8. 前記凹部の体積又は前記胚組織、好ましくは精巣組織の体積が、約１〜約１００ｍｍ^３、好ましくは約０．５〜約１５０ｍｍ^３、例えば約１〜約３０ｍｍ^３である、請求項１〜７の何れか一項に記載の方法。
9. 前記胚組織、好ましくは精巣組織が：
   − 性腺毒性（gonado-toxic）処置又は手術、例えば癌治療等を受ける予定の、健常な思春期前又は思春期後患者；
   − 例えば遺伝的若しくは後天的非閉塞性無精子症、幼小児期の両側性停留精巣、又は重篤な鎌状細胞疾患等により、精子を産生しない思春期後患者；
   − 両側性停留精巣又は重篤な鎌状細胞疾患を有する思春期前患者；
   − 絶滅危惧種；
   − ウマ、ラクダ（camel）、ヒトコブラクダ（dromedary）、又は愛玩動物；
   − 家畜
   に由来する、請求項１〜８の何れか一項に記載の方法。
10. 前記生体材料が物理的にヒドロゲル状態にあり、好ましくは多糖類、好ましくは天然多糖類、又は構造タンパク質、好ましくはコラーゲン、又はこれらの混合物を含む、請求項１〜９の何れか一項に記載の方法。
11. 前記天然多糖類が、キトサン、ヒアルロン酸、アルギン酸、ペクチン、又は修飾天然多糖類、例えばカルボキシメチルセルロース（carboxymethylcellulose：ＣＭＣ）を単独又は複数混合で、好ましくはキトサン又はアルギン酸を単独又は複数混合で、好ましくはキトサンを含む、請求項１０に記載の方法。
12. 当該方法が：
    ａ）胚組織の試料を提供し；
    ｂ）生体材料からなり少なくとも１つの凹部を含むバイオリアクターを提供し；
    ｃ）該胚組織を該バイオリアクターの前記少なくとも１つの凹部に導入し；任意により前記バイオリアクターを密閉し
    ｄ）該胚組織を含む該バイオリアクターを、培地を含むタンク内に配置し；
    ｅ）伸長精細胞及び／又は精子が得られるまで前記胚組織を成熟させ；
    ｆ）伸長精細胞及び／又は精子を前記バイオリアクターから回収する
    工程を含む、請求項１〜１１の何れか一項に記載の方法。
13. 前記バイオリアクターが前記胚組織の周囲に形成される、請求項１〜１２の何れか一項に記載の方法。
14. 前記バイオリアクターが、前記胚組織が配置される管孔を含む生体材料の中空繊維である、請求項１〜１２の何れか一項に記載の方法。
15. 前記バイオリアクターがヒドロゲルからなる、請求項１〜１４の何れか一項に記載の方法。
16. 前記バイオリアクターが培地内に、又は培地と接触するように配置され、ここで：
    − 前記培地が、成長因子、ホルモン、テストステロン、ビタミン、抗生物質、代謝産物等のうち一又は二以上を、単独又は複数混合で含み；又は
    − 前記培地が、成長因子、ホルモン、ビタミン、抗生物質、代謝産物等のうち一又は二以上を、単独又は複数混合で含むとともに、当該方法の過程において、テストステロンが前記培地に添加される、請求項１〜１５の何れか一項に記載の方法。
17. 空気、二酸化炭素、及び前記バイオリアクターが成熟のために配置される前記培地の成分が、前記生体材料内を拡散しうるように構成される、請求項１〜１７の何れか一項に記載の方法。
18. インビトロでの受精の方法であって：
    ａ）請求項１〜１７の何れか一項に記載の方法に従って、伸長精細胞及び／又は精子を調製し；又は、請求項１〜１７の何れか一項に記載の方法により、伸長精細胞及び／又は精子を提供し；
    ｂ）得られた前記伸長精細胞及び／又は精子により、卵母細胞を受精させる
    工程を含む方法。
19. 雄胚組織からインビトロで精子形成を実施するためのキットであって、生体材料からなり、胚組織が配置される少なくとも１つの凹部を含む、バイオリアクターを含むキット。

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