JP2017504564A - Ｈｅｒ２標的一価抗原結合コンストラクトの使用方法 - Google Patents

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Abstract

本明細書は、ＨＥＲ２を標的とする第１のまたは第１及び第２の一価抗原結合コンストラクトを用いる、使用方法及び治療方法を提供する。一価抗原結合コンストラクトは、ＨＥＲ２に特異的に結合する、重鎖可変ドメインを含む少なくとも１つの抗原結合ポリペプチドと、ヘテロ二量体Ｆｃとを含み得、該Ｆｃは、少なくとも２つのＣＨ３配列を含み、リンカーによりまたはリンカーなしで抗原結合ポリペプチドに連結している。【選択図】図１

Description

関連出願の相互参照
本願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０１３年１１月１３日出願の米国特許仮出願第６１／９０３，８３９号の優先権を主張する。
配列表
本願発明は、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介して提示されている配列表を含み、その全体が参照によって本明細書に援用される。２０１４年１１月１３日に作成の該ＡＳＣＩＩ原稿は、ファイル名２７９０５ＰＣＴ＿ｓｅｑｕｅｎｃｅｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔで、容量が３５５，９８６バイトである。
背景
治療用タンパク質の分野では、それらの多価の標的結合特性を有する抗体は、薬剤候補品のデザインの優良なスカフォールドである。現在市販の抗体治療薬は、２つの抗体ＦＡＢによって付与される高アフィニティ結合及びアビディティに関して最適化され、選択されている二価の単一特異性抗体である。突然変異誘発によるＦｃｇＲ結合の脱フコシル化または強化を用いて、細胞障害メカニズム依存の抗体Ｆｃを介して抗体をより効果的なものとしてきた。非フコシル化抗体またはＦｃｇＲ結合が強化されている抗体は、臨床検査において治療的有効性が依然として不完全であり、これらの抗体はいずれも、依然として市販されていない。
治療用抗体は、理想的には、対象患者投与後の標的特異性、生体内安定性、生物学的利用能及び体内分布、並びに治療的効果依存抗体を最大化するための十分な標的結合アフィニティ、及び高標的占有、及び標的細胞への抗体結合など、ある特定の最少の特性を有する。これらの最小限の特性をすべて所有する抗体療法を生み出す目的においては、特に、抗体対標的の比率が１：１で完全に標的を占有することができる抗体において、奏功が制限されていた。例えば、従来の二価の単一特異性ＩｇＧ抗体は、飽和濃度であっても１：１の比率で完全に標的を占有することができなかった。理論上、飽和濃度で、従来の単一特異性二価抗体は、一価抗体断片と比較して、アビディティ効果を付与することができる２つの同一の抗原結合ＦＡＢの存在により、抗体１対標的２の比率で最大限標的に結合すると考えられている。更に、こうした従来の抗体は、より大きい分子サイズの結果として、生物学的利用能及び／または体内分布の更なる制限を受けている。更に、従来の抗体は、場合によっては標的抗原へ結合時にアゴニスト作用を示し、これは、アンタゴニスト作用が望ましい治療的機能である場合には、好ましくないものである。いくつかの例では、この現象は、細胞表面受容体に結合することによりレセプターの活性化をもたらす受容体の二量化が促進するとき、二価抗体の「架橋」効果に起因する。さらに、従来の二価抗体は、抗体依存性細胞障害効果または他の治療的活性のメカニズムが可能である最大治療的安全投与量で抗体対標的抗原との比率１：２での抗体の標的細胞への結合が制限されることにより、治療的有効性の制限を受ける。
ＨＥＲ２と結合する一価抗体は、国際公開特許第ＷＯ２００８／１３１２４２号（Ｚｙｍｏｇｅｎｅｔｉｃｓ， Ｉｎｃ．）（特許文献１）及びＷＯ２０１１／１４７９８２号（Ｇｅｎｍａｂ Ａ／Ｓ）（特許文献２）に記述されている。２０１１年１１月４日出願の共有特許出願ＰＣＴ／ＣＡ２０１１／００１２３８（特許文献３）、２０１２年１１月２日出願のＰＣＴ／ＣＡ２０１２／０５０７８０（特許文献４）、２０１３年５月１０日出願のＰＣＴ／ＣＡ２０１３／００４７１（特許文献５）、及び２０１３年５月８日出願のＰＣＴ／ＣＡ２０１３／０５０３５８（特許文献６）には、治療用抗体について記述されている。いずれも、すべての目的において、その全体が参照によって援用される。
ＷＯ２００８／１３１２４２号 ＷＯ２０１１／１４７９８２号 ＰＣＴ／ＣＡ２０１１／００１２３８ ＰＣＴ／ＣＡ２０１２／０５０７８０ ＰＣＴ／ＣＡ２０１３／００４７１ ＰＣＴ／ＣＡ２０１３／０５０３５８
概要
本明細書では、有効量の第１の一価抗原結合コンストラクト（例えば、抗体）または第１及び第２の一価抗原結合コンストラクトの組み合わせを対象に投与することによる、ヒトなどの対象の治療方法を開示し、この第１及び第２の一価抗原結合コンストラクトはそれぞれ、抗原結合ポリペプチドコンストラクトと、リンカーの有無に関わらず、抗原結合ポリペプチドコンストラクトに結合している二量体Ｆｃとを有する。各抗原結合ポリペプチドコンストラクトは、ヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２）の細胞外ドメイン２（ＥＣＤ２）、ＨＥＲ２のＥＣＤ４、またはＨＥＲ２のＥＣＤ１に特異的に結合する。第１の一価抗原結合コンストラクト及び第２の一価抗原結合コンストラクトは、重複していないエピトープに結合し、ＨＥＲ２への結合に関して互いに競合することはない。
さまざまな実施形態において、対象の治療方法としては、例えば、ＨＥＲ２＋腫瘍の増殖の阻害、ＨＥＲ２＋腫瘍の進行の遅延、ＨＥＲ２＋癌の治療、またはＨＥＲ２＋癌の予防が挙げられる。ＨＥＲ２＋腫瘍または癌は、乳房の、卵巣の、胃の、食道胃接合部の、子宮内膜の、唾液腺の、頭頸部の、肺の、脳の、腎臓の、結腸の、結腸直腸の、甲状腺の、膵臓の、前立腺の、または膀胱の腫瘍または癌であり得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法で使用される一価抗原結合コンストラクトとしては、融解温度（Ｔｍ）約６８℃以上を有する少なくとも２つのＣＨ３配列及び二量体化ＣＨ３配列を含むヘテロ二量体Ｆｃが挙げられる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法において使用される一価抗原結合コンストラクトは、ＨＥＲ２に特異的に結合する単一特異性二価抗原結合コンストラクトと比較して、より大きい最大結合（Ｂｍａｘ）で、選択的に及び／または特異的にＨＥＲ２に結合し、１：１の一価抗原結合コンストラクト：標的比において、単一特異性二価抗原結合コンストラクトと比較したＢｍａｘの増大は、飽和濃度以下のコンストラクトの観察された平衡定数（ＫＤ）を超える濃度で観察される。
異なるＯＡ抗体フォーマットの略図を示す。Ａは、二価単一特異性全長抗体のコンストラクトを示し、軽鎖は白色で示し、重鎖のＦａｂ部分は斜線で示し、重鎖のＦｃ部分は灰色で示す。Ｂは、抗原結合ドメインがＦａｂフォーマットにある一価の単一特異性ＯＡの２つの型を示す。いずれの型も、軽鎖は白色で示し、重鎖のＦａｂ部分は斜線で示す。鎖ＡのＦｃ部分は灰色であり、鎖ＢのＦｃ部分は黒色である。左側の型では、Ｆａｂは鎖Ａに融合し、右側の型では、Ｆａｂは鎖Ｂに縮合される。Ｃは、抗原結合ドメインがｓｃＦｖフォーマットにあるＯＡの２つの型を示す。これらのいずれの型も、軽鎖の可変ドメイン（ＶＬ）は白色で示し、重鎖の可変ドメイン（ＶＨ）は斜線で示す。鎖ＡのＦｃ部分は灰色であり、鎖ＢのＦｃ部分は黒色である。左側の型では、ｓｃＦｖは鎖Ａに融合させ、右側の型では、ｓｃＦｖは鎖Ｂに融合させる。 ＦＡＣＳにより測定したとき、卵巣ＨＥＲ２ ２〜３＋（増幅遺伝子）ＳＫＯＶ３細胞に結合する一価の抗ＨＥＲ２抗体コンストラクトの能力を示す。 一価の抗ＨＥＲ２抗体がＨＥＲ２発現乳癌細胞の増殖を阻害する能力を示す。Ａは、さまざまな一価の抗ＨＥＲ２抗体の能力を示し、ＢＴ−４７４細胞の増殖阻害を制御する。Ｂは、さまざまな一価の抗ＨＥＲ２抗体の能力を示し、ＳＫＯＶ３細胞の増殖阻害を制御する。 ＳＫＯＶ３細胞内に内部移行する一価の抗ＨＥＲ２抗体及び組み合わせの内部移行効率を示す。 一価の抗ＨＥＲ２抗体及び組み合わせがＳＫＯＶ３細胞内で、濃度依存性ＡＤＣＣを媒介する能力を示す。 一価の抗ＨＥＲ２抗体ＡＤＣが濃度依存的方法で細胞障害を媒介する能力を示す。Ａは、一価の抗ＨＥＲ２抗体ＡＤＣがＳＫＯＶ３細胞において細胞障害を媒介する能力を示す。Ｂは、一価の抗ＨＥＲ２抗体ＡＤＣがＪＩＭＴ１細胞において細胞障害を媒介する能力を示す。 Ｔ−ＤＭ１類縁体（ｖ６２４６）と比較して、一価の抗ＨＥＲ２抗体ＡＤＣがＪＩＭＴ１細胞において濃度依存性細胞障害性を媒介する能力を示す。 マウス異種移植片モデルにおいて、一価の抗ＨＥＲ２抗体の組み合わせが、定着した卵巣ＳＫＯＶ３腫瘍増殖を阻害する能力を示す。 一価の抗ＨＥＲ２抗体の組み合わせが本モデルでの生存に及ぼす効果を示す。 原発性乳癌異種移植片モデルにおいて、一価の抗ＨＥＲ２抗体の定着した原発性乳房腫瘍（トラスツズマブ及び化学療法耐性）の増殖を阻害する能力を示す。 マウスにおける例示的な一価抗原結合コンストラクトの薬物動態学的プロファイルを示す。 インビトロ血液脳関門モデルの略図を示す。不死ラット脳微小血管内皮細胞（ＳＶ−ＡＲＢＥＣ）は、血液脳関門を模した強固なバリアを形成する。 ＯＡ−ＨＥＲ２がＢＢＢを経細胞輸送する能力をＦＳＡ−ＨＥＲ２と比較して示す。Ａは、非特異的ＩｇＧ対照と比較して、インビトロＢＢＢモデルでの抗体の経細胞輸送の倍増を示す（ｎ＝３）。Ｂは、ＦＳＡ−ＨＥＲ２と比較し、ｖ１０４０の経細胞輸送を示す。棒は、Ａ２０．１非特異的対照への正規化後の底部チャンバ抗体濃度の中央ＡＵＣを示す（ｎ＝３．＊，ｐ＜０．０５）。 ｖ５０６と比較して、脳へのｖ１０４０の分布の増加を示していることを示す。棒は、蛍光標識抗体１０ｍｇ／ｋｇを注入後２４時間の平均エクスビボ脳蛍光を示す（ｎ＝１）。 ｖ５０６と比較して、肺へのｖ１０４０の分布が増加していることを示す。棒は、蛍光標識抗体１０ｍｇ／ｋｇを注入後２４時間の平均エクスビボ肺蛍光を示す（ｎ＝１）。 ＨＢＣｘ−１３ｂ患者由来異種移植片を担持する動物での肺転移のエクスビボ定量を示す。点は、ラインで示した中央値を有する個々の動物を示す（ｎ＝４）。 ＨＥＲ２＋細胞において一価の抗ＨＥＲ２抗体がＡＤＣＣを媒介する能力を示す。ＳＫＢＲ３細胞でのＡＤＣＣ活性を示す。 ＨＥＲ２＋細胞において一価の抗ＨＥＲ２抗体がＡＤＣＣを媒介する能力を示す。ＺＲ−７５−１細胞でのＡＤＣＣ活性を示す。 ＨＥＲ２＋細胞において一価の抗ＨＥＲ２抗体がＡＤＣＣを媒介する能力を示す。ＭＣＦ７細胞でのＡＤＣＣ活性を示す。 ＨＥＲ２＋細胞において一価の抗ＨＥＲ２抗体がＡＤＣＣを媒介する能力を示す。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞でのＡＤＣＣ活性を示す。
詳細な説明
本明細書には、ＨＥＲ２＋癌の治療方法を記述し、本方法は、ＨＥＲ２に一価で結合する１つ以上の一価抗原結合コンストラクト（一価の抗ＨＥＲ２抗原結合コンストラクト、一価の抗ＨＥＲ２抗体）を投与することを含む。各一価の抗ＨＥＲ２抗原結合コンストラクトは、細胞外ドメイン１（ＥＣＤ１）、細胞外ドメイン２（ＥＣＤ２）、または細胞外ドメイン４（ＥＣＤ４）に配置されるＨＥＲ２のエピトープに結合する。一実施形態では、２つ以上の一価の抗ＨＥＲ２抗原結合コンストラクトが投与され、一価の抗ＨＥＲ２抗原結合コンストラクトは、重なり合ったエピトープに結合しないようまたは互いにＨＥＲ２への結合を阻害しないように選択される。いくつかの実施形態では、２つ以上の一価の抗ＨＥＲ２抗原結合コンストラクトが投与され、一価の抗ＨＥＲ２抗原結合コンストラクトの少なくとも１つは、例えば、メイタンシノイドなどの薬物または毒素に複合体化される。別の実施形態では、投与される一価の抗ＨＥＲ２抗原結合コンストラクトはいずれも、薬物または毒素に複合体化される。
本明細書に記載される方法において使用するために好適な一価の抗ＨＥＲ２抗原結合コンストラクトは、標準の二価の単一特異性抗ＨＥＲ２抗原結合コンストラクト（例えば、対応する全長抗体、ＦＳＡ）と比較して、ＨＥＲ２発現標的細胞に対してさらに高い最大結合Ｂｍａｘを示す。また、一価の抗ＨＥＲ２抗原結合コンストラクトは、ｉ）癌細胞増殖阻害能力；ｉｉ）癌細胞死滅能力；ｉｉｉ）癌細胞内の内部移行能力；ｉｖ）ＨＥＲ２のダウンレギュレーション能力；及び／またはｖ）エフェクター細胞指向細胞死滅媒介能力などのインビトロ特性を示す。いくつかの実施形態では、好適な一価の抗ＨＥＲ２抗原結合コンストラクトは、標準二価の単一特異性抗ＨＥＲ２抗原結合コンストラクトと比較して、増殖阻害及び／またはエフェクター細胞指向細胞の死滅の増加を伴うＢｍａｘの上昇を示し、いくつかの実施形態では、一価の抗ＨＥＲ２抗原結合コンストラクトの組み合わせは、標準二価の単一特異性抗ＨＥＲ２抗原結合コンストラクトとの組み合わせと比較して、増殖阻害及び／またはエフェクター細胞指向細胞の死滅の増加を伴うＢｍａｘの上昇を示す。また、一価の抗ＨＥＲ２抗原結合コンストラクトは、標準二価の単一特異性抗ＨＥＲ２抗原結合コンストラクトと比較して、組織分布の増加を示す。
このため、一実施形態では、１つ以上の一価の抗ＨＥＲ２抗原結合コンストラクトを投与することを含むＨＥＲ２＋癌を治療する方法に関して記載され、ＨＥＲ２＋癌は、乳癌、卵巣癌、胃癌、食道胃接合癌、子宮内膜癌、唾液腺癌、脳腫瘍、肺癌、腎癌、結腸癌、結腸直腸癌、甲状腺癌、膵癌、前立腺癌、膀胱癌及び頭頸部から選択される。別の実施形態では、ＨＥＲ２＋癌は、乳癌、卵巣癌、脳腫瘍、及び肺癌から選択される。
他の実施形態では、乳癌は、トラスツズマブに対して治療抵抗性または耐性である、化学療法耐性乳癌、トリプルネガティブ乳癌、エストロゲン受容体陰性乳癌、またはエストロゲン受容体陽性乳癌である。
標準二価の単一特異性抗ＨＥＲ２抗原結合コンストラクトと比較して、ＨＥＲ２発現標的細胞のＢｍａｘの上昇、並びに一価の抗ＨＥＲ２抗原結合コンストラクトのＡＤＣＣを媒介する能力が、ＨＥＲ２の発現レベルに依存することなく観察されるが、一実施形態では、０〜２＋レベルでＨＥＲ２が発現しているＨＥＲ２＋細胞内で、一価の抗ＨＥＲ２抗原結合コンストラクトと標準二価の単一特異性抗ＨＥＲ２抗原結合コンストラクトとのＡＤＣＣ活性の最大差が観察され、このＨＥＲ２発現レベルは、免疫組織化学（ＩＨＣ）によって評価される。このため、一実施形態では、１つ以上の一価の抗ＨＥＲ２抗原結合コンストラクトを投与することを含むＨＥＲ２＋癌の治療方法が本明細書に記述され、ＨＥＲ２＋癌は、２＋以下のレベルでＨＥＲ２を発現している。一実施形態では、ＨＥＲ２＋癌は、１＋レベルでＨＥＲ２を発現している。
一実施形態では、ＨＥＲ２＋癌は、ＩＨＣで評価したとき２＋／３＋レベルでＨＥＲ２を発現している卵巣癌である。一実施形態では、ＨＥＲ２＋癌は、ＩＨＣで評価したとき２＋以下のレベルでＨＥＲ２を発現している乳癌である。一実施形態では、ＨＥＲ２＋癌は、ＩＨＣで評価したとき１＋のレベルでＨＥＲ２を発現している乳癌である。
本明細書に記載される方法において使用するために好適な一価の抗ＨＥＲ２抗原結合コンストラクトは、標準の二価の抗ＨＥＲ２抗原結合コンストラクトと比較して、更なる差異を示す。例えば、一価の抗ＨＥＲ２抗原結合コンストラクトは、標準の二価の抗ＨＥＲ２抗原結合コンストラクトと比較して、血液脳関門（ＢＢＢ）透過性の増大を示し、インビボモデルにおいて肺転移数を減少させることができる。このため、ＨＥＲ２＋癌の治療方法が本明細書に記述され、１つ以上の一価の抗ＨＥＲ２抗原結合コンストラクトを投与することを含み、ＨＥＲ２＋癌は、定着した原発性及び転移性乳癌である。一実施形態では、ＨＥＲ２＋癌は、原発性乳癌の肺転移または脳転移である。
治療方法
本明細書において、対象の治療方法を記述する。本方法は、対象にＨＥＲ２に結合する有効量の１つ以上の一価抗原結合コンストラクトを投与することを含む。
いくつかの実施形態において、治療法は、ＨＥＲ２＋腫瘍の増殖の阻害、及び／またはＨＥＲ２＋腫瘍の進行の遅延、及び／またはＨＥＲ２＋癌の治療、及び／またはＨＥＲ２＋癌の予防を目的とする。ＨＥＲ２＋腫瘍または癌は、乳房の、卵巣の、胃の、食道胃接合の、子宮内膜の、唾液腺の、頭頸部の、肺の、脳の、腎臓の、結腸の、結腸直腸の、甲状腺の、膵臓の、前立腺の、または膀胱の腫瘍または癌であり得る。いくつかの実施形態では、本方法は、トラスツズマブ耐性乳癌、化学療法耐性乳癌、トリプルネガティブ乳癌、エストロゲン受容体陰性乳癌、エストロゲン受容体陽性乳癌であるＨＥＲ＋乳癌の治療方法である。いくつかの実施形態では、本方法は、転移性乳癌、転移性脳腫瘍若しくは転移性肺癌、定着した原発性若しくは転移性乳癌、または乳癌の肺転移若しくは脳転移であるＨＥＲ２＋転移性癌を治療すること若しくは予防することである。
いくつかの実施形態では、ＨＥＲ２＋腫瘍または癌は、２＋以下のレベルでＨＥＲ２を発現している。いくつかの実施形態では、ＨＥＲ２＋腫瘍または癌は、免疫組織化学（ＩＨＣ）により判定し、本明細書に記載されるように、２＋または３＋のレベルでＨＥＲ２を発現している卵巣癌である。
本明細書に記載の治療方法は、ＨＥＲ２に結合する一価抗原結合コンストラクトまたは一価抗原結合コンストラクトの組み合わせを投与することを含む。一実施形態では、本方法は、ＨＥＲ２に結合する２つの一価抗原結合コンストラクトを投与することを含む。別の実施形態では、本方法は、ＨＥＲ２に結合する３つの一価抗原結合コンストラクトを投与することを含む。更に別の実施形態では、本方法は、ＨＥＲ２に結合する３つ以上の抗原結合コンストラクトを投与することを含む。
一価抗原結合コンストラクトの組み合わせを使用するとき、重複していないエピトープと結合するかまたはＨＥＲ２と結合するために互いに競合するように、一価抗原結合コンストラクトが選択される。例えば、各一価抗原結合コンストラクトがＨＥＲ２のＥＣＤ１、ＥＣＤ２、またはＥＣＤ３に結合する一価抗原結合コンストラクトの組み合わせを使用することができる。このため、一実施形態では、本組み合わせは、ＨＥＲ２のＥＣＤ１に結合する一価抗原結合コンストラクト及びＨＥＲ２のＥＣＤ２に結合する一価抗原結合コンストラクトを含む。一実施形態では、本組み合わせは、ＥＣＤ１に結合する一価抗原結合コンストラクト及びＥＣＤ４に結合する一価抗原結合コンストラクトを含む。一実施形態では、本組み合わせは、ＥＣＤ２に結合する一価抗原結合コンストラクト及びＥＣＤ４に結合する一価抗原結合コンストラクトを含む。一実施形態では、本組み合わせは、ＥＣＤ１に結合する一価抗原結合コンストラクト、ＥＣＤ２に結合する一価抗原結合コンストラクト及びＥＣＤ４に結合する一価抗原結合コンストラクトを含む。
用語「癌」及び「癌性」は、典型的には未調節細胞成長／増殖を特徴とする哺乳類における生理学的状態を意味するまたは説明する。癌の例としては、これらに限定されないが、癌腫、リンパ腫、芽腫、肉腫及び白血病が挙げられる。こうした癌の更に特定の例としては、扁平上皮癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌、肺扁平上皮癌、腹膜癌、骨髄腫（例えば、多発性骨髄腫）、肝細胞癌、胃腸癌、膵癌、グリア芽細胞腫／グリオーマ（例えば、未分化星状細胞腫、グリア芽細胞腫多形、退形成オリゴデンドログリオーマ、退形成オリゴデンドロアストロサイトーマ）、子宮頸癌、卵巣癌、肝癌、膀胱癌、肝癌、乳癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜または子宮癌、唾液腺癌、腎癌、肝癌、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、肝癌及びさまざまな型の頭頸部癌が挙げられる。
本明細書で使用するとき、「治療」は、治療対象の個体または細胞の自然経過を変化させるための臨床的介入を指し、予防としてまたは臨床病理学の経過中のいずれかで実施することができる。治療の望ましい効果としては、疾患の発症または再発の予防、症状の緩和、疾患の任意の間接的または非間接的な病理学的帰結の減少、転移の予防、疾患進行速度の低減、疾患状態の改善または緩和及び寛解または予後の改善が挙げられる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗体を使用して、疾患または障害の進行を遅延させる。一実施形態では、本明細書に記載の抗体及び方法により、腫瘍の退縮となる。一実施形態では、本明細書に記載の抗体及び方法により、腫瘍／癌の増殖の阻害となる。
本発明で使用するとき、用語「対象」は、動物を指し、いくつかの実施形態では哺乳類を指し、他の実施形態ではヒトであり、治療、観察または実験の対象である。動物は、コンパニオン動物（例えば、イヌ、ネコなど）、家畜（例えば、雌ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマなど）または実験室用動物（例えば、ラット、マウス、モルモットなど）である。
いくつかの実施形態では、対象は障害を有する。実施例としては、本明細書に記載の一価抗原結合コンストラクトまたは方法を用いる治療から利益を得る任意の状態が挙げられる。この状態としては、哺乳類が、問題の障害に罹患しやすいこれらの病理学的状態などの慢性及び急性の障害または疾患が挙げられる。本明細書で治療対象となる障害の非限定例としては、悪性及び良性腫瘍；非白血病及びリンパ液悪性疾患；ニューロン、グリア、星状細胞、視床下部及び他の腺、マクロファージ性、上皮性、間質性及び卵割腔障害；及び炎症性障害、免疫性疾患及び他の脈管形成関連障害が挙げられる。
本明細書で使用するとき、用語「有効量」とは、投与される一価抗原結合コンストラクトの量を指し、治療される疾病、病態または障害の１つ以上の症状がある程度軽減されることとなる。本明細書に記載のコンストラクトを含む組成物は、予防的に、強化するために、及び／または治療用処置のために投与され得る。
用語「強化する」または「強化すること」は、所望の効果の効力または持続時間のいずれかを増大するか、または延長することを意味する。このため、薬物分子または治療薬の効果を強化することに関して、用語「強化すること」は、任意の系での治療薬の効果を、効力または持続時間のいずれかにおいて増大するかまたは延長する能力を意味する。本明細書で使用するとき、「強化有効量」とは、所望の系において別の治療薬または薬剤の効果を強化するために適切な量を意味する。患者に使用される場合、この用途に有効な量は、疾病、障害または病態の重症度及び経過、従来の療法、患者の健康状態及び薬物応答性、並びに治療担当医師の判断に依存する。
癌治療
対象の治療用薬物を製造するために、本明細書に記載の少なくとも１つの一価抗原結合コンストラクトを使用することが本明細書に記載される。ある実施形態では、例えば、乳房の、卵巣の、胃の、食道胃接合部の、子宮内膜の、唾液腺の、頭頸部の、肺の、脳の、腎臓の、結腸の、結腸直腸の、甲状腺の、膵臓の、前立腺の、または膀胱のＨＥＲ２＋腫瘍または癌などの、ＨＥＲ２＋腫瘍の増殖阻害、ＨＥＲ２＋腫瘍の進行の遅延、ＨＥＲ２＋癌の治療またはＨＥＲ２＋癌の予防のために薬物を製造することを目的として、本明細書に記載の一価抗原結合コンストラクトを使用することが記述されている。
いくつかの実施形態では、薬剤の製造のための、本明細書に記載の一価のＨＥＲ２結合抗原結合コンストラクト使用は、癌の治療またはＨＥＲ１機能障害、ＨＥＲ２機能障害、ＨＥＲ３機能障害及び／またはＨＥＲ４機能障害など、ＥＧＦＲ及び／またはＨＥＲ機能障害に関連する任意の増殖性疾患の治療のためである。ある実施形態では、癌は低ＥＧＦＲ及び／またはＨＥＲ２発現癌である。特定の態様において、癌は、二価のＨＥＲ２抗体を用いる治療に耐性がある。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＨＥＲ２結合一価抗原結合コンストラクトは、乳癌細胞の治療において使用される。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の一価のＨＥＲ２結合抗原結合コンストラクトは、現在の療法に一部応答性のある患者を治療するために使用される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＨＥＲ２結合一価抗原結合コンストラクトは、現在の療法に耐性のある患者を治療するために使用される。別の実施形態では、本明細書に記載の一価のＨＥＲ２結合抗原結合コンストラクトは、現在の療法に耐性を発現している患者を治療するために使用される。いくつかの実施形態では、薬剤の製造のための、本明細書に記載の一価のＨＥＲ２結合抗原結合コンストラクトの使用は、トラスツズマブを用いる治療に耐性のある癌を治療するためである。
一実施形態では、本明細書に記載の一価のＨＥＲ２結合抗原結合コンストラクトは、現在の乳癌の療法に非応答性である患者を治療するために有用である。ある実施形態では、これらの患者は、トリプルネガティブ癌を患っている。いくつかの実施形態では、トリプルネガティブ癌は、低いかまたは無視できるほどのエストロゲン受容体（ＥＲ）遺伝子、プロゲステロン受容体（ＰＲ）遺伝子及びＨＥＲ２遺伝子の発現を有する乳癌である。特定の他の実施形態では、本明細書に記載の一価のＨＥＲ２結合抗原結合コンストラクトが、任意により、例えば、乳癌の治療などのための１つ以上の現在の抗ＨＥＲ２療法を組み合わせて、現在の治療に無応答である患者に提供される。いくつかの実施形態では、現在の抗ＨＥＲ２療法としては、これらに限定されないが、抗ＨＥＲ２または抗ＨＥＲ３単一特異性二価抗体、トラスツズマブ、ペルツズマブ、Ｔ−ＤＭ１、二重特異性ＨＥＲ２／ＨＥＲ３ ｓｃＦｖ若しくはこれらの組み合わせが挙げられる。一実施形態では、本明細書に記載の一価抗原結合コンストラクトは、トラスツズマブ、ペルツズマブ、Ｔ−ＤＭ１、抗ＨＥＲ２、または抗ＨＥＲ３の単独のもの、または組み合わせたものに応答しない患者を治療するために使用される。
一実施形態では、ＨＥＲ２に結合する抗原結合ポリペプチドコンストラクトを含む一価のＨＥＲ２結合抗原結合コンストラクトは、転移性乳癌患者の治療において使用可能である。一実施形態では、ＨＥＲ２結合一価抗体は、局所的進行または進行性転移癌患者の治療に有用である。一実施形態では、ＨＥＲ２結合一価抗体は、治療抵抗性癌患者の治療に有用である。一実施形態では、ＨＥＲ２結合一価抗体は、患者がこれまでの抗ＨＥＲ２治療で進行した場合に、転移性癌の治療のために該患者に提供される。一実施形態では、本明細書に記載のＨＥＲ２結合一価抗体は、トリプルネガティブ乳癌患者の治療に使用することも可能である。一実施形態では、本明細書に記載のＨＥＲ２結合一価抗体は、進行性、治療抵抗性ＨＥＲ２増幅ヘレグリン陽性癌患者の治療に使用される。
一価のＨＥＲ２結合抗原結合コンストラクトは、癌治療用の他の公知の療法と組み合わせて投与され得る。この実施形態によれば、一価抗原結合コンストラクトは、ＦＳＡを上回って有意にＢｍａｘ及び抗体依存性細胞障害活動を上昇させるために、重複していない結合標的エピトープを有する他の一価抗原結合コンストラクトまたは多価抗体と組み合わせて投与され得る。例えば、本明細書に記載の一価のＨＥＲ２結合抗原結合コンストラクトは、以下の組み合わせで投与され得る：
（１）ｖ４１８２との組み合わせにおいて、ｖ１０４０またはｖ１０４１などの一価抗原結合コンストラクト（ペルツズマブをベースとする）；（２）セツキシマブ二価ＥＧＦＲ抗体との組み合わせにおいて、ｖ１０４１またはｖ１０４０及び／またはｖ４１８２、ならびに（３）同一標的細胞での同一及び異なる表面抗原で指向された非競合抗体の複数の組み合わせ。ある実施形態では、本明細書に記載の一価抗原結合コンストラクトは、進行性ＨＥＲ２増幅ヘレグリン陽性乳癌患者の治療のために、ハーセプチン（商標）、Ｔ−ＤＭ１、非フルコシ化抗体またはＰｅｒｊｅｔａから選択される治療法と組み合わせて投与する。ある実施形態では、本明細書に記載の一価抗原結合コンストラクトは、食道下部、胃食道（ＧＥ）接合部及び胃のＨＥＲ２発現癌患者において、ハーセプチン（商標）またはＰｅｒｊｅｔａと組み合わせて投与する。
ＨＥＲ２＋癌とは、ＨＥＲ２発現している癌を意味し、したがって本明細書に記載の一価抗原結合コンストラクトが癌と結合できる。当該技術分野で周知のように、ＨＥＲ２＋癌では、さまざまなレベルでＨＥＲ２を発現している。癌におけるＥｒｂＢ、例えば、ＥｒｂＢ２の発現を判定するために、さまざまな診断アッセイ／予後アッセイが利用可能である。一実施形態では、ＩＨＣ、例えば、ＨＥＲＣＥＰＴＥＳＴ（登録商標）（Ｄａｋｏ）を用いることによって、ＥｒｂＢ２の過剰発現を解析することもできる。腫瘍生検によるパラフィン包埋組織切片に対してＩＨＣアッセイを行い、以下のＥｒｂＢ２タンパク質の染色強度基準に従ってもよい：
スコア０。染色が観察されないか、または、腫瘍細胞の１０％未満の膜染色が観察される。
スコア１＋。腫瘍細胞の１０％超にかすかな／ほとんど識別できない膜染色が検出される。細胞は、それらの膜の一部のみ染色されている。
スコア２＋。腫瘍細胞の１０％超に弱〜中程度の完全な膜染色が観察される。
スコア３＋。腫瘍細胞の１０％超に中〜強程度の完全な膜染色が観察される。
ＥｒｂＢ２過剰発現評価用のスコア０または１＋のこれらの腫瘍は、ＥｒｂＢ２を過剰発現していないとみなし、またスコア２＋または３＋のこれらの腫瘍は、ＥｒｂＢ２を過剰発現しているとみなしてよい。
代替的または追加の方法として、ホルマリン固定パラフィン包埋腫瘍組織で、例えば、商品名ＩＮＦＯＲＭ（商標）（Ｖｅｎｔａｎａ，Ａｒｉｚより販売）または商品名ＰＡＴＨＶＩＳＩＯＮ（商標）（Ｖｙｓｉｓ，Ｉｌｌ）などのＦＩＳＨ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）法を実施して、腫瘍中のＥｒｂＢ２過剰発現範囲（存在する場合には）を測定してもよい。ＩＨＣ法と比較して、ＨＥＲ２遺伝子の増幅を測定するＦＩＳＨ法は、患者のハーセプチン（登録商標）による治療への応答とより良好に相関していると考えられ、また、現在では、ハーセプチン（登録商標）治療または本発明の二重特異性抗体コンストラクトによる治療より利益を受ける可能性が高い患者の同定に好ましい方法であると考えられている。
いくつかの実施形態では、薬剤の製造のための、本明細書に記載の一価のＨＥＲ２結合抗原結合コンストラクト使用は、２＋レベル以下でＨＥＲ２を発現している癌の治療のためであり、ＨＥＲ２のレベルはＩＨＣにより測定する。いくつかの実施形態では、薬剤の製造のための、本明細書に記載の一価のＨＥＲ２結合抗原結合コンストラクト使用は、１＋レベル以下でＨＥＲ２を発現している癌の治療のためであり、ＨＥＲ２のレベルはＩＨＣにより測定する。いくつかの実施形態では、薬剤の製造のための、本明細書に記載の一価のＨＥＲ２結合抗原結合コンストラクト使用は、３＋レベルでＨＥＲ２を発現している癌の治療のためであり、ＨＥＲ２のレベルは、ＩＨＣにより測定する。いくつかの実施形態では、薬剤の製造のために本明細書に記載の一価のＨＥＲ２結合抗原結合コンストラクトを使用することは、２＋レベルまたは３＋レベルでＨＥＲ２を発現している癌の治療のためであり、ＨＥＲ２のレベルはＩＨＣにより測定する。
併用投与：
いくつかの実施形態では、一価のＨＥＲ２抗原結合コンストラクトの使用は、追加の剤（例えば、放射線治療剤、化学療法剤、ホルモン療法剤、免疫療法剤及び抗腫瘍剤）と組み合わせて投与され得る。
抗原結合コンストラクト
本明細書に記載の治療法としては、ＨＥＲ２に結合する少なくとも１つの一価抗原結合コンストラクト、例えば少なくとも１つの一価抗体の投与が挙げられる。本明細書に記載の方法で使用される抗原結合コンストラクトとしては、Ｆｃ及び抗原結合ポリペプチドコンストラクトが挙げられる。
用語「抗原結合コンストラクト」とは、例えば、抗原に結合可能なポリペプチドまたはポリペプチド錯体など、任意の剤を意味する。いくつかの態様では、抗原結合コンストラクトは、目的とする抗原に特異的に結合するポリペプチドである。抗原結合コンストラクトは、単量体、二量体、多量体、タンパク質、ペプチド、またはタンパク質もしくはペプチド錯体、抗体、抗体断片、またはそれらの抗原結合断片、ｓｃＦｖなどであってもよい。抗原結合コンストラクトは、単一特異性、二重特異性、多特異性のポリペプチドコンストラクトであってもよい。いくつかの態様では、抗原結合コンストラクトとしては、例えば、１つ以上のＦｃに連結する１つ以上の抗原結合要素（例えば、ＦａｂまたはｓｃＦｖ）などを挙げることができる。抗原結合コンストラクトの更なる例としては、以下で説明し、実施例に示す。
本明細書で使用するとき、用語「一価抗原結合コンストラクト」は、１つの抗原結合ドメインを有する抗原結合コンストラクトを意味する。抗原結合ドメインは、これに限定されないが、Ｆａｂ（抗原結合断片）、ｓｃＦｖ（単鎖Ｆｖ）及びｓｄａｂ（シングルドメイン抗体）などのフォーマットであってもよい。一価抗原結合コンストラクトの例示的コンストラクトは、図１Ｂ及び１Ｃに示す。
本明細書で使用するとき、用語「単一特異性二価抗原結合コンストラクト」は、２つの抗原結合ドメイン（二価）を有する抗原結合コンストラクトを意味し、そのいずれもが同一のエピトープ／抗原（単一特異性）に結合する。抗原結合ドメインは、これに限定されないが、Ｆａｂ（抗原結合断片）、ｓｃＦｖ（単鎖Ｆｖ）及びｓｄａｂ（シングルドメイン抗体）などのフォーマットであってもよい。また、単一特異性二価抗原結合コンストラクトは、本明細書において、「全長抗体」または「ＦＳＡ」とも称される。単一特異性二価抗原結合コンストラクトの例示的コンストラクトは、図１Ａに示す。いくつかの実施形態では、単一特異性二価抗原結合コンストラクトは、一価抗原結合コンストラクトの性質を測定したものに対する基準である。いくつかの他の実施形態では、２つの単一特異性二価抗原結合コンストラクトの組み合わせは、２つの一価抗原結合コンストラクトの性質を測定したものに対する基準である。かかる場合、標準の単一特異性二価抗原結合コンストラクトは、一価抗原結合コンストラクトに対応している。例えば、ＨＥＲ２のＥＣＤ２において一価抗原結合コンストラクトがエピトープに結合し、かつ抗原結合ドメインがＦａｂフォーマットにある場合、対応する単一特異性二価抗原結合コンストラクトもＨＥＲ２のＥＣＤ２内の同一エピトープに結合し、２つの抗原結合ドメインもＦａｂフォーマット内にある。２つの単一特異性二価抗原結合コンストラクトの組み合わせが標準として使用される場合には、同じことが言え、２つの単一特異性二価抗原結合コンストラクトのそれぞれが、一価抗原結合コンストラクトの１つに対応することになる。いくつかの実施形態では、２つの一価抗原結合コンストラクトの組み合わせが使用される場合、１つの単一特異性二価抗原結合コンストラクトが標準として使用され、１つの単一特異性二価抗原結合コンストラクトは、例えば、ハーセプチン（商標）またはＴ−ＤＭ１などの標準（ＳＯＣ）療法を指す。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法で使用される一価抗原結合コンストラクトはヒト化されている。非ヒト（例えば、げっ歯類）抗体の「ヒト化」形態は、非ヒト免疫グロブリンから誘導される最少の配列を含有するキメラ抗体である。ほとんどの部分では、ヒト化抗体は、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）であり、レシピエントの高頻度可変領域の残基は、マウス、ラット、ウサギまたは所望の特異性、アフィニティ及び能力を有する非ヒト霊長類など、非ヒト種（ドナー抗体）の高頻度可変領域の残基に置き換えられる。いくつかの例では、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域（ＦＲ）残基は、対応する非ヒト残基によって置き換えられている。更に、ヒト化抗体は、レシピエント抗体またはドナー抗体において検出されない残基を含んでもよい。これらの修飾を行って更に抗体性能を洗練させる。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つの、典型的には２つの実質的に全ての可変ドメインを含み、全てまたは実質的に全ての高頻度可変性ループは、非ヒト免疫グロブリンのこれらのループに対応し、全てまたは実質的に全てのＦＲは、ヒト免疫グロブリン配列のループである。また、ヒト化抗体は、任意により少なくとも一部の免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、典型的にはヒト免疫グロブリンの定常領域も含む。更なる詳細については、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２〜５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３〜３２９（１９８８）；及びＰｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３〜５９６（１９９２）を参照されたい。
ヒト化ＨＥＲ２抗体としては、参照によって本明細書に明示的に援用される米国特許明細書第５，８２１，３３７号表３に示すように、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−１、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−２、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−３、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−４、 ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−５、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−６、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−７及び、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−８またはトラスツズマブ（ハーセプチン（登録商標））、米国特許明細書第２００６／００１８８９９号に記載されているようにヒト化５２０Ｃ９（ＷＯ９３／２１３１９）及び２０'ヒト化２Ｃ４抗体が挙げられる。
抗原結合ポリペプチドコンストラクト
本明細書に記載の方法において使用される抗原結合コンストラクトとしては、例えば、抗原結合ドメインなどの抗原結合ポリペプチドコンストラクトが挙げられる。抗原結合ポリペプチドコンストラクトは、ＨＥＲ２に特異的に結合する。抗原結合ポリペプチドコンストラクトのフォーマットは、その適用に依存して、例えば、Ｆａｂフォーマット、ｓｃＦＶフォーマット、Ｓｄａｂフォーマットであり得る。
「Ｆａｂ断片」フォーマット（抗原結合断片とも称される）は、それぞれ軽鎖及び重鎖での可変ドメインＶＬ及びＶＨと共に、軽鎖の定常ドメイン（ＣＬ）及び重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）を含有する。可変ドメインは、抗原結合に伴う相補性決定ループ（ＣＤＲ、高頻度可変性領域とも称される）を含む。Ｆａｂ'断片は、抗体ヒンジ領域の１つ以上のシステインなど、重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端に少数の残基を添加することによって、Ｆａｂ断片とは異なる。
「一本鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」フォーマットとしては、これらのドメインは、一本鎖ポリペプチド内に存在する抗体のＶＨ及びＶＬドメインが挙げられる。一実施形態では、Ｆｖポリペプチドは、抗原結合のために、ｓｃＦｖが所望のコンストラクトを形成できるようになるＶＨドメインとＶＬドメインとの間にポリペプチドリンカーを更に含む。ｓｃＦｖを検討する場合は、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ ｉｎ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， ｖｏｌ． １１３， Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ ａｎｄ Ｍｏｏｒｅ ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６９〜３１５（１９９４）を参照されたい。ＨＥＲ２抗体ｓｃＦｖ断片は、ＷＯ９３／１６１８５、米国特許明細書第５，５７１，８９４号及び米国特許明細書第５，５８７，４５８号に記載されている。
「シングルドメイン抗体」または「Ｓｄａｂ」フォーマットは、個々の免疫グロブリンドメインである。Ｓｄａｂは、かなり安定しており、抗体のＦｃ鎖との融合パートナーとして、容易に発現する（Ｈａｒｍｓｅｎ ＭＭ， Ｄｅ Ｈａａｒｄ ＨＪ（２００７），"Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ， ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ， ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｃａｍｅｌｉｄ ｓｉｎｇｌｅ−ｄｏｍａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ"Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ７７（１）：１３〜２２）。
一価で抗原に結合する抗原結合ポリペプチドコンストラクトは、公知の抗体若しくは抗原結合ドメインから誘導することができるか、または新規の抗体若しくは抗原結合ドメインから誘導することができる。抗原結合コンストラクトの選択は、本明細書に更に詳細に記載されている。
一価抗原結合コンストラクトがＨＥＲ２に結合する抗原結合ポリペプチドコンストラクトを含む実施形態では、抗原結合ポリペプチドコンストラクトは、Ｆａｂ断片、ｓｃＦｖ及びｓｄａｂなどのさまざまなフォーマットで公知の抗ＨＥＲ２抗体または抗ＨＥＲ２結合ドメインから誘導することができる。ある実施形態では、抗原結合ポリペプチドコンストラクトは、これらの抗体のヒト化体またはキメラ体から誘導することができる。一実施形態では、抗原結合ポリペプチドコンストラクトは、トラスツズマブ、ペルツズマブ、またはそれらのヒト化体のＦａｂ断片から誘導される。このような抗原結合ポリペプチドコンストラクトの非限定的例としては、これらに限定されないが、１０４０、１０４１及び４１８２など、本明細書に記載の一価抗原結合コンストラクト内で見出されるものが挙げられる。一実施形態では、抗原結合ポリペプチドコンストラクトは、ｓｃＦｖから誘導される。このような抗原結合ポリペプチドコンストラクトの非限定的例としては、６３０及び８７８など、一価抗原結合コンストラクト内で見出されるものが挙げられる。一実施形態では、抗原結合ポリペプチドコンストラクトは、ｓｄａｂから誘導される。
本明細書の他の場所で記述しているように、ＥＣＤ１、ＥＣＤ２またはＥＣＤ４に結合する抗体は、当技術分野において既知であり、例えば、２Ｃ４またはペルツズマブ（ＥＣＤ２に結合する）、４Ｄ５またはトラスツズマブ（ＥＣＤ４に結合する）、あるいは７Ｃ２／Ｆ３、Ｂ１Ｄ２、またはｃ６．５（ＥＣＤ１に結合する）が挙げられる。ＨＥＲ２に結合する他の抗体についても、当該技術分野、例えば、ＷＯ２０１１／１４７９８２（Ｇｅｎｍａｂ Ａ／Ｓ）に記述されている。本明細書に記載の治療法での使用に好適な一価抗原結合コンストラクトは、ＥＣＤ１、ＥＣＤ２、またはＥＣＤ４に結合する他の公知の抗ＨＥＲ２抗体から誘導することができる。
いくつかの実施形態では、一価抗原結合コンストラクトの抗原結合ポリペプチドコンストラクトは、ＨＥＲ２のＥＣＤ４へのトラスツズマブの結合を５０％以上遮断する抗体から誘導される。いくつかの実施形態では、一価抗原結合コンストラクトの抗原結合ポリペプチドコンストラクトは、ＨＥＲ２のＥＣＤ２へのペルツズマブの結合を５０％以上遮断する抗体から誘導される。いくつかの実施形態では、一価抗原結合コンストラクトの抗原結合ポリペプチドコンストラクトは、ＨＥＲ２のＥＣＤ１へのＣ６．５、Ｂ１Ｄ２または７Ｃ２／Ｆ３の結合を５０％以上遮断する抗体から誘導される。
いくつかの実施形態では、抗原結合ポリペプチドコンストラクトを修飾して、ＨＥＲ２のアフィニティを増大させる。ＨＥＲ２のアフィニティが増大している抗原結合コンストラクトの作製方法及び／またはスクリーニング方法の例を、本明細書に記載する。非限定的例としては、本明細書に記載の一価抗原結合コンストラクト４４４２、４４４３、４４４４、及び４４４５内で見出されるものが挙げられる。
ＨＥＲ２
本明細書に記載の方法としては、ＨＥＲ２に結合する抗原結合ポリペプチドコンストラクトを有する少なくとも１つの単離された一価抗原結合コンストラクトの投与が挙げられる。いくつかの実施形態では、抗原結合ポリペプチドコンストラクトは、ＨＥＲ２のＥＣＤ１及びＥＣＤ２またはＥＣＤ４に結合される。
発現「ＥｒｂＢ２」及び「ＨＥＲ２」は、本明細書では同義的に用いられ、例えば、Ｓｅｍｂａ ｅｔ ａｌ， ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）８２：６４９７〜６５０１（１９８５）及びＹａｍａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ． Ｎａｔｕｒｅ ３１９：２３０〜２３４（１９８６）（Ｇｅｎｅｂａｎｋアクセッション番号Ｘ０３３６３）に記載されたヒトＨＥＲ２タンパク質を意味する。用語「ｅｒｂＢ２」及び「ｎｅｕ」は、ヒトＥｒｂＢ２タンパク質をコードする遺伝子を意味し、ｐ１８５またはｐ１８５ｎｅｕは、ｎｅｕ遺伝子のタンパク質生成物を意味する。好ましいＨＥＲ２は、天然配列ヒトＨＥＲ２である。
ＨＥＲ２の細胞外（ｅｃｔｏ）ドメインは、４つのドメイン、ドメインＩ（ＥＣＤ１、約１〜１９５のアミノ酸残基）、ドメインＩＩ（ＥＣＤ２、約１９６〜３１９のアミノ酸残基）、ドメインＩＩＩ（ＥＣＤ３、約３２０〜４８８のアミノ酸残基）、及びドメインＩＶ（ＥＣＤ４、約４８９〜６３０のアミノ酸残基）（残基の数には、シグナルペプチドを含まない）を含む。Ｇａｒｒｅｔｔ ｅｔ ａｌ． Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． １１：４９５〜５０５ （２００３），Ｃｈｏ ｅｔ ａｌ． Ｎａｔｕｒｅ ４２１：７５６〜７６０ （２００３），Ｆｒａｎｋｌｉｎ ｅｔ ａｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ ５：３１７〜３２８ （２００４），Ｔｓｅ ｅｔ ａｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｔｒｅａｔ Ｒｅｖ． ２０１２ Ａｐｒ；３８（２）：１３３〜４２（２０１２）、またはＰｌｏｗｍａｎ ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ９０：１７４６〜１７５０（１９９３）を参照されたい。
ＨＥＲ２の配列は次のとおりである；ＥＣＤ境界は、ドメインＩ：１〜１６５；ドメインＩＩ：１６６〜３２２；ドメインＩＩＩ：３２３〜４８８：ドメインＩＶ：４８９〜６０７である。
Figure 2017504564
「ＨＥＲ受容体」は、ヒト上皮成長因子受容体（ＨＥＲ）ファミリーに属する受容体タンパク質チロシンキナーゼであり、ＥＧＦＲ受容体、ＨＥＲ２受容体、ＨＥＲ３受容体及びＨＥＲ４受容体が挙げられる。ＨＥＲ受容体は、概して細胞外ドメインを含み、ＨＥＲリガンド、親油性の膜貫通ドメイン、保存された細胞内チロシンキナーゼドメイン、及びリン酸化され得るいくつかのチロシン残基を含むカルボキシ末端シグナル伝達ドメインに結合し得る。
「ＨＥＲリガンド」は、ＨＥＲ受容体に結合する及び／または活性化するポリペプチドを意味する。例としては、以下などの天然配列ヒトＨＥＲリガンドが挙げられる；上皮成長因子（ＥＧＦ）（Ｓａｖａｇｅ ｅｔ ａｌ，Ｊ． Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４７：７６１２〜７６２１（１９７２））；トランスフォーミング成長因子アルファ（ＴＧＦ−α）（Ｍａｒｑｕａｒｄｔ ｅｔ ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ２２３：１０７９〜１０８２（１９８４））；ｓｃｈｗａｎｏｍａとしても公知のアンフィレグリンまたはケラチノサイトオートクライン成長因子（Ｓｈｏｙａｂ ｅｔ ａｌ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４３：１０７４〜１０７６（１９８９）；Ｋｉｍｕｒａ ｅｔ ａｌ． Ｎａｔｕｒｅ ３４８：２５７〜２６０（１９９０）；及びＣｏｏｋ ｅｔ ａｌ． Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１：２５４７〜２５５７（１９９１））；ｂｅｔａｃｅｌｌｕｌｉｎ （Ｓｈｉｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５９：１６０４〜１６０７（１９９３）；及びＳａｓａｄａ ｅｔ ａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ．１９０：１１７３（１９９３））；ヘパリン結合上皮成長因子（ＨＢ−ＥＧＦ）（Ｈｉｇａｓｈｉｙａｍａ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５１：９３６〜９３９（１９９１））；ｅｐｉｒｅｇｕｌｉｎ（Ｔｏｙｏｄａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．２７０：７４９５〜７５００ （１９９５）；及びＫｏｍｕｒａｓａｋｉ ｅｔ ａｌ． Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １５：２８４１〜２８４８（１９９７））；ヘレグリン（下記参照）；ニューレグリン−２（ＮＲＧ−２）（Ｃａｒｒａｗａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３８７：５１２〜５１６（１９９７））；ニューレグリン−３（ＮＲＧ−３）（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９４：９５６２〜９５６７（１９９７））；ニューレグリン−４（ＮＲＧ−４）（Ｈａｒａｒｉ ｅｔ ａｌ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １８：２６８１〜８９（１９９９））またはクリプロ（ＣＲ−１）（Ｋａｎｎａｎ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２（６）：３３３０〜３３３５（１９９７））。ＥＧＦＲを結合するＨＥＲリガンドとしては、ＥＧＦ、ＴＧＦ−α、アンフィレギュリン、ｂｅｔａｃｅｌｌｕｌｉｎ、ＨＢ−ＥＧＦ及びｅｐｉｒｅｇｕｌｉｎが挙げられる。ＨＥＲ３を結合するＨＥＲリガンドとしては、ヘレグリンが挙げられる。ＨＥＲ４を結合可能なＨＥＲリガンドとしては、ｂｅｔａｃｅｌｌｕｌｉｎ、ｅｐｉｒｅｇｕｌｉｎ、ＨＢ−ＥＧＦ、ＮＲＧ−２、ＮＲＧ−３、ＮＲＧ−４及びヘレグリンが挙げられる。
本明細書で使用するとき、米国特許第５，６４１，８６９号またはＭａｒｃｈｉｏｎｎｉ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ，３６２：３１２〜３１８（１９９３）に記載されているように、「ヘレグリン」（ＨＲＧ）は、ヘレグリン遺伝子産物によってコードされるポリペプチドを意味する。ヘレグリンの例としては、以下が挙げられる；ヘレグリン−α、ヘレグリン−β１、ヘレグリン−β２及びヘレグリン−β３（Ｈｏｌｍｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５６：１２０５〜１２１０（１９９２）；及び米国特許第５，６４１，８６９号）；ｎｅｕ分化因子（ＮＤＦ）（Ｐｅｌｅｓ ｅｔ ａｌ． Ｃｅｌｌ ６９：２０５〜２１６（１９９２））；アセチルコリン受容体誘導活性（ＡＲＩＡ）（Ｆａｌｌｓ ｅｔ ａｌ． Ｃｅｌｌ ７２：８０１〜８１５（１９９３））；グリア成長因子（ＧＧＦ）（Ｍａｒｃｈｉｏｎｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３６２：３１２〜３１８（１９９３））；感覚神経及び運動神経誘導因子（ＳＭＤＦ）（Ｈｏ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１４５２３〜１４５３２（１９９５））；γ−ヘレグリン（Ｓｃｈａｅｆｅｒ ｅｔ ａｌ． Ｏｎｃｏｇｅｎｅ１５：１３８５〜１３９４（１９９７））。この用語には、それらのＥＧＦ−様ドメイン断片などの（例えば、ＨＲＧβ１１７７〜２４４）天然配列ＨＲＧポリペプチドの生物学的活性断片及び／またはアミノ酸配列変異型が含まれる。
「ＨＥＲ活性化」または「ＨＥＲ２活性化」とは、いずれか１つ以上のＨＥＲ受容体またはＨＥＲ２受容体の活性化またはリン酸化を意味する。概して、ＨＥＲ活性化により、シグナル伝達が起こる（例えば、ＨＥＲ受容体または基質ポリペプチド内でのＨＥＲ受容体リン酸化チロシン残基の細胞内キナーゼドメインによって起こる）。ＨＥＲ活性化は、目的のＨＥＲ受容体を含むＨＥＲ二量体に結合しているＨＥＲリガンドに媒介されてもよい。ＨＥＲ二量体に結合するＨＥＲリガンドは、二量体中の１つ以上のＨＥＲ受容体のキナーゼドメインを活性化することもあり、これによって、１つ以上のＨＥＲ受容体においてチロシン残基がリン酸化される、及び／またはＡｋｔまたはＭＡＰＫ細胞内キナーゼなど、追加の基質ポリペプチド（複数可）中のチロシン残基がリン酸化される。
本明細書で使用するとき、用語「ＥＧＦＲ」は、上皮成長因子受容体（ＨＥＲ−１またはＥｒｂ−Ｂ１としても公知）を意味し、ヒト形態（複数可）（Ｕｌｒｉｃｈ， Ａ． ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３０９：４１８〜４２５（１９８４）；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔアクセッション＃Ｐ００５３３；セカンダリアクセッション番号：Ｏ００６８８、Ｏ００７３２、Ｐ０６２６８、Ｑ１４２２５、Ｑ９２７９５、Ｑ９ＢＺＳ２、Ｑ９ＧＺＸ１、Ｑ９Ｈ２Ｃ９、Ｑ９Ｈ３Ｃ９、Ｑ９ＵＭＤ７、Ｑ９ＵＭＤ８、Ｑ９ＵＭＧ５）並びに天然アイソフォーム及びそれらの変異型が挙げられる。このようなアイソフォーム及び変異型としては、これらに限定されないが、ＥＧＦＲｖＩＩＩ変異体、選択的スプライシング産物（例えば、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ００５３３−１、Ｐ００５３３−２、Ｐ００５３３−３、Ｐ００５３３−４により識別される）、変異型ＧＬＮ−９８、ＡＲＧ−２６６、Ｌｙｓ−５２１、ＩＬＥ−６７４、ＧＬＹ−９６２及びＰＲＯ−９８８（Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎ， Ｒ． Ｊ． ｅｔ ａｌ．，ＮＩＥＨＳ−ＳＮＰｓ，ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ ｇｅｎｏｍｅ ｐｒｏｊｅｃｔ， ＮＩＥＨＳ ＥＳ１５４７８，Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓｅａｔｔｌｅ，Ｗａｓｈ．（２００４））、及び次のアクセッション番号によって同定される他のもの：ＮＭ００５２２８．３、ＮＭ２０１２８２．１、ＮＭ２０１２８３．１、ＮＭ２０１２８４．１（ＲＥＦＳＥＱ ｍＲＮＡ）；ＡＦ１２５２５３．１、ＡＦ２７７８９７．１、ＡＦ２８８７３８．１、ＡＩ２１７６７１．１、ＡＫ１２７８１７．１、ＡＬ５９８２６０．１、ＡＵ１３７３３４．１、ＡＷ１６３０３８．１、ＡＷ２９５２２９．１、ＢＣ０５７８０２．１、ＣＢ１６０８３１．１、Ｋ０３１９３．１、Ｕ４８７２２．１、Ｕ９５０８９．１、Ｘ００５８８．１、Ｘ００６６３．１；Ｈ５４４８４Ｓ１、Ｈ５４４８４Ｓ３、Ｈ５４４８４Ｓ２（ＭＩＰＳアセンブリ）；ＤＴ．４５３６０６、ＤＴ．８６８５５６５１、ＤＴ．９５１６５５９３、ＤＴ．９７８２２６８１、ＤＴ．９５１６５６００、ＤＴ．１００７５２４３０、ＤＴ．９１６５４３６１、ＤＴ．９２０３４４６０、ＤＴ．９２４４６３４９、ＤＴ．９７７８４８４９、ＤＴ．１０１９７８０１９、ＤＴ．４１８６４７、ＤＴ．８６８４２１６７、ＤＴ．９１８０３４５７、ＤＴ．９２４４６３５０、ＤＴ．９５１５３００３、ＤＴ．９５２５４１６１、ＤＴ．９７８１６６５４、ＤＴ．８７０１４３３０、ＤＴ．８７０７９２２４（ＤＯＴＳアセンブリ）が挙げられる。本明細書で参照しているアクセッション番号はすべて、２０１３年１１月８日時点でのＮＣＢＩデータベース（または関連した標準データベース）から取得する。
一価抗原結合コンストラクトがＨＥＲ２に結合する抗原結合ポリペプチドコンストラクトを含む実施形態では、抗原結合ポリペプチドコンストラクトは、ＨＥＲ２若しくはＨＥＲ２の特定のドメインまたはエピトープに結合する。一実施形態では、抗原結合ポリペプチドコンストラクトは、ＨＥＲ２の細胞外ドメインに結合する。当該技術分野で周知であるとおり、ＨＥＲ２抗原は、複数の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を含む。
一実施形態は、ＥＣＤ１、ＥＣＤ２、ＥＣＤ３及びＥＣＤ４から選択されるＨＥＲ２のＥＣＤに結合する抗原結合ポリペプチドコンストラクトを含む本明細書に記載の一価抗原結合コンストラクトである。別の実施形態では、一価抗原結合コンストラクトは、ＥＣＤ１、ＥＣＤ２及びＥＣＤ４から選択されるＨＥＲ２のＥＣＤに結合する抗原結合ポリペプチドコンストラクトを含む。一実施形態では、一価抗原結合コンストラクトは、ＥＣＤ１に結合する抗原結合ポリペプチドコンストラクトを含む。一実施形態では、一価抗原結合コンストラクトは、ＥＣＤ２に結合する抗原結合ポリペプチドコンストラクトを含む。一実施形態では、一価抗原結合コンストラクトは、ＥＣＤ４に結合する抗原結合ポリペプチドコンストラクトを含む。別の実施形態では、一価抗原結合構造コンストラクトは、２Ｃ４、４Ｄ５及びＣ６．５から選択されるＨＥＲ２のエピトープに結合する抗原結合ポリペプチドコンストラクトを含む。
「エピトープ２Ｃ４」は、抗体２Ｃ４が結合するＨＥＲ２細胞外ドメイン内の領域である。２Ｃ４エピトープに結合する抗体のスクリーニングを行うには、ルーチンの交差ブロッキングアッセイ（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｅｄ Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｄａｖｉｄ Ｌａｎｅ（１９８８）に記載されているものなど）を実施してもよい。あるいは、当該技術分野において既知の方法を使用して、エピトープマッピングを実施して、抗体がＨＥＲ２の２Ｃ４エピトープに結合するかを評価することができる、及び／または抗体ＨＥＲ２コンストラクト（Ｆｒａｎｋｌｉｎ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ ５：３１７−３２８（２００４））を研究して、ＨＥＲ２の何のドメイン（複数可）が抗体によって結合されているかがわかる。エピトープ２Ｃ４は、ＨＥＲ２の細胞外ドメインにおいてドメインＩＩ由来の残基を含む。２Ｃ４及びペルツズマブは、ドメインＩ、ＩＩ及びＩＩＩの接合部でＨＥＲ２の細胞外ドメインに結合する（Ｆｒａｎｋｌｉｎ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ ５：３１７〜３２８（２００４））。
「エピトープ４Ｄ５」は、抗体４Ｄ５（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１０４６３）及びトラスツズマブが結合するＨＥＲ２細胞外ドメイン内の領域である。このエピトープは、ＨＥＲ２の膜貫通ドメインに近く、ＨＥＲ２のドメインＩＶ内にある。４Ｄ５エピトープに結合する抗体のスクリーニングを行うには、ルーチンの交差ブロッキングアッセイ（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｅｄ Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｄａｖｉｄ Ｌａｎｅ（１９８８）に記載されているものなど）を実施してもよい。あるいは、エピトープマッピングを実施して、抗体がＨＥＲ２の４Ｄ５エピトープ（例えば、約５２９残基〜約６２５残基の範囲内で任意の１つ以上の残基）に結合するかを評価することができる（米国特許公報第２００６／００１８８９９号図１を参照されたい）。
「エピトープ７Ｃ２／Ｆ３」は、７Ｃ２及び／または７Ｆ３抗体（それぞれ、ＡＴＣＣに寄託。下記参照）が結合するＨＥＲ２の細胞外ドメインのドメインＩ内のＮ末端領域である。７Ｃ２／７Ｆ３エピトープに結合する抗体のスクリーニングを行うには、ルーチンの交差ブロッキングアッセイ（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｅｄ Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｄａｖｉｄ Ｌａｎｅ（１９８８）に記載されているものなど）を実施してもよい。あるいは、エピトープマッピングを実施して、抗体がＨＥＲ２の７Ｃ２／７Ｆ３エピトープ（例えば、ＨＥＲ２の約２２残基〜約５３残基の範囲内で任意の１つ以上の残基）に結合するかを証明することができる（米国特許公報第２００６／００１８８９９号図１を参照されたい）。
「エピトープＣ６．５」は、抗体Ｃ６．５が結合するＨＥＲ２の細胞外ドメインのドメインＩ内の領域である（Ｓｃｈｉｅｒ Ｒ．ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｈｕｍａｎ ａｎｔｉ−ｃ−ｅｒｂＢ−２ ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ Ｆｖ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ａ ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ ｐｈａｇｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｌｉｂｒａｒｙ．Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １，７３）。
「特異的に結合する」、「特異的結合」または「選択的結合」は、抗原にとって結合が選択的であり、不必要なまたは非特異的な相互作用とは区別され得ることを意味する。抗原結合部分が特定の抗原決定基に結合する能力は、酵素−結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）または当業者に既知の他の技術、例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術（ＢＩＡｃｏｒｅ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔにて解析）（Ｌｉｌｊｅｂｌａｄ ｅｔ ａｌ， Ｇｌｙｃｏ Ｊ １７，３２３〜３２９（２０００））及び従来の結合アッセイ（Ｈｅｅｌｅｙ，Ｅｎｄｏｃｒ Ｒｅｓ ２８，２１７〜２２９ （２００２））を介して測定され得る。一実施形態では、非関連タンパク質への抗原結合部分の結合長さは、例えば、ＳＰＲで測定されたとおり、抗原への抗原結合部分の結合の約１０％未満である。ある実施形態では、抗原に結合する抗原結合部分、またはその抗原結合部分を含む抗原結合分子は、解離定数（ＫＤ）１μＭ未満、１００ｎＭ未満、１０ｎＭ未満、１ｎＭ未満、０．１ｎＭ未満、０．０１ｎＭ未満、または０．００１ｎＭ未満（例えば、１０〜８Ｍ以下、例えば、１０〜８Ｍ〜１０"１３Ｍ、例えば、１０"９Ｍ〜１０"１３Ｍ）を有する。
Ｆｃ
本明細書に記載の方法で使用される抗原結合コンストラクトとしては、Ｆｃ、例えば二量体Ｆｃが挙げられる。
用語「Ｆｃ」は、少なくとも一部分の定常領域を含有する免疫グロブリン重鎖のＣ端末領域であり、次に詳細に記載する。この用語には、天然配列Ｆｃ領域及び変異型Ｆｃ領域が挙げられる。本明細書で特に指示がない限り、Ｆｃ領域または定常領域でのアミノ酸残基は、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ， Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ， ５ｔｈ Ｅｄ． Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ， Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ， １９９１にて記載されているように、ＥＵナンバリングシステム（ＥＵインデックスとも称される）により付番される。本明細書で使用するとき、二量体Ｆｃの「Ｆｃポリペプチド」は、二量体Ｆｃドメイン（すなわち、免疫グロブリン重鎖のＣ末端定常領域を含むポリペプチド）を形成する２つのポリペプチドのうちの１つを意味し、安定的自己組織化が可能である。例えば、二量体のＩｇＧ ＦｃのＦｃポリペプチドは、ＩｇＧ ＣＨ２及びＩｇＧ ＣＨ３定常ドメイン配列を含む。
「二量体」または「ヘテロ二量体」は、少なくとも、第１のモノマーポリペプチド及び第２のモノマーポリペプチドを含む分子である。ヘテロ二量体の場合、該モノマーのうちの１つは、他のモノマーとは少なくとも１つのアミノ酸残基が異なる。ある実施形態では、二量体の組織化は、表面積の埋設により行われる。いくつかの実施形態では、単量体ポリペプチドは、所望の二量体の好ましい形成及び／または他の所望外の試験体の好ましくない形成により二量体の形成を駆動する静電相互作用及び／または塩橋相互作用により互いに相互作用する。いくつかの実施形態では、モノマーポリペプチドは、所望の二量体の好ましい形成及び／または他の自己組織型の好ましくない形成により二量体の形成を駆動する疎水性相互作用により互いに相互作用する。ある実施形態では、モノマーポリペプチドは、共有結合形成により互いに相互作用する。ある実施形態では、所望の二量体形成を駆動する天然に存在するシステインまたは取り込まれたシステインに共有結合が形成される。本明細書に記載のある実施形態では、モノマー間にいずれの共有結合も形成されていない。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、所望の二量体の好ましい形成、及び／または他の所望外の実施形態の好ましくない形成により二量体の形成を駆動するｐａｃｋｉｎｇ（パッキング）／サイズ−相補性／ｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓ／ｐｒｏｔｒｕｂｅｒａｎｃｅ−ｃａｖｉｔｙ ｔｙｐｅ相互作用により、互いに相互作用する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、二量体の形成を駆動するカチオンπ相互作用により互いに相互作用する。ある実施形態では、個々のモノマーポリペプチドは、溶液中に単離モノマーとして存在することはできない。
Ｆｃドメインは、ＣＨ３ドメインまたはＣＨ３及びＣＨ２ドメインのいずれかを含む。ＣＨ３ドメインは、２つのＣＨ３配列を含み、二量体Ｆｃの２つのＦｃポリペプチドのそれぞれの由来のものである。ＣＨ２ドメインは、２つのＣＨ２配列を含み、二量体Ｆｃの２つのＦｃポリペプチドのそれぞれの由来のものである。
いくつかの態様では、Ｆｃは、少なくとも１つのまたは２つのＣＨ３配列を含む。いくつかの態様では、Ｆｃは、１つ以上のリンカーの有無に関係なく、第１の抗原結合コンストラクト及び／または第２の抗原結合コンストラクトに連結する。いくつかの態様では、ＦｃはヒトＦｃである。いくつかの態様では、ＦｃはヒトＩｇＧまたはＩｇＧ１ Ｆｃである。いくつかの態様では、Ｆｃはヘテロ二量体Ｆｃである。いくつかの態様では、Ｆｃは少なくとも１つまたは２つのＣＨ２配列を含む。
いくつかの態様では、Ｆｃは、ＣＨ３配列の少なくとも１つに１つ以上の修飾を含む。いくつかの態様では、Ｆｃは、ＣＨ２配列の少なくとも１つに１つ以上の修飾を含む。いくつかの態様では、Ｆｃは１つのポリペプチドである。いくつかの態様では、Ｆｃは複数のペプチド、例えば２つのポリペプチドである。
いくつかの態様では、Ｆｃは２０１１年１１月４日出願の特許出願ＰＣＴ／ＣＡ２０１１／００１２３８または２０１２年１１月２日出願のＰＣＴ／ＣＡ２０１２／０５０７８０に記載されているＦｃであり、そのそれぞれの全体開示が、本出願において参照によって本明細書に援用される。
修飾ＣＨ３ドメイン
いくつかの態様では、本明細書に記載の抗原結合コンストラクトは、非対称に修飾された修飾ＣＨ３ドメインを含むヘテロ二量体Ｆｃを含む。ヘテロ二量体Ｆｃは、第１のＦｃポリペプチド及び第２のＦｃポリペプチドの２つの重鎖定常ドメインポリペプチドを含むことができる。Ｆｃが１つの第１のＦｃポリペプチド及び１つの第２のＦｃポリペプチドを含む場合には、これらは同義的に使用可能である。概して、第１のＦｃポリペプチドは第１のＣＨ３配列を含み、第２のＦｃポリペプチドは、第２のＣＨ３配列を含む。
非対称形式で取り込まれた１つ以上のアミノ酸の修飾を含む２つのＣＨ３配列は、２つのＣＨ３配列が二量化するとき、概して、ホモ二量体ではなく、ヘテロ二量体Ｆｃとなる。本明細書で使用するとき、「非対称のアミノ酸修飾」とは、第１のＣＨ３配列の特定の位置でのアミノ酸は、第２のＣＨ３配列の同一位置でのアミノ酸とは異なり、第１及び第２のＣＨ３配列は優先的に対となり、ホモ二量体ではなく、ヘテロ二量体を形成する任意の修飾を意味する。このヘテロ二量体化は、各配列において対応するアミノ酸の同じ位置の２つのアミノ酸のうちの１つのみ修飾した結果であるか、または第１及び第２のＣＨ３配列のそれぞれの対応する同じ位置での各配列の双方のアミノ酸の修飾であってもよい。ヘテロ二量体Ｆｃの第１及び第２のＣＨ３配列は、１つ以上の非対称のアミノ酸修飾を含むことができる。
表Ａは、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ配列のアミノ酸配列を示し、これは、全長ヒトＩｇＧ１重鎖のアミノ酸２３１〜４４７に相当する。ＣＨ３配列は、全長ヒトＩｇＧ１重鎖のアミノ酸３４１〜４４７を含む。
典型的には、Ｆｃは、二量化が可能な２つの連続重鎖配列（Ａ及びＢ）を含むことができる。いくつかの態様では、Ｆｃの片方または両方の配列は、次の場所で１つ以上の突然変異または修飾を含む：Ｌ３５１、Ｆ４０５、Ｙ４０７、Ｔ３６６、Ｋ３９２、Ｔ３９４、Ｔ３５０、Ｓ４００及び／またはＮ３９０（ＥＵ番号を使用）。いくつかの態様では、Ｆｃとしては、表Ｘに示す変異配列が挙げられる。いくつかの態様では、Ｆｃとしては、変異型１Ａ〜Ｂの変異が挙げられる。いくつかの態様では、Ｆｃとしては、変異型２Ａ〜Ｂの変異が挙げられる。いくつかの態様では、Ｆｃとしては、変異型３Ａ〜Ｂの変異が挙げられる。いくつかの態様では、Ｆｃとしては、変異型４Ａ〜Ｂの変異が挙げられる。いくつかの態様では、Ｆｃとしては、変異型５Ａ〜Ｂの変異が挙げられる。
（表Ａ）ＩｇＧ１ Ｆｃ配列
Figure 2017504564
第１及び第２のＣＨ３配列は、全長ヒトＩｇＧ１重鎖のアミノ酸２３１〜４４７に関して、本明細書に記載されるように、アミノ酸変異を含んでもよい。一実施形態では、ヘテロ二量体Ｆｃは、Ｆ４０５及びＹ４０７位にアミノ酸修飾を有する第一のＣＨ３配列及びＴ３９４位にアミノ酸修飾を有する第２のＣＨ３配列を有する修飾ＣＨ３ドメインを含む。一実施形態では、ヘテロ二量体Ｆｃは、Ｌ３５１Ｙ、Ｆ４０５Ａ及びＹ４０７Ｖから選択される１つ以上のアミノ酸修飾を有する第１のＣＨ３配列及びＴ３６６Ｌ、Ｔ３６６Ｉ、Ｋ３９２Ｌ、Ｋ３９２Ｍ及びＴ３９４Ｗから選択される１つ以上のアミノ酸修飾を有する第２のＣＨ３配列を有する修飾ＣＨ３ドメインを含む。
一実施形態では、ヘテロ二量体Ｆｃは、Ｌ３５１、Ｆ４０５及びＹ４０７位にアミノ酸修飾を有する第１のＣＨ３配列及びＴ３６６、Ｋ３９２、及びＴ３９４位でのアミノ酸修飾を有する第２のＣＨ３配列を有する修飾ＣＨ３ドメインを含み、第１または第２のＣＨ３配列の片方はＱ３４７位にアミノ酸修飾を更に含み、他方のＣＨ３配列は、Ｋ３６０位にアミノ酸修飾を更に含む。別の実施形態では、ヘテロ二量体Ｆｃは、Ｌ３５１、Ｆ４０５及びＹ４０７位にアミノ酸修飾を有する第１のＣＨ３配列及びＴ３６６、Ｋ３９２、及びＴ３９４でのアミノ酸修飾を有する第２のＣＨ３配列を有する修飾ＣＨ３ドメインを含み、第１または第２のＣＨ３配列の片方はＱ３４７位にアミノ酸修飾を更に含み、他方のＣＨ３配列は、Ｋ３６０位にアミノ酸修飾を更に含み、また該ＣＨ３配列の片方または両方は、アミノ酸修飾Ｔ３５０Ｖを更に含む。
一実施形態では、ヘテロ二量体Ｆｃは、Ｌ３５１、Ｆ４０５及びＹ４０７位にアミノ酸修飾を有する第１のＣＨ３配列及びＴ３６６、Ｋ３９２、及びＴ３９４位でのアミノ酸修飾を有する第２のＣＨ３配列を有する修飾ＣＨ３ドメインを含み、該第１または第２のＣＨ３配列の片方はＤ３９９ＲまたはＤ３９９Ｋのアミノ酸修飾を更に含み、該他方のＣＨ３配列は、Ｔ４１１Ｅ、Ｔ４１１Ｄ、Ｋ４０９Ｅ、Ｋ４０９Ｄ、Ｋ３９２Ｅ及びＫ３９２Ｄの１つ以上を含む。別の実施形態では、ヘテロ二量体Ｆｃは、Ｌ３５１、Ｆ４０５及びＹ４０７位にアミノ酸修飾を有する第１のＣＨ３配列及びＴ３６６、Ｋ３９２、及びＴ３９４位でのアミノ酸修飾を有する第２のＣＨ３配列を有する修飾ＣＨ３ドメインを含み、該第１及び第２のＣＨ３配列の片方はＤ３９９ＲまたはＤ３９９Ｋのアミノ酸修飾を更に含み、該他方のＣＨ３配列は、Ｔ４１１Ｅ、Ｔ４１１Ｄ、Ｋ４０９Ｅ、Ｋ４０９Ｄ、Ｋ３９２Ｅ及びＫ３９２Ｄの１つ以上を含み、該ＣＨ３配列の片方または両方は、アミノ酸修飾Ｔ３５０Ｖを更に含む。
一実施形態では、ヘテロ二量体Ｆｃは、Ｌ３５１、Ｆ４０５及びＹ４０７位にアミノ酸修飾を有する第１のＣＨ３配列並びにＴ３６６、Ｋ３９２、及びＴ３９４位にアミノ酸修飾を有する第２のＣＨ３配列を有する修飾ＣＨ３ドメインを含み、該ＣＨ３配列の片方または両方はＴ３５０Ｖのアミノ酸修飾を更に含む。
一実施形態では、ヘテロ二量体Ｆｃは、次のアミノ酸修飾を含む修飾ＣＨ３ドメインを含み、「Ａ」は第１のＣＨ３配列に対するアミノ酸修飾を示し、「Ｂ」は第２のＣＨ３配列に対するアミノ酸修飾を示す。Ａ：Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ、Ｂ：Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｍ＿Ｔ３９４Ｗ、Ａ：Ｌ３５１Ｙ Ｆ４０５Ａ Ｙ４０７Ｖ、Ｂ：Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｌ＿Ｔ３９４Ｗ、Ａ：Ｔ３５０Ｖ＿Ｌ３５１Ｙ Ｆ４０５Ａ Ｙ４０７Ｖ、Ｂ：Ｔ３５０Ｖ＿Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｌ＿Ｔ３９４Ｗ、Ａ：Ｔ３５０Ｖ＿Ｌ３５１Ｙ Ｆ４０５Ａ Ｙ４０７Ｖ、Ｂ：Ｔ３５０Ｖ＿Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｍ＿Ｔ３９４Ｗ、Ａ：Ｔ３５０Ｖ＿Ｌ３５１ｆＹ＿Ｓ４００Ｅ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ、及び／またはＢ：Ｔ３５０Ｖ＿Ｔ３６６Ｌ＿Ｎ３９０Ｒ＿Ｋ３９２Ｍ＿Ｔ３９４Ｗ。
１つ以上の非対称のアミノ酸の修飾により、ヘテロ二量体ＣＨ３ドメインが野生型ホモ二量体ＣＨ３ドメインに相当する安定性を有するヘテロ二量体Ｆｃの形成が促進され得る。一実施形態において、１つ以上の非対称のアミノ酸修飾により、ヘテロ二量体Ｆｃドメインが野生型ホモ二量体Ｆｃドメインに相当する安定性を有するヘテロ二量体Ｆｃドメインの形成が促進される。一実施形態において、１つ以上の非対称のアミノ酸の修飾により、ヘテロ二量体Ｆｃドメインが、示差走査熱量測定試験において、融解温度（Ｔｍ）を介して観察された安定性を有し、該融解温度が、対応する対称野生型ホモ二量体Ｆｃドメインで観察された融解温度の４℃以内であるヘテロ二量体Ｆｃドメインの形成が促進される。いくつかの態様では、Ｆｃは、野生型ホモ二量体Ｆｃに相当する安定性を有するヘテロ二量体Ｆｃの形成を促進する少なくとも１つのＣＨ３配列において１つ以上の修飾を含む。
一実施形態では、ＣＨ３ドメインの安定性は、例えば、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）によって、ＣＨ３ドメインの融解温度を測定することによって評価することができる。したがって、更なる実施形態では、ＣＨ３ドメインは、約６８℃以上の融解温度を有する。別の実施形態では、ＣＨ３ドメインは、約７０℃以上の融解温度を有する。別の実施形態では、ＣＨ３ドメインは、約７２℃以上の融解温度を有する。別の実施形態では、ＣＨ３ドメインは、約７３℃以上の融解温度を有する。別の実施形態では、ＣＨ３ドメインは、約７５℃以上の融解温度を有する。別の実施形態では、ＣＨ３ドメインは、約７８℃以上の融解温度を有する。いくつかの態様では、二量体化ＣＨ３配列は、融解温度（Ｔｍ）約６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７７．５、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、または８５℃以上を有する。
いくつかの実施形態では、修飾ＣＨ３配列を含むヘテロ二量体Ｆｃは、発現生成物内のホモ二量体Ｆｃと比較して、少なくとも約７５％の純度で形成することができる。別の実施形態では、ヘテロ二量体Ｆｃは、約８０％超の純度で形成される。別の実施形態では、ヘテロ二量体Ｆｃは、約８５％超の純度で形成される。別の実施形態では、ヘテロ二量体Ｆｃは、約９０％超の純度で形成される。別の実施形態では、ヘテロ二量体Ｆｃは、約９５％超の純度で形成される。別の実施形態では、ヘテロ二量体Ｆｃは、約９７％超の純度で形成される。いくつかの態様では、Ｆｃは、発現するとき、約７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％超の純度で形成されるヘテロ二量体である。いくつかの態様では、Ｆｃは、単一細胞を介して発現するとき、約７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％超の純度で形成されるヘテロ二量体である。
ヘテロ二量体Ｆｃ形成を促進するためのモノマーＦｃポリペプチドの追加の修飾方法は、以下に記述されている；ＰＣＴ国際公開特許ＷＯ９６／０２７０１１（ｋｎｏｂｓ ｉｎｔｏ ｈｏｌｅｓ）、Ｇｕｎａｓｅｋａｒａｎ ｅｔ ａｌ． （Ｇｕｎａｓｅｋａｒａｎ Ｋ． ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２８５，１９６３７〜４６， ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃ ｄｅｓｉｇｎ ｔｏ ａｃｈｉｅｖｅ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）、Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．（Ｄａｖｉｓ， ＪＨ． ｅｔ ａｌ． （２０１０） Ｐｒｏｔ Ｅｎｇ Ｄｅｓ Ｓｅｌ ；２３（４）： １９５−２０２， ｓｔｒａｎｄ ｅｘｃｈａｎｇｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｄｏｍａｉｎ（ＳＥＥＤ） ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、及びＬａｂｒｉｊｎ ｅｔ ａｌ ［Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｔａｂｌｅ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ＩｇＧ１ ｂｙ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｆａｂ−ａｒｍ ｅｘｃｈａｎｇｅ．Ｌａｂｒｉｊｎ ＡＦ， Ｍｅｅｓｔｅｒｓ ＪＩ， ｄｅ Ｇｏｅｉｊ ＢＥ， ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｒｅｍｅｒ ＥＴ， Ｎｅｉｊｓｓｅｎ Ｊ， ｖａｎ Ｋａｍｐｅｎ ＭＤ， Ｓｔｒｕｍａｎｅ Ｋ， Ｖｅｒｐｌｏｅｇｅｎ Ｓ， Ｋｕｎｄｕ Ａ， Ｇｒａｍｅｒ ＭＪ， ｖａｎ Ｂｅｒｋｅｌ ＰＨ， ｖａｎ ｄｅ Ｗｉｎｋｅｌ ＪＧ， Ｓｃｈｕｕｒｍａｎ Ｊ， Ｐａｒｒｅｎ ＰＷ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ． ２０１３ Ｍａｒ ２６；１１０（１３）：５１４５〜５０。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の単離した抗原結合コンストラクトは、抗原を結合する抗原結合ポリペプチドコンストラクト及び安定性など、優れた生物物理学的性質を有する二量体Ｆｃを含み、かつ同一の二量体Ｆｃを含まない抗原結合コンストラクトと比較して、製造が簡易である。Ｆｃ領域におけるいくつかのアミノ酸の修飾は、異なるＦｃガンマ受容体のＦｃのアフィニティを選択的に変更するために、当技術分野において既知である。いくつかの態様では、Ｆｃ−ガンマ受容体の選択的結合を促進するために、Ｆｃは１つ以上の修飾を含む。これらのアミノ酸修飾の型は、典型的には、ＣＨ２ドメイン内または抗原結合コンストラクト内のヒンジ領域に配置される。
ＣＨ２ドメイン
ＦｃのＣＨ２ドメインは、表ａに示す配列のアミノ酸２３１〜３４０である。代表的突然変異は以下に記載される：
●Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａ， Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａ／Ｋ３２６Ａ（Ｌｕ Ｙ， Ｖｅｒｎｅｓ ＪＭ， Ｃｈｉａｎｇ Ｎ，ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ． ２０１１ Ｆｅｂ ２８；３６５（１−２）： １３２−４１）；
●Ｆ２４３Ｌ／Ｒ２９２Ｐ／Ｙ３００Ｌ／Ｖ３０５Ｉ／Ｐ３９６Ｌ， Ｆ２４３Ｌ／Ｒ２９２Ｐ／Ｙ３００Ｌ／Ｌ２３５Ｖ／Ｐ３９６Ｌ （Ｓｔａｖｅｎｈａｇｅｎ ＪＢ， Ｇｏｒｌａｔｏｖ Ｓ， Ｔｕａｉｌｌｏｎ Ｎ， ｅｔ ａｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ２００７ Ｓｅｐ １５；６７（１８）：８８８２−９０； Ｎｏｒｄｓｔｒｏｍ ＪＬ， Ｇｏｒｌａｔｏｖ Ｓ， Ｚｈａｎｇ Ｗ， ｅｔ ａｌ． Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ２０１１ Ｎｏｖ ３０；１３（６）：Ｒ１２３）；
●Ｆ２４３Ｌ（Ｓｔｅｗａｒｔ Ｒ， Ｔｈｏｍ Ｇ， Ｌｅｖｅｎｓ Ｍ， ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ Ｄｅｓ Ｓｅｌ． ２０１１ Ｓｅｐ；２４（９）：６７１〜８．）， Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａ （Ｓｈｉｅｌｄｓ ＲＬ， Ｎａｍｅｎｕｋ ＡＫ， Ｈｏｎｇ Ｋ， ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ． ２００１ Ｍａｒ ２；２７６（９）：６５９１−６０４）；
●Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ／Ａ３３０Ｌ， Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ （Ｌａｚａｒ ＧＡ， Ｄａｎｇ Ｗ， Ｋａｒｋｉ Ｓ， ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ． ２００６ Ｍａｒ １４；１０３（１１）：４００５〜１０）；
●Ｓ２３９Ｄ／Ｓ２６７Ｅ， Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ （Ｃｈｕ ＳＹ， Ｖｏｓｔｉａｒ Ｉ， Ｋａｒｋｉ Ｓ， ｅｔ ａｌ． Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２００８ Ｓｅｐ；４５（１５）：３９２６〜３３）；
●Ｓ２３９Ｄ／Ｄ２６５Ｓ／Ｓ２９８Ａ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｅ／Ｓ２９８Ａ／Ｋ３２６Ａ／Ａ３２７Ｈ、Ｇ２３７Ｆ／Ｓ２９８Ａ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ／Ｓ２９８Ａ、Ｓ２３９Ｄ／Ｋ３２６Ｅ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅ／Ｓ２９８Ａ、Ｇ２３６Ａ／Ｓ２３９Ｄ／Ｄ２ ７０Ｌ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｅ／Ｓ２６７Ｅ／Ｈ２６８Ｄ、Ｌ２３４Ｆ／Ｓ２６７Ｅ／Ｎ３２５Ｌ、Ｇ２３７Ｆ／Ｖ２６６Ｌ／Ｓ２６７Ｄ並びに本明細書に参照として援用されるＷＯ２０１１／１２０１３４及びＷＯ２０１１／１２０１３５に列挙されている他の突然変異。Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ （ｂｙ Ｗｉｌｌｉａｍ Ｒ． Ｓｔｒｏｈｌ ａｎｄ Ｌｉｌａ Ｍ． Ｓｔｒｏｈｌ， Ｗｏｏｄｈｅａｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ｓｅｒｉｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｎｏ １１， ＩＳＢＮ １ ９０７５６８ ３７ ９， Ｏｃｔ ２０１２）では、２８３頁に突然変異が列挙されている。
いくつかの実施形態では、ＣＨ２ドメインは、１つ以上の非対称アミノ酸の修飾を含む。いくつかの実施形態では、ＣＨ２ドメインは、ＦｃＲの選択的結合を促進するために、１つ以上の非対称アミノ酸の修飾を含む。いくつかの実施形態では、ＣＨ２ドメインにより、本明細書に記載の単離コンストラクトの分離及び精製が可能になる。
エフェクター機能の向上のための更なる修飾
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗原結合コンストラクトを修飾して、そのエフェクター機能を向上し得る。このような修飾は、当技術分野において既知であり、低フコシル化、または活性化受容体（主にＡＤＣＣ用のＦＣＧＲ３ａ及びＣＤＣ用のＣ１ｑ）に対するＦｃアフィニティの修飾操作が挙げられる。次表Ｂは、エフェクター機能工学に関する文献で報告されているさまざまな設計についてまとめている。
したがって、一実施形態では、本明細書に記載のコンストラクトとしては、表Ｂに記載のように、改善されたエフェクター機能を付与する１つ以上のアミノ酸の修飾を含む二量体Ｆｃを挙げることができる。別の実施形態では、コンストラクトを低フルコシ化することで、エフェクター機能を改善することができる。
（表Ｂ）ＣＨ２ドメイン及びエフェクター機能工学
Figure 2017504564
ＦｃγＲ及び／または補体結合及び／またはエフェクター機能が低下するＦｃ修飾が当技術分野において既知である。近年の公報では、低下またはサイレンス化されたエフェクター活性を有する抗体の操作に使用されてきた戦略が記述されている（Ｓｔｒｏｈｌ，ＷＲ（２００９），Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ ２０：６８５〜６９１及びＳｔｒｏｈｌ， ＷＲ ａｎｄ Ｓｔｒｏｈｌ ＬＭ，"Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｆｃ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｆｏｒ ｏｐｔｉｍａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ" Ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ：Ｗｏｏｄｈｅａｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ（２０１２），ｐｐ２２５〜２４９を参照されたい）。これらの戦略としては、Ｆｃのヒンジ領域またはＣＨ２領域における、グリコシル化の修飾、ＩｇＧ２/ＩｇＧ４スカフォールドの使用、または突然変異の導入を介するエフェクター機能の低下が挙げられる。例えば、米国特許公報第２０１１／０２１２０８７号（Ｓｔｒｏｈｌ）、国際公開特許第ＷＯ２００６／１０５３３８号（Ｘｅｎｃｏｒ）、米国特許公報第２０１２／０２２５０５８号（Ｘｅｎｃｏｒ）、米国特許公報第２０１２／０２５１５３１号（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）及びＳｔｒｏｐ ｅｔ ａｌ（（２０１２） Ｊ． Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４２０：２０４〜２１９）では、Ｆｃに結合するＦｃγＲまたは補体を減少するための特定の修飾について記述している。
公知のアミノ酸修飾の特定の非限定的実施例としては、以下の表に示すものが挙げられる：
（表Ｃ）Ｆｃに結合するＦｃγＲまたは補体を減少するための修飾
Figure 2017504564
一実施形態では、Ｆｃは、上記表に示される少なくとも１つのアミノ酸修飾を含む。別の実施形態では、Ｆｃは、Ｌ２３４、Ｌ２３５、またはＤ２６５の少なくとも１つのアミノ酸修飾を含む。別の実施形態では、Ｆｃは、Ｌ２３４、Ｌ２３５、及びＤ２６５のアミノ酸修飾を含む。別の実施形態では、Ｆｃは、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＤ２６５Ｓのアミノ酸修飾を含む。
ＦｃＲｎ結合及びＰＫパラメータ
当該技術分野で公知なように、ＦｃＲｎへの結合により、エンドソームから血流に戻る形質膜陥入抗体を再利用する（Ｒａｇｈａｖａｎ ｅｔ ａｌ，１９９６，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ １２：１８１〜２２０； Ｇｈｅｔｉｅ ｅｔ ａｌ， ２０００，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ １８：７３９〜７６６）。この工程では、全長分子が大きいために腎臓ろ過の防止と一体となり、１週から３週の範囲である好ましい抗体血清半減期となる。ＦｃとＦｃＲｎとの結合も、抗体輸送において重要な役割を担っている。したがって、一実施形態では、本明細書に記載の抗原結合コンストラクトは、ＦｃＲｎに結合し得る。
リンカー
本明細書に記載の抗原結合コンストラクトとしては、本明細書に記載のＦｃに操作可能に連結される１つ以上の抗原結合ポリペプチドコンストラクトを挙げることができる。いくつかの態様では、Ｆｃは１つ以上のリンカーにより１つ以上の抗原結合ポリペプチドコンストラクトと連結される。いくつかの態様では、Ｆｃは１つ以上の抗原結合ポリペプチドコンストラクトと直接連結される。いくつかの態様では、Ｆｃはリンカーにより各抗原結合ポリペプチドの重鎖に連結される。
いくつかの態様では、１つ以上のリンカーは、１つ以上のポリペプチドリンカーである。いくつかの態様では、１つ以上のリンカーは、１つ以上のＩｇＧ１ヒンジ領域を含む。
抗原結合コンストラクトの選択
本明細書に記載の方法で使用される抗原結合コンストラクトは、当業者に既知の任意の数の分析法を使用して用いるために、選択され得る。
アフィニティ成熟
その同種抗原に関して抗原結合ポリペプチドコンストラクトのアフィニティを増大することが望ましい場合、当該技術分野に公知の方法を使用して、その抗原の抗原結合ポリペプチドコンストラクトのアフィニティを増大させることができる。このような方法の例は、次の文献に記述されている；Ｂｉｒｔａｌａｎ ｅｔ ａｌ．（２００８）ＪＭＢ ３７７，１５１８〜１５２８；Ｇｅｒｓｔｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００２） ＪＭＢ ３２１，８５１〜８６２；Ｋｅｌｌｅｙ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｂｉｏｃｈｅｍ３２（２７），６８２８〜６８３５；Ｌｉ ｅｔ ａｌ．（２０１０）ＪＢＣ ２８５（６），３８６５〜３８７１及びＶａｊｄｏｓ ｅｔ ａｌ．（２００２）ＪＭＢ３２０，４１５〜４２８。
こうした方法の一例としては、アフィニティ成熟である。１つの例示的なＨＥＲ２抗原結合ドメインのアフィニティ成熟方法を次に示す。トラスツズマブ／ＨＥＲ２（ＰＤＢコード１Ｎ８Ｚ）錯体コンストラクト及びペルツズマブ／ＨＥＲ２錯体コンストラクト（ＰＤＢコード１Ｓ７８）をモデリング化に使用する。分子動態（ＭＤ）を用いて、水性環境でのＷＴ錯体の内因性動的性質を評価することができる。可撓性主鎖と共に平均場法及びｄｅａｄ−ｅｎｄ ｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎ法を用いて、スクリーニング対象の変異モデルコンストラクトを最適化し、作製することができる。挿入後、接触密度、衝突スコア、疎水性及び静電など、いくつかの特性に評点をつける。一般化ボルン法により、溶媒環境の効果の正確なモデリングが可能になり、タンパク質中の特定の位置での交互の残基の型に対する変異後の自由エネルギー差を算出することができる。接触密度及び衝突スコアから、相補性の尺度、効果的なタンパク質挿入の重大な態様がもたらされる。スクリーニング手順では、知識に基づいた潜在性並びに対残基相互作用エネルギー及びエントロピー計算に依存する結合解析スキームを用いる。ＨＥＲ２の結合を強化することが公知の文献に記述されている変異は、次の表にまとめる。
（表Ａ４）トラスツズマブ−ＨＥＲ２系のＨＥＲ２への結合の増大が公知のトラスツズマブ変異
Figure 2017504564
（表Ａ５）ペルツズマブ−ＨＥＲ２系のＨＥＲ２への結合の増大が公知のペルツズマブ変異
Figure 2017504564
好適な一価抗原結合コンストラクトは、以下の性質を有する。ｉ）飽和抗体濃度でのＨＥＲ２＋癌細胞への最大結合（Ｂｍａｘ）の上昇、ｉｉ）ＨＥＲ２＋癌細胞に内部移行する能力；ｉｉｉ）ＨＥＲ２＋癌細胞の細胞障害をもたらすエフェクター細胞機能を媒介する能力、及び／またはＨＥＲ２＋癌細胞の増殖を阻害する能力。
本明細書に記載の一価抗原結合コンストラクトは、一旦、標的細胞に結合すると、内部移行する。一実施形態では、一価抗原結合コンストラクトは、対応する単一特異性二価抗原結合コンストラクトと比較して、同じ程度になるように内部移行している。いくつかの実施形態では、一価抗原結合コンストラクトは、対応する単一特異性二価抗原結合コンストラクトと比較して、より効率よく内部移行している。
標的細胞
標的細胞は、一価抗原結合コンストラクトの用途に基づいて選択される。一実施形態では、標的細胞は、癌、感染症、自己免疫疾患または炎症性疾患内で活性化されたまたは増幅された細胞である。
一実施形態では、一価抗原結合コンストラクトは、癌治療に使用することを目的とし、標的細胞は、例えば、ＳＫＢＲ３及びＢＴ４７４など、ＥＧＦＲ及び／またはＨＥＲ２の３＋過剰発現を示す腫瘍から誘導される。一実施形態では、標的細胞は、例えば、ＭＣＦ７など、ＥＧＦＲ及び／またはＨＥＲ２の発現が少ない腫瘍から誘導される。一実施形態では、標的細胞は、例えば、ＪＩＭＴ１など、ＥＧＦＲ及び／またはＨＥＲ２耐性を示す腫瘍から誘導される。一実施形態では、標的細胞は、トリプルネガティブ（ＥＲ／ＰＲ／ＨＥＲ２）腫瘍である腫瘍から誘導される。
一価抗原結合コンストラクトを癌治療に使用することを目的としている一実施形態では、標的細胞は、例示的なＥＧＦＲ及び／またはＨＥＲ２の３＋過剰発現である癌細胞株である。一実施形態では、標的細胞は、代表的なＥＧＦＲ及び／またはＨＥＲ２の発現が少ない癌細胞株である。一実施形態では、標的細胞は、代表的なＥＧＦＲ及び／またはＨＥＲ２耐性である癌細胞株である。一実施形態では、標的細胞は、代表的な乳癌トリプルネガティブ細胞（例えば、ＭＤＡ−ＭＤ−２３１細胞）である癌細胞株である。
一実施形態では、本明細書に記載の一価抗原結合コンストラクトは、乳癌細胞または上皮細胞由来癌細胞を標的とするように設計されている。例としては、以下に限定されないが、プロゲステロン受容体（ＰＲ）陰性細胞及びエストロゲン受容体（ＥＲ）陰性細胞、低ＨＥＲ２発現細胞、中程度のＨＥＲ２発現細胞、高ＨＥＲ２発現細胞、抗ＨＥＲ２抗体耐性細胞または上皮細胞由来癌細胞が挙げられる。
一実施形態では、本明細書に記載の一価抗原結合コンストラクトは、胃及び食道腺癌を標的とするように設計されている。例示的病理組織学的タイプとしては、腸型表現型を有するＨＥＲ２陽性近位胃癌、及びＨＥＲ２陽性遠位びまん性胃癌が挙げられる。胃癌細胞の例示的分類としては、これらに限定されないが、（Ｎ−８７、ＯＥ−１９、ＳＮＵ−２１６及びＭＫＮ−７）が挙げられる。
他の実施形態では、本明細書に記載の一価抗原結合コンストラクトは、脳内の転移性ＨＥＲ２＋乳癌を標的とするように設計されている。胃癌細胞の例示的分類としては、これらに限定されないが、ＢＴ４７４が挙げられる。
一価抗体コンストラクトがＨＥＲ２に結合する抗原結合ポリペプチドコンストラクトを含む実施形態では、抗原結合ポリペプチドコンストラクトは、ＨＥＲ２若しくはＨＥＲ２の特定のドメインまたはエピトープに結合する。一実施形態では、抗原結合ポリペプチドコンストラクトは、ＨＥＲ２の細胞外ドメインに結合する。当該技術分野で周知であるとおり、ＨＥＲ２抗原は、複数の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を含む。
一実施形態では、ＥＣＤ１、ＥＣＤ２、ＥＣＤ３及びＥＣＤ４から選択されるＨＥＲ２のＥＣＤに結合する抗原結合ポリペプチドコンストラクトを含む本明細書に記載の一価抗体コンストラクトである。別の実施形態では、一価抗体コンストラクトは、ＥＣＤ１、ＥＣＤ２及びＥＣＤ４から選択されるＨＥＲ２のＥＣＤに結合する抗原結合ポリペプチドコンストラクトを含む。一実施形態では、一価抗体コンストラクトは、ＥＣＤ１に結合する抗原結合ポリペプチドコンストラクトを含む。一実施形態では、一価抗体コンストラクトは、ＥＣＤ２に結合する抗原結合ポリペプチドコンストラクトを含む。一実施形態では、一価抗体コンストラクトは、ＥＣＤ４に結合する抗原結合ポリペプチドコンストラクトを含む。別の実施形態では、一価抗体コンストラクトは、２Ｃ４、４Ｄ５及びＣ６．５から選択されるＨＥＲ２のエピトープに結合する抗原結合ポリペプチドコンストラクトを含む。
解離定数（ＫＤ）及び最大結合（Ｂｍａｘ）
いくつかの実施形態では、これらに限定されないが、解離定数及び最大結合などの機能的特性により抗原結合コンストラクトについて記載する。
本明細書で使用するとき、用語「解離定数（ＫＤ）」は、特定のリガンド−タンパク質相互作用の平衡解離定数と称することを意図する。本明細書で使用するとき、リガンド−タンパク質相互作用とは、これらに限定されないが、タンパク質−タンパク質相互作用または抗体−抗原相互作用を意味する。ＫＤでは、２つのタンパク質（例えば、ＡＢ）の性質）を測定し、可逆的により小さい要素（Ａ＋Ｂ）に解離させ、解離速度（「ｏｆｆ−ｒａｔｅ（ｋｏｆｆ）」とも称される）対会合速度（「ｏｎ−ｒａｔｅ （ｋｏｎ）」）の比率として定義される。したがって、ＫＤは、ｋｏｆｆ／ｋｏｎと等しく、モル濃度（Ｍ）として表現されている。ＫＤがより小さい場合には、結合アフィニティがより強いという結果となる。このため、ＫＤ１ｍＭは、ＫＤ１ｎＭと比較して、弱い結合アフィニティを示す。抗原結合コンストラクトのＫＤ値は、当該技術分野において確立されている方法を用いて求めることができる。抗原結合コンストラクトのＫＤを求める一方法は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、典型的には、例えばＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）システムなどの生体内感知装置を用いることによる。等温滴定熱量測定（ＩＴＣ）は、値を求める際に使用可能である別の方法である。
抗原結合コンストラクトの結合特性は、さまざまな技術によって決定することができる。そのうちの１つは、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ，Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇ）により、抗原を発現している標的細胞への結合を測定することである。典型的には、このような実験では、目的とする抗原を発現している標的細胞を抗原結合コンストラクトと共に異なる濃度でインキュベートし、洗浄し、抗原結合コンストラクトを検出するために第２の剤でインキュベートし、洗浄し、フローサイトメトリー装置で分析し、細胞での検出シグナルの強度を表す中央蛍光強度（ＭＦＩ）を測定し、これは、細胞に結合される抗原結合コンストラクトの数に関係する。その後、抗原結合コンストラクト濃度対ＭＦＩデータを、飽和結合方程式にフィッティングし、２つの重要な結合パラメータ、Ｂｍａｘ及びみかけのＫＤを求める。
みかけのＫＤまたはみかけの平衡解離定数は、細胞の最大半減結合が観察される抗原結合コンストラクトの濃度を示す。明かであるように、ＫＤ値が小さいほど、最大の細胞結合に到達するのにより低い抗原結合コンストラクト濃度が必要とされ、このため、抗原結合コンストラクトのアフィニティがより高い。みかけのＫＤは、細胞に発現する異なる受容体レベルなど、細胞結合実験条件及びインキュベーション条件に依存し、このため、みかけのＫＤは、概して、ＳＰＲ及びＩＴＣなどの無細胞分子実験から求めるＫＤ値とは異なる。しかし、概して、異なる方法間でも上手く一致している。
用語「Ｂｍａｘ」または「最大結合」は、抗原結合コンストラクトの飽和濃度での細胞での最大抗原結合コンストラクトの結合レベルを指す。このパラメータは、相対比較用の任意の単位のＭＦＩで報告され得るか、または標準曲線を用いて、細胞に結合される抗原結合コンストラクト数に対応する絶対値に変換することができる。いくつかの実施形態では、抗原結合コンストラクトは、標準抗原結合コンストラクトのＢｍａｘの１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９または２．０倍であるＢｍａｘを示す。
本明細書に記載の抗原結合コンストラクトについては、飽和濃度であり、ＦＳＡによりＢｍａｘがこれ以上上昇することがない場合にＢｍａｘ対ＦＳＡの最も明白な分離が発生している。この有意性は、非飽和濃度より低い。一実施形態では、標準抗原結合コンストラクトと比較したときに、抗原結合コンストラクトのＢｍａｘ及びＫＤの上昇は、標的細胞での標的抗原の発現レベルに依存していない。一実施形態では、標的細胞において、一価抗原結合コンストラクトは、対応する二価抗原結合コンストラクトと比較して、Ｂｍａｘの１．１〜１．５倍の上昇を示す。一実施形態では、標的細胞において、一価抗原結合コンストラクトは、対応する二価抗原結合コンストラクトを組み合わせた場合と比較して、Ｂｍａｘの１．１〜１．５倍の上昇を示す。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の単離された抗原結合コンストラクトであり、該抗原結合コンストラクトは、対応する標準抗原結合コンストラクトと比較して、該抗原を示す標的細胞に対するＢｍａｘ（最大結合）の上昇を示す。いくつかの実施形態では、Ｂｍａｘの該上昇は、対応する標準抗原結合コンストラクトのＢｍａｘの少なくとも約１２５％である。ある実施形態では、Ｂｍａｘの上昇は、対応する標準抗原結合コンストラクトのＢｍａｘの少なくとも約１５０％である。いくつかの実施形態では、Ｂｍａｘの上昇は、対応する標準抗原結合コンストラクトのＢｍａｘの少なくとも約２００％である。いくつかの実施形態では、Ｂｍａｘの上昇は、対応する標準抗原結合コンストラクトのＢｍａｘの約１１０％超である。
有効性／生物活性
本明細書に示すように、本明細書に記載の一価抗原結合コンストラクトは、対応する単一特異性二価抗原結合コンストラクトと比較して、優れた有効性及び／または生物活性を示す。本明細書に記載の一価抗原結合コンストラクトの有効性及び／または生物活性の非限定的例は、標的細胞の増殖を阻害し、またはエフェクター細胞媒介細胞死滅を媒介する一価抗原結合コンストラクトの能力によって表わされる。一実施形態では、一価抗原結合コンストラクトの優れた有効性及び／または生物活性は、主に、単一特異性二価抗原結合コンストラクトと比較して、一価抗原結合コンストラクトのエフェクター機能の増大の結果である。
抗体「エフェクター機能」とは、抗体のＦｃドメイン（天然配列Ｆｃドメインまたはアミノ酸配列変異型Ｆｃドメイン）に起因するこれらの生物学的活性を意味する。抗体エフェクター機能の例としては、抗体依存性細胞貪食活性（ＡＤＣＰ）、Ｃ１ｑ結合；補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）；Ｆｃ受容体結合；抗体依存性細胞介在細胞障害（ＡＤＣＣ）；貪食活性；細胞表面受容体のダウンレギュレーション（例えば、Ｂ細胞受容体、ＢＣＲ）などが挙げられる。
「抗体依存細胞介在細胞障害」及び「ＡＤＣＣ」は、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）を発現する非特異的細胞障害細胞（例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球及びマクロファージ）が標的細胞での結合抗体を認識し、その後、標的細胞の溶解を引き起こす細胞媒介反応を意味する。
「補体依存性細胞傷害」及び「ＣＤＣ」とは、補体の存在下における標的の溶解を意味する。補体活性化経路は、補体系（Ｃ１ｑ）の第１の構成要素と、同種抗原と錯体化させた分子（例えば、抗体）との結合により開始される。
「抗体依存性細胞貪食活性」及び「ＡＤＣＰ」は、単核細胞またはマクロファージ媒介貪食活性を介する標的細胞の破壊を意味する。
用語「Ｆｃ受容体」及び「ＦｃＲ」は、抗体のＦｃドメインに結合する受容体を説明するために使用する。例えば、ＦｃＲは、天然配列ヒトＦｃＲであってもよい。概してＦｃＲは、ＩｇＧ抗体（ガンマ受容体）と結合する受容体であり、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩサブクラスの受容体（これらの受容体の対立遺伝子変異型及び代替的スプライシング型など）が挙げられる。ＦｃγＲＩＩ受容体としては、ＦｃγＲＩＩＡ（「活性化受容体」）及びＦｃγＲＩＩＢ（「阻害受容体」）が挙げられ、それらの細胞質ドメインが主に異なる類似のアミノ酸配列を有する。他のイソタイプの免疫グロブリンも、特定のＦｃＲにより結合され得る（例えば、Ｊａｎｅｗａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｙ：ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｅ ｓｙｓｔｅｍ ｉｎ ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ ｄｉｓｅａｓｅ，（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｔｄ．，ＮＹ）（４ｔｈ ｅｄ．，１９９９）を参照されたい）。活性化受容体ＦｃγＲＩＩＡは、その細胞質ドメインに免疫受容体チロシン系活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含む。阻害受容体ＦｃγＲＩＩＢは、その細胞質ドメインに免疫受容体チロシン系阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）を含む（Ｄａeｒｏｎ， Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５：２０３−２３４ （１９９７）にて検討）。ＦｃＲは、Ｒａｖｅｔｃｈ ａｎｄ Ｋｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ ９：４５７〜９２（１９９１）；Ｃａｐｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ ４：２５〜３４（１９９４）及びｄｅ Ｈａａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ． Ｍｅｄ．１２６：３３０〜４１（１９９５）にて検討されている。他のＦｃＲは（今後同定されるものを含む）、本明細書の用語「ＦｃＲ」を包含する。また、本用語は、新生児型受容体ＦｃＲｎを更に含み、これは、母性ＩｇＧの胎児への移行に関与している（Ｇｕｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１７：５８７（１９７６）；及びＫｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：２４９（１９９４））。
本明細書では、用語「アビディティ」は、結合アフィニティと主要コンストラクトとを組み合わせた相乗的な強さ並びに治療用単一特異性二価抗体の生物学的属性を示すために使用される。アビディティがなく、相乗的結合強さがないことによって、みかけの標的結合アフィニティの低下をもたらし得る。他方では、固定数の抗原を有する標的細胞では、多価の（または二価の）結合から生じたアビディティにより、一価の結合を示す抗体に対して、更に少ない数の抗体分子で標的抗原の占有の増加が引き起こされる。二価の溶解抗体を適用するにあたって、標的細胞に結合される更に少ない数の抗体分子で、抗体依存性細胞障害死滅メカニズムは、効率良く機能しないかもしれず、有効性の低下がもたらされる。エフェクター機能のこれらの型は、概して、Ｆｃ濃度しきい値に依存すると考えられるため、不十分な抗体が結合して、ＡＤＣＣ、ＣＤＣ、ＡＤＣＰを媒介する。アゴニスト抗体の場合、アビディティの低下によりこの効率が低下し、それらの抗原が架橋し、二量化し、経路を活性化する。
ＡＤＣＣ
このため、一実施形態では、一価抗原結合コンストラクトは、対応する単一特異性二価抗原結合コンストラクトよりも、さらに高い程度のＡＤＣＣによる細胞死滅を示す。この実施形態では、一価抗原結合コンストラクトは、対応する単一特異性二価抗原結合コンストラクトを上回る約１．２〜１．８倍のＡＤＣＣ活性の上昇を示す。一実施形態では、一価抗原結合コンストラクトは、ＡＤＣＣによる細胞死滅において、対応する単一特異性二価抗原結合コンストラクトよりも、約１．３倍の上昇を示す。一実施形態では、一価抗原結合コンストラクトは、ＡＤＣＣによる細胞死滅において、対応する単一特異性二価抗原結合コンストラクトよりも、約１．４倍の上昇を示す。一実施形態では、一価抗原結合コンストラクトは、ＡＤＣＣによる細胞死滅において、対応する単一特異性二価抗原結合コンストラクトよりも、約１．５倍の上昇を示す。
一実施形態では、一価抗原結合コンストラクトは、ＥＧＦＲ及び／またはＨＥＲ２に結合する抗原結合ポリペプチドコンストラクトを含み、対応する単一特異性二価抗原結合コンストラクトを上回る約１．２〜１．６倍のＡＤＣＣ活性の上昇を示す。一実施形態では、一価抗原結合コンストラクトは、ＥＧＦＲ及び／またはＨＥＲ２に結合する抗原結合ポリペプチドコンストラクトを含み、ＡＤＣＣによる細胞死滅において、対応する単一特異性二価抗原結合コンストラクトよりも、約１．３倍の上昇を示す。一実施形態では、一価抗原結合コンストラクトは、ＥＧＦＲ及び／またはＨＥＲ２に結合する抗原結合ポリペプチドコンストラクトを含み、ＡＤＣＣによる細胞死滅において、対応する単一特異性二価抗原結合コンストラクトよりも、約１．５倍の上昇を示す。
ＡＤＣＰ
一実施形態では、一価抗原結合コンストラクトは、対応する単一特異性二価抗原結合コンストラクトよりも、さらに高い程度のＡＤＣＰによる細胞死滅を示す。
ＣＤＣ
一実施形態では、一価抗原結合コンストラクトは、対応する単一特異性二価抗原結合コンストラクトよりも、さらに高い程度のＣＤＣによる細胞死滅を示す。一実施形態では、一価抗原結合コンストラクトは、ＥＧＦＲ及び／またはＨＥＲ２に結合する抗原結合ポリペプチドコンストラクトを含み、ＣＤＣによる細胞死滅において、対応する単一特異性二価抗原結合コンストラクトよりも、約１．５倍の上昇を示す。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の単離された一価抗原結合コンストラクトであり、該コンストラクトは、２つの抗原結合ポリペプチドコンストラクトを有する対応する二価抗原結合コンストラクトの少なくとも１つのＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ及びＣＤＣの少なくとも約１２５％を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の単離された一価抗原結合コンストラクトであり、該コンストラクトは、２つの抗原結合ポリペプチドコンストラクトを有する対応する二価抗原結合コンストラクトの少なくとも１つのＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ及びＣＤＣの少なくとも約１５０％を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の単離された一価抗原結合コンストラクトであり、該コンストラクトは、２つの抗原結合ポリペプチドコンストラクトを有する対応する二価抗原結合コンストラクトの少なくとも１つのＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ及びＣＤＣの少なくとも約３００％を有する。
ＦｃγＲに対する結合能力の増大
いくつかの実施形態では、一価抗原結合コンストラクトは、１つ以上のＦｃγＲへのさらに高い結合能力（Ｒｍａｘ）を示す。一価抗原結合コンストラクトがＨＥＲ２に結合する抗原結合ポリペプチドコンストラクトを含む一実施形態では、一価抗原結合コンストラクトは、対応する単一特異性二価抗原結合コンストラクトを上回る約１．３〜２倍の間の１つ以上のＦｃγＲに対するＲｍａｘの上昇を示す。一価抗原結合コンストラクトがＥＧＦＲ及び／またはＨＥＲ２に結合する抗原結合ポリペプチドコンストラクトを含む一実施形態では、一価抗原結合コンストラクトは、対応する単一特異性二価抗原結合コンストラクトを上回る約１．３〜１．８倍の間のＣＤ１６ ＦｃγＲに対するＲｍａｘの上昇を示す。一価抗原結合コンストラクトがＥＧＦＲ及び／またはＨＥＲ２に結合する抗原結合ポリペプチドコンストラクトを含む一実施形態では、一価抗原結合コンストラクトは、対応する単一特異性二価抗原結合コンストラクトを上回る約１．３〜１．８倍の間のＣＤ３２ ＦｃγＲに対するＲｍａｘの上昇を示す。一価抗原結合コンストラクトがＥＧＦＲ及び／またはＨＥＲ２に結合する抗原結合ポリペプチドコンストラクトを含む一実施形態では、一価抗原結合コンストラクトは、対応する単一特異性二価抗原結合コンストラクトを上回る約１．３〜１．８倍の間のＣＤ６４ ＦｃγＲに対するＲｍａｘの上昇を示す。
ＦｃγＲのアフィニティの増大
一実施形態では、本明細書に提供される一価抗原結合コンストラクトは、対応する二価抗原結合コンストラクトと比較したとき、予想外のＦｃγＲのアフィニティの増大を有する。結合に起因するＦｃ濃度の上昇は、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、ＣＤＣ活性の増大と一致する。
いくつかの実施形態では、一価抗原結合コンストラクトは、１つ以上のＦｃγＲのアフィニティの上昇を示す。一実施形態では、一価抗原結合コンストラクトは、ＨＥＲ２に結合する抗原結合ポリペプチドコンストラクトを含み、一価抗原結合コンストラクトは、少なくとも１つのＦｃγＲのアフィニティの上昇を示す。本実施形態では、一価抗原結合コンストラクトは、ＣＤ３２のアフィニティの上昇を示す。
別の実施形態では、本明細書に記載の一価抗原結合コンストラクトは、対応する単一特異性二価抗原結合コンストラクトと比較して、内部移行の増大を示し、これによって、優れた有効性及び／または生物活性をもたらす。
一価抗原結合コンストラクトの試験。ＦｃγＲ、ＦｃＲｎ及びＣ１ｑ結合
本明細書に記載の一価抗原結合コンストラクトは、対応する単一特異性二価抗原結合コンストラクトと比較して、エフェクター機能の強化を示す。一価抗原結合コンストラクトのエフェクター機能は、次のように試験を行うことができる。インビトロ及び／またはインビボ細胞障害アッセイを実施して、ＡＤＣＰ、ＣＤＣ及び／またはＡＤＣＣ活性を評価することができる。例えば、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）結合アッセイを実施して、ＦｃγＲ結合を測定することができる。ＡＤＣＣ、ＮＫ細胞を媒介するための初代細胞は、ＦｃγＲＩＩＩのみを発現し、単核細胞は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞でのＦｃＲの発現は、Ｒａｖｅｔｃｈ ａｎｄ Ｋｉｎｅｔ， Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ ９：４５７〜９２（１９９１）の４６４頁表３にまとめる。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのインビトロアッセイの一例は、米国特許第５，５００，３６２号または同第５，８２１，３３７号に記述されている。こうしたアッセイ向けの有用なエフェクター細胞としては、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が挙げられる。代替的に、または追加的に、目的の分子のＡＤＣＣ活性は、インビボ、例えば、Ｃｌｙｎｅｓ ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）９５：６５２〜６５６（１９９８）に開示されているモデルなどの動物モデルで評価してもよい。また、Ｃ１ｑ結合アッセイを実施して、一価抗原結合コンストラクトがＣ１ｑの結合及びそのためにＣＤＣの活性が可能であるかを判断してもよい。補体の活性化を評価するために、例えば、Ｇａｚｚａｎｏ−Ｓａｎｔｏｒｏ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ２０２：１６３（１９９６）に記載されているように、ＣＤＣアッセイを実施してもよい。当該技術分野において周知の方法を使用して、例えばＳＰＲによるＦｃＲｎ結合及び抗体のインビボＰＫ測定を実施することもできる。
薬物動態学的パラメータ
ある実施形態では、本明細書に提示されている一価抗原結合コンストラクトは、市販の治療用抗体と同程度である薬物動態学（ＰＫ）特性を示す。一実施形態では、本明細書に記載の一価抗原結合コンストラクトは、血清濃度、ｔ１／２、ベータ半減期及び／またはＣＬに関して、既知の治療用抗体に類似したＰＫ特性を示す。一実施形態では、一価抗原結合コンストラクトは、該単一特異性二価抗原結合コンストラクトと同等以上のインビボ安定性を示す。このようなインビボ安定性パラメータとしては、血清濃度、ｔ１／２、ベータ半減期及び／またはＣＬが挙げられる。
一実施形態では、本明細書に提示の一価抗原結合コンストラクトは、対応する単一特異性二価抗原結合コンストラクトと比較して、さらに高い分布量（Ｖｓｓ）を示す。抗体の分布量は、血漿または血液体積（Ｖｐ）、組織量（ＶＴ）及び組織対血漿分画（ｋＰ）に関連する。線形条件では、ＩｇＧ抗体は、動物、またはヒトにおいて血管内投与された後、主に血漿コンパートメント及び血管外液に分布する。いくつかの実施形態では、例えば、新生児のＦｃ受容体（ＦｃＲｎ）による取り込みなどの能動的輸送プロセスも、他の結合するタンパク質の中で、抗体の体内分布に影響を与える。
別の実施形態では、本明細書に記載の一価抗原結合コンストラクトは、対応する単一特異性二価抗原結合コンストラクトと比較して、さらに高い分布量（Ｖｓｓ）を示し、類似したアフィニティを有するＦｃＲｎに結合する。
本明細書で使用するとき、用語「血清半減期の調節」は、天然形態に対して、本明細書に記載の抗原結合コンストラクトに含まれる抗原結合ポリペプチドの循環半減期の陽性または陰性の変化を意味する。血清半減期は、コンストラクト投与後のさまざまな時点で血液サンプルを採取し、各サンプル中の該分子の濃度を測定することにより測定される。血清濃度と時間との相関関係から、血清半減期を算出することができる。血清半減期の上昇は、好ましくは少なくとも約２倍であるが、より少ない上昇であれば、例えば、良好な投与計画が可能であるか、または毒性作用を回避することが可能である場合、有用であり得る。いくつかの実施形態では、上昇は少なくとも約３倍、少なくとも約５倍、または少なくとも約１０倍である。
本明細書で使用するとき、用語「治療的半減期の調節」は、非修飾形態に対して、本明細書に記載の一価抗原結合コンストラクトに含まれる治療有効量の抗原結合ポリペプチドの半減期の陽性または陰性変化を意味する。治療的半減期は、投与後、さまざまな時間での該分子の薬物動態学及び／または薬力学的特性を測定することによって測定される。治療用半減期の上昇により、特定の有益な投与計画、特定の有益な全量が好ましく得られるか、好ましくない効果が回避され得る。いくつかの実施形態では、治療用半減期の上昇は、効力の増加、その標的に対する修飾分子の結合の増加若しくは減少、プロテアーゼなどの酵素による該分子の分解の増加または減少、または非修飾分子の活動の別のパラメータまたはメカニズムの増加または減少、または該分子の受容体媒介クリアランスの増加または減少からもたらされる。
抗原結合コンストラクトの作製
抗原結合コンストラクトは、例えば、米国特許第４，８１６，５６７に記載のような組換え方法及び組成物を使用して作製され得る。一実施形態では、本明細書に記載の抗原結合コンストラクトをコードする単離された核酸が提供される。このような核酸は、ＶＬを含むアミノ酸配列及び／または抗原結合コンストラクトのＶＨを含むアミノ酸配列（例えば、抗原結合コンストラクトの軽鎖及び／または重鎖）をコードし得る。さらなる実施形態では、かかる核酸を含む１つまたはそれ以上のベクター（例えば、発現ベクター）が提供される。一実施形態では、核酸は多シストロン性ベクター内に提供される。さらなる実施形態では、このような核酸を含む宿主細胞が提供される。このような一実施形態では、宿主細胞は、（１）抗原結合コンストラクトのＶＬを含むアミノ酸配列と抗原結合性ポリペプチドコンストラクトのＶＨを含むアミノ酸配列とをコードする核酸を含むベクター、または、（２）抗原結合性ポリペプチドコンストラクトのＶＬを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第１のベクター及び抗原結合性ポリペプチドコンストラクトのＶＨを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第２のベクターを含む（例えば、これらのベクターで形質転換されている）。一実施形態では、宿主細胞は真核生物の細胞、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、またはヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ）細胞、またはリンパ系細胞（例えば、Ｙ０、ＮＳ０、Ｓｐ２０細胞）である。一実施形態では、抗原結合コンストラクトを作製する方法が提供され、この方法には、抗原結合コンストラクトをコードする上記で提供されたような核酸を含む宿主細胞を、抗原結合コンストラクトの発現に好適な条件下で培養すること、及び任意選択で、宿主細胞（または宿主細胞培地）から抗原結合コンストラクトを回収することが含まれる。
抗原結合コンストラクトの組換え作製では、例えば、上記のような抗原結合コンストラクトをコードする核酸を単離して１つまたはそれ以上のベクターに挿入し、さらなるクローニング及び／または宿主細胞での発現に供する。このような核酸は、従来の手順を使用して（例えば、抗原結合コンストラクトの重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを使用して）容易に単離し配列決定され得る。
いくつかの実施形態では、発現した抗原結合コンストラクトにはシグナルペプチドが含まれる。例としては、スタニオカルシンのシグナル配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）及びコンセンサスのシグナル配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）が含まれるがこれらに限定されない。
抗原結合コンストラクトをコードするベクターのクローニングまたは発現に好適な宿主細胞には、本明細書に記載の原核細胞または真核細胞が挙げられる。例えば、抗原結合コンストラクトは、特に、グリコシル化及びＦｃエフェクター機能が必要ない場合に細菌内に作製され得る。抗原結合コンストラクトの断片及びポリペプチドの細菌内発現については、例えば、米国特許第５，６４８，２３７号、５，７８９，１９９号、及び５，８４０，５２３号を参照のこと。（抗体断片を大腸菌内に発現させる記載のＣｈａｒｌｔｏｎ， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ．２４８（Ｂ．Ｋ．Ｃ． Ｌｏ， ｅｄ．， Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， Ｔｏｔｏｗａ， Ｎ．Ｊ．，２００３），ｐｐ．２４５−２５４も参照のこと）。発現後、抗原結合コンストラクトを細菌細胞ペーストから可溶性画分に単離してよく、それをさらに精製することができる。
原核生物の他、糸状菌または酵母などの真核微生物は、抗原結合コンストラクトをコードするベクターに好適なクローニング宿主または発現宿主であり、これらの、グリコシル化経路はすでに「ヒト化」されていて、部分的または完全にヒトグリコシル化パターンを伴う抗原結合コンストラクトの産生をもたらす。Ｇｅｒｎｇｒｏｓｓ， Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈ． ２２：１４０９−１４１４（２００４）、及びＬｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈ． ２４：２１０−２１５（２００６）を参照のこと。
グリコシル化された抗原結合コンストラクトの発現に好適な宿主細胞は、多細胞性生物（無脊椎動物及び脊椎動物）由来でもある。無脊椎動物の細胞の例には植物細胞及び昆虫細胞が含まれる。多数のバキュロウイルス株が同定されており、特にヨウトガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞のトランスフェクションに昆虫細胞と併用して使用され得る。
植物細胞培養も宿主として用いることができる。例えば、米国特許第米国特許第．５，９５９，１７７号、６，０４０，４９８号、６，４２０，５４８号、７，１２５，９７８号、及び６，４１７，４２９号（トランスジェニック植物に抗原結合コンストラクトを作製するためのＰＬＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ（商標）技術を記載）を参照のこと。
脊椎動物細胞を宿主として使用してもよい。例えば、浮遊培養に適応させた哺乳類細胞株は有用であり得る。有用な哺乳類宿主細胞株の他の例には、ＳＶ４０（ＣＯＳ−７）で形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株；ヒト胎児由来腎臓株（２９３または、例えば、Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．３６：５９（１９７７）に記載のような２９３細胞）；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）；マウスセルトリ細胞（例えば、Ｍａｔｈｅｒ， Ｂｉｏｌ． Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３−２５１（１９８０）に記載のようなＴＭ４細胞）；サル腎臓細胞（ＣＶ１）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ）；バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ３Ａ）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８）；ヒト肝細胞（Ｈｅｐ Ｇ２）；マウス乳房腫瘍（ＭＭＴ０６０５６２）；例えば、Ｍａｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３：４４−６８（１９８２）に記載のようなＴＲＩ細胞；ＭＲＣ５細胞；及びＦＳ４細胞がある。有用な哺乳類宿主細胞株には他に、ＤＨＦＲ-ＣＨＯ細胞（Ｕｒｌａｕｂ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７７：４２１６（１９８０））などの、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞；並びにＹ０、ＮＳ０及びＳｐ２／０のような骨髄腫細胞株が挙げられる。抗原結合コンストラクトの作製に好適な特定の哺乳類宿主細胞株の概説については、例えば、Ｙａｚａｋｉ ａｎｄ Ｗｕ， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２４８（Ｂ．Ｋ．Ｃ． Ｌｏ， ｅｄ．， Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， Ｔｏｔｏｗａ， Ｎ．Ｊ．）、２５５〜２６８頁（２００３）を参照のこと。
一実施形態では、本明細書に記載の抗原結合コンストラクトは安定した哺乳類細胞で作製され、その際、少なくとも１つの安定した哺乳類細胞を、抗原結合コンストラクトをコードする所定の比率の核酸で形質移入すること；及び、前述の少なくとも１つの哺乳類細胞に前述の核酸を発現させることを含む方法により作製される。いくつかの実施形態では、核酸の所定の比率は、発現産物における抗原結合コンストラクトの割合が最も高くなるような核酸投入量の相対比を測定するための一過性トランスフェクションの実験で決定される。
いくつかの実施形態には、本明細書に記載のように一価抗原結合コンストラクトを安定した哺乳類細胞に作製する方法が記載され、これにおいて、前述の少なくとも１つの安定した哺乳類細胞の発現産物は、所望のグリコシル化された一価抗体を、重鎖若しくは軽鎖の単量体ポリペプチド、または他の抗体よりも多く含む。
いくつかの実施形態には、グリコシル化された一価抗原結合コンストラクトを、本明細書に記載の安定した哺乳類細胞に作製する方法が記載され、該方法は、所望のグリコシル化された一価抗体を同定及び精製することを含む。いくつかの実施形態では、かかる同定を、液体クロマトグラフィー及び質量分析の両方またはいずれか一方により行う。
必要に応じ、抗原結合コンストラクトは、発現後、精製または単離することができる。タンパク質は、当業者に公知の多種多様な方法で単離または精製され得る。標準的な精製方法には、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、粒径排除またはゲルろ過クロマトグラフィー、及び逆相クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィー法が含まれ、大気圧またはＦＰＬＣ及びＨＰＬＣのようなシステムを使用して高圧で行われる。精製方法には、電気泳動法、免疫測定法、沈降法、透析法、及びクロマトフォーカシング法も含まれる。タンパク質濃度と併用した限外ろ過及び血液透析ろ過技術も有用である。当技術分野において周知のように、多種多様な天然タンパク質がＦｃ及び抗体を結合し、これらのタンパク質を、抗原結合コンストラクトを精製するために本発明で利用することができる。例えば、細菌のプロテインＡ及びＧはＦｃ領域に結合する。同様に、細菌のタンパク質Ｌは一部の抗体のＦａｂ領域に結合する。精製は、特定の融合パートナーにより可能なことが多い。例えば、抗体は、ＧＳＴ融合を使用する場合はグルタチオン樹脂を使用して、また、Ｈｉｓタグを使用する場合はＮｉ＋２アフィニティクロマトグラフィーを、または、ｆｌａｇタグを使用する場合は固定化抗ｆｌａｇ抗体を使用して精製され得る。好適な精製技術の一般ガイダンスについては、例えば、参照により全体が組み込まれるＰｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ， ３ｒｄ Ｅｄ．， Ｓｃｏｐｅｓ， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ， ＮＹ， １９９４を参照のこと（参照により全体が組み込まれる）。必要な精製の程度は、抗原結合コンストラクトの使用に応じて異なってくる。いくつかの場合、精製が必要ない場合もある。
ある実施形態では、抗原結合コンストラクトは、Ｑ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、ＤＥＡＥ ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、ｐｏｒｏｓ ＨＱ、ｐｏｒｏｓ ＤＥＡＦ、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ Ｑ、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ＱＡＥ、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ＤＥＡＥ、Ｒｅｓｏｕｒｃｅ／Ｓｏｕｒｃｅ Ｑ及びＤＥＡＥ、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ Ｑ及びＤＥＡＥカラムでのクロマトグラフィーを含むが、これらに限定されない陰イオン交換クロマトグラフィーを使用して精製される。
特定の実施形態では、本明細書に記載のタンパク質は、ＳＰ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、ＣＭ ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、ｐｏｒｏｓ ＨＳ、ｐｏｒｏｓ ＣＭ、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ＳＰ、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ＣＭ、Ｒｅｓｏｕｒｃｅ／Ｓｏｕｒｃｅ Ｓ及びＣＭ、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ Ｓ及びＣＭの各種カラム並びにそれらと同等及び匹敵するものを含むが、これらに限定されない陽イオン交換クロマトグラフィーを使用して精製される。
さらに、本明細書に記載の抗原結合コンストラクトが、当技術分野で公知である技術を使用して化学的に合成可能である（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ， １９８３， Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ， Ｗ． Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．， Ｎ．Ｙ ａｎｄ Ｈｕｎｋａｐｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， ３１０：１０５−１１１（１９８４）を参照のこと）。例えば、あるポリペプチドの断片に対応するポリペプチドは、ペプチド合成装置の使用により合成可能である。さらに、必要であれば、非典型的なアミノ酸または化学的アミノ酸類似体を、置換体または付加体としてポリペプチド配列に導入することができる。非古典的アミノ酸には、共通アミノ酸のＤ−異性体、２，４ジアミノ酪酸、アルファ−アミノイソ酪酸、４アミノ酪酸、Ａｂｕ、２−アミノ酪酸、ｇ−Ａｂｕ、ｅ−Ａｈｘ、６アミノヘキサン酸、Ａｉｂ、２−アミノイソ酪酸、３−アミノプロピオン酸、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、サルコシン、シトルリン、ホモシトルリン、システイン酸、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、−アラニン、フルオロ−アミノ酸、−メチルアミノ酸、Ｃ−メチルアミノ酸、Ｎ−メチルアミノ酸、及び一般アミノ酸類似体のようなデザイナー・アミノ酸が挙げられるが、これに限定されるものではない。さらに、かかるアミノ酸は、Ｄ（右旋性）またはＬ（左旋性）であり得る。
「組換え型宿主細胞」または「宿主細胞」とは、例えば、直接取込み、形質導入、ｆ−接合、または組換え型宿主細胞を作出するために当技術分野で公知の他の方法など、挿入に使用した方法にかかわらず外因性ポリヌクレオチドを含む細胞をいう。外因性ポリヌクレオチドを、非組み込みベクター、例えば、プラスミドとして維持してよく、または別法として、宿主ゲノムに組み込んでよい。
本発明において、用語「真核生物」とは、動物（哺乳類、昆虫類、爬虫類、鳥類等を含むがこれらに限定されない）、繊毛虫類、植物（単子葉植物、双子葉植物、藻類等を含むがこれらに限定されない）、真菌類、酵母、鞭毛虫類、微胞子虫類、原生生物等のような、系統発生学的ドメインで真核生物に属する生物をいう。
本発明において、用語「原核生物」とは、原核生物をいう。例えば、非真核生物は、系統発生学的ドメインの真正細菌（大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、サーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バシラス‐ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）等を含むがこれらに限定されない）、または系統発生学的ドメインの古細菌（メタノコックス・ヤンナスキイ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）、メタノバクテリウム・サーモオートトロフィクム（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ）、ハロフェラックス・ボルカニイ（Ｈａｌｏｆｅｒａｘ ｖｏｌｃａｎｉｉ）及びハロバクテリウム（Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＮＲＣ−１種のようなハロバクテリウム（Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、アーケオグロブス・フルギダス（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ ｆｕｌｇｉｄｕｓ）、パイロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ）、パイロコッカス・ホリコシイ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ）、アエロパイラム・ペルニクス（Ａｅｕｒｏｐｙｒｕｍ ｐｅｒｎｉｘ）等を含むがこれらに限定されない）に属し得る。
本発明において、用語「培地（ｍｅｄｉｕｍ）」または「培地（ｍｅｄｉａ）」には、任意の培養培地、液体培地、固形培地、半固形培地、または細菌宿主細胞、酵母宿主細胞、昆虫宿主細胞、植物宿主細胞、真核生物宿主細胞、哺乳類宿主細胞、ＣＨＯ細胞、原核生物宿主細胞、大腸菌またはシュードモナス宿主細胞、及び細胞内容物などの任意の宿主細胞を支持または含有し得る固い支持体が含まれる。したがって、かかる用語には、増殖工程の前または後のいずれの培地も含めた、宿主細胞を中で増殖させた培地、例えば、中にタンパク質が分泌された培地が包含され得る。また、かかる用語には、本明細書に記載の抗原結合コンストラクトが細胞内に作製され、ヘテロ多量体を放出させるために宿主細胞が溶解または破壊される場合のような、宿主細胞の溶解物を含有する緩衝液または試薬も包含され得る。
抗原結合コンストラクトの試験
本明細書に記載の抗原結合コンストラクトまたは医薬組成物を、ヒトでの使用に先立ち、所望の治療的または予防的作用についてインビトロで試験した後、インビボで試験した。例えば、化合物または医薬組成物の治療または予防上の有用性を実証するためのインビトロ試験には、細胞株または患者の組織試料に対する化合物の作用が含まれる。細胞株及び／または組織試料に対する化合物または組成物の作用は、ロゼット形成試験及び細胞溶解試験を含むが、これらに限定されない当業者に公知の技術を使用して測定することができる。本発明に従い、特定の抗原結合コンストラクトを投与することが適応されるか否かを決定するために使用可能なインビトロ試験には、インビトロ細胞培養試験、または患者の組織試料を培養で増殖させ、抗原結合コンストラクトに曝露させるか別の方法で投与し、かかる抗原結合コンストラクトの組織試料に対する作用を観察するインビトロ試験が含まれる。
一価抗原結合コンストラクトの候補は、細胞、例えば、ＨＥＲ２を発現している乳癌細胞株を使用して分析し調べることができる。以下の表Ａには、いくつかの代表的癌細胞株のＨＥＲ２発現レベルが記載されている。
（表Ａ５）対象細胞株におけるＨＥＲ２の相対的発現レベル
Figure 2017504564
ＭｃＤｏｎａｇｈ ｅｔ ａｌ Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ． ２０１２ Ｍａｒ；１１（３）：５８２−９３
Ｓｕｂｉｋ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ：Ｂａｓｉｃ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ：４；３５−４１
Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ． ＰＮＡＳ，１９９４：８９；４２８５−４２８９；Ｙａｒｄｅｎ ２０００， ＨＥＲ２：Ｂａｓｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ
Ｈｅｎｄｒｉｃｋｓ ｅｔ ａｌ Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ ２０１３；１２：１８１６−２８
当技術分野で公知のように、本明細書に記載の方法での使用に好適な一価抗原結合コンストラクトを同定するために、多数の試験法が使用され得る。これらの試験法は、ＨＥＲ２を発現している癌細胞で実施可能である。好適な癌細胞の例を表Ａ５に示す。実施され得る試験法の例を以下の通り記載する。
例えば、ＨＥＲ２を結合する一価抗原結合コンストラクトの増殖阻害候補を同定するために、ＨＥＲ２を発現している癌細胞の増殖を阻害する抗体についてスクリーニングしてよい。一実施形態では、抗原結合コンストラクトの選択候補は、細胞培養での癌細胞の増殖を、対照の抗原結合コンストラクトに比べ約２０〜１００％、好ましくは約５０〜１００％阻害できる。
例えば、ＰＩ（ホスファチジルイノシトール）で示される細胞死、膜統合性の損失を誘導する抗原結合コンストラクトの候補を選択するには、対照と比較したトリパンブルーまたは７ＡＡＤの取込みが評価され得る。
アポトーシスを誘導する抗原結合コンストラクト候補を選択するためには、アネキシン結合アッセイが使用され得る。アネキシン結合アッセイの他に、ＤＮＡ染色法を使用してもよい。
一実施形態では、対象とする一価抗原結合コンストラクトの候補は、共免疫沈降実験で測定した場合に、ＭＣＦ７細胞及びＳＫ−ＢＲ−３細胞いずれにおいてもＥｒｂＢ２とＥｒｂＢ３とのヘレグリン依存性会合をモノクローナル抗体４Ｄ５より実質的に有効に、好ましくは、モノクローナル抗体７Ｆ３より実質的に有効にブロッキングし得る。
対象抗体が結合したＥｒｂＢ２のエピトープに結合する一価抗原結合コンストラクトについてスクリーニングするには、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｅｄ Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｄａｖｉｄ Ｌａｎｅ （１９８８）に記載のようなルーチンのクロスブロッキング（ｃｒｏｓｓ−ｂｌｏｃｋｉｎｇ）法を実施できる。別法として、または追加で、当技術分野で公知の方法によりエピトープマッピングを実施することができる。
細胞を用いた上記の試験で得られた結果から、次に、動物モデル、例えば、マウスモデルでの試験、及びヒト臨床試験を行うことができる。
抗原結合コンストラクト及び抗体薬物複合体（ＡＤＣ）
ある実施形態では、抗原結合コンストラクトを、薬物、例えば、毒素、化学療法薬、免疫調節薬、または放射性同位元素に複合体化させる。ＡＤＣ（抗体薬物複合体または抗原結合コンストラクト薬物複合体）を調製する各種方法は当技術分野で公知であり、例えば、米国特許第８，６２４，００３（ポット法（ｐｏｔ ｍｅｔｈｏｄ）号、８，１６３，８８８（一段階法（ｏｎｅ−ｓｔｅｐ））号、及び５，２０８，０２０（２段階法（ｔｗｏ−ｓｔｅｐ ｍｅｔｈｏｄ）号に記載されている。
いくつかの実施形態では、薬物は、メイタンシン、アウリスタチン、カリケアマイシン、またはその誘導体から選択される。その他の実施形態では、薬物は、ＤＭ１及びＤＭ４から選択されるメイタンシンである。さらなる実施例を以下に記載する。
いくつかの実施形態では、ＳＭＣＣリンカー（ＤＭ１）、またはＳＰＤＢリンカー（ＤＭ４）を有する単離された抗原結合コンストラクトに薬物を複合体化させる。さらなる例を以下に記載する。薬物と抗原結合タンパク質の比（ＤＡＲ）は、例えば、１．０対６．０または３．０対５．０または３．５対４．２であり得る。
いくつかの実施形態では、抗原結合コンストラクトを細胞傷害性薬剤に複合体化させる。本明細書で使用する用語「細胞傷害性薬剤」とは、細胞の機能を阻害または防止する物質及び／または細胞破壊を引き起こす物質をいう。かかる用語には、放射性同位体（例えば、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、及びＬｕ１７７）、化学療法薬、並びに、細菌、真菌、植物若しくは動物由来の酵素活性毒素のような毒素または低分子毒素（その断片及び／または変異体を含む）が含まれることが意図される。さらなる実施例を以下に記載する。
薬物
ＡＤＣのさまざまな実施形態で使用される薬物またはペイロードの非限定的例としては、ＤＭ１（メイタンシン、Ｎ２'−デアセチル−Ｎ２'−（３−メルカプト−１−オキソプロピル）−またはＮ２'−デアセチル−Ｎ２'−（３−メルカプト−１−オキソプロピル）−メイタンシン）、ｍｃ−ＭＭＡＤ（６−マレイミドカプロイル−モノメチルアウリスタチン−ＤまたはＮ−メチル−Ｌ−バリル−Ｎ−［（１Ｓ，２Ｒ）−２−メトキシ−４−［（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−［［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（２−チアゾリル）エチル］アミノ］プロピル］−１−ピロリジニル］−１−［（１Ｓ）−１−メチルプロピル］−４−オキソブチル］−Ｎ−メチル−（９Ｃｌ）−Ｌ−バリンアミド）、ｍｃ−ＭＭＡＦ（マレイミドカプロイル−モノメチルアウリスタチンＦまたはＮ−［６−（２，５−ジヒドロ−２，５−ジオキソ−１Ｈ−ピロール−１−イル）−１−オキソヘキシル］−Ｎ−メチル−Ｌ−バリル−Ｌ−バリル−（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−３−メトキシ−５−メチル−４−（メチルアミノ）ヘプタノイル−（αＲ，βＲ，２Ｓ）−β−メトキシ−α−メチル−２−ピロリジンプロパノイル−Ｌ−フェニルアラニン）、及びｍｃ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＡ−ＭＭＡＥ（６−マレイミドカプロイル−ＶａｌｃＣｉｔ−（ｐ−アミノベンジルオキシカルボニル）−モノメチルアウリスタチンＥまたはＮ−［［［４−［［Ｎ−［６−（２，５−ジヒドロ−２，５−ジオキソ−１Ｈ−ピロール−１−イル）−１−オキソヘキシル］−Ｌ−バリル−Ｎ５−（アミノカルボニル）−Ｌ−オルニチル］アミノ］フェニル］メトキシ］カルボニル］−Ｎ−メチル−Ｌ−バリル−Ｎ−［（１Ｓ，２Ｒ）−４−［（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−３−［［（１Ｒ，２Ｓ）−２−ヒドロキシ−１−メチル−２−フェニルエチル］アミノ］−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソプロピル］−１−ピロリジニル］−２−メトキシ−１−［（１Ｓ）−１−メチルプロピル］−４−オキソブチル］−Ｎ−メチル−Ｌ−バリンアミド）が挙げられる。ＤＭ１はチューブリン阻害薬メイタンシンの誘導体であり、ＭＭＡＤ、ＭＭＡＥ、及びＭＭＡＦはアウリスタチン誘導体である。
メイタンシノイド薬物部分
上記に示したように、いくつかの実施形態では、薬物はメイタンシノイドである。例示的なメイタンシノイドには、ＤＭ１、ＤＭ３（Ｎ２'−デアセチル−Ｎ２'−（４−メルカプト−１−オキソペンチル）メイタンシン）、及びＤＭ４（Ｎ２'−デアセチル−Ｎ２'−（４−メチル−４−メルカプト−１−オキソペンチル）メチルメイタンシン）（ＵＳ２００９０２０２５３６を参照のこと）が挙げられる。
結合の種類に応じて、メイタンシン化合物の多くの位置が結合位置として有用であることが知られている。例えば、エステル結合の形成には、ヒドロキシル基を有するＣ−３位、ヒドロキシメチルで修飾されたＣ−１４位、ヒドロキシル基で修飾されたＣ−１５位及びヒドロキシル基を有するＣ−２０位はいずれも好適である。
メイタンシノイド薬物部分のすべての立体異性体が、本明細書に記載のＡＤＣとして意図され、すなわち、Ｄ型キラル炭素におけるＲ及びＳの立体配置のあらゆる組み合わせが意図される。
アウリスタチン類
いくつかの実施形態では、薬物は、アウリスタチンＥ（当技術分野ではドラスタチン−１０の誘導体としても知られる）またはその誘導体のようなアウリスタチンである。アウリスタチンは、例えば、アウリスタチンＥとケト酸の間に形成されるエステルであり得る。例えば、アウリスタチンＥをパラアセチル安息香酸またはベンゾイル吉草酸と反応させて、それぞれからＡＥＢ及びＡＥＶＢを生成させることができる。典型的な他のアウリスタチンには、ＡＦＰ、ＭＭＡＦ、及びＭＭＡＥが挙げられる。例示的アウリスタチンの合成及び構造は、米国特許第．６，８８４，８６９号、７，０９８，３０８号、７，２５６，２５７号、７，４２３，１１６号、７，４９８，２９８号及び７，７４５，３９４号に記載されており、その各々はあらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に取り込まれる。
化学療法薬
いくつかの実施形態では、抗原結合コンストラクトを化学療法薬に複合体化させる。例としては、シスプランチン（Ｃｉｓｐｌａｎｔｉｎ）及びラパチニブが含まれるが、これらに限定されない。「化学療法薬」は癌治療に有用な化学的化合物である。
化学療法薬の例には、チオテパ及びシクロホスファミド（ＣＹＴＯＸＡＮ（商標））のようなアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファン及びピポスルファンのようなスルホン酸アルキル類；ベンゾドーパ（ｂｅｎｚｏｄｏｐａ）、カルボコン、メツレドーパ（ｍｅｔｕｒｅｄｏｐａ）、及びウレドーパ（ｕｒｅｄｏｐａ）のようなアジリジン類；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホルアミド（ｔｒｉｅｔｈｉｙｌｅｎｅｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｅ）、トリエチレンチオホスホルアミド（ｔｒｉｅｔｈｙｌｅｎｅｔｈｉｏｐｈｏｓｐｈａｏｒａｍｉｄｅ）及びトリメチローロメラミン（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｏｌｏｍｅｌａｍｉｎｅ）のようなエチレンイミン類及びメチラメラミン類；クロラムブシル、クロルナファジン、コロホスファミド（ｃｈｏｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシド塩酸塩（ｍｅｃｈｌｏｒｅｔｈａｍｉｎｅ ｏｘｉｄｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）、メルファラン、ノブエンビキン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタードのようなナイトロジェンマスタード類；カルムスチン、クロロゾトシン、ホテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチンのようなニトロスレア類（ｎｉｔｒｏｓｕｒｅａ）；アクラシノマイシン類、アクチノマイシン、オースラマイシン（ａｕｔｈｒａｍｙｃｉｎ）、アザセリン、ブレオマイシン類、カクチノマイシン（ｃａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ）、カリケアマイシン、カラビシン（ｃａｒａｂｉｃｉｎ）、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン類、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン類、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン類（ｏｌｉｖｏｍｙｃｉｎ）、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン（ｐｏｔｆｉｒｏｍｙｃｉｎ）、ピューロマイシン、ケラマイシン（ｑｕｅｌａｍｙｃｉｎ）、ロドルビシン（ｒｏｄｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシンのような抗生物質；メトトレキサート及び５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）のような代謝拮抗剤；デノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサートのような葉酸類似体；フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニンのようなプリン類似体；アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロキシウリジン、５−ＦＵのようなピリミジン類似体；カルステロン、ドロモスタノロンプロピオナート、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトンのようなアンドロゲン類；アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタンのような抗副腎皮質ホルモン剤；フロリン酸のような葉酸補充剤；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド（ａｌｄｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ）；アミノレブリン酸；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトラキサート（ｅｄａｔｒａｘａｔｅ）；デフォファミン（ｄｅｆｏｆａｍｉｎｅ）；デメコルチン；ジアジクオン；エルホルニチン（ｅｌｆｏｒｎｉｔｈｉｎｅ）；酢酸エリプチニウム（ｅｌｌｉｐｔｉｎｉｕｍ ａｃｅｔａｔｅ）；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシウレア；レンチナン；ロニダミン；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダモール；ニトラクリン（ｎｉｔｒａｃｒｉｎｅ）；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ポドフィリン酸；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ７；ラゾキサン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジクオン；２，２'，２'＝−トリクロロトリエチルアミン；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン（ｇａｃｙｔｏｓｉｎｅ）；アラビノシド（"Ａｒａ−Ｃ"）；シクロホスファミド；チオテパ；タキサン類、例えば、パクリタキセル（ＴＡＸＯＬ（登録商標）、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、Ｎ．Ｊ．）及びドキセタキセル（ｄｏｘｅｔａｘｅｌ）（ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）、Ｒｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ Ｒｏｒｅｒ，Ａｎｔｏｎｙ，Ｆｒａｎｃｅ）；クロラムブシル；ゲムシタビン；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；シスプラチン及びカルボプラチンのような白金類似体；ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ−１６）；イホスファミド；マイトマイシンＣ；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ナベルビン；ノバントロン；テニポシド；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼローダ；イバンドロネート；ＣＰＴ−１１；トポイソメラーゼ阻害薬ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイン酸；エスペラミシン類；カペシタビン；及び上述薬の薬学的に許容される塩類、酸類または誘導体が挙げられる。この定義には、例えばタモキシフェン、ラロキシフェン、アロマターゼ阻害４（５）−イミダゾール類、４−ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、ＬＹ１１７０１８、オナプリストン、及びトレミフェン（Ｆａｒｅｓｔｏｎ）などの抗エストロゲン薬、並びに、フルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、リュープロリド、及びゴセレリンなどの抗アンドロゲン類のような腫瘍のホルモン作用を調節または阻害して作用する抗ホルモン剤、並びに上述薬の薬学的に許容される塩類、酸類または誘導体も含まれる。
複合体リンカー
いくつかの実施形態では、薬物は抗原結合コンストラクト、例えば、抗体にリンカーにより結合している。抗体に対するリンカーの付加は、表面のリジンを介した付加、酸化炭水化物への還元的カップリング、及び鎖間ジスルフィド結合の還元により遊離化したシステイン残基を介した付加のような多種多様な方法で達成可能である。ヒドラゾン系結合、ジスルフィド系結合及びペプチド系結合など多種多様なＡＤＣ結合系が当技術分野で公知である。
好適なリンカーには、例えば、開裂可能なリンカー及び開裂不可能なリンカーが含まれる。開裂可能なリンカーは典型的には細胞内の条件で開裂しやすい。好適な開裂可能リンカーには、例えば、リソソームプロテアーゼまたはエンドソームプロテアーゼのような細胞内プロテアーゼで開裂可能なペプチドリンカーが含まれる。例示的な実施形態では、リンカーは、バリン−シトルリン（ｖａｌ−ｃｉｔ）、フェニルアラニン−リシン（ｐｈｅ−ｌｙｓ）リンカー、またはマレイミドヘキサン（ｍａｌｅｉｍｉｄｏｃａｐｒｏｎｉｃ）−バリン−シトルリン−ｐ−アミノベンジルオキシカルボニル（ｍｃ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＡ）リンカーなどのジペプチドリンカーであり得る。別のリンカーはスルホスクシンイミジル−４−［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボキシラート（ＳＭＣＣ）である。スルホ−ｓｍｃｃ複合体化は、スルフヒドリル類（チオール類、-ＳＨ）と反応するマレイミド基を介して起こるが、そのスルホ−ＮＨＳエステルは第一級アミン類（リシン内及びタンパク質またはペプチドＮ末端に見られるもの）に対し反応性がある。さらに別のリンカーはマレイミドカプロイル（ＭＣ）である。好適なリンカーには他に、ヒドラゾンリンカーのような特定ｐＨまたはあるｐＨ範囲で加水分解性のあるリンカーが挙げられる。さらなる好適な開裂可能リンカーには、ジスルフィドリンカーが挙げられる。リンカーは、抗体が細胞内で必ず分解され薬物、例えば、ＭＣリンカー等を放出するような程度に抗体に共有結合させてよい。
ＡＤＣの調製
ＡＤＣは、当業者に公知の有機化学の反応、条件、及び試薬を用いたいくつかの経路で調製でき、これらには、（１）抗体の求核基または求電子基と二価のリンカー試薬とを反応させて共有結合を介した抗体−リンカー中間体Ａｂ−Ｌを形成した後、活性化薬物部分Ｄと反応させる経路；及び（２）薬物部分の求核基または求電子基とリンカー試薬とを反応させて共有結合を介した薬物−リンカー中間体Ｄ−Ｌを形成した後、抗体の求核基または求電子基と反応させる経路が挙げられる。複合体化方法（１）及び（２）を多種多様な抗体、薬物部分、及びリンカーと共に用いてここに記載の抗体−薬物複合体を調製してよい。
ＡＤＣの調製方法の各種具体例が当技術分野で公知であり、米国特許第８，６２４，００３号（ポット法（ｐｏｔ ｍｅｔｈｏｄ））、８，１６３，８８８号（一段階法（ｏｎｅ−ｓｔｅｐ））、及び５，２０８，０２０号（２段階法（ｔｗｏ−ｓｔｅｐ ｍｅｔｈｏｄ））に記載がある。
抗原結合コンストラクト製剤及び投与方法
本明細書に記載の抗原結合コンストラクトは、当業者に周知のあらゆる方法により適応に応じて製剤化及び投与が可能である。いくつかの実施形態では、抗原結合コンストラクトは、抗原結合コンストラクトと薬学的に許容される担体との医薬組成物中に配合される。
用語「薬学的に許容される」とは、動物での使用、より具体的にはヒトでの使用について、連邦政府または州政府の規制当局により承認されている、または米国薬局方または一般に認識されている他の薬局方に掲載されていることを意味する。用語「担体」とは、共に治療薬が投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤、またはビヒクルをいう。このような医薬担体は、ピーナッツ油、ダイズ油、鉱油、ゴマ油等のような石油由来、動物由来、植物由来または合成由来のものを含めた水及び油などの無菌液であり得る。いくつかの態様では、担体は自然界には見られない人為的に作製した担体である。医薬組成物を静脈内投与する場合は水を担体として使用できる。生理食塩水及び水溶性ブドウ糖及びグリセロール溶液も、特に、注射液用の液状担体として使用できる。好適な医薬賦形剤には、デンプン、グルコース、ラクトース、ショ糖、ゼラチン、麦芽、米、小麦、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどが挙げられる。組成物には、必要に応じ、少量の湿潤剤若しくは乳化剤、またはｐＨ緩衝剤を含有させることもできる。これらの組成物は、溶液、懸濁液、エマルジョン、錠剤、丸剤、カプセル、粉末、徐放性製剤等の形態をとり得る。組成物は、トリグリセリド類などの従来の結合剤及び担体と共に坐剤として製剤化可能である。経口製剤には、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウム等のような標準的担体を含むことができる。好適な医薬担体の例は、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎ著「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」に記載されている。このような組成物には、患者に適切に投与するための形態を提供するため、治療有効量の化合物が、好ましくは精製された形態で、好適量の担体と共に含有されることとなる。製剤は投与方法に適していなければならない。
ある実施形態では、コンストラクトを含む組成物を、ヒトへの静脈内投与に適した医薬組成物として常套的手順に従って製剤化する。典型的には、静脈内投与用組成物は、無菌の等張水性緩衝液に溶解させた溶液である。必要な場合には、組成物に、可溶化剤及び注射部位の痛みを和らげるためのリグノカインなどの局所麻酔薬を含めてもよい。一般に、成分は、例えば、活性薬剤量が表記されたアンプルまたは小袋のような密封容器内に凍結乾燥粉末または無水濃縮物として、別々に、または混合された状態で単位剤形にして供給される。組成物を注入により投与する場合、無菌の医薬品グレードの水または生理食塩水を含有する注入ボトルで調合することができる。組成物を注射で投与する場合、成分を投与前に混合できるよう注射用滅菌水または生理食塩水のアンプルが提供され得る。
ある実施形態では、本明細書に記載の抗原結合コンストラクトを中性または塩の形態として製剤化する。薬学的に許容される塩類には、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸等に由来する陰イオンのような陰イオンで形成される塩類、及びナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化鉄（ＩＩＩ）イソプロピルアミン（ｆｅｒｒｉｃ ｈｙｄｒｏｘｉｄｅ ｉｓｏｐｒｏｐｙｌａｍｉｎｅ）、トリエチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカイン等に由来する陽イオンのような陽イオンで形成される塩類が含まれる。
さまざまな送達システムが公知であり、本明細書に記載の抗原結合コンストラクト製剤の投与に使用できるが、例えば、リポソーム、微粒子、マイクロカプセルへの封入、化合物を発現できる組換え型細胞、受容体媒介によるエンドサイトーシス（例えば、Ｗｕ ａｎｄ Ｗｕ， Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９−４４３２（１９８７）を参照のこと）、レトロウイルスまたは他のベクターの一部としての核酸の構築などのシステムがある。導入方法には、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、経鼻、硬膜外、及び経口の経路が含まれるが、これらに限定されない。化合物または組成物は、任意の好都合な経路、例えば、注入若しくはボーラス注射、上皮内膜または粘膜皮膚内膜（例えば、口腔粘膜、直腸粘膜及び腸管粘膜等）からの吸収により投与してよく、また、生物学的に活性な他の薬剤と共に投与してよい。投与は、全身投与または局所投与であり得る。さらに、ある実施形態では、本明細書に記載の抗原結合コンストラクト組成物を、脳室内注射及びくも膜下腔内注射など任意の好適な経路により中枢神経系に導入することが望ましく、脳室内注射は、例えば、オンマヤ（Ｏｍｍａｙａ）リザーバのようなリザーバに取り付けた、脳室内カテーテルを使用することで容易に実施され得る。例えば、吸入器または噴霧器、及びエアロゾル化剤配合製剤の使用により、肺への投与も可能である。
特定の実施形態では、本明細書に記載の抗原結合コンストラクトまたは組成物を、処置を要する領域に局所的に投与することが望ましく、これは、例えば、非限定的に、術中の局所注入、例えば術後の、創傷被覆材と併用した局所塗布、注射、カテーテル手段、坐剤手段、またはｓｉａｌａｓｔｉｃメンブレン若しくは繊維のようなメンブレンを含め多孔質材料、非多孔質材料またはゲル状材料のインプラント手段により達成され得る。好ましくは、本明細書に記載の抗体などのタンパク質を投与する場合、タンパク質が吸収しない材料を使用するよう注意が必要である。
別の実施形態では、抗原結合コンストラクトまたは組成物は、小胞、特にリポソームに入れて送達可能である（Ｌａｎｇｅｒ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７−１５３３（１９９０）；Ｔｒｅａｔ ｅｔ ａｌ．， ｉｎ Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ， Ｌｏｐｅｚ−Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｆｉｄｌｅｒ（ｅｄｓ．）， Ｌｉｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、３５３〜３６５頁（１９８９）；Ｌｏｐｅｚ−Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ，同書，ｐｐ．３１７〜３２７；及び、同書全般を参照のこと）
さらに別の実施形態では、抗原結合コンストラクトまたは組成物は、放出制御システムで送達可能である。一実施形態では、ポンプが使用され得る（Ｌａｎｇｅｒ，前掲；Ｓｅｆｔｏｎ， ＣＲＣ Ｃｒｉｔ．Ｒｅｆ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．１４：２０１（１９８７）；Ｂｕｃｈｗａｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｓｕｒｇｅｒｙ ８８：５０７（１９８０）；Ｓａｕｄｅｋ ｅｔ ａｌ．， Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２１：５７４（１９８９）を参照のこと）。別の実施形態では、高分子物質を使用できる（Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ， Ｌａｎｇｅｒ ａｎｄ Ｗｉｓｅ（ｅｄｓ．）， ＣＲＣ Ｐｒｅｓ．， Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ， Ｆｌａ． （１９７４）；Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｒｕｇ Ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ， Ｄｒｕｇ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ， Ｓｍｏｌｅｎ ａｎｄ Ｂａｌｌ（ｅｄｓ．）， Ｗｉｌｅｙ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９８４）；Ｒａｎｇｅｒ ａｎｄ Ｐｅｐｐａｓ， Ｊ．，Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｓｃｉ．Ｒｅｖ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３：６１（１９８３）を参照のこと；Ｌｅｖｙ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２８：１９０（１９８５）；Ｄｕｒｉｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．２５：３５１（１９８９）；Ｈｏｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．７１：１０５（１９８９）も参照のこと）。さらに別の実施形態では、放出制御システムを治療の標的、例えば、脳の近傍に配置して、必要全身用量を少なくすることができる（例えば、Ｇｏｏｄｓｏｎ， ｉｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，前掲，ｖｏｌ．２，ｐｐ．１１５−１３８（１９８４）を参照のこと）。
本明細書に記載の抗原結合コンストラクトをコードする核酸を含む特定の実施形態では、かかる核酸をインビボ投与し、そのコードされたタンパク質の発現を促進することができ、これは、例えば、レトロウイルスベクターの使用により（米国特許第４，９８０，２８６号を参照のこと）、細胞内に取り込まれるよう適切な核酸発現ベクターの一部として核酸を構築し投与すること、または直接注射すること、または、微粒子の撃ち込み（例えば、遺伝子銃；Ｄｕｐｏｎｔ社Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ）または脂質若しくは細胞表面受容体または形質移入薬剤でコーティングすること、または細胞核に入り込むことが知られているホメオボックス様ペプチドに結合させて投与すること（例えば、Ｊｏｌｉｏｔ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８８：１８６４−１８６８（１９９１）を参照のこと）等により可能である。別法として、核酸を細胞内に導入し、相同組換えにより宿主細胞ＤＮＡ内に組み込んで発現させることができる。
ある実施形態では、本明細書に記載する、単一アームの一価抗原結合コンストラクトを、結合標的エピトープが重複しない、別の単一アームの一価抗体または多価抗体との組み合わせとして投与する。
本明細書では医薬組成物も提供される。このような組成物は、治療有効量の化合物、及び薬学的に許容される担体を含む。特定の実施形態では、用語「薬学的に許容される」は、動物での使用、より具体的にはヒトでの使用について、連邦政府または州政府の規制当局により承認されている、または米国薬局方または一般に認識されている他の薬局方に掲載されていることを意味する。用語「担体」とは、共に治療薬が投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤、またはビヒクルをいう。このような医薬担体は、ピーナッツ油、ダイズ油、鉱油、ゴマ油等のような石油由来、動物由来、植物由来または合成由来のものを含めた水及び油などの無菌液であり得る。水は、医薬組成物を静脈内投与する場合に好ましい担体である。生理食塩水及び水溶性ブドウ糖及びグリセロール溶液も、特に、注射液用の液状担体として使用できる。好適な医薬賦形剤には、デンプン、グルコース、ラクトース、ショ糖、ゼラチン、麦芽、米、小麦、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどが挙げられる。組成物には、必要に応じ、少量の湿潤剤若しくは乳化剤、またはｐＨ緩衝剤を含有させることもできる。これらの組成物は、溶液、懸濁液、エマルジョン、錠剤、丸剤、カプセル、粉末、徐放性製剤等の形態をとり得る。組成物は、トリグリセリド類などの従来の結合剤及び担体と共に坐剤として製剤化可能である。経口製剤には、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウム等のような標準的担体を挙げることができる。好適な医薬担体の例は、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎ著「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」に記載されている。このような組成物には、患者に適切に投与するための形態を提供するため、治療有効量の化合物が、好ましくは精製された形態で、好適量の担体と共に含有されることとなる。製剤は投与方法に適していなければならない。
ある実施形態では、抗原結合コンストラクトを含む組成物をヒトへの静脈内投与に適した医薬組成物として常套的手順に従って製剤化する。典型的には、静脈内投与用組成物は、無菌の等張水性緩衝液に溶解させた溶液である。必要な場合には、組成物に、可溶化剤及び注射部位の痛みを和らげるためのリグノカインなどの局所麻酔薬を含めてもよい。一般に、成分は、例えば、活性薬剤量が表記されたアンプルまたは小袋のような密封容器内に凍結乾燥粉末または無水濃縮物として、単位剤形にして別々に、または混合された状態で供給される。組成物を注入により投与する場合、無菌の医薬品グレードの水または生理食塩水を含有する注入ボトルで調合することができる。組成物を注射で投与する場合、成分を投与前に混合できるよう注射用滅菌水または生理食塩水のアンプルが提供され得る。
ある実施形態では、本明細書に記載の組成物を中性または塩の形態として製剤化する．薬学的に許容される塩類には、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸等に由来する陰イオンのような陰イオンで形成される塩類、及びナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化鉄（ＩＩＩ）イソプロピルアミン（ｆｅｒｒｉｃ ｈｙｄｒｏｘｉｄｅ ｉｓｏｐｒｏｐｙｌａｍｉｎｅ）、トリエチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカイン等に由来する陽イオンのような陽イオンで形成される塩類が含まれる。
治療用タンパク質の異常な発現及び／または活性に関連した、疾患若しくは障害の治療、阻害及び予防に有効となる、本明細書に記載の組成物量は、標準的な臨床技術により決定され得る。さらに、至適用量範囲を同定するための一助として、インビトロ試験法を任意選択で使用してよい。製剤に使用する正確な用量もまた、投与経路、及び疾患または障害の重篤性に左右されることになり、医師の判断及び各患者の状況にしたがって決定されるべきである。有効用量は、インビトロまたは動物モデルの試験系に由来する用量−反応曲線から外挿する。
本明細書に記載の抗原結合コンストラクトは、単独または他の種類の治療（例えば、放射線療法、化学療法、ホルモン療法、免疫療法及び抗腫瘍薬）と併用して投与され得る。一般に、患者と同一種である種由来または種反応性（抗体の場合）の製品の投与が好ましい。したがって、一実施形態では、ヒト抗体、断片誘導体、類似体、または核酸を、ヒト患者に治療または予防のために投与する。
ポリペプチド及び核酸
本明細書に記載の方法では、核酸によりコードされるポリペプチドを含む単離された抗原結合コンストラクトが使用される。
用語「単離された」を核酸またはタンパク質に使用する場合、核酸またはタンパク質が、それが天然状態で会合している細胞成分の少なくとも一部を含まないこと、または、核酸またはタンパク質が、それがインビボまたはインビトロで産生される濃度よりも高いレベルまで濃縮されていることを意味する。それは、均一な状態であり得る。単離された物質は、乾燥若しくは半乾燥状態、または水溶液など、これに限定されない溶液中のいずれでもよい。それは、さらなる薬学的に許容される担体及び／または賦形剤を含む医薬組成物の成分であり得る。純度及び均一性は、典型的に、ポリアクリルアミドゲル電気泳動または高速液体クロマトグラフィーなどの分析化学技術を使用して測定される。調製物中に含まれる主な種であるタンパク質は実質的に精製されている。特に、単離された遺伝子は、その遺伝子に隣接しタンパク質をコードする、対象遺伝子以外のオープンリーディングフレームから分離される．用語「精製された」は、核酸またはタンパク質が電気泳動ゲルで実質的に１本のバンドになることを意味する。特に、核酸またはタンパク質が少なくとも８５％純粋である、少なくとも９０％純粋である、少なくとも９５％純粋である、少なくとも９９％以上純粋であることを意味し得る。
用語「核酸」とは、一本鎖または二本鎖いずれの形態でも、デオキシリボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオシド、リボヌクレオシド、またはリボヌクレオチド及びそのポリマーをいう。具体的に限定しない限り、かかる用語には、参照核酸と同様の結合特性を有し、天然に生じるヌクレオチドと同様の方法で代謝される既知の天然ヌクレオチド類似体を含有する核酸が包含される。特に具体的に限定しない限り、かかる用語は、ＰＮＡ（ペプチド核酸）などのオリゴヌクレオチド類似体、アンチセンス技術で使用するＤＮＡ類似体（ホスホロチオエート、ホスホルアミダート等）も指す。特に明記しない限り、特定の核酸配列にも、その保存的に修飾された変異体（縮重コドンの置換を含むがこれに限定されない）及び相補配列、並びに、明示される配列が暗黙のうちに包含される。具体的には、縮重コドンの置換は、選択した１つまたはそれ以上（またはすべて）のコドンの３番目が混合塩基及び／またはデオキシイノシン残基で置換された配列を生成することにより達成され得る（Ｂａｔｚｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１９：５０８１（１９９１）；Ｏｈｔｓｕｋａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２６０：２６０５−２６０８（１９８５）；Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｐｒｏｂｅｓ ８：９１−９８（１９９４））。
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」は、本明細書では同じ意味で使用されアミノ酸残基のポリマーを意味する。すなわち、ポリペプチドを対象とする記載は、ペプチドの記載及びタンパク質の記載についても同等に適用され、その逆も同様である。かかる用語は、天然に生じるアミノ酸ポリマー並びに１つまたはそれ以上のアミノ酸残基が人工的にコードされたアミノ酸であるアミノ酸ポリマーにも適用される。本発明において、かかる用語には、アミノ酸残基がペプチド共有結合により結合している、完全長タンパク質などあらゆる長さのアミノ酸鎖が包含される。
用語「アミノ酸」とは、天然に生じるアミノ酸及び天然には生じないアミノ酸、並びに天然に生じるアミノ酸と同様の方法で機能するアミノ酸類似体及びアミノ酸模倣体をいう。天然にコードされるアミノ酸は、２０の共通アミノ酸（アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、及びバリン）及びピロリシン及びセレノシステインである。アミノ酸類似体とは、天然に生じるアミノ酸と基本化学構造体が同一である、すなわち、α炭素に水素、カルボキシル基、アミノ基、及びホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムなどのＲ基が結合している化合物をいう。このような類似体は、修飾されたＲ基（ノルロイシンなど）または修飾ペプチド骨格を有するが、天然に生じるアミノ酸と同一の基本化学構造体を維持している。アミノ酸には、例えば、天然に生じるタンパク質構成Ｌ−アミノ酸；Ｄ−アミノ酸、アミノ酸変異体及びアミノ酸誘導体のような化学的に修飾したアミノ酸；β−アラニン、オルニチン等のような天然に生じる非タンパク質構成アミノ酸；及び当技術分野でアミノ酸の特徴として知られる特性を有する化学的合成した化合物が含まれる。天然には生じないアミノ酸の例には、α−メチルアミノ酸（例えば、α−メチルアラニン）、Ｄ−アミノ酸、ヒスチジン様アミノ酸（例えば、２−アミノ−ヒスチジン、β−ヒドロキシ−ヒスチジン、ホモヒスチジン）、側鎖に余分のメチレンを有するアミノ酸（「ホモ」アミノ酸）、及び側鎖のカルボン酸官能基がスルホン酸基で置換されているアミノ酸（例えば、システイン酸）が挙げられるが、これに限定されるものではない。非天然型合成アミノ酸、置換アミノ酸、または１つ若しくはそれ以上のＤ−アミノ酸などの非天然型アミノ酸を、本発明のタンパク質に組み込むことは、多数の異なる方法において有利である。Ｄ−アミノ酸含有ペプチド等は、インビトロまたはインビボで、Ｌ−アミノ酸含有ペプチドに比べ高い安定性を示す。したがって、Ｄ−アミノ酸を組み込むペプチド等の構築は、高い細胞内安定性が所望または要求される場合には特に有用であり得る。より具体的には、Ｄ−ペプチド等は内因性のペプチダーゼ類及びプロテアーゼ類に耐性があるため、分子の生物学的利用能の改善、インビボでの寿命延長が望ましいとされる場合にはそれらが得られる。その上、Ｄ−ペプチド等は、ヘルパーＴ細胞に対して主要組織適合性複合体クラスＩＩ拘束性に提示されるための、効率的なプロセッシングを受けることができないため、生物体全体において液性免疫応答を誘導しにくいと考えられる。
アミノ酸は、本明細書では、一般に公知の３文字表記で、またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名委員会（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ）推奨の１文字表記で言及され得る。同様に、ヌクレオチドは、それらに対して一般に認められている１文字表記で言及され得る。
「保存的に修飾された変異体」はアミノ酸及び核酸配列の双方に適用される。特定の核酸配列に関する場合、「保存的に修飾された変異体」とは、同一または本質的に同一なアミノ酸配列をコードする核酸を指し、または、核酸がアミノ酸配列をコードしない場合は、本質的に同一な配列を指す。遺伝暗号の縮重のため、機能的に同一な多数の核酸が任意の所与のタンパク質をコードする。例えば、コドンのＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ及びＧＣＵはいずれもアラニンというアミノ酸をコードする。したがって、コドンでアラニンが指定されているあらゆる位置で、そのコドンを、コードされるポリペプチドを改変せずに対応する任意の記載コドンに改変することができる。このような核酸の変異は「サイレント変異」であり、保存的に修飾された変異の一種である。一ポリペプチドをコードする本明細書の核酸配列の各々は、核酸のあらゆる可能なサイレント変異も表す。当業者は、核酸内の各コドン（ただし、通常はメチオニンの唯一のコドンであるＡＵＧ、及び、通常はトリプトファンの唯一のコドンであるＴＧＧを除く）を修飾して機能的に同一な分子を得ることができることを認識するであろう。したがって、ポリペプチドをコードする核酸の各サイレント変異が各記載配列に含まれる。
アミノ酸配列に関しては、核酸、ペプチド、ポリペプチド、若しくはタンパク質の配列に対し、単一アミノ酸若しくはコードされた配列のうち少量の割合のアミノ酸を改変、付加または欠失させる個々の置換、欠失または付加は、その改変によりあるアミノ酸が欠失する、あるアミノ酸が付加される、またはあるアミノ酸が化学的に類似のアミノ酸に置換される場合は「保存的に修飾された変異体」であることを当業者は認識するであろう。機能的に類似のアミノ酸が記載された保存的置換の表は、当業者に公知である。このような保存的に修飾された変異体は、本明細書に記載の多形変異体、種間の相同体、及び対立遺伝子への追加であって除外ではない。
機能的に類似のアミノ酸が記載された保存的置換の表は当業者に公知である。以下の各８群には、互いに保存的置換であるアミノ酸が含まれている：１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；４）アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）；５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；６）フェニルアラニン（Ｌ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；７）セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）；及び［０１３９］ ８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ， Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ（Ｗ Ｈ Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．；２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｄｅｃｅｍｂｅｒ １９９３）を参照のこと））。
２つまたはそれ以上の核酸またはポリペプチド配列の文脈において、用語「同一な」またはパーセントの「同一性」とは、同一である２つまたはそれ以上の配列若しくはサブ配列を意味する。以下の配列比較アルゴリズムの１つ（または当業者が入手可能な他のアルゴリズム）を使用した測定で、比較枠（ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｗｉｎｄｏｗ）または指定領域上で最大一致度について比較及びアライメントを行った場合、または手作業でアライメントし目視確認した場合に、アミノ酸残基またはヌクレオチドの割合が同じ（すなわち、特定領域にわたり、約６０％の同一性、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、または約９５％の同一性）であれば、配列は「実質的に同一」である。この定義は、試験配列の相補体も指す。同一性は、長さが少なくとも約５０アミノ酸またはヌクレオチドである領域にわたって、または長さが７５〜１００アミノ酸またはヌクレオチドである領域にわたって、または、ポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列全体を通して特定されていない場所に存在し得る。ヒト以外の種に由来する相同体を含め、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、本明細書に記載のポリヌクレオチド配列またはその断片を有する標識プローブを用いてストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でライブラリーをスクリーニングする工程、及び前述のポリヌクレオチド配列を含む完全長ｃＤＮＡ及びゲノムクローンを単離する工程を含む処理により得られる。このようなハイブリダイゼーション技術は当業者に周知である。
配列比較の場合、典型的に１つの配列を参照配列とし、それに対して試験配列を比較する。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験配列と参照配列をコンピュータに入力し、必要に応じてサブ配列の座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムのパラメータを指定する。デフォルトのプログラムパラメータを使用でき、または別のパラメータを指定することもできる。その後、配列比較アルゴリズムにより、参照配列に対する試験配列の配列同一性パーセントがプログラムパラメータに基づいて計算される。
本発明において「比較枠（ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｗｉｎｄｏｗ）」には、２０〜６００、通常約５０〜約２００、より一般的には約１００〜約１５０からなる群から選択される連続位置番号のいずれか１つの位置のセグメントに対する参照が含まれ、比較対象配列及びそれと同じ連続位置番号のリファレンス配列を最適にアライメントしてから２配列の比較を行ってよい。比較のための配列アライメント方法は当業者に公知である。比較のための最適な配列アライメントは、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ （１９７０）Ａｄｖ． Ａｐｐｌ． Ｍａｔｈ．２：４８２ｃの局所相同性アルゴリズムによるもの、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ （１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３の相同性アライメントアルゴリズムによるもの、Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ（１９８８）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ'ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：２４４４の類似性検索法によるもの、これらのアルゴリズム実装コンピュータ（ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡ：Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ， Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ， ５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）によるもの、または手作業でのアライメントと目視検査によるもの（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９５補遺）を参照のこと）を含むが、これらに限定されずに実施可能である。
配列同一性及び配列類似性のパーセント測定に好適なアルゴリズムの一例は、ＢＬＡＳＴ及びＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムであり、それぞれ、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｎｕｃ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２、及びＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０に記載されている。ＢＬＡＳＴ解析実行用ソフトウェアは、国立生物工学情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）に公開されておりｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖで入手可能である。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータのＷ、Ｔ、及びＸで、アライメントの感度及び速度が決まる。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列の場合）では、ワード長（Ｗ）１１、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４及び両鎖比較がデフォルトで使用される。アミノ酸配列の場合、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、ワード長３、及び期待値（Ｅ）１０をデフォルトで使用し、ＢＬＯＳＵＭ６２スコア行列（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ａｎｄ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：１０９１５を参照のこと）はアライメント（Ｂ）５０、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、及び両鎖比較をデフォルトで使用する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムは典型的に「低複雑度」フィルターを外して実施する。
ＢＬＡＳＴアルゴリズムでは、２配列間の類似性の統計解析も実施される（例えば、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ （１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：５８７３−５７８７を参照のこと）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって得られる類似性の１つの基準は最小和確率（ｓｍａｌｌｅｓｔ ｓｕｍ ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ）（Ｐ（Ｎ））であり、ヌクレオチドまたはアミノ酸の２つの配列間の一致が偶然に起こる確率の指標が得られる。例えば、核酸が参照配列に類似すると見なされるのは、被験核酸と参照核酸との比較で最小和確率（ｓｍａｌｌｅｓｔ ｓｕｍ ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ）が約０．２未満、または約０．０１未満、または約０．００１未満の場合である。
語句「に選択的に（または特異的に）ハイブリッド形成する」とは、特定のヌクレオチド配列が複合混合体（全細胞性またはライブラリーのＤＮＡまたはＲＮＡを含むがこれらに限定されない）に存在している場合に、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で分子がその特定ヌクレオチド配列に対してのみ結合、二重鎖形成（ｄｕｐｌｅｘｉｎｇ）、またはハイブリッド形成することを指す。
語句「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」とは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、または他の核酸、またはそれらの組み合わせの配列のハイブリダイゼーションを、当技術分野で公知のように低イオン強度及び高温という条件下で行うこと指す。典型的に、ストリンジェントな条件下では、プローブは、核酸の複合混合体中のその標的サブ配列とはハイブリッド形成するが（全細胞性若しくはライブラリーのＤＮＡまたはＲＮＡを含むがこれらに限定されない）、複合混合体中の他の配列とはハイブリッド形成をしない。ストリンジェントな条件は配列依存的であり、状況が異なれば条件は異なってくる。配列が長いほど、より高温で特異的にハイブリッド形成する。核酸のハイブリダイゼーションに関する広範なガイドは、Ｔｉｊｓｓｅｎ， Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ-Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ｐｒｏｂｅｓ， "Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ａｓｓａｙｓ"（１９９３）に記載されている。
本明細書で使用する用語「修飾された」とは、ポリペプチドの長さ、アミノ酸配列、化学的構造体に対する変更、ポリペプチドの共翻訳修飾、またはポリペプチドの翻訳後修飾のような、所与のポリペプチドに行われるあらゆる変更をいう。「（修飾された）」という形になっている場合、用語は、そこで述べているポリペプチドは任意選択で修飾される、すなわち、そこで述べているポリペプチドは、修飾されてもよいし、または修飾されなくてもよいことを意味する。
用語「翻訳後修飾された」とは、天然または非天然型アミノ酸がポリペプチド鎖に組み込まれた後に、かかる天然または非天然型のアミノ酸に対して行われるあらゆる修飾を指す。かかる用語には、あくまでも例示のためであるが、インビボの共翻訳修飾、インビトロの共翻訳修飾（無細胞翻訳系など）、インビボの翻訳後修飾、及びインビトロの翻訳後修飾が包含される。
提供されるのは、翻訳中または翻訳後に差別的な修飾を受ける、例えば、公知の保護基／ブロッキング基、タンパク質分解開裂、抗体分子または他の細胞リガンド等への結合によるグリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、誘導体化を受ける抗原結合コンストラクトである。多数ある化学的修飾のいずれの修飾も、臭化シアン、トリプシン、キモトリプシン、パパイン、Ｖ８プロテアーゼ、ＮａＢＨ４による特異的な化学的開裂；アセチル化、ホルミル化、酸化、還元；ツニカマイシン存在下の代謝合成等を含むがこれらに限定されない公知の技術により行われ得る。
本明細書に包含されるさらなる翻訳後修飾には、例えば、原核生物の宿主細胞に発現した結果としての、Ｎ結合またはＯ結合した炭水化物鎖（Ｎ末端またはＣ末端のプロセッシング）、アミノ酸骨格への化学部分の付加、Ｎ結合またはＯ結合した炭水化物鎖の化学的修飾、及びＮ末端メチオニン残基の付加または欠失が挙げられる。タンパク質を検出及び単離できるよう、抗原結合コンストラクトを酵素標識、蛍光標識、同位体標識、またはアフィニティ標識のような検出可能な標識で修飾する。好適な酵素の例には、西洋わさびペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、βガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼが含まれ；好適な補欠分子族複合体の例には、ストレプトアビジン・ビオチン及びアビジン／ビオチンが含まれ；好適な蛍光物質の例には、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン（ｄｉｃｈｌｏｒｏｔｒｉａｚｉｎｙｌａｍｉｎｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）、ダンシルクロリドまたはフィコエリスリンが含まれ；発光物質の例には、ルミノール；生物発光物質の例には、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、及びエクオリンが含まれ；また、好適な放射性物質の例には、ヨウ素、炭素、硫黄、トリチウム、インジウム、テクネチウム、タリウム、ガリウム、パラジウム、モリブデン、キセノン、フッ素が含まれる。
本明細書ではさまざまな刊行物が引用しているが、それらの開示内容は、参照によりその全体が組み入れられたものとする。
本発明は、特定のプロトコルに限定されるものではなく、したがって本明細書に記載の細胞株、コンストラクト、及び試薬は異なり得ることを理解されるべきである。本明細書で使用する用語はあくまでも個々の実施形態を説明するためのものであって、本発明の範囲を限定することは意図されず、添付の請求の範囲によってのみ限定されることも理解されるべきである。
特に明記しない限り、本明細書で使用する技術用語及び科学用語はいずれも、本発明の属する分野の当業者に共通して理解される意味と同一の意味を持つ。本明細書に記載の方法、装置、及び材料と類似または等価なあらゆるものを使用して本明細書の記載内容の実施または試験が可能であるが、その好ましい方法、装置及び材料をここに記載する。
本明細書で言及したすべての刊行物及び特許は、例えば、刊行物に記載されるコンストラクト及び方法の説明及び開示を目的として参照により本明細書に組み込まれ、それらは本願記載の発明と関連してその使用が考えられる。本明細書で論じる刊行物は、本出願の出願日前の関連技術の開示のみを目的として提供されるものである。本明細書のいかなる記載も、本発明者らが先行発明を理由として、または他のいかなる理由によっても、かかる開示に先行する権利がないことを承認するものと解釈すべきではない。
参考文献：
Figure 2017504564
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以下は、本発明を実施するための具体的な実施形態例である。実施例は、あくまで事例を提供するにすぎず、本発明の範囲を何ら限定するものではない。使用する数字（例えば、量、温度など）に関し、正確さを保証する努力がなされたが、一部の実験上の誤差及び偏差は当然許容されるべきである。
本発明の実施には、特に明記しない限り、当技術分野の技術の範囲内であるタンパク質化学、生化学、組換えＤＮＡ技術及び薬理学の従来方法が使用される。そのような技術は文献に十分に説明されている。例えば、Ｔ．Ｅ． Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ， Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ（Ｗ．Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ， １９９３）；Ａ．Ｌ． Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ （Ｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， Ｉｎｃ．， ｃｕｒｒｅｎｔ ａｄｄｉｔｉｏｎ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ， ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ、１９８９）；Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｓ． Ｃｏｌｏｗｉｃｋ ａｎｄ Ｎ．Ｋａｐｌａｎ ｅｄｓ．， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．）；Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， １８ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ （Ｅａｓｔｏｎ， Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ：Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ， １９９０）；Ｃａｒｅｙ ａｎｄ Ｓｕｎｄｂｅｒｇ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３ｒｄ Ｅｄ． （Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ） Ｖｏｌｓ Ａ ａｎｄ Ｂ（１９９２）を参照のこと。
実施例で使用する試薬は、一般に市販されているか、当技術分野で公知の市販の計測器、方法、または試薬を使用して調製可能である。上述の各例は本明細書に記載の多種多様な態様及び本明細書に記載の方法の実施について例示している。各例で、本明細書に記載の多数の異なる実施形態についての記載を網羅しているわけではない。したがって、上述の発明は、明瞭な理解を目的とした説明及び実施例で一部が詳述されてはいるが、添付の請求の範囲の趣旨および範囲から逸脱することなく多くの変更及び修正を行うことが可能であることを当業者は容易に理解するであろう。
実施例１：単一アーム（ＯＡ）抗ＨＥＲ２抗体及び対照群の調製
多数の一価抗ＨＥＲ２抗体及び対照群を以下に記載のように調製した。図１は、各種ＯＡ抗体フォーマットの概略図を示す。図１Ａは、二価の単一特異性全長抗体の構造を示し、軽鎖は白で示され、重鎖のＦａｂ部分は斜線で示され、重鎖のＦｃ部分は灰色で示されている。図１Ｂは、抗原結合ドメインがＦａｂフォーマットである一価単一特異性ＯＡの２つの型を示す。これらのいずれの型においても、軽鎖は白色で示され、重鎖のＦａｂ部分は斜線で示されている。鎖ＡのＦｃ部分は灰色であり、鎖ＢのＦｃ部分は黒色である。左の型では、Ｆａｂは鎖Ａに融合しており、右の型では、Ｆａｂは鎖Ｂに融合している。図１Ｃは、抗原結合ドメインがｓｃＦｖフォーマットであるＯＡの２つの型を示す。これらのいずれの型においても、軽鎖（ＶＬ）の可変ドメインは白色で示され、重鎖（ＶＨ）の可変ドメインは斜線で示されている。鎖ＡのＦｃ部分は灰色であり、鎖ＢのＦｃ部分は黒色である。左の型では、ｓｃＦｖは鎖Ａに融合しており、右の型では、ｓｃＦｖは鎖Ｂに融合している。図１Ｂまたは図１Ｃに記載のフォーマットにある多数のＯＡ抗ＨＥＲ２抗体を以下に及び実施例１７に記載のように調製した。
例示的な抗ＨＥＲ２一価抗体（単一アーム抗体（Ｏｎｅ−ａｒｍｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ）、ＯＡＡ）：
ｖ１０４０：一価抗ＨＥＲ２抗体。ＨＥＲ２結合ドメインは鎖Ａ上のトラスツズマブ由来のＦａｂであり、Ｆｃ領域は、鎖Ａ内に変異Ｔ３５０Ｖ＿Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖを、鎖Ｂ内に変異Ｔ３５０Ｖ＿Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｌ＿Ｔ３９４Ｗを有するヘテロ二量体であり、鎖Ｂのヒンジ領域に変異Ｃ２２６Ｓを有する。抗原結合ドメインはＨＥＲ２のドメイン４に結合する。重鎖Ａ、軽鎖、及び重鎖ＢのＤＮＡ配列はそれぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５に示される。重鎖Ａ、軽鎖、及び重鎖Ｂのアミノ酸配列はそれぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４、及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６に示される。
ｖ４１８２：一価抗ＨＥＲ２抗体。ＨＥＲ２結合ドメインは鎖Ａ上のペルツズマブ由来のＦａｂであり、Ｆｃ領域は鎖Ａ内に変異Ｔ３５０Ｖ＿Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖを、鎖Ｂ内に変異Ｔ３５０Ｖ＿Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｌ＿Ｔ３９４Ｗを有するヘテロ二量体であり、鎖Ｂのヒンジ領域に変異Ｃ２２６Ｓを有する。抗原結合ドメインはＨＥＲ２のドメイン２に結合する。
対照用抗ＨＥＲ２二価抗体（全長抗体（ｆｕｌｌ−ｓｉｚｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ）、ＦＳＡ）
ｖ５０６は、対照として、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞で自作した野生型の抗ＨＥＲ２である。ＨＥＲ２結合ドメインは双方ともトラスツズマブ由来のＦａｂフォーマットであり、Ｆｃは野生型ホモ二量体である。抗原結合ドメインはＨＥＲ２のドメイン４に結合する。この抗体はトラスツズマブ類似体とも呼ばれる。
ｖ７９２はＩｇＧ１ヒンジを有する野生型トラスツズマブである。ＨＥＲ２結合ドメインは双方ともトラスツズマブ由来のＦａｂフォーマットであり、Ｆｃ領域は鎖Ａ内に変異Ｔ３５０Ｖ＿Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖを、鎖Ｂ内に変異Ｔ３５０Ｖ＿Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｌ＿Ｔ３９４Ｗを有するヘテロ二量体である。抗原結合ドメインはＨＥＲ２のドメイン４に結合する。この抗体はトラスツズマブ類似体とも呼ばれる。
ｖ４１８４：二価抗ＨＥＲ２抗体。ＨＥＲ２結合ドメインは双方ともペルツズマブ由来のＦａｂフォーマットであり、Ｆｃ領域は鎖Ａ内に変異Ｆ３５１Ｙ＿Ｓ４００Ｅ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖを、鎖Ｂ内に変異Ｔ３６６Ｉ＿Ｎ３９０Ｒ＿Ｋ３９２Ｍ＿Ｔ３９４Ｗを有するヘテロ二量体である。抗原結合ドメインはＨＥＲ２のドメイン２に結合する。この抗体はペルツズマブ類似体とも呼ばれる。
ｈＩｇＧは市販の非特異的ポリクローナル抗体対照である（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、＃００９−０００−００３）。
各変異体に対応する関連するアミノ酸配列とＤＮＡ配列を表１に示す。
（表１）
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これらの抗体及び対照をクローニングし以下のように発現させた。ヒト／哺乳類での発現用に至適化したコドンを使用した遺伝子合成により、抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子を構築した。トラスツズマブＦａｂ配列を公知のＨＥＲ２／ｎｅｕドメイン４結合抗体（Ｃａｒｔｅｒ Ｐ． ｅｔ ａｌ． （１９９２） Ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ａｎｔｉ ｐ１８５ ｈｅｒ２ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｏｒ ｈｕｍａｎ ｃａｎｃｅｒ ｔｈｅｒａｐｙ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ８９， ４２８５）から生成した。ＦｃはＩｇＧ１アイソタイプであった。ペルツズマブＦａｂ配列を公知のＨＥＲ２／ｎｅｕドメイン２結合抗体（Ａｄａｍｓ ＣＷ ｅｔ ａｌ． （２００６） Ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｏ ｐｒｏｄｕｃｅ ａ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ＨＥＲ２ ｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ， Ｐｅｒｔｕｚｕｍａｂ． Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ． ２００６：５５(６）：７１７−２７）から生成した。
最終遺伝子産物を、哺乳類用発現ベクターＰＴＴ５（ＮＲＣ−ＢＲＩ、Ｃａｎａｄａ）にサブクローニングし、ＣＨＯ細胞において発現させた（Ｄｕｒｏｃｈｅｒ， Ｙ．， Ｐｅｒｒｅｔ， Ｓ． ＆ Ｋａｍｅｎ， Ａ． Ｈｉｇｈ−ｌｅｖｅｌ ａｎｄ ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ−ｇｒｏｗｉｎｇ ＣＨＯ ｃｅｌｌｓ． Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ｒｅｓｅａｒｃｈ ３０， ｅ９ （２００２））。
ＣＨＯ細胞を、対数増殖期（１５０〜２００万細胞／ｍｌ）に、２５ｋＤａの水溶性ポリエチレンイミン１ｍｇ／ｍｌ（ＰＥＩ， ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ）をＰＥＩ：ＤＮＡ比２．５：１で用いてトランスフェクションした（Ｒａｙｍｏｎｄ Ｃ． ｅｔ ａｌ． Ａ ｓｉｍｐｌｉｆｉｅｄ ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｓｓ ｆｏｒ ｌａｒｇｅ−ｓｃａｌｅ ａｎｄ ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ． Ｍｅｔｈｏｄｓ．５５（１）：４４−５１（２０１１））。ヘテロ二量体の形成に至適な濃度範囲を測定するため、ヘテロ二量体形成を可能にする、重鎖Ａ（ＨＣ−Ａ）、軽鎖（ＬＣ）、及び重鎖Ｂ（ＨＣ−Ｂ）の至適なＤＮＡ比でＤＮＡをトランスフェクションした（例えば、ＨＣ−Ａ／ＨＣ−Ｂ／ＬＣ比＝３０：３０：４０（ｖ１０４０またはｖ４１８２））。トランスフェクションした細胞は５〜６日後に、培地を４０００ｒｐｍにて遠心分離した後に回収し、０．４５μｍフィルターを使用して清澄化して、回収した。
清澄化した培地をＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）ＳｕＲｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）プロテインＡカラムに添加し、１０カラム体積のＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．２）で洗浄した。抗体を、１０カラム体積のクエン酸緩衝液（ｐＨ３．６）で溶出させ、抗体を含有するプール画分をｐＨ１１のトリスで中和した。
プロテインＡ抗体溶出液をゲルろ過（ＳＥＣ）でさらに精製した。ゲルろ過では、３．５ｍｇの抗体混合物を１．５ｍＬまで濃縮し、ＡＫＴＡ Ｅｘｐｒｅｓｓ ＦＰＬＣにより流速１ｍＬ／分でＳｅｐｈａｄｅｘ ２００ ＨｉＬｏａｄ １６／６００ ２００ ｐｇ カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に添加した。ｐＨ７．４のＰＢＳ緩衝液を流速１ｍＬ／分で使用した。精製抗体に相当する画分を採取し、約１ｍｇ／ｍＬまで濃縮した。
実施例２：例示的な抗ＨＥＲ２抗体薬物複合体（ＡＤＣ）の調製
以下の抗ＨＥＲ２抗体薬物複合体を調製した：ｖ６２４６：ｖ５０６とＤＭ１との複合体（Ｔ−ＤＭ１類似体）；ｖ６２４７：ｖ１０４０（ＯＡ−ｔｒａｓ）とＤＭ１との複合体；ｖ６２４８：ｖ４１８２（ＯＡ−ｐｅｒｔ）とＤＭ１との複合体。
これらのＡＤＣは、メイタンシンに直接結合させて調製した。実施例１に記載のようにプロテインＡとＳＥＣとで精製した抗体（純度＞９５％）をＡＤＣ分子の調製に使用した。Ｋｏｖｔｕｎ ＹＶ， Ａｕｄｅｔｔｅ ＣＡ， Ｙｅ Ｙ， ｅｔ ａｌ． Ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｔｏ ｅｒａｄｉｃａｔｅ ｔｕｍｏｒｓ ｗｉｔｈ ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ ａｎｄ ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｔａｒｇｅｔ ａｎｔｉｇｅｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００６；６６：３２１４−２１に記載の方法に従いＡＤＣを結合させた。ＡＤＣは、以下に記載のＬＣ／ＭＳで測定した場合に、１抗体あたり平均モル比２．８〜３．５のメイタンシノイド分子を有していた。
ＡＤＣ複合体化反応に使用した試薬の詳細は、以下の通りである。結合用緩衝液１：５０ｍＭ リン酸カリウム／５０ｍＭ 塩化ナトリウム（ｐＨ６．５）、２ｍＭ ＥＤＴＡ。結合用緩衝液２：５０ｍＭ コハク酸ナトリウム（ｐＨ５．０）。ＡＤＣ製剤緩衝液：２０ｍＭ コハク酸ナトリウム、６％（ｗ／ｖ）トレハロース、０．０２％ポリソルベート２０（ｐＨ５．０）。ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）；ＤＭＡに溶解させた１０ｍＭ ＳＭＣＣ（複合体化する前に調製しておく）、ＤＭＡに溶解させた１０ｍＭ ＤＭ１−ＳＨ（複合体化する前に調製しておく）、ＰＢＳに溶解させた１ｍＭ ＤＴＮＢ、緩衝液に溶解させた１ｍＭ システイン、２０ｍＭ コハク酸ナトリウム（ｐＨ５．０）。ＵＶ−ＶＩＳ分光光度計（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製Ｎａｎｏ ｄｒｏｐ １００）、ＰＤ−１０カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）。
ＡＤＣを以下の通り調製した。２５ｍｌの結合用緩衝液１、続いて０．５ｍｌの結合用緩衝液１で予め平衡化しておいたＰＤ−１０カラムに出発抗体溶液を添加した。抗体溶出液を回収してＡ２８０で濃度測定し、その濃度を２０ｍｇ／ｍＬに調整した。ＤＭＡに溶解させた１０ｍＭ ＳＭＣＣ−ＤＭ１溶液を調製した。抗体に対して７．５モル当量のＳＭＣＣ−ＤＭ１を抗体溶液に加えた後、ＤＭＡを加えて最終ＤＭＡ量を１０ｖ／ｖ％とする。反応物を簡単に混合し、室温で２時間インキュベートした。第２のＰＤ−１０カラムを２５ｍｌの結合用緩衝液１で平衡化し、抗体−ＳＭＣＣ−ＤＭ１溶液をカラムに加えて０．５ｍｌの緩衝液１を入れた。抗体−ＳＭＣＣ−ＤＭ１溶出液を採取し、抗体溶液のＡ２５２及びＡ２８０を測定した。抗体−ＳＭＣＣ−ＤＭ１濃度を計算した（＝１．４５ｍｇ−１ｃｍ−１、または２１７５００Ｍ−１ｃｍ−１）。ＡＤＣを、高分子量分析用のＳＥＣ−ＨＰＬＣカラムで分析した（ＳＥＣ−ＨＰＬＣカラムＴＯＳＯＨ、Ｇ３０００−ＳＷＸＬ、７．８ｍｍ×３０ｃｍ、緩衝液、１００ｍＭ リン酸ナトリウム、３００ｍＭ 塩化ナトリウム、ｐＨ７．０、流速：１ｍｌ／分）。
ＡＤＣの抗体に対する薬物の比（ＤＡＲ）を以下の方法によりＬＣ／ＭＳで測定した。抗体を、ＬＣ−ＭＳに添加する前にＰＮＧａｓＦで脱グリコシル化した。Ａｇｉｌｅｎｔ１１００ Ｓｅｒｉｅｓ ＨＰＬＣで以下の条件下で液体クロマトグラフィーを行った。
流速：１ｍＬ／分からポストカラム型スプリットでＭＳへ１００ｕＬ／分で送液。溶媒：Ａ＝０．１％蟻酸含有ｄｄＨ２Ｏ、Ｂ＝６５％アセトニトリル、２５％ＴＨＦ、９．９％ｄｄＨ２０、０．１％蟻酸。カラム：２．１×３０ｍｍ ＰｏｒｏｓＲ２。カラム温度：８０℃；溶媒も予熱。勾配：２０％Ｂ（０〜３分）、２０〜９０％Ｂ（３〜６分）、９０〜２０％Ｂ（６〜７分）、２０％Ｂ（７〜９分）
その後、質量分析（ＭＳ）をＬＴＱ−Ｏｒｂｉｔｒａｐ ＸＬ質量分析計で以下の条件下行った：Ｉｏｎ Ｍａｘ Ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙを使用したイオン化法。校正及び同調の方法：ＣｓＩの２ｍｇ／ｍＬ溶液を流速１０μＬ／分で注入した。次いで、Ａｕｔｏｍａｔｉｃ Ｔｕｎｅ自動調節機能を使用してＯｒｂｉｔｒａｐをｍ／ｚ値２２１１に調節する（観察された全体的なＣｓＩイオン範囲：１６９０〜２８００）。コーン電圧：４０Ｖ；チューブレンズ：１１５Ｖ；ＦＴ分解能：７，５００；走査範囲ｍ／ｚ４００〜４０００；走査遅延：１．５分。Ｔｈｅｒｍｏ製Ｐｒｏｍａｓｓ ｄｅｃｏｎｖｏｌｕｔｉｏｎソフトウェアを使用して、得られたデータの分子量プロファイルを生成した。ＤＡＲを計算：Σ（ＤＡＲ×画分ピーク強度）を用いて求めた。
表２は、ＡＤＣ分子の平均ＤＡＲをまとめたものである。ＯＡ抗ＨＥＲ２ ＡＤＣの平均ＤＡＲは約２であり、抗ＨＥＲ２ ＦＳＡの平均ＤＡＲは３．４であった。
（表２）
Figure 2017504564
実施例３：ＦＡＣＳを使用した一価抗ＨＥＲ２抗体及びその組み合わせの細胞表面結合の測定
高レベルのＨＥＲ２を発現している卵巣ＨＥＲ２ ２−３＋（遺伝子増幅）細胞株であるＳＫＯＶ３細胞の表面に結合した一価抗ＨＥＲ２抗体の量を測定するため、以下の実験を実施した。実験を以下の通り行った。
ＳＫＯＶ３細胞表面への被験抗体の結合をフローサイトメトリーにより測定した。細胞を準飽和密度（ｓｕｂｃｏｎｆｌｕｅｎｃｙ）まで増殖させ、ＰＢＳで洗浄し、ＤＭＥＭに１ｘ１０５細胞／１００μｌで再懸濁させた。細胞懸濁液１００μｌを各微量遠沈管に加えた後、１０μｌ／管の抗体変異体を加えた。管を回転装置上で４℃にて２時間インキュベートした。微量遠沈管を２０００ＲＰＭで室温にて２分間遠心分離し、細胞ペレットを培養液５００μｌで洗浄した。各細胞ペレットを、培養液に２μｇ／試料で希釈した蛍光色素標識した二次抗体１００μｌに再懸濁させた。その後、試料を回転装置上で４℃にて１時間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を２０００ｒｐｍで２分間遠心分離し、培養液で洗浄した。細胞を、培養液５００μｌに再懸濁させ、ろ過し、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）５μｌ含有管に移してから、ＢＤ ＬＳＲ ＩＩフローサイトメーターで製造者の指示に従い解析した。パラトープが２つある例示的な抗ＨＥＲ２ヘテロ二量体抗体及び対照抗体のＫＤをＦＡＣＳにより評価し、データ解析及び曲線フィッティングをＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍで実施した。
その結果を図２に示し、下記表３にまとめている。
（表３）
Figure 2017504564
図２及び表２にまとめたデータにあるＦＡＣＳの結合結果から、抗ＨＥＲ２ ＯＡＡ２つの組み合わせ（ｖ１０４０＋ｖ４１８２）は全細胞結合（Ｂｍａｘ）が個々のＯＡＡ（ｖ１０４０、ｖ４１８２）のＢｍａｘ及びＦＳＡの組み合わせ（ｖ５０６＋ｖ４１８４）のＢｍａｘより約１．７倍多く、ＦＳＡ抗体（ｖ５０６）のＢｍａｘより約２．７倍多いことがわかる。見かけのＫＤ値を見ると、抗ＨＥＲ２ ＯＡＡ２つの組み合わせのＫＤはＦＳＡの組み合わせのＫＤより約２倍高く、またＦＳＡ ｖ５０６のＫＤより約１０倍高いことがわかる。
実施例４：共焦点顕微鏡による一価抗ＨＥＲ２抗体及びその組み合わせの細胞表面結合の測定
一価抗ＨＥＲ２抗体及びその組み合わせがＪＩＭＴ−１細胞（トラスツズマブ耐性乳癌細胞株）の表面に結合する能力を、共焦点顕微鏡を使用して測定した。異なる測定時点を通して全細胞結合を可視化するために共焦点顕微鏡を使用した。
ＪＩＭＴ−１細胞を抗体変異体（２００ｎＭ）と共に無血清ＤＭＥＭ中で３７℃にて１時間、３時間、及び１６時間インキュベートした。細胞を、温めた無菌ＰＢＳ（５００ｍｌ／ウェル）で穏やかに２回洗浄した。細胞を１０％ホルマリン／ＰＢＳ溶液２５０ｍｌを用いて室温で１０分間固定させた。ホルマリン溶液を除去し、固定した細胞をＰＢＳ（５００μｌ／ウェル）で３回洗浄した。細胞を、２５０μｌ／ウェルの０．２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００含有ＰＢＳで５分間透過処理し、次いで、５００μｌ／ウェルのＰＢＳで３回洗浄した。５００μｌ／ウェルのＰＢＳ＋５％ヤギ血清を用いて室温で１時間ブロッキングを行った。ブロッキング緩衝液を除去し、二次抗体３００μｌ／ウェルを加え、細胞を室温で１時間インキュベートした。二次抗体を、５００μｌ／ウェルのＰＢＳで３回洗浄して除去した。その後、Ｐｒｏｌｏｎｇ ｇｏｌｄ褪色防止剤（ＤＡＰＩ含有）（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ／製品番号Ｐ３６９３１／ロット番号１３１９４９３）を使用して、固定した細胞を含有しているカバースリップをスライド上に封入した。Ｏｌｙｍｐｕｓ ＦＶ１０００共焦点顕微鏡を使用して６０倍の単一画像を得た。
本実験結果から、ＦＳＡ抗体（ｖ５０６）及びＦＳＡの組み合わせ（ｖ５０６＋ｖ４１８４）は点状の細胞内染色（データ示さず）によって示されるように１時間及び３時間において内部移行したように見られたのに比べ、抗ＨＥＲ２単一アーム抗体２つ（ｖ１０４０＋ｖ４１８２）の組み合わせでは、１時間、３時間及び１６時間（一晩）においてＪＩＭＴ−１細胞表面が濃く染色されたことがわかる。ＯＡＡの組み合わせ（ｖ１０４０＋ｖ４１８２）の表面染色は、いずれの時点においても、個々のＯＡＡ単独（ｖ１０４０またはｖ４１８２）の表面染色より濃かった。ＪＩＭＴ−１細胞の細胞染色共焦点画像は、実施例３に記載の、ＳＫＯＶ３細胞内の抗ＨＥＲ２ ＯＡＡ２つの組み合わせで得た、高い細胞表面修飾（Ｂｍａｘ）データと一致している。
実施例５：一価抗ＨＥＲ２抗体及びその組み合わせの細胞増殖阻害能力
一価抗ＨＥＲ２抗体及びその組み合わせがＳＫＯＶ３細胞及びＢＴ−４７４細胞の増殖を阻害する能力を測定するため、本実験を実施した。先に示したように、ＳＫＯＶ３細胞は卵巣ＨＥＲ２ ２−３＋（遺伝子増幅）細胞株である。ＢＴ−４７４細胞は、ＨＥＲ２ ３＋乳癌細胞株である。実験を以下に記載のように行った。
被験抗体を培養液に希釈し、ＳＫＯＶ３またはＢＴ−４７４細胞に３連で１０μｌ／ウェル（３００ｎＭ）加えた。プレートを３７℃で５日間インキュベートした。ＡｌａｍａｒＢｌｕｅ（商標）（ＢＩＯＳＯＵＲＣＥ ＃ ＤＡＬ １１００）を使用し細胞生存率を測定した。ウェルあたり１０μｌのＡｌａｍａｒＢｌｕｅ（商標）を加え、プレートを３７℃で２時間インキュベートした。５３０／５８０ｎｍの吸光度を読み取った。［対照？］
ＢＴ−４７４細胞の増殖阻害アッセイの結果を図３Ａに記載する。これらの結果から、ｖ１０４０＋ｖ４１８２の組み合わせは、個々のＯＡＡ単独の場合（ｖ１０４０またはｖ４１８２）より高い増殖阻害、ＦＳＡ ｖ５０６と同等の増殖阻害、ＦＳＡの組み合わせ（ｖ５０６＋ｖ４１８４）より低い増殖阻害を媒介することがわかる。
ＳＫＯＶ３細胞での増殖阻害アッセイの結果を図３Ｂに示す。データは、対照ＩｇＧと比較した増殖（％）として報告する。ｖ１０４０とｖ４１８２の組み合わせは、ＳＫＯＶ３においてＦＳＡ ｖ５０６と同等の増殖阻害を有し、ＦＳＡの組み合わせｖ５０６＋ｖ４１８４より優れた増殖阻害を有する。
先のデータでは、一価抗ＨＥＲ２抗体の組み合わせはＨＥＲ２ ３＋乳癌細胞及びＨＥＲ２ ２−３＋卵巣癌細胞の増殖を阻害できることが示されている。しかしながら、検証したＨＥＲ２ ３＋乳癌細胞とＨＥＲ２ ２−３＋卵巣癌細胞とでは観察された増殖阻害レベルには差がある。
実施例６：一価抗ＨＥＲ２抗体及びその組み合わせのＨＥＲ２＋細胞における内部移行能力
ＦＳＡ及び組み合わせと比較した、一価抗ＨＥＲ２抗体及び組み合わせの内部移行する能力を測定するため、本実験を実施した。ＨＥＲ２ ３＋卵巣腫瘍細胞株であるＳＫＯＶ３でアッセイを行った。アッセイを以下の通り行った。
直接導入法を、Ｓｃｈｍｉｄｔ， Ｍ． ｅｔ ａｌ．，Ｋｉｎｅｔｉｃｓ ｏｆ ａｎｔｉ−ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ：ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ａｆｆｉｎｉｔｙ， ｂｉｖａｌｅｎｃｙ， ａｎｄ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ． Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ （２００８） ５７：１８７９−１８９０に詳述されている操作手順にしたがい行った。具体的には、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）４８８ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ａ１０２３５）を使用して製造者の指示書にしたがいながら抗体を直接標識した。
内部移行アッセイでは、１２ウェルプレートに１×１０５細胞／ウェルを播種し、３７℃＋５％ＣＯ２で一晩インキュベートした。翌日、標識した抗体をＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳに２００ｎＭ加え、３７℃＋５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした。暗所条件下、培養液を吸引し、ウェルをＰＢＳ５００μＬで２回洗浄した。細胞を回収するため、細胞解離緩衝液を（２５０μＬ）３７℃で加えた。細胞をペレット化し、ａｎｔｉ−Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８ ウサギＩｇＧ画分（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ａ１１０９４、ロット番号１２１４７１１）５０μｇ／ｍＬを加えて、または加えずに、１００μＬのＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳに再懸濁させ、氷上で３０分間インキュベートした。分析に先立ち、３００μＬのＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳで試料をろ過しヨウ化プロピジウム４μＬを加えた。試料を、ＬＳＲＩＩフローサイトメーターを使用して分析した。
結果は図４に示され、図中、アスタリスク（＊）は蛍光標識された抗体を指し、記載の内部移行効率は、内部移行した標識された抗体量の測定値である（例えば、「ｖ１０４０＊＋ｖ４１８２」の場合、ｖ４１８２存在下で内部移行した標識されたｖ１０４０の量の測定値である）。単一抗体治療剤はすべて２００ｎＭで測定し、組み合わせ治療剤は２００ｎＭ＋２００ｎＭで測定した。結果は、抗ＨＥＲ２ ＯＡＡはいずれもＨＥＲ２ ３＋ ＳＫＯＶ３細胞内に内部移行できることを示している。
実施例７：一価抗ＨＥＲ２抗体及び組み合わせのＨＥＲ２＋細胞におけるＡＤＣＣ媒介能力
一価抗ＨＥＲ２抗体及び組み合わせが、ＳＫＯＶ３細胞株に濃度依存的ＡＤＣＣを媒介する能力を評価するため以下の実験を実施した。被験一価抗体は１０４０、１０４０と４１８２との組み合わせ、ＦＳＡ対照群としての７９２と４１８４であった。被験抗体はいずれも、ｎａｎｏＬＣ−ＭＳでグリコペプチドの解析及び検出を行って測定した場合に、ＦｃのＮ結合グリカンのフコシル化レベルは同等であった（約８８％）（データ示さず）。アッセイを以下の通り行った。
ＳＫＯＶ３標的細胞（ＡＴＣＣ、カタログ番号ＨＴＢ−３０）を８００ｒｐｍ、３分間の遠心分離により回収した。細胞をアッセイ培地で１回洗浄して遠心分離し、ペレット上の培地を完全に除去した。細胞をアッセイ培地で穏やかに懸濁し単一細胞溶液を作製した。ＳＫＯＶ３細胞数を４ｘ細胞ストックに調整した（５０μｌアッセイ培地中１０，０００細胞）。その後、被験抗体を図５に示す所望の濃度に希釈した。
ＳＫＯＶ３標的細胞を以下のようにアッセイプレートに播種した。４ｘ標的細胞ストック５０μｌ及び４ｘ試料希釈液５０μｌを９６ウェルアッセイプレートのウェルに加え、プレートを細胞培養インキュベーター内で室温にて３０分インキュベートした。エフェクター細胞（ＮＫ９２／ＦｃＲγ３ａ（１５８Ｖ／Ｖ）、１００μｌ、Ｅ／Ｔ＝５：１、すなわち、１ウェルあたり５０，０００エフェクター細胞）を加えて反応を開始させ、クロス振盪（ｃｒｏｓｓ ｓｈａｋｉｎｇ）で穏やかに混合した。プレートを３７℃／５％ＣＯ２にしたインキュベーターで６時間インキュベートした。
エフェクター細胞及び抗体を含まない細胞対照群に、標的細胞を溶解させるためにＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を最終濃度１％で加え、これらの対照群を最大溶解対照とした。ＡＤＣＣアッセイ緩衝液（９８％のフェノールレッド不含のＭＥＭ培地、１％のＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐ及び１％のＦＢＳ）をエフェクター細胞及び抗体を含まない細胞対照群に加え、これを最小ＬＤＨ放出対照とした。抗体を含まずエフェクター細胞と共にインキュベートした標的細胞を、両細胞を一緒にインキュベートした場合の非特異的ＬＤＨ放出のバックグラウンド対照とした。細胞生存率を、ＬＤＨキットを用いて調べた（Ｒｏｃｈｅ、カタログ番号１１６４４７９３００１）。ＯＤ４９２ｎｍ及びＯＤ６５０ｎｍの吸光度データをＦｌｅｘｓｔａｔｉｏｎ ３で読み取った。データ解析及び曲線フィッティング（シグモイド型用量−反応、可変傾斜）をＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍで実施した。
結果を図５に示し、結果の概要を下記表４に記載している。図５及び表４のデータから、抗ＨＥＲ２ ＯＡＡ２つの組み合わせは、抗ＨＥＲ２ ＦＳＡ（ｖ７９２：Ｆｃ領域にアミノ酸修飾が含まれている点でｖ５０６とは異なる。実施例１の記載を参照のこと）に比べＡＤＣＣによる最大細胞溶解率を約１．５倍高く媒介し、また、抗ＨＥＲ２ ＦＳＡの組み合わせ（ｖ７９２＋ｖ４１８４）に比べＡＤＣＣを約１．１倍高く媒介できることがわかる。最大細胞溶解パーセントは、ＯＡ単独（ｖ１０４０）とＯＡＡの組み合わせ（ｖ１０４０＋ｖ４１８２）とではほぼ同等であった。
（表４）
Figure 2017504564
実施例８：一価抗ＨＥＲ２抗体薬物複合体（ＡＤＣ）の組み合わせにより一価抗ＨＥＲ２ ＡＤＣ単独の場合よりもＨＥＲ２ ２＋ 細胞傷害性効力が増加
ＤＭ１に複合体化させた場合の一価抗ＨＥＲ２抗体の組み合わせが濃度依存的に細胞傷害性を媒介する能力を、ＨＥＲ２ ２−３＋卵巣腫瘍（ＳＫＯＶ３）、及びＨＥＲ２ ２＋乳房腫瘍（ＪＩＭＴ−１）細胞において測定した。アッセイを以下の通り行った。
被験抗体を培養液に希釈し、１０μｌ／ウェルを細胞に３連で加えた。プレートを３７℃で４日間インキュベートした。細胞生存率を、ＡｌａｍａｒＢｌｕｅ（商標）（ＢＩＯＳＯＵＲＣＥ＃ ＤＡＬ１１００）を使用して測定した。１ウェルあたり１０μｌのＡｌａｍａｒＢｌｕｅ（商標）を加え、プレートを３７℃で２時間インキュベートした。５３０／５８０ｎＭの吸光度を読み取った。
結果を図６Ａ（ＳＫＯＶ３細胞）及び図６Ｂ（ＪＩＭＴ−１細胞）に示し、結果の概要を表５に記載している。図６Ａ、図６Ｂ及び表５の結果から、ＩＣ５０として示されるＳＫＯＶ３における等モル濃度での細胞傷害性は、抗ＨＥＲ２ ＯＡＡ２つの組み合わせ（ｖ６２４７＋ｖ６２４８）の方が単一ＯＡＡ単独（ｖ６２４７またはｖ６２４８）に比べ約２〜３倍から４倍高いことがわかる。ＪＩＭＴ−１細胞では、Ｌｏｇ ＥＣ５０で示される等モル濃度での細胞傷害性は、抗ＨＥＲ２ ＯＡＡ２つの組み合わせ（ｖ６２４７＋ｖ６２４８）の方が単一ＯＡＡ単独（ｖ６２４７またはｖ６２４８）に比べ約２〜６倍高い。
（表５）
Figure 2017504564
実施例９：一価抗ＨＥＲ２抗体薬物複合体（ＡＤＣ）の組み合わせによりＦＳＡ−Ｔｒａｓ−ＤＭ１よりもＨＥＲ２＋細胞傷害性効力が増加
一価抗ＨＥＲ２ ＡＤＣの組み合わせが細胞傷害性に及ぼす作用をハーセプチン（商標）耐性ＨＥＲ２ ２＋乳房腫瘍細胞株であるＪＩＭＴ−１で測定し、ＦＳＡ−Ｔｒａｓ−ＤＭ１（ｖ６２４６、Ｔ−ＤＭ１類似体）及びＦＳＡ−Ｔｒａｓ−ＤＭ１とｖ４１８４（ペルツズマブ類似体）とのＦＳＡ組み合わせ体に比較した。実施例８のＪＩＭＴ−１細胞についての記載のようにアッセイを実施した。ただし、細胞は、ＯＡ ＡＤＣと共に５日間インキュベートした。
結果を図７に示し、結果の概要を下記表６に記載している。個々のＯＡ ＡＤＣ（ｖ６２４７またはｖ６２４８）の細胞傷害性はＴ−ＤＭ１類似体（ｖ６２４６）及びＴ−ＤＭ１＋ペルツズマブ類似体（ｖ６２４６＋ｖ４１８４）と同等であった。抗ＨＥＲ２−ＡＤＣ ＯＡＡの組み合わせ（ｖ６２４７＋ｖ６２４８）は、５種のＡＤＣ治療剤のうちＩＣ５０値が最も低く（表６）、細胞傷害性はＴ−ＤＭ１＋ペルツズマブ類似体（ｖ６２４６＋ｖ４１８４）治療剤より約２倍高かった。
（表６）
Figure 2017504564
実施例１０：一価抗ＨＥＲ２抗体の組み合わせは、ＳＫＯＶ３マウスモデルで確立された腫瘍増殖をＩｇＧ対照群より有効に阻害する
一価抗ＨＥＲ２抗体の単剤として、及び後続追加による組み合わせとしての腫瘍増殖阻害に対する有効性を測定するため、ヌードマウスでは中程度にトラスツズマブ感受性である、異種移植モデル由来の卵巣癌細胞ＳＫＯＶ３（ＨＥＲ２ ３＋）で本実験を実施した。ＯＡ−トラスツズマブ（ｖ１０４０）の効果をトラスツズマブ類似体（ｖ５０６）単独と比較し、次に、それぞれにＯＡ−ペルツズマブ（４１８２）またはペルツズマブ類似体（４１８４）を後続追加により組み合わせて比較した。
雌の無胸腺ヌードマウスに腫瘍断片１ｍｍ３を皮下挿入することにより腫瘍を接種させた。腫瘍を平均体積２２０ｍｍ３に達するまで監視し、その後、動物をＩｇＧ対照群、トラスツズマブ類似体（ｖ５０６）、及びＯＡ−Ｔｒａｓ（ｖ１０４０）の３つの治療群に無作為化した。動物１５匹を各群に組み入れた。各群の用量は、下記用量または腫瘍体積が２０００ｍｍ３（終了エンドポイント）に達するまでの、いずれか早い方とした。
Ａ）ＩｇＧ対照群に、初回用量３０ｍｇ／ｋｇを試験１日目に、その後、維持用量２０ｍｇ／ｋｇを試験３９日目まで週２回静脈内投与した。
Ｂ）トラスツズマブ類似体（ｖ５０６）を、試験１日目に初回用量１５ｍｇ／ｋｇ、その後、試験１８日目まで週２回の維持用量１０ｍｇ／ｋｇを静脈内に投与した。２２日目から３９日目まで、トラスツズマブ類似体５ｍｇ／ｋｇ週２回の静脈内投与をペルツズマブ類似体（ｖ４１８４）５ｍｇ／ｋｇ週２回腹腔内投与と併用して行った。
Ｃ）ＯＡ−Ｔｒａｓ（ｖ１０４０）を、試験１日目に初回用量１５ｍｇ／ｋｇ、その後、試験１８日目まで週２回の維持用量１０ｍｇ／ｋｇを静脈内に投与した。試験日２２日目から３９日目まで、単一アームのトラスツズマブ１０ｍｇ／ｋｇ週２回静脈内投与を、ＯＡ−Ｐｅｒｔ（ｖ４１８２）１０ｍｇ／ｋｇ週２回腹腔内投与と併用して行った。
結果を図８Ａ、図８Ｂ、及び表７及び８に示す。ＯＡ−トラスツズマブ一価抗体及びトラスツズマブ類似体では、ＩｇＧ対照群と比較して有意及び同様の腫瘍増殖阻害が誘導された。さらに、ＯＡ−トラスツズマブでの治療は、トラスツズマブに比較すると治療に反応する腫瘍数の増加と関連しており（それぞれ１５例中７例と１５例中５例）、動物１匹は残存疾患ゼロであった（表７）。ＰＫの結果と一致して、試験１１日目のＯＡ−トラスツズマブ抗体の血清曝露は、トラスツズマブ類似体より低く、それぞれの値は７０．９及び１４６．７μｇ／ｍｌであった（表７）。
上記に示したように、試験２２日目に、トラスツズマブ類似体への組み合わせでペルツズマブ類似体を、または、ＯＡ−トラスツズマブ一価抗体への組み合わせでＯＡ−ペルツズマブ一価抗体を追加した。２種の抗ＨＥＲ２ ＯＡＡ（ｖ１０４０＋ｖ４１８２）の組み合わせは、組み合わせ投与後に腫瘍増殖速度が遅くなったことからわかるように改善された腫瘍増殖阻害を示した。ｖ５０６及びｖ１０４０の各治療群間、また、２２日後に組み合わせを行った群間（すなわち、ｖ１０４０＋ｖ４１８２、及びｖ５０６＋ｖ４１８４）いずれにおいても腫瘍増殖阻害における有意差は検出されなかった。２種の抗ＨＥＲ２ ＯＡＡ（ｖ１０４０＋ｖ４１８２）の組み合わせでは、対照ＩｇＧ群に対し生存期間中央値の有意な改善が示され（それぞれ４６日と２２日）、また、全長抗体の組み合わせ（ｖ５０６＋ｖ４１８４）に比べ生存期間中央値の改善が示された（それぞれ４６日と３６日）（表８）。治療剤の組み合わせはいずれも対照に比べ生存率を有意に改善し、抗ＨＥＲ２ ＯＡＡ２つの組み合わせ（ｖ１０４０＋ｖ４１８２）では、全長抗体の組み合わせ（ｖ５０６＋ｖ４１８４）より生存期間が延長される傾向が認められた（図８Ｂ）。この結果は、ＯＡ抗ＨＥＲ２抗体が、単一薬剤として、またＯＡ抗ＨＥＲ２抗体の組み合わせとして、ＨＥＲ２陽性卵巣癌の治療に有用であり得ることを示している。
（表７）
Figure 2017504564
（表８）
Figure 2017504564
実施例１１：原発性乳癌の異種移植モデルＨＢＣｘ−１３ｂにおける一価抗ＨＥＲ２抗体の腫瘍増殖阻害有効性
一価抗ＨＥＲ２抗体の有効性と全長トラスツズマブ類似体の有効性とを比較するため、トラスツズマブ耐性の原発性乳癌の異種移植モデルＨＢＣｘ−１３ｂで本実験を実施した。ＨＢＣｘ−１３ｂは、ＨＥＲ２ ３＋、エストロゲン受容体陰性、転移性乳癌であり、ヌードマウスでは先天的にトラスツズマブ耐性である。ＨＢＣｘ−１３ｂはまた、ドセタキセル、カペシタビンの他、アドリアマイシン／シクロホスファミドの組み合わせに耐性がある。
雌の無胸腺ヌードマウスに腫瘍断片２０ｍｍ３を皮下挿入することにより腫瘍を接種させた。腫瘍を平均体積１００ｍｍ３に達するまで監視し、その後、動物をトラスツズマブ類似体（ｖ５０６）及びＯＡ−ｔｒａｓ（ｖ１０４０）の２つの治療群に無作為化した。動物７匹を各群に組み入れた。両群とも、試験１日目に初回用量１５ｍｇ／ｋｇを静脈内投与し、試験３、７、１０、１４、１７、２１、及び２４日目に維持用量１０ｍｇ／ｋｇを投与した。総試験期間は６４日であった。
結果を図９に示し、図中、縦の点線は２４日目の最終投与日を指す。一価抗ＨＥＲ２抗体（ｖ１０４０）は、トラスツズマブ類似体（５０６）より有意に優れた腫瘍増殖阻害を示し、また、腫瘍が進行するまでの期間をトラスツズマブの類似体より有意に延長した（それぞれ４１日と１５日）。ＰＫの結果と一致して、試験１１日目のＯＡ−トラスツズマブ抗体の血清曝露は、トラスツズマブ類似体より低かった（それぞれ、１０７．３μｇ／ｍｌ及び１９０．５μｇ／ｍｌ）（表９）。結果から、ｖ１０４０は、トラスツズマブ及び化学療法薬に耐性のある転移性乳癌に有用性があり得ることが示唆される。
表９は、一価抗ＨＥＲ２抗体及びＦＳＡ−ｔｒａｓ対照（ｖ５０６）の有効性測定値を比較するデータを示す。表９から、一価抗ＨＥＲ２抗体（ｖ１０４０）はＦＳＡ−ｔｒａｓ（ｖ５０６）よりも平均腫瘍体積（ＴＶ ｍｍ３）の減少、応答被験体数（ＴＶ＞対照の５０％）、完全奏効数（＜１０％のベースラインからの退縮）、残存疾患ゼロ（ＴＶ＜２０ｍｍ３）を示す数、進行性腫瘍（腫瘍倍加）の数、及び腫瘍が進行するまでの平均期間（倍加時間）において優れていることがわかる。
（表９）
Figure 2017504564
実施例１２：一価抗ＨＥＲ２抗体は二価ＨＥＲ２抗体（ＦＳＡ）よりも分布体積増大を示す
例示的な一価抗ＨＥＲ２抗体（ｖ１０４０、ＯＡ−ｔｒａｓ）の薬物動態（ＰＫ）を調べ、対照の二価抗ＨＥＲ２抗体（トラスツズマブ類似体のｖ５０６）と比較した。これらの試験を以下に記載のように行った
系統／性別：ＣＤ−１ヌード／雄
治療時の動物の目的体重：０．０２５ｋｇ
動物数：１２、ｎ＝３／時点
体重：投与するべき容量を計算するため治療前日に記録。
臨床徴候観察：注射後２時間まで観察し，以降、１日目から１１日目まで１日２回。
１日目、用量１０ｍｇ／ｋｇの被験物質をマウス尾静脈にＩＶ注射で投与した。投与後２４０時間まで下記表８に従い選択測定時点で（各測定時点につき動物３匹）顎下静脈または伏在静脈から血液試料を約０．０６０ｍＬ採取した。治療前血清試料（Ｐｒｅ−Ｒｘ）を未処置動物から得た。血液試料を室温で１５〜３０分間凝固させた。血液試料を２７００ｒｐｍ、室温にて１０分間遠心分離して血清を得、得られた血清を−８０℃で保存した。終末血液には、心臓穿刺により血液を採取した。
血清濃度をＥＬＩＳＡにより測定した。簡単に言えば、ＨＥＲ２を、ＨｉｇｈＢｉｎｄ ３８４プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ ３７００）プレートにＰＢＳ中０．５ｕｇ／ｍｌ、２５ｕｌ／ウェルでコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。ウェルをＰＢＳ−０．０５％ｔｗｅｅｎ−２０で３回洗浄し、８０μｌ／ウェルの１％ＢＳＡ含有ＰＢＳで室温にて１〜２時間ブロッキングした。抗体血清の希釈液及び標準液１％ＢＳＡ含有ＰＢＳを調製した。ブロッキング後、ブロッキングを除去し、抗体希釈液をウェルに移した。ＥＬＩＳＡプレートを１０００ｇで３０秒間遠心分離して気泡を除去し、プレートを室温で２時間インキュベートした。プレートをＰＢＳ−０．０５％ｔｗｅｅｎ−２０で３回洗浄し、２５μｌ／ウェルのＡＰ結合ヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆｃ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を加え（１％ＢＳＡ含有ＰＢＳに１：５０００で希釈）室温で１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳ−０．０５％ｔｗｅｅｎ−２０で４回洗浄し、２５μｌ／ウェルのＡＰ基材（５．５ｍＬ ｐＮＰＰ緩衝液中１錠）を加えた。Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ製Ｅｎｖｉｓｉｏｎプレートリーダーを使用して、異なる時間間隔（０〜３０分）で４０５ｎｍのＯＤを読み取った。ＯＤ４０５が２．２に達する前に５μＬの３Ｎ ＮａＯＨを添加して反応を中止させた。最終読取の前にプレートを１０００ｇで２分間遠心分離した。
血清濃度を、ＷｉｎｎｏｎＬｉｎソフトウェア バージョン５．３を使用して解析しＰＫパラメータを得た。血清試料を２セットの多段階希釈液で解析し、検証された範囲内にある結果を許容とし平均を求めた。ＥＬＩＳＡ解析後に定量下限値（ＬＬＯＱ）に満たない血清濃度値を０と見なして平均血清濃度を計算した。ＥＬＩＳＡアッセイから得られたＬＬＯＱは約１．２μｇ／ｍＬであった。
結果を図１０に示し、検討ＰＫパラメータを表１０に示す。
（表１０）ＰＫパラメータ
Figure 2017504564
図１０に示される結果は、ＯＡ−ｔｒａｓのＰＫパラメータがヒトへの投与に妥当であることを指している。明白にわかるように、ＯＡ−ｔｒａｓはＶｓｓ（定常状態における体積）が大きく、このことは、抗体がより大きな体積に分布しており、組織内により広く分布していることを指している。ＯＡ−ｔｒａｓは組織分布が一層大きく、また一般的なＯＡＡも組織分布が大きいため、かかる抗体は、抗体濃度が限られる末梢組織の疾患を治療する上で、治療的有用性を有し得る。
実施例１３：一価抗ＨＥＲ２抗体は、インビトロでＦＳＡよりも血液脳関門（ＢＢＢ）通過能の促進を示す
例示的な一価抗ＨＥＲ２抗体変異体ｖ１０４０の、インビトロのＢＢＢモデルにおける通過能を検討するため、本実験を実施した。使用したインビトロのＢＢＢモデルは、Ｇａｒｂｅｒｇ， Ｍ． Ｂａｌｌ， Ｎ． Ｂｏｒｇ， Ｒ． Ｃｅｃｃｈｅｌｌｉ， Ｌ． Ｆｅｎａｒｔ， Ｒ． Ｄ． Ｈｕｒｓｔ， Ｔ． Ｌｉｎｄｍａｒｋ， Ａ． Ｍａｂｏｎｄｚｏ， Ｊ． Ｅ． Ｎｉｌｓｓｏｎ， Ｔ． Ｊ． Ｒａｕｂ， Ｄ． Ｓｔａｎｉｍｉｒｏｖｉｃ， Ｔ． Ｔｅｒａｓａｋｉ， Ｊ． Ｏ． Ｏｂｅｒｇ， ａｎｄ Ｔ． Ｏｓｔｅｒｂｅｒｇ． Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｍｏｄｅｌｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｂｌｏｏｄ−ｂｒａｉｎ ｂａｒｒｉｅｒ． Ｔｏｘｉｃｏｌ， ｉｎ Ｖｉｔｒｏ １９：２９９−３３４（２００５）に詳述されている。このモデルでは、前掲のＧａｒｂｅｒｇらの記載にあるように調製したＳＶ−ＡＲＢＥＣラットの脳内皮細胞を使用した。
アッセイの実験設計を図１１に示す。１２ウェル組織培養プレートにフェノールレッド不含ＳＶ−ＡＲＢＥＣフィード培地１ｍＬを入れた、ラット尾コラーゲンでコーティングした細孔径１μｍの０．８３ｃｍ２ Ｆａｌｃｏｎセルインサートに、ラット脳内皮細胞（ＳＶ−ＡＲＢＥＣ）８０，０００を播種した。下層チャンバーには、フェノールレッド不含ＳＶ−ＡＲＢＥＣ培地とラットアストロサイト馴化培地との５０：５０（ｖ／ｖ）混合物２ｍＬを入れた。輸送緩衝液（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、及び０．０１％ＢＳＡを溶解させたリン酸緩衝生理食塩液、ｐＨ７．４；アッパーチャンバーに１ｍｌ及びボトムチャンバーに２ｍｌ）を多分割して使用し、被験抗体と、経細胞輸送能が既知である陽性対照抗体（マウスＦｃ融合ＶＨＨのＡ２０．１ＶＨＨを７９ｋＤａ）と、非特異的陰性対照抗体断片（ＶＨＨ １７ｋＤａ）とを加えて、輸送実験を３連で実施した。
アッセイに使用した試験材料とそのサイズを下記表１１に記載する。
（表１１）
Figure 2017504564
各抗体の投入濃度（ｉｎｐｕｔ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）を５μＭとし、多重反応モニタリング（ＭＲＭ：ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ）法（Ｈａｑｑａｎｉ ｅｔ ａｌ．， ２００８， Ｈａｑｑａｎｉ ｅｔ ａｌ．， ２００８、２０１３）を使用して３０、６０及び９０分にボトムチャンバーから分注したアリコート１ ｌ（分注後は、アリコートの採取ごとに輸送緩衝液１００ ｌをボトムチャンバーに入れた）の抗体濃度を測定することにより、全抗体の経細胞輸送を定量化した。
簡単に言えば、ＭＲＭは、先に記載のＬＣＭＳ法（Ｈａｑｑａｎｉ ｅｔ ａｌ．、２００８、Ｈａｑｑａｎｉ ｅｔ ａｌ．、２００８、２０１３）を使用してペプチド特異的抗体断片を検出し定量する。標準曲線を使用して試料中の各ＭＲＭペプチドの濃度を計算した。本アッセイの結果を図１２に示す。図１２Ａは、ｖ５０６及びｖ１０４０の経細胞輸送における３０、６０及び９０分時の平均増加倍率を非特異的ＩｇＧと比較したものを示す。図１２Ｂは、３回繰り返しのすべてから得られた二価抗体及び一価抗体の曲線下面積（ＡＵＣ）の平均を示し、ＡＵＣは、非特異的ＩｇＧ対照群に合わせて標準化してから計算されたものである。
図１２Ｂに示される結果は、一価抗ＨＥＲ２抗体が、ＦＳＡよりも１．８倍高い、統計的に有意な高レベルのＢＢＢ経細胞輸送を示すことを実証している。
実施例１４：一価抗ＨＥＲ２抗体のインビトロＢＢＢ通過能の増加は分子量に関連しない
分子量が被験抗体のインビトロＢＢＢ通過能に与える影響を測定するため、変異体５０６（トラスツズマブ類似体対照）、４１８２（ＯＡ−ｐｅｒｔ）、ｖ６２４７（ｖ１０４０とＤＭ−１との複合体）、ｖ６２４８（４１８２とＤＭ−１との複合体）及びｖ６３０（抗原結合ドメインがトラスツズマブ由来のｓｃＦｖである、トラスツズマブ系一価抗ＨＥＲ２抗体。以下のさらなる記載を参照のこと）の性能とｖ１０４０の性能とを比較した。
Ｖ６３０は一価抗ＨＥＲ２抗体であり、これは、ＨＥＲ２結合ドメインがトラスツズマブ由来ｓｃＦｖであり、Ｆｃ領域は、鎖Ａ内に変異L３５１Ｙ＿Ｓ４００Ｅ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ、鎖Ｂ内に変異Ｔ３６６Ｉ＿Ｎ３９０Ｒ＿Ｋ３９２Ｍ＿Ｔ３９４Ｗを有するヘテロ二量体である。ｖ６３０は、ＨＥＲ２のドメイン４に結合する。
アッセイを実施例１３に記載のように行った。結果を下記表１２に示す。
（表１２）
Figure 2017504564
これらの結果から、Ｆａｂ（トラスツズマブ系でもペルツズマブ系でも）からなる単一アーム（一価）の抗体は、全長抗体よりも優れたインビトロＢＢＢ通過能を有することが示される。その上、抗体質量はＢＢＢ通過能と相関しないように思われる。さらに、ＯＡＡにＤＭ１を結合させると抗体のインビトロＢＢＢ通過能が減少した。
実施例１５：一価抗ＨＥＲ２抗体は脳及び肺の分布が全長抗体よりも広い
一価抗ＨＥＲ２抗体、ＯＡ−ｔｒａｓ（ｖ１０４０）の脳及び肺に分布する能力を全長抗ＨＥＲ２抗体（トラスツズマブ類似体ｖ５０６）のそれとエキソビボ画像診断を使用して比較した。
雌の無胸腺ヌードマウスにＳＫＯＶ３腫瘍細胞懸濁液を皮下で接種させた。腫瘍体積が約２０００ｍｍ３に達するまで腫瘍を監視し、その後、動物を蛍光標識した抗ＨＥＲ２全長抗体ｖ５０６または蛍光標識した一価抗ＨＥＲ２抗体ｖ１０４０の２つの治療群に無作為化した。両抗体を画像診断用にＣｙ５．５で蛍光標識したところ、どちらの抗体もタンパク質染色は同様で比は約１．５：１であった。１匹の動物に各抗体１０ｍｇ／ｋｇをＩＶ投与した。注射から２４時間後、動物に麻酔をかけヘパリン加生理食塩水で心内灌流した。灌流後、脳及び両肺を除去し、光学的画像診断で抗体分布を測定した。
結果を図１３（脳）及び図１４（肺）に示す。図１３は、ｖ１０４０の脳分布がｖ５０６より１．６倍大きいことを示している。脳内でＦＳＡより優れた脳分布を示す一価抗ＨＥＲ２抗体は、脳転移の治療において治療上の利点を提供し得る。
図１４は、ｖ１０４０の肺分布がｖ５０６より２．４倍大きいことを示している。ＦＳＡより優れた肺分布を示す一価抗ＨＥＲ２抗体は、肺転移の治療において治療上の利点を提供し得る。
実施例１６：一価抗ＨＥＲ２抗体は、トラスツズマブ耐性ＰＤＸモデルにおいてＴ−ＤＭ１類似体よりも自然転移性肺疾患の抑制を示す。
トラスツズマブ耐性原発性乳癌の異種移植モデルＨＢＣｘ−１３ｂにおいて、一価抗ＨＥＲ２抗体が自然肺転移を予防する能力を、緩衝液対照及びＴ−ＤＭ１類似体（ｖ６２４６）のそれと比較した。ＨＢＣｘ−１３ｂは、ヌードマウスにおいて先天的にトラスツズマブ耐性である、ＨＥＲ２ ３＋、エストロゲン受容体陰性、転移性乳癌モデルである。
雌の無胸腺ヌードマウスに、患者由来の乳癌をマウスに連続継代させたＨＢＣｘ−１３ｂの腫瘍断片２０ｍｍ３を皮下で接種させた。ＨＢＣｘ−１３ｂは、ヌードマウスにおいてトラスツズマブ耐性である、ＨＥＲ３＋、エストロゲン受容体陰性、転移性乳癌モデルである。その後、腫瘍を平均体積１５０ｍｍ３に達するまで監視した。その後、動物をビヒクル対照、Ｔ−ＤＭ１類似体（ｖ６２４６）及び脱フコシル化一価抗ＨＥＲ２抗体（ＯＡ−ＨＥＲ２−ａｆｕｃｏ、ｖ７１８８）の３つの治療群（各群８匹または９匹）に無作為化した。ｖ７１８８はｖ１０４０の脱フコシル化型であり、ここでは一価抗ＨＥＲ２抗体の別例として使用した。ｖ１０４０の脱フコシル化型を、実施例１に記載のものと同一の一過性ＣＨＯ発現システム及びプロテインＡ及びサイズ排除クロマトグラフィー精製手順を使用して調製した。ただし、その他に、トランスフェクションした総ＤＮＡの１５％にＧＤＰ−６−デオキシ−Ｄ−リキソ−４−ヘキスロースレダクターゼ（ＲＭＤ）をコードする余分のクローンを加えた。
投与を以下の通り行った。
Ａ． ビヒクル対照を５ｍｌ／ｋｇの製剤緩衝液と共に試験３９日目まで週２回静脈内投与した。
Ｂ． Ｔ−ＤＭ１類似体を３ｍｇ／ｋｇで試験開始日、１５、３３、及び４３日目に静脈内投与した。
Ｃ． ＯＡ−ＨＥＲ２ａｆｕｃｏ（ｖ７１８８）を１０ｍｇ／ｋｇで試験３９日目まで週２回静脈内投与した。
試験４３日目に各群につき動物４匹を屠殺して両肺及び腫瘍を採取し、瞬間凍結（ｓｎａｐ ｆｒｅｅｚｉｎｇ）して転移の定量用に保存した。先に記載のように特異的ヒトＡｌｕ配列のＰＣＲにより両肺の転移を定量した（Ｓｃｈｅｕｅｒ Ｗ ｅｔ ａｌ．２００９．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６９：９３３０−９３３６）。ＨＢＣｘ−１３ｂの凍結腫瘍ライセートを使用して標準曲線を生成した。
表１３に示すように、緩衝液を投与したマウスにおいてＨＢＣｘ−１３ｂ腫瘍の肺への自然転移が認められ、投入ＤＮＡ（ｎｇ）あたりのヒトＤＮＡ（ｐｇ）（ｎ＝４）の中央値は２７．４ｐｇであった。図１５は、Ｔ−ＤＭ１類似体またはＯＡ−ＨＥＲ２−ａｆｕｃｏ（ｖ７１８８）の投与を受けたマウスの投入ＤＮＡ（ｎｇ）あたりのヒトＤＮＡ（ｐｇ）（ｎ＝４）の中央値は、それぞれ、２１．３ｐｇ及び１８．７ｐｇであることを示す。ＯＡ−ＨＥＲ２−ａｆｕｃｏ抗体では、対照及びＴ−ＤＭ１類似体よりも肺転移が抑制される傾向が示された。この結果は、ＯＡ−ＨＥＲ２−ａｆｕｃｏ抗体は肺転移の抑制に有効であり得ることを示している。
（表１３）ＨＢＣｘ−１３ｂ腫瘍を有するマウスにおける、転移性疾患を示すヒトＤＮＡのＰＣＲによる定量
Figure 2017504564
実施例１７：さらなるＯＡ抗ＨＥＲ２抗体の調製
本明細書に記載の方法による使用に好適なＯＡ抗ＨＥＲ２抗体のさらなる例として、以下のＯＡ抗体を調製した。ｖ１０４１、ｖ６３０、及びｖ８７８は先に記載されており、国際特許公開第 ＷＯ２０１３／１６６６０４号に明らかにされている。
トラスツズマブ由来ＯＡ抗体
ｖ１０４１−一価抗ＨＥＲ２抗体。ＨＥＲ２結合ドメインは鎖Ｂ上のトラスツズマブ由来のＦａｂであり、Ｆｃ領域は、鎖Ａ内に変異Ｔ３５０Ｖ＿Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖを、鎖Ｂ内に変異Ｔ３５０Ｖ＿Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｌ＿Ｔ３９４Ｗを有するヘテロ二量体であり、ヒンジ領域は、鎖Ａ内に変異Ｃ２２６Ｓ（ＥＵ番号付け）を有する。抗原結合ドメインはＨＥＲ２のドメイン４に結合する。
ｖ６３０、一価抗Ｈｅｒ２抗体。ＨＥＲ２結合ドメインは鎖Ａ上のトラスツズマブ由来のｓｃＦｖであり、Ｆｃ領域は、鎖Ａ内に変異Ｌ３５１Ｙ＿Ｓ４００Ｅ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ、鎖Ｂ内に変異Ｔ３６６Ｉ＿Ｎ３９０Ｒ＿Ｋ３９２Ｍ＿Ｔ３９４Ｗを有するヘテロ二量体であり、ヒンジ領域は、両鎖に変異Ｃ２２６Ｓ（ＥＵ番号付け）を有する。抗原結合ドメインはＨＥＲ２のドメイン４に結合する。
抗体Ｂ１Ｄ２由来ＯＡ抗体
ｖ８７８、一価抗Ｈｅｒ２抗体。ＨＥＲ２結合ドメインは鎖Ａ上の抗体Ｂ１Ｄ２由来ｓｃＦｖ（既知のＨｅｒ２／ｎｅｕ結合Ａｂから作製（Ｓｃｈｉｅｒ Ｒ． ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｈｕｍａｎ ａｎｔｉ−ｃ−ｅｒｂＢ−２ ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ Ｆｖ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ａ ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ ｐｈａｇｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｌｉｂｒａｒｙ． Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １，７３））であり、Ｆｃ領域は、鎖Ａ内に変異Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ、鎖Ｂ内に変異Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｍ＿Ｔ３９４Ｗを有するヘテロ二量体であり、ヒンジ領域は両鎖に変異Ｃ２２６Ｓ（ＥＵ番号付け）を有する。抗原結合ドメインはＨＥＲ２のドメイン１に結合する。
親和性が改善された抗原結合ドメインを有するＯＡ抗体
ｖ４４４２：一価抗ＨＥＲ２抗体。ＨＥＲ２結合ドメインは鎖Ａ上にある親和性が改善されたペルツズマブ由来のＦａｂであり、重鎖に変異Ｔ３０Ａ、及び軽鎖にＹ９６Ｆ（Ｋａｂａｔ番号付け）を有し、Ｆｃ領域は、鎖Ａ内に変異Ｔ３５０Ｖ＿Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ、鎖Ｂ内に変異Ｔ３５０Ｖ＿Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｌ＿Ｔ３９４Ｗを有するヘテロ二量体であり、ヒンジ領域は、鎖Ｂ内に変異Ｃ２２６Ｓ（ＥＵ番号付け）を有する。抗原結合ドメインはＨＥＲ２のドメイン２に結合する。
ｖ４４４３：一価抗ＨＥＲ２抗体。ＨＥＲ２結合ドメインは鎖Ａ上にある、親和性が改善されたペルツズマブ由来のＦａｂであり、重鎖に変異Ｔ３０Ａ、軽鎖に変異Ｙ９６Ａ（Ｋａｂａｔ番号付け）を有し、Ｆｃ領域は、鎖Ａ内に変異Ｔ３５０Ｖ＿Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ、鎖Ｂ内に変異Ｔ３５０Ｖ＿Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｌ＿Ｔ３９４Ｗを有するヘテロ二量体であり、ヒンジ領域は、鎖Ｂ内に変異Ｃ２２６Ｓ（ＥＵ番号付け）を有する。抗原結合ドメインはＨＥＲ２のドメイン２に結合する。
ｖ４４４４：一価抗ＨＥＲ２抗体。ＨＥＲ２結合ドメインは鎖Ａ上にある、親和性が改善されたペルツズマブ由来のＦａｂであり、重鎖に変異Ｔ３０Ａ及びＧ５７Ａ、軽鎖に変異Ｙ９６Ｆ（Ｋａｂａｔ番号付け）を有し、Ｆｃ領域は、鎖Ａ内に変異Ｔ３５０Ｖ＿Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ、鎖Ｂ内に変異Ｔ３５０Ｖ＿Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｌ＿Ｔ３９４Ｗを有するヘテロ二量体であり、ヒンジ領域は、鎖Ｂ内に変異Ｃ２２６Ｓ（ＥＵ番号付け）を有する。抗原結合ドメインはＨＥＲ２のドメイン２に結合する。
ｖ４４４５：一価抗ＨＥＲ２抗体。ＨＥＲ２結合ドメインは鎖Ａ上にある、親和性が改善されたペルツズマブ由来のＦａｂであり、重鎖に変異Ｔ３０Ａ及びＧ５７Ａ、軽鎖に変異Ｙ９６Ａ（Ｋａｂａｔ番号付け）を有し、Ｆｃ領域は、鎖Ａ内に変異Ｔ３５０Ｖ＿Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ、鎖Ｂ内に変異Ｔ３５０Ｖ＿Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｌ＿Ｔ３９４Ｗを有するヘテロ二量体であり、ヒンジ領域は、鎖Ｂ内に変異Ｃ２２６Ｓ（ＥＵ番号付け）を有する。抗原結合ドメインはＨＥＲ２のドメイン２に結合する。
さらに明瞭に理解するために、抗体のＦａｂ部において修飾されたアミノ酸残基番号を、ＩＭＧＴ及びＫａｂａｔの両方の番号付け（ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎｓ）を使用して下記表１４にて識別する。
（表１４）Ｆａｂ領域の修飾された残基のＩＭＧＴ及びＫａｂａｔによる番号付け
Figure 2017504564
すべての変異体を実施例１に記載のように調製し、発現させて精製した。
実施例１８：親和性が改善されたＯＡ抗ＨＥＲ２抗体の生物物理学的特性の測定
親和性が改善されたＯＡ抗ＨＥＲ２抗体４４４２、４４４３、４４４４、及び４４４５の生物物理学的特性を評価した。評価した生物物理学的特性は熱安定性及び標的結合親和性であった。
熱安定性
熱安定性を、示差走査熱量測定法により以下の通り評価した。ＳＥＣで精製した各変異体に示差走査熱量測定法（ＤＳＣ）を実施し、分子の熱力学的安定性を評価した。ＯＡ変異体４４４２、４４４３、４４４４、及び４４４５と、野生型ペルツズマブのＦａｂを有するＯＡ変異体であるＯＡ変異体４１８２とを比較した。
ＧＥまたはＭｉｃｒｏＣａｌ ＶＰ−Ｃａｐｉｌｌａｒｙ装置を使用してＤＳＣ実験を行った。タンパク質をＰＢＳ（ｐＨ７．４）にバッファー交換し０．３〜０．７ｍｇ／ｍＬまで希釈した後、０．１３７ｍＬをサンプルセルに充填し、スキャンレート１℃／分で２０〜１００℃を測定した。データは、Ｏｒｉｇｉｎソフトウェア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用し、ＰＢＳ緩衝液のバックグラウンドは減算して解析した。
融解温度（Ｔｍ）で表されるＤＳＣの結果を下記表１５に示す。
標的結合親和性
親和性が改善された変異体がＨＥＲ２に結合する能力を、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により以下の通り評価した。
ＳＥＣで精製した変異体にＳＰＲを実施し変異体のＨＥＲ２細胞外ドメインへの親和性を評価した。すべてのＳＰＲ法は、ＢｉａｃｏｒｅＴ２００ 装置（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（Ｃａｎａｄａ）Ｌｔｄ．（Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ， ＯＮ））を使用して行い、その際、１Ｘ ＰＢＳランニング緩衝液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０に０．５Ｍ ＥＤＴＡ原液を加えて最終濃度３．４ｍＭとしたＩＸ ＰＢＳ緩衝液）を用いてトラスツズマブは３７℃で、またペルツズマブでは２５℃で行った。抗ヒトＦｃ表面をＣＭ５センサーチップで作製し、標準固定化ウィザードテンプレート（ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｚａｒｄ ｔｅｍｐｌａｔｅ）に記載の条件を使用して、固定化量のオプションを２０００ＲＵに設定して行った。４つのフローセル（ＦＣ）はいずれも、１０ｍＭ ＮａＯＡｃ（ｐＨ４．５）に５〜１０ｕｇ／ｍｌで希釈された抗ヒトＦｃと同様の量で固定化した。ＯＡ変異体６４４９（トラスツズマブを結合）と、野生型（ｗｔ）トラスツズマブＦａｂを有するＯＡ変異体であるｖ１０４０とを比較した。ＯＡ変異体４４４２、４４４３、４４４４、及び４４４５と、野生型ペルツズマブＦａｂを有するＯＡ変異体であるＯＡ変異体４１８２とを比較した。変異体を０．５〜２μｇ／ｍｌで６０秒間、流速１０μｌ／分でＦＣ２、ＦＣ３またはＦＣ４に注入した。ＦＣ１は変異体捕捉には使用せず、ブランクの対照表面として残した。
捕捉された変異体に対するＨｅｒ２結合の動態パラメータは、シングルサイクルカイネティクス（ＳＣＫ）を使用して測定し、ＢｉａｃｏｒｅＴ２００評価ソフトウェアを使用して１：１モデルから求めた。ＨＥＲ２を、流速５０μｌ／分、濃度系列０．７４、２．２２、６．６６、２０及び６０ｎＭで１８０秒間注入し、解離時間を１８００秒とした。すべての測定を少なくとも２連で実施した。
被験ＯＡ抗体で測定された親和性（ＫＤで表示）についても下記表１５に示す。
（表１５）熱安定性及び標的親和性の測定値概要
Figure 2017504564
表１５に示すデータは、親和性が改善された変異体の熱安定性は野生型の対照抗体の熱安定性と非常に類似していることを指している。親和性が改善された変異体６４４９は、野生型対照と比べ約１．７倍高い親和性を示している。親和性が改善された変異体４４４２〜４４４５は、野生型対照と比べ４．７倍〜８．５倍の高い親和性を示している。
実施例１９：ＯＡ抗ＨＥＲ２親和性成熟変異体のＨＥＲ２発現細胞への結合能測定
ＯＡ抗ＨＥＲ２親和性成熟変異体がＳＫＯＶ３細胞に結合する能力を、実施例３に記載のようにＦＡＣＳにより評価した。ここでは、親和性が改善されたペルツズマブＦａｂを有する変異体のみを評価し、すべての変異体をＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）４８８ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ａ１０２３５）を使用して製造者の指示書にしたがいながら直接標識した。
結果は下記表１６に示されており、ここで試験した親和性が改善されたＯＡ抗ＨＥＲ２変異体は、ＳＫＯＶ３細胞表面に発現しているＨＥＲ２に結合できることを示している。
（表１６）ＳＫＯＶ３細胞での結合データ
Figure 2017504564
実施例２０：親和性が改善されたＯＡ抗ＨＥＲ２変異体のＨＥＲ２発現細胞への内部移行能力
親和性が改善されたペルツズマブＦａｂを有するＯＡ抗ＨＥＲ２変異体の内部移行する能力をＳＫＯＶ３細胞で評価した。アッセイは、各抗体を個別に試験したことを除いては、実施例６に記載のように行った。
結果は表１７に示されており、被験ＯＡ抗ＨＥＲ２変異体は、対照変異体４１８２と同程度にＳＫＯＶ３細胞内に内部移行できたことを示している。
（表１７）ＳＫＯＶ３細胞への内部移行
Figure 2017504564
実施例２１：一価抗ＨＥＲ２抗体及び組み合わせがＨＥＲ２＋細胞にＡＤＣＣを媒介する能力
一価抗ＨＥＲ２抗体及び組み合わせが、ＨＥＲ２＋腫瘍細胞株、ＳＫＢｒ３（ＨＥＲ２ ３＋）、ＺＲ−７５−１（ＨＥＲ２ ２＋、エストロゲン受容体陽性、乳癌）、ＭＣＦ７（ＨＥＲ２ １＋）及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ＨＥＲ２ ０／１＋、トリプルネガティブ乳癌；ＴＮＢＣ）にＡＤＣＣを媒介する能力を評価するため以下の実験を実施した。アッセイを実施例７に記載のように行った。ただし、ＺＲ−７５−１には、ＰＢＭＣをエフェクター細胞としてＥ／Ｔ＝３０：１で使用した。被験一価抗体は１０４０、４１８２、及び１０４０と４１８２との組み合わせであり、ハーセプチン（商標）をＦＳＡ対照とした。被験抗体はいずれも、ｎａｎｏＬＣ−ＭＳでグリコペプチドの解析及び検出を行って測定した場合に、ＦｃのＮ結合グリカンのフコシル化レベルは同等であった（約８８％）（データ示さず）。ハーセプチン（商標）をＲｏｃｈｅ社より購入した。
結果を図１６Ａ〜Ｄ及び表１８〜２１に示す。
ＳＫＢｒ３ ＨＥＲ２ ３＋ 乳房腫瘍細胞での結果は図１６Ａ及び表１８に示されており、抗ＨＥＲ２ ＯＡＡ２つの組み合わせは、抗ＨＥＲ２ ＦＳＡ（ハーセプチン（商標））及び抗ＨＥＲ２ ＯＡＡ（ｖ１０４０）と比べ、ＡＤＣＣによる最大細胞溶解を同等に媒介できることを示している。
（表１８）
Figure 2017504564
ＺＲ−７５−１ ＨＥＲ２ ２＋ 乳房腫瘍細胞での結果は図１６Ｂ及び表１９に示されており、抗ＨＥＲ２ ＯＡＡ２つの組み合わせは、ＡＤＣＣによる最大細胞溶解を、抗ＨＥＲ２ ＦＳＡ（市販ハーセプチン）より約１．４倍高く、抗ＨＥＲ２ ＯＡＡ（ｖ１０４０）より約１．２倍高く媒介できることを示している。
（表１９）
Figure 2017504564
ＭＣＦ７ ＨＥＲ２ １＋ 乳房腫瘍細胞での結果は図１６Ｃ及び表２０に示されており、抗ＨＥＲ２ ＯＡＡ２つの組み合わせは、ＡＤＣＣによる最大細胞溶解を抗ＨＥＲ２ ＦＳＡ（市販ハーセプチン）より約１．５倍高く媒介し、また抗Ｈｅｒ２ ＯＡＡ（ｖ１０４０）と同等のＡＤＣＣを媒介できることを示している。
（表２０）
Figure 2017504564
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１ＨＥＲ２ ０／１＋ ＴＮＢＣ腫瘍細胞での結果は図１６Ｄ及び表２１に示されており、抗ＨＥＲ２ ＯＡＡ２つの組み合わせは、ＡＤＣＣによる最大細胞溶解を抗ＨＥＲ２ ＦＳＡ（市販ハーセプチン）より約１．４倍高く媒介でき、抗ＨＥＲ２ ＯＡＡ（ｖ１０４０）より約１．１倍高いＡＤＣＣを媒介できることを示している。
（表２１）
Figure 2017504564
ここに記載の結果及び実施例７の結果から、抗ＨＥＲ２ ＯＡＡ２つの組み合わせは、抗ＨＥＲ２ ＦＳＡより高い標的細胞溶解率で、ＨＥＲ２ ３＋、２＋、１＋及び０／１＋の乳癌及び卵巣腫瘍細胞にＡＤＣＣを媒介するのに有効であることがわかる。また、結果は、抗ＨＥＲ２ ＯＡＡ２つの方が抗ＨＥＲ２ ＯＡＡ１つよりもＨＥＲ２ ２＋ ＺＲ−７５−１及びＨＥＲ２ ０／１＋ＭＤＡ−ＭＢ−２３１の乳房腫瘍細胞におけるＡＤＣＣが高い傾向にあることも示している。ＯＡの組み合わせでＡＤＣＣが高くなるこの傾向は、図２に示される高い細胞表面修飾と一致している。細胞表面修飾（図２）及び図５のＡＤＣＣデータに基づくと、抗ＨＥＲ２ ＯＡＡ２つの組み合わせは、抗ＨＥＲ２ ＦＳＡの組み合わせ（ｖ７９２＋ｖ４１８４）より高い最大細胞溶解をＨＥＲ２陽性腫瘍細胞に誘発するであろうと予測される。
（表２２）例示的な変異体、クローン名称、及びSEQ ID NO
Figure 2017504564
Figure 2017504564
Figure 2017504564
（表２３）
Figure 2017504564
（表２４)
Figure 2017504564
Figure 2017504564
Figure 2017504564
Figure 2017504564
Figure 2017504564
Figure 2017504564
Figure 2017504564
Figure 2017504564
Figure 2017504564
Figure 2017504564

Claims (46)

  1. 対象の治療方法であって、有効量の第１の一価抗原結合コンストラクトまたは第１及び第２の一価抗原結合コンストラクトの組み合わせを前記対象へ投与することを含み、
    ａ）前記第１及び第２の一価抗原結合コンストラクトがそれぞれ、抗原結合ポリペプチドコンストラクトと、前記抗原結合ポリペプチドコンストラクトにリンカーによりまたはリンカーなしで連結した二量体Ｆｃとを含み；
    ｂ）各抗原結合ポリペプチドコンストラクトが、ヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２）の細胞外ドメイン２（ＥＣＤ２）、ＨＥＲ２のＥＣＤ４、またはＨＥＲ２のＥＣＤ１に特異的に結合し；
    ｃ）前記第１の一価抗原結合コンストラクト及び前記第２の一価抗原結合コンストラクトが、重複していないエピトープに結合し、ＨＥＲ２への結合に関して互いに競合せず；
    ｄ）前記第１の一価抗原結合コンストラクトがｖ１０４０を含み、前記第２の一価抗原結合コンストラクトがｖ４１８２を含み；かつ
    ｅ）前記対象の治療が、免疫組織化学（ＩＨＣ）により判定したとき、２＋以下のレベルでＨＥＲ２を発現しているＨＥＲ２＋癌の治療である、前記方法。
  2. 対象の治療方法であって、有効量の第１の一価抗原結合コンストラクトまたは第１及び第２の一価抗原結合コンストラクトの組み合わせを前記対象へ投与することを含み、
    ａ）前記第１及び第２の一価抗原結合コンストラクトが、それぞれ抗原結合ポリペプチドコンストラクトと、前記抗原結合ポリペプチドコンストラクトにリンカーによりまたはリンカーなしで連結した二量体Ｆｃとを含み；
    ｂ）各抗原結合ポリペプチドコンストラクトが、ヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２）の細胞外ドメイン２（ＥＣＤ２）、ＨＥＲ２のＥＣＤ４、またはＨＥＲ２のＥＣＤ１に特異的に結合し；かつ、
    ｃ）前記第１の一価抗原結合コンストラクト及び前記第２の一価抗原結合コンストラクトが、重複していないエピトープに結合し、ＨＥＲ２への結合に関して互いに競合しない、前記方法。
  3. 対象の治療が、ＨＥＲ２＋腫瘍の増殖阻害、ＨＥＲ２＋腫瘍の進行の遅延、ＨＥＲ２＋癌の治療、またはＨＥＲ２＋癌の予防である、請求項１または２に記載の方法。
  4. 前記ＨＥＲ２＋腫瘍または癌が、乳房の、卵巣の、胃の、食道胃接合部の、子宮内膜の、唾液腺の、頭頸部の、肺の、脳の、腎臓の、結腸の、結腸直腸の、甲状腺の、膵臓の、前立腺の、または膀胱の腫瘍または癌から選択される、請求項３に記載の方法。
  5. 前記ＨＥＲ２＋腫瘍または癌が、乳房の、卵巣の、胃の、肺の、または脳の腫瘍または癌から選択される、請求項４に記載の方法。
  6. 前記ＨＥＲ２＋腫瘍または癌が、免疫組織化学（ＩＨＣ）により判定したとき、２＋以下のレベルでＨＥＲ２を発現している、請求項４に記載の方法。
  7. 前記ＨＥＲ２＋腫瘍または癌が、免疫組織化学（ＩＨＣ）により判定したとき、２＋または３＋のレベルでＨＥＲ２を発現している卵巣癌である、請求項４に記載の方法。
  8. 前記ＨＥＲ２＋腫瘍または癌が乳癌である、請求項４に記載の方法。
  9. 前記乳癌が、免疫組織化学（ＩＨＣ）により判定したとき、２＋以下のレベルでＨＥＲ２を発現している、請求項８に記載の方法。
  10. 前記乳癌が、トラスツズマブ耐性乳癌、化学療法耐性乳癌、トリプルネガティブ乳癌、エストロゲン受容体陰性乳癌、またはエストロゲン受容体陽性乳癌である、請求項８に記載の方法。
  11. 前記治療が、ＨＥＲ２＋転移性癌の治療または予防である、請求項１または２に記載の方法。
  12. 前記ＨＥＲ２＋転移性癌が、転移性乳癌、転移性脳癌、または転移性肺癌である、請求項１１に記載の方法。
  13. 前記ＨＥＲ２＋癌が、定着した原発性及び転移性乳癌、または乳癌の肺転移もしくは脳転移である、請求項１１に記載の方法。
  14. 前記対象がヒトである、請求項１に記載の方法。
  15. 前記第１の一価抗原結合コンストラクトがｖ１０４０を含み、前記第２の一価抗原結合コンストラクトがｖ４１８２を含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
  16. 前記二量体Ｆｃが少なくとも２つのＣＨ３配列を含むヘテロ二量体Ｆｃであり、前記二量体化ＣＨ３配列が約６８℃以上の融解温度（Ｔｍ）を有する、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
  17. 各一価抗原結合コンストラクトが、ＨＥＲ２に特異的に結合する単一特異性二価抗原結合コンストラクトと比較してより大きい最大結合（Ｂｍａｘ）で、ＨＥＲ２に選択的に及び／または特異的に結合し、１：１の一価抗原結合コンストラクト：標的比において、前記単一特異性二価抗原結合コンストラクトと比較したＢｍａｘの増加が、飽和濃度以下の前記コンストラクトについて観察された平衡定数（ＫＤ）を超える濃度で観察される、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
  18. 前記第１の一価抗原結合コンストラクトの前記抗原結合ポリペプチドコンストラクトが、前記ｖ１０４０抗原結合ポリペプチドアミノ酸配列を含み、前記第２の一価抗原結合コンストラクトの前記抗原結合ポリペプチドコンストラクトが、前記ｖ４１８２抗原結合ポリペプチドコンストラクトアミノ酸配列を含む、請求項２〜１７のいずれか一項に記載の方法。
  19. 前記第１の一価抗原結合コンストラクトの前記抗原結合ポリペプチドコンストラクトが、前記ｖ１０４０抗原結合ポリペプチドコンストラクトと少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含み、前記第２の一価抗原結合コンストラクトの前記抗原結合ポリペプチドコンストラクトが、前記ｖ１０４０抗原結合ポリペプチドコンストラクトと少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項２〜１７のいずれか一項に記載の方法。
  20. 前記第１の一価抗原結合コンストラクトがｖ１０４０のヘテロ二量体Ｆｃを含み、前記第２の一価抗原結合コンストラクトがｖ４１８２のヘテロ二量体Ｆｃを含む、請求項２〜１７のいずれか一項に記載の方法。
  21. 前記第１の一価抗原結合コンストラクト及び前記第２の一価抗原結合コンストラクトが、ｖ１０４１、ｖ１０４１、ｖ４１８２、ｖ６３０、ｖ８７８、ｖ４４４２、ｖ４４４３、ｖ４４４４、及びｖ４４４５から選択される、請求項２〜１７のいずれか一項に記載の方法。
  22. 第１の一価抗原結合コンストラクト及び第２の一価抗原結合コンストラクトの組み合わせが、ｖ１０４０及びｖ４１８２である、請求項２〜１７のいずれか一項に記載の方法。
  23. 第１の一価抗原結合コンストラクトのみを投与し、前記第１の一価抗原結合コンストラクトが、ｖ１０４１、ｖ１０４１、ｖ４１８２、ｖ６３０、ｖ８７８、ｖ４４４２、ｖ４４４３、ｖ４４４４、及びｖ４４４５から選択される、請求項２〜１７のいずれか一項に記載の方法。
  24. 各ヘテロ二量体Ｆｃが、
    ａ．ヒトＦｃであり；及び／または
    ｂ．ヒトＩｇＧ１ Ｆｃであり；及び／または
    ｃ．前記ＣＨ３ドメインの少なくとも１つに１つ以上の修飾を含み；及び／または
    ｄ．野生型ホモ二量体Ｆｃと同等の安定性を有するヘテロ二量体Ｆｃの形成を促進する、前記ＣＨ３ドメインの少なくとも１つにおける１つ以上の修飾を含み；及び／または
    ｅ．表Ａ２に記載のとおり、前記ＣＨ３ドメインの少なくとも１つにおける１つ以上の修飾を含み；
    ｆ．少なくとも１つのＣＨ２ドメインを更に含み；及び／または
    ｇ．１つ以上の修飾を含む少なくとも１つのＣＨ２ドメインを更に含み；及び／または
    ｈ．表Ａ２に記載のとおり、ＣＨ２ドメインの少なくとも１つにおける１つ以上の修飾を含む少なくとも１つのＣＨ２ドメインを更に含み；及び／または
    ｉ．Ｆｃγ受容体の選択的結合を促進するために、１つ以上の修飾を含む、
    請求項１６に記載の方法。
  25. 前記二量体化ＣＨ３ドメインが、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７７．５、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、または８５℃以上の融解温度（Ｔｍ）を有する、請求項２４に記載の方法。
  26. 各ヘテロ二量体Ｆｃドメインが、リンカーによって前記抗原結合ポリペプチドコンストラクトに融合されている、請求項２４に記載の方法。
  27. 前記リンカーがポリペプチドリンカーである、請求項２６に記載の方法。
  28. 前記リンカーがＩｇＧ１ヒンジ領域を含む、請求項２６に記載の方法。
  29. 前記第１の及び／または第２の一価抗原結合コンストラクトが、薬物に複合体化されている、請求項２〜２８のいずれか一項に記載の方法。
  30. 前記第１の及び／または第２の一価抗原結合コンストラクトが、メイタンシン（ＤＭ１）に複合体化されている、請求項２〜２９のいずれか一項に記載の方法。
  31. 医薬組成物の状態で前記第１の及び第２の一価抗原結合コンストラクトを投与することを含む、請求項２〜３０のいずれか一項に記載の方法。
  32. 緩衝液、酸化防止剤、低分子量分子、薬物、タンパク質、アミノ酸、炭水化物、脂質、キレート化剤、安定剤、または賦形剤を含む医薬組成物の状態で、前記第１の及び第２の一価抗原結合コンストラクトを投与することを含む、請求項２〜３０のいずれか一項に記載の方法。
  33. 前記第１の及び第２の一価抗原結合コンストラクトが同時投与される、請求項１〜３２のいずれか一項に記載の方法。
  34. 追加の薬剤の投与を更に含む、請求項１〜３３のいずれか一項に記載の方法。
  35. 投与が、経口的であるかまたは注射を介する、請求項１〜３４のいずれか一項に記載の方法。
  36. 請求項１〜３５のいずれか一項に記載の方法において使用するための医薬組成物。
  37. ａ．対象において腫瘍を縮小するための；及び／または
    ｂ．腫瘍を有する前記対象において全生存を向上させるための；及び／または
    ｃ．前記対象においてＨＥＲ２の発現を特徴とする疾患を治療するための；及び／または
    ｄ．前記対象の乳房組織、結腸組織、卵巣組織、胃腸組織、もしくは脳組織におけるＨＥＲ２の発現を特徴とする疾患を治療するための；及び／または
    ｅ．トラスツズマブ及び／もしくはペルツズマブ及び／もしくはトラスツズマブエムタンシン（Ｔ−ＤＭ１）を含む抗ＨＥＲ２治療に対して治療抵抗性もしくは耐性である前記対象において、ＨＥＲ２の発現を特徴とする疾患を治療するための；及び／または
    ｆ．前記対象において癌を治療するための；及び／または
    ｇ．化学療法の標準治療（ＳｏＣ）に対して治療抵抗性である前記対象において癌を治療するための；及び／または
    ｈ．前記対象において乳癌を治療するための
    方法であって、
    有効量の第１の一価抗原結合コンストラクトまたは第１及び第２の一価抗原結合コンストラクトの組み合わせを前記対象へ投与することを含み、
    ａ）前記第１及び第２の一価抗原結合コンストラクトがそれぞれ、少なくとも１つの抗原結合ポリペプチドコンストラクトと、前記抗原結合ポリペプチドコンストラクトにリンカーによりまたはリンカーなしで連結した二量体Ｆｃとを含み；
    ｂ）各抗原結合ポリペプチドコンストラクトが、ヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２）の細胞外ドメイン２（ＥＣＤ２）、ＨＥＲ２のＥＣＤ４、またはＨＥＲ２のＥＣＤ１を特異的に結合し；かつ
    ｃ）前記第１の一価抗原結合コンストラクト及び前記第２の一価抗原結合コンストラクトが、重複していないエピトープに結合し、ＨＥＲ２への結合に関して互いに競合しない、
    前記方法。
  38. 前記二量体Ｆｃが少なくとも２つのＣＨ３ドメインを含み、前記二量体化ＣＨ３ドメインが約６８℃以上の融解温度（Ｔｍ）を有する、請求項３７に記載の方法。
  39. 各一価抗原結合コンストラクトが、ＨＥＲ２に特異的に結合する単一特異性二価抗原結合コンストラクトと比較してより大きい最大結合（Ｂｍａｘ）で、ＨＥＲ２に選択的に及び／または特異的に結合し、１：１のコンストラクト：標的比において、前記単一特異性二価抗原結合コンストラクトと比較したＢｍａｘの増加が、飽和濃度以下の前記コンストラクトについて観察された平衡定数（ＫＤ）を超える濃度で観察される、請求項３７に記載の方法。
  40. 前記第１及び第２の一価抗原結合コンストラクトが、
    ａ．細胞を各一価抗原結合コンストラクト単独及び／もしくはＨＥＲ２に特異的に結合する二価抗原結合コンストラクトと接触させた場合と比較して、細胞を双方のコンストラクトと接触させた場合に、ＦＡＣＳ及び／もしくは共焦点顕微鏡によって判定されるＳＫＯＶ３細胞における細胞表面修飾がより多いこと；及び／または
    ｂ．ＢＴ−４７４細胞を各一価抗原結合コンストラクト単独と接触させた場合と比較して、前記細胞を双方のコンストラクトと接触させた場合に、ＢＴ−４７４細胞における増殖阻害が増強されること；及び／または
    ｃ．ＳＫＯＶ３細胞を双方のコンストラクトと接触させた場合、ＳＫＯＶ３細胞中に双方の一価抗原結合コンストラクトが内部移行すること；及び／または
    ｄ．ＳＫＯＶ３細胞を双方のコンストラクトと接触させた場合、ＳＫＯＶ３細胞の抗体依存性細胞障害（ＡＤＣＣ）が媒介されること；及び／または
    ｅ．ＳＫＯＶ３及び／もしくはＪＩＭＴ−１細胞を各一価抗原結合コンストラクト単独と接触させた場合と比較して、前記細胞を双方のコンストラクトと接触させた場合に、ＳＫＯＶ３及び／もしくはＪＩＭＴ−１細胞における細胞毒性により測定される効力が増大すること；及び／または
    ｆ．ハーセプチン耐性ＪＩＭＴ−１細胞を各一価抗原結合コンストラクト単独と接触させた場合と比較して、前記細胞を双方のコンストラクトと接触させた場合に、ハーセプチン耐性ＪＩＭＴ−１細胞における細胞毒性により測定される効力が同等であること
    によって特徴付けられる、請求項３７に記載の方法。
  41. ＨＥＲ２＋癌細胞の増殖の阻害方法であって、対象に対して、前記ＨＥＲ２＋癌細胞を、第１の一価抗原結合コンストラクトと、または第１及び第２の一価抗原結合コンストラクトの組み合わせと接触させることを含み、
    ａ．前記第１及び第２の一価抗原結合コンストラクトがそれぞれ、少なくとも１つの抗原結合ポリペプチドコンストラクトと、前記抗原結合ポリペプチドにリンカーによりまたはリンカーなしで連結した二量体Ｆｃとを含み；
    ｂ．各抗原結合ポリペプチドコンストラクトが、ヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２）の細胞外ドメイン２（ＥＣＤ２）、ＨＥＲ２のＥＣＤ４、またはＨＥＲ２のＥＣＤ１に特異的に結合し；かつ、
    ｃ．前記第１の一価抗原結合コンストラクト及び前記第２の一価抗原結合コンストラクトが、重複していないエピトープに結合し、ＨＥＲ２への結合に関して互いに競合しない、
    前記方法。
  42. ＨＥＲ２＋癌細胞の死滅方法であって、対象に対して、前記ＨＥＲ２＋癌細胞を、第１の一価抗原結合コンストラクトと、または第１及び第２の一価抗原結合コンストラクトの組み合わせと接触させることを含み、
    ａ．前記第１及び第２の一価抗原結合コンストラクトがそれぞれ、少なくとも１つの抗原結合ポリペプチドコンストラクトと、前記抗原結合ポリペプチドコンストラクトにリンカーによりまたはリンカーなしで連結した二量体Ｆｃとを含み；
    ｂ．各抗原結合ポリペプチドコンストラクトが、ヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２）の細胞外ドメイン２（ＥＣＤ２）、ＨＥＲ２のＥＣＤ４、またはＨＥＲ２のＥＣＤ１に特異的に結合し；かつ、
    ｃ．前記第１の一価抗原結合コンストラクト及び前記第２の一価抗原結合コンストラクトが、重複していないエピトープに結合し、ＨＥＲ２への結合に関して互いに競合しない、
    前記方法。
  43. 前記二量体Ｆｃが少なくとも２つのＣＨ３ドメインを含み、前記二量体化ＣＨ３ドメインが、約６８℃以上の融解温度（Ｔｍ）を有する、請求項４１または４２に記載の方法。
  44. 各一価抗原結合コンストラクトが、ＨＥＲ２に特異的に結合する単一特異性二価抗原結合コンストラクトと比較してより大きい最大結合（Ｂｍａｘ）で、ＨＥＲ２に選択的に及び／または特異的に結合し、１：１のコンストラクト：標的比において、前記単一特異性二価抗原結合コンストラクトと比較したＢｍａｘの増加が、飽和濃度以下の前記コンストラクトについて観察された平衡定数（ＫＤ）を超える濃度で観察される、請求項４１または４２に記載の方法。
  45. 前記第１の一価抗原結合または第１及び第２の一価抗原結合コンストラクトの前記組み合わせが、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、またはＣＤＣによるＨＥＲ２＋癌細胞の死滅を媒介する、請求項４２に記載の方法。
  46. 前記第１の一価抗原結合または第１及び第２の一価抗原結合コンストラクトの前記組み合わせが薬物に複合体化されている、請求項４２に記載の方法。
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