JP2017509584A - 重度低血糖症の治療のための新規化合物 - Google Patents

Abstract

本発明は、低血糖症の治療に有用な新規化合物を提供する。【選択図】なし

Description

本発明は、糖尿病及び／または肥満の治療における使用のための、ヒトグルカゴンを超える改善された溶解度ならびに物理的及び化学的安定性を有する化合物に関する。

Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ（配列番号１）のアミノ酸配列を有するヒトグルカゴンは、膵臓において産生される２９個のアミノ酸のペプチドホルモンである。血中グルコースが降下し始めると、グルカゴンは肝臓に信号を送り、貯蔵されていたグリコーゲンをグルコースに分解して血流中に放出することにより、血中グルコースレベルを上昇させる。

糖尿病を有する対象において、低血糖症は、糖尿病治療の副作用として生じ得る。加えて、糖尿病患者における低血糖症に対する天然グルカゴン応答は損なわれており、グルコースレベルが正常範囲に戻ることをより困難にし得る。治療せずに放置すると、重度または急性低血糖症は、発作、意識喪失、脳損傷、または更には死亡などの深刻な問題を引き起こし得る。

グルカゴンの投与は、急性低血糖症の治療のための確立された療法である。緊急のグルカゴン投与は、投与から数分以内に正常なグルコースレベルを回復させることができる。しかしながら、投与のために調製されたグルカゴンは、いくつかの問題を有する。生理的ｐＨまたは生理的ｐＨ付近の水性緩衝液中では、グルカゴンは溶解度が不良である。低いｐＨまたは高いｐＨで調合された場合、グルカゴンはまた、ゲル化及び可溶性凝集体形成などの不良な化学的安定性及び不良な物理的安定性を示す。これらの問題を最低限に抑えるために、現在市販されているグルカゴン製品は、投与時に水でもどすようにという指示と共に、凍結乾燥した粉末として提供されている。緊急事態では、凍結乾燥した粉末を水でもどすことは、手間であり不便である。故に、生理的条件下でヒトグルカゴンの生物学的能力を維持し、同時に、非生理的条件下での十分な水溶解度、化学的安定性、及び物理的安定性も呈する、治療的使用のための化合物を提供することが望ましい。

アミノ酸置換によって酸性ｐＨ及び生理的ｐＨの緩衝液における溶解度及び安定性を改善したグルカゴン類似体が、国際公開第２００８０８６０８６号に開示されている。生理的条件下でヒトグルカゴンの生物学的能力を維持し、同時に、非生理的条件下での十分な溶解度ならびに化学的及び物理的安定性も呈する化合物が依然として必要である。

したがって、本発明は、野生型グルカゴン活性を維持するが、十分な溶解度ならびに化学的及び物理的安定性も呈する化合物を提供する。本発明はまた、ポンプ及び／または緊急投与に好適な化合物を提供する。加えて、本発明は、二室式ポンプ中で即効性のインスリン類似体と組み合わせて投与して、閉ループ血糖管理を提供することができる化合物を提供する。

本発明は、アミノ酸配列

Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−（Ａｉｂ）−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−ＮＨ_２（配列番号２）を含む化合物を提供する。本発明はまた、アミノ酸配列

Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−（Ａｉｂ）−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−ＮＨ_２（配列番号２）からなる化合物を提供する。意外なことに、本発明の化合物は、水溶液中のヒトグルカゴンと比較して、増加した水溶解度、増加した化学的安定性、及び減少したフィブリル化を呈することが見出された。加えて、本発明の化合物は、５〜７の範囲のｐＨにて強化された溶解度を示す。本発明の化合物はまた、ヒトグルカゴンと同様の活性、例えば、ヒトグルカゴンと比較して、グルカゴン受容体での効力、活性時間、及び選択性を提供する。故に、本発明の化合物は、重度または急性低血糖症を含む低血糖症を治療するのに好適である。本発明の化合物の改善された特性により、ポンプ投与及び重度低血糖症の治療のための水溶液中でのグルカゴンの調製も可能となる。

本発明は、配列番号２のアミノ酸配列を含む化合物を投与することを含む、対象における低血糖症を治療する方法を更に提供する。本発明はまた、配列番号２のアミノ酸配列からなる化合物を投与することを含む、対象における低血糖症を治療する方法も提供する。本発明は、療法における使用のための配列番号２のアミノ酸配列を含む化合物を更に提供する。本発明はまた、療法における使用のための配列番号２のアミノ酸配列からなる化合物も提供する。本発明はまた、低血糖症の治療における使用のための配列番号２のアミノ酸配列を含む化合物も提供する。本発明はまた、低血糖症の治療における使用のための配列番号２のアミノ酸配列からなる化合物も提供する。本発明は、低血糖症治療用の医薬品の製造における使用のための配列番号２のアミノ酸配列を含む化合物を提供する。本発明はまた、低血糖症治療用の医薬品の製造における使用のための配列番号２のアミノ酸配列からなる化合物を提供する。

本発明は、配列番号２のアミノ酸配列を含む化合物と薬学的に許容される緩衝液とを含む薬学的組成物を提供する。本発明はまた、配列番号２のアミノ酸配列からなる化合物と薬学的に許容される緩衝液とを含む薬学的組成物も提供する。本発明はまた、配列番号２のアミノ酸配列を含む化合物とヒスチジン緩衝液とを含む薬学的組成物も提供する。本発明はまた、配列番号２のアミノ酸配列からなる化合物とヒスチジン緩衝液とを含む薬学的組成物も提供する。本発明はまた、配列番号２のアミノ酸配列を含む化合物とヒスチジンとを含む薬学的組成物も提供する。本発明はまた、配列番号２のアミノ酸配列からなる化合物とヒスチジンとを含む薬学的組成物も提供する。本発明はまた、配列番号２のアミノ酸配列を含む化合物とヒスチジン緩衝生理食塩水とを含む薬学的組成物も提供する。本発明はまた、配列番号２のアミノ酸配列からなる化合物とヒスチジン緩衝生理食塩水とを含む薬学的組成物も提供する。薬学的組成物は水溶液であることが好ましい。本明細書で使用する場合、「薬学的に許容される緩衝液」という用語は、当業者に既知の標準的な薬学的緩衝液のいずれをも包含するように理解される。非経口投与のための薬学的に許容される緩衝液としては、例えば、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、クエン酸緩衝生理食塩水、及びヒスチジン緩衝生理食塩水が挙げられる。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡに記載のものなどの標準的な薬学的調合技法を用いてもよい。

本発明の化合物は、非経口、静脈内、皮下、筋肉内、または経皮などの任意の標準的な投与経路を使用して投与することができる。一実施形態では、本発明の化合物は、皮下または筋肉内投与される。

薬学的組成物は、生理学的に許容されるｐＨを有し得る。一実施形態では、薬学的組成物は、約４〜約８の範囲のｐＨを有し得る。より好ましくは、薬学的組成物は、約５〜約６のｐＨを有し得る。

本発明の化合物の用量は、約０．０１ｍｇ〜約１００ｍｇの範囲であることができる。用量は、約０．０１ｍｇ〜約１０ｍｇの範囲であり得る。用量はまた、約０．１ｍｇ〜約３ｍｇの範囲であってもよい。加えて、用量は、約０．０１ｍｇ〜約０．０３ｍｇの範囲であり得る。

本発明の化合物は、キットの一部として提供することができる。一実施形態では、キットは、化合物をヒト対象に投与するためのデバイスと共に提供される。より好ましくは、キットは、化合物を投与するための注射器及び注射針を含む。最も好ましくは、化合物は、注射器内の水溶液中で事前調合される。

本発明の化合物はまた、インスリンポンプまたは二重ホルモン（例えば、インスリン−グルカゴン）ポンプシステムなどのポンプシステムにおいて使用することもできる。

本明細書で使用する場合、「有効量」という用語は、対象への投与時に、許容できない副作用を引き起こすことなく所望の治療効果を生む量を意味すると理解される。例えば、本発明の化合物の「有効量」は、未治療の場合よりも優れた血中グルコース濃度の制御をもたらし得る量である。対象に投与される本発明の化合物の「有効量」は、疾患の種類及び重症度、ならびに全般的な健康、年齢、性別、体重、薬物耐性、及び血中グルコース調節不能の重症度が挙げられるがこれらに限定されない対象の特徴に依存し得る。

本明細書で使用する場合、「治療する」という用語は、低血糖症などの特定の障害または状態に関連する症状の緩和を意味すると理解される。

本発明のアミノ酸配列は、２０個の天然型アミノ酸の標準的な一文字表記または三文字表記を含む。加えて、「Ａｉｂ」はアルファアミノイソ酪酸である。

本明細書で使用する場合、「フィブリル化」は、グルカゴンが低いｐＨまたは高いｐＨで調合される場合に観察されるゲル化及び可溶性凝集体形成を指す。

実施例１：ペプチド合成
配列番号２の化合物を、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．のＳｙｍｐｈｏｎｙ上での固相ペプチド合成によって生成する。合成（０．１２５ｍｍｏｌスケール）を、約０．６８ｍｍｏｌ／ｇの置換で、Ｆｍｏｃ−Ｒｉｎｋアミドポリスチレン樹脂（Ｒａｐｐ Ｐｏｌｙｍｅｒｅ Ｔｕｂｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）上で行う。この合成は、Ｆｍｏｃ主鎖保護基戦略を使用して行う。使用するアミノ酸側鎖誘導体は、Ａｓｐ（Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチル、ＯｔＢｕ）、Ｇｌｎ（トリチル、Ｔｒｔ）、Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）、Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）、Ｌｙｓ（ｔｅｒｔ−ブトキシ−カルボニル、Ｂｏｃ）、Ｓｅｒ（ＯｔＢｕ）、Ｔｈｒ（ＯｔＢｕ）、Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）、及びＴｙｒ（ＯｔＢｕ）である。結合を、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中のジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）及びヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）（モル比１：１：１）で活性化した当量約１０のアミノ酸を用いて実行する。結合は、室温で９０分〜４時間実行される。

同時の樹脂からの開裂及び側鎖保護基除去を、室温で２時間、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）：トリイソプロピルシラン：１，２−エタンジチオール：水：チオアニソールを９０：４：２：２：２（ｖ／ｖ）で含有する溶液中で実行する。溶液を濾過し、ペプチドを冷ジエチルエーテルで沈殿させ、４０００ｒｐｍで３分間遠心分離させる（冷エーテルでの洗浄を３回繰り返す）。粗ペプチドを、１０％の酢酸を含有する４０ｍＬの水中に再溶解させ、Ｃ_１８逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）カラム（Ｗａｔｅｒｓ ＳｙｍｍｅｔｒｙＰｒｅｐ ７μｍ、１９×３００ｍｍ）上で１８ｍＬ／分の流量にて精製する。試料を、１００分間の１５〜５５％Ｂの線形ＡＢ勾配で溶出させ、ここで、Ａ＝０．０５％のＴＦＡ／Ｈ_２Ｏ及びＢ＝０．０４％のＴＦＡ／アセトニトリルである。産生物は、概して、約２６〜２８％のアセトニトリルで溶出する。ペプチド純度及び分子量を、シングル四重極ＭＳ検出器を持つＡｇｉｌｅｎｔ １１００ Ｓｅｒｉｅｓ液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ−ＭＳ）システム上で確認する。分析的ＨＰＬＣ分離を、１５分間の１０〜１００％Ｂの線形ＡＢ勾配で、Ｗａｔｅｒｓ ＳｙｍｍｅｔｒｙＳｈｉｅｌｄ ＲＰ１８、３．５μｍ、４．６ｍｍ×１００ｍｍカラム上で行い、ここで、Ａ＝０．０５％のＴＦＡ／Ｈ_２Ｏ及びＢ＝０．０４％のＴＦＡ／４０％のＨ_２Ｏ／６０％のアセトニトリルであり、流量は０．７ｍＬ／分（２２０ηｍの波長）である。化合物を、９５％を超える純度に精製し、１原子質量単位（ａｍｕ）以内の計算値と対応する分子量を有することを確認する。

ＴＦＡ塩を、ＡＧ １−Ｘ８ Ｒｅｓｉｎ（Ｂｉｏ−ＲＡＤ、酢酸形態、１００〜２００メッシュ、３．２ｍｅｑ／乾燥ｇ、含水率３９〜４８重量％）（アニオン交換樹脂）を使用して酢酸塩に変換する。例えば、４２２ｍｇのペプチドを、１２０ｍＬの３０％のアセトニトリル／Ｈ_２Ｏ中に溶解させる。４０ｇの樹脂（ペプチドの正電荷に対して約１００倍のモル比）を添加する。混合溶液を、室温で１時間、回転攪拌機によって混合する。混合溶液を濾過し、樹脂を３０％のＡＣＮ／Ｈ_２Ｏで５回洗浄する。原溶液と洗浄した溶液とを組み合わせ、凍結乾燥させる。

溶解度及び化学的安定性
配列番号２の化合物をＨ_２Ｏ中に溶解させて１０ｍｇ／ｍＬの濃度（ペプチド含量）にし、０．２２μｍのフィルタ（Ｍｉｌｌｅｘ，ＳＬＧＶ００４ＳＬ）を通して濾過した後、緩衝液Ｐ５（１０ｍＭのヒスチジン、Ｈ_２０中の１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ５．０）、または緩衝液Ｐ６（１０ｍＭのヒスチジン、Ｈ_２Ｏ中の１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．０）中で１ｍｇ／ｍＬに希釈する。各溶液を３つのバイアルに移し、加熱滅菌する。その後、試料を、４℃、３０℃、及び４０℃に維持する。試料を、濁度及び相分離について異なる時点で目視評価する。化合物の安定性を、１．２ｍＬ／分の流量（２２０ηｍの波長）で、５分間の５％Ｂ均一濃度、２０分間の５〜２５％Ｂ、３０分間の２５〜３０％Ｂ、及び１０分間の３０〜４５％ＢのＡＢ（Ａ＝０．０５％のＴＦＡ／Ｈ_２Ｏ、Ｂ＝０．０４％のＴＦＡ／アセトニトリル）勾配で、６０℃に加熱したＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ａｅｒｉｓ Ｗｉｄｅｐｏｒｅ、３．６μｍ、ＸＢ−Ｃ１８ ４．６×１００ｍｍカラム（Ｐ／ＮＯ ００Ｄ−４４８２−Ｅ０）上で分析的逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）によって評価する。

配列番号２の化合物は、目視評価とＲＰ−ＨＰＬＣとの両方によって、４週間を越えて、ｐＨ５（緩衝液Ｐ５）及びｐＨ６（緩衝液Ｐ６）にて、４℃、３０℃、及び４０℃で、良好な溶解度を維持する。物理的外観は無色透明であり、乳白光及び粒子はない。ＲＰ−ＨＰＬＣによるリカバリーは定量であり、表１に示す通りである。

配列番号２の化合物はまた、４週間、４℃、３０℃、及び４０℃に維持する場合、ｐＨ５（緩衝液Ｐ５）及びｐＨ６（緩衝液Ｐ６）にて化学的安定性を維持する。表２に示すように、ＲＰ−ＨＰＬＣにより試料の評価は、３０℃対４℃で４週間後にｐＨ５（緩衝液Ｐ５）とｐＨ６（緩衝液Ｐ６）との両方について１％未満、４０℃対４℃で４週間後にｐＨ５（緩衝液Ｐ５）にて６％未満、４０℃対４℃で４週間後にｐＨ６（緩衝液Ｐ６）にて４％未満の主ピークの変化を示す。

チオフラビンＴ結合アッセイを使用する物理的安定性試験
フィブリル化は、グルカゴンが水溶液中に形成される場合に一般的な問題である。本発明の化合物のフィブリル化のレベルを評価するために、チオフラビンＴ結合アッセイを行う。

配列番号２の化合物を、ノミサイズの撹拌棒（Ｆｉｓｈｅｒｓカタログ＃１４５１３６４）を含む２．５ｍＬの平底Ｆｉｓｈｅｒバイアル（Ｆｉｓｈｅｒ ＦＳ６０９６５Ｄ）中で、１ｍｇ／ｍＬで種々の試験緩衝液中に溶解させる。試験緩衝液をＨ_２Ｏ中で調製し、全てｐＨ６．０に調整する。
緩衝液１＝２０ｍＭのヒスチジン
緩衝液２＝１０ｍＭのヒスチジン、１５０ｎＭのＮａＣｌ
緩衝液３＝１０ｍＭのヒスチジン、３００ｍＭのソルビトール
緩衝液４＝１０ｍＭのヒスチジン、０．０２％のＴｗｅｅｎ８０
緩衝液５＝１０ｍＭのヒスチジン、３００ｍＭのアルギニン
緩衝液６＝１０ｍＭのヒスチジン、３００ｍＭのスクロース

加えて、ヒトグルカゴン（配列番号１）をｐＨ２．８の１２ｍｇ／ｍＬのグリセロール溶液中に溶解させて、１ｍｇ／ｍＬの最終グルカゴン濃度にする。全ての試料を、３００ｒｐｍに設定した磁気撹拌プレートにおいて２５℃で機械的に圧力を加える。異なる試料のアリコート（各１００μＬのアリコート、３連で行う）を、０、４０、及び１２０時間の時点で取り、プレートに加えた後、１０μＬの１ｍＭチオフラビンＴ（Ｔ３５５１６−２５Ｇ、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）（Ｈ_２Ｏ中のｐＨ２．８の１ｍＭ原液）を添加する。試料を３０分間インキュベートする。励起波長として４４０ηｍを使用するＳｐｅｃｔｒａｍａｘ Ｍ５（Ｍｏｌｅｃｕｌｅｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して蛍光を測定し、発光波長は、４７５ηｍのカットオフ及び自動感度調整で、４８０ηｍに設定する。Ｓｏｆｔｍａｘ Ｐｒｏ ５．４．１（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて生データ収集し、エクセルに取り込む。各時点あたり３つのウェルの平均が、以下の表３に示す報告する蛍光単位となる。

表３に示すように、配列番号２の化合物は、目視評価とチオフラビンＴ結合アッセイとの両方によって評価して、機械的圧力の存在下で２５℃及びｐＨ６にて物理的安定性を維持する。配列番号２の化合物は、チオフラビンＴ結合アッセイによって測定して、フィブリル化を示さなかった。

Ｃ５７／Ｂｌ６雄マウスにおける化合物の血中グルコースレベルに対する効果
配列番号２の化合物の血中グルコースレベルに対する効果を決定するために、化合物をＣ５７／Ｂ１６マウスに投与する。生後３カ月の雄のＣ５７ＢＬ６マウス（Ｈａｒｌａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用する。動物を、１２時間の明暗周期の温度制御された（２４℃）設備中に個々に収容し、飼料及び水に自由にアクセスさせる。１週間設備に順化させた後、マウスを治療群に無作為に割り付ける（ｎ＝４／群）。試験化合物を緩衝液２中で調合する（チオフラビンＴ結合アッセイを使用する物理的安定性試験を参照されたい）。試験の朝、午前０８：００に飼料を除去する。飼料を除去した２時間後、試験化合物を、０、１、３、または１０μｇ／ｋｇの用量で皮下に与える。血中グルコースを、ＡＣＣＵ−ＣＨＥＣＫ（登録商標）（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）血糖計を用いて、試験化合物投与後０、１５、３０、６０、及び１２０分の時点で測定する。表４は、異なる時点でのグルコース値を示す。結果を、１群あたり４匹のマウスの平均±標準誤差平均（ＳＥＭ）として表す。

ＥＤ_５０を、３０分のグルコース測定値を元に計算する。１０μｇ／ｋｇの配列番号２の化合物での血中グルコースレベルを最大値とする。配列番号２の化合物については、ＥＤ_５０は３．２８μｇ／ｋｇである（９５％の信頼区間）。結果は、配列番号２の化合物が、血中グルコースを増加させることができることを示す。

ヒトグルカゴン受容体結合アッセイ
配列番号２の化合物の結合を、ヒトグルカゴン受容体（ｈＧＲ）（Ｌｏｋ Ｓ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅ １４０（２），２０３−２０９（１９９４）、ＧｅｎＢａｎｋ：Ｌ２０３１６）を過剰発現している２９３ＨＥＫ細胞株を使用することによって決定する。

粗原形質膜を、懸濁または接着培養からの細胞を使用して調製する。細胞ペレットを、２０μｇ／ｍｌのデオキシリボヌクレアーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，１８０４７−０１９）によって低張均質化緩衝液（２５ｍＭのトリスＨＣｌ、ｐＨ７．５、１ｍＭのＭｇＣｌ_２、及びＥＤＴＡなしのＲｏｃｈｅ Ｃｏｍｐｌｅｔｅ（商標）Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｒｏｃｈｅ，１１８７３５８０００１））中の氷上で融解させる。細胞懸濁液を、テフロン乳棒を２５回使用してガラス製ダウンス型ホモジナイザーで均質化する。ホモジネートを、４℃で１５分間、１８００×ｇで遠心分離させた。上清を収集し、ペレットを、低張均質化緩衝液（デオキシリボヌクレアーゼなし）中に再懸濁させ、再度均質化した。混合物を１５分間１８００×ｇで遠心分離させる。第２の上清を、第１の上清と組み合わせ、１５分間１８００×ｇで遠心分離させて澄ませる。この澄ませた上清を、４℃で３０分間、２５０００×ｇで更に遠心分離させる。膜ペレットを、低張均質化緩衝液（デオキシリボヌクレアーゼなし）中に再懸濁させ、使用まで−８０℃で凍結アリコートとして貯蔵する。

ヒトグルカゴンを、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ／ＮＥＮ（ＮＥＸ２０７）にて、^１２５Ｉ−ラクトペルオキシダーゼ手順によって放射性ヨウ素標識し、逆相ＨＰＬＣによって精製する。比放射能は約２２００Ｃｉ／ｍｍｏｌである。Ｋ_Ｄ決定は、^１２５Ｉ標識化グルカゴン物質中のプロパノール含量が高いため、飽和結合の代わりに相同競合アッセイによって行う。Ｋ_Ｄは１．２４ηＭであると見積もり、これを使用して、試験した全ての化合物についてのＫｉ値を計算する。

受容体結合アッセイを、１％の脂肪酸不含ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（Ｇｉｂｃｏ、７．５％ＢＳＡ）で事前にブロックしたコムギ胚芽凝集素（ＷＧＡ）ビーズ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を用いて、シンチレーション近接アッセイ（ＳＰＡ）（Ｓｕｎ，Ｓ．，Ａｌｍａｄｅｎ，Ｊ．，Ｃａｒｌｓｏｎ，Ｔ．Ｊ．，Ｂａｒｋｅｒ，Ｊ．ａｎｄ Ｇｅｈｒｉｎｇ，Ｍ．Ｒ．Ａｓｓａｙ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｄａｔａ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｌｉｇａｎｄ ｂｉｎｄｉｎｇ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ ａｓｓａｙ．Ｍｅｔａｂ Ｅｎｇ．７：３８−４４（２００５））を使用して行う。グルカゴン（配列番号１）及び化合物（配列番号２）を、２ｍＭの濃度でジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中に溶解させ、−２０℃で凍結貯蔵する。

グルカゴン及び配列番号２の化合物をＤＭＳＯ中で連続希釈する。１０μＬの希釈した試料を、４０μＬのアッセイ結合緩衝液（ｐＨ７．４の２５ｍＭの４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、２．５ｍＭのＣａＣｌ_２、１ｍＭのＭｇＣｌ_２、０．１％の脂肪酸不含ＢＳＡ、０．００３％のＴｗｅｅｎ２０、及びＥＤＴＡなしのＲｏｃｈｅ Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒまたは冷グルカゴン（最終の１μＭで非特異的結合（ＮＳＢ））を含むＣｏｒｎｉｎｇ ３６３２透明底アッセイプレートに移す。９０μＬの膜（３μｇ／ウェル）、５０μＬの^１２５Ｉ標識化グルカゴン（反応物中０．１５ηＭの最終濃度）、及び５０μＬのＷＧＡビーズ（１５０μｇ／ウェル）を添加する。ＤＭＳＯ濃度は４．２％を超過しない。プレートを密封し、回転させて混合し、室温での１２時間の沈降時間の後、ＭｉｃｒｏＢｅｔａ（登録商標）シンチレーションカウンターで読み取る。

結果を、化合物の存在下での特異的な^１２５Ｉ標識化グルカゴン結合のパーセントとして計算する。化合物の絶対ＩＣ_５０濃度を、^１２５Ｉ標識化グルカゴンの特異的結合パーセント対添加した試料の濃度（８．５×１０^−１２〜０．５×１０^−７ｍｏｌ／Ｌ）の非線形回帰によって導く。ＩＣ_５０用量を、Ｃｈｅｎｇ−Ｐｒｕｓｏｆｆ等式を使用してＫｉに変換する（Ｃｈｅｎｇ Ｙ．，Ｐｒｕｓｏｆｆ Ｗ．Ｈ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２２：３０９９−３１０８（１９７３））。配列番号２の化合物のＫｉは、ｈＧＲ結合については０．３９７±０．０６２ηＭ（ｎ＝７）であった（ヒトグルカゴンのＫｉは、ｈＧＲ結合について１．６６±０．０９ηＭ（ｎ＝４７）であった）。このデータは、配列番号２の化合物が、ヒトグルカゴンと比較して増加した親和性でｈＧＲと結合し、その受容体を活性化することでグルカゴン依存性生理的応答を引き起こし得ることを示す。

マウスグルカゴン受容体結合アッセイ
配列番号２の化合物がマウスグルカゴン受容体（ｍＧＲ）と結合するかどうかを決定するために、ヒトグルカゴン受容体結合アッセイに本質的に記載するような結合アッセイを行う。クローン化ｍＧＲを発現している懸濁培養液中の２９３ＨＥＫ細胞から粗原形質膜を調製する。（（Ｂｕｒｃｅｌｉｎ Ｒ，Ｌｉ Ｊ，Ｃｈａｒｒｏｎ ＭＪ．Ｇｅｎｅ １６４（２），３０５−１０（１９９５）ＧｅｎＢａｎｋ：Ｌ３８６１３）。膜ペレットを、ヒトグルカゴン受容体結合アッセイに記載のように調製し、均質化緩衝液中に懸濁させ、使用まで−８０℃で凍結アリコートとして貯蔵する。

ヒトグルカゴンを、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ／ＮＥＮ（ＮＥＸ２０７）にて、^１２５Ｉ−ラクトペルオキシダーゼ手順によって放射性ヨウ素標識し、逆相ＨＰＬＣによって精製する。比放射能は約２２００Ｃｉ／ｍｍｏｌである。Ｋ_Ｄ決定は、^１２５Ｉ標識化グルカゴン物質中のプロパノール含量が高いため、飽和結合の代わりに相同競合アッセイによって行う。Ｋ_Ｄは２．０５ηＭであると見積もり、これを使用して、試験した全ての化合物についてのＫｉ値を計算する。

ＳＰＡ受容体結合アッセイ及び結果の計算を、ヒトグルカゴン受容体結合アッセイに記載のように実行する。配列番号２の化合物のＫｉは、ｍＧＲ結合については０．４９４±０．０５４ηＭ（ｎ＝７）であった（ヒトグルカゴンのＫｉは、ｍＧＲ結合について１．３７±０．０７ηＭ（ｎ＝３３）であった）。このデータは、配列番号２の化合物が、ヒトグルカゴンと比較して増加した親和性でｍＧＲと結合し、その受容体を活性化することでグルカゴン依存性生理的応答を引き起こし得ることを示す。

グルカゴン様ペプチド１受容体結合アッセイ
配列番号２の化合物がヒトグルカゴン様ペプチド１受容体（ｈＧＬＰ−１Ｒ）と結合するかどうかを決定するために、ヒトグルカゴン受容体結合アッセイに本質的に記載するような結合アッセイを行う。粗原形質膜を、２９３ＨＥＫ膜から単離したクローン化ヒトグルカゴン様ペプチド１受容体（ｈＧＬＰ−１Ｒ）（Ｇｒａｚｉａｎｏ ＭＰ，Ｈｅｙ ＰＪ，Ｂｏｒｋｏｗｓｋｉ Ｄ，Ｃｈｉｃｃｈｉ ＧＧ，Ｓｔｒａｄｅｒ ＣＤ，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ．１９６（１）：１４１−６（１９９３）ＧｅｎＢａｎｋ：ＮＭ＿００２０６２）を発現している２９３ＨＥＫ懸濁細胞から調製する。膜ペレットを、ヒトグルカゴン受容体結合アッセイに記載のように調製し、均質化緩衝液中に懸濁させ、使用まで−８０℃で凍結アリコートとして貯蔵する。

グルカゴン様ペプチド１アミド（ＧＬＰ−１アミド）（配列番号３）を、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ／ＮＥＮ（ＮＥＸ３０８）にて、^１２５Ｉ−ラクトペルオキシダーゼ手順によって放射性ヨウ素標識し、逆相ＨＰＬＣによって精製する。比放射能は約２２００Ｃｉ／ｍｍｏｌである。Ｋ_Ｄ決定は、^１２５Ｉ標識化ＧＬＰ−１物質中のプロパノール含量が高いため、飽和結合の代わりに相同競合アッセイによって行う。Ｋ_Ｄは０．３２９ηＭであると見積もり、これを使用して、試験した全ての化合物についてのＫｉ値を計算する。

ＳＰＡ受容体結合アッセイ及び結果の計算を、ヒトグルカゴン受容体結合アッセイの放射性ヨウ素標識化グルカゴンの代わりに放射性ヨウ素標識化ＧＬＰ−１アミドを使用することを除き、ヒトグルカゴン受容体結合アッセイに記載のように実行する。

配列番号２の化合物のＫｉは、ｈＧＬＰ−１Ｒ結合について１２２１±７８ηＭ（ｎ＝６）であり、グルカゴン（配列番号１）のＫｉは、２０９８±９１（ｎ＝１７）であった（ヒトＧＬＰ−１ ７−３６アミドのＫｉは、ｈＧＬＰ−１Ｒ結合について０．４２７±０．１６９ηＭ（ｎ＝６４）であった）。このデータは、配列番号２の化合物が低い親和性でｈＧＬＰ−１Ｒと結合するため、ＧＬＰ−１Ｒ媒介性生理学的応答を引き起こさないことを示す。

グルコース依存性インスリン分泌促進ペプチド受容体結合アッセイ
配列番号２の化合物がグルコース依存性インスリン分泌促進ペプチド受容体（ＧＩＰ−Ｒ）と結合するかどうかを決定するために、ヒトグルカゴン受容体結合アッセイに本質的に記載するような結合アッセイを行う。粗原形質膜を、懸濁培養からの細胞を使用して、ヒトＧＩＰ−Ｒ（Ｒ（Ｕｓｄｉｎ，Ｔ．Ｂ．、Ｇｒｕｂｅｒ，Ｃ．、Ｍｏｄｉ，Ｗ．、及びＢｏｎｎｅｒ，Ｔ．Ｉ．、ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＡ８４４１８．１）を発現している懸濁チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ−Ｓ）から調製する。膜ペレットを、ヒトグルカゴン受容体結合アッセイに記載のように調製し、均質化緩衝液中に懸濁させ、使用まで−８０℃で凍結アリコートとして貯蔵する。

ＧＩＰ（配列番号４）を、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ／ＮＥＮ（ＮＥＸ−４０２）にて、Ｉ−１２５−ラクトペルオキシダーゼ手順（Ｍａｒｋａｌｏｎｉｓ，Ｊ．Ｊ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１１３：２９９（１９６９））によって放射性ヨウ素標識し、逆相ＨＰＬＣによって精製する。比放射能は２２００Ｃｉ／ｍｍｏｌである。Ｋ_Ｄの決定は、飽和結合の代わりに、冷ヒトＧＩＰを使用する相同競合によって行う。Ｋ_Ｄは０．１７４ηＭであると見積もり、これを使用して、試験した全ての化合物についてのＫｉ値を計算する。

ＳＰＡ受容体結合アッセイ及び結果の計算を、ヒトグルカゴン受容体結合アッセイの放射性ヨウ素標識化グルカゴンの代わりに放射性ヨウ素標識化ＧＩＰを使用することを除き、ヒトグルカゴン受容体結合アッセイに記載のように実行する。

配列番号２の化合物のＫｉは、ヒトＧＩＰ−Ｒ結合について１０５４±１６７ηＭ（ｎ＝７）であり、グルカゴン（配列番号１）のＫｉは、３０１０（ｎ＝１）を超えた（ヒトＧＩＰ１−４２のＫｉは、０．２７９±０．０２１ηＭ、ｎ＝２であった）。このデータは、配列番号２の化合物が低い親和性でｈＧＩＰ−Ｒと結合するため、ｈＧＩＰ−Ｒ媒介性生理学的応答を引き起こさないことを示す。

ヒトグルカゴン受容体刺激ｃＡＭＰ機能アッセイ
ｈＧＲ刺激ｃＡＭＰ機能アッセイは、ヒトグルカゴン受容体結合アッセイにおいて上に記載したｈＧＲ結合アッセイに使用したものと同じクローン化ｈＧＲを発現している細胞株を使用する。細胞を、グルカゴン、緩衝液対照、または試験試料で刺激し、細胞内で生成されたｃＡＭＰを、ＣｉｓＢｉｏ ｃＡＭＰ Ｄｙｎａｍｉｃ ２ ＨＴＲＦ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（６２ＡＭ４ＰＥＣ）を使用して定量化する。手短に述べると、細胞内のｃＡＭＰレベルは、細胞融解緩衝液の存在下でのｃＡＭＰ−ｄ２捕捉抗体との結合によって検出される。キットで提供される第２の検出抗体である抗ｃＡＭＰクリプテートを添加して、競合サンドイッチアッセイを創出する。検出抗体複合体が形成されると、Ｐｅｒｋｉｎ−ＥｌｍｅｒのＥｎｖｉｓｉｏｎ（登録商標）計器で測定される信号が増加する。

ｈＧＲ−ＨＥＫ２９３細胞を、酵素不含細胞解離溶液（Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ Ｍｅｄｉａ ５−００４−Ｂ）を用いてサブコンフルエント状態の組織培養皿から採取する。細胞を、室温で５分間１００×ｇでペレット化した後、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄する。洗浄した細胞ペレットを、Ｒｅｃｏｖｅｒｙ（商標）凍結培地（Ｇｉｂｃｏ ２０４４）中に１×１０^７細胞／ｍｌで再懸濁させ、液体窒素中で凍結させる。処理当日に、細胞の凍結アリコートを、事前に温めた再懸濁細胞培地（０．５％の既知組成ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ ＳＨ３００７０）を含有するＤＭＥＭ，Ｇｉｂｃｏ（３１０５３Ｐ）、ｐＨ７．４の２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、及び２ｍＭのグルタミン）に移す。その後、細胞を、室温で５分間、１００×ｇでペレット化する。上清を除去し、細胞ペレットを、１．２５×１０^５細胞／ｍｌで細胞培地（０．１％の脂肪酸不含ウシ血清アルブミン、ＢＳＡ、７．５％（Ｇｉｂｃｏ １５６２０）を含むＤＭＥＭ，Ｇｉｂｃｏ（３１０５３Ｐ）、ｐＨ７．４の２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、及び２ｍＭのグルタミン）中に再懸濁させる。試験試料を、ＤＭＳＯ中の２ｍＭの原液として調製し、必要時まで−２０℃で凍結させる。グルカゴン、緩衝液対照、及び配列番号２の化合物を、ＤＭＳＯ中に連続希釈し、続いて、化合物希釈媒体（５００μＭのＩＢＭＸを含有するアッセイ媒体（０．１％の脂肪酸不含ウシ血清アルブミン、ＢＳＡ、７．５％（Ｇｉｂｃｏ １５６２０）を含むＤＭＥＭ，Ｇｉｂｃｏ（３１０５３Ｐ）、ｐＨ７．４の２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、及び２ｍＭのグルタミン））中に逓減希釈する。２０μＬの細胞（２５００細胞／ウェル）またはｃＡＭＰ標準曲線試料を黒色の９６ウェルプレートハーフエリアプレート（Ｃｏｓｔａｒ ３６９４）に添加し、続いて、２０μＬの２倍濃縮グルカゴン、緩衝液対照、または配列番号２の化合物のいずれかを化合物希釈媒体に添加することによって、４０μＬ中で反応を行う。最終ＤＭＳＯ濃度は１．１％を超過せず、最終ＩＢＭＸ濃度は２５０μＭである。ＣｉｓＢｉｏ融解緩衝液中に希釈した２０μＬのｃＡＭＰ−ｄ２−捕捉抗体（ＣｉｓＢｉｏ）を添加することで反応を停止させた後、ＴＩＴＥＲＴＥＫシェーカー中で穏やかに混合した。５分の融解の後、２０μＬの検出抗体である抗ｃＡＭＰクリプテート（ＣｉｓＢｉｏ）を添加し、６００ｒｐｍで１分間混合した後、３００ｒｐｍで振盪させる。融解させた細胞と抗体との混合物を、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｅｎｖｉｓｉｏｎ（登録商標）を使用して、１時間後に室温で読み取る。Ｅｎｖｉｓｉｏｎ（登録商標）単位を、ｃＡＭＰ標準曲線を使用してρｍｏｌ／Ｌ ｃＡＭＰ／ウェルに変換した。各ウェルで生成されたｃＡＭＰのピコモルを、グルカゴン対照で観察された最大応答のパーセントに変換する。相対ＥＣ_５０値を、最大応答パーセント対添加したペプチドの濃度（０．１７×１０^−１２〜１×１０^−８Ｍ）を使用する非線形回帰分析によって導く。

配列番号２の化合物は、０．０３５６±０．００７１ηＭ（ｎ＝８）のＥＣ_５０でｈＧＲと結合した（ヒトグルカゴンのＥＣ_５０は０．０１４２±０．００１８ηＭ、ｎ＝６であった）。このデータは、配列番号１の化合物が、ｈＧＲと結合し、ｈＧＲを活性化し、それによりグルカゴン受容体媒介性生理学的応答を引き起こし得ることを示す。

配列一覧
ヒトグルカゴン：
Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ（配列番号１）
実施例１
Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−（Ａｉｂ）−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−ＮＨ_２（配列番号２）
ヒトＧＬＰ−１：
Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＮＨ_２（配列番号３）
ヒトＧＩＰ：
Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−Ａｓｎ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ（配列番号４）

配列一覧
ヒトグルカゴン：
Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ（配列番号１）
実施例１
Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−（Ａｉｂ）−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−ＮＨ_２（配列番号２）
ヒトＧＬＰ−１：
Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＮＨ_２（配列番号３）
ヒトＧＩＰ：
Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−Ａｓｎ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ（配列番号４）

本発明は、以下の態様を含む。
［１］
Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−（Ａｉｂ）−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−ＮＨ _２ （配列番号２）のアミノ酸配列を含む、化合物。
［２］
前記化合物が、Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−（Ａｉｂ）−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−ＮＨ _２ （配列番号２）のアミノ酸配列からなる、［１］に記載の前記化合物。
［３］
［１］または［２］に記載の前記化合物と、薬学的に許容される緩衝液とを含む、薬学的組成物。
［４］
前記薬学的に許容される緩衝液が、ヒスチジン緩衝生理食塩水である、［２］に記載の前記薬学的組成物。
［５］
有効量の［１］または［２］に記載の化合物を投与することを含む、対象における低血糖症を治療する方法。
［６］
療法における使用のための、［１］または［２］に記載の化合物。
［７］
低血糖症の治療における使用のための、［１］または［２］に記載の化合物。
［８］
低血糖症治療用の医薬品の製造における使用のための、［１］または［２］に記載の化合物。

Claims (8)

1. Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−（Ａｉｂ）−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−ＮＨ_２（配列番号２）のアミノ酸配列を含む、化合物。
2. 前記化合物が、Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−（Ａｉｂ）−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−ＮＨ_２（配列番号２）のアミノ酸配列からなる、請求項１に記載の前記化合物。
3. 請求項１または請求項２に記載の前記化合物と、薬学的に許容される緩衝液とを含む、薬学的組成物。
4. 前記薬学的に許容される緩衝液が、ヒスチジン緩衝生理食塩水である、請求項３に記載の前記薬学的組成物。
5. 有効量の請求項１または請求項２に記載の化合物を投与することを含む、対象における低血糖症を治療する方法。
6. 療法における使用のための、請求項１または請求項２に記載の化合物。
7. 低血糖症の治療における使用のための、請求項１または請求項２に記載の化合物。
8. 低血糖症治療用の医薬品の製造における使用のための、請求項１または請求項２に記載の化合物。