JP2017509594A - マトリプターゼ及びｕ‐プラスミノーゲン活性化因子の基質及び他の切断可能部分、並びにその使用方法 - Google Patents

マトリプターゼ及びｕ‐プラスミノーゲン活性化因子の基質及び他の切断可能部分、並びにその使用方法 Download PDF

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Abstract

本発明は概して、マトリプターゼ及びｕ‐プラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）から選択される少なくとも１つのプロテアーゼのための基質である切断可能部分を含んでいるポリペプチド、マトリプターゼ及びｕ‐プラスミノーゲン活性化因子から選択される少なくとも１つのプロテアーゼのための基質である切断可能部分を含んでいる活性化可能抗体及び他の大型分子、並びにマトリプターゼ及びｕ‐プラスミノーゲン活性化因子から選択される少なくとも１つのプロテアーゼのための基質である切断可能部分を含んでいるこれらのポリペプチドの作製方法、及びさまざまな治療適応、診断適応及び予防適応における使用方法に関する。

Description

関連出願
本出願は、２０１４年１月３１日に出願された米国特許仮出願第６１／９３４，６１９号及び２０１４年３月２７日に出願された米国特許仮出願第６１／９７１，００９号の利益を主張する。これらの出願のそれぞれの内容を、それらの全体として参照により本明細書中に援用する。
発明の分野
本発明は概して、マトリプターゼ及びｕ‐プラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）から選択される少なくとも１つのプロテアーゼのための基質である切断可能部分を含んでいるポリペプチド、マトリプターゼ及びｕＰＡから選択される少なくとも１つのプロテアーゼのための基質である切断可能部分を含んでいる活性化可能抗体及び他の大型分子、並びにマトリプターゼ及びｕＰＡから選択される少なくとも１つのプロテアーゼのための基質である切断可能部分を含んでいるこれらのポリペプチドの作製方法、及びさまざまな治療適応、診断適応及び予防適応における使用方法に関する。
プロテアーゼは、アミノ酸残基間のペプチド結合を切断する酵素である。一部のプロテアーゼは、タンパク質内の特定のアミノ酸配列の存在に基づいて特定のペプチド結合を壊すことが知られている。プロテアーゼは、すべての生物体内で自然に生じ、簡単な分解から高度に調整された経路までさまざまな生理的反応に関与している。しかしながら、多くの病的状態が、調節を逸脱したプロテアーゼの発現及び／又は活性に関連している。このように、不適切なタンパク質分解が、癌、並びに心臓血管疾患、炎症性疾患、神経変性疾患、真核生物性疾患、細菌性疾患、ウイルス性疾患、及び寄生虫性疾患の発生及び進行において主要な役割を担っている可能性がある。
従って、プロテアーゼのための新しい基質を同定する必要性、並びにさまざまな治療的、診断的、及び予防的適応においてこれらの基質を使用する必要性が存在する。
本開示では、マトリプターゼ（本明細書中ではＭＴ‐ＳＰ１、マトリプターゼ‐１、及びマトリプターゼを意味する類似語でも呼ばれる）及びｕ‐プラスミノーゲン活性化因子（本明細書中ではｕＰＡ、ウロキナーゼ、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子、及びｕＰＡを意味する類似語でも呼ばれる）から選択される少なくとも１つのプロテアーゼのための基質である切断可能部分（ＣＭ）を含んでいるアミノ酸配列を提供する。これらのＣＭはさまざまな治療的、診断的、及び予防的適応において有用である。
いくつかの実施形態において、ＣＭは、抗体に連結されているか又は別の方法で取り付けられている。例えば、ＣＭは、プロテアーゼ、すなわち、マトリプターゼ及び／又はｕＰＡに晒されると、ＣＭが切断され、そして剤が抗体又はその抗原結合フラグメントから放出されるように、所定の標的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメントに１若しくは複数の剤を連結するのに使用される。代表的な標的としては、これだけに限定されるものではないが、表１に示した標的が挙げられる。代表的な抗体又はその抗原結合フラグメントとしては、これだけに限定されるものではないが、表２に示した標的が挙げられる。いくつかの実施形態において、未切断状態の抗体は、以下のようなＮ末端からＣ末端への構造配置：剤‐ＣＭ‐（抗体又は抗原結合フラグメント）又は（抗体又は抗原結合フラグメント）‐ＣＭ‐剤を有する。いくつかの実施形態において、抗体は、抗体又は抗原結合フラグメントとＣＭとの間に連結ペプチドを含む。いくつかの実施形態において、抗体又は抗原結合フラグメントは、ＣＭと複合化剤との間に連結ペプチドを含む。
いくつかの実施形態において、抗体は、第１連結ペプチド（ＬＰ１）及び第２連結ペプチド（ＬＰ２）を含み、ここで、抗体は、未切断状態で以下のようなＮ末端からＣ末端への構造配置：剤‐ＬＰ１‐ＣＭ‐ＬＰ２‐（抗体又は抗原結合フラグメント）又は（抗体又は抗原結合フラグメント）‐ＬＰ２‐ＣＭ‐ＬＰ１‐剤を有する。いくつかの実施形態において、２つの連結ペプチドは、互いに同一である必要はない。
いくつかの実施形態において、ＬＰ１又はＬＰ２のうちの少なくとも１つは、（ＧＳ）ｎ、（ＧＧＳ）ｎ、（ＧＳＧＧＳ）ｎ（配列番号３８５）及び（ＧＧＧＳ）ｎ（配列番号３８６）｛ここで、ｎは少なくとも１つの整数である｝から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、ＬＰ１又はＬＰ２のうちの少なくとも１つは、ＧＧＳＧ（配列番号３８７）、ＧＧＳＧＧ（配列番号３８８）、ＧＳＧＳＧ（配列番号３８９）、ＧＳＧＧＧ（配列番号３９０）、ＧＧＧＳＧ（配列番号３９１）、及びＧＳＳＳＧ（配列番号３９２）から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、ＬＰ１は、アミノ酸配列ＧＳＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧ（配列番号３９３）、ＧＳＳＧＧＳＧＧＳＧＧ（配列番号３９４）、ＧＳＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳ（配列番号３９５）、ＧＳＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号３９６）、ＧＳＳＧＧＳＧＧＳＧ（配列番号３９７）、又はＧＳＳＧＧＳＧＧＳＧＳ（配列番号３９８）を含む。
いくつかの実施形態において、ＬＰ２は、アミノ酸配列ＧＳＳ、ＧＧＳ、ＧＧＧＳ（配列番号３９９）、ＧＳＳＧＴ（配列番号４００）又はＧＳＳＧ（配列番号４０１）を含む。
いくつかの実施形態において、抗体又はその抗原結合フラグメントは、標的への結合に関して約１００ｎＭ以下の平衡解離定数を有する。
いくつかの実施形態において、抗体又はその抗原結合フラグメントは、標的を特異的に結合する。いくつかの実施形態において、標的を結合する抗体又はその免疫学的活性フラグメントは、モノクローナル抗体、ドメイン抗体、単鎖、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、ｓｃＦｖ、ｓｃＡｂ、ｄＡｂ、単一ドメインＨ鎖抗体、又は単一ドメインＬ鎖抗体である。いくつかの実施形態において、標的に結合する斯かる抗体又はその免疫学的活性フラグメントは、マウス、他の齧歯動物、キメラ、ヒト化又は完全なヒトモノクローナル抗体である。
いくつかの実施形態において、プロテアーゼ、すなわち、マトリプターゼ及び／又はｕＰＡは組織内で標的と共局在し、そして抗体がプロテアーゼに晒されるとき、プロテアーゼは抗体内のＣＭを切断する。
いくつかの実施形態において、ＣＭは長さが最大１５アミノ酸のポリペプチドである。
いくつかの実施形態において、ＣＭは少なくともマトリプターゼのための基質である。いくつかの実施形態において、ＣＭは少なくともｕＰＡのための基質である。いくつかの実施形態において、ＣＭは少なくともマトリプターゼ及びｕＰＡのための基質である。
いくつかの実施形態において、ＣＭはマトリプターゼ及び／又はｕＰＡのための基質であり、少なくとももう一方のプロテアーゼによる切断に対して抵抗性の基質である。いくつかの実施形態において、ＣＭはマトリプターゼ及び／又はｕＰＡのための基質であり、少なくともプラスミンによる切断に対して抵抗性の基質である。いくつかの実施形態において、ＣＭはマトリプターゼ及び／又はｕＰＡのための基質であり、少なくとも組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）による切断に対して抵抗性の基質である。
いくつかの実施形態において、ＣＭはマトリプターゼ及び／又はｕＰＡのための基質であり、マトリプターゼ及び／又はｕＰＡによって認識されるモチーフ配列を含んでいるが、但し、本開示の任意のモチーフ配列に関して：
（ｉ）ＣＭは、以下のアミノ酸配列ＴＧＲＧＰＳＷＶ（配列番号４０２）、ＳＡＲＧＰＳＲＷ（配列番号４０３）、又はＴＡＲＧＰＳＦＫ（配列番号４０４）のいずれも含まず；且つ、ＣＭは、例えば、ＴＡＲＧＰＳＷ（配列番号４０５）などのこれらのアミノ酸配列に基づくコンセンサスアミノ酸配列を含まず；
（ｉｉ）ＣＭは、以下のアミノ酸配列ＬＳＧＲＳＤＮＨ（配列番号４０６）、ＧＧＷＨＴＧＲＮ（配列番号４０７）、ＨＴＧＲＳＧＡＬ（配列番号４０８）、又はＰＬＴＧＲＳＧＧ（配列番号４０９）のいずれも含まず；且つ、ＣＭは、例えば、ＬＴＧＲＳＧＡ（配列番号４１０）などのこれらのアミノ酸配列に基づくコンセンサスアミノ酸配列を含まず；及び／又は
（ｉｉｉ）ＣＭは、以下のアミノ酸配列ＡＡＲＧＰＡＩＨ（配列番号４１１）、ＲＧＰＡＦＮＰＭ（配列番号４１２）、ＳＳＲＧＰＡＹＬ（配列番号４１３）、又はＲＧＰＡＴＰＩＭ（配列番号４１４）のいずれも含まず；且つ、ＣＭは、例えば、ＲＧＰＡ（配列番号４１５）などのこれらのアミノ酸配列に基づくコンセンサスアミノ酸配列を含まない。
いくつかの実施形態において、モチーフ配列は、少なくともマトリプターゼのための基質であり、且つ、以下の表８Ａ〜８Ｊに示すコアＣＭコンセンサス配列を含む。いくつかの実施形態において、モチーフ配列は、以下の表８Ａ〜８Ｊに示すコアＣＭコンセンサス配列の亜属（subgenus）、すなわち、亜群（subset）を含む。
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いくつかの実施形態において、モチーフ配列は、少なくともマトリプターゼのための基質であり、且つ、表８Ａ〜８Ｊに示すコアＣＭコンセンサス配列の１つに基づく拡張コンセンサス配列を含む。いくつかの実施形態において、拡張コンセンサス配列は、以下の表９Ａ〜９Ｊ‐３に示すコンセンサス配列である。
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いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＡＡＰＲＳ（配列番号１６３）を含むコアＣＭコンセンサス１配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＡＡＰＲＳＦ（配列番号１６４）を含む拡張コアＣＭコンセンサス１配列を含む。
いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＳＲＲＶＰ（配列番号１６５）を含むコアＣＭコンセンサス２配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭは、ＱＳＲＲＶＰ（配列番号１６６）、ＱＴＲＲＶＰ（配列番号１６７）、ＳＲＲＶＰＬ（配列番号１６８）、ＳＲＲＶＰＶ（配列番号１６９）、ＱＳＲＲＶＰＬ（配列番号１７０）、ＱＳＲＲＶＰＶ（配列番号１７１）、ＱＴＲＲＶＰＬ（配列番号１７２）、及びＱＴＲＲＶＰＶ（配列番号１７３）から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む拡張コアＣＭコンセンサス２配列を含む。
いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＱＳＲＲＶＰ（配列番号１６６）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＱＴＲＲＶＰ（配列番号１６７）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＳＲＲＶＰＬ（配列番号１６８）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＳＲＲＶＰＶ（配列番号１６９）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＱＳＲＲＶＰＬ（配列番号１７０）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＱＳＲＲＶＰＶ（配列番号１７１）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＱＴＲＲＶＰＬ（配列番号１７２）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＱＴＲＲＶＰＶ（配列番号１７３）を含む。
いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＰＰＬＧＲ（配列番号１７４）を含むコアＣＭコンセンサス３配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭは、ＧＰＰＬＧＲ（配列番号１７５）、ＳＰＰＬＧＲ（配列番号１７６）、ＣＧＰＰＬＧＲ（配列番号１７７）、ＣＳＰＰＬＧＲ（配列番号１７８）、ＧＧＰＰＬＧＲ（配列番号１７９）、ＧＳＰＰＬＧＲ（配列番号１８０）、ＳＧＰＰＬＧＲ（配列番号１８１）、ＳＳＰＰＬＧＲ（配列番号１８２）、ＧＣＧＰＰＬＧＲ（配列番号１８３）、ＧＣＳＰＰＬＧＲ（配列番号１８４）、ＧＧＧＰＰＬＧＲ（配列番号１８５）、ＧＧＳＰＰＬＧＲ（配列番号１８６）、ＧＳＧＰＰＬＧＲ（配列番号１８７）、ＧＳＳＰＰＬＧＲ（配列番号１８８）、ＳＣＧＰＰＬＧＲ（配列番号１８９）、ＳＣＳＰＰＬＧＲ（配列番号１９０）、ＳＧＧＰＰＬＧＲ（配列番号１９１）、ＳＧＳＰＰＬＧＲ（配列番号１９２）、ＳＳＧＰＰＬＧＲ（配列番号１９３）、及びＳＳＳＰＰＬＧＲ（配列番号１９４）から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む拡張コアＣＭコンセンサス３配列を含む。
いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＧＰＰＬＧＲ（配列番号１７５）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＳＰＰＬＧＲ（配列番号１７６）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＣＧＰＰＬＧＲ（配列番号１７７）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＣＳＰＰＬＧＲ（配列番号１７８）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＧＧＰＰＬＧＲ（配列番号１７９）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＧＳＰＰＬＧＲ（配列番号１８０）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＳＧＰＰＬＧＲ（配列番号１８１）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＳＳＰＰＬＧＲ（配列番号１８２）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＧＣＧＰＰＬＧＲ（配列番号１８３）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＧＣＳＰＰＬＧＲ（配列番号１８４）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＧＧＧＰＰＬＧＲ（配列番号１８５）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＧＧＳＰＰＬＧＲ（配列番号１８６）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＧＳＧＰＰＬＧＲ（配列番号１８７）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＧＳＳＰＰＬＧＲ（配列番号１８８）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＳＣＧＰＰＬＧＲ（配列番号１８９）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＳＣＳＰＰＬＧＲ（配列番号１９０）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＳＧＧＰＰＬＧＲ（配列番号１９１）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＳＧＳＰＰＬＧＲ（配列番号１９２）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＳＳＧＰＰＬＧＲ（配列番号１９３）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＳＳＳＰＰＬＧＲ（配列番号１９４）を含む。
いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＬＲＳＧＷ（配列番号１９５）を含むコアＣＭコンセンサス４配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭは、ＭＬＲＳＧＷ（配列番号１９６）、ＭＬＲＳＧＷＲ（配列番号１９７）、ＭＬＲＳＧＷＲＧ（配列番号１９８）、ＭＬＲＳＧＷＲＬ（配列番号１９９）、及びＭＬＲＳＧＷＲＳ（配列番号２００）から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む拡張コアＣＭコンセンサス４配列を含む。
いくつかの実施形態において、アミノ酸配列ＭＬＲＳＧＷ、（配列番号１９６）をＣＭは含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＭＬＲＳＧＷＲ（配列番号１９７）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＭＬＲＳＧＷＲＧ（配列番号１９８）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＭＬＲＳＧＷＲＬ（配列番号１９９）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＭＬＲＳＧＷＲＳ（配列番号２００）を含む。
いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＶＳＲＳＡ（配列番号２０１）を含むコアＣＭコンセンサス５配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭは、ＩＶＳＲＳＡ（配列番号２０２）、ＹＩＶＳＲＳＡ（配列番号２０３）、及びＱＹＩＶＳＲＳＡ（配列番号２０４）から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む拡張コアＣＭコンセンサス５配列を含む。
いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＩＶＳＲＳＡ（配列番号２０２）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＹＩＶＳＲＳＡ（配列番号２０３）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＱＹＩＶＳＲＳＡ（配列番号２０４）を含む。
いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＡＬＲＡＰ（配列番号２０５）を含むコアＣＭコンセンサス６配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭは、アミノ酸配列ＲＡＬＲＡＰ（配列番号２０６）を含む拡張コアＣＭコンセンサス６配列を含む。
いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＰＡＧＲＲ（配列番号２０７）を含むコアＣＭコンセンサス７配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭは、ＰＡＧＲＲＳ（配列番号２０８）、ＰＡＧＲＲＳＬ（配列番号２０９）、ＶＰＡＧＲＲＳ（配列番号２１０）、及びＶＰＡＧＲＲＳＬ（配列番号２１１）から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む拡張コアＣＭコンセンサス７配列を含む。
いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＰＡＧＲＲＳ（配列番号２０８）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＰＡＧＲＲＳＬ（配列番号２０９）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＶＰＡＧＲＲＳ（配列番号２１０）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＶＰＡＧＲＲＳＬ（配列番号２１１）を含む。
いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＧＲＳＭＬ（配列番号２１２）を含むコアＣＭコンセンサス８配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭは、ＧＲＳＭＬＬ（配列番号２１３）、ＧＲＳＭＬＭ（配列番号２１４）、ＧＲＳＭＬＬＧ（配列番号２１５）、ＧＲＳＭＬＬＰ（配列番号２１６）、ＧＲＳＭＬＬＳ（配列番号２１７）、ＧＲＳＭＬＭＧ（配列番号２１８）、ＧＲＳＭＬＭＰ（配列番号２１９）、ＧＲＳＭＬＭＳ（配列番号２２０）、ＧＲＳＭＬＬＧＧ（配列番号２２１）、ＧＲＳＭＬＬＰＧ（配列番号２２２）、ＧＲＳＭＬＬＳＧ（配列番号２２３）、ＧＲＳＭＬＭＧＧ（配列番号２２４）、ＧＲＳＭＬＭＰＧ（配列番号２２５）、ＧＲＳＭＬＭＳＧ（配列番号２２６）、ＧＲＳＭＬＬＧＰ（配列番号２２７）、ＧＲＳＭＬＬＰＰ（配列番号２２８）、ＧＲＳＭＬＬＳＰ（配列番号２２９）、ＧＲＳＭＬＭＧＰ（配列番号２３０）、ＧＲＳＭＬＭＰＰ（配列番号２３１）、ＧＲＳＭＬＭＳＰ（配列番号２３２）、ＧＲＳＭＬＬＧＳ（配列番号２３３）、ＧＲＳＭＬＬＰＳ（配列番号２３４）、ＧＲＳＭＬＬＳＳ（配列番号２３５）、ＧＲＳＭＬＭＧＳ（配列番号２３６）、ＧＲＳＭＬＭＰＳ（配列番号２３７）、及びＧＲＳＭＬＭＳＳ（配列番号２３８）から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む拡張コアＣＭコンセンサス８配列を含む。
いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＧＲＳＭＬＬ（配列番号２１３）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＧＲＳＭＬＭ（配列番号２１４）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＧＲＳＭＬＬＧ（配列番号２１５）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＧＲＳＭＬＬＰ（配列番号２１６）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＧＲＳＭＬＬＳ（配列番号２１７）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＧＲＳＭＬＭＧ（配列番号２１８）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＧＲＳＭＬＭＰ（配列番号２１９）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＧＲＳＭＬＭＳ（配列番号２２０）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＧＲＳＭＬＬＧＧ（配列番号２２１）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＧＲＳＭＬＬＰＧ（配列番号２２２）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＧＲＳＭＬＬＳＧ（配列番号２２３）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＧＲＳＭＬＭＧＧ（配列番号２２４）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＧＲＳＭＬＭＰＧ（配列番号２２５）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＧＲＳＭＬＭＳＧ（配列番号２２６）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＧＲＳＭＬＬＧＰ（配列番号２２７）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＧＲＳＭＬＬＰＰ（配列番号２２８）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＧＲＳＭＬＬＳＰ（配列番号２２９）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＧＲＳＭＬＭＧＰ（配列番号２３０）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＧＲＳＭＬＭＰＰ（配列番号２３１）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＧＲＳＭＬＭＳＰ（配列番号２３２）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＧＲＳＭＬＬＧＳ（配列番号２３３）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＧＲＳＭＬＬＰＳ（配列番号２３４）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＧＲＳＭＬＬＳＳ（配列番号２３５）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＧＲＳＭＬＭＧＳ（配列番号２３６）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＧＲＳＭＬＭＰＳ（配列番号２３７）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＧＲＳＭＬＭＳＳ（配列番号２３８）を含む。
いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＬＡＲＡＧ（配列番号２３９）を含むコアＣＭコンセンサス９配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭは、ＬＡＲＡＧＩ（配列番号２４０）、ＬＡＲＡＧＬ（配列番号２４１）、ＰＬＡＲＡＧＩ（配列番号２４２）、ＰＬＡＲＡＧＬ（配列番号２４３）、ＲＰＬＡＲＡＧＩ（配列番号２４４）、及びＲＰＬＡＲＡＧＬ（配列番号２４５）から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む拡張コアＣＭコンセンサス９配列を含む。
いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＬＡＲＡＧＩ（配列番号２４０）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＬＡＲＡＧＬ（配列番号２４１）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＰＬＡＲＡＧＩ（配列番号２４２）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＰＬＡＲＡＧＬ（配列番号２４３）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＲＰＬＡＲＡＧＩ（配列番号２４４）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＲＰＬＡＲＡＧＬ（配列番号２４５）を含む。
いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＥＳＲＲＷ（配列番号２４６）を含むコアＣＭコンセンサス１０配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭは、ＥＳＲＲＷＭ（配列番号２４７）、ＥＳＲＲＷＭＰ（配列番号２４８）、及びＰＥＳＲＲＷＭＰ（配列番号２４９）から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む拡張コアＣＭコンセンサス１０配列を含む。
いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＥＳＲＲＷＭ（配列番号２４７）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＥＳＲＲＷＭＰ（配列番号２４８）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＰＥＳＲＲＷＭＰ（配列番号２４９）を含む。
いくつかの実施形態において、ＣＭは、ＩＬＰＲＳＰＡＦ（配列番号２５０）、ＶＡＧＲＳＭＲＰ（配列番号２５１）、ＶＶＰＥＧＲＲＳ（配列番号２５２）、ＱＧＲＡＩＴＦＩ（配列番号２５３）、ＶＬＳＫＱＭＳＦ（配列番号２５４）、ＬＫＧＲＳＹＹＹ（配列番号２５５）、ＫＲＭＰＶＱＦＬ（配列番号２５６）、ＰＱＨＲＩＶＳＦ（配列番号２５７）、ＹＫＫＦＶＧＳＬ（配列番号２５８）、ＨＭＭＱＹＡＲＨ（配列番号２５９）、ＩＰＦＳＷＳＲＦ（配列番号２６０）、ＬＳＱＡＲＷＲＫ（配列番号２６１）、ＤＩＳＨＷＲＲＳ（配列番号２６２）、ＲＫＴＶＱＨＷＷ（配列番号２６３）、ＲＦＹＲＮＱＦＦ（配列番号２６４）、ＲＳＬＶＦＡＰＩ（配列番号２６５）、ＲＳＰＳＲＬＫＣ（配列番号２６６）、及びＲＫＭＰＮＩＴＶ（配列番号２６７）から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＩＬＰＲＳＰＡＦ（配列番号２５０）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＶＡＧＲＳＭＲＰ（配列番号２５１）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＶＶＰＥＧＲＲＳ（配列番号２５２）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＱＧＲＡＩＴＦＩ（配列番号２５３）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＶＬＳＫＱＭＳＦ（配列番号２５４）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＬＫＧＲＳＹＹＹ（配列番号２５５）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＫＲＭＰＶＱＦＬ（配列番号２５６）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＰＱＨＲＩＶＳＦ（配列番号２５７）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＹＫＫＦＶＧＳＬ（配列番号２５８）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＨＭＭＱＹＡＲＨ（配列番号２５９）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＩＰＦＳＷＳＲＦ（配列番号２６０）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＬＳＱＡＲＷＲＫ（配列番号２６１）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＤＩＳＨＷＲＲＳ（配列番号２６２）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＲＫＴＶＱＨＷＷ（配列番号２６３＿）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＲＦＹＲＮＱＦＦ（配列番号２６４）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＲＳＬＶＦＡＰＩ（配列番号２６５）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＲＳＰＳＲＬＫＣ（配列番号２６６）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＲＫＭＰＮＩＴＶ（配列番号２６７）を含む。
いくつかの実施形態において、ＣＭは、少なくともｕＰＡ及び／又はマトリプターゼのための基質であるモチーフ配列を含んでいて、且つ、以下の表１０Ａ〜１０Ｊに示すコアＣＭコンセンサス配列を含んでいる。いくつかの実施形態において、モチーフ配列は、以下の表１０Ａ〜１０Ｄに示すコアＣＭコンセンサス配列の亜属、すなわち、亜群を含んでいる。
Figure 2017509594
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いくつかの実施形態において、モチーフ配列は、少なくともｕＰＡ及び／又はマトリプターゼのための基質であり、且つ、表１０Ａ〜１０Ｄに示すコアＣＭコンセンサス配列の１つに基づく拡張コンセンサス配列を含んでいる。いくつかの実施形態において、拡張コンセンサス配列は、以下の表１１Ａ〜１１Ｄに示すコンセンサス配列である。
Figure 2017509594
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いくつかの実施形態において、ＣＭは、アミノ酸配列ＬＳＧＲＳＡＮＨ（配列番号３０７）又はＬＳＧＲＳＧＮＨ（配列番号３０８）を含むコアＣＭコンセンサス１１配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭは、アミノ酸配列ＤＲＬＳＧＲＳＡＮＨＫＫ（配列番号３０９）、ＤＲＬＳＧＲＳＤＮＨＫＫ（配列番号３１０）、又はＮＴＬＳＧＲＳＧＮＨＧＳ（配列番号３１１）を含む拡張コアＣＭコンセンサス１１配列を含む。
いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＬＳＧＲＳＡＮＨ（配列番号３０７）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＬＳＧＲＳＧＮＨ（配列番号３０８）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＤＲＬＳＧＲＳＡＮＨＫＫ（配列番号３０９）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＤＲＬＳＧＲＳＤＮＨＫＫ（配列番号３１０）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＮＴＬＳＧＲＳＧＮＨＧＳ（配列番号３１１）を含む。
いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＬＳＧＲＳＡＮＨ（配列番号３０７）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＬＮＧＲＳＤＮＨ（配列番号３１３）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＬＴＧＲＳＤＲＨ（配列番号３１４）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭは、アミノ酸配列ＬＳＧＲＳＡＮＨ（配列番号３０７）、ＬＮＧＲＳＤＮＨ（配列番号３１３）、及びＬＴＧＲＳＤＲＨ（配列番号３１４）を含むコアＣＭコンセンサス１２配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭは、ＤＲＬＳＧＲＳＡＮＨＫＫ（配列番号３０９）、ＤＲＬＳＧＲＳＤＮＨＫＫ（配列番号３１０）、ＧＰＬＮＧＲＳＤＮＨＫＡ（配列番号３２０）、ＧＰＬＮＧＲＳＤＮＨＫＫ（配列番号３２１）、ＧＰＬＮＧＲＳＤＮＨＫＲ（配列番号３２２）、ＧＰＬＮＧＲＳＤＮＨＱＡ（配列番号３２３）、ＧＰＬＮＧＲＳＤＮＨＱＫ（配列番号３２４）、ＧＰＬＮＧＲＳＤＮＨＱＲ（配列番号３２５）、ＧＰＬＮＧＲＳＤＮＨＲＡ（配列番号３２６）、ＧＰＬＮＧＲＳＤＮＨＲＫ（配列番号３２７）、ＧＰＬＮＧＲＳＤＮＨＲＲ（配列番号３２８）、ＲＰＬＮＧＲＳＤＮＨＫＡ（配列番号３２９）、ＲＰＬＮＧＲＳＤＮＨＫＫ（配列番号３３０）、ＲＰＬＮＧＲＳＤＮＨＫＲ（配列番号３３１）、ＲＰＬＮＧＲＳＤＮＨＱＡ（配列番号３３２）、ＲＰＬＮＧＲＳＤＮＨＱＫ（配列番号３３３）、ＲＰＬＮＧＲＳＤＮＨＱＲ（配列番号３３４）、ＲＰＬＮＧＲＳＤＮＨＲＡ（配列番号３３５）、ＲＰＬＮＧＲＳＤＮＨＲＫ（配列番号３３６）、ＲＰＬＮＧＲＳＤＮＨＲＲ（配列番号３３７）、ＧＰＬＳＧＲＳＤＮＨＫＡ（配列番号３３８）、ＧＰＬＳＧＲＳＤＮＨＫＫ（配列番号３３９）、ＧＰＬＳＧＲＳＤＮＨＫＲ（配列番号３４０）、ＧＰＬＳＧＲＳＤＮＨＱＡ（配列番号３４１）、ＧＰＬＳＧＲＳＤＮＨＱＫ（配列番号３４２）、ＧＰＬＳＧＲＳＤＮＨＱＲ（配列番号３４３）、ＧＰＬＳＧＲＳＤＮＨＲＡ（配列番号３４４）、ＧＰＬＳＧＲＳＤＮＨＲＫ（配列番号３４５）、ＧＰＬＳＧＲＳＤＮＨＲＲ（配列番号３４６）、ＲＰＬＳＧＲＳＤＮＨＫＡ（配列番号３４７）、ＲＰＬＳＧＲＳＤＮＨＫＫ（配列番号３４８）、ＲＰＬＳＧＲＳＤＮＨＫＲ（配列番号３４９）、ＲＰＬＳＧＲＳＤＮＨＱＡ（配列番号３５０）、ＲＰＬＳＧＲＳＤＮＨＱＫ（配列番号３５１）、ＲＰＬＳＧＲＳＤＮＨＱＲ（配列番号３５２）、ＲＰＬＳＧＲＳＤＮＨＲＡ（配列番号３５３）、ＲＰＬＳＧＲＳＤＮＨＲＫ（配列番号３５４）、ＲＰＬＳＧＲＳＤＮＨＲＲ（配列番号３５５）、及びＫＧＬＴＧＲＳＤＲＨＱＡ（配列番号３５６）から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む拡張コアＣＭコンセンサス１２配列を含む。
いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＤＲＬＳＧＲＳＡＮＨＫＫ（配列番号３０９）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＤＲＬＳＧＲＳＤＮＨＫＫ（配列番号３１０）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＧＰＬＮＧＲＳＤＮＨＫＡ（配列番号３２０）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＧＰＬＮＧＲＳＤＮＨＫＫ（配列番号３２１）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＧＰＬＮＧＲＳＤＮＨＫＲ（配列番号３２２）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＧＰＬＮＧＲＳＤＮＨＱＡ（配列番号３２３）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＧＰＬＮＧＲＳＤＮＨＱＫ（配列番号３２４）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＧＰＬＮＧＲＳＤＮＨＱＲ（配列番号３２５）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＧＰＬＮＧＲＳＤＮＨＲＡ（配列番号３２６）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＧＰＬＮＧＲＳＤＮＨＲＫ（配列番号３２７）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＧＰＬＮＧＲＳＤＮＨＲＲ（配列番号３２８）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＲＰＬＮＧＲＳＤＮＨＫＡ（配列番号３２９）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＲＰＬＮＧＲＳＤＮＨＫＫ（配列番号３３０）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＲＰＬＮＧＲＳＤＮＨＫＲ（配列番号３３１）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＲＰＬＮＧＲＳＤＮＨＱＡ（配列番号３３２）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＲＰＬＮＧＲＳＤＮＨＱＫ（配列番号３３３）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＲＰＬＮＧＲＳＤＮＨＱＲ（配列番号３３４）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＲＰＬＮＧＲＳＤＮＨＲＡ（配列番号３３５）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＲＰＬＮＧＲＳＤＮＨＲＫ（配列番号３３６）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＲＰＬＮＧＲＳＤＮＨＲＲ（配列番号３３７）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＧＰＬＳＧＲＳＤＮＨＫＡ（配列番号３３８）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＧＰＬＳＧＲＳＤＮＨＫＫ（配列番号３３９）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＧＰＬＳＧＲＳＤＮＨＫＲ（配列番号３４０）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＧＰＬＳＧＲＳＤＮＨＱＡ（配列番号３４１）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＧＰＬＳＧＲＳＤＮＨＱＫ（配列番号３４２）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＧＰＬＳＧＲＳＤＮＨＱＲ（配列番号３４３）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＧＰＬＳＧＲＳＤＮＨＲＡ（配列番号３４４）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＧＰＬＳＧＲＳＤＮＨＲＫ（配列番号３４５）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＧＰＬＳＧＲＳＤＮＨＲＲ（配列番号３４６）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＲＰＬＳＧＲＳＤＮＨＫＡ（配列番号３４７）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＲＰＬＳＧＲＳＤＮＨＫＫ（配列番号３４８）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＲＰＬＳＧＲＳＤＮＨＫＲ（配列番号３４９）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＲＰＬＳＧＲＳＤＮＨＱＡ（配列番号３５０）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＲＰＬＳＧＲＳＤＮＨＱＫ（配列番号３５１）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＲＰＬＳＧＲＳＤＮＨＱＲ（配列番号３５２）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＲＰＬＳＧＲＳＤＮＨＲＡ（配列番号３５３）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＲＰＬＳＧＲＳＤＮＨＲＫ（配列番号３５４）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＲＰＬＳＧＲＳＤＮＨＲＲ（配列番号３５５）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＫＧＬＴＧＲＳＤＲＨＱＡ（配列番号３５６）を含む。
いくつかの実施形態において、ＣＭは、アミノ酸配列ＲＩＧＲＳＤＮＨ（配列番号３５７）又はＲＬＧＲＳＤＮＮ（配列番号３５８）を含むコアＣＭコンセンサス１３配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭは、アミノ酸配列ＮＨＲＩＧＲＳＤＮＨＲＲ（配列番号３５９）又はＴＬＲＬＧＲＳＤＮＮＫＮ（配列番号３６０）を含む拡張コアＣＭコンセンサス１３配列を含む。
いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＲＩＧＲＳＤＮＨ（配列番号３５７）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＲＬＧＲＳＤＮＮ（配列番号３５８）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＮＨＲＩＧＲＳＤＮＨＲＲ（配列番号３５９）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＴＬＲＬＧＲＳＤＮＮＫＮ（配列番号３６０）を含む。
いくつかの実施形態において、ＣＭは、ＴＳＧＲＳＡＮＰ（配列番号３６１）、ＴＳＧＲＳＧＮＰ（配列番号３６２）、ＬＳＧＲＳＡＮＰ（配列番号３６３）、及びＬＳＧＲＳＧＮＰ（配列番号３６４）から成る群から選択されるアミノ酸配列を含むコアＣＭコンセンサス１４配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭは、ＴＳＴＳＧＲＳＡＮＰＲＧ（配列番号３６５）、ＴＳＴＳＧＲＳＧＮＰＲＧ（配列番号３６６）、ＴＳＬＳＧＲＳＡＮＰＲＧ（配列番号３６７）、及びＴＳＬＳＧＲＳＧＮＰＲＧ（配列番号３６８）から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む拡張コアＣＭコンセンサス１４配列を含む。
いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＴＳＧＲＳＡＮＰ（配列番号３６１）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＴＳＧＲＳＧＮＰ（配列番号３６２）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＬＳＧＲＳＡＮＰ（配列番号３６３）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＬＳＧＲＳＧＮＰ（配列番号３６４）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＴＳＴＳＧＲＳＡＮＰＲＧ（配列番号３６５）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＴＳＴＳＧＲＳＧＮＰＲＧ（配列番号３６６）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＴＳＬＳＧＲＳＡＮＰＲＧ（配列番号３６７）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列とＴＳＬＳＧＲＳＧＮＰＲＧ（配列番号３６８）を含む。
いくつかの実施形態において、ＣＭは、ＬＳＧＲＳＥＮＨ（配列番号３６９）、ＳＩＡＲＳＤＮＬ（配列番号３７０）、ＬＳＧＲＳＶＴＱ（配列番号３７１）、ＬＳＧＲＳＧＮＨ（配列番号３０８）、ＬＴＧＲＳＤＲＨ（配列番号３１４）、ＬＹＧＲＳＥＮＮ（配列番号３７４）、ＲＬＧＲＳＤＮＮ（配列番号３７５）、ＴＳＧＲＳＡＮＰ（配列番号３７６）、ＮＴＬＳＧＲＳＥＮＨＳＧ（配列番号３７７）、ＰＰＳＩＡＲＳＤＮＬＡＮ（配列番号３７８）、ＴＧＬＳＧＲＳＶＴＱＴＳ（配列番号３７９）、ＮＴＬＳＧＲＳＧＮＨＧＳ（配列番号３１１）、ＫＧＬＴＧＲＳＤＲＨＱＡ（配列番号３８１）、ＫＮＬＹＧＲＳＥＮＮＧＮ（配列番号３８２）、ＴＬＲＬＧＲＳＤＮＮＫＮ（配列番号３８３）、及びＴＳＴＳＧＲＳＡＮＰＲＧ（配列番号３８４）から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＬＳＧＲＳＥＮＨ（配列番号３６９）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＳＩＡＲＳＤＮＬ（配列番号３７０）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＬＳＧＲＳＶＴＱ（配列番号３７１）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＬＳＧＲＳＧＮＨ（配列番号３０８）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＬＴＧＲＳＤＲＨ（配列番号３１４）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＬＹＧＲＳＥＮＮ（配列番号３７４）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＲＬＧＲＳＤＮＮ（配列番号３７５）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＴＳＧＲＳＡＮＰ（配列番号３７６）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＮＴＬＳＧＲＳＥＮＨＳＧ（配列番号３７７）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＰＰＳＩＡＲＳＤＮＬＡＮ（配列番号３７８）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＴＧＬＳＧＲＳＶＴＱＴＳ（配列番号３７９）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＮＴＬＳＧＲＳＧＮＨＧＳ（配列番号３１１）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＫＧＬＴＧＲＳＤＲＨＱＡ（配列番号３８１）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＫＮＬＹＧＲＳＥＮＮＧＮ（配列番号３８２）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＴＬＲＬＧＲＳＤＮＮＫＮ（配列番号３８３）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＴＳＴＳＧＲＳＡＮＰＲＧ（配列番号３８４）を含む。
いくつかの実施形態において、ＣＭは、少なくとも２つのプロテアーゼのための基質である。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのプロテアーゼは、マトリプターゼ又はｕＰＡであり、そして、少なくとも１つのプロテアーゼは、表７に示すものから成る群から選択される。
Figure 2017509594
いくつかの実施形態において、抗体は、少なくとも第１のＣＭ及び第２のＣＭに取り付けられている。いくつかの実施形態において、第１のＣＭ及び第２のＣＭはそれぞれ、１５アミノ酸未満の長さのポリペプチドである。いくつかの実施形態において、未切断状態における抗体内の第１のＣＭ及び第２のＣＭは、以下のようなＮ末端からＣ末端への構造配置：剤‐ＣＭ１‐ＣＭ２‐（抗体又は抗原結合フラグメント）、（抗体又はその抗原結合フラグメント）‐ＣＭ２‐ＣＭ１‐剤、剤‐ＣＭ２‐ＣＭ１‐（抗体又はその抗原結合フラグメント）、又は（抗体又はその抗原結合フラグメント）‐ＣＭ１‐ＣＭ２‐剤を有する。いくつかの実施形態において、抗体は、剤とＣＭ１との間に連結ペプチドを含んでいる。いくつかの実施形態において、抗体は、ＣＭ１とＣＭ２との間に連結ペプチドを含んでいる。いくつかの実施形態において、抗体は、ＣＭ２と抗体又はその抗原結合フラグメントとの間に連結ペプチドを含んでいる。いくつかの実施形態において、抗体は、剤とＣＭ１との間に連結ペプチドを、及びＣＭ２と抗体又はその抗原結合フラグメントとの間に連結ペプチドを含んでいる。いくつかの実施形態において、抗体は、剤とＣＭ１との間に連結ペプチドを、及びＣＭ１とＣＭ２との間に連結ペプチドを含んでいる。いくつかの実施形態において、抗体は、ＣＭ１とＣＭ２との間に連結ペプチドを、及びＣＭ２と抗体又はその抗原結合フラグメントとの間に連結ペプチドを含んでいる。いくつかの実施形態において、抗体は、剤とＣＭ１との間に連結ペプチドを、ＣＭ１とＣＭ２との間に連結ペプチドを、及びＣＭ２と抗体又はその抗原結合フラグメントとの間に連結ペプチドを含んでいる。
いくつかの実施形態において、抗体は、マトリプターゼ及びｕＰＡから選択される少なくとも１つのプロテアーゼのための基質を含んでいる少なくとも１つの第１のＣＭ、並びに基質配列を含んでいる第２のＣＭを含んでいる。第２のＣＭ（ＣＭ２）のための代表的な基質としては、これだけに限定されるものではないが、表７で列挙した以下の酵素又はプロテアーゼの１若しくは複数で切断可能基質が挙げられる。
いくつかの実施形態において、ＣＭ２は、特定のプロテアーゼとの使用のために選択される。いくつかの実施形態において、ＣＭ２は、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）、好中球エラスターゼ、ｕＰＡ（また、ｕ‐プラスミノーゲン活性化因子とも呼ばれる）、レグミン、マトリプターゼ、トロンビン、例えばカテプシンなどのシステインプロテアーゼ、ＡＤＡＭ１７、ＢＭＰ‐１、ＨｔｒＡ１、並びに、例えばＴＭＰＲＳＳ３又はＴＭＰＲＳＳ４などのＴＭＰＲＳＳから成る群から選択される少なくとも１つのプロテアーゼのための基質である。
いくつかの実施形態において、ＣＭ２は好中球エラスターゼのための基質である。いくつかの実施形態において、ＣＭ２はｕＰＡのための基質である。いくつかの実施形態において、ＣＭ２はレグミンのための基質である。いくつかの実施形態において、ＣＭ２はマトリプターゼのための基質である。いくつかの実施形態において、ＣＭ２はトロンビンのための基質である。いくつかの実施形態において、ＣＭ２はシステインプロテアーゼのための基質である。いくつかの実施形態において、ＣＭ２はカテプシンのための基質である。いくつかの実施形態において、ＣＭ２はＡＤＡＭ１７のための基質である。いくつかの実施形態において、ＣＭ２はＢＭＰ‐１のための基質である。いくつかの実施形態において、ＣＭ２はＨｔｒＡ１のための基質である。いくつかの実施形態において、ＣＭ２はＴＭＰＲＳＳのための基質である。いくつかの実施形態において、ＣＭ２はＴＭＰＲＳＳ３のための基質である。いくつかの実施形態において、ＣＭ２はＴＭＰＲＳＳ４のための基質である。
例えば、好適なＣＭ２は、少なくとも１つのプロテアーゼによって切断され、且つ、配列ＴＧＲＧＰＳＷＶ（配列番号４０２）；ＳＡＲＧＰＳＲＷ（配列番号４０３）；ＴＡＲＧＰＳＦＫ（配列番号４０４）；ＴＡＲＧＰＳＷ（配列番号４０５）；ＬＳＧＲＳＤＮＨ（配列番号４０６）；ＧＧＷＨＴＧＲＮ（配列番号４０７）；ＨＴＧＲＳＧＡＬ（配列番号４０８）；ＰＬＴＧＲＳＧＧ（配列番号４０９）；ＡＡＲＧＰＡＩＨ（配列番号４１１）；ＲＧＰＡＦＮＰＭ（配列番号４１２）；ＳＳＲＧＰＡＹＬ（配列番号４１３）；ＲＧＰＡＴＰＩＭ（配列番号４１４）；ＲＧＰＡ（配列番号４１５）；ＧＧＱＰＳＧＭＷＧＷ（配列番号４１６）；ＦＰＲＰＬＧＩＴＧＬ（配列番号４１７）；ＶＨＭＰＬＧＦＬＧＰ（配列番号４１８）；ＳＰＬＴＧＲＳＧ（配列番号４１９）；ＳＡＧＦＳＬＰＡ（配列番号１２６）；ＬＡＰＬＧＬＱＲＲ（配列番号４２０）；ＳＧＧＰＬＧＶＲ（配列番号４２１）；ＰＬＧＬ（配列番号４２２）；ＧＰＲＳＦＧＬ（配列番号４２３）及び／又はＧＰＲＳＦＧ（配列番号４２４）を含んでいる。
いくつかの実施形態において、ＣＭ２はアミノ酸配列ＴＧＲＧＰＳＷＶ（配列番号４０２）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭ２はアミノ酸配列ＳＡＲＧＰＳＲＷ（配列番号４０３）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭ２はアミノ酸配列ＴＡＲＧＰＳＦＫ（配列番号４０４）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭ２はアミノ酸配列ＴＡＲＧＰＳＷ（配列番号４０５）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭ２はアミノ酸配列ＬＳＧＲＳＤＮＨ（配列番号４０６）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭ２はアミノ酸配列ＧＧＷＨＴＧＲＮ（配列番号４０７）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭ２はアミノ酸配列ＨＴＧＲＳＧＡＬ（配列番号４０８）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭ２はアミノ酸配列ＰＬＴＧＲＳＧＧ（配列番号４０９）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭ２はアミノ酸配列ＡＡＲＧＰＡＩＨ（配列番号４１１）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭ２はアミノ酸配列ＲＧＰＡＦＮＰＭ（配列番号４１２）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭ２はアミノ酸配列ＳＳＲＧＰＡＹＬ（配列番号４１３）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭ２はアミノ酸配列ＲＧＰＡＴＰＩＭ（配列番号４１４）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭ２はアミノ酸配列ＲＧＰＡ（配列番号４１５）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭ２はアミノ酸配列ＧＧＱＰＳＧＭＷＧＷ（配列番号４１６）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭ２はアミノ酸配列ＦＰＲＰＬＧＩＴＧＬ（配列番号４１７）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭ２はアミノ酸配列ＶＨＭＰＬＧＦＬＧＰ（配列番号４１８）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭ２はアミノ酸配列ＳＰＬＴＧＲＳＧ（配列番号４１９）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭ２はアミノ酸配列ＬＡＰＬＧＬＱＲＲ（配列番号４２０）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭ２はアミノ酸配列ＳＧＧＰＬＧＶＲ（配列番号４２１）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭ２はアミノ酸配列ＰＬＧＬ（配列番号４２２）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭ２はアミノ酸配列ＧＰＲＳＦＧＬ（配列番号４２３）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭ２はアミノ酸配列ＧＰＲＳＦＧ（配列番号４２４）を含む。
いくつかの実施形態において、ＣＭ２は少なくとも１つのＭＭＰのための基質である。いくつかの実施形態において、ＣＭ２は表７で列挙した少なくとも１つのＭＭＰのための基質である。いくつかの実施形態において、ＣＭ２はＭＭＰ９のための基質である。いくつかの実施形態において、ＣＭ２はＭＭＰ１４のための基質である。いくつかの実施形態において、ＣＭ２は２つ以上のＭＭＰのための基質である。いくつかの実施形態において、ＣＭ２は少なくともＭＭＰ９又はＭＭＰ１４のための基質である。いくつかの実施形態において、ＣＭ２は２つ以上のＭＭＰのための基質である。いくつかの実施形態において、ＣＭ２は少なくともＭＭＰ９及びＭＭＰ１４のための基質である。
いくつかの実施形態において、ＣＭ２は、ＭＭＰのための基質であり、且つ、配列ＩＳＳＧＬＬＳＳ（配列番号４２５）；ＱＮＱＡＬＲＭＡ（配列番号４２６）；ＡＱＮＬＬＧＭＶ（配列番号４２７）；ＳＴＦＰＦＧＭＦ（配列番号４２８）；ＰＶＧＹＴＳＳＬ（配列番号４２９）；ＤＷＬＹＷＰＧＩ（配列番号４３０）；ＭＩＡＰＶＡＹＲ（配列番号４３１）；ＲＰＳＰＭＷＡＹ（配列番号４３２）；ＷＡＴＰＲＰＭＲ（配列番号４３３）；ＦＲＬＬＤＷＱＷ（配列番号４３４）；ＬＫＡＡＰＲＷＡ（配列番号４３５）；ＧＰＳＨＬＶＬＴ（配列番号４３６）；ＬＰＧＧＬＳＰＷ（配列番号４３７）；ＭＧＬＦＳＥＡＧ（配列番号４３８）；ＳＰＬＰＬＲＶＰ（配列番号４３９）；ＲＭＨＬＲＳＬＧ（配列番号４４０）；ＬＡＡＰＬＧＬＬ（配列番号４４１）；ＡＶＧＬＬＡＰＰ（配列番号４４２）；ＬＬＡＰＳＨＲＡ（配列番号４４３）；ＰＡＧＬＷＬＤＰ（配列番号４４４）及び／又はＩＳＳＧＬＳＳ（配列番号４４５）を含んでいる。
いくつかの実施形態において、第１の切断剤と第２の切断剤は同じプロテアーゼであり、且つ、第１のＣＭ及び第２のＣＭは酵素によって異なった基質である。いくつかの実施形態において、第１の切断剤と第２の切断剤は異なったプロテアーゼである。いくつかの実施形態において、第１の切断剤と第２の切断剤は標的組織内で共局在する。いくつかの実施形態において、第１のＣＭ及び第２のＣＭは標的組織内の少なくとも１つの切断剤によって切断される。
いくつかの実施形態において、ＣＭはプロテアーゼ切断部位の非プライムサイドを含む；すなわち、ＣＭは少なくともＰ１及びＰ２アミノ酸を含み、そして、いくつかの実施形態において、Ｐ１、Ｐ２及びＰ３アミノ酸を含み、そして、いくつかの実施形態において、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、及びＰ４アミノ酸を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはプロテアーゼ切断部位の非プライムサイドとプライムサイドを含む。いくつかの実施形態において、ＣＭは、非プライムサイドを含むが、プロテアーゼ切断部位のプライムサイドの少なくとも一部を欠いている。いくつかの実施形態において、ＣＭは、非プライムサイドを含んでいるが、プロテアーゼ切断部位のプライムサイドを欠いている。斯かるＣＭは、抗体又は例えばこれだけに限定されるものではないが、検出部分などの本明細書中の本開示に示す他の分子に直接連結されるか、又はリンカーを通して連結される。
いくつかの実施形態において、抗体又はその抗原結合フラグメントに複合化される剤は治療薬である。いくつかの実施形態において、剤は、抗腫瘍剤である。いくつかの実施形態において、剤は、毒素又はその断片である。本明細書中に使用される場合、毒素の断片は、毒性活性を保持している断片である。いくつかの実施形態において、剤は、切断可能なリンカーを介してＡＢに結合される。いくつかの実施形態において、剤は、本明細書中に記載した少なくとも１つの切断可能基質配列を含んでいるリンカーを介してＡＢに結合される。いくつかの実施形態において、剤は、非切断可能リンカーを介してＡＢに結合される。いくつかの実施形態において、剤は、微小管阻害剤である。いくつかの実施形態において、剤は、ＤＮＡアルキル化剤又はＤＮＡインターカレーター、或いは他のＤＮＡ損傷剤など核酸損傷剤である。いくつかの実施形態において、剤は、表３で列挙した群から選ばれた剤である。いくつかの実施形態において、剤はドラスタチンである。いくつかの実施形態において、剤は、アウリスタチン又はその誘導体である。いくつかの実施形態において、剤は、アウリスタチンＥ又はその誘導体である。いくつかの実施形態において、剤はモノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）である。いくつかの実施形態において、剤はモノメチルアウリスタチンＤ（ＭＭＡＤ）である。いくつかの実施形態において、剤は、マイタンシノイド又はマイタンシノイド誘導体である。いくつかの実施形態において、剤は、ＤＭ１又はＤＭ４である。いくつかの実施形態において、剤は、デュオカルマイシン又はその誘導体である。いくつかの実施形態において、剤は、カリケアマイシン又はその誘導体である。いくつかの実施形態において、剤はピロロベンゾジアゼピンである。
いくつかの実施形態において、剤は、抗炎症剤である。
いくつかの実施形態において、抗体はまた、検出可能部分も含んでいる。いくつかの実施形態において、検出可能部分は診断剤である。
いくつかの実施形態において、複合抗体及び／又は複合活性化可能抗体は、検出可能標識を含んでいる。いくつかの実施形態において、検出可能標識は、イメージング剤（imaging agent）、造影剤、酵素、蛍光標識、発色団、色素、１若しくは複数の金属イオン、又はリガンドベースの標識を含む。いくつかの実施形態において、イメージング剤は放射性同位元素を含む。いくつかの実施形態において、放射性同位元素は、インジウム又はテクネチウムである。いくつかの実施形態において、造影剤は、ヨウ素、ガドリニウム又は酸化鉄を含む。いくつかの実施形態において、酵素は、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、又はβガラクトシダーゼを含む。いくつかの実施形態において、蛍光標識は、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、修飾された赤色蛍光タンパク質（ｍＲＦＰ）、赤色蛍光タンパク質ｔｄｉｍｅｒ２（ＲＦＰ ｔｄｉｍｅｒ２）、ＨＣＲＥＤ、又はユーロピウム誘導体を含む。いくつかの実施形態において、発光性標識は、Ｎ‐メチルアクリジニウム誘導体を含む。いくつかの実施形態において、標識は、Ａｌｅｘ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６８０又はＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）７５０などのＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）標識を含む。いくつかの実施形態において、リガンドベースの標識は、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン又は１若しくは複数のハプテンを含む。
いくつかの実施形態において、抗体は、１若しくは複数のジスルフィド結合を自然に含む。いくつかの実施形態において、抗体又はその抗原結合フラグメントは、１若しくは複数のジスルフィド結合を含むように設計され得る。
いくつかの実施形態において、抗体及び／又は複合抗体は単一特異的である。いくつかの実施形態において、抗体及び／又は複合抗体は、多重特異的、例えば、制限されることのない例によれば、二重特異的又は三重特異的である。いくつかの実施形態において、抗体及び／又は複合抗体は、プロ‐二重特異的Ｔ細胞エンゲイジャー（プロ‐ＢＩＴＥ）分子の一部として処方される。いくつかの実施形態において、抗体及び／又は複合抗体は、プロ‐キメラ抗原受容体（プロ‐ＣＡＲ）修飾Ｔ細胞又は他の遺伝子操作された受容体の一部として処方される。
いくつかの実施形態において、活性化可能抗体及び／又は複合活性化可能抗体は単一特異的である。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体及び／又は複合活性化可能抗体は多重特異的であり、本明細書中では多重特異的活性化可能抗体及び／又は多重特異的な複合活性化可能抗体とも呼ばれる。本明細書中に使用される場合、「活性化可能抗体」という用語やその文法的変化形のすべてが、別段の注意がない限り、活性化可能抗体が本開示の多重特異的活性化可能抗体である実施形態に限定されることなく、本開示の多重特異的活性化可能抗体を包含するものとする。本明細書中に使用される場合、「複合活性化可能抗体」という用語やその文法的変化形のすべてが、別段の注意がない限り、複合活性化可能抗体が本開示の多重特異的な複合活性化可能抗体である実施形態に限定されることなく、本開示の多重特異的な複合活性化可能抗体を包含するものとする。いくつかの実施形態において、多重特異的活性化可能抗体及び／又は多重特異的な複合活性化可能抗体は、二重特異的又は三重特異的である。
いくつかの実施形態において、本明細書中に記載した複合抗体は、１若しくは複数の追加の剤と複合化した状態で、又は追加の剤と組み合わせた状態で使用される。好適な追加の剤は、例えば、癌などの対象とする適用のための現在の医薬療法及び／又は外科療法を含む。例えば、複合抗体は、追加の化学療法剤又は抗癌剤と複合化した状態で使用される。
本開示のマトリプターゼ及び／又はｕＰＡ基質もまた、活性化可能抗体に有用である。本明細書に記載される活性化された状態での活性化可能抗体は、所定の標的を結合し、そして次のものを含む：（ｉ）標的に対して特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ）；（ｉｉ）活性化可能抗体が未切断状態で存在する場合、標的に対するＡＢの結合を阻害するマスキング部分（ＭＭ）；及び（ｉiｉ）ＡＢにカップリングされる切断可能部分（ＣＭ）、ここでＣＭはマトリプターゼ及び／又はｕＰＡから選択される少なくとも１つのプロテアーゼのための基質として機能するポリペプチドである。
いくつかの実施形態において、未切断状態下での活性化可能抗体は、次の通りにＮ末端からＣ末端側への構造配置：ＭＭ−ＣＭ−ＡＢ又はＡＢ−ＣＭ−ＭＭを有する。
いくつかの実施形態において、活性化可能抗体は、ＭＭとＣＭとの間に連結ペプチドを含む。
いくつかの実施形態において、活性化可能抗体は、ＣＭとＡＢとの間に連結ペプチドを含む。
いくつかの実施形態において、活性化可能抗体は第１連結ペプチド（ＬＰ１）及び第２連結ペプチド（ＬＰ２）を含み、そして未切断状態での前記活性化可能抗体は、Ｎ末端からＣ末端側に、次のような構造配置：ＭＭ−ＬＰ１−ＣＭ−ＬＰ２−ＡＢ 又はＡＢ−ＬＰ２−ＣＭ−ＬＰ１−ＭＭを有する。
いくつかの実施形態において、前記２種の連結ペプチドがお互い同一である必要はない。
いくつかの実施形態において、ＬＰ１又はＬＰ２のうちの少なくとも１つは、（ＧＳ）ｎ、（ＧＧＳ）ｎ、（ＧＳＧＧＳ）ｎ（配列番号３８５）及び（ＧＧＧＳ）ｎ（配列番号３８６）｛ここで、ｎは少なくとも１つの整数である｝から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、ＬＰ１又はＬＰ２のうちの少なくとも１つは、ＧＧＳＧ（配列番号３８７）、ＧＧＳＧＧ（配列番号３８８）、ＧＳＧＳＧ（配列番号３８９）、ＧＳＧＧＧ（配列番号３９０）、ＧＧＧＳＧ（配列番号３９１）、及びＧＳＳＳＧ（配列番号３９２）から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、ＬＰ１は、アミノ酸配列ＧＳＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧ（配列番号３９３）、ＧＳＳＧＧＳＧＧＳＧＧ（配列番号３９４）、ＧＳＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳ（配列番号３９５）、ＧＳＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号３９６）、ＧＳＳＧＧＳＧＧＳＧ（配列番号３９７）、又はＧＳＳＧＧＳＧＧＳＧＳ（配列番号３９８）を含む。
いくつかの実施形態において、ＬＰ２は、アミノ酸配列ＧＳＳ、ＧＧＳ、ＧＧＧＳ（配列番号３９９）、ＧＳＳＧＴ（配列番号４００）又はＧＳＳＧ（配列番号４０１）を含む。
いくつかの実施形態において、ＡＢは、標的への結合に関して約１００ｎＭ以下の平衡解離定数を有する。
いくつかの実施形態において、活性化可能抗体は、標的を特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメントを含んでいる。いくつかの実施形態において、標的を結合する抗体又はその免疫学的活性フラグメントは、モノクローナル抗体、ドメイン抗体、単鎖、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、ｓｃＦｖ、ｓｃＡｂ、ｄＡｂ、単一ドメインＨ鎖抗体、又は単一ドメインＬ鎖抗体である。いくつかの実施形態において、標的に結合する斯かる抗体又はその免疫学的活性フラグメントは、マウス、他の齧歯動物、キメラ、ヒト化又は完全なヒトモノクローナル抗体である。
いくつかの実施形態において、ＭＭは、標的へのＡＢの平衡解離定数よりも大きい、ＡＢへの結合のための平衡解離定数を有する。
いくつかの実施形態において、ＭＭは、標的へのＡＢの平衡解離定数以下である、ＡＢへの結合のための平衡解離定数を有する。
いくつかの実施形態において、ＭＭは、切断された状態である場合、標的への結合のために、ＡＢと干渉もしないし、競合もしない。
いくつかの実施形態において、ＭＭは、約２〜４０個の長さのアミノ酸のポリペプチドである。例えば、ＭＭは、４０個以下の長さのアミノ酸のポリペプチドである。
いくつかの実施形態において、ＭＭポリペプチド配列は、ＡＢのどの天然の結合パートナーのポリペプチド配列とも異なっている。いくつかの実施形態において、ＭＭポリペプチド配列は、ＡＢの任意の天然の結合パートナーに対して５０％未満同一である。いくつかの実施形態において、ＭＭポリペプチド配列は、ＡＢの任意の天然の結合パートナーに対して４０％、３０％、２５％、２０％、１５％、又は１０％未満同一である。
いくつかの実施形態において、ＭＭのカップリングは、標的を結合するＡＢの能力を低め、結果的に、標的に向かってＭＭにカップリングされる場合のＡＢの解離定数（Ｋｄ）は、標的に向かってＭＭにカップリングされない場合のＡＢのＫｄよりも、少なくとも２倍高い。
いくつかの実施形態において、ＭＭのカップリングは、標的を結合するＡＢの能力を低め、結果的に、標的に向かってＭＭにカップリングされる場合のＡＢの解離定数（Ｋｄ）は、標的に向かってＭＭにカップリングされない場合のＡＢのＫｄよりも、少なくとも３倍高い。
いくつかの実施形態において、ＭＭのカップリングは、標的を結合するＡＢの能力を低め、結果的に、標的に向かってＭＭにカップリングされる場合のＡＢの解離定数（Ｋｄ）は、標的に向かってＭＭにカップリングされない場合のＡＢのＫｄよりも、少なくとも５倍高い。
いくつかの実施形態において、ＭＭのカップリングは、標的を結合するＡＢの能力を低め、結果的に、標的に向かってＭＭにカップリングされる場合のＡＢの解離定数（Ｋｄ）は、標的に向かってＭＭにカップリングされない場合のＡＢのＫｄよりも、少なくとも１０倍高い。
いくつかの実施形態において、ＭＭのカップリングは、標的を結合するＡＢの能力を低め、結果的に、標的に向かってＭＭにカップリングされる場合のＡＢの解離定数（Ｋｄ）は、標的に向かってＭＭにカップリングされない場合のＡＢのＫｄよりも、少なくとも２０倍高い。
いくつかの実施形態において、ＭＭのカップリングは、標的を結合するＡＢの能力を低め、結果的に、標的に向かってＭＭにカップリングされる場合のＡＢの解離定数（Ｋｄ）は、標的に向かってＭＭにカップリングされない場合のＡＢのＫｄよりも、少なくとも４０倍高い。
いくつかの実施形態において、ＭＭのカップリングは、標的を結合するＡＢの能力を低め、結果的に、標的に向かってＭＭにカップリングされる場合のＡＢの解離定数（Ｋｄ）は、標的に向かってＭＭにカップリングされない場合のＡＢのＫｄよりも、少なくとも１００倍高い。
いくつかの実施形態において、ＭＭのカップリングは、標的を結合するＡＢの能力を低め、結果的に、標的に向かってＭＭにカップリングされる場合のＡＢの解離定数（Ｋｄ）は、標的に向かってＭＭにカップリングされない場合のＡＢのＫｄよりも、少なくとも１０００倍高い。
いくつかの実施形態において、ＭＭのカップリングは、標的を結合するＡＢの能力を低め、結果的に、標的に向かってＭＭにカップリングされる場合のＡＢの解離定数（Ｋｄ）は、標的に向かってＭＭにカップリングされない場合のＡＢのＫｄよりも、少なくとも１０，０００倍高い。
いくつかの実施形態において、プロテアーゼ、すなわち、マトリプターゼ及び／又はｕＰＡは組織内で標的と共局在し、そして活性化抗体がプロテアーゼに晒されるとき、プロテアーゼは活性化抗体内のＣＭを切断する。
いくつかの実施形態において、標的の存在下で、ＭＭは、標的置換アッセイ、例えばＰＣＴ公開番号第ＷＯ２００９／０２５８４６号及び同第ＷＯ２０１０／０８１１７３号に記載されるアッセイを用いて、インビトロでアッセイされる場合、ＣＭが切断される場合に比較して、ＣＭが切断されていない場合、標的を結合するＡＢの能力を、少なくとも９０％低める。
いくつかの実施形態において、ＣＭは活性化可能抗体に位置し、結果的に、未切断状態下で、標的への活性化可能抗体の結合が低められ、標的に結合する未修飾ＡＢの平衡解離定数よりも少なくとも２倍、高い平衡解離定数の発生が確認され、そしてところが、切断された状態で（すなわち、活性化可能抗体が切断状態にあるとき）、ＡＢは標的を結合する。
いくつかの実施形態において、ＣＭは活性化可能抗体に位置し、結果的に、未切断状態下で、標的への活性化可能抗体の結合が低められ、標的に結合する未修飾ＡＢの平衡解離定数よりも少なくとも５倍、高い平衡解離定数の発生が確認され、そしてところが、切断された状態で（すなわち、活性化可能抗体が切断状態にあるとき）、ＡＢは標的を結合する。
いくつかの実施形態において、ＣＭは活性化可能抗体に位置し、結果的に、未切断状態下で、標的への活性化可能抗体の結合が低められ、標的に結合する未修飾ＡＢの平衡解離定数よりも少なくとも１０倍、高い平衡解離定数の発生が確認され、そしてところが、切断された状態で（すなわち、活性化可能抗体が切断状態にあるとき）、ＡＢは標的を結合する。
いくつかの実施形態において、ＣＭは活性化可能抗体に位置し、結果的に、未切断状態下で、標的への活性化可能抗体の結合が低められ、標的に結合する未修飾ＡＢの平衡解離定数よりも少なくとも２０倍、高い平衡解離定数の発生が確認され、そしてところが、切断された状態で（すなわち、活性化可能抗体が切断状態にあるとき）、ＡＢは標的を結合する。
いくつかの実施形態において、ＣＭは活性化可能抗体に位置し、結果的に、未切断状態下で、標的への活性化可能抗体の結合が低められ、標的に結合する未修飾ＡＢの平衡解離定数よりも少なくとも４０倍、高い平衡解離定数の発生が確認され、そしてところが、切断された状態で、ＡＢは標的を結合する。
いくつかの実施形態において、ＣＭは活性化可能抗体に位置し、結果的に、未切断状態下で、標的への活性化可能抗体の結合が低められ、標的に結合する未修飾ＡＢの平衡解離定数よりも少なくとも５０倍、高い平衡解離定数の発生が確認され、そしてところが、切断された状態で（すなわち、活性化可能抗体が切断状態にあるとき）、ＡＢは標的を結合する。
いくつかの実施形態において、ＣＭは活性化可能抗体に位置し、結果的に、未切断状態下で、標的への活性化可能抗体の結合が低められ、標的に結合する未修飾ＡＢの平衡解離定数よりも少なくとも１００倍、高い平衡解離定数の発生が確認され、そしてところが、切断された状態で（すなわち、活性化可能抗体が切断状態にあるとき）、ＡＢは標的を結合する。
いくつかの実施形態において、ＣＭは活性化可能抗体に位置し、結果的に、未切断状態下で、標的への活性化可能抗体の結合が低められ、標的に結合する未修飾ＡＢの平衡解離定数よりも少なくとも２００倍、高い平衡解離定数の発生が確認され、そしてところが、切断された状態で（すなわち、活性化可能抗体が切断状態にあるとき）、ＡＢは標的を結合する。
いくつかの実施形態において、ＣＭは長さが最大１５アミノ酸のポリペプチドである。
いくつかの実施形態において、ＣＭは少なくともマトリプターゼのための基質である。いくつかの実施形態において、ＣＭは少なくともｕＰＡのための基質である。いくつかの実施形態において、ＣＭは少なくともマトリプターゼ及びｕＰＡのための基質である。
いくつかの実施形態において、ＣＭはマトリプターゼ及び／又はｕＰＡのための基質であり、少なくとももう一方のプロテアーゼによる切断に対して抵抗性の基質である。いくつかの実施形態において、ＣＭはマトリプターゼ及び／又はｕＰＡのための基質であり、少なくともプラスミンによる切断に対して抵抗性の基質である。いくつかの実施形態において、ＣＭはマトリプターゼ及び／又はｕＰＡのための基質であり、少なくとも組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）による切断に対して抵抗性の基質である。
いくつかの実施形態において、ＣＭはマトリプターゼ及び／又はｕＰＡのための基質であり、マトリプターゼ及び／又はｕＰＡによって認識されるモチーフ配列を含んでいるが、但し、本開示の任意のモチーフ配列に関して：
（ｉ）ＣＭは、以下のアミノ酸配列ＴＧＲＧＰＳＷＶ（配列番号４０２）、ＳＡＲＧＰＳＲＷ（配列番号４０３）、又はＴＡＲＧＰＳＦＫ（配列番号４０４）のいずれも含まず；且つ、ＣＭは、例えば、ＴＡＲＧＰＳＷ（配列番号４０５）などのこれらのアミノ酸配列に基づくコンセンサスアミノ酸配列を含まず；
（ｉｉ）ＣＭは、以下のアミノ酸配列ＬＳＧＲＳＤＮＨ（配列番号４０６）、ＧＧＷＨＴＧＲＮ（配列番号４０７）、ＨＴＧＲＳＧＡＬ（配列番号４０８）、又はＰＬＴＧＲＳＧＧ（配列番号４０９）のいずれも含まず；且つ、ＣＭは、例えば、ＬＴＧＲＳＧＡ（配列番号４１０）などのこれらのアミノ酸配列に基づくコンセンサスアミノ酸配列を含まず；及び／又は
（ｉｉｉ）ＣＭは、以下のアミノ酸配列ＡＡＲＧＰＡＩＨ（配列番号４１１）、ＲＧＰＡＦＮＰＭ（配列番号４１２）、ＳＳＲＧＰＡＹＬ（配列番号４１３）、又はＲＧＰＡＴＰＩＭ（配列番号４１４）のいずれも含まず；且つ、ＣＭは、例えば、ＲＧＰＡ（配列番号４１５）などのこれらのアミノ酸配列に基づくコンセンサスアミノ酸配列を含まない。
いくつかの実施形態において、モチーフ配列は、表８Ａ〜８Ｊに示すコアＣＭコンセンサス配列を含む。いくつかの実施形態において、モチーフ配列は、表８Ａ〜８Ｊに示すコアＣＭコンセンサス配列の亜属、すなわち、亜群を含む。
いくつかの実施形態において、モチーフ配列は、表８Ａ‐８Ｊに示すコアＣＭコンセンサス配列の１つに基づく拡張コンセンサス配列を含む。いくつかの実施形態において、拡張コンセンサス配列は、表９Ａ〜９Ｊ‐３に示すコンセンサス配列である。
いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＡＡＰＲＳ（配列番号１６３）を含むコアＣＭコンセンサス１配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＡＡＰＲＳＦ（配列番号１６４）を含む拡張コアＣＭコンセンサス１配列を含む。
いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＳＲＲＶＰ（配列番号１６５）を含むコアＣＭコンセンサス２配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭは、ＱＳＲＲＶＰ（配列番号１６６）、ＱＴＲＲＶＰ（配列番号１６７）、ＳＲＲＶＰＬ（配列番号１６８）、ＳＲＲＶＰＶ（配列番号１６９）、ＱＳＲＲＶＰＬ（配列番号１７０）、ＱＳＲＲＶＰＶ（配列番号１７１）、ＱＴＲＲＶＰＬ（配列番号１７２）、及びＱＴＲＲＶＰＶ（配列番号１７３）から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む拡張コアＣＭコンセンサス２配列を含む。
いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＱＳＲＲＶＰ（配列番号１６６）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＱＴＲＲＶＰ（配列番号１６７）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＳＲＲＶＰＬ（配列番号１６８）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＳＲＲＶＰＶ（配列番号１６９）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＱＳＲＲＶＰＬ（配列番号１７０）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＱＳＲＲＶＰＶ（配列番号１７１）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＱＴＲＲＶＰＬ（配列番号１７２）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＱＴＲＲＶＰＶ（配列番号１７３）を含む。
いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＰＰＬＧＲ（配列番号１７４）を含むコアＣＭコンセンサス３配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭは、ＧＰＰＬＧＲ（配列番号１７５）、ＳＰＰＬＧＲ（配列番号１７６）、ＣＧＰＰＬＧＲ（配列番号１７７）、ＣＳＰＰＬＧＲ（配列番号１７８）、ＧＧＰＰＬＧＲ（配列番号１７９）、ＧＳＰＰＬＧＲ（配列番号１８０）、ＳＧＰＰＬＧＲ（配列番号１８１）、ＳＳＰＰＬＧＲ（配列番号１８２）、ＧＣＧＰＰＬＧＲ（配列番号１８３）、ＧＣＳＰＰＬＧＲ（配列番号１８４）、ＧＧＧＰＰＬＧＲ（配列番号１８５）、ＧＧＳＰＰＬＧＲ（配列番号１８６）、ＧＳＧＰＰＬＧＲ（配列番号１８７）、ＧＳＳＰＰＬＧＲ（配列番号１８８）、ＳＣＧＰＰＬＧＲ（配列番号１８９）、ＳＣＳＰＰＬＧＲ（配列番号１９０）、ＳＧＧＰＰＬＧＲ（配列番号１９１）、ＳＧＳＰＰＬＧＲ（配列番号１９２）、ＳＳＧＰＰＬＧＲ（配列番号１９３）、及びＳＳＳＰＰＬＧＲ（配列番号１９４）から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む拡張コアＣＭコンセンサス３配列を含む。
いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＧＰＰＬＧＲ（配列番号１７５）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＳＰＰＬＧＲ（配列番号１７６）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＣＧＰＰＬＧＲ（配列番号１７７）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＣＳＰＰＬＧＲ（配列番号１７８）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＧＧＰＰＬＧＲ（配列番号１７９）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＧＳＰＰＬＧＲ（配列番号１８０）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＳＧＰＰＬＧＲ（配列番号１８１）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＳＳＰＰＬＧＲ（配列番号１８２）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＧＣＧＰＰＬＧＲ（配列番号１８３）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＧＣＳＰＰＬＧＲ（配列番号１８４）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＧＧＧＰＰＬＧＲ（配列番号１８５）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＧＧＳＰＰＬＧＲ（配列番号１８６）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＧＳＧＰＰＬＧＲ（配列番号１８７）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＧＳＳＰＰＬＧＲ（配列番号１８８）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＳＣＧＰＰＬＧＲ（配列番号１８９）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＳＣＳＰＰＬＧＲ（配列番号１９０）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＳＧＧＰＰＬＧＲ（配列番号１９１）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＳＧＳＰＰＬＧＲ（配列番号１９２）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＳＳＧＰＰＬＧＲ（配列番号１９３）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＳＳＳＰＰＬＧＲ（配列番号１９４）を含む。
いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＬＲＳＧＷ（配列番号１９５）を含むコアＣＭコンセンサス４配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭは、ＭＬＲＳＧＷ（配列番号１９６）、ＭＬＲＳＧＷＲ（配列番号１９７）、ＭＬＲＳＧＷＲＧ（配列番号１９８）、ＭＬＲＳＧＷＲＬ（配列番号１９９）、及びＭＬＲＳＧＷＲＳ（配列番号２００）から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む拡張コアＣＭコンセンサス４配列を含む。
いくつかの実施形態において、アミノ酸配列ＭＬＲＳＧＷ、（配列番号１９６）をＣＭは含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＭＬＲＳＧＷＲ（配列番号１９７）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＭＬＲＳＧＷＲＧ（配列番号１９８）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＭＬＲＳＧＷＲＬ（配列番号１９９）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＭＬＲＳＧＷＲＳ（配列番号２００）を含む。
いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＶＳＲＳＡ（配列番号２０１）を含むコアＣＭコンセンサス５配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭは、ＩＶＳＲＳＡ（配列番号２０２）、ＹＩＶＳＲＳＡ（配列番号２０３）、及びＱＹＩＶＳＲＳＡ（配列番号２０４）から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む拡張コアＣＭコンセンサス５配列を含む。
いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＩＶＳＲＳＡ（配列番号２０２）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＹＩＶＳＲＳＡ（配列番号２０３）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＱＹＩＶＳＲＳＡ（配列番号２０４）を含む。
いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＡＬＲＡＰ（配列番号２０５）を含むコアＣＭコンセンサス６配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭは、アミノ酸配列ＲＡＬＲＡＰ（配列番号２０６）を含む拡張コアＣＭコンセンサス６配列を含む。
いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＰＡＧＲＲ（配列番号２０７）を含むコアＣＭコンセンサス７配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭは、ＰＡＧＲＲＳ（配列番号２０８）、ＰＡＧＲＲＳＬ（配列番号２０９）、ＶＰＡＧＲＲＳ（配列番号２１０）、及びＶＰＡＧＲＲＳＬ（配列番号２１１）から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む拡張コアＣＭコンセンサス７配列を含む。
いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＰＡＧＲＲＳ（配列番号２０８）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＰＡＧＲＲＳＬ（配列番号２０９）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＶＰＡＧＲＲＳ（配列番号２１０）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＶＰＡＧＲＲＳＬ（配列番号２１１）を含む。
いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＧＲＳＭＬ（配列番号２１２）を含むコアＣＭコンセンサス８配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭは、ＧＲＳＭＬＬ（配列番号２１３）、ＧＲＳＭＬＭ（配列番号２１４）、ＧＲＳＭＬＬＧ（配列番号２１５）、ＧＲＳＭＬＬＰ（配列番号２１６）、ＧＲＳＭＬＬＳ（配列番号２１７）、ＧＲＳＭＬＭＧ（配列番号２１８）、ＧＲＳＭＬＭＰ（配列番号２１９）、ＧＲＳＭＬＭＳ（配列番号２２０）、ＧＲＳＭＬＬＧＧ（配列番号２２１）、ＧＲＳＭＬＬＰＧ（配列番号２２２）、ＧＲＳＭＬＬＳＧ（配列番号２２３）、ＧＲＳＭＬＭＧＧ（配列番号２２４）、ＧＲＳＭＬＭＰＧ（配列番号２２５）、ＧＲＳＭＬＭＳＧ（配列番号２２６）、ＧＲＳＭＬＬＧＰ（配列番号２２７）、ＧＲＳＭＬＬＰＰ（配列番号２２８）、ＧＲＳＭＬＬＳＰ（配列番号２２９）、ＧＲＳＭＬＭＧＰ（配列番号２３０）、ＧＲＳＭＬＭＰＰ（配列番号２３１）、ＧＲＳＭＬＭＳＰ（配列番号２３２）、ＧＲＳＭＬＬＧＳ（配列番号２３３）、ＧＲＳＭＬＬＰＳ（配列番号２３４）、ＧＲＳＭＬＬＳＳ（配列番号２３５）、ＧＲＳＭＬＭＧＳ（配列番号２３６）、ＧＲＳＭＬＭＰＳ（配列番号２３７）、及びＧＲＳＭＬＭＳＳ（配列番号２３８）から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む拡張コアＣＭコンセンサス８配列を含む。
いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＧＲＳＭＬＬ（配列番号２１３）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＧＲＳＭＬＭ（配列番号２１４）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＧＲＳＭＬＬＧ（配列番号２１５）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＧＲＳＭＬＬＰ（配列番号２１６）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＧＲＳＭＬＬＳ（配列番号２１７）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＧＲＳＭＬＭＧ（配列番号２１８）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＧＲＳＭＬＭＰ（配列番号２１９）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＧＲＳＭＬＭＳ（配列番号２２０）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＧＲＳＭＬＬＧＧ（配列番号２２１）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＧＲＳＭＬＬＰＧ（配列番号２２２）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＧＲＳＭＬＬＳＧ（配列番号２２３）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＧＲＳＭＬＭＧＧ（配列番号２２４）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＧＲＳＭＬＭＰＧ（配列番号２２５）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＧＲＳＭＬＭＳＧ（配列番号２２６）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＧＲＳＭＬＬＧＰ（配列番号２２７）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＧＲＳＭＬＬＰＰ（配列番号２２８）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＧＲＳＭＬＬＳＰ（配列番号２２９）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＧＲＳＭＬＭＧＰ（配列番号２３０）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＧＲＳＭＬＭＰＰ（配列番号２３１）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＧＲＳＭＬＭＳＰ（配列番号２３２）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＧＲＳＭＬＬＧＳ（配列番号２３３）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＧＲＳＭＬＬＰＳ（配列番号２３４）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＧＲＳＭＬＬＳＳ（配列番号２３５）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＧＲＳＭＬＭＧＳ（配列番号２３６）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＧＲＳＭＬＭＰＳ（配列番号２３７）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＧＲＳＭＬＭＳＳ（配列番号２３８）を含む。
いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＬＡＲＡＧ（配列番号２３９）を含むコアＣＭコンセンサス９配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭは、ＬＡＲＡＧＩ（配列番号２４０）、ＬＡＲＡＧＬ（配列番号２４１）、ＰＬＡＲＡＧＩ（配列番号２４２）、ＰＬＡＲＡＧＬ（配列番号２４３）、ＲＰＬＡＲＡＧＩ（配列番号２４４）、及びＲＰＬＡＲＡＧＬ（配列番号２４５）から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む拡張コアＣＭコンセンサス９配列を含む。
いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＬＡＲＡＧＩ（配列番号２４０）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＬＡＲＡＧＬ（配列番号２４１）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＰＬＡＲＡＧＩ（配列番号２４２）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＰＬＡＲＡＧＬ（配列番号２４３）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＲＰＬＡＲＡＧＩ（配列番号２４４）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＲＰＬＡＲＡＧＬ（配列番号２４５）を含む。
いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＥＳＲＲＷ（配列番号２４６）を含むコアＣＭコンセンサス１０配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭは、ＥＳＲＲＷＭ（配列番号２４７）、ＥＳＲＲＷＭＰ（配列番号２４８）、及びＰＥＳＲＲＷＭＰ（配列番号２４９）から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む拡張コアＣＭコンセンサス１０配列を含む。
いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＥＳＲＲＷＭ（配列番号２４７）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＥＳＲＲＷＭＰ（配列番号２４８）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＰＥＳＲＲＷＭＰ（配列番号２４９）を含む。
いくつかの実施形態において、ＣＭは、ＩＬＰＲＳＰＡＦ（配列番号２５０）、ＶＡＧＲＳＭＲＰ（配列番号２５１）、ＶＶＰＥＧＲＲＳ（配列番号２５２）、ＱＧＲＡＩＴＦＩ（配列番号２５３）、ＶＬＳＫＱＭＳＦ（配列番号２５４）、ＬＫＧＲＳＹＹＹ（配列番号２５５）、ＫＲＭＰＶＱＦＬ（配列番号２５６）、ＰＱＨＲＩＶＳＦ（配列番号２５７）、ＹＫＫＦＶＧＳＬ（配列番号２５８）、ＨＭＭＱＹＡＲＨ（配列番号２５９）、ＩＰＦＳＷＳＲＦ（配列番号２６０）、ＬＳＱＡＲＷＲＫ（配列番号２６１）、ＤＩＳＨＷＲＲＳ（配列番号２６２）、ＲＫＴＶＱＨＷＷ（配列番号２６３）、ＲＦＹＲＮＱＦＦ（配列番号２６４）、ＲＳＬＶＦＡＰＩ（配列番号２６５）、ＲＳＰＳＲＬＫＣ（配列番号２６６）、及びＲＫＭＰＮＩＴＶ（配列番号２６７）から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＩＬＰＲＳＰＡＦ（配列番号２５０）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＶＡＧＲＳＭＲＰ（配列番号２５１）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＶＶＰＥＧＲＲＳ（配列番号２５２）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＱＧＲＡＩＴＦＩ（配列番号２５３）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＶＬＳＫＱＭＳＦ（配列番号２５４）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＬＫＧＲＳＹＹＹ（配列番号２５５）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＫＲＭＰＶＱＦＬ（配列番号２５６）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＰＱＨＲＩＶＳＦ（配列番号２５７）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＹＫＫＦＶＧＳＬ（配列番号２５８）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＨＭＭＱＹＡＲＨ（配列番号２５９）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＩＰＦＳＷＳＲＦ（配列番号２６０）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＬＳＱＡＲＷＲＫ（配列番号２６１）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＤＩＳＨＷＲＲＳ（配列番号２６２）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＲＫＴＶＱＨＷＷ（配列番号２６３＿）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＲＦＹＲＮＱＦＦ（配列番号２６４）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＲＳＬＶＦＡＰＩ（配列番号２６５）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＲＳＰＳＲＬＫＣ（配列番号２６６）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＲＫＭＰＮＩＴＶ（配列番号２６７）を含む。
いくつかの実施形態において、モチーフ配列は、表１０Ａ〜１０Ｄに示すコアＣＭコンセンサス配列を含む。いくつかの実施形態において、モチーフ配列は、表１０Ａ〜１０Ｄに示すコアＣＭコンセンサス配列の亜属、すなわち、亜群を含む。
いくつかの実施形態において、モチーフ配列は、表１０Ａ〜１０Ｄに示すコアＣＭコンセンサス配列の１つに基づく拡張コンセンサス配列を含む。いくつかの実施形態において、拡張コンセンサス配列は、表１１Ａ〜１１Ｄに示すコンセンサス配列である。
いくつかの実施形態において、ＣＭは、アミノ酸配列ＬＳＧＲＳＡＮＨ（配列番号３０７）又はＬＳＧＲＳＧＮＨ（配列番号３０８）を含むコアＣＭコンセンサス１１配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭは、アミノ酸配列ＤＲＬＳＧＲＳＡＮＨＫＫ（配列番号３０９）、ＤＲＬＳＧＲＳＤＮＨＫＫ（配列番号３１０）、又はＮＴＬＳＧＲＳＧＮＨＧＳ（配列番号３１１）を含む拡張コアＣＭコンセンサス１１配列を含む。
いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＬＳＧＲＳＡＮＨ（配列番号３０７）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＬＳＧＲＳＧＮＨ（配列番号３０８）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＤＲＬＳＧＲＳＡＮＨＫＫ（配列番号３０９）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＤＲＬＳＧＲＳＤＮＨＫＫ（配列番号３１０）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＮＴＬＳＧＲＳＧＮＨＧＳ（配列番号３１１）を含む。
いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＬＳＧＲＳＡＮＨ（配列番号３０７）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＬＮＧＲＳＤＮＨ（配列番号３１３）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＬＴＧＲＳＤＲＨ（配列番号３１４）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭは、アミノ酸配列ＬＳＧＲＳＡＮＨ（配列番号３０７）、ＬＮＧＲＳＤＮＨ（配列番号３１３）、及びＬＴＧＲＳＤＲＨ（配列番号３１４）を含むコアＣＭコンセンサス１２配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭは、ＤＲＬＳＧＲＳＡＮＨＫＫ（配列番号３０９）、ＤＲＬＳＧＲＳＤＮＨＫＫ（配列番号３１０）、ＧＰＬＮＧＲＳＤＮＨＫＡ（配列番号３２０）、ＧＰＬＮＧＲＳＤＮＨＫＫ（配列番号３２１）、ＧＰＬＮＧＲＳＤＮＨＫＲ（配列番号３２２）、ＧＰＬＮＧＲＳＤＮＨＱＡ（配列番号３２３）、ＧＰＬＮＧＲＳＤＮＨＱＫ（配列番号３２４）、ＧＰＬＮＧＲＳＤＮＨＱＲ（配列番号３２５）、ＧＰＬＮＧＲＳＤＮＨＲＡ（配列番号３２６）、ＧＰＬＮＧＲＳＤＮＨＲＫ（配列番号３２７）、ＧＰＬＮＧＲＳＤＮＨＲＲ（配列番号３２８）、ＲＰＬＮＧＲＳＤＮＨＫＡ（配列番号３２９）、ＲＰＬＮＧＲＳＤＮＨＫＫ（配列番号３３０）、ＲＰＬＮＧＲＳＤＮＨＫＲ（配列番号３３１）、ＲＰＬＮＧＲＳＤＮＨＱＡ（配列番号３３２）、ＲＰＬＮＧＲＳＤＮＨＱＫ（配列番号３３３）、ＲＰＬＮＧＲＳＤＮＨＱＲ（配列番号３３４）、ＲＰＬＮＧＲＳＤＮＨＲＡ（配列番号３３５）、ＲＰＬＮＧＲＳＤＮＨＲＫ（配列番号３３６）、ＲＰＬＮＧＲＳＤＮＨＲＲ（配列番号３３７）、ＧＰＬＳＧＲＳＤＮＨＫＡ（配列番号３３８）、ＧＰＬＳＧＲＳＤＮＨＫＫ（配列番号３３９）、ＧＰＬＳＧＲＳＤＮＨＫＲ（配列番号３４０）、ＧＰＬＳＧＲＳＤＮＨＱＡ（配列番号３４１）、ＧＰＬＳＧＲＳＤＮＨＱＫ（配列番号３４２）、ＧＰＬＳＧＲＳＤＮＨＱＲ（配列番号３４３）、ＧＰＬＳＧＲＳＤＮＨＲＡ（配列番号３４４）、ＧＰＬＳＧＲＳＤＮＨＲＫ（配列番号３４５）、ＧＰＬＳＧＲＳＤＮＨＲＲ（配列番号３４６）、ＲＰＬＳＧＲＳＤＮＨＫＡ（配列番号３４７）、ＲＰＬＳＧＲＳＤＮＨＫＫ（配列番号３４８）、ＲＰＬＳＧＲＳＤＮＨＫＲ（配列番号３４９）、ＲＰＬＳＧＲＳＤＮＨＱＡ（配列番号３５０）、ＲＰＬＳＧＲＳＤＮＨＱＫ（配列番号３５１）、ＲＰＬＳＧＲＳＤＮＨＱＲ（配列番号３５２）、ＲＰＬＳＧＲＳＤＮＨＲＡ（配列番号３５３）、ＲＰＬＳＧＲＳＤＮＨＲＫ（配列番号３５４）、ＲＰＬＳＧＲＳＤＮＨＲＲ（配列番号３５５）、及びＫＧＬＴＧＲＳＤＲＨＱＡ（配列番号３５６）から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む拡張コアＣＭコンセンサス１２配列を含む。
いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＤＲＬＳＧＲＳＡＮＨＫＫ（配列番号３０９）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＤＲＬＳＧＲＳＤＮＨＫＫ（配列番号３１０）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＧＰＬＮＧＲＳＤＮＨＫＡ（配列番号３２０）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＧＰＬＮＧＲＳＤＮＨＫＫ（配列番号３２１）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＧＰＬＮＧＲＳＤＮＨＫＲ（配列番号３２２）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＧＰＬＮＧＲＳＤＮＨＱＡ（配列番号３２３）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＧＰＬＮＧＲＳＤＮＨＱＫ（配列番号３２４）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＧＰＬＮＧＲＳＤＮＨＱＲ（配列番号３２５）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＧＰＬＮＧＲＳＤＮＨＲＡ（配列番号３２６）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＧＰＬＮＧＲＳＤＮＨＲＫ（配列番号３２７）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＧＰＬＮＧＲＳＤＮＨＲＲ（配列番号３２８）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＲＰＬＮＧＲＳＤＮＨＫＡ（配列番号３２９）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＲＰＬＮＧＲＳＤＮＨＫＫ（配列番号３３０）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＲＰＬＮＧＲＳＤＮＨＫＲ（配列番号３３１）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＲＰＬＮＧＲＳＤＮＨＱＡ（配列番号３３２）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＲＰＬＮＧＲＳＤＮＨＱＫ（配列番号３３３）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＲＰＬＮＧＲＳＤＮＨＱＲ（配列番号３３４）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＲＰＬＮＧＲＳＤＮＨＲＡ（配列番号３３５）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＲＰＬＮＧＲＳＤＮＨＲＫ（配列番号３３６）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＲＰＬＮＧＲＳＤＮＨＲＲ（配列番号３３７）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＧＰＬＳＧＲＳＤＮＨＫＡ（配列番号３３８）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＧＰＬＳＧＲＳＤＮＨＫＫ（配列番号３３９）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＧＰＬＳＧＲＳＤＮＨＫＲ（配列番号３４０）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＧＰＬＳＧＲＳＤＮＨＱＡ（配列番号３４１）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＧＰＬＳＧＲＳＤＮＨＱＫ（配列番号３４２）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＧＰＬＳＧＲＳＤＮＨＱＲ（配列番号３４３）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＧＰＬＳＧＲＳＤＮＨＲＡ（配列番号３４４）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＧＰＬＳＧＲＳＤＮＨＲＫ（配列番号３４５）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＧＰＬＳＧＲＳＤＮＨＲＲ（配列番号３４６）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＲＰＬＳＧＲＳＤＮＨＫＡ（配列番号３４７）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＲＰＬＳＧＲＳＤＮＨＫＫ（配列番号３４８）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＲＰＬＳＧＲＳＤＮＨＫＲ（配列番号３４９）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＲＰＬＳＧＲＳＤＮＨＱＡ（配列番号３５０）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＲＰＬＳＧＲＳＤＮＨＱＫ（配列番号３５１）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＲＰＬＳＧＲＳＤＮＨＱＲ（配列番号３５２）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＲＰＬＳＧＲＳＤＮＨＲＡ（配列番号３５３）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＲＰＬＳＧＲＳＤＮＨＲＫ（配列番号３５４）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＲＰＬＳＧＲＳＤＮＨＲＲ（配列番号３５５）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＫＧＬＴＧＲＳＤＲＨＱＡ（配列番号３５６）を含む。
いくつかの実施形態において、ＣＭは、アミノ酸配列ＲＩＧＲＳＤＮＨ（配列番号３５７）又はＲＬＧＲＳＤＮＮ（配列番号３５８）を含むコアＣＭコンセンサス１３配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭは、アミノ酸配列ＮＨＲＩＧＲＳＤＮＨＲＲ（配列番号３５９）又はＴＬＲＬＧＲＳＤＮＮＫＮ（配列番号３６０）を含む拡張コアＣＭコンセンサス１３配列を含む。
いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＲＩＧＲＳＤＮＨ（配列番号３５７）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＲＬＧＲＳＤＮＮ（配列番号３５８）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＮＨＲＩＧＲＳＤＮＨＲＲ（配列番号３５９）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＴＬＲＬＧＲＳＤＮＮＫＮ（配列番号３６０）を含む。
いくつかの実施形態において、ＣＭは、ＴＳＧＲＳＡＮＰ（配列番号３６１）、ＴＳＧＲＳＧＮＰ（配列番号３６２）、ＬＳＧＲＳＡＮＰ（配列番号３６３）、及びＬＳＧＲＳＧＮＰ（配列番号３６４）から成る群から選択されるアミノ酸配列を含むコアＣＭコンセンサス１４配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭは、ＴＳＴＳＧＲＳＡＮＰＲＧ（配列番号３６５）、ＴＳＴＳＧＲＳＧＮＰＲＧ（配列番号３６６）、ＴＳＬＳＧＲＳＡＮＰＲＧ（配列番号３６７）、及びＴＳＬＳＧＲＳＧＮＰＲＧ（配列番号３６８）から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む拡張コアＣＭコンセンサス１４配列を含む。
いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＴＳＧＲＳＡＮＰ（配列番号３６１）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＴＳＧＲＳＧＮＰ（配列番号３６２）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＬＳＧＲＳＡＮＰ（配列番号３６３）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＬＳＧＲＳＧＮＰ（配列番号３６４）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＴＳＴＳＧＲＳＡＮＰＲＧ（配列番号３６５）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＴＳＴＳＧＲＳＧＮＰＲＧ（配列番号３６６）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＴＳＬＳＧＲＳＡＮＰＲＧ（配列番号３６７）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列とＴＳＬＳＧＲＳＧＮＰＲＧ（配列番号３６８）を含む。
いくつかの実施形態において、ＣＭは、ＬＳＧＲＳＥＮＨ（配列番号３６９）、ＳＩＡＲＳＤＮＬ（配列番号３７０）、ＬＳＧＲＳＶＴＱ（配列番号３７１）、ＬＳＧＲＳＧＮＨ（配列番号３０８）、ＬＴＧＲＳＤＲＨ（配列番号３１４）、ＬＹＧＲＳＥＮＮ（配列番号３７４）、ＲＬＧＲＳＤＮＮ（配列番号３７５）、ＴＳＧＲＳＡＮＰ（配列番号３７６）、ＮＴＬＳＧＲＳＥＮＨＳＧ（配列番号３７７）、ＰＰＳＩＡＲＳＤＮＬＡＮ（配列番号３７８）、ＴＧＬＳＧＲＳＶＴＱＴＳ（配列番号３７９）、ＮＴＬＳＧＲＳＧＮＨＧＳ（配列番号３１１）、ＫＧＬＴＧＲＳＤＲＨＱＡ（配列番号３８１）、ＫＮＬＹＧＲＳＥＮＮＧＮ（配列番号３８２）、ＴＬＲＬＧＲＳＤＮＮＫＮ（配列番号３８３）、及びＴＳＴＳＧＲＳＡＮＰＲＧ（配列番号３８４）から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＬＳＧＲＳＥＮＨ（配列番号３６９）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＳＩＡＲＳＤＮＬ（配列番号３７０）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＬＳＧＲＳＶＴＱ（配列番号３７１）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＬＳＧＲＳＧＮＨ（配列番号３０８）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＬＴＧＲＳＤＲＨ（配列番号３１４）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＬＹＧＲＳＥＮＮ（配列番号３７４）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＲＬＧＲＳＤＮＮ（配列番号３７５）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＴＳＧＲＳＡＮＰ（配列番号３７６）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＮＴＬＳＧＲＳＥＮＨＳＧ（配列番号３７７）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＰＰＳＩＡＲＳＤＮＬＡＮ（配列番号３７８）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＴＧＬＳＧＲＳＶＴＱＴＳ（配列番号３７９）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＮＴＬＳＧＲＳＧＮＨＧＳ（配列番号３１１）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＫＧＬＴＧＲＳＤＲＨＱＡ（配列番号３８１）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＫＮＬＹＧＲＳＥＮＮＧＮ（配列番号３８２）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＴＬＲＬＧＲＳＤＮＮＫＮ（配列番号３８３）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはアミノ酸配列ＴＳＴＳＧＲＳＡＮＰＲＧ（配列番号３８４）を含む。
いくつかの実施形態において、ＣＭは、少なくとも２つのプロテアーゼのための基質である。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのプロテアーゼは、マトリプターゼ及びｕＰＡから選択され、そして、少なくとも１つのプロテアーゼは、表７に示すものから成る群から選択される。
いくつかの実施形態において、活性化可能抗体は、少なくとも第１のＣＭ及び第２のＣＭを含んでいる。いくつかの実施形態において、第１のＣＭ及び第２のＣＭはそれぞれ、長さが１５アミノ酸未満のポリペプチドである。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体内の第１のＣＭ及び第２のＣＭは、未切断状態で以下のＮ末端からＣ末端への構造配置：ＭＭ‐ＣＭ１‐ＣＭ２‐ＡＢ、ＡＢ‐ＣＭ２‐ＣＭ１‐ＭＭ、ＭＭ‐ＣＭ２‐ＣＭ１‐ＡＢ、又はＡＢ‐ＣＭ１‐ＣＭ２‐ＭＭを有する。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体は、ＭＭとＣＭ１との間に連結ペプチドを含んでいる。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体は、ＣＭ１とＣＭ２との間に連結ペプチドを含んでいる。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体は、ＣＭ２とＡＢとの間に連結ペプチドを含んでいる。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体は、ＭＭとＣＭ１との間に連結ペプチドを、及びＣＭ２とＡＢとの間に連結ペプチドを含んでいる。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体は、ＭＭとＣＭ１との間に連結ペプチドを、及びＣＭ１とＣＭ２との間に連結ペプチドを含んでいる。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体は、ＣＭ１とＣＭ２との間に連結ペプチドを、及びＣＭ２とＡＢとの間に連結ペプチドを含んでいる。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体は、ＭＭとＣＭ１との間に連結ペプチドを、ＣＭ１とＣＭ２との間に連結ペプチドを、及びＣＭ２とＡＢとの間に連結ペプチドを含んでいる。
いくつかの実施形態において、ＣＭ２は、特定のプロテアーゼとの使用のために選択される。いくつかの実施形態において、ＣＭ２は、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）、好中球エラスターゼ、ｕＰＡ、レグミン、マトリプターゼ、トロンビン、例えばカテプシンなどのシステインプロテアーゼ、ＡＤＡＭ１７、ＢＭＰ‐１、ＨｔｒＡ１、並びに、例えばＴＭＰＲＳＳ３又はＴＭＰＲＳＳ４などのＴＭＰＲＳＳから成る群から選択される少なくとも１つのプロテアーゼのための基質である。
いくつかの実施形態において、ＣＭ２は好中球エラスターゼのための基質である。いくつかの実施形態において、ＣＭ２はｕＰＡのための基質である。いくつかの実施形態において、ＣＭ２はレグミンのための基質である。いくつかの実施形態において、ＣＭ２はマトリプターゼのための基質である。いくつかの実施形態において、ＣＭ２はトロンビンのための基質である。いくつかの実施形態において、ＣＭ２はシステインプロテアーゼのための基質である。いくつかの実施形態において、ＣＭ２はカテプシンのための基質である。いくつかの実施形態において、ＣＭ２はＡＤＡＭ１７のための基質である。いくつかの実施形態において、ＣＭ２はＢＭＰ‐１のための基質である。いくつかの実施形態において、ＣＭ２はＨｔｒＡ１のための基質である。いくつかの実施形態において、ＣＭ２はＴＭＰＲＳＳのための基質である。いくつかの実施形態において、ＣＭ２はＴＭＰＲＳＳ３のための基質である。いくつかの実施形態において、ＣＭ２はＴＭＰＲＳＳ４のための基質である。
例えば、好適なＣＭ２は、少なくとも１つのプロテアーゼによって切断され、且つ、配列ＴＧＲＧＰＳＷＶ（配列番号４０２）；ＳＡＲＧＰＳＲＷ（配列番号４０３）；ＴＡＲＧＰＳＦＫ（配列番号４０４）；ＴＡＲＧＰＳＷ（配列番号４０５）；ＬＳＧＲＳＤＮＨ（配列番号４０６）；ＧＧＷＨＴＧＲＮ（配列番号４０７）；ＨＴＧＲＳＧＡＬ（配列番号４０８）；ＰＬＴＧＲＳＧＧ（配列番号４０９）；ＡＡＲＧＰＡＩＨ（配列番号４１１）；ＲＧＰＡＦＮＰＭ（配列番号４１２）；ＳＳＲＧＰＡＹＬ（配列番号４１３）；ＲＧＰＡＴＰＩＭ（配列番号４１４）；ＲＧＰＡ（配列番号４１５）；ＧＧＱＰＳＧＭＷＧＷ（配列番号４１６）；ＦＰＲＰＬＧＩＴＧＬ（配列番号４１７）；ＶＨＭＰＬＧＦＬＧＰ（配列番号４１８）；ＳＰＬＴＧＲＳＧ（配列番号４１９）；ＳＡＧＦＳＬＰＡ（配列番号１２６）；ＬＡＰＬＧＬＱＲＲ（配列番号４２０）；ＳＧＧＰＬＧＶＲ（配列番号４２１）；ＰＬＧＬ（配列番号４２２）；ＧＰＲＳＦＧＬ（配列番号４２３）及び／又はＧＰＲＳＦＧ（配列番号４２４）を含んでいる。
いくつかの実施形態において、ＣＭ２はアミノ酸配列ＴＧＲＧＰＳＷＶ（配列番号４０２）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭ２はアミノ酸配列ＳＡＲＧＰＳＲＷ（配列番号４０３）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭ２はアミノ酸配列ＴＡＲＧＰＳＦＫ（配列番号４０４）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭ２はアミノ酸配列ＴＡＲＧＰＳＷ（配列番号４０５）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭ２はアミノ酸配列ＬＳＧＲＳＤＮＨ（配列番号４０６）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭ２はアミノ酸配列ＧＧＷＨＴＧＲＮ（配列番号４０７）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭ２はアミノ酸配列ＨＴＧＲＳＧＡＬ（配列番号４０８）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭ２はアミノ酸配列ＰＬＴＧＲＳＧＧ（配列番号４０９）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭ２はアミノ酸配列ＡＡＲＧＰＡＩＨ（配列番号４１１）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭ２はアミノ酸配列ＲＧＰＡＦＮＰＭ（配列番号４１２）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭ２はアミノ酸配列ＳＳＲＧＰＡＹＬ（配列番号４１３）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭ２はアミノ酸配列ＲＧＰＡＴＰＩＭ（配列番号４１４）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭ２はアミノ酸配列ＲＧＰＡ（配列番号４１５）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭ２はアミノ酸配列ＧＧＱＰＳＧＭＷＧＷ（配列番号４１６）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭ２はアミノ酸配列ＦＰＲＰＬＧＩＴＧＬ（配列番号４１７）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭ２はアミノ酸配列ＶＨＭＰＬＧＦＬＧＰ（配列番号４１８）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭ２はアミノ酸配列ＳＰＬＴＧＲＳＧ（配列番号４１９）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭ２はアミノ酸配列ＬＡＰＬＧＬＱＲＲ（配列番号４２０）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭ２はアミノ酸配列ＳＧＧＰＬＧＶＲ（配列番号４２１）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭ２はアミノ酸配列ＰＬＧＬ（配列番号４２２）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭ２はアミノ酸配列ＧＰＲＳＦＧＬ（配列番号４２３）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭ２はアミノ酸配列ＧＰＲＳＦＧ（配列番号４２４）を含む。
いくつかの実施形態において、ＣＭ２は少なくとも１つのＭＭＰのための基質である。いくつかの実施形態において、ＣＭ２は表７で列挙した少なくとも１つのＭＭＰのための基質である。いくつかの実施形態において、ＣＭ２はＭＭＰ９のための基質である。いくつかの実施形態において、ＣＭ２はＭＭＰ１４のための基質である。いくつかの実施形態において、ＣＭ２は２つ以上のＭＭＰのための基質である。いくつかの実施形態において、ＣＭ２は少なくともＭＭＰ９又はＭＭＰ１４のための基質である。いくつかの実施形態において、ＣＭ２は２つ以上のＭＭＰのための基質である。いくつかの実施形態において、ＣＭ２は少なくともＭＭＰ９及びＭＭＰ１４のための基質である。
いくつかの実施形態において、ＣＭ２は、ＭＭＰのための基質であり、且つ、配列ＩＳＳＧＬＬＳＳ（配列番号４２５）；ＱＮＱＡＬＲＭＡ（配列番号４２６）；ＡＱＮＬＬＧＭＶ（配列番号４２７）；ＳＴＦＰＦＧＭＦ（配列番号４２８）；ＰＶＧＹＴＳＳＬ（配列番号４２９）；ＤＷＬＹＷＰＧＩ（配列番号４３０）；ＭＩＡＰＶＡＹＲ（配列番号４３１）；ＲＰＳＰＭＷＡＹ（配列番号４３２）；ＷＡＴＰＲＰＭＲ（配列番号４３３）；ＦＲＬＬＤＷＱＷ（配列番号４３４）；ＬＫＡＡＰＲＷＡ（配列番号４３５）；ＧＰＳＨＬＶＬＴ（配列番号４３６）；ＬＰＧＧＬＳＰＷ（配列番号４３７）；ＭＧＬＦＳＥＡＧ（配列番号４３８）；ＳＰＬＰＬＲＶＰ（配列番号４３９）；ＲＭＨＬＲＳＬＧ（配列番号４４０）；ＬＡＡＰＬＧＬＬ（配列番号４４１）；ＡＶＧＬＬＡＰＰ（配列番号４４２）；ＬＬＡＰＳＨＲＡ（配列番号４４３）；ＰＡＧＬＷＬＤＰ（配列番号４４４）
及び／又はＩＳＳＧＬＳＳ（配列番号４４５）を含んでいる。
いくつかの実施形態において、第１の切断剤と第２の切断剤はマトリプターゼ及びｕＰＡから選択されるプロテアーゼであり、且つ、第１のＣＭ及び第２のＣＭは酵素によって異なった基質である。いくつかの実施形態において、第１の切断剤と第２の切断剤は異なったプロテアーゼであり、ここで、少なくとも１つのプロテアーゼがマトリプターゼ及びｕＰＡから選択される。いくつかの実施形態において、第１の切断剤と第２の切断剤は標的組織内で共局在する。いくつかの実施形態において、第１のＣＭ及び第２のＣＭは標的組織内の少なくとも１つの切断剤によって切断される。
いくつかの実施形態において、活性化可能抗体がマトリプターゼ及びｕＰＡ斯かるから選択されるプロテアーゼに晒され、それによって切断され、その結果、活性化された又は切断された状態で、活性化された抗体は、プロテアーゼがＣＭを切断した後、少なくともＬＰ２及び／又はＣＭ配列の一部を含む軽鎖アミノ酸配列を含んでいる。
いくつかの実施形態において、ＣＭはプロテアーゼ切断部位の非プライムサイドを含む；すなわち、ＣＭは少なくともＰ１及びＰ２アミノ酸を含み、そして、いくつかの実施形態において、Ｐ１、Ｐ２及びＰ３アミノ酸を含み、そして、いくつかの実施形態において、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、及びＰ４アミノ酸を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭはプロテアーゼ切断部位の非プライムサイドとプライムサイドを含む。いくつかの実施形態において、ＣＭは、非プライムサイドを含むが、プロテアーゼ切断部位のプライムサイドの少なくとも一部を欠いている。いくつかの実施形態において、ＣＭは、非プライムサイドを含んでいるが、プロテアーゼ切断部位のプライムサイドを欠いている。斯かるＣＭは、抗体又は例えばこれだけに限定されるものではないが、検出部分などの本明細書中の本開示に示す他の分子に直接連結されるか、又はリンカーを通して連結される。
いくつかの実施形態において、活性化可能抗体もまた、ＡＢと複合化された剤を含んでいる。いくつかの実施形態において、剤は治療剤である。いくつかの実施形態において、剤は抗腫瘍剤である。いくつかの実施形態において、剤は、毒素又はその断片である。いくつかの実施形態において、剤はリンカーを介してＡＢに結合される。いくつかの実施形態において、リンカーは切断可能なリンカーである。いくつかの実施形態において、剤は微小管阻害剤である。いくつかの実施形態において、剤は、例えばＤＮＡアルキル化剤、ＤＮＡインターカレーター、又は他のＤＮＡ損傷剤などの核酸損傷剤である。いくつかの実施形態において、リンカーは切断可能なリンカーである。いくつかの実施形態において、剤は、少なくとも１つのＭＭＰ切断可能基質配列を含んでいるリンカーを介してＡＢに結合される。いくつかの実施形態において、剤は、表３で列挙した群から選ばれた剤である。いくつかの実施形態において、剤はドラスタチンである。いくつかの実施形態において、剤は、アウリスタチン又はその誘導体である。いくつかの実施形態において、剤は、アウリスタチンＥ又はその誘導体である。いくつかの実施形態において、剤はモノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）である。いくつかの実施形態において、剤はモノメチルアウリスタチンＤ（ＭＭＡＤ）である。いくつかの実施形態において、剤は、マイタンシノイド又はマイタンシノイド誘導体である。いくつかの実施形態において、剤は、ＤＭ１又はＤＭ４である。いくつかの実施形態において、剤は、デュオカルマイシン又はその誘導体である。いくつかの実施形態において、剤は、カリケアマイシン又はその誘導体である。いくつかの実施形態において、剤はピロロベンゾジアゼピンである。
いくつかの実施形態において、剤は、抗炎症剤である。
いくつかの実施形態において、活性化可能抗体はまた、検出可能部分も含んでいる。いくつかの実施形態において、検出可能部分は診断剤である。
いくつかの実施形態において、複合抗体は、検出可能標識を含んでいる。いくつかの実施形態において、検出可能標識は、イメージング剤（imaging agent）、造影剤、酵素、蛍光標識、発色団、色素、１若しくは複数の金属イオン、又はリガンドベースの標識を含む。いくつかの実施形態において、イメージング剤は放射性同位元素を含む。いくつかの実施形態において、放射性同位元素は、インジウム又はテクネチウムである。いくつかの実施形態において、造影剤は、ヨウ素、ガドリニウム又は酸化鉄を含む。いくつかの実施形態において、酵素は、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、又はβガラクトシダーゼを含む。いくつかの実施形態において、蛍光標識は、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、修飾された赤色蛍光タンパク質（ｍＲＦＰ）、赤色蛍光タンパク質ｔｄｉｍｅｒ２（ＲＦＰ ｔｄｉｍｅｒ２）、ＨＣＲＥＤ、又はユーロピウム誘導体を含む。いくつかの実施形態において、発光性標識は、Ｎ‐メチルアクリジニウム誘導体を含む。いくつかの実施形態において、標識は、Ａｌｅｘ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６８０又はＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）７５０などのＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）標識を含む。いくつかの実施形態において、リガンドベースの標識は、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン又は１若しくは複数のハプテンを含む。
いくつかの実施形態において、活性化可能抗体はまた、シグナルペプチドも含んでいる。いくつかの実施形態において、シグナルペプチドはスペーサーを介して活性化可能抗体に結合される。いくつかの実施形態において、スペーサーはシグナルペプチドがない状態でも活性化可能抗体に結合される。いくつかの実施形態において、スペーサーは活性化可能抗体のＭＭに直接連結される。いくつかの実施形態において、スペーサーは、スペーサー‐ＭＭ‐ＣＭ‐ＡＢのＮ末端からＣ末端への構造配置で活性化可能抗体のＭＭに直接連結される。活性化可能抗体のＭＭのＮ末端に直接連結されるスペーサーの例は、ＱＧＱＳＧＱ（配列番号４４６）である。いくつかの実施形態において、スペーサーは、少なくともアミノ酸配列ＱＧＱＳＧＱ（配列番号４４６）を含んでいる。
いくつかの実施形態において、活性化可能抗体のＡＢは、１若しくは複数のジスルフィド結合を自然に含んでいる。いくつかの実施形態において、ＡＢは、１若しくは複数のジスルフィド結合を含むように設計され得る。
いくつかの実施形態において、活性化可能抗体の血清中半減期は、対応する抗体の血清中半減期より長い；例えば、活性化可能抗体のｐＫは、対応する抗体のｐＫより長い。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体の血清中半減期は、対応する抗体の血清中半減期と同等である。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体の血清中半減期は、生物に投与される場合、少なくとも１５日である。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体の血清中半減期は、生物に投与される場合、少なくとも１２日である。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体の血清中半減期は、生物に投与される場合、少なくとも１１日である。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体の血清中半減期は、生物に投与される場合、少なくとも１０日である。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体の血清中半減期は、生物に投与される場合、少なくとも９日である。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体の血清中半減期は、生物に投与される場合、少なくとも８日である。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体の血清中半減期は、生物に投与される場合、少なくとも７日である。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体の血清中半減期は、生物に投与される場合、少なくとも６日である。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体の血清中半減期は、生物に投与される場合、少なくとも５日である。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体の血清中半減期は、生物に投与される場合、少なくとも４日である。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体の血清中半減期は、生物に投与される場合、少なくとも３日である。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体の血清中半減期は、生物に投与される場合、少なくとも２日である。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体の血清中半減期は、生物に投与される場合、少なくとも２４時間である。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体の血清中半減期は、生物に投与される場合、少なくとも２０時間である。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体の血清中半減期は、生物に投与される場合、少なくとも１８時間である。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体の血清中半減期は、生物に投与される場合、少なくとも１６時間である。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体の血清中半減期は、生物に投与される場合、少なくとも１４時間である。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体の血清中半減期は、生物に投与される場合、少なくとも１２時間である。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体の血清中半減期は、生物に投与される場合、少なくとも１０時間である。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体の血清中半減期は、生物に投与される場合、少なくとも８時間である。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体の血清中半減期は、生物に投与される場合、少なくとも６時間である。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体の血清中半減期は、生物に投与される場合、少なくとも４時間である。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体の血清中半減期は、生物に投与される場合、少なくとも３時間である。
いくつかの実施形態において、活性化可能抗体及び／又は複合化（conjugated）活性化可能抗体は、単一特異的である。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体及び／又は複合活性化可能抗体は、多重特異的であり、例えば非限定な例によれば、二重特異的又は三官能性である。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体及び／又は複合活性化可能抗体は、プロ‐二重特異的Ｔ細胞エンゲージ（ＢＩＴＥ）分子の一部として処方される。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体及び／又は複合活性化可能抗体は、プロ‐キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）修飾されたＴ細胞又は他の操作された受容体の一部として処方される。
本開示はまた、所定の標的を特異的に結合する抗体又は抗体フラグメント（ＡＢ）を含む活性化可能抗体を含む組成物及び方法をも提供し、ここでＡＢは、ＡＢのその標的を結合する能力を低めるマスキング部分（ＭＭ）に結合される。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体はさらに、マトリプターゼ及びｕＰＡから選択される少なくとも１つのプロテアーゼのための基質である切断可能部分（ＣＭ）を含む。本明細書に提供される組成物及び方法は、活性化可能抗体の活性（例えば、マスキング、活性化又は結合活性）を損なうことなく、ＡＢにおける１若しくは複数のシステイン残基への１若しくは複数の剤の結合を可能にする。いくつかの実施形態において、本明細書に提供される組成物及び方法は、ＭＭ内の１若しくは複数のジスルフィド結合を還元し、そうでなければ、破壊することなく、ＡＢにおける１若しくは複数のシステイン残基への１若しくは複数の剤の結合を可能にする。本明細書に提供される組成物及び方法は、１若しくは複数の剤、例えば任意の種々の治療剤、診断剤及び／又は予防剤に結合される活性化可能抗体を生成し、例えば、いくつかの実施形態において、前記（単数若しくは複数の）剤のいずれも、活性化可能抗体のＭＭに結合されない。本明細書に提供される組成物及び方法は、ＭＭが切断されていない状態で活性化可能抗体のＡＢを、効果的且つ効率的にマスキングする能力を保持する、複合活性化可能抗体（conjugated activatable antibody)を生成する。本明細書に提供される組成物及び方法は、複合活性化可能抗体を生成し、ここで活性化可能抗体は、ＣＭを切断できるプロテアーゼ、すなわち、マトリプターゼ及び／又はｕＰＡの存在下でまだ活性されており、すなわち切断されている。
活性化可能抗体は、剤のための少なくとも１つの結合点を有するが、本明細書に提供される方法及び組成物においては、すべてよりも少ない可能性ある結合点が、剤への結合のために利用できる。いくつかの実施形態において、１若しくは複数の結合点は、ジスルフィド結合に含まれる硫黄原子である。いくつかの実施形態において、１若しくは複数の結合点は、鎖間ジスルフィド結合に含まれる硫黄原子である。いくつかの実施形態において、１若しくは複数の結合点は、鎖間スルフィド結合に含まれる硫黄原子であるが、しかし鎖内ジスルフィド結合に含まれる硫黄原子ではない。いくつかの実施形態において、１若しくは複数の結合点は、システイン、又は硫黄原子を含む他のアミノ酸残基中の硫黄原子である。斯かる残基は、抗体構造中に天然に存在することができるか、又は部位特異的突然変異誘発、化学的変換、又は非天然アミノ酸の誤取り組みにより、抗体中に組み込まれ得る。
ＡＢに１若しくは複数の鎖間シスルフィド結合及びＭＭに１若しくは複数の鎖内辞スルフィド結合を有する活性化可能抗体の調製方法もまた提供され、そして遊離チオールと反応性の薬物が提供される。前記方法は一般的に、活性化可能抗体における鎖間ジスルフィド結合を、還元剤、例えばＴＣＥＰにより部分的に還元し；そして前記部分的に還元された活性化可能抗体に、遊離チオールと反応性の薬物を結合することを含んでいる。本明細書において使用される場合、用語「部分的還元」とは、活性化可能抗体が、還元剤と接触され、そしてすべてよりも少ないジスルフィド結合、例えばすべてよりも少ない可能性ある結合部位が還元される状況を言及する。いくつかの実施形態において、すべての可能性ある結合部位の９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％又は５％未満が還元される。
いくつかの実施形態において、剤、例えば薬物を、前記剤の配置下で選択性をもたらす活性化可能抗体に還元し、そして結合する方法が提供される。前記方法は、一般的に、還元剤により活性化可能抗体を部分的に還元し、結果的に、活性化可能抗体のマスキング部分又は他の非−ＡＢ部分における任意の結合部位が還元されず、そして前記剤を、ＡＢにおける鎖間チオールに結合することを含んでいる。結合部位は、所望する部位での結合を可能にする剤の所望する配置を可能にするよう選択される。還元剤は例えば、ＴＣＥＰである。還元反応条件、例えば還元剤：活性化可能抗体の比、インキュベーションの長さ、インキュベーションとの間に温度、還元反応溶液のｐＨ、等は、ＭＭが切断されていない状態で活性化可能抗体のＡＢを、効果的に且つ効率的にマスキングする能力を保持する、複合活性化可能抗体を生成する条件を同定することにより決定される。還元剤：活性化可能抗体の比は、活性化可能抗体に依存して変化するのであろう。いくつかの実施形態において、還元剤：活性化可能抗体の比は、約２０：１〜１：１、約１０：１〜１：１、約９：１〜１：１、約８：１〜１：１、約７：１〜１：１、約６：１〜１：１、約５：１〜１：１、約４：１〜１：１、約３：１〜１：１、約２：１〜１：１、約２０：１〜１：１．５、約１０：１〜１：１．５、約９：１〜１：１．５、約８：１〜１：１．５、約７：１〜１：１．５、約６：１〜１：１．５、約５：１〜１：１．５、約４：１〜１：１．５、約３：１〜１：１．５、約２：１〜１：１．５、約１．５：１〜１：１．５又は約１：１〜１：１．５の範囲で存在するであろう。いくつかの実施形態において、前記比は、約５：１〜１．５：１の範囲で存在する。いくつかの実施形態において、前記比は、約４：１〜１：１の範囲で存在する。いくつかの実施形態において、前記比は、約４：１〜１．５：１の範囲で存在する。いくつかの実施形態において、前記比は、約８：１〜約１：１の範囲で存在する。いくつかの実施形態において、前記比は、約２．５：１〜１：１の範囲で存在する。
いくつかの実施形態において、活性化可能抗体のＡＢにおける鎖間ジスルフィド結合を還元し、そして剤、例えばチオール含有剤、例えば薬物を、ＡＢ上に剤を選択的に位置決定するために、前記得られる鎖間チオールに結合する方法が提供される。前記方法は一般的に、活性化可能抗体におけるすべての可能性ある鎖間チオールを形成しないで、少なくとも２つの鎖間チオールを形成するために、還元剤によりＡＢを部分的に還元市；前記剤を、部分的に還元されたＡＢの鎖間チオールに結合することを含んでいる。例えば活性化可能抗体のＡＢは、還元剤：活性化可能抗体の所望する比で、約３７℃で約１時間、部分的に還元される。いくつかの実施形態において、還元剤：活性化可能抗体の比は、約２０：１〜１：１、約１０：１〜１：１、約９：１〜１：１、約８：１〜１：１、約７：１〜１：１、約６：１〜１：１、約５：１〜１：１、約４：１〜１：１、約３：１〜１：１、約２：１〜１：１、約２０：１〜１：１．５、約１０：１〜１：１．５、約９：１〜１：１．５、約８：１〜１：１．５、約７：１〜１：１．５、約６：１〜１：１．５、約５：１〜１：１．５、約４：１〜１：１．５、約３：１〜１：１．５、約２：１〜１：１．５、約１．５：１〜１：１．５又は約１：１〜１：１．５の範囲で存在するであろう。いくつかの実施形態において、前記比は、約５：１〜１：１の範囲で存在する。いくつかの実施形態において、前記比は、約４：１〜１：１の範囲で存在する。いくつかの実施形態において、前記比は、約４：１〜１．５：１の範囲で存在する。いくつかの実施形態において、前記比は、約８：１〜約１：１の範囲で存在する。いくつかの実施形態において、前記比は、約２．５：１〜１：１の範囲で存在する。
チオール含有試薬は例えば、システイン又はＮ−アセチルシステインであり得る。還元剤は例えば、ＴＣＥＰであり得る。いくつかの実施形態において、還元された活性化可能抗体は、結合の前、例えばカラムクロマトグラフィー、透析又はダイアフィルトレーションを用いて、精製され得る。いくつかの実施形態において、還元された抗体は、部分的還元の後、及び結合の前、精製されない。
本発明は、部分的に還元された活性化可能抗体も提供し、ここで前記活性化可能抗体における少なくとも１つの鎖間ジスルフィド結合が、活性化可能抗体中のいずれの鎖内ジスルフィド結合も妨害しないで、還元剤により還元されており、ここで前記活性化可能抗体は、標的に対して特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ）、切断されていない状態で、標的への活性化可能抗体中のＡＢの結合を阻害するマスキング部分（ＭＭ）、及びＡＢに結合される切断可能部分（ＣＭ）を含み、ここで、該ＣＭは、マトリプターゼ及びｕＰＡから選択されるプロテアーゼのための基質として機能するポリペプチドである。いくつかの実施形態において、ＭＭは、ＣＭを介してＡＢに結合される。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体の１若しくは複数の鎖内ジスルフィド結合は、還元剤により妨害されない。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体内のＭＭの１若しくは複数の鎖内ジスルフィド結合は、還元剤により妨害されない。いくつかの実施形態において、切断されていない状態での活性化可能抗体は、以下のようなＮ末端からＣ末端側への構造配置：ＭＭ−ＣＭ−ＡＢ又はＡＢ−ＣＭ−ＭＭを有する。いくつかの実施形態において、還元剤はＴＣＥＰである。
本開示はまた、モノメチルアウリスタチンＤ（ＭＭＡＤ）ペイロードに接続された活性化可能抗体を含む複合活性化可能抗体を提供し、ここで前記活性化可能抗体は、標的に対して特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ）、切断されていない状態で、標的への活性化可能抗体中のＡＢの結合を阻害するマスキング部分（ＭＭ）、及びＡＢに結合される切断可能部分（ＣＭ）を含み、且つ、該ＣＭは少なくとも１つのＭＭＰプロテアーゼのための基質として機能するポリペプチドである。
いくつかの実施形態において、ＭＭＡＤ複合活性化可能抗体は、剤をＡＢに付加するためのいくつかの方法：（ａ）ＡＢの炭化水素部分への付加、又は（ｂ）ＡＢのスルフヒドリル基への付加、又は（ｃ）ＡＢのアミノ基への付加、又は（ｄ）ＡＢのカルボキシラート基への付加、のいずれかを使用して複合化され得る。
いくつかの実施形態において、ＭＭＡＤペイロードはリンカーを介してＡＢに結合される。いくつかの実施形態において、ＭＭＡＤペイロードはリンカーを介してＡＢのシステインに結合される。いくつかの実施形態において、ＭＭＡＤペイロードはリンカーを介してＡＢのリジンに結合される。いくつかの実施形態において、ＭＭＡＤペイロードは、本明細書中に本開示されたそれらの残基などのリンカーを介してＡＢの別の残基に結合される。いくつかの実施形態において、リンカーはチオール含有リンカーである。いくつかの実施形態において、リンカーは切断可能なリンカーである。いくつかの実施形態において、リンカーは、非切断可能リンカーである。いくつかの実施形態において、リンカーは、表５及び６に示したリンカーから成る群から選択される。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体とＭＭＡＤペイロードは、マレイミドカプロイル−バリン−シトルリンリンカーを介して連結される。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体とＭＭＡＤペイロードは、マレイミドＰＥＧ−バリン−シトルリンリンカーを介して連結される。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体とＭＭＡＤペイロードは、マレイミドカプロイル−バリン−シトルリン−パラ−アミノベンジルオキシカルボニルリンカーを介して連結される。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体とＭＭＡＤペイロードは、マレイミドＰＥＧ−バリン−シトルリン−パラ−アミノベンジルオキシカルボニルリンカーを介して連結される。いくつかの実施形態において、ＭＭＡＤペイロードは、本明細書中に本開示した部分還元と結合技術を使用してＡＢに結合される。
本開示はまた、本明細書中に提示したマトリプターゼ切断可能基質配列及び／又は本明細書中に提示したｕＰＡ切断可能基質配列の１若しくは複数を含んでいるポリペプチド及び他の大型分子を提供する。制限されることのない例によると、本明細書中に提示したマトリプターゼ切断可能基質配列及び／又は本明細書中に提示したｕＰＡ切断可能基質配列は、プロドラッグ組成物及びその使用方法に有効である。これらの本明細書中に提示したマトリプターゼ切断可能基質配列及び／又は本明細書中に提示したｕＰＡ切断可能基質配列は、プローブ及び他の検出可能な剤、並びにその使用方法に有効である。例えば、本明細書中に提示したマトリプターゼ切断可能基質配列及び／又は本明細書中に提示したｕＰＡ切断可能基質配列は、イメージング剤及び／又は他の診断薬などの検出可能な剤を生じさせるために蛍石や他のクエンチャーと結合状態で使用される。当業者は、本明細書中に提示したマトリプターゼ切断可能基質配列及び／又は本明細書中に提示したｕＰＡ切断可能基質配列がマトリプターゼ及び／又はｕＰＡによって切断可能基質を使用する技術分野における任意の組成物及び／又は方法に有効であることを理解する。
いくつかの実施形態において、本開示のマトリプターゼ及び／又はｕＰＡ基質は、大型分子、例えば、（ｉ）ＣＭに対してアミノ（Ｎ）末端側に位置する、すなわち、大型分子内にて、ＣＭよりも大型分子のＮ末端の近くに位置している、少なくとも１つの部分（ＭＮ）；（ｉｉ）ＣＭに対してカルボキシル（Ｃ）末端側に位置する、すなわち、大型分子内にて、ＣＭよりも大型分子のＣ末端の近くに位置している少なくとも１つの部分（ＭＣ）；（ｉｉｉ）その組み合わせ、から成る群から選択される少なくとも１つの追加部分（Ｍ）を含む単離されたポリペプチドに使用される。いくつかの実施形態において、大型分子は、少なくとも１つのＭＮ及び少なくとも１つのＭＣを含んでいる。
制限されることのない例によると、本開示の大型分子における使用のための好適なＭＮは、次の：マスキング部分、抗体、タンパク質、治療薬、抗悪性腫瘍薬、毒性剤、薬剤、検出可能部分、診断剤、親和性タグ、及びその組み合わせ、のうちの少なくとも１つを含む。
制限されることのない例によると、本開示の大型分子における使用のための好適なＭＣは、次の：マスキング部分、抗体、タンパク質、治療薬、抗悪性腫瘍薬、毒性剤、薬剤、検出可能部分、診断剤、親和性タグ、及びその組み合わせ、のうちの少なくとも１つを含む。
本開示はまた、本開示のＣＭ含有分子、例えばＣＭ含有ポリペプチド、例えば本明細書中に記載したＣＭ含有プローブ、抗体、及び／又は活性化可能抗体、をコードする単離された核酸分子、並びにこれらの単離された核酸配列を含むベクターも提供する。本開示は、ＣＭ含有ポリペプチドの発現につながる条件下で細胞を培養することによってＣＭ含有ポリペプチドを製造する方法を提供し、ここで、該細胞は斯かるベクターを含む。本開示は、抗体及び／又は活性化可能抗体の発現につながる条件下で細胞を培養することによって抗体及び／又は活性化可能抗体を製造する方法を提供し、ここで、該細胞は斯かるベクターを含む。
本開示は、所定の標的に結合する、本開示のＣＭ含有ポリペプチドを製造する方法であって、（ａ）ＣＭ含有ポリペプチドをコードする核酸構築物を含んでいる細胞を、ポリペプチドの発現につながる条件下で培養し、（ｉ）ここで、該ポリペプチドは切断可能部分（ＣＭ）を含んでおり、及び（ｉｉ）ここで、該ＣＭが、マトリプターゼ及びｕＰＡから選択される少なくとも１つのプロテアーゼのための基質として機能するポリペプチドであり；そして、（ｂ）ポリペプチドを回収することによる方法を提供する。これらの方法はまた、（ｃ）回収したポリペプチドを１若しくは複数の追加の剤に結合すること、から成る更なるステップを含むこともできる。
本開示は、所定の標的に結合する、本開示の複合抗体を製造する方法であって、（ａ）抗体をコードする核酸構築物を含んでいる細胞を、抗体の発現につながる条件下で培養し、（ｉ）ここで、該抗体が切断可能部分（ＣＭ）を含んでおり、及び（ｉｉ）該ＣＭが、マトリプターゼ及びｕＰＡから選択される少なくとも１つのプロテアーゼのための基質として機能するポリペプチドであり；（ｂ）抗体を回収し；そして、（ｃ）回収した抗体を１若しくは複数の追加の剤に結合することによる方法を提供する。
本開示はまた、（ａ）活性化可能抗体をコードする核酸構築物を含む細胞を、前記活性化可能抗体の発現を導く条件下で培養し、ここで前記活性化可能抗体はマスキング成分（ＭＭ）、切断可能成分（ＣＭ）、及び標的を特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ）を含み、ここで、（ｉ）ＣＭは、マトリプターゼ及びｕＰＡから選択されるプロテアーゼのための基質として機能するアミノ酸配列を含むポリペプチドであり；そして（ｉｉ）前記ＣＭは、活性化可能抗体に位置し、結果的に、末切断状態下で、ＭＭは標的へのＡＢの特異的結合と干渉し、そして切断された状態下で、前記ＭＭは標的へのＡＢの特異的結合と干渉しないか又はその結合と競合せず；そして（ｂ）前記活性可能抗体を回収することにより、所定の標的に活性化された状態で結合する、本開示の活性化可能抗体の製造方法も提供する。
本開示はまた、制限されることのない例として、プロドラッグ、非ペプチド型プローブなどを含むＣＭ含有非ポリペプチド分子を製造する方法も提供する。これらのＣＭ含有非ポリペプチド分子は、標準的な化学合成及び／又は複合化方法を含めた、技術分野で認識されているさまざまな技術を使用することで作製されることができる。
本開示は、それを必要としている対象に、治療上有効な量の本明細書中に記載した複合抗体、活性化可能抗体及び／又は複合活性化可能抗体を投与するのによって、対象の標的関連の疾患を予防する、進行を遅らせる、処置する、症状を緩和する、又はそうでなければ改善する方法を提供する。
本開示は、それを必要としている対象に、治療上有効な量の本明細書中に記載した複合抗体、活性化可能抗体及び／又は複合活性化可能抗体を投与するのによって、対象の炎症及び／又は炎症性疾患を予防する、進行を遅らせる、処置する、症状を緩和する、又はそうでなければ改善する方法を提供する。本開示はまた、それを必要としている対象に、治療上有効な量の本明細書中に記載した複合抗体、活性化可能抗体及び／又は複合活性化可能抗体を投与するのによって、対象の癌を予防する、進行を遅らせる、処置する、症状を緩和する、又はそうでなければ改善する方法を提供する。本開示はまた、それを必要としている対象に、治療上有効な量の本明細書中に記載した複合抗体、活性化可能抗体及び／又は複合活性化可能抗体を投与するのによって、対象の自己免疫疾患を予防する、進行を遅らせる、処置する、症状を緩和する、又はそうでなければ改善する方法を提供する。
これらの方法及び用途のいずれの実施形態で使用される複合抗体、活性化可能抗体及び／又は複合活性化可能抗体も、疾患のいずれの病期で投与されてもよい。例えば、斯かる複合抗体、活性化可能抗体及び／又は複合活性化可能抗体は、初期から転移性までのいずれの病期の癌罹患患者に投与されてもよい。対象及び患者という用語は、本明細書中で互換的に使用される。
いくつかの実施形態において、対象は哺乳類、例えばヒト、ヒト以外の霊長類、愛玩動物（例えば、ネコ、イヌ、ウマ）、家畜、作業動物又は動物園の動物などである。いくつかの実施形態において、対象はヒトである。いくつかの実施形態において、対象は愛玩動物である。いくつかの実施形態において、対象は、獣医が処置中の動物である。
複合抗体、活性化可能抗体及び／又は複合活性化可能抗体及びその治療製剤は、異常な標的の発現及び／又は活性に関係する疾患又は障害を有するか又はかかりやすい対象に投与される。異常な標的の発現及び／又は活性に関係する疾患又は障害を有するか又はかかりやすい対象は、当業界において知られている種々の方法を用いて、同定される。例えば、癌又は他の腫瘍性状態を有する対象は、健康状態を評価するために、種々の臨床学的及び／又は臨床検査、例えば物理的検査法、及び血液、尿及び／又は検便を用いて、同定される。例えば、炎症及び／又は炎症性疾患に罹患している対象は、健康状態を評価するために、臨床学的及び／又は臨床検査、例えば物理的検査法、及び体液分析、血液、尿及び／又は検便などのさまざまな検査のいずれかを用いて、同定される。
異常な標的の発現及び／又は活性に関係する疾患又は障害を有する患者への複合抗体、活性化可能抗体及び／又は複合活性化可能抗体の投与は、種々の実験的又は臨床目的が達成される場合、成功したものとして見なされる。例えば、異常な標的の発現及び／又は活性に関係する疾患又は障害を有する患者への複合抗体、活性化可能抗体及び／又は複合活性化可能抗体の投与は、患者又は障害に関連する１若しくは複数の症状が緩和され、軽減され、阻害されるか、又はさらなる悪化状態に進行しない場合、成功したものとして見なされる。異常な標的の発現及び／又は活性に関係する疾患又は障害を有する患者への複合抗体、活性化可能抗体及び／又は複合活性化可能抗体の投与は、疾患又は障害が回復するか、又はさらに悪化状態に進行しない場合、成功したものとして見なされる。
いくつかの実施形態において、複合抗体、活性化可能抗体及び／又は複合活性化可能抗体は、例えば、抗炎症剤、免疫抑制剤、及び／又は化学療法薬などの１若しくは複数の追加の剤と組み合わせて、処置中及び／又は処置後に投与される。いくつかの実施形態において、複合抗体、活性化可能抗体及び／又は複合活性化可能抗体、並びに（単数若しくは複数の）追加の剤は、同時に投与する。例えば、複合抗体、活性化可能抗体及び／又は複合活性化可能抗体、並びに（単数若しくは複数の）追加の剤は、単一の組成物で処方されても、又は２つ以上の別個の組成物として投与されてもよい。いくつかの実施形態において、複合抗体、活性化可能抗体及び／又は複合活性化可能抗体、並びに（単数若しくは複数の）追加の剤は、連続して投与されるか、又は抗体及び／又は複合抗体、並びに追加の剤は、治療計画中のいろいろな時間に投与される。例えば、抗体及び／又は複合抗体は追加の剤の投与前に投与されるか、抗体及び／又は複合抗体は追加の剤の投与に続いて投与されるか、又は抗体及び／又は複合抗体、並びに追加の剤は交互の様式で投与される。本明細書中に記載したように、抗体及び／又は複合抗体、並びに追加の剤は単回投与又は複数回投与で投与される。
いくつかの実施形態において、複合抗体、活性化可能抗体及び／又は複合活性化可能抗体は、制限されることのない例によれば、抗炎症剤、免疫抑制剤、例えばアルキル化剤、代謝拮抗物質、抗微小管剤、トポイソメラーゼ阻害剤、細胞傷害性の抗生物質、及び／又はその他の核酸損傷剤などの化学療法薬などの１若しくは複数の追加の剤と組み合わせて、処置中及び／又はその後に投与される。いくつかの実施形態において、追加の剤はパクリタキセルなどのタキサン（例えば、Abraxane（登録商標））である。いくつかの実施形態において、追加の剤はゲムシタビンなどの代謝拮抗物質である。いくつかの実施形態において、追加の剤は、カルボプラチン又はシスプラチンなどの白金を用いた化学療法などのアルキル化剤である。いくつかの実施形態において、追加の剤は、キナーゼ阻害剤、例えば、ソラフェニブ又はエルロチニブなどの標的化剤である。いくつかの実施形態において、追加の剤は、別の抗体、例えば、モノクローナル抗体（例えば、ベバシズマブ）、二重特異性抗体、又は多重特異性抗体などの標的化剤である。いくつかの実施形態において、追加の剤は、ボルテゾミブ又はカーフィルゾミブなどのプロテオソーム阻害剤である。いくつかの実施形態において、追加の剤は、レナリドマイド（lenolidominde）又はＩＬ−２などの免疫修飾薬である。いくつかの実施形態において、追加の剤は放射線である。いくつかの実施形態において、追加の剤は、当業者によって標準的な処置と考えられる剤である。いくつかの実施形態において、追加の剤は、当業者にとって周知の化学療法薬である。
いくつかの実施形態において、追加の剤は、抗体、別の複合抗体、別の活性化可能抗体、及び／又は別の複合活性化可能抗体である。いくつかの実施形態において、追加の剤は、第１の複合抗体、活性化可能抗体及び／又は複合活性化可能抗体と同じ標的に対する抗体、別の複合抗体、別の活性化可能抗体、及び／又は別の複合活性化可能抗体はそうである。いくつかの実施形態において、追加の剤は、第１の複合抗体、活性化可能抗体及び／又は複合活性化可能抗体の標的と異なった標的に対する抗体、別の複合抗体、別の活性化可能抗体、及び／又は別の複合活性化可能抗体である。
いくつかの実施形態において、複合抗体、活性化可能抗体及び／又は複合活性化可能抗体、並びに（単数若しくは複数の）追加の剤は、同時に投与する。例えば、複合抗体、活性化可能抗体及び／又は複合活性化可能抗体、並びに（単数若しくは複数の）追加の剤は、単一の組成物で処方されても、又は２つ以上の別個の組成物として投与されてもよい。いくつかの実施形態において、複合抗体、活性化可能抗体及び／又は複合活性化可能抗体、並びに（単数若しくは複数の）追加の剤は、連続して投与されるか、又は抗体及び／又は複合抗体、並びに追加の剤は、治療計画中のいろいろな時間に投与される。例えば、抗体及び／又は複合抗体は追加の剤の投与前に投与されるか、抗体及び／又は複合抗体は追加の剤の投与に続いて投与されるか、又は抗体及び／又は複合抗体、並びに追加の剤は交互の様式で投与される。本明細書中に記載したように、抗体及び／又は複合抗体、並びに追加の剤は単回投与又は複数回投与である。
いくつかの実施形態において、ＣＭは、マスキング部分（ＭＭ）にカップリングされた所定の標的に特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメントを含んでいる活性化可能抗体に連結されるか又は別の方法で取り付けられ、結果的に、ＡＢへのＭＭのカップリングが、標的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメントの能力を低減する。いくつかの実施形態において、ＭＭはＣＭを介してカップリングされる。代表的な標的は、これだけに限定されるものではないが、表１に示す標的を含む。代表的なＡＢは、これだけに限定されるものではないが、ないで、表２に示す標的を含む。本明細書中に提供した活性化可能抗体は、循環中で安定していて、意図される治療及び／又は診断部位で活性化されるが、正常であれば、例えば健康な組織又は処置及び／又は診断の標的となっていない他の組織で活性化されず、そして、活性化された場合、対応する未修飾の抗体に少なくとも匹敵する標的への結合を示す。
本開示はまた、種々の診断及び／又は予防徴候に、複合抗体、活性化可能抗体及び／又は複合活性化可能抗体を使用するための方法及びキットも提供する。
いくつかの実施形態において、本開示は、（ｉ）対象又はサンプルと、活性化可能抗体とを接触し、ここで前記活性化可能抗体は、マスキング部分（ＭＭ）、切断剤により切断される切断可能部分（ＣＭ）、及び目的の標的物を特異的に結合する抗原結合ドメイン又はそのフラグメント（ＡＢ）を含み、ここで未切断、非活性化状態での活性化可能抗体は、次の通りにＮ末端からＣ末端側への構造配置：ＭＭ−ＣＭ−ＡＢ又はＡＢ−ＣＭ−ＭＭを有し、ここで（ａ）ＭＭは、標的へのＡＢの結合を阻害するペプチドであり、そしてＭＭはＡＢの天然に存在する結合パートナーのアミノ酸配列を有さず、そしてＡＢの天然の結合パートナーの修飾された形ではなく、そして（ｂ）未切断、非活性化状態で、ＭＭは標的へのＡＢの特異的結合と干渉し、そして切断された、活性化された状態で、ＭＭは標的へのＡＢの特異的結合と干渉せず、又は競合せず；そして（ｉｉ）対象又はサンプルにおける活性化された活性化可能抗体のレベルを測定することにより、対象又はサンプルにおける切断剤及び目的の標的物の存在又は不在を検出するための方法及びキットを提供し、ここで、対象又はサンプルにおける検出可能レベルの活性化された、活性化可能抗体は、切断剤及び標的が対象又はサンプルに存在することを示唆し、そして対象又はサンプルにおける検出可能レベルの活性化された、活性化可能抗体の不在が、切断剤、標的、又はそれらの両者が対象又はサンプルに不在であり、及び／又は十分には存在しないことを示唆する。
いくつかの実施形態において、活性化可能抗体は、治療剤が結合される活性化可能抗体である。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体は、剤に結合されな。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体は、検出可能標識を含む。いくつかの実施形態において、検出可能標識は、ＡＢ上に位置する。いくつかの実施形態において、対象又はサンプルにおける活性化可能抗体のレベルの測定は、活性化された抗体に対して特異的に結合する二次試薬を用いて達成され、ここで前記試薬は検出可能標識を含む。いくつかの実施形態において、前記二次試薬は、検出可能標識を含む抗体である。
それらの方法及びキットのいくつかの実施形態において、活性化可能抗体は、検出可能標識を含む。それらの方法及びキットのいくつかの実施形態において、検出可能標識は、イメージング剤、造影剤、酵素、蛍光標識、発色団、色素、１又は２以上の金属イオン、又はリガンド系標識を含む。それらの方法及びキットのいくつかの実施形態において、イメージング剤は、放射性同位体を含む。それらの方法及びキットのいくつかの実施形態において、放射性同位体は、インジウム又はテクネチウムである。それらの方法及びキットのいくつかの実施形態において、造影剤は、ヨウ素、ガドリニウム又は酸化鉄を含む。それらの方法及びキットのいくつかの実施形態において、酵素は、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ又はβ−ガラクトシダーゼを含む。それらの方法及びキットのいくつかの実施形態において、発光標識は、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、修正赤色蛍光タンパク質（ｍＲＦＰ）、赤色蛍光タンパク質tdimer2 (ＲＦＰ tdimer2)、ＨＣＲＥＤ、又はユーロピウム誘導体を包含する。それらの方法及びキットのいくつかの実施形態において、発光標識は、Ｎ−メチルアクリジウム誘導体を含む。それらの方法及びキットのいくつかの実施形態において、標識は、Alexa Fluor（登録商標）標識、例えばAlex Fluor（登録商標）６８０又はAlexa Fluor（登録商標）７５０を包含する。それらの方法及びキットのいくつかの実施形態において、リガンド系標識は、ビオチン、アビジン、ストレプタビジン、又は１又は２以上のハプテンを包含する。
それらの方法及びキットのいくつかの実施形態において、対象は哺乳類である。それらの方法のいくつかの実施形態において、対象はヒトである。それらの方法及びキットのいくつかの実施形態において、対象は非ヒト哺乳類、例えば非ヒト霊長類、愛玩動物（例えば、ネコ、イヌ、ウマ）、家畜、作業動物又は動物園の動物である。いくつかの実施形態において、対象は齧歯動物である。
それらの方法及びキットのいくつかの実施形態において、前記方法は、インビボ方法である。それらの方法のいくつかの実施形態において、前記方法は、現場方法である。それらの方法のいくつかの実施形態において、前記方法は、エクスビボ方法である。それらの方法のいくつかの実施形態において、前記方法は、インビトロ方法である。
本開示はまた、（ｉ）対象又は生物学的サンプルを、切断可能部分（ＣＭ）及びＣＭの切断後に放出又は活性化される検出可能標識を含んでいるプローブと接触させ；そして、（ｉｉ）対象又は生物学的サンプル中の検出可能標識のレベルを計測することによる、対象又はサンプル内の切断剤の有無を検出する方法を提供する。斯かる放出又は活性化が標識の検出を増強する（例えば、検出可能シグナルを刺激する）とき、対象又は生物学的サンプル中の検出可能標識の検出可能レベルは、切断剤が対象又は生物学的サンプル中に存在することを示し、そして、ここで、対象又は生物学的サンプル中の検出可能標識の検出可能レベルの低下は、対象又は生物学的サンプル中に切断剤が存在していない、及び／又は検出可能レベルにて対象又は生物学的サンプル中に存在しておらず、その結果、斯かるＣＭのプロテアーゼ切断が検出できないことを示す。斯かる放出又は活性化が標識の検出を削減する場合、対象又は生物学的サンプル中の検出可能標識の検出可能レベルは、検出可能レベルにて対象又は生物学的サンプル中に切断剤が存在していないか又は十分に存在していないことを示し、その結果、ＣＭのプロテアーゼ切断が対象又は生物学的サンプル中で検出されることはできず、そしてここで、対象又は生物学的サンプル中の検出可能標識の削減された検出可能レベルは、切断剤が対象又は生物学的サンプル中に存在することを示す。
それらの方法及びキットのいくつかの実施形態において、ＣＭ含有プローブは、検出可能標識を含む。それらの方法及びキットのいくつかの実施形態において、検出可能標識は、イメージング剤、造影剤、酵素、蛍光標識、発色団、色素、１又は２以上の金属イオン、又はリガンド系標識を含む。それらの方法及びキットのいくつかの実施形態において、イメージング剤は、放射性同位体を含む。それらの方法及びキットのいくつかの実施形態において、放射性同位体は、インジウム又はテクネチウムである。それらの方法及びキットのいくつかの実施形態において、造影剤は、ヨウ素、ガドリニウム又は酸化鉄を含む。それらの方法及びキットのいくつかの実施形態において、酵素は、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ又はβ−ガラクトシダーゼを含む。それらの方法及びキットのいくつかの実施形態において、発光標識は、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、修正赤色蛍光タンパク質（ｍＲＦＰ）、赤色蛍光タンパク質tdimer2 (ＲＦＰ tdimer2)、ＨＣＲＥＤ、又はユーロピウム誘導体を包含する。それらの方法及びキットのいくつかの実施形態において、発光標識は、Ｎ−メチルアクリジウム誘導体を含む。それらの方法及びキットのいくつかの実施形態において、標識は、Alexa Fluor（登録商標）標識、例えばAlex Fluor（登録商標）６８０又はAlexa Fluor（登録商標）７５０を包含する。それらの方法及びキットのいくつかの実施形態において、リガンド系標識は、ビオチン、アビジン、ストレプタビジン、又は１又は２以上のハプテンを包含する。
それらの方法のいくつかの実施形態において、前記方法は、インビボ方法である。それらの方法のいくつかの実施形態において、前記方法は、現場方法である。それらの方法のいくつかの実施形態において、前記方法は、エクスビボ方法である。それらの方法のいくつかの実施形態において、前記方法は、インビトロ方法である。
それらの方法及びキットのいくつかの実施形態において、前記方法は、本開示の活性化可能抗体による治療と、それに続くその活性化可能抗体及び／又は複合活性化可能抗体をそれを必要としている対象に投与することによる治療のために適切な患者集団を同定するか、そうでなければ、細分するために使用される。例えば、標的、及びそれらの方法において試験される活性化可能抗体の切断可能部分（ＣＭ）において基質を切断するマトリプターゼ及びｕＰＡから選択される少なくとも１つのプロテアーゼの両者について検査陽性である患者は、斯かるＣＭを含む斯かる活性化可能抗体による治療のための適切な候補として同定され、その後、該患者には、治療上有効な量の試験される活性化可能抗体及び／又は複合活性化可能抗体が投与される。同様に、標的、及びそれらの方法を用いて試験される活性化可能抗体中のＣＭにおける基質を切断するプロテアーゼ、すなわち、マトリプターゼ及び／又はｕＰＡのいずれか又は両者について検査陰性である患者は、別の治療形のための適切な候補として同定されるであろう（すなわち、試験される活性化可能抗体による治療のために適切でない）。いくつかの実施形態において、斯かる患者は、治療のための適切な活性化可能抗体が同定されるまで、他の活性化可能抗体により検査され得る。いくつかの実施形態において、患者にはその後、該患者が検査で陽性であった活性化可能抗体及び／又は複合活性化可能抗体の治療上有効な量が投与される。
本開示はまた、本明細書中に提示したマトリプターゼ切断可能基質配列及び／又は本明細書中に提示したｕＰＡ切断可能基質配列の１若しくは複数を含んでいるポリペプチド及び他の大型分子を提供する。制限されることのない例によると、本明細書中に提示したマトリプターゼ切断可能基質配列及び／又は本明細書中に提示したｕＰＡ切断可能基質配列は、プロドラッグ組成物及びその使用方法に有効である。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは小分子などの薬剤に連結されたＣＭを含む。薬剤の例は当該技術分野で周知である。これらの本明細書中に提示したマトリプターゼ切断可能基質配列及び／又は本明細書中に提示したｕＰＡ切断可能基質配列は、プローブ及び他の検出可能な剤、並びにその使用方法に有効である。例えば、本明細書中に提示したマトリプターゼ切断可能基質配列及び／又は本明細書中に提示したｕＰＡ切断可能基質配列は、イメージング剤及び／又は他の診断薬などの検出可能な剤を生じさせるために蛍石や他のクエンチャーと結合状態で使用される。当業者は、本明細書中に提示したマトリプターゼ切断可能基質配列及び／又は本明細書中に提示したｕＰＡ切断可能基質配列がマトリプターゼ及び／又はｕＰＡによって切断可能基質を使用する技術分野における任意の組成物及び／又は方法に有効であることを理解する。
いくつかの実施形態において、本開示のマトリプターゼ及び／又はｕＰＡ基質は、大型分子、例えば、（ｉ）ＣＭに対してアミノ（Ｎ）末端側に位置する、すなわち、大型分子内にて、ＣＭよりも大型分子のＮ末端の近くに位置している、少なくとも１つの部分（ＭＮ）；（ｉｉ）ＣＭに対してカルボキシル（Ｃ）末端側に位置する、すなわち、大型分子内にて、ＣＭよりも大型分子のＣ末端の近くに位置している少なくとも１つの部分（ＭＣ）；（ｉｉｉ）その組み合わせ、から成る群から選択される少なくとも１つの追加部分（Ｍ）を含む単離されたポリペプチドに使用される。いくつかの実施形態において、大型分子は、少なくとも１つのＭＮ及び少なくとも１つのＭＣを含んでいる。
制限されることのない例によると、本開示の大型分子における使用のための好適なＭＮは、次の：マスキング部分、抗体、タンパク質、治療薬、抗悪性腫瘍薬、毒性剤、薬剤、検出可能部分、診断剤、親和性タグ、及びその組み合わせ、のうちの少なくとも１つを含む。
制限されることのない例によると、本開示の大型分子における使用のための好適なＭＣは、次の：マスキング部分、抗体、タンパク質、治療薬、抗悪性腫瘍薬、毒性剤、薬剤、検出可能部分、診断剤、親和性タグ、及びその組み合わせ、のうちの少なくとも１つを含む。
本開示による医薬組成物は本開示の抗体及び担体を含むことができる。これらの医薬組成物は、例えば、診断キットなどのキットに含まれ得る。
図１は、マトリプターゼ‐１によるプールＳＭＰ３０の切断を示す一連のグラフである。 図２は、マトリプターゼ‐１によるプールＳＭＰ１７の切断及びｔＰＡによる切断に対する抵抗性を示す一連のグラフである。 図３は、マトリプターゼ‐１による基質配列ＶＡＧＲＳＭＲＰ（配列番号２５１）の切断を示す一連のグラフである。 図４Ａは、本明細書中に提供した実施例において使用されるペプチドディスプレイプラットフォームの一連の略図である。図４Ａは「ディスプレイプラットフォームＣＹＴＸ ＤＰ ＸＸＸＸＸＸＸＸ」又は「ＣＹＴＸ ＤＰ ＸＸＸＸＸＸＸＸ」（配列番号６９４）と本明細書中で呼ばれるディスプレイプラットフォーム配列の略図である。図４Ｂは「ディスプレイプラットフォームＳＰ‐ＣＹＴＸ ＤＰ ＸＸＸＸＸＸＸＸ」又は「ＳＰ‐ＣＹＴＸ ＤＰ ＸＸＸＸＸＸＸＸ」（配列番号６９５）と本明細書中で呼ばれるディスプレイプラットフォーム配列の略図であり、ここで、ＳＰ‐ＣＹＴＸ ＤＰ ＸＸＸＸＸＸＸＸは、シグナルペプチドを伴うＣＹＴＸ ＤＰ ＸＸＸＸＸＸＸＸプラットフォームである。 図４Ｂは、本明細書中に提供した実施例において使用されるペプチドディスプレイプラットフォームの一連の略図である。図４Ｂは「ディスプレイプラットフォームＳＰ‐ＣＹＴＸ ＤＰ ＸＸＸＸＸＸＸＸ」又は「ＳＰ‐ＣＹＴＸ ＤＰ ＸＸＸＸＸＸＸＸ」（配列番号６９５）と本明細書中で呼ばれるディスプレイプラットフォーム配列の略図であり、ここで、ＳＰ‐ＣＹＴＸ ＤＰ ＸＸＸＸＸＸＸＸは、シグナルペプチドを伴うＣＹＴＸ ＤＰ ＸＸＸＸＸＸＸＸプラットフォームである。
発明の詳細な説明
本開示は、マトリプターゼ及びｕ‐プラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）から選択される少なくとも１つのプロテアーゼのための基質である切断可能部分（ＣＭ）を含んでいるアミノ酸配列を提供する。これらのＣＭは、さまざまな治療的、診断的、及び予防的適応において有用である。
本開示は、これらのマトリプターゼ切断可能基質及び／又はｕＰＡ切断可能基質の１若しくは複数を含んでいる抗体を提供する。例えば、これらのマトリプターゼ切断可能基質、及び／又はｕＰＡ切断可能基質は、抗体を１若しくは複数の追加の剤に結合して複合抗体を製造するときに有用である。これらのマトリプターゼ切断可能基質及び／又はｕＰＡ切断可能基質は、活性化可能抗体構築物において有用である。
複合抗体は、標的に特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメントを含んでおり、活性化可能抗体は、標的に特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ）を含んでいる。抗体又はその抗原結合フラグメントの標的の代表的なクラスとしては、これだけに限定されるものではないが、細胞表面受容体及び分泌される結合タンパク質（例えば、成長因子）、可溶性酵素、構造タンパク質（例えば、コラーゲン、フィブロネクチン）などが挙げられる。いくつかの実施形態において、複合抗体及び／又は活性化可能抗体は、細胞外標的、通常、細胞外タンパク質標的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメントを有する。いくつかの実施形態において、複合抗体及び／又は活性化可能抗体は、細胞取り込み向けに設計され、そして、細胞内部で切り替え可能である。
制限されることのない例として、抗体又は抗原結合フラグメント及び／又は活性化可能抗体のＡＢは、表１で列挙した任意の標的の結合パートナーである。
Figure 2017509594
Figure 2017509594
制限されることのない例として、抗体又は抗原結合フラグメント及び／又は活性化可能抗体のＡＢは、表２で列挙した抗体であるか、又はそれに由来する。
Figure 2017509594
Figure 2017509594
本開示の代表的な複合抗体及び／又は活性化可能抗体は、例えば、インターロイキンー６受容体（ＩＬ‐６Ｒ）に結合する、並びにインターロイキン６受容体（ＩＬ‐６Ｒ）と結合する本明細書中で「Ａｖ１」抗体と呼ばれる抗体であるか若しくはそれに由来する重鎖及び軽鎖を含んでいる抗体を含む。Ａｖ１重鎖及びＡｖ１軽鎖のアミノ酸配列はそれぞれ配列番号５４及び配列番号５５において以下に示されている。
Ａｖ１抗体重鎖アミノ酸配列：
QVQLQESGPGLVRPSQTLSLTCTVSGYSITSDHAWSWVRQPPGRGLEWIGYISYSGITTYNPSLKSRVTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARSLARTTAMDYWGQGSLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK （配列番号４４７）
Ａｖ１抗体軽鎖アミノ酸配列：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQGNTLPYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC （配列番号４４８）
本開示の代表的な複合抗体及び／又は活性化可能抗体は、例えば、インターロイキン６受容体（ＩＬ‐６Ｒ）に結合する、並びにＡｖ１抗体及びマスキング部分であるか若しくはそれに由来する重鎖及び軽鎖を含んでいる抗体を含む。本開示の代表的な複合抗体及び／又は活性化可能抗体は、ＡＶ１軽鎖のＮ末端に結合されたアミノ酸配列を含んでいる。これらのＮ末端アミノ酸配列としては、例えばYGSCSWNYVHIFMDC（配列番号４４９）；QGDFDIPFPAHWVPIT（配列番号４５０）；MGVPAGCVWNYAHIFMDC（配列番号４５１）；QGQSGQYGSCSWNYVHIFMDC（配列番号４５２）；QGQSGQGDFDIPFPAHWVPIT（配列番号４５３）；又はQGQSGQMGVPAGCVWNYAHIFMDC（配列番号４５４）が挙げられる。斯かるアミノ酸配列がＡＶ１重鎖のＮ末端、又はＡＶ１重鎖若しくは軽鎖のＣ末端に取り付けられることもまた理解されるべきである。
本開示の代表的な活性化可能抗体は、例えば、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）に結合する、並びにそのそれぞれがＥＧＦＲに結合する本明細書中で「ｃ２２５ｖ５」と呼ばれる抗体、本明細書中で「ｃ２２５ｖ４」と呼ばれる抗体及び本明細書中で「ｃ２２５ｖ６」と呼ばれる抗体から成る群から選択される抗体であるか若しくはそれに由来する重鎖及び軽鎖を含んでいる抗体を含む。ｃ２２５ｖ５抗体、ｃ２２５ｖ４抗体、及びｃ２２５ｖ６抗体は、本明細書中で「ｃ２２５軽鎖」と呼ばれる同じ軽鎖配列を共有する。ｃ２２５ｖ５重鎖、ｃ２２５ｖ４抗体、ｃ２２５ｖ６抗体、及びｃ２２５軽鎖のアミノ酸配列は以下に示されている。
Ｃ２２５ｖ５抗体重鎖アミノ酸配列：
QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTNYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGNTDYNTPFTSRLSINKDNSKSQVFFKMNSLQSQDTAIYYCARALTYYDYEFAYWGQGTLVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK* （配列番号４５５）
Ｃ２２５ｖ４抗体重鎖アミノ酸配列：
QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTNYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGNTDYNTPFTSRLSINKDNSKSQVFFKMNSLQSNDTAIYYCARALTYYDYEFAYWGQGTLVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK* （配列番号４５６）
Ｃ２２５ｖ６抗体重鎖アミノ酸配列：
QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTNYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGNTDYNTPFTSRLSINKDNSKSQVFFKMNSLQSQDTAIYYCARALTYYDYEFAYWGQGTLVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK* （配列番号４５７）
Ｃ２２５抗体軽鎖アミノ酸配列：
QILLTQSPVILSVSPGERVSFSCRASQSIGTNIHWYQQRTNGSPRLLIKYASESISGIPSRFSGSGSGTDFTLSINSVESEDIADYYCQQNNNWPTTFGAGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC* （配列番号４５８）
本開示の代表的な活性化可能抗体は、例えば、ＥＧＦＲに結合し、ｃ２２５ｖ５抗体であるか若しくはそれに由来する重鎖及び軽鎖を含み、そして、マスキング部分、第１連結ペプチド、切断可能部分、及び第２の連結ペプチドを含んでいる抗体を含む。いくつかの実施形態において、重鎖及び／又は軽鎖はシグナルペプチドを含んでいる。シグナルペプチドのないｃ２２５ｖ５の重鎖及び軽鎖アミノ酸配列は、配列番号４５５（シグナルペプチドのない重鎖）及び配列番号４５８（シグナルペプチドのない軽鎖）において先に示している。いくつかの実施形態において、活性化可能な抗ＥＧＦＲ抗体は、配列番号４５５、配列番号４５８に示したアミノ酸配列、及び／又は以下に示した核酸及びアミノ酸配列の組み合わせを含む：
シグナルペプチドを有するＣ２２５ｖ５抗体重鎖核酸配列：
ATGTACAGGATGCAACTCCTGTCTTGCATTGCACTAAGTCTTGCACTTGTCACGAATTCGCAGGTGCAGCTGAAACAGAGCGGCCCGGGCCTGGTGCAGCCGAGCCAGAGCCTGAGCATTACCTGCACCGTGAGCGGCTTTAGCCTGACCAACTATGGCGTGCATTGGGTGCGCCAGAGCCCGGGCAAAGGCCTGGAATGGCTGGGCGTGATTTGGAGCGGCGGCAACACCGATTATAACACCCCGTTTACCAGCCGCCTGAGCATTAACAAAGATAACAGCAAAAGCCAGGTGTTTTTTAAAATGAACAGCCTGCAAAGCCAGGATACCGCGATTTATTATTGCGCGCGCGCGCTGACCTATTATGATTATGAATTTGCGTATTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCGCGGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA （配列番号６８４）
下線部：シグナルペプチド
シグナルペプチドを有するＣ２２５ｖ５抗体重鎖アミノ酸配列：
MYRMQLLSCIALSLALVTNSQVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTNYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGNTDYNTPFTSRLSINKDNSKSQVFFKMNSLQSQDTAIYYCARALTYYDYEFAYWGQGTLVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK* （配列番号６８５）
下線部：シグナルペプチド
シグナルペプチドを有する３９５４‐２７８７‐ｃ２２５軽鎖核酸配列：
ATGTACAGGATGCAACTCCTGTCTTGCATTGCACTAAGTCTTGCACTTGTCACGAATTCGCAAGGCCAGTCTGGCCAGTGCATCTCACCTCGTGGTTGTCCGGACGGCCCATACGTCATGTACGGCTCGAGCGGTGGCAGCGGTGGCTCTGGTGGATCCGGTACCTCCACCTCCGGCCGTTCCGCGAACCCGCGTGGTGGCAGTAGCGGTACCCAGATCTTGCTGACCCAGAGCCCGGTGATTCTGAGCGTGAGCCCGGGCGAACGTGTGAGCTTTAGCTGCCGCGCGAGCCAGAGCATTGGCACCAACATTCATTGGTATCAGCAGCGCACCAACGGCAGCCCGCGCCTGCTGATTAAATATGCGAGCGAAAGCATTAGCGGCATTCCGAGCCGCTTTAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGATTTTACCCTGAGCATTAACAGCGTGGAAAGCGAAGATATTGCGGATTATTATTGCCAGCAGAACAACAACTGGCCGACCACCTTTGGCGCGGGCACCAAACTGGAACTGAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG （配列番号６８６）
下線部：シグナルペプチド
シグナルペプチドを有する３９５４‐２７８７‐ｃ２２５軽鎖アミノ酸配列：
MYRMQLLSCIALSLALVTNSQGQSGQCISPRGCPDGPYVMYGSSGGSGGSGGSGTSTSGRSANPRGGSSGTQILLTQSPVILSVSPGERVSFSCRASQSIGTNIHWYQQRTNGSPRLLIKYASESISGIPSRFSGSGSGTDFTLSINSVESEDIADYYCQQNNNWPTTFGAGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC* （配列番号６８７）
下線部：シグナルペプチド
３９５４‐２７８７‐ｃ２２５軽鎖核酸配列（シグナルペプチドなし）：
CAAGGCCAGTCTGGCCAGTGCATCTCACCTCGTGGTTGTCCGGACGGCCCATACGTCATGTACGGCTCGAGCGGTGGCAGCGGTGGCTCTGGTGGATCCGGTACCTCCACCTCCGGCCGTTCCGCGAACCCGCGTGGTGGCAGTAGCGGTACCCAGATCTTGCTGACCCAGAGCCCGGTGATTCTGAGCGTGAGCCCGGGCGAACGTGTGAGCTTTAGCTGCCGCGCGAGCCAGAGCATTGGCACCAACATTCATTGGTATCAGCAGCGCACCAACGGCAGCCCGCGCCTGCTGATTAAATATGCGAGCGAAAGCATTAGCGGCATTCCGAGCCGCTTTAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGATTTTACCCTGAGCATTAACAGCGTGGAAAGCGAAGATATTGCGGATTATTATTGCCAGCAGAACAACAACTGGCCGACCACCTTTGGCGCGGGCACCAAACTGGAACTGAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG （配列番号６８８）
３９５４‐２７８７‐ｃ２２５軽鎖アミノ酸配列（シグナルペプチドなし）：
QGQSGQCISPRGCPDGPYVMYGSSGGSGGSGGSGTSTSGRSANPRGGSSGTQILLTQSPVILSVSPGERVSFSCRASQSIGTNIHWYQQRTNGSPRLLIKYASESISGIPSRFSGSGSGTDFTLSINSVESEDIADYYCQQNNNWPTTFGAGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC* （配列番号６８９）
本開示の代表的な複合抗体及び／又は活性化可能抗体は、例えば、Ｊａｇｇｅｄ標的、Ｊａｇｇｅｄ‐１、Ｊａｇｇｅｄ‐２、及び／又はＪａｇｇｅｄ‐１及びＪａｇｇｅｄ‐２の両方に結合する抗体、並びに以下に示した可変重鎖及び可変軽鎖配列であるか若しくはそれに由来する可変重鎖領域及び可変軽鎖領域の組み合わせを含んでいる抗体を含む。
可変軽鎖アミノ配列Ｌｃ４
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSVVAPLTFGQGTKVEIKR （配列番号４５９）
可変重鎖アミノ配列Ｈｃ４
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSIEQMGWQTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDIGGRSAFDYWGQGTLVTVSS （配列番号４６０）
可変軽鎖アミノ配列Ｌｃ５
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSVVAPLTFGQGTKVEIKR （配列番号４６１）
可変重鎖アミノ配列Ｈｃ５
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSIEQMGWQTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSPPYHGQFDYWGQGTLVTVSS （配列番号４６２）
可変軽鎖アミノ配列Ｌｃ７
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSVVAPLTFGQGTKVEIKR （配列番号４６３）
可変重鎖アミノ配列Ｈｃ７
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSIEQMGWQTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSPPFFGQFDYWGQGTLVTVSS （配列番号４６４）
可変軽鎖アミノ配列Ｌｃ８
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSVVAPLTFGQGTKVEIKR （配列番号４６５）
可変重鎖アミノ配列Ｈｃ８
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSIEQMGWQTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKHIGRTNPFDYWGQGTLVTVSS （配列番号４６６）
可変軽鎖アミノ配列Ｌｃ１３
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSVVAPLTFGQGTKVEIKR （配列番号４６７）
可変重鎖アミノ配列Ｈｃ１３
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSIEQMGWQTEYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSAAAFDYWGQGTLVTVSS （配列番号４６８）
可変軽鎖アミノ配列Ｌｃ１６
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSVVAPLTFGQGTKVEIKR （配列番号４６９）
可変重鎖アミノ配列Ｈｃ１６
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSIEQMGWQTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSPPYYGQFDYWGQGTLVTVSS （配列番号４７０）
可変軽鎖アミノ配列Ｌｃ１９
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSVVAPLTFGQGTKVEIKR （配列番号４７１）
可変重鎖アミノ配列Ｈｃ１９
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSIEQMGWQTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSPPFFGQFDYWGQGTLVTVSS （配列番号４７２）
可変軽鎖アミノ配列Ｌｃ２１
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSVVAPLTFGQGTKVEIKR （配列番号４７３）
可変重鎖アミノ配列Ｈｃ２１
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSIEQMGWQTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDIGGRSAFDYWGQGTLVTVSS （配列番号４７４）
可変軽鎖アミノ配列Ｌｃ２４
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSVVAPLTFGQGTKVEIKR （配列番号４７５）
可変重鎖アミノ配列Ｈｃ２４
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSIEEMGWQTLYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSAAAFDYWGQGTLVTVSS （配列番号４７６）
可変軽鎖アミノ配列Ｌｃ２６
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSVVAPLTFGQGTKVEIKR （配列番号４７７）
可変重鎖アミノ配列Ｈｃ２６
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSIEQMGWQTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDIGGRSAFDYWGQGTLVTVSS （配列番号４７８）
可変軽鎖アミノ配列Ｌｃ２７
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSVVAPLTFGQGTKVEIKR （配列番号４７９）
可変重鎖アミノ配列Ｈｃ２７
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSIEQMGWQTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSPPFYGQFDYWGQGTLVTVSS （配列番号４８０）
可変軽鎖アミノ配列Ｌｃ２８
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSVVAPLTFGQGTKVEIKR （配列番号４８１）
可変重鎖アミノ配列Ｈｃ２８
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSIEQMGWQTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSPPFFGQFDYWGQGTLVTVSS （配列番号４８２）
可変軽鎖アミノ配列Ｌｃ３０
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSVVAPLTFGQGTKVEIKR （配列番号４８３）
可変重鎖アミノ配列Ｈｃ３０
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSIEEMGWQTLYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYAKSAAAFDYWGQGTLVTVSS （配列番号４８４）
可変軽鎖アミノ配列Ｌｃ３１
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSVVAPLTFGQGTKVEIKR （配列番号４８５）
可変重鎖アミノ配列Ｈｃ３１
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSIEQMGWQTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDIGGRSAFDYWGQGTLVTVSS （配列番号４８６）
可変軽鎖アミノ配列Ｌｃ３２
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSVVAPLTFGQGTKVEIKR （配列番号４８７）
可変重鎖アミノ配列Ｈｃ３２
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSIDPEGWQTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSAAAFDYWGQGTLVTVSS （配列番号４８８）
可変軽鎖アミノ配列Ｌｃ３７
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSVVAPLTFGQGTKVEIKR （配列番号４８９）
可変重鎖アミノ配列Ｈｃ３７
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSIEQMGWQTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSPPHNGQFDYWGQGTLVTVSS （配列番号４９０）
可変軽鎖アミノ配列Ｌｃ３９
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSVVAPLTFGQGTKVEIKR （配列番号４９１）
可変重鎖アミノ配列Ｈｃ３９
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSIEQMGWQTEYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSAAAFDYWGQGTLVTVSS （配列番号４９２）
可変軽鎖アミノ配列Ｌｃ４０
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSVVAPLTFGQGTKVEIKR （配列番号４９３）
重鎖アミノ配列Ｈｃ４０
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSIEQMGWQTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSPPFFGQFDYWGQGTLVTVSS （配列番号４９４）
可変軽鎖アミノ配列Ｌｃ４７
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSVVAPLTFGQGTKVEIKR （配列番号４９５）
可変重鎖アミノ配列Ｈｃ４７
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSIDEMGWQTEYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSAAAFDYWGQGTLVTVSS （配列番号４９６）
可変４Ｂ２軽鎖
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTLDAPPQFGQGTKVEIKR （配列番号４９７）
可変４Ｂ２重鎖
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSIEQMGWQTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDIGGRSAFDYWGQGTLVTVSS （配列番号４９８）
可変４Ｄ１１軽鎖
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTVVAPPLFGQGTKVEIKR （配列番号４９９）
可変４Ｄ１１重鎖
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSIDPEGRQTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDIGGRSAFDYWGQGTLVTVSS （配列番号５００）
可変４Ｅ７軽鎖
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSLVAPLTFGQGTKVEIKR （配列番号５０１）
可変４Ｅ７重鎖
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSIEEMGWQTKYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSAAAFDYWGQGTLVTVSS （配列番号５０２）
可変４Ｅ１１軽鎖
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQALDAPLMFGQGTKVEIKR （配列番号５０３）
可変４Ｅ１１重鎖
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSIEPMGQLTEYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDIGGRSAFDYWGQGTLVTVSS （配列番号５０４）
可変６Ｂ７軽鎖
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQALVAPLTFGQGTKVEIKR （配列番号５０５）
可変６Ｂ７重鎖
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSIDEMGWQTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSAAAFDYWGQGTLVTVSS （配列番号５０６）
可変６Ｆ８軽鎖
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQALVAPLTFGQGTKVEIKR （配列番号５０７）
可変６Ｆ８重鎖
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSIDEMGWQTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSAAAFDYWGQGTLVTVSS （配列番号５０８）
本開示の代表的な複合抗体及び／又は活性化可能抗体は、例えば、Ｊａｇｇｅｄ標的、Ｊａｇｇｅｄ‐１、Ｊａｇｇｅｄ‐２、及び／又はＪａｇｇｅｄ‐１及びＪａｇｇｅｄ‐２の両方に結合する抗体、並びに以下に示した重鎖及び軽鎖配列であるか若しくはそれらに由来する重鎖領域と軽鎖領域の組み合わせを含んでいる抗体を含む。
４Ｄ１１軽鎖配列：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTVVAPPLFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC （配列番号５０９）
４Ｄ１１重鎖配列：
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSIDPEGRQTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDIGGRSAFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK （配列番号５１０）
４Ｄ１１ｖ２重鎖配列
EVHLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSIDPEGRQTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDIGGRSAFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK （配列番号５１１）
４Ｄ１１ｖ２軽鎖配列
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTVVAPPLFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLXKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC （配列番号５１２）
本明細書中に提供した活性化可能抗体は、標的、例えばヒト標的に特異的に結合する、抗体又はその抗体フラグメント（本開示を通じてＡＢとしてまとめて言及される）を少なくとも含み、ここで、ＡＢはマスキング部分（ＭＭ）によって修飾される。
いくつかの実施形態において、マスキング部分は、特異的抗体又は抗体フラグメントと共に使用するために選択される。例えば、ＥＧＦＲに結合する抗体と共に使用するのに好適なマスキング部分としては、配列CISPRG（配列番号５１３）を含むＭＭが挙げられる。制限されることのない例として、ＭＭは、ＣＩＳＰＲＧＣ（配列番号６９０）、ＣＩＳＰＲＧＣＧ（配列番号５１４）、ＣＩＳＰＲＧＣＰＤＧＰＹＶＭＹ（配列番号５１５）、ＣＩＳＰＲＧＣＰＤＧＰＹＶＭ（配列番号５１６）、ＣＩＳＰＲＧＣＥＰＧＴＹＶＰＴ（配列番号５１７）、及びＣＩＳＰＲＧＣＰＧＱＩＷＨＰＰ（配列番号５１８）などの配列を含み得る。他の好適なマスキング部分としては、制限されることのない例によれば、GSHCLIPINMGAPSC（配列番号５１９）；CISPRGCGGSSASQSGQGSHCLIPINMGAPSC（配列番号５２０）；CNHHYFYTCGCISPRGCPG（配列番号５２１）；ADHVFWGSYGCISPRGCPG（配列番号５２２）；CHHVYWGHCGCISPRGCPG（配列番号５２３）；CPHFTTTSCGCISPRGCPG（配列番号５２４）；CNHHYHYYCGCISPRGCPG（配列番号５２５）；CPHVSFGSCGCISPRGCPG（配列番号５２６）；CPYYTLSYCGCISPRGCPG（配列番号５２７）；CNHVYFGTCGCISPRGCPG（配列番号５２８）；CNHFTLTTCGCISPRGCPG（配列番号５２９）；CHHFTLTTCGCISPRGCPG（配列番号５３０）；YNPCATPMCCISPRGCPG（配列番号５３１）；CNHHYFYTCGCISPRGCG（配列番号５３２）；CNHHYHYYCGCISPRGCG（配列番号５３３）；CNHVYFGTCGCISPRGCG（配列番号５３４）；CHHVYWGHCGCISPRGCG（配列番号５３５）；CPHFTTTSCGCISPRGCG（配列番号５３６）；CNHFTLTTCGCISPRGCG（配列番号５３７）；CHHFTLTTCGCISPRGCG（配列番号５３８）；CPYYTLSYCGCISPRGCG（配列番号５３９）；CPHVSFGSCGCISPRGCG（配列番号５４０）；ADHVFWGSYGCISPRGCG（配列番号５４１）；YNPCATPMCCISPRGCG（配列番号５４２）；CHHVYWGHCGCISPRGCG（配列番号５４３）；C（N／P）H（H／V／F）（Y／T）（F／W／T／L）（Y／G／T／S）（T／S／Y／H）CGCISPRGCG（配列番号５４４）；CISPRGCGQPIPSVK（配列番号５４５）；CISPRGCTQPYHVSR（配列番号５４６）；及び／又はCISPRGCNAVSGLGS（配列番号５４７）などのＰＣＴ出願公開ＷＯ２０１０／０８１１７３で開示されたＥＧＦＲ特異的なマスクのいずれかが挙げられる。
Ｊａｇｇｅｄ標的（例えば、Ｊａｇｇｅｄ１及び／又はＪａｇｇｅｄ２）に結合する抗体と共に使用するのに好適なマスキング部分としては、制限されることのない例としてQGQSGQCNIWLVGGDCRGWQG（配列番号６９１）；QGQSGQGQQQWCNIWINGGDCRGWNG（配列番号５４８）；PWCMQRQDFLRCPQP（配列番号５４９）；QLGLPAYMCTFECLR（配列番号５５０）；CNLWVSGGDCGGLQG（配列番号５５１）；SCSLWTSGSCLPHSP（配列番号５５２）；YCLQLPHYMQAMCGR（配列番号５５３）；CFLYSCTDVSYWNNT（配列番号５５４）；PWCMQRQDYLRCPQP（配列番号５５５）；CNLWISGGDCRGLAG（配列番号５５６）；CNLWVSGGDCRGVQG（配列番号５５７）；CNLWVSGGDCRGLRG（配列番号５５８）；CNLWISGGDCRGLPG（配列番号５５９）；CNLWVSGGDCRDAPW（配列番号５６０）；CNLWVSGGDCRDLLG（配列番号５６１）；CNLWVSGGDCRGLQG（配列番号５６２）；CNLWLHGGDCRGWQG（配列番号５６３）；CNIWLVGGDCRGWQG（配列番号５６４）；CTTWFCGGDCGVMRG（配列番号５６５）；CNIWGPSVDCGALLG（配列番号５６６）；CNIWVNGGDCRSFEG（配列番号５６７）；YCLNLPRYMQDMCWA（配列番号５６８）；YCLALPHYMQADCAR（配列番号５６９）；CFLYSCGDVSYWGSA（配列番号５７０）；CYLYSCTDSAFWNNR（配列番号５７１）；CYLYSCNDVSYWSNT（配列番号５７２）；CFLYSCTDVSYW（配列番号５７３）；CFLYSCTDVAYWNSA（配列番号５７４）；CFLYSCTDVSYWGDT（配列番号５７５）；CFLYSCTDVSYWGNS（配列番号５７６）；CFLYSCTDVAYWNNT（配列番号５７７）；CFLYSCGDVSYWGNPGLS（配列番号５７８）；CFLYSCTDVAYWSGL（配列番号５７９）；CYLYSCTDGSYWNST（配列番号５８０）；CFLYSCSDVSYWGNI（配列番号５８１）；CFLYSCTDVAYW（配列番号５８２）；CFLYSCTDVSYWGST（配列番号５８３）；CFLYSCTDVAYWGDT（配列番号５８４）；GCNIWLNGGDCRGWVDPLQG（配列番号５８５）；GCNIWLVGGDCRGWIGDTNG（配列番号５８６）；GCNIWLVGGDCRGWIEDSNG（配列番号５８７）；GCNIWANGGDCRGWIDNIDG（配列番号５８８）；GCNIWLVGGDCRGWLGEAVG（配列番号５８９）；GCNIWLVGGDCRGWLEEAVG（配列番号５９０）；GGPALCNIWLNGGDCRGWSG（配列番号５９１）；GAPVFCNIWLNGGDCRGWMG（配列番号５９２）；GQQQWCNIWINGGDCRGWNG（配列番号５９３）；GKSEFCNIWLNGGDCRGWIG（配列番号５９４）；GTPGGCNIWANGGDCRGWEG（配列番号５９５）；GASQYCNLWINGGDCRGWRG（配列番号５９６）；GCNIWLVGGDCRPWVEGG（配列番号５９７）；GCNIWAVGGDCRPFVDGG（配列番号５９８）；GCNIWLNGGDCRAWVDTG（配列番号５９９）；GCNIWIVGGDCRPFINDG（配列番号６００）；GCNIWLNGGDCRPVVFGG（配列番号６０１）；GCNIWLSGGDCRMFMNEG（配列番号６０２）；GCNIWVNGGDCRSFVYSG（配列番号６０３）；GCNIWLNGGDCRGWEASG（配列番号６０４）；GCNIWAHGGDCRGFIEPG（配列番号６０５）；GCNIWLNGGDCRTFVASG（配列番号６０６）；GCNIWAHGGDCRGFIEPG（配列番号６０７）；GFLENCNIWLNGGDCRTG（配列番号６０８）；GIYENCNIWLNGGDCRMG（配列番号６０９）；及び／又はGIPDNCNIWINGGDCRYG（配列番号６１０）などの配列を含むマスキング部分が挙げられる。
インターロイキン６標的、例えば、インターロイキン６受容体（ＩＬ−６Ｒ）に結合する抗体と共に使用するのに好適なマスキング部分としては、制限されることのない例としてQGQSGQYGSCSWNYVHIFMDC（配列番号６１１）；QGQSGQGDFDIPFPAHWVPIT（配列番号６１２）；QGQSGQMGVPAGCVWNYAHIFMDC（配列番号６１３）；YRSCNWNYVSIFLDC（配列番号６１４）；PGAFDIPFPAHWVPNT（配列番号６１５）；ESSCVWNYVHIYMDC（配列番号６１６）；YPGCKWNYDRIFLDC（配列番号６１７）；YRTCSWNYVGIFLDC（配列番号６１８）；YGSCSWNYVHIFMDC（配列番号６１９）；YGSCSWNYVHIFLDC（配列番号６２０）；YGSCNWNYVHIFLDC（配列番号６２１）；YTSCNWNYVHIFMDC（配列番号６２２）；YPGCKWNYDRIFLDC（配列番号６２３）；WRSCNWNYAHIFLDC（配列番号６２４）；WSNCHWNYVHIFLDC（配列番号６２５）；DRSCTWNYVRISYDC（配列番号６２６）；SGSCKWDYVHIFLDC（配列番号６２７）；SRSCIWNYAHIHLDC（配列番号６２８）；SMSCYWQYERIFLDC（配列番号６２９）；YRSCNWNYVSIFLDC（配列番号６３０）；SGSCKWDYVHIFLDC（配列番号６３１）；YKSCHWDYVHIFLDC（配列番号６３２）；YGSCTWNYVHIFMEC（配列番号６３３）；FSSCNWNYVHIFLDC（配列番号６３４）；WRSCNWNYAHIFLDC（配列番号６３５）；YGSCQWNYVHIFLDC（配列番号６３６）；YRSCNWNYVHIFLDC（配列番号６３７）；NMSCHWDYVHIFLDC（配列番号６３８）；FGPCTWNYARISWDC（配列番号６３９）；XXsCXWXYvhIfXdC（配列番号６４０）；MGVPAGCVWNYAHIFMDC（配列番号６４１）；RDTGGQCRWDYVHIFMDC（配列番号６４２）；AGVPAGCTWNYVHIFMEC（配列番号６４３）；VGVPNGCVWNYAHIFMEC（配列番号６４４）；DGGPAGCSWNYVHIFMEC（配列番号６４５）；AVGPAGCWWNYVHIFMEC（配列番号６４６）；CTWNYVHIFMDCGEGEGP（配列番号６４７）；GGVPEGCTWNYAHIFMEC（配列番号６４８）；AEVPAGCWWNYVHIFMEC（配列番号６４９）；AGVPAGCTWNYVHIFMEC（配列番号６５０）；SGASGGCKWNYVHIFMDC（配列番号６５１）；TPGCRWNYVHIFMECEAL（配列番号６５２）；VGVPNGCVWNYAHIFMEC（配列番号６５３）；PGAFDIPFPAHWVPNT（配列番号６５４）；RGACDIPFPAHWIPNT（配列番号６５５）；QGDFDIPFPAHWVPIT（配列番号６５６）；XGafDIPFPAHWvPnT（配列番号６５７）；RGDGNDSDIPFPAHWVPRT（配列番号６５８）；SGVGRDRDIPFPAHWVPRT（配列番号６５９）；WAGGNDCDIPFPAHWIPNT（配列番号６６０）；WGDGMDVDIPFPAHWVPVT（配列番号６６１）；AGSGNDSDIPFPAHWVPRT（配列番号６６２）；ESRSGYADIPFPAHWVPRT（配列番号６６３）；及び／又はRECGRCGDIPFPAHWVPRT（配列番号６６４）などの配列を含むマスキング部分が挙げられる。
ＡＢがＭＭにより修飾され、そして標的の存在下にある場合、ＡＢのその標的物への特異的結合は、ＭＭにより修飾されていないＡＢの特異的結合、又は標的物への親ＡＢの特異的結合に比較して、低められるか、又は阻害される。
標的に対する、ＭＭにより修飾されたＡＢのＫｄは、ＭＭにより修飾されていないＡＢ、又は標的物に対する親ＡＢのＫｄよりも、少なくとも５、１０、２５、５０、１００、２５０、５００、１、０００、２、５００、５、０００、１０、０００、５０、０００、１００、０００、５００、０００、１、０００、０００、５、０００、０００、１０、０００、０００、５０、０００、０００又はそれ以上、又は５〜１０、１０〜１００、１０〜１、０００、１０〜１０、０００、１０〜１００、０００、１０〜１、０００、０００、１０〜１０、０００、０００、１００〜１、０００、１００〜１０、０００、１００〜１００、０００、１００〜１、０００、０００、１００〜１０、０００、０００、１、０００〜１０、０００、１、０００〜１００、０００、1、０００〜１、０００、０００、１０００〜１０、０００、０００、１０、０００〜１００、０００、１０、０００〜１、０００、０００、１０、０００〜１０、０００、０００、１００、０００〜１、０００、０００又は１００、０００〜１０、０００、０００倍、高い。逆に言えば、ＭＭにより修飾されたＡＢの標的に対する結合親和性は、ＭＭにより修飾されていないＡＢ、又は標的物に対する親ＡＢの結合親和性よりも、少なくとも２、３、４、５、１０、２５、５０、１００、２５０、５００、１、０００、２、５００、５、０００、１０、０００、５０、０００、１００、０００、５００、０００、１、０００、０００、５、０００、０００、１０、０００、０００、５０、０００、０００又はそれ以上、又は５〜１０、１０〜１００、１０〜１、０００、１０〜１０、０００、１０〜１００、０００、１０〜１、０００、０００、１０〜１０、０００、０００、１００〜１、０００、１００〜１０、０００、１００〜１００、０００、１００〜１、０００、０００、１００〜１０、０００、０００、１、０００〜１０、０００、１、０００〜１００、０００、1、０００〜１、０００、０００、１０００〜１０、０００、０００、１０、０００〜１００、０００、１０、０００〜１、０００、０００、１０、０００〜１０、０００、０００、１００、０００〜１、０００、０００又は１００、０００〜１０、０００、０００倍、低い。
ＡＢに対するＭＭの解離定数（Ｋｄ）は一般的に、標的に対するＡＢのＫｄよりも大きい。ＡＢに対するＭＭのＫｄは、標的に対するＡＢのＫｄよりも、少なくとも５、１０、２５、５０、１００、２５０、５００、１、０００、２、５００、５、０００、１０、０００、１００、０００、１、０００、０００ 又はさらに １０、０００、０００倍、大きい。逆に言えば、ＡＢに対するＭＭの結合親和性は、一般的に、標的に対するＡＢの結合親和性よりも低い。ＡＢに対するＭＭの結合親和性は、標的に対するＡＢの結合親和性よりも少なくとも５、１０、２５、５０、１００、２５０、５００、１、０００、２、５００、５、０００、１０、０００、１００、０００、１、０００、０００ 又はさらに １０、０００、０００倍、低い。
ＡＢがＭＭにより修飾され、そして標的の存在下にある場合、ＡＢのその標的への特異的結合は、ＭＭにより修飾されていないＡＢの特異的結合、又は標的への親ＡＢの特異的結合に比較して、低められるか、又は阻害される。ＭＭにより修飾されていないＡＢの結合、又は標的への親ＡＢの結合に比較される場合、ＭＭにより修飾される場合の標的を結合するＡＢの能力は、インビボ又はインビトロアッセイにより測定される場合、少なくとも２、４、６、８、１２、２８、２４、３０、３６、４８、６０、７２、８４、又は９６時間、又は５、１０、１５、３０、４５、６０、９０、１２０、１５０、または１８０日間、又は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、又は１２か月間、又はそれ以上の間、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％ 及びさらに１００％、低められ得る。
ＭＭは、標的へのＡＢの結合を阻害する。ＭＭは、ＡＢの抗原結合ドメインを結合し、そして標的へのＡＢの結合を阻害する。ＭＭは、標的へのＡＢの結合を立体的に阻害することができる。ＭＭはＡＢのその標的への結合を、アロステリック的に阻害することができる。それらの実施形態において、ＡＢが修飾され、標的の存在下でＭＭにカップリングされる場合、ＭＭにより修飾されていないＡＢ、親ＡＢ、又はＭＭにカップリングされていないＡＢの標的への結合に比較して、インビボ又はインビトロアッセイで測定される場合、少なくとも２、４、６、８、１２、２８、２４、３０、３６、４８、６０、７２、８４、又は９６時間、又は５、１０、１５、３０、４５、６０、９０、１２０、１５０、または１８０日間、又は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、又は１２か月間、又はそれ以上の間、標的へのＡＢの結合は存在しないか、又は実質的に存在しないか、又はせいぜい０．００１％、０．０１％、０．１％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、又は５０％の標的へのＡＢの結合が存在する。
ＡＢがＭＭにカップリングされるか、又はＭＭにより修飾される場合、ＭＭは、標的へのＡＢの特異的結合を、「マスキングするか」又は低めるか、又は他方では、阻害する。ＡＢがＭＭにカップリングされるか、又はＭＭにより修飾される場合、斯かるカップリング又は修飾は、ＡＢのその標的を特異的に結合する能力を低めるか又は阻害する構造変化をもたらすことができる。
ＭＭにカップリングされるか、又はＭＭにより修飾されるＡＢは、アミノ（Ｎ）末端領域からカルボキシル（Ｃ）末端領域に順に、以下の式で表され得る：
（ＭＭ）-（ＡＢ）
（ＡＢ）-（ＭＭ）
（ＭＭ）‐Ｌ‐（ＡＢ）
（ＡＢ）‐Ｌ‐（ＭＭ）
式中、ＭＭはマスキング部分であり、ＡＢは抗体又は抗体フラグメントであり、そしてＬはリンカーである。多くの実施形態において、柔軟性を提供するために、組成物中に、１又は２以上のリンカー、例えば柔軟リンカー（flexible linker）を挿入することが所望される。
ある実施形態において、ＭＭは、ＡＢの天然の結合パートナーではない。いくつかの実施形態において、ＭＭは、ＡＢの任意の天然結合パートナーに対する相同性を含まないか、又は実質的に含まない。いくつかの実施形態において、ＭＭは、ＡＢの任意の天然の結合パートナーに対して、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、又は８０％以下、類似する。いくつかの実施形態において、ＭＭは、ＡＢの任意の天然の結合パートナーに対して、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、又は８０％以下、同一である。いくつかの実施形態において、ＭＭは、ＡＢの任意の天然の結合パートナーに対して、２５％以下、同一である。いくつかの実施形態において、ＭＭは、ＡＢの任意の天然の結合パートナーに対して、５０％以下、同一である。いくつかの実施形態において、ＭＭは、ＡＢの任意の天然の結合パートナーに対して、２０％以下、同一である。いくつかの実施形態において、ＭＭは、ＡＢの任意の天然の結合パートナーに対して、１０％以下、同一である。
いくつかの実施形態において、活性化可能抗体は、ＭＭにより修飾されるＡＢを含み、そしてまた、１又は２以上の切断可能部分（ＣＭ）も含む。斯かる活性可能抗体は、ＡＢの標的への活性化可能／切り替え可能結合を示す。
活性可能抗体は一般的に、マスキング部分（ＭＭ）及び修飾可能又は切断可能部分（ＣＭ）により修飾されたか又はそれらにカップリングされた、抗体又は抗体フラグメント（ＡＢ）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＭは、マトリプターゼ及びｕＰＡから選択される少なくとも１つのプロテアーゼのための基質として作用するアミノ酸配列を含む。
活性化可能抗体の要素は、ＭＭ及びＣＭが、切断された（又は比較的活性の）状態で、及び標的の存在下で、ＡＢが標的を結合するが、ところが切断されていない（又は比較的不活性の）状態で、標的の存在下で、ＡＢのその標的の特異的結合が低められるか又は阻害されるよう位置決定されるよう配置される。ＡＢのその標的への特異的結合は、ＭＭによりその標的を特異的に結合するＡＢの能力の阻害又はマスキングのために低められ得る。
標的に対する、ＭＭ及びＣＭにより修飾されたＡＢのＫｄは、ＭＭ及びＣＭにより修飾されていないＡＢ、又は標的に対する親ＡＢのＫｄよりも、少なくとも５、１０、２５、５０、１００、２５０、５００、１、０００、２、５００、５、０００、１０、０００、５０、０００、１００、０００、５００、０００、１、０００、０００、５、０００、０００、１０、０００、０００、５０、０００、０００又はそれ以上、又は５〜１０、１０〜１００、１０〜１、０００、１０〜１０、０００、１０〜１００、０００、１０〜１、０００、０００、１０〜１０、０００、０００、１００〜１、０００、１００〜１０、０００、１００〜１００、０００、１００〜１、０００、０００、１００〜１０、０００、０００、１、０００〜１０、０００、１、０００〜１００、０００、1、０００〜１、０００、０００、１０００〜１０、０００、０００、１０、０００〜１００、０００、１０、０００〜１、０００、０００、１０、０００〜１０、０００、０００、１００、０００〜１、０００、０００又は１００、０００〜１０、０００、０００倍、高い。逆に言えば、ＭＭ及びＣＭにより修飾されたＡＢの標的に対する結合親和性は、ＭＭ及びＣＭにより修飾されていないＡＢ、又は標的に対する親ＡＢの結合親和性よりも、少なくとも５、１０、２５、５０、１００、２５０、５００、１、０００、２、５００、５、０００、１０、０００、５０、０００、１００、０００、５００、０００、１、０００、０００、５、０００、０００、１０、０００、０００、５０、０００、０００又はそれ以上、又は５〜１０、１０〜１００、１０〜１、０００、１０〜１０、０００、１０〜１００、０００、１０〜１、０００、０００、１０〜１０、０００、０００、１００〜１、０００、１００〜１０、０００、１００〜１００、０００、１００〜１、０００、０００、１００〜１０、０００、０００、１、０００〜１０、０００、１、０００〜１００、０００、1、０００〜１、０００、０００、１０００〜１０、０００、０００、１０、０００〜１００、０００、１０、０００〜１、０００、０００、１０、０００〜１０、０００、０００、１００、０００〜１、０００、０００又は１００、０００〜１０、０００、０００倍、低い。
ＡＢがＭＭ及びＣＭにより修飾され、そして標的の存在下であるが、しかし修飾剤（例えば、マトリプターゼ及びｕＰＡから選択される少なくとも１つのプロテアーゼ）の存在下にはない場合、その標的へのＡＢの特異的結合は、ＭＭ及びＣＭ又は親ＡＢにより修飾されていないＡＢの標的への特異的結合に比較して、低められるか又は阻害される。親ＡＢの結合、又はＭＭ及びＣＭにより修飾されていないＡＢのその標的への結合に比較して、ＭＭ及びＣＭにより修飾される場合の標的を結合するＡＢの能力は、インビボ又はインビトロアッセイにより測定される場合、少なくとも２、４、６、８、１２、２８、２４、３０、３６、４８、６０、７２、８４、又は９６時間、又は５、１０、１５、３０、４５、６０、９０、１２０、１５０、または１８０日間、又は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、又は１２か月間の間、又はそれ以上の間、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％ 及びさらに１００％、低められ得る。
本明細書において使用される場合、用語、切断された状態とは、マトリプターゼ及びｕＰＡから選択される少なくとも１つのプロテアーゼによるＣＭの修飾に続いての活性化可能抗体の状態を言及する。用語、切断れていない状態とは、本明細書において使用される場合、マトリプターゼ及びｕＰＡから選択されるプロテアーゼによるＣＭの切断の不在下での活性化可能抗体の状態を言及する。上記で論じられるように、用語「活性化可能抗体」は、その切断されていない（生来の）状態及びその切断された状態での活性化可能抗体を言及するために、本明細書において使用される。いくつかの実施形態において、切断された活性化可能抗体が、プロテアーゼによるＣＭの切断のためにＭＭを欠いており、少なくともＭＭ（例えば、ＭＭは共有結合（例えば、システイン残基間のジスルフィド結合）により活性化可能抗体に連結されていない）の放出をもたらすことは、当業者に明らかであろう。
活性化可能又は切り替え可能とは、活性化可能抗体が、阻害された、マスキングされた又は切断されていない状態（すなわち、第１コンホメーション）下で、標的への結合の第１レベル、及び阻害されていない、マスキングされていない及び／又は切断された状態（すなわち、第２コンホメーション）下で標的への結合の第２レベルを示すことを意味し、ここで標的結合の第２レベルは、結合の第１レベルよりも大きい。一般的に、活性化可能抗体のＡＢへの標的の接近性は、ＣＭを切断できる切断剤、すなわち、マトリプターゼ及びｕＰＡから選択されるプロテアーゼの存在下で、斯かる切断剤の不在下でよりも高い。従って、活性化可能が切断されていない状態下で存在する場合、ＡＢは、標的結合から阻害され、そして標的結合からマスキングされ得（すなわち、第１コンホメーション下で、斯かるＡＢは標的を結合できない）、そして切断された状態で、ＡＢは標的結合に阻害されないか、又はマスキングされていない。
活性化可能抗体のＣＭ及びＡＢが選択され、結果的に、ＡＢは所定の標的のための結合部分を表し、そしてＣＭは、マトリプターゼ及びｕＰＡから選択されるプロテアーゼのために基質を表す。いくつかの実施形態において、プロテアーゼは、対象における治療部分又は診断部位で標的と共局在する。本明細書中に使用される場合、共局在とは、同じ部位又は比較的に近くにあることを示す。いくつかの実施形態において、プロテアーゼはＣＭを切断し、切断部位の近くに位置する標的に結合する活性化された抗体を得た。本明細書に開示される活性化可能抗体は、例えばＣＭ内の部位を切断できるプロテアーゼ、すなわち、マトリプターゼ及びｕＰＡから選択されるプロテアーゼが、非治療部位の組織（例えば、健康な組織）においてよりも、治療部位又は診断部位の標的含有組織において、比較的高いレベルで存在する場合、特に使用される。いくつかの実施形態において、本開示のＣＭはまた、他の１若しくは複数のプロテアーゼによっても切断される。いくつかの実施形態において、標的と共局在し、インビボにおけるＣＭの切断に応答し得る他の１若しくは複数のプロテーアーゼである。
いくつかの実施形態において、活性化可能抗体は、ＡＢがマスキングされていないか又は標的の結合から阻害される場合、非治療部位でＡＢの結合に起因する、低められた毒性及び／又は有害な副作用を提供する。
一般的に、活性化可能抗体は、目的のＡＢを選択し、そして活性化可能抗体の残りの部分を構成することにより設計され得、結果的に、コンホメーション的に制約される場合、ＭＭはＡＢのマスキング、又はＡＢのその標的への結合の低下を提供する。構造的設計基準が、この機能的特徴を提供するために考慮されるべきである。
阻害されていないコンホメーションに対する阻害されたコンホメーションにおいて標的結合のための所望するダイナミック範囲の切り替え可能な表現型を示す活性化可能抗体が、提供される。ダイナミック範囲は一般的に、（ｂ）第２組の条件下でのパラメーターの最小の検出される値に対する（ａ）第１組の条件下でのパラメーターの最大の検出されるレベルの比率を意味する。例えば、活性化可能抗体の場合、ダイナミック範囲とは、（ｂ）プロテアーゼの不在化で活性化可能抗体に結合する、標的タンパク質の最小検出レベルに対する、（ａ）活性化可能抗体のＣＭを切断できるマトリプターゼ及びｕＰＡから選択される少なくとも１つのプロテアーゼの存在下で活性化可能抗体に結合する標的タンパク質、すなわち標的の最大検出レベルの比率を意味する。活性化可能抗体のダイナミック範囲は、活性化可能抗体切断剤処理の平衡解離定数に対する活性化可能抗体切断剤（例えば、酵素）処理の平衡解離定数の比率として計算され得る。活性化可能抗体のダイナミック範囲が高いほど、活性化可能抗体の切り替え可能表現型は良好である。比較的高いダイナミック範囲（例えば、１以上）を有する活性化可能抗体は、より所望の切り替え可能表現型を示し、結果的に、活性化可能抗体による標的タンパク質結合が、切断剤の不在下でよりも、活性化可能抗体のＣＭを切断できる切断剤（例えば、酵素）の存在化でより高い程度、生じる（例えば、主として生じる）。
活性化可能抗体は、種々の構造コンホメーションで提供され得る。活性化可能抗体についての典型的な式は、下記に提供される。ＡＢ、ＭＭ及びＣＭのＮ−末端からＣ−末端の順序が、活性化可能抗体内で逆にされ得ることが特に意図される。ＣＭ及びＭＭはアミノ酸配列においてオーバーラップし、例えば結果的に、ＣＭはＭＭ内に含まれることもまた特に意図される。
例えば、活性化可能抗体は、アミノ（Ｎ）末端領域からカルボキシル（Ｃ）末端領域の順に、下記式によりあらわされ得る：
（ＭＭ）‐（ＣＭ）‐（ＡＢ）
（ＡＢ）‐（ＣＭ）-（ＭＭ）
式中、ＭＭはマスキング部分であり、ＣＭは切断可能部分であり、そしてＡＢは抗体又はそのフラグメントである。ＭＭ及びＣＭは上記式においては異なった成分として示されているが、本明細書に開示されるすべての典型的な実施形態（式を包含する）においては、ＭＭ及びＣＭのアミの酸配列がオーバーラップし、例えば結果的に、ＣＭはＭＭ内に完全に又は部分的に含まれることが意図される。さらに、上記式は、活性化可能抗体要素にＮ−末端又はＣ−末端を位置決定できる追加のアミノ酸配列を提供する。
ある実施形態において、ＭＭは、ＡＢの天然の結合パートナーではない。いくつかの実施形態において、ＭＭは、ＡＢの任意の天然結合パートナーに対する相同性を含まないか、又は実質的に含まない。いくつかの実施形態において、ＭＭは、ＡＢの任意の天然の結合パートナーに対して、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、又は８０％以下、類似する。いくつかの実施形態において、ＭＭは、ＡＢの任意の天然の結合パートナーに対して、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、又は８０％以下、同一である。いくつかの実施形態において、ＭＭは、ＡＢの任意の天然の結合パートナーに対して、５０％以下、同一である。いくつかの実施形態において、ＭＭは、ＡＢの任意の天然の結合パートナーに対して、２５％以下、同一である。いくつかの実施形態において、ＭＭは、ＡＢの任意の天然の結合パートナーに対して、２０％以下、同一である。いくつかの実施形態において、ＭＭは、ＡＢの任意の天然の結合パートナーに対して、１０％以下、同一である。
多くの実施形態において、１又は２以上のＭＭ−ＣＭ接合、ＣＭ−ＡＢ接合、又は両者で、柔軟性を提供するために、１又は２以上のリンカー、例えば柔軟リンカーを、活性化可能抗体構築物中に挿入することが所望される。例えば、ＡＢ、ＭＭ及び／又はＣＭは、所望する柔軟性を提供するのに十分な数の残基（例えば、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、特にＧｌｙ及びＳｅｒ、特にＧｌｙ）を含まない。斯かる活性化可能抗体構築物の切切り換え可能表現型は、柔軟リンカーを提供するために、１又は２以上のアミノ酸の導入から利益を得ることができる。さらに、下記のように、活性化可能体がコンホメーション的に制約された構築物として提供される場合、柔軟リンカーが、切断された活性化可能抗体において環状構造の形成及び維持を促進するために、操作可能的に挿入され得る。
例えば、ある実施形態において、活性化可能抗体は、下記式の１つを含む（ここで、下記式は、Ｎ−からＣ−末端方向、又はＣ−からＮ−末端方向のいずれかでのアミノ酸配列を表す）：
（ＭＭ）‐Ｌ１‐（ＣＭ）‐（ＡＢ）
（ＭＭ）‐（ＣＭ）‐Ｌ２‐（ＡＢ）
（ＭＭ）‐Ｌ１‐（ＣＭ）‐Ｌ２‐（ＡＢ）
式中、ＭＭ、ＣＭ及びＡＢは上記に定義される通りであり；Ｌ１及びＬ２はそれぞれ独立して及び任意には、存在しても又は不在であっても良く、少なくとも１つの柔軟アミノ酸（例えば、Ｇｌｙ）を含む同じか又は異なった柔軟リンカーである。さらに、上記式は、活性化可能抗体要素にＮ−末端又はＣ−末端を位置決定できる追加のアミノ酸配列を提供する。例としては、次のものを挙げることが、但しそれらだけには限定されない：標的部分（例えば、標的組織に存在する細胞の受容体のためのリガンド）、及び血清中半減期拡張部分（例えば、血清タンパク質、例えば免疫グロブリン（例えば、ＩｇＧ）又は血清アルブミン（例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＡＳ））を結合するポリペプチド。
ＣＭは、約０．００１〜１５００ ｘ １０４Ｍ−１Ｓ−１又は少なくとも０．００１、０．００５、０．０１、０．０５、０．１、０．５、１、２．５、５、７．５、１０、１５、２０、２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、２００、２５０、５００、７５０、１０００、１２５０、又は 1５００ ｘ １０４Ｍ−１Ｓ−１の速度で、酵素により特異的に切断される。いくつかの実施形態において、ＣＭは約１００，０００Ｍ−１Ｓ−１の速度で特異的に切断される。いくつかの実施形態において、ＣＭは約１ｘ１０Ｅ２〜１ｘ１０Ｅ６１０４Ｍ−１Ｓ−１（すなわち、約１×１０２〜約１×１０６Ｍ−１Ｓ−１）の速度で特異的に切断される。
酵素による特異的切断のためには、酵素とＣＭとの間の接触が行われる。ＭＭ及びＣＭにカップリングされるＡＢを含む活性化可能抗体が標的且つ十分な酵素活性の存在下にある場合、ＣＭは切断され得る。十分な酵素活性とは、ＣＭと接触し、そして切断をもたらす酵素の能力を言及する。酵素はＣＭと接近して存在するが、しかし酵素の他の細胞要因又はタンパク質修飾のために、切断できないことが容易に想定され得る。
本明細書に記載される組成物に使用するのに適切なリンカーは一般的に、標的へのＡＢの結合の阻害を促進するために、修飾されたＡＢ又は活性化可能抗体の柔軟性を提供するリンカーである。斯かるリンカーは一般的に、柔軟リンカーとして言及される。適切なリンカーは、容易に選択され得、そして異なった長さのいずれかの適切なもの、例えば長さが１アミノ酸（例えば、Ｇｌｙ）〜２０アミノ酸、長さが２アミノ酸〜１５アミノ酸、長さが３アミノ酸〜１２アミノ酸、長さが４アミノ酸〜１０アミノ酸、長さが５アミノ酸〜９アミノ酸、長さが６アミノ酸〜８アミノ酸、又は長さが７アミノ酸〜８アミノ酸であり、そして長さが１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０アミノ酸であり得る。
典型的な柔軟リンカーは、グリシンポリマー（Ｇ）ｎ、グリシン−セリンポリマー（例えば、（ＧＳ）ｎ、（ＧＳＧＧＳ）ｎ (配列番号３８５) 及び（ＧＧＧＳ）ｎ (配列番号３８６)、ここでｎは少なくとも１つの整数である）、グリシン−アラニン−セリンポリマー及び当業界において知られている他の柔軟リンカーを包含する。グリシン及びグリシン−セリンポリマーは、比較的構造化されておらず、そして従って、成分間の中立テザーとして機能することができる。グリシンは、アラニンよりも有意にφ−ψ（phi-psi）空間にアクセスし、そしてより長い側鎖を有する残基よりもはるかに低く制限される（Scheraga, Rev. Computational Chem. 11173-142 (1992)を参照のこと）。典型的な柔軟リンカーは、次のものを包含するが、但しそれらだけには限定されない：Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ (配列番号３８７)、Gly-Gly-Ser-Gly-Glｙ (配列番号３８８)、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ (配列番号３８９)、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ (配列番号３９０)、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ (配列番号３９１)、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ (配列番号３９２)、及び同様のもの。当業者は、活性化可能抗体の企画が、完全に又は部分的に柔軟性であるリンカーを包含することができ、結果的に、前記リンカーは、柔軟リンカー、及び所望する活性化可能抗体構造を提供するために、低い柔軟性構造を与える１又は２以上の部分を含むことができることを理解するであろう。
本明細書中に記載した複合活性化可能抗体はまた、活性化可能抗体に複合化された剤を含む。いくつかの実施形態において、複合化される剤は、抗炎症剤及び／又は抗悪性腫瘍薬などの治療剤である。斯かる実施形態では、例えば、いくつかの実施形態において、炭化水素部分が抗体の抗原結合領域又は活性化可能抗体内の抗原結合フラグメントの外側に位置している場合には、剤は活性化可能抗体の炭化水素部分に結合されるいくつかの実施形態において、剤は、活性化可能抗体内の抗体又は抗原結合フラグメントのスルフヒドリル基に結合される。
いくつかの実施形態において、剤は、細胞毒性剤、例えば毒素（例えば、細菌、真菌、植物又は動物起源の酵素的活性毒素、若しくはそのフラグメント）又は放射性同位体（すなわち、放射性複合体）である。適切な細胞毒性剤は、例えば、表４に列挙される細胞毒性剤のいずれかである。
いくつかの実施形態において、剤は、例えば、標識又は他のマーカーなどの検出可能部分である。例えば、剤は、放射性標識アミノ酸、目印を付したアビジン（例えば、光学的又は熱量計的方法で検出できるストレプトアビジン含有蛍光標識又は酵素活性）によって検出できる１若しくは複数のビオチニル残基、１若しくは複数の放射性同位元素又は放射性核種、１若しくは複数の蛍光標識、１若しくは複数の酵素標識、及び／又は１若しくは複数の化学発光剤を含んでいる。いくつかの実施形態において、検出可能残基はスペーサ分子によって取り付けられる。
本開示はまた、細胞毒性薬、例えば毒素（例えば、細菌、真菌、植物又は動物起源の酵素的活性毒素、若しくはそのフラグメント）又は放射性同位体（すなわち、放射性複合体）などに結合した抗体を含む免疫複合体に関係する。好適な細胞毒性薬としては、例えばドラスタチン及びその誘導体（例えば、アウリスタチンＥ、ＡＦＰ、ＭＭＡＦ、ＭＭＡＥ、ＭＭＡＤ、ＤＭＡＦ、ＤＭＡＥ）が挙げられる。例えば、剤はモノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）又はモノメチルアウリスタチンＤ（ＭＭＡＤ）である。いくつかの実施形態において、剤は、表３で列挙した基から選択される剤である。いくつかの実施形態において、剤はドラスタチンである。いくつかの実施形態において、剤は、アウリスタチン又はその誘導体である。いくつかの実施形態において、剤は、アウリスタチンＥ又はその誘導体である。いくつかの実施形態において、剤はモノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）である。いくつかの実施形態において、剤はモノメチルアウリスタチンＤ（ＭＭＡＤ）である。いくつかの実施形態において、剤はマイタンシノイドである又はマイタンシノイド誘導体である。いくつかの実施形態において、剤は、ＤＭ１又はＤＭ４である。いくつかの実施形態において、剤は、デュオカルマイシン又はその誘導体である。いくつかの実施形態において、剤は、カリケアマイシン又はその誘導体である。いくつかの実施形態において、剤は、ピロロベンゾジアゼピンである。
いくつかの実施形態において、剤は、マレイミドカプロイル−バリン−シトルリンリンカー又はマレイミドＰＥＧ−バリン−シトルリンリンカーを使用してＡＢに接続される。いくつかの実施形態において、剤は、マレイミドカプロイル−バリン−シトルリンリンカーを使用してＡＢに接続される。いくつかの実施形態において、剤は、マレイミドＰＥＧ−バリン−シトルリンリンカーを使用してＡＢに接続される。いくつかの実施形態において、剤は、マレイミドＰＥＧ−バリン−シトルリン−パラ−アミノベンジルオキシカルボニルリンカーを使用してＡＢに接続されたモノメチルアウリスタチンＤ（ＭＭＡＤ）であり、このリンカーペイロード構築物は本明細書中で「ｖｃ−ＭＭＡＤ」と呼ばれる。いくつかの実施形態において、剤は、マレイミドＰＥＧ−バリン−シトルリン−パラ−アミノベンジルオキシカルボニルリンカーを使用してＡＢに接続されたモノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）であり、このリンカーペイロード構築物は本明細書中で「ｖｃ−ＭＭＡＥ」と呼ばれる。ｖｃ−ＭＭＡＤ及びｖｃ−ＭＭＡＥの構造物は、以下に示されている：
ｖｃ−ＭＭＡＤ：
Figure 2017509594
ｖｃ−ＭＭＡＥ：
Figure 2017509594
使用され得る酵素的活性の毒素及びそのフラグメントは、ジフテリアＡ鎖、ジフテリアトキシンの非結合活性フラグメント、外毒素Ａ鎖（シュードモナス・アエルギノサ（Pseudomonas aeruginosaからの）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、α−サルシン、アレウリテス・フォルジ（Aleurites fordii）タンパク質、ジアンチンタンパク質、ファイトラカ・アメリカナ（Phytolaca americana）タンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ及びＰＡＰ−Ｓ）、ゴーヤ（Momordica charantia）阻害剤、クルシン、クロチン、サパオナリア・オフィシナリス（Sapaonaria officinalis）阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン及びトリコテセンを包含する。種々の放射性核種は、放射性複合抗体の製造のために利用できる。例としては、２１２Ｂｉ、１３１Ｉ、１３１Ｉｎ、９０Ｙ及び１８６Ｒｅを挙げることができる。
抗体と細胞毒性剤との結合は、種々の二官能性タンパク質−カップリング剤、例えばＮ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオール）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（例えば、ジメチルアジピミデートＨＣｌ）、活性エステル（例えば、ジスクシンイミジルスベート）、アルデヒド（例えば、グルタルアルデヒド）、ビス−アジド誘導体（例えば、ビス−（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビス−ジアゾニウム誘導体（例えば、ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えば、トルエン２，６−ジイソシアネート）、及びビス−活性フッ素化合物（例えば、１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン）を用いて製造される。例えば、リシン免疫毒素は、Vitetta et al., Science 238: 1098 (1987)に記載のようにして調製され得る。炭素−１４−標識された１−イソチオシアネートベンジル−３−メチルジエチレントリアミン五酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、抗体への放射性核種の結合のための典型的なキレート剤である（ＷＯ９４／１１０２６を参照のこと）。
表３は、本明細書に記載される開示に使用され得る典型的な医薬剤のいくつかを列挙するが、但しそれらだけに限定するものではない。
Figure 2017509594
Figure 2017509594
当業者は、多くの種類の可能性ある部分が、本開示の得られる抗体に結合され得ることを理解するであろう（例えば、"Conjugate Vaccines", Contributions to Microbiology and Immunology, J. M. Cruse and R. E. Lewis, Jr (eds), Carger Press, New York, (1989)を参照のこと；それらの全内容は、参照により本明細書に援用される）。
いくつかの実施形態において、本明細書中に提供された組成物及び方法に加えて、複合活性化可能抗体はまた、
カップリングは、抗体及び他の部分がそれらのそれぞれの活性をできるだけ長く保持するよう、それらの２つの分子を結合するであろういずれかの化学反応を使用することによって達成され得る。この結合は、多くの化学機構、例えば共有結合、親和性結合、インターカレーション、コーディネート結合及び複合体化を包含する。いくつかの実施形態において、結合は、しかしながら、共有結合である。共有結合は、存在する側鎖の直接的縮合により、又は外部架橋分子の組込みにより達成され得る。多くの二価又は多価結合剤が、タンパク質分子、例えば本開示の抗体の他の分子へのカップリングにおいて有用である。例えば、代表的なカップリング剤は、有機化合物、例えばチオエステル、カルボジイミド、スクシンイミドエステル、ジイソシアネート、グルタルアルデヒド、ジアゾベンゼン及びヘキサメチレンジアミンを包含することができる。この列挙は、当業界において知られている種々の種類のカップリング剤を網羅することを意図するものではなく、むしろ、より一般的なカップリング剤の例である（Killen and Lindstrom, Jour. Immun. 133:1335-2549 (1984); Jansen et al., Immunological Reviews 62:185-216 (1982); 及びVitetta et al., Science 238:1098 (1987)を参照のこと）。
いくつかの実施形態において、本明細書中に提供された組成物及び方法に加えて、複合活性化可能抗体もまた、活性化可能抗体配列に挿入されたか、そうでなければ、含まれる修飾されたアミノ酸配列を通して部位−特異的結合のために修飾され得る。それらの修飾されたアミノ酸配列は、複合活性化可能抗体内の結合された剤の制御された配置及び／又は投与を可能にするよう企画される。例えば、活性化可能抗体は、反応性チオ基を提供し、そして抗原結合を変更しないで、タンパク質折り畳み及びアッセンブリーに負の影響を及ぼさない、Ｌ及びＨ鎖上の位置でのシステイン置換を含むよう構築され得る。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体は、結合のための適切な部位を提供するために活性化可能抗体内に１若しくは複数の非天然アミノ酸残基を含むか、そうでなければ、導入するよう構築され得る。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体は、活性化可能抗体配列内に酵素的に活性化可能ペプチド配列を含むかそうでなければ、導入するよう構築され得る。
好適なリンカーは、文献に記載されている（例えば、ＭＢＳ（Ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）の使用を記載する、Ramakrishnan, S. et al., Cancer Res. 44:201-208 (1984)を参照のこと）。また、オリゴペプチドリンカーにより抗体に結合されるハロゲン化されたアセチルヒドラジド誘導体の使用を記載する米国特許第５，０３０，７１９号を参照のこと。いくつかの実施形態において、好適なリンカーは、次のものを包含する：（ｉ）ＥＤＣ（１‐エチル‐３‐（３‐ジメチルアミノ‐プロピル）カルボジイミドヒドロクロリド；（ｉｉ）ＳＭＰＴ（４−スクシンイミジルオキシカルボニル−α−メチル−α−（２−ピリジル−ジチオ）−トルエン（Pierce Chem. Co.、カタログ番号（２１５５８Ｇ）；（ｉｉｉ）ＳＰＤＰ（スクシンイミジル−６［３−（２−ピリジルジチオ）プロピオンアミド］ヘキサノエート（Pierce Chem. Co.、カタログ番号２１６５Ｇ）；（ｉｖ）スルホ−ＬＣ−ＳＰＤＰ（スルホスクシンイミジル６［３−（２−ピリジルジチオ）−プロピオンアミド］ヘキサノエート（Pierce Chem. Co.、カタログ番号２１６５−Ｇ）；及び（ｖ）ＥＤＣに結合されたスルホ‐ＮＨＳ（Ｎ‐ヒドロキシスルホ‐スクシンイミド：Pierce Chem. Co.、カタログ番号２４５１０）。追加のリンカーとしては、これだけに限定されるものではないが、ＳＭＣＣ、スルホ−ＳＭｑＣＣ、ＳＰＤＢ、又はスルホ−ＳＰＤＢが挙げられる。
上記リンカーは、異なった属性を有し、従って異なった物理化学的特性を有する複合体を導く成分を含む。例えば、カルボン酸アルキルのスルホ‐ＮＨＳエステルは、芳香族カルボキシレートのスルホ‐ＮＨＳエステルより安定している。ＮＨＳ‐エステル含有リンカーは、スルホ‐ＮＨＳエステルより可溶性が低い。さらに、リンカーＳＨＰＴは、立体的ヒンダードジスルフィド結合を含み、そして高められた安定性を有する複合体を形成することができる。ジスルフィド結合はインビトロで切断され、低い利用可能な複合体をもたらすので、そのジスルフィド結合は一般的に、他の結合よりも低い安定性である。スルホ‐ＮＨＳは特に、カルボジミド（carbodimide）カップリングの安定性を高め得る。スルホ‐ＮＨＳとの結合に使用される場合、カルボジミドカップリング（ＥＤＣなど）は、単独のカルボジミドカップリング反応より加水分解に抵抗性であるエステルを形成する。
いくつかの実施形態において、リンカーは切断できる。いくつかの実施形態において、リンカーは非切断性である。いくつかの実施形態において、複数のリンカーが存在する。前記複数のリンカーはすべて同じであり、すなわち切断できるか、又は非切断性であり、又は複数のリンカーは異なっており、すなわち少なくとも１つは切断でき、そして少なくとも１つは非切断性である。
本開示は、次のように、ＡＢへの剤の結合のためにいくつかの方法を利用する：（ａ）ＡＢの炭水化物部分への結合、又は（ｂ）ＡＢのスルフヒドリル基への結合、又は（ｃ）ＡＢのアミノ基への結合、又は（ｄ）ＡＢのカルボキシレート基への結合。本開示のによれば、ＡＢは少なくとも２種の反応基（１つはＡＢと反応し、そして１つは剤と反応する）を有する中間リンカーを介して剤に共有結合され得る。任意の適合できる有機化合物を含むリンカーが選択され、結果的に、ＡＢ（又は剤）との反応はＡＢ反応性及び選択性に悪影響を及ぼさない。さらに、剤へのリンカーの結合は、剤の活性を破壊しない。酸化された抗体又は酸化された抗体フラグメントとの反応のための適切なリンカーは、第１級アミン、第ニアミン、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドロキシルアミン、フェニルヒドラジン、セミカルバジド及びチオセミカルバジド基から成る群から選択されたアミンを含むそれらを包含する。斯かる反応性官能基は、リンカーの構造の一部として存在することができるか、又は斯かる基を含まないリンカーの適切な化学的修飾により導入され得る。
本開示によれば、還元されたＡＢへの結合のための適切なリンカーは、還元された抗体又はフラグメントのスルフヒドリル基と反応できる一定の反応基を有するそれらを包含する。斯かる反応基は、次のものを包含するが、但しそれらだけには制限されない：反応性ハロアルキル基（例えば、ハロアセチル基)、ｐ−マーキュリーベンゾエート基、及びマイケル型付加反応できる基（例えば、マレイミド、及びMitra and Lawton, 1979, J. Amer. Chem. Soc. 101: 3097-3110により記載される基を包含する）。
本開示によれば、酸化も還元もされていないＡｂへの結合のための適切なリンカーは、ＡＢにおける修飾されていないリシン残基に存在する一次アミノ基と反応できる一定の官能基を有するそれらを包含する。斯かる反応基は、次のものを包含するが、但しそれらだけに制限されない：ＮＨＳカルボン酸又は炭酸エステル、ペンタフルオロフェニルカルボン酸又は炭酸エステル、アシルイミダゾール、イソシアネート及びイソチオシアネート。
本開示によれば、酸化も又は還元もされていないＡＢへの結合のための適切なリンカーは、適切な試薬により活性化されている、Ａｂにおけるアスパラギン酸又はグルタミン酸残基に存在するカルボン酸基と反応できる一定の官能基を有するそれらを包含する。適切な活性化試薬は、付加されたＮＨＳ又はスルホ−ＮＨＳを有するか又は有さないＥＤＣ、及びカルボキサミド形成のために使用される他の脱水剤を包含する。それらの場合、適切なリンカーに存在する官能基は、第１級及び第２級アミン、ヒドラジン、ヒドロキシルアミン及びヒドラジドを包含する。
剤は、リンカーがＡＢに結合される前又はその後、リンカーに結合され得る。ある種の用途によれば、リンカーが関連する剤を有さないＡＢ−リンカー中間体を、まず生成することが所望される。特定の用途に依存して、特定の剤がリンカーに共有結合され得る。他の実施形態において、ＡＢはまず、ＭＭ、ＣＭ、及び関連リンカーに結合され、そして次に、結合目的のためのリンカーに結合される。
分枝状リンカー：特定の実施形態において、剤の結合のための複数の部位を有する分枝リンカーが使用される。複数部位リンカーに関しては、ＡＢへの単一の共有結合が、多くの部位で剤を結合できるＡＢ−リンカー中間体をもたらす。部位はアデヒド又はスルフヒドリル基、又は剤が結合され得るいずれかの化学部位であり得る。
他方では、より高い比活性（又はＡＢに対する剤のより高い比率）が、ＡＢ上の複数部位での単一部位リンカーの結合により達成され得る。この複数部位は、２種の方法のいずれかによりＡＢ中に導入され得る。最初の方法は、同じＡＢに複数のアルデヒド基及び／又はスルフヒドリル基を生成することができる。第２の方法は、リンカーへの続く結合のための複数の官能部位を有する「分枝状リンカー」を、ＡＢのアルデヒド又はスルフヒドリル基に結合することができる。分枝状リンカー又は複数部位リンカー中の官能部位は、アルデヒド又はスルフヒドリル基であり得、又はリンカーが結合され得るいずれかの化学部位であり得る。さらに高い比活性が、それらの２つのアプローチを組合すことにより、すなわちＡＢ上のいくつかの部位で複数部位リンカーを結合することにより得られる。
切断可能リンカー：補体系の酵素、例えばｕ‐プラスミノーゲン活性化因子、組織プラスミノーゲン活性化因子、トリプシン、プラスミン、又はタンパク質分解活性を有する別の酵素（但し、それらだけには限定されない）による分解に対して敏感であるペプチドリンカーは、本開示の１つの実施形態に使用され得る。本開示の１つの方法によれば、剤は、補体による切断に対して感受性のリンカーを介して結合される。抗体は、補体を活性化できる種類から選択される。従って、抗体−剤結合体は、補体カスケードを活性化し、そして標的部位で剤を開放する。本開示の別の方法によれば、剤は、タンパク質分解活性を有する酵素、例えばｕ‐プラスミノーゲン活性化因子、組織プラスミノーゲン活性因子、プラスミン又はトリプシンによる切断に対して感受性のリンカーを介して結合される。それらの切断可能リンカーは、細胞外毒素、例えば非制限的例によれば、表３に示される細胞外毒素のいずれかを含む複合活性化可能抗体において有用である。
切断可能リンカー配列の非制限的例が、表４に提供される。
Figure 2017509594
さらに、剤は、ジスルフィド結合（例えば、システイン分子上のジスルフィド結合）を介してＡＢに結合され得る。多くの腫瘍は自然に高レベルのグルタチオン（還元剤）を放出するので、これはジスルフィド結合を還元し、続いて、送達の部位で剤を開放する。いくつかの実施形態において、ＣＭを修飾する還元剤はまた、複合活性化可能抗体のリンカーも修飾するであろう。
スペーサー及び切断可能要素：いくつかの実施形態において、剤と、活性化可能抗体のＡＢとの間の空間を最適化するような手段でリンカーを構築することが必要である。これは、下記一般構造のリンカーの使用により達成され得る：
Ｗ‐（ＣＨ２）ｎ‐Ｑ
式中、Ｗは、−ＮＨ−ＣＨ2−又は−ＣＨ2−のいずれかであり；
Ｑは、アミノ酸、ペプチドであり；そして
ｎは、０〜２０の整数である。
いくつかの実施形態において、リンカーは、スペーサー要素及び切断可能要素を含むことができる。スペーサー要素は、ＡＢのコアーから離れて切断可能要素を配置するのに役立ち、結果的に、切断可能要素は切断を担当できる酵素により接近できる。上記に記載される特定の分枝状リンカーがスペーサー要素として役立つことができる。
この議論を通して、剤へのリンカー（又は切断可能要素へのスペーサー要素の、又は剤への切断可能要素の）の結合は、結合又は反応の特定の様式である必要はない。適切な安定性及び生物学的適合性の生成物を提供するいずれかの反応が許容される。
血清補体及びリンカーの選択：本開示の１つの方法によれば、剤の放出が所望される場合、補体を活性化できる種類の抗体であるＡＢが使用される。得られる結合体は、抗原を結合し、そして補体カスケードを活性化する両能力を保持する。従って、本開示の実施形態において、剤は、切断可能リンカー又は切断可能要素の一端に連結され、そしてリンカー基の他端はＡＢ上の特定部位に結合される。例えば、剤がヒドロキシ基又はアミノ基を有する場合、それは、それぞれエステル又はアミド結合を介して、ペプチド、アミノ酸又は他の適切に選択されたリンカーのカルボキシ末端に結合され得る。例えば、斯かる剤は、カルボジイミド反応を介してリンカーペプチドに結合され得る。剤がリンカーへの結合と干渉する官能基を含む場合、それらの干渉性官能基は、結合の前、ブロックされ得、そして生成物の結合体又は中間体が製造されると、ブロック解除される。次に、リンカーの反対又はアミノ末端が直接的に、又は補体を活性化できるＡＢへの結合のためにさらなる修飾の後、使用される。
リンカー（又はリンカーのスペーサー要素）は任意の所望する長さのものであり得、その一端は、活性化可能抗体のＡＢ上の特定部位に共有結合され得る。リンカー又はスペーサー要素の他端は、アミノ酸又はペプチドリンカーに結合され得る。
従って、それらの結合体が補体の存在下で抗原に結合する場合、リンカーに剤を結合するアミド又はエステル結合が切断され、その活性形での剤の放出がもたらされる。それらの結合体は、対象に投与される場合、標的部位で剤の送達及び放出を達成し、そして表３に提供されるように（但し、それらに限定されない）、医薬剤、抗生物質、代謝拮抗剤、抗増殖剤及び同様のもののインビボ送達のために特に効果的である。
補体活性化を伴わない放出のためのリンカー：標的化された送達のさらなる別の用途によれば、補体活性化を伴わない剤の放出が、補体カスケードの活性化は究極的には標的細胞を溶解するので、所望される。従って、このアプローチは、剤の送達及び放出が標的細胞を殺さないで達成される場合、有用である。細胞メディエーター、例えばホルモン、酵素、コルチコステロイド、神経達成物質、遺伝子又は酵素の標的細胞への送達が所望される、そのような場合が、目標である。それらの結合体は、血清プロテアーゼによる切断に対して軽度に影響を受けるリンカーを介して、補体を活性化できないＡＢへの剤の結合により調製され得る。この結合体が個人に投与される場合、抗原−抗体複合体はすばやく形成するが、ところが剤の切断はゆっくり生じ、従って標的部位での化合物の放出がもたらされる。
生化学的架橋剤：いくつかの実施形態において、活性化可能抗体は、一定の生化学的架橋剤を用いて、１又は２以上の治療剤に結合され得る。架橋試薬は、２種の異なった分子の官能基を一緒に結びつける分子架橋を形成する。２種の異なったタンパク質を段階的に連結するためには、所望しないホモポリマー形成を排除するヘテロ二官能性架橋剤が使用され得る。
リソソームプロテアーゼにより切断できるペプチジルリンカー、例えばＶａｌ−Ｃｉｔ、Ｖａｌ−Ａｌａ、又は他のジペプチドがまた有用である。さらに、リソソームの低−ｐＨ環境下で切断できる酸−不安定性リンカー、例えばビス−シアリルエーテルが使用され得る。他の適切なリンカーは、カテプシン−不安定性基質、特に酸性ｐＨで最適な機能を示すそれらのものを包含する。
代表的なヘテロ二官能性架橋剤が表５に参照される。
Figure 2017509594
非切断可能リンカー又は直接的結合：本開示のいくつかの実施形態において、結合体は、剤が標的に送達するが、しかし放出されないよう設計され得る。これは、直接的に、又は非切断可能リンカーを介して、ＡＢに剤を結合することにより達成され得る。
それらの非切断可能リンカーは、続いて、本明細書に記載される方法によりＡＢへの結合において利用され得る官能基を含むよう修飾され得る、アミノ酸、ペプチド、Ｄ−アミノ酸又は他の有機化合物を包含することができる。斯かる有機リンカーのための一般式は、下記式であり得る：
Ｗ‐（ＣＨ２）ｎ‐Ｑ
式中、Ｗは、−ＮＨ−ＣＨ2−又は−ＣＨ2−のいずれかであり；
Ｑは、アミノ酸、ペプチドであり；そして
ｎは、０〜２０の整数である。
非切断可能結合体：いくつかの実施形態において、化合物は、補体を活性化しないＡＢに結合され得る。補体活性化できないＡＢを用いる場合、この結合は、活性化された補体による切断に対して敏感であるリンカー、又は活性化された補体による切断に対して敏感ではないリンカーを用いて、達成され得る。
本明細書に開示される抗体はまた、免疫リポソームとして処方され得る。抗体を含むリポソームは、当業界において知られている方法、例えばEpstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 3688 (1985); Hwang et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 77: 4030 (1980); 及び米国特許第４，４８５，０４５号 及び第４，５４４，５４５号に記載される方法により調製される。向上された循環時間を有するリポソームが、米国特許第５，０１３，５５６号に開示されている。
特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール及びＰＥＧ−誘導体化されたホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰE）を含む脂質組成物による逆相蒸発方法により生成され得る。リポソームは、規定の孔サイズのフィルターを通して押出され、所望する直径を有するリポソームが得られる。本開示の抗体のＦａｂ′フラグメントは、ジスルフィド−交換反応を介してMartin et al., J. Biol. Chem., 257: 286-288 (1982)に記載のようにして、リポソームに結合され得る。
定義：
特にことわらない限り、本開示に関連して使用される科学用語及び技術用語は、当業者により通常理解される意味を有するであろう。「ａ」実体（「a」 entity）又は「ａｎ」実体（「an」 entity）といった用語は、１若しくは複数のその実体を指す。例えば、「ａ」化合物（「a」 compound）は１若しくは複数の化合物を指す。このように、「ａ」、「ａｎ」、「１若しくは複数」及び「少なくとも１つ」といった用語は互換的に使用され得る。さらに、特に必要とされない限り、単数形の用語は複数を含むものとし、そして複数形は単数を含むものとする。一般的に、本明細書に記載される細胞及び組織培養物、分子生物学、及びタンパク質及びオリゴ−又はポリヌクレオチド化学及びハイブリダイゼーションに関連して使用される命名法及びそれらの技法は、当業者に良く知られており、そして当業界において通常使用される。標準技法が、組換えＤＮＡ、オリゴヌクレオチド合成、及び組織培養及び形質転換（例えば、エレクトロポレーション、リポフェクション）について使用される。酵素反応及び精製技法は、製造業者の規格に従って、又は当業界において通常達成されるようにして、又は本明細書に記載されるようにして、実施される。前述の技法及び手順は、当業界において良く知られている従来の方法に従って、及び本明細書を通して引用され、そして論じられる種々の一般的及び特定の参照に記載のようにして、一般的に実施される。例えば、Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989))を参照のこと。本明細書に記載される分析化学、合成有機化学、及び医学及び薬化学に関連して使用される命名法、及び実験手順及び技法は、当業者に良く知られており、そして当業界において通常使用される。標準技法が、化学合成、化学分析、医薬調製、配合、及び送達、及び患者の治療のために使用される。
本開示に従って使用される場合、次の用語が、特にことわらない限り、次の意味を有することが理解されるであろう。
本明細書において使用される場合、用語「抗体（antibody）」とは、免疫グロブリン分子、及び免疫グロブリン（Ｉｇ）分子の免疫学的活性部分、すなわち抗原を特異的に結合する（抗原と免疫反応する）抗原結合部位を含む分子を言及する。「特異的に結合する（specifically bind）」又は「免疫反応する（immunoreacts with）」又は「免疫特異的に結合する（immunospecifically bind）」とは、抗体が所望する抗原の１又は２以上の抗原決定因子と反応し、そして他のポリペプチドと反応せず、そしてより低い親和性（Ｋｄ＞１０-6）で結合しないことを意味する。抗体は、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、ドメイン抗体、単鎖、Ｆａｂ，及びＦ（ａｂ′）2フラグメント、ｓｃＦｖｓ、及びＦａｂ発現ライブラリーを包含するが、但しそれらだけには限定されない。
基本的な抗体構造単位は、テトラマーを含むことが知られている。各テトラマーは、同一の２対のポリペプチド鎖から構成され、各対は１つの「Ｌ鎖」（約２５ｋＤａ）及び１つの「Ｈ鎖」（約５０〜７０ｋＤａ）を有する。各鎖のアミノ末端部分は、抗原認識を主に担当する約１００〜１１０又はそれ以上のアミノ酸の可変領域を含む。各鎖のカルボキシ末端は、エフェクター機能を主に担当する不変領域を規定する。一般的に、ヒトから得られる抗体分子は、分子に存在するＨ鎖の性質によりお互い異なる、クラスＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ及びＩｇＤのいずれかに関連する。特定クラスは、サブクラス、例えばＩｇＧ1、ＩｇＧ2、及び他のものも有する。さらに、ヒトにおいては、Ｌ鎖はカッパ鎖又はラムダ鎖である得る。
用語「モノクローナル抗体（monoclonal antibody）」（ｍＡｂ）又は「モノクローナル抗体組成物（monoclonal antibody composition）」とは、本明細書において使用される場合、固有のＬ鎖遺伝子生成物及び固有のＨ鎖遺伝子生成物から成る抗体分子の１つの分子種のみを含む抗体分子集団を言及する。特に、モノクローナル抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）は、前記集団のすべての分子において同一である。ＭＡｂは、抗原のエピトープに対して固有の結合親和性により特徴づけられる抗原の特定エピトープと免疫反応できる抗原結合部位を含む。
用語「抗原−結合部位（antigen-binding site）」又は「結合部分（binding portion）」とは、抗原結合に関与する免疫グロブリン分子の一部を言及する。抗原結合部位は、重鎖（Ｈ）及び軽鎖（Ｌ）のＮ−末端可変（Ｖ）領域のアミノ酸残基により形成される。「超可変領域（hypervariable regions）」として言及される、Ｈ及びＬ鎖のＶ領域内の３種の高度に分岐するストレッチが、「フレームワーク領域（framework regions）」又は「ＦＲ」として知られているより保存された隣接ストレッチ間に介在される。従って、用語「ＦＲ」とは、免疫グロブリン中の超可変領域間に、及びそれに隣接して天然に見出されるアミノ酸配列を言及する。抗体分子においては、Ｌ鎖の３種の超可変領域及びＨ鎖の３種の超可変領域が、立体空間においてお互い相対的に配列され、抗原−結合表面が形成される。前記抗原−結合表面は、結合される抗原の立体表面に対して相補的であり、そして各Ｈ及びＬ鎖の３種の超可変領域は、「相補性−決定領域（complementarity-determining regions）」又は「ＣＤＲ」として言及される。各ドメインへのアミノ酸の割り当ては、Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 and 1991))、又は Chothia & Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987), Chothia et al. Nature 342:878-883 (1989)の定義に従う。
本明細書において使用される場合、用語「エピトープ（epitope）」は、免疫グロブリン、ｓｃＦｖ又はＴ細胞受容体に対して特異的結合できる任意のタンパク質決定因子を包含する。用語「エピトープ」は、免疫グロブリン又はＴ細胞受容体に対して特異的結合できる任意のタンパク質決定因子を包含する。エピトープ決定因子は通常、アミノ酸又は糖側鎖などの分子の化学的活性表面基から成り、そして通常、特定の立体構造特性、及び特定の電荷特性を有する。例えば、抗体は、ポリペプチドのＮ末端又はＣ末端ペプチドに対して産生され得る。抗体は、解離定数が≦１μＭ；いくつかの実施形態において、≦１００ｍＭ、及びいくつかの実施形態において、≦１０ｎＭである場合、抗原を特異的に結合すると言われる。
本明細書において使用される場合、用語「特異的結合（specific binding）」、「免疫学的結合（immunological binding）」及び「免疫学的結合性質（immunological binding properties）」とは、免疫グロブリンが特異的である、免疫グロブリン分子と抗原との間に生じるタイプの非共有相互作用を言及する。免疫学的結合相互作用の強度又は親和性は、相互作用の解離定数（Ｋｄ）により表され、ここでより小さなＫｄはより大きな親和性を表す。選択されるポリペプチドの免疫学的結合性質は、当業界において良く知られている方法を用いて定量化され得る。１つのそのような方法は、抗原結合部位／抗原複合体形成及び解離の速度を測定することを伴い、ここでそれらの速度は、複雑なパートナーの濃度、相互作用の親和性、及び両方の速度の等しい影響を及ぼす幾何学的パラメーターに依存する。従って、「オン速度定数（on rate constant）」（Ｋon）及び「オフ速度定数（off rate constant）」（Ｋoff）の両者は、濃度、及び会合及び解離の実際の速度の計算により決定され得る（Nature 361:186-87 (1993)を参照のこと）。Ｋoff／Ｋonの比は、親和性に関連しないすべてのパラメーターの取り消しを可能にし、そして解離定数Ｋｄに等しい（一般的に、Davies et al. (1990) Annual Rev Biochem 59:439-473を参照のこと）。本開示の抗体は、アッセイ、例えば放射性リガンド結合アッセイ又は当業者に知られている類似するアッセイにより測定されるように、平衡結合定数（Ｋｄ）が≦１μＭ、いくつかの実施形態において、≦１００ｎＭ、いくつかの実施形態において、≦１０ｎＭ、及びいくつかの実施形態において、≦１００Ｍ〜約１ｐＭである場合、標的に対して特異的に結合すると言われる。
用語「単離されたポリヌクレオチド（isolated polynucleotide）」とは、本明細書において使用される場合、ゲノム、ｃＤＮＡ又は合成起源、又はそれらのいくつかの組合せのポリヌクレオチドを意味し、その起源によれば、「単離されたポリヌクレオチド」は、（１）「単離されたポリヌクレオチド」が天然に見出されるポリヌクレオチドのすべて又は一部と会合せず、（２）それが天然で連結されないポリヌクレオチドに対して操作可能的に連結されるか、又は（３）大きな配列の一部として、天然に存在しない。本開示のポリヌクレオチドは、本明細書に示されるＨ鎖免疫グロブリン分子をコードする核酸分子、及び本明細書に記載されるＬ鎖免疫グロブリン分子をコードする核酸分子を含む。
本明細書に記載される用語「単離されたタンパク質（isolated protein）」とは、ｃＤＮＡ、組換えＲＮＡ、又は合成起源又はそれらのいくつかの組合せのタンパク質を意味し、その起源、又は誘導の源によれば、「単離されたタンパク質」は、（１）自然界に見出されるタンパク質に関連せず、（２）同じ源からの他のタンパク質を有さず、例えばネズミタンパク質を有さず、（３）異なった種からの細胞により発現され、又は（４）自然界には存在しない。
用語「ポリペプチド（polypeptide）」は、ポリペプチド配列の天然タンパク質、フラグメント、又は類似体を言及するために一般用語として本明細書において使用される。従って、天然タンパク質、フラグメント及び類似体は、ポリペプチド属の種である。本開示のポリペプチドは、本明細書に示されるＨ鎖免疫グロブリン分子、及び本明細書に示されるＬ鎖免疫グロブリン分子、並びにＬ鎖免疫グロブリン分子、例えばカッパＬ鎖免疫グロブリン分子、及びその逆、並びにそれらのフラグメント及び類似体を含んで成る組合せにより形成される抗体分子を含む。
本明細書において使用される場合、用語「天然に存在する（naturally-occurring）」とは、目的物に適用される場合、目的物が自然界において見出され得る事実を言及する。例えば、生物（例えば、ウィルス）に存在するポリペプチド又はポリヌクレオチドは、自然源から単離され、そして実験室においてヒトにより意図的に変性されていないか、又は他方では、天然に存在する。
用語「操作可能的に連結された（operably linked）」とは、本明細書において使用される場合、記載される成分の意図された様式でのそれらの機能を可能にする関係下にある斯かる成分の位置を言及する。コード配列に「操作可能的に連結された」制御配列は、そのコード配列の発現が制御配列と適合できる条件下で達成されるような手段で連結される。
用語「制御配列（control sequence）」とは、本明細書において使用される場合、それらが連結されるコード配列の発現及びプロセッシングをもたらすのに必要であるポリヌクレオチド配列を言及する。斯かる制御配列の性質は、原核生物における宿主生物に依存して異なり、斯かる制御配列は一般的に、真核生物におけるプロモーター、リボソーム結合部位及び転写終結配列を含み、一般的に斯かる制御配列は、プロモーター及び転写終結配列を含む。用語「制御配列」は、それらの存在が発現及びプロセッシングのために必須であるすべての成分を、最低でも含むことが意図され、そしてまた、それらの存在がリーダー配列及び融合パートナー配列のために好都合である追加成分も含むことができる。用語「ポリヌクレオチド」とは、本明細書において使用される場合、少なくとも１０個の長さの塩基のヌクレオチド、リボヌクレオチド又はデオキシヌクレオチドのいずれか、又は修飾された形のいずれかのタイプのヌクレオチドを意味する。この用語は、単鎖及び二本鎖形のＤＮＡを包含する。
本明細書に言及される用語「オリゴヌクレオチド（oligonucleotide）」は、天然に存在し、そして天然に存在しないオリゴヌクレオチド結合により一緒に連結された、天然に存在し、そして修飾されたヌクレオチドを包含する。オリゴヌクレオチドは、２００個の長さか、又はそれよりも少ない長さの塩基を、一般的に含むポリヌクレオチドサブセットである。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、１０〜６０個の長さ、及び、いくつかの実施形態において、１２，１３，１４，１５，１６，１７，１８，１９又は２０〜４０個の長さの塩基である。オリゴヌクレオチドは通常、例えばプローブに関しては、単鎖であり、ところがオリゴヌクレオチドは、遺伝子変異体の構成への使用のためには、二本鎖であり得る。本開示のオリゴヌクレオチドは、センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
本明細書において言及される用語「天然に存在するヌクレオチド（naturally occurring nucleotides）」は、デオキシリボヌクレオチド及びリボヌクレオチドを包含する。本明細書において言及される用語「修飾されたヌクレオチド」は、修飾された又は置換された糖基及び同様のものを有するヌクレオチドを包含する。本明細書において言及される用語「オリゴヌクレオチド結合」は、オリゴヌクレオチド結合、例えばホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホラニラデ−ト（phoshoraniladate）、ホスホロンミデート（phoshoronmidate）及び同様のものを包含する。例えば、LaPlanche et al. Nucl. Acids Res. 14:9081 (1986); Stec et al. J. Am. Chem. Soc. 106:6077 (1984), Stein et al. Nucl. Acids Res. 16:3209 (1988), Zon et al. Anti Cancer Drug Design 6:539 (1991); Zon et al. Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, pp. 87-108 (F. Eckstein, Ed., Oxford University Press, Oxford England (1991)); Stec et al. U.S. Patent No. 5,151,510; Uhlmann and Peyman Chemical Reviews 90:543 (1990)を参照のこと。オリゴヌクレオチドは、所望には、検出のための標識を含むことができる。
本明細書において使用される場合、２０個の従来のアミノ酸及びそれらの略語は、従来の使用法に従う。Immunology - A Synthesis (2nd Edition, E.S. Golub and D.R. Gren, Eds., Sinauer Associates, Sunderland Mass. (1991))を参照のこと。２０個の従来のアミノ酸の立体異性体（例えば、Ｄ−アミノ酸）、非天然アミノ酸、例えばα−、α−二置換されたアミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸、乳酸、及び他の非従来型アミノ酸もまた、本開示のポリペプチドのための適切な成分であり得る。非従来型アミノ酸の例は、次のものを包含する：４−ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタメート、・−Ｎ、Ｎ、Ｎ、Ｎ−トリメチルリシン、・−Ｎ−アセチルリシン、Ｏ−ホスホセリン、Ｎ−アセチルセリン、Ｎ−ホルミルメチオニン、３−メチルヒスチジン、５−ヒドロキシリシン、・−Ｎ−メチルアルギニン、及び他の類似するアミノ酸及びイミノ酸（例えば、４−ヒドロキシプロリン）。本明細書で使用されるポリペプチド表記法においては、標準用法及び慣例に従って、左側方向はアミノ末端方向であり、そして右側方向はカルボキシ末端方向である。
同様に、特にことわらない限り、単鎖ポリヌクレオチド配列の左側端は、５′端であり、二本鎖ポリヌクレオチド配列の左側方向は、５′方向として言及される。新生ＲＮＡ転写体の５′から３′付加の方向は、転写方向として言及され、ＲＮＡと同じ配列を有するＤＮＡ鎖上の及びＲＮＡ転写体の５′末端に対して５′側い存在する配列領域は、「上流配列（upstream sequences）」と呼ばれ、ＲＮＡと同じ配列を有するＤＮＡ鎖上の、及びＲＮＡ転写体の３′末端に対して３′側に存在する領域は、「下流配列（downstream sequences）」と呼ばれる。
ポリペプチドに適用される場合、用語「実質的に同一（substantial identity）」とは、２種のペプチド配列が、デフォルトギャップ重量を用いて、プログラムＧＡＰ又はＧＥＳＴＦＩＴによれば、適切に整列される場合、少なくとも８０％の配列同一性、いくつかの実施形態において、少なくとも９０％の配列同一性、いくつかの実施形態において、少なくとも９５％の配列同一性、及びいくつかの実施形態において、少なくとも９９％の配列同一性を共有することを意味する。
いくつかの実施形態において、同一でない残基位置は、保存性アミノ酸置換により異なる。
本明細書において論じられる場合、抗体又は免疫グロブリン分子のアミノ酸配列におけるマイナーな変動は、アミノ酸配列における変動が少なくとも７５％、いくつかの実施形態において、少なくとも８０％、９０％、９５％及びいくつかの実施形態において、９９％維持する場合、本開示により包含されるものとして意図される。特に、保存性アミノ酸置換が企画される。保存性置換は、それらの側鎖に関連するアミノ酸ファミリー内で起こるそれらの置換である。遺伝的にコードされたアミノ酸は一般的に、次のファミリーに分けられる：（１）酸性アミノ酸はアスパラギン酸、グルタミン酸であり；（２）塩基性アミノ酸は、リシン、アルギニン、ヒスチジンであり；（３）非極性アミノ酸は、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファンであり、そして（４）非荷電性極性アミノ酸は、グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、トレオニン、チロシンである。親水性アミノ酸は、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、ヒスチジン、リジン、セリン、及びトレオニンを包含する。疎水性アミノ酸は、アラニン、システイン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン、チロシン及びバリンを包含する。他のファミリーのアミノ酸は、（ｉ）脂肪族−ヒドロキシファミリーである、セリン及びトレオニン；（ｉｉ）アミド含有ファミリーである、アスパラギン及びグルタミン；（ｉｉｉ）脂肪族ファミリーである、アラニン、バリン、ロイシン、及びイソロイシン；及び（ｉｖ）芳香族ファミリーである、フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシンを包含する。例えば、イソロイシン又はバリンによるロイシンの、グルタミン酸によるアスパラギン酸の、セリンによるトレオニンの単離された置換、又は構造的に関連するアミノ酸による１つのアミノ酸の類似する置換は、特にその置換が骨格部位内にアミノ酸を含まない場合、得られる分子の結合又は性質に対して主要効果を有さないであろうことを予測するが妥当である。アミノ酸変化が機能ペプチドをもたらすかどうかは、ポリペプチド誘導体の比活性をアッセイすることにより、容易に決定され得る。アッセイは本明細書に詳細に記載される。抗体又は免疫グロブリン分子のフラグメント又は類似体は、当業者により容易に調製され得る。フラグメント又は類似体の好適なアミノ−及びカルボキシ末端は、機能的ドメインの境界近くで存在する。構造的及び機能的ドメインは、公的又は独自の配列データベースとのヌクレオチド及び／又はアミノ酸配列データの比較により同定され得る。いくつかの実施形態において、コンピューター化された比較方法が、既知構造及び／又は機能の他のタンパク質に存在する配列モチーフ又は予測されるタンパク質コンホメーションドメインを同定するために使用される。既知立体構造に折り畳むタンパク質配列を同定するための方法は周知である（Bowie et al. Science 253:164 (1991)）。従って、前述の例は、当業者が本開示に従って構造及び機能的ドメインを規定するために使用され得る、配列モチーフ及び構造コンホメーションを認識することができることを示している。
好適なアミノ酸置換は、（１）タンパク質分解に対する感受性を低め、（２）酸化に対する感受性を低め、（３）タンパク質複合体を形成するために結合親和性を変更し、（４）結合親和性を変更し、並びに（５）斯かる類似体の他の物理化学的又は機能的性質を付与するか又は修正するそれらの置換である。類似体は、天然に存在するペプチド配列以外の配列の種々のムテインを含むことができる。例えば、単一又は複数のアミノ酸置換（例えば、保存性アミノ酸置換）が、分子間接触を形成する天然に存在する配列（例えば、ドメイン外のポリペプチドの一部）において行われ得る。保存性アミノ酸置換は、親配列の構造特性を実質的変更すべきではない（例えば、置換アミノ酸は、親配列に生じるヘリックスを分解するか、又は親配列を特徴づける他のタイプの二次構造を破壊する傾向であってはならない）。当核分野で認識されるポリペプチド二次及び三次構造の例は、Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton, Ed., W. H. Freeman and Company, New York (1984)); Introduction to Protein Structure (C. Branden and J. Tooze, eds., Garland Publishing, New York, N.Y. (1991));及びThornton et at. Nature 354:105 (1991)に記載される。
用語「ポリペプチドフラグメント（polypeptide fragment）」とは、本明細書において使用される場合、アミノ酸末端及び／又はカルボキシ末端欠失及び／又は１又は２以上の内部欠失を有するが、しかし残るアミノ酸配列は例えば完全長ｃＤＮＡ配列から推定される天然に存在する配列においてその対応する位置と同一であるポリペプチドを言及する。フラグメントは、典型的には、少なくとも５、６、８又は１０個の長さのアミノ酸、いくつかの実施形態において、少なくとも１４個の長さのアミノ酸、いくつかの実施形態において、少なくとも２０個の長さのアミノ酸、通常少なくとも５０個の長さのアミノ酸、及びいくつかの実施形態において、少なくとも７０個の長さのアミノ酸でである。用語「類似体」とは、本明細書において使用される場合、推定されるアミノ酸配列の一部に対して実質的な同一性を有し、そして適切な結合条件下で標的に対する特異的結合を有する、少なくとも２５個のアミノ酸のセグメントから構成されるポリペプチドを言及する。典型的には、ポリペプチド類似体は、天然に存在する配列に関して、保存性アミノ酸置換（又は付加又は欠失）を含む。類似体は典型的には、少なくとも２０個の長さのアミノ酸、いくつかの実施形態において、少なくとも５０個又はそれ以上の長さのアミノ酸であり、そしてしばしば、完全な長さの天然に存在するポリペプチドと同じ長さであり得る。
用語「剤（agent）」は、化学物質、化学物質及び生体高分子の混合物、又は生物学的材料から製造される抽出物を示すために、本明細書において使用される。
本明細書において使用される場合、用語「標識（label）」又は「標識された（labeled）」とは、例えば放射性標識されたアミノ酸の組込み、又はマークされたアビジン（例えば、光学的又は熱量測定方法により検出され得る蛍光マーカー又は酵素活性を含むストレプタビジン）により検出され得るビオチニル部分のポリペプチドへの結合による、検出可能マーカーの組込みを言及する。一定の状況下で、標識又はマーカーもまた治療性であり得る。ポリペプチド及び糖タンパク質を標識する種々の方法は、周知であり、そして使用され得る。ポリペプチドについての標識の例は、次のものを包含するが、但しそれらだけには限定されない：放射性同位体又は放射性核種（例えば、3Ｈ、14Ｃ、15Ｎ、35Ｓ、90Ｙ、99Ｔｃ、111Ｉｎ、125Ｉ、131Ｉ）、蛍光標識（例えば、ＦＩＴＣ、ローダミン、ランタニド蛍光体）、酵素標識（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、ｐ−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）、化学ルミネセンス、ゼオチニル基、二次レポーターにより認識される所定のポリペプチドエピトープ（例えば、ロイシンジッパー対配列、二次抗体のための結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ）。いくつかの実施形態において、標識は、可能性ある立体障害を低めるために、種々の長さのスペーサーアームにより結合される。用語「医薬剤又は薬剤（pharmaceutical agent or drug）」とは、本明細書において使用される場合、患者に適切に投与される場合、所望する治療効果を誘発できる化学物質又は組成物を言及する。
本明細書における他の化学用語は、The McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (Parker, S., Ed., McGraw-Hill, San Francisco (1985))により例示されるように、当核技術分野における従来の使用法に従って使用される。
本明細書において使用される場合、「実質的に純粋な（substantially pure）」とは、目的の種が存在する優性種であり（すなわち、モル基準で、組成物において任意の他の個々の種より豊富である）、そして、いくつかの実施形態において、実質的に純粋な画分が、目的の種が存在するすべての高分子種の少なくとも約５０％（モル基準で）を含む組成物であることを意味する。
一般的に、実質的に純粋な組成物は、組成物に存在するすべての高分子種の約８０％以上、いくつかの実施形態において、約８５％、９０％、９５％及び９９％以上を含むであろう。いくつかの実施形態において、目的の種は、本質的な均質性に精製され（汚染種は従来の検出方法によっては、組成物において検出され得ない）、ここで組成物は単一の高分子種から実質的に成る。
用語、患者とは、ヒト及び動物種を包含する。
本開示の活性化可能抗体は所定の標的、例えばヒト標的タンパク質に結合する。本明細書中に記載した活性化可能抗体と同じエピトープに結合する活性化可能抗体もまた本開示に含まれる。
当業者は、モノクローナル抗体（例えば、ネズミ又はヒト適合されたモノクローナル抗体）が、前者が標的への結合から後者を妨げるかどうかを確かめることにより、本明細書に記載される方法に使用されるモノクローナル抗体と同じ特異性を有するかどうかを、過渡の実験をすることなく、決定することが可能であることを認識するであろう。試験されるモノクローナル抗体が、本開示のモノクローナル抗体による結合の低下により示されるように、本開示のモノクローナル抗体と競争する場合、それらの２種のモノクローナル抗体は、同じか、又は密接に関連するエピトープに結合する。モノクローナル抗体が本開示のモノクローナル抗体の特異性を有するかどうかを決定するための他の方法は、標的と共に本開示のモノクローナル抗体をプレインキュベートし、そして次に、試験されるモノクローナル抗体が標的を結合するその能力を阻害するかどうかを決定するために試験されるモノクローナル抗体を添加することである。試験されるモノクローナル抗体が阻害される場合、十中八九、それは本開示のモノクローナル抗体と同じか、又は機能的に等しいエピトープ特異性を有する。
多重特異的活性化可能抗体
本開示はまた、多重特異的活性化可能抗体も提供する。本明細書において提供される多重特異的活性化可能抗体は、本明細書中に提供した多重特異的活性化可能抗体は、２つ以上の別個の抗原又はエピトープを認識し、且つ、多重特異的抗体の少なくとも１つの抗原−又はエピトープ結合ドメインに連結される少なくとも１つのマスキング部分（ＭＭ）を含む多重特異的抗体であり、ここでＭＭのカップリングが、抗原−又はエピトープ−結合ドメインのその標的を結合する能力を低める。いくつかの実施形態において、ＭＭは、ｕＰＡ及びマトリプターゼから選択される少なくとも１つのプロテアーゼのための基質として機能する切断可能部分（ＣＭ）を介して、多重特異的抗体の抗原−又はエピトープ−結合ドメインにカップリングされる。本明細書において提供される多重特異的活性化可能抗体は、循環において安定し、治療及び／又は診断の意図される部位で活性化されるが、しかし正常な、すなわち健康な組織においては活性化されず、そして活性化される場合、その対応する、修飾されていない多重特異的抗体に、少なくとも匹敵する標的への結合を示す。
いくつかの実施形態において、多重特異的活性化可能抗体は、また本明細書において免疫エフェクター細胞動員多重特異的活性化可能抗体としても言及される免疫エフェクター細胞を動員するよう企画される。いくつかの実施形態において、多重特異的活性化可能抗体は、また白血病動員多重特異的活性化可能抗体として本明細書において言及される、白血球を動員するよう企画される。いくつかの実施形態において、多重特異的活性化可能抗体は、またＴ細胞動員多重特異的活性化可能抗体として本明細書において言及される、Ｔ細胞を動員するよう企画される。いくつかの実施形態において、多重特異的活性化可能抗体は、白血球、例えばＴ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、骨髄単核細胞、マクロファージ、及び／又は別の免疫エフェクター細胞上の表面抗原を動員する。いくつかの実施形態において、免疫エフェクター細胞は、白血球である。いくつかの実施形態において、免疫エフェクター細胞は、Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、免疫エフェクター細胞は、ＮＫ細胞である。いくつかの実施形態において、免疫エフェクター細胞は、単核細胞、例えば骨髄単核細胞である。いくつかの実施形態において、多重特異的活性化可能抗体は、多抗原標的化抗体及び／又は多抗原標的化、活性化可能抗体としても本明細書において言及される、複数の標的及び／又は複数のエピトープを結合するか、又は他方では、それと反応するよう企画される。本明細書において使用される場合、用語「標的（target）」及び「抗原（antigen）」とは、交換可能的に使用される。
いくつかの実施形態において、本開示の免疫エフェクター細胞動員多重特異的活性化可能抗体は、標的化抗体又はその抗原結合フラグメント、及び免疫エフェクター細胞動員抗体又はその抗原結合部分を含み、ここで標的化抗体又はその抗原結合フラグメント、及び/又は免疫エフェクター細胞動員抗体又はその抗原結合部分の少なくとも１つはマスキングされている。いくつかの実施形態において、免疫エフェクター細胞動員抗体又はその抗原結合フラグメントは、第１免疫エフェクター細胞動員標的を結合する、第１抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ１）を含み、ここで前記ＡＢ１はマスキング部分（ＭＭ１）に結合され、結果的に、前記ＭＭ１のカップリングは、前記第１標的を結合するＡＢ１の能力を低める。いくつかの実施形態において、標的化抗体又はその抗原結合フラグメントは、第２標的を結合する、第２抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ２）を含み、ここで前記ＡＢ２はマスキング部分（ＭＭ２）に結合され、結果的に、ＭＭ２のカップリングは、第２標的を結合するＡＢ２の能力を低める。いくつかの実施形態において、免疫エフェクター細胞動員抗体又はその抗原結合フラグメントは、第１免疫エフェクター細胞動員標的を結合する、第１抗体又はその抗原フラグメント（ＡＢ１）を含み、ここで前記ＡＢ１はマスキング部分（ＭＭ１）に結合され、結果的にＭＭ１のカップリングは、第１標的を結合するＡＢ１の能力を低め、そして前記標的化抗体又はその抗原結合フラグメントは、第２標的を結合する、第２抗体又は抗原結合フラグメント（ＡＢ２）を含み、ここで前記ＡＢ２は、マスキング成分（ＭＭ２）に結合され、結果的に、ＭＭ２のカップリングは、第２標的を結合するＡＢ２の能力を低める。いくつかの実施形態において、非免疫エフェクター細胞動員抗体は、癌標的化抗体である。いくつかの実施形態において、免疫エフェクター細胞動員抗体は、ｓｃＦｖである。いくつかの実施形態において、標的化抗体（例えば、非免疫細胞エフェクター抗体）は、ＩｇＧであり、そして免疫エフェクター細胞動員抗体はｓｃＦｖである。いくつかの実施形態において、免疫エフェクター細胞は白血球である。いくつかの実施形態において、免疫エフェクター細胞は、Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、免疫エフェクター細胞は、ＮＫ細胞である。いくつかの実施形態において、免疫エフェクター細胞は骨髄単核細胞である。
いくつかの実施形態において、本開示のＴ細胞動員多重特異的活性化可能抗体は、標的化抗体又はその抗原結合フラグメント、及びＴ細胞動員抗体又はその抗原結合部分を含み、ここで標的化抗体又はその抗原結合フラグメント、及び/又はＴ細胞動員抗体又はその抗原結合部分の少なくとも１つはマスキングされている。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞動員抗体又はその抗原結合フラグメントは、第１Ｔ細胞動員標的を結合する、第１抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ１）を含み、ここで前記ＡＢ１はマスキング部分（ＭＭ１）に結合され、結果的に、前記ＭＭ１のカップリングは、前記第１標的を結合するＡＢ１の能力を低める。いくつかの実施形態において、標的化抗体又はその抗原結合フラグメントは、第２標的を結合する、第２抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ２）を含み、ここで前記ＡＢ２はマスキング部分（ＭＭ２）に結合され、結果的に、ＭＭ２のカップリングは、第２標的を結合するＡＢ２の能力を低める。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞動員抗体又はその抗原結合フラグメントは、第１Ｔ細胞動員標的を結合する、第１抗体又はその抗原フラグメント（ＡＢ１）を含み、ここで前記ＡＢ１はマスキング部分（ＭＭ１）に結合され、結果的にＭＭ１のカップリングは、第１標的を結合するＡＢ１の能力を低め、そして前記標的化抗体又はその抗原結合フラグメントは、第２標的を結合する、第２抗体又は抗原結合フラグメント（ＡＢ２）を含み、ここで前記ＡＢ２は、マスキング成分（ＭＭ２）に結合され、結果的に、ＭＭ２のカップリングは、第２標的を結合するＡＢ２の能力を低める。
いくつかの実施形態において、Ｔ細胞動員多重特異的活性化可能抗体は、癌標的化抗体又はその抗原結合フラグメント、及びＴ細胞動員抗体又はその抗原結合部分を含み、ここで癌標的化抗体又はその抗原結合フラグメント、及び/又はＴ細胞動員抗体又はその抗原結合部分の少なくとも１つはマスキングされている。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞動員抗体又はその抗原結合フラグメントは、第１Ｔ細胞動員標的を結合する、第１抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ１）を含み、ここで前記ＡＢ１はマスキング部分（ＭＭ１）に結合され、結果的に、前記ＭＭ１のカップリングは、前記第１標的を結合するＡＢ１の能力を低める。いくつかの実施形態において、癌標的化抗体又はその抗原結合フラグメントは、第２標的を結合する、第２抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ２）を含み、ここで前記ＡＢ２はマスキング部分（ＭＭ２）に結合され、結果的に、ＭＭ２のカップリングは、第２癌関連標的を結合するＡＢ２の能力を低める。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞動員抗体又はその抗原結合フラグメントは、第１Ｔ細胞動員標的を結合する、第１抗体又はその抗原フラグメント（ＡＢ１）を含み、ここで前記ＡＢ１はマスキング部分（ＭＭ１）に結合され、結果的にＭＭ１のカップリングは、第１標的を結合するＡＢ１の能力を低め、そして前記癌標的化抗体又はその抗原結合フラグメントは、第２癌関連標的を結合する、第２抗体又は抗原結合フラグメント（ＡＢ２）を含み、ここで前記ＡＢ２は、マスキング成分（ＭＭ２）に結合され、結果的に、ＭＭ２のカップリングは、第２癌関連標的を結合するＡＢ２の能力を低める。
いくつかの実施形態において、Ｔ細胞動員多重特異的活性化可能抗体は、癌標的化ＩｇＧ抗体又はその抗原結合フラグメント、及びＴ細胞動員ｓｃＦｖを含み、ここで癌標的化ＩｇＧ抗体又はその抗原結合フラグメント、及び/又はＴ細胞動員抗体又はその抗原結合部分の少なくとも１つはマスキングされている。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞動員抗体又はその抗原結合フラグメントは、第１Ｔ細胞動員標的を結合する、第１抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ１）を含み、ここで前記ＡＢ１はマスキング部分（ＭＭ１）に結合され、結果的に、前記ＭＭ１のカップリングは、前記第１標的を結合するＡＢ１の能力を低める。いくつかの実施形態において、癌標的化ＩｇＧ抗体又はその抗原結合フラグメントは、第２標的を結合する、第２抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ２）を含み、ここで前記ＡＢ２はマスキング部分（ＭＭ２）に結合され、結果的に、ＭＭ２のカップリングは、第２癌関連標的を結合するＡＢ２の能力を低める。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞動員抗体又はその抗原結合フラグメントは、第１Ｔ細胞動員標的を結合する、第１抗体又はその抗原フラグメント（ＡＢ１）を含み、ここで前記ＡＢ１はマスキング部分（ＭＭ１）に結合され、結果的にＭＭ１のカップリングは、第１標的を結合するＡＢ１の能力を低め、そして前記癌標的化ＩｇＧ抗体又はその抗原結合フラグメントは、第２癌関連標的を結合する、第２抗体又は抗原結合フラグメント（ＡＢ２）を含み、ここで前記ＡＢ２は、マスキング成分（ＭＭ２）に結合され、結果的に、ＭＭ２のカップリングは、第２癌関連標的を結合するＡＢ２の能力を低める。
免疫エフェクター動員多重特異的活性化可能抗体のいくつかの実施形態において、１つの抗原は典型的には、腫瘍細胞、又は疾患に関連する他の細胞型の表面上に存在する抗原、例えば、表１に列挙されるに任意の標的、例えばＥＧＧＲ、ｅｒｂＢ２、ＥｐＣＡＭ、Ｊａｇｇｅｄ、ＰＤ−Ｌ１、Ｂ７Ｈ３又はＣＤ７１（トランスフェリン受容体）であるが、但しそれらだけには限定されず、そして別の抗原は典型的には、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、骨髄単核細胞、マクロファージ、及び／又は他の免疫エフェクター細胞の表面上に存在する刺激又は阻害受容体、例えばＢ７−Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１６ａ、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３２、ＣＤ５６、ＣＤ１３７、ＣＴＬＡ−４、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、ＩＣＯＳ、ＬＡＧ３、ＮＫＧ２Ｄ、ＯＸ４０、ＰＤ−１、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ３、又は ＶＩＳＴＡであるが、但しそれらだけには限定されない。いくつかの実施形態において、抗原は、Ｔ細胞又はＮＫ細胞の表面上に存在する刺激受容体であり；斯かる刺激受容体の例は、ＣＤ３、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ１３７ (又は４−１ＢＢとしても言及される)、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、ＩＣＯＳ、ＮＫＧ２Ｄ、及び ＯＸ４０を包含するが、但しそれらだけには制限されない。いくつかの実施形態において、抗原は、Ｔ細胞の表面上に存在する阻害受容体であり；斯かる阻害受容体の例は、ＢＴＬＡ、ＣＴＬＡ−４、ＬＡＧ３、ＰＤ−1、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ３及びＮＫ−発現ＫＩＲを包含するが、但しそれらだけには限定されない。Ｔ細胞表面抗原に対して特異的を与える抗体エフェクター細胞受容体、例えばＢ７−１、Ｂ７−２、Ｂ７Ｈ３、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２又はＴＮＦＳＦ９（但し、それらだけには限定されない）に結合する、リガンド又はリガンドドメインにより置換され得る。
本開示の１つの実施形態は、癌微小環境において活性化でき、そして抗体、例えば腫瘍標的及びアゴニスト抗体に向けられるＩｇＧ又はｓｃＦｖ、例えば活性化されたＴ細胞又はＮＫ細胞の表面上で発現される共刺激受容体に向けられるＩｇＧ又はｓｃＦｖを含む多重特異的活性化可能抗体であり、ここで前記癌標的抗体及び／又はアゴニスト抗体の少なくとも１つはマスキングされている。共刺激受容体の例は、ＣＤ２７、 ＣＤ１３７、 ＧＩＴＲ、 ＨＶＥＭ、 ＮＫＧ２Ｄ及びＯＸ４０を包含するが、但しそれらだけには限定されない。この実施形態において、多重特異的活性化可能抗体は、腫瘍関連プロテーゼにより活性化されると、任意の腫瘍抗原に応答するＴ細胞の活性を、それらの内因性Ｔ細胞抗原又はＮＫ−活性化受容体を介して増強するために、腫瘍依存性態様でＴ細胞又はＮＫ細胞発現共刺激受容体を効果的に架橋し、そして活性化するであろう。それらのＴ細胞又はＮＫ細胞共刺激受容体の活性化−依存性質は、それらの抗原特異的に関係なく、すべてのＴ細胞を活性化しないで、腫瘍特異的Ｔ細胞に、活性化された多重特異的活性化可能抗体の活性の焦点を当てている。１つの実施形態において、多重特異的活性化可能抗体の少なくとも共刺激受容体抗体、多重特異的活性化可能抗体において腫瘍標的指向抗体により認識される抗原をまた発現する組織に存在することができる自己反応性Ｔ細胞の活性化を防止するために、マスキングされているが、しかしそれらの活性は、共受容体の動員の欠如により制限されている。
本開示の１つの実施形態は、Ｔ細胞過剰刺激により特徴づけられる疾患、例えば自己免疫疾患又は炎症性疾患の微小環境（但し、それらだけには限定されない）において活性化できる多重特異的活性化可能抗体である。斯かる多重特異的活性化可能抗体は、抗体、例えば自己免疫炎症性疾患においてＴ細胞により標的化される組織において発現される表面抗原を含む標的に向けられたＩｇＧ又はｓｃＦｖ、及び抗体、例えばＴ細胞又はＮＫ細胞の表面上に発現される阻害受容体に向けられるＩｇＧ又はｓｃＦｖを含み、ここで疾患組織標的抗体及び／又はＴ細胞受容体抗体の少なくとも１つはマスキングされている。阻害受容体の例は、次のものを包含するが、但しそれらだけには限定されない：ＢＴＬＡ、ＣＴＬＡ−４、ＬＡＧ３、ＰＤ−1、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ３及びＮＫ−発現ＫＩＲ。自己免疫疾患におけるＴ細胞により標的化される組織抗原の例は、次のものを包含するが、但しそれらだけには制限されない：多発生硬化症におけるミエリン又は神経細胞上に発現される表面抗原、又は１型糖尿病における膵島細胞上に発現される表面抗原。この実施形態において、多重特異的活性化可能抗体は、自己免疫攻撃又は炎症下で組織に局在する場合、活性化され、そして任意の疾患組織−標的化抗原に応答する自己反応性Ｔ細胞の活性を抑制するために、Ｔ細胞又はＮＫ細胞阻害受容体を、それらの内因性ＴＣＲ又は活性化受容体を介して共同動員する。１つの実施形態において、少なくとも１つの又は複数の抗体が、標的抗原がまた発現され得る非疾患組織におけるＴ細胞応答の抑制を防ぐために、マスキングされる。
いくつかの実施形態において、Ｔ細胞動員多重特異的活性化可能抗体は、抗−ＣＤ３イプシロン（ＣＤ３ε、またＣＤ３ｅ及びＣＤ３としても本明細書において言及される）ｓｃＦｖ及び標的化抗体又はその抗原結合フラグメントを含み、ここで抗−ＣＤ３εｓｃＦｖ及び／又は標的化抗体又はその抗原結合フラグメントの少なくとも１つはマスキングされている。いくつかの実施形態において、前記ＣＤ３ε ｓｃＦｖは、ＣＤ３εを結合する、第１抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ１）を含み、ここで前記ＡＢ１はマスキング部分（ＭＭ１）に結合され、結果的に、ＭＭ１のカップリングは、ＣＤ３εを結合するＡＢ１の能力を低める。いくつかの実施形態において、前記標的化抗体又はその抗原結合フラグメントは、第２標的を結合する、第２抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ２）を含む、第２抗体又はそのフラグメントを含み、ここで前記ＡＢ２はマスキング部分（ＭＭ２）に結合され、結果的に、ＭＭ２のカップリングが前記第２標的を結合するＡＢ２の能力を低める。いくつかの実施形態において、前記ＣＤ３ε ｓｃＦｖは、ＣＤ３εを結合する、第１抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ１）を含み、ここで前記ＡＢ１はマスキング部分（ＭＭ１）に結合され、結果的に、ＭＭ１のカップリングは、ＣＤ３εを結合するＡＢ１の能力を低め、そして前記標的化抗体又はその抗原結合フラグメントは、第２標的を結合する、第２抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ２）を含む、第２抗体又はそのフラグメントを含み、ここで前記ＡＢ２はマスキング部分（ＭＭ２）に結合され、結果的に、ＭＭ２のカップリングが前記第２標的を結合するＡＢ２の能力を低める。
いくつかの実施形態において、Ｔ細胞動員多重特異的活性化可能抗体は、抗−ＣＤ３ε ｓｃＦｖ及び癌標的化抗体又はその抗原結合フラグメントを含み、ここで抗−ＣＤ３εｓｃＦｖ及び／又は癌標的化抗体又はその抗原結合フラグメントの少なくとも１つはマスキングされている。いくつかの実施形態において、前記ＣＤ３ε ｓｃＦｖは、ＣＤ３εを結合する、第１抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ１）を含み、ここで前記ＡＢ１はマスキング部分（ＭＭ１）に結合され、結果的に、ＭＭ１のカップリングは、ＣＤ３εを結合するＡＢ１の能力を低める。いくつかの実施形態において、前記癌標的化抗体又はその抗原結合フラグメントは、第２の癌関連標的を結合する、第２抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ２）を含む、第２抗体又はそのフラグメントを含み、ここで前記ＡＢ２はマスキング部分（ＭＭ２）に結合され、結果的に、ＭＭ２のカップリングが前記第２癌関連標的を結合するＡＢ２の能力を低める。いくつかの実施形態において、前記ＣＤ３ε ｓｃＦｖは、ＣＤ３εを結合する、第１抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ１）を含み、ここで前記ＡＢ１はマスキング部分（ＭＭ１）に結合され、結果的に、ＭＭ１のカップリングは、ＣＤ３εを結合するＡＢ１の能力を低め、そして前記癌標的化抗体又はその抗原結合フラグメントは、第２癌関連標的を結合する、第２抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ２）を含む、第２抗体又はそのフラグメントを含み、ここで前記ＡＢ２はマスキング部分（ＭＭ２）に結合され、結果的に、ＭＭ２のカップリングが前記第２癌関連標的を結合するＡＢ２の能力を低める。
いくつかの実施形態において、Ｔ細胞動員多重特異的活性化可能抗体は、抗−ＣＤ３ε ｓｃＦｖ及び癌標的化ＩｇＧ抗体又はその抗原結合フラグメントを含み、ここで抗−ＣＤ３εｓｃＦｖ及び／又は癌標的化ＩｇＧ抗体又はその抗原結合フラグメントの少なくとも１つはマスキングされている。いくつかの実施形態において、前記ＣＤ３ε ｓｃＦｖは、ＣＤ３εを結合する、第１抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ１）を含み、ここで前記ＡＢ１はマスキング部分（ＭＭ１）に結合され、結果的に、ＭＭ１のカップリングは、ＣＤ３εを結合するＡＢ１の能力を低める。いくつかの実施形態において、前記癌標的化ＩｇＧ抗体又はその抗原結合フラグメントは、第２の癌関連標的を結合する、第２抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ２）を含む、第２抗体又はそのフラグメントを含み、ここで前記ＡＢ２はマスキング部分（ＭＭ２）に結合され、結果的に、ＭＭ２のカップリングが前記第２癌関連標的を結合するＡＢ２の能力を低める。いくつかの実施形態において、前記ＣＤ３ε ｓｃＦｖは、ＣＤ３εを結合する、第１抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ１）を含み、ここで前記ＡＢ１はマスキング部分（ＭＭ１）に結合され、結果的に、ＭＭ１のカップリングは、ＣＤ３εを結合するＡＢ１の能力を低め、そして前記癌標的化ＩｇＧ抗体又はその抗原結合フラグメントは、第２癌関連標的を結合する、第２抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ２）を含む、第２抗体又はそのフラグメントを含み、ここで前記ＡＢ２はマスキング部分（ＭＭ２）に結合され、結果的に、ＭＭ２のカップリングが前記第２癌関連標的を結合するＡＢ２の能力を低める。
いくつかの実施形態においてＴ細胞動員多重特異的活性化可能抗体は、ＯＫＴ３由来の抗−ＣＤ３イプシロン（ＣＤ３ε）ｓｃＦｖを含み、ここで標的抗体又はその抗原結合フラグメント及び／又はＯＫＴ３ ｓｃＦｖ又はＯＫＴ３−由来のｓｃＦｖの少なくとも１つがマスキングされている。いくつかの実施形態において、前記ＯＫＴ３ ｓｃＦｖ又はＯＫＴ３−由来のｓｃＦｖは、ＣＤ３εを結合する、第１抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ１）を含み、ここで前記ＡＢ１はマスキング部分（ＭＭ１）に結合され、結果的に、ＭＭ１のカップリングは、ＣＤ３εを結合するＡＢ１の能力を低める。いくつかの実施形態において、前記標的化抗体又はその抗原結合フラグメントは、第２標的を結合する、第２抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ２）を含む、第２抗体又はそのフラグメントを含み、ここで前記ＡＢ２はマスキング部分（ＭＭ２）に結合され、結果的に、ＭＭ２のカップリングが前記第２標的を結合するＡＢ２の能力を低める。いくつかの実施形態において、前記ＯＫＴ３ ｓｃＦｖ又はＯＫＴ３−由来のｓｃＦｖは、ＣＤ３εを結合する、第１抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ１）を含み、ここで前記ＡＢ１はマスキング部分（ＭＭ１）に結合され、結果的に、ＭＭ１のカップリングは、ＣＤ３εを結合するＡＢ１の能力を低め、そして前記標的化抗体又はその抗原結合フラグメントは、第２標的を結合する、第２抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ２）を含む、第２抗体又はそのフラグメントを含み、ここで前記ＡＢ２はマスキング部分（ＭＭ２）に結合され、結果的に、ＭＭ２のカップリングが前記第２標的を結合するＡＢ２の能力を低める。
いくつかの実施形態において、Ｔ細胞動員多重特異的活性化可能抗体は、ＯＫＴ３ ｓｃＦｖ又はＯＫＴ３−由来のｓｃＦｖ及び癌標的化抗体又はその抗原結合フラグメントを含み、ここでＯＫＴ３ ｓｃＦｖ又はＯＫＴ３−由来のｓｃＦｖ及び／又は癌標的化抗体又はその抗原結合フラグメントの少なくとも１つはマスキングされている。いくつかの実施形態において、前記ＯＫＴ３ ｓｃＦｖ又はＯＫＴ３−由来のｓｃＦｖは、ＣＤ３εを結合する、第１抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ１）を含み、ここで前記ＡＢ１はマスキング部分（ＭＭ１）に結合され、結果的に、ＭＭ１のカップリングは、ＣＤ３εを結合するＡＢ１の能力を低める。いくつかの実施形態において、前記癌標的化抗体又はその抗原結合フラグメントは、第２の癌関連標的を結合する、第２抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ２）を含む、第２抗体又はそのフラグメントを含み、ここで前記ＡＢ２はマスキング部分（ＭＭ２）に結合され、結果的に、ＭＭ２のカップリングが前記第２癌関連標的を結合するＡＢ２の能力を低める。いくつかの実施形態において、前記ＯＫＴ３ ｓｃＦｖ又はＯＫＴ３−由来のｓｃＦｖは、ＣＤ３εを結合する、第１抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ１）を含み、ここで前記ＡＢ１はマスキング部分（ＭＭ１）に結合され、結果的に、ＭＭ１のカップリングは、ＣＤ３εを結合するＡＢ１の能力を低め、そして前記癌標的化抗体又はその抗原結合フラグメントは、第２癌関連標的を結合する、第２抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ２）を含む、第２抗体又はそのフラグメントを含み、ここで前記ＡＢ２はマスキング部分（ＭＭ２）に結合され、結果的に、ＭＭ２のカップリングが前記第２癌関連標的を結合するＡＢ２の能力を低める。
いくつかの実施形態において、Ｔ細胞動員多重特異的活性化可能抗体は、ＯＫＴ３ ｓｃＦｖ又はＯＫＴ３−由来のｓｃＦｖ及び癌標的化ＩｇＧ抗体又はその抗原結合フラグメントを含み、ここでＯＫＴ３ ｓｃＦｖ又はＯＫＴ３−由来のｓｃＦｖ及び／又は癌標的化ＩｇＧ抗体又はその抗原結合フラグメントの少なくとも１つはマスキングされている。いくつかの実施形態において、前記ＯＫＴ３ ｓｃＦｖ又はＯＫＴ３−由来のｓｃＦｖは、ＣＤ３εを結合する、第１抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ１）を含み、ここで前記ＡＢ１はマスキング部分（ＭＭ１）に結合され、結果的に、ＭＭ１のカップリングは、ＣＤ３εを結合するＡＢ１の能力を低める。いくつかの実施形態において、前記癌標的化ＩｇＧ抗体又はその抗原結合フラグメントは、第２の癌関連標的を結合する、第２抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ２）を含む、第２抗体又はそのフラグメントを含み、ここで前記ＡＢ２はマスキング部分（ＭＭ２）に結合され、結果的に、ＭＭ２のカップリングが前記第２癌関連標的を結合するＡＢ２の能力を低める。いくつかの実施形態において、前記ＯＫＴ３ ｓｃＦｖ又はＯＫＴ３−由来のｓｃＦｖは、ＣＤ３εを結合する、第１抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ１）を含み、ここで前記ＡＢ１はマスキング部分（ＭＭ１）に結合され、結果的に、ＭＭ１のカップリングは、ＣＤ３εを結合するＡＢ１の能力を低め、そして前記癌標的化ＩｇＧ抗体又はその抗原結合フラグメントは、第２癌関連標的を結合する、第２抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ２）を含む、第２抗体又はそのフラグメントを含み、ここで前記ＡＢ２はマスキング部分（ＭＭ２）に結合され、結果的に、ＭＭ２のカップリングが前記第２癌関連標的を結合するＡＢ２の能力を低める。
いくつかの実施形態においてＴ細胞動員多重特異的活性化可能抗体は、抗−ＣＴＬＡ−４ ｓｃＦｖを含み、ここで標的抗体又はその抗原結合フラグメント及び／又は抗−ＣＴＬＡ−４ ｓｃＦｖの少なくとも１つがマスキングされている。いくつかの実施形態において、前記抗−ＣＴＬＡ−４ ｓｃＦｖは、ＣＴＬＡ−４を結合する、第１抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ１）を含み、ここで前記ＡＢ１はマスキング部分（ＭＭ１）に結合され、結果的に、ＭＭ１のカップリングは、ＣＴＬＡ−４を結合するＡＢ１の能力を低める。いくつかの実施形態において、前記標的化抗体又はその抗原結合フラグメントは、第２標的を結合する、第２抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ２）を含む、第２抗体又はそのフラグメントを含み、ここで前記ＡＢ２はマスキング部分（ＭＭ２）に結合され、結果的に、ＭＭ２のカップリングが前記第２標的を結合するＡＢ２の能力を低める。いくつかの実施形態において、前記抗−ＣＴＬＡ−４ ｓｃＦｖは、ＣＴＬＡ−４を結合する、第１抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ１）を含み、ここで前記ＡＢ１はマスキング部分（ＭＭ１）に結合され、結果的に、ＭＭ１のカップリングは、ＣＴＬＡ−４を結合するＡＢ１の能力を低め、そして前記標的化抗体又はその抗原結合フラグメントは、第２標的を結合する、第２抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ２）を含む、第２抗体又はそのフラグメントを含み、ここで前記ＡＢ２はマスキング部分（ＭＭ２）に結合され、結果的に、ＭＭ２のカップリングが前記第２標的を結合するＡＢ２の能力を低める。
いくつかの実施形態において、Ｔ細胞動員多重特異的活性化可能抗体は、抗−ＣＴＬＡ−４ ｓｃＦｖ、及び標的化ＩｇＧ抗体又はその抗原結合フラグメントを含み、ここで抗−ＣＴＬＡ−４ ｓｃＦｖ及び／又は標的ＩｇＧ抗体又はその抗原結合部分の少なく１つはマスキングされている。いくつかの実施形態において、前記抗−ＣＴＬＡ−４ ｓｃＦｖは、ＣＴＬＡ−４を結合する、第１抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ１）を含み、ここで前記ＡＢ１はマスキング部分（ＭＭ１）に結合され、結果的に、ＭＭ１のカップリングは、ＣＴＬＡ−４を結合するＡＢ１の能力を低める。いくつかの実施形態において、前記標的化ＩｇＧ抗体又はその抗原結合フラグメントは、第２標的を結合する、第２抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ２）を含む、第２抗体又はそのフラグメントを含み、ここで前記ＡＢ２はマスキング部分（ＭＭ２）に結合され、結果的に、ＭＭ２のカップリングが前記第２標的を結合するＡＢ２の能力を低める。いくつかの実施形態において、前記抗−ＣＴＬＡ−４ ｓｃＦｖは、ＣＴＬＡ−４を結合する、第１抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ１）を含み、ここで前記ＡＢ１はマスキング部分（ＭＭ１）に結合され、結果的に、ＭＭ１のカップリングは、ＣＴＬＡ−４を結合するＡＢ１の能力を低め、そして前記標的化ＩｇＧ抗体又はその抗原結合フラグメントは、第２標的を結合する、第２抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ２）を含む、第２抗体又はそのフラグメントを含み、ここで前記ＡＢ２はマスキング部分（ＭＭ２）に結合され、結果的に、ＭＭ２のカップリングが前記第２標的を結合するＡＢ２の能力を低める。
いくつかの実施形態において、多重抗原標的化抗体及び／又は多重抗原標的化活性化可能抗体は、第１標的及び／又は第１エピトープを結合する、第１抗体又はその抗原結合フラグメント、及び第２標的及び／又は第２エピトープを結合する、第２抗体又はその抗原結合フラグメントを少なくとも含む。いくつかの実施形態において、多重抗原標的化抗体及び／又は多重抗原標的化活性化可能抗体は、複数の異なった標的を結合する。いくつかの実施形態において、多重抗原標的化抗体及び／又は多重抗原標的化活性化可能抗体は、同じ標的上の複数の異なったエピトープを結合する。いくつかの実施形態において、多重抗原標的化抗体及び／又は多重抗原標的化活性化可能抗体は、複数の異なった標的及び同じ標的上の複数の異なったエピトープの組合せを結合する。
いくつかの実施形態において、ＩｇＧを含む多重特異的活性化可能抗体は、マスキングされたＩｇＧ可能ドメインを有する。いくつかの実施形態において、ｓｃＦｖを含む多重特異的活性化可能抗体は、マスキングされたｓｃＦｖドメインを有する。いくつかの実施形態において、多重特異的活性化可能抗体は、ＩｇＧ可変ドメイン及びｓｃＦｖドメインの両者を有し、ここでＩｇＧ可変ドメインの少なくとも１つは、マスキングのブ部にカップリングされる。いくつかの実施形態において、多重特異的活性化可能抗体は、ＩｇＧ可変ドメイン及びｓｃＦｖドメインの両者を有し、ここでｓｃＦｖドメインの少なくとも１つはマスキング部分にカップリングされる。いくつかの実施形態において、多重特異的活性化可能抗体は、ＩｇＧ可変ドメイン及びｓｃＦｖドメインの両者を有し、ここでＩｇＧ可変ドメインの少なくとも１つは、マスキング部分にカップリングされ、そしてｓｃＦｖドメインの少なくとも１つはマスキング部分にカップリングされる。いくつかの実施形態において、多重特異的活性化可能抗体は、ＩｇＧ可変ドメイン及びｓｃＦｖドメインの両者を有し、ここでＩｇＧ可変ドメイン及びｓｃＦｖドメインの個々は、それ自体のマスキング部分にカップリングされる。いくつかの実施形態において、多重特異的活性化可能抗体の１つの抗体ドメインは、標的抗原に対する特異的を有し、そして別の抗体ドメインは、Ｔ細胞表面抗原に対する特異的を有する。いくつかの実施形態において、多重特異的活性化可能抗体の１つの抗体ドメインは、標的抗原に対する特異的を有し、そして別の抗体ドメインは、別の標的抗原に対する特異的を有する。いくつかの実施形態において、多重特異的活性化可能抗体の１つの抗体ドメインは、標的抗原のエピトープに対する特異的を有し、そして別の抗体ドメインは、標的抗原の別のエピトープに対する特異的を有する。
多重特異的活性化可能抗体においては、ｓｃＦｖは、ＩｇＧ活性可能抗体のＨ鎖のカルボキシル末端に、ＩｇＧ活性化可能抗体のＬ鎖のカルボキシル末端、又はＩｇＧ活性化可能抗体のＨ鎖及びＬ鎖の両鎖のカルボキシル末端に融合され得る。多重特異的活性化可能抗体においては、ｓｃＦｖは、ＩｇＧ活性化可能抗体のＨ鎖のアミノ末端に、ＩｇＧ活性化可能抗体のＬ鎖のアミノ末端に、又はＩｇＧ活性化可能抗体のＨ鎖及びＬ鎖の両鎖のアミノ末端に融合され得る。多重特異的活性化可能抗体においては、ｓｃＦｖは、ＩｇＧ活性可能性抗体の１又は２以上のカルボキシル末端及び１又は２以上のアミノ末端のいずれかの組合せに融合され得る。いくつかの実施形態において、切断可能胃部分（ＣＭ）に連結されるマスキング部分（ＭＭ）は、ＩｇＧの抗原結合ドメインに結合され、そしてそのドメインをマスキングする。いくつかの実施形態において、切断可能部分（ＣＭ）に連結されるマスキング部分（ＭＭ）は、少なくとも１つのｓｃＦｖの抗原結合ドメインに結合され、そしてそのドメインをマスキングする。いくつかの実施形態において、切断可能部分（ＣＭ）に連結されるマスキング部分（ＭＭ）は、ＩｇＧの抗原結合ドメインに連結され、そしてそのドメインをマスキングし、そして切断可能部分（ＣＭ）に連結されるマスキング部分（ＭＭ）は、少なくとも１つのｓｃＦｖの抗原結合ドメインに結合され、そしてそのドメインをマスキングする。
本開示は、以下のもの（但し、それらだけには限定されない）を含む多重特異的活性化可能抗体構造の例を提供し：
(VL-CL)2:(VH-CH1-CH2-CH3-L4-VH*-L3-VL*-L2-CM-L1-MM)2; (VL-CL)2:(VH-CH1-CH2-CH3-L4-VL*-L3-VH*-L2-CM-L1-MM)2; (MM-L1-CM-L2-VL-CL)2:(VH-CH1-CH2-CH3-L4-VH*-L3-VL*)2; (MM-L1-CM-L2-VL-CL)2:(VH-CH1-CH2-CH3-L4-VL*-L3-VH*)2; (VL-CL)2:(MM-L1-CM-L2-VL*-L3-VH*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL)2:(MM-L1-CM-L2-VH*-L3-VL*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (MM-L1-CM-L2-VL-CL)2:(VL*-L3-VH*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (MM-L1-CM-L2-VL-CL)2:(VH*-L3-VL*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VH*-L3-VL*-L2-CM-L1-MM)2:(VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VL*-L3-VH*-L2-CM-L1-MM)2:(VH-CH1-CH2-CH3)2; (MM-L1-CM-L2-VL*-L3-VH*-L4-VL-CL)2:(VH-CH1-CH2-CH3)2; (MM-L1-CM-L2-VH*-L3-VL*-L4-VL-CL)2:(VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VH*-L3-VL*-L2-CM-L1-MM)2: (MM-L1-CM-L2-VL*-L3-VH*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VH*-L3-VL*-L2-CM-L1-MM)2: (MM-L1-CM-L2-VH*-L3-VL*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VL*-L3-VH*-L2-CM-L1-MM)2: (MM-L1-CM-L2-VL*-L3-VH*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VL*-L3-VH*-L2-CM-L1-MM)2: (MM-L1-CM-L2-VH*-L3-VL*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VH*-L3-VL*)2: (MM-L1-CM-L2-VL*-L3-VH*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VH*-L3-VL*)2: (MM-L1-CM-L2-VH*-L3-VL*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VL*-L3-VH*)2: (MM-L1-CM-L2-VL*-L3-VH*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VL*-L3-VH*)2: (MM-L1-CM-L2-VH*-L3-VL*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VH*-L3-VL*-L2-CM-L1-MM)2: (VL*-L3-VH*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VH*-L3-VL*-L2-CM-L1-MM)2: (VH*-L3-VL*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VL*-L3-VH*-L2-CM-L1-MM)2: (VL*-L3-VH*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2;又は (VL-CL-L4-VL*-L3-VH*-L2-CM-L1-MM)2: (VH*-L3-VL*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2、ここでＶＬ及びＶＨは、ＩｇＧに含まれる、第１特異的のＬ及びＨ可変ドメインを表し；ＶＬ*及びＶＨ*は、ｓｃＦｖに含まれる、第２特異的の可変ドメインを表し；Ｌ１は、マスキング部分（ＭＭ）及び切断可能部分（ＣＭ）を連結するリンカーペプチドであり；Ｌ２は、切断可能部分（ＣＭ）及び抗体を連結するリンカーペプチドであり；Ｌ３は、ｓｃＦｖの可変ドメインを連結するリンカーペプチドであり；Ｌ４は、第２特異的の抗体に、第１特異的の抗体を有するリンカーペプチドであり；ＣＬは、Ｌ鎖不変ドメインであり；そしてＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３は、Ｈ鎖不変ドメインである。前記第１及び第２特異的は、いずれかの抗原又はエピトープに対して存在することができる。
Ｔ細胞動員多重特異的活性化可能抗体のいくつかの実施形態において、１つの抗原は典型的には、腫瘍細胞又は疾患に関連する他の細胞型の表面上に存在する抗原、例えば表１に列挙されるいずれかの標的（但し、それらだけには限定されない）、例えばＥＧＦＲ、ｅｒｂＢ２、ＥｐＣＡＭ、Ｊａｇｇｅｄ、ＰＤ−Ｌ１、Ｂ７Ｈ３又は ＣＤ７１（トランスフェリン受容体）（但し、それらだけには制限されない）であり、そして別の抗原は典型的には、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、骨髄単核細胞、マクロファージ及び／又は他の免疫エフェクター細胞の表面上に存在する刺激（また、本明細書においては、活性化として言及される）又は阻害受容体、たとえばＢ７−Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１６ａ、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３２、ＣＤ５６、ＣＤ１３７（または、TNFRSF9としても言及される）、ＣＴＬＡ−４、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、ＩＣＯＳ、ＬＡＧ３、ＮＫＧ２Ｄ、ＯＸ４０、ＰＤ−１、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ３、又は ＶＩＳＴＡ（但し、それらだけには制限されない）である。Ｔ細胞表面抗原に対して特異的を提供する抗体ドメインはまた、Ｔ細胞受容体、ＮＫ−細胞受容体、マクロファージ受容体及び／又は他の免疫エフェクター細胞受容体、例えばＢ７−１、 Ｂ７−２、Ｂ７Ｈ３、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２又はＴＮＦＳＦ９（但し、それらだけには制限されない）に結合するリガンド又はリガンドドメインにより置換され得る。多重抗原標的化活性化可能抗原のいくつかの実施形態において、１つの抗原は、表１に列挙される標的群から選択され、そして別の抗原は、表１に列挙される標的群から選択される。
いくつかの実施形態において、標的化抗原は、抗−ＥＧＦＲ抗体である。いくつかの実施形態において、標的化抗体は、ＥＧＦＲへの結合に対して特異的であるＣ２２５ｖ５である。いくつかの実施形態において、標的化抗体は、ＥＧＦＲへの結合に対して特異的であるＣ２２５である。いくつかの実施形態において、標的化抗体は、ＥＧＦＲへの結合に対して特異的であるＣ２２５ｖ４である。いくつかの実施形態において、標的化抗体は、ＥＧＦＲへの結合に対して特異的であるＣ２２５ｖ６である。いくつかの実施形態において、標的化抗体は、抗−Ｊａｇｇｅｄ抗体である。いくつかの実施形態において、標的化抗体は、ヒト及びマウスＪａｇｇｅｄ１及びＪａｇｇｅｄ２への結合に対して特異的である４Ｄ１１である。いくつかの実施形態において、標的化抗体は、ヒト及びマウスＪａｇｇｅｄ１及びＪａｇｇｅｄ２への結合に対して特異的である４Ｄ１１ｖ２である。
いくつかの実施形態において、標的化抗体は、活性化可能抗体の形で存在することができる。いくつかの実施形態において、ｓｃＦｖは、プロ−ｓｃＦｖの形で存在することができる（例えば、国際公開第２００９／０２５８４６号、国際公開第２０１０／０８１１７３号を参照のこと）。
いくつかの実施形態において、ｓｃＦｖは、ＣＤ３εの結合に対して特異的であり、そしてＣＤ３ε、例えばＣＨ２５２７、ＦＮ１８、Ｈ２Ｃ、ＯＫＴ３、２Ｃ１１、ＵＣＨＴ１又はＶ９を結合する、抗体又はそのフラグメントであるか、又はそれに由来する。いくつかの実施形態において、ｓｃＦｖは、ＣＴＬＡ−４（また、本明細書においては、ＣＴＬＡ及びＣＴＬＡ４としても言及される）の結合に対して特異的である。
いくつかの実施形態において、抗ＣＴＬＡ‐４ ｓｃＦｖは、以下のアミノ酸配列を含んでいる：
GGGSGGGGSGSGGGSGGGGSGGGEIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPLTFGGGTKVEIKRSGGSTITSYNVYYTKLSSSGTQVQLVQTGGGVVQPGRSLRLSCAASGSTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCATNSLYWYFDLWGRGTLVTVSSAS （配列番号６９２）
いくつかの実施形態において、抗ＣＴＬＡ‐４ ｓｃＦｖは、配列番号６９２のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上同一であるアミノ酸配列を含んでいる。
いくつかの実施形態において、抗ＣＤ３ε ｓｃＦｖは、以下のアミノ酸配列を含んでいる：
GGGSGGGGSGSGGGSGGGGSGGGQVQLQQSGAELARPGASVKMSCKASGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPAHFRGSGSGTSYSLTISGMEAEDAATYYCQQWSSNPFTFGSGTKLEINR （配列番号６９３）
いくつかの実施形態において、抗ＣＤ３ε ｓｃＦｖは、配列番号６９３のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上同一のアミノ酸配列を含んでいる。
いくつかの実施形態において、ｓｃＦｖは、１又は２以下のＴ細胞、１又は２以上のＮＫ−細胞及び／又は１又は２以上のマクロファージの結合に対して特異的である。いくつかの実施形態において、ｓｃＦｖは、Ｂ７−Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１６ａ、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３２、ＣＤ５６、ＣＤ１３７、ＣＴＬＡ−４、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、ＩＣＯＳ、ＬＡＧ３、ＮＫＧ２Ｄ、ＯＸ４０、ＰＤ−１、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ３、又はＶＩＳＴＡから成る群から選択される標的の結合に対して特異的である。
いくつかの実施形態において、多重特異的活性化可能抗体はまた、ＡＢに接合される剤も含む。いくつかの実施形態において、前記剤は、抗腫瘍である。いくつかの実施形態において、前記剤は、毒素又はその断片である。いくつかの実施形態において、剤はリンカーを介して多重特異的活性化可能抗体に結合される。いくつかの実施形態において、剤は切断可能なリンカーを介してＡＢに結合される。いくつかの実施形態において、剤は少なくとも１つのｕＰＡ切断可能基質配列又は少なくとも１つのマトリプターゼ切断可能基質配列を含んでいるリンカーを介してＡＢに結合される。いくつかの実施形態において、前記リンカーは、非切断性リンカーである。いくつかの実施形態において、前記剤は微小管阻害剤である。いくつかの実施形態において、前記剤は、核酸損傷剤、例えばＤＮＡアルキル化剤、又はＤＮＡインターカレーター、又は他のＤＮＡ損傷剤である。いくつかの実施形態において、前記リンカーは、切断可能リンカーである。いくつかの実施形態において、前記剤は、表４に列挙される群から選択される剤である。いくつかの実施形態において、前記剤は、トラスタチンである。いくつかの実施形態において、前記剤は、アウリスタチン又はその誘導体である。いくつかの実施形態において、前記剤は、アウリスタチンＥ又はその誘導体である。いくつかの実施形態において、前記剤は、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）である。いくつかの実施形態において、前記剤は、モノメチルアウリスタチンＤ（ＭＭＡＤ）である。いくつかの実施形態において、前記剤は、メイタンシノイド又はマイタンシノイド誘導体である。いくつかの実施形態において、前記剤は、ＤＭ１又はＤＭ４である。いくつかの実施形態において、前記剤は、デュオカルマイシン又はその誘導体である。いくつかの実施形態において、前記剤は、カリケアマイシン又はその誘導体である。いくつかの実施形態において前記剤は、ピロロベンゾジアゼピンである。
いくつかの実施形態において、多重特異的活性化可能抗体はまた、検出可能部分も含むことができる。いくつかの実施形態において、前記検出可能部分は、診断剤である。
いくつかの実施形態において、多重特異的活性化可能抗体は、天然において、１又は２以上のジスルフィド結合を含む。いくつかの実施形態において、多重特異的活性化可能抗体は、１又は２以上のジスルフィド結合を含むよう操作され得る。
本開示はまた、本明細書に記載される多重特異的活性化可能抗体をコードする単離核酸分子、及びそれらの単離核酸配列を含むベクターを提供する。本開示は、活性化可能抗体の発現を導く条件下で、斯かる核酸分子を含む細胞を培養するこによる、多重特異的活性化可能抗体の生成方法を提供する。いくつかの実施形態において、前記細胞は、斯かるベクターを含む。
本開示はまた、本開示の多重特異的活性化可能抗体を製造する方法であって、（ａ）多重特異的活性化可能抗体の発現につながる条件下、多重特異的活性化可能抗体をコードする核酸構築物を含む細胞を培養し、そして（ｂ）多重特異的活性化可能抗体を回収することによる方法も提供する。
本開示はまた、第１標的又は第１エピトープを特異的に結合する、第１抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ１）、及び第２標的又は第２エピトープを結合する、第２抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ２）を少なくとも含む多重特異的活性化可能抗体組成物も提供し、ここで少なくともＡＢ１がマスキング部分（ＭＭ１）にカップリングされるか、又は他方では、結合され、結果的に、ＭＭ１のカップリングが、ＡＢ１のその標的を結合する能力を低める。いくつかの実施形態において、ＭＭ１は、プロテアーゼ、例えば対象における治療部位又は診断部位でＡＢ１の標的と共局在するプロテアーゼのための基質を含む第１切断可能部分（ＣＭ１）配列を介してＡＢ１にカップリングされる。本明細書において提供される多重特異的活性化可能抗体は、循環において安定し、治療及び／又は診断の意図される部位で活性化されるが、しかし正常、すなわち健康組織において活性化されず、そして活性化される場合、その対応する修飾されていない多重特異的抗体に少なくとも匹敵するＡＢ１の標的への結合を示す。
いくつかの実施形態において、多重特異的活性化可能抗体は、ＭＭ１とＣＭ１との間に連結ペプチドを含む。
いくつかの実施形態において、多重特異的活性化可能抗体は、ＣＭ１とＡＢ１との間に連結ペプチドを含む。
いくつかの実施形態において、活性化可能抗体は、第１連結ペプチド（ＬＰ１）及び第２連結ペプチド（ＬＰ２）を含み、そして多重特異的活性化可能抗体の少なくとも一部が、切断されていない状態で次のようなＮ−末端からＣ−末端への構造配置を有する：ＭＭ１−ＬＰ１−ＣＭ１−ＬＰ２−ＡＢ１又はＡＢ１−ＬＰ２−ＣＭ１−ＬＰ１−ＭＭ１。いくつかの実施形態において、前記２つの連結ペプチドはお互い同一である必要はない。
いくつかの実施形態において、ＬＰ１又はＬＰ２の少なくとも１つは、（ＧＳ）n、（ＧＧＳ）n、（ＧＳＧＧＳ）n (配列番号３８５) 及び（ＧＧＧＳ）n (配列番号３８６)（ｎは少なくとも１つの整数である）から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＬＰ１又はＬＰ２の少なくとも１つは、ＧＧＳＧ (配列番号３８７)、ＧＧＳＧＧ (配列番号３８８)、ＧＳＧＳＧ (配列番号３８９)、ＧＳＧＧＧ (配列番号３９０)、ＧＧＧＳＧ (配列番号３９１)、 及び ＧＳＳＳＧ (配列番号３９２)から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、多重特異的活性化可能抗体は、第１標的又は第１エピトープを特異的に結合する、第１抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ１）、及び第２標的又は第２エピトープを特異的に結合する、第２抗体又はその抗体結合フラグメント（ＡＢ２）を少なくとも含む。いくつかの実施形態において、多重特異的活性化可能抗体における各ＡＢは、モノクローナル抗体、ドメイン、抗体、一本鎖、Ｆaｂフラグメント、Ｆ（ａb’)2フラグメント、ｓｃＦｖ、ｓｃＡｂ，ｄＡｂ、単一ドメインＨ鎖抗体、及び単一ドメインＬ鎖抗体から成る群から独立して選択される。いくつかの実施形態において、多重特異的活性化可能抗体における各ＡＢは、齧歯類（例えば、マウス又はラット）、キメラ性、ヒト化又は完全ヒトモノクローナル抗体である。
いくつかの実施形態において、多重特異的活性化可能抗体における各ＡＢは、その対応する標的又はエピトープに結合するために、約１００ｎＭ又はそれ以下の平衡解離定数を有する。
いくつかの実施形態において、ＭＭ１は、ＡＢのその対応する標的又はエピトープへの結合のための平衡解離定数よりも高い、その対応するＡＢへの結合のための平衡解離定数を有する。
いくつかの実施形態において、ＭＭ１は、ＡＢのその対応する標的又はエピトープへの結合のための平衡解離定数に過ぎない、その対応するＡＢへの結合のための平衡解離定数を有する。
いくつかの実施形態において、ＭＭ１は、多重特異的活性化可能抗体が切断された状態で存在する場合、その対応する標的又はエピトープに結合するために、その対応するＡＢを阻止しないか、又はそれと競争しない。
いくつかの実施形態において、ＭＭ１は、約２〜４０個の長さのアミノ酸のポリペプチドである。いくつかの実施形態において、多重特異的活性化可能抗体における各ＭＭは、４０個以下の長さのアミノ酸のポリペプチドである。
いくつかの実施形態において、ＭＭ１は、その対応するＡＢの標的の配列とは異なるポリペプチド配列を有する。
いくつかの実施形態において、ＭＭ１は、その対応するＡＢの任意の天然結合パートナーに対して５０％以下、同一であるポリペプチド配列を有する。いくつかの実施形態において、ＭＭ１は、その対応するＡＢの任意の天然結合パートナーに対して２５％以下、同一であるポリペプチド配列を有する。いくつかの実施形態において、ＭＭ１は、その対応するＡＢの任意の天然結合パートナーに対して１０％以下、同一であるポリペプチド配列を有する。
いくつかの実施形態において、ＭＭ１のカップリングは、その対応するＡＢのその標的又はエピトープへの結合の能力を低め、結果的に、その対応する標的又はエピトープに向かってＭＭ１にカップリングされる場合、ＡＢの解離定数（Ｋｄ）は、その対応する標的又はエピトープに向かってＭＭ１にカップリングされない場合のＡＢのＫｄよりも少なくとも２０倍、高い。
いくつかの実施形態において、ＭＭ１のカップリングは、その対応するＡＢのその標的又はエピトープへの結合の能力を低め、結果的に、その対応する標的又はエピトープに向かってＭＭ１にカップリングされる場合、ＡＢの解離定数（Ｋｄ）は、その対応する標的又はエピトープに向かってＭＭ１にカップリングされない場合のＡＢのＫｄよりも少なくとも４０倍、高い。
いくつかの実施形態において、ＭＭ１のカップリングは、その対応するＡＢのその標的又はエピトープへの結合の能力を低め、結果的に、その対応する標的又はエピトープに向かってＭＭ１にカップリングされる場合、ＡＢの解離定数（Ｋｄ）は、その対応する標的又はエピトープに向かってＭＭ１にカップリングされない場合のＡＢのＫｄよりも少なくとも１００倍、高い。
いくつかの実施形態において、ＭＭ１のカップリングは、その対応するＡＢのその標的又はエピトープへの結合の能力を低め、結果的に、その対応する標的又はエピトープに向かってＭＭ１にカップリングされる場合、ＡＢの解離定数（Ｋｄ）は、その対応する標的又はエピトープに向かってＭＭ１にカップリングされない場合のＡＢのＫｄよりも少なくとも１０００倍、高い。
いくつかの実施形態において、ＭＭ１のカップリングは、その対応するＡＢのその標的又はエピトープへの結合の能力を低め、結果的に、その対応する標的又はエピトープに向かってＭＭ１にカップリングされる場合、ＡＢの解離定数（Ｋｄ）は、その対応する標的又はエピトープに向かってＭＭ１にカップリングされない場合のＡＢのＫｄよりも少なくとも１０，０００倍、高い。
いくつかの実施形態において、ＭＭ１は、本明細書中に提示した実施例に示したＭＭから選択されるアミノ酸配列である。
いくつかの実施形態において、多重特異的活性化可能抗体は、その多重特異的活性化可能抗体が切断されていない状態にある場合、ＡＢ２のその標的への結合を阻害する、第２マスキング部分（ＭＭ２）、及び第２プロテアーゼのための基質として機能する、ＡＢ２にカップリングされる第２切断可能部分（ＣＭ２）を少なくとも含む。いくつかの実施形態において、ＣＭ２は、長さが１５アミノ酸以下のポリペプチドである。いくつかの実施形態において、前記第２プロテアーゼは、組織において第２標的又はエピトープと共局在し、そして第２プロテアーゼは、多重特異的活性化可能抗体が第２プロテアーゼに暴露される場合、多重特異的活性化可能抗体におけるＣＭ２を切断する。いくつかの実施形態において、第１プロテアーゼ及び第２プロテアーゼは、組織において、第１標的又はエピトープ及び第２標的又はエピトープと共局在する。いくつかの実施形態において、第１プロテアーゼ及び第２プロテアーゼは、同じプロテアーゼである。いくつかの実施形態において、ＣＭ１及びＣＭ２は、同じプロテアーゼのための異なった基質である。いくつかの実施形態において、プロテアーゼは、表７に示されるそれらから成る群から選択される。いくつかの実施形態において、第１プロテアーゼ及び第２プロテアーゼは、異なったプロテアーゼである。いくつかの実施形態において、第１プロテアーゼ及び第２プロテアーゼは、表７に示されるそれらから成る群から選択される異なったプロテアーゼである。
いくつかの実施形態において、多重特異的活性化可能抗体における各ＭＭ、例えばＭＭ１及び少なくともＭＭ２は、ＡＢのその対応する標的又はエピトープに結合するための平衡解離定数よりも高い、その対応するＡＢに結合するための平衡解離定数を有する。
いくつかの実施形態において、多重特異的活性化可能抗体における各ＭＭ、例えばＭＭ１及び少なくともＭＭ２は、ＡＢのその対応する標的又はエピトープに結合するための平衡解離定数以下である、その対応するＡＢに結合するための平衡解離定数を有する。
いくつかの実施形態において、多重特異的活性化可能抗体における各ＭＭは、多重特異的活性化可能抗体が切断された状態にある場合、対応する標的又はエピトープに結合するためにその対応するＡＢを妨げないか、又はそれと競争しない。
いくつかの実施形態において、多重特異的活性化可能抗体における各ＭＭは、約２−４０個の長さのアミノ酸のポリペプチドである。いくつかの実施形態において、多重特異的活性化可能抗体における各ＭＭは４０個以下の長さのアミノ酸のポリペプチドである。
いくつかの実施形態において、多重特異的活性化可能抗体における各ＭＭは、対応するＡＢの標的の配列とは異なるポリペプチド配列を有する。
いくつかの実施形態において、多重特異的活性化可能抗体における各ＭＭは、その対応するＡＢの任意の天然の結合パートナーに対して５０％同一に過ぎないポリペプチド配列を有する。いくつかの実施形態において、多重特異的活性化可能抗体における各ＭＭは、その対応するＡＢの任意の天然の結合パートナーに対して２５％同一に過ぎないポリペプチド配列を有する。いくつかの実施形態において、多重特異的活性化可能抗体における各ＭＭは、その対応するＡＢの任意の天然の結合パートナーに対して１０％同一に過ぎないポリペプチド配列を有する。
いくつかの実施形態において、各ＭＭのカップリングは、その対応するＡＢのその標的又はエピトープを結合する能力を低め、結果的に、その対応する標的又はエピトープに向かってＭＭにカップリングされる場合、ＡＢの解離定数（Ｋｄ）は、その対応する標的又はエピトープに向かってＭＭにカップされない場合のＡＢのＫｄよりも少なくとも２０倍、高い。
いくつかの実施形態において、各ＭＭのカップリングは、その対応するＡＢのその標的又はエピトープを結合する能力を低め、結果的に、その対応する標的又はエピトープに向かってＭＭにカップリングされる場合、ＡＢの解離定数（Ｋｄ）は、その対応する標的又はエピトープに向かってＭＭにカップされない場合のＡＢのＫｄよりも少なくとも４０倍、高い。
いくつかの実施形態において、各ＭＭのカップリングは、その対応するＡＢのその標的又はエピトープを結合する能力を低め、結果的に、その対応する標的又はエピトープに向かってＭＭにカップリングされる場合、ＡＢの解離定数（Ｋｄ）は、その対応する標的又はエピトープに向かってＭＭにカップされない場合のＡＢのＫｄよりも少なくとも１００倍、高い。
いくつかの実施形態において、各ＭＭのカップリングは、その対応するＡＢのその標的又はエピトープを結合する能力を低め、結果的に、その対応する標的又はエピトープに向かってＭＭにカップリングされる場合、ＡＢの解離定数（Ｋｄ）は、その対応する標的又はエピトープに向かってＭＭにカップされない場合のＡＢのＫｄよりも少なくとも１０００倍、高い。
いくつかの実施形態において、各ＭＭのカップリングは、その対応するＡＢのその標的又はエピトープを結合する能力を低め、結果的に、その対応する標的又はエピトープに向かってＭＭにカップリングされる場合、ＡＢの解離定数（Ｋｄ）は、その対応する標的又はエピトープに向かってＭＭにカップされない場合のＡＢのＫｄよりも少なくとも１０，０００倍、高い。
いくつかの実施形態において、各ＭＭは、本明細書に開示した実施例に示されるＭＭから選択されるアミノ酸配列である。
いくつかの実施形態において、ＣＭ１及び／又はＣＭ２のうちの少なくとも１つが、ｕＰＡ及びマトリプターゼから選択される少なくとも１つのプロテアーゼによって切断される。いくつかの実施形態において、ＣＭ１及び／又はＣＭ２のうちの少なくとも１つが、８Ａ〜８Ｊに示すコアＣＭコンセンサス配列、表８Ａ〜８Ｊに示すコアＣＭコンセンサス配列の亜属、表８Ａ〜８Ｊに示すコアＣＭコンセンサス配列のうちの１つに基づく拡張コンセンサス配列から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、拡張コンセンサス配列は、表９Ａ〜９Ｊ‐３に示すコンセンサス配列、表１０Ａ〜１０Ｄに示すコアＣＭコンセンサス配列、表１０Ａ〜１０Ｄに示すコアＣＭコンセンサス配列の亜属、及び表１１Ａ〜１１Ｄに示すコンセンサス配列である。
いくつかの実施形態において、ＣＭ１及び／又はＣＭ２のうちの少なくとも１つは、配列番号１６３〜２６７から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、第１切断可能部分（ＣＭ１）配列を切断するプロテアーゼは、組織において多重特異的活性化可能抗体におけるＡＢ１の標的と共局在し、そしてプロテアーゼは、多重特異的活性化可能抗体がそのプロテアーゼに暴露される場合、多重特異的活性化可能抗体におけるＣＭ１を切断する。
いくつかの実施形態において、多重特異的活性化可能抗体は、複数の切断可能部分配列を含み、そして少なくとも１つの切断可能部分配列を切断するプロテアーゼは、組織において多重特異的活性化可能抗体におけるＡＢ領域の少なくとも１つの領域の標的と共局在され、そしてプロテアーゼは、多重特異的活性化可能抗体がプロテアーゼに暴露される場合、多重特異的活性化可能抗体におけるＣＭを切断する。
いくつかの実施形態において、各ＣＭ、例えばＣＭ１及び少なくともＣＭ２は、多重特異的活性化可能抗体に位置し、結果的に、切断されていない状態下で、ＡＢ領域中の１つの領域の標的への多重特異的活性化可能抗体の結合が、その標的に結合する修飾されていないＡＢの平衡解離定数よりも少なくとも２倍、高い平衡解離定数を伴って生じるよう低められ、そしてところが、切断された状態下で、ＡＢはその標的を結合する。
いくつかの実施形態において、各ＣＭ、例えばＣＭ１及び少なくともＣＭ２は、多重特異的活性化可能抗体に位置し、結果的に、切断されていない状態下で、ＡＢ領域中の１つの領域の標的への多重特異的活性化可能抗体の結合が、その標的に結合する修飾されていないＡＢの平衡解離定数よりも少なくとも３倍、高い平衡解離定数を伴って生じるよう低められ、そしてところが、切断された状態下で、ＡＢはその標的を結合する。
いくつかの実施形態において、各ＣＭ、例えばＣＭ１及び少なくともＣＭ２は、多重特異的活性化可能抗体に位置し、結果的に、切断されていない状態下で、ＡＢ領域中の１つの領域の標的への多重特異的活性化可能抗体の結合が、その標的に結合する修飾されていないＡＢの平衡解離定数よりも少なくとも４倍、高い平衡解離定数を伴って生じるよう低められ、そしてところが、切断された状態下で、ＡＢはその標的を結合する。
いくつかの実施形態において、各ＣＭ、例えばＣＭ１及び少なくともＣＭ２は、多重特異的活性化可能抗体に位置し、結果的に、切断されていない状態下で、ＡＢ領域中の１つの領域の標的への多重特異的活性化可能抗体の結合が、その標的に結合する修飾されていないＡＢの平衡解離定数よりも少なくとも５倍、高い平衡解離定数を伴って生じるよう低められ、そしてところが、切断された状態下で、ＡＢはその標的を結合する。
いくつかの実施形態において、各ＣＭ、例えばＣＭ１及び少なくともＣＭ２は、多重特異的活性化可能抗体に位置し、結果的に、切断されていない状態下で、ＡＢ領域中の１つの領域の標的への多重特異的活性化可能抗体の結合が、その標的に結合する修飾されていないＡＢの平衡解離定数よりも少なくとも１０倍、高い平衡解離定数を伴って生じるよう低められ、そしてところが、切断された状態下で、ＡＢはその標的を結合する。
いくつかの実施形態において、各ＣＭ、例えばＣＭ１及び少なくともＣＭ２は、多重特異的活性化可能抗体に位置し、結果的に、切断されていない状態下で、ＡＢ領域中の１つの領域の標的への多重特異的活性化可能抗体の結合が、その標的に結合する修飾されていないＡＢの平衡解離定数よりも少なくとも２０倍、高い平衡解離定数を伴って生じるよう低められ、そしてところが、切断された状態下で、ＡＢはその標的を結合する。
いくつかの実施形態において、各ＣＭ、例えばＣＭ１及び少なくともＣＭ２は、多重特異的活性化可能抗体に位置し、結果的に、切断されていない状態下で、ＡＢ領域中の１つの領域の標的への多重特異的活性化可能抗体の結合が、その標的に結合する修飾されていないＡＢの平衡解離定数よりも少なくとも４０倍、高い平衡解離定数を伴って生じるよう低められ、そしてところが、切断された状態下で、ＡＢはその標的を結合する。
いくつかの実施形態において、各ＣＭ、例えばＣＭ１及び少なくともＣＭ２は、多重特異的活性化可能抗体に位置し、結果的に、切断されていない状態下で、ＡＢ領域中の１つの領域の標的への多重特異的活性化可能抗体の結合が、その標的に結合する修飾されていないＡＢの平衡解離定数よりも少なくとも５０倍、高い平衡解離定数を伴って生じるよう低められ、そしてところが、切断された状態下で、ＡＢはその標的を結合する。
いくつかの実施形態において、各ＣＭ、例えばＣＭ１及び少なくともＣＭ２は、多重特異的活性化可能抗体に位置し、結果的に、切断されていない状態下で、ＡＢ領域中の１つの領域の標的への多重特異的活性化可能抗体の結合が、その標的に結合する修飾されていないＡＢの平衡解離定数よりも少なくとも１００倍、高い平衡解離定数を伴って生じるよう低められ、そしてところが、切断された状態下で、ＡＢはその標的を結合する。
いくつかの実施形態において、各ＣＭ、例えばＣＭ１及び少なくともＣＭ２は、多重特異的活性化可能抗体に位置し、結果的に、切断されていない状態下で、ＡＢ領域中の１つの領域の標的への多重特異的活性化可能抗体の結合が、その標的に結合する修飾されていないＡＢの平衡解離定数よりも少なくとも２００倍、高い平衡解離定数を伴って生じるよう低められ、そしてところが、切断された状態下で、ＡＢはその標的を結合する。
いくつかの実施形態において、多重特異的活性化可能抗体における各ＣＭは、長さが最大１５アミノ酸のポリペプチドである。
いくつかの実施形態において、多重特異的活性化可能抗体の少なくとも一方のＣＭが、配列番号１６３〜２６７から成る群から選択されるアミノ酸配列を含んでいて、そして、もう片方のＣＭが、アミノ酸配列ＬＳＧＲＳＤＮＨ（配列番号４０６）を含んでいる。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのＣＭが、アミノ酸配列ＬＳＧＲＳＤＮＨ（配列番号４０６）を含んでいる。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの切断可能部分が、特異的プロテアーゼ、例えば多重特異的活性化可能抗体の少なくとも１つの標的との共局在が知られているプロテアーゼとの使用のために選択される。例えば、本開示の多重特異的活性化可能抗体における使用のための好適な切断可能部分は、少なくともウロキナーゼ、レグミン、及び／又はマトリプターゼ（本明細書中ではＭＴ‐ＳＰ１又はＭＴＳＰ１とも呼ばれる）などのプロテアーゼによって切断される。いくつかの実施形態において、好適な切断可能部分は、配列番号１６３〜２６７から成る群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を含んでいる。
いくつかの実施形態において、多重特異的活性化可能抗体内の一方のＣＭがｕＰＡ及びマトリプターゼから選択される少なくとも１つのプロテアーゼのための基質であり、もう片方のＣＭが、表７に示されるそれらから成る群から選択されるプロテアーゼのための基質である。いくつかの実施形態において、プロテアーゼは、ｕＰＡ、レグミン、マトリプターゼ、ＡＤＡＭ１７、ＢＭＰ−１、ＴＭＰＲＳＳ３、ＴＭＰＲＳＳ４、好中球エラスターゼ、ＭＭＰ−７、ＭＭＰ−９、ＭＭＰ−１２、ＭＭＰ−１３及びＭＭＰ−１４から成る群から選択される。プロテアーゼは、カテプシン、例えば、カテプシンＳであるが、但しそれだけには限定されない。いくつかの実施形態において、多重特異的活性化可能抗体における各ＣＭは、uＰＡ（ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子）、レグミン及びマトリプターゼから成る群から選択されるプロテアーゼのための基質である。いくつかの実施形態において、プロテアーゼは、ｕＰＡを包含する。いくつかの実施形態において、プロテアーゼはレグミンを包含する。いくつかの実施形態において、プロテアーゼは、マトリプターゼを包含する。
いくつかの実施形態において、多重特異的活性化可能抗体中の少なくとも１つのＣＭは、少なくとも２つのプロテアーゼのための基質である。いくつかの実施形態において、多重特異的活性化可能抗体中の少なくとも１つのＣＭは、少なくとも２つのプロテアーゼのための基質であり、ここでプロテアーゼの１つは、ｕＰＡ及びマトリプターゼから成る群から選択され、そして他のプロテアーゼは、表７に示されるそれらから成る群から選択される。いくつかの実施形態において、多重特異的活性化可能抗体中の少なくとも１つのＣＭは、ｕＰＡ、レグミン及びマトリプターゼから成る群から選択され少なくとも２種のプロテアーゼのための基質である。
いくつかの実施形態において、多重特異的活性化可能抗体は、第１ＣＭ（ＣＭ１）及び第２ＣＭ（ＣＭ２）を少なくとも含む。いくつかの実施形態において、ＣＭ１及びＣＭ２は、ＭＭをＡＢに連結する単一の切断可能リンカーの一部である。いくつかの実施形態において、ＣＭ１は、ＭＭ１をＡＢ１に連結する切断可能リンカーの一部であり、そしてＣＭ２は、ＭＭ２をＡＢ２に連結する別の切断可能リンカーの一部である。いくつかの実施形態において、多重特異的活性化可能抗体は、２以上のＣＭを含む。いくつかの実施形態において、斯かる多重特異的活性化可能抗体は、２つ以上のＣＭ及び２つ以上のＭＭを含む。いくつかの実施形態において、ＣＭ１及びＣＭ２は、それぞれ、１５個以下の長さのアミノ酸のポリペプチドである。いくつかの実施形態において、第１ＣＭ及び第２ＣＭの少なくとも１つは、表７に列挙されるそれらから成る群から選択されるプロテアーゼのための基質として機能するポリペプチドである。いくつかの実施形態において、第１ＣＭ及び第２ＣＭの少なくとも１つは、ｕＰＡ、レグミン及びマトリプターゼから成る群から選択されるプロテアーゼのための基質としても機能するポリペプチドである。いくつかの実施形態において、第１ＣＭは、標的組織において、ｕＰＡ、レグミン及びマトリプターゼから成る群から選択される第１切断剤により切断され、そして第２ＣＭは、標的組織において、第２切断剤により切断される。いくつかの実施形態において、他のプロテアーゼは、表７に示されるそれらから成る群から選択される。いくつかの実施形態において、第１切断剤及び第２切断剤は、表７に列挙されるそれらから成る群から選択される同じプロテアーゼであり、そして第１ＣＭ及び第２ＣＭは、酵素のための異なった基質である。いくつかの実施形態において、第１切断剤及び第２切断剤は、ｕＰＡ、レグミン及びマトリプターゼから成る群から選択される同じプロテアーゼであり、そして第１ＣＭ及び第２ＣＭは、酵素のための異なった基質である。いくつかの実施形態において、第１切断剤及び第２切断剤は、表７に列挙される群から選択される同じプロテアーゼであり、そして第１ＣＭ及び第２ＣＭは同じ基質である。いくつかの実施形態において、第１切断剤及び第２切断剤は、異なったプロテアーゼである。いくつかの実施形態において、第１切断剤及び第２切断剤は、表７に示されるそれらから成る群から選択される異なったプロテアーゼである。いくつかの実施形態において、第１切断剤及び第２切断剤は、標的組織において共局在される。いくつかの実施形態において、第１ＣＭ及び第２ＣＭは、標的組織において少なくとも１つの切断剤により切断される。
いくつかの実施形態において、多重特異的活性化可能抗体は、プロテアーゼに暴露され、そして切断され、結果的に、活性化されたか又は切断された状態下で、活性化された多重特異的活性化可能抗体は、プロテアーゼがＣＭを切断した後、ＬＰ２及び／又はＣＭ配列の少なくとも１部を含むＬ鎖アミノ酸配列を含む。
本開示はまた、標的を特異的に結合する第１抗体又はフラグメント（ＡＢ１）、及び第２抗体又はフラグメント（ＡＢ２）を少なくとも含む多重特異的活性化可能抗体を包含する組成物及び方法も提供し、ここで少なくとも多重特異的活性化可能抗体における第１ＡＢは、ＡＢ１のその標的を結合する能力を低めるマスキング部分（ＭＭ１）にカップリングされている。いくつかの実施形態において、各ＡＢは、その対応するＡＢの各標的を結合する能力を低めるＭＭにカップリングされる。例えば多重特異的活性化可能抗体の実施形態において、ＡＢ１は、ＡＢ１のその標的を結合する能力を低める第１マスキング部分（ＭＭ１）にカップリングされ、そしてＡＢ２は、ＡＢ２のその標的を結合する能力を低める第２マスキング部分（ＭＭ２）にカップリングされる。いくつかの実施形態において、多重特異的活性化可能抗体は、２つ以上のＡＢ領域を含み；斯かる実施形態において、ＡＢ１は、ＡＢ１のその標的を結合する能力を低める第１マスキング部分（ＭＭ１）にカップリングされ、ＡＢ２は、ＡＢ２のその標的を結合する能力を低める第２マスキング部分（ＭＭ２）にカップリングされ、ＡＢ３は、ＡＢ３のその標的を結合する能力を低める第３マスキング部分（ＭＭ３）にカップリングされそして多重特異的活性化可能抗体における各ＡＢについても同様である。
いくつかの実施形態において、多重特異的活性化可能抗体は、プロテアーゼのための基質である少なくとも１つの切断可能部分（ＣＭ）をさらに含み、ここでＣＭはＭＭをＡＢに連結する。例えば、いくつかの実施形態において、多重特異的活性化可能抗体は、標的を特異的に結合する第１抗体又は抗体フラグメント（ＡＢ１）及び第２抗体又は抗体フラグメント（ＡＢ２）を少なくとも含み、多重特異的活性化可能抗体における少なくとも第１ＡＢは、ＡＢ１のその標的を結合する能力を低めるマスキング部分（ＭＭ１）に、切断可能部分（ＣＭ１）を介してカップリングされる。いくつかの多重特異的活性化可能抗体の実施形態において、ＡＢ１はＣＭ１を介してＭＭ１にカップリングされ、そしてＡＢ２は、ＡＢ２のその標的を結合する能力を低める第２マスキング部分（ＭＭ２）に、第２切断可能部分（ＣＭ２）を介してカップリングされる。いくつかの実施形態において、多重特異的活性化可能抗体は、２以上のＡＢ領域を含み；それらの実施形態のいくつかによれば、ＡＢ１はＣＭ１を介してＭＭ１にカップリングされ、ＡＢ２はＣＭ２を介してＭＭ２にカップリングされ、そしてＡＢ３は第３切断可能部分（ＣＭ３）を介して、ＡＢ３のその標的を結合する能力を低める第３マスキング部分（ＭＭ３）にカップリングされ、そして多重特異的活性化可能抗体における各ＡＢについても同様である。
非結合立体部分又は非結合立体部分のための結合パートナーを有する活性化可能抗体
本開示はまた、非結合立体部分（ＮＢ）又は非結合立体部分のための結合パートナー（ＢＰ）を含む活性化可能抗体も提供し、ここでＢＰは、活性化可能抗体に対するＮＢを、リクルートするか、又は他方では、誘引する。本明細書に提供される活性化可能抗体は、非結合立体部分（ＮＢ）、切断可能リンカー（ＣＬ）、及び標的を結合する抗体又は抗体フラグメント（ＡＢ）を含む活性化可能抗体；非結合立体部分（ＢＰ）のための結合パートナー（ＢＰ）、ＣＬ及びＡＢを含む活性化可能抗体；及びＮＢがリクルートされているＢＰ、ＣＬ、及び標的を結合するＡＢを含む活性化可能抗体を包含する。ＮＢが活性化可能抗体のＣＬ及びＡＢに共有結合されるか、又は活性化可能抗体のＣＬ及びＡＢに共有結合されるＢＰとの相互作用により結合される活性化可能抗体は、「ＮＢ含有活性化可能抗体」として本明細書においては言及される。活性化可能又は切り替え可能とは、活性化可能抗体は、活性化可能抗体が、阻害された、マスキングされた又は切断されていない状態（すなわち、第１コンホメーション）下にある場合、標的への第１レベルの結合、及び活性化可能抗体が、阻害されていない、マスキングされていない及び／又は切断された状態（すなわち、第２コンホメーション、すなわち活性化された抗体）下にある場合、標的への第２レベルの結合を示すことを意味し、ここで標的結合の第２レベルは、標的結合の第１レベルよりも大きい。活性化可能組成物は、従来の抗体療法に比べて、高められた生物学的利用能、及びより好ましい生体内分布を示すことができる。
いくつかの実施形態において、活性化可能抗体は、ＡＢがマスキングされないか、又は他方では、非治療部位及び／又は非診断部位への結合から阻害されない場合、斯かる部位での結合に起因する、低められた毒性及び／又は有害な副作用を提供する。
１つの実施形態において、活性化可能抗体は、非結合立体部分（ＮＢ）；切断可能リンカー（ＣＬ）；及び標的に対して特異的に結合する抗体又は抗体フラグメント（ＡＢ）を含み、ここでＮＢはＡＢに対して特異的に結合しないポリペプチドであり；ＣＬは酵素のための基質を含むポリペプチドであり；ＣＬは、未切断状態で、ＮＢが標的へのＡＢの結合と干渉し、そして切断された状態で、ＮＢは標的へのＡＢの結合と干渉せず；そしてＮＢは酵素によるＣＬの切断を阻害しない。本明細書及び全体を通して使用される場合、用語、ポリペプチドはとは、少なくとも２個のアミノ酸残基を含むいずれかのポリペプチド、例えばより大きなポリペプチド、完全長タンパク質及びそれらのフラグメントを言及し、そして前記用語のポリペプチドは、単鎖ポリペプチドに制限されず、そして複数ユニット、例えば多鎖ポリペプチドを包含する。ポリペプチドが、より短い長さ、例えば合計５０個未満のアミノ酸のものである場合、用語ペプチド及びポリペプチドは、本明細書においては、交換可能的に使用され、そしてポリペプチドがより長い長さ、例えば５０個又はそれ以上の長さのアミノ酸のものである場合、用語ポリペプチド及びタンパク質は、本明細書においては、交換可能的に使用される。
１つの実施形態において、活性化可能抗体は、非結合立体部分（ＮＢ）；切断可能リンカー（ＣＬ）；及び標的に対して特異的に結合する抗体又は抗体フラグメント（ＡＢ）を含み、ここで（ｉ）ＮＢは、ＡＢに対して特異的に結合しないポリペプチドを含み；（ｉｉ）ＣＬは、酵素、例えばマトリプターゼ及びｕＰＡから選択されるプロテアーゼのための基質（Ｓ）を含む、５０個の長さまでのアミノ酸のポリペプチドであり；（ｉｉｉ）ＣＬは、未切断状態で、ＮＢが標的へのＡＢの結合と干渉し、そして切断された状態で、ＮＢが標的へのＡＢの結合と干渉しないよう位置決定され；そして（ｉｖ）ＮＢは酵素によるＣＬの切断を阻害しない。例えば、ＣＬは、１５個までの長さのアミノ酸、２０個までの長さのアミノ酸、２５個までの長さのアミノ酸、３０個までの長さのアミノ酸、３５個までの長さのアミノ酸、４０個までの長さのアミノ酸、４５個までの長さのアミノ酸、５０個までの長さのアミノ酸、１０〜５０個までの長さのアミノ酸、１５〜５０個までの長さのアミノ酸、２０〜５０個までの長さのアミノ酸、２５〜５０個までの長さのアミノ酸、３０〜５０個までの長さのアミノ酸、３５〜５０個までの長さのアミノ酸、４０〜５０個までの長さのアミノ酸、４５〜５０個までの長さのアミノ酸、１０〜４０個までの長さのアミノ酸、１５〜４０個までの長さのアミノ酸、２０〜４０個までの長さのアミノ酸、２５〜４０個までの長さのアミノ酸、３０〜４０個までの長さのアミノ酸、３５〜４０個までの長さのアミノ酸、１０〜３０個までの長さのアミノ酸、１５〜３０個までの長さのアミノ酸、２０〜３０個までの長さのアミノ酸、２５〜３０個までの長さのアミノ酸、１０〜２０個までの長さのアミノ酸、又は１０〜１５個までの長さのアミノ酸、を有する。
１つの実施形態において、活性化可能抗体は、非結合立体部分（ＮＢ）；切断可能リンカー（ＣＬ）；及び標的に対して特異的に結合する抗体又は抗体フラグメント（ＡＢ）を含み、ここで（ｉ）ＮＢは、ＡＢに対して特異的に結合しないポリペプチドを含み；（ｉｉ）ＣＬは、酵素、例えばマトリプターゼ及びｕＰＡから選択されるプロテアーゼのための基質（Ｓ）を含むポリペプチドであり；（ｉｉｉ）ＣＬは、未切断状態で、ＮＢが標的へのＡＢの結合と干渉し、そして切断された状態で、ＮＢが標的へのＡＢの結合と干渉しないよう位置決定され；そして（ｉｖ）ＮＢは酵素によるＣＬの切断を阻害せず；そして（ｖ）活性化可能抗体は、未切断状態で、次の通りに、Ｎ末端からＣ末端側への構造的配置を有する：ＮＢ−ＣＬ−ＡＢ又はＡＢ−ＣＬ−ＮＢ。
１つの実施形態において、活性化可能抗体は、非結合立体部分（ＮＢ）；切断可能リンカー（ＣＬ）；及び標的に対して特異的に結合する抗体又は抗体フラグメント（ＡＢ）を含み、ここで（ｉ）ＮＢは、ＡＢに対して特異的に結合しないポリペプチドを含み；（ｉｉ）ＣＬは、酵素、例えばマトリプターゼ及びｕＰＡから選択されるプロテアーゼのための基質（Ｓ）を含むポリペプチドであり；（ｉｉｉ）ＣＬは、未切断状態で、ＮＢが標的へのＡＢの結合と干渉し、そして切断された状態で、ＮＢが標的へのＡＢの結合と干渉しないよう位置決定され、そして未切断の活性化可能抗体下で、ＮＢは、標的を結合するＡＢの能力を、標的を結合する、切断されたＡＢの能力に比較して、少なくとも 50%、例えば、少なくとも 60%、少なくとも 70%、少なくとも 75%、少なくとも 80%、少なくとも 85%、少なくとも 90%、少なくとも 95%、少なくとも 96%、少なくとも 97%、少なくとも 98%、少なくとも 99%、少なくとも 100%、低め；そして（ｉｖ）ＮＢは、酵素によるＣＬの切断を阻害しない。標的を結合するＡＢの能力の低下は、例えば本明細書に記載されているアッセイ、又はインビトロ標的置換アッセイ、例えば国際公開第２００９／０２５８４６号及び第２０１０／０８１１７３号に記載されるアッセイを用いて、決定される。
１つの実施形態において、活性化可能抗体は、非結合立体部分（ＮＢ）のための結合パートナー（ＢＰ）；切断リンカー（ＣＬ）；及び標的に対して特異的に結合する抗体又は抗体フラグメント（ＡＢ）を含み、ここでＢＰは、ＮＢに供される場合、ＮＢに結合するポリペプチドであり；ＮＢはＡＢに対して特異的に結合せず；ＣＬは、酵素、例えばマトリプターゼ及びｕＰＡから選択されるプロテアーゼのための基質（Ｓ）を含むポリペプチドであり；ＣＬは、ＮＢの存在下で、未切断状態で、ＮＢが標的へのＡＢの結合と干渉し、そして切断された状態で、ＮＢが標的へのＡＢの結合と干渉せず、そしてＢＰは標的へのＡＢの結合と干渉するよう位置決定され；そしてＮＢ及びＢＰは、酵素によるＣＬの切断を阻害しない。この実施形態のいくつかの例によれば、活性化可能抗体のＢＰは任意には、ＮＢに結合される。１つの実施形態において、ＮＢはインビボで、活性化可能抗体のＢＰによりリクルートされる。
任意のこれらの活性化可能抗体の実施形態に関するいくつかの例において、活性化可能抗体は、組成物として処方される。いくつかのそれらの実施形態において、組成物はまた、ＮＢを含み、ここでＮＢは、ＢＰ、ＣＬ及びＡＢを含む活性化可能抗体と共に同時処方される。この実施形態のいくつかの例によれば、ＢＰは、アルブミン結合ペプチド、フィブリノゲン結合ペプチド、フィブロネクチン結合ペプチド，ヘモグロビン結合ペプチド、トランスフェリン結合ペプチド、免疫グロブリンドメイン結合ペプチド、及び他の血清タンパク質結合ペプチドから成る群から選択される。
任意のこれらの活性化可能抗体の実施形態に関するいくつかの例において、ＮＢは可溶性球状タンパク質である。任意のこれらの活性化可能抗体の実施形態に関するいくつかの例において、ＮＢは、血流において循環するタンパク質である。任意のこれらの活性化可能抗体の実施形態に関するいくつかの例において、ＮＢは、アルブミン、フィブリノゲン、フィブロネクチン、ヘモグロビン、トランスフェリン、免疫グロブリンドメイン、および他の血清タンパク質から成る群から選択される。
任意のこれらの活性化可能抗体の実施形態に関するいくつかの例において、ＣＬは、プロテアーゼのための基質（Ｓ）を含むポリペプチドである。任意のこれらの活性化可能抗体の実施形態に関するいくつかの例において、プロテアーゼは標的と共局在し、そしてプロテアーゼは、活性化可能抗体がプロテアーゼに供される場合、活性化可能抗体におけるＣＬを切断する。任意のこれらの活性化可能抗体の実施形態に関するいくつかの例において、ＣＬは、５０個までの長さのアミノ酸のポリペプチドである。抗体、ＣＬは、１５個までの長さのアミノ酸、例えば３個の長さのアミノ酸、４個の長さのアミノ酸、５個の長さのアミノ酸、６個の長さのアミノ酸、７個の長さのアミノ酸、８個の長さのアミノ酸、９個の長さのアミノ酸、１０個の長さのアミノ酸、１１個の長さのアミノ酸、１２個の長さのアミノ酸、１３個の長さのアミノ酸、又は１５個の長さのアミノ酸を有する、基質（Ｓ）を含むポリペプチドである。
任意のこれらの活性化可能抗体の実施形態に関するいくつかの例において、活性化可能抗体は、未切断状態で次の通りに、Ｎ末端からＣ末端側に構造配置を有する：ＮＢ−ＣＬ−ＡＢ、ＡＢ−ＣＬ−ＮＢ、ＢＰ−ＣＬ−ＡＢ又はＡＢ−ＣＬ−ＢＰ。活性化可能抗体がＢＰを含み、そして活性化可能抗体がその対応するＮＢの存在下で存在する実施形態において、活性化可能抗体は、未切断状態で次の通りに、Ｎ末端からＣ末端側に構造配置を有し：ＮＢ：ＢＰ−ＣＭ−ＡＢ又はＡＢ−ＣＭ−ＢＰ：ＮＢ、ここで「：」は、ＮＢとＢＰとの間の相互作用、例えば、結合を表す。
任意のこれらの活性化可能抗体の実施形態に関するいくつかの例において、活性化可能抗体は、標的を特異的に結合する、抗体又はその抗原結合フラグメントを含み、そしてモノクローナル抗体、ドメイン抗体、単鎖、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）2フラグメント、ｓｃＦｖ、ｓｃａｂ、ｄＡｂ、単一ドメインＨ鎖抗体及び単一ドメインＬ鎖抗体である。いくつかの実施形態において、標的を結合する斯かる抗体又はその免疫学的活性フラグメントは、マウス、他の齧歯動物、キメラ、ヒト適合化、又は完全ヒトモノクローナル抗体である。
任意のこれらの活性化可能抗体の実施形態に関するいくつかの例において、活性化可能抗体は、本明細書中に提示したアミノ酸配列を含む可変重鎖領域と本明細書中に提示したアミノ酸配列を含む可変軽鎖領域の組み合わせを含んでいる。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体は、本明細書中に提示したアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上同一のアミノ酸配列を含んでいる可変重鎖領域と、本明細書中に提示したアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上同一のアミノ酸配列を含んでいる可変軽鎖領域の組み合わせを含む。
任意のこれらの活性化可能抗体の実施形態に関するいくつかの例において、活性化可能抗体はまた、ＡＢに結合される剤も含む。いくつかの実施形態において、前記剤は治療剤である。いくつかの実施形態において、前記剤は抗腫瘍剤である。いくつかの実施形態において、前記剤は毒素又はその断片である。いくつかの実施形態において、前記剤は、リンカーを介してＡＢに結合される。いくつかの実施形態において、前記リンカーは、切断可能リンカーである。いくつかの実施形態において、前記剤は、非切断可能リンカーを介してＡＢに結合される。いくつかの実施形態において、前記剤は、表３に列挙される群から選択された剤である。いくつかの実施形態において、前記剤は微小管阻害剤である。いくつかの実施形態において、前記剤は、ＤＮＡアルキル化剤、ＤＮＡインターカレーター、又は他のＤＮＡ損傷剤などの核酸損傷剤である。いくつかの実施形態において、前記剤はドラスタチンである。いくつかの実施形態において、前記剤は、アウリスタチン又はその誘導体である。いくつかの実施形態において、前記剤は、アウリスタチンＥ又はその誘導体である。いくつかの実施形態において、前記剤はモノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）である。いくつかの実施形態において、剤はモノメチルアウリスタチンＤ（ＭＭＡＤ）である。いくつかの実施形態において、前記剤はマイタンシノイド又はマイタンシノイド誘導体である。いくつかの実施形態において、前記剤はＤＭ１又はＤＭ４である。いくつかの実施形態において、前記剤は、デュオカルマイシン又はその誘導体である。いくつかの実施形態において、前記剤は、カリケアマイシン又はその誘導体である。いくつかの実施形態において、剤はピロロベンゾジアゼピンである。
任意のこれらの活性化可能抗体の実施形態に関するいくつかの例において、活性化可能抗体はまた、検出可能成分も含む。いくつかの実施形態において、前記検出可能成分は、診断剤である。
任意のこれらの活性化可能抗体の実施形態に関するいくつかの例において、活性化可能抗体はまた、スペーサーも包含する。任意のこれらの活性化可能抗体の実施形態に関するいくつかの例において、活性化可能抗体はまた、シグナルペプチドも包含する。いくつかの実施形態において、シグナルペプチドは、スペーサーを介して活性化可能抗体に結合される。任意のこれらの活性化可能抗体の実施形態に関するいくつかの例において、スペーサーは、活性化可能抗体のＭＭに直接的に結合される。
いくつかの実施形態において、活性化可能抗体の血清中半減期は、対応する抗体の血清中半減期より長い；例えば、活性化可能抗体のｐＫは、対応する抗体のｐＫより長い。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体の血清中半減期は、対応する抗体の血清中半減期と同等である。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体の血清中半減期は、生物に投与される場合、少なくとも１５日である。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体の血清中半減期は、生物に投与される場合、少なくとも１２日である。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体の血清中半減期は、生物に投与される場合、少なくとも１１日である。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体の血清中半減期は、生物に投与される場合、少なくとも１０日である。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体の血清中半減期は、生物に投与される場合、少なくとも９日である。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体の血清中半減期は、生物に投与される場合、少なくとも８日である。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体の血清中半減期は、生物に投与される場合、少なくとも７日である。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体の血清中半減期は、生物に投与される場合、少なくとも６日である。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体の血清中半減期は、生物に投与される場合、少なくとも５日である。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体の血清中半減期は、生物に投与される場合、少なくとも４日である。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体の血清中半減期は、生物に投与される場合、少なくとも３日である。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体の血清中半減期は、生物に投与される場合、少なくとも２日である。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体の血清中半減期は、生物に投与される場合、少なくとも２４時間である。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体の血清中半減期は、生物に投与される場合、少なくとも２０時間である。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体の血清中半減期は、生物に投与される場合、少なくとも１８時間である。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体の血清中半減期は、生物に投与される場合、少なくとも１６時間である。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体の血清中半減期は、生物に投与される場合、少なくとも１４時間である。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体の血清中半減期は、生物に投与される場合、少なくとも１２時間である。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体の血清中半減期は、生物に投与される場合、少なくとも１０時間である。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体の血清中半減期は、生物に投与される場合、少なくとも８時間である。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体の血清中半減期は、生物に投与される場合、少なくとも６時間である。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体の血清中半減期は、生物に投与される場合、少なくとも４時間である。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体の血清中半減期は、生物に投与される場合、少なくとも３時間である。
本開示はまた、それらの活性化可能抗体をコードする単離された核酸分子、及びそれらの単離された核酸配列を含むベクターも提供する。本開示は、斯かる核酸配列を含む細胞を、活性化可能抗体の発現を導く条件下で培養することによる活性化可能抗体の生成方法を提供する。いくつかの実施形態において、細胞は、斯かるベクターを含む。
標的に対するＮＢ含有活性化可能抗体の解離定数（Ｋｄ）は、それがＮＢ又はＮＢ：ＢＰにより結合されない場合、標的に対するＡＢのＫｄよりも高い。標的に対するＮＢ含有活性化可能抗体の解離定数（Ｋｄ）は、標的に対するＡＢのＫｄよりも高い。標的に対するＮＢ含有活性化可能抗体の解離定数（Ｋｄ）は、標的に対する親ＡＢのＫｄよりも高い。例えば、標的に対するＮＢ含有活性化可能抗体のＫｄは、ＮＢ又はＮＢ：ＢＰにより結合されない場合のＡＢのＫｄ、又は標的に対する親ＡＢのＫｄよりも、少なくとも５、１０、２５、５０、１００、２５０、５００、１、０００、２、５００、５、０００、１０、０００、５０、０００、１００、０００、５００、０００、１、０００、０００、５、０００、０００、１０、０００、０００、５０、０００、０００又はそれ以上、又は５〜１０、１０〜１００、１０〜１、０００、１０〜１０、０００、１０〜１００、０００、１０〜１、０００、０００、１０〜１０、０００、０００、１００〜１、０００、１００〜１０、０００、１００〜１００、０００、１００〜１、０００、０００、１００〜１０、０００、０００、１、０００〜１０、０００、１、０００〜１００、０００、1、０００〜１、０００、０００、１０００〜１０、０００、０００、１０、０００〜１００、０００、１０、０００〜１、０００、０００、１０、０００〜１０、０００、０００、１００、０００〜１、０００、０００又は１００、０００〜１０、０００、０００倍、高い。逆に言えば、標的に対するＮＢ含有活性化可能抗体の結合親和性は、ＮＢ又はＮＢ：ＢＰにより結合されない場合のＡＢの結合親和性、又は標的に対する親ＡＢの結合親和性よりも、少なくとも５、１０、２５、５０、１００、２５０、５００、１、０００、２、５００、５、０００、１０、０００、５０、０００、１００、０００、５００、０００、１、０００、０００、５、０００、０００、１０、０００、０００、５０、０００、０００又はそれ以上、又は５〜１０、１０〜１００、１０〜１、０００、１０〜１０、０００、１０〜１００、０００、１０〜１、０００、０００、１０〜１０、０００、０００、１００〜１、０００、１００〜１０、０００、１００〜１００、０００、１００〜１、０００、０００、１００〜１０、０００、０００、１、０００〜１０、０００、１、０００〜１００、０００、1、０００〜１、０００、０００、１０００〜１０、０００、０００、１０、０００〜１００、０００、１０、０００〜１、０００、０００、１０、０００〜１０、０００、０００、１００、０００〜１、０００、０００又は１００、０００〜１０、０００、０００倍、低い。
ＮＢ含有活性化可能抗体が標的の存在下にある場合、標的へのＡＢの特異的結合は、ＮＢ又はＮＢ：ＢＰにより結合されない場合のＡＢの特異的結合に比較して、低められるか、又は阻害される。ＮＢ含有活性化可能抗体が標的の存在下にある場合、標的へのＡＢの特異的結合は、標的への親ＡＢの特異的結合に比較して、低められるか、又は阻害される。ＮＢ又はＮＢ：ＢＰに結合されないＡＢの結合、又は標的への親ＡＢの結合に比較される場合、標的を結合するＮＢ含有活性化可能抗体の能力は、インビボ又はインビトロアッセイにより測定される場合、少なくとも２、４、６、８、１２、２８、２４、３０、３６、４８、６０、７２、８４、又は ９６ 時間、又は５、１０、１５、３０、４５、６０、９０、１２０、１５０、または１８０ 日間、又は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、又は１２ か月間、又はそれ以上の間、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％ 及びさらに１００％、低められ得る。
ＮＢ含有活性化可能抗体が標的の存在下にある場合（但し、修飾剤（例えば、プロテアーゼ又は他の酵素）は不在である）、標的へのＡＢの特異的結合は、ＮＢ又はＮＢ：ＢＰにより結合されない場合のＡＢの特異的結合に比較して、低められるか、又は阻害される。ＮＢ含有活性化可能抗体が標的の存在下にある場合（但し、修飾剤（例えば、プロテアーゼ、他の酵素、還元剤又は光）は不在である）、標的へのＡＢの特異的結合は、標的への親ＡＢの特異的結合に比較して、低められるか、又は阻害される。ＮＢ又はＮＢ：ＢＰに結合されないＡＢの結合、又は標的への親ＡＢの結合に比較される場合、標的を結合するＮＢ含有活性化可能抗体の能力は、インビボ又はインビトロアッセイにより測定される場合、少なくとも２、４、６、８、１２、２８、２４、３０、３６、４８、６０、７２、８４、又は ９６ 時間、又は５、１０、１５、３０、４５、６０、９０、１２０、１５０、または１８０ 日間、又は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、又は１２ か月間、又はそれ以上の間、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％ 及びさらに１００％、低められ得る。
任意のこれらの活性化可能抗体の実施形態に関するいくつかの例において、活性化可能抗体は、活性化可能抗体結合体を生成するために、ＡＢに結合される剤を含む。任意のこれらの活性化可能抗体の実施形態に関するいくつかの例において、前記剤は治療剤である。いくつかの実施形態において、前記剤は診断剤である。いくつかの実施形態において、前記剤は検出可能マーカーである。活性化可能抗体結合体のいくつかの実施形態において、前記剤は抗腫瘍剤である。活性化可能抗体結合体のいくつかの実施形態において、前記剤は毒素又はその断片である。活性化可能抗体結合体のいくつかの実施形態において、前記剤は、リンカーを介してＡＢに結合される。活性化可能抗体結合体のいくつかの実施形態において、前記リンカーは、切断可能リンカーである。いくつかの実施形態において、前記剤は、切断不可能なリンカーを介してＡＢに結合される。いくつかの実施形態において、前記剤は微小管阻害剤である。いくつかの実施形態において、前記剤は、ＤＮＡアルキル化剤、ＤＮＡインターカレーター、又は他のＤＮＡ損傷剤などの核酸損傷剤である。いくつかの実施形態において、前記剤は、表３に列挙される群から選択された剤である。いくつかの実施形態において、前記剤はドラスタチンである。いくつかの実施形態において、前記剤は、アウリスタチン又はその誘導体である。いくつかの実施形態において、前記剤は、アウリスタチンＥ又はその誘導体である。いくつかの実施形態において、前記剤はモノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）である。いくつかの実施形態において、前記剤は、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）である。いくつかの実施形態において、前記剤はマイタンシノイド又はマイタンシノイド誘導体である。いくつかの実施形態において、前記剤はＤＭ１又はＤＭ４である。いくつかの実施形態において、前記剤は、デュオカルマイシン又はその誘導体である。いくつかの実施形態において、前記剤は、カリケアマイシン又はその誘導体である。いくつかの実施形態において、前記剤はピロロベンゾジアゼピンである。
任意のこれらの活性化可能抗体の実施形態に関するいくつかの例において、活性化可能抗体は、二重標的結合活性化可能抗体である。斯かる二重標的結合活性化可能抗体は、同じか又は異なった標的を結合できる２つのＡｂを含む。特定の実施形態において、二重標的活性化可能抗体は、二重特異的抗体又は抗体フラグメントを含む。
二重標的結合活性化可能抗体は、活性化可能抗体のＡＢに結合することができる標的の１つ又は両者と共に、標的組織において共局在する切断剤、例えばマトリプターゼ及びｕＰＡから選択されるプロテアーゼにより切断されるＣＬを有するよう企画される。同じか又は異なった標的に対する複数のＡＢを有する二重標的結合活性化可能抗体は、複数のＣＬを有するよう企画され得、ここで第１ＣＬは第１標的組織において切断剤により切断でき、そして第２ＣＬは第２標的組織において切断剤により切断でき、そして１又は２以上の標的は活性化可能抗体のＡＢに結合する。１つの実施形態において、第１及び第２標的組織は、例えば生物における異なった部位で、空間的に分離される。１つの実施形態において、第１及び第２標的組織は、一時的に分離される同じ組織、例えば異なった時点での同じ組織であり、ここで第１時点は、組織が初期段階腫瘍である時点であり、そして第２時点は、組織が後期段階腫瘍である時点である。
本開示はまた、本明細書に記載される活性化可能抗体をコードする核酸分子も提供する。本開示はまた、それらの核酸を含むベクターを提供する。本明細書に記載される活性化可能抗体は、活性化可能抗体の発現を誘導する条件下で、それらの核酸分子又はベクターを含む細胞を培養することにより生成される。
本開示はまた、活性化可能抗体の製造方法を提供する。１つの実施形態において、前記方法は、（ａ）活性化可能抗体をコードする核酸構築物を含む細胞を、活性化可能抗体の発現を導く条件下で培養し、ここで前記活性化可能抗体は、（ｉ）非結合立体部分（ＮＢ）；（ｉｉ）切断可能リンカー（ＣＬ）；及び（ｉｉｉ）標的を特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ）を含み、ここで（１）ＮＢはＡＢに対して特異的に結合せず；（２）ＣＬは、酵素、例えばマトリプターゼ及びｕＰＡから選択されるプロテアーゼのための基質（Ｓ）を含みポリペプチドであり；（３）ＣＬは、未切断状態下で、ＮＢが標的へのＡＢの結合と干渉し、そして切断された状態下で、ＮＢが標的へのＡＢの結合と干渉しないよう位置決定され；そして（４）ＮＢが酵素によるＤＬの切断を阻害せず；そして（ｂ）活性化可能抗体を回収する段階を包含する。
別の実施形態において、前記方法は、（ａ）活性化可能抗体をコードする核酸構築物を含む細胞を、活性化可能抗体の発現を導く条件下で培養し、ここで前記活性化可能抗体は、（ｉ）非結合立体部分（ＮＢ）のための結合パートナー（ＢＰ）；（ｉｉ）切断可能リンカー（ＣＬ）；及び（ｉｉｉ）標的を特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ）を含み、ここで（１）ＮＢはＡＢに対して特異的に結合せず；（２）ＣＬは、酵素、例えばマトリプターゼ及びｕＰＡから選択されるプロテアーゼのための基質（Ｓ）を含みポリペプチドであり；（３）ＣＬは、ＮＢの存在下で、未切断状態下で、ＮＢが標的へのＡＢの結合と干渉し、そして切断された状態下で、ＮＢが標的へのＡＢの結合と干渉せず、そしてＢＰが標的へのＡＢの結合と干渉しないよう位置決定され；そして（４）ＮＢが酵素によるＤＬの切断を阻害せず；そして（ｂ）活性化可能抗体を回収する段階を包含する。この実施形態のいくつかの例によれば、活性化可能抗体のＢＰは、ＮＢに結合される。
複合抗体及び活性化可能抗体を含めたＣＭ含有分子の使用
本開示の治療剤が、改良された転送、送達、耐性及び同様のものを提供するために製剤中に組込まれる、適切な担体、賦形剤及び他の剤と共に投与されることは理解されるであろう。多数の適切な製剤が、すべての製薬化学者に周知の処方に見出され得る：Remington's Pharmaceutical Sciences (15th ed, Mack Publishing Company, Easton, PA (1975))、特にそこにおける、Blaug、Seymourによるチャプター８７。それらの製剤は、例えば粉末、ペースト、軟膏、ジェリー、ワックス、オイル、脂質、脂質（カチオン性又はアニオン性）含有小胞（例えば、Lipofection（登録商標））、ＤＮＡ結合体、無水吸水性ペースト、水中油型及び油中水型エマルジョン、エマルジョンカーボワックス（種々の分子量のポリエチレングリコール）、半固体状ゲル、及びカーボワックスを含む半固体状混合物を包含する。前述の混合物のいずれかが、製剤中の活性成分が製剤化により不活性化されず、そして製剤が生理学的に適合でき、そして投与の経路で許容できる場合、本開示による治療及び療法において適切であり得る。また、Baldrick P. “Pharmaceutical excipient development: the need for preclinical guidance.” Regul. Toxicol Pharmacol. 32(2):210-8 (2000), Wang W. “Lyophilization and development of solid protein pharmaceuticals.” Int. J. Pharm. 203(1-2):1-60 (2000), Charman WN “Lipids, lipophilic drugs, and oral drug delivery-some emerging concepts.” J Pharm Sci.89(8):967-78 (2000), Powell et al. “Compendium of excipients for parenteral formulations” PDA J Pharm Sci Technol. 52:238-311 (1998)、及び製薬化学者に周知の製剤、賦形剤及び担体に関連する追加の情報についてのそこにおける引用も参照のこと。
制限されることのない例として、複合抗体、活性化可能抗体及び／又は複合活性化可能抗体などのＣＭ含有分子を含んでいる本開示の治療製剤は、異常な標的発現及び／又は活性に関係している疾患又は障害を予防、治療、又はそうでなければ、改善するのに使用される。例えば、ＣＭ含有分子、例えば複合抗体、活性化可能抗体及び／又は複合活性化可能抗体を含めた本開示の治療製剤は、炎症、炎症性疾患、自己免疫疾患及び／又は癌若しくは他の腫瘍性病態を治療、又はそうでなければ、改善するのに使用される。いくつかの実施形態において、癌とは、標的が発現されている固形腫瘍又は血液悪性腫瘍である。いくつかの実施形態において、癌とは、標的が発現されている固形腫瘍である。いくつかの実施形態において、癌とは、標的が発現されている血液悪性腫瘍である。いくつかの実施形態において、標的は、実質（例えば、癌において、多くの場合臓器又は組織の機能を果たす臓器又は組織の一部）で発現される。いくつかの実施形態において、標的は、細胞、組織、又は臓器で発現される。いくつかの実施形態において、標的は、間質（すなわち、細胞、組織、又は臓器の結合支持フレームワーク）で発現される。いくつかの実施形態において、標的は、骨芽細胞で発現される。いくつかの実施形態において、標的は、内皮（血管系）で発現される。いくつかの実施形態において、標的は、癌の幹細胞で発現される。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体に複合化されている剤は、微小管阻害剤である。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体に複合化されている剤は、核酸損傷剤である。
予防、改善又は治療の有効性は、例えば異常な標的の発現及び／又は活性などの標的の発現及び／又は活性に関連する疾患又は障害を診断するか、又は治療するためのいずれかの既知方法に関連して決定される。対象の生存性の延長、そうでなければ、対象における標的の発現及び又は活性、例えば異常な標的の発現及び／又は活性に関連する疾患又は障害の進行の遅延は、複合抗体、活性化可能抗体及び／又は複合活性化可能抗体が臨床的利益を与えることを示唆する。
ＣＭ含有分子、例えば複合抗体、活性化可能抗体及び／又は複合活性化可能抗体は、医薬組成物の形で投与され得る。斯かる組成物の調製に関連する原則及び考慮点、並びに成分の選択の指針は、例えばRemington : The Science And Practice Of Pharmacy 19th ed. (Alfonso R. Gennaro, et al., editors) Mack Pub. Co., Easton, Pa.: 1995; Drug Absorption Enhancement : Concepts, Possibilities, Limitations, And Trends, Harwood Academic Publishers, Langhorne, Pa., 1994; and Peptide And Protein Drug Delivery (Advances In Parenteral Sciences, Vol. 4), 1991, M. Dekker, New Yorkに提供される。
抗体フラグメントが使用されるいくつかの実施形態において、標的タンパク質の結合ドメインに対して特異的に結合する最小フラグメントが選択される。例えば、抗体の可変領域配列に基づけば、標的タンパク質配列を結合する能力を保持するペプチド分子が企画され得る。斯かるペプチドは、化学的に合成され、及び／又は組換えＤＮＡ技法により製造され得る（例えば、Marasco et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 7889-7893 (1993)を参照のこと）。製剤はまた、治療される特定の徴候のために必要な１以上の活性化合物、例えば、いくつかの実施形態において、互いに悪影響を与えない相補的活性を有するそれらのものも含むことができる。いくつかの実施形態において、又はさらに、組成物は、その機能を増強する剤、例えば細胞毒性剤、サイトカイン、化学療法剤、又は成長阻害剤を含むことができる。斯かる分子は、意図する目的のために効果的である量での組み合わせで適切に存在する。
活性成分はまた、それぞれ、コロイド状薬剤送達システム（例えば、リポソーム、アルブミン微小球、マイクロエマルジョン、ナノ粒子及びナノカプセル）下で、又はマイクロエマルジョン下で、液滴形成技法又は界面重合により調製されたマイクロカプセル、例えばヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン−マイクロカプセル及びポリ−（メチルメタクリレート）マイクロカプセルに閉じ込められ得る。
インビボ投与のために使用される製剤は、無菌であるべきである。これは、無菌濾過膜を通しての濾液により容易に達成される。
徐放性製剤が調製され得る。除放性製剤の適切な例は、抗体を含む固体疎水性ポリマーの半透過性マトリックスを包含し、ここでマトリックスは成形品、例えばフィルム又はマイクロカプセルの形で存在する。除放性マトリックスの例は、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ−（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、又はポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸及びγエチル−Ｌ−グルタノートのコポリマー、非分解性エチレン−酢酸ビニル、分解性乳酸−グルコール酸コポリマー、例えばLUPRON DEPOT（登録商標）（乳酸−クリコール酸コポリマー及び酢酸ロイプロリドから構成される注射用微小球）、及びポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸を包含する。ポリマー、例えばエチレン−酢酸ビニル及び乳酸−グリコール酸は１００日間にわたって分子を放出できるが、ある種のヒドロゲルは、より短い期間、タンパク質を放出する。
いくつかの実施形態において、ＣＭ含有分子、例えば複合抗体、活性化可能抗体及び／又は複合活性化可能抗体は、検出可能標識を含む。損なわれていない抗体、又はそのフラグメント（例えば、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ又はＦ（ａｂ）２）が使用される。プローブ又は抗体に関して、用語「標識された」とは、プローブ又は抗体に検出可能物質を結合する（すなわち、物理的に連結する）ことによるプローブの直接的標識、及び直接的に標識される別の試薬との反応性によるプローブ又は抗体の間接的標識の包含を意図する。間接的標識の例は、蛍光標識された二次抗体を用いての一次抗体の検出、及び蛍光標識されたストレプタビジンにより検出され得るようビオチンによるＤＮＡプローブの末端標識を包含する。用語「生物学的サンプル」とは、対象から単離された組織、細胞及び生物学的流体、並びに対象内に存在する組織、細胞及び体液の包含を意図する。従って、用語「生物学的サンプル」の使用範囲内に包含されるものは、血液、及び血清、血漿又はリンパを含む血液の画分又は成分である。すなわち、本開示の検出方法は、インビトロ及びインビボで、生物学的サンプルにおける検体ｍＲＮＡ、タンパク質、又はゲノムＤＮＡを検出するために使用され得る。例えば、検体ｍＲＮＡの検出のためのインビトロ法は、ノザンハイブリダイゼーション及びインサイチュハイブリダイゼーションを包含する。分析物タンパク質の検出のためのインビトロ技法において、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、ウェスターンブロット、免疫沈澱、免疫化学染色、及び免疫蛍光が挙げられる。検体ゲノムＤＮＡの検出のためのインビトロ法は、サザンハイブリダイゼイションを包含する。免疫検定を行うための手順は、例えば“ELISA: Theory and Practice: Methods in Molecular Biology”, Vol. 42, J. R. Crowther (Ed.) Human Press, Totowa, NJ, 1995; “Immunoassay”, E. Diamandis and T. Christopoulus, Academic Press, Inc., San Diego, CA, 1996; and “Practice and Theory of Enzyme Immunoassays”, P. Tijssen, Elsevier Science Publishers, Amsterdam, 1985に記載される。さらに、分析物タンパク質の検出のためのインビボ技法は、標識された抗−分析物タンパク質抗体を対象中に導入することを包含する。例えば、抗体は、対象における存在及び位置が標識イメージング技法により検出され得る放射性マーカーにより標識され得る。
本開示の複合抗体、活性化可能抗体及び／又は複合活性化可能抗体はまた、様々な診断及び予防製剤にも使用される。１つの実施形態において、複合抗体、活性化可能抗体及び／又は複合活性化可能抗体は、１又は２以上の前述の癌又は線維製障害を発症する危険性がある患者に投与される。１又は２以上の前述の障害に対する患者又は器官の素因は、遺伝子型、血清学的又は生化学的マーカーを用いて決定され得る。
本開示のいくつかの実施形態において、複合抗体、活性化可能抗体及び／又は複合活性化可能抗体は、１又は２以上の前述の障害に関連する臨床学的徴候を有するものとして診断されたヒト個人に投与される。診断に基づいて、複合抗体、活性化可能抗体及び／又は複合活性化可能抗体は、臨床学的徴候の効果を軽減するか又は無効にするために投与される。
本開示の複合抗体、活性化可能抗体及び／又は複合活性化可能抗体はまた、患者サンプルにおける標的の検出においても有用であり、そして従って、診断としても有用である。例えば、本開示の抗体及び／又は活性化可能抗体、並びにその複合化バージョンは、患者サンプルにおける標的レベルを検出するために、インビトロアッセイ、例えばＥＬＩＳＡに使用される。
１つの実施形態において、本開示の複合抗体、活性化可能抗体及び／又は複合活性化可能抗体は、固体支持体（例えば、マイクロタイタープレートのウェル）上に固定される。固定された複合抗体、活性化可能抗体及び／又は複合活性化可能抗体は、試験サンプルに存在できるいずれかの標的のための保護抗体として機能する。患者サンプルと固定された抗体との接触の前、固体支持体は、すすがれ、そしてブロッキング剤、例えば乳タンパク質又はアルブミンにより、分析物の非特異的吸着を妨げるために処理される。
結果的に、ウェルは、抗原を含む疑いのある試験サンプル、又は標準量の抗原と含む溶液により処理される。斯かるサンプルは例えば、病理学の診断であると見なされるレベルの循環抗体を有する疑いのある対象からの血清サンプルである。試験サンプル又は標準をすすいだ後、固体支持体は、検出可能的に標識される二次抗体により処理される。標識された二次抗体は、検出抗体として作用する。検出可能標識のレベルが測定され、そして試験サンプル中の標的抗原の濃度が、標識サンプルから得られる標準曲線との比較により決定される。
インビトロ診断アッセイで本開示の抗体及びその複合化バージョンを用いて得られる結果に基づけば、標的抗体の発現レベルに基づいて対象における疾患を段階的に分けることが可能であることが理解されるであろう。所定の疾患に関しては、血液サンプルが疾患の進行における種々の段階であるものとして診断された患者から、及び／又は疾患の治療処置における種々の点で採取される。進行又は治療の各段階について統計学的に有意な結果を提供するサンプル集団を用いて、各段階の特性と考えられ得る抗原の濃度範囲が示される。
複合抗体、活性化可能抗体及び／又は複合活性化可能抗体はまた、診断及び／又はイメージング方法にも使用され得る。いくつかの実施形態において、斯かる方法は、インビトロ方法である。いくつかの実施形態において、斯かる方法は、インビボ方法である。いくつかの実施形態において、斯かる法方は、インサイチュ方法である。いくつかの実施形態において、斯かる方法はエクスビボ方法である。例えば、酵素切断できるＣＭを有する活性化可能抗体は、ＣＭを切断できる酵素の存在又は不在を検出するために使用され得る。斯かる活性化可能抗体は、所定の宿主生物の所定の細胞又は組織における活性化された抗体（すなわち、活性化可能抗体の切断に起因する抗体）の測定される蓄積を通して酵素活性（又は、いくつかの実施形態において、ジスルフィド結合の還元を提供することができる高められた還元電位の環境）のインビボ検出（例えば、定性的又は定量的）を包含することができる診断に使用され得る。活性化された抗体のそのような蓄積は、組織が酵素活性（又はＣＭの性質に依存する高められた還元電位）を表すことを示すのみならず、また組織が活性化された抗体が結合する標的を表すことも示唆する。
例えば、ＣＭは、腫瘍の部位で、ウィルス又は細菌感染の部位で、生成学的に制限された部位で(例えば、膿瘍において、器官において、及び同様において)、及び同様の部位で見出されるマトリプターゼ及びｕＰＡから選択される少なくとも１つのプロテアーゼのための基質として選択され得る。ＡＢは、標的抗原を結合するものである。本明細書中に開示した方法、又は適切であれば当業者になじみの方法を用いて、検出可能標識（例えば、蛍光標識又は放射性標識又は放射性トレーサー）は、ＡＢ、又は抗体及び／又は活性化可能抗体の他の領域に結合され得る。適切な検出可能標識は、上記スクリーニング方法において論じられ、そして追加の特定の例が下記に提供される。その活性が興味ある疾患組織において高められるマトリプターゼ及びｕＰＡから選択される少なくとも１つのプロテアーゼと共に、病状のタンパク質又はペプチドに対して特異的なＡＢを用いて、活性化可能抗体は、ＣＭ特異的酵素が検出可能レベルで存在しないか、又は疾患組織においてよりも低いレベルで存在するか、又は不活性である（例えば、チモーゲン形で、又は阻害剤との複合体下で）、組織と比較して、疾患組織への結合率の増加を示すであろう。小タンパク質及びペプチドは腎臓濾過システムにより血液から急速にクリアランスされるので、及びＣＭに対して特異的な酵素は検出可能レベルで存在しないので（又は非疾患組織に低レベルで存在するか、又は不活性コンホメーション下で存在する）、疾患組織における活性化された抗体の蓄積は、非疾患組織に対して増強される。
別の例によれば、活性化可能抗体は、サンプルにおける切断剤の存在又は不在を検出するために使用され得る。例えば、活性化可能抗体が酸素による切断に対して敏感なＣＭを含む場合、活性化可能抗体は、サンプル中の酵素の存在を検出する（定性的に又は定量的に）ために使用され得る。活性化可能抗体が還元剤による切断に対して敏感なＣＭを含む別の例によれば、活性化可能抗体は、サンプルにおける還元状態の存在を検出する（定性的に又は定量的に）ために使用され得る。それらの方法での分析を促進するためには、活性化可能抗体は検出可能的に標識され得、そして支持体（例えば、固体支持体、例えばスライド又はビーズ）に結合され得る。検出可能標識は、切断に続いて放出されない活性化可能抗体の一部上に位置し、例えば検出可能標識は、クエンチ蛍光標識、又は切断が生じるまで検出できない他の標識であり得る。アッセイは、例えば固定された、検出可能的に標識された活性化可能抗体と、酵素及び／又は還元剤を含む疑いがあるサンプルとを、切断が生じるのに十分な時間、接触し、次に過剰のサンプル及び汚染物を除去するために洗浄することにより実施され得る。次に、サンプル中に切断剤（例えば、酵素又は還元剤）の存在又は不在が、サンプルとの接触の前、活性化可能抗体の検出可能シグナルの変化、例えばサンプル中の切断剤による活性化可能抗体の切断による検出可能シグナルの存在及び／又は上昇により評価され得る。
斯かる検出方法は、切断される場合、活性化可能抗体のＡＢを結合できる標的の存在又は不在の検出を提供できるよう適合され得る。従って、アッセイは、切断剤の存在又は不在、及び興味ある標的の存在又は不在を評価するように適合され得る。切断剤の存在又は不在は、上記のような活性化可能抗体の検出可能レベルでの存在及び／又は上昇により検出され得、そして標的の存在又は不在は標的−ＡＢ複合体の検出により、例えば検出可能的に標識された抗−標的抗体の使用により、検出され得る。
活性化可能抗体は、例えばプロテアーゼ切断及び特定標的への結合による、活性化可能抗体活性化の検証のためのインサイチュイメージングにおいても有用である。インサイチュイメージングは、生物学的サンプル、例えば細胞培養物又は組織切片におけるタンパク質分解活性及び標的の局在化を可能にする技法である。この技法を用いて、所定の標的への結合、及び検出可能標識（たとえば、蛍光標識）の存在に基づいてのタンパク質分解活性の両者を確認することが可能である。
それらの技法は、疾患部位（例えば、腫瘍組織）又は健康組織由来の任意の凍結細胞又は組織に関して有用である。それらの技法はまた、新鮮細胞又は組織サンプルに関しても有用である。
それらの技法によれば、活性化可能抗体は、検出可能標識により標識される。検出可能標識は、蛍光色素（例えば、蛍光団、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）、Alexa Fluor（登録商標）標識）近赤外（ＮＩＲ）色素（例えば、Ｑｄｏｔ（登録商標）ナノ結晶）、コロイド状金属、ハプテン、放射性マーカー、ビオチン及び増幅試薬、例えばストレプタビジン、又は酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ又はアルカリホスファターゼ）であり得る。
標識された、活性化可能抗体と共にインキュベートされたサンプル中の標識の検出は、サンプルが標的を含み、そして活性化可能抗体のＣＭに対して特異的である、マトリプターゼ及びｕＰＡから選択されるプロテアーゼを含むことを示唆する。いくつかの実施形態において、マトリプターゼ及びｕＰＡから選択されるプロテアーゼの存在は、広範囲のプロテアーゼ阻害剤、例えば本明細書に記載されるそれらを用いて、及び／又はプロテアーゼに対して特異的である剤、例えばプロテアーゼであるマトリプターゼに対して特異的であり、そしてマトリプターゼのタンパク質分解活性を阻害する抗体、例えばＡ１１を用いることにより確認され得る；例えば、国際公開番号第ＷＯ２０１０／１２９６０９号（２０１０年１１月１１日に公開された）を参照のこと。広範囲のプロテアーゼ阻害剤、例えば本明細書に記載されるそれらを使用し、及び／又はより選択的な阻害剤を使用する同じアプローチが、活性可能抗体のＣＭに対して特異的であるマトリプターゼ及びｕＰＡから選択されるプロテアーゼを同定するために使用され得る。いくつかの実施形態において、標的の存在は、標的、例えば別の抗体に対して特異的である剤を用いて確認され得、又は検出可能標識が、標識されていない標的と比較され得る。いくつかの実施形態において、標識されていない活性化可能抗体が、標識された二次抗体又はより複雑な検出システムによる検出を伴って、使用され得る。
類似する技法がまた、対象、例えば哺乳類、例えばヒトにおける蛍光シグナルの検出が、疾患部位が標的を含み、そして活性化可能抗体のＣＭに対して特異的である、マトリプターゼ及びｕＰＡから選択されるプロテアーゼを含むことを示唆する、インビボイメージングのためにも有用である。
それらの技法はまた、活性化可能抗体におけるプロテアーゼ−特異的ＣＭに基づいて、種々の細胞、組織及び生物におけるプロテアーゼの検出、同定又は特徴化のために、キットにおいて、及び／又は試薬としても有用である。
本開示はまた、種々の診断及び／又は予防徴候に、抗体及び／又は活性化可能抗体を使用するための方法も提供する。例えば、本開示は、（ｉ）対象又はサンプルと、活性化可能抗体とを接触し、ここで前記活性化可能抗体は、マスキング部分（ＭＭ）、切断剤、例えばマトリプターゼ及びｕＰＡから選択されるプロテアーゼにより切断される切断可能部分（ＣＭ）、及び目的の標的を特異的に結合する抗原結合ドメイン又はそのフラグメント（ＡＢ）を含み、ここで未切断、非活性化状態での活性化可能抗体は、次の通りにＮ末端からＣ末端側への構造配置：ＭＭ−ＣＭ−ＡＢ又はＡＢ−ＣＭ−ＭＭを有し、ここで（ａ）ＭＭは、標的へのＡＢの結合を阻害するペプチドであり、そしてＭＭはＡＢの天然に存在する結合パートナーのアミノ酸配列を有さず、そしてＡＢの天然の結合パートナーの修飾された形ではなく、そして（ｂ）未切断、非活性化状態で、ＭＭは標的へのＡＢの特異的結合と干渉し、そして切断された、活性化された状態で、ＭＭは標的へのＡＢの特異的結合と干渉せず、又は競合せず；そして（ｉｉ）対象又はサンプルにおける活性化された活性化可能抗体のレベルを測定することにより、対象又はサンプルにおける切断剤及び目的の標的の存在又は不在を検出するための方法及びキットを提供し、ここで、対象又はサンプルにおける検出可能レベルの活性化された、活性化可能抗体は、切断剤及び標的が対象又はサンプルに存在することを示唆し、そして対象又はサンプルにおける検出可能レベルの活性化された、活性化可能抗体は、切断剤、標的、又はそれらの両者が対象又はサンプルに不在であり、そして／又は十分には存在しないことを示唆しない。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体は、治療剤が結合される活性化可能抗体である。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体は、剤に結合されな。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体は、検出可能標識を含む。いくつかの実施形態において、検出可能標識は、ＡＢ上に位置する。いくつかの実施形態において、対象又はサンプルにおける活性化可能抗体のレベルの測定は、活性化された抗体に対して特異的に結合する二次試薬を用いて達成され、ここで前記試薬は検出可能標識を含む。いくつかの実施形態において、前記二次試薬は、検出可能標識を含む抗体である。
本開示は、（ｉ）対象又はサンプルと、活性化可能抗体とを、目的の標的、例えば標的の存在下で接触し、ここで前記活性化可能抗体は、マスキング部分（ＭＭ）、切断剤、例えばマトリプターゼ及びｕＰＡから選択されるプロテアーゼにより切断される切断可能部分（ＣＭ）、及び目的の標的を特異的に結合する抗原結合ドメイン又はそのフラグメント（ＡＢ）を含み、ここで未切断、非活性化状態での活性化可能抗体は、次の通りにＮ末端からＣ末端側への構造配置：ＭＭ−ＣＭ−ＡＢ又はＡＢ−ＣＭ−ＭＭを有し、ここで（ａ）ＭＭは、標的へのＡＢの結合を阻害するペプチドであり、そしてＭＭはＡＢの天然に存在する結合パートナーのアミノ酸配列を有さず、そしてＡＢの天然の結合パートナーの修飾された形ではなく、そして（ｂ）未切断、非活性化状態で、ＭＭは標的へのＡＢの特異的結合と干渉し、そして切断された、活性化された状態で、ＭＭは標的へのＡＢの特異的結合と干渉せず、又は競合せず；そして（ｉｉ）対象又はサンプルにおける活性化された活性化可能抗体のレベルを測定することにより、対象又はサンプルにおける切断剤の存在又は不在を検出するための方法及びキットを提供し、ここで、対象又はサンプルにおける検出可能レベルの活性化された、活性化可能抗体は、切断剤が対象又はサンプルに存在することを示唆し、そして対象又はサンプルにおける検出可能レベルの活性化された、活性化可能抗体が、切断剤が対象又はサンプルに不在であり、そして／又は十分には存在しないことを示唆できない。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体は、治療剤が結合される活性化可能抗体である。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体は、剤に結合されない。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体は、検出可能標識を含む。いくつかの実施形態において、検出可能標識は、ＡＢ上に位置する。いくつかの実施形態において、対象又はサンプルにおける活性化可能抗体のレベルの測定は、活性化された抗体に対して特異的に結合する二次試薬を用いて達成され、ここで前記試薬は検出可能標識を含む。いくつかの実施形態において、前記二次試薬は、検出可能標識を含む抗体である。
本開示はまた、対象又はサンプルにおける切断剤及び目的の標的の存在又は不在の検出方法への使用のためのキットも提供し、ここで前記キットは、マスキング部分（ＭＭ）、切断剤、例えばマトリプターゼ及びｕＰＡから選択されるプロテアーゼにより切断される切断可能部分（ＣＭ）、及び目的の標的を特異的に結合する抗原結合ドメイン又はそのフラグメント（ＡＢ）を含む活性化可能抗体を少なくとも含み、ここで未切断の非活性化状態で、前記活性化可能抗体は、次の通りに、Ｎ−末端からＣ−末端側に構造配置を構造配置を含み：ＭＭ−ＣＭ−ＡＢ又はＡＢ−ＣＭ−ＭＭ；ここで（ａ）ＭＭは、標的へのＡＢの結合を阻害するペプチドであり、そしてＭＭはＡＢの天然に存在する結合パートナーのアミノ酸配列を有さず、そしてＡＢの天然の結合パートナーの修飾された形ではなく、そして（ｂ）未切断、非活性化状態で、ＭＭは標的へのＡＢの特異的結合と干渉し、そして切断された、活性化された状態で、ＭＭは標的へのＡＢの特異的結合と干渉せず、又は競合せず；そして（ｉｉ）対象又はサンプルにおける活性化された活性化可能抗体のレベルを測定することを包含し、ここで、対象又はサンプルにおける活性化された活性化可能抗体の検出可能レベルは、切断剤が対象又はサンプルに存在することを示唆し、そして対象又はサンプルにおける検出可能レベルの活性化された、活性化可能抗体は、切断剤が対象又はサンプルに不在であり、そして／又は十分には存在しないことを示唆しない。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体は、治療剤が結合される活性化可能抗体である。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体は、剤に結合されな。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体は、検出可能標識を含む。いくつかの実施形態において、検出可能標識は、ＡＢ上に位置する。いくつかの実施形態において、対象又はサンプルにおける活性化可能抗体のレベルの測定は、活性化された抗体に対して特異的に結合する二次試薬を用いて達成され、ここで前記試薬は検出可能標識を含む。いくつかの実施形態において、前記二次試薬は、検出可能標識を含む抗体である。
本開示は、（ｉ）対象又はサンプルと、活性化可能抗体とを接触し、ここで前記活性化可能抗体は、マスキング部分（ＭＭ）、切断剤、例えばマトリプターゼ及びｕＰＡから選択されるプロテアーゼにより切断される切断可能部分（ＣＭ）、標的を特異的に結合する抗原結合ドメイン（ＡＢ）、及び検出可能標識を含み、ここで未切断、非活性化状態での活性化可能抗体は、次の通りにＮ末端からＣ末端側への構造配置：ＭＭ−ＣＭ−ＡＢ又はＡＢ−ＣＭ−ＭＭを有し；ここでＭＭは、標的へのＡＢの結合を阻害するペプチドであり、そしてＭＭはＡＢの天然に存在する結合パートナーのアミノ酸配列を有さず、そしてＡＢの天然の結合パートナーの修飾された形ではなく；そして未切断、非活性化状態で、ＭＭは標的へのＡＢの特異的結合と干渉し、そして切断された、活性化された状態で、ＭＭは標的へのＡＢの特異的結合と干渉せず、又は競合せず；そして検出可能標識が、ＣＭの切断に続いて放出される活性化可能抗体の一部を位置決定され；そして（ｉｉ）対象又はサンプルにおける検出可能標識のレベルを測定することにより、対象又はサンプルにおける切断剤の存在又は不在を検出するための方法を提供し、ここで、対象又はサンプルにおける検出可能標識の検出可能レベルは、切断剤が対象又はサンプルに不在であり、そして/又は十分には存在しないことを示唆し、そして対象又はサンプルにおける検出可能標識の検出可能レベルが、切断剤が対象又はサンプルに存在することを示唆しない。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体は、治療剤が結合される活性化可能抗体である。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体は、剤に結合されない。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体は、検出可能標識を含む。いくつかの実施形態において、検出可能標識は、ＡＢ上に位置する。いくつかの実施形態において、対象又はサンプルにおける活性化可能抗体のレベルの測定は、活性化された抗体に対して特異的に結合する二次試薬を用いて達成され、ここで前記試薬は検出可能標識を含む。いくつかの実施形態において、前記二次試薬は、検出可能標識を含む抗体である。
本開示はまた、対象又はサンプルにおける切断剤及び目的の標的の存在又は不在の検出方法への使用のためのキットも提供し、ここで前記キットは、対象又は生物学的サンプルの接触に使用するための本明細書に記載される活性化可能抗体及び／又は複合活性化可能抗体（例えば、治療剤が結合される活性化可能抗体）、及び対象又は生物学的サンプルにおける活性化可能抗体及び／又は複合活性化可能抗体のレベルを検出するための手段を、少なくとも包含し、ここで、対象又は生物学的サンプルにおける活性化された活性化可能抗体の検出可能レベルが、切断剤及び標的が対象又は生物学的サンプルに存在することを示唆し、そして対象又は生物学的サンプルにおける活性化された活性化可能抗体の検出可能レベルが、切断剤及び標的が対象又は生物学的サンプルに不在であり、そして／又は十分には存在しないことを示唆せず、結果的に、活性化可能抗体の標的結合及び／又はプロテアーゼ切断は、対象又は生物学的サンプルにおいては検出され得ない。
本開示はまた、（ｉ）対象又は生物学的サンプルと、活性化可能抗体とを、標的の存在下で接触し、そして（ｉｉ）対象又は生物学的サンプルにおける活性化された活性化可能抗体のレベルを測定することにより、対象又はサンプルにおける切断剤の存在又は不在を検出するための方法を提供し、ここで、対象又は生物学的サンプルにおける活性化された、活性化可能抗体の検出可能レベルは、切断剤が対象又は生物学的サンプルに存在することを示唆し、そして対象又は生物学的サンプルにおける活性化された、活性化可能抗体の検出可能レベルが、切断剤が対象又は生物学的サンプルにおいて、検出可能レベルで不在であり、そして／又は十分には存在しないことを示唆できずない。斯かる活性化可能抗体は、マスキング部分（ＭＭ）、切断剤、例えばマトリプターゼ及びｕＰＡから選択されるプロテアーゼにより切断される切断可能部分（ＣＭ）、及び目的の標的を特異的に結合する抗原結合ドメイン又はそのフラグメント（ＡＢ）を含み、ここで未切断（すなわち、活性化されていない）状態での活性化可能抗体は、次の通りにＮ末端からＣ末端側への構造配置：ＭＭ−ＣＭ−ＡＢ又はＡＢ−ＣＭ−ＭＭを有し、ここで（ａ）ＭＭは、標的へのＡＢの結合を阻害するペプチドであり、そしてＭＭはＡＢの天然に存在する結合パートナーのアミノ酸配列を有さず、そして（ｂ）未切断状態で、活性化可能抗体のＭＭは標的へのＡＢの特異的結合と干渉し、そして切断された（すなわち、活性化された）状態で、ＭＭは標的へのＡＢの特異的結合と干渉せず、又は競合しない。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体は、治療剤が結合される活性化可能抗体である。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体は、剤に結合されない。いくつかの実施形態において、検出可能標識はマスキング部分に結合される。いくつかの実施形態において、検出可能標識は、プロテアーゼ切断部分のＮ末端側の切断部分に結合される。いくつかの実施形態において、ＡＢの単一抗体結合部位がマスキングされる。本開示の抗体が少なくとも２種の抗原結合部位を有するいくつかの実施形態において、少なくとも１つの抗原結合部位がマスキングされ、そして少なくとも１つの抗原結合部位はマスキングされない。いくつかの実施形態において、すべての抗原結合部位はマスキングされない。いくつかの実施形態において、測定段階は、検出可能標識を含む第２試薬の使用を包含する。
本開示はまた、対象又はサンプルにおける切断剤及び目的の標的の存在又は不在の検出方法への使用のためのキットも提供し、ここで前記キットは、対象又は生物学的サンプルと、活性化可能抗体とを、標的の存在下で接触し、そして対象又は生物学的サンプルにおける活性化された活性化可能抗体のレベルを測定することへの使用のために本明細書に記載される活性化可能抗体及び／又は複合活性化可能抗体を少なくとも含み、ここで対象又は生物学的サンプルにおける活性化された、活性化可能抗体の検出可能レベルは、切断剤が対象又は生物学的サンプルに存在することを示唆し、そして対象又は生物学的サンプルにおける活性化された、活性化可能抗体の検出可能レベルが、切断剤が対象又は生物学的サンプルにおいて、検出可能レベルで不在であり、そして／又は十分には存在しないことを示唆できない。斯かる活性化可能抗体は、マスキング部分（ＭＭ）、切断剤、例えばマトリプターゼ及びｕＰＡから選択されるプロテアーゼにより切断される切断可能部分（ＣＭ）、及び標的を特異的に結合する抗原結合ドメイン又はそのフラグメント（ＡＢ）を含み、ここで未切断（すなわち、活性化されていない）状態での活性化可能抗体は、次の通りにＮ末端からＣ末端側への構造配置：ＭＭ−ＣＭ−ＡＢ又はＡＢ−ＣＭ−ＭＭを有し、ここで（ａ）ＭＭは、標的へのＡＢの結合を阻害するペプチドであり、そしてＭＭはＡＢの天然に存在する結合パートナーのアミノ酸配列を有さず、そして（ｂ）未切断状態で、活性化可能抗体のＭＭは標的へのＡＢの特異的結合と干渉し、そして切断された（すなわち、活性化された）状態で、活性化可能抗体のＭＭは標的へのＡＢの特異的結合と干渉せず、又は競合しない。いくつかの実施形態において、検出可能標識はマスキング部分に結合される。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体は、治療剤が結合される活性化可能抗体である。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体は、剤に結合されない。いくつかの実施形態において、検出可能標識はマスキング部分に結合される。いくつかの実施形態において、検出可能標識は、プロテアーゼ切断部分のＮ末端側の切断部分に結合される。いくつかの実施形態において、ＡＢの単一抗体結合部位がマスキングされる。本開示の抗体が少なくとも２種の抗原結合部位を有するいくつかの実施形態において、少なくとも１つの抗原結合部位がマスキングされ、そして少なくとも１つの抗原結合部位はマスキングされない。いくつかの実施形態において、すべての抗原結合部位はマスキングされない。いくつかの実施形態において、測定段階は、検出可能標識を含む第２試薬の使用を包含する。
本開示はまた、対象又はサンプルにおける切断剤の存在又は不在の検出方法への使用のためのキットも提供し、ここで前記キットは、対象又は生物学的サンプルの接触に使用するための本明細書に記載される活性化可能抗体及び／又は複合活性化可能抗体、及び対象又は生物学的サンプルにおける活性化された活性化可能抗体及び／又は複合活性化可能抗体のレベルを検出するための手段を、少なくとも包含し、ここで活性化可能抗体は、ＣＭの切断に続いて放出される活性化可能抗体の一部に基づいて位置決定される検出可能標識を含み、ここで対象又は生物学的サンプルにおける活性化された活性化可能抗体の検出可能レベルは、切断剤が、対象又は生物学的サンプルに不在であり、そして／又は十分に存在しないことを示唆し、結果的に、活性化可能抗体の標的結合及び／又はプロテアーゼ切断は対象又は生物学的サンプルには検出され得ず、そして対象又は生物学的サンプルにおける活性化された抗体の検出可能レベルは、切断剤が対象又は生物学的サンプルに検出可能レベルで存在することを示唆しない。
本開示は、（ｉ）対象又は生物学的サンプルと、活性化可能抗体とを接触し、ここで前記活性化可能抗体は、ＣＭの切断に続いて放出される活性化可能抗体の一部に基づいて位置決定される検出可能標識を含み、そして（ｉｉ）前記対象又は生物学的サンプルにおける活性化された、活性化可能抗体のレベルを測定することにより、対象又は生物学的サンプルにおける活性化された、活性化可能抗体のレベルを測定することにより、対象又は生物学的における切断剤及び標的の存在又は不在を検出するための方法を提供し、ここで対象又は生物学的サンプルにおける活性化された活性化可能抗体の検出可能レベルが、切断剤、標的、又は切断剤及び標的の両者が、対象又は生物学的サンプルに不在であり、そして／又は十分に存在しないことを示唆し、結果的に、活性化可能抗体の標的結合及び／又はプロテアーゼ切断は対象又は生物学的サンプルには検出され得ず、そして前記対象又は生物学的サンプル中の活性化された、活性化可能抗体の低められた検出可能レベルが、切断剤及び標的が対象又は生物学的サンプルに存在することを示唆する。検出可能標識の低められたレベルは例えば、約５％、約１０％、約 １５％、約 ２０％、約 ２５％、約 ３０％、約 ３５％、約 ４０％、約 ４５％、約 ５０％、約 ５５％、約 ６０％、約 ６５％、約 ７０％、約 ７５％、約 ８０％、約 ８５％、約 ９０％、約 ９５％ 及び/又は約 １００％の低下率である。斯かる活性化可能抗体は、マスキング部分（ＭＭ）、切断剤により切断される切断可能部分（ＣＭ）、及び標的を特異的に結合する抗原結合ドメイン又はそのフラグメント（ＡＢ）を含み、ここで未切断（すなわち、活性化されていない）状態での活性化可能抗体は、次の通りにＮ末端からＣ末端側への構造配置：ＭＭ−ＣＭ−ＡＢ又はＡＢ−ＣＭ−ＭＭを有し、ここで（ａ）ＭＭは、標的へのＡＢの結合を阻害するペプチドであり、そしてＭＭはＡＢの天然に存在する結合パートナーのアミノ酸配列を有さず、そして（ｂ）未切断状態で、活性化可能抗体のＭＭは標的へのＡＢの特異的結合と干渉し、そして切断された（すなわち、活性化された）状態で、活性化可能抗体のＭＭは標的へのＡＢの特異的結合と干渉せず、又は競合しない。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体は、治療剤が結合される活性化可能抗体である。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体は、剤に結合されない。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体は、検出可能標識である。いくつかの実施形態において、検出可能標識は、ＡＢ上に位置決定される。いくつかの実施形態において、対象又はサンプル中の活性化可能抗体のレベルの測定は、活性化された抗体に対して特異的に結合する第２試薬を用いて達成され、ここで前記試薬は検出可能標識を含む。いくつかの実施形態において、第２試薬は、検出可能標識を含む抗体である。
本開示はまた、対象又はサンプルにおける切断剤及び目的の標的の存在又は不在の検出方法への使用のためのキットも提供し、ここで前記キットは、対象又は生物学的サンプルの接触に使用するための本明細書に記載される活性化可能抗体及び／又は複合活性化可能抗体、及び対象又は生物学的サンプルにおける活性化された活性化可能抗体及び／又は複合活性化可能抗体のレベルを検出するための手段を、少なくとも包含し、ここで対象又は生物学的サンプルにおける活性化された活性化可能抗体の検出可能レベルは、切断剤、標的、又は切断剤及び標的両者が、対象又は生物学的サンプルに不在であり、そして／又は十分に存在しないことを示唆し、結果的に、活性化可能抗体の標的結合及び／又はプロテアーゼ切断は対象又は生物学的サンプルには検出され得ず、そして前記対象又は生物学的サンプル中の活性化された、活性化可能抗体の低められた検出可能レベルが、切断剤及び標的が対象又は生物学的サンプルに存在することを示唆する。検出可能標識の低められたレベルは例えば、約５％、約１０％、約 １５％、約 ２０％、約 ２５％、約 ３０％、約 ３５％、約 ４０％、約 ４５％、約 ５０％、約 ５５％、約 ６０％、約 ６５％、約 ７０％、約 ７５％、約 ８０％、約 ８５％、約 ９０％、約 ９５％ 及び/又は約 １００％の低下率である。
本開示はまた、（ｉ）対象又は生物学的サンプルと、活性化可能抗体とを接触し、ここで前記活性化可能抗体は、ＣＭの切断に続いて放出される活性化可能抗体の一部に基づいて位置決定される検出可能標識を含み、そして（ｉｉ）前記対象又は生物学的サンプルにおける検出可能標識のレベルを測定することにより、対象又は生物学的サンプルにおける活性化された、活性化可能抗体のレベルを測定することにより、対象又は生物学的における切断剤の存在又は不在を検出するための方法を提供し、ここで対象又は生物学的サンプルにおける検出可能レベルが、切断剤が、検出可能レベルで、対象又は生物学的サンプルに不在であり、そして／又は十分に存在しないことを示唆し、結果的に、活性化可能抗体のプロテアーゼ切断は対象又は生物学的サンプルには検出され得ず、そして前記対象又は生物学的サンプル中の検出可能レベルの低められた検出可能レベルが、切断剤が対象又は生物学的サンプルに存在することを示唆する。検出可能標識の低められたレベルは例えば、約５％、約１０％、約 １５％、約 ２０％、約 ２５％、約 ３０％、約 ３５％、約 ４０％、約 ４５％、約 ５０％、約 ５５％、約 ６０％、約 ６５％、約 ７０％、約 ７５％、約 ８０％、約 ８５％、約 ９０％、約 ９５％ 及び/又は約 １００％の低下率である。斯かる活性化可能抗体は、マスキング部分（ＭＭ）、切断剤により切断される切断可能部分（ＣＭ）、及び標的を特異的に結合する抗原結合ドメイン又はそのフラグメント（ＡＢ）を含み、ここで未切断（すなわち、活性化されていない）状態での活性化可能抗体は、次の通りにＮ末端からＣ末端側への構造配置：ＭＭ−ＣＭ−ＡＢ又はＡＢ−ＣＭ−ＭＭを有し、ここで（ａ）ＭＭは、標的へのＡＢの結合を阻害するペプチドであり、そしてＭＭはＡＢの天然に存在する結合パートナーのアミノ酸配列を有さず、そして（ｂ）未切断状態で、活性化可能抗体のＭＭは標的へのＡＢの特異的結合と干渉し、そして切断された（すなわち、活性化された）状態で、活性化可能抗体のＭＭは標的へのＡＢの特異的結合と干渉せず、又は競合しない。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体は、治療剤が結合される活性化可能抗体である。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体は、剤に結合されない。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体は、検出可能標識である。いくつかの実施形態において、検出可能標識は、ＡＢ上に位置決定される。いくつかの実施形態において、対象又はサンプル中の活性化可能抗体のレベルの測定は、活性化された抗体に対して特異的に結合する第２試薬を用いて達成され、ここで前記試薬は検出可能標識を含む。いくつかの実施形態において、第２試薬は、検出可能標識を含む抗体である。
本開示はまた、対象又はサンプルにおける目的の切断剤の存在又は不在の検出方法への使用のためのキットも提供し、ここで前記キットは、対象又は生物学的サンプルの接触に使用するための本明細書に記載される活性化可能抗体及び／又は複合活性化可能抗体、及び対象又は生物学的サンプルにおける活性化された活性化可能抗体及び／又は複合活性化可能抗体のレベルを検出するための手段を、少なくとも包含し、ここで活性化可能抗体は、ＣＭの切断に続いて放出される活性化可能抗体の一部に基づいて位置決定される検出可能標識を含み、ここで対象又は生物学的サンプルにおける検出可能標識の検出可能レベルは、切断剤、標的、又は断剤、標的の両者が、対象又は生物学的サンプルに不在であり、そして／又は十分に存在しないことを示唆し、結果的に、活性化可能抗体の標的結合及び／又はプロテアーゼ切断は対象又は生物学的サンプルには検出され得ず、そして前記対象又は生物学的サンプル中の検出可能標識の検出可能レベルが、切断剤及び標的が対象又は生物学的サンプルに存在することを示唆する。検出可能標識の低められたレベルは例えば、約５％、約１０％、約 １５％、約 ２０％、約 ２５％、約 ３０％、約 ３５％、約 ４０％、約 ４５％、約 ５０％、約 ５５％、約 ６０％、約 ６５％、約 ７０％、約 ７５％、約 ８０％、約 ８５％、約 ９０％、約 ９５％ 及び/又は約 １００％の低下率である。
それらの方法及びキットのいくつかの実施形態において、活性化可能抗体は、検出可能標識を含む。それらの方法及びキットのいくつかの実施形態において、検出可能標識は、イメージング剤、造影剤、酵素、蛍光標識、発色団、色素、１又は２以上の金属イオン、又はリガンド系標識を含む。それらの方法及びキットのいくつかの実施形態において、イメージング剤は、放射性同位体を含む。それらの方法及びキットのいくつかの実施形態において、放射性同位体は、インジウム又はテクネチウムである。それらの方法及びキットのいくつかの実施形態において、造影剤は、ヨウ素、ガドリニウム又は酸化鉄を含む。それらの方法及びキットのいくつかの実施形態において、酵素は、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ又はβ−ガラクトシダーゼを含む。それらの方法及びキットのいくつかの実施形態において、発光標識は、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、修正赤色蛍光タンパク質（ｍＲＦＰ）、赤色蛍光タンパク質tdimer2 (ＲＦＰ tdimer2)、ＨＣＲＥＤ、又はユーロピウム誘導体を包含する。それらの方法及びキットのいくつかの実施形態において、発光標識は、Ｎ−メチルアクリジウム誘導体を含む。それらの方法及びキットのいくつかの実施形態において、標識は、Alexa Fluor（登録商標）標識、例えばAlex Fluor（登録商標）６８０又はAlexa Fluor（登録商標）７５０を包含する。それらの方法及びキットのいくつかの実施形態において、リガンド系標識は、ビオチン、アビジン、ストレプタビジン、又は１又は２以上のハプテンを包含する。
それらの方法及びキットのいくつかの実施形態において、対象は哺乳類である。それらの方法及びキットのいくつかの実施形態において、対象はヒトである。それらの方法及びキットのいくつかの実施形態において、対象は非ヒト哺乳類、例えば非ヒト霊長類、愛玩動物（例えば、ネコ、イヌ、ウマ）、家畜、作業動物又は動物園の動物である。いくつかの実施形態において、対象は齧歯動物である。
それらの方法のいくつかの実施形態において、前記方法は、インビボ方法である。それらの方法のいくつかの実施形態において、前記方法は、現場方法である。それらの方法のいくつかの実施形態において、前記方法は、エクスビボ方法である。それらの方法のいくつかの実施形態において、前記方法は、インビトロ方法である。
いくつかの実施形態において、インサイチュイメージング及び／又はインビボイメージングは、治療する患者を同定する方法において有用である。例えば、インサイチュイメージングによれば、活性化可能抗体は、適切な位置で、例えば腫瘍部位で、適切なプロテアーゼ及び標的を有するそれらの患者を同定するために、患者サンプルをスクリーニングするために使用される。
いくつかの実施形態において、インサイチュイメージングが、本開示の活性化可能抗体による治療のために適切な患者集団を同定するか、又は他方では、細分するために使用される。標的（例えば、標的）、及び試験される活性化可能抗体の切断可能部分（ＣＭ）（例えば、疾患部位で活性化抗体を蓄積する）における基質を切断するプロテアーゼの両者に対して陽性の患者が、斯かるＣＭを含む活性化可能抗体による治療のための適切な候補として同定される。同様に、標的（例えば、標的）、及びそれらの方法を用いて試験される活性化可能抗体中のＣＭにおいて基質を切断するプロテアーゼのいずれか又は両者に対して陰性の患者が、別の形の療法のための適切な候補として同定されるであろう。いくつかの実施形態において、第１の活性化可能抗体に関して陰性のそのような患者は、治療のための適切な活性化可能抗体（例えば、疾患の部位で患者により切断されるＣＭを含む活性化可能抗体）が同定されるまで、異なったＣＭを含む他の活性化可能抗体により試験され得る。いくつかの実施形態において、患者は次に、該患者が検査でそれに関して陽性であった複合活性化可能抗体の治療上有効な量が投与される。
いくつかの実施形態において、インビボイメージングは、本開示の活性化可能抗体による治療のために適切な患者集団を同定するか又は細分するために使用される。標的（例えば、標的）、及び試験される活性化可能抗体の切断可能部分（ＣＭ）（例えば、疾患部位で活性化抗体を蓄積する）における基質を切断するプロテアーゼの両者に対して陽性の患者が、斯かるＣＭを含む斯かる活性化可能抗体による治療のための適切な候補として同定される。同様に、陰性の患者が、別の形の療法（すなわち、試験される活性化可能抗体による治療のためには適切でない）のための適切な候補として同定されるであろう。いくつかの実施形態において、第１の活性化可能抗体に関して陰性のそのような患者は、治療のための適切な活性化可能抗体（例えば、疾患の部位で患者により切断されるＣＭを含む活性化可能抗体）が同定されるまで、異なったＣＭを含む他の活性化可能抗体により試験され得る。いくつかの実施形態において、患者は次に、該患者が検査でそれに関して陽性であった複合活性化可能抗体の治療上有効な量が投与される。
それらの方法及び／又はキットのいくつかの実施形態において、方法及び／又はキットは、開示の活性化可能抗体による治療のために適切な患者集団を同定するか、又は他方では、細分し、例えば層別化するために使用される。例えば、標的（例えば、標的）及びそれらの方法において試験される活性化可能抗体の切断部分（ＣＭ）において基質を切断するプロテアーゼの両者について検査陽性である患者は、斯かるＣＭを含む斯かる活性化可能抗体による治療のための適切な候補として同定される。同様に、標的（例えば、標的）、及びそれらの方法を用いて試験される活性化可能抗体中のＣＭにおける基質を切断するプロテアーゼのいずれか又は両者について検査陰性である患者は、別の治療形のための適切な候補として同定される（すなわち、試験される活性化可能抗体による治療のために適切でない）。いくつかの実施形態において、そのような患者は、治療のための適切な活性化可能抗体（例えば、患者の部位で患者により切断されるＣＭを含む抗−ＥＧＦＲ活性可能抗体）が同定されるまで、他の活性化可能抗体により検査され得る。いくつかの実施形態において、標的（例えば、標的）のいずれかに対して陰性である患者は、斯かるＣＭを含む斯かる活性化可能抗体による治療のための適切な候補として同定される。いくつかの実施形態において、標的（例えば、標的）のいずれかに対して陰性である患者は、斯かるＣＭを含む斯かる活性化可能抗体による治療のための適切な候補ではないものとして同定される。いくつかの実施形態において、そのような患者は、治療のための適切な活性化可能抗体（例えば、患者の部位で患者により切断されるＣＭを含む抗−ＥＧＦＲ活性可能抗体）が同定されるまで、他の活性化可能抗体により検査され得る。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体は、治療剤が結合される活性化可能抗体である。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体は、剤に結合されな。いくつかの実施形態において、活性化可能抗体は、検出可能標識を含む。いくつかの実施形態において、検出可能標識は、ＡＢ上に位置する。いくつかの実施形態において、対象又はサンプルにおける活性化可能抗体のレベルの測定は、活性化された抗体に対して特異的に結合する二次試薬を用いて達成され、ここで前記試薬は検出可能標識を含む。いくつかの実施形態において、前記二次試薬は、検出可能標識を含む抗体である。
いくつかの実施形態において、開示の活性化可能抗体及び／又は複合活性化可能抗体（例えば、治療剤が結合される活性化可能抗体）による治療、活性化可能抗体及び／又は複合活性化可能抗体を、その必要な対象に投与することによる続く治療のために適切な患者集団を同定するか、又は他方では、細分するために、方法又はキットが使用される。例えば、標的（例えば、標的）、及びそれらの方法において試験される活性化可能抗体及び/又は複合活性化可能抗体の切断可能部分（ＣＭ）における基質を切断するプロテアーゼの両者についての検査で陽性である患者が、斯かるＣＭを含む斯かる抗体及び/又は斯かる複合活性化可能抗体による治療のための適切な候補として同定され、そして次に、前記患者は、治療的有効量の試験された活性化可能抗体及び／又は複合活性化可能抗体を投与される。同様に、標的（例えば、標的）、及びそれらの方法を用いて試験される活性化可能抗体のＣＭにおける基質を切断するプロテアーゼのいずれか、又は両者についての検査で陰性である患者は、別の形の治療のための適切な候補として同定され得る。いくつかの実施形態において、そのような患者は、治療のための適切な抗体及び／又は複合活性化可能抗体（例えば、疾患の部位で患者により切断されるＣＭを含む、活性化可能抗体及び／又は複合活性化可能抗体）が同定されるまで、他の抗体及び／又は複合活性化可能抗体により試験され得る。いくつかの実施形態において、次に、検査で陽性であった患者は、治療的有効量の活性化可能抗体及び／又は複合活性化可能抗体を投与される。
それらの方法及びキットのいくつかの実施形態において、ＭＭは、約４〜４０個の長さのアミノ酸を有するペプチドである。それらの方法及びキットのいくつかの実施形態において、活性化可能抗体は、リンカーペプチドを含み、ここで前記リンカーペプチドは、ＭＭとＣＭとの間に位置する。それらの方法及びキットのいくつかの実施形態において、活性化可能抗体は、リンカーペプチドを含み、ここで前記リンカーペプチドは、ＡＢとＣＭとの間に位置する。それらの方法及びキットのいくつかの実施形態において、活性化可能抗体は、第１リンカーペプチド（Ｌ１）及び第２リンカーペプチド（Ｌ２）を含み、ここで前記第１リンカーペプチドはＭＭとＣＭとの間に位置し、そして前記第２リンカーペプチドはＡＢとＣＭとの間に位置する。それらの方法及びキットのいくつかの実施形態において、各Ｌ１及びＬ２は約１〜２０個の長さのアミノ酸のペプチドであり、そして各１及びＬ２は同じリンカーである必要はない。それらの方法及びキットのいくつかの実施形態において、Ｌ１及びＬ２の１つ又は両者は、グリシン−セリンポリマーである。それらの方法及びキットのいくつかの実施形態において、Ｌ１及びＬ２の少なくとも１つは、（ＧＳ）ｎ、（ＧＳＧＧＳ）ｎ (配列番号３８５)及び（ＧＧＧＳ）ｎ (配列番号３８６)（ここで、ｎは少なくとも１つの整数である）から成る群から選択されたアミノ酸配列を含む。それらの方法及びキットのいくつかの実施形態において、Ｌ１及びＬ２の少なくとも１つは、式（ＧＧＳ）ｎ（ここで、ｎは少なくとも１の整数である）を有するアミノ酸配列を含む。それらの方法及びキットのいくつかの実施形態において、Ｌ１及びＬ２の少なくとも１つは、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ (配列番号３８７)、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ (配列番号３８８)、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ (配列番号３８９)、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ (配列番号３９０)、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ (配列番号３９１)及び Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ (配列番号３９２)から成る群から選択されたアミノ酸配列を含む。
それらの方法及びキットのいくつかの実施形態において、ＡＢは、本明細書に提供される交差反応性抗体配列から選択された抗体又は抗体フラグメント配列を含む。それらの方法及びキットのいくつかの実施形態において、ＡＢは、Ｆａｂフラグメント、ｓｃＦｖ又は単鎖抗体（ｓｃＡｂ）を含む。
それらの方法及びキットのいくつかの実施形態において、切断剤は、標的と、対象又はサンプルにおいて共局在するプロテアーゼであり、そしてＣＭはプロテアーゼのための基質として機能するポリペプチドであり、ここで、活性化可能抗体がプロテアーゼに供される場合、前記プロテアーゼは、活性化可能抗体におけるＣＭを切断する。それらの方法及びキットのいくつかの実施形態において、ＣＭは、１５個までの長さのアミノ酸ポリペプチドである。それらの方法及びキットのいくつかの実施形態において、ＣＭは、ＡＢのＮ末端にカップリングされる。それらの方法及びキットのいくつかの実施形態において、ＣＭは、ＡＢのＣ末端にカップリングされる。それらの方法及びキットのいくつかの実施形態において、ＣＭは、ＡＢのＶＬ鎖のＮ末端にカップリングされる。
本開示の活性化可能抗体及び／又は複合活性化可能抗体は、診断及び予防製剤に使用される。１つの実施形態において、活性化可能抗体は、１若しくは複数の前述の癌又は線維製障害を発症する危険性がある患者に投与される。
炎症、炎症性疾患、癌又は他の障害の１若しくは複数に対する患者又は器官の素因は、遺伝子型、血清学的又は生化学的マーカーを用いて決定され得る。
本開示のいくつかの実施形態において、活性化可能抗体及び／又は複合活性化可能抗体は、１若しくは複数の前述の障害に関連する臨床学的徴候を有するものとして診断されたヒト個人に投与される。診断に基づいて、活性化可能抗体及び／又は複合活性化可能抗体は、臨床学的徴候の効果を軽減するか又は無効にするために投与される。
本開示の活性化可能抗体及び／又は複合活性化可能抗体はまた、患者サンプルにおける標的の検出においても有用であり、そして従って、診断としても有用である。例えば、本開示の抗体及び／又は活性化可能抗体は、患者サンプルにおける標的レベルを検出するために、インビトロアッセイ、例えばＥＬＩＳＡに使用される。
１つの実施形態において、本開示の活性化可能抗体は、固体支持体（例えば、マイクロタイタープレートのウェル）上に固定される。固定された活性化可能抗体は、試験サンプルに存在できるいずれかの標的のための保護抗体として機能する。患者サンプルと固定された抗体との接触の前、固体支持体は、すすがれ、そしてブロッキング剤、例えば乳タンパク質又はアルブミンにより、分析物の非特異的吸着を妨げるために処理される。
結果的に、ウェルは、抗原を含む疑いのある試験サンプル、又は標準量の抗原と含む溶液により処理される。斯かるサンプルは例えば、病理学の診断であると見なされるレベルの循環抗体を有する疑いのある対象からの血清サンプルである。試験サンプル又は標準をすすいだ後、固体支持体は、検出可能的に標識される二次抗体により処理される。標識された二次抗体は、検出抗体として作用する。検出可能標識のレベルが測定され、そして試験サンプル中の標的抗原の濃度が、標識サンプルから得られる標準曲線との比較により決定される。
インビトロ診断アッセイで本開示の抗体を用いて得られる結果に基づけば、標的抗体の発現レベルに基づいて対象における疾患を段階的に分けることが可能であることが理解されるであろう。所定の疾患に関しては、血液サンプルが疾患の進行における種々の段階であるものとして診断された患者から、及び／又は疾患の治療処置における種々の点で採取される。進行又は治療の各段階について統計学的に有意な結果を提供するサンプル集団を用いて、各段階の特性と考えられ得る抗原の濃度範囲が示される。
活性化可能抗体及び／又は複合活性化可能抗体はまた、診断及び／又はイメージング方法にも使用され得る。いくつかの実施形態において、斯かる方法は、インビトロ方法である。いくつかの実施形態において、斯かる方法は、インビボ方法である。いくつかの実施形態において、斯かる法方は、インサイチュ方法である。いくつかの実施形態において、斯かる方法はエクスビボ方法である。例えば、酵素切断できるＣＭを有する活性化可能抗体は、ＣＭを切断できる酵素の存在又は不在を検出するために使用され得る。斯かる活性化可能抗体は、所定の宿主生物の所定の細胞又は組織における活性化された抗体（すなわち、活性化可能抗体の切断に起因する抗体）の測定される蓄積を通して酵素活性（又は、いくつかの実施形態において、ジスルフィド結合の還元を提供することができる高められた還元電位の環境）のインビボ検出（例えば、定性的又は定量的）を包含することができる診断に使用され得る。活性化された抗体のそのような蓄積は、組織が酵素活性（又はＣＭの性質に依存する高められた還元電位）を表すことを示すのみならず、また組織が活性化された抗体が結合する標的を表すことも示唆する。
例えば、ＣＭは、腫瘍の部位で、ウィルス又は細菌感染の部位で、生成学的に制限された部位で(例えば、膿瘍において、器官において、及び同様において)、及び同様の部位で見出されるプロテアーゼのためのプロテアーゼ基質として選択され得る。ＡＢは、標的抗原を結合するものである。本明細書中に開示した方法、又は適切であれば当業者になじみの方法を用いて、検出可能標識（例えば、蛍光標識又は放射性標識又は放射性トレーサー）は、ＡＢ、又は活性化可能抗体の他の領域に結合され得る。適切な検出可能標識は、上記スクリーニング方法において論じられ、そして追加の特定の例が下記に提供される。その活性が興味ある疾患組織において高められるプロテアーゼと共に、病状のタンパク質又はペプチドに対して特異的なＡＢを用いて、活性化可能抗体は、ＣＭ特異的酵素が検出可能レベルで存在しないか、又は疾患組織においてよりも低いレベルで存在するか、又は不活性である（例えば、チモーゲン形で、又は阻害剤との複合体下で）、組織と比較して、疾患組織への結合率の増加を示すであろう。小タンパク質及びペプチドは腎臓濾過システムにより血液から急速にクリアランスされるので、及びＣＭに対して特異的な酵素は検出可能レベルで存在しないので（又は非疾患組織に低レベルで存在するか、又は不活性コンホメーション下で存在する）、疾患組織における活性化された抗体の蓄積は、非疾患組織に対して増強される。
別の例によれば、活性化可能抗体は、サンプルにおける切断剤の存在又は不在を検出するために使用され得る。例えば、活性化可能抗体が酸素による切断に対して敏感なＣＭを含む場合、活性化可能抗体は、サンプル中の酵素の存在を検出する（定性的に又は定量的に）ために使用され得る。活性化可能抗体が還元剤による切断に対して敏感なＣＭを含む別の例によれば、活性化可能抗体は、サンプルにおける還元状態の存在を検出する（定性的に又は定量的に）ために使用され得る。それらの方法での分析を促進するためには、活性化可能抗体は検出可能的に標識され得、そして支持体（例えば、固体支持体、例えばスライド又はビーズ）に結合され得る。検出可能標識は、切断に続いて放出されない活性化可能抗体の一部上に位置し、例えば検出可能標識は、クエンチ蛍光標識、又は切断が生じるまで検出できない他の標識であり得る。アッセイは、例えば固定された、検出可能的に標識された活性化可能抗体と、酵素及び／又は還元剤を含む疑いがあるサンプルとを、切断が生じるのに十分な時間、接触し、次に過剰のサンプル及び汚染物を除去するために洗浄することにより実施され得る。次に、サンプル中に切断剤（例えば、酵素又は還元剤）の存在又は不在が、サンプルとの接触の前、活性化可能抗体の検出可能シグナルの変化、例えばサンプル中の切断剤による活性化可能抗体の切断による検出可能シグナルの存在及び／又は上昇により評価され得る。
斯かる検出方法は、切断される場合、活性化可能抗体のＡＢを結合できる標的の存在又は不在の検出を提供できるよう適合され得る。従って、アッセイは、切断剤の存在又は不在、及び興味ある標的の存在又は不在を評価するように適合され得る。切断剤の存在又は不在は、上記のような活性化可能抗体の検出可能レベルでの存在及び／又は上昇により検出され得、そして標的の存在又は不在は標的−ＡＢ複合体の検出により、例えば検出可能的に標識された抗−標的抗体の使用により、検出され得る。
活性化可能抗体は、例えばプロテアーゼ切断及び特定標的への結合による、活性化可能抗体活性化の検証のためのインサイチュイメージングにおいても有用である。インサイチュイメージングは、生物学的サンプル、例えば細胞培養物又は組織切片におけるタンパク質分解活性及び標的の局在化を可能にする技法である。この技法を用いて、所定の標的への結合、及び検出可能標識（たとえば、蛍光標識）の存在に基づいてのタンパク質分解活性の両者を確認することが可能である。
それらの技法は、疾患部位（例えば、腫瘍組織）又は健康組織由来の任意の凍結細胞又は組織に関して有用である。それらの技法はまた、新鮮細胞又は組織サンプルに関しても有用である。
それらの技法によれば、活性化可能抗体は、検出可能標識により標識される。検出可能標識は、蛍光色素（例えば、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ））近赤外（ＮＩＲ）色素（例えば、Ｑｄｏｔ（登録商標）ナノ結晶）、コロイド状金属、ハプテン、放射性マーカー、ビオチン及び増幅試薬、例えばストレプタビジン、又は酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ又はアルカリホスファターゼ）であり得る。
標識された、活性化可能抗体と共にインキュベートされたサンプル中の標識の検出は、サンプルが標的を含み、そして活性化可能抗体のＣＭに対して特異的である、プロテアーゼを含むことを示唆する。いくつかの実施形態において、プロテアーゼの存在は、広範囲のプロテアーゼ阻害剤、例えば本明細書に記載されるそれらを用いて、及び／又はプロテアーゼに対して特異的である剤、例えばプロテアーゼであるマトリプターゼに対して特異的であり、そしてマトリプターゼのタンパク質分解活性を阻害する抗体、例えばＡ１１を用いることにより確認され得る；例えば、国際公開番号第ＷＯ２０１０／１２９６０９号（２０１０年１１月１１日に公開された）を参照のこと。広範囲のプロテアーゼ阻害剤、例えば本明細書に記載されるそれらを使用し、及び／又はより選択的な阻害剤を使用する同じアプローチが、活性可能抗体のＣＭに対して特異的なプロテアーゼ又はプロテアーゼの種類を同定するために使用され得る。いくつかの実施形態において、標的の存在は、標的、例えば別の抗体に対して特異的である剤を用いて確認され得、又は検出可能標識が、標識されていない標的と比較され得る。いくつかの実施形態において、標識されていない活性化可能抗体が、標識された二次抗体又はより複雑な検出システムによる検出を伴って、使用され得る。
類似する技法がまた、対象、例えば哺乳類、例えばヒトにおける蛍光シグナルの検出が、疾患部位が標的を含み、そして活性化可能抗体のＣＭに対して特異的である、プロテアーゼを含むことを示唆する、インビボイメージングのためにも有用である。
それらの技法はまた、活性化可能抗体におけるプロテアーゼ−特異的ＣＭに基づいて、種々の細胞、組織及び生物におけるプロテアーゼの検出、同定又は特徴化のために、キットにおいて、及び／又は試薬としても有用である。
いくつかの実施形態において、インサイチュイメージング及び／又はインビボイメージングは、治療する患者を同定する方法において有用である。例えば、インサイチュイメージングによれば、活性化可能抗体は、適切な位置で、例えば腫瘍部位で、適切なプロテアーゼ及び標的を有するそれらの患者を同定するために、患者サンプルをスクリーニングするために使用される。
いくつかの実施形態において、インサイチュイメージングが、本開示の活性化可能抗体による治療のために適切な患者集団を同定するか、又は他方では、細分するために使用される。例えば、標的、及び試験される活性化可能抗体の切断可能部分（ＣＭ）（例えば、疾患部位で活性化抗体を蓄積する）における基質を切断するプロテアーゼの両者に対して陽性の患者が、斯かるＣＭを含む活性化可能抗体による治療のための適切な候補として同定される。同様に、標的、及びそれらの方法を用いて試験される活性化可能抗体中のＣＭにおいて基質を切断するプロテアーゼのいずれか又は両者に対して陰性の患者が、別の形の療法のための適切な候補として同定される（すなわち、試験されている活性化可能抗体を用いた処置に好適でない）。いくつかの実施形態において、第１の活性化可能抗体に関して陰性のそのような患者は、治療のための適切な活性化可能抗体（例えば、疾患の部位で患者により切断されるＣＭを含む活性化可能抗体）が同定されるまで、異なったＣＭを含む他の活性化可能抗体により試験され得る。
いくつかの実施形態において、インビボイメージングは、本開示の活性化可能抗体による治療のために適切な患者集団を同定するか又は細分するために使用される。例えば、標的、及び試験される活性化可能抗体の切断可能部分（ＣＭ）（例えば、疾患部位で活性化抗体を蓄積する）における基質を切断するプロテアーゼの両者に対して陽性の患者が、斯かるＣＭを含む斯かる活性化可能抗体による治療のための適切な候補として同定される。同様に、陰性の患者が、別の形の療法（すなわち、試験される活性化可能抗体による治療のためには適切でない）のための適切な候補として同定される（すなわち、試験されている活性化可能抗体を用いた処置に好適でない）。いくつかの実施形態において、第１の活性化可能抗体に関して陰性のそのような患者は、治療のための適切な活性化可能抗体（例えば、疾患の部位で患者により切断されるＣＭを含む活性化可能抗体）が同定されるまで、異なったＣＭを含む他の活性化可能抗体により試験され得る。
医薬組成物
本開示の複合抗体、活性化可能抗体及び／又は複合活性化可能抗体（また「活性化合物」として、本明細書において言及される）、その誘導体、フラグメント、類似体及び相同体は、投与のために適切な医薬組成物中に組み込まれ得る。斯かる組成物は典型的には、複合抗体、活性化可能抗体及び／又は複合活性化可能抗体、並びに医薬的に許容し得る担体を含む。本明細書において使用される場合、用語「医薬的に許容し得る担体」とは、医薬投与に適合できる、いずれか及びすべての溶媒、分散媒体、コーチング、抗菌及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤、及び同様のものを含むよう意図される。適切な担体は、参照により本明細書に組み込まれる、分野的標準参考テキストである、Remington’s Pharmaceutical Sciencesの最新版に記載される。斯かる担体又は希釈剤の例は、水、生理食塩水、リンガー溶液、デキストロース液体、及び５％ヒト血清アルブミンを包含するが、但しそれらだけには限定されない。リボソーム及び非水性ビヒクル、例えば固定油がまた使用され得る。医薬敵活性物質のための斯かる媒体及び剤の使用は、周知である。いずれかの従来の媒体又は剤が活性化合物と不適合である限りを除いて、組成物へのそれらの使用が企画される。補助活性化合物もまた、組成物中に組み込まれ得る。
本開示の医薬組成物は、その意図される投与経路と適合できるよう処方される。投与経路の例は、非経口、例えば静脈内、皮内、皮下、経口（例えば、吸入）、経皮（すなわち、局所）、経粘膜、及び直腸投与を包含する。非経口、皮内又は皮下適用のために使用される溶液又は懸濁液は次の成分を含むことができる：無菌希釈剤、例えば注射用蒸留水、生理食塩水溶液、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール又は他の合成溶媒；抗菌剤、例えばベンジルアルコール又はメチルパラベン；酸化防止剤、例えばアスコルビン酸又は亜硫酸水素ナトリウム；キレート剤、例えばエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）；緩衝液、例えば酢酸塩、クエン酸塩又はリン酸塩及び張性の調整のための剤、例えば塩化ナトリウム又はデキストロース。ｐＨは、酸又は塩基、例えば塩酸又は水酸化ナトリウムにより調節され得る。非経口製剤は、アンプル、使い捨て注射器、又はガラス又はプラスチック製の複数用量バイアル中に封入され得る。
注射使用に適した医薬組成物は、無菌注射用溶液又は分散液の即時調整のための無菌水溶液（ここで、水溶性）又は分散液、及び無菌粉末を含む。静脈内投与に関しては、適切な担体は、生理食塩水、静菌水、Cremophor EL（登録商標）（BASF, Parsippany, N.J.）又はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を含む。すべての場合、組成物は、無菌であるべきであり、そして容易な注射針通過性が存在する程度に流動する必要がある。それは、製造及び貯蔵の条件下で安定性でなければならず、そして微生物、例えば細菌及び真菌の汚染作用に対して保存されるべきである。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコール、及び同様のもの）、及びそれらの適切な混合物を含む溶媒又は分散性媒体であり得る。適切な流動性は、例えばコーチング、例えばレシチンの使用により、分散液の場合、必要とされる粒度の維持により、及び界面活性剤の使用により維持され得る。微生物の作用の防止は、種々の抗菌剤及び抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサール及び同様のものにより達成され得る。いくつかの実施形態において、等張剤、例えば糖、ポリアルコール、例えばマニトール、ソルビトール、塩化ナトリウムを、組成物に含むことが望ましい。注射用組成物の持続吸収は、吸収を遅延する剤、例えばモノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを、組成物に含むことによりもたらされ得る。
無菌注射用溶液は、上記に列挙される１つの成分又は成分の組み合わせと共に、適切な溶媒に、必要とされる量の活性化合物を組み込むことにより、必要なら、続いて濾過殺菌により調製され得る。一般的に、分散液は、塩基性分散液媒体及び上記に列挙されるそれらからの必要とされる他の成分を含む無菌ビヒクル中に、活性化合物を組み込むことにより調製される。注射用溶液の調製のための無菌粉末の場合、調製方法は、活性成分の粉末、及び前もって無菌濾過された溶液からの任意の追加の所望する成分の粉末を生成する、真空乾燥及び凍結乾燥である。
経口組成物は一般的に、不活性希釈剤又は食用担体を含む。それらは、ゼラチンカプセルに封入されるか、又は錠剤に圧縮される。経口治療投与のためには、活性化合物が、賦形剤と共に組込まれ、そして錠剤、トローチ又はカプセルの形で使用され得る。経口組成物はまた、マウスウォシュとしての使用のために流体担体を用いて調製され得、ここで流体担体中、化合物が経口適用され、うがいされ、そして吐き出されるか、又は飲み込まれる。医薬的に適用できる結合剤及び／又はアジュバント材料が、組成物の一部として含まれ得る。錠剤、ピル、カプセル、トローチ及び同様のものは、次の成分、又は類似する性質の化合物：結合剤、例えば微結晶性セルロース、トラガカントゴム又はゼラチン；賦形剤、例えば澱粉又はラクトース、崩壊剤、例えばアルギン酸、プリモゲル又はコーンスターチ；潤滑剤、例えばステアリン酸マグネシウム又はステローツ（Sterotes）；流動促進剤、例えばコロイド状二酸化珪素；甘味剤、例えばスクロース又はサッカリン；又は風味剤、例えばペパーミント、サリチル酸メチル又はオレンジ香料、のいずれかを含むことができる。
吸入による投与に関しては、化合物は、適切な推進剤、例えばガス、例えば二酸化炭素を含む加圧された容器又は分散器、又はネブライザーからエアロゾル噴霧の形で供給される。
全身性投与はまた、経粘膜又は経皮手段によるものであっても良い。経粘膜又は経皮投与に関しては、浸透されるバリアに適切な浸透剤が製剤に使用される。斯かる浸透剤は一般的に周知であり、そして例えば、経粘膜投与のためには、界面活性剤、胆汁酸塩、及びフシジン酸誘導体を包含する。経粘膜投与は、鼻用スプレー又は坐剤の使用を通して達成され得る。経皮投与に関しては、活性化合物は、一般的に当業界において知られているように、軟膏、膏剤、ゲル又はクリーム中に処方される。
化合物はまた、直腸供給のためには、坐剤（例えば、従来の坐剤基材、例えばココアバター及び他のグリセリドを含む）、又は保持浣腸の形でも調製され得る。
１つの実施形態において、活性化合物は、身体からの急速な排除に対して化合物を保護するであろう担体、例えば制御放出製剤、例えばインプラント及びマイクロカプセル化送達システムにより調製される。生分解性、生体適合性ポリマー、例えばエチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル及びポリ乳酸が使用され得る。斯かる製剤の調製方法は、当業者に明らかであろう。材料はまた、Alza Corporation and Nova Pharmaceuticals, Inc.から商業的に得られる。リポソーム懸濁液（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体により、感染された細胞に標的化されるリポソームを含む）はまた、医薬的に許容し得る担体としても使用され得る。それらは、米国特許第４，５２２，８１１号に記載されるように、当業者に知られている方法に従って調製され得る。
容易な投与及び投薬量の均一性のために、投薬単位形で、経口又は非経口組成物を処方することが特に好都合である。投薬単位形とは、本明細書において使用される場合、治療される対象のために単位投与量として適した物理的に別個の単位を言及し；各単位は、必要とされる医薬担体と共に所望する治療効果を生成するために計算された所定量の活性化合物を含む。本開示の単位剤形の仕様は、活性化合物のユニーク特性及び達成される特定の治療効果、及び個人の治療のために活性化合物を配合する技術的に固有の制限により決定され、そしてそれらに直接的に依存する。
医薬組成物は、投与についての説明書と共に、容器、パック又はディスペンサーに含まれ得る。
本発明はさらに、次の実施例に記載されるが、それらは請求項に記載される本発明の範囲を限定されるものではない。
実施例１．材料と方法
試薬と菌株：ストレプトアビジン複合化フィコエリトリン（ＳＡ‐ＰＥ）（Invitrogen, Life Technologies）を修飾せずに使用した。ヒトマトリプターゼ‐１（Research & Diagnostics Systems, Inc.）を修飾せずに使用した。ヒトプラスミン（Haematologic Technologies Inc.）を修飾せずに使用した。ヒトｔＰＡ（Molecular Innovations）を修飾せずに使用した。Ｍｏｎａ（単球のアダプター）のＳＨ３ドメインに融合させたＹＰｅｔを修飾せずに使用した。ＴＢＳＴ（５０ｍＭのＴｒｉｓ ＨＣｌ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．４）を使用した。Ｅ．コリ（E. coli）ＭＣ１０６１（Casadaban et al., JMB 138(2):179-207 (1980)）を使用した。すべての細菌増殖を、別の抗生物質を指定しない限り３４μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールを補ったＬＢ培地（ＬＢ）中で激しく振盪しながら、３７℃にて実施した。
基質切断と足場安定性分析：スクリーニング及びクローン分析のために、一晩培養した物を、新鮮培地（１：５０）中に希釈し、１．５〜２時間培養することによって継代培養した。各継代培養物を、次に、０．０４％のアラビノースによって誘導し、振盪しながら３７℃にて１時間インキュベートした。更なる増殖を停止するために、細胞を氷上で１５〜３０分間インキュベートした。細胞アリコートを集菌し、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で洗浄した。細胞を遠心分離によってペレット化し、上清を除去し、そして細胞を酵素含有反応バッファー中に再懸濁した；反応混合物を３７℃にて動かさずインキュベートした。反応を停止するために、細胞を取り出し、ＰＢＳ中に１０倍に希釈し、遠心分離によってペレット化し、そして、ＳＡ‐ＰＥ（μｇ／の２０ｍＬ）又はＹＰｅｔ‐Ｍｏｎａ（５０ｎＭ）のいずれかを含んでいるＰＢＳ中に再懸濁した。氷上におけるインキュベーション（３０分間）後に、細胞をＰＢＳで洗浄し、ＦＡＣＳＡｒｉａ(商標)セルソーターを使用して分析した。
プロテアーゼ切断アッセイのために、培養物を１時間誘導した。マトリプターゼ‐１のための反応バッファーはＴＢＳＴであった。マトリプターゼ‐１加水分解に関するアッセイを、１時間の２００ｐＭ〜２００ｎＭのマトリプターゼ‐１を用いた反応後に実施した。指定した基質領域内に生じる加水分解を保証するために、基質部位に隣接する領域のバックグラウンド加水分解を各反応条件下で計測した（２０１３年８月９日に出願され、２０１４年２月１３日にＷＯ２０１４／０２６１３６として公開されたＰＣＴ特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ１３／５４３７８号に記載のプラットフォームｅＣＬｉＰＳ３．０‐ＮＳＵＢ＿ＳＰを使用した）。
ヒトプラスミン安定性分析のために、プラットフォームｅＣＬｉＰＳ３．０‐ＮＳＵＢ＿ＳＰを使用した；培養物を１時間誘導した。プラスミンのための反応バッファーは、１００ｍＭのＮａＣｌ、０．０１％のＴｗｅｅｎ２０、及び１ｍＭのＥＤＴＡを補った５０ｍＭのＴｒｉｓ ＨＣｌ ｐＨ７．５であった。プラスミン加水分解のためのアッセイを、プラスミンを用いた反応の１時間後に実施した。
ヒトｔＰＡ安定性分析のために、プラットフォームｅＣＬｉＰＳ３．０‐ＮＳＵＢ＿ＳＰを使用した；培養物を１時間誘導した。ｔＰＡのための反応バッファーはＴＢＳＴであった。ｔＰＡ加水分解のためのアッセイを、ｔＰＡを用いた反応の１時間後に実施した。
アミノ及びカルボキシ末端の標識条件：ストレプトアビジン複合化フィコエリトリン（ＳＡＰＥ）を、ＣＰＸのＮ末端でストレプトアビジン結合親和性リガンドを標識するために使用した。ＭｏｎａのＳＨ３ドメインに融合した蛍光タンパク質ＹＰｅｔを、ＣＰＸのＣ末端でＭｏｎａ結合親和性リガンドを標識するために使用した。プロテアーゼ反応のない細胞の最適な標識のために、細胞をＳＡＰＥ（２０μｇ／ｍＬ）又はＹＰｅｔ‐Ｍｏｎａ（５０ｎＭ）と共に４℃にて３０分間インキュベートした。
反応速度データ分析：細胞表面提示ペプチド基質の変換の程度を、プロテアーゼ処理によるクローン細胞集団の平均蛍光における変化を計測するためにフローサイトメトリーを使用して直接計測した。具体的には、各サンプルに関して、変換を、以下の相関関係を使用したフローサイトメトリー分析によって決定した：
Figure 2017509594
ここで、（ＦＬ−）は酵素なしインキュベーション後の蛍光であり、（ＦＬ＋）は酵素ありインキュベーション後の蛍光であり、及び（ＦＬ０）は非標識細胞の蛍光である。予想される使用基質濃度が、標的プロテアーゼ（target protease）のための基質の予想されるＫＭを有意に下回ることを考慮して、ミカエリス‐メンテン（Michaelis-Menton）モデルを以下のように簡略化し：
Figure 2017509594
そして、基質の変換を以下のように表現できる：
Figure 2017509594
ここで、［Ｓ］は基質濃度であり、［Ｅ］は酵素濃度であり、及びｔは時間である。二次反応速度定数（ｋｃａｔ／ＫＭ）を決定するために、方程式［３］を簡略化した：
Figure 2017509594
配列データ分析‐メタモチーフ：基質をＩｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ(商標)配列決定法に供した（例えば、Rothenberg, JM, Nature 475, 348-352を参照のこと）。未処理のＩｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ読み取り物を不変ベクター配列によって切り取り、可変ペプチド挿入物のみを得た。挿入配列を翻訳し、終止コドンのある配列を更なる分析から除外した。それぞれの配列の頻度は、観察したすべての実行可能なペプチド読み取り物から観察された回数によって得られた。配列の豊富さは、選択後のそれぞれの配列の観測頻度を選択前のそれぞれの配列の頻度と比較することによって得た。モチーフ分析を、すべての可能性のある２ｍｅｒｓ、３ｍｅｒｓ、４ｍｅｒｓ、並びに非連続１ｎ２ｍｅｒｓ、２ｎ１ｍｅｒｓ、２ｎ２ｍｅｒｓ及び２ｎｎ２ｍｅｒｓ（ここで、最初の数字が第１の不変位置を表し、２番目の数字が第２の不変位置を表し、そして間のｎの数が２つの不変位置の間にある可変位置の数を表す）を抽出することによって実施した。それぞれのモチーフの頻度は、選択前及び選択後ライブラリの両方ですべての標準化配列にわたって確立されて、それぞれのモチーフの豊富さの有意性を確立している。メターモチーフを作り出すために、各モチーフを含むすべての配列を整列し、そして、モチーフ担体内の各位置におけるアミノ酸傾向を表している位置加重行列（Positional Weight Matrix）（ＰＷＭ）を作成した。プロファイル‐プロファイル整列及びスコアリングを、それぞれのプロファイル‐プロファイル整列レジスタをスコア化するための最小相互情報量（Minimum Mutual Information Content）（ＭＭＩＣ）スコア関数を使用して、すべてのモチーフにわたって実施した。有意である場合には、独特の形成ＰＷＭから成る不正確なレジスタのバックグラウンドを先に整列したレジスタを抽出し；次に、個々のＰＷＭを加え、平均メタモチーフを作成した。
配列データ分析‐定方向ファミリー：最終的な基質プールをＩｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ(商標)配列決定法を使用して配列決定した。個々の配列を同定し、これらのデータから単離し、そして、配列をＣＬＣ ｍａｉｎ ｌａｂ（ＣＬＣメインワークベンチ６．６．２、オンラインで入手可能）により整列した。整列ファイルをＪａｌｖｉｅｗにインポートし（例えばWaterhouse, A.M., et al., 2009, Bioinformatics 9, 1189-1191を参照のこと）、平均距離系統樹をＢＬＯＳＵＭ６２アルゴリズムを使用して構築した（S Henikoff S et al., 1992, Proc Natl Acad Sci U S A. 89, 10915-10919）。制限される配列の基としては、着目の配列に最も近いクラスタ部材が挙げられる。伸長される配列の基としては、（適切である場合に）最も近い共通祖先を共有する分岐を追加する配列が挙げられる。
実施例２．プラットフォーム足場内の基質プールの選択と特徴づけ
細胞全体におけるマルチコピー基質ディスプレイの使用はマトリプターゼ‐１によって切断される基質集団の選択を可能にした。組み換えヒトマトリプターゼ‐１を使用した選択を、２０１０年２月２３日に交付された米国特許第７，６６６，８１７Ｂ号に記載のとおり実施した。（プラットフォームｅＣＬｉＰＳ３．０‐ＮＳＵＢ＿ＳＰを使用した）基質部位に隣接する領域のバックグラウンド加水分解を、各反応条件下で計測して、指定された基質領域において起こる加水分解を保証した。最終的なプールを、マトリプターゼ‐１、プラスミン、及びｔＰＡに対して試験した。該プールは、マトリプターゼ‐１によって切断されたが、ｔＰＡ又はプラスミンによって切断されなかった。図１は、ＴＢＳＴ中でのマトリプターゼ‐１によるプールＳＭＰ３０の切断を示し、図２は、共にＴＢＳＴ中、プールＳＭＰ１７に関する５０ｎＭのマトリプターゼ‐１による切断、及びｔＰＡに対する抵抗性を示す。同様の技術を使用して、別のライブラリをスクリーニングして、マトリプターゼ‐１とｕ‐プラスミノーゲン活性化因子の両方で切断されるが、ｔＰＡ又はプラスミンによって切断されない基質を選択した。
実施例３．プラットフォーム足場における基質切断反応速度の特徴づけ
細胞全体におけるマルチコピー基質ディスプレイの使用は切断反応速度の簡単で直接的な定量的特徴づけを可能にした。その結果、フローサイトメトリーを、基質変換に基づいて個々の単離クローンを格付けするのに使用し、そしてクローンをＤＮＡ配列決定によって同定した。このようにして、各クローンに関する変換の程度を、いくつかの異なったプロテアーゼ濃度にて測定し、そして、ミカエリス‐メンテンモデル（反応速度データ分析の項）に当てはめることができる。観察した二次反応速度定数（ｋｃａｔ／ＫＭ）を各基質対マトリプターゼ‐１に関して決定した。（プラットフォームｅＣＬｉＰＳ３．０‐ＮＳＵＢ＿ＳＰを使用した）基質に隣接する領域のバックグラウンド加水分解を各反応条件下で計測して、指定された基質領域において起こる加水分解を保証した。例えば、図３は、ＴＢＳＴ中、マトリプターゼ‐１によるアミノ酸配列ＶＡＧＲＳＭＲＰを含む基質の切断を示す。
実施例４．活性化可能抗体のインビトロ基質活性
この実施例は、本開示の基質に関して、それらが活性化可能抗体内に組み込まれた場合のインビトロにおける活性を実証する。
これらの試験で同定したいくつかの基質を、３９５４マスクを有するＰｒｏｂｏｄｉｅｓ及び（ＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１３／１６３６３１に記載の）セツキシマブのＣ２２５ｖ５バリアントに挿入した。前記文献の全体を参照により本明細書中に援用する。
得られた活性化可能抗体内の基質がマトリプターゼ‐１又はｕＰＡによって切断される能力を次のようにして測定した。すべてのプロテアーゼ消化を、５０ｍＭのＴｒｉｓ ＨＣｌ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％のＴｗｅｅｎ‐２０、ｐＨ＝７．４中で実施した。様々な濃度の活性部位滴定ｕＰＡ又はマトリプターゼを、一定の活性化可能抗体濃度と組み合わせて、少なくとも５０の基質対プロテアーゼ比を維持した。サンプルを、３７℃にて最長２０時間インキュベートした。反応を止めるために、５μｌの消化産物を、２０ｍＭの２‐メルカプトエタノールを含んでいるHT Protein Express Sample Buffer（Caliper LifeSciences）７μｌに加え、９５℃にて１０分間加熱した。熱変性後、３２μｌのｄｄＨ２Ｏを加え、サンプルを製造業者の取扱説明書によりLabChip GXIIで分析した。LabChip GXIIソフトウェアを使用して、軽鎖ピーク面積を定量化した。生成物変換を、以下の方程式：切断ＬＣ／（切断ＬＣ＋非切断ＬＣ）、ＬＣ＝軽鎖、に軽鎖ピーク面積を代入することによって計算した。ｋｃａｔ／ＫＭ値を、以下の方程式を用いて決定した：
Figure 2017509594
ここで、Ｃは生成物変換であり、ｔは時間であり、及びｐはプロテアーゼ濃度（Ｍ）であって、基質濃度がＫｍを下回っており、且つ、プロテアーゼ濃度を超えていると仮定する。
ｕＰＡ及びマトリプターゼによる切断のために選択される基質を含んでいる得られた活性化可能抗体は、ｕＰＡに関して約４００〜５，０００Ｍ−１ｓ−１、及びマトリプターゼに関して約３，０００〜１００，０００Ｍ−１ｓ−１の範囲のｋｃａｔ／ＫＭ値を有した（試験した７つの基質）。
マトリプターゼによる切断のために選択される基質を含んでいる得られた活性化可能抗体は、マトリプターゼに関して約６，５００〜１００，０００Ｍ−１ｓ−１の範囲のｋｃａｔ／ＫＭ値を有した（試験した５つの基質）。
実施例５．インビボにおける活性化可能抗体の基質の安定性
この実施例は、本開示の基質に関して、それらが活性化可能抗体に組み込まれて、マウスに注入された場合のインビボにおける安定性を実証する。
先に記載したように製造した、本開示のいくつかの基質を含む活性化可能抗体を、標準的なＮＨＳエステル化学反応を使用してＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６８０又はＤｙＬｉｇｈｔ６８０のいずれかを用いて標識した。未反応の色素を、Ｚｅｂａスピン脱塩カラム（４０ｋＤａ ＭＷＣＯ、ThermoFisher）を用いた精製によって取り除いた。タンパク質濃度を、タンパク質配列及び色素吸収度を考慮した修正係数から計算した吸光係数を使用してＡ２８０によって測定した。
３匹のヌードマウス（Ｃｒｌ：ＮＵ‐Ｆｏｘｎｌｎｕ）には、０日目に１０ｍｇ／ｋｇ又は１２．５ｍｇ／ｋｇにて単回ＩＰ用量の各活性化可能抗体を与えた。マウスを４日目（投与後約９６時間）にＣＯ２窒息によって安楽死させ、そして、血液を血漿‐ＥＤＴＡとしてすぐに採取し、−８０℃にて保存した。
血漿サンプルを、ｋｃａｔ／Ｋｍの項に記載の毛細管電気泳動による分析のために調製した。簡単に言えば、５μｌの血漿を２‐メルカプトエタノールを含むProtein Express Sample Buffer７μｌに加えた。循環安定性の定量は、生成物変換の定量と同一であった。
ｕＰＡ又はマトリプターゼによる切断のために選択される本開示の基質を含んでいる１４個の活性化可能抗体のうち、１３個が採取した血漿サンプルにおいて２０％未満の切断を呈した。
実施例６．材料と方法
試薬と菌株：ヒトｕＰＡ（カタログ番号１３１０‐ＳＥ、Research & Diagnostics Systems, Inc.）を修飾せずに使用した。ヒトマトリプターゼ‐１（カタログ番号３９４６‐ＳＥ、Research & Diagnostics Systems, Inc.）を修飾せずに使用した。ヒトｔＰＡ（カタログ番号ＨＴＰＡ‐ＴＣ、Molecular Innovations）を修飾せずに使用した。ヒトプラスミン（カタログ番号ＨＣＰＭ‐０１４０、Haematologic Technologies Inc.）を修飾せずに使用した。抗ＥＥモノクローナル抗体（Covance, Princeton, NJ）をＡｌｅｘａ６４７（Life Sciences）で標識し、他に修飾せずに使用した（ＥＥ６４７と名付けた）。
Ｅ．コリＭＣ１０６１又はＭＣ１０６１誘導菌株（ＤＨ１０β）をすべての実験に使用した（Casadaban et al., JMB 138(2):179-207 (1980)）。すべての細菌増殖を、別の抗生物質を指定しない限り、３４μｇ／ｍＬのクロラムフェニコール（ｃｍ）を補ったＬＢ培地（ＬＢ）中で激しく振盪しながら３７℃にて実施した。
ディスプレイプラットフォーム：本実施形態の８〜１２アミノ酸基質を含むようにそれぞれ設計したディスプレイプラットフォームを、２０１４年２月１３日に公開された国際公開番号ＷＯ２０１４／０２６１３６に記載のとおり作製し、そして、使用した。前記文献の全体を参照により本明細書中に援用する。成熟（すなわち、シグナルペプチドなし）ＣＹＴＸ‐ＤＰ‐ＸＸＸＸＸＸＸＸディスプレイプラットフォーム（配列番号６９４）のアミノ酸配列を図４Ａに示す。ＸＸＸＸＸＸＸＸは、各基質がその中に挿入される位置を示す。ＣＹＴＸ‐ＤＰ‐ＸＸＸＸＸＸＸＸディスプレイプラットフォームのアミノ酸配列はまた、そのシグナルペプチドも含んでいる、すなわち、ＳＰ‐ＣＹＴＸ‐ＤＰ‐ＸＸＸＸＸＸＸＸディスプレイプラットフォーム（配列番号６９５）を図４Ｂに示す。
ＣＹＴＸ‐ＤＰ‐ＸＸＸＸＸＸＸＸディスプレイプラットフォーム：
GQSGQEYMPMEGGSGQXXXXXXXXSGGQGGSGGSGGSGGSGGSAYYGITAGPAYRINDWASIYGVVGVGYGSGPGGSYGFSYGAGLQFNPMENVALDFSYEQSRIRSVDVGTWILSVGYRFGSKSRRATSTVTGGYAQSDAQGQMNKMGGFNLKYRYEEDNSPLGVIGSFTYTGGSGGSSGQAAAGHHHHHHHH （配列番号６９４）
ＳＰ‐ＣＹＴＸ‐ＤＰ‐ＸＸＸＸＸＸＸＸディスプレイプラットフォーム：
MKKIACLSALAAVLAFTAGTSVAGQSGQEYMPMEGGSGQXXXXXXXXSGGQGGSGGSGGSGGSGGSAYYGITAGPAYRINDWASIYGVVGVGYGSGPGGSYGFSYGAGLQFNPMENVALDFSYEQSRIRSVDVGTWILSVGYRFGSKSRRATSTVTGGYAQSDAQGQMNKMGGFNLKYRYEEDNSPLGVIGSFTYTGGSGGSSGQAAAGHHHHHHHH （配列番号６９５）
基質切断と足場安定性分析：クローン分析のために、一晩培養した物を、新鮮培地（１：４０）中に希釈し、１．５〜２時間培養することによって継代培養した。継代培養物を、次に、０．０４％のアラビノースによって誘導し、振盪しながら３７℃にて４０分間から１時間インキュベートした。更なる増殖を停止するために、次に、細胞を氷上で１５〜１時間インキュベートした。細胞アリコートを集菌し、反応バッファーで洗浄した。細胞を遠心分離によってペレット化し、上清を除去し、そして細胞を酵素含有反応バッファー中に再懸濁した；反応混合物を３７℃にて振盪しながらインキュベートした。反応を停止するために、細胞を取り出し、ＰＢＳ中に１０倍に希釈し、遠心分離によってペレット化し、そして、抗ＥＥ６４７（１ｍｌあたり２０マイクログラム（本明細書中ではｕｇ／ｍｌ又はμｇ／ｍｌとも言及される））を含んでいるＰＢＳ中に再懸濁した。氷上におけるインキュベーション（最長１時間）後に、細胞をＰＢＳで洗浄し、Ａｃｃｕｒｉ Ｃ６セルソーターを使用して分析した。
ｕＰＡプロテアーゼ切断アッセイのために、培養物を４０分間〜１時間誘導した。ｕＰＡのための反応バッファーは、５０ｍＭのＴｒｉｓ ＨＣｌ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．４（ＴＢＳＴ）であった。ｕＰＡ加水分解に関するアッセイを、２ｎＭ〜５０ｎＭのｕＰＡを用いた１時間の切断後に実施した。指定した基質領域内に起こる加水分解を保証するために、（「基質」が非切断可能リンカーＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号６９６）であるディスプレイプラットフォーム、例えば、ＣＹＴＸ‐ＤＰ‐ＮＳＵＢを使用した）基質部位に隣接する領域のバックグラウンド加水分解を各反応条件下で計測した。
マトリプターゼ‐１プロテアーゼ切断アッセイのために、培養物を４０分間〜１時間誘導した。マトリプターゼ‐１のための反応バッファーは、５０ｍＭのＴｒｉｓ ＨＣｌ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．４（ＴＢＳＴ）であった。マトリプターゼ‐１加水分解に関するアッセイを、２ｎＭ〜５０ｎＭのマトリプターゼ‐１を用いた１時間の切断後に実施した。指定した基質領域内に起こる加水分解を保証するために、（例えば、ＣＹＴＸ‐ＤＰ‐ＮＳＵＢを使用した）基質部位に隣接する領域のバックグラウンド加水分解を各反応条件下で計測した。
ヒトプラスミンプロテアーゼ切断アッセイのために、培養物を４０分間〜１時間誘導した。プラスミンのための反応バッファーは、１００ｍＭのＮａＣｌ、０．０１％のＴｗｅｅｎ２０、及び１ｍＭのＥＤＴＡを補った５０ｍＭのＴｒｉｓ ＨＣｌ ｐＨ７．５であった。プラスミン加水分解に関するアッセイを、２０〜５００ｐＭのプラスミンを用いた１時間の切断後に実施した。指定した基質領域内に起こる加水分解を保証するために、（例えば、ＣＹＴＸ‐ＤＰ‐ＮＳＵＢを使用した）基質部位に隣接する領域のバックグラウンド加水分解を各反応条件下で計測した。
ｔＰＡプロテアーゼ切断アッセイのために、培養物を４０分間〜１時間誘導した。ｔＰＡのための反応バッファーは、５０ｍＭのＴｒｉｓ ＨＣｌ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．４（ＴＢＳＴ）であった。ｔＰＡ加水分解に関するアッセイを、２ｎＭ〜５０ｎＭのｔＰＡを用いた１時間の切断後に実施した。指定した基質領域内に起こる加水分解を保証するために、（例えば、ＣＹＴＸ‐ＤＰ‐ＮＳＵＢを使用した）基質部位に隣接する領域のバックグラウンド加水分解を各反応条件下で計測した。
アミノ末端及びカルボキシル末端の標識条件：Ａｌｅｘａ‐６４７複合抗ＥＥ抗体（ＥＥ６４７）を、ＣＹＴＸ‐ＤＰ‐ＸＸＸＸＸＸＸＸディスプレイプラットフォームのＮ末端のＥＥ結合親和性リガンドを標識するのに使用した。Ａｌｅｘａ‐６４７複合抗Ｈｉｓ抗体（Ｈｉｓ６４７）を、ＣＹＴＸ‐ＤＰ‐ＸＸＸＸＸＸＸＸディスプレイプラットフォームのＣ末端の８Ｈｉｓ結合親和性リガンドを標識するのに使用した。プロテアーゼ反応のない細胞の最適な標識のために、細胞をＥＥ６４７（１μｇ／ｍＬ）又はＨｉｓ６４７（２μｇ／ｍｌ）と共に４℃にて１時間インキュベートした。以下で記載した実施例のために、１時間のインキュベーションを使用した。
反応速度データ分析：細胞表面提示ペプチド基質の変換の程度を、プロテアーゼ処理によるクローン細胞集団の平均蛍光の変化を計測するためのフローサイトメトリーを使用して直接計測した。具体的には、各サンプルに関して、変換を、以下の相関関係を使用したフローサイトメトリー分析によって決定した：
Figure 2017509594
ここで、（ＦＬ−）は酵素なしインキュベーション後の蛍光であり、（ＦＬ＋）は酵素ありインキュベーション後の蛍光であり、及び（ＦＬ０）は非標識細胞の蛍光である。予想される使用基質濃度が、標的プロテアーゼのための基質の予想されるＫＭを有意に下回ることを考慮して、ミカエリス‐メンテンモデルを以下のように簡略化し：
Figure 2017509594
そして、基質の変換を以下のように表現できる：
Figure 2017509594
ここで、［Ｓ］は基質濃度であり、［Ｅ］は酵素濃度であり、及びｔは時間である。二次反応速度定数（ｋｃａｔ／ＫＭ）を決定するために、各基質に関する経時的変換を方程式［３］に当てはめた。
実施例７．ＣＹＴＸ‐ＤＰディスプレイプラットフォームにおける基質切断性の特徴づけ
この実施例は、本実施形態の基質がマトリプターゼ及び／又はｕＰＡによって切断されるが、プラスミン及び／又はｔＰＡによって切断されない能力を実証する。
細胞全体におけるマルチコピー基質ディスプレイの使用は、切断反応速度の簡単で直接的な定量的特徴づけを可能にした。基質をコードするクローンを、ＤＮＡ配列決定によって同定し、そして、ＣＹＴＸ‐ＤＰ‐ＸＸＸＸＸＸＸＸディスプレイプラットフォーム内に、発現されたディスプレイプラットフォームがＸＸＸＸＸＸＸＸの位置に基質（典型的には８又は１２アミノ酸）を含むようにサブクローニングした。個々の基質提示クローン（合計で１４８の独立した基質含有ディスプレイプラットフォーム）を、マトリプターゼ及び／又はｕＰＡ（標的プロテアーゼ、すなわち、基質を選択するのに使用するプロテアーゼ）及びプラスミン及び／又はｔＰＡ（標的外プロテアーゼ（off-target protease））による切断について評価した；フローサイトメトリーによって代謝回転を測定した。５１個の基質を、マトリプターゼ及びｕＰＡの両方による切断のために選択する（すなわち、マトリプターゼ及びｕＰＡ選択基質）。プールからの２８個のマトリプターゼ及びｕＰＡ選択基質を、配列番号３０８、３１４、及び３６１のアミノ酸配列を含む基質と同じプールから、並びに配列番号３６９〜３７１、３７４〜３７９、及び３８１〜３８４のアミノ酸配列を含む基質から選択する。２３個のマトリプターゼ及びｕＰＡ選択コンセンサス基質を、配列番号３０７〜３１１、３１３〜３１４、及び３２０〜３６８のアミノ酸配列を含む基質から選択する。
９７個の基質を、マトリプターゼによる切断のために選択する（すなわち、マトリプターゼ選択基質）。プールからの５２個のマトリプターゼ選択基質を、表８Ａ〜８Ｊ及び表９Ａ〜９Ｊ‐３の基質から、並びに配列番号２５０〜２６７のアミノ酸配列を含む基質から選択する。４５個のマトリプターゼ選択コンセンサス基質を、配列番号１６３〜２４９のアミノ酸配列を含む基質から選択する。
このように、各クローンに関する切断の程度を決定でき、そして、標的プロテアーゼによって切断され、そして、データを集めて、標的外プロテアーゼによって切断されなかったクローンのパーセントを決定した。（例えば、ＣＹＴＸ‐ＤＰ‐ＮＳＵＢディスプレイプラットフォームを使用した）基質部位に隣接する領域のバックグラウンド加水分解を、各反応条件下で計測して、指定された基質領域において起こる加水分解を保証した。結果を表１２に示す。
Figure 2017509594
表１２は、ＣＹＴＸ‐ＤＰディスプレイプラットフォームにおいて試験したマトリプターゼ及びｕＰＡ選択基質又はマトリプターゼ選択基質のパーセンテージを示しており、（ａ）５０ｍＭのＴｒｉｓ ＨＣｌ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．４（ＴＢＳＴ）中で３７℃にて１時間、修飾なしで使用される５０ｎＭのヒトｕＰＡ（カタログ番号１３１０‐ＳＥ、Research & Diagnostics Systems, Inc.）と共にインキュベートしたとき、２０％超の切断を呈し（５０ｎＭのｕＰＡを用いて＞２０％の切断）；（ｂ）５０ｍＭのＴｒｉｓ ＨＣｌ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．４（ＴＢＳＴ）中で３７℃にて１時間、修飾なしで使用される５０ｎＭのヒトマトリプターゼ‐１（カタログ番号３９４６‐ＳＥ、Research & Diagnostics Systems, Inc.）と共にインキュベートしたとき、２０％超の切断を呈し（５０ｎＭのマトリプターゼ‐１を用いて＞２０％の切断）；（ｃ）１００ｍＭのＮａＣｌ、０．０１％のＴｗｅｅｎ２０、及び１ｍＭのＥＤＴＡを補った５０ｍＭのＴｒｉｓ ＨＣｌ ｐＨ７．５中で３７℃にて１時間、修飾なしで使用される５００ｐＭのヒトプラスミン（カタログ番号ＨＣＰＭ‐０１４０、Haematologic Technologies, Inc.）と共にインキュベートしたとき、２０％未満の切断を呈し（５００ｐＭのプラスミンを用いて＜２０％の切断）；並びに（ｄ）５０ｍＭのＴｒｉｓ ＨＣｌ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．４（ＴＢＳＴ）中で３７℃にて１時間、修飾なしで使用される５０のｎＭのヒトｔＰＡ（カタログ番号ＨＴＰＡ‐ＴＣ、Molecular Innovations）と共にインキュベートしたとき、２０％未満の切断を呈した（５０ｎＭのｔＰＡを用いて＜２０％の切断）。
実施例８．ＣＹＴＸ‐ＤＰディスプレイプラットフォームにおける基質切断反応速度の特徴づけ
この実施例は、本実施形態の様々な基質に関する切断反応速度を実証する。
細胞全体におけるマルチコピー基質ディスプレイの使用は、切断反応速度の簡単で直接的な定量的特徴づけを可能にした。本明細書中に記載したように、クローンをＤＮＡ配列決定によって同定し、そして、ＣＹＴＸ‐ＤＰ‐ＸＸＸＸＸＸＸＸディスプレイプラットフォーム内にサブクローニングした。９０個の個々の基質提示クローンを切断に関して評価し、そして、サブセットを選択して、該クローンの標的プロテアーゼによる切断反応速度を評価した。各クローンに関する変換の程度を、いくつかの異なったプロテアーゼ濃度にて測定し、そして、本明細書中に記載したミカエリス‐メンテンモデルに当てはめることができる。（例えば、ＣＹＴＸ‐ＤＰ‐ＮＳＵＢを使用した）基質部位に隣接する領域のバックグラウンド加水分解を各反応条件下で計測して、指定された基質領域において起こる加水分解を保証した。結果を表１３及び表１４に示す。
Figure 2017509594
Figure 2017509594
実施例９．マトリプターゼ及び／又はｕＰＡによって切断可能な基質を含んでいる活性化可能抗体のインビボにおける有効性とインサイチュにおける活性化
この実施例は、マトリプターゼ及び／又はｕＰＡによって切断可能である本実施形態の基質を含んでいる活性化可能抗体がインビボにおいて有効であることを実証する。この実施例はまた、斯かる活性化可能抗体が、２０１４年７月１０日に公開された国際公開番号ＷＯ２０１４／１０７５５９に記載のものなどのインサイチュイメージングアッセイにおいて活性化可能であることも実証する。前記文献の全体を参照により本明細書中に援用する。
マトリプターゼ及び／又はｕＰＡによって切断される本実施形態の異なった基質をそれぞれ含んでいる３つの活性化可能抗体を、Ｈ２９２異種移植腫瘍担持（肺癌）マウスに対して０日目に１０ｍｇ／ｋｇにて投与した。３つの活性化可能抗体のすべてはまた、アミノ酸配列ＣＩＳＰＲＧＣＰＤＧＰＹＶＭＹ（配列番号５１５）を含むマスキング部分、並びに軽鎖（配列番号４５８）及び重鎖（配列番号４５５）を含む抗ＥＧＦＲ抗体Ｃ２２５ｖ５抗体も含んでいる。活性化可能抗体の軽鎖の立体配置は、Ｃ２２５ｖ５のマスキング部分‐基質‐軽鎖であった。
マウスを４日目（投与後約９６時間）に後眼窩採血に供した。血液を、血漿‐ＥＤＴＡとしてすぐに採取し、そして、−８０℃にて保存した。３つの活性化可能抗体を、磁性ビーズを使用した抗ヒトＩｇＧ免疫沈降反応によって血漿から精製した。毛細管電気泳動によって分析するために、５μｌの溶出ＩｇＧを、２０ｍＭの２‐メルカプトエタノールを含む７μｌのProtein Express Sample Buffer（Caliper LifeSciences）に加え、９５℃にて１０分間加熱した。熱変性後に、３２μｌのｄｄＨ２Ｏを加え、サンプルを製造業者の取扱説明書によりLabChip GXIIで分析した。LabChip GXIIソフトウェアを使用して、軽鎖ピーク面積を定量化した。生成物変換を、以下の方程式：切断ＬＣ／（切断ＬＣ＋非切断ＬＣ）、ＬＣ＝軽鎖ピーク面積、に軽鎖ピーク面積を代入することによって計算した。４日目の時点で、３つの活性化可能抗体は、１３％〜３０％に及ぶ活性化値の平均％を実証した。活性化の平均％は、（（試験群の生成物変換の合計）＊１００％）／（試験群の動物数）として計算される。
３つの活性化可能抗体は、Δ阻害の平均％として計測した場合に、３２％〜５９％に及ぶ腫瘍増殖阻害を実証した。Δ阻害の平均％は、（平均（Ｃ）−平均（Ｃ０））−（平均（Ｔ）−平均（Ｔ０））／（平均（Ｃ）−平均（Ｃ０））＊１００％｛式中、Ｔは現在の試験群値であり、Ｔ０は現在の試験群の初期値であり、Ｃは対照群値であり、及びＣ０は対照群の初期値である｝として計算される。ＥＧＦＲ抗体のセツキシマブは、この試験で９６％の阻害を実証した。
同じ３つの活性化可能抗体を、ＷＯ２０１４／１０７５５９、前掲の実施例に記載の条件を使用して、マウス異種移植腫瘍組織のインサイチュイメージングアッセイに供した。３つの活性化可能抗体は活性化されて、そして、基質を切断し、放出された抗体が腫瘍組織のＥＧＦＲに結合したことを実証した。染色シグナルは、セツキシマブのＩＨＣシグナル強度の１５％〜８５％に及んだ。
他の実施形態
本発明はその詳細な説明と共に記載されて来たが、前述の記載は例示的であり、添付の特許請求の範囲により定義される本発明の範囲を限定するものではない。他の態様、利点及び改変は、以下の範囲内である。

Claims (57)

  1. 配列番号２６９〜２７３、２７５〜２７９、２８１、２８２、２８４〜２８６、２７０〜２７３、２〜５、７〜９、１１、１２、１４〜１７、１９、２０、２２〜２５、２７〜３０、３２〜３４、３６〜３９、４１〜４４、及び２５０〜２６７から成る群から選択されるアミノ酸配列を含んでいる切断可能部分（ＣＭ）を含み、ここで、該切断可能部分がプロテアーゼのための基質である単離ポリペプチド。
  2. 前記ＣＭが、配列番号２８８〜２９２、２９４〜２９８、３００、３０１、及び３０３〜３０６から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の単離ポリペプチド。
  3. 前記ＣＭが、配列番号３０７〜３１１、３１３、３１４、３２０〜３７１、３７４〜３７９、及び３８１〜３８４から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の単離ポリペプチド。
  4. 前記ＣＭが、配列番号４６〜４９、５１〜５３、５５〜５７、５９〜６１、６３、６４、６６、６７、６９、７０、７２〜７５、７７〜８０、８２〜８５、８７〜８９、９１〜９３、９５〜９７、９９〜１０２、１０４〜１０７、１０９〜１１２、１１４〜１１７、１１９〜１２２、１２４〜１２７、１２９〜１３２、１３４〜１３７、１３９〜１４２、１４４〜１４７、１４９〜１５２、１５４〜１５７、及び１５９〜１６２から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の単離ポリペプチド。
  5. 前記ＣＭが、配列番号１６３〜２４９から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の単離ポリペプチド。
  6. 前記ＣＭが、配列番号２５０〜２５３から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の単離ポリペプチド。
  7. 前記ＣＭが、配列番号２５４〜２６７から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の単離ポリペプチド。
  8. 前記ＣＭが、少なくともマトリプターゼプロテアーゼ又はｕ‐プラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）プロテアーゼのための基質である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の単離ポリペプチド。
  9. 前記単離ポリペプチドが、ＣＭに対してアミノ（Ｎ）末端近くに位置している部分（ＭＮ）、ＣＭに対してカルボキシル（Ｃ）末端に位置している部分（ＭＣ）、及びその組み合わせから成る群から選択される少なくとも１つの追加部分（Ｍ）を含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の単離ポリペプチド。
  10. 前記単離ポリペプチドが、少なくとも１つのＭＮ及び少なくとも１つのＭＣを含む、請求項９に記載の単離ポリペプチド。
  11. 前記ＭＮが、マスキング部分、抗体、タンパク質、治療薬、抗悪性腫瘍薬、毒性剤、薬剤、検出可能部分、診断剤、及び親和性タグから成る群から選択される、請求項９に記載の単離ポリペプチド。
  12. 前記ＭＣが、マスキング部分、抗体、タンパク質、治療薬、抗悪性腫瘍薬、毒性剤、薬剤、検出可能部分、診断剤、及び親和性タグから成る群から選択される、請求項９に記載の単離ポリペプチド。
  13. 前記ポリペプチドが、標的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ）を含んでいる、請求項１〜７のいずれか１項に記載の単離ポリペプチド。
  14. 前記ＣＭが、組織内で標的と共局在しているプロテアーゼのための基質である、請求項１３に記載の単離ポリペプチド。
  15. 前記抗原結合フラグメントが、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、ｓｃＦｖ、ｓｃＡｂ、ｄＡｂ、単一ドメイン重鎖抗体、及び単一ドメイン軽鎖抗体から成る群から選択される、請求項１３に記載の単離ポリペプチド。
  16. 前記ＡＢがＣＭに連結される、請求項１３に記載の単離ポリペプチド。
  17. 前記ＡＢがＣＭに直接連結される、請求項１６に記載の単離ポリペプチド。
  18. 前記ＡＢが、連結ペプチドを介してＣＭに連結される、請求項１６に記載の単離ポリペプチド。
  19. 前記単離ポリペプチドがマスキング部分（ＭＭ）を含み、ここで、該ＭＭが、標的への結合に関するＡＢの平衡解離定数より高いＡＢへの結合に関する平衡解離定数を有する、請求項１３に記載の単離ポリペプチド。
  20. 前記ＭＭが、４０アミノ酸未満の長さのポリペプチドである、請求項１９に記載の単離ポリペプチド。
  21. 前記ＭＭがＣＭに連結され、その結果、未切断状態において、単離ポリペプチドが次のようなＮ末端からＣ末端への構造配置：ＭＭ‐ＣＭ‐ＡＢ又はＡＢ‐ＣＭ‐ＭＭを含む、請求項１９に記載の単離ポリペプチド。
  22. 前記単離ポリペプチドが、ＭＭとＣＭとの間に連結ペプチドを含む、請求項２１に記載の単離ポリペプチド。
  23. 前記単離ポリペプチドが、ＣＭとＡＢとの間に連結ペプチドを含む、請求項２１に記載の単離ポリペプチド。
  24. 前記単離ポリペプチドが、第１連結ペプチド（ＬＰ１）及び第２連結ペプチド（ＬＰ２）を含み、ここで、該単離ポリペプチドが、未切断状態で、次のようなＮ末端からＣ末端への構造配置：ＭＭ‐ＬＰ１‐ＣＭ‐ＬＰ２‐ＡＢ又はＡＢ‐ＬＰ２‐ＣＭ‐ＬＰ１‐ＭＭを有する、請求項２１に記載の単離ポリペプチド。
  25. 前記の２つの連結ペプチドが互いに同一である必要はない、請求項２４に記載の単離ポリペプチド。
  26. 前記ＬＰ１及びＬＰ２のそれぞれが、約１〜２０アミノ酸の長さのペプチドである、請求項２４に記載の単離ポリペプチド。
  27. 前記ＭＭのアミノ酸配列が、標的のアミノ酸配列と異なっている、請求項１９に記載の単離ポリペプチド。
  28. 前記ＭＭが、切断状態において、標的への結合に関してＡＢと干渉しないか、又は競合しない、請求項１９に記載の単離ポリペプチド。
  29. 前記ＡＢに連結したＴ細胞動員ｓｃＦｖを含んでいる、請求項１３に記載の単離ポリペプチド。
  30. 前記Ｔ細胞動員ｓｃＦｖがマスキング部分を含んでいる、請求項２９に記載の単離ポリペプチド。
  31. 前記ＡＢに連結したＴ細胞動員ｓｃＦｖを含んでいる、請求項１９に記載の単離ポリペプチド。
  32. 前記Ｔ細胞動員ｓｃＦｖがマスキング部分を含んでいる、請求項３１に記載の単離ポリペプチド。
  33. 剤に結合した、請求項１３〜１８のいずれか１項に記載の単離ポリペプチド。
  34. 前記剤が、毒素又はその断片である、請求項３３に記載の単離ポリペプチド。
  35. 前記剤が、ドラスタチン又はその誘導体、アウリスタチン又はその誘導体、マイタンシノイド又はその誘導体、デュオカルマイシン又はその誘導体、及びカリケアマイシン又はその誘導体から成る群から選択される、請求項３３に記載の単離ポリペプチド。
  36. 前記剤が検出可能部分である、請求項３３に記載の単離ポリペプチド。
  37. 前記剤が、リンカーを介してポリペプチドに結合される、請求項３３に記載の単離ポリペプチド。
  38. 前記リンカーが、切断可能リンカーである、請求項３７に記載の単離ポリペプチド。
  39. 前記ＡＢが剤に結合される、請求項１９〜２８のいずれか１項に記載の単離ポリペプチド。
  40. 前記剤が、毒素又はその断片である、請求項３９に記載の単離ポリペプチド。
  41. 前記剤が、ドラスタチン、アウリスタチン又はその誘導体、マイタンシノイド又はその誘導体、デュオカルマイシン又はその誘導体、及びカリケアマイシン又はその誘導体から成る群から選択される、請求項３９に記載の単離ポリペプチド。
  42. 前記剤が、アウリスタチンＥ又はその誘導体である、請求項３９に記載の単離ポリペプチド。
  43. 前記剤が、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）である、請求項３９に記載の単離ポリペプチド。
  44. 前記剤が、モノメチルアウリスタチンＤ（ＭＭＡＤ）である、請求項３９に記載の単離ポリペプチド。
  45. 前記剤が、ＤＭ１又はＤＭ４である、請求項３９に記載の単離ポリペプチド。
  46. 前記剤が、リンカーを介してＡＢに結合される、請求項３９に記載の単離ポリペプチド。
  47. 前記リンカーが、切断可能リンカーである、請求項４６に記載の単離ポリペプチド。
  48. 検出可能部分を含んでいる、請求項１９〜２８のいずれか１項に記載の単離ポリペプチド。
  49. 前記検出可能部分が診断剤である、請求項４８に記載の単離ポリペプチド。
  50. 請求項１〜７のいずれか１項に記載の単離ポリペプチドをコードする単離核酸分子。
  51. 請求項５０に記載の単離核酸分子を含んでいるベクター。
  52. 請求項１３に記載の単離ポリペプチドをコードする単離核酸分子。
  53. 請求項５２に記載の単離核酸分子を含んでいるベクター。
  54. 請求項１９に記載の単離ポリペプチドをコードする単離核酸分子。
  55. 請求項５４に記載の単離核酸分子を含んでいるベクター。
  56. 切断可能部分（ＣＭ）を含んでいるポリペプチドを製造する方法であって、該ポリペプチドの発現につながる条件下、請求項５１、５３、又は５５のいずれか１項に記載のベクターを含んでいる細胞を培養することによる方法。
  57. 切断可能部分（ＣＭ）を含んでいるポリペプチドを製造する方法であって：
    （ａ）請求項１〜７のいずれか１項に記載の単離ポリペプチドをコードする核酸構築物を含む細胞を、該ポリペプチドの発現につながる条件下で培養し、そして、
    （ｂ）該ポリペプチドを回収すること、
    を含む方法。
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