JP2017510547A - 肝細胞ガンの処置のための方法及び医薬組成物 - Google Patents

Abstract

本発明は、肝細胞ガンの処置のための方法及び医薬組成物に関する。特に、本発明は、肝細胞ガンの処置を必要とする対象における、その処置における使用のためのＯＸ１Ｒアゴニストに関する。

Description

発明の分野：
本発明は、肝細胞ガンの処置のための方法及び医薬組成物に関する。

発明の背景：
肝細胞ガン（ＨＣＣ）は、世界中で５番目に多く見られるガンであり、ガン関連死の３番目に多く見られる原因である。本疾患は、多くの場合に臨床徴候の経過の後期に診断される。結果として、患者の１０〜１５％だけが治癒手術の候補である。ＨＣＣ患者の大多数について、全身化学療法又は支持療法は、頼みの綱の処置選択肢である。それにもかかわらず、大部分の化学療法剤は限られた有効性を示し、患者の生存期間を改善できていなかった。大部分のＨＣＣ患者の有害な臨床経過は、より効果的な化学療法及びターゲティング戦略の開発の大きな必要性を強く示している。

オレキシン（ヒポクレチン）は、視床下部で産生された２種の神経ペプチド：オレキシンＡ（ＯＸ−Ａ）（アミノ酸３３個のペプチド）及びオレキシンＢ（ＯＸ−Ｂ）（アミノ酸２８個のペプチド）を含む（Sakurai T. et al., Cell, 1998, 92, 573-585）。オレキシンは、ラットにおける摂餌を刺激することが見出され、これは、食行動をレギュレーションする中枢フィードバックメカニズムにおける伝達物質としてのこれらのペプチドにとっての生理学的役割を示唆している。オレキシンは、睡眠及び覚醒の状態をレギュレーションし、ナルコレプシー及び不眠症の患者のための潜在的に新規な治療への道を開いている。オレキシンは、覚醒、報酬、学習及び記憶にも役割を果たすとして示されている。２種のオレキシンレセプターが、哺乳動物においてクローニングされ、特徴づけられている。それらは、Ｇタンパク質共役レセプタースーパーファミリー（７回膜貫通レセプター）に属する（Sakurai T. et al., Cell, 1998, 92, 573-585）：オレキシン−１レセプター（ＯＸ１Ｒ又はＨＣＴＲ１）は、ＯＸ−ＢよりもＯＸ−Ａに対して選択性が高く、オレキシン−２レセプター（ＯＸ２Ｒ又はＨＣＴＲ２）は、ＯＸ−Ａと同様にＯＸ−Ｂと結合する。最近の研究は、結腸ガン細胞が結腸ガンの化学療法において最も一般的に使用される薬物に耐性の場合であっても、オレキシンによるＯＸ１Ｒの活性化が、結腸ガン細胞においてインビトロ及びインビボの強いアポトーシスを促進することができることを示している（Voisin T, El Firar A, Fasseu M, Rouyer-Fessard C, Descatoire V, Walker F, Paradis V, Bedossa P, Henin D, Lehy T, Laburthe M. Aberrant expression of OX1 receptors for orexins in colon cancers and liver metastases: an openable gate to apoptosis. Cancer Res. 2011 May 1;71(9):3341-51）。注目すべきは、全ての原発性結腸直腸腫瘍は、それらの局在及びデューク分類のステージにかかわらず、ＯＸ１Ｒを発現したが、一方で隣接する正常な結腸細胞及び対照の正常組織は陰性であった。したがって、本研究は、ＯＸ１Ｒが結腸ガン（化学療法抵抗性であっても）のアキレス腱であることを裏付けており、ＯＸ１Ｒアゴニストが結腸ガン療法のための新規な候補であり得ると示唆している。

発明の概要：
本発明は、肝細胞ガンの処置のための方法及び医薬組成物に関する。特に本発明は、特許請求の範囲によって定義される。

発明の詳細な説明：
本発明は、肝細胞ガンの処置を必要とする対象における、その処置における使用のためのＯＸ１Ｒアゴニストに関する。

本明細書に使用される用語「ＯＸ１Ｒ」は、当技術分野においてその一般的な意味を有し、オレキシンに対する７回膜貫通レセプターＯＸ１Ｒを表す。本発明によると、ＯＸ１Ｒは、ヒト膵臓ガン細胞系において、Ｇｑ介在性ホスホリパーゼＣ活性化及び細胞カルシウム過渡応答に関係しないメカニズムによりアポトーシスを促進する。オレキシンは、実際に、ＯＸ１Ｒ、ＩＴＩＭ及びＩＴＳＭにおいて２個のチロシンベースモチーフのチロシンリン酸化を誘導し、ホスホチロシンホスファターゼＳＨＰ−２の動員を招き、その活性化がミトコンドリア性アポトーシスの一因となる（Voisin T, El Firar A, Rouyer-Fessard C, Gratio V, Laburthe M. A hallmark of immunoreceptor, the tyrosine-based inhibitory motif ITIM, is present in the G protein-coupled receptor OX1R for orexins and drives apoptosis: a novel mechanism. FASEB J. 2008 Jun;22(6):1993-2002.;El Firar A, Voisin T, Rouyer-Fessard C, Ostuni MA, Couvineau A, Laburthe M. Discovery of a functional immunoreceptor tyrosine-based switch motif in a 7-transmembrane-spanning receptor: role in the orexin receptor OX1R-driven apoptosis. FASEB J. 2009 Dec;23(12):4069-80. doi: 10.1096/fj.09-131367. Epub 2009 Aug 6.）。ＯＸ１Ｒの例示的なアミノ酸配列は、配列番号：１として示される。

オレキシンレセプター−１ ＯＸ１Ｒ（配列番号：１）

したがって、本明細書に使用される用語「ＯＸ１Ｒアゴニスト」は、ＯＸ１Ｒに結合することができる、任意の天然又は非天然化合物であって、一過性カルシウム放出に関係なく、ＳＨＰ−２の動員及び細胞のアポトーシスの誘導を伴うシグナル伝達経路の活性化からなるＯＸ１Ｒ活性を促進する化合物を表す。

一部の実施態様では、ＯＸ１Ｒアゴニストは、小型有機分子である。用語「小型有機分子」は、一般的に医薬品に使用される有機分子に匹敵するサイズの分子を表す。本用語は、生物学的高分子（例えば、タンパク質、核酸など）を除外する。好ましい小型有機分子は、最大約５０００Da、より特には最大２０００Da、最も特には最大約１０００Daのサイズの範囲である。

ある実施態様では、ＯＸ１Ｒアゴニストは、ＯＸ１Ｒ抗体又はその部分である。

本明細書に使用される「抗体」は、天然抗体及び非天然抗体の両方を含む。具体的には、「抗体」は、ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体、並びにそれらの一価及び二価フラグメントを含む。さらに、「抗体」は、キメラ抗体、全合成抗体、単鎖抗体、及びそれらのフラグメントを含む。抗体は、ヒト又は非ヒト抗体であり得る。非ヒト抗体は、ヒトにおけるその免疫原性を低下させるためにリコンビナント法によってヒト化され得る。

本明細書記載の抗体又はそれらの部分の一部の実施態様では、抗体は、モノクローナル抗体である。本明細書記載の抗体又はそれらの部分の一部の実施態様では、抗体は、ポリクローナル抗体である。本明細書記載の抗体又はそれらの部分の一部の実施態様では、抗体は、ヒト化抗体である。本明細書記載の抗体又はそれらの部分の一部の実施態様では、抗体は、キメラ抗体である。本明細書記載の抗体又はそれらの部分の一部の実施態様では、抗体の部分は、抗体の軽鎖を含む。本明細書記載の抗体又はそれらの部分の一部の実施態様では、抗体の部分は、抗体の重鎖を含む。本明細書記載の抗体又はそれらの部分の一部の実施態様では、抗体の部分は、抗体のＦａｂ部分を含む。本明細書記載の抗体又はそれらの部分の一部の実施態様では、抗体の部分は、抗体のＦ（ａｂ’）２部分を含む。本明細書記載の抗体又はそれらの部分の一部の実施態様では、抗体の部分は、抗体のＦｃ部分を含む。本明細書記載の抗体又はそれらの部分の一部の実施態様では、抗体の部分は、抗体のＦｖ部分を含む。本明細書記載の抗体又はそれらの部分の一部の実施態様では、抗体の部分は、抗体の可変ドメインを含む。本明細書記載の抗体又はそれらの部分の一部の実施態様では、抗体の部分は、抗体の１つ以上のＣＤＲドメインを含む。

抗体は、従来の方法論により調製される。モノクローナル抗体は、Kohler及びMilsteinの方法（Nature, 256:495, 1975）を用いて作製され得る。本発明に有用なモノクローナル抗体を調製するために、マウス又は他の適切なホスト動物に、ＯＸ１Ｒの抗原性形態が、適切な間隔で免疫処置される（例えば週２回、週１回、月２回又は月１回）。動物に、屠殺の１週間以内に抗原の最終「追加免疫処置」が施され得る。免疫処置の間に免疫アジュバントを使用することが、多くの場合に望ましい。適切な免疫アジュバントは、フロイントの完全アジュバント、フロイントの不完全アジュバント、ミョウバン、Ribiアジュバント、HunterのTitermax、QS21若しくはQuil Aなどのサポニンアジュバント、又はＣｐＧ含有免疫刺激性オリゴヌクレオチドを含む。他の適切なアジュバントは、当技術分野において周知である。動物は、皮下、腹腔内、筋肉内、静脈内、鼻腔内又は他の経路によって免疫処置され得る。所与の動物に、複数の経路により複数の形態の抗原が免疫処置され得る。簡潔には、リコンビナント細胞系を用いた発現によって、リコンビナントＯＸ１Ｒが提供され得る。特に、表面にＯＸ１Ｒを発現しているヒト細胞の形態でＯＸ１Ｒが提供され得る。免疫処置のレジメンに従って、リンパ球が、動物の脾臓、リンパ節又は他の器官から単離され、ポリエチレングリコールなどの薬剤を使用して適切な骨髄腫細胞系と融合されて、ハイブリドーマが形成される。融合後に、記載された標準方法を使用して、融合パートナーではなくハイブリドーマの成長にとって許容的な培地中に細胞が入れられる（Coding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice: Production and Application of Monoclonal Antibodies in Cell Biology, Biochemistry and Immunology, 3rd edition, Academic Press, New York, 1996）。ハイブリドーマの培養後に、所望の特異性の抗体、すなわち抗原と選択的に結合する抗体の存在について、細胞上清が分析される。適切な分析技法は、ＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリー、免疫沈降、及びウエスタンブロット分析を含む。他のスクリーニング技法は、当技術分野において周知である。好ましい技法は、コンフォメーションがインタクトで自然にフォールディングした抗原に対する抗体の結合を確認する、未変性ＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリー、及び免疫沈降などの技法である。

重大なことには、当技術分野において周知のように、抗体分子の小さな部分であるパラトープのみが、抗体からそのエピトープへの結合に関与する（一般的に、Clark, W. R. (1986) The Experimental Foundations of Modern Immunology Wiley & Sons, Inc., New York; Roitt, I. (1991) Essential Immunology, 7th Ed., Blackwell Scientific Publications, Oxfordを参照されたい）。例えば、Ｆｃ’及びＦｃ領域は、補体カスケードのエフェクターであるが、抗原結合に関与しない。Ｆ（ａｂ’）２フラグメントと呼ばれる、ｐＦｃ’領域が酵素的に切断された、又はｐＦｃ’領域なしに産生された抗体は、インタクトな抗体の両方の抗原結合部位を保持する。同様に、Ｆａｂフラグメントと呼ばれる、Ｆｃ領域が酵素的に切断された、又はＦｃ領域なしに産生された抗体は、インタクトな抗体分子の抗原結合部位の１つを保持する。さらに続けると、Ｆａｂフラグメントは、抗体軽鎖とＦｄと呼ばれる抗体重鎖の部分とが共有結合したものからなる。Ｆｄフラグメントは、抗体特異性の主決定因子であり（単一のＦｄフラグメントは、抗体特異性を変更せずに最大１０個の異なる軽鎖と結合し得る）、Ｆｄフラグメントは、単独でエピトープ結合能を保持する。

当技術分野において周知のように、抗体の抗原結合性部分内には、抗原のエピトープと直接相互作用する相補性決定領域（ＣＤＲ）及びパラトープの三次構造を維持するフレームワーク領域（ＦＲ）がある（一般的に、Clark, 1986; Roitt, 1991を参照されたい）。ＩｇＧ免疫グロブリンの重鎖Ｆｄフラグメント及び軽鎖の両方に、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ１からＣＤＲ４）によってそれぞれ分離された４つのフレームワーク領域（ＦＲ１からＦＲ４）がある。ＣＤＲ、特にＣＤＲＳ領域、より詳細には重鎖ＣＤＲＳは、抗体特異性を大きく担う。

今日、哺乳動物抗体の非ＣＤＲ領域が、元の抗体のエピトープ特異性を保持しながら同種又は異種抗体の類似領域と置換され得ることが、当技術分野において十分に確立されている。これは、非ヒトＣＤＲをヒトＦＲ及び／又はＦｃ／ｐＦｃ’領域と共有結合させて機能的抗体を産生する「ヒト化」抗体の開発及び使用において最もはっきりと示される。

特定の実施態様では、本発明は、ヒト化形態の抗体を含む組成物及び方法を提供する。本明細書に使用される「ヒト化」は、ＣＤＲ領域外の一部、大部分又は全てのアミノ酸が、ヒト免疫グロブリン分子由来の対応するアミノ酸と置換された抗体を示す。ヒト化の方法は、非限定的に、参照により本明細書に組み入れられる米国特許第４，８１６，５６７号、同第５，２２５，５３９号、同第５，５８５，０８９号、同第５，６９３，７６１号、同第５，６９３，７６２号及び同第５，８５９，２０５号に記載された方法を含む。上記の米国特許第５，５８５，０８９号及び同第５，６９３，７６１号、並びに国際公開公報第９０／０７８６１号も、ヒト化抗体を設計する上で使用され得る４つの可能性のある基準を提唱している。第１の提唱は、アクセプターについて、ヒト化されるべきドナー免疫グロブリンに並外れて相同な、特定のヒト免疫グロブリンからのフレームワークを使用すること、又は多数のヒト抗体からのコンセンサスフレームワークを使用することであった。第２の提唱は、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク中の一アミノ酸が独特で、その位置でドナーアミノ酸がヒト配列に典型的であるならば、アクセプターよりもむしろドナーアミノ酸が選択され得るというものであった。第３の提唱は、ヒト化免疫グロブリン鎖内の３つのＣＤＲのすぐ隣の位置では、アクセプターアミノ酸よりもむしろドナーアミノ酸が選択され得るというものであった。第４の提唱は、抗体の３次元モデルにおいてドナーアミノ酸がＣＤＲから３Ａ以内に側鎖原子を有すると予測され、ＣＤＲと相互作用する能力があると予測されるフレームワーク位置で、そのドナーアミノ酸残基を使用することであった。上記方法は、単に、ヒト化抗体を作るために当業者が採用できる方法のいくつかの例証となる。当業者は、抗体のヒト化のための他の方法に精通している。

ヒト化型抗体の一部の実施態様では、ＣＤＲ領域外の一部、大部分又は全てのアミノ酸が、ヒト免疫グロブリン分子からのアミノ酸と置換されているが、１つ以上のＣＤＲ領域内の一部、大部分又は全てのアミノ酸は交換されない。アミノ酸の小さな付加、欠失、挿入、置換又は改変は、抗体が所与の抗原と結合する能力をそれらが打ち消さない限り許容される。適切なヒト免疫グロブリン分子は、ＩｇＧｌ、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ及びＩｇＭ分子を含む。「ヒト化」抗体は、元の抗体と類似の抗原特異性を保持する。しかし、特定のヒト化方法を用いて、その内容が参照により本明細書に組み入れられるWu et al., /. Mol. Biol. 294:151, 1999に記載される「定向進化」方法を用いて、抗体の結合の親和性及び／又は特異性を増加させてもよい。

完全ヒトモノクローナル抗体は、また、ヒト免疫グロブリン重鎖及び軽鎖遺伝子座の大きな部分に関してトランスジェニックなマウスを免疫処置することによって調製することができる。例えば、内容が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第５，５９１，６６９号、同第５，５９８，３６９号、同第５，５４５，８０６号、同第５，５４５，８０７号、同第６，１５０，５８４号、及びその中に引用された参考文献を参照されたい。これらの動物は、内在性（例えばマウス）抗体の産生に機能的欠失があるように遺伝的に改変されている。動物は、さらに、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子座の全て又は部分を含むように改変されることにより、これらの動物の免疫処置は、関心対象の抗原に対する完全ヒト抗体の産生を招く。これらのマウスの免疫処置後に（例えば、XenoMouse（Abgenix）、HuMAbマウス（Medarex/GenPharm））、標準的なハイブリドーマ技法に従ってモノクローナル抗体を調製することができる。これらのモノクローナル抗体は、ヒト免疫グロブリンアミノ酸配列を有し、したがって、ヒトに投与した場合にヒト抗マウス抗体（ＫＡＭＡ）応答を誘起しない。

ヒト抗体を産生するためのインビトロ方法も存在する。これらは、ファージディスプレイ技法（米国特許第５，５６５，３３２号及び第５，５７３，９０５号）並びにヒトＢ細胞のインビトロ刺激（米国特許第５，２２９，２７５号及び第５，５６７，６１０号）を含む。これらの特許の内容は、参照により本明細書に組み入れられる。

したがって、当業者に明白なように、本発明は、また、Ｆ（ａｂ’）２ Ｆａｂ、Ｆｖ及びＦｄフラグメント；Ｆｃ及び／又はＦＲ及び／又はＣＤＲ１及び／又はＣＤＲ２及び／又は軽鎖ＣＤＲ３領域が、相同なヒト又は非ヒト配列と置換されているキメラ抗体；ＦＲ及び／又はＣＤＲ１及び／又はＣＤＲ２及び／又は軽鎖ＣＤＲ３領域が、相同なヒト又は非ヒト配列と置換されているキメラＦ（ａｂ’）２フラグメント抗体；ＦＲ及び／又はＣＤＲ１及び／又はＣＤＲ２及び／又は軽鎖ＣＤＲ３領域が、相同なヒト又は非ヒト配列と置換されているキメラＦａｂフラグメント抗体；並びにＦＲ及び／又はＣＤＲ１及び／又はＣＤＲ２領域が、相同なヒト又は非ヒト配列によって置換されているキメラＦｄフラグメント抗体を提供する。本発明は、また、いわゆる単鎖抗体を含む。

様々な抗体分子及びフラグメントは、非限定的に、ＩｇＡ、分泌ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭを含む、一般的に公知の免疫グロブリンクラスのいずれかに由来し得る。ＩｇＧのサブクラスも、当業者に周知であり、非限定的に、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４を含む。

別の実施態様では、本発明による抗体は、単一ドメイン抗体である。用語「単一ドメイン抗体」（ｓｄＡｂ）又は「ＶＨＨ」は、軽鎖を自然に欠如するラクダ科哺乳動物において見出すことができる種類の抗体の単一重鎖可変ドメインを表す。そのようなＶＨＨは、また、「nanobody（登録商標）」と呼ばれる。本発明により、ｓｄＡｂは、特にラマｓｄＡｂであることができる。

本明細書記載の薬剤の一部の実施態様では、薬剤は、ポリペプチドである。特定の一実施態様では、ポリペプチドは、オレキシン−Ａ又はオレキシン−Ｂの機能的等価物である。

本明細書に使用される用語「オレキシン−Ａ」は、当技術分野においてその一般的な意味を有し、配列番号：２によって示されるアミノ酸配列を表す。

オレキシン−Ａ（配列番号：２）：

［式中、_ｐｅは、ピログルタメートを意味する］。

本明細書に使用される「オレキシン−Ｂ」は、当技術分野においてその一般的な意味を有し、配列番号：３によって示されるアミノ酸配列を表す。

オレキシン−Ｂ（配列番号：３）：

本明細書に使用される「オレキシンの機能的等価物」は、ＯＸ１Ｒに結合する能力があることによって、本発明によるＯＸ１Ｒ活性を促進するポリペプチドである。用語「機能的等価物」は、オレキシン−Ａ及びオレキシン−Ｂのフラグメント、突然変異体、及びムテインを含む。したがって、用語「機能的に等価」は、タンパク質類似体がＯＸ１Ｒに結合する能力を保持し、かつ本発明によるＯＸ１Ｒ活性（例えばガン細胞のアポトーシス）を促進するようにアミノ酸配列を変更することによって、例えば１つ以上のアミノ酸の欠失、置換又は付加によって、得られるオレキシン（すなわちオレキシン−Ａ又はオレキシン−Ｂ）の任意の等価物を含む。アミノ酸置換は、例えば、アミノ酸配列をコードするＤＮＡの点突然変異により行ってもよい。

一部の実施態様では、機能的等価物は、対応するタンパク質と少なくとも８０％相同である（すなわち、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、又は１００％相同）。一部の実施態様では、機能的等価物は、例えば、Pileup配列解析ソフトウェア（Program Manual for the Wisconsin Package, 1996）などの任意の従来の解析アルゴリズムによって評価されるとき、少なくとも９０％相同（すなわち、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、又は１００％相同）である。本明細書に使用される用語「機能的に等価なフラグメント」は、また、ＯＸ１Ｒに結合し、かつ本発明によるＯＸ１Ｒ活性を促進するオレキシンの任意のフラグメント又はフラグメントの組み立てを意味し得る。したがって、本発明は、オレキシン−Ａ又はオレキシン−Ｂの少なくとも部分（その部分は、ＯＸ１Ｒに結合し、本発明によるＯＸ１Ｒ活性を促進する）の配列に対応する配列を有する連続アミノ酸を含むポリペプチドを提供する。機能的に等価なフラグメントは、本明細書において同定されるヒトオレキシンと同じタンパク質ファミリーに属し得る。「タンパク質ファミリー」によって、共通の機能を分かち合い、共通の配列相同性を示すタンパク質群が意味される。相同タンパク質は、非ヒト種由来であり得る。特に、機能的に等価なタンパク質配列間の相同性は、配列全体にわたり少なくとも８０％である。より特に、相同性は、配列全体にわたって９０％を超える。より特に、相同性は、配列全体にわたり９５％を超える。

一部の実施態様では、配列番号：３の最後の残基、すなわち位置２８のメチオニン残基は、アミド化されている。本明細書に使用される用語「アミド化」は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、アミド部分を産生することからなる工程を表す。

本発明のポリペプチドは、当業者に明らかな、任意の適切な手段によって産生され得る。本発明による使用のために十分な量のポリペプチド又はその機能的等価物を産生するために、発現は、本発明のポリペプチドを含有するリコンビナントホスト細胞を適切な条件下で培養することによって好都合に達成され得る。特に、ポリペプチドは、リコンビナント手段により、コード化核酸分子からの発現によって産生される。多様な異なるホスト細胞におけるポリペプチドのクローニング及び発現のためのシステムは、周知である。リコンビナント形態で発現された場合、ポリペプチドは、特に、ホスト細胞におけるコード化核酸からの発現によって生成される。特定のシステムの個別の要件に応じて、任意のホスト細胞を使用してもよい。適切なホスト細胞は、細菌、哺乳動物細胞、植物細胞、酵母及びバキュロウイルスシステムを含む。異種ポリペプチドの発現のために当技術分野において利用可能な哺乳動物細胞系は、チャイニーズハムスター卵巣細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓細胞及びその他多数を含む。細菌が操作及び成長され得る容易さが原因で、細菌も、リコンビナントタンパク質の産生のために好ましいホストである。一般的な好ましい細菌ホストは、大腸菌（E coli）である。

アミド化ポリペプチドを産生するための方法は、当技術分野において周知であり、典型的にはアミド化酵素の使用を伴う。本明細書に使用される用語「アミド化酵素」は、ポリペプチドのカルボキシル基をアミド基に変換することができる酵素として定義される。ペプチドのＣ末端をアミド化する能力がある酵素は、長い間公知である（Eipper et al. Mol. Endocrinol. 1987 November; 1 (11): 777）。アミド化酵素の例は、本明細書においてＰＡＭと呼ばれるペプチジルグリシンα−モノオキシゲナーゼ（ＥＣ１．１４．１７．３）及び本明細書においてＰＧＬと呼ばれるペプチジルアミドグリコラートリアーゼ（ＥＣ４．３．２．５）を含む。そのようなＰＡＭ酵素の調製及び精製は、熟練作業者によく知られており、詳細に記載されている（M. Nogudi et al. Prot. Expr. Purif. 2003, 28: 293）。酵素が、アミド化されるべき前駆タンパク質（すなわち配列番号：３）と同じホスト細胞において同時発現される場合、ＰＡＭによる「インビトロ」アミド化の代替案が出現する。これは、ホスト特異的調節配列のコントロール下で、ＰＡＭ活性をコードする遺伝子配列をホスト細胞中に導入することによって達成される。この発現配列は、それぞれの染色体ＤＮＡ配列に安定的に組み入れられるか、又はターゲットタンパク質（すなわち配列番号：３）についての発現プラスミドに平行して第２のプラスミド上に存在するか、又は同じベクター上の第２の発現カセットとして組み入れられるか、又は同じプロモーター配列のコントロール下でターゲットタンパク質（すなわち配列番号：３）をコードする遺伝子配列と同相でポリシストロン発現アプローチでクローニングされるかのいずれかであることができる。アミド化のためのさらなる一方法は、タンパク質特異的自己切断メカニズムの使用に基づく（Cottingham et al. Nature Biotech. Vol. 19, 974-977, 2001）。上記アミド化工程は、少なくとも１個のアミノ酸グリシン又はその代わりに暫定のペプチドによって伸長されたターゲットペプチドのＣ末端から開始する。代替方法は、国際公開公報第２００７０３６２９９号にも記載されている。したがって、一部の実施態様では、オレキシンポリペプチド（すなわち配列番号：３）をコードする核酸配列が、該オレキシンポリペプチドをアミド化させるように選択されるので、グリシン伸長前駆体をコードする追加的なコドンを含み得る。典型的には、グリシン伸長前駆体は、ＹＧＸＸに似ている［式中、Ｙは、アミド化させるアミノ酸を表し、Ｘは、該グリシン伸長前駆体からのアミド化ポリペプチドの産生をアミド化酵素（例えばＰＡＭ）が触媒するような任意のアミノ酸を表す。一部の実施態様では、グリシン伸長前駆体はＭＧＲＲである。

一部の実施態様では、本発明のポリペプチドは、イムノアドヘシンである。

本明細書に使用される用語「イムノアドヘシン」は、異種タンパク質（ＯＸ１Ｒと結合できる「アドヘシン」）の結合特異性を、免疫グロブリン定常ドメインのエフェクター機能と組み合わせる抗体様分子を意味する。構造的に、イムノアドヘシンは、ＯＸ１Ｒに対して所望の結合特異性を有するアミノ酸配列（すなわち、「異種」である）と、免疫グロブリン定常ドメイン配列との融合物を含む。イムノアドヘシン分子のアドヘシン部分は、典型的には、少なくともＯＸ１Ｒに対する結合部位を含む連続アミノ酸配列である。一部の実施態様では、アドヘシンは、配列番号：２又は配列番号：３によって特徴づけられるポリペプチドを含む。イムノアドヘシンにおける免疫グロブリン定常ドメイン配列は、ＩｇＧ−１、ＩｇＧ−２、ＩｇＧ−３、若しくはＩｇＧ−４サブタイプ、ＩｇＡ（ＩｇＡ−１及びＩｇＡ−２を含む）、ＩｇＥ、ＩｇＤ又はＩｇＭなどの任意の免疫グロブリンから得てもよい。

免疫グロブリン配列は、必然的ではないが、典型的には、免疫グロブリン定常ドメイン（Ｆｃ領域）である。イムノアドヘシンは、ヒト抗体の有用な化学特性及び生物特性の多くを有することができる。イムノアドヘシンは、適切なヒト免疫グロブリンのヒンジ及び定常ドメイン（Ｆｃ）配列に連結した所望の特異性を有するヒトタンパク質配列から構築することができるので、関心対象の結合特異性は、完全にヒトの成分を使用して達成することができる。そのようなイムノアドヘシンは、患者に対して最小限に免疫原性であり、慢性又は反復使用しても安全である。

一部の実施態様では、Ｆｃ領域は、ネイティブな配列のＦｃ領域である。一部の実施態様では、Ｆｃ領域は、変異型Ｆｃ領域である。なお別の実施態様では、Ｆｃ領域は、機能的Ｆｃ領域である。本明細書に使用される用語「Ｆｃ領域」は、ネイティブな配列のＦｃ領域及び変異型Ｆｃ領域を含む、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の境界は変動し得るものの、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、通常、位置Ｃｙｓ２２６のアミノ酸残基から、又はＰｒｏ２３０から、そのカルボキシル末端までの広がりと定義される。イムノアドヘシンの接着部分と免疫グロブリン配列部分とを、最小限のリンカーによって連結してもよい。免疫グロブリン配列は、必然的ではないが典型的に、免疫グロブリン定常ドメインである。本発明のキメラ中の免疫グロブリン部位は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３若しくはＩｇＧ４サブタイプ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ又はＩｇＭから得られ得るが、典型的にはＩｇＧ１又はＩｇＧ３であり得る。

本発明のポリペプチド、それらのフラグメント、及び本発明による融合タンパク質（例えばイムノアドヘシン）は、グリコシル化（例えば、Ｎ−結合型又はＯ−結合型グリコシル化）、ミリスチル化、パルミチル化、アセチル化及びリン酸化（例えば、セリン／トレオニン又はチロシン）を非限定的に含む翻訳後修飾を示すことができる。

具体的な実施態様では、本発明の治療方法に使用されるポリペプチドは、それらの治療有効性を改善するために改変され得ると考えられている。治療用化合物のそのような改変は、毒性を減らす、循環時間を延長する、又は生体内分布を改変するために使用され得る。例えば、潜在的に重要な治療用化合物の毒性を、生体内分布を改変する多様な薬物担体ビヒクルとの組み合わせにより有意に減少させることができる。例えば、ジペプチドを付加することは、眼における内因性輸送体を使用することによる血液網膜関門に対する循環薬剤の透過を改善することができる。

薬物の実現性を改善するための戦略は、水溶性ポリマーの利用である。様々な水溶性ポリマーは、生体内分布を改変し、細胞取込み様式を改善し、生理学的関門に対する透過性を変化させ；かつ身体からのクリアランス速度を改変することが示されている。ターゲティング効果又は徐放効果のいずれかを達成するために、末端基として、骨格の部分として、又はポリマー鎖上のペンダント基として薬物部分を含む水溶性ポリマーが合成されている。

ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、その高度の生体適合性及び改変の容易さを考えて、薬物担体として広く使用されている。様々な薬物、タンパク質、及びリポソームへの付着が、滞留時間を改善し、毒性を減少させることが示されている。ＰＥＧは、鎖末端のヒドロキシル基を介して、及び他の化学的方法により活性薬剤に結合させることができるが；しかし、ＰＥＧ自体は、１分子あたり最大２個の活性薬剤に限られる。異なるアプローチでは、ＰＥＧの生体適合特性を保持するが、１分子あたり多数の結合点がある（より大きな薬物負荷を提供する）という付加的な長所を有し、多様な応用に見合うように合成的に設計できるという新規な生体材料として、ＰＥＧとアミノ酸とのコポリマーが研究された。

当業者は、薬物の効果的な改変のためのＰＥＧ化技法を承知している。例えば、ＰＥＧと、リシンなどの三官能性モノマーとの交互ポリマーからなる薬物送達ポリマーが、VectraMed（Plainsboro, N.J.）によって使用されている。ＰＥＧ鎖（典型的には２０００ダルトン以下）は、安定なウレタン連結を経由してリシンのａ−及びｅ−アミノ基に連結される。そのようなコポリマーは、ＰＥＧの望ましい特性を保持し、一方で、ポリマー鎖に沿って厳密にコントロールされ、所定の間隔で反応性ペンダント基（リシンのカルボン酸基）を提供する。反応性ペンダント基は、他の分子との誘導体化、架橋、又はコンジュゲーションのために使用することができる。これらのポリマーは、ポリマーの分子量、ＰＥＧセグメントの分子量、及び薬物とポリマーとの間の切断可能な連結を多様にすることにより、安定で長期循環性のプロドラッグを産生するために有用である。ＰＥＧセグメントの分子量は、薬物／連結基複合体の間隔及びコンジュゲートの分子量あたりの薬物量に影響する（ＰＥＧセグメントが小さいほどより大きな薬物負荷を提供する）。一般的に、ブロックコポリマーコンジュゲートの全体的な分子量を増加させることは、コンジュゲートの循環半減期を増加させる。それにもかかわらず、コンジュゲートは、容易に分解可能であるか、又は糸球体濾過許容閾値を下回る分子量（例えば６０kDa未満）を有するかのいずれかでなければならない。

循環半減期及び生体内分布を維持するのに重要なポリマー主鎖に加えて、リンカーが、治療剤を、特異的トリガーにより、典型的にはターゲティングされた組織における酵素活性により、主鎖ポリマーから放出されるまで、プロドラッグ形態に維持するために使用され得る。例えば、この種の組織活性化薬物送達は、生体内分布の特定部位への送達が必要とされ、治療剤が病変部位又はその近くで放出される場合に、特に有用である。活性化薬物の送達における使用のための連結基ライブラリーは、当業者に公知であり、選択された疾患特異的酵素の酵素動態、活性酵素の普及、及び切断特異性に基づき得る。そのようなリンカーは、治療的送達のために本明細書記載のタンパク質又はタンパク質のフラグメントを改変することに使用され得る。

一部の実施態様では、ＯＸ１Ｒアゴニストはアプタマーである。アプタマーは、分子認識に関して抗体の代替に相当する分子クラスである。アプタマーは、高い親和性及び特異性で任意のクラスのターゲット分子を事実上認識する能力を有するオリゴヌクレオチド又はオリゴペプチド配列である。そのようなリガンドは、ランダム配列ライブラリーの試験管内進化法（ＳＥＬＥＸ）を経由して単離してもよい。ランダム配列ライブラリーは、ＤＮＡのコンビナトリアル化学合成によって入手可能である。このライブラリーでは、各メンバーは、最終的に化学的に改変された、独特な配列の直鎖オリゴマーである。ペプチドアプタマーは、２つのハイブリッド法によりコンビナトリアルライブラリーから選択された、大腸菌チオレドキシンＡなどのプラットフォームタンパク質によってディスプレイされた、立体配座的に制限された抗体可変領域からなる。

本明細書に使用される用語「肝細胞ガン」は、当技術分野においてその一般的な意味を有し、肝細胞において発生したガンを表す。一般的に、肝臓ガンは、概して肝細胞ガンを示す。ＨＣＣは、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ、本明細書下記においてＨＢＶと称され得る）又はＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ、本明細書下記においてＨＣＶと称され得る）などの感染性因子によって引き起こされ得る。一部の実施態様では、ＨＣＣは、アルコール性脂肪性肝炎又は非アルコール性脂肪性肝炎（本明細書下記において「ＮＡＳＨ」として略記され得る）に起因する。本用語は、また、消化器肝臓微小転移（digestive hepatic micro-metastasis）を含む。

一部の実施態様では、ＨＣＣは、早期ＨＣＣ、非転移性ＨＣＣ、原発性ＨＣＣ、進行性ＨＣＣ、局所進行性ＨＣＣ、転移性ＨＣＣ、寛解期のＨＣＣ、又は再発性ＨＣＣである。一部の実施態様では、ＨＣＣは、限局性切除可能（すなわち、完全な外科的除去が可能な、肝臓の一部に限定された腫瘍）、限局性切除不能（すなわち、重大な血管構造に波及していることから、若しくは肝臓が不全であることから、限局性腫瘍が切除不能であり得る）、又は切除不能である（すなわち、腫瘍が肝臓の全ての葉に波及し、かつ／若しくは拡散して他の器官（例えば、肺、リンパ節、骨）に波及した）。一部の実施態様では、ＨＣＣは、ＴＮＭ分類に従うと、ステージＩ腫瘍（血管浸潤のない単一腫瘍）、ステージＩＩ腫瘍（血管浸潤を有する単一腫瘍、又は複数の腫瘍、５cmを超えるものはない）、ステージＩＩＩ腫瘍（複数の腫瘍、任意のものが５cmを超える、又は門脈若しくは肝静脈の主要分枝に波及する腫瘍）、ステージＩＶ腫瘍（胆嚢以外の隣接器官の直接浸潤又は臓側腹膜の穿孔を有する腫瘍）、Ｎ１腫瘍（領域リンパ節転移）、又はＭ１腫瘍（遠隔転移）である。一部の実施態様では、ＨＣＣは、ＡＪＣＣ（American Joint Commission on Cancer）ステージング基準に従うと、ステージＴ１、Ｔ２、Ｔ３、又はＴ４のＨＣＣである。

本明細書に使用される「処置」又は「処置すること」は、臨床結果を含む有益又は所望の結果を得るためのアプローチである。本発明のために、有益又は所望の臨床結果は、非限定的に、以下の１つ以上を含む：疾患に起因する１つ以上の症状を緩和すること、疾患の程度を減らすこと、疾患を安定化すること（例えば、疾患の悪化を阻止若しくは遅延させること）、疾患の拡散（例えば転移）を阻止若しくは遅延させること、疾患の再発を阻止若しくは遅延させること、疾患の進行を遅延若しくは減速すること、病状を改善すること、疾患の寛解（部分若しくは全寛解）を提供すること、疾患を処置するために要求される１つ以上の他の投薬の用量を減少させること、疾患の進行を遅延させること、生活の質を上げること、及び／又は生存期間を延長すること。同じく「処置」によって包含されるのは、ＨＣＣの病理学的帰結の低下である。本発明の方法は、処置のこれらの態様の任意の１つ以上を考えている。

一部の実施態様では、本発明のＯＸ１Ｒアゴニストは、治療有効量で対象に投与される。

「治療有効量」によって、任意の医学的処置に適用可能な合理的な便益／リスク比で肝細胞ガンを処置するためのＯＸ１Ｒの十分な量が意味される。本発明の化合物及び組成物の合計１日使用量は、担当の医師によって健全な医学的判断の範囲内で決定されることが理解されるだろう。任意の個別の対象についての特定の治療有効用量のレベルは、処置される障害及び障害の重症度；採用される特定の化合物の活性；採用される特定の組成；対象の年齢、体重、全身の健康状態、性別及び食事；採用される特定の化合物の投与の時間、投与経路、及び排泄速度；処置の期間；採用される特定のポリペプチドと組み合わせて又は同時に使用される薬物；並びに医学において周知の同様の要因を含む、多様な要因に依存する。例えば、所望の治療効果を達成するために要するレベル未満のレベルで化合物の用量を開始すること、及び所望の効果が達成されるまで投薬量を徐々に増加させることは、十分に当業者の技能の範囲内である。しかし、製品の１日投薬量は、成人１人あたり１日０．０１〜１，０００mgの広範囲にわたり変動し得る。特に、組成物は、処置されるべき対象への投薬量を症候的に調整するために活性成分０．０１、０．０５、０．１、０．５、１．０、２．５、５．０、１０．０、１５．０、２５．０、５０．０、１００、２５０及び５００mgを含有する。医薬品は、典型的には、活性成分約０．０１mg〜約５００mg、特に活性成分１mg〜約１００mgを含有する。薬物の有効量は、通常、１日あたり０．０００２mg/kg体重〜約２０mg/kg体重、特に１日あたり約０．００１mg/kg体重〜７mg/kg体重の投薬量レベルで供給される。

本発明のさらなる一目的は、樹立した肝細胞ガンのサイズの減少を、それを必要とする患者において行う方法に関する。本方法は、患者に治療有効量のＯＸ１Ｒアゴニストを投与する段階を含み、該量は、腫瘍のサイズを減少させるために十分である。本方法は、また、肝細胞ガン、例えば樹立した検出可能な腫瘍を患う又は有する患者を特定する段階を含み得る。「樹立した」腫瘍は、通常の検出法を用いて検出されるために十分なサイズを有する腫瘍であり、例えば腫瘍は、普通、少なくとも１つの寸法で少なくとも約０．５cm以上のサイズであり、例えば触診により、イメージング（例えばＸ線、陽電子放出断層撮影法（ＰＥＴ／ＣＴ）、磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）、超音波など）により、又はいくつかの他の手段により検出可能である。１次元、２次元及び／又は３次元測定を使用して、腫瘍のサイズ及び／又は体積を決定してもよい。少なくとも１つのＯＸ１Ｒアゴニストの投与は、等価（例えば対照）の未処置腫瘍のサイズと比較して、腫瘍サイズにおける、例えば少なくとも約１０％、普通は約２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０又は１００％の減少を招く。１００％の減少は、検出可能な腫瘍の完全根絶を示す。

本発明のさらなる一目的は、肝細胞ガンの成長の阻止又は減速を、それを必要とする患者において行う方法であって、該患者に、治療有効量のＯＸ１Ｒアゴニストを投与することを含む方法に関し、該量は、少なくとも１つの肝細胞ガンの成長を阻止又は減速させるために十分である。腫瘍の成長速度（サイズの増加）は、比較可能な（例えば対照）未処置腫瘍の成長速度と比較して、例えば少なくとも約１０％、普通は約２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０又は１００％減速する。腫瘍の成長における１００％の減少は、アゴニストの投与に応答して、腫瘍が成長を止め（腫瘍の成長が停止し）、腫瘍がサイズを減少さえし得る（マイナス成長速度）ことを意味する。

本発明のＯＸ１Ｒアゴニストを、薬学的に許容し得る賦形剤及び場合により生分解性ポリマーなどの徐放マトリックスと組み合わせて、治療用組成物を形成させてもよい。

「薬学的に」又は「薬学的に許容し得る」は、哺乳類、特にヒトに適宜投与された場合に、有害反応、アレルギー反応又は他の不都合な反応を引き起こさない分子実体及び組成物を表す。薬学的に許容し得る担体又は賦形剤は、任意の種類の無毒の固体、半固体又は液体の増量剤、希釈剤、封入材又は製剤佐剤を表す。

経口、舌下、皮下、筋肉内、静脈内、経皮、局所又は直腸投与のための本発明の医薬組成物において、活性主薬を、単独で又は別の活性主薬と組み合わせて、従来の薬学的支持体との混合物として単位投与形態で動物及びヒトに投与することができる。適切な単位投与形態は、錠剤、ゲルカプセル剤、散剤、顆粒剤、及び経口懸濁剤又は液剤などの経口経路形態、舌下及び口内投与形態、エアロゾル、植込剤、皮下、経皮、局所、腹腔内、筋肉内、静脈内、真皮下、経皮、クモ膜下腔内及び鼻腔内投与形態、並びに直腸投与形態を含む。

特に、医薬組成物は、注射可能な製剤にとって薬学的に許容し得るビヒクルを含有する。これらは、特に、等張無菌塩類溶液（リン酸一ナトリウム若しくはリン酸二ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム若しくは塩化マグネシウムなど、又はそのような塩の混合物）、又は場合に応じて無菌水又は生理食塩水を添加すると注射液の構築を許す乾燥組成物、特に凍結乾燥組成物であり得る。

注射使用に適した薬学的形態は、無菌水性液剤又は分散剤；ゴマ油、ラッカセイ油又は水性プロピレングリコールを含む製剤；及び無菌注射剤又は分散剤の即時調製用の無菌粉末を含む。全ての場合で、該形態は、無菌でなければならず、容易な注射針通過能が存在する程度に流動性でなければならない。それは、製造及び貯蔵条件で安定でなければならず、細菌及び真菌などの微生物の汚染作用から保護されなければならない。

本発明の化合物を遊離塩基又は薬理学的に許容し得る塩として含む液剤を、ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤と適切に混合された水中で調製することができる。分散剤を、また、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、及びそれらの混合物中で、並びに油中で調製することができる。通常の貯蔵及び使用条件下で、これらの調製物は、微生物の成長を阻止するために保存料を含有する。

本発明のＯＸ１Ｒアゴニストを、中性形態又は塩形態で組成物に製剤化することができる。薬学的に許容し得る塩は、例えば塩酸若しくはリン酸などの無機酸、又は酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などの有機酸と形成される酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基と形成される）を含む。遊離カルボキシル基と形成された塩も、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、又は水酸化鉄（ＩＩＩ）などの無機塩基、及びイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなどの有機塩基に由来することができる。

担体は、また、例えば水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコールなど）を含有する溶媒又は分散媒、それらの適切な混合物、及び植物油であることができる。適正な流動性を、例えば、レシチンなどのコーティング剤の使用により、分散剤の場合、所要の粒子サイズの維持により、及び界面活性剤の使用により、維持することができる。微生物の作用の阻止を、様々な抗細菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによってもたらすことができる。多くの場合に、等張化剤、例えば糖又は塩化ナトリウムを含むことが好ましい。注射用組成物の持続的吸収を、吸収を遅延させる薬剤、例えばモノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンの組成物中での使用によりもたらすことができる。

無菌注射剤は、適切な溶媒中に、所要量の活性ポリペプチドを、必要に応じて上に列挙された様々な他の成分と共に組み入れ、続いて濾過滅菌することによって調製される。一般的に、分散剤は、基礎分散媒及び上に列挙されたものからの所要の他の成分を含有する無菌ビヒクル中に、様々な無菌活性成分を組み入れることによって調製される。無菌注射剤の調製のための無菌粉末の場合、好ましい調製方法は、活性成分に加えて任意の追加的な所望の成分の粉末を、予め無菌濾過されたその溶液からもたらす真空乾燥技法及び凍結乾燥技法である。

製剤化されると、液剤は、投薬製剤と適合する方法で、治療的に有効な量で投与される。製剤は、上記注射液剤の種類などの多様な投薬形態で容易に投与されるが、薬物放出カプセルなども採用することができる。

水性液剤の状態での非経口投与のために、例えば、液剤は、必要に応じて適切に緩衝化されるべきであり、液体希釈剤が、最初に十分な生理食塩水又はグルコースで等張にされる。これらの特定の水性液剤は、特に、静脈内、筋肉内、皮下及び腹腔内投与に適している。これに関連して、採用できる無菌水性媒質は、本開示に照らして当業者に公知である。例えば、投薬１回分を等張ＮａＣｌ溶液１ml中に溶解し、皮下注入液１０００mlに添加するか、又は提唱された注入部位に注射するかのいずれかとすることもできる。投薬量におけるいくらかの変動が、処置される対象の状態に応じて必然的に起こる。いずれにしても、投与の責任者が、個別の対象に適切な用量を決定する。

本発明のＯＸ１Ｒアゴニストは、１回程度あたり約０．０００１〜１．０ミリグラム、又は約０．００１〜０．１ミリグラム、又は約０．１〜１．０若しくは約１０ミリグラムさえ含むように、治療用混合物に製剤化され得る。複数回を投与することもできる。

静脈内又は筋肉内注射などの非経口投与用に製剤化された本発明の化合物に加えて、他の薬学的に許容し得る形態は、例えば、錠剤又は経口投与用の他の固形剤；リポソーム製剤；時間放出カプセル；及び現在使用されている任意の他の形態を含む。

一部の実施態様では、本発明のＯＸ１Ｒアゴニストは、化学療法剤と組み合わせて使用される。化学療法剤は、非限定的に、アルキル化剤、例えばチオテパ及びシクロホスファミド；アルキルスルホナート、例えばブスルファン、インプロスルファン及びピポスルファン；アジリジン、例えばベンゾドーパ（benzodopa）、カルボコン、メツレドーパ（meturedopa）、及びウレドーパ（uredopa）；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド（trietylenephosphoramide）、トリエチレンチオホスホラミド（triethiylenethiophosphoramide）及びトリメチロロメラミン（trimethylolomelamine）を含むエチレンイミン及びメチラメラミン（methylamelamine）；アセトゲニン（特にブラタシン及びブラタシノン）；カンプトテシン（合成類似体トポテカンを含む）；ブリオスタチン；カリスタチン（callystatin）；ＣＣ−１０６５（そのアドゼレシン、カルゼレシン及びビゼレシン合成類似体を含む）；クリプトフィシン（特にクリプトフィシン１及びクリプトフィシン８）；ドラスタチン；デュオカルマイシン（合成類似体ＫＷ−２１８９及びＣＢ１−ＴＭ１を含む）；エリュテロビン；パンクラチスタチン（pancratistatin）；サルコジクチイン（sarcodictyin）；スポンギスタチン（spongistatin）；ナイトロジェンマスタード、例えばクロラムブシル、クロルナファジン、コロホスファミド（cholophosphamide）、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシドヒドロクロリド、メルファラン、ノベンビキン（novembichin）、フェネステリン（phenesterine）、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタード；ニトロソウレア（nitrosurea）、例えばカルムスチン、クロロゾトシン、ホテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、及びラニムスチン（ranimnustine）；抗生物質、例えばエンジイン抗生物質（例えばカリチアマイシン、特にカリチアマイシンガンマｌｌ及びカリチアマイシンオメガｌｌ；ダイネマイシン（dynemicin）Ａを含むダイネマイシン；ビスホスホナート、例えばクロドロナート；エスペラミシン；並びにネオカルチノスタチン発色団及び関連する色素タンパク質であるエンジイン抗生物質発色団、アクラシノマイシン（aclacinomysin）、アクチノマイシン、オースラマイシン（authrarnycin）、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン（carabicin）、カモノマイシン（caminomycin）、カルチノフィリン、クロモマイシン（chromomycinis）、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ドキソルビシン（モルホリノ−ドキソルビシン、シアノモルホリノ−ドキソルビシン、２−ピロリノ−ドキソルビシン及びデオキシドキソルビシンを含む）、エピルビシン、エソルビシン（esorubicin）、イダルビシン、マルセロマイシン（marcellomycin）、マイトマイシン、例えばマイトマイシンＣ、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン（potfiromycin）、ピューロマイシン、クエラマイシン（quelamycin）、ロドルビシン（rodorubicin）、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン；代謝拮抗薬、例えばメトトレキサート及び５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）；葉酸類似体、例えばデノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサート；プリン類似体、例えばフルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン（thiamiprine）、チオグアニン；ピリミジン類似体、例えばアンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジン；アンドロゲン、例えばカルステロン、ドロモスタノロンプロピオナート、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン；抗副腎薬（anti-adrenal）、例えばアミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン；葉酸補充剤、例えばフロリン酸（frolinic acid）；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アムサクリン；ベストラブシル（bestrabucil）；ビサントレン（bisantrene）；エダトラキサート（edatraxate）；デホファミン（defofamine）；デメコルチン；ジアジクォン；エルホルミチン（elformithine）；エリプチニウムアセタート（elliptinium acetate）；エポチロン；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダイニン（lonidainine）；マイタンシノイド、例えばマイタンシン及びアンサミトシン（ansamitocin）；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダモール（mopidanmol）；ニトラエリン（nitraerine）；ペントスタチン；フェナメット（phenamet）；ピラルビシン；ロソキサントロン；ポドフィリン酸；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ多糖複合体）；ラゾキサン；リゾキシン（rhizoxin）；シゾフラン（sizofuran）；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジクォン；２，２’，２”−トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン（特にＴ−２毒素、ベラクリン（verracurin）Ａ、ロリジン（roridin）Ａ及びアングイジン（anguidine））；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン（gacytosine）；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド、例えばパクリタキセル及びドキセタキセル（doxetaxel）；クロラムブシル；ゲムシタビン；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；白金配位錯体、例えばシスプラチン、オキサリプラチン及びカルボプラチン；ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ−１６）；イホスファミド；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ノバントロン（novantrone）；テニポシド；エダトレキサート；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼローダ；イバンドロナート；イリノテカン（例えばＣＰＴ−１１）；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（difluoromethylomithine）（ＤＭＦＯ）；レチノイド、例えばレチノイン酸；カペシタビン；及び上記の任意の薬学的に許容し得る塩、酸又は誘導体を含む。

本発明のさらなる一目的は、肝細胞ガンの処置を、それを必要とする対象において行うための方法であって、ｉ）対象から得られた腫瘍組織試料中のＯＸ１Ｒの発現レベルを決定する段階、ｉｉ）段階ｉ）で決定された発現レベルを参照値と比較する段階、及びｉｉｉ）段階ｉ）で決定されたレベルが参照値よりも高い場合、対象に治療有効量のＯＸ１Ｒアゴニストを投与する段階を含む方法に関する。

ＯＸ１Ｒの発現レベルは、当技術分野において周知の任意の方法によって決定され得る。例えば、ｍＲＮＡの量を決定するための方法は、当技術分野において周知である。典型的には、試料（例えば、患者から調製された細胞又は組織）中に含有される核酸が、最初に標準的な方法に従い、例えば溶解酵素若しくは化学溶液を使用して抽出されるか、又は核酸結合性樹脂によって製造業者の説明書に従って抽出される。次に、抽出されたｍＲＮＡが、ハイブリダイゼーション（例えば、ノーザンブロット分析）及び／又は増幅（例えばＲＴ−ＰＣＲ）によって検出される。好ましくは、定量又は半定量ＲＴ−ＰＣＲが好ましい。リアルタイム定量又は半定量ＲＴ−ＰＣＲが、特に有利である。あるいは、免疫組織化学（ＩＨＣ）法を使用してもよい。ＩＨＣは、具体的には、インサイツで試料又は組織標本においてターゲットを検出する方法を提供する。ＩＨＣにおいて、試料の全体的な細胞完全性が維持されるので、関心対象のターゲット（すなわちＯＸ１Ｒ）の存在及び位置の両方の検出が可能になる。典型的には、試料は、ホルマリンで固定され、パラフィン中に包埋され、染色及び光学顕微鏡法によるその後の検査のために切片に切断される。現行のＩＨＣ法は、直接ラベリング又は二次抗体ベース若しくはハプテンベースのラベリングのいずれかを使用する。公知のＩＨＣシステムの例は、例えば、EnVision（商標）（DakoCytomation)、Powervision（登録商標）（Immunovision, Springdale, AZ）、ＮＢＡ（商標）キット（Zymed Laboratories Inc., South San Francisco, CA）、HistoFine（登録商標）（Nichirei Corp, Tokyo, Japan）を含む。特別な実施態様では、腫瘍組織切片は、ＯＸ１Ｒに対して指向する抗体と共にインキュベーションした後に、スライド又は他の支持体上に乗せられ得る。次に、適切な固体支持体上に乗せられた試料における顕微鏡検査が行われ得る。顕微鏡写真の製作のために、試料を含む切片をガラススライド又は他の平面支持体上に乗せて、選択的染色によって関心対象のタンパク質の存在を強調してもよい。

「参照値」は、「閾値」又は「カットオフ値」であることができる。典型的には、「閾値」又は「カットオフ値」は、実験的、経験的、又は理論的に決定することができる。当業者によって認識されるように、閾値は、また、既存の実験条件及び／又は臨床条件に基づき任意に選択することができる。閾値は、試験の機能及び便益／リスクバランス（偽陽性及び偽陰性の臨床結果）に従って最適な感度及び特異性を得るために、決定されなければならない。典型的には、最適な感度及び特異性（よって閾値）は、実験データに基づき、受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線を使用して決定することができる。典型的には、閾値は、ＯＸ１Ｒアゴニストを用いた効率的な処置を得るために十分な量のＯＸ１Ｒレベルを有する１体以上の対象由来の腫瘍組織試料において決定されたＯＸ１Ｒ発現レベル（又は比、又はスコア）から導き出される。さらに、適正に預けられた歴史的対象試料におけるＯＸ１Ｒ発現レベル（又は比、又はスコア）の後ろ向き測定を、これらの閾値の樹立に使用してもよい。

本発明のさらなる一目的は、ｉ）複数の試験物質を提供する段階、ｉｉ）試験物質がＯＸ１Ｒアゴニストであるかどうか決定する段階、及びｉｉｉ）ＯＸ１Ｒアゴニストである試験物質をポジティブ選択する段階を含む、肝細胞ガンの処置のための薬物をスクリーニングするための方法に関する。

典型的には、本発明のスクリーニング方法は、表面上にオレキシン−１レセプターを発現する適切な細胞を提供することを伴う。そのような細胞は、哺乳動物、酵母、ドロソフィラ（Drosophila）又は大腸菌からの細胞を含む。特に、オレキシン−１レセプターをコードするポリヌクレオチドを使用して、細胞にトランスフェクトしてレセプターを発現させる。次に、発現されたレセプターは、試験物質及び適宜オレキシン−１レセプターリガンド（例えばオレキシン）と接触させ、ＳＨＰ−２の動員及び細胞の細胞アポトーシスの誘導などの機能的応答の活性化が観察される。機能的アッセイ法は、El Firar A, Voisin T, Rouyer-Fessard C, Ostuni MA, Couvineau A, Laburthe M. Discovery of a functional immunoreceptor tyrosine-based switch motif in a 7-transmembrane-spanning receptor: role in the orexin receptor OX1R-driven apoptosis. FASEB J. 2009 Dec;23(12):4069-80. doi: 10.1096/fj.09-131367. Epub 2009 Aug 6に記載のように行ってもよい。特に、比較段階は、試験物質によって誘導された活性と、オレキシンなどの周知のＯＸ１Ｒアゴニストによって誘導された活性とを比較することを伴い得る。特に、周知のＯＸ１Ｒアゴニストと類似又はそれよりも良好でさえある活性を有する能力がある物質が、ポジティブ選択される。

典型的には、本発明のスクリーニング方法は、また、細胞表面に存在するオレキシン−１レセプターに結合する能力がある試験物質についてスクリーニングすることを伴い得る。典型的には、試験物質はラベルされ（例えば放射性ラベルで）、結合が、オレキシンなどの周知のＯＸ１Ｒアゴニストと比較される。調製物は、ラベル化ＯＸ１Ｒと共にインキュベートされ、ＮＧＡＬと結合した試験物質の複合体が単離され、当技術分野において公知の日常的な方法に従って特徴づけられる。あるいは、ＯＸ１Ｒを、固体支持体に結合させることにより、細胞から溶解された結合性分子をカラムに結合させ、次に日常的な方法に従って溶離及び特徴づけしてもよい。別の実施態様では、細胞区画は、ＮＧＡＬによってモジュレートされるシグナル伝達経路又は調節経路の分子などの、ＮＧＡＬと結合する分子を発現する細胞から調製され得る。調製物は、候補化合物の不在下又は存在下でラベル化ＮＧＡＬと共にインキュベートされる。候補化合物が結合性分子と結合する能力は、ラベル化リガンドの結合減少に反映される。

典型的には、候補化合物は、小型有機分子、ペプチド、ポリペプチド又はオリゴヌクレオチドからなる群より選択される。

ポジティブ選択された試験物質は、肝細胞ガンの処置のためのその特性をさらにアッセイすることを考えて、さらなる選択段階に供され得る。例えば、ポジティブ選択された候補化合物は、肝細胞ガンのための動物モデルでその性質をさらにアッセイすることを考慮して、さらなる選択段階に供され得る。

肝細胞ガンの処置に有用であり得る薬物を開発するための試験物質を特定するために、ハイスループットスクリーニング技法を使用して上記アッセイ法を行ってもよい。ハイスループットスクリーニング技法は、自動ロボットシステムを使用して複数のアッセイ法を実施するために、マルチウェルプレート（例えば、９６、３８９、又は１５３６ウェルプレート）を使用して実施され得る。したがって、試験物質の大規模ライブラリーが、高度に効率的な方法でアッセイされ得る。より詳細には、マイクロタイタープレートのウェル（９６ウェル又は３８４ウェル）中で成長している、安定的にトランスフェクトされた細胞を、化合物ライブラリーのハイスループットスクリーニングに適応することができる。ライブラリー中の化合物は、上記トランスジェニック細胞が入ったマイクロタイターディッシュのウェルに自動的に１つずつ充てられる。アポトーシスシグナルを活性化する試験物質が特定された後に、それらをさらなる特徴づけのためにポジティブ選択することができる。これらのアッセイ法は、いくつかの利点を与える。全細胞への試験物質の曝露は、試験物質が作用し得る自然状況でその活性の評価を可能にする。このアッセイ法は、マイクロタイタープレート形式で容易に行うことができるので、記載のアッセイ法は、自動ロボットシステムによって行うことができ、合理的に短い時間枠内で多数の試験試料の試験を可能にする。本発明のアッセイ法は、これまで未試験の化合物又は抽出物の活性を判断するための篩として使用することができ、この場合、単一濃度が試験され、対照と比較される。これらのアッセイ法は、また、例えば１００μM〜１nMの範囲の濃度範囲を試験し、アポトーシスが最大である濃度を計算することによって、化合物の相対効力を判断するために使用することができる。

本発明は、また、肝細胞ガン及び／又は消化器肝臓微小転移のイメージングを、それを必要とする対象において行うための方法であって、ｉ）検出可能な物質でラベルされた、ある量のＯＸ１Ｒリガンドを対象に投与する段階、及びｉｉ）対象におけるリガンドの存在を検出する段階を含む方法に関する。

本明細書に使用される用語「ＯＸ１Ｒリガンド」は、当技術分野においてその一般的な意味を有し、ＯＸ１Ｒに結合する能力を有する任意の分子（天然又は非天然）を表す。典型的には、ＯＸＲリガンドは、非限定的に、オレキシン−Ａ又はオレキシン−Ｂの機能的等価物であるポリペプチド、及びＯＸ１Ｒ抗体を含む。

ＯＸ１Ｒリガンドに関して本明細書に使用される用語「ラベル化された」は、検出可能な物質の結合（coupling）（すなわち物理的連結）によるＯＸ１Ｒリガンドの直接ラベリングを包含することが意図される。

典型的には、検出可能な物質には、非限定的に、放射性イメージング剤、光学的イメージング剤、ＰＥＴイメージング剤、ＭＲＩ造影剤、ＣＴ造影剤、及びＦＲＥＴイメージング剤を含む。

検出可能な物質は、放射性金属イオン、すなわち放射性金属であり得る。適切な放射性金属は、６４Ｃｕ、４８Ｖ、５２Ｆｅ、５５Ｃｏ、９４ｍＴｃ若しくは６８Ｇａなどのポジトロン放出体；９９ｍＴｃ １１１Ｉｎ １１３ｍＩｎ若しくは６７Ｇａなどのガンマ放出体、又は６７Ｃｕ、８９Ｓｒ、９０Ｙ、１５３Ｓｍ、１３６Ｒｅ、１８８Ｒｅ若しくは１９２Ｉｒなどのベータ放出体のいずれかであることができる。この特別な実施態様では、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）又は１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ”’−四酢酸（ＤＯＴＡ）などのポリアミノポリカルボキシラートキレート剤も、放射性金属のラベリングのために開発された。これらのキレート剤は、単一光子放出型コンピュータ断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）のための１１１Ｉｎ及びポジトロン放出断層撮影（ＰＥＴ）のための６８Ｇａなどの、イメージングに適した放射性同位体を用いたラベリングを可能にする。ポリアミノポリカルボキシラートは、また、９０Ｙ及び１７７Ｌｕ同位体に適したキレート剤である。

検出可能な物質は、常磁性金属イオンであり得、適切なそのような金属イオンは：Ｇｄ（ＩＩＩ）、Ｍｎ（ＩＩ）、Ｃｕ（ＩＩ）、Ｃｒ（ＩＩＩ）、Ｆｅ（ＩＩＩ）、Ｃｏ（ＩＩ）１ Ｅｒ（ＩＩ）１ Ｎｉ（ＩＩ）、Ｅｕ（ＩＩＩ）又はＤｙ（ＩＩＩ）を含む。

検出可能な物質は、ガンマ放出放射性ハロゲンであり得る。放射性ハロゲンは、１２３Ｉ、１３１Ｉ又は７７Ｂｒより適宜選択される。

検出可能な物質は、ポジトロン放出放射性非金属であり得る。適切なそのようなポジトロン放出体は：１１Ｃ、２３Ｎ、１５Ｏ、１７Ｆ、１８Ｆ、７５Ｂｒ、７６Ｂｒ又は１２４Ｉを含む。

検出可能な物質は、過分極したＮＭＲ活性核であり得る。そのようなＮＭＲ活性核は、非ゼロ核スピンを有する場合があり、１３Ｃ、１５Ｎ、１９Ｆ、２９Ｓｉ及び３１Ｐを含む。用語「過分極した」によって、ＮＭＲ活性核の、その平衡分極を超えた分極度の増強が意味される。１３Ｃの自然存在度（１２Ｃに対する）は約１％であり、適切な１３Ｃラベル化化合物は、過分極される前に、少なくとも５％、好ましくは少なくとも５０％、最も好ましくは少なくとも９０％の存在度に適宜濃縮される。本発明のイメージング剤の少なくとも１個の炭素原子は、適宜１３Ｃで濃縮され、続いて過分極される。

検出可能な物質は、インビボ光学イメージングに適したレポーターであり得、そのレポーターは、光学イメージング手順で直接的又は間接的のいずれかで検出する能力がある任意の部位である。レポーターは、光散乱体（例えば着色又は非着色粒子）、光吸収体又は発光体であり得る。より好ましくは、レポーターは、発色団又は蛍光化合物などの色素である。色素は、紫外光から近赤外の波長を有する電磁スペクトルで光と相互作用する任意の色素であることができる。最も好ましくは、レポーターは、蛍光特性を有する。典型的な有機発色団及び蛍光団レポーターは、大規模な非局在化電子システム、例えばシアニン、メロシアニン、インドシアニン、フタロシアニン、ナフタロシアニン、トリフェニルメチン、ポルフィリン、ピリリウム（pyrilium）色素、チアピリリウム色素、スクアリリウム色素、クロコニウム（croconium）色素、アズレニウム色素、インドアニリン、ベンゾフェノキサジニウム色素、ベンゾチアフェノチアジニウム色素、アントラキノン、ナフトキノン（napthoquinone）、インダトレン（indathrene）、フタロイルアクリドン、トリスフェノキノン、アゾ色素、分子内及び分子間電荷移動色素及び色素複合体、トロポン、テトラジン、ｂ／ｓ（ジチオレン）複合体、ビスベンゼン（bisbenzene）−ジチオラート（dithiolatei）複合体、ヨードアニリン色素、ｂ／ｓ（Ｓ，Ｏ−ジチオレン）複合体を有する基を含む。緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）及び異なる吸収／発光特性を有するＧＦＰの改変物などの蛍光タンパク質も、有用である。特定の希土類金属（例えば、ユーロピウム、サマリウム、テルビウム又はジスプロシウム）の複合体がある状況で使用され、蛍光ナノ結晶（量子ドット）も同様である。

使用され得る発色団の特別な例は：フルオレセイン、スルホロダミン１０１（Texas Red）、ロダミンＢ、ロダミン６Ｇ、ロダミン１９、インドシアニングリーン、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、Marina Blue、Pacific Blue、Oregon Green 88、Oregon Green 514、テトラメチルロダミン、並びにAlexa Fluor 350、Alexa Fluor 430、Alexa Fluor 532、Alexa Fluor 546、Alexa Fluor 555、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 660、Alexa Fluor 680、Alexa Fluor 700、及びAlexa Fluor 750を含む。

特に好ましいのは、４００nmから３μmの間、特に６００から１３００nmの間の可視又は近赤外（ＮＩＲ）領域に吸収極大を有する色素である。光学イメージング様式及び測定技法は、非限定的に：発光イメージング；内視鏡検査；蛍光内視鏡検査；光干渉断層法、透過イメージング；時間分解透過イメージング；共焦点イメージング；非線形顕微鏡法；光音響イメージング；音響光学イメージング；分光法；反射率分光法；インターフェロメトリー；干渉インターフェロメトリー；拡散光トモグラフィー及び蛍光媒介拡散光トモグラフィー（連続波、時間領域及び周波数領域システム）、並びに光散乱、吸収、分極、発光、蛍光寿命、量子収量、及び消光の測定を含む。

好ましい検出可能な物質は、インビボ投与後に外部から非侵襲的に検出できる物質である。最も好ましいイメージング部位は、放射性、特に放射性金属イオン、ガンマ放出放射性ハロゲン及びポジトロン放出放射性非金属、特に、単一光子放出型コンピュータ断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）又はポジトロン放出断層撮影（ＰＥＴ）を使用するイメージングに適したものである。

検出可能な分子をポリペプチド、特に抗体にコンジュゲートするための技法は、当技術分野において周知である（例えば、Arnon et al., “Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy,” in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy (Reisfeld et al. eds., Alan R. Liss, Inc., 1985); Hellstrom et al., “Antibodies For Drug Delivery,” in Controlled Drug Delivery (Robinson et al. eds., Marcel Deiker, Inc., 2nd ed. 1987); Thorpe, “Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review,” in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications (Pinchera et al. eds., 1985); “Analysis, Results, and Future Prospective of the Therapeutic Use of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy,” in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy (Baldwin et al. eds., Academic Press, 1985);及びThorpe et al., 1982, Immunol. Rev. 62:119-58を参照されたい。例えばＰＣＴ公報である国際公開公報第８９／１２６２４号も参照されたい）。典型的には、核酸分子は、抗体上のリシン又はシステインに、それぞれＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル又はマレイミド官能基を経由して共有結合される。加工されたシステインを使用したコンジュゲーション又は非天然アミノ酸の組み入れの方法が、コンジュゲートの均一性を改善するために報告されている（Axup, J.Y., Bajjuri, K.M., Ritland, M., Hutchins, B.M., Kim, C.H., Kazane, S.A., Halder, R., Forsyth, J.S., Santidrian, A.F., Stafin, K., et al. (2012). Synthesis of site-specific antibody-drug conjugates using unnatural amino acids. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 109, 16101-16106.; Junutula, J.R., Flagella, K.M., Graham, R.A., Parsons, K.L., Ha, E., Raab, H., Bhakta, S., Nguyen, T., Dugger, D.L., Li, G., et al. (2010). Engineered thio-trastuzumab-DM1 conjugate with an improved therapeutic index to target humanepidermal growth factor receptor 2-positive breast cancer. Clin. Cancer Res.16, 4769-4778.）。Junutulaら(2008)は、従来のコンジュゲーション法と比較して改善された治療指数を示すと主張された「ＴＨＩＯＭＡＢ」（ＴＤＣ）と呼ばれるシステインベースの部位特異的コンジュゲーションを開発した。抗体中に組み入れられた非天然アミノ酸へのコンジュゲーションも、ＡＤＣについて探究されているが；このアプローチの一般性は、まだ確立されていない（Axup et al., 2012）。特に、当業者は、また、アシル供与体グルタミン含有タグ（例えば、Ｇｉｎ含有ペプチドタグ若しくはＱ−タグ）又はポリペプチド加工（例えば、ポリペプチド上のアミノ酸の欠失、挿入、置換、又は変異）によって反応性にされた内因性グルタミンで加工されたＦｃ含有ポリペプチドを構想することができる。次に、トランスグルタミナーゼが、アミン供与体剤（例えば、反応性アミンを含む又はそれに結合した小分子）と共有結合的に架橋されて、アミン供与体剤がアシル供与体グルタミン含有タグ又は到達可能な／露出した／反応性内因性グルタミンを経由してＦｃ含有ポリペプチドに部位特異的にコンジュゲートしている、加工されたＦｃ含有ポリペプチドコンジュゲートの安定で均一な集団を形成することができる（国際公開公報第２０１２０５９８８２号）。

本明細書記載のイメージング法に使用されるラベル化リガンドの量は、ターゲティングリガンドの同一性、検出可能な物質の同一性、イメージング剤を検出するために利用可能な手段、対象にリガンドを投与するために使用される手段、及び対象の体重を含む、多様な要因に依存する。一般的に、リガンドは、イメージング法において約０．１mgから約５０mgの間の量で対象に投与される。特別な例は、約０．５mg〜約１０mg、及び約１mg〜約５mgを含む。非限定的な例では、本発明のリガンド約１mg、２mg、３mg、４mg、５mg、６mg、７mg、８mg、９mg又は１０mgが、本明細書記載のイメージング法における使用のために対象に投与されるべき適切なリガンド量であり得る。

典型的には、リガンドは、対象に非経口的に、例えば、皮内、皮下、筋肉内、腹腔内、静脈内、又はクモ膜下腔内に投与される。しかし、熟練の技術者は、場合によっては、投与が経口、舌下、鼻腔内、眼内、直腸、経皮、粘膜、肺、又は局所であり得ると理解するであろう。

リガンドを検出することに加えて、熟練の技術者は、検出されるシグナルの量を、肝細胞ガン及び／若しくは消化器肝臓微小転移を有さないことが公知の対象からの対照値、又は同じ対象からより早い日付に得られた値などの他の値と比較することができることを理解している。一部の実施態様では、本方法は、さらに、対象におけるリガンドの量を測定すること、及び場合により、測定値を、対照値又は同じ対象におけるより早い時間に得られた値とさらに比較することを含む。

放射性イメージング剤を含む本発明のリガンドを検出するために適した手段は、非限定的に、放射性イメージングシステム、ＭＲＩ、ＳＰＥＣＴ−ＣＴ、及びＰＥＴイメージングを含む。光学イメージング剤を含むリガンドを検出するために適した手段は、非限定的に、フローサイトメトリー、共焦点顕微鏡法、蛍光標示式細胞分取器、及びLumina IIなどの蛍光イメージングシステムを含む。

肝細胞ガン及び／又は消化器肝臓微小転移が検出された後に、対象は、本発明によるＯＸ１Ｒアゴニストで処置され得る。

本発明は、以下の図面及び実施例によってさらに例証される。しかし、これらの実施例及び図面は、本発明の範囲を限定するものとして決して解釈されるべきではない。

欄Ａ：ＳＨＰタンパク質チロシンホスファターゼ阻害剤ＮＳＣ−８７８７７は、ＳＫ−ＨＥＰ−１のオレキシン誘導型成長阻害を遮断する。ＳＫ−ＨＥＰ−１細胞を、１μM オレキシン−Ａの存在下（黒）又は不在下（白）で、ＮＳＣ−８７８７７の不在下（ｗｏ）又は存在下（５０μM）で４８時間誘発した。処置の終わりに、接着細胞をトリプシンで処理し、トリパンブルーを排除している細胞を計数してＳＫ−ＨＥＰ−１細胞の成長を測定した。Ｂ欄：ヌードマウスにおけるヒトＨＣＣガン細胞ＳＫ−ＨＥＰ−１を異種移植することによって発生した腫瘍の成長に及ぼすオレキシン−Ａ接種の効果。０日目にヌードマウスの側腹部にＳＫ−ＨＥＰ−１細胞を接種した。マウスに、０日目（白丸）若しくは２２日目（三角）に開始して、オレキシン−Ａ（０．２３μmol/kg）溶液 １００μL又は対照についてＰＢＳ（黒丸） １００mLを週２回腹腔内注射した。

実施例：
オレキシンは、睡眠／覚醒のコントロールに関与する視床下部ペプチドである。本発明者らは、オレキシンが、結腸直腸ガン細胞において強いアポトーシスを促進することを示した（Voisin T, El Firar A, Fasseu M, Rouyer-Fessard C, Descatoire V, Walker F, Paradis V, Bedossa P, Henin D, Lehy T, Laburthe M. (2011) Aberrant expression of OX1 receptors for orexins in colon cancers and liver metastases: an openable gate to apoptosis. Cancer Res. 71:3341-51.）。細胞死は、オレキシン１受容体（ＯＸ１Ｒ）によって、ＯＸ１Ｒ配列における２つのＩＴＩＭ（免疫受容抑制性チロシンモチーフ）の存在並びにチロシンホスファターゼＳＨＰ−２の動員及び活性化を伴う本来のメカニズムを介して仲介される（Voisin T, El Firar A, Rouyer-Fessard C, Gratio V, Laburthe M. (2008) A hallmark of immunoreceptor, the tyrosine-based inhibitory motif ITIM, is present in the G protein-coupled receptor OX1R for orexins and drives apoptosis: a novel mechanism. FASEB J. 22:1993-2002.）。クラスＡのＧＰＣＲであるＯＸ１Ｒは、原発性結腸直腸腫瘍、膵臓腺ガン及び肝臓転移において異常発現される。ＨＣＣは、肝臓の原発性悪性腫瘍であり、世界中でガン死の主因の第３位に相当する。処置の頼みの綱は、切除及び化学療法であるが、多くの腫瘍は、表出すると切除不能である。本発明者らは、組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）を使用する免疫組織化学法によってＨＣＣにＯＸ１Ｒが発現していることを実証したが、これは、異所性ＯＸ１Ｒ発現を示唆している。本研究の目的は：１／ ヒトＨＣＣ細胞系におけるＯＸ１Ｒの存在を研究すること、及びアポトーシスに関係するオレキシン−Ａの効果を分析すること；２／ オレキシン−Ａに応答した腫瘍成長の研究のための、ＯＸ１Ｒを発現している細胞系からインビボ異所性異種移植モデルを開発することであった。４つのＨＣＣ細胞系（Ｈｅｐ Ｇ２、ＳＫ−ＨＥＰ−１、ＨｕＨ−７及びＨｅｐ ３Ｂ）において、ＯＸ１Ｒの発現をｍＲＮＡ（ＲＴ−ＰＣＲ）、タンパク質（免疫細胞化学）及び機能的レベルで検討した。ＳＫ−ＨＥＰ−１細胞系だけがＯＸ１Ｒを発現している。オレキシン−Ａを用いた処置は、ミトコンドリア性アポトーシスを促進することによって細胞成長阻害を６２％促進した（図１、Ａ欄）。ＳＨＰ阻害剤ＮＳＣ−８７８７７を使用して、本発明者らは、阻害剤がＳＫ−ＨＥＰ−１細胞におけるオレキシン誘導型アポトーシスを後退させる能力があることを実証した（図１、Ａ欄）。ＳＫ−ＨＥＰ−１細胞を異種移植されたヌードマウスにおけるオレキシン−Ａの注射は、処置されたケースにおける腫瘍進行を８０％低下させた（図１、Ｂ欄）。アポトーシスの誘導が、オレキシン−Ａ処置腫瘍において観察された（活性化カスパーゼ−３）。

本研究は、ＨＣＣにおけるオレキシンの抗腫瘍効果及びアポトーシス促進効果を実証した。これに関連して、オレキシンレセプターは、肝細胞ガンの抗悪性腫瘍療法及び／又は前臨床診断における新しい有望なターゲットに相当する。

参考文献：
本出願にわたり、様々な参考文献が、本発明が属する技術分野の水準を説明している。これらの参考文献の開示は、本明細書によって参照により本開示に組み入れられる。

Claims (17)

1. 肝細胞ガンの処置を必要とする対象におけるその処置のための方法であって、対象に治療有効量のＯＸ１Ｒアゴニストを投与することを含む方法。
2. ＯＸ１Ｒアゴニストが、小型有機分子である、請求項１記載の方法。
3. ＯＸ１Ｒアゴニストが、抗体である、請求項１記載の方法。
4. ＯＸ１Ｒアゴニストが、キメラ抗体、ヒト化抗体、又は完全ヒトモノクローナル抗体からなる群より選択される、請求項１記載の方法。
5. ＯＸ１Ｒアゴニストが、ポリペプチドである、請求項１記載の方法。
6. ＯＸ１Ｒアゴニストが、オレキシン−Ａ又はオレキシン−Ｂの機能的等価物である、請求項１記載の方法。
7. ＯＸ１Ｒアゴニストが、配列番号：２又は３と少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドである、請求項１記載の方法。
8. ＯＸ１Ｒアゴニストが、イムノアドヘシンである、請求項１記載の方法。
9. ＯＸ１Ｒが、アプタマーである、請求項１記載の方法。
10. 肝細胞ガンが、早期肝細胞ガン、非転移性肝細胞ガン、原発性肝細胞ガン、進行肝細胞ガン、局所進行肝細胞ガン、転移性肝細胞ガン、寛解期の肝細胞ガン、又は再発性肝細胞ガンからなる群より選択される、請求項１記載の方法。
11. 肝細胞ガンが、限局性切除可能、限局性切除不能、又は切除不能である、請求項１記載の方法。
12. 対象が、また、化学療法剤を投与される、請求項１記載の方法。
13. 肝細胞ガンの処置を、それを必要とする対象において行うための方法であって、ｉ）対象から得られた腫瘍組織試料中のＯＸ１Ｒの発現レベルを決定する段階、ｉｉ）段階ｉ）で決定された発現レベルを参照値と比較する段階、及びｉｉｉ）段階ｉ）で決定されたレベルが参照値よりも高い場合、対象に治療有効量のＯＸ１Ｒアゴニストを投与する段階を含む、方法。
14. ｉ）複数種の試験物質を提供する段階、ｉｉ）試験物質がＯＸ１Ｒアゴニストであるかどうかを決定する段階、及びｉｉｉ）ＯＸ１Ｒアゴニストである試験物質をポジティブ選択する段階を含む、肝細胞ガンの処置のための薬物をスクリーニングするための方法。
15. 肝細胞ガン及び／又は消化器肝臓微小転移のイメージングを、それを必要とする対象において行うための方法であって、ｉ）検出可能な物質でラベルされた、ある量のＯＸ１Ｒリガンドを対象に投与する段階、及びｉｉ）対象における検出可能な物質でラベルされたＯＸ１Ｒリガンドの存在を検出する段階を含む、方法。
16. 樹立した肝細胞ガンのサイズの減少を、それを必要とする患者において行う方法であって、患者に治療有効量のＯＸ１Ｒアゴニストを投与する段階を含み、該量が、腫瘍のサイズを減少させるために十分である、方法。
17. 肝細胞ガンの成長の阻止又は減速を、それを必要とする患者において行う方法であって、該患者に治療有効量のＯＸ１Ｒアゴニストを投与することを含み、該量が、少なくとも１つの肝細胞ガンの成長を阻止又は減速するために十分である、方法。