JP2017515852A - 代謝障害を処置するための組成物および方法 - Google Patents

代謝障害を処置するための組成物および方法 Download PDF

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Abstract

本開示は、糖尿病、インスリン分泌の阻害に関連する状態を含む、カルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）に関連する代謝障害を処置するための、または長寿を増加させるための組成物および方法を特色とする。特に、本方法は、代謝障害を患う対象に、治療有効量の抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体を投与するステップを含む。一部の実施形態では、対象は、治療有効量の１種または複数の抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体の投与後に、インスリン分泌増加、グルコース耐性増加および長寿増加を示し得る。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、参照によって本明細書に組み込まれる２０１４年５月１６日に出願された米国仮出願第６１／９９４，７３９号に基づく優先権を主張する。
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出され、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる配列表を含む。２０１５年５月１５日に作成された当該ＡＳＣＩＩコピーは、７１５８−９２３６６−０２＿ＳＬ．ｔｘｔという名称で、サイズが６０，１７８バイトである。
ＣＧＲＰ（カルシトニン遺伝子関連ペプチド）は、カルシトニン、アドレノメデュリンおよびアミリンを含むペプチドのファミリーに属する、３７アミノ酸のニューロペプチドである。ヒトにおいて、２つの型のＣＧＲＰ（α−ＣＧＲＰおよびβ−ＣＧＲＰ）が存在し、同様の活性を有する。これらは、３個のアミノ酸によって変動し、差次的分布を示す。少なくとも２種のＣＧＲＰ受容体サブタイプが、差次的活性を説明することもできる。ＣＧＲＰは、中枢神経系における神経伝達物質であり、末梢における強力な血管拡張薬であることが示されており、ＣＧＲＰ含有ニューロンが血管と密接に関連する。ＣＧＲＰ媒介性血管拡張は、血漿の血管外漏出および微小血管系の血管拡張をもたらす事象のカスケードの一部として、神経原性炎症にも関連し、片頭痛に見られる。
代謝障害（例えば、肥満、糖尿病等）および加齢に関連する状態は、２つの重複し増加しつつある公衆衛生上の問題である。代謝障害は、脂質およびグルコース代謝における異常を反映するいくつかの徴候を有する。これらの異常は、粥状動脈硬化、心血管疾患（ＣＶＤ）、真性糖尿病その他の原因であると考えられる。代謝障害の頻度は、生活習慣および年齢に依存する。高齢者集団における代謝障害は、死亡率または心血管（ＣＶ）罹患率、特に、脳卒中および冠動脈心疾患（ＣＨＤ）の証明済みのリスク因子である。高齢者集団における代謝障害、心発作および糖尿病の高い有病率は、年齢のエビデンスを、代謝異常発症の独立的リスク因子とする。したがって、代謝障害の処置または長寿促進の差し迫った必要がある。
対象における代謝障害を処置するための方法の差し迫った必要がある。本開示は、これらの必要に取り組む。
本開示は、代謝障害を処置するための方法を提供する。本方法は、代謝障害を患う対象に、治療有効量の抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体を投与するステップを含むことができる。例示的な代謝障害として、体重増加、糖尿病、心血管疾患またはこれらの組合せが挙げられるがこれらに限定されない。一部の実施形態では、代謝障害は、糖尿病である。一部の実施形態では、代謝障害は、インスリン分泌の阻害によって特徴付けられる障害である。
一部の実施形態では、対象は、治療有効量の１種または複数の抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体の投与後に、インスリン分泌増加、グルコース耐性増加および長寿増加を示し得る。
本明細書に提供されている方法のいずれかの実施において、抗体は、ヒトまたはヒト化抗体であり得る。一部の実施形態では、抗体は、モノクローナル抗体である。
一部の実施形態では、本明細書に開示されている対象は、ヒト等の哺乳動物である。
本明細書に開示されている方法は、ＣＧＲＰに結合する治療有効量の抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体を投与するステップを含むことができる。一部の事例において、抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体は、３７℃における表面プラズモン共鳴によって測定される５０ｎＭまたはそれ未満のＫＤでＣＧＲＰに結合する。一部の事例において、抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体は、ｉｎ ｖｉｖｏで少なくとも７日間の半減期を有する。
一部の実施形態では、抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体は、ＣＧＲＰのＣ末端領域に特異的に結合することができる。一部の事例において、抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体は、配列ＧＳＫＡＦ（配列番号４８）によって規定されるエピトープを特異的に認識する。一部の事例において、抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体は、配列番号１または１５５に示すアミノ酸配列を有するＶＨドメインを含む。一部の事例において、抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体は、配列番号２または１５６に示すアミノ酸配列を有するＶＬドメインを含む。
一部の実施形態では、抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体は、（ａ）配列番号３、１６９もしくは１７０に表記されているＣＤＲ Ｈ１；配列番号４もしくは１７１に表記されているＣＤＲ Ｈ２；配列番号５に表記されているＣＤＲ Ｈ３；配列番号６に表記されているＣＤＲ Ｌ１；配列番号７に表記されているＣＤＲ Ｌ２；および配列番号８に表記されているＣＤＲ Ｌ３；（ｂ）配列番号１５７、１７２もしくは１７３に表記されているＣＤＲ Ｈ１；配列番号１５８もしくは１７４に表記されているＣＤＲ Ｈ２；配列番号１５９に表記されているＣＤＲ Ｈ３；配列番号１６０に表記されているＣＤＲ Ｌ１；配列番号１６１に表記されているＣＤＲ Ｌ２；および配列番号１６２に表記されているＣＤＲ Ｌ３；または（ｃ）表６に示す（ａ）に従った抗体のバリアントを含む。一部の事例において、抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体は、配列番号１に示すアミノ酸配列を有するＶＨドメインと、配列番号２に示すアミノ酸配列を有するＶＬドメインとを含むことができる。
一部の実施形態では、抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体は、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（ＡＴＣＣ）受託番号ＰＴＡ−６８６７および／またはＰＴＡ−６８６６を有する発現ベクターによって産生される。
一部の実施形態では、抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体は、Ｃ末端リシンを有するまたは有さない、配列番号１１に示す抗体Ｇ１重鎖完全抗体アミノ酸配列と、配列番号１２に示す抗体Ｇ１軽鎖完全抗体アミノ酸配列とを含む。一部の事例において、抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体は、配列番号１６５に示す抗体Ｇ２重鎖完全抗体アミノ酸配列と、配列番号１６６に示す抗体Ｇ２軽鎖完全抗体アミノ酸配列とを含む。
抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体は、末梢に等、いずれかルーチンの方法を使用して投与することができる。一部の例において、抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体は、経口、舌下、吸入により、経皮、皮下、静脈内、動脈内、関節内、関節周囲、局所的および／または筋肉内投与される。一部の例において、抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体は、皮下または静脈内投与される。
一部の実施形態では、抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体は、投与後に末梢に作用することができる。
一部の実施形態では、抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体は、（ａ）ＣＧＲＰに結合する；（ｂ）ＣＧＲＰがその受容体に結合するのを遮断する；（ｃ）ＣＧＲＰ受容体活性化を遮断もしくは減少させる；（ｄ）ＣＧＲＰの生物学的活性を阻害、遮断、抑制もしくは低下させる；（ｅ）ＣＧＲＰのクリアランスを増加させる；および／または（ｇ）ＣＧＲＰ合成、産生もしくは放出を阻害する。
本開示の前述および他の目的および特色は、添付の図面を参照しつつ進行する次の詳細な説明からより明らかとなるであろう。
図１は、異なるアラニン置換ヒトα−ＣＧＲＰ断片に対する１２種のマウス抗体の結合親和性を示す表である。結合親和性は、チップ上のＣＧＲＰにわたってＦａｂを流動させることにより、Ｂｉａｃｏｒｅを使用して２５℃で測定した。囲まれた値は、１９〜３７親に由来する、Ｋ３５Ａを除いた、親断片２５〜３７（イタリック体）と比べたアラニン突然変異体の親和性の喪失を表す。「ａ」は、１９〜３７および２５〜３７断片に対する親和性が、異なるセンサーチップにおける２回の独立的測定の平均±標準偏差であることを示す。「ｂ」は、これらの相互作用が、二相性オフレートのために単純な二分子相互作用モデルから逸脱したため、立体構造変化モデルを使用してこれらの親和性を決定したことを示す。グレースケールキー：白色（１．０）は、親親和性を示し；薄灰色（０．５未満）は、親よりも高い親和性を示し；暗灰色（２超）は、親よりも低い親和性を示し；黒色は、結合が検出されなかったことを示す。
図２Ａおよび２Ｂは、３０秒間の電気パルス刺激後に血球細胞フラックスとして測定される皮膚血流量における、ＣＧＲＰ８−３７（４００ｎｍｏｌ／ｋｇ）、抗体４９０１（２５ｍｇ／ｋｇ）および抗体７Ｄ１１（２５ｍｇ／ｋｇ）の投与の効果を示す。ＣＧＲＰ８−３７は、電気パルス刺激の３〜５分前に静脈内（ｉｖ）投与した。抗体は、電気パルス刺激の７２時間前に腹腔内（ＩＰ）投与した。グラフにおける各点は、表示条件下で処置した１匹のラットのＡＵＣを表す。グラフにおける各線は、表示条件下で処置したラットの平均ＡＵＣを表す。ＡＵＣ（曲線下面積）は、Δフラックス×Δ時間に等しい。「Δフラックス」は、電気パルス刺激後のフラックス単位の変化を表し；「Δ時間」は、血球細胞フラックスレベルが、電気パルス刺激前のレベルに戻るのに要した期間を表す。 図２Ａおよび２Ｂは、３０秒間の電気パルス刺激後に血球細胞フラックスとして測定される皮膚血流量における、ＣＧＲＰ８−３７（４００ｎｍｏｌ／ｋｇ）、抗体４９０１（２５ｍｇ／ｋｇ）および抗体７Ｄ１１（２５ｍｇ／ｋｇ）の投与の効果を示す。ＣＧＲＰ８−３７は、電気パルス刺激の３〜５分前に静脈内（ｉｖ）投与した。抗体は、電気パルス刺激の７２時間前に腹腔内（ＩＰ）投与した。グラフにおける各点は、表示条件下で処置した１匹のラットのＡＵＣを表す。グラフにおける各線は、表示条件下で処置したラットの平均ＡＵＣを表す。ＡＵＣ（曲線下面積）は、Δフラックス×Δ時間に等しい。「Δフラックス」は、電気パルス刺激後のフラックス単位の変化を表し；「Δ時間」は、血球細胞フラックスレベルが、電気パルス刺激前のレベルに戻るのに要した期間を表す。
図３は、３０秒間の電気パルス刺激後に血球細胞フラックスとして測定される皮膚血流量における、異なる投薬量の抗体４９０１（２５ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、２．５ｍｇ／ｋｇまたは１ｍｇ／ｋｇ）の投与の効果を示す。抗体は、電気パルス刺激の２４時間前に静脈内（ＩＶ）投与した。グラフにおける各点は、表示条件下で処置した１匹のラットのＡＵＣを表す。グラフにおける線は、表示条件下で処置したラットの平均ＡＵＣを表す。
図４Ａおよび４Ｂは、３０秒間の電気パルス刺激後に血球細胞フラックスとして測定される皮膚血流量における、抗体４９０１（１ｍｇ／ｋｇまたは１０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｖ．）、抗体７Ｅ９（１０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｖ．）および抗体８Ｂ６（１０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｖ．）の投与の効果を示す。抗体を静脈内（ｉ．ｖ．）投与し、続いて抗体投与の３０分、６０分、９０分および１２０分後に電気パルス刺激した。Ｙ軸は、抗体が投与されなかった場合のＡＵＣのレベル（０時）と比較したＡＵＣのパーセントを表す。Ｘ軸は、抗体投与および電気パルス刺激の間の期間（分）を表す。「＊」は、０時と比較したＰ＜０．０５を示し、「＊＊」は、Ｐ＜０．０１を示す。ダネットの多重比較検定による一元配置ＡＮＯＶＡを使用して、データを解析した。 図４Ａおよび４Ｂは、３０秒間の電気パルス刺激後に血球細胞フラックスとして測定される皮膚血流量における、抗体４９０１（１ｍｇ／ｋｇまたは１０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｖ．）、抗体７Ｅ９（１０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｖ．）および抗体８Ｂ６（１０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｖ．）の投与の効果を示す。抗体を静脈内（ｉ．ｖ．）投与し、続いて抗体投与の３０分、６０分、９０分および１２０分後に電気パルス刺激した。Ｙ軸は、抗体が投与されなかった場合のＡＵＣのレベル（０時）と比較したＡＵＣのパーセントを表す。Ｘ軸は、抗体投与および電気パルス刺激の間の期間（分）を表す。「＊」は、０時と比較したＰ＜０．０５を示し、「＊＊」は、Ｐ＜０．０１を示す。ダネットの多重比較検定による一元配置ＡＮＯＶＡを使用して、データを解析した。
図５は、抗体Ｇ１の重鎖可変領域（配列番号１）および軽鎖可変領域（配列番号２）のアミノ酸配列を示す。Ｋａｂａｔ ＣＤＲはボールド体テキストとし、Ｃｈｏｔｈｉａ ＣＤＲに下線を引く。重鎖および軽鎖可変領域のアミノ酸残基に連続的に番号を振る。
図６は、Ｂｉａｃｏｒｅを使用したペプチド競合による抗体Ｇ１のエピトープマッピングを示す。Ｎ−ビオチン化ヒトα−ＣＧＲＰをＳＡセンサーチップにおいて捕捉した。競合ペプチドの非存在下の、または１０ｕＭの競合ペプチドと共に１時間プレインキュベートしたＧ１ Ｆａｂ（５０ｎＭ）を、チップ上に流動した。チップにおけるヒトα−ＣＧＲＰへのＧ１ Ｆａｂの結合を測定した。Ｙ軸は、競合ペプチドの非存在下の結合と比較した、競合ペプチドの存在によって遮断された結合のパーセンテージを表す。
図７Ａ〜７Ｄは、ＴＲＰＶ１破壊が、マウスの寿命を延長し得ることを示す。図７Ａ〜７Ｂ：野生型（ＷＴ）およびＴＲＰＶ１ノックアウト（ＫＯ）マウスのカプラン・マイヤー生存曲線を示す。図７Ａ：雄データ；図７Ｂ：雌データ。生存データは、表９に報告する。図７Ｃ：剖検解析。新生物および非新生物疾患の発生率。新生物または厳密に非新生物疾患いずれかの出現を示すマウスのパーセンテージとして結果を報告（ｐ＜０．１、ｎｓ、フィッシャー直接検定）；図７Ｄ：新生物疾患の性質。疾患を有するマウスのパーセンテージ（総数）として結果を報告、＊ｐ＜０．０５、フィッシャー直接検定。Ｎｓ：有意ではない、ｎａ：適用されない。 図７Ａ〜７Ｄは、ＴＲＰＶ１破壊が、マウスの寿命を延長し得ることを示す。図７Ａ〜７Ｂ：野生型（ＷＴ）およびＴＲＰＶ１ノックアウト（ＫＯ）マウスのカプラン・マイヤー生存曲線を示す。図７Ａ：雄データ；図７Ｂ：雌データ。生存データは、表９に報告する。図７Ｃ：剖検解析。新生物および非新生物疾患の発生率。新生物または厳密に非新生物疾患いずれかの出現を示すマウスのパーセンテージとして結果を報告（ｐ＜０．１、ｎｓ、フィッシャー直接検定）；図７Ｄ：新生物疾患の性質。疾患を有するマウスのパーセンテージ（総数）として結果を報告、＊ｐ＜０．０５、フィッシャー直接検定。Ｎｓ：有意ではない、ｎａ：適用されない。
図８Ａ〜８Ｅは、ＴＲＰＶ１突然変異体マウスにおける健康寿命評価を実証する図表および図解である。図８Ａ：バーンズ迷路手順。含有する２０個の等しく間隔をあけた孔のうち１個のみが逃避孔である明るく照射された迷路における逃避孔を発見するように、３０ヶ月の雄マウス（ｎ＝１０）を４日間、１日当たり３回の試行で訓練した。２日間の間隔の後、保持検査においてマウスを再検査した。最後に、本来の孔から９０°に逃避孔を再配置する、逆転記憶検査でマウスを検証した。図８Ｂ：訓練、保持および逆転期にわたる、バーンズ迷路逃避潜時（二元配置Ａｎｏｖａ、＊＊ｐ＜０．００５、＊ｐ＜０．０１）。逆転期において、孔までの一次通路長も測定した。ＴＲＰＶ１ ＫＯマウスは、ＷＴよりも速く孔に位置する傾向があったが、隠れる（すなわち、孔に入る）意欲の減少を呈し、これは、ＴＲＰＶ１突然変異体マウスにおける不安の低下によって説明することができる。したがって、本出願人らは、孔までの一次通路長を測定し、ＴＲＰＶ１突然変異体マウスが、そのＷＴカウンターメイトよりも直接的に逃避箱へと移動したことを見出した。図８Ｃ：バーンズ迷路エラー（二元配置Ａｎｏｖａ、＊＊＊ｐ＜０．０００１、＊ｐ＜０．０１）。図８Ｄ：４、１２および２４ヶ月目における回転ロッドから転落するまでの潜時（スチューデントｔ検定、＊ｐ＜０．０１）。図８Ｅ：上パネル。２４ヶ月目のＴＲＰＶ１ ＫＯおよびＷＴ雄の海馬のＣＡ１、ＣＡ３およびＤＧ区域におけるニッスル陽性ニューロンの分布。下パネル。２４ヶ月目のＴＲＰＶ１ ＫＯおよびＷＴ雄由来の脳切片の代表的なヘマトキシリンおよびエオシン染色（十字縫合−１．６４ｍｍ）。 図８Ａ〜８Ｅは、ＴＲＰＶ１突然変異体マウスにおける健康寿命評価を実証する図表および図解である。図８Ａ：バーンズ迷路手順。含有する２０個の等しく間隔をあけた孔のうち１個のみが逃避孔である明るく照射された迷路における逃避孔を発見するように、３０ヶ月の雄マウス（ｎ＝１０）を４日間、１日当たり３回の試行で訓練した。２日間の間隔の後、保持検査においてマウスを再検査した。最後に、本来の孔から９０°に逃避孔を再配置する、逆転記憶検査でマウスを検証した。図８Ｂ：訓練、保持および逆転期にわたる、バーンズ迷路逃避潜時（二元配置Ａｎｏｖａ、＊＊ｐ＜０．００５、＊ｐ＜０．０１）。逆転期において、孔までの一次通路長も測定した。ＴＲＰＶ１ ＫＯマウスは、ＷＴよりも速く孔に位置する傾向があったが、隠れる（すなわち、孔に入る）意欲の減少を呈し、これは、ＴＲＰＶ１突然変異体マウスにおける不安の低下によって説明することができる。したがって、本出願人らは、孔までの一次通路長を測定し、ＴＲＰＶ１突然変異体マウスが、そのＷＴカウンターメイトよりも直接的に逃避箱へと移動したことを見出した。図８Ｃ：バーンズ迷路エラー（二元配置Ａｎｏｖａ、＊＊＊ｐ＜０．０００１、＊ｐ＜０．０１）。図８Ｄ：４、１２および２４ヶ月目における回転ロッドから転落するまでの潜時（スチューデントｔ検定、＊ｐ＜０．０１）。図８Ｅ：上パネル。２４ヶ月目のＴＲＰＶ１ ＫＯおよびＷＴ雄の海馬のＣＡ１、ＣＡ３およびＤＧ区域におけるニッスル陽性ニューロンの分布。下パネル。２４ヶ月目のＴＲＰＶ１ ＫＯおよびＷＴ雄由来の脳切片の代表的なヘマトキシリンおよびエオシン染色（十字縫合−１．６４ｍｍ）。
図９Ａ〜９Ｅは、ＴＲＰＶ１突然変異体マウスにおけるＧＨ／ＩＧＦ−１軸の必要性の評価を図解する図表および画像である。図９Ａ：成体ＴＲＰＶ１ ＫＯの代表的な写真（６ヶ月齢、左：ＷＴ、右：ＴＲＰＶ１ ＫＯ）。図９Ｂ：３〜２４ヶ月齢、（左）雄データ（ＴＲＰＶ１ ＫＯ、ｎ＝３８；ＷＴ、ｎ＝３２）、（右）雌データ（ＴＲＰＶ１ ＫＯ、ｎ＝４８；ＷＴ、ｎ＝４２）由来のＴＲＰＶ１ ＫＯおよびＷＴマウスの全身成長。平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．、ｎ．ｓ．、二元配置ＡＮＯＶＡ。図９Ｃ：２４ヶ月齢ＴＲＰＶ１ ＫＯおよびＷＴ雄の体組成。肺、肝臓、腎臓、脾臓、膵臓、脳、心臓、ｉＷＡＴ（鼠径部白色脂肪組織）、ｇＷＡＴ（性腺白色脂肪組織）、ｐＷＡＴ（腹膜白色脂肪組織）の臓器重量は、総体重のパーセンテージとして表現する。平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．、ｎ．ｓ．、スチューデントｔ検定。図９Ｄ：脳下垂体（ｎ＝５、６ヶ月齢）由来の成長ホルモン（ＧＨ）のウエスタンブロッティング。ローディング対照：β−アクチン。（Ｅ）食事を与えた雄マウス（ｎ＝１５、６ヶ月齢）における血漿ＩＧＦ−１レベルのＥＬＩＳＡ解析。平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．、ｎ．ｓ．、スチューデントｔ検定。図９Ｅは、ＩＧＦ−１の血漿レベルを示す棒グラフである。 図９Ａ〜９Ｅは、ＴＲＰＶ１突然変異体マウスにおけるＧＨ／ＩＧＦ−１軸の必要性の評価を図解する図表および画像である。図９Ａ：成体ＴＲＰＶ１ ＫＯの代表的な写真（６ヶ月齢、左：ＷＴ、右：ＴＲＰＶ１ ＫＯ）。図９Ｂ：３〜２４ヶ月齢、（左）雄データ（ＴＲＰＶ１ ＫＯ、ｎ＝３８；ＷＴ、ｎ＝３２）、（右）雌データ（ＴＲＰＶ１ ＫＯ、ｎ＝４８；ＷＴ、ｎ＝４２）由来のＴＲＰＶ１ ＫＯおよびＷＴマウスの全身成長。平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．、ｎ．ｓ．、二元配置ＡＮＯＶＡ。図９Ｃ：２４ヶ月齢ＴＲＰＶ１ ＫＯおよびＷＴ雄の体組成。肺、肝臓、腎臓、脾臓、膵臓、脳、心臓、ｉＷＡＴ（鼠径部白色脂肪組織）、ｇＷＡＴ（性腺白色脂肪組織）、ｐＷＡＴ（腹膜白色脂肪組織）の臓器重量は、総体重のパーセンテージとして表現する。平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．、ｎ．ｓ．、スチューデントｔ検定。図９Ｄ：脳下垂体（ｎ＝５、６ヶ月齢）由来の成長ホルモン（ＧＨ）のウエスタンブロッティング。ローディング対照：β−アクチン。（Ｅ）食事を与えた雄マウス（ｎ＝１５、６ヶ月齢）における血漿ＩＧＦ−１レベルのＥＬＩＳＡ解析。平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．、ｎ．ｓ．、スチューデントｔ検定。図９Ｅは、ＩＧＦ−１の血漿レベルを示す棒グラフである。
図１０は、ＴＲＰＶ１突然変異体マウスの組織学的プロファイリングを示す。２４ヶ月目のＴＲＰＶ１ ＫＯおよびＷＴ雄の組織切片の代表的なヘマトキシリンおよびエオシン染色。
図１１Ａ〜１１Ｆは、ＴＲＰＶ１突然変異体マウスの代謝プロファイリングを図解する。図１１Ａ：６ヶ月齢雄ＴＲＰＶ１ ＫＯおよびＷＴの平均直腸体温および食物摂取測定（ｎ．ｓ．、スチューデントｔ検定）。図１１Ｂ：６ヶ月齢雄ＴＲＰＶ１ ＫＯおよびＷＴの絶食時インスリン、レプチン、アディポネクチン、コレステロールおよびトリグリセリド（ｎ．ｓ．、スチューデントｔ検定）。図１１Ｃ：２４ヶ月目のＢＡＴにおける熱発生のｑＰＣＲ解析（ｎ＝５、平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ、ｎ．ｓ．、スチューデントｔ検定）。図１１Ｄ：３ヶ月および１６ヶ月目の酸素消費（図１１Ｄ）ＶＯ２および（図１１Ｅ）総歩行活動。図１１Ｆ：ＴＲＰＶ１ ＫＯ群およびＷＴ群における％ＫＩ６７＋／インスリン＋％および％ＣＫ２０＋／インスリン＋％。＊＊ｐ＜０．００１、スチューデントｔ検定（ｎ＝８、平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ）。 図１１Ａ〜１１Ｆは、ＴＲＰＶ１突然変異体マウスの代謝プロファイリングを図解する。図１１Ａ：６ヶ月齢雄ＴＲＰＶ１ ＫＯおよびＷＴの平均直腸体温および食物摂取測定（ｎ．ｓ．、スチューデントｔ検定）。図１１Ｂ：６ヶ月齢雄ＴＲＰＶ１ ＫＯおよびＷＴの絶食時インスリン、レプチン、アディポネクチン、コレステロールおよびトリグリセリド（ｎ．ｓ．、スチューデントｔ検定）。図１１Ｃ：２４ヶ月目のＢＡＴにおける熱発生のｑＰＣＲ解析（ｎ＝５、平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ、ｎ．ｓ．、スチューデントｔ検定）。図１１Ｄ：３ヶ月および１６ヶ月目の酸素消費（図１１Ｄ）ＶＯ２および（図１１Ｅ）総歩行活動。図１１Ｆ：ＴＲＰＶ１ ＫＯ群およびＷＴ群における％ＫＩ６７＋／インスリン＋％および％ＣＫ２０＋／インスリン＋％。＊＊ｐ＜０．００１、スチューデントｔ検定（ｎ＝８、平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ）。 図１１Ａ〜１１Ｆは、ＴＲＰＶ１突然変異体マウスの代謝プロファイリングを図解する。図１１Ａ：６ヶ月齢雄ＴＲＰＶ１ ＫＯおよびＷＴの平均直腸体温および食物摂取測定（ｎ．ｓ．、スチューデントｔ検定）。図１１Ｂ：６ヶ月齢雄ＴＲＰＶ１ ＫＯおよびＷＴの絶食時インスリン、レプチン、アディポネクチン、コレステロールおよびトリグリセリド（ｎ．ｓ．、スチューデントｔ検定）。図１１Ｃ：２４ヶ月目のＢＡＴにおける熱発生のｑＰＣＲ解析（ｎ＝５、平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ、ｎ．ｓ．、スチューデントｔ検定）。図１１Ｄ：３ヶ月および１６ヶ月目の酸素消費（図１１Ｄ）ＶＯ２および（図１１Ｅ）総歩行活動。図１１Ｆ：ＴＲＰＶ１ ＫＯ群およびＷＴ群における％ＫＩ６７＋／インスリン＋％および％ＣＫ２０＋／インスリン＋％。＊＊ｐ＜０．００１、スチューデントｔ検定（ｎ＝８、平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ）。
図１２Ａ〜１２Ｈは、全身エネルギー支出およびインスリン抵抗性の解析を図解する。図１２Ａ：雄ＴＲＰＶ１ ＫＯおよびＷＴ対照の呼吸交換率（ＲＥＲ）解析。ｎ＝８、平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．、＊＊＊ｐ＜０．０００４、一元配置ＡＮＯＶＡ。図１２Ｂ：３ヶ月および２２ヶ月目のグルコース耐性検査、ｎ＝１６、平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．、＊＊＊ｐ＜０．０００１、＊＊ｐ＜０．００１、＊ｐ＜０．０１、スチューデントｔ検定。図１２Ｃ：初期グルコースレベルのパーセンテージとして表現される、３ヶ月および２２ヶ月目のインスリン耐性検査、ｎ＝１１〜１６、平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．、＊＊ｐ＜０．００１、＊ｐ＜０．０１、スチューデントｔ検定。図１２Ｄ：膵臓を固定し、インスリン（赤色）およびグルカゴン（緑色）、ｄａｐｉ核色素（青色）に対して免疫標識した。図１２Ｅ：２４ヶ月齢ＴＲＰＶ１ ＫＯおよびＷＴマウスのβ細胞質量、ｎ＝４、平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．、＊ｐ＜０．０５、スチューデントｔ検定。図１２Ｆ：ＴＲＰＶ１ ＫＯおよびＷＴマウスから単離された膵β細胞の定量的ＰＣＲ解析、ｎ＝８、平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．、＊ｐ＜０．０１、スチューデントｔ検定。図１２Ｇ：グルコース刺激インスリン分泌アッセイ、ｎ＝５、平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．、＊ｐ＜０．０１、スチューデントｔ検定。図１２Ｈ：ＴＲＰＶ１ ＫＯおよびＷＴ筋肉（左）および肝臓（右）におけるホスホＡＫＴ（Ｓｅｒ４７３）および総ＡＫＴのウエスタンブロット解析（ｎ＝５）。α−チューブリンおよびβ−アクチンは、筋肉および肝臓組織のローディング対照としてそれぞれ使用した。 図１２Ａ〜１２Ｈは、全身エネルギー支出およびインスリン抵抗性の解析を図解する。図１２Ａ：雄ＴＲＰＶ１ ＫＯおよびＷＴ対照の呼吸交換率（ＲＥＲ）解析。ｎ＝８、平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．、＊＊＊ｐ＜０．０００４、一元配置ＡＮＯＶＡ。図１２Ｂ：３ヶ月および２２ヶ月目のグルコース耐性検査、ｎ＝１６、平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．、＊＊＊ｐ＜０．０００１、＊＊ｐ＜０．００１、＊ｐ＜０．０１、スチューデントｔ検定。図１２Ｃ：初期グルコースレベルのパーセンテージとして表現される、３ヶ月および２２ヶ月目のインスリン耐性検査、ｎ＝１１〜１６、平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．、＊＊ｐ＜０．００１、＊ｐ＜０．０１、スチューデントｔ検定。図１２Ｄ：膵臓を固定し、インスリン（赤色）およびグルカゴン（緑色）、ｄａｐｉ核色素（青色）に対して免疫標識した。図１２Ｅ：２４ヶ月齢ＴＲＰＶ１ ＫＯおよびＷＴマウスのβ細胞質量、ｎ＝４、平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．、＊ｐ＜０．０５、スチューデントｔ検定。図１２Ｆ：ＴＲＰＶ１ ＫＯおよびＷＴマウスから単離された膵β細胞の定量的ＰＣＲ解析、ｎ＝８、平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．、＊ｐ＜０．０１、スチューデントｔ検定。図１２Ｇ：グルコース刺激インスリン分泌アッセイ、ｎ＝５、平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．、＊ｐ＜０．０１、スチューデントｔ検定。図１２Ｈ：ＴＲＰＶ１ ＫＯおよびＷＴ筋肉（左）および肝臓（右）におけるホスホＡＫＴ（Ｓｅｒ４７３）および総ＡＫＴのウエスタンブロット解析（ｎ＝５）。α−チューブリンおよびβ−アクチンは、筋肉および肝臓組織のローディング対照としてそれぞれ使用した。 図１２Ａ〜１２Ｈは、全身エネルギー支出およびインスリン抵抗性の解析を図解する。図１２Ａ：雄ＴＲＰＶ１ ＫＯおよびＷＴ対照の呼吸交換率（ＲＥＲ）解析。ｎ＝８、平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．、＊＊＊ｐ＜０．０００４、一元配置ＡＮＯＶＡ。図１２Ｂ：３ヶ月および２２ヶ月目のグルコース耐性検査、ｎ＝１６、平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．、＊＊＊ｐ＜０．０００１、＊＊ｐ＜０．００１、＊ｐ＜０．０１、スチューデントｔ検定。図１２Ｃ：初期グルコースレベルのパーセンテージとして表現される、３ヶ月および２２ヶ月目のインスリン耐性検査、ｎ＝１１〜１６、平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．、＊＊ｐ＜０．００１、＊ｐ＜０．０１、スチューデントｔ検定。図１２Ｄ：膵臓を固定し、インスリン（赤色）およびグルカゴン（緑色）、ｄａｐｉ核色素（青色）に対して免疫標識した。図１２Ｅ：２４ヶ月齢ＴＲＰＶ１ ＫＯおよびＷＴマウスのβ細胞質量、ｎ＝４、平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．、＊ｐ＜０．０５、スチューデントｔ検定。図１２Ｆ：ＴＲＰＶ１ ＫＯおよびＷＴマウスから単離された膵β細胞の定量的ＰＣＲ解析、ｎ＝８、平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．、＊ｐ＜０．０１、スチューデントｔ検定。図１２Ｇ：グルコース刺激インスリン分泌アッセイ、ｎ＝５、平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．、＊ｐ＜０．０１、スチューデントｔ検定。図１２Ｈ：ＴＲＰＶ１ ＫＯおよびＷＴ筋肉（左）および肝臓（右）におけるホスホＡＫＴ（Ｓｅｒ４７３）および総ＡＫＴのウエスタンブロット解析（ｎ＝５）。α−チューブリンおよびβ−アクチンは、筋肉および肝臓組織のローディング対照としてそれぞれ使用した。
図１３Ａ〜１３Ｄは、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓにおけるｔｒｐｖ突然変異が、寿命を調節するためにｃｒｔｃ１を要求することを図解する図表および画像である。図１３Ａ：単一突然変異体と比較した、ｔｒｐｖ二重ヌル突然変異体虫ｏｓｍ−９（ｋｙ１０）；ｏｃｒ−２（ａｋ４７）の生存曲線。図１３Ｂ：ｔｒｐｖ突然変異体（ｏｓｍ−９（ｋｙ１０）；ｏｃｒ−２（ａｋ４７））虫およびＷＴ対照における、トリカイン処置後の腸細胞におけるＣＲＴＣ１：：ＲＦＰ細胞質から核へのシャトリングの代表的な画像。図１３Ｃ：ＧＦＰ ＲＮＡｉを与えた対照虫（単純線）と比較した、カルシニューリン（ｔａｘ−６）ＲＮＡｉにおいてＣＲＴＣ１：：ＲＦＰを発現するトランスジェニック虫（破線）の生存曲線。図１３Ｄ：ＷＴ対照と比較した、ｔａｘ−６脱リン酸化部位が突然変異した（Ｓ７６Ａ、Ｓ１７９Ａ）構成的核ＣＲＴＣ１系統におけるＴＲＰＶ突然変異体の生存曲線。 図１３Ａ〜１３Ｄは、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓにおけるｔｒｐｖ突然変異が、寿命を調節するためにｃｒｔｃ１を要求することを図解する図表および画像である。図１３Ａ：単一突然変異体と比較した、ｔｒｐｖ二重ヌル突然変異体虫ｏｓｍ−９（ｋｙ１０）；ｏｃｒ−２（ａｋ４７）の生存曲線。図１３Ｂ：ｔｒｐｖ突然変異体（ｏｓｍ−９（ｋｙ１０）；ｏｃｒ−２（ａｋ４７））虫およびＷＴ対照における、トリカイン処置後の腸細胞におけるＣＲＴＣ１：：ＲＦＰ細胞質から核へのシャトリングの代表的な画像。図１３Ｃ：ＧＦＰ ＲＮＡｉを与えた対照虫（単純線）と比較した、カルシニューリン（ｔａｘ−６）ＲＮＡｉにおいてＣＲＴＣ１：：ＲＦＰを発現するトランスジェニック虫（破線）の生存曲線。図１３Ｄ：ＷＴ対照と比較した、ｔａｘ−６脱リン酸化部位が突然変異した（Ｓ７６Ａ、Ｓ１７９Ａ）構成的核ＣＲＴＣ１系統におけるＴＲＰＶ突然変異体の生存曲線。
図１４Ａ〜１４Ｅは、ＣＲＴＣ１の核転位が、ＴＲＰＶ１の活性化を要求することを示す。図１４Ａ：図１４Ｂ〜Ｄにおいて使用される薬理学的操作後の、ＤＲＧニューロンのＣＲＴＣ１シャトリングにおけるｃＡＭＰシグナリングおよびＴＲＰＶ１活性のモジュレーションを表す模式図。図１４Ｂ〜１４Ｄ：ニューロン体の核全体のｚ−スタック切片の最大投射。図１４Ｂ：野生型マウスＤＲＧ初代培養物を、ＴＲＰＶ１（赤色）、ＣＲＴＣ１（緑色）に対する抗体およびｄａｐｉ（青色）で免疫染色した。図１４Ｃ：左。ＤＲＧニューロン培養物を、ｃＡＭＰ放出を誘導するＬ型カルシウムチャネルのアゴニストであるＦＳＫ（２５μＭ）、および強力なＴＲＰＶ１アゴニストであるＣａｐ（１μＭ）にさらした。固定後に、ＣＧＲＰ（赤色）、ＣＲＴＣ１（緑色）に対する抗体およびｄａｐｉ（青色）により免疫染色を行った。右。媒体処置と比べた平均核対細胞質比の定量化。図１４Ｄ：左。ＷＴ ＤＲＧ培養物を、ＦＳＫおよびＣａｐによる刺激１時間前に、媒体、カルシニューリン阻害剤ＣｓＡ（１０μＭ）およびＴＲＰＶ１アンタゴニストＳＢ−３６６７９１（１０μＭ）で前処置した。ニューロンを固定し、ＴＲＰＶ１（赤色）、ＣＲＴＣ１（緑色）に対する抗体およびｄａｐｉ（青色）で免疫染色した。右。媒体処置と比べた平均核対細胞質比の定量化（図１４Ｃ〜１４Ｄ）。ｎ＝９０〜１２０細胞を解析、平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．、＊＊＊ｐ＜０．０００１、スチューデントｔ検定。図１４Ｅ：定量的ＰＣＲ解析を行って、ＴＲＰＶ１ ＫＯおよびＷＴ由来の未処置ＤＲＧニューロンにおけるＣＲＥＢ依存性転写産物誘導を試験した。Ｎ＝７、平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．（＊ｐ＜０．０５、スチューデントｔ検定）。 図１４Ａ〜１４Ｅは、ＣＲＴＣ１の核転位が、ＴＲＰＶ１の活性化を要求することを示す。図１４Ａ：図１４Ｂ〜Ｄにおいて使用される薬理学的操作後の、ＤＲＧニューロンのＣＲＴＣ１シャトリングにおけるｃＡＭＰシグナリングおよびＴＲＰＶ１活性のモジュレーションを表す模式図。図１４Ｂ〜１４Ｄ：ニューロン体の核全体のｚ−スタック切片の最大投射。図１４Ｂ：野生型マウスＤＲＧ初代培養物を、ＴＲＰＶ１（赤色）、ＣＲＴＣ１（緑色）に対する抗体およびｄａｐｉ（青色）で免疫染色した。図１４Ｃ：左。ＤＲＧニューロン培養物を、ｃＡＭＰ放出を誘導するＬ型カルシウムチャネルのアゴニストであるＦＳＫ（２５μＭ）、および強力なＴＲＰＶ１アゴニストであるＣａｐ（１μＭ）にさらした。固定後に、ＣＧＲＰ（赤色）、ＣＲＴＣ１（緑色）に対する抗体およびｄａｐｉ（青色）により免疫染色を行った。右。媒体処置と比べた平均核対細胞質比の定量化。図１４Ｄ：左。ＷＴ ＤＲＧ培養物を、ＦＳＫおよびＣａｐによる刺激１時間前に、媒体、カルシニューリン阻害剤ＣｓＡ（１０μＭ）およびＴＲＰＶ１アンタゴニストＳＢ−３６６７９１（１０μＭ）で前処置した。ニューロンを固定し、ＴＲＰＶ１（赤色）、ＣＲＴＣ１（緑色）に対する抗体およびｄａｐｉ（青色）で免疫染色した。右。媒体処置と比べた平均核対細胞質比の定量化（図１４Ｃ〜１４Ｄ）。ｎ＝９０〜１２０細胞を解析、平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．、＊＊＊ｐ＜０．０００１、スチューデントｔ検定。図１４Ｅ：定量的ＰＣＲ解析を行って、ＴＲＰＶ１ ＫＯおよびＷＴ由来の未処置ＤＲＧニューロンにおけるＣＲＥＢ依存性転写産物誘導を試験した。Ｎ＝７、平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．（＊ｐ＜０．０５、スチューデントｔ検定）。 図１４Ａ〜１４Ｅは、ＣＲＴＣ１の核転位が、ＴＲＰＶ１の活性化を要求することを示す。図１４Ａ：図１４Ｂ〜Ｄにおいて使用される薬理学的操作後の、ＤＲＧニューロンのＣＲＴＣ１シャトリングにおけるｃＡＭＰシグナリングおよびＴＲＰＶ１活性のモジュレーションを表す模式図。図１４Ｂ〜１４Ｄ：ニューロン体の核全体のｚ−スタック切片の最大投射。図１４Ｂ：野生型マウスＤＲＧ初代培養物を、ＴＲＰＶ１（赤色）、ＣＲＴＣ１（緑色）に対する抗体およびｄａｐｉ（青色）で免疫染色した。図１４Ｃ：左。ＤＲＧニューロン培養物を、ｃＡＭＰ放出を誘導するＬ型カルシウムチャネルのアゴニストであるＦＳＫ（２５μＭ）、および強力なＴＲＰＶ１アゴニストであるＣａｐ（１μＭ）にさらした。固定後に、ＣＧＲＰ（赤色）、ＣＲＴＣ１（緑色）に対する抗体およびｄａｐｉ（青色）により免疫染色を行った。右。媒体処置と比べた平均核対細胞質比の定量化。図１４Ｄ：左。ＷＴ ＤＲＧ培養物を、ＦＳＫおよびＣａｐによる刺激１時間前に、媒体、カルシニューリン阻害剤ＣｓＡ（１０μＭ）およびＴＲＰＶ１アンタゴニストＳＢ−３６６７９１（１０μＭ）で前処置した。ニューロンを固定し、ＴＲＰＶ１（赤色）、ＣＲＴＣ１（緑色）に対する抗体およびｄａｐｉ（青色）で免疫染色した。右。媒体処置と比べた平均核対細胞質比の定量化（図１４Ｃ〜１４Ｄ）。ｎ＝９０〜１２０細胞を解析、平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．、＊＊＊ｐ＜０．０００１、スチューデントｔ検定。図１４Ｅ：定量的ＰＣＲ解析を行って、ＴＲＰＶ１ ＫＯおよびＷＴ由来の未処置ＤＲＧニューロンにおけるＣＲＥＢ依存性転写産物誘導を試験した。Ｎ＝７、平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．（＊ｐ＜０．０５、スチューデントｔ検定）。
図１５Ａ〜１５Ｆは、ＣＧＲＰが、代謝の神経内分泌調節因子であることを示す。図１５Ａ〜１５Ｃ：１６．８ｍＭグルコース刺激による、マウスインスリノーマ細胞（ＭＩＮ６）のインスリン分泌アッセイ。図１５Ａ：ラットＣＧＲＰα、図１５Ｂ：ラットＣＧＲＰβおよび図１５Ｃ：ラットサブスタンスＰの０．１〜０．５μＭ合成ペプチドと共に細胞をインキュベートした、ｎ＝４、平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ、＊＊ｐ＜０．０１、＊ｐ＜０．０５、スチューデントｔ検定。図１５Ｄ：３および２４ヶ月目のＷＴおよびＴＲＰＶ１突然変異体由来の血液試料における、ＥＬＩＳＡによって測定されるＣＧＲＰの血清レベル、ｎ＝７、平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．、ａ、ｎｓおよびｂ、ｐ＜０．０５。図１５Ｅ：ＣＧＲＰ８−３７または媒体対照で処置した２３ヶ月齢雄ＷＴ動物の呼吸交換率（ＲＥＲ）解析。図１５Ｆ：ＣＧＲＰ８−３７または媒体対照で処置した２３ヶ月齢雄ＷＴ動物の酸素消費、ｎ＝１０、平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．、＊＊ｐ＜０．０１、＊ｐ＜０．０５、スチューデントｔ検定。 図１５Ａ〜１５Ｆは、ＣＧＲＰが、代謝の神経内分泌調節因子であることを示す。図１５Ａ〜１５Ｃ：１６．８ｍＭグルコース刺激による、マウスインスリノーマ細胞（ＭＩＮ６）のインスリン分泌アッセイ。図１５Ａ：ラットＣＧＲＰα、図１５Ｂ：ラットＣＧＲＰβおよび図１５Ｃ：ラットサブスタンスＰの０．１〜０．５μＭ合成ペプチドと共に細胞をインキュベートした、ｎ＝４、平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ、＊＊ｐ＜０．０１、＊ｐ＜０．０５、スチューデントｔ検定。図１５Ｄ：３および２４ヶ月目のＷＴおよびＴＲＰＶ１突然変異体由来の血液試料における、ＥＬＩＳＡによって測定されるＣＧＲＰの血清レベル、ｎ＝７、平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．、ａ、ｎｓおよびｂ、ｐ＜０．０５。図１５Ｅ：ＣＧＲＰ８−３７または媒体対照で処置した２３ヶ月齢雄ＷＴ動物の呼吸交換率（ＲＥＲ）解析。図１５Ｆ：ＣＧＲＰ８−３７または媒体対照で処置した２３ヶ月齢雄ＷＴ動物の酸素消費、ｎ＝１０、平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．、＊＊ｐ＜０．０１、＊ｐ＜０．０５、スチューデントｔ検定。
図１６Ａ〜１６Ｃは、ＴＲＰＶ１突然変異体マウスのインスリン分泌および炎症を図解する。図１６Ａ：０．１〜０．５μＭ合成ヒトＣＧＲＰαによる１６．８ｍＭグルコース刺激後の、マウスインスリノーマ細胞（ＭＩＮ６）のインスリン分泌アッセイ。図１６Ｂ：１６．８ｍＭグルコースおよびエキセンディン４刺激後のインスリン分泌アッセイ（ＭＩＮ６）。ｈ ＣＧＲＰα、ラットＣＧＲＰβおよびラットサブスタンスＰの０．１〜０．５μＭ合成ペプチドと共に細胞をインキュベートした、ｎ＝４、平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ、＊＊ｐ＜０．０１、＊ｐ＜０．０５、スチューデントｔ検定。図１６Ｃ：２４ヶ月目の脳、四頭筋、性腺脂肪および膵臓における２４ヶ月目のケモカインおよび炎症促進性遺伝子のｑＰＣＲ解析（ｎ＝５、平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ、ｎ．ｓ．、スチューデントｔ検定）。 図１６Ａ〜１６Ｃは、ＴＲＰＶ１突然変異体マウスのインスリン分泌および炎症を図解する。図１６Ａ：０．１〜０．５μＭ合成ヒトＣＧＲＰαによる１６．８ｍＭグルコース刺激後の、マウスインスリノーマ細胞（ＭＩＮ６）のインスリン分泌アッセイ。図１６Ｂ：１６．８ｍＭグルコースおよびエキセンディン４刺激後のインスリン分泌アッセイ（ＭＩＮ６）。ｈ ＣＧＲＰα、ラットＣＧＲＰβおよびラットサブスタンスＰの０．１〜０．５μＭ合成ペプチドと共に細胞をインキュベートした、ｎ＝４、平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ、＊＊ｐ＜０．０１、＊ｐ＜０．０５、スチューデントｔ検定。図１６Ｃ：２４ヶ月目の脳、四頭筋、性腺脂肪および膵臓における２４ヶ月目のケモカインおよび炎症促進性遺伝子のｑＰＣＲ解析（ｎ＝５、平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ、ｎ．ｓ．、スチューデントｔ検定）。
図１７は、ＴＲＰＶ１発現ニューロンによる代謝の神経内分泌調節のモデルを図解する模式図である。外部刺激によるＴＲＰＶ１の刺激は、ＤＲＧニューロンから膵β細胞へのＣＧＲＰ分泌、およびインスリン放出の阻害を促進する。ＴＲＰＶ１活性化は、カルシウム流入、カルシニューリンの活性化をもたらし、ＣＲＴＣ１の脱リン酸化および１４−３−３タンパク質からの放出を可能にし、ＣＲＴＣ１の核内部移行およびＣＧＲＰ等のその標的の転写をもたらす。ＣＧＲＰ蓄積は、エネルギー支出、グルコース耐性および加齢に有害効果を有する。対照的に、ＴＲＰＶ１の喪失は、インスリン分泌増加による寿命延長、ＣＲＴＣ１／ＣＲＥＢシグナリングカスケードの不活性化による代謝的健康を促進する。
図１８は、ヒトおよびラットＣＧＲＰアミノ酸配列のアライメントである。
配列表
添付の配列表に収載されている核酸およびアミノ酸配列に関して、３７ Ｃ．Ｆ．Ｒ．１．８２２に規定されている通り、ヌクレオチド塩基は標準文字略語を、アミノ酸は３文字コードを使用して示す。各核酸配列の一方の鎖のみを示しているが、表示されている鎖のいずれかの参照により、相補鎖が含まれていると理解される。
配列番号１は、Ｇ１重鎖可変領域アミノ酸配列である。
配列番号２は、Ｇ１軽鎖可変領域アミノ酸配列である。
配列番号３は、Ｇ１ ＣＤＲ Ｈ１（延長されたＣＤＲ）アミノ酸配列である。
配列番号４は、Ｇ１ ＣＤＲ Ｈ２（延長されたＣＤＲ）アミノ酸配列である。
配列番号５は、Ｇ１ ＣＤＲ Ｈ３アミノ酸配列である。
配列番号６は、Ｇ１ ＣＤＲ Ｌ１アミノ酸配列である。
配列番号７は、Ｇ１ ＣＤＲ Ｌ２アミノ酸配列である。
配列番号８は、Ｇ１ ＣＤＲ Ｌ３アミノ酸配列である。
配列番号９は、Ｇ１重鎖可変領域ヌクレオチド配列である。
配列番号１０は、Ｇ１軽鎖可変領域ヌクレオチド配列である。
配列番号１１は、Ｇ１重鎖完全抗体アミノ酸配列（本明細書に記載されている修飾ＩｇＧ２を含む）である。
配列番号１２は、Ｇ１軽鎖完全抗体アミノ酸配列である。
配列番号１３は、Ｇ１重鎖完全抗体ヌクレオチド配列（本明細書に記載されている修飾ＩｇＧ２を含む）である。
配列番号１４は、Ｇ１軽鎖完全抗体ヌクレオチド配列である。
配列番号１５は、ヒトα−ＣＧＲＰアミノ酸配列である。
配列番号１６は、ヒトα−ＣＧＲＰアミノ酸配列の断片（アミノ酸８〜３７）である。
配列番号１７は、ヒトα−ＣＧＲＰアミノ酸配列の断片（アミノ酸１９〜３７）である。
配列番号１８は、ヒトα−ＣＧＲＰアミノ酸配列の突然変異体断片（Ｐ２８Ａアミノ酸１９〜３７）である。
配列番号１９は、ヒトα−ＣＧＲＰアミノ酸配列の突然変異体断片（Ｋ３５Ｋアミノ酸１９〜３７）である。
配列番号２０は、ヒトα−ＣＧＲＰアミノ酸配列の突然変異体断片（Ｋ３５Ｅアミノ酸１９〜３７）である。
配列番号２１は、ヒトα−ＣＧＲＰアミノ酸配列の突然変異体断片（Ｋ３５Ｍアミノ酸１９〜３７）である。
配列番号２２は、ヒトα−ＣＧＲＰアミノ酸配列の突然変異体断片（Ｋ３５Ｑアミノ酸１９〜３７）である。
配列番号２３は、ヒトα−ＣＧＲＰアミノ酸配列の突然変異体断片（Ｆ３７Ａアミノ酸１９〜３７）である。
配列番号２４は、ヒトα−ＣＧＲＰアミノ酸配列の突然変異体断片（３８Ａアミノ酸２５〜３８）である。
配列番号２５は、ヒトα−ＣＧＲＰアミノ酸配列の断片（２５〜３７）である。
配列番号２６は、ヒトα−ＣＧＲＰアミノ酸配列の突然変異体断片（Ｆ２７Ａアミノ酸２５〜３７）である。
配列番号２７は、ヒトα−ＣＧＲＰアミノ酸配列の突然変異体断片（Ｖ２８Ａアミノ酸２５〜３７）である。
配列番号２８は、ヒトα−ＣＧＲＰアミノ酸配列の突然変異体断片（Ｐ２９Ａアミノ酸２５〜３７）である。
配列番号２９は、ヒトα−ＣＧＲＰアミノ酸配列の突然変異体断片（Ｔ３０Ａアミノ酸２５〜３７）である。
配列番号３０は、ヒトα−ＣＧＲＰアミノ酸配列の突然変異体断片（Ｎ３１Ａアミノ酸２５〜３７）である。
配列番号３１は、ヒトα−ＣＧＲＰアミノ酸配列の突然変異体断片（Ｖ３２Ａアミノ酸２５〜３７）である。
配列番号３２は、ヒトα−ＣＧＲＰアミノ酸配列の突然変異体断片（Ｇ３３Ａアミノ酸２５〜３７）である。
配列番号３３は、ヒトα−ＣＧＲＰアミノ酸配列の突然変異体断片（Ｓ３４Ａアミノ酸２５〜３７）である。
配列番号３４は、ヒトα−ＣＧＲＰアミノ酸配列の突然変異体断片（Ｆ３７Ａアミノ酸２５〜３７）である。
配列番号３５は、ヒトα−ＣＧＲＰアミノ酸配列の断片（アミノ酸２６〜３７）である。
配列番号３６は、ヒトα−ＣＧＲＰアミノ酸配列のアミド化断片（アミノ酸１９〜３７）である。
配列番号３７は、ヒトα−ＣＧＲＰアミノ酸配列のアミド化断片（アミノ酸１９〜３６）である。
配列番号３８は、ヒトα−ＣＧＲＰアミノ酸配列のアミド化断片（アミノ酸１〜３６）である。
配列番号３９は、ヒトα−ＣＧＲＰアミノ酸配列のアミド化断片（アミノ酸１〜１９）である。
配列番号４０は、ヒトα−ＣＧＲＰアミノ酸配列のアミド化断片（アミノ酸１〜１３）である。
配列番号４１は、ラットα−ＣＧＲＰアミノ酸配列である。
配列番号４２は、ラットα−ＣＧＲＰアミノ酸配列の断片（アミノ酸１９〜３７）である。
配列番号４３は、ヒトβ−ＣＧＲＰアミノ酸配列である。
配列番号４４は、ラットβ−ＣＧＲＰアミノ酸配列である。
配列番号４５は、ヒトカルシトニンアミノ酸配列断片（アミノ酸１〜３２）である。
配列番号４６は、ヒトアミリンアミノ酸配列断片（アミノ酸１〜３７）である。
配列番号４７は、ヒトアドレノメデュリンアミノ酸配列断片（アミノ酸１〜５２）である。
配列番号４８は、ＣＧＲＰエピトープ配列である。
配列番号４９〜５５は、プライマー配列である。
配列番号５６は、６−Ｈｉｓタグ配列である。
配列番号５７は、リンカー配列である。
配列番号５８〜１５４は、プライマー配列である。
配列番号１５５は、抗体Ｇ２重鎖可変領域アミノ酸配列である。
配列番号１５６は、抗体Ｇ２軽鎖可変領域アミノ酸配列である。
配列番号１５７は、抗体Ｇ２ ＣＤＲ Ｈ１（Ｋａｂａｔ ＣＤＲ）アミノ酸配列である。
配列番号１５８は、抗体Ｇ２ ＣＤＲ Ｈ２（延長されたＣＤＲ）アミノ酸配列である。
配列番号１５９は、抗体Ｇ２ ＣＤＲ Ｈ３アミノ酸配列である。
配列番号１６０は、抗体Ｇ２ ＣＤＲ Ｌ１アミノ酸配列である。
配列番号１６１は、抗体Ｇ２ ＣＤＲ Ｌ２アミノ酸配列である。
配列番号１６２は、抗体Ｇ２ ＣＤＲ Ｌ３アミノ酸配列である。
配列番号１６３は、抗体Ｇ２重鎖可変領域ヌクレオチド配列である。
配列番号１６４は、抗体Ｇ２軽鎖可変領域ヌクレオチド配列である。
配列番号１６５は、抗体Ｇ２重鎖完全抗体アミノ酸配列（Ｆｃドメインを含まない）である。
配列番号１６６は、抗体Ｇ２軽鎖完全抗体アミノ酸配列である。
配列番号１６７は、抗体Ｇ２重鎖完全抗体ヌクレオチド配列（Ｆｃドメインを含まない）である。
配列番号１６８は、抗体Ｇ２軽鎖完全抗体ヌクレオチド配列である。
配列番号１６９は、抗体Ｇ１ ＣＤＲ Ｈ１（Ｃｈｏｔｈｉａ ＣＤＲ）アミノ酸配列である。
配列番号１７０は、抗体Ｇ１ ＣＤＲ Ｈ１（Ｋａｂａｔ ＣＤＲ）アミノ酸配列である。
配列番号１７１は、抗体Ｇ１ ＣＤＲ Ｈ２（Ｃｈｏｔｈｉａ ＣＤＲ）アミノ酸配列である。
配列番号１７２は、抗体Ｇ２ ＣＤＲ Ｈ１（延長されたＣＤＲ）アミノ酸配列である。
配列番号１７３は、抗体Ｇ２ ＣＤＲ Ｈ１（Ｃｈｏｔｈｉａ ＣＤＲ）アミノ酸配列である。
配列番号１７４は、抗体Ｇ２ ＣＤＲ Ｈ２（Ｃｈｏｔｈｉａ ＣＤＲ）アミノ酸配列である。
詳細な説明
本開示は、対象に治療有効量の抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体を投与することにより、対象における代謝障害を処置および／または予防するための方法を提供する。対象に治療有効量の抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体を投与することにより、対象の長寿を増加させるための方法も本明細書に記載されている。抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体は、ＣＧＲＰに特異的に結合する抗体であり得る。本開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２００７／０５４８０９の表６に示す、Ｇ１またはそのバリアントに由来する抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体およびポリペプチドも提供する。
他に説明がなければ、本明細書に使用されているあらゆる技術および科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されているものと同じ意味を有する。分子生物学における共通用語の定義は、Ｂｅｎｊａｍｉｎ Ｌｅｗｉｎ、Ｇｅｎｅｓ Ｖ、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓにより出版、１９９４年（ＩＳＢＮ０−１９−８５４２８７−９）；Ｋｅｎｄｒｅｗら（編）Ｔｈｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｔｄ．により出版、１９９４年（ＩＳＢＮ０−６３２−０２１８２−９）；およびＲｏｂｅｒｔ Ａ． Ｍｅｙｅｒｓ（編）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ： ａ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ、ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， Ｉｎｃ．により出版、１９９５年（ＩＳＢＮ１−５６０８１−５６９−８）に見出すことができる。
単数形の用語「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈がそれ以外を明らかに示さない限り、複数の指示対象を含む。同様に、単語「または（もしくは）」は、文脈がそれ以外を明らかに示さない限り、「および（ならびに）」を含むことを意図する。したがって、「ＡまたはＢを含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、ＡもしくはＢまたはＡおよびＢを含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）ことを意味する。さらに、用語「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「有している」、「有する」、「備える」またはこれらの変種が、詳細な説明および／または特許請求の範囲のいずれかにおいて使用される程度まで、かかる用語は、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」と同様の様式で包括的となることを意図する。核酸またはポリペプチドに与えられているあらゆる塩基サイズまたはアミノ酸サイズおよびあらゆる分子量または分子質量値は、近似であり、説明のために提供されていることをさらに理解されたい。本開示の実施または検査において、本明細書に記載されているものと同様または均等な方法および材料を使用することができるが、適した方法および材料について後述する。本明細書に言及されているあらゆる刊行物、特許出願、特許、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）受託番号および他の参考文献は、それらの全体が参照により組み込まれる。矛盾が生じる場合、用語の説明を含む本明細書が優先するであろう。加えて、材料、方法および例は、単なる実例的なものであり、限定的なものとなることを意図しない。
本開示の様々な実施形態の概説を容易にするために、特異的な用語に関して次の説明を提供する：
用語「約」または「およそ」は、値が測定または決定される仕方、すなわち、測定システムの限界に一部には基づく、当業者によって決定される特定の値の許容される誤差範囲内を意味する。例えば、「約」は、当技術分野の慣例に従った、１以内のまたは１を超える標準偏差を意味することができる。あるいは、「約」は、所与の値の最大２０％、最大１０％、最大５％または最大１％の範囲を意味することができる。あるいは、特に、生物学的な系または過程に関して、この用語は、値の５倍以内または２倍以内等、１桁以内を意味することができる。特定の値が、本願および特許請求の範囲に記載されている場合、他に断りがなければ、特定の値の許容される誤差範囲内を意味する用語「約」を想定すべきである。
「処置」、「処置している」、「緩和している」および「寛解している」は、本明細書において、互換的に使用されている。これらの用語は、治療上の利益および／または予防上の利益が挙げられるがこれらに限定されない、有益なまたは所望の結果を得るためのアプローチを指す。治療上の利益とは、処置されている根底にある障害の根絶または寛解を意味する。また、治療上の利益は、患者が根底にある障害に依然として苦しみ得るにもかかわらず患者において改善が観察されるように、根底にある障害に関連する生理的症状のうち１種または複数の根絶または寛解により達成される。予防上の利益のため、組成物は、この障害の診断が為されていない可能性がある場合であっても、特定の障害を発症するリスクがある患者に、または障害の生理的症状のうち１種もしくは複数を報告する患者に投与することができる。
「抗体」は、免疫グロブリン分子の可変領域に位置する少なくとも１個の抗原認識部位を介して、炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、ポリペプチド等の標的に特異的に結合することができる免疫グロブリン分子である。本明細書において、この用語は、インタクトなポリクローナルまたはモノクローナル抗体のみならず、その断片（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｄＡｂ等）、単鎖抗体（ＳｃＦｖ）、その突然変異体、キメラ抗体、ダイアボディ、抗体部分を含む融合タンパク質、および抗原認識部位を含む他のいずれかの修飾された構成の免疫グロブリン分子も包含する。抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＡまたはＩｇＭ（またはこれらのサブクラス）等、いずれかのクラスの抗体を含むことができる。その重鎖の定常ドメインの抗体アミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンを異なるクラスに割り当てることができる。５種の免疫グロブリン主要クラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭが存在し、これらのうちいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２にさらに分けることができる。免疫グロブリンの異なるクラスに相当する重鎖定常ドメインは、それぞれアルファ、デルタ、イプシロン、ガンマおよびミューと呼ぶことができる。免疫グロブリンの異なるクラスのサブユニット構造および三次元構成は周知である。「Ｆｖ」は、完全抗原認識および結合部位を含有する抗体断片を指す。二鎖Ｆｖ種において、この領域は、緊密に非共有結合性会合した１個の重鎖および１個の軽鎖可変ドメインの二量体からなる。単鎖Ｆｖ種において、１個の重鎖および１個の軽鎖可変ドメインは、軽鎖および重鎖が二鎖Ｆｖ種のものと類似の二量体構造で会合できるように、可動性ペプチドリンカーによって共有結合性連結することができる。この構成において、各可変ドメインの３個のＣＤＲは、ＶＨ−ＶＬ二量体の表面において抗原結合特異性を画定するように相互作用することができる。しかし、単一の可変ドメイン（または抗原に特異的な３個のＣＤＲのみを含むＦｖの半分）は、一般に、結合部位全体よりも低い親和性ではあるが、抗原を認識および結合する能力を有することができる。
Ｆａｂ断片は、軽鎖の定常ドメインおよび重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）も含有する。Ｆａｂ’断片は、抗体ヒンジ領域由来の１個または複数のシステインを含む、重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端における数残基の付加がＦａｂ断片とは異なる。Ｆ（ａｂ）２断片は、ヒンジ領域におけるジスルフィド架橋によって連結した２個のＦａｂ断片を含む二価断片である。
抗体は、１個または複数の結合部位（抗原と組み合わせるための）を有することができる。２個以上の結合部位が存在する場合、これらの結合部位は、互いに同一であっても、異なっていてもよい。例えば、天然起源の免疫グロブリンは、２個の同一結合部位を有することができ、単鎖抗体またはＦａｂ断片は、１個の結合部位を有することができるが、「二特異的」または「二官能性」抗体（ダイアボディ）は、配列および／または抗原／エピトープ認識の観点から、２個の異なる結合部位を有することができる。
「単離された抗体」は、（１）その天然状態においてこれを伴う、他の天然に会合する抗体を含む天然に会合する構成成分と会合していない、（２）同じ種由来の他のタンパク質を含まない、（３）異なる種由来の細胞によって発現される、および／または（４）自然に発生しない抗体を指す。
「モノクローナル抗体」は、均質な抗体集団を指し、このモノクローナル抗体は、抗原の選択的結合に関与するアミノ酸（天然起源および非天然起源）で構成される。モノクローナル抗体の集団は、高度に特異的であり、単一の抗原部位に対して作製されている。用語「モノクローナル抗体」は、インタクトなモノクローナル抗体および全長モノクローナル抗体のみならず、その断片（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ等）、単鎖（ＳｃＦｖ）、その突然変異体、抗体部分を含む融合タンパク質、ならびに要求される特異性および抗原に結合する能力のある抗原認識部位を含む他のいずれかの修飾された構成の免疫グロブリン分子も包含する。これは、抗体の供給源またはこれが作製される様式（例えば、ハイブリドーマ、ファージ選択、組換え発現、トランスジェニック動物等による）に関して限定されることを意図しない。
「ヒト化抗体」は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含有する、特異的キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖またはこれらの断片（Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２または抗体の他の抗原結合部分配列等）である非ヒト（例えば、マウス）抗体の形態を指す。例えば、非ヒト免疫グロブリンに由来する配列は、１０％未満、９％未満、８％未満、７％未満、６％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、１％未満、０．５％未満、０．１％未満もしくは０．０１％未満であり得る；またはさらには非ヒト免疫グロブリンに由来する配列を実質的に含まなくてよい。一般に、ヒト化抗体は、レシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）由来の残基が、所望の特異性、親和性および生物学的活性を有するマウス、ラットまたはウサギ等、非ヒト種（ドナー抗体）のＣＤＲ由来の残基に置き換えられたヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。一部の事例において、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）残基は、相当する非ヒト残基に置き換えられる。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、移入されたＣＤＲまたはフレームワーク配列にも存在しないが、抗体性能をさらに緻密化および最適化するために含まれる残基を含むことができる。一般に、ヒト化抗体は、全てまたは実質的に全てのＣＤＲ領域が、非ヒト免疫グロブリンのＣＤＲ領域に相当し、全てまたは実質的に全てのＦＲ領域が、ヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のＦＲ領域である、少なくとも１個、典型的には２個の可変ドメインの実質的に全てを含むであろう。一部の例において、ヒト化抗体は、典型的には、ヒト免疫グロブリンの、免疫グロブリン定常領域またはドメイン（Ｆｃ）の少なくとも部分を含むであろう。抗体は、ＷＯ９９／５８５７２に記載されている通りに修飾されたＦｃ領域を有することができる。他の形態のヒト化抗体は、本来の抗体に対して変更された１個または複数のＣＤＲ（１、２、３、４、５、６個）を有し、これらは、本来の抗体由来の１個または複数のＣＤＲ「に由来する」１個または複数のＣＤＲとも称される。
「ヒト抗体」は、ヒトにおいて産生される抗体のアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列を有する抗体である、および／または当技術分野で公知のもしくは本明細書に開示されているヒト抗体を作製するための技法のいずれかを使用して作製された。ヒト抗体は、少なくとも１個のヒト重鎖ポリペプチドまたは少なくとも１個のヒト軽鎖ポリペプチドを含む抗体を含むことができる。かかる一例は、マウス軽鎖およびヒト重鎖ポリペプチドを含む抗体である。ヒト抗体は、当技術分野で公知の様々な技法を使用して産生することができる。一実施形態では、ヒト抗体は、ヒト抗体を発現するファージライブラリーから選択される（Ｖａｕｇｈａｎら、１９９６年、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１４巻：３０９〜３１４頁；Ｓｈｅｅｔｓら、１９９８年、ＰＮＡＳ， （ＵＳＡ）９５巻：６１５７〜６１６２頁；ＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍおよびＷｉｎｔｅｒ、１９９１年、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、２２７巻：３８１頁；Ｍａｒｋｓら、１９９１年、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、２２２巻：５８１頁）。ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を、内在性免疫グロブリン遺伝子が部分的にまたは完全に不活性化されたトランスジェニック動物、例えば、マウスに導入することにより作製することもできる。このアプローチは、全てこれらの全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，５４５，８０７号；同第５，５４５，８０６号；同第５，５６９，８２５号；同第５，６２５，１２６号；同第５，６３３，４２５号；および同第５，６６１，０１６号に記載されている。一例において、ヒト抗体は、標的抗原に対する抗体を産生するヒトＢリンパ球を不死化させることにより調製される（かかるＢリンパ球は、個体から回収することができるか、またはｉｎ ｖｉｔｒｏで免疫化されていてよい）。例えば、Ｃｏｌｅら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ、Ａｌａｎ Ｒ． Ｌｉｓｓ、７７頁（１９８５年）；Ｂｏｅｒｎｅｒら、１９９１年、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４７巻（１号）：８６〜９５頁；および米国特許第５，７５０，３７３号を参照されたい。
「単鎖抗体（ｓｃＦｃ）」は、ＶＬおよびＶＨ領域が、これらが単一のタンパク質鎖となることを可能にする合成リンカーを介して対になって一価分子を形成した抗体を指す（例えば、Ｂｉｒｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４２巻：４２３〜４２６頁（１９８８年）およびＨｕｓｔｏｎら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、８５巻：５８７９〜５８８３頁（１９８８年）を参照）。
「ダイアボディ」は、ＶＨおよびＶＬドメインが、単一のポリペプチド鎖において発現されるが、同じ鎖における該２個のドメインの間で対形成させるには短すぎるリンカーを使用することにより、ドメインを別の鎖の相補ドメインと対形成させて２個の抗原結合部位を作製した、二価二特異的抗体を指す。
「キメラ抗体」は、重鎖および軽鎖のアミノ酸配列のそれぞれの１個の部分が、特定の種に由来するまたは特定のクラスに属する抗体における相当する配列と相同であるが、鎖の残るセグメントが、別の種またはクラスの抗体における相当する配列と相同である抗体を指す。このようなキメラ抗体において、軽鎖および重鎖両方の可変領域は、哺乳動物のある種に由来する抗体の可変領域を模倣することができるが、定常部分は、別の種に由来する抗体における配列と相同であり得る。かかるキメラ形態の１つの利点は、例えば限定されないが、可変領域が、例えば、ヒト細胞調製物に由来する定常領域と組み合わせて、非ヒト宿主生物由来の容易に入手できるハイブリドーマまたはＢ細胞を使用した現在公知の供給源に簡便に由来し得ることである。可変領域は、調製の容易さおよび特異性がその供給源による影響を受けないという利点を有することができるが、ヒトのものである定常領域は、非ヒト供給源由来の定常領域よりも、抗体を注射する際にヒト対象から免疫応答を誘発する可能性が低くなり得る。この定義は、この特定例に限定されない。
「機能的Ｆｃ領域」は、ネイティブ配列Ｆｃ領域の少なくとも１種のエフェクター機能を保有することができる。例示的な「エフェクター機能」として、Ｃ１ｑ結合；補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）；Ｆｃ受容体結合；抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）；ファゴサイトーシス；細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体；ＢＣＲ）の下方調節その他が挙げられるがこれらに限定されない。かかるエフェクター機能は、一般に、結合ドメイン（例えば、抗体可変ドメイン）と組み合わせるためにＦｃ領域を必要とし、かかる抗体エフェクター機能を評価するための、当技術分野で公知の様々なアッセイを使用して評価することができる。
「ネイティブ配列Ｆｃ領域」は、自然に存在するＦｃ領域のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を含む。「バリアントＦｃ領域」は、少なくとも１個のアミノ酸修飾が理由でネイティブ配列Ｆｃ領域のものとは異なるアミノ酸配列を含むが、ネイティブ配列Ｆｃ領域の少なくとも１種のエフェクター機能を依然として保持する。一例において、バリアントＦｃ領域は、ネイティブ配列Ｆｃ領域または親ポリペプチドのＦｃ領域と比較して少なくとも１個のアミノ酸置換、例えば、ネイティブ配列Ｆｃ領域または親ポリペプチドのＦｃ領域における約１〜約１０個のアミノ酸置換または約１〜約５個のアミノ酸置換（１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のアミノ酸置換等）を有する。バリアントＦｃ領域は、一部の例において、ネイティブ配列Ｆｃ領域および／または親ポリペプチドのＦｃ領域に対し少なくとも約８０％の配列同一性、例えば、それに対する少なくとも約９０％の配列同一性、それに対する少なくとも約９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を保有する。
「抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）」は、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）を発現する非特異的な細胞傷害性細胞（例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球およびマクロファージ）が、標的細胞における結合された抗体を認識し、その後に該標的細胞の溶解を引き起こす細胞媒介性反応を指す。目的の分子のＡＤＣＣ活性は、米国特許第５，５００，３６２号または同第５，８２１，３３７号に記載されているアッセイ等、ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＡＤＣＣアッセイを使用して評価することができる。かかるアッセイに有用なエフェクター細胞は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）およびＮＫ細胞を含む。あるいはまたは加えて、目的の分子のＡＤＣＣ活性は、ｉｎ ｖｉｖｏで、例えば、Ｃｌｙｎｅｓら、１９９８年、ＰＮＡＳ （ＵＳＡ）、９５巻：６５２〜６５６頁に開示されているモデル等、動物モデルにおいて評価することができる。
「Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）」は、抗体のＦｃ領域に結合する受容体について記載する。ＦｃＲは、ネイティブ配列ヒトＦｃＲであり得る。さらに、例示的なＦｃＲは、ＩｇＧ抗体に結合するＦｃＲであり（ガンマ受容体）、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩおよびＦｃγＲＩＩＩサブクラスの受容体を含み、これは、これらの受容体の対立遺伝子バリアントおよび選択的（ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅｌｙ）スプライス型を含む。ＦｃγＲＩＩ受容体は、その細胞質ドメインが主に異なる同様のアミノ酸配列を有する、ＦｃγＲＩＩＡ（「活性化受容体」）およびＦｃγＲＩＩＢ（「阻害受容体」）を含む。ＦｃＲは、ＲａｖｅｔｃｈおよびＫｉｎｅｔ、１９９１年、Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、９巻：４５７〜９２頁；Ｃａｐｅｌら、１９９４年、Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ、４巻：２５〜３４頁；ならびにｄｅ Ｈａａｓら、１９９５年、Ｊ． Ｌａｂ． Ｃｌｉｎ． Ｍｅｄ．、１２６巻：３３０〜４１頁に概説されている。「ＦｃＲ」は、胎児への母性ＩｇＧの移入の原因となる新生児受容体ＦｃＲｎも含む（Ｇｕｙｅｒら、１９７６年、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１１７巻：５８７頁；およびＫｉｍら、１９９４年、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２４巻：２４９頁）。
「補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）」は、補体の存在下での標的の溶解を指す。補体活性化経路は、同族抗原と複合体形成した分子（例えば、抗体）への補体系の第１の構成成分（Ｃ１ｑ）の結合によって開始される。補体活性化を評価するために、例えば、Ｇａｚｚａｎｏ−Ｓａｎｔｏｒｏら、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ、２０２巻：１６３頁（１９９６年）に記載されているＣＤＣアッセイを行うことができる。
「カルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）」は、ＣＧＲＰの活性の少なくとも一部を保持する、いずれかの形態のカルシトニン遺伝子関連ペプチドおよびそのバリアントを指す。例えば、ＣＧＲＰは、α−ＣＧＲＰまたはβ−ＣＧＲＰであり得る。本明細書において、ＣＧＲＰは、あらゆる哺乳動物種のネイティブ配列ＣＧＲＰ、例えば、ヒト、イヌ、ネコ、ウマおよびウシを含む。ヒトα−ＣＧＲＰに関する追加的な情報は、ＯＭＩＭ１１４１３０に見出すことができる。ヒトβ−ＣＧＲＰに関する追加的な情報は、ＯＭＩＭ１１４１６０に見出すことができる。ＣＧＲＰ配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）配列データベースから公開されている。当業者であれば、追加的なＣＧＲＰ核酸およびタンパク質配列を同定することができる。他の具体例が本明細書に提供されている（例えば、ヒトα−ＣＧＲＰ（配列番号１５）；ヒトβ−ＣＧＲＰ（配列番号４３）；ラットα−ＣＧＲＰ（配列番号４１）；およびラットβ−ＣＧＲＰ（配列番号４４））。例示的なＣＧＲＰ配列のアライメントを図１８に示す。
「抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体」は、ＣＧＲＰの生物学的活性および／またはＣＧＲＰシグナリングによって媒介される下流経路（複数可）を阻害することができる抗体を指す。抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体は、受容体結合および／またはＣＧＲＰに対する細胞性応答の誘発等、ＣＧＲＰシグナリングによって媒介される下流経路を含むＣＧＲＰの生物学的活性を遮断、アンタゴナイズ、抑制または低下（有意に、を含む）させる抗体を包含する。本開示の目的のため、用語「抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体」が、それによって、ＣＧＲＰそれ自体、ＣＧＲＰの生物学的活性（頭痛のいずれかの側面を媒介するその能力が挙げられるがこれに限定されない）または生物学的活性の帰結が、実質的に無効にされる、減少するまたはいずれか有意義な程度で中和される、あらゆる以前に同定された用語、表題ならびに機能的状態および特徴を包含することが理解されるであろう。一部の実施形態では、抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体は、ＣＧＲＰに結合し、ＣＧＲＰ受容体へのＣＧＲＰ結合を防止する。他の実施形態では、抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体は、ＣＧＲＰに結合し、ＣＧＲＰ受容体の活性化を防止する。抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体の例が、本明細書に提供されている。ＣＧＲＰに結合する抗体は、本明細書において、「抗ＣＧＲＰ抗体」とも称される。
「Ｇ１」および「抗体Ｇ１」は、寄託番号ＡＴＣＣ−ＰＴＡ−６８６７およびＡＴＣＣ−ＰＴＡ−６８６６を有する発現ベクターによって産生される抗体を指すよう互換的に使用されている。重鎖および軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号１および２に示す。抗体Ｇ１のＣＤＲ部分（ＣｈｏｔｈｉａおよびＫａｂａｔ ＣＤＲを含む）は、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２００７／０５４８０９の図５において図表により描写されている。重鎖および軽鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドは、配列番号９および１０に示す。抗体Ｇ１の特徴付けは、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２００７／０５４８０９の実施例に記載されている。Ｇ１は、ニューロペプチドＣＧＲＰ（ａおよびｂ）の結合および活性ならびにＣＧＲＰ放出に起因するその神経原性血管拡張効果を遮断する、ヒト化モノクローナル遮断抗体（ＩｇＧ２）である。Ｇ１は、マウス形質細胞腫細胞と融合された、ヒトおよびラットＣＧＲＰで免疫化したマウスから調製された脾臓細胞を使用したスクリーニングにおいて同定される、ｍｕＭＡｂ７Ｅ９と表示されるマウス抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体前駆体に由来するＩｇＧ２．ＤＥＬＴＡ．ａモノクローナル抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体である。Ｇ１は、ｍｕＭＡｂ ７Ｅ９由来の軽鎖および重鎖ＣＤＲを、最も近縁のヒト生殖系列配列にグラフトし、続いて各ＣＤＲに少なくとも１個の突然変異およびＶＨに２個のフレームワーク突然変異を導入することにより作製された。Ｇ１のＦｃドメインに２個の突然変異を導入して、ヒトＦｃ受容体活性化を抑制した。Ｇ１およびｍｕＭａｂ７Ｅ９は、同じエピトープを認識することが示された。
「Ｇ２」および「抗体Ｇ２」は、Ｗｏｎｇら、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ １２巻：９３〜１０６頁（１９９３年）に記載されている抗ラットＣＧＲＰマウスモノクローナル抗体を指すよう互換的に使用されている。重鎖および軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号１５５および１５６に示す。重鎖および軽鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドは、配列番号１６３および１６４に示す。抗体Ｇ２のＣＤＲ部分は、配列番号１５７〜１６２に提示する。Ｇ２は、Ｇ１と同じエピトープを認識することが示された。
抗体の「免疫特異的」結合は、抗体の抗原結合部位と、該抗体によって認識される特異的抗原との間に発生する抗原特異的結合相互作用を指す（すなわち、抗体は、ＥＬＩＳＡまたは他のイムノアッセイにおいてこのタンパク質と反応し、無関係なタンパク質とは検出可能に反応しない）。
抗体またはポリペプチドに「特異的に結合」または「優先的に結合」（本明細書において互換的に使用）するエピトープは、当技術分野で十分に理解されている用語であり、かかる特異的または優先的結合を決定する方法も、当技術分野で周知である。分子は、代替細胞または物質と反応または会合するよりも頻繁に、それよりも急速に、それよりも優れた持続時間でおよび／またはそれよりも優れた親和性で、特定の細胞または物質と反応または会合する場合、「特異的結合」または「優先的結合」を示すと言われる。抗体は、他の物質に結合するよりも優れた親和性で、アビディティーで、それよりも容易におよび／またはそれよりも優れた持続時間で結合する場合、標的に「特異的に結合」または「優先的に結合」する。例えば、第１の標的に特異的にまたは優先的に結合する抗体（または部分もしくはエピトープ）が、第２の標的に特異的にまたは優先的に結合してもしなくてもよいことも理解される。そのようなものとして、「特異的結合」または「優先的結合」は、排他的結合を必ずしも必要としない（これを含んでもよいが）。一般に、ただし必然的ではなく、結合の言及は、優先的結合を意味する。
用語「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、いずれかの長さのアミノ酸のポリマーを指すよう本明細書において互換的に使用されている。ポリマーは、直鎖状であっても分枝状であってもよく、修飾されたアミノ酸を含むことができ、非アミノ酸によって中断されていてよい。この用語は、天然にまたは介入によって修飾されたアミノ酸ポリマーも包含する；例えば、標識構成成分とのコンジュゲーション等、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質付加、アセチル化、リン酸化または他のいずれかの操作もしくは修飾。例えば、アミノ酸の１種または複数の類似体（例えば、非天然アミノ酸等を含む）および当技術分野で公知の他の修飾を含有するポリペプチドも含まれる。本明細書に提供されているポリペプチドは、抗体に基づくため、ポリペプチドが、単鎖または会合した鎖として発生し得ることが理解される。
本明細書において互換的に使用されている「ポリヌクレオチド」または「核酸分子」は、いずれかの長さのヌクレオチドのポリマーを指し、ＤＮＡおよびＲＮＡを含む。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾ヌクレオチドもしくは塩基、および／またはそれらの類似体、またはＤＮＡもしくはＲＮＡポリメラーゼによってポリマーに取り込むことができるいずれかの基質であり得る。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチドおよびその類似体等、修飾ヌクレオチドを含むことができる。存在するのであれば、ポリマーのアセンブリ前または後にヌクレオチド構造に対する修飾を付与することができる。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド構成成分によって中断することができる。ポリヌクレオチドは、標識構成成分とのコンジュゲーション等により、重合後にさらに修飾することができる。他の種類の修飾は、例えば、類似体による天然起源のヌクレオチドのうち１個または複数の「キャップ」置換、例えば、無電荷結合（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホアミデート、カバメート（ｃａｂａｍａｔｅ）等）および荷電結合（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート等）による修飾、例えば、タンパク質（例えば、ヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ポリ（ｐｌｙ）−Ｌ−リシン等）等のペンダント部分を含有する修飾、挿入剤（例えば、アクリジン、ソラレン等）による修飾、キレート剤（例えば、金属、放射性金属、ホウ素、酸化的金属等）を含有する修飾、アルキル化剤を含有する修飾、修飾された結合（例えば、アルファアノマー核酸等）による修飾等、ヌクレオチド間修飾、ならびに非修飾型のポリヌクレオチド（複数可）を含む。さらに、糖に通常存在するヒドロキシル基のいずれかは、例えば、ホスホネート基、リン酸基によって置き換えることができるか、標準保護基によって保護することができるか、または活性化して追加的なヌクレオチドへの追加的な結合を調製することができるか、または固体支持体にコンジュゲートすることができる。５’および３’末端ＯＨは、リン酸化することができるか、または１〜２０個の炭素原子のアミンもしくは有機キャッピング基部分で置換することができる。他のヒドロキシルは、標準保護基に誘導体化することもできる。ポリヌクレオチドは、例えば、２’−Ｏ−メチル−、２’−Ｏ−アリル、２’−フルオロ−または２’−アジド−リボース、炭素環式糖類似体、α−アノマー糖、アラビノース、キシロースまたはリキソース等のエピマー糖、ピラノース糖、フラノース糖、セドヘプツロース、非環式類似体およびメチルリボシド等の脱塩基ヌクレオシド類似体を含む、当技術分野で一般に公知であるリボースまたはデオキシリボース糖の類似型を含有することもできる。１個または複数のホスホジエステル結合は、代替連結基に置き換えることができる。このような代替連結基として、リン酸が、Ｐ（Ｏ）Ｓ（「チオエート」）、Ｐ（Ｓ）Ｓ（「ジチオエート」）、（Ｏ）ＮＲ２（「アミデート」）、Ｐ（Ｏ）Ｒ、Ｐ（Ｏ）ＯＲ’、ＣＯまたはＣＨ２（「ホルムアセタール」）（式中、各ＲまたはＲ’は独立に、Ｈ、またはエーテル（−−Ｏ−−）結合、アリール、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニルもしくはアラルジルを任意選択で含有する置換もしくは非置換アルキル（１〜２０Ｃ）である）に置き換えられる実施形態が挙げられるがこれらに限定されない。ポリヌクレオチドにおける全ての結合が同一である必要はない。先行する記載は、ＲＮＡおよびＤＮＡを含む、本明細書に参照されるあらゆるポリヌクレオチドに当てはまる。
抗体の「可変領域」は、単独のまたは組み合わせた、抗体軽鎖の可変領域または抗体重鎖の可変領域を指す。重鎖および軽鎖の可変領域はそれぞれ、高頻度可変領域としても公知の３個の相補性決定領域（ＣＤＲ）によって接続された４個のフレームワーク領域（ＦＲ）からなる。各鎖におけるＣＤＲは、ＦＲによってごく近接して一体に保持され、他の鎖由来のＣＤＲと共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する。ＣＤＲを決定するための少なくとも２種の技法が存在する：（１）異種間配列可変性に基づくアプローチ（例えば、Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（第５版、１９９１年、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｍｄ．））；および（２）抗原−抗体複合体の結晶学的研究に基づくアプローチ（例えば、Ｃｈｏｔｈｉａら（１９８９年）Ｎａｔｕｒｅ ３４２巻：８７７頁；Ａｌ−ｌａｚｉｋａｎｉら（１９９７年）Ｊ． Ｍｏｌｅｃ． Ｂｉｏｌ．２７３巻：９２７〜９４８頁））。本明細書において、ＣＤＲは、いずれか一方のアプローチまたは両方のアプローチの組合せによって定義されるＣＤＲを指すことができる。
抗体の「定常領域」は、単独のまたは組み合わせた、抗体軽鎖の定常領域または抗体重鎖の定常領域を指す。
「実質的に純粋」は、少なくとも９０％純粋、少なくとも９５％純粋、少なくとも９８％純粋または少なくとも９９％純粋等、少なくとも５０％純粋（すなわち、夾雑物を含まない）である材料を指す。
「宿主細胞」は、ポリヌクレオチド挿入物を取り込むためのベクター（複数可）のレシピエントとなり得るまたはそうであった個々の細胞または細胞培養物を含む。宿主細胞は、単一の宿主細胞の後代を含み、後代は、天然、偶発的または計画的突然変異により、本来の親細胞と必ずしも（形態またはゲノムＤＮＡ相補体が）完全に同一でなくてもよい。宿主細胞は、本開示のポリヌクレオチド（複数可）をｉｎ ｖｉｖｏでトランスフェクトされた細胞を含む。
本明細書にさらに記載されている用語「有効量」、「治療有効量」または「治療量」は、このようなより少ない有効量および通常の有効量の両方を包含し、実際に、特定の状態、効果および／または応答の誘発に有効であるいずれかの量を包含する。そのようなものとして、同時発生的投与のいずれかのかかる対象の用量は、単独で投与される場合に使用できる用量未満であり得る。投与のいずれかのかかる対象（複数可）の１種または複数の効果は、相加的または相乗的であり得る。投与のいずれかのかかる対象（複数可）は、２回以上投与することができる。有効量は、当業者によって容易に決定することができる、意図される適用（ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏ）または処置されている対象および疾患状態、例えば、対象の体重および年齢、疾患状態の重症度、投与の様式その他に応じて変動し得る。この用語は、標的細胞において特定の応答、例えば、増殖の低下または標的タンパク質の活性の下方調節を誘導するであろう用量にも当てはまる。特異的な用量は、選択された特定の化合物、従うべき投薬レジメン、他の化合物と組み合わせて投与されるか否か、投与のタイミング、これが投与される組織およびこれを運ぶ物理的送達系に応じて変動し得る。
薬剤または治療法の「治療量以下の量」は、治療的とみなされる量を下回る、該薬剤または治療法の有効量未満の量である。しかし、かかる量は、有効量または治療量以下の量の別の薬剤または治療法と組み合わされると、例えば、得られた有効な効果における相乗作用またはこの組合せにおいて使用される薬剤のうち１種もしくは複数の副作用の低下により、医師が望む結果を生じることができる。例えば、ＦＤＡガイドラインは、特定の状態を処置するための投薬の指定のレベルを提案することができ、治療量以下の量は、ＦＤＡが提案する投薬レベルを下回るいずれかのレベルとなるであろう。
薬剤または治療法の「相乗的に有効な治療量」は、有効量または治療量以下の量の別の薬剤または治療法と組み合わされると、この２種の薬剤または治療法のどちらかが単独で使用される場合よりも優れた効果を生じる量である。一部の実施形態では、薬剤または治療法の相乗的に有効な治療量は、組み合わせて使用される場合、単独で使用された場合のこの２種の薬剤または治療法のそれぞれの相加的効果よりも優れた効果を生じる。
「治療効果」は、本明細書において、本明細書に記載されている治療上の利益および／または予防上の利益を包含する。予防効果は、疾患もしくは状態の出現の遅延もしくは排除、疾患もしくは状態の症状の発病の遅延もしくは排除、疾患もしくは状態の進行を遅くすること、停止もしくは逆転、またはこれらのいずれかの組合せを含む。
用語「薬学的に許容される塩」は、当技術分野で周知の様々な有機および無機対イオンに由来する塩を指す。薬学的に許容される酸付加塩は、無機酸および有機酸により生成することができる。塩を生じることができる無機酸は、例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸その他を含む。塩を生じることができる有機酸は、例えば、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、シュウ酸、マレイン酸、マロン酸、コハク酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、桂皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、サリチル酸その他を含む。薬学的に許容される塩基付加塩は、無機および有機塩基により生成することができる。塩を生じることができる無機塩基は、例えば、ナトリウム、カリウム、リチウム、アンモニウム、カルシウム、マグネシウム、鉄、亜鉛、銅、マンガン、アルミニウムその他を含む。塩を生じることができる有機塩基は、例えば、一級、二級および三級アミン、天然起源の置換アミンを含む置換アミン、環状アミン、塩基性イオン交換樹脂その他、特に、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミンおよびエタノールアミン等を含む。一部の実施形態では、薬学的に許容される塩基付加塩は、アンモニウム、カリウム、ナトリウム、カルシウムおよびマグネシウム塩から選択される。よって、本明細書に開示されている抗体（例えば、抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体）は、対象への投与に適した塩等、１種または複数の薬学的に許容される塩と組み合わせることができる。
「薬学的に許容される担体」または「薬学的に許容される賦形剤」は、ありとあらゆる溶媒、分散媒、コーティング、抗細菌および抗真菌剤、等張性および吸収遅延剤その他を含む。薬学的活性物質のためのかかる培地および薬剤の使用は、当技術分野で周知である。いずれかの従来の培地または薬剤が活性成分と不適合性である場合を除いて、本開示の治療用組成物におけるその使用が企図される。補足的活性成分を組成物に取り込むこともできる。本明細書において、「薬学的に許容される担体」は、活性成分と組み合わされた場合に、該成分が生物学的活性を保持することを可能にし、対象の免疫系と非反応性であるいずれかの材料を含む。例として、リン酸緩衝食塩水溶液、水、油／水エマルション等のエマルションおよび様々な種類の湿潤剤等、標準医薬品担体のいずれかが挙げられるがこれらに限定されない。エアロゾルまたは非経口的投与に好ましい希釈液は、リン酸緩衝食塩水または通常の（０．９％）生理食塩水である。かかる担体を含む組成物は、周知の従来の方法によって製剤化される（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１８版、Ａ． Ｇｅｎｎａｒｏ編、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐａ．、１９９０年；およびＲｅｍｉｎｇｔｏｎ、Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ、第２０版、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、２０００年を参照）。よって、本明細書に開示されている抗体（例えば、抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体）は、対象への投与に適した１種または複数の薬学的に許容される担体中に存在することができる。
一実施形態では、本明細書における「のために調製される」は、医薬が、末梢投与における使用のために適宜包装および／またはマークされた、投薬量単位その他の形態であることを意味する。
「生物学的試料」は、個体から得られる様々な試料型を包含し、診断またはモニタリングアッセイにおいて使用することができる。この用語は、血液および生物学的起源の他の液体試料、生検標本等の固形組織試料またはこれに由来する組織培養物もしくは細胞、ならびにこれらの後代を包含する。この用語は、試薬による処置、可溶化またはタンパク質もしくはポリヌクレオチド等のある特定の構成成分の濃縮、または切片作製する目的での半固体もしくは固体マトリックスにおける包埋による等、その調達後にいずれかの仕方で操作された試料も含む。用語「生物学的試料」は、臨床試料を包含し、培養中の細胞、細胞上清、細胞溶解物、血清、血漿、生体液および組織試料も含む。
「個体」または「対象」は、哺乳動物、例えば、ヒト等、脊椎動物である。哺乳動物として、家畜（ウシ、ブタ、ヒツジ等）、競技（ｓｐｏｒｔ）動物、ペット（ネコ、イヌおよびウマ等）、霊長類、ウサギ、マウスおよびラットが挙げられるがこれらに限定されない。本明細書に記載されている方法は、ヒト治療薬、前臨床および獣医学適用の両方において有用であり得る。一部の実施形態では、対象は、哺乳動物であり、一部の実施形態では、対象は、ヒトである。
用語「ｉｎ ｖｉｖｏ」は、対象の身体において起こる事象を指す。
「ベクター」は、宿主細胞において１種または複数の目的の遺伝子または配列を送達することができ、一部の例においては、これを発現することができる構築物である。ベクターの例として、ウイルスベクター、ネイキッドＤＮＡまたはＲＮＡ発現ベクター、プラスミド、コスミドまたはファージベクター、カチオン性縮合剤を伴うＤＮＡまたはＲＮＡ発現ベクター、リポソームに被包されたＤＮＡまたはＲＮＡ発現ベクター、および産生細胞等、ある特定の真核細胞が挙げられるがこれらに限定されない。
「発現制御配列」は、核酸の転写を方向付ける核酸配列である。発現制御配列は、構成的もしくは誘導性プロモーター等のプロモーターまたはエンハンサーであり得る。発現制御配列は、転写しようとする核酸配列に作動可能に連結される。
用語「末梢に投与される」は、物質、医薬および／または抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体が送達されるべき経路を指し、特に、中枢にではなく、脊髄にではなく、くも膜下腔内ではなく、ＣＮＳへと直接的に送達されないことを意味する。この用語は、直前に述べた経路以外の投与経路を指し、経口、舌下、頬側、外用、直腸、吸入による、経皮、皮下、静脈内、動脈内、筋肉内、心臓内、骨内、真皮内、腹腔内、経粘膜、腟、硝子体内、関節内、関節周囲、局所的または皮膚上である経路によることを含む。よって、本明細書に開示されている抗体（例えば、抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体）は、これらの方法のいずれかを使用して対象に投与することができる。
用語「末梢に作用する」は、物質、化合物、医薬および／または抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体の作用部位を指し、前記部位は、中枢神経系とは対照的に末梢神経系内であり、前記化合物、医薬および／または抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体は、末梢に投与されるとＣＮＳおよび脳への関門を通過できないことによって限定される。用語「中枢に浸透」は、脳またはＣＮＳへの関門を通過する物質の能力を指す。
用語「ｋｏｎ」は、抗原への抗体の会合の速度定数を指すことを意図する。
用語「ｋｏｆｆ」は、抗体／抗原複合体からの抗体の解離の速度定数を指すことを意図する。
用語「ＫＤ」は、抗体−抗原相互作用の平衡解離定数を指すことを意図する。
「薬剤」は、生物学的、薬学的または化学的化合物もしくは他の部分を指す。非限定例として、単純もしくは複雑な有機もしくは無機分子、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、抗体、抗体誘導体、抗体断片、ビタミン誘導体、炭水化物、毒素または化学療法的化合物が挙げられる。様々な化合物を合成することができ、例えば、小分子およびオリゴマー（例えば、オリゴペプチドおよびオリゴヌクレオチド）、ならびに様々なコア構造に基づく合成有機化合物が挙げられる。加えて、様々な天然供給源が、植物または動物抽出物その他等、スクリーニングのための化合物を提供することができる。当業者であれば、本開示の薬剤の構造的性質に関する限界がないことを容易に認識することができる。
一般に、構成成分、薬剤、物質、材料、組成物および／またはその他等、対象の身体への投与のための２種またはそれを超える投与対象を参照した用語「同時発生的投与」、「同時投与」または「と併せた投与」は、投与対象が、僅少な量未満の時間間隔にわたり、対象の身体内または対象の身体における作用部位に共に存在するような、用量（複数可）および時間間隔（複数可）を使用して為される投与を指す。時間間隔は、例えば、数分間、数時間、数日間または数週間の適切な間隔等、いずれか適した時間間隔であり得る。投与対象は、例えば単一の組成物の一部または他の仕方による等、共に投与することができる。投与対象は、実質的に同時に（例えば、互いに約５分間、約３分間もしくは約１分間未満またはこれに等しい時間内等）または互いに短い時間内で（例えば、互いに約１時間、３０分間もしくは１０分間未満もしくはこれに等しい時間内等または約５分間超から最大約１時間以内）投与することができる。このように投与された投与対象は、実質的に同時に投与されたとみなすことができる。当業者であれば、投与対象が対象の身体内に僅少を超えるレベルでおよび／または対象の身体内に有効濃度で存在するように、対象の身体への投与対象の投与に適切な用量（複数可）および時間間隔（複数可）を決定することができるであろう。投与対象が、対象の身体に同時発生的に投与される場合、いずれかのかかる投与対象は、単独で投与された場合に使用できる有効量に満たずに有効量となることができる。
「真性糖尿病」は、膵臓が、十分なインスリンを産生しないために、または細胞が、産生されたインスリンに応答しないために、対象が高血糖を有する代謝性疾患の群を指す。１型糖尿病は、身体が、インスリンを産生できないことに起因する。この型は、「インスリン依存性真性糖尿病」（ＩＤＤＭ）または「若年性糖尿病」とも呼ばれる。２型糖尿病は、細胞がインスリンを適切に使用できない状態である、インスリン抵抗性に起因し、絶対的インスリン欠乏と組み合わされる場合もある。この型は、「インスリン非依存性真性糖尿病」（ＮＩＤＤＭ）または「成人発症型糖尿病」とも呼ばれる。インスリンに対する体組織の応答性欠損は、インスリン受容体に関与すると考えられる。真性糖尿病は、反復性または持続性高血糖症によって特徴付けられ、一部の例において、
ａ．絶食時血漿グルコースレベル≧７．０ｍｍｏｌ／ｌ（１２６ｍｇ／ｄｌ）；
ｂ．グルコース耐性検査における７５ｇ経口グルコース負荷の２時間後の血漿グルコース≧１１．１ｍｍｏｌ／ｌ（２００ｍｇ／ｄＬ）；
ｃ．高血糖症の症状および随時（ｃａｓｕａｌ）血漿グルコース≧１１．１ｍｍｏｌ／ｌ（２００ｍｇ／ｄｌ）；
ｄ．糖化ヘモグロビン（Ｈｂ Ａ１Ｃ）≧６．５％
のうちいずれか一項目を実証することによって診断される。
代謝障害／疾患：正常な哺乳動物の代謝過程の破壊に起因する疾患または障害。メタボリックシンドロームを含む。例として、（１）真性糖尿病（Ｉ型および２型）、妊娠性糖尿病、高血糖症、インスリン抵抗性、異常グルコース代謝、「前糖尿病」（絶食時血中ブドウ糖不良（ＩＦＧ）またはグルコース耐性障害（ＩＧＴ））および例えば、膵β細胞破壊等の病理組織学的変化を含む、高血糖性状態に伴うまたはこれに起因する他の生理的障害を含む、グルコース利用障害およびこれに伴う続発症；（２）脂質異常症およびその続発症、例えば、粥状動脈硬化、冠動脈疾患、脳血管障害その他等；（３）肥満およびボディマス上昇（非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）および多嚢胞性卵巣症候群（ＰＣＯＳ）等が挙げられるがこれらに限定されない、その併存症状態を含む）等、メタボリックシンドロームに関連し得、血栓症、凝固性亢進および血栓形成促進性状態（動脈および静脈）、高血圧症、心血管疾患、脳卒中ならびに心不全も含む他の状態；（４）粥状動脈硬化、慢性炎症性腸疾患（例えば、クローン病および潰瘍性大腸炎）、喘息、エリテマトーデス、関節炎または他の炎症性リウマチ性障害を含む、炎症性反応が関与する障害または状態；（５）例えば、脂肪肉腫、固形腫瘍および新生物を含む脂肪細胞腫瘍、脂肪性（ｌｉｐｏｍａｔｏｕｓ）癌等、細胞周期または細胞分化過程の障害；（６）アルツハイマー病、多発性硬化症、パーキンソン病、進行性多巣性白質脳症およびギラン（Ｇｕｉｌｌｉａｎ）・バレー症候群を含む、中枢および末梢神経系の神経変性疾患および／もしくは脱髄性障害、ならびに／または神経炎症性（ｎｅｕｒｏｉｎｆｉａｍｍａｔｏｒｙ）過程に関与する神経学的疾患、ならびに／または他の末梢性ニューロパチー；（７）紅斑性（ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏ）扁平上皮皮膚病を含む、皮膚および皮膚科学的障害ならびに／または創傷治癒過程の障害；ならびに（８）シンドロームＸ、骨関節炎および急性呼吸促迫症候群等、他の障害が挙げられるがこれらに限定されない。他の例は、ＷＯ２０１４／０８５３６５（参照により本明細書に組み込まれる）に提供されている。
具体例において、代謝性疾患は、糖尿病（２型糖尿病、非２型糖尿病、１型糖尿病、潜在性自己免疫性糖尿病（ＬＡＤ）または若年発症成人型糖尿病（ＭＯＤＹ）等）、多嚢胞性卵巣症候群（ＰＣＯＳ）、メタボリックシンドローム（ＭｅｔＳ）、肥満、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、脂質異常症（例えば、高脂血症）および心血管疾患（例えば、高血圧症）のうち１種または複数（少なくとも２または少なくとも３種等）を含む。
代謝障害を処置するための方法
代謝障害または加齢を有効に処置、予防または遅延させるのに有用である組成物および方法の臨床的な必要がある。代謝障害および／または１種もしくは複数の代謝障害の症状を処置、予防、進行を遅くする、制御または寛解するための組成物および方法が本明細書に開示されている。本方法は、代謝障害を有するまたはそれを発症するリスクがある対象に治療有効量の１種または複数の抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体を投与するステップを含むことができる。抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体は、ＣＧＲＰに結合する抗体であり得る。一部の事例において、当技術分野で公知である、代謝障害または加齢を処置するための治療量以下の量の第２の薬剤を、開示されている組成物と同時投与することができる。開示されている組成物および方法は、第２の薬剤の副作用の低下においても有用であり得る。
ＣＧＲＰは、それと血管運動症状との関連可能性で知られている（Ｗｙｏｎら、Ｓｃａｎｄ． Ｊ． Ｕｒｏｌ． Ｎｅｐｈｒｏｌ．３５巻：９２〜９６頁（２００１年）；Ｗｙｏｎら、Ｍｅｎｏｐａｕｓｅ ７巻（１号）：２５〜３０頁（２０００年））。のぼせおよび寝汗等、血管運動症状（ＶＭＳ）が、閉経期に伴う最も一般的な症状であり、天然または外科的に誘導される閉経期の後に全女性の６０％〜８０％において発生する。のぼせは、減退する性ステロイドに対する中枢神経系（ＣＮＳ）の適応応答である可能性がある（Ｆｒｅｅｄｍａｎ， Ａｍ． Ｊ． Ｈｕｍａｎ Ｂｉｏｌ．１３巻：４５３〜４６４頁（２００１年））。男性も、ステロイドホルモン（アンドロゲン）退薬後にのぼせを経験する。これは、加齢に伴うアンドロゲン減退の場合（Ｋａｔｏｖｉｃｈら、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、１９９０年、１９３巻（２号）：１２９〜３５頁）および前立腺がんの処置に伴うホルモン欠乏症の極端な症例（Ｂｅｒｅｎｄｓｅｎら、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、２００１年、４１９巻（１号）：４７〜５４頁）に当てはまる。これらの患者の３分の１もの患者が、有意な不快感および不自由を引き起こすのに十分に重症な持続性かつ頻繁な症状を経験するであろう。
ＣＧＲＰは、片頭痛（前兆ありまたはなし）および群発性頭痛を含むあらゆる形態の血管性頭痛等、他の血管運動症状の病理に関与する強力な血管拡張薬である。Ｄｕｒｈａｍ， Ｎ． Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ．３５０巻：１０７３〜１０７５頁、２００４年。外頸静脈におけるＣＧＲＰの血清レベルは、片頭痛性頭痛中に患者において上昇する。Ｇｏａｄｓｂｙら、Ａｎｎ． Ｎｅｕｒｏｌ．２８巻：１８３〜７頁、１９９０年。ヒトα−ＣＧＲＰの静脈内投与は、前兆なしの片頭痛を患う患者において、頭痛および片頭痛を誘導し、ＣＧＲＰが、片頭痛において原因となる役割を有することを示唆する。Ｌａｓｓｅｎら、Ｃｅｐｈａｌａｌｇｉａ ２２巻：５４〜６１頁、２００２年。片頭痛におけるＣＧＲＰの関与は、ＣＧＲＰの放出を阻害する（例えば、スマトリプタン）、ＣＧＲＰ受容体をアンタゴナイズする（例えば、ジペプチド誘導体ＢＩＢＮ４０９６ＢＳ（Ｂｏｅｒｈｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ）；ＣＧＲＰ（８−３７））、または両者がＣＧＲＰとその受容体との結合に影響する、受容体活性膜タンパク質（ＲＡＭＰ）もしくは受容体構成成分タンパク質（ＲＣＰ）等、受容体関連タンパク質のうち１種もしくは複数と相互作用する、いくつかの化合物の開発および検査のための基盤であった。Ｂｒａｉｎら、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ２３巻：５１〜５３頁、２００２年。アルファ−２アドレナリン受容体サブタイプおよびアデノシンＡ１受容体も、ＣＧＲＰ放出および三叉神経活性化を制御（阻害）する（Ｇｏａｄｓｂｙら、Ｂｒａｉｎ １２５巻：１３９２〜４０１頁、２００２年）。ヒトにおける神経原性血管拡張および三叉神経侵害受容を阻害することが示された、アデノシンＡ１受容体アゴニストＧＲ７９２３６（メトラファジル（ｍｅｔｒａｆａｄｉｌ））も、抗片頭痛活性を有し得る（Ａｒｕｌｍａｎｉら、Ｃｅｐｈａｌａｌｇｉａ ２５巻：１０８２〜１０９０頁、２００５年；Ｇｉｆｆｉｎら、Ｃｅｐｈａｌａｌｇｉａ ２３巻：２８７〜２９２頁、２００３年）。この理論を混乱させているのは、神経原性炎症（例えば、タキキニンＮＫ１受容体アンタゴニスト）または三叉神経活性化（例えば、５ＨＴ１Ｄ受容体アゴニスト）を排他的に阻害する化合物による処置が、片頭痛のための急性処置として相対的に無効であると示されたという観察であり、一部の研究者に、ＣＧＲＰの放出の阻害が、有効な抗片頭痛処置の一次作用機構であるか疑問視させる。Ａｒｕｌｍａｎｉら、Ｅｕｒ． Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５００巻：３１５〜３３０頁、２００４年。抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８，６２３，３６６号に記載されている通り、片頭痛または疼痛を処置するために使用されてきた。
生物は、生存に有害な環境における潜在的な有害な刺激を感知、認識およびこれに対し適切に応答するように指定された受容体およびその関連するシグナリング経路を進化させてきた。侵害性刺激を検出する神経受容体は、さらなる危害からの回避および生物の保護を促進するために、痛覚を誘引することができる。一過性受容器電位カチオンチャネルサブファミリーＶメンバー１（ＴＲＰＶ１）は、皮膚の真皮および表皮層、口腔および鼻粘膜ならびに関節等、標的組織における極めて高い温度および有痛性刺激を検出する求心性感覚ニューロンにおいて発現される。このようなニューロンの細胞体は、脊髄の後角への投射による中枢神経系への環境刺激に関する情報を中継する。その疼痛感受性縮小に加えて、ＴＲＰＶ１ヌル突然変異体マウスは、食事誘導性肥満に対するその保護である表現型を示すことができる。ＴＲＰＶ１は、代謝における役割を有することができる。ＴＲＰＶ１を発現する無髄Ｃ線維は、膵臓を神経支配する高密度の網目構造を形成し、その刺激は、それぞれ神経原性炎症を促進するまたはｉｎ ｖｉｖｏアッセイにおいてインスリン放出をアンタゴナイズするニューロペプチド、サブスタンスＰおよびカルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）の放出を引き起こす。しかし、生物のＣＧＲＰ放出、加齢ならびに全体的な健康および代謝の間の関係性は、十分に理解されていない。
疼痛の経験は必然的に、生物にストレスを引き起こすが、依然として不明なのは、疼痛の経験ではなく知覚が、生物のための長期的結果を誘発する程度である。臨床試験は、慢性レベルの疼痛を経験する患者における、寿命の相関性の減少および健康の全体的な減少を観察した。さらに、加齢過程が、環境因子に強く影響される無脊椎動物において、正準感覚的知覚の変更は、正常な加齢に急性に影響し得る。ＣＲＴＣ１／ＣＲＥＢ経路の遺伝子操作が、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓの加齢をモジュレートし、化学受容性知覚の破壊が、虫およびハエにおける寿命を延長することが示されてきたが、同様の機構が哺乳動物の長寿を調節するかは不明であった。本明細書において、侵害受容に決定的なイオンチャネルであるＴＲＰＶ１の遺伝的欠失が、末梢感覚ニューロンにおけるＣＲＴＣ１の活性を調節することにより、マウスおよびＣ．ｅｌｅｇａｎｓの寿命を延長することが示される。ＴＲＰＶ１突然変異体マウスも、軽度のインスリン抵抗性にもかかわらず、加齢を通じて改善されたグルコース耐性および増加したエネルギー支出を有する。前者を除いて、これらの表現型は、これらのマウスの例外的な長寿の根底にある可能性がある。加齢を通じた改善されたエネルギー支出は、炭水化物および脂肪代謝の間のより健康的な移行を確実にすることにより、脂肪貯蔵および脂肪代謝に関連する全身性損傷を予防する。改善されたエネルギー支出と一貫して、ＴＲＰＶ１突然変異体マウスは、グルコース耐性における有益な効果および高脂肪食によって誘導される肥満に対する抵抗性を示す。
本明細書において、ＴＲＰＶチャネルが、ＣＲＴＣ１／ＣＲＥＢ回路により代謝活性を調整することにより、複数の感覚入力を統合し、長寿を促進する神経内分泌シグナルへとこれらを伝達する進化的に保存された系として感覚ニューロンにおいて機能することが示されている。特に、これらのデータは、哺乳動物における長寿の決定的な神経内分泌調節因子ならびに予測寿命および健康寿命の可能なバイオマーカーとしてのニューロペプチドＣＧＲＰの役割を強調する。興味深いことに、３０年間を超えて生きる極めて長寿命のハダカデバネズミは、ＤＲＧにおけるＣＧＲＰを天然に欠く（Ｐａｒｋら、Ｊ． Ｃｏｍｐ． Ｎｅｕｒｏｌ．４６５巻、１０４〜１２０頁、２００３年）。本明細書において、ＴＲＰＶ１および／またはＣＧＲＰの薬理学的操作が、疼痛に有用となるのみならず、グルコース恒常性および加齢も改善し得ることが提案される。この考えと一貫して、ＴＲＰＶ１ニューロンを過剰刺激し、その死を引き起こし得るカプサイシンが豊富な食事は、ヒトにおける糖尿病および代謝調節不全のより低い発生率に長年関連付けられてきた（Ｗｅｓｔｅｒｔｅｒｐ−Ｐｌａｎｔｅｎｇａら、Ｉｎｔ． Ｊ． Ｏｂｅｓ．２００５年、２９巻、６８２〜６８８頁、２００５年）。
本明細書に記載されている方法は、代謝障害を患う（またはそのリスクがある）対象に治療有効量の１種または複数の抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体（１、２、３、４または５種の異なる抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体等）を含む組成物を投与するステップを含む。例示的な対象は、哺乳動物、例えば、ヒト等、動物を含む。本明細書に記載されている方法および組成物は、ヒト治療薬、前臨床および獣医学適用の両方において有用であり得る。一部の実施形態では、対象は、哺乳動物であり、一部の実施形態では、対象は、ヒトである。処置される対象は、対象の年齢によって限定されない。例えば、ヒト対象は、小児（例えば、新生児、乳児、幼児、青年期直前）、青年期、思春期または成人（例えば、若年期成人、中年期成人、高齢者）であり得る。一部の実施形態では、ヒト対象は、高齢者である。ヒト対象は、約０ヶ月齢〜約１２０歳またはそれ超の間であり得る。例えば、ヒト対象は、約０〜約１２ヶ月齢の間；約０〜１２歳の間；約１３歳〜１９歳の間（例えば、約１３、１４、１５、１６、１７、１８または１９歳）；約２０〜約３９歳の間（例えば、約２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８または３９歳）；約４０〜約５９歳の間（例えば、約４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８または５９歳）；またはさらには５９歳超（例えば、約６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９または１２０歳）であり得る。特異的な実施形態では、ヒト対象は、約４５歳もしくはそれ超；または５５歳もしくはそれ超である。ヒト対象は、男性対象または女性対象であり得る。
対象は、代謝障害を誘導し得る、異なる種類の食事を摂ることができる。「食事」は、対象が、ある期間習慣的に消費する食物の種類を指す。期間は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２ヶ月間；２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００年間超であり得る。一部の実施形態では、いくつかの種類の食事を摂る対象は、代謝障害のリスクがあり得る。一部の実施形態では、対象は、糖分の多い食事、高脂肪食、高タンパク質食、低繊維食または精製デンプンが多い食事を摂ることができる。食事の各種類に関して、「高」は、食品医薬局（Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）（「Ｄｉｅｔａｒｙ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ｆｏｒ Ａｍｅｒｉｃａｎｓ」、２０１０年）に記載されている、当技術分野で周知である通常の食事における含量よりも一般に高い含量レベルを指す。対象は、１種または複数の代謝障害リスク因子レベルの上昇を引き起こし得る食事を摂ることができる。対象は、アルコールを過剰に消費することができる。対象は、デザートが多い食事を摂ることができる。対象は、加工食品が多い食事を摂ることができる。
処置される対象は、様々な体重を有することができる。体重は、代謝障害を示す、またはこれに関連し得る。対象は、過体重または肥満であり得る。過体重または肥満であるということは、対象の体重が、理想体重範囲を上回ることを意味する。一般に、理想体重範囲は、約１８〜２５のボディマスインデックス（ＢＭＩ）である。ＢＭＩは、メートル単位の対象の身長の二乗で割った、キログラム単位の対象の体重によって計算される。対象は、約２５〜３０であるＢＭＩを有することができる。例えば、対象は、約２５、２５．５、２６、２６．５、２７、２７．５、２８、２８．５、２９、２９．５、２９．９または３０であるＢＭＩを有することができる。対象は、約３０よりも高いＢＭＩを有することができる。例えば、対象は、約３０．５、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９または４０であるＢＭＩを有することができる。対象は、約４０よりも高いＢＭＩを有することができる。対象は、約５０、７５、１００、１２５、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０または４００ｌｂを超える重さであり得る。
対象は、習慣を有していてもよく、または習慣を欠いていてもよい。かかる習慣または習慣の欠如は、代謝障害に関連することがあり、対象を、代謝障害を発症するリスクにさらすことがある。「習慣」は、対象によってルーチンに、または通常よりも高い頻度で為される活動を指す。一部の実施形態では、習慣は、血流もしくは血清中のグルコースレベルを増加させることができる、または対象におけるインスリン分泌を阻害することができる。対象は、喫煙または紫煙吸入の習慣を有していてもよい。対象は、巻きたばこ、葉巻またはパイプが挙げられるがこれらに限定されない、タバコ製品による喫煙の習慣を有していてもよい。対象は、喫煙または受動喫煙を含有する環境に置かれていてもよい。対象は、定期的に運動するまたは身体活動を行う習慣を有していなくてもよい。対象は、通常よりも低い頻度で、運動するまたは身体活動を行っていてもよい。対象は、平均して、１週間、１ヶ月間、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２ヶ月間、２、３、４、５、６、７、８、９、１０年間に約１回運動していてもよい。対象は、１週間に約１回；１ヶ月間に１回；２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２ヶ月間に１回；または２、３、４、５、６、７、８、９、１０年間に１回未満運動していてもよい。対象は、動けなくなっていてもよい。
本明細書に記載されている治療有効量の抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体を含む組成物および方法を使用して、状態を患うまたはこれを患うリスクがある対象を処置することができる。対象が患い得るまたは患うリスクがある状態は、代謝障害または代謝障害に関連する状態であり得る。一部の実施形態では、状態は、糖尿病（例えば、Ｉ型またはＩＩ型）、肝臓障害、膵臓障害、妊娠、心血管疾患、高脂血症、肥満、体重増加、加齢および／またはアルコール消費、エストロゲン投与その他等の薬物関連の脂質代謝変化である。一部の実施形態では、心血管疾患は、冠動脈疾患、脳卒中、高血圧症、末梢血管疾患、心発作もしくは虚血性心疾患および／または先天性心疾患である。対象が患い得るまたはリスクがある他の例示的な代謝障害として、酸性リパーゼ疾患、バース症候群、橋中心髄鞘崩壊症、ファーバー病、ガングリオシドーシス、リソソーム蓄積症、ゴーシェ病、ハンター症候群、ハーラー症候群、トリメチルアミン尿症、レッシュ・ナイハン症候群、脂質蓄積症、筋肉の代謝性疾患、代謝性筋疾患、ミトコンドリア筋症、ムコリピドーシス、ムコ多糖症、ニーマン・ピック病、ポンペ病、Ｉ型糖原病、サンドホフ病、テイ・サックス病、ポンペ病、尿素サイクル異常症、高シュウ酸尿症およびシュウ酸症その他が挙げられるがこれらに限定されない。他の例は、本明細書に提供されている。
一態様では、本方法および組成物を使用して、糖尿病を患う対象を処置することができる。真性糖尿病（ＤＭ）または糖尿病は、高血糖症としても公知の、血流中の過剰なグルコースレベルによって特徴付けられる代謝性疾患の群である。糖尿病は、その有病率、罹患率および死亡率によって公衆衛生を脅かす主要な疾患の１つである。近年、糖尿病または関連する状態の発病は、より若い患者において出現している。糖尿病の臨床症状は、過食症、多飲症、多尿症、疲労、体重減少、霧視、不十分な創傷治癒、口渇症、乾燥もしくは敏感肌、足もしくは踵におけるピリピリ感、勃起機能不全、反復性感染症、外耳感染症、心不整脈、昏迷、昏睡または発作であり得る。糖尿病は、高血圧症、高脂血症、冠動脈心疾患、慢性腎不全および他の合併症をさらにもたらし得る。
糖尿病は、２つの型、Ｉ型糖尿病およびＩＩ型糖尿病にカテゴリー化することができる。Ｉ型糖尿病は、膵β細胞の機能減退に起因する。したがって、Ｉ型糖尿病は、インスリンの欠如に起因する疾患である。Ｉ型糖尿病患者は、ケトアシドーシス等、急性合併症の傾向がある。ＩＩ型糖尿病は、異なるレベルの病理学的症状を有する複合代謝障害である。これは、膵島β細胞機能の減退、インスリン抵抗性およびグリコーゲン代謝障害によって特徴付けることができる。よって、対象が患う可能性があり（またはリスクがあり）、本組成物および方法によって処置することができる代謝障害は、ＩＩ型糖尿病等、Ｉ型またはＩＩ型糖尿病であり得る。
対象が患う可能性がある（またはリスクがある）状態は、インスリン分泌の阻害または高血糖（すなわち、高血糖症、血流、血漿または血清中を循環する高レベルまたは過剰量のグルコース）によって特徴付けられる障害であり得る。高血糖症は、１００ｍｇ／ｄｌよりも高い絶食時グルコースレベルによって特徴付けることができるが、症状は、２５０〜３００ｍｇ／ｄｌ等、さらにより高い値まで注目すべきものになり始めていなくてよい。１００〜１２６ｍｇ／ｄｌ（米国糖尿病協会（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）ガイドライン）の間の一貫した範囲を有する対象は、高血糖性とみなされるが、１２６ｍｇ／ｄｌまたは７ｍｍｏｌ／ｌ超は、一般に、糖尿病または高血糖症であると考えられる。７０ｍｇ／ｄｌまたは４ｍｍｏｌ／ｌを下回る一貫した範囲を有する対象は、低血糖とみなすことができる。７ｍｍｏｌ／ｌ（１２５ｍｇ／ｄｌ）を超える慢性レベルは、臓器損傷を生じ得る。グルコースレベルは、食事の前後および一日の様々な時間で変動し得る。一般に、多くの人にとっての絶食時グルコースレベルの正常範囲は、約８０〜１１０ｍｇ／ｄｌであり得る。絶食時グルコースレベルは、一般に、８〜１２時間の絶食後に、または５時間、８時間、１０時間、１２時間、１５時間、２４時間もしくはさらにより長い時間の絶食後に測定される血清グルコースレベルを指す。絶食中の成人において、正常血漿グルコースは、１２６ｍｇ／ｄＬ未満であり得る。持続したより高いレベルの血糖は、血管およびそれが供給する臓器に損傷を引き起こし、糖尿病の合併症を生じ得る。高血糖症は、ＨｂＡ１ｃ検査またはグルコース耐性検査を含む、医学技術分野で公知のいずれかの方法を使用して測定することができる。よって、対象が患うまたは患うリスクがある状態は、対象におけるグルコースの過剰な血清レベル（２００ｍｇ／ｄｌ超またはさらには３００ｍｇ／ｄｌ超等、１２６ｍｇ／ｄｌを上回るグルコースレベルを有する対象等）に関連する状態であり得る。１種または複数の抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体を含む組成物を使用して、対象におけるグルコースの血清レベルを変化させることができる。本抗体は、ＣＧＲＰに結合する抗体であり得る。
一部の実施形態では、対象のグルコースレベルは、本治療用組成物の投与前の時点と比較して、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％またはさらには少なくとも６０％の低下等、１種または複数の抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体の投与後に下げられる。下げられるグルコースレベルは、絶食時グルコースレベルまたは食後のもしくはグルコース耐性検査の際のグルコースレベルであり得る。グルコース耐性検査またはグルコース負荷検査は、グルコースが与えられ、その後に血液試料が採取されて、血液からこれがどの程度速く排除されるかを決定する医学的検査である。検査を使用して、糖尿病、インスリン抵抗性、ならびに場合により反応性低血糖および先端巨大症またはより珍しい炭水化物代謝障害に関して検査することができる。グルコース耐性検査は、標準用量のグルコースの経口摂取および２時間後の血液レベルのチェックを含む、経口グルコース耐性検査（ＯＧＴＴ）として行うことができる。数年間にわたって、様々な目的のため、異なる標準用量のグルコース、異なる投与経路、異なるサンプリング間隔および持続時間、ならびに血中グルコースに加えて測定される様々な物質を用いて、グルコース耐性検査の多くの変種が考案されてきた。
一部の例において、対象におけるインスリン耐性が、本治療用組成物の投与前の時点等の対照と比較した、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも１００％またはさらには少なくとも２００％の増加等、１種または複数の抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体の投与後に増加する。インスリン耐性を測定する方法は、当技術分野で公知であり、その例は、本明細書に提供されている。
一部の例において、対象の寿命は、同じ代謝障害を有するが、本治療用組成物を与えなかった対象または対象群の寿命との比較等、対照と比較した、少なくとも１ヶ月間、少なくとも６ヶ月間、少なくとも１年間、少なくとも２年間、少なくとも３年間、少なくとも４年間、少なくとも５年間または少なくとも１０年間の増加等、１種または複数の抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体の投与後に増加する。
一部の例において、対象における呼吸交換率（ＲＥＲ）は、本治療用組成物の投与前の時点等の対照と比較した、または同じ代謝障害を有するが、本治療用組成物を与えなかった対象もしくは対象群のＲＥＲと比較した、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも１００％またはさらには少なくとも２００％の増加等、１種または複数の抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体の投与後に増加する。ＲＥＲを測定する方法は、当技術分野で公知であり、その例は、本明細書に提供されている。
一部の例において、対象における酸素消費は、本治療用組成物の投与前の時点等の対照と比較した、または同じ代謝障害を有するが、本治療用組成物を与えなかった対象もしくは対象群の酸素消費と比較した、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも１００％またはさらには少なくとも２００％の増加等、１種または複数の抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体の投与後に増加する。酸素消費を測定する方法は、当技術分野で公知であり、その例は、本明細書に提供されている。
代謝障害または代謝障害に関連する状態を患う（またはそのリスクがある）対象は、医学技術分野で公知である１種または複数の検査を使用して診断または選択することができる。代謝障害を患うまたは代謝障害を患うリスクがある対象の同定、選択または診断に使用することができる方法または検査として、代謝パネル（米国臨床化学会（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ））から選択されるバイオマーカーのレベル、乳酸検査、メチルマロン酸検査、ミトコンドリア病症状、尿臭（ｕｒｉｎｅ ｏｄｏｒ）、グルコース耐性検査その他が挙げられるがこれらに限定されない。
一部の実施形態では、１種または複数の抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体を含む方法および組成物は、ガイドラインに従って、糖尿病または代謝障害に関して血清グルコースレベルが非常に高リスク、高リスク、境界域高リスクまたはほぼ最適であると分類される対象への投与に有用である。例えば、対象は、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１２６、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２５０または３００ｍｇ／ｄＬよりも高い絶食時血清グルコースレベルを有することができる。一部の実施形態では、抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体は、約８０〜３００、８０〜２５０、８０〜１２５、８０〜１００、１００〜３００、１００〜２５０、１００〜１２５、１２５〜３００または２５０〜３００ｍｇ／ｄＬである絶食時血清グルコースレベルを有する対象に投与することができる。一部の実施形態では、抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体は、約１００、１２５または２５０ｍｇ／ｄＬよりも高い絶食時血清グルコースレベルを有する対象に使用することができる。所望であれば、治療有効量の抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体の投与後の血清グルコースの選択された生理的レベルは、絶食条件下で、例えば、少なくとも約８時間、１０時間、１２時間、１５時間、２４時間もしくはさらにはより長く、または８〜１２時間食物を摂らずに、測定することができる。一部の事例において、抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体の投与後の血清グルコースレベルは、グルコースの摂取または食後２時間後に測定される。
対象の状態が、抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体の投与後に改善されるように、治療有効量の１種または複数の抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体を、状態を有する対象に投与するための方法および組成物が本明細書に記載されている。抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体は、ＣＧＲＰに結合する抗体であり得る。治療有効量の抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体の投与は、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％および少なくとも９９％の状態改善をもたらすことができる。一部の実施形態では、状態は、５０％を超えて改善される。改善は、処置されている状態に関連するバイオマーカー等、対象におけるバイオマーカーまたはリスク因子のレベルに関して特徴付けることができる。改善は、その正常機能と比較した、臓器の機能改善によって特徴付けることもできる。改善は、インスリン分泌の増加、グルコース耐性の増加、長寿または全体的な代謝的健康の増加によって特徴付けることもできる。かかる改善は、かかる処置の前の状態と比べたものであり得るか、または同じ代謝性状態（複数可）を有するもしくはそのリスクがある対象において予想されるものと比べたものであり得る。
一部の実施形態では、本明細書に記載されている組成物および方法は、抗代謝障害剤の１種または複数の副作用の寛解または低下に有用である。本明細書に記載されている抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体を含む方法および組成物は、１種または複数の抗代謝障害剤も投与された対象に投与することもできる。一部の実施形態では、１種または複数の抗代謝障害剤は、代謝障害を処置するのに有効な量で投与される。一部の実施形態では、１種または複数の抗代謝障害剤は、対象におけるグルコースレベルを低くするのに有効な量で投与される。一部の実施形態では、１種または複数の抗代謝障害剤は、副作用を有し得る。別の事例では、１種または複数の抗高血糖剤は、抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体と併せて治療量以下のレベルで投与して、副作用を最小化することができる。抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体は、ＣＧＲＰに結合する抗体であり得る。
一部の実施形態では、対象に、抗代謝障害剤または抗糖尿病剤を含む有効量の１種または複数の治療剤をさらに投与することができる。よって、本明細書に記載されている方法は、治療量の１種または複数の抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体を投与するステップと、治療量の１種または複数の追加的な治療剤（例えば、抗代謝障害剤または抗糖尿病剤）を投与するステップとを含むことができる。一部の実施形態では、抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体は、同時に同じ経路で、１種または複数の追加的な治療剤と共に投与される。一部の実施形態では、抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体は、１種または複数の追加的な治療剤とは別々に投与される。一部の実施形態では、抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体および１種または複数の追加的な治療剤は、追加的な治療剤を最初にまたは抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体を最初に、続けて投与することができる。一部の実施形態では、抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体は、１種または複数の追加的な治療剤と併せて対象に投与される。一部の実施形態では、抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体は、１種または複数の追加的な治療剤と同じ投与経路で投与される。抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体は、１種または複数の追加的な治療剤とは異なる投与経路で投与することができる。例えば、抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体は、皮下投与することができる一方、１種または複数の追加的な治療剤は、静脈内注射により投与することができる。１種または複数の追加的な治療剤のそれぞれは、同じまたは異なる投与経路により投与することができる。
１種または複数の抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体（および１種または複数の追加的な治療剤（例えば、抗代謝障害剤または抗糖尿病剤））は、いずれか適した様式で投与することができる。かかる投与は、皮下注射であり得る。経口、経皮、静脈内、エアロゾル、筋肉内、腟、直腸、真皮下、非経口的、点眼、肺、経粘膜、耳、経鼻および外用投与等、他の投与経路を使用することができる。抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体、抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体のバイオアベイラビリティを増加させるための少なくとも１種の薬剤または少なくとも１種の追加的な治療剤等、本明細書に記載されている組成物の構成成分は、本明細書および／または米国特許出願公開番号ＵＳ２００６／００８９３３５Ａ１に記載されている同時発生的投与のいずれかの様式等で、同時発生的に対象に投与することができる。加えて、単なる一例として、非経口的送達は、筋肉内、皮下、静脈内、髄内注射ならびにくも膜下腔内、直接的脳室内、腹腔内、リンパ内および鼻腔内注射を含む。
一実施形態では、１種または複数の抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体は、部位特異的または標的化局所的送達技法により投与される。部位特異的または標的化局所的送達技法の例として、抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体の様々な植え込み型デポ源または注入カテーテル、留置カテーテルもしくは針カテーテル等の局所的送達カテーテル、合成グラフト、外膜ラップ、シャントおよびステント、または他の植え込み型デバイス、部位特異的担体、直接的注射もしくは直接的適用が挙げられる。例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ００／５３２１１および米国特許第５，９８１，５６８号を参照されたい。
さらに、一部の事例において、本明細書に記載されている方法は、１種または複数の追加的な治療剤と同じまたは異なる処置持続時間、１種または複数の抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体を投与するステップを含む。例えば、１種または複数の抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体は、３０日間投与することができる一方、１種または複数の追加的な治療剤は、１０日間投与される。対象は、１種または複数の抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体を投与する前の期間に、１種または複数の追加的な治療剤による処置を受けることができる。１種または複数の抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体および１種または複数の追加的な治療剤は、代謝障害に相乗的に作用することができる。
１種または複数の抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体と同時投与することができる追加的な治療剤の例として、当技術分野で公知の抗糖尿病剤が挙げられる。追加的な治療剤として、ＨＭＧ−ＣｏＡ阻害剤（またはスタチン）、ビグアナイド、スルホニルウレア（ｓｕｆｏｎｙｌｕｒｅａ）、チアゾリジンジオン、メグリチニド、グリニド、α−グルコシダーゼ阻害剤、レパグリニド、ナテグリニド、ＤＰＰ−ＩＶ阻害剤、シタグリプチン、ビルダグリプチン、サキサグリプチンまたはインスリンおよびインスリン類似体のうち１種または複数（１、２、３、４または５種等）を挙げることができるがこれらに限定されない。高血糖症または糖尿病、特に、Ｉ型糖尿病の処置に使用するためのインスリンおよびインスリン類似体の非限定例は、速効型インスリン、中間型インスリンおよび長時間作用型インスリンを含むことができる。速効型インスリンは、レギュラーインスリン（ヒューマリンＲ、ノボリンＲ）、インスリンリスプロ（ヒューマログ）、インスリンアスパルト（ノボログ（Ｎｏｖｏｌｏｇ））、インスリングルリジン（アピドラ）、迅速型インスリン亜鉛（セミレンテ（Ｓｅｍｉｌｅｎｔｅ））その他を含むことができる。中間型インスリンは、イソフェンインスリン、中性プロタミンハーゲドルン（ｈａｇｅｄｏｒｎ）（ヒューマリンＮ、ノボリンＮ）、インスリン亜鉛（レンテ）その他を含むことができる。長時間作用型インスリンは、延長型インスリン亜鉛インスリン（ウルトラレンテ）、インスリングラルギン（ランタス）、インスリンデテミル（レベミル）その他を含むことができる。抗高血糖剤は、インスリン感受性改善薬（ｓｅｎｓｉｔｉｚｅｒ）であり得る。インスリン感受性改善薬を使用して、特にＩＩ型糖尿病を処置することができる。例示的なインスリン感受性改善薬として、ビグアナイドまたはチアゾリジンジオンが挙げられるがこれらに限定されない。ビグアナイドは、メトホルミン、フェンホルミンまたはブホルミンであり得る。メトホルミンは通常、臨床でのＩＩ型糖尿病の処置に使用される第一選択薬物療法である。チアゾリジンジオンは、ロシグリタゾン（アバンディア）、ピオグリタゾン（アクトス）またはトログリタゾン（レズリン）であり得る。抗高血糖剤は、分泌促進物質等、膵臓からのインスリン産出量を増加させる薬剤であり得る。分泌促進物質は、スルホニルウレアまたは非スルホニルウレア分泌促進物質であり得る。スルホニルウレアとして、トルブタミド（ｔｏｌｕｔａｍｉｄｅ）（オリナーゼ（Ｏｒｉｎａｓｅ）、ラスチノン（Ｒａｓｔｉｎｏｎ）商品名）、アセトヘキサミド（ジメロール（Ｄｙｍｅｌｏｒ））、トラザミド（トリナーゼ（Ｔｏｌｉｎａｓｅ））、クロルプロパミド（ジアビナーゼ（Ｄｉａｂｉｎａｓｅ））、グリピジド（グルコトロール（Ｇｌｕｃｏｔｒｏｌ）、ミニジアブ（Ｍｉｎｉｄｉａｂ）、グリベネス（Ｇｌｉｂｅｎｅｓｅ））、グリブリドまたはグリベンクラミド（ジアベタ（Ｄｉａｂｅｔａ）、ミクロナーゼ（Ｍｉｃｒｏｎａｓｅ）、グリナーゼ、ダニル（Ｄａｎｉｌ）、ユーグリコン（Ｅｕｇｌｙｃｏｎ））、グリメピリド（アマリール）、グリクラジド（ユニジアミクロン（Ｕｎｉ Ｄｉａｍｉｃｒｏｎ））、グリクロピラミド（ｇｌｙｃｏｐｙｒａｍｉｄｅ）、グリキドン（グルレノルム（Ｇｌｕｒｅｎｏｒｍ））を挙げることができるがこれらに限定されない。非スルホニルウレア分泌促進物質は、メグリチニド、レパグリニド（プランジン（Ｐｒａｎｄｉｎ）、ノボノルム（Ｎｏｖｏｎｏｒｍ））またはナテグリニド（スタルリクス（Ｓｔａｒｌｉｘ））を含むことができる。抗高血糖剤または抗糖尿病剤は、アルファグルコシダーゼ阻害剤であり得る。アルファグルコシダーゼ阻害剤は、食事のデンプン由来のグルコースが、さらにゆっくりと血流に進入でき、不良なインスリン応答または感受性によってより有効にマッチできるように、小腸におけるデンプンの消化を遅らせることができる。アルファグルコシダーゼ阻害剤の非限定例として、ミグリトール（グリセット（Ｇｌｙｓｅｔ））、アカルボース（プレコース（Ｐｒｅｃｏｓｅ）／グルコバイ）またはボグリボースを挙げることができる。抗高血糖剤は、ペプチド類似体であり得る。ペプチド類似体として、注射用インクレチンミメティック、注射用グルカゴン様ペプチド類似体およびアゴニスト、胃抑制ペプチド類似体、ジペプチジルペプチダーゼ−４阻害剤または注射用アミリン類似体を挙げることができるがこれらに限定されない。注射用インクレチンミメティックは、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）および胃抑制ペプチド（グルコース依存性インスリン分泌性ペプチド、ＧＩＰ）を含むことができる。注射用グルカゴン様ペプチド類似体およびアゴニストは、エキセナチド（同様にエキセンディン−４またはバイエッタ）、リラグルチド、タスポグルチドまたはリキシセナチド（リクスミア（Ｌｙｘｕｍｉａ））ｓａｎｏｆｉ ａｖｅｎｔｉｓを含むことができる。ジペプチジルペプチダーゼ−４阻害剤は、ジペプチジルペプチダーゼ−４によるその分解を阻害することにより、インクレチンＧＬＰ−１の血中濃度を増加させることができる。ジペプチジルペプチダーゼ−４阻害剤は、ビルダグリプチン（ガルブス（Ｇａｌｖｕｓ））、シタグリプチン（ジャヌビア）、サキサグリプチン（オングリザ）、リナグリプチン（トラゼンタ）、アログリプチンまたはセプタグリプチンを含むことができる。注射用アミリン類似体は、プラムリンチドであり得る。抗高血糖または抗糖尿病剤は、グリコスリクスであり得る。グリコスリクスは、ナトリウム／グルコースコトランスポーター２（ＳＧＬＴ２）であり得、これは、腎尿細管におけるグルコースの再取り込みを遮断するように機能し、尿中のグルコースの喪失を促進する。グリコスリクスは、カナグリフロジン（インボカナ（Ｉｎｖｏｋａｎａ））またはダパグリフロジン（フォシーガ）であり得る。一部の事例において、抗高血糖剤または抗糖尿病剤は、植物、元素または漢方薬等、天然の物質であり得る。抗高血糖または抗糖尿病剤としての天然の物質の非限定例として、シナモン、白檀、キノの木、Ｇｅｎｔｉａｎａ ｏｌｉｖｉｅｒｉ、クロムサプリメント、硫酸バナジルまたはチアミンが挙げられる。
１種または複数の抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体と同時投与することができる追加的な治療剤の他の例として、アルファ−グルコシダーゼ阻害剤、アミリンアゴニスト、ジペプチジル−ペプチダーゼ４（ＤＰＰ−４）阻害剤、メグリチニド、スルホニルウレアまたはペルオキシソーム増殖因子活性化受容体（ＰＰＡＲ）−ガンマアゴニストが挙げられるがこれらに限定されない。ＰＰＡＲ−ガンマアゴニストの例として、チアゾリジンジオン（ＴＺＤ）（ピオグリタゾン、ロシグリタゾン、リボグリタゾンまたはトログリタゾン等）、アレグリタザル、ファルグリタザル、ムラグリタザルまたはテサグリタザルが挙げられる。
本明細書に記載されている１種または複数の治療剤（例えば、抗高血糖剤または抗糖尿病剤）が、抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体と共に投与される場合、１種または複数の治療剤は、治療量以下の量で使用することができる。本明細書に記載されている治療剤または抗糖尿病剤の治療量以下の量は、単独で使用される場合に治療量であるとみなされる量よりも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または９９％少なくなり得る。治療量は、ＦＤＡガイドラインによって提案される用量、または全て１種もしくは複数の特徴を有する個々の対象もしくは対象群に対して評価される量であり得る。この特徴は、年齢、体重、人種、性別、民族性、国籍、特定の食事、身体活動レベルまたはある特定のバイオマーカーのレベルのうち１種または複数であり得る。
抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体
一部の実施形態では、本明細書に提供されている方法は、１種または複数の抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体を使用する。
抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体は、次の特徴のうちいずれか１種または複数を示すことができる：（ａ）ＣＧＲＰに結合する；（ｂ）ＣＧＲＰがその受容体（複数可）に結合するのを遮断する；（ｃ）ＣＧＲＰ受容体活性化（ｃＡＭＰ活性化を含む）を遮断または減少させる；（ｄ）ＣＧＲＰの生物学的活性またはＣＧＲＰシグナリング機能によって媒介される下流経路を阻害する；（ｅ）頭痛（例えば、片頭痛）のいずれかの側面を予防、寛解または処置する；（ｆ）ＣＧＲＰのクリアランスを増加させる；および（ｇ）ＣＧＲＰ合成、産生または放出を阻害（低下）する。いくつかの抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体が、当技術分野で公知である。例えば、Ｔａｎら、Ｃｌｉｎ． Ｓｃｉ． （Ｌｏｎｄ）．８９巻：５６５〜７３頁、１９９５年；Ｓｉｇｍａ（Ｍｉｓｓｏｕｒｉ、ＵＳ）、製品番号Ｃ７１１３（クローン＃４９０１）；Ｐｌｏｕｒｄｅら、Ｐｅｐｔｉｄｅｓ １４巻：１２２５〜１２２９頁、１９９３年を参照されたい。
一部の実施形態では、抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体は、ＣＧＲＰおよび／またはＣＧＲＰシグナリング機能によって媒介される下流経路を阻害する様式で、ＣＧＲＰと反応する。一部の実施形態では、抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体は、ヒトＣＧＲＰ（配列番号１５等）を認識する。一部の実施形態では、抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体は、ヒトα−ＣＧＲＰおよびβ−ＣＧＲＰ（例えば、配列番号１５および４３）の両方に結合する。一部の実施形態では、抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体は、ヒトおよびラットＣＧＲＰ（例えば、配列番号１５および４１、４３および４４、またはこれらの配列の全４種）に結合する。一部の実施形態では、抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体は、ＣＧＲＰのアミノ酸２５〜３７を有するＣ末端断片（例えば、配列番号２５）に結合する。一部の実施形態では、抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体は、ＣＧＲＰのアミノ酸２５〜３７内（例えば、配列番号２５内）のＣ末端エピトープに結合する。
本開示において有用な抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、抗体断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、Ｆｃ等）、キメラ抗体、二特異的抗体、ヘテロコンジュゲート抗体、ラクダ科動物抗体、単鎖（ＳｃＦｖ）、これらの突然変異体、抗体部分を含む融合タンパク質（例えば、ドメイン抗体）、ヒト化抗体、ならびに抗体のグリコシル化バリアント、抗体のアミノ酸配列バリアントおよび共有結合により修飾された抗体を含む要求される特異性の抗原認識部位を含む他のいずれかの修飾された構成の免疫グロブリン分子を含む。抗体は、マウス、ラット、ヒトまたは他のいずれかの起源（キメラまたはヒト化抗体を含む）のものであり得る。
一部の実施形態では、抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体は、モノクローナル抗体である。一部の実施形態では、抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体は、ヒト化されている。一部の実施形態では、抗体は、ヒトである。一部の実施形態では、抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体は、抗体Ｇ１（本明細書に記載されている）である。一部の実施形態では、抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体は、表６に示す抗体Ｇ１またはＧ１のバリアントの１個または複数のＣＤＲ（１、２、３、４、５個、または一部の実施形態では、全６個のＣＤＲ等）を含む。さらに他の実施形態では、抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体は、図５に示す重鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号１）および図５に示す軽鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号２）を含む。
一部の実施形態では、抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体は、本明細書に記載されている免疫学的に不活性である定常領域等、修飾された定常領域を含む。一部の実施形態では、定常領域は、Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９９年）２９巻：２６１３〜２６２４頁；ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＧＢ９９／０１４４１；および／または英国特許出願第９８０９９５１．８号に記載されている通りに修飾される。他の実施形態では、抗体は、次の突然変異：Ａ３３０Ｐ３３１からＳ３３０Ｓ３３１（野生型ＩｇＧ２配列を参照したアミノ酸ナンバリング）を含むヒト重鎖ＩｇＧ２定常領域を含む。Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９９年）２９巻：２６１３〜２６２４頁。一部の実施形態では、抗体は、次の突然変異：Ｅ２３３Ｆ２３４Ｌ２３５からＰ２３３Ｖ２３４Ａ２３５を含むＩｇＧ４の定常領域を含む。さらに他の実施形態では、定常領域は、Ｎ結合型グリコシル化のために脱グリコシル化（ａｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅ）される。一部の実施形態では、定常領域は、定常領域におけるＮ−グリコシル化認識配列の一部であるオリゴ糖取り付け残基（Ａｓｎ２９７等）および／または隣接する残基を突然変異させることにより、Ｎ結合型グリコシル化のために脱グリコシル化される。一部の実施形態では、定常領域は、Ｎ結合型グリコシル化のために脱グリコシル化される。定常領域は、酵素により、またはグリコシル化欠損宿主細胞における発現により、Ｎ結合型グリコシル化のために脱グリコシル化することができる。
ＣＧＲＰ（ヒトα−ＣＧＲＰ等）に対する抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体の結合親和性（ＫＤ）は、約０．０２〜約２００ｎＭであり得る。一部の実施形態では、結合親和性は、約２００ｎＭ、約１００ｎＭ、約５０ｎＭ、約１０ｎＭ、約１ｎＭ、約５００ｐＭ、約１００ｐＭ、約６０ｐＭ、約５０ｐＭ、約２０ｐＭ、約１５ｐＭ、約１０ｐＭ、約５ｐＭまたは約２ｐＭのいずれかである。一部の実施形態では、結合親和性は、約２５０ｎＭ、約２００ｎＭ、約１００ｎＭ、約５０ｎＭ、約１０ｎＭ、約１ｎＭ、約５００ｐＭ、約１００ｐＭまたは約５０ｐＭのいずれか未満である。
ＣＧＲＰに対する抗体の結合親和性を決定または測定する１つの仕方は、抗体の単官能性Ｆａｂ断片の結合親和性を測定することによる。単官能性Ｆａｂ断片を得るために、抗体（例えば、ＩｇＧ）をパパインで切断するか、または組換えにより発現させることができる。抗体の抗ＣＧＲＰ Ｆａｂ断片の親和性は、ＨＢＳ−ＥＰランニングバッファー（０．０１Ｍ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、０．１５ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．００５％ｖ／ｖ界面活性物質Ｐ２０）を使用して、予め固定化されたストレプトアビジンセンサーチップ（ＳＡ）を備える表面プラズモン共鳴（Ｂｉａｃｏｒｅ３０００（商標）表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）システム、Ｂｉａｃｏｒｅ，ＩＮＣ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ ＮＪ）によって決定することができる。ビオチン化ヒトＣＧＲＰ（または他のいずれかのＣＧＲＰ）は、０．５ｕｇ／ｍＬ未満の濃度となるようにＨＢＳ−ＥＰバッファーに希釈し、可変的な接触時間を使用して個々のチップチャネルにわたって注射して、詳細な動態研究のために５０〜２００応答単位（ＲＵ）またはスクリーニングアッセイのために８００〜１，０００ＲＵのいずれか２種の範囲の抗原密度を達成することができる。再生研究は、２５％ｖ／ｖエタノールにおける２５ｍＭ ＮａＯＨが、２００回超の注射にわたってチップにおけるＣＧＲＰの活性を維持しつつ、結合したＦａｂを有効に除去することを示した。典型的には、精製Ｆａｂ試料の系列希釈（０．１〜１０×推定ＫＤの濃度に及ぶ）が、１００μＬ／分で１分間注射され、最大２時間の解離時間が置かれる。Ｆａｂタンパク質の濃度は、標準として公知濃度（アミノ酸解析によって決定）のＦａｂを使用して、ＥＬＩＳＡおよび／またはＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動によって決定される。動態学的会合速度（ｋｏｎ）および解離速度（ｋｏｆｆ）は、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎプログラムを使用して、１：１ラングミュア結合モデル（Ｋａｒｌｓｓｏｎ， Ｒ． Ｒｏｏｓ， Ｈ． Ｆａｇｅｒｓｔａｍ， Ｌ． Ｐｅｔｅｒｓｓｏｎ， Ｂ．（１９９４年）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ６巻、９９〜１１０頁）にデータを網羅的に適合させることにより同時に得られる。平衡解離定数（ＫＤ）値は、ｋｏｆｆ／ｋｏｎとして計算される。このプロトコールは、ヒトＣＧＲＰ、別の哺乳動物のＣＧＲＰ（マウスＣＧＲＰ、ラットＣＧＲＰ、霊長類ＣＧＲＰ等）および異なる型のＣＧＲＰ（αおよびβ型等）を含むいずれかのＣＧＲＰに対する抗体の結合親和性の決定における使用に適する。抗体の結合親和性は、一般に２５℃で測定されるが、３７℃で測定することもできる。
抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体は、当技術分野で公知のいずれかの方法によって作製することができる。宿主動物の免疫化の経路およびスケジュールは一般に、本明細書にさらに記載されている、抗体刺激および産生のための確立された従来の技法を順守したものである。ヒトおよびマウス抗体の産生のための一般技法は、当技術分野で公知であり、本明細書に記載されている。
ヒトまたはそれに由来する抗体産生細胞を含むいずれかの哺乳動物対象を操作して、ヒトを含む哺乳動物のハイブリドーマ細胞株の産生のための基盤とすることができることが企図されている。典型的には、宿主動物は、腹腔内、筋肉内、経口、皮下、足底内および／または真皮内に、本明細書に記載されているものを含むある量の免疫原を接種される。
ハイブリドーマは、Ｋｏｈｌｅｒ， Ｂ．およびＭｉｌｓｔｅｉｎ， Ｃ．（１９７５年）Ｎａｔｕｒｅ ２５６巻：４９５〜４９７頁の一般的な体細胞ハイブリダイゼーション技法を使用して、またはＢｕｃｋら、Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ、１８巻：３７７〜３８１頁（１９８２年）によって修正される通りに、リンパ球および不死化ミエローマ細胞から調製することができる。Ｘ６３−Ａｇ８．６５３およびＳａｌｋ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｔｕｄｉｅｓ、Ｃｅｌｌ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．、ＵＳＡ由来の系統が挙げられるがこれらに限定されない、利用できるミエローマ系統をハイブリダイゼーションにおいて使用することができる。一般に、技法は、ポリエチレングリコール等、膜融合物質（ｆｕｓｏｇｅｎ）を使用したまたは当業者に周知の電気的手段による、ミエローマ細胞およびリンパ系細胞の融合を含む。融合後に、細胞は、融合培地から分離し、ヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン（ＨＡＴ）培地等、選択的成長培地において成長させて、ハイブリダイズしなかった親細胞を排除する。血清を補充したまたは補充しなかった本明細書に記載されている培地のいずれかを、モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを培養するために使用することができる。細胞融合技法の別の代替として、ＥＢＶ不死化Ｂ細胞を使用して、本開示の抗ＣＧＲＰモノクローナル抗体を産生することができる。ハイブリドーマを拡大増殖させ、必要に応じてサブクローニングし、従来のイムノアッセイ手順（例えば、ラジオイムノアッセイ、エンザイムイムノアッセイまたは蛍光イムノアッセイ）により抗免疫原活性に関して上清をアッセイする。
抗体の供給源として使用することができるハイブリドーマは、ＣＧＲＰに特異的なモノクローナル抗体またはその部分を産生する親ハイブリドーマのあらゆる派生体、後代細胞を包含する。
かかる抗体を産生するハイブリドーマは、公知の手順を使用して、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで成長させることができる。モノクローナル抗体は、必要に応じて硫酸アンモニウム沈殿、ゲル電気泳動、透析、クロマトグラフィーおよび限外濾過等、従来の免疫グロブリン精製手順により、培養培地または体液から単離することができる。望まれない活性が存在する場合、例えば、固相に取り付けられた免疫原でできた吸着剤に調製物を流し、免疫原から所望の抗体を溶出または放出させることにより、除去することができる。二官能性または誘導体化薬剤、例えば、マレイミドベンゾイルスルホサクシニミドエステル（システイン残基を介したコンジュゲーション）、Ｎ−ヒドロキシサクシニミド（リシン残基を介した）、グルタルアルデヒド（ｇｌｕｔａｒａｄｅｈｙｄｅ）、無水コハク酸、ＳＯＣｌ２またはＲ１Ｎ＝Ｃ＝ＮＲ（式中、ＲおよびＲ１は、異なるアルキル基である）を使用した、免疫化しようとする種において免疫原性であるタンパク質、例えば、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリンまたはダイズトリプシン阻害剤にコンジュゲートされた標的アミノ酸配列を含有するヒトＣＧＲＰまたは断片による宿主動物の免疫化は、抗体（例えば、モノクローナル抗体）の集団を生じることができる。
必要に応じて、目的の抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体（モノクローナルまたはポリクローナル）を配列決定し、続いて相当するポリヌクレオチド配列を発現または繁殖のためのベクターにクローニングすることができる。目的の抗体をコードする配列は、宿主細胞中のベクターにおいて維持することができ、次にこの宿主細胞を拡大増殖させ、将来的な使用のために凍結することができる。代替として、ポリヌクレオチド配列を遺伝子操作に使用して、抗体を「ヒト化」する、または抗体の親和性もしくは他の特徴を改善することができる。例えば、定常領域は、ヒト定常領域により似るように操作して、ヒトにおける臨床治験および処置において抗体が使用される場合の免疫応答を回避することができる。ＣＧＲＰに対するより優れた親和性およびＣＧＲＰ阻害におけるより優れた有効性を得るように、抗体配列を遺伝的に操作することが望ましくなり得る。当業者には、１個または複数のポリヌクレオチド変化を抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体に生じさせても、ＣＧＲＰに対するその結合能力を依然として維持できることが明らかであろう。
モノクローナル抗体をヒト化するための４つの一般的ステップが存在する。それらは（１）出発抗体軽および重可変ドメインのヌクレオチドおよび予測アミノ酸配列の決定、（２）ヒト化抗体の設計、すなわち、ヒト化過程中にどの抗体フレームワーク領域を使用するかに関する決断、（３）実際のヒト化方法論／技法ならびに（４）ヒト化抗体のトランスフェクションおよび発現である。例えば、米国特許第４，８１６，５６７号；同第５，８０７，７１５号；同第５，８６６，６９２号；同第６，３３１，４１５号；同第５，５３０，１０１号；同第５，６９３，７６１号；同第５，６９３，７６２号；同第５，５８５，０８９号；および同第６，１８０，３７０号を参照されたい。
ヒト定常ドメインに融合された齧歯類または修飾された齧歯類Ｖ領域およびそれらの関連する相補性決定領域（ＣＤＲ）を有するキメラ抗体を含む、非ヒト免疫グロブリンに由来する抗原結合部位を含むいくつかの「ヒト化」抗体分子が記載されている。例えば、Ｗｉｎｔｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３４９巻：２９３〜２９９頁（１９９１年）、Ｌｏｂｕｇｌｉｏら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８６巻：４２２０〜４２２４頁（１９８９年）、Ｓｈａｗら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３８巻：４５３４〜４５３８頁（１９８７年）およびＢｒｏｗｎら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４７巻：３５７７〜３５８３頁（１９８７年）を参照されたい。他の参考文献は、適切なヒト抗体定常ドメインとの融合に先立ちヒト支持フレームワーク領域（ＦＲ）にグラフトされた齧歯類ＣＤＲについて記載する。例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３３２巻：３２３〜３２７頁（１９８８年）、Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９巻：１５３４〜１５３６頁（１９８８年）およびＪｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ ３２１巻：５２２〜５２５頁（１９８６年）を参照されたい。別の参考文献は、組換えにより切り接ぎ（ｖｅｎｅｅｒ）された齧歯類フレームワーク領域によって支持される齧歯類ＣＤＲについて記載する。例えば、欧州特許公開第０５１９５９６号を参照されたい。これらの「ヒト化」分子は、ヒトレシピエントにおけるこれらの部分の治療適用の持続時間および有効性を限定する齧歯類抗ヒト抗体分子に向かう望まれない免疫学的応答を最小化するように設計されている。例えば、抗体定常領域は、免疫学的に不活性となる（例えば、補体溶解を誘引しない）ように操作することができる。例えば、ＰＣＴ公開番号ＰＣＴ／ＧＢ９９／０１４４１；英国特許出願第９８０９９５１．８号を参照されたい。同様に利用することができる抗体をヒト化する他の方法は、Ｄａｕｇｈｅｒｔｙら、Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９巻：２４７１〜２４７６頁（１９９１年）ならびに米国特許第６，１８０，３７７号；同第６，０５４，２９７号；同第５，９９７，８６７号；同第５，８６６，６９２号；同第６，２１０，６７１号；および同第６，３５０，８６１号；ならびにＰＣＴ公開番号ＷＯ０１／２７１６０により開示されている。
一部の実施形態では、完全ヒト抗体は、特異的なヒト免疫グロブリンタンパク質を発現するように操作された市販のマウスを使用することにより得ることができる。ヒト化またはヒト抗体を作製するために、望ましい（例えば、完全ヒト抗体）またはより頑強な免疫応答を生じるように設計されたトランスジェニック動物を使用することもできる。かかる技術の例は、Ａｂｇｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．（Ｆｒｅｍｏｎｔ、ＣＡ）製のＸｅｎｏｍｏｕｓｅ（商標）ならびにＭｅｄａｒｅｘ，Ｉｎｃ．（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、ＮＪ）製のＨｕＭＡｂ−Ｍｏｕｓｅ（登録商標）およびＴＣ Ｍｏｕｓｅ（商標）である。
一部の実施形態では、抗体は、当技術分野で公知のいずれかの方法を使用して、組換えにより作製および発現させることができる。一部の実施形態では、抗体は、ファージディスプレイ技術によって、組換えにより作製することができる。例えば、米国特許第５，５６５，３３２号；同第５，５８０，７１７号；同第５，７３３，７４３号；および同第６，２６５，１５０号；ならびにＷｉｎｔｅｒら、Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２巻：４３３〜４５５頁（１９９４年）を参照されたい。ファージディスプレイ技術（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、Ｎａｔｕｒｅ ３４８巻：５５２〜５５３頁（１９９０年））を使用して、未免疫化ドナー由来の免疫グロブリン可変（Ｖ）ドメイン遺伝子レパートリーから、ｉｎ ｖｉｔｒｏでヒト抗体および抗体断片を産生することができる。この技法に従って、抗体Ｖドメイン遺伝子を、Ｍ１３またはｆｄ等、糸状バクテリオファージの大または小コートタンパク質遺伝子のいずれかにインフレームでクローニングし、ファージ粒子の表面上に機能的抗体断片として提示する。糸状粒子は、ファージゲノムの一本鎖ＤＮＡコピーを含有するため、抗体の機能特性に基づく選択も、このような特性を示す抗体をコードする遺伝子の選択をもたらす。よって、ファージは、Ｂ細胞の特性の一部を模倣する。ファージディスプレイは、様々な形式で行うことができる；概説のため、例えば、ＪｏｈｎｓｏｎおよびＣｈｉｓｗｅｌｌ、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ３巻：５６４〜５７１頁（１９９３年）を参照されたい。Ｖ−遺伝子セグメントの数種類の供給源をファージディスプレイのために使用することができる。Ｃｌａｃｋｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３５２巻：６２４〜６２８頁（１９９１年）は、免疫化マウスの脾臓に由来するＶ遺伝子の小型のランダムコンビナトリアルライブラリーから多種多様な抗オキサゾロン抗体を単離した。Ｍａｒｋら、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．２２２巻：５８１〜５９７頁（１９９１年）またはＧｒｉｆｆｉｔｈら、ＥＭＢＯ Ｊ．１２巻：７２５〜７３４頁（１９９３年）に記載されている技法に基本的に従って、未免疫化ヒトドナー由来のＶ遺伝子のレパートリーを構築することができ、多種多様な抗原（自己抗原を含む）に対する抗体を単離することができる。自然免疫応答において、抗体遺伝子は、高い比率で突然変異を蓄積する（体細胞高頻度突然変異）。導入された変化の一部は、より高い親和性を付与し、高親和性表面免疫グロブリンを提示するＢ細胞が、その後の抗原負荷中に優先的に複製および分化される。この天然過程は、「鎖シャッフリング」として公知の技法を用いることにより模倣することができる。Ｍａｒｋｓら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ．１０巻：７７９〜７８３頁（１９９２年））。この方法において、重鎖および軽鎖Ｖ領域遺伝子を未免疫化ドナーから得られるＶドメイン遺伝子の天然起源のバリアント（レパートリー）のレパートリーに連続的に置き換えることにより、ファージディスプレイによって得られる「一次」ヒト抗体の親和性を改善することができる。この技法は、ｐＭ〜ｎＭ範囲内の親和性を有する抗体および抗体断片の産生を可能にする。非常に大型のファージ抗体レパートリー（「究極の（ｍｏｔｈｅｒ−ｏｆ−ａｌｌ）ライブラリー」としても公知）を作製するための戦略は、Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅら、Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２１巻：２２６５〜２２６６頁（１９９３年）に記載されている。遺伝子シャッフリングを使用して、齧歯類抗体からヒト抗体を派生させることもでき、このヒト抗体は、出発齧歯類抗体と同様の親和性および特異性を有する。「エピトープインプリンティング」とも称されるこの方法に従って、ファージディスプレイ技法によって得られる齧歯類抗体の重鎖または軽鎖Ｖドメイン遺伝子は、ヒトＶドメイン遺伝子のレパートリーに置き換えられ、齧歯類−ヒトキメラを作製する。抗原における選択は、機能的抗原結合部位を回復することができるヒト可変領域の単離をもたらす、すなわち、エピトープは、パートナーの選択を支配（インプリント）する。残る齧歯類Ｖドメインを置き換えるためにこの過程が反復されると、ヒト抗体が得られる（ＰＣＴ公開番号ＷＯ９３／０６２１３、１９９３年４月１日発表を参照）。ＣＤＲグラフトによる齧歯類抗体の伝統的なヒト化とは異なり、この技法は、齧歯類起源のフレームワークまたはＣＤＲ残基がない、完全ヒト抗体を提供する。
上述の考察は、ヒト化抗体に関係するが、述べられている一般原則は、例えば、イヌ、ネコ、霊長類、ウマおよびウシにおける使用のための抗体のカスタマイズに適用可能である。本明細書に記載されている抗体のヒト化の１種または複数の態様を、例えば、ＣＤＲグラフト、フレームワーク突然変異およびＣＤＲ突然変異と組み合わせることができることがさらに明らかである。
まず、宿主動物から抗体および抗体産生細胞を単離し、遺伝子配列を得て、遺伝子配列を使用して、宿主細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）において組換えにより抗体を発現させることにより、抗体を組換えにより作製することができる。用いることができる別の方法は、植物（例えば、タバコ）またはトランスジェニックミルクにおいて抗体配列を発現させることである。植物またはミルクにおいて組換えにより抗体を発現させるための方法が開示されている。例えば、Ｐｅｅｔｅｒｓら、Ｖａｃｃｉｎｅ １９巻：２７５６頁（２００１年）；ＬｏｎｂｅｒｇおよびＨｕｓｚａｒ、Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ １３巻：６５頁（１９９５年）；およびＰｏｌｌｏｃｋら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２３１巻：１４７頁（１９９９年）を参照されたい。抗体の誘導体、例えば、ヒト化、単鎖等を作製するための方法は、当技術分野で公知である。
イムノアッセイおよび蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）等のフローサイトメトリー選別技法を用いて、ＣＧＲＰに特異的な抗体を単離することもできる。
開示されている抗体は、多くの異なる担体に結合させることができる。担体は、活性および／または不活性であり得る。使用することができる周知の担体の例として、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、ガラス、天然および修飾セルロース、ポリアクリルアミド、アガロースおよびマグネタイトが挙げられるがこれらに限定されない。担体の性質は、本開示の目的のために可溶性または不溶性のいずれかであり得る。当業者であれば、抗体を結合するための他の適した担体が分かるであろう、またはルーチン実験法を使用してこれを確認することができるであろう。一部の実施形態では、担体は、心筋を標的化する部分を含む。
モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、従来の手順を使用して（例えば、モノクローナル抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用することにより）、容易に単離および配列決定することができる。ハイブリドーマ細胞は、かかるＤＮＡの好ましい供給源として機能する。単離されたら、ＤＮＡを発現ベクター（ＰＣＴ公開番号ＷＯ８７／０４４６２に開示されている発現ベクター等）中に配置し、次にこれを、この操作がなければ免疫グロブリンタンパク質を産生しないＥ．ｃｏｌｉ細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞またはミエローマ細胞等の宿主細胞にトランスフェクトして、組換え宿主細胞におけるモノクローナル抗体の合成を得ることができる。例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ８７／０４４６２を参照されたい。例えば、相同マウス配列の代わりにヒト重鎖および軽鎖定常ドメインのコード配列を置換することにより、Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．８１巻：６８５１頁（１９８４年）、または免疫グロブリンコード配列に、非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の全体または一部を共有結合により連結することにより、ＤＮＡを修飾することもできる。この様式で、本明細書における抗ＣＧＲＰモノクローナル抗体の結合特異性を有する「キメラ」または「ハイブリッド」抗体が調製される。
ＣＧＲＰの生物学的活性の低下、寛解または中和を検出および／または測定する当技術分野で公知の方法を使用して、抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体および抗体に由来するポリペプチドを同定または特徴付けることができる。例えば、抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体は、候補薬剤をＣＧＲＰと共にインキュベートし、次の特徴のうちいずれか１種または複数をモニターすることにより同定することもできる：（ａ）ＣＧＲＰに結合する；（ｂ）ＣＧＲＰがその受容体（複数可）に結合するのを遮断する；（ｃ）ＣＧＲＰ受容体活性化（ｃＡＭＰ活性化を含む）を遮断または減少させる；（ｄ）ＣＧＲＰの生物学的活性またはＣＧＲＰシグナリング機能によって媒介される下流経路を阻害する；（ｅ）頭痛（例えば、片頭痛）のいずれかの側面を予防、寛解または処置する；（ｆ）ＣＧＲＰのクリアランスを増加させる；および（ｇ）ＣＧＲＰ合成、産生または放出を阻害（低下）する。一部の実施形態では、抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体またはポリペプチドは、候補薬剤をＣＧＲＰと共にインキュベートし、ＣＧＲＰの結合および／またはその生物学的活性の付随する低下もしくは中和をモニターすることにより同定される。結合アッセイは、精製ＣＧＲＰポリペプチド（複数可）またはＣＧＲＰポリペプチド（複数可）を天然に発現するもしくはこれを発現するようにトランスフェクトされた細胞を用いて行うことができる。一実施形態では、結合アッセイは、ＣＧＲＰ結合に関して公知の抗ＣＧＲＰアンタゴニストと競合する候補抗体の能力が評価される競合的結合アッセイである。アッセイは、ＥＬＩＳＡ形式を含む様々な形式で行うことができる。他の実施形態では、抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体は、候補薬剤をＣＧＲＰと共にインキュベートし、細胞表面に発現されるＣＧＲＰ受容体活性化の結合および付随する阻害をモニターすることにより同定される。
初期同定後に、候補抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体の活性は、標的化された生物学的活性を検査することが公知のバイオアッセイによりさらに確認および緻密化することができる。あるいは、バイオアッセイを使用して、直接的に候補をスクリーニングすることができる。例えば、ＣＧＲＰは、応答性細胞におけるいくつかの測定可能な変化を促進する。それらには、細胞（例えば、ＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞）におけるｃＡＭＰの刺激が含まれるがこれに限定されない。ラット伏在神経の刺激によって誘導される皮膚血管拡張の測定等、動物モデルを使用して、アンタゴニスト活性を測定することもできる。Ｅｓｃｏｔｔら、Ｂｒ． Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１１０巻：７７２〜７７６頁、１９９３年。アンタゴニスト抗体またはポリペプチドの有効性を検査するために、頭痛（片頭痛等）の動物モデルをさらに使用することができる。Ｒｅｕｔｅｒら、Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ（１５巻）追補３号、２０００年。抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体またはポリペプチドを同定および特徴付けるための方法のいくつかは、実施例において詳細に記載されている。
抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体は、当技術分野で周知の方法を使用して特徴付けることができる。例えば、一方法は、それが結合するエピトープを同定することまたは「エピトープマッピング」である。例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９９年の第１１章に記載されている、抗体−抗原複合体の結晶構造の解析、競合アッセイ、遺伝子断片発現アッセイおよび合成ペプチドに基づくアッセイを含む、タンパク質におけるエピトープの位置をマッピングおよび特徴付けるための当技術分野で公知の多くの方法が存在する。追加的な例において、エピトープマッピングを使用して、抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体が結合する配列を決定することができる。エピトープマッピングは、様々な供給源、例えば、Ｐｅｐｓｃａｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｅｄｅｌｈｅｒｔｗｅｇ １５、８２１９ ＰＨ Ｌｅｌｙｓｔａｄ、Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）から市販されている。エピトープは、直鎖状エピトープであり得る、すなわち、単一のストレッチのアミノ酸に含有されるか、または単一のストレッチに必ずしも含有されていなくてもよいアミノ酸の三次元的相互作用により形成される立体構造エピトープであり得る。変動する長さ（例えば、少なくとも４〜６アミノ酸長）のペプチドを単離または合成（例えば、組換えにより）し、抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体による結合アッセイに使用することができる。別の例において、抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体が結合するエピトープは、ＣＧＲＰ配列に由来する重複ペプチドを使用し、抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体による結合を決定することにより、体系的スクリーニングにおいて決定することができる。遺伝子断片発現アッセイに従って、ＣＧＲＰをコードするオープンリーディングフレームは、ランダムに、または特異的遺伝的構築により断片化され、ＣＧＲＰの発現された断片と検査しようとする抗体との反応性が決定される。遺伝子断片を例えばＰＣＲによって産生し、次に、放射性アミノ酸の存在下でｉｎ ｖｉｔｒｏで転写および翻訳してタンパク質にすることができる。次に、免疫沈降およびゲル電気泳動により、放射標識されたＣＧＲＰ断片への抗体の結合が決定される。ファージ粒子の表面上に提示されたランダムペプチド配列の大型のライブラリー（ファージライブラリー）を使用することにより、ある特定のエピトープを同定することもできる。重複ペプチド断片の定義されたライブラリーは、単純な結合アッセイにおいて被験抗体への結合に関して検査することができる。追加的な例において、抗原結合ドメインの突然変異誘発、ドメイン取り替え実験およびアラニンスキャニング突然変異誘発を行って、エピトープ結合に要求される、十分なおよび／または必要な残基を同定することができる。例えば、ドメイン取り替え実験は、ＣＧＲＰポリペプチドの様々な断片が、密接に関係するが、抗原的に別個のタンパク質（ニューロトロフィンタンパク質ファミリーの別のメンバー等）由来の配列に置き換えられた（取り替えられた）突然変異体ＣＧＲＰを使用して行うことができる。突然変異体ＣＧＲＰへの抗体の結合を評価することにより、抗体結合に対する特定のＣＧＲＰ断片の重要性を評価することができる。
抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体を特徴付けるために使用することができるさらに別の方法は、同じ抗原、すなわち、ＣＧＲＰにおける様々な断片に結合することが公知の他の抗体との競合アッセイを使用して、抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体が、他の抗体と同じエピトープに結合するか決定することである。競合アッセイは、当業者に周知である。
発現ベクターを使用して、抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体の発現を方向付けることができる。当業者は、ｉｎ ｖｉｖｏで外来性タンパク質の発現を得るための発現ベクターの投与に精通している。例えば、米国特許第６，４３６，９０８号；同第６，４１３，９４２号；および同第６，３７６，４７１号を参照されたい。発現ベクターの投与は、注射、経口投与、パーティクルガンまたはカテーテル処置投与および外用投与を含む、局所的または全身性投与を含む。別の実施形態では、発現ベクターは、交感神経幹もしくは神経節に、または冠動脈、心房、心室（ｖｅｎｔｒｉｃａｌ）もしくは心膜内へと直接的に投与される。
発現ベクターまたはサブゲノムポリヌクレオチドを含有する治療用組成物の標的化送達を使用することもできる。受容体媒介性ＤＮＡ送達技法は、例えば、Ｆｉｎｄｅｉｓら、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９３年）１１巻：２０２頁；Ｃｈｉｏｕら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ： Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｏｆ Ｄｉｒｅｃｔ Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ（Ｊ．Ａ． Ｗｏｌｆｆ編）（１９９４年）；Ｗｕら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．（１９８８年）２６３巻：６２１頁；Ｗｕら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．（１９９４年）２６９巻：５４２頁；Ｚｅｎｋｅら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ（１９９０年）８７巻：３６５５頁；Ｗｕら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．（１９９１年）２６６巻：３３８頁に記載されている。ポリヌクレオチドを含有する治療用組成物は、遺伝子療法プロトコールにおける局所的投与のために、約１００ｎｇ〜約２００ｍｇのＤＮＡの範囲内で投与される。約５００ｎｇ〜約５０ｍｇ、約１μｇ〜約２ｍｇ、約５μｇ〜約５００μｇおよび約２０μｇ〜約１００μｇのＤＮＡの濃度範囲を遺伝子療法プロトコール中に使用することもできる。治療用ポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、遺伝子送達媒体を使用して送達することができる。遺伝子送達媒体は、ウイルスまたは非ウイルス起源のものであり得る（一般に、Ｊｏｌｌｙ、Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９４年）１巻：５１頁；Ｋｉｍｕｒａ、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９４年）５巻：８４５頁；Ｃｏｎｎｅｌｌｙ、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９５年）１巻：１８５頁；およびＫａｐｌｉｔｔ、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（１９９４年）６巻：１４８頁を参照）。内在性哺乳動物または異種プロモーターを使用して、かかるコード配列の発現を誘導することができる。コード配列の発現は、構成的であっても調節されてもよい。
所望のポリヌクレオチドの送達および所望の細胞における発現のためのウイルスに基づくベクターは、当技術分野で周知である。例示的なウイルスに基づく媒体として、組換えレトロウイルス（例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９０／０７９３６；ＷＯ９４／０３６２２；ＷＯ９３／２５６９８；ＷＯ９３／２５２３４；ＷＯ９３／１１２３０；ＷＯ９３／１０２１８；ＷＯ９１／０２８０５；米国特許第５，２１９，７４０号および同第４，７７７，１２７号；英国特許第２，２００，６５１号；ならびに欧州特許第０３４５２４２号を参照）、アルファウイルスに基づくベクター（例えば、シンドビスウイルスベクター、セムリキ森林ウイルス（ＡＴＣＣ ＶＲ−６７；ＡＴＣＣ ＶＲ−１２４７）、ロスリバーウイルス（ＡＴＣＣ ＶＲ−３７３；ＡＴＣＣ ＶＲ−１２４６）およびベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＡＴＣＣ ＶＲ−９２３；ＡＴＣＣ ＶＲ−１２５０；ＡＴＣＣ ＶＲ １２４９；ＡＴＣＣ ＶＲ−５３２））およびアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター（例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９４／１２６４９、ＷＯ９３／０３７６９；ＷＯ９３／１９１９１；ＷＯ９４／２８９３８；ＷＯ９５／１１９８４およびＷＯ９５／００６５５を参照）が挙げられるがこれらに限定されない。Ｃｕｒｉｅｌ、Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．（１９９２年）３巻：１４７頁に記載されている死滅させたアデノウイルスに連結されたＤＮＡの投与を用いることもできる。
非ウイルス送達媒体および方法を用いることもでき、その例として、死滅させたアデノウイルス単独に連結されたまたは連結されないポリカチオン性凝縮ＤＮＡ（例えば、Ｃｕｒｉｅｌ、Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．（１９９２年）３巻：１４７頁を参照）；リガンド連結されたＤＮＡ（例えば、Ｗｕ、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．（１９８９年）２６４巻：１６９８５頁を参照）；真核細胞送達媒体細胞（例えば、米国特許第５，８１４，４８２号；ＰＣＴ公開番号ＷＯ９５／０７９９４；ＷＯ９６／１７０７２；ＷＯ９５／３０７６３；およびＷＯ９７／４２３３８を参照）および核（ｎｕｃｌｅｉｃ）荷電中和または細胞膜との融合が挙げられるがこれらに限定されない。ネイキッドＤＮＡを用いることもできる。例示的なネイキッドＤＮＡ導入方法は、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９０／１１０９２および米国特許第５，５８０，８５９号に記載されている。遺伝子送達媒体として作用し得るリポソームは、米国特許第５，４２２，１２０号；ＰＣＴ公開番号ＷＯ９５／１３７９６；ＷＯ９４／２３６９７；ＷＯ９１／１４４４５；およびＥＰ０５２４９６８に記載されている。追加的なアプローチは、Ｐｈｉｌｉｐ、Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．（１９９４年）１４巻：２４１１頁およびＷｏｆｆｅｎｄｉｎ、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．（１９９４年）９１巻：１５８１頁に記載されている。
抗体Ｇ１および関連する抗体、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクターおよび宿主細胞
表６に示す抗体Ｇ１およびそのバリアントまたは表６に示す抗体Ｇ１およびそのバリアントに由来するポリペプチド；ならびにＧ１およびそのバリアントまたはポリペプチドをコードする配列を含むポリヌクレオチドを含む、医薬組成物を含む組成物が本明細書に開示されている。一部の実施形態では、本組成物は、ＣＧＲＰに結合する１種もしくは複数の抗体もしくはポリペプチド（抗体であってもそうでなくてもよい）、および／またはＣＧＲＰに結合する１種もしくは複数の抗体もしくはポリペプチドをコードする配列を含む１種もしくは複数のポリヌクレオチドを含む。このような組成物は、当技術分野で周知であるバッファーを含む薬学的に許容される賦形剤等、適した賦形剤をさらに含むことができる。
本開示の抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体およびポリペプチドは、次の特徴のうちいずれか（１種または複数）によって特徴付けられる：（ａ）ＣＧＲＰに結合する；（ｂ）ＣＧＲＰがその受容体（複数可）に結合するのを遮断する；（ｃ）ＣＧＲＰ受容体活性化（ｃＡＭＰ活性化を含む）を遮断または減少させる；（ｄ）ＣＧＲＰの生物学的活性またはＣＧＲＰシグナリング機能によって媒介される下流経路を阻害する；（ｅ）頭痛（例えば、片頭痛）のいずれかの側面を予防、寛解または処置する；（ｆ）ＣＧＲＰのクリアランスを増加させる；および（ｇ）ＣＧＲＰ合成、産生または放出を阻害（低下）する。
したがって、本開示は、次のうちいずれか、または次のうちいずれかを含む組成物（医薬組成物を含む）を提供する：（ａ）表６に示す抗体Ｇ１またはそのバリアント；（ｂ）表６に示す抗体Ｇ１またはそのバリアントの断片または領域；（ｃ）表６に示す抗体Ｇ１またはそのバリアントの軽鎖；（ｄ）表６に示す抗体Ｇ１またはそのバリアントの重鎖；（ｅ）表６に示す抗体Ｇ１またはそのバリアントの軽鎖および／または重鎖由来の１個または複数の可変領域；（ｆ）表６に示す抗体Ｇ１またはそのバリアントの１個または複数のＣＤＲ（１、２、３、４、５または６個のＣＤＲ）；（ｇ）抗体Ｇ１の重鎖由来のＣＤＲ Ｈ３；（ｈ）表６に示す抗体Ｇ１またはそのバリアントの軽鎖由来のＣＤＲ Ｌ３；（ｉ）表６に示す抗体Ｇ１またはそのバリアントの軽鎖由来の３個のＣＤＲ；（ｊ）表６に示す抗体Ｇ１またはそのバリアントの重鎖由来の３個のＣＤＲ；（ｋ）表６に示す抗体Ｇ１またはそのバリアントの軽鎖由来の３個のＣＤＲおよび重鎖由来の３個のＣＤＲ；ならびに（ｌ）（ｂ）〜（ｋ）のうちいずれか１つを含む抗体。本開示は、上述のうちいずれか１種または複数を含むポリペプチドも提供する。
抗体Ｇ１のＣＤＲ部分（ＣｈｏｔｈｉａおよびＫａｂａｔ ＣＤＲを含む）は、図５において図表で描写されている。ＣＤＲ領域の決定は、十分に当技術分野の技能範囲内にある。一部の実施形態では、ＣＤＲが、ＫａｂａｔおよびＣｈｏｔｈｉａ ＣＤＲの組合せ（「組み合わされたＣＤＲ」または「延長されたＣＤＲ」とも命名される）であり得ることが理解される。一部の実施形態では、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ ＣＤＲである。他の実施形態では、ＣＤＲは、Ｃｈｏｔｈｉａ ＣＤＲである。言い換えると、２個以上のＣＤＲによる実施形態では、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、組合せＣＤＲまたはこれらの組合せのいずれかであり得る。
一部の実施形態では、本開示は、表６に示すＧ１またはそのバリアントの少なくとも１個のＣＤＲ、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５または全６個のＣＤＲと実質的に同一である、少なくとも１個のＣＤＲ、少なくとも２、少なくとも３または少なくとも４、少なくとも５または全６個のＣＤＲを含むポリペプチド（抗体であってもそうでなくてもよい）を提供する。他の実施形態は、Ｇ１のまたはＧ１に由来する少なくとも２、３、４、５または６個のＣＤＲと実質的に同一である、少なくとも２、３、４、５または６個のＣＤＲを有する抗体を含む。一部の実施形態では、少なくとも１、２、３、４、５または６個のＣＤＲは、表６に示すＧ１またはそのバリアントの少なくとも１、２、３、４、５または６個のＣＤＲと少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である。本開示の目的のため、活性の程度は、表６に示すＧ１またはそのバリアントと比較して変動し得る（より大きくまたは小さくなり得る）が、結合特異性および／または全体的活性が一般に保持されることが理解される。
本開示は、次のうちいずれかを有する表６に示すＧ１またはそのバリアントのアミノ酸配列を含むポリペプチド（抗体であってもそうでなくてもよい）も提供する：表６に示すＧ１またはそのバリアントの配列の少なくとも５個の連続するアミノ酸、少なくとも８個の連続するアミノ酸、少なくとも約１０個の連続するアミノ酸、少なくとも約１５個の連続するアミノ酸、少なくとも約２０個の連続するアミノ酸、少なくとも約２５個の連続するアミノ酸、少なくとも約３０個の連続するアミノ酸であって、アミノ酸のうち少なくとも３個は、表６に示すＧ１（図５）またはそのバリアントの可変領域に由来する。一実施形態では、可変領域は、Ｇ１の軽鎖に由来する。別の実施形態では、可変領域は、Ｇ１の重鎖に由来する。例示的なポリペプチドは、Ｇ１の重鎖および軽鎖可変領域の両方に由来する連続するアミノ酸（上述の長さ）を有する。別の実施形態では、５個の（またはそれを超える）連続するアミノ酸は、図５に示すＧ１の相補性決定領域（ＣＤＲ）に由来する。一部の実施形態では、連続するアミノ酸は、Ｇ１の可変領域に由来する。
ＣＧＲＰ（ヒトα−ＣＧＲＰ等）に対する抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体およびポリペプチドの結合親和性（ＫＤ）は、一部の例において、約０．０６〜約２００ｎＭであり得る。一部の実施形態では、結合親和性は、約２００ｎＭ、１００ｎＭ、約５０ｎＭ、約１０ｎＭ、約１ｎＭ、約５００ｐＭ、約１００ｐＭ、約６０ｐＭ、約５０ｐＭ、約２０ｐＭ、約１５ｐＭ、約１０ｐＭ、約５ｐＭまたは約２ｐＭのいずれかである。一部の実施形態では、結合親和性は、約２５０ｎＭ、約２００ｎＭ、約１００ｎＭ、約５０ｎＭ、約１０ｎＭ、約１ｎＭ、約５００ｐＭ、約１００ｐＭまたは約５０ｐＭのいずれか未満である。
本開示は、これらの抗体またはポリペプチドのいずれかを作製する方法も提供する。抗体は、当技術分野で公知の手順によって作製することができる。ポリペプチドは、抗体のタンパク質分解もしくは他の分解により、上述の組換え方法（すなわち、単一または融合ポリペプチド）により、または化学合成により産生することができる。抗体のポリペプチド、特に、最大約５０アミノ酸のより短いポリペプチドは、化学合成によって簡便に作製される。化学合成の方法は、当技術分野で公知であり、市販されている。例えば、抗体は、固相方法を用いる自動ポリペプチド合成機によって産生することができる。米国特許第５，８０７，７１５号；同第４，８１６，５６７号；および同第６，３３１，４１５号も参照されたい。
一部の実施形態では、抗体は、当技術分野で周知の手順を使用して、組換えにより作製することができる。一実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号９および配列番号１０に示す抗体Ｇ１の重鎖および／または軽鎖可変領域をコードする配列を含む。別の実施形態では、配列番号９および配列番号１０に示すヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドは、発現または繁殖のための１種または複数のベクターにクローニングされる。目的の抗体をコードする配列を宿主細胞中のベクターにおいて維持することができ、次に宿主細胞を拡大増殖させ、将来的な使用のために凍結することができる。ベクター（発現ベクターを含む）および宿主細胞は、本明細書にさらに記載されている。
本開示は、Ｇ１等、本開示の抗体の単鎖可変領域断片（「ｓｃＦｖ」）も包含する。単鎖可変領域断片は、典型的には、短い連結ペプチドを使用して軽鎖および／または重鎖可変領域を連結することにより作製される。Ｂｉｒｄら（１９８８年）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２巻：４２３〜４２６頁。連結ペプチドの例は、一方の可変領域のカルボキシ末端および他方の可変領域のアミノ末端の間のおよそ３．５ｎｍを架橋する（ＧＧＧＧＳ）３（配列番号５７）である。他の配列のリンカーが設計および使用されている。Ｂｉｒｄら（１９８８年）。続いて、リンカーは、薬物の取り付けまたは固体支持体への取り付け等、追加的な機能のために修飾することができる。単鎖バリアントは、組換えまたは合成のいずれかにより産生することができる。ｓｃＦｖの合成産生のため、自動合成機を使用することができる。ｓｃＦｖの組換え産生のため、ｓｃＦｖをコードするポリヌクレオチドを含有する適したプラスミドを、酵母、植物、昆虫もしくは哺乳動物細胞等の真核生物またはＥ．ｃｏｌｉ等の原核生物のいずれかの、適した宿主細胞に導入することができる。目的のｓｃＦｖをコードするポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドのライゲーション等、ルーチン操作によって作製することができる。得られたｓｃＦｖは、当技術分野で公知の標準タンパク質精製技法を使用して単離することができる。
ダイアボディ等、他の形態の単鎖抗体も包含される。ダイアボディは、二価二特異的抗体であり、この抗体は、単一のポリペプチド鎖においてＶＨおよびＶＬドメインが発現されるが、同じ鎖における２個のドメインの間を対形成させるには短すぎるリンカーを使用し、それによってこのドメインを別の鎖の相補的ドメインと対形成させ、２個の抗原結合部位を生成する（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒら（１９９３年）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０巻：６４４４〜６４４８頁；Ｐｏｌｊａｋら（１９９４年）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ２巻：１１２１〜１１２３頁を参照）。
例えば、少なくとも２種の異なる抗原に対する結合特異性を有するモノクローナル抗体である二特異的抗体は、本明細書に開示されている抗体を使用して調製することができる。二特異的抗体を作製するための方法は、当技術分野で公知である（例えば、Ｓｕｒｅｓｈら、１９８６年、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １２１巻：２１０頁を参照）。伝統的には、二特異的抗体の組換え産生は、２個の重鎖が異なる特異性を有する２個の免疫グロブリン重鎖−軽鎖ペアの同時発現に基づいた（ＭｉｌｌｓｔｅｉｎおよびＣｕｅｌｌｏ、１９８３年、Ｎａｔｕｒｅ ３０５巻、５３７〜５３９頁）。
二特異的抗体を作製する１つのアプローチによると、所望の結合特異性を有する抗体可変ドメイン（抗体−抗原結合部位）は、免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合される。融合体は、好ましくは、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領域の少なくとも一部を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインを有する。一例において、軽鎖結合に必要な部位を含有する第１の重鎖定常領域（ＣＨ１）は、融合体の少なくとも１種に存在する。免疫グロブリン重鎖融合体および必要に応じて免疫グロブリン軽鎖をコードするＤＮＡは、別々の発現ベクターに挿入され、適した宿主生物にコトランスフェクトされる。これは、構築において使用される３種のポリペプチド鎖の不均等な比が最適な収量をもたらす実施形態において、３種のポリペプチド断片の相互割合の調整において優れた柔軟性をもたらす。しかし、等しい比の少なくとも２種のポリペプチド鎖の発現が高収量をもたらす場合、または比が特に有意ではない場合、２または全３種のポリペプチド鎖のコード配列を１種の発現ベクターに挿入することが可能である。
１つのアプローチにおいて、二特異的抗体は、一方の腕に第１の結合特異性を有するハイブリッド免疫グロブリン重鎖、および他方の腕におけるハイブリッド免疫グロブリン重鎖−軽鎖ペア（第２の結合特異性をもたらす）で構成される。二特異的分子の半分側にのみ免疫グロブリン軽鎖を有するこの非対称構造は、望まれない免疫グロブリン鎖組合せからの所望の二特異的化合物の分離を容易にする。このアプローチは、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９４／０４６９０、１９９４年３月３日に発表に記載されている。
２個の共有結合により連結された抗体を含むヘテロコンジュゲート抗体も、本開示の範囲内である。かかる抗体は、望まれない細胞に免疫系細胞を標的化するため（米国特許第４，６７６，９８０号）およびＨＩＶ感染の処置のため（ＰＣＴ出願公開番号ＷＯ９１／００３６０およびＷＯ９２／２００３７３；ＥＰ０３０８９）に使用されてきた。ヘテロコンジュゲート抗体は、いずれか簡便な架橋方法を使用して作製することができる。適した架橋剤および技法は、当技術分野で周知であり、米国特許第４，６７６，９８０号に記載されている。
キメラまたはハイブリッド抗体は、架橋剤を含む方法を含む、合成タンパク質化学の公知方法を使用してｉｎ ｖｉｔｒｏで調製することもできる。例えば、免疫毒素は、ジスルフィド交換反応を使用して、またはチオエーテル結合を形成することにより構築することができる。この目的に適した試薬の例として、イミノチオレートおよびメチル−４−メルカプトブチルイミデートが挙げられる。
表６に示す抗体Ｇ１もしくはそのバリアントの１個もしくは複数のＣＤＲまたは表６に示す抗体Ｇ１もしくはそのバリアントに由来する１個もしくは複数のＣＤＲを含むヒト化抗体は、当技術分野で公知のいずれかの方法を使用して作製することができる。例えば、４つの一般的ステップを使用して、モノクローナル抗体をヒト化することができる。
本開示は、その特性に有意に影響しない機能的に均等な抗体ならびに増強または減少した活性および／または親和性を有するバリアントを含む、表６に示す抗体Ｇ１またはそのバリアントに対する修飾を包含する。例えば、表６に示す抗体Ｇ１またはそのバリアントのアミノ酸配列を突然変異させて、ＣＧＲＰに対し所望の結合親和性を有する抗体を得ることができる。ポリペプチドの修飾は、当技術分野におけるルーチン実務であり、本明細書に詳細に記載する必要はない。ポリペプチドの修飾は、実施例に例証されている。修飾されたポリペプチドの例として、アミノ酸残基の保存的置換、機能活性を有意に有害に変化させないアミノ酸の１個もしくは複数の欠失もしくは付加、または化学的類似体の使用を有するポリペプチドが挙げられる。
アミノ酸配列挿入は、１残基〜百またはそれを超える残基を含有するポリペプチドに及ぶ長さのアミノおよび／またはカルボキシル末端融合、ならびに単一または複数のアミノ酸残基の配列内挿入を含む。末端挿入の例として、Ｎ末端メチオニル残基を有する抗体またはエピトープタグに融合された抗体が挙げられる。抗体分子の他の挿入バリアントは、酵素の抗体または抗体の血清半減期を増加させるポリペプチドのＮまたはＣ末端への融合を含む。
置換バリアントは、抗体分子における少なくとも１個のアミノ酸残基を除去され、その位置に異なる残基が挿入される。置換突然変異誘発にとって最も関心がある部位は、高頻度可変領域を含むが、ＦＲ変更も企図される。保存的置換は、表１において「保存的置換」の見出しの下に示す。かかる置換が、生物学的活性に変化を生じる場合、表１における「例示的な置換」と命名されるまたはアミノ酸クラスを参照してさらに後述する、より実質的な変化を導入して、産物をスクリーニングすることができる。
抗体の生物学的特性における実質的な修飾は、（ａ）例えば、シートもしくはヘリックス立体構造としての、置換の区域におけるポリペプチド骨格の構造、（ｂ）標的部位における分子の電荷もしくは疎水性、または（ｃ）側鎖の容積の維持におけるその効果が有意に異なる置換を選択することにより達成される。天然起源の残基は、共通側鎖特性に基づく群に分けられる：
（１）非極性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
（２）電荷なしの極性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
（３）酸性（負電荷を持つ）：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性（正電荷を持つ）：Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）鎖の配向性に影響を与える残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；および
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｈｉｓ。
非保存的置換は、これらのクラスのうち１つのメンバーを別のクラスと交換することにより為される。
抗体の適切な立体構造の維持に関与しないいずれかのシステイン残基を一般にセリンに置換して、分子の酸化的安定性を改善し、異常な架橋を予防することもできる。逆に、特に、抗体が、Ｆｖ断片等、抗体断片である場合、システイン結合（複数可）を抗体に加えて、その安定性を改善することができる。
アミノ酸修飾は、１個または複数のアミノ酸の変化または修飾から、可変領域等の領域の完全な再設計までに及び得る。可変領域の変化は、結合親和性および／または特異性を変更することができる。一部の実施形態では、１〜５個以下の保存的アミノ酸置換が、ＣＤＲドメイン内に為される。他の実施形態では、１〜３個以下の保存的アミノ酸置換が、ＣＤＲドメイン内に為される。さらに他の実施形態では、ＣＤＲドメインは、ＣＤＲ Ｈ３および／またはＣＤＲ Ｌ３である。
修飾は、グリコシル化および非グリコシル化ポリペプチド、ならびに例えば、異なる糖によるグリコシル化、アセチル化およびリン酸化等、他の翻訳後修飾を有するポリペプチドも含む。抗体は、その定常領域における保存された位置でグリコシル化される（ＪｅｆｆｅｒｉｓおよびＬｕｎｄ、１９９７年、Ｃｈｅｍ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．６５巻：１１１〜１２８頁；ＷｒｉｇｈｔおよびＭｏｒｒｉｓｏｎ、１９９７年、ＴｉｂＴＥＣＨ １５巻：２６〜３２頁）。免疫グロブリンのオリゴ糖側鎖は、タンパク質の機能（Ｂｏｙｄら、１９９６年、Ｍｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．３２巻：１３１１〜１３１８頁；ＷｉｔｔｗｅおよびＨｏｗａｒｄ、１９９０年、Ｂｉｏｃｈｅｍ．２９巻：４１７５〜４１８０頁）ならびに立体構造に影響し得る糖タンパク質の部分および糖タンパク質の提示されている三次元表面の間の分子内相互作用（ＨｅｆｆｅｒｉｓおよびＬｕｎｄ、上記参照；ＷｙｓｓおよびＷａｇｎｅｒ、１９９６年、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈ．７巻：４０９〜４１６頁）に影響する。オリゴ糖は、特異的な認識構造に基づき、ある特定の分子に所与の糖タンパク質を標的化するように機能することもできる。抗体のグリコシル化は、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）に影響することも報告された。特に、二分ＧｌｃＮＡｃの形成を触媒するグリコシルトランスフェラーゼであるβ（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素ＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ）のテトラサイクリン調節発現を有するＣＨＯ細胞は、改善されたＡＤＣＣ活性を有することが報告された（Ｕｍａｎａら、１９９９年、Ｍａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１７巻：１７６〜１８０頁）。
抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体等、抗体のグリコシル化は、典型的に、Ｎ結合型またはＯ結合型のいずれかである。Ｎ結合型は、アスパラギン残基の側鎖への糖鎖の取り付けを指す。トリペプチド配列、アスパラギン−Ｘ−セリン、アスパラギン−Ｘ−スレオニンおよびアスパラギン−Ｘ−システイン（式中、Ｘは、プロリンを除くいずれかのアミノ酸である）は、アスパラギン側鎖への糖鎖の酵素による取り付けのための認識配列である。よって、ポリペプチドにおけるこれらのトリペプチド配列のいずれかの存在は、潜在的なグリコシル化部位を作製する。Ｏ結合型グリコシル化は、最も一般的にはセリンまたはスレオニンであるが、５−ヒドロキシプロリンまたは５−ヒドロキシリシンを使用してもよいヒドロキシアミノ酸への糖、Ｎ−アセチルガラクトサミン、ガラクトースまたはキシロースのうち１種の取り付けを指す。
抗体へのグリコシル化部位の付加は、上述のトリペプチド配列のうち１種または複数を含有するように、アミノ酸配列を変更することにより簡便に達成される（Ｎ結合型グリコシル化部位のための）。変更は、本来の抗体の配列への１個または複数のセリンまたはスレオニン残基の付加またはこれによる置換によって為すこともできる（Ｏ結合型グリコシル化部位のため）。
根底にあるヌクレオチド配列を変更することなく、抗体のグリコシル化パターンを変更することもできる。グリコシル化は、大部分は、抗体の発現に使用される宿主細胞に依存する。潜在的な治療薬としての組換え糖タンパク質、例えば、抗体の発現に使用される細胞型は、ネイティブ細胞であることはめったにないため、抗体のグリコシル化パターンにおける変種を予想することができる（例えば、Ｈｓｅら、１９９７年、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．２７２巻：９０６２〜９０７０頁を参照）。
宿主細胞の選択に加えて、抗体の組換え産生中のグリコシル化に影響する因子は、成長様式、培地製剤、培養密度、酸素添加、ｐＨ、精製スキームその他を含む。オリゴ糖産生に関与するある特定の酵素の導入または過剰発現を含む、特定の宿主生物において達成されるグリコシル化パターンを変更するための様々な方法が提案された（米国特許第５，０４７，３３５号；同第５，５１０，２６１号および同第５．２７８，２９９号）。グリコシル化またはある種のグリコシル化は、例えば、エンドグリコシダーゼＨ（Ｅｎｄｏ Ｈ）、Ｎ−グリコシダーゼＦ、エンドグリコシダーゼＦ１、エンドグリコシダーゼＦ２、エンドグリコシダーゼＦ３を使用して、糖タンパク質から酵素により除去することができる。加えて、組換え宿主細胞は、ある種の多糖のプロセシングを欠損するように遺伝子操作することができる。上述および同様の技法は、当技術分野で周知である。
他の修飾方法は、酵素的手段、酸化的置換およびキレート化が挙げられるがこれらに限定されない、当技術分野で公知のカップリング技法の使用を含む。修飾は、例えば、イムノアッセイのための標識の取り付けに使用することができる。修飾されたＧ１ポリペプチドは、当技術分野で確立された手順を使用して作製され、その一部を後述および実施例に記載する当技術分野で公知の標準アッセイを使用してスクリーニングすることができる。
一部の実施形態では、抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体は、免疫学的に不活性または部分的に不活性である、例えば、補体媒介性溶解を誘引しない、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を刺激しない、またはミクログリアを活性化しない；あるいは次のうちいずれか１種または複数：補体媒介性溶解の誘引、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）の刺激またはミクログリアの活性化において低下した活性（非修飾抗体と比較して）を有する定常領域等の修飾された定常領域を含む。定常領域の異なる修飾を使用して、エフェクター機能の最適レベルおよび／または組合せを達成することができる。例えば、Ｍｏｒｇａｎら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ８６巻：３１９〜３２４頁（１９９５年）；Ｌｕｎｄら、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １５７巻：４９６３〜９頁、１５７巻：４９６３〜４９６９頁（１９９６年）；Ｉｄｕｓｏｇｉｅら、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １６４巻：４１７８〜４１８４頁（２０００年）；Ｔａｏら、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １４３巻：２５９５〜２６０１頁（１９８９年）；およびＪｅｆｆｅｒｉｓら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ １６３巻：５９〜７６頁（１９９８年）を参照されたい。一部の実施形態では、定常領域は、Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９９年）２９巻：２６１３〜２６２４頁；ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＧＢ９９／０１４４１；および／または英国特許出願第９８０９９５１．８号に記載されている通りに修飾される。他の実施形態では、抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体は、次の突然変異を含むヒト重鎖ＩｇＧ２定常領域を含む：Ａ３３０Ｐ３３１からＳ３３０Ｓ３３１（野生型ＩｇＧ２配列を参照したアミノ酸ナンバリング）。Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９９年）２９巻：２６１３〜２６２４頁。さらに他の実施形態では、定常領域は、Ｎ結合型グリコシル化に関して脱グリコシル化される。一部の実施形態では、定常領域は、グリコシル化されるアミノ酸残基または定常領域におけるＮ−グリコシル化認識配列の一部である隣接する残基を突然変異させることにより、Ｎ結合型グリコシル化に関して脱グリコシル化される。例えば、Ｎ−グリコシル化部位Ｎ２９７は、Ａ、Ｑ、ＫまたはＨに突然変異させることができる。Ｔａｏら、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １４３巻：２５９５〜２６０１頁（１９８９年）；およびＪｅｆｆｅｒｉｓら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ １６３巻：５９〜７６頁（１９９８年）を参照されたい。一部の実施形態では、定常領域は、Ｎ結合型グリコシル化に関して脱グリコシル化される。定常領域は、Ｎ結合型グリコシル化に関して酵素により（酵素ＰＮＧａｓｅによる炭水化物の除去等）またはグリコシル化欠損宿主細胞における発現により脱グリコシル化することができる。
他の抗体修飾は、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９９／５８５７２、１９９９年１１月１８日に発表に記載されている通りに修飾された抗体を含む。このような抗体は、標的分子において方向付けられた結合ドメインに加えて、ヒト免疫グロブリン重鎖の定常ドメインの全体または一部と実質的に相同なアミノ酸配列を有するエフェクタードメインを含むことができる。このような抗体は、標的の有意な補体依存性溶解または細胞媒介性破壊を誘引することなく、標的分子に結合することができる。一部の実施形態では、エフェクタードメインは、ＦｃＲｎおよび／またはＦｃγＲＩＩｂに特異的に結合することができる。これらは典型的には、２種またはそれを超えるヒト免疫グロブリン重鎖ＣＨ２ドメインに由来するキメラドメインに基づく。この様式で修飾された抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体等の抗体は、従来の抗体療法に対する炎症および他の有害反応を回避するための、慢性抗体療法における使用に特に適している。
本開示は、親和性成熟された実施形態を含む。例えば、親和性成熟された抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体は、当技術分野で公知の手順によって産生することができる（Ｍａｒｋｓら、１９９２年、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１０巻：７７９〜７８３頁；Ｂａｒｂａｓら、１９９４年、Ｐｒｏｃ Ｎａｔ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ， ＵＳＡ ９１巻：３８０９〜３８１３頁；Ｓｃｈｉｅｒら、１９９５年、Ｇｅｎｅ、１６９巻：１４７〜１５５頁；Ｙｅｌｔｏｎら、１９９５年、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５５巻：１９９４〜２００４頁；Ｊａｃｋｓｏｎら、１９９５年、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５４巻（７号）：３３１０〜９頁；Ｈａｗｋｉｎｓら、１９９２年、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、２２６巻：８８９〜８９６頁；およびＷＯ２００４／０５８１８４）。
次の方法は、抗体、抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体の親和性を調整し、ＣＤＲを特徴付けるために使用することができる。抗体のＣＤＲを特徴付けるおよび／または抗体等のポリペプチドの結合親和性を変更する（改善する等）１つの仕方は、「ライブラリースキャニング突然変異誘発」と命名される。一般に、ライブラリースキャニング突然変異誘発は、次の通りに機能する。当技術分野で認識されている方法を使用して、ＣＤＲにおける１個または複数のアミノ酸位置を、２種またはそれを超える（３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０種等）アミノ酸に置き換える。これは、クローンの小型のライブラリーを作製し（一部の実施形態では、解析される全アミノ酸位置に対し１種）、それぞれ、２種またはそれを超えるメンバーの複雑性を有する（全位置において２種またはそれを超えるアミノ酸が置換される場合）。一般に、ライブラリーは、ネイティブ（非置換）アミノ酸を含むクローンも含む。各ライブラリーから少数のクローン、例えば、約２０〜８０クローン（ライブラリーの複雑性に依存する）が、標的ポリペプチド（または他の結合標的）に対する結合親和性に関してスクリーニングされ、結合が増加した、同じ、減少したまたは結合なしの候補が同定される。結合親和性を決定するための方法は、当技術分野で周知である。結合親和性は、約２倍またはそれを超える結合親和性の差を検出する、Ｂｉａｃｏｒｅ表面プラズモン共鳴解析を使用して決定することができる。出発抗体が既に、相対的に高い親和性、例えば、約１０ｎＭまたはそれより低いＫＤで結合した場合、Ｂｉａｃｏｒｅは特に有用である。Ｂｉａｃｏｒｅ表面プラズモン共鳴を使用したスクリーニングは、本明細書の実施例に記載されている。
結合親和性は、Ｋｉｎｅｘａ Ｂｉｏｃｅｎｓｏｒ、シンチレーション近接アッセイ、ＥＬＩＳＡ、ＯＲＩＧＥＮイムノアッセイ（ＩＧＥＮ）、蛍光クエンチング、蛍光移動および／または酵母ディスプレイを使用して決定することができる。結合親和性は、適したバイオアッセイを使用してスクリーニングすることもできる。
一部の実施形態では、当技術分野で認識されている突然変異誘発方法（その一部は本明細書に記載されている）を使用して、ＣＤＲにおける全アミノ酸位置が、全２０種の天然アミノ酸に置き換えられる（一部の実施形態では、一度に１個）。これは、クローンの小型のライブラリーを作製し（一部の実施形態では、解析される全アミノ酸位置に対し１種）、それぞれが、２０種のメンバーの複雑性を有する（全位置において全２０種のアミノ酸が置換される場合）。
一部の実施形態では、スクリーニングしようとするライブラリーは、同じＣＤＲまたは２個もしくはそれを超えるＣＤＲに存在し得る、２個またはそれを超える位置における置換を含む。よって、ライブラリーは、１個のＣＤＲにおける２個またはそれを超える位置における置換を含むことができる。ライブラリーは、２個またはそれを超えるＣＤＲにおける２個またはそれを超える位置における置換を含むことができる。ライブラリーは、３、４、５個またはそれを超える位置における置換を含むことができ、前記位置は、２、３、４、５または６個のＣＤＲに存在する。置換は、低冗長性コドンを使用して調製することができる。例えば、Ｂａｌｉｎｔら（１９９３年）Ｇｅｎｅ １３７巻（１号）：１０９〜１８頁の表２を参照されたい。
ＣＤＲは、ＣＤＲＨ３および／またはＣＤＲＬ３であり得る。ＣＤＲは、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２および／またはＣＤＲＨ３のうち１種または複数であり得る。ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ ＣＤＲ、Ｃｈｏｔｈｉａ ＣＤＲまたは延長されたＣＤＲであり得る。
改善された結合を有する候補を配列決定し、これにより、改善された親和性をもたらすＣＤＲ置換突然変異体を同定することができる（「改善された」置換とも命名される）。結合する候補を配列決定し、これにより、結合を保持するＣＤＲ置換を同定することもできる。
複数ラウンドのスクリーニングを行うことができる。例えば、改善された結合を有する候補（それぞれ、１個または複数のＣＤＲの１個または複数の位置にアミノ酸置換を含む）は、改善されたＣＤＲ位置（すなわち、置換突然変異体が改善された結合を示したＣＤＲにおけるアミノ酸位置）のそれぞれに少なくとも本来のおよび置換されたアミノ酸を含有する、第２のライブラリーの設計にも有用である。このライブラリーの調製およびスクリーニングまたは選択についてさらに後述する。
改善された結合、同じ結合、減少した結合または結合なしのクローンの頻度が、抗体−抗原複合体の安定性に対する各アミノ酸位置の重要性に関する情報も提供する限りにおいて、ライブラリースキャニング突然変異誘発は、ＣＤＲを特徴付けるための手段も提供する。例えば、ＣＤＲの位置が、全２０種のアミノ酸に変化させた場合に結合を保持する場合、該位置は、抗原結合に必要とされる可能性が低い位置として同定される。逆に、ＣＤＲの位置が、ごくわずかなパーセンテージの置換において結合を保持する場合、該位置は、ＣＤＲ機能に重要な位置として同定される。よって、ライブラリースキャニング突然変異誘発方法は、多くの異なるアミノ酸（全２０種のアミノ酸を含む）に変化させることができるＣＤＲにおける位置および変化させることができないまたはいくつかのアミノ酸にしか変化させることができないＣＤＲにおける位置に関する情報を生じる。
改善された親和性を有する候補は、所望のスクリーニングまたは選択方法を使用して、該位置に改善されたアミノ酸、本来のアミノ酸を含み、望まれるまたは許されるライブラリーの複雑性に応じて、該位置に追加的な置換をさらに含むことができる第２のライブラリーにおいて組み合わせることができる。加えて、必要に応じて、隣接するアミノ酸位置は、少なくとも２種またはそれを超えるアミノ酸にランダム化することができる。隣接するアミノ酸のランダム化は、突然変異体ＣＤＲにおける追加的な立体構造上の可動性を可能にすることができ、これは続いて、より多数の改善突然変異の導入を可能にまたは容易にすることができる。ライブラリーは、スクリーニングの第１ラウンドにおいて改善された親和性を示さなかった位置に置換（複数可）を含むこともできる。
Ｂｉａｃｏｒｅ表面プラズモン共鳴解析を使用したスクリーニング、ならびにファージディスプレイ、酵母ディスプレイおよびリボソームディスプレイを含む選択のための当技術分野で公知のいずれかの方法を使用した選択を含む、当技術分野で公知のいずれかの方法を使用して、第２のライブラリーは、改善および／または変更された結合親和性を有するライブラリーメンバーに関してスクリーニングまたは選択される。
本開示は、本開示の抗体（Ｇ１等）またはポリペプチド由来の１種または複数の断片または領域を含む融合タンパク質も包含する。一実施形態では、配列番号２（図５）に示す可変軽鎖領域の少なくとも１０個の連続するアミノ酸および／または配列番号１（図５）に示す可変重鎖領域の少なくとも１０個のアミノ酸を含む融合ポリペプチドが提供される。他の実施形態では、配列番号２（図５）に示す可変軽鎖領域の少なくとも約１０、少なくとも約１５、少なくとも約２０、少なくとも約２５もしくは少なくとも約３０個の連続するアミノ酸、および／または配列番号１（図５）に示す可変重鎖領域の少なくとも約１０、少なくとも約１５、少なくとも約２０、少なくとも約２５もしくは少なくとも約３０個の連続するアミノ酸を含む融合ポリペプチドが提供される。別の実施形態では、融合ポリペプチドは、図５の配列番号２および配列番号１に示すＧ１の軽鎖可変領域および／または重鎖可変領域を含む。別の実施形態では、融合ポリペプチドは、Ｇ１の１種または複数のＣＤＲを含む。さらに他の実施形態では、融合ポリペプチドは、抗体Ｇ１のＣＤＲ Ｈ３および／またはＣＤＲ Ｌ３を含む。本開示の目的のため、Ｇ１融合タンパク質は、１種または複数のＧ１抗体と、これがネイティブ分子においては取り付けられてない別のアミノ酸配列、例えば、別の領域由来の異種配列または相同配列とを含有する。例示的な異種配列として、ＦＬＡＧタグまたは６Ｈｉｓタグ（配列番号５６）等、「タグ」が挙げられるがこれらに限定されない。タグは、当技術分野で周知である。
Ｇ１融合ポリペプチドは、当技術分野で公知の方法によって、例えば、合成または組換えにより作製することができる。典型的には、本開示のＧ１融合タンパク質は、本明細書に記載されている組換え方法を使用して、これをコードするポリヌクレオチドの発現を調製することにより作製されるが、例えば、化学合成を含む当技術分野で公知の他の手段によって調製することもできる。
本開示は、固体支持体へのカップリングを容易にする薬剤（ビオチンまたはアビジン等）にコンジュゲート（例えば、連結）された、Ｇ１に由来する抗体またはポリペプチドを含む組成物も提供する。簡潔にするため、これらの方法が、本明細書に記載されているＣＧＲＰ結合実施形態のいずれかに当てはまるという理解により、一般に、Ｇ１または抗体に関する参照が為されるであろう。コンジュゲーションは、一般に、本明細書に記載されているこれらの構成成分の連結を指す。連結（一般に、少なくとも投与のための近接した関係性でのこれらの構成成分の固定）は、あらゆる仕方で達成することができる。例えば、それぞれが、相手と反応することができる置換基を保有する場合、薬剤および抗体の間の直接的な反応が可能である。例えば、一方におけるアミノまたはスルフヒドリル基等の求核基は、他方における無水物もしくは酸ハロゲン化物等のカルボニル含有基または優れた脱離基を含有するアルキル基（例えば、ハロゲン化物）と反応することができる。
本開示の抗体またはポリペプチドは、蛍光分子、放射性分子、酵素、ハプテン、化学発光分子または当技術分野で公知の他のいずれかの標識等、標識剤（あるいは「標識」と命名される）に連結することができる。シグナルを一般に生じる（直接的にまたは間接的に）標識が当技術分野で公知である。
本開示は、抗体Ｇ１、ならびに本明細書に記載されている抗体（例えば、抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体）および／またはポリペプチドのうちいずれか１種または複数（または全種）を含む組成物（医薬組成物を含む）およびキットも提供する。
本開示は、抗体およびポリペプチド（図５に示す軽鎖および重鎖可変領域のポリペプチド配列を含む抗体を含む）をコードする単離されたポリヌクレオチド、ならびに該ポリヌクレオチドを含むベクターおよび宿主細胞も提供する。
したがって、本開示は、次のうちいずれかをコードするポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド（または医薬組成物を含む組成物）を提供する：（ａ）表６に示す抗体Ｇ１またはそのバリアント；（ｂ）表６に示す抗体Ｇ１またはそのバリアントの断片または領域；（ｃ）表６に示す抗体Ｇ１またはそのバリアントの軽鎖；（ｄ）表６に示す抗体Ｇ１またはそのバリアントの重鎖；（ｅ）表６に示す抗体Ｇ１またはそのバリアントの軽鎖および／または重鎖由来の１個または複数の可変領域；（ｆ）表６に示す抗体Ｇ１またはそのバリアントの１個または複数のＣＤＲ（１、２、３、４、５または６個のＣＤＲ）；（ｇ）抗体Ｇ１の重鎖由来のＣＤＲ Ｈ３；（ｈ）表６に示す抗体Ｇ１またはそのバリアントの軽鎖由来のＣＤＲ Ｌ３；（ｉ）表６に示す抗体Ｇ１またはそのバリアントの軽鎖由来の３個のＣＤＲ；（ｊ）表６に示す抗体Ｇ１またはそのバリアントの重鎖由来の３個のＣＤＲ；（ｋ）表６に示す抗体Ｇ１またはそのバリアントの軽鎖由来の３個のＣＤＲおよび重鎖由来の３個のＣＤＲ；ならびに（ｌ）（ｂ）〜（ｋ）のうちいずれか１種を含む抗体。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号９および配列番号１０に示すポリヌクレオチドのいずれか一方または両方を含む。
一態様では、本開示は、不良なエフェクター機能を有する抗体およびポリペプチド等、本明細書に記載されている抗体（抗体断片を含む）およびポリペプチドのいずれかをコードするポリヌクレオチドを提供する。ポリヌクレオチドは、当技術分野で公知の手順によって作製することができる。
一態様では、本開示は、本開示のポリヌクレオチドのいずれかを含む組成物（医薬組成物等）を提供する。一部の実施形態では、組成物は、本明細書に記載されているＧ１抗体をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む。一部の実施形態では、組成物は、本明細書に記載されている抗体またはポリペプチドのいずれかをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む。さらに他の実施形態では、組成物は、配列番号９および配列番号１０に示すポリヌクレオチドのいずれか一方または両方を含む。発現ベクターおよびポリヌクレオチド組成物の投与は、本明細書にさらに記載されている。
一態様では、本開示は、本明細書に記載されているポリヌクレオチドのいずれかを作製する方法を提供する。
いずれかのかかる配列と相補的なポリヌクレオチドも、本開示に包含されている。ポリヌクレオチドは、一本鎖（コードまたはアンチセンス）であっても二本鎖であってもよく、ＤＮＡ（ゲノム、ｃＤＮＡまたは合成）であってもＲＮＡ分子であってもよい。ＲＮＡ分子は、イントロンを含有し、１対１（ｏｎｅ−ｔｏ−ｏｎｅ）様式でＤＮＡ分子に相当するＨｎＲＮＡ分子と、イントロンを含有しないｍＲＮＡ分子とを含む。追加的なコードまたは非コード配列が、本開示のポリヌクレオチド内に存在してもよいが、そうである必要はなく、ポリヌクレオチドは、他の分子および／または支持材料に連結されていてもよいが、そうである必要はない。
ポリヌクレオチドは、ネイティブ配列（すなわち、抗体またはその部分をコードする内在性配列）を含むことができるか、またはかかる配列のバリアントを含むことができる。コードされるポリペプチドの免疫反応性が、ネイティブ免疫反応性分子と比べて縮小されないように、ポリヌクレオチドバリアントは、１個または複数の置換、付加、欠失および／または挿入を含有する。コードされるポリペプチドの免疫反応性における効果は、一般に、本明細書に記載されている通りに評価することができる。バリアントは、ネイティブ抗体またはその部分をコードするポリヌクレオチド配列に対し、少なくとも約７０％の同一性、少なくとも約８０％の同一性、少なくとも約９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性または少なくとも９９％の同一性を示すことができる。
２種のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列は、後述する最大一致のためにアラインされると、該２配列におけるヌクレオチドまたはアミノ酸の配列が同じである場合、「同一」であると言われる。２配列間の比較は、典型的には、比較ウィンドウにわたって配列を比較して、配列類似性の局所的領域を同定および比較することにより行われる。「比較ウィンドウ」は、本明細書において、２配列が最適にアラインされた後に配列を同数の連続する位置の参照配列と比較することができる、少なくとも約２０の連続する位置、通常、３０〜約７５、４０〜約５０のセグメントを指す。
比較のための配列の最適なアライメントは、デフォルトパラメータを使用した、バイオインフォマティクスソフトウェアのＬａｓｅｒｇｅｎｅ一式におけるＭｅｇａｌｉｇｎプログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を使用して行うことができる。このプログラムは、次の参考文献に記載されている数種類のアライメントスキームを具体化する：Ｄａｙｈｏｆｆ， Ｍ．Ｏ．（１９７８年）Ａ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ｃｈａｎｇｅ ｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ − Ｍａｔｒｉｃｅｓ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ｄｉｓｔａｎｔ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ、Ｄａｙｈｏｆｆ， Ｍ．Ｏ．（編）Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ ＤＣ、５巻、追補３号、３４５〜３５８頁；Ｈｅｉｎ Ｊ．、１９９０年、Ｕｎｉｆｉｅｄ Ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ａｎｄ Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｓ、６２６〜６４５頁、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１８３巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ；Ｈｉｇｇｉｎｓ， Ｄ．Ｇ．およびＳｈａｒｐ， Ｐ．Ｍ．、１９８９年、ＣＡＢＩＯＳ ５巻：１５１〜１５３頁；Ｍｙｅｒｓ， Ｅ．Ｗ．およびＭｕｌｌｅｒ Ｗ．、１９８８年、ＣＡＢＩＯＳ ４巻：１１〜１７頁；Ｒｏｂｉｎｓｏｎ， Ｅ．Ｄ．、１９７１年、Ｃｏｍｂ． Ｔｈｅｏｒ．１１巻：１０５頁；Ｓａｎｔｏｕ， Ｎ．、Ｎｅｓ， Ｍ．、１９８７年、Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． Ｅｖｏｌ．４巻：４０６〜４２５頁；Ｓｎｅａｔｈ， Ｐ．Ｈ．Ａ．およびＳｏｋａｌ， Ｒ．Ｒ．、１９７３年、Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ Ｔａｘｏｎｏｍｙ ｔｈｅ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ Ｔａｘｏｎｏｍｙ、Ｆｒｅｅｍａｎ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ， ＣＡ；Ｗｉｌｂｕｒ， Ｗ．Ｊ．およびＬｉｐｍａｎ， Ｄ．Ｊ．、１９８３年、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８０巻：７２６〜７３０頁。
一例において、「配列同一性のパーセンテージ」は、少なくとも２０個の位置の比較のウィンドウにわたって、２種の最適にアラインされた配列を比較することにより決定され、比較ウィンドウにおけるポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の部分は、２配列の最適なアライメントのための参照配列（付加も欠失も含まない）と比較して、２０パーセントまたはそれ未満、通常、５〜１５パーセントまたは１０〜１２パーセントの付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含むことができる。パーセンテージは、両方の配列において同一核酸塩基またはアミノ酸残基が発生する位置の数を決定して、マッチした位置の数を得て、マッチした位置の数を、参照配列における位置の総数（すなわち、ウィンドウサイズ）で割り、結果に１００を掛けて、配列同一性のパーセンテージを得ることにより計算される。よって、一部の例において、開示されている方法により使用することができる本明細書に提供されている抗体または抗体断片のいずれかは、本明細書に提供されている抗体または抗体断片に対し少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の配列同一性を有することができる（例えば、配列番号１〜１４または１５５〜１７４のいずれかに対しかかる配列同一性を有する）。
バリアントも同様にまたはその代わりに、ネイティブ遺伝子またはその部分もしくは相補体と実質的に相同であり得る。かかるポリヌクレオチドバリアントは、中程度にストリンジェントな条件下で、ネイティブ抗体をコードする天然起源のＤＮＡ配列（または相補的配列）とハイブリダイズすることができる。
適した「中程度にストリンジェントな条件」は、５×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、１．０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）の溶液における予洗；５０℃〜６５℃、５×ＳＳＣにおける一晩のハイブリダイズ；続く、０．１％ＳＤＳを含有する２×、０．５×および０．２×ＳＳＣのそれぞれによる６５℃２０分間の２回洗浄を含む。
本明細書において、「高度にストリンジェントな条件」または「高ストリンジェンシー条件」は、（１）洗浄のために低イオン強度および高温、例えば、０．０１５Ｍ塩化ナトリウム／０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム／０．１％ドデシル硫酸ナトリウム、５０℃を用いる；（２）ハイブリダイゼーション中に、ホルムアミド等の変性剤、例えば、５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミドと、０．１％ウシ血清アルブミン／０．１％フィコール／０．１％ポリビニルピロリドン／５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー、ｐＨ６．５と、７５０ｍＭ塩化ナトリウム、７５ｍＭクエン酸ナトリウム、４２℃を用いる；または（３）５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（０．７５Ｍ ＮａＣｌ、０．０７５Ｍクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％ピロリン酸ナトリウム、５×デンハルト溶液、超音波処理したサケ精子ＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）、０．１％ＳＤＳおよび１０％デキストラン硫酸、４２℃を用い、４２℃で０．２×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）で洗浄し、５０％ホルムアミド、５５℃を用い、続くＥＤＴＡを含有する０．１×ＳＳＣ、５５℃からなる高ストリンジェンシー洗浄を用いる条件である。当業者であれば、必要に応じて温度、イオン強度等を調整して、プローブの長さその他等の因子を適応させる仕方を認識するであろう。
当業者であれば、遺伝暗号の縮重の結果として、本明細書に記載されているポリペプチドをコードする多くのヌクレオチド配列が存在することを認めるであろう。これらのポリヌクレオチドの一部は、いずれかのネイティブ遺伝子のヌクレオチド配列に対し最小の相同性を有する。にもかかわらず、コドン使用の差により変動するポリヌクレオチドが、本開示によって特に企図されている。さらに、本明細書に提供されているポリヌクレオチド配列を含む遺伝子の対立遺伝子は、本開示の範囲内に収まる。対立遺伝子は、ヌクレオチドの欠失、付加および／または置換等、１個または複数の突然変異の結果として変更される内在性遺伝子である。その結果得られるｍＲＮＡおよびタンパク質は、変更された構造または機能を有することができるが、そうである必要はない。対立遺伝子は、標準技法を使用して同定することができる（ハイブリダイゼーション、増幅および／またはデータベース配列比較等）。
本開示のポリヌクレオチドは、化学合成、組換え方法またはＰＣＲを使用して得ることができる。化学的ポリヌクレオチド合成の方法は、当技術分野で周知であり、本明細書に詳細に記載する必要はない。当業者であれば、本明細書に提供されている配列および市販のＤＮＡ合成機を使用して、所望のＤＮＡ配列を産生することができる。
本明細書にさらに述べられている通り、組換え方法を使用してポリヌクレオチドを調製するために、所望の配列を含むポリヌクレオチドを適したベクターに挿入することができ、続いてこのベクターを、複製および増幅のために適した宿主細胞に導入することができる。ポリヌクレオチドは、当技術分野で公知のいずれかの手段により宿主細胞に挿入することができる。直接的取り込み、エンドサイトーシス、トランスフェクション、Ｆ−接合またはエレクトロポレーションにより外来性ポリヌクレオチドを導入することにより、細胞を形質転換することができる。導入されると、外来性ポリヌクレオチドは、非組み込み型ベクター（プラスミド等）として細胞内で維持することができるか、または宿主細胞ゲノム中に組み込まれ得る。このようにして増幅されたポリヌクレオチドは、当技術分野内で周知の方法によって、宿主細胞から単離することができる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９年）を参照されたい。
あるいは、ＰＣＲは、ＤＮＡ配列の再生産を可能にする。ＰＣＲ技術は、当技術分野で周知であり、米国特許第４，６８３，１９５号、同第４，８００，１５９号、同第４，７５４，０６５号および同第４，６８３，２０２号ならびにＰＣＲ： Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ、Ｍｕｌｌｉｓら編、Ｂｉｒｋａｕｓｗｅｒ Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｓｔｏｎ（１９９４年）に記載されている。
ＲＮＡは、適切なベクターにおける単離されたＤＮＡを使用し、これを適した宿主細胞に挿入することにより得ることができる。細胞が複製し、ＤＮＡがＲＮＡに転写されると、次いでＲＮＡは、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８９年）に表記されている通りに、当業者に周知の方法を使用して単離することができる。
適したクローニングベクターは、標準技法に従って構築することができるか、または当技術分野で利用できる多数のクローニングベクターから選択することができる。選択されるクローニングベクターは、使用しようとする宿主細胞に応じて変動し得るが、有用なクローニングベクターは、一般に、自己複製する能力を有し、特定の制限エンドヌクレアーゼのための単一の標的を保有することができ、および／またはベクターを含有するクローンの選択において使用することができるマーカーの遺伝子を保持することができる。適した例として、プラスミドおよび細菌ウイルス、例えば、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（例えば、ｐＢＳ ＳＫ＋）およびその派生体、ｍｐ１８、ｍｐ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９、ＣｏｌＥ１、ｐＣＲ１、ＲＰ４、ファージＤＮＡ、ならびにｐＳＡ３およびｐＡＴ２８等のシャトルベクターが挙げられる。上述および多くの他のクローニングベクターは、ＢｉｏＲａｄ、ＳｔｒａｔｅｇｅｎｅおよびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ等、商業的ベンダーから入手することができる。
発現ベクターは、一般に、本開示に係るポリヌクレオチドを含有する複製可能なポリヌクレオチド構築物である。発現ベクターが、エピソームまたは染色体ＤＮＡの組み込み部分のいずれかとして宿主細胞において複製可能でなければならないことが暗示される。適した発現ベクターとして、プラスミド、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルスを含むウイルスベクター、コスミドおよびＰＣＴ公開番号ＷＯ８７／０４４６２に開示されている発現ベクター（複数可）が挙げられるがこれらに限定されない。ベクター構成成分として一般に、次のうち１種または複数を挙げることができるがこれらに限定されない：シグナル配列；複製起点；１種または複数のマーカー遺伝子；適した転写制御エレメント（プロモーター、エンハンサーおよびターミネーター等）。発現（すなわち、翻訳）のため、リボソーム結合部位、翻訳開始部位および終止コドン等、１種または複数の翻訳制御エレメントも通常要求される。
目的のポリヌクレオチドを含有するベクターは、塩化カルシウム、塩化ルビジウム、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥ−デキストランまたは他の物質を用いたエレクトロポレーション、トランスフェクション；微粒子銃；リポフェクション；および感染（例えば、ベクターが、ワクシニアウイルス等の感染病原体である場合）を含む、いくつかの適切な手段のいずれかによって宿主細胞に導入することができる。導入ベクターまたはポリヌクレオチドの選択は多くの場合、宿主細胞の特色に依存するであろう。
本開示は、本明細書に記載されているポリヌクレオチドのいずれかを含む宿主細胞も提供する。異種ＤＮＡを過剰発現することができるいずれかの宿主細胞は、目的の抗体、ポリペプチドまたはタンパク質をコードする遺伝子を単離する目的のために使用することができる。哺乳動物宿主細胞の非限定例として、ＣＯＳ、ＨｅＬａおよびＣＨＯ細胞が挙げられるがこれらに限定されない。ＰＣＴ公開番号ＷＯ８７／０４４６２も参照されたい。適した非哺乳動物宿主細胞は、原核生物（Ｅ．ｃｏｌｉまたはＢ．ｓｕｂｔｉｌｌｉｓ等）および酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓａｅ、Ｓ．ｐｏｍｂｅ；またはＫ．ｌａｃｔｉｓ等）を含む。一部の例において、宿主細胞は、存在するのであれば宿主細胞における目的の相当する内在性抗体またはタンパク質のレベルよりも約少なくとも５倍高い、少なくとも１０倍高い、または少なくとも２０倍高いレベルでｃＤＮＡを発現する。ＣＧＲＰへの特異的結合に関する宿主細胞のスクリーニングは、イムノアッセイまたはＦＡＣＳによってもたらされる。目的の抗体またはタンパク質を過剰発現する細胞を同定することができる。
医薬組成物
１種または複数の抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体を含む組成物は、有効量の活性成分としての１種または複数の抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体、またはその薬学的に許容される塩、エステル、プロドラッグ、溶媒和化合物、水和物もしくは誘導体をもたらすように製剤化することができる。組成物は、医薬組成物であり得る。組成物は、処置されている状態に対するその特定の有用性のために選択される１種または複数の追加的な治療剤をさらに含むことができる。例えば、治療剤は、抗糖尿病剤であり得る。抗糖尿病剤は、糖尿病に関連した症状の処置において有効な量であり得る。望ましい場合、組成物は、薬学的に許容される塩および／またはその配位錯体、ならびに１種または複数の薬学的に許容される賦形剤、不活性固体希釈剤およびフィラーを含む担体、無菌水溶液および様々な有機溶媒を含む希釈液、透過促進剤、可溶化剤ならびにアジュバントを含有する。
一部の実施形態では、本開示の方法において使用される組成物は、本明細書に記載されている有効量の１種または複数の抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体または抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体由来のポリペプチドを含む。一実施形態では、組成物は、１種または複数の追加的なＣＧＲＰアンタゴニストをさらに含む。一部の実施形態では、抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体は、ヒトＣＧＲＰに結合する。一部の実施形態では、抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体は、ヒト化されている。一部の実施形態では、抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体は、抗体媒介性溶解またはＡＤＣＣ等、望まれないまたは望ましくない免疫応答を誘引しない定常領域を含む。一部の実施形態では、抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体は、抗体Ｇ１の１個または複数のＣＤＲ（Ｇ１由来の１、２、３、４、５、または一部の実施形態では、全６個のＣＤＲ等）を含む。一部の実施形態では、抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体は、ヒト抗体である。
組成物は、２種以上の抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体（例えば、ＣＧＲＰの異なるエピトープを認識する抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体の混合物）を含むことができる。他の例示的な組成物は、同じエピトープ（複数可）を認識する２種以上の抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体、またはＣＧＲＰの異なるエピトープに結合する異なる種の抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体を含む。組成物は、ポリクローナル抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体を含むことができる。組成物は、２種またはそれを超えるモノクローナル抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体（例えば、２、３、４、５種またはそれを超えるモノクローナル抗体）の混合物を含むことができる。
開示されている方法において使用される組成物は、凍結乾燥された製剤または水溶液の形態の、薬学的に許容される担体、賦形剤または安定剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ： Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ、第２０版（２０００年）Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ、Ｋ． Ｅ． Ｈｏｏｖｅｒ編）をさらに含むことができる。許容される担体、賦形剤または安定剤は、その投薬量および濃度ではレシピエントにとって無毒性であり、リン酸塩、クエン酸塩および他の有機酸等、バッファー；アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤；保存料（オクタデシルジメチルベンジル塩化アンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール；メチルまたはプロピルパラベン等、アルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびｍ−クレゾール等）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチンもしくは免疫グロブリン等、タンパク質；ポリビニルピロリドン等、親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニンもしくはリシン等、アミノ酸；グルコース、マンノースもしくはデキストランを含む単糖、二糖および他の炭水化物；ＥＤＴＡ等、キレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロースもしくはソルビトール等、糖；ナトリウム等、塩形成対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）；および／またはＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）もしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等、非イオン性界面活性物質を含むことができる。薬学的に許容される賦形剤は、本明細書にさらに記載されている。
かかる組成物は、予防および／または治療に適するまたは有益となることができる。組成物は、栄養学もしくは予防適用および／または治療適用等、様々な適用のいずれかに適するまたは有益となることができるように、相対的に迅速な抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体摂取、供給および／または補給に適し得る。組成物は、例えば食糧および／または飲料等、食事性媒体または消費できる媒体を介して達成することができるいずれか等、抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体摂取、供給および／または補給適用（複数可）に適したまたは有益な媒体であり得る。
一部の実施形態では、１種または複数の抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体を含む組成物は、単一の剤形で存在し得る。一部の事例において、組成物は、複数の剤形で存在し得る。組成物は、単一用量または複数用量で投与することができる。投薬は、１日当たり約１回、２回、３回、４回、５回、６回または６回超であり得る。投薬は、１ヶ月に約１回、２週間に１回、１週間に１回または１日おきに１回であり得る。一部の実施形態では、投薬は、毎日少なくとも１回であり得る。別の実施形態では、１種もしくは複数の抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体および／または１種もしくは複数の追加的な治療剤（例えば、抗代謝障害剤または抗糖尿病剤）は共に、１日当たり約１回〜１日当たり約６回投与することができる。
別の実施形態では、抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体および／または１種もしくは複数の追加的な治療剤の投与は、約７日間未満続けることができる。さらに別の実施形態では、投与は、約６、１０、１４、２０、２８、３０日間、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２ヶ月間、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０年間に等しいまたはそれを超える期間続ける。一部の事例において、連続的投薬は、必要な限り達成および維持される。一部の実施形態では、１種または複数の抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体を含む組成物は、少なくとも約１ヶ月間投与される。一部の実施形態では、組成物は、少なくとも約１０日間投与される。抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体を含む組成物の投与は、必要な限り続けることができる。一部の実施形態では、本開示の化合物は、２８、１４、７、６、５、４、３、２または１日間未満の間投与される。一部の実施形態では、本開示の化合物は、例えば、慢性効果の処置のために、進行ベースで慢性的に投与される。
本開示の組成物は、投薬量で投与することができる。化合物薬物動態における対象間の可変性により、投薬レジメンの個別化が、最適な治療法に望まれ得ることが当技術分野で公知である。本開示を踏まえたルーチンの実験法により、本開示の化合物の投薬を見出すことができる。
対象への１種または複数の抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体を含む組成物の投与に適切な投薬量の決定は、先に言及した因子、例えば、いずれかの潜在的なもしくは実際の副作用（複数可）、ならびに／または状態処置目的、副作用低下目的および／もしくは抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体を含む組成物を対象に投与することができる他の目的（複数可）等、抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体を含む組成物の投与の目的等、様々な因子のいずれかを考慮に入れることができる。適切な投薬量の決定は、これらの因子、他のいずれかの適した因子（複数可）、いずれかの副作用（複数可）、動物試験モデリング、ヒト試験モデリング、臨床試験モデリング、薬物試験モデリングおよびこれらの間のいずれかの釣合せのいずれかを考慮に入れることができる。
対象によって吸収され得る抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体の量、または対象による抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体の吸収速度は、様々な因子のいずれかに基づき、対象間で変動し得る。かかる因子の例として、代謝速度、腎機能、全体的な健康および／または対象に関する他の因子（複数可）、ならびに対イオン、いずれかの増強剤、その投与媒体もしくは方法等の抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体それ自体を含む組成物の特性もしくは性質、ならびに／または１種もしくは複数の抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体を含む組成物（複数可）および／または対象へのその投与に関する他の因子が挙げられる。
一部の実施形態では、１種または複数の抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体を含む製剤は、いずれか適した投与経路のために調製することができる。一部の例において、１種または複数の抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体は、０．１ｍｇ〜３０００ｍｇ、１ｍｇ〜１０００ｍｇ、１００〜１０００ｍｇ、１００〜５００ｍｇ、１０ｍｇ〜１００ｍｇまたは１０ｍｇ〜２５ｍｇに及ぶ量で存在する。１種または複数の抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体を含む製剤は、０．１ｍｇ、１ｍｇ、１００ｍｇ、１ｍｇ、１０ｍｇ、２５ｍｇ、５０ｍｇ、７５ｍｇ、１００ｍｇ、１２５ｍｇ、１５０ｍｇ、１７５ｍｇ、２００ｍｇ、２２５ｍｇ、２５０ｍｇ、２７５ｍｇ、３００ｍｇ、３２５ｍｇ、３５０ｍｇ、３７５ｍｇ、４００ｍｇ、４５０ｍｇ、４７５ｍｇ、５００ｍｇ、５２５ｍｇ、５５０ｍｇ、５７５ｍｇ、６００ｍｇ、６２５ｍｇ、６５０ｍｇ、６７５ｍｇ、７００ｍｇ、７２５ｍｇ、７５０ｍｇ、７７５ｍｇ、８００ｍｇ、８２５ｍｇ、８５０ｍｇ、８７５ｍｇ、９００ｍｇ、９２５ｍｇ、９５０ｍｇ、９７５ｍｇ、１０００ｍｇ、１５００ｍｇ、２０００ｍｇもしくは３０００ｍｇ、多くても０．１ｍｇ、１ｍｇ、１００ｍｇ、１ｍｇ、１０ｍｇ、２５ｍｇ、５０ｍｇ、７５ｍｇ、１００ｍｇ、１２５ｍｇ、１５０ｍｇ、１７５ｍｇ、２００ｍｇ、２２５ｍｇ、２５０ｍｇ、２７５ｍｇ、３００ｍｇ、３２５ｍｇ、３５０ｍｇ、３７５ｍｇ、４００ｍｇ、４５０ｍｇ、４７５ｍｇ、５００ｍｇ、５２５ｍｇ、５５０ｍｇ、５７５ｍｇ、６００ｍｇ、６２５ｍｇ、６５０ｍｇ、６７５ｍｇ、７００ｍｇ、７２５ｍｇ、７５０ｍｇ、７７５ｍｇ、８００ｍｇ、８２５ｍｇ、８５０ｍｇ、８７５ｍｇ、９００ｍｇ、９２５ｍｇ、９５０ｍｇ、９７５ｍｇ、１０００ｍｇ、１５００ｍｇ、２０００ｍｇもしくは３０００ｍｇ、または少なくとも０．１ｍｇ、１ｍｇ、１００ｍｇ、１ｍｇ、１０ｍｇ、２５ｍｇ、５０ｍｇ、７５ｍｇ、１００ｍｇ、１２５ｍｇ、１５０ｍｇ、１７５ｍｇ、２００ｍｇ、２２５ｍｇ、２５０ｍｇ、２７５ｍｇ、３００ｍｇ、３２５ｍｇ、３５０ｍｇ、３７５ｍｇ、４００ｍｇ、４５０ｍｇ、４７５ｍｇ、５００ｍｇ、５２５ｍｇ、５５０ｍｇ、５７５ｍｇ、６００ｍｇ、６２５ｍｇ、６５０ｍｇ、６７５ｍｇ、７００ｍｇ、７２５ｍｇ、７５０ｍｇ、７７５ｍｇ、８００ｍｇ、８２５ｍｇ、８５０ｍｇ、８７５ｍｇ、９００ｍｇ、９２５ｍｇ、９５０ｍｇ、９７５ｍｇ、１０００ｍｇ、１５００ｍｇ、２０００ｍｇもしくは３０００ｍｇの抗体量で、いずれか適した投与経路のために調製することができる。
一部の実施形態では、１種または複数の抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体を含む液体製剤は、０．１〜５００ｍｇ／ｍＬ、０．１〜３７５ｍｇ／ｍＬ、０．１〜２５０ｍｇ／ｍＬ、０．１〜１７５ｍｇ／ｍＬまたは０．１〜１００ｍｇ／ｍＬに及ぶ抗体濃度で、いずれか適した投与経路のために調製することができる。一部の実施形態では、１種または複数の抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体を含む液体製剤は、０．１、０．５、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０もしくは５００ｍｇ／ｍＬの、多くても０．１、０．５、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０もしくは５００ｍｇ／ｍＬの、少なくとも０．１、０．５、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０もしくは５００ｍｇ／ｍＬの、または０．１、０．５、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０もしくは５００ｍｇ／ｍＬ未満の抗体濃度で、いずれか適した投与経路のために調製することができる。
一部の実施形態では、抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体の初期用量（例えば、負荷用量）を対象に投与し、続いて所望の間隔で１または複数の追加的な用量を投与することができる。一部の実施形態では、初期用量および追加的な用量の１または複数は、同じ用量である。一部の実施形態では、１または複数の追加的な用量は、初期用量とは異なる用量である。一部の実施形態では、１または複数の追加的な用量が投与される頻度は、一定（例えば、毎月）である。一部の実施形態では、１または複数の追加的な用量が投与される頻度は、可変的（例えば、初期用量の１ヶ月後に１回の追加的な用量が投与され、続いて初期用量の３ヶ月後に別の追加的な用量が投与される）である。初期負荷用量、追加的な用量、ならびに追加的な用量の頻度（例えば、本明細書に記載されているものを含む）のいずれか望ましいおよび／または治療用レジメンを使用することができる。例示的なレジメンは、皮下投与される６７５ｍｇ抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体の初期負荷用量と、続く１ヶ月間の間隔で皮下投与される抗体の２２５ｍｇのその後の維持用量を含む。
一部の実施形態では、０．１μｇ、１μｇ、１００μｇ、１ｍｇ、１０ｍｇ、２５ｍｇ、５０ｍｇ、７５ｍｇ、１００ｍｇ、１２５ｍｇ、１５０ｍｇ、１７５ｍｇ、２００ｍｇ、２２５ｍｇ、２５０ｍｇ、２７５ｍｇ、３００ｍｇ、３２５ｍｇ、３５０ｍｇ、３７５ｍｇ、４００ｍｇ、４５０ｍｇ、４７５ｍｇ、５００ｍｇ、５２５ｍｇ、５５０ｍｇ、５７５ｍｇ、６００ｍｇ、６２５ｍｇ、６５０ｍｇ、６７５ｍｇ、７００ｍｇ、７２５ｍｇ、７５０ｍｇ、７７５ｍｇ、８００ｍｇ、８２５ｍｇ、８５０ｍｇ、８７５ｍｇ、９００ｍｇ、９２５ｍｇ、９５０ｍｇ、９７５ｍｇ、１０００ｍｇ、１５００ｍｇ、２０００ｍｇまたは３０００ｍｇの１種または複数の抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体の初期用量を対象に投与し、続いて０．１μｇ、１μｇ、１００μｇ、１ｍｇ、１０ｍｇ、２５ｍｇ、５０ｍｇ、７５ｍｇ、１００ｍｇ、１２５ｍｇ、１５０ｍｇ、１７５ｍｇ、２００ｍｇ、２２５ｍｇ、２５０ｍｇ、２７５ｍｇ、３００ｍｇ、３２５ｍｇ、３５０ｍｇ、３７５ｍｇ、４００ｍｇ、４５０ｍｇ、４７５ｍｇ、５００ｍｇ、５２５ｍｇ、５５０ｍｇ、５７５ｍｇ、６００ｍｇ、６２５ｍｇ、６５０ｍｇ、６７５ｍｇ、７００ｍｇ、７２５ｍｇ、７５０ｍｇ、７７５ｍｇ、８００ｍｇ、８２５ｍｇ、８５０ｍｇ、８７５ｍｇ、９００ｍｇ、９２５ｍｇ、９５０ｍｇ、９７５ｍｇ、１０００ｍｇ、１５００ｍｇ、２０００ｍｇまたは３０００ｍｇの１種または複数の抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体の１または複数の追加的な用量を投与することができる。
一部の実施形態では、抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体（複数可）の用量は、例えば、投与経路および／または投与される特定の製剤に応じて、部分用量（ｓｕｂ−ｄｏｓｅ）に分け、複数の部分用量として投与することができる。例えば、用量が皮下投与される場合、例えば、単一の部位におけるより多量の単一の皮下注射を回避するために、皮下用量を複数の部分用量に分け、各部分用量を異なる部位に投与することができる。例えば、９００ｍｇの皮下用量は、各２２５ｍｇの４個の部分用量に分け、各２２５ｍｇ用量を異なる部位に投与することができ、これは、各部位に注射される容量を最小化するのを助けることができる。部分用量の分割は、等しくても（例えば、４個の等しい部分用量）、等しくなくてもよい（例えば、部分用量のうち２個が他の部分用量の２倍である、４個の部分用量）。
一部の実施形態では、処置の経過にわたって対象に投与される抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体（複数可）の用量の数は、例えば、対象における代謝障害症状の発生率低下の達成に応じて変動し得る。例えば、処置の経過にわたって投与される用量の数は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９もしくは５０であり得るか、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９もしくは５０であり得るか、または多くても１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９もしくは５０であり得る。一部の事例において、処置は、無期限に与えることができる。一部の事例において、多くても１、２、３、４、５または６用量が処置のために対象に投与されるように、処置は、急性であり得る。
一部の実施形態では、１種または複数の抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体の用量（または部分用量）を液体製剤において製剤化し、液体として対象に投与（例えば、皮下注射により）することができる。かかる事例において、対象に投与される１種または複数の抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体を含む液体製剤の容量は、例えば、液体製剤における抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体の濃度、１種もしくは複数の抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体の所望の用量および／または使用される投与経路に応じて変動し得る。例えば、１種または複数の抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体を含み、対象に投与される（例えば、皮下注射等、注射により）液体製剤の容量は、０．００１ｍＬ〜１０．０ｍＬ、０．０１ｍＬ〜５．０ｍＬ、０．１ｍＬ〜５ｍＬ、０．１ｍＬ〜３ｍＬ、０．５ｍＬ〜２．５ｍＬまたは１ｍＬ〜２．５ｍＬであり得る。例えば、１種または複数の抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体を含み、対象に投与される（例えば、皮下注射等、注射により）液体製剤の容量は、０．００１、０．００５、０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１０、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５もしくは１０．０ｍＬであり得るか、少なくとも０．００１、０．００５、０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１０、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５もしくは１０．０ｍＬであり得るか、０．００１、０．００５、０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１０、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５もしくは１０．０ｍＬ未満であり得るか、または多くても０．００１、０．００５、０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１０、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５もしくは１０．０ｍＬであり得る。
抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体は、注射（例えば、腹腔内、静脈内、皮下、筋肉内等）を含むいずれか適した方法を使用して投与することができる。抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体は、本明細書に記載されている通り、吸入により投与することもできる。一般に、抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体の投与のため、初期候補投薬量は、約２ｍｇ／ｋｇであり得る。本開示の目的のため、典型的な一日投薬量は、上に言及されている因子に応じて、３μｇ／ｋｇ〜３０μｇ／ｋｇ〜３００μｇ／ｋｇ〜３ｍｇ／ｋｇ〜３０ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇまたはそれ超のいずれかにほぼ及び得る。例えば、約１ｍｇ／ｋｇ、約２．５ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇおよび約２５ｍｇ／ｋｇの投薬量を使用することができる。数日間またはそれより長くにわたる反復的投与のため、状態に応じて、処置は、症状の所望の抑制が生じるまで、または十分な治療レベルが達成されて、例えば、疼痛が低下するまで持続される。例示的な投薬レジメンは、抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体の約２ｍｇ／ｋｇの初期用量の投与と、続く約１ｍｇ／ｋｇの毎週の維持用量または続く１週間おきの約１ｍｇ／ｋｇの維持用量の投与を含む。別の例示的な投薬レジメンは、対象への１ヶ月当たり１回の皮下による１００ｍｇ、１２５ｍｇ、１５０ｍｇ、２００ｍｇ、２２５ｍｇ、２５０ｍｇ、２７５ｍｇ、３００ｍｇ、３５０ｍｇ、４００ｍｇ、４５０ｍｇ、５００ｍｇ、５５０ｍｇ、６００ｍｇ、６７５ｍｇまたは９００ｍｇの用量の投与を含む。別の例示的な投薬レジメンは、皮下による６７５ｍｇの初期用量の投与と、続く皮下による抗体の２２５ｍｇの毎月の用量の投与を含む。しかし、開業医が達成を望む薬物動態減衰のパターンに応じて、他の投薬量レジメンが有用となり得る。例えば、一部の実施形態では、１週間に１〜４回の投薬が企図される。この治療法の進行は、従来の技法およびアッセイによって容易にモニターすることができる。投薬レジメン（使用されるＣＧＲＰアンタゴニスト（複数可）を含む）は、経時的に変動し得る。
一部の実施形態では、抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体の用量は、０．１μｇ〜３０００ｍｇ、１ｍｇ〜１０００ｍｇ、１００〜１０００ｍｇまたは１００〜５００ｍｇに及び得る。一部の実施形態では、抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体の用量は、０．１μｇ、１μｇ、１００μｇ、１ｍｇ、１０ｍｇ、２５ｍｇ、５０ｍｇ、７５ｍｇ、１００ｍｇ、１２５ｍｇ、１５０ｍｇ、１７５ｍｇ、２００ｍｇ、２２５ｍｇ、２５０ｍｇ、２７５ｍｇ、３００ｍｇ、３２５ｍｇ、３５０ｍｇ、３７５ｍｇ、４００ｍｇ、４５０ｍｇ、４７５ｍｇ、５００ｍｇ、５２５ｍｇ、５５０ｍｇ、５７５ｍｇ、６００ｍｇ、６２５ｍｇ、６５０ｍｇ、６７５ｍｇ、７００ｍｇ、７２５ｍｇ、７５０ｍｇ、７７５ｍｇ、８００ｍｇ、８２５ｍｇ、８５０ｍｇ、８７５ｍｇ、９００ｍｇ、９２５ｍｇ、９５０ｍｇ、９７５ｍｇ、１０００ｍｇ、１５００ｍｇ、２０００ｍｇもしくは３０００ｍｇであり得るか、多くても０．１μｇ、１μｇ、１００μｇ、１ｍｇ、１０ｍｇ、２５ｍｇ、５０ｍｇ、７５ｍｇ、１００ｍｇ、１２５ｍｇ、１５０ｍｇ、１７５ｍｇ、２００ｍｇ、２２５ｍｇ、２５０ｍｇ、２７５ｍｇ、３００ｍｇ、３２５ｍｇ、３５０ｍｇ、３７５ｍｇ、４００ｍｇ、４５０ｍｇ、４７５ｍｇ、５００ｍｇ、５２５ｍｇ、５５０ｍｇ、５７５ｍｇ、６００ｍｇ、６２５ｍｇ、６５０ｍｇ、６７５ｍｇ、７００ｍｇ、７２５ｍｇ、７５０ｍｇ、７７５ｍｇ、８００ｍｇ、８２５ｍｇ、８５０ｍｇ、８７５ｍｇ、９００ｍｇ、９２５ｍｇ、９５０ｍｇ、９７５ｍｇ、１０００ｍｇ、１５００ｍｇ、２０００ｍｇもしくは３０００ｍｇであり得るか、０．１μｇ、１μｇ、１００μｇ、１ｍｇ、１０ｍｇ、２５ｍｇ、５０ｍｇ、７５ｍｇ、１００ｍｇ、１２５ｍｇ、１５０ｍｇ、１７５ｍｇ、２００ｍｇ、２２５ｍｇ、２５０ｍｇ、２７５ｍｇ、３００ｍｇ、３２５ｍｇ、３５０ｍｇ、３７５ｍｇ、４００ｍｇ、４５０ｍｇ、４７５ｍｇ、５００ｍｇ、５２５ｍｇ、５５０ｍｇ、５７５ｍｇ、６００ｍｇ、６２５ｍｇ、６５０ｍｇ、６７５ｍｇ、７００ｍｇ、７２５ｍｇ、７５０ｍｇ、７７５ｍｇ、８００ｍｇ、８２５ｍｇ、８５０ｍｇ、８７５ｍｇ、９００ｍｇ、９２５ｍｇ、９５０ｍｇ、９７５ｍｇ、１０００ｍｇ、１５００ｍｇ、２０００ｍｇもしくは３０００ｍｇ未満であり得るか、または少なくとも０．１μｇ、１μｇ、１００μｇ、１ｍｇ、１０ｍｇ、２５ｍｇ、５０ｍｇ、７５ｍｇ、１００ｍｇ、１２５ｍｇ、１５０ｍｇ、１７５ｍｇ、２００ｍｇ、２２５ｍｇ、２５０ｍｇ、２７５ｍｇ、３００ｍｇ、３２５ｍｇ、３５０ｍｇ、３７５ｍｇ、４００ｍｇ、４５０ｍｇ、４７５ｍｇ、５００ｍｇ、５２５ｍｇ、５５０ｍｇ、５７５ｍｇ、６００ｍｇ、６２５ｍｇ、６５０ｍｇ、６７５ｍｇ、７００ｍｇ、７２５ｍｇ、７５０ｍｇ、７７５ｍｇ、８００ｍｇ、８２５ｍｇ、８５０ｍｇ、８７５ｍｇ、９００ｍｇ、９２５ｍｇ、９５０ｍｇ、９７５ｍｇ、１０００ｍｇ、１５００ｍｇ、２０００ｍｇもしくは３０００ｍｇであり得る。
一部の実施形態では、抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体の用量は、０．１〜５００、０．１〜１００、０．１〜５０、０．１〜２０または０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重に及び得る。一部の実施形態では、抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体の用量は、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、１０．０、１０．５、１１．０、１１．５、１２．０、１２．５、１３．０、１３．５、１４．０、１４．５、１５．０、１５．５、１６．０、１６．５、１７．０、１７．５、１８．０、１８．５、１９．０、１９．５、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５もしくは５００ｍｇ／ｋｇ体重であり得るか、多くても０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、１０．０、１０．５、１１．０、１１．５、１２．０、１２．５、１３．０、１３．５、１４．０、１４．５、１５．０、１５．５、１６．０、１６．５、１７．０、１７．５、１８．０、１８．５、１９．０、１９．５、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５もしくは５００ｍｇ／ｋｇ体重であり得るか、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、１０．０、１０．５、１１．０、１１．５、１２．０、１２．５、１３．０、１３．５、１４．０、１４．５、１５．０、１５．５、１６．０、１６．５、１７．０、１７．５、１８．０、１８．５、１９．０、１９．５、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５もしくは５００ｍｇ／ｋｇ体重未満であり得るか、または少なくとも０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、１０．０、１０．５、１１．０、１１．５、１２．０、１２．５、１３．０、１３．５、１４．０、１４．５、１５．０、１５．５、１６．０、１６．５、１７．０、１７．５、１８．０、１８．５、１９．０、１９．５、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５もしくは５００ｍｇ／ｋｇ体重であり得る。
半減期等、経験的考察は、投薬量の決定に寄与することができる。例えば、ヒト化抗体または完全ヒト抗体等、ヒト免疫系と適合性の抗体を使用して、抗体の半減期を延長させ、抗体が宿主の免疫系によって攻撃されるのを防ぐことができる。投与の頻度は、治療法の経過にわたり決定および調整することができ、一般に、ただし必ずしもそうである必要はないが、頭痛（例えば、代謝障害）の処置および／または抑制および／または寛解および／または遅延に基づく。あるいは、抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体の持続した連続的放出製剤が適切であり得る。持続放出を達成するための様々な製剤およびデバイスが、当技術分野で公知である。
一実施形態では、抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体の投薬量は、抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体の１または複数の投与を与えた個体において経験的に決定することができる。個体に、抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体の増分投薬量を与える。抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体の有効性を評価するために、疾患の指標を追跡することができる。
本開示における方法に従った１種または複数の抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体の投与は、例えば、レシピエントの生理的状態、投与の目的が治療であるか予防であるか、および熟練の開業医にとって公知の他の因子に応じて連続的または断続的であり得る。抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体の投与は、予め選択された期間にわたり基本的に連続的であり得る、あるいは代謝障害（例えば、糖尿病）発症前、その最中またはその後のいずれか；代謝障害発症前；その最中；その前および後；その最中および後；その前および最中；またはその前、最中およびその後に、一連の間隔をあけた用量であり得る。投与は、代謝障害を生じる可能性のあるいずれかの事象の前、その最中および／またはその後であり得る。
一部の実施形態では、２種以上の抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体が存在し得る。少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５種の異なるまたはそれを超える抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体が存在し得る。一般に、これらの抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体は、互いに有害に影響しない相補的な活性を有することができる。抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体の非限定例として、ＡＬＤ４０３（Ａｌｄｅｒ ＢｉｏＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ製の抗ＣＧＲＰ抗体）、ＬＹ２９５１７４２（Ａｒｔｅａｕｓ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ製の抗ＣＧＲＰ抗体）または全てこれらの全体が参照により本明細書に組み込まれるＰＣＴ特許出願番号ＷＯ２０１２１６２２４３、米国特許第８，４５０，３２７号、ＰＣＴ特許出願番号ＷＯ２０１００７５２３８および欧州特許出願番号ＥＰ０３４８４９０に記載されている抗体を挙げることができる。抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体は、他のＣＧＲＰアンタゴニストと併せて使用することもできる。例えば、次のＣＧＲＰアンタゴニストのうち１種または複数を使用することができる：ＣＧＲＰに向けられたアンチセンス分子（ＣＧＲＰをコードする核酸に向けられたアンチセンス分子を含む）、ＣＧＲＰ阻害性化合物、ＣＧＲＰ構造類似体およびＣＧＲＰに結合するＣＧＲＰ受容体のドミナントネガティブ突然変異。抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体は、薬剤の有効性を増強および／または補完するよう機能する他の薬剤と併せて使用することもできる。
上述の通り、かかる投薬量は、対象、例えばヒト対象に関する臨床治験の結果等、いずれか適した因子（複数可）に基づき決定、修正および／または緻密化することができる。一部の実施形態では、適した投薬量は、適した動物モデルに適した投薬量の決定に基づき、例えば、実験的試験または検査、およびかかる適した動物投薬量の適したヒト投薬量への変換に基づき、例えば、いずれか適した確立された変換因子（複数可）等、適した変換因子（複数可）に基づき、決定、修正および／または緻密化することができる。さらに、例として、いずれかのかかる適したヒト投薬量を、例えば、ヒト対象を含む臨床治験に基づきさらに決定、修正および／または緻密化することができることが企図される。
本開示の組成物は、本開示の活性成分（例えば、抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体）またはその薬学的に許容される塩および／または配位錯体、ならびに不活性固体希釈剤およびフィラー、希釈液、無菌水溶液および様々な有機溶媒、透過促進剤、可溶化剤およびアジュバントが挙げられるがこれらに限定されない、１種または複数の薬学的に許容される賦形剤、担体を含むことができる。組成物は、１種または複数のサプリメントまたは他の活性成分をさらに含むことができる。組成物は、１種または複数の着色染料をさらに含むことができる。
非限定的な例示的な組成物およびこれを調製するための方法について後述する。一部の実施形態では、本開示は、１種または複数の抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体および医薬品賦形剤を含む医薬組成物を提供する。対象への投与に適切な１種または複数の抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体を含む組成物は、例えば、液体形態、ゲル形態、半液体（例えば、ある程度固体を含有する粘稠性の液体等、液体）形態、半固体（ある程度液体を含有する固体）形態および／または固体形態等、いずれか適した形態で提供することができる。単なる例として、錠剤形態、カプセル形態、食物形態、噛み砕ける形態、噛み砕けない形態、緩徐もしくは持続放出形態、非緩徐もしくは非持続放出形態および／またはその他を用いることができる。漸進的放出錠剤は、当技術分野で公知である。かかる錠剤の例は、米国特許第３，４５６，０４９号に表記されている。かかる組成物は、能動的であれ受動的であれ、追加的な薬剤（単数または複数）を含むことができる。かかる薬剤の例として、単なる例として、いずれか適した形態における、甘味料、調味料、着色料、充填剤、結合剤、潤滑剤、賦形剤、保存料、製造用薬剤および／またはその他が挙げられるがこれらに限定されない。緩徐または持続放出形態は、例えば、相対的に長い期間等、ある期間にわたり、組成物および／またはその１種もしくは複数の構成成分の崩壊および／または吸収を遅延させることができる。食物形態は、例えば、棒状の食品（ｆｏｏｄ ｂａｒ）、シリアル製品、ベーカリー製品、乳製品および／またはその他の形態を採ることができる。ベーカリー製品形態は、単なる例として、ベーグルまたはパンそのもの、例えば、ドーナツ、マフィンおよび／またはその他等、パン型製品の形態を採ることができる。１種または複数の抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体を含む組成物の構成成分は、組成物の別の構成成分の形態以外の形態で提供することができる。例えば、抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体は、液体形態の抗代謝障害剤と共に摂取される固形食品またはシリアル等、固体形態で提供することができる。複数の形態における１種または複数の抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体を含む組成物のかかる投与は、同時に、または異なる時点で発生することができる。
一部の実施形態では、１種または複数の抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体を含む組成物は、注射に適した固体または液体医薬組成物である。注射に適した本開示の医薬組成物は、それぞれ既定量の活性成分を含有する別々のまたは単位剤形として提示することができる。既定量の活性成分は、粉末または顆粒、ビーズ、水性または非水性液体における溶液または懸濁液、水中油型エマルションまたは油中水型液体エマルションであり得る。対象剤形は、薬局の方法のいずれかにより調製することができる。一部の事例において、本方法は、１種または複数の所望の成分を構成する担体と活性成分を関連させるステップを含むことができる。組成物は、活性成分を液体担体もしくは微粉化固体担体またはその両方と均一かつ密接に混合し、次に必要に応じて、この産物を所望の体裁に成形することにより調製することができる。
水は、一部の化合物の分解を容易にし得るため、本開示は、活性成分（１種または複数の抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体等）を含む無水医薬組成物および剤形をさらに包含する。例えば、薬学技術分野において、経時的な製剤の有効期間または安定性等の特徴を決定するために、長期貯蔵をシミュレートする手段として、水を加えることができる（例えば、５％）。本開示の無水医薬組成物および剤形は、無水または低水分含有成分および低水分または低湿度条件を使用して調製することができる。製造、包装および／または貯蔵中に水分および／または湿度との実質的な接触が予想される場合、本開示の医薬組成物および剤形は、無水にすることができる。無水医薬組成物は、その無水性質が維持されるように調製および貯蔵することができる。したがって、無水組成物は、適した処方キットに含まれ得るように、水への曝露を防止することが公知の材料を使用して包装することができる。適した包装の例として、密封ホイル、プラスチックその他、単位用量容器、ブリスターパックおよびストリップパックが挙げられるがこれらに限定されない。
活性成分（１種または複数の抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体等）は、従来の医薬品配合技法に従って、医薬品担体との密接な混合物において組み合わせることができる。担体は、投与に望まれる調製物の形態に応じて多種多様な形態を採ることができる。経口剤形のための組成物の調製において、通常の医薬品培地のいずれかを担体として用いることができ、その例として、経口液体調製物（懸濁液、溶液およびエリキシル剤等）またはエアロゾルの場合は水、グリコール、油、アルコール、調味料、保存料、着色料その他が挙げられるがこれらに限定されない；または、デンプン、糖、微結晶性セルロース、希釈液、造粒剤、潤滑剤、バインダーおよび崩壊剤等の担体は、経口固体調製物の場合に、一部の実施形態では、ラクトースを使用することなく使用することができる。例えば、適した担体は、固体経口調製物による、粉末、カプセル、顆粒および錠剤を含む。必要に応じて、錠剤は、標準水性または非水性技法によりコーティングすることができる。
本医薬組成物および剤形における使用に適したバインダーとして、トウモロコシデンプン、ジャガイモデンプンまたは他のデンプン、ゼラチン、アラビアゴム等の天然および合成ゴム、アルギン酸ナトリウム、アルギン酸、他のアルギン酸塩、粉末トラガント、グアーガム、セルロースおよびその誘導体（例えば、エチルセルロース、酢酸セルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム）、ポリビニルピロリドン、メチルセルロース、アルファ化デンプン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、微結晶性セルロースならびにこれらの混合物が挙げられるがこれらに限定されない。
本明細書に開示されている医薬組成物および剤形における使用に適したフィラーの例として、タルク、タルカム、炭酸カルシウム（例えば、顆粒または粉末）、微結晶性セルロース、粉末セルロース、デキストレート（ｄｅｘｔｒａｔｅ）、カオリン、マンニトール、ケイ酸、ソルビトール、デンプン、アルファ化デンプンおよびこれらの混合物が挙げられるがこれらに限定されない。
本開示の組成物において崩壊剤を使用して、水性環境に曝露されると崩壊する錠剤を提供することができる。多すぎる崩壊剤は、ボトル内で崩壊し得る錠剤を生じ得る。少なすぎると、崩壊の発生に不十分となる場合があり、よって、剤形からの活性成分（複数可）の放出の速度および程度を変更し得る。よって、活性成分（複数可）の放出を有害に変更するほど少なすぎも多すぎもしない十分な量の崩壊剤を使用して、本明細書に開示されている化合物の剤形を形成することができる。使用される崩壊剤の量は、製剤の種類および投与様式に基づき変動する可能性があり、当業者には容易に識別可能である。約０．５〜約１５重量パーセントの崩壊剤または約１〜約５重量パーセントの崩壊剤を医薬組成物において使用することができる。本開示の医薬組成物および剤形の形成に使用することができる崩壊剤として、寒天−寒天、アルギン酸、炭酸カルシウム、微結晶性セルロース、クロスカルメロースナトリウム、ポビドン、ポビドンｋ３０、クロスポビドン、ポラクリンカリウム、デンプングリコール酸ナトリウム、ジャガイモもしくはタピオカデンプン、他のデンプン、アルファ化デンプン、他のデンプン、粘土、他のアルギン、他のセルロース、ガムまたはこれらの混合物が挙げられるがこれらに限定されない。
本開示の医薬組成物および剤形の形成に使用することができる潤滑剤として、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、鉱油、軽油、グリセリン、ソルビトール、マンニトール、ポリエチレングリコール、他のグリコール、ステアリン酸、ラウリル硫酸ナトリウム、タルク、水素付加植物油（例えば、ピーナッツ油、綿実油、ヒマワリ油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油およびダイズ油）、ステアリン酸亜鉛、オレイン酸エチル、ラウリン酸エチル（ｅｔｈｙｌ ｌａｕｒｅａｔｅ）、寒天またはこれらの混合物が挙げられるがこれらに限定されない。追加的な潤滑剤は、例えば、シロイド（ｓｙｌｏｉｄ）シリカゲル、合成シリカの凝固エアロゾルまたはこれらの混合物を含む。医薬組成物の約１重量パーセント未満の量の潤滑剤を任意選択で添加することができる。
１種または複数の抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体を含む組成物が、経口投与に望まれる場合、その中の組成物は、水、エタノール、プロピレングリコール、グリセリンおよびこれらの様々な組合せ等の希釈液と共に、様々な甘味料または調味料（例えば、アスパルテーム、糖）、着色物質または色素（例えば、黄色染料）および所望であれば、乳化および／または懸濁化剤と組み合わせることができる。
甘味剤、甘味料または調味料は、食物、飲料または医薬組成物を甘くする物質である。甘味剤は、糖、サッカリンまたは他の低カロリー合成産物（Ｒａｎｄｏｍ Ｈｏｕｓｅ Ｕｎａｂｒｉｄｇｅｄ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ、第２版より）であり得る。甘味料または調味料の非限定例として、Ｎ−（Ｎ−（３−（３−ヒドロキシ−４−メトキシフェニル）プロピル）−アルファ−アスパルチル）−Ｌ−フェニルアラニン１−メチルエステル（アスパルテーム）、１１−オキソ−モグロシドＶ、アスパルチル−アラニンフェンキルエステル、アブルソシドＡメチルエステル、ネオテーム、オスラジン、ＳＣ４５６４７、セロビオフルクトース（、ゲンチオビオフルクトース、４，４’，６，６’−テトラクロロ−４，４’，６，６’−テトラデオキシガラクトトレハロース、ブラゼインタンパク質、Ｐｅｎｔａｄｉｐｌａｎｄｒａ ｂｒａｚｚｅａｎａ、ヒドランゲノール−４’−Ｏ−グルコシド、ヒドランゲノール−８−Ｏ−ガラクトシド、３，３’−ジデオキシトレハロース、セリゲアインＡ、ペリアンドリンＶ、ＮＣ１７４、マビンリンタンパク質、Ｃａｐｐａｒｉｓ ｍａｓａｉｋａｉ、アリターム、シクロカリオシドＡ、マビリンＩＩタンパク質、Ｃａｐｐａｒｉｓ ｍａｓａｉｋａｉ、Ｎ−（４−シアノフェニル）−Ｎ’−（２−カルボキシエチル）ウレア、ステビオールビオシド、アデントール、ペリアンドラズルシンＣ、ペリアンドラズルシンＢ、ペリアンドラズルシンＡ、スウィートレクス、モネリン、Ａｓｎ（２２）−Ｇｌｎ（２５）−Ａｓｎ（２６）−Ａ−鎖−Ａｓｎ（４９）−Ｇｌｕ（５０）−Ｂ−鎖、クルクリン、ロイクロース、ポリポドシドＡ、ルブソシド、グリチルレチル３−モノグルクロニド、オキシムＶ、ヘルナンズルシン、フンジテトラオース、ネオシュガー、モグロシドＩＶ、モグロシドＶ、モグロシドＶＩ、カップリング糖、４−クロロキヌレニン、グルコシルスクロース、６−クロロトリプトファン、レバウジオシドＡ、ペリラルチン、ヒドランゲノール、パラチニット、リカシン、シクロヘプチルスルファメート、ＣＨ４０１−Ｎａ、ネオヘスペリジンジヒドロカルコン、Ｐ４０００、マルチトール、フィロズルシン、ミラクリンタンパク質、Ｓｙｎｓｅｐａｌｕｍ ｄｕｌｃｉｆｉｃｕｍ、アセスルファム（ａｃｅｔｏｓｕｌｆａｍ）またはズルシンが挙げられる。
錠剤は、コーティングされていなくてもよいか、または公知技法によってコーティングされて、胃腸管における崩壊および吸収を遅延させ、これにより、より長い期間にわたり持続した作用をもたらしてもよい。例えば、モノステアリン酸グリセリンまたはジステアリン酸グリセリル等、時間遅延材料を用いることができる。経口使用のための製剤は、活性成分が不活性固体希釈剤、例えば、炭酸カルシウム、リン酸カルシウムもしくはカオリンと混合された硬ゼラチンカプセルとして、または活性成分が水もしくは油培地、例えば、ピーナッツ油、液体パラフィンもしくはオリーブ油と混合された軟ゼラチンカプセルとして提示することもできる。
本開示の医薬組成物および剤形の形成に使用することができる界面活性物質として、親水性界面活性物質、親油性界面活性物質およびこれらの混合物が挙げられるがこれらに限定されない。すなわち、親水性界面活性物質の混合物を用いることができるか、親油性界面活性物質の混合物を用いることができるか、または少なくとも１種の親水性界面活性物質および少なくとも１種の親油性界面活性物質の混合物を用いることができる。
適した親水性界面活性物質は、一般に、少なくとも１０のＨＬＢ値を有することができるが、適した親油性界面活性物質は、一般に、約１０のまたはそれ未満のＨＬＢ値を有することができる。非イオン性両親媒性化合物の相対的親水性および疎水性の特徴付けに使用される経験的パラメータは、親水性−親油性バランス（「ＨＬＢ」値）である。より低いＨＬＢ値を有する界面活性物質は、より親油性または疎水性であり、油におけるより大きい溶解性を有するが、より高いＨＬＢ値を有する界面活性物質は、より親水性であり、水溶液におけるより大きい溶解性を有する。親水性界面活性物質は、一般に、約１０よりも大きいＨＬＢ値を有する化合物、およびＨＬＢスケールが一般に適用不能なアニオン性、カチオン性または双性イオン化合物であるとみなされる。同様に、親油性（すなわち、疎水性）界面活性物質は、約１０に等しいまたはそれ未満のＨＬＢ値を有する化合物である。しかし、界面活性物質のＨＬＢ値は、工業、医薬品および化粧品エマルションの製剤化を可能にするために一般に使用される単に大雑把な目安である。
親水性界面活性物質は、イオン性または非イオン性のいずれかであり得る。適したイオン性界面活性物質として、アルキルアンモニウム塩；フシジン酸塩；アミノ酸、オリゴペプチドおよびポリペプチドの脂肪酸誘導体；アミノ酸、オリゴペプチドおよびポリペプチドのグリセリド誘導体；レシチンおよび水素付加レシチン；リゾレシチンおよび水素付加リゾレシチン；リン脂質およびその誘導体；リゾリン脂質およびその誘導体；カルニチン脂肪酸エステル塩；アルキルサルフェートの塩；脂肪酸塩；ドクセートナトリウム；アシルラクチレート；モノおよびジグリセリドのモノおよびジアセチル化酒石酸エステル；サクシニル化モノおよびジグリセリド；モノおよびジグリセリドのクエン酸エステル；ならびにこれらの混合物が挙げられるがこれらに限定されない。
上述の群のうち、イオン性界面活性物質は、例として：レシチン、リゾレシチン、リン脂質、リゾリン脂質およびこれらの誘導体；カルニチン脂肪酸エステル塩；アルキルサルフェートの塩；脂肪酸塩；ドクセートナトリウム；アシルラクチレート（ａｃｙｌａｃｔｙｌａｔｅ）；モノおよびジグリセリドのモノおよびジアセチル化酒石酸エステル；サクシニル化モノおよびジグリセリド；モノおよびジグリセリドのクエン酸エステル；ならびにこれらの混合物を含む。
イオン性界面活性物質は、電離型のレシチン、リゾレシチン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸、ホスファチジルセリン、リゾホスファチジルコリン、リゾホスファチジルエタノールアミン、リゾホスファチジルグリセロール、リゾホスファチジン酸、リゾホスファチジルセリン、ＰＥＧ−ホスファチジルエタノールアミン、ＰＶＰ−ホスファチジルエタノールアミン、脂肪酸のラクチル酸エステル、ステアロイル−２−ラクチレート、ステアロイルラクチレート、サクシニル化モノグリセリド、モノ／ジグリセリドのモノ／ジアセチル化酒石酸エステル、モノ／ジグリセリドのクエン酸エステル、コリルサルコシン、カプロン酸塩、カプリル酸塩、カプリン酸塩、ラウリン酸塩、ミリスチン酸塩、パルミチン酸塩、オレイン酸塩、リシノール酸塩、リノール酸塩、リノレン酸塩、ステアリン酸塩、ラウリル硫酸塩、テラセシル硫酸塩、ドクセート、ラウロイルカルニチン、パルミトイルカルニチン、ミリストイルカルニチンならびにこれらの塩および混合物であり得る。
親水性非イオン性界面活性物質として、アルキルグルコシド；アルキルマルトシド；アルキルチオグルコシド；ラウリルマクロゴールグリセリド；ポリエチレングリコールアルキルエーテル等、ポリオキシアルキレンアルキルエーテル；ポリエチレングリコールアルキルフェノール等、ポリオキシアルキレンアルキルフェノール；ポリエチレングリコール脂肪酸モノエステルおよびポリエチレングリコール脂肪酸ジエステル等、ポリオキシアルキレンアルキルフェノール脂肪酸エステル；ポリエチレングリコールグリセロール脂肪酸エステル；ポリグリセロール脂肪酸エステル；ポリエチレングリコールソルビタン脂肪酸エステル等、ポリオキシアルキレンソルビタン脂肪酸エステル；グリセリド、植物油、水素付加植物油、脂肪酸およびステロールからなる群の少なくとも１つのメンバーによるポリオールの親水性エステル転移反応産物；ポリオキシエチレンステロール、その誘導体および類似体；ポリオキシエチル化ビタミンおよびその誘導体；ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマー；ならびにこれらの混合物；ポリエチレングリコールソルビタン脂肪酸エステル、ならびにトリグリセリド、植物油および水素付加植物油からなる群の少なくとも１つのメンバーによるポリオールの親水性エステル転移反応産物を挙げることができるがこれらに限定されない。ポリオールは、グリセロール、エチレングリコール、ポリエチレングリコール、ソルビトール、プロピレングリコール、ペンタエリスリトールまたはサッカライドであり得る。
他の親水性非イオン性界面活性物質は、ＰＥＧ−１０ラウリン酸塩、ＰＥＧ−１２ラウリン酸塩、ＰＥＧ−２０ラウリン酸塩、ＰＥＧ−３２ラウリン酸塩、ＰＥＧ−３２ジラウリン酸塩、ＰＥＧ−１２オレイン酸塩、ＰＥＧ−１５オレイン酸塩、ＰＥＧ−２０オレイン酸塩、ＰＥＧ−２０ジオレイン酸塩、ＰＥＧ−３２オレイン酸塩、ＰＥＧ−２００オレイン酸塩、ＰＥＧ−４００オレイン酸塩、ＰＥＧ−１５ステアリン酸塩、ＰＥＧ−３２ジステアリン酸塩、ＰＥＧ−４０ステアリン酸塩、ＰＥＧ−１００ステアリン酸塩、ＰＥＧ−２０ジラウリン酸塩、ＰＥＧ−２５グリセリルトリオレイン酸塩、ＰＥＧ−３２ジオレイン酸塩、ＰＥＧ−２０グリセリルラウリン酸塩、ＰＥＧ−３０グリセリルラウリン酸塩、ＰＥＧ−２０グリセリルステアリン酸塩、ＰＥＧ−２０グリセリルオレイン酸塩、ＰＥＧ−３０グリセリルオレイン酸塩、ＰＥＧ−３０グリセリルラウリン酸塩、ＰＥＧ−４０グリセリルラウリン酸塩、ＰＥＧ−４０パーム核油、ＰＥＧ−５０水素付加ヒマシ油、ＰＥＧ−４０ヒマシ油、ＰＥＧ−３５ヒマシ油、ＰＥＧ−６０ヒマシ油、ＰＥＧ−４０水素付加ヒマシ油、ＰＥＧ−６０水素付加ヒマシ油、ＰＥＧ−６０トウモロコシ油、ＰＥＧ−６カプリン酸塩／カプリル酸塩グリセリド、ＰＥＧ−８カプリン酸塩／カプリル酸塩グリセリド、ポリグリセリル−１０ラウリン酸塩、ＰＥＧ−３０コレステロール、ＰＥＧ−２５フィトステロール、ＰＥＧ−３０大豆ステロール、ＰＥＧ−２０トリオレイン酸塩、ＰＥＧ−４０ソルビタンオレイン酸塩、ＰＥＧ−８０ソルビタンラウリン酸塩、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、ＰＯＥ−９ラウリルエーテル、ＰＯＥ−２３ラウリルエーテル、ＰＯＥ−１０オレイルエーテル、ＰＯＥ−２０オレイルエーテル、ＰＯＥ−２０ステアリルエーテル、トコフェリルＰＥＧ−１００コハク酸塩、ＰＥＧ−２４コレステロール、ポリグリセリル−１０オレイン酸塩、Ｔｗｅｅｎ４０、Ｔｗｅｅｎ６０、スクロースモノステアリン酸塩、スクロースモノラウリン酸塩、スクロースモノパルミチン酸塩、ＰＥＧ１０−１００ノニルフェノールシリーズ、ＰＥＧ１５−１００オクチルフェノールシリーズおよびポロクサマーを限定することなく含む。
適した親油性界面活性物質は、単なる一例として：脂肪アルコール；グリセロール脂肪酸エステル；アセチル化グリセロール脂肪酸エステル；低級アルコール脂肪酸エステル；プロピレングリコール脂肪酸エステル；ソルビタン脂肪酸エステル；ポリエチレングリコールソルビタン脂肪酸エステル；ステロールおよびステロール誘導体；ポリオキシエチル化ステロールおよびステロール誘導体；ポリエチレングリコールアルキルエーテル；糖エステル；糖エーテル；モノおよびジグリセリドの乳酸誘導体；グリセリド、植物油、水素付加植物油、脂肪酸およびステロールからなる群の少なくとも１つのメンバーによるポリオールの疎水性エステル転移反応産物；油溶性ビタミン／ビタミン誘導体；ならびにこれらの混合物を含む。この群のうち、好ましい親油性界面活性物質は、グリセロール脂肪酸エステル、プロピレングリコール脂肪酸エステルおよびこれらの混合物を含む、または植物油、水素付加植物油およびトリグリセリドからなる群の少なくとも１つのメンバーによるポリオールの疎水性エステル転移反応産物である。
一実施形態では、組成物は、可溶化剤を含んで、本開示の化合物の十分な可溶化および／または溶解を確実にし、本開示の化合物の沈殿を最小化することができる。これは、非経口使用のための組成物、例えば、注射のための組成物に特に有益となり得る。可溶化剤を添加して、界面活性物質等、親水性薬物および／もしくは他の構成成分の溶解性を増加させる、または安定的もしくは均質な溶液もしくは分散として組成物を維持することもできる。
適した可溶化剤の例として、次のものが挙げられるがこれらに限定されない：エタノール、イソプロパノール、ブタノール、ベンジルアルコール、エチレングリコール、プロピレングリコール、ブタンジオールおよびその異性体、グリセロール、ペンタエリスリトール、ソルビトール、マンニトール、トランスクトール、ジメチルイソソルビド、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルメチルセルロースおよび他のセルロース誘導体、シクロデキストリンおよびシクロデキストリン誘導体等、アルコールおよびポリオール；テトラヒドロフルフリルアルコールＰＥＧエーテル（グリコフロール）またはメトキシＰＥＧ等、約２００〜約６０００の平均分子量を有するポリエチレングリコールのエーテル；２−ピロリドン、２−ピペリドン、ε−カプロラクタム、Ｎ−アルキルピロリドン、Ｎ−ヒドロキシアルキルピロリドン、Ｎ−アルキルピペリドン、Ｎ−アルキルカプロラクタム、ジメチルアセトアミドおよびポリビニルピロリドン等、アミドおよび他の窒素含有化合物；プロピオン酸エチル、クエン酸塩、クエン酸トリブチル、アセチルクエン酸トリエチル、アセチルクエン酸トリブチル、クエン酸トリエチル、オレイン酸エチル、カプリル酸エチル、酪酸エチル、トリアセチン、プロピレングリコールモノアセテート、プロピレングリコールジアセテート、ε−カプロラクトンおよびその異性体、δ−バレロラクトンおよびその異性体、β−ブチロラクトンおよびその異性体等、エステル；ならびにジメチルアセトアミド、ジメチルイソソルビド、Ｎ−メチルピロリドン、モノオクタノイン、ジエチレングリコールモノエチルエーテルおよび水等、当技術分野で公知の他の可溶化剤。
可溶化剤の混合物を使用することもできる。例として、トリアセチン、クエン酸トリエチル、オレイン酸エチル、カプリル酸エチル、ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチルピロリドン、Ｎ−ヒドロキシエチルピロリドン、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルシクロデキストリン、エタノール、ポリエチレングリコール２００−１００、グリコフロール、トランスクトール、プロピレングリコールおよびジメチルイソソルビドが挙げられるがこれらに限定されない。他の例示的な可溶化剤は、ソルビトール、グリセロール、トリアセチン、エチルアルコール、ＰＥＧ−４００、グリコフロールおよびプロピレングリコールを含む。
含まれ得る可溶化剤の量は、特に限定されない。所与の可溶化剤の量は、当業者によって容易に決定することができる生体許容できる量に限定することができる。一部の状況では、例えば、蒸留または蒸発等の従来の技法を使用して、対象に組成物を与える前に過剰な可溶化剤を除去しつつ、薬物の濃度を最大化するために、生体許容できる量をはるかに超過した可溶化剤の量を含むことが有利であり得る。よって、存在する場合、可溶化剤は、薬物および他の賦形剤の組み合わされた重量に対して、重量で１０％、２５％、５０％、１００％または最大約２００％の重量比であり得る。必要に応じて、５％、２％、１％またはさらにより少ない等、ごく少量の可溶化剤を使用することもできる。典型的には、可溶化剤は、重量で約１％〜約１００％、より典型的には、約５％〜約２５％の量で存在することができる。
組成物は、１種または複数の薬学的に許容される添加物および賦形剤をさらに含むことができる。かかる添加物および賦形剤は、粘着除去剤（ｄｅｔａｃｋｉｆｉｅｒ）、消泡剤、緩衝剤、ポリマー、抗酸化剤、保存料、キレート剤、粘性調節剤、浸透圧調節剤、香味料、着色剤、匂い物質、乳白剤、懸濁化剤、バインダー、フィラー、可塑剤、潤滑剤およびこれらの混合物を限定することなく含む。
加えて、加工を容易にするため、安定性を増強するため、または他の理由のため、酸または塩基を組成物に取り込むことができる。薬学的に許容される塩基の例として、アミノ酸、アミノ酸エステル、水酸化アンモニウム、水酸化カリウム、水酸化ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、水酸化アルミニウム、炭酸カルシウム、水酸化マグネシウム、ケイ酸アルミニウムマグネシウム、合成ケイ酸アルミニウム、合成ヒドロカルサイト、水酸化マグネシウムアルミニウム、ジイソプロピルエチルアミン、エタノールアミン、エチレンジアミン、トリエタノールアミン、トリエチルアミン、トリイソプロパノールアミン、トリメチルアミン、ｔｒｉｓ（ヒドロキシメチル）アミノメタン（ＴＲＩＳ）その他が挙げられる。酢酸、アクリル酸、アジピン酸、アルギン酸、アルカンスルホン酸、アミノ酸、アスコルビン酸、安息香酸、ホウ酸、酪酸、炭酸、クエン酸、脂肪酸、ギ酸、フマル酸、グルコン酸、ヒドロキノスルホン酸、イソアスコルビン酸、乳酸、マレイン酸、シュウ酸、パラ−ブロモフェニルスルホン酸、プロピオン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、サリチル酸、ステアリン酸、コハク酸、タンニン酸、酒石酸、チオグリコール酸、トルエンスルホン酸、尿酸その他等、薬学的に許容される酸の塩である塩基も適している。リン酸ナトリウム、リン酸水素二ナトリウムおよびリン酸二水素ナトリウム等、多塩基酸の塩を使用することもできる。塩基が塩である場合、カチオンは、アンモニウム、アルカリ金属、アルカリ土類金属その他等、いずれか簡便かつ薬学的に許容されるカチオンであり得る。例として、ナトリウム、カリウム、リチウム、マグネシウム、カルシウムおよびアンモニウムを挙げることができるがこれらに限定されない。
適した酸は、薬学的に許容される有機または無機酸である。使用することができる適した無機酸の例として、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸、硝酸、ホウ酸、リン酸その他が挙げられる。適した有機酸の例として、酢酸、アクリル酸、アジピン酸、アルギン酸、アルカンスルホン酸、アミノ酸、アスコルビン酸、安息香酸、ホウ酸、酪酸、炭酸、クエン酸、脂肪酸、ギ酸、フマル酸、グルコン酸、ヒドロキノスルホン酸、イソアスコルビン酸、乳酸、マレイン酸、メタンスルホン酸、シュウ酸、パラ−ブロモフェニルスルホン酸、プロピオン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、サリチル酸、ステアリン酸、コハク酸、タンニン酸、酒石酸、チオグリコール酸、トルエンスルホン酸、尿酸その他が挙げられる。
生理食塩水における水溶液も従来から注射のために使用されている。例として、エタノール、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールその他（およびこれらの適した混合物）、シクロデキストリン誘導体が挙げられ、植物油を用いることもできる。分散の場合は要求される粒子サイズの維持のために、例えば、レシチン等、コーティングの使用により、また、界面活性物質の使用により、適切な流動性を維持することができる。微生物の作用の防止は、様々な抗細菌および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールその他によってもたらすことができる。
無菌注射用溶液は、必要に応じて、上に列挙されている様々な他の成分を有する適切な溶媒において要求される量の本開示の化合物を取り込み、続いて濾過滅菌することにより調製される。一般に、分散は、基本分散媒および上に列挙されているもののうち要求される他の成分を含有する無菌媒体へと様々な滅菌した活性成分を取り込むことにより調製される。無菌注射用溶液の調製のための無菌粉末の場合、ある特定の望ましい調製方法は、事前に滅菌濾過したその溶液から活性成分プラスいずれか追加的な所望の成分の粉末を生じる、真空乾燥およびフリーズドライ技法である。
吸入またはガス注入のための組成物は、薬学的に許容される、水性もしくは有機溶媒またはこれらの混合物における溶液および懸濁液ならびに粉末を含む。液体または固体組成物は、上記参照の通りの適した薬学的に許容される賦形剤を含有することができる。組成物は、局所的または全身性効果のための経口または鼻呼吸経路により投与することができる。薬学的に許容される溶媒における組成物は、不活性ガスの使用により噴霧することができる。噴霧された溶液は、噴霧デバイスから直接的に吸入することができるか、または噴霧デバイスは、フェイスマスクテントもしくは断続的陽圧呼吸機械に取り付けることができる。溶液、懸濁液または粉末組成物は、適切な様式で製剤を送達するデバイスから好ましくは、経口または経鼻投与することができる。
医薬組成物は、本明細書に記載されている組成物、および舌下、頬側、直腸、骨内、眼内、鼻腔内、硬膜外または脊髄内投与に適した１種または複数の薬学的に許容される賦形剤から調製することもできる。かかる医薬組成物の調製は、当技術分野で周知である。例えば、全てこれらの全体が参照により本明細書に組み込まれるＡｎｄｅｒｓｏｎ， Ｐｈｉｌｉｐ Ｏ．；Ｋｎｏｂｅｎ， Ｊａｍｅｓ Ｅ．；Ｔｒｏｕｔｍａｎ， Ｗｉｌｌｉａｍ Ｇ編、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｄｒｕｇ Ｄａｔａ、第１０版、ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ、２００２年；ＰｒａｔｔおよびＴａｙｌｏｒ編、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｄｒｕｇ Ａｃｔｉｏｎ、第３版、Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９０年；Ｋａｔｚｕｎｇ編、Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、第９版、ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ、２００３７ｙｂｇ；ＧｏｏｄｍａｎおよびＧｉｌｍａｎ編、Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、第１０版、ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ、２００１年；Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第２０版、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ．、２０００年；Ｍａｒｔｉｎｄａｌｅ、Ｔｈｅ Ｅｘｔｒａ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ、第３２版（Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｅｓｓ、Ｌｏｎｄｏｎ、１９９９年）を参照されたい。
１種または複数の抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体を含有するリポソームは、Ｅｐｓｔｅｉｎら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８２巻：３６８８頁（１９８５年）；Ｈｗａｎｇら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７７巻：４０３０頁（１９８０年）；ならびに米国特許第４，４８５，０４５号および同第４，５４４，５４５号に記載されている方法等、当技術分野で公知の方法によって調製することができる。増強された循環時間を有するリポソームは、米国特許第５，０１３，５５６号に開示されている。ホスファチジルコリン、コレステロールおよびＰＥＧ誘導体化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）を含む脂質組成物による逆相蒸発方法により、特に有用なリポソームを作製することができる。リポソームが、既定のポアサイズのフィルターを通して押し出されて、所望の直径を有するリポソームを生じる。
活性成分は、例えば、コアセルベーション技法または界面重合により調製されたマイクロカプセルに封入することもできる、例えば、それぞれコロイド薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルション、ナノ粒子およびナノカプセル）またはマクロエマルションにおける、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチンマイクロカプセルおよびポリ（メチルメタクリル酸（ｍｅｔｈｙｌｍｅｔｈａｃｙｌａｔｅ））マイクロカプセル。かかる技法は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ、Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ 第２０版、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ（２０００年）に開示されている。
キット
本開示は、本方法における使用のためのキットも提供する。本開示のキットは、本明細書に記載されている１種または複数の抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体（ヒト化抗体等）またはポリペプチドを含む１個または複数の容器と、本明細書に記載されている本開示の方法のいずれかに従った使用のための説明書とを含む。一般に、このような説明書は、本明細書に記載されている方法のいずれかに従って代謝障害または代謝障害に関連する状態（糖尿病等）を処置、寛解または予防するための、１種または複数の抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体の投与に関する記載を含む。キットは、個体が代謝障害を有するかまたは個体に代謝障害を有するリスクがあるかを同定することに基づく、処置に適した個体の選択に関する記載をさらに含むことができる。さらに他の実施形態では、説明書は、代謝障害（糖尿病等）を有するリスクがある個体への抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体の投与に関する記載を含む。
一部の実施形態では、抗体は、ヒト化抗体である。一部の実施形態では、抗体は、ヒトである。一部の実施形態では、抗体は、モノクローナル抗体である。一部の実施形態では。一部の実施形態では、抗体は、抗体Ｇ１の１個または複数のＣＤＲ（Ｇ１由来の１、２、３、４、５個または一部の実施形態では、全６個のＣＤＲ等）を含む。
抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体の使用に関する説明書は、典型的に、意図される処置の投薬量、投薬スケジュールおよび投与経路に関する情報を含む。容器は、単位用量、バルク包装（例えば、複数用量包装）またはサブユニット用量であり得る。本開示のキットに供給される説明書は、典型的に、ラベルまたは添付文書における書面の説明書である（例えば、キットに含まれる紙のシート）が、機械可読説明書（例えば、磁気または光学記憶ディスクに持ち込まれた説明書）も許容される。
一部の実施形態では、ラベルまたは添付文書は、組成物が、代謝障害（糖尿病等）の処置、寛解および／または予防に使用されることを示す。説明書は、本明細書に記載されている方法のいずれかを実施するために提供することができる。
一部の例において、キットは、当技術分野で公知のまたは本明細書に提供されている１種または複数の抗代謝障害剤または抗糖尿病剤等、１種または複数の追加的な治療剤を含む。よって、キットは、ＨＭＧ−ＣｏＡ阻害剤（またはスタチン）、ビグアナイド、スルホニルウレア（ｓｕｆｏｎｙｌｕｒｅａ）、チアゾリジンジオン、メグリチニド、グリニド、α−グルコシダーゼ阻害剤、レパグリニド、ナテグリニド、ＤＰＰ−ＩＶ阻害剤、シタグリプチン、ビルダグリプチン、サキサグリプチンまたはインスリンおよびインスリン類似体のうち１種または複数（１、２、３、４または５種等）を含むことができる。他の例示的な追加的な抗代謝障害剤または抗糖尿病剤は、上に提示されている。かかる追加的な治療剤は、抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体と同じまたは別々の容器に入れてよい。
本開示のキットは、典型的に、適した包装中に存在する。適した包装として、バイアル、ボトル、ジャー、フレキシブルな包装（例えば、封着されたＭｙｌａｒまたはプラスチック袋）その他が挙げられるがこれらに限定されない。インヘラー、経鼻投与デバイス（例えば、アトマイザ）またはミニポンプ等の注入デバイス等、特定のデバイスと組み合わせた使用のための包装も企図される。キットは、無菌アクセスポートを有することができる（例えば、容器は、皮下組織注射針によって貫通可能なストッパを有する静脈内溶液バッグまたはバイアルであり得る）。容器は、無菌アクセスポートを有することもできる（例えば、容器は、皮下組織注射針によって貫通可能なストッパを有する静脈内溶液バッグまたはバイアルであり得る）。一部の実施形態では、組成物における少なくとも１種の活性薬剤は、抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体である。容器は、第２の薬学的活性薬剤または治療剤をさらに含むことができる。
キットは、バッファーおよび解釈的な情報等、追加的な構成成分を任意選択で提供することができる。通常、キットは、容器と、該容器に貼り付けたまたは結び付けたラベルまたは添付文書（複数可）を含む。
（実施例１）
ＣＧＲＰに対するモノクローナル抗体の作製および特徴付け
抗ＣＧＲＰ抗体の作製。ラットおよびヒトＣＧＲＰに対し異種間反応性を有する抗ＣＧＲＰ抗体を作製するために、アジュバントにおけるＫＬＨにコンジュゲートされた２５〜１００μｇのヒトα−ＣＧＲＰまたはβ−ＣＧＲＰでマウスを様々な間隔で免疫化した（足蹠当たり５０μｌ、マウス当たり合計１００μｌ）。免疫化は、一般に、Ｇｅｅｒｌｉｇｓら、１９８９年、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ １２４巻：９５〜１０２頁；Ｋｅｎｎｅｙら、１９８９年、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ １２１巻：１５７〜１６６頁；およびＷｉｃｈｅｒら、１９８９年、Ｉｎｔ． Ａｒｃｈ． Ａｌｌｅｒｇｙ Ａｐｐｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．８９巻：１２８〜１３５頁に記載されている通りに行った。マウスはまず、ＣＦＡ（完全フロイントアジュバント）におけるＫＬＨにコンジュゲートされた５０μｇのヒトα−ＣＧＲＰまたはβ−ＣＧＲＰで免疫化した。２１日後に、マウスを第２に、ＩＦＡ（不完全フロイントアジュバント）におけるＫＬＨにコンジュゲートされた２５μｇのヒトβ−ＣＧＲＰ（ヒトα−ＣＧＲＰでまず免疫化したマウスのため）またはα−ＣＧＲＰ（ヒトβ−ＣＧＲＰでまず免疫化したマウスのため）で免疫化した。第２の免疫化から２３日後に、ＩＦＡにおけるＫＬＨにコンジュゲートされた２５μｇのラットα−ＣＧＲＰにより第３の免疫化を行った。１０日後に、ＥＬＩＳＡを使用して抗体価を検査した。第３の免疫化から３４日後に、ＩＦＡにおける２５μｇのペプチド（ラットα−ＣＧＲＰ−ＫＬＨ）により第４の免疫化を行った。第４の（ｆｏｒｔｈ）免疫化から３２日後に、１００μｇ可溶性ペプチド（ラットα−ＣＧＲＰ）により最終ブースターを行った。
免疫化マウスから脾細胞を得て、ポリエチレングリコール１５００により、１０：１の比でＮＳＯミエローマ細胞と融合させた。９６ウェルプレート内の２０％ウマ血清および２−オキサロ酢酸塩／ピルビン酸塩／インスリン（Ｓｉｇｍａ）を含有するＤＭＥＭにハイブリッドを蒔き、ヒポキサンチン／アミノプテリン／チミジン選択を始めた。８日目に、２０％ウマ血清を含有する１００μｌのＤＭＥＭを全ウェルに添加した。抗体捕捉イムノアッセイを使用することにより、ハイブリッドの上清をスクリーニングした。クラス特異的な第２の抗体により、抗体クラスの決定を行った。
さらなる特徴付けのために、ヒトおよびラットＣＧＲＰへのその結合に基づきモノクローナル抗体産生細胞株のパネルを選択した。これらの抗体および特徴を下表２および３に示す。
精製およびＦａｂ断片調製。さらなる特徴付けのために選択されたモノクローナル抗体を、プロテインＡ親和性クロマトグラフィーを使用してハイブリドーマ培養物の上清から精製した。上清をｐＨ８に平衡化した。次に、上清を、ｐＨ８となるようＰＢＳで平衡化したプロテインＡカラムＭａｂＳｅｌｅｃｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ＃１７−５１９９−０２）にロードした。５カラム容量のＰＢＳ、ｐＨ８でカラムを洗浄した。５０ｍＭクエン酸塩−リン酸塩バッファー、ｐＨ３で抗体を溶出させた。溶出された抗体を１Ｍリン酸塩バッファー、ｐＨ８で中和した。精製された抗体をＰＢＳ、ｐＨ７．４で透析した。マウスモノクローナル抗体標準曲線を使用して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより抗体濃度を決定した。
Ｉｍｍｕｎｏｐｕｒｅ Ｆａｂキット（Ｐｉｅｒｃｅ＃４４８８５）を使用して、完全抗体のパパインタンパク質分解によりＦａｂを調製し、製造業者の説明書に従ったプロテインＡクロマトグラフィーのフロースルーにより精製した。公知濃度（アミノ酸解析により決定）の標準Ｆａｂを使用したＥＬＩＳＡおよび／またはＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動により、また、１ＯＤ＝０．６ｍｇ／ｍｌ（またはアミノ酸配列に基づく理論上の当量）を使用したＡ２８０により濃度を決定した。
Ｆａｂの親和性決定。製造業者独自のランニングバッファー、ＨＢＳ−ＥＰ（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．００５％ｖ／ｖポリソルベートＰ２０）によるＢｉａｃｏｒｅ３０００（商標）表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）システム（Ｂｉａｃｏｒｅ，ＩＮＣ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ ＮＪ）を使用して、２５℃または３７℃のいずれかで抗ＣＧＲＰモノクローナル抗体の親和性を決定した。ＳＡチップに予め固定化されたストレプトアビジンを介して、Ｎ末端ビオチン化ＣＧＲＰペプチド（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｎｅｗ ＪｅｒｓｅｙまたはＧｌｏｂａｌ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、Ｃｏｌｏｒａｄｏから特注）を捕捉し、ＣＧＲＰ表面にわたって力価決定された抗体Ｆａｂの結合動態を測定することにより親和性を決定した。ビオチン化ＣＧＲＰをＨＢＳ−ＥＰに希釈し、０．００１ｍｇ／ｍｌ未満の濃度でチップ上に注射した。個々のチップチャネルにわたる可変的な流動時間を使用して、抗原密度の２種の範囲を達成した：詳細な動態研究のための＜５０応答単位（ＲＵ）ならびに濃度試験およびスクリーニングのための約８００ＲＵ。典型的には、１μＭ〜０．１ｎＭ（０．１〜１０×推定ＫＤを目標とする）に及ぶ濃度の精製Ｆａｂ断片の２または３倍系列希釈を１００μＬ／分で１分間注射し、１０分間の解離時間を置いた。各結合サイクル後に、２５％ｖ／ｖエタノール中２５ｍＭ ＮａＯＨで表面を再生し、これは、数百サイクルにわたって耐容性を示した。ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎプログラムを使用してデータを１：１ラングミュア結合モデル（Ｋａｒｌｓｓｏｎ， Ｒ． Ｒｏｏｓ， Ｈ． Ｆａｇｅｒｓｔａｍ， Ｌ． Ｐｅｔｅｒｓｓｏｎ， Ｂ．（１９９４年）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ６巻９９〜１１０頁）に適合させることにより、動態学的会合速度（ｋｏｎ）および解離速度（ｋｏｆｆ）を同時に得た。比ＫＤ＝ｋｏｆｆ／ｋｏｎから網羅的平衡解離定数（ＫＤ）または「親和性」を計算した。マウスＦａｂ断片の親和性を表２および３に示す。
マウス抗ＣＧＲＰ抗体のエピトープマッピング。ヒトα−ＣＧＲＰにおける抗ＣＧＲＰ抗体が結合するエピトープを決定するために、ＳＡセンサーチップにおいてＮ末端ビオチン化ＣＧＲＰ断片アミノ酸１９〜３７およびアミノ酸２５〜３７を捕捉することにより、上述の通り様々なＣＧＲＰ断片に対するＦａｂ断片の結合親和性を測定した。図１は、２５℃で測定されたその結合親和性を示す。図１に示す通り、抗体４９０１を除く全抗体が、全長ヒトα−ＣＧＲＰ（１〜３７）に対するその結合親和性と同様の親和性で、ヒトα−ＣＧＲＰ断片１９〜３７および２５〜３７に結合する。抗体４９０１は、主にオフレートの損失のために、全長ヒトα−ＣＧＲＰ断片への結合よりも６倍低い親和性で、ヒトα−ＣＧＲＰ断片２５〜３７に結合する。データは、これらの抗ＣＧＲＰ抗体が一般に、ＣＧＲＰのＣ末端に結合することを示す。
アラニンスキャニングを行って、抗ＣＧＲＰ抗体の結合に関与するヒトα−ＣＧＲＰにおけるアミノ酸をさらに特徴付けた。単一のアラニン置換によるヒトα−ＣＧＲＰの異なるバリアントをペプチド合成により作製した。そのアミノ酸配列を、Ｂｉａｃｏｒｅ解析に使用したあらゆる他のペプチドと共に表４に示す。上述の通りにＢｉａｃｏｒｅを使用して、これらのバリアントに対する抗ＣＧＲＰ抗体のＦａｂ断片の親和性を決定した。図１に示す通り、全１２抗体は、Ｃ末端エピトープを標的とし、アミノ酸Ｆ３７が、最も重大な残基である。Ｆ３７からアラニンへの突然変異は、親和性を有意に低下させたか、またはさらにはペプチドへの抗ＣＧＲＰ抗体の結合を完全にノックアウトした。その次に重要なアミノ酸残基は、Ｇ３３であるが、高親和性抗体（７Ｅ９、８Ｂ６、１０Ａ８および７Ｄ１１）のみが、この位置におけるアラニン置き換えによって影響された。アミノ酸残基Ｓ３４も、これら４種の高親和性抗体の結合において有意だがより重要性の低い役割を果たす。
（実施例２）
ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイを使用した抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体のスクリーニング
細胞に基づくｃＡＭＰ活性化アッセイおよび結合アッセイを使用して、ｉｎ ｖｉｔｒｏでアンタゴニスト活性に関してマウス抗ＣＧＲＰ抗体をさらにスクリーニングした。
ｃＡＭＰアッセイによって測定されるアンタゴニスト活性。抗ＣＧＲＰ抗体（最終濃度１〜３０００ｎＭ）の存在もしくは非存在下における５マイクロリットルのヒトもしくはラットα−ＣＧＲＰ（最終濃度５０ｎＭ）、またはラットα−ＣＧＲＰもしくはヒトα−ＣＧＲＰ（最終濃度０．１ｎＭ〜１０μＭ；ｃ−ＡＭＰ活性化の陽性対照として）を３８４ウェルプレート（Ｎｕｎｃ、Ｃａｔ．Ｎｏ．２６４６５７）に分注した。刺激バッファー（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１４６ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＣａＣｌ２、１ｍＭ ＭｇＣｌ２および５００ｕＭ ３−イソブチル−１−メチルキサンチン（ＩＢＭＸ））における１０マイクロリットルの細胞（ヒトα−ＣＧＲＰが使用される場合はヒトＳＫ−Ｎ−ＭＣ、またはラットα−ＣＧＲＰが使用される場合はＡＴＣＣ由来のラットＬ６）をプレートのウェルに加えた。このプレートを室温で３０分間インキュベートした。
インキュベーション後に、製造業者の説明書に従ってＨｉｔＨｕｎｔｅｒ（商標）Ｅｎｚｙｍｅ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用してｃＡＭＰ活性化を行った。アッセイは、酵素アクセプター（ＥＡ）および酵素ドナー（ＥＤ）と称される２種の断片からなる遺伝子操作されたβ−ガラクトシダーゼ酵素に基づく。この２種の断片が分離されると、酵素は不活性となる。これらの断片は、共に存在すると、補完と呼ばれる過程により、活性酵素を形成するように自発的に組み換えることができる。ＥＦＣアッセイプラットフォームは、抗ｃＡＭＰによってｃＡＭＰが認識されるＥＤ−ｃＡＭＰペプチドコンジュゲートを利用する。このＥＤ断片は、ＥＡと再会合して、活性酵素を形成することができる。このアッセイにおいて、抗ｃＡＭＰ抗体は、ＥＤ−ｃＡＭＰコンジュゲートに結合し、酵素形成を阻害するために最適に力価決定される。細胞溶解物試料におけるｃＡＭＰのレベルは、抗ｃＡＭＰ抗体への結合に関してＥＤ−ｃＡＭＰコンジュゲートと競合する。アッセイにおける遊離ＥＤコンジュゲートの量は、ｃＡＭＰの濃度と比例する。したがって、ｃＡＭＰは、β−ガラクトシダーゼルミネセンス基質のターンオーバーによって定量化される活性酵素の形成により測定される。１０μｌの溶解バッファーおよび抗ｃＡＭＰ抗体（１：１比）を添加し、続いて室温で６０分間インキュベーションすることにより、ｃＡＭＰ活性化アッセイを行った。次に、１０μｌのＥＤ−ｃＡＭＰ試薬を各ウェルに添加し、６０分間室温でインキュベートした。インキュベーション後に、２０μｌのＥＡ試薬およびＣＬ混合物（基質を含有）（１：１比）を各ウェルに添加し、１〜３時間または一晩室温でインキュベートした。ＰＭＴ機器において１秒間／ウェルでまたは撮像装置において３０秒間／プレートでプレートを読み取った。上表２および３において、α−ＣＧＲＰによってｃＡＭＰの活性化を阻害する抗体を同定した（「あり」と称される）。表２および３におけるデータは、アッセイにおいてアンタゴニスト活性を実証した抗体が、全般的に高い親和性を有することを示す。例えば、ヒトα−ＣＧＲＰに対し約８０ｎＭもしくはそれ未満のＫＤ（２５℃で決定）を有するまたはラットα−ＣＧＲＰに対し約４７ｎＭもしくはそれ未満のＫＤ（３７℃で決定）を有する抗体は、このアッセイにおいてアンタゴニスト活性を示した。
放射性リガンド結合アッセイ。結合アッセイを行って、以前に記載されている通りに、ＣＧＲＰが受容体に結合するのを遮断する抗ＣＧＲＰ抗体のＩＣ５０を測定した。Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎら、Ｐｅｐｔｉｄｅｓ １６巻：４２１〜４頁、１９９５年；Ｍａｌｌｅｅら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．２７７巻：１４２９４〜８頁、２００２年。総容量１ｍＬにおいて１０ｐＭ １２５Ｉ−ヒトα−ＣＧＲＰを含有するインキュベーションバッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ、ｐＨ７．４、５ｍＭ ＭｇＣＬ２、０．１％ＢＳＡ）において９０分間室温で、ＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞由来の膜（２５μｇ）をインキュベートした。阻害濃度（ＩＣ５０）を決定するために、約１００倍高いストック溶液から、抗体または非標識ＣＧＲＰ（対照として）を変動濃度でインキュベーションバッファーにおいて溶解し、膜および１０ｐＭ １２５Ｉ−ヒトα−ＣＧＲＰと同時にインキュベートした。０．５％ポリエチレンイミン（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｍｉｍｉｎｅ）によりブロッキングされたガラスマイクロファイバーフィルター（ＧＦ／Ｂ、１μｍ）を通した濾過により、インキュベーションを終了させた。用量応答曲線をプロットし、方程式：Ｋｉ＝ＩＣ５０／（１＋（［リガンド］／ＫＤ）（式中、ＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞に存在するＣＧＲＰ１受容体に対するヒトα−ＣＧＲＰの平衡解離定数ＫＤ＝８ｐＭ、Ｂｍａｘ＝０．０２５ｐｍｏｌ／ｍｇタンパク質）を使用してＫｉ値を決定した。報告されたＩＣ５０値（ＩｇＧ分子に関して）を結合部位に変換することにより（これに２を掛けることにより）、Ｂｉａｃｏｒｅによって決定される親和性（ＫＤ）と比較することができた（表２を参照）。
表２は、マウス抗体７Ｅ９、８Ｂ６、６Ｈ２および４９０１のＩＣ５０を示す。データは、抗体親和性が全般的にＩＣ５０と相関することを示す：より高い親和性（より低いＫＤ値）を有する抗体は、放射性リガンド結合アッセイにおいてより低いＩＣ５０を有する。
（実施例３）
ラット伏在神経の刺激によって誘導される皮膚血管拡張における抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体の効果
抗ＣＧＲＰ抗体のアンタゴニスト活性を検査するために、以前に記載されたラットモデルを使用して、ラット伏在神経の刺激による皮膚血管拡張における抗体の効果を検査した。Ｅｓｃｏｔｔら、Ｂｒ． Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１１０巻：７７２〜７７６頁、１９９３年。このラットモデルにおいて、伏在神経の電気的刺激は、神経終末からのＣＧＲＰの放出を誘導し、皮膚血流量の増加をもたらす。雄スプラーグドーリー（Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄｗａｌｅｙ）ラット（１７０〜３００ｇ、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｈｏｌｌｉｓｔｅｒ製）の足の皮膚における血流量を伏在神経刺激後に測定した。２％イソフルランによる麻酔下にラットを維持した。ブレチリウムトシレート（３０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｖ．投与）を実験の初めに与えて、伏在神経の交感神経線維の随伴性の刺激による血管収縮を最小化した。温度制御された加温パッドにサーモスタット接続された直腸探索子の使用により、３７℃に体温を維持した。抗体、陽性対照（ＣＧＲＰ８−３７）および媒体（ＰＢＳ、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０）を含む化合物を、図３に示す実験を除いて、右大腿静脈を介して静脈内に与え、尾静脈を介して被験化合物および対照を注射し、図２Ａおよび２Ｂに示す実験のため、抗体４９０１および７Ｄ１１を腹腔内（ＩＰ）注射した。陽性対照化合物ＣＧＲＰ８−３７（血管拡張アンタゴニスト）は、その短い半減期のため、４００ｎｍｏｌ／ｋｇ（２００μｌ）で神経刺激の３〜５分前に与えた。Ｔａｎら、Ｃｌｉｎ． Ｓｃｉ．８９巻：６５６〜７３頁、１９９５年。異なる用量で抗体を与えた（１ｍｇ／ｋｇ、２．５ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇおよび２５ｍｇ／ｋｇ）。
図２Ａおよび２Ｂに示す実験のため、抗体４９０１（２５ｍｇ／ｋｇ）、抗体７Ｄ１１（２５ｍｇ／ｋｇ）または媒体対照（０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ）を、電気パルス刺激の７２時間前に腹腔内（ＩＰ）投与した。図３に示す実験のため、抗体４９０１（１ｍｇ／ｋｇ、２．５ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇまたは２５ｍｇ／ｋｇ）または媒体対照（０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ）を、電気パルス刺激の２４時間前に静脈内投与した。抗体または媒体対照の投与後に、右後肢の伏在神経を外科的に露出させ、近位にカットし、プラスチックラップで覆って乾燥を防いだ。伏在神経によって神経支配された領域である、後足皮膚の背側正中側の上にレーザードプラ探索子を置いた。血球細胞フラックスとして測定される皮膚血流量を、レーザードプラ流量計によりモニターした。安定的なベースラインフラックス（５％未満の変動）が、少なくとも５分間確立されたら、白金双極電極上に神経を置き、６０パルス（２Ｈｚ、１０Ｖ、１ｍｓを３０秒間）で電気的に刺激し、次に２０分後に再度行った。皮膚血流量の累積的変化は、電気パルス刺激に対するフラックス応答毎のフラックス−時間曲線下面積（ＡＵＣ、時間変化を乗じたフラックス変化に等しい）によって推定された。２回の刺激に対する血流応答の平均をとった。１〜３時間の期間、動物を麻酔下に維持した。
図２Ａおよび図２Ｂに示す通り、伏在神経における電子パルスの印加によって刺激される血流増加は、対照と比較して、ＣＧＲＰ８−３７（４００ｎｍｏｌ／ｋｇ、ｉ．ｖ．投与）、抗体４９０１（２５ｍｇ／ｋｇ、ｉｐ投与）または抗体７Ｄ１１（２５ｍｇ／ｋｇ、ｉｐ投与）の存在によって阻害された。ＣＧＲＰ８−３７は、伏在神経刺激の３〜５分前に投与した；抗体は、伏在神経刺激の７２時間前に投与した。図３に示す通り、伏在神経における電子パルスの印加によって刺激された血流増加は、伏在神経刺激の２４時間前に静脈内投与された異なる用量（１ｍｇ／ｋｇ、２．５ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇおよび２５ｍｇ／ｋｇ）の抗体４９０１の存在によって阻害された。
図４Ａおよび４Ｂに示す実験のため、抗体投与前に伏在神経を外科的に露出させた。右後肢の伏在神経を外科的に露出させ、近位にカットし、プラスチックラップで覆って乾燥を防いだ。伏在神経によって神経支配された領域である、後足皮膚の背側正中側の上にレーザードプラ探索子を置いた。レーザードプラ流量計により、血球細胞フラックスとして測定される皮膚血流量をモニターした。ブレチリウムトシレート注射の３０〜４５分後に、安定的なベースラインフラックス（５％未満の変動）が少なくとも５分間確立されたら、白金双極電極の上に神経を置き、電気的に刺激し（２Ｈｚ、１０Ｖ、１ｍｓを３０秒間）、２０分後に再度行った。これら２回の刺激に対する血流フラックス応答の平均を使用して、電気的刺激に対するベースライン応答（０時）を確立した。次に、抗体４９０１（１ｍｇ／ｋｇまたは１０ｍｇ／ｋｇ）、抗体７Ｅ９（１０ｍｇ／ｋｇ）、抗体８Ｂ６（１０ｍｇ／ｋｇ）または媒体（０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ）を静脈内（ｉ．ｖ．）投与した。神経をその後、抗体または媒体投与の３０分、６０分、９０分および１２０分後に刺激した（２Ｈｚ、１０Ｖ、１ｍｓを３０秒間）。およそ３時間の期間、動物を麻酔下に維持した。皮膚血流量の累積的変化は、電気パルス刺激に対するフラックス応答毎のフラックス−時間曲線下面積（ＡＵＣ、時間変化を乗じたフラックス変化に等しい）によって推定された。
図４Ａに示す通り、抗体投与の６０分、９０分および１２０分後に電子パルス刺激が印加されると、伏在神経における電子パルスの印加によって刺激される血流増加は、ｉ．ｖ．投与された抗体４９０１、１ｍｇ／ｋｇの存在によって有意に阻害され、抗体投与の３０分、６０分、９０分および１２０分後に電子パルス刺激が印加されると、伏在神経における電子パルスの印加によって刺激される血流増加は、ｉ．ｖ．投与された抗体４９０１、１０ｍｇ／ｋｇの存在によって有意に阻害された。図４Ｂは、抗体投与の３０分、６０分、９０分および１２０分後に電子パルス刺激が印加されると、伏在神経における電子パルスの印加によって刺激される血流増加が、抗体７Ｅ９（１０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｖ．投与）の存在によって有意に阻害され、抗体投与の３０分後に電子パルス刺激が印加されると、抗体８Ｂ６（１０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｖ．投与）の存在によって有意に阻害されたことを示す。
これらのデータは、抗体４９０１、７Ｅ９、７Ｄ１１および８Ｂ６が、ラット伏在神経の刺激によって誘導される皮膚血管拡張によって測定されるＣＧＲＰ活性の遮断において有効であることを示す。
（実施例４）
抗ＣＧＲＰ抗体Ｇ１およびそのバリアントの特徴付け
抗ＣＧＲＰ抗体Ｇ１の重鎖可変領域および軽鎖可変領域のアミノ酸配列を図５に示す。抗体Ｇ１およびそのバリアントの発現および特徴付けのために次の方法を使用した。
使用した発現ベクター。抗体のＦａｂ断片の発現は、Ｂａｒｂａｓ（２００１年）Ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ： ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ ｐｇ ２．１０． Ｖｅｃｔｏｒ ｐＣｏｍｂ３Ｘ）に記載されているものと同様のＩＰＴＧ誘導性ｌａｃＺプロモーターの制御下に置かれたが、修飾は、次の追加的なドメインの付加および発現を含んだ：ＩｇＧ２ヒト免疫グロブリンのヒトカッパー軽鎖定常ドメインおよびＣＨ１定常ドメイン、Ｉｇガンマ−２鎖Ｃ領域、タンパク質受託番号Ｐ０１８５９；免疫グロブリンカッパー軽鎖（ｈｏｍｏｓａｐｉｅｎｓ）、タンパク質受託番号ＣＡＡ０９１８１。
小規模Ｆａｂ調製。Ｆａｂライブラリーにより形質転換された（エレクトロポレーションコンピテントなＴＧ１細胞または化学的にコンピテントなＴｏｐ１０細胞のいずれかを使用して）Ｅ．ｃｏｌｉから、単一のコロニーを使用して、マスタープレート（寒天ＬＢ＋カルベニシリン（５０ｕｇ／ｍＬ）＋２％グルコース）および作業プレート（２ｍＬ／ウェル、９６ウェル／プレート）の両方に接種し、各ウェルは、１．５ｍＬ ＬＢ＋カルベニシリン（５０ｕｇ／ｍＬ）＋２％グルコースを含有した。ガス透過性接着シール（ＡＢｇｅｎｅ、Ｓｕｒｒｅｙ、ＵＫ）をプレートに貼った。両方のプレートを３０℃で１２〜１６時間インキュベートした；作業プレートを激しく振盪した。マスタープレートを必要になるまで４℃で貯蔵する一方、作業プレート由来の細胞をペレット化し（４０００ｒｐｍ、４℃、２０分間）、１．０ｍＬ ＬＢ＋カルベニシリン（５０ｕｇ／ｍＬ）＋０．５ｍＭ ＩＰＴＧに再懸濁して、５時間３０℃の激しい振盪によりＦａｂの発現を誘導した。誘導された細胞を４０００ｒｐｍ、４℃で２０分間遠心分離し、０．６ｍＬ Ｂｉａｃｏｒｅ ＨＢ−ＳＥＰバッファー（１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．００５％ｖ／ｖ Ｐ２０）に再懸濁した。ＨＢ−ＳＥＰに再懸濁した細胞の溶解は、凍結（−８０℃）し、続いて３７℃で解凍することにより達成された。細胞溶解物を４０００ｒｐｍ、４℃で１時間遠心分離して、Ｆａｂ含有上清からデブリを分離し、これをその後、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ ９６−Ｗｅｌｌ Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ Ｐｌａｔｅおよび真空マニフォールドを使用して濾過した（０．２ｕｍ）。Ｂｉａｃｏｒｅを使用して、センサーチップ上のＣＧＲＰにわたって注射することにより、濾過した上清を解析した。Ｆａｂを発現する親和性選択されたクローンをマスタープレートからレスキューし、これは、ＰＣＲ、配列決定およびプラスミド調製のための鋳型ＤＮＡをもたらした。
大規模Ｆａｂ調製。動態学的パラメータを得るために、次の通りに、より大きな規模でＦａｂを発現させた。１５０ｍＬ ＬＢ＋カルベニシリン（５０ｕｇ／ｍＬ）＋２％グルコースを含有するエルレンマイヤーフラスコに、親和性選択されたＦａｂ発現Ｅ．ｃｏｌｉクローン由来の１ｍＬの「スターター」一晩培養物を接種した。スターター培養物の残り（ほぼ３ｍＬ）を使用して、配列決定およびさらなる操作のためにプラスミドＤＮＡを調製した（ＱＩＡｐｒｅｐミニプレップ、Ｑｉａｇｅｎキット）。１．０のＯＤ６００ｎｍが達成されるまで（典型的には１２〜１６時間）、３０℃で激しく振盪しつつ大量の培養物をインキュベートした。４０００ｒｐｍ、４℃で２０分間遠心分離することにより細胞をペレット化し、１５０ｍＬ ＬＢ＋カルベニシリン（５０ｕｇ／ｍＬ）＋０．５ｍＭ ＩＰＴＧに再懸濁した。３０℃で５時間の発現後に、４０００ｒｐｍ、４℃で２０分間遠心分離することにより細胞をペレット化し、１０ｍＬ Ｂｉａｃｏｒｅ ＨＢＳ−ＥＰバッファーに再懸濁し、１回の凍結（−８０℃）／解凍（３７℃）サイクルを使用して溶解した。４０００ｒｐｍ、４℃で１時間遠心分離することにより細胞溶解物をペレット化し、上清を収集し、濾過した（０．２ｕｍ）。濾過した上清を、ＰＢＳ、ｐＨ８で平衡化したＮｉ−ＮＴＡスーパーフロー（ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ）セファロース（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ．ＣＡ）カラム上にロードし、続いて５カラム容量のＰＢＳ、ｐＨ８で洗浄した。ＰＢＳ（ｐＨ８）＋３００ｍＭイミダゾールにより、異なる画分において溶出された個々のＦａｂ。Ｆａｂを含有する画分をプールし、ＰＢＳにおいて透析し、次に親和性特徴付けに先立ちＥＬＩＳＡによって定量化した。
完全抗体調製。完全抗体の発現のため、重鎖および軽鎖可変領域を哺乳動物発現ベクターにクローニングし、リポフェクタミンを使用して一過性発現のためにＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトした。標準方法を使用したプロテインＡを使用して、抗体を精製した。
ベクターｐＤｂ．ＣＧＲＰ．ｈＦｃＧＩは、Ｇ１抗体の重鎖を含む発現ベクターであり、重鎖の一過性または安定的発現に適している。ベクターｐＤｂ．ＣＧＲＰ．ｈＦｃＧＩは、次の領域に相当するヌクレオチド配列を有する：マウスサイトメガロウイルスプロモーター領域（ヌクレオチド７〜６１２）；合成イントロン（ヌクレオチド６１３〜１６７９）；ＤＨＦＲコード領域（ヌクレオチド６８８〜１２５３）；ヒト成長ホルモンシグナルペプチド（ヌクレオチド１８９９〜１９７６）；Ｇ１の重鎖可変領域（ヌクレオチド１９７７〜２６２１）；次の突然変異を含有するヒト重鎖ＩｇＧ２定常領域：Ａ３３０Ｐ３３１からＳ３３０Ｓ３３１（野生型ＩｇＧ２配列を参照したアミノ酸ナンバリング；Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９９年）２９巻：２６１３〜２６２４頁を参照）。ベクターｐＤｂ．ＣＧＲＰ．ｈＦｃＧＩは、２００５年７月１５日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６８６７を割り当てられた。
ベクターｐＥｂ．ＣＧＲＰ．ｈＫＧＩは、Ｇ１抗体の軽鎖を含む発現ベクターであり、軽鎖の一過性発現に適している。ベクターｐＥｂ．ＣＧＲＰ．ｈＫＧＩは、次の領域に相当するヌクレオチド配列を有する：マウスサイトメガロウイルスプロモーター領域（ヌクレオチド２〜６１３）；ヒトＥＦ−１イントロン（ヌクレオチド６１４〜１１４９）；ヒト成長ホルモンシグナルペプチド（ヌクレオチド１１６０〜１２３７）；抗体Ｇ１軽鎖可変領域（ヌクレオチド１２３８〜１５５８）；ヒトカッパー鎖定常領域（ヌクレオチド１５５９〜１８８２）。ベクターｐＥｂ．ＣＧＲＰ．ｈＫＧＩは、２００５年７月１５日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６８６６を割り当てられた。
親和性決定のためのＢｉａｃｏｒｅアッセイ。Ｂｉａｃｏｒｅ３０００（商標）表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）システム（Ｂｉａｃｏｒｅ，ＩＮＣ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ ＮＪ）を使用して、２５℃または３７℃のいずれかで、Ｇ１モノクローナル抗体およびそのバリアントの親和性を決定した。予め固定化されたストレプトアビジン（ＳＡセンサーチップ）によりＮ末端ビオチン化ＣＧＲＰまたは断片を捕捉し、チップにおけるＣＧＲＰまたは断片にわたり力価決定された抗体Ｇ１ Ｆａｂ断片またはバリアントの結合動態を測定することにより、親和性を決定した。ＨＢＳ−ＥＰランニングバッファー（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．００５％ｖ／ｖポリソルベートＰ２０）において全Ｂｉａｃｏｒｅアッセイを行った。ＨＢＳ−ＥＰバッファーにおいて０．００１ｍｇ／ｍＬ未満の濃度までＮ−ビオチン化ＣＧＲＰを希釈し、可変的な接触時間を使用してＳＡセンサーチップにわたって注射することにより、ＣＧＲＰ表面を調製した。高分解能動態研究のために捕捉レベル＜５０応答単位（ＲＵ）に相当する低容量表面を使用した一方、濃度試験、スクリーニングおよび溶液親和性決定のために高容量表面（約８００ＲＵの捕捉ＣＧＲＰ）を使用した。１ｕＭ〜０．１ｎＭ（０．１〜１０×推定ＫＤを目標とする）に及ぶ濃度まで２または３倍増分で抗体Ｇ１ Ｆａｂを系列希釈することにより、動態学的データを得た。試料は典型的に、１分間１００μＬ／分で注射し、少なくとも１０分間の解離時間を置いた。各結合サイクルの後に、２５％ｖ／ｖエタノール中２５ｍＭ ＮａＯＨにより表面を再生させ、これは、数百サイクルにわたって耐容性を示した。力価決定系列全体（典型的に２回複製して作製）を、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎプログラムを使用して、１：１ラングミュア結合モデルに網羅的に適合させた。これは、各結合相互作用の会合および解離動態学的速度定数（それぞれ、ｋｏｎおよびｋｏｆｆ）の特有のペアを返し、その比は平衡解離定数（ＫＤ＝ｋｏｆｆ／ｋｏｎ）をもたらした。このようにして決定された親和性（ＫＤ値）を表６および７に示す。
極めて遅いオフレートによる結合相互作用の高分解能解析。極めて遅いオフレートによる相互作用のため（特に、２５℃でのチップにおけるヒトα−ＣＧＲＰへの抗体Ｇ１ Ｆａｂ結合）、二部構成（ｔｗｏ−ｐａｒｔ）実験において親和性を得た。次の修正により上述のプロトコールを使用した。３０秒間１００ｕＬ／分で５５０ｎＭ〜１ｎＭに及ぶ２倍力価決定系列（２回複製）を注射し、３０秒間のみの解離相を置くことにより、会合速度定数（ｋｏｎ）を決定した。２回複製して同じ力価決定系列の３種の濃度（高、中および低）を３０秒間注射し、２時間の解離相を置くことにより、解離速度定数（ｋｏｆｆ）を決定した。表５に示す通り、両方の種類の実験において得られるｋｏｎおよびｋｏｆｆ値を組み合わせることにより、各相互作用の親和性（ＫＤ）を得た。
Ｂｉａｃｏｒｅによる溶液親和性の決定。ラットα−ＣＧＲＰおよびＦ３７Ａ（１９〜３７）ヒトα−ＣＧＲＰに対する抗体Ｇ１の溶液親和性をＢｉａｃｏｒｅにより３７℃で測定した。高容量ＣＧＲＰチップ表面を使用し（検出目的のために高親和性ヒトα−ＣＧＲＰを選択した）、ＨＢＳ−ＥＰランニングバッファーを５ｕＬ／分で流動させた。５ｎＭの一定濃度の抗体Ｇ１ Ｆａｂ断片（溶液に基づく相互作用の予想されるＫＤまたはそれ未満となることを目標とする）を、３倍系列希釈における１ｎＭ〜１ｕＭに及ぶ最終濃度の競合ペプチドであるラットα−ＣＧＲＰまたはＦ３７Ａ（１９〜３７）ヒトα−ＣＧＲＰのいずれかとプレインキュベートした。溶液に基づく競合ペプチドの非存在または存在下における抗体Ｇ１ Ｆａｂ溶液をチップ上のＣＧＲＰにわたって注射し、溶液競合の結果としてチップ表面において検出される結合応答の枯渇をモニターした。チップ上のＣＧＲＰにわたる抗体Ｇ１ Ｆａｂ単独（５、２．５、１．２５、０．６２５、０．３２５および０ｎＭ）の力価決定によって構築された較正曲線を使用して、これらの結合応答を「遊離Ｆａｂ濃度」に変換した。「遊離Ｆａｂ濃度」を、各データ点の作成に使用した競合する溶液に基づくペプチドの濃度に対してプロットし、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアを使用して溶液親和性モデルに適合させた。このようにして決定された（間接的に）溶液親和性は、表５および７に示し、ＳＡチップ上のＮ−ビオチン化ＣＧＲＰにわたり直接的にＦａｂを注射した際に得られる親和性の検証に使用した。これら２種の方法によって決定される親和性の間の密接な一致は、チップへのＮ−ビオチン化バージョンのＣＧＲＰの繋留が、そのネイティブ溶液結合活性を変更しないことを確認する。
下表５は、ＳＡチップ上のＮ−ビオチン化ＣＧＲＰにわたりＦａｂ断片を流動させることにより、Ｂｉａｃｏｒｅによって決定されるヒトα−ＣＧＲＰ、ヒトβ−ＣＧＲＰ、ラットα−ＣＧＲＰおよびラットβ−ＣＧＲＰに対する抗体Ｇ１の結合親和性を示す。極めて遅いオフレートによる結合相互作用の親和性をより良く解像するために、二部構成実験において親和性も決定して、このアッセイの方向性を補完し、ラットα−ＣＧＲＰ相互作用の溶液親和性も決定した（上述の通り）。両方のアッセイの方向性において測定される親和性の密接な一致は、溶液におけるネイティブラットα−ＣＧＲＰの結合親和性が、これがＮ−ビオチン化されＳＡチップに繋留された場合に変更されないことを確認する。
＊α−ＣＧＲＰ（ラットおよびヒト）に対する親和性は、高分解能二部構成実験において決定し、解離相は２時間モニターした（ｋｏｎ、ｋｏｆｆおよびＫＤの値は、ｎ回複製実験の平均と、パーセント分散として表される標準偏差を表す）。β−ＣＧＲＰ（ラットおよびヒト）に対する親和性は、２０分間のみの解離相を使用した網羅的解析により決定し、これは、これらの極めてオフレートの定量化に十分なほど正確ではなかった（これらのオフレートは、ここに記述されるものよりも遅い可能性があり、したがって、これらの親和性は、さらにより高い可能性がある）。抗体Ｇ１ Ｆａｂは、Ｂｉａｃｏｒｅアッセイの分解能限界に近づくオフレートで、全ＣＧＲＰ（α−ラットＣＧＲＰを除いて）から極めてゆっくりと解離した（特に２５℃で）。
＊＊溶液に基づくラットα−ＣＧＲＰ競合体とプレインキュベートした抗体Ｇ１ Ｆａｂに対する、チップ上のＣＧＲＰにおいて検出される結合応答の枯渇の測定によって決定される溶液親和性。
下表６は、抗体Ｇ１と比較してアミノ酸配列変種を有する抗体、ならびにラットα−ＣＧＲＰおよびヒトα−ＣＧＲＰの両方に対するこれらの親和性を示す。表６に示すバリアントの全アミノ酸置換は、Ｇ１の配列と比べて記載されている。Ｆａｂ断片の結合親和性は、これらをＳＡチップ上のＣＧＲＰにわたって流動させることにより、Ｂｉａｃｏｒｅによって決定した。
ＫａｂａｔおよびＣｈｏｔｈｉａ ＣＤＲの両方を含む全ＣＤＲ。アミノ酸残基に連続的に番号を振る（図５を参照）。全クローンは、Ｇ１と同一のＬ３＋Ｈ１＋Ｈ３配列を有する。
ＫＤ＝ｋｏｆｆ／ｋｏｎ。全ｋｏｆｆ値は、Ｆａｂ濃度系列の網羅的解析によって得られた下線を引いたものを除いてスクリーニング様式において決定した（Ｇ１は、高分解能様式において解析した）。したがって、下線を引いたＫＤ値は、ｋｏｎを測定することにより実験的に決定した。他のｋｏｎ値は、Ｍ２５と同じであると推定した。
ｎ．ｄ．＝決定されず
抗体Ｇ１によって認識されるヒトα−ＣＧＲＰにおけるエピトープを決定するために、上述のＢｉａｃｏｒｅアッセイを使用した。Ｎ−ビオチン化バージョンとしてヒトα−ＣＧＲＰを購入して、ＳＡセンサーチップによるその高親和性捕捉を可能にした。ＣＧＲＰペプチドの非存在または存在下におけるチップ上のヒトα−ＣＧＲＰへのＧ１ Ｆａｂ断片の結合を決定した。典型的には、２０００：１ｍｏｌペプチド／Ｆａｂ溶液（例えば、５０ｎＭ Ｇ１ Ｆａｂにおける１０ｕＭペプチド）をチップ上のヒトα−ＣＧＲＰにわたって注射した。図６は、競合ペプチドによって遮断される結合のパーセンテージを示す。図６に示すデータは、ヒトα−ＣＧＲＰへのＧ１ Ｆａｂの結合を１００％遮断するペプチドが、ヒトα−ＣＧＲＰの１〜３７（ＷＴ）、８〜３７、２６〜３７、Ｐ２９Ａ（１９〜３７）、Ｋ３５Ａ（１９〜３７）、Ｋ３５Ｅ（１９〜３７）およびＫ３５Ｍ（１９〜３７）；β−ＣＧＲＰ（ＷＴ）の１〜３７；ラットα−ＣＧＲＰ（ＷＴ）の１〜３７；ならびにラットβ−ＣＧＲＰ（ＷＴ）の１〜３７であることを示す。これらのペプチドは全て、Ｃ末端がアミド化されている。ヒトα−ＣＧＲＰのペプチドＦ３７Ａ（１９〜３７）および１９〜３７（後者はＣ末端がアミド化されていない）も、ヒトα−ＣＧＲＰへのＧ１ Ｆａｂの結合の約８０％〜９０％を遮断した。ヒトα−ＣＧＲＰのペプチド１〜３６（Ｃ末端がアミド化されていない）は、ヒトα−ＣＧＲＰへのＧ１ Ｆａｂの結合の約４０％を遮断した。ヒトα−ＣＧＲＰのペプチド断片１９〜３６（Ｃ末端がアミド化）；ヒトα−ＣＧＲＰのペプチド断片１〜１３および１〜１９（どちらもＣ末端がアミド化されていない）；ならびにヒトアミリン、カルシトニンおよびアドレノメデュリン（全てＣ末端がアミド化）は、チップ上のヒトα−ＣＧＲＰへのＧ１ Ｆａｂの結合と競合しなかった。これらのデータは、Ｇ１が、ＣＧＲＰのＣ末端エピトープを標的とし、最末端残基（Ｆ３７）の同一性およびそのアミド化の両方が、結合に重要であることを実証する。
ヒトα−ＣＧＲＰのバリアントに対するＧ１ Ｆａｂの結合親和性（３７℃における）も決定した。下表７は、チップ上のＮ−ビオチン化ヒトα−ＣＧＲＰおよびバリアントにわたるＧ１ Ｆａｂの力価決定によって直接的に測定される親和性を示す。表７におけるデータは、抗体Ｇ１が、Ｃ末端エピトープに結合し、Ｆ３７およびＧ３３が最も重要な残基であることを示す。余分なアミノ酸残基（アラニン）がＣ末端（アミド化されている）に付加されると、Ｇ１は、ＣＧＲＰに結合しない。
上のデータは、抗体Ｇ１が結合するエピトープが、ヒトα−ＣＧＲＰのＣ末端に存在し、ヒトα−ＣＧＲＰにおけるアミノ酸３３および３７が、抗体Ｇ１の結合に重要であることを示す。また、残基Ｆ３７のアミド化は、結合に重要である。
（実施例５）
代謝的健康および長寿における抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体およびＴＲＰＶ突然変異の効果
本実施例は、低下した疼痛知覚が、進化的に保存されたＴＲＰＶを標的化することにより、哺乳動物の加齢をプラスに調節し得るか決定するために使用される方法について記載する。この長寿増加の機構も調査する。
マウスにおける長寿試験
ＴＲＰＶ１突然変異体マウスを作製し、これは、ＴＲＰＶ１遺伝子の５回および全６回推定膜貫通ドメインならびにポア−ループ領域の部分をコードするエクソンの欠失を含有する。ホモ接合動物は、生存可能であり、繁殖力があり、正常に見える。両者共にＪａｃｋｓｏｎ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ）から得られるＣ５７ＢＬ／６Ｊおよび野生型（ＷＴ）Ｃ５７ＢＬ／６Ｊブリーダーペアへと１１回戻し交配されたホモ接合ＴＲＰＶ１突然変異体の１６組のブリーダーペアから長寿試験を作製した。同様のサイズの同腹から使用した動物を各寿命試験に使用した。ＴＲＰＶ１遺伝子型決定を使用して、実験および対照群の両方を割り当てた。死後ゲノム走査解析を行って、遺伝的背景が、遺伝子型中で１００％同一であったことを確認した（表１１）。
病原体不含条件下において、水および固形飼料（ＰｉｃｏＬａｂ Ｒｏｄｅｎｔ ２０ ５０５３＊、ＬａｂＤｉｅｔ）への適宜アクセスにより、２〜５匹の同性同腹仔の群にマウスを収容した。個体を毎日モニターし、毎月秤量したが、それ以外は死ぬまで干渉せずにおいた。９０匹の雌（４８匹のＴＲＰＶ１ ＫＯ、４２匹のＷＴ）および７０匹の雄（３８匹のＴＲＰＶ１ ＫＯ、３２匹のＷＴ）マウスから生存を評価し、この報告の時点までに１００％の動物が死んだ。自然死の直後に、マウスをホルマリンに浸漬し、７０％エタノールにおいて乾燥させた。組織を解剖し、パラフィンに包埋し、ヘマトキシリンおよびエオシンによって染色した。獣医学スタッフによって死後病理学的解析を行った。追加的な実験コホートを作製して、代謝試験を行い、後述する初代ニューロン培養物を作製した。公知の誕生および死亡日を使用してカプラン・マイヤー生存曲線を構築し、ログランク検定を使用して群間の差を評価した。
マウスにおける代謝試験
Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｌａｂ Ａｎｉｍａｌ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｃｏｌｕｍｂｕｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）において間接的熱量測定試験を行った。ＧＴＴおよびＧＳＩＳのため、グルコース（２ｇ／ｋｇ体重）を腹腔内投与し、Ｏｎｅ Ｔｏｕｃｈ Ｕｌｔｒａ ｇｌｕｃｏｍｅｔｅｒ（ＬｉｆｅＳｃａｎ）を使用して、注射後の表示時点で尾出血から血中グルコースを測定した。ＩＴＴのため、５時間絶食したマウスに、１ｕ／ｋｇのヒトインスリン（ヒューマリン；Ｅｌｉ Ｌｉｌｙ）を注射し、ＧＴＴと同様にグルコースを測定した。肝臓および筋肉組織におけるインスリン刺激されたシグナリングを以前に記載された通りに行った。５．５ｍｇ／ｍＬでＣＧＲＰ８−３７（Ｔｏｃｒｉｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を拡散する浸透圧ポンプ（Ａｌｚｅｔ）を２２ヶ月齢Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ雄（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ａｇｉｎｇ）に植え込んだ。ＣＧＲＰ８−３７は、トランケートバージョンの抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体である。ＵｌｔｒａＳｅｎｓｉｔｉｖｅ Ｉｎｓｕｌｉｎ ＥＬＩＳＡキット（Ｃｒｙｓｔａｌ Ｃｈｅｍ）を使用して血清インスリンを測定した。Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して絶食時レプチン、アディポネクチンの血清レベルを測定した。製造業者の説明書に従ってＴｈｅｒｍｏ酵素比色分析方法を使用して、トリグリセリドおよびコレステロールを測定した。ＥＬＩＳＡ（ＥＩＡａｂ）を使用してＣＧＲＰを測定した。
定量的ＰＣＲ解析およびタンパク質解析
膵島を単離した。各マウスから２５〜４０個のＤＲＧを切除し、トリゾール中でホモジナイズした。トリゾール／クロロホルム抽出およびＲＮＥａｓｙ Ｑｉａｇｅｎカラムを使用してＲＮＡを単離した。ｑｕａｎｔｉｔｅｃｔ逆転写キットを使用してＲＮＡをｃＤＮＡに変換した。ＳＹＢＲ ｇｒｅｅｎを使用したｑＰＣＲにより遺伝子発現を評価した。プライマー配列を表８に示す。
免疫組織化学的検査および組織学的試験
免疫組織化学的検査のため、ＰＢＳ中４％パラホルムアルデヒドに組織を４〜１６時間４０Ｃで浸漬し、続いてＰＢＳ中３０％スクロースにおいて一晩凍結保護した。ＯＣＴ（Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ）中で組織を凍結し、クリオスタットにおいて切片作製した。２％ロバ血清および０．４％Ｔｒｉｔｏｎ ｘ１００を含有するＰＢＳにおける一次抗体で、１２μｍ厚の切片をイムノブロットした。使用した抗体は、１：１００の抗ＣＲＴＣ１（Ｂｅｔｈｙｌ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、１：５００の抗ＣＲＴＣ１（ＬＳ Ｂｉｏ）、１：５００の抗ＣＧＲＰ（Ｂａｃｈｅｍ）、１：５００の抗ＴＲＰＶ１（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、１：５００の抗インスリン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、１：７０００の抗グルカゴン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）であり、二次抗体（Ａｌｅｘｘａ）は、１：６００に希釈した。ＬＳＭ ７１０共焦点顕微鏡を使用して切片を撮像した。組織学的解析のため、組織をホルマリンに一晩浸漬し、７０％エタノールにおいて乾燥させ、パラフィンに包埋した。β細胞質量を測定するために、膵臓全体を秤量し、切片作製し、その後、Ｅｎｖｉｓｉｏｎ＋ＤＡＢ ｓｙｔｅｍペルオキシダーゼ（Ｄａｋｏ）と１：１００のウサギ抗インスリン抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）およびヘマトキシリンによる対比染色によるインスリン免疫染色および標識を行った。ＶＳ１２０スライドスキャナ（Ｏｌｙｍｐｕｓ）によりスライドを撮像し、ＶＳ−ＡＳＷソフトウェアを使用したポイントカウンティング形態計測によりβ細胞質量を測定した。
細胞培養試験
Ｕｌｕｐｉ Ｊｈａｌａ（ＵＣＳＤ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）から１８継代目のＭＩＮ６インスリノーマ細胞を得て、以前に記載された通りに（Ｈｕｉｓｉｎｇら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．１０７巻：９１２〜９１７頁、２０１０年）、１１ｍＭグルコース、１０％ＦＢＳ、Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および１０μＭ β−メルカプト（ｍｅｒｃａｐｔｈｏ）エタノールを含有するＤＭＥＭ（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）において培養した。低（２．８ｍＭ）および高（１６．８ｍＭ）のグルコース刺激を行った。処置は、２．８ｍＭグルコースを有するクレブス・リンゲル炭酸水素塩バッファーにおいて希釈した。
ＤＲＧニューロンをマウスから解離させ、コラゲナーゼ処置後にパパインにおける粉砕によって解離させ、Ｇｅｌｔｒｅｘ（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）でコーティングしたチャンバースライド（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）における皮質アストロサイトの単層上に播種し、Ｂ２７、Ｎ２、５０ｎｇ／ｍｌラットＢＤＮＦ、５０ｎｇ／ｍｌラットβ−ＮＧＦならびに有糸分裂後阻害剤１７．５μｇ／ｍｌウリジンおよび７．５μｇ／ｍｌ ５−フルオロ−２−デオキシウリジン（ｄｅｏｘｙｕｒｉｎｅ）を補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２において培養した。ＤＲＧニューロン間で軸索再成長およびシナプス形成させるために、ラット皮質アストロサイトの単層上でニューロンを７〜１０日間培養した。
媒体対照またはアンタゴニスト遮断（２時間）のいずれかに先立ちＴＴＸ（１μＭ）で４時間ニューロンを前処置し、続いて核外輸送を阻害するレプトマイシンＢ（１０ｎｇ／ｍｌ）を補充して１時間薬物刺激して、ＣＲＴＣ１核蓄積を検出した。Ｃａｐ、ＦＳＫおよびレプトマイシンＢはＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから、ＳＢ３６６７９１およびＴＴＸはＴｏｃｒｉｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから、ＣｓＡはＣａｌｂｉｏｃｈｅｍから得た。薬物は、次の濃度で適用した：Ｃａｐ（１μＭ）、ＦＳＫ（２５μＭ）、ＫＣｌ（３０ｍＭ）、ＳＢ３６６７９１（２μＭ）およびＣｓＡ（１０μＭ）。次に、ニューロンをＰＢＳ中４％パラホルムアルデヒドにおいて固定し、免疫組織化学的検査のために調製した。
Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ実験
ｏｓｍ−９（ｋｙ４）、ｏｃｒ−２（ａｋ４７）およびＮ２系統をＣａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｅｎｔｅｒから得た。ＡＧＤ４１８（Ｎ２；ｕｔｈＩｓ２０５［Ｐｃｒｔｃ−１：：ｃｒｔｃ−１：：ＲＦＰ：：ｕｎｃ−５４ ３’ＵＴＲ、ｒｏｌ−６］）およびＡＧＤ４６６（Ｎ２、ｕｔｈＥＸ２２２［ｃｒｔｃ−１ｐ：：ｃｒｔｃ−１ ｃＤＮＡ（Ｓ７６Ａ、Ｓ１７９Ａ）：：ｔｄＴＯＭＡＴＯ：：ｕｎｃ−５４ ３’ＵＴＲ；ｒｏｌ−６（ｓｕ１００６）］）は、他の場所で作製した（Ｍａｉｒら、２０１１年）。ｏｓｍ−９（ｋｙ４）、ｏｃｒ−２（ａｋ４７）系統は、Ｎ２へと６回外交配した。ＡＧＤ４１８およびＡＧＤ４６６は、ｏｓｍ−９（ｋｙ４）；ｏｃｒ−２（ａｋ４７）と交配した。寿命解析を２０℃で行い、２〜４回反復した。条件につき１００〜１２０匹の動物を使用し、１日おきにスコア化した。寿命は、表示の通り、対照ＧＦＰ ＲＮＡｉまたはｔａｘ−６ ＲＮＡｉによるＨＴ１１５において行った。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ５を統計解析のために使用した。ログランク（Ｍａｎｔｅｌ−Ｃｏｘ）方法を使用してｐ値を計算した。
結果：ＴＲＰＶ１を欠くマウスは、若々しく長寿命である
ＴＲＰＶ１受容体を欠く動物は、そのカプラン・マイヤー生存曲線、中位および最大寿命によって示されている通り、例外的に長寿命であった（図７Ａ、７Ｂおよび表９）。通常の適宜給餌条件下では、ＴＲＰＶ１突然変異は、その効果が性別特異的ではなかった：両性における長寿は、同様の程度まで延長され、野生型、同質遺伝子的Ｃ５７ＢＬ／６対照（ＷＴ）と比較して、雄ＴＲＰＶ１突然変異体における１１．９％増加および中位雌寿命における１５．９％増加であった。平均して、ＴＲＰＶ１突然変異体雄は、対照動物よりもほぼ１００日間長く生き、ＴＲＰＶ１突然変異体雌は、１３０日間長く生きた（平均寿命、表９）。最大寿命は、雌突然変異体マウスにおいて強く延長された。
がん発生率は、死後剖検および病理組織学検査を行うことにより決定した（図７Ｃ、７Ｄ）。がんの有病率は、ＴＲＰＶ１突然変異体対対照マウスにおいて低下する傾向があった（図７Ｃ）。本出願人らのマウスコホートにおいて観察される死亡の主原因である新生物は、幅広いパネルのがん型を含んだ（図７Ｄ）。とりわけ、両方の遺伝子型において観察される最も蔓延したがんであるリンパ系起源の造血器新生物の発生率は、ＴＲＰＶ１突然変異体動物において低下した。肉腫、癌腫、下垂体および肺腺腫を含む他のがん型も、両方の遺伝子型において存在したが、少数の観察は、遺伝子型間のこれらの病理の発生率に関するいかなる結論も許さなかった。さらに、遺伝子型間で非新生物疾患の発生率における有意差は観察されなかった（図７Ｃおよび表１０）。
改善された長寿および低下した加齢と一貫して、３０ヶ月齢ＴＲＰＶ１突然変異体マウスは、バーンズ迷路検査における訓練、保持および逆転パラダイムに挑戦した際に、その同齢対照動物と比較して改善された空間記憶を呈した（図８Ａ、８Ｂ、８Ｃ）。回転ロッドからの転落までの潜時によって測定される運動協調性も、長寿命ＴＲＰＶ１突然変異体マウスにおいて遅延された（図８Ｄ）。ＴＲＰＶ１の存在が、海馬において検出されたため（Ｍｅｚｅｙら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．９７巻、３６５５〜３６６０頁、２０００年；Ｓａｓａｍｕｒａら、Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏｒｔ ９巻、２０４５〜２０４８頁、１９９８年）、海馬のＣＡ１、ＣＡ３および歯状回（ＤＧ）区域におけるニューロン密度をニッスル染色によって試験した（図８Ｅ）。これらの区域におけるニッスル陽性ニューロンの分布は、ＷＴおよびＴＲＰＶ１突然変異体マウスにおいて同様であり、ＴＲＰＶ１突然変異体における改善された認知機能が、ＴＲＰＶ１突然変異体動物におけるニューロン数の増加によるものではなく、これらのマウスにおける健康寿命の網羅的な改善によるものであることを示唆する。
結果：長寿命ＴＲＰＶ１突然変異体マウスは、低下した成長速度も変更されたＩＧＦ−１レベルも持たない
低下した成長ホルモン（ＧＨ）および／またはインスリン成長因子（ＩＧＦ−１）シグナリングは、多くの場合成長遅延および小型の成体動物をもたらす、長寿に密接に関連付けられてきた（Ｂｌｕｈｅｒ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９９巻：５７２〜５７４頁、２００３年；Ｏｒｔｅｇａ−Ｍｏｌｉｎａら、Ｃｅｌｌ Ｍｅｔａｂ．１５巻：３８２〜３９４頁、２０１２年；Ｓｅｌｍａｎら、ＦＡＳＥＢ Ｊ．２２巻：８０７〜８１８頁、２００８年）。ＧＨ／ＩＧＦ−１マウスとは異なり、ＴＲＰＶ１突然変異体マウスは、ＷＴマウスとサイズが同様に見えた（図９Ａ）。成長ホルモン（ＧＨ）またはＩＧＦ−１シグナリングのいずれかにおける活性変更によるマウスモデルとは対照的に（Ｂｌｕｈｅｒ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９９巻：５７２〜５７４頁、２００３年；Ｂｒｏｗｎ−Ｂｏｒｇら、Ｎａｔｕｒｅ ３８４巻：３３頁、１９９６年；Ｃｏｓｃｈｉｇａｎｏら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １４１巻：２６０８〜２６１３頁、２０００年、Ｃｏｓｃｈｉｇａｎｏら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １４４巻：３７９９〜３８１０頁、２００３年；Ｆｌｕｒｋｅｙら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．９８巻：６７３６〜６７４１頁、２００１年、Ｆｌｕｒｋｅｙら、Ｍｅｃｈ． Ａｇｅｉｎｇ Ｄｅｖ．１２３巻：１２１〜１３０頁、２００２年；Ｈｏｌｚｅｎｂｅｒｇｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ４２１巻：１８２〜１８７頁、２００３年；Ｏｒｔｅｇａ−Ｍｏｌｉｎａら、Ｃｅｌｌ Ｍｅｔａｂ．１５巻：３８２〜３９４頁、２０１２年；Ｓｅｌｍａｎら、ＦＡＳＥＢ Ｊ．２２巻：８０７〜８１８頁、２００８年、Ｓｅｌｍａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２６巻：１４０〜１４４頁、２００９年；Ｚｈａｎｇら、ｅＬｉｆｅ １巻、２０１２年）、その成長曲線は、加齢を通じて両性においてＷＴ対照と同一であった（図９Ｂ）。年齢および性別が対応した（ａｇｅ ａｎｄ ｇｅｎｄｅｒ ｍａｔｃｈｅｄ）対照の体組成の解析は、肺、肝臓、腎臓、脾臓、膵臓、脳、心臓および異なる脂肪パッド（鼠径部、性腺、後腹膜）を含む臓器が、両方の遺伝子型において同じサイズであったことを確認した（図９Ｃ）。重要な代謝組織（肝臓、白色脂肪、心臓）のＨ＆Ｅ染色による基礎組織学的解析は、野生型およびＴＲＰＶ１突然変異体マウスの間の形態学的な差を明らかにしなかった（図１０）。正常な体重と一貫して、下垂体におけるＧＨ含量は、ＴＲＰＶ１突然変異体成体マウスにおいて正常であった（図９Ｄ）。加えて、ＧＨによって調節されるＩＧＦ−１の血漿レベルは、両方の遺伝子型において同一であった（図９Ｅ）。したがって、ＴＲＰＶ１の喪失は、ＧＨ／ＩＧＦ−１軸とは独立的な機構における加齢過程をモジュレートすると思われる。
結果：長寿命ＴＲＰＶ１突然変異体マウスは、若々しい代謝プロファイルを有する
変更された代謝プログラムは、虫からマウスに及ぶ多くの長寿経路に関連付けられてきた。ＴＲＰＶ１突然変異体マウスが、野生型動物と比較して別個の代謝プロファイルを有するか決定された。代謝活性を示し、食事制限された長寿命Ａｍｅｓ矮性マウスにおいて低いことが報告された（Ｂｒｏｗｎ−Ｂｏｒｇら、Ｎａｔｕｒｅ ３８４巻：３３頁、１９９６年）体温の解析は、対照動物と比較して同齢ＴＲＰＶ１突然変異体マウスにおいて影響されなかった（図１１Ａ）。同様に、食事制限により寿命に影響し得る食物摂取は、影響されなかった（図１１Ａ）。代謝活性を示す血液因子の全般的な評価は、遺伝子型にわたる絶食時インスリンレベル、レプチン、アディポネクチンまたは循環トリグリセリドおよびコレステロールにおける差を明らかにしなかった（図１１Ｂ）。肩甲骨間褐色脂肪組織における熱発生および褐色脂肪発達に特徴的な褐色脂肪特異的遺伝子の発現における変更はなかった（図１１Ｃ）。しかし、ＴＲＰＶ１突然変異体動物は、同齢対照マウスと比較して若々しい代謝プログラムを保持した（図１２Ａ）。特に、グルコースから脂質代謝への一日の移行を測定する呼吸交換率（ＲＥＲ）は、老齢ＴＲＰＶ１突然変異体動物において夜から昼への若々しい概日シフトを保持した。３ヶ月目に、ＷＴおよびＴＲＰＶ１突然変異体マウスの両方が、夜から昼への同一の概日振動を呈した。しかし晩年期において、ＴＲＰＶ１突然変異体は、若齢マウスのものと比較して同様の桁の概日移行を保持した一方、ＷＴ動物は、その概日シフトを失った。実際に、より低いＲＥＲを含むエネルギー支出の減退は一般的に、老齢マウスにおいて観察され、加齢マウスが、脂肪に向かう比例的な基質優先度を有することを示す（Ｈｏｕｔｋｏｏｐｅｒら、Ｓｃｉ． Ｒｅｐ．１巻、２０１１年）。ＴＲＰＶ１突然変異体マウスが、晩年にこの優先度を持たないことが観察された。
代謝改善と同時発生的に、夜行性活動のピーク時の同齢ＷＴ対照と比較して、若齢および老齢時点の両方におけるＴＲＰＶ１突然変異体において酸素消費が増強された（図１１Ｄ）。加齢と共に消費される最大ＶＯ２の減退を呈するＷＴ動物とは対照的に、ＴＲＰＶ１突然変異体は、晩年にそのＶＯ２最大消費を維持した。興味深いことに、自発的活動は、若齢ＴＲＰＶ１突然変異体動物において僅かにより高かったが、老齢時にはＷＴと同じ程度まで縮小した（図１１Ｅ）。総合すると、これらのデータは、老齢ＴＲＰＶ１突然変異体動物に観察される若々しいエネルギー支出が、自発的運動の増加によるものではないが、年齢に伴うより効率的な代謝維持によるものと思われることを示す。
結果：長寿命ＴＲＰＶ１突然変異体マウスは、変更されたインスリン代謝を有する
ＴＲＰＶ１突然変異体マウスの若々しい代謝表現型の根底にある機構を明らかにするために、これらのマウスのグルコース代謝プロファイルを特徴付けた。ＴＲＰＶ１突然変異体動物が、グルコース耐性であることが仮定された。ＴＲＰＶ１突然変異体マウスが、グルコース耐性検査（ＧＴＴ、図１２Ｂ）においてそれぞれ「若齢」および「老齢」時点に相当する３ヶ月齢および２２ヶ月齢において、ＷＴよりも顕著にグルコース耐性であることが観察された。絶食時グルコースレベルは、突然変異体および野生型マウスの間で変化しなかった。グルコース耐性改善は多くの場合、インスリン感受性増加に関連するため、インスリン耐性検査（ＩＴＴ、図１２Ｃ）によりインスリン注射後に、どの程度効率的にＴＲＰＶ１突然変異体マウスが血中グルコースを排除するかを解析した。グルコース耐性改善にもかかわらず、６７％下落したＷＴ対照とは反対に、若齢ＴＲＰＶ１突然変異体マウスの血中グルコースレベルが、急性インスリン負荷後にほぼ４０％減少したことが観察された。２２ヶ月目に、ＷＴマウスは、その血中グルコース下落は、若齢ＷＴマウスよりも１４％効率が低いため、予想される加齢発病インスリン抵抗性を呈した。
ＴＲＰＶ１突然変異体のインスリン抵抗性も、より老齢の動物において１９％さらに増悪された。インスリン抵抗性は、β細胞不全をもたらす２型糖尿病の特徴であるため、本出願人らは、成体マウスにおける膵β細胞島形態を解析した。突然変異体または野生型マウスの島におけるインスリンおよびグルカゴンを染色した際に、島構造における差は観察されず、ＴＲＰＶ１突然変異体島が、正常であることを示唆する（図１２Ｄ）。さらなる研究は、β細胞質量が、ＴＲＰＶ１突然変異体マウスにおいて増加したことを明らかにし、β細胞生存が、その増殖または新生速度とは独立に、これらのマウスにおいて改善されたことを示唆した（図１２Ｅおよび１１Ｆ）。定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）による単離された島ｍＲＮＡの遺伝子発現は、ＴＲＰＶ１突然変異体およびＷＴ島内分泌マーカーの間の転写の差を明らかにしなかった（図１２Ｆ）。グルカゴン（ｇｃｇ）、ウロコルチン−３（ｕｃｎ３）、アミリン（ａｍｙ）、インスリン受容体基質２（ｉｒｓ２）、核ホルモン受容体ｎｒ４ａ２、ｆｏｓ遺伝子ｃＦｏｓ、ユビキチンカルボキシル末端ヒドロラーゼ１（ｕｓｐ１）、Ｇタンパク質シグナリング２の調節因子（ｒｇｓ２）およびペルオキシソーム増殖因子活性化受容体ガンマコアクチベーター１−アルファ（ｐｇｃ１α）のレベルは、遺伝子型の間で変化しなかった。
ＴＲＰＶ１突然変異体マウスにおいて観察されるβ細胞質量増加のため、本出願人らは、その軽度のインスリン抵抗性を代償するために、グルコース耐性改善が、グルコースに応答したインスリン過分泌により達成されたと想定した。この仮説と一貫して、齧歯類におけるＴＲＰＶ１ニューロンの化学除神経またはＴＲＰＶ１の化学的阻害のいずれかが、グルコース依存性インスリン分泌を増加させる（Ｇｒａｍら、Ｅｕｒ． Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２５巻：２１３〜２２３頁、２００７年；Ｔａｎａｋａら、Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．８８巻：５５９〜５６３頁、２０１１年）。実際に、膵島ｍＲＮＡのｑＰＣＲ解析は、インスリン遺伝子（ｉｎｓ２）が、ＴＲＰＶ１突然変異体細胞においてほぼ２倍上方調節されたことを明らかにした。ＴＲＰＶ１およびインスリン分泌の間の関連を直接的に評価するために、グルコース注射後にインスリンレベルがモニターされる、グルコース刺激インスリン分泌実験（ＧＳＩＳ）を行った（図１２Ｇ）。本出願人らは、インスリン放出が、ＷＴよりもＴＲＰＶ１突然変異体マウスにおいて有意に明白であった（ｐ＜０．０５）ことを見出し、これにより、ＴＲＰＶ１突然変異体のグルコース耐性改善を説明する。健康であり、２型糖尿病の症状がないＴＲＰＶ１突然変異体マウスと一貫して、絶食時インスリンレベルは、野生型マウスと比較して同様に低かった（図１２Ｇ、１１Ｂ）。したがって、ＴＲＰＶ１突然変異体マウスは、高インスリン性ではなく、むしろ、グルコース負荷に対しより頑強に応答するための食事インスリンの上昇を呈する。ＴＲＰＶ１突然変異体マウスのインスリン抵抗性の性質をさらに研究するために、本出願人らは、インスリン受容体経路の下流エフェクターを構成するＡＫＴリン酸化を解析することにより、肝臓および骨格筋におけるインスリン刺激シグナリングを評価した。静脈内インスリン注射後に、セリン／スレオニンキナーゼＡＫＴタンパク質のセリン４７３のリン酸化は、対照動物と比較してＴＲＰＶ１突然変異体動物の両方の組織において変更されず（図１２Ｈ）、インスリンシグナリングが、インスリンに応答してＴＲＰＶ１突然変異体において機能的であることを示す。
総合すると、ＴＲＰＶ１の喪失は、成長遅延されず、変更されたＩＧＦ−１レベルまたは応答性を持たないが、グルコース負荷後のインスリン分泌増加によって媒介されるグルコース耐性増加による若々しい代謝プロファイルを有する長寿命マウスをもたらす。これらのデータは、不良なＴＲＰＶ１感覚ニューロン機能が、グルコース恒常性および長寿に有益な効果を有することを示唆する。確立された長寿パラダイム（ＧＨ／ＩＧＦ−１および食事制限）に対し正準ではない機構によって長く生きるこのようなマウスの能力に興味をそそられ、ＴＲＰＶ１ニューロンが、この長寿促進性シグナルをモジュレートすることができる機構を研究した。
結果：Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ ＴＲＰＶは、ＣＲＴＣ１／ＣＲＥＢを介して寿命を調節する
哺乳動物神経内分泌系および代謝におけるその影響の複雑性に直面して、線虫Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓを使用して、ＴＲＰＶ１が、代謝および加齢過程をモジュレートすることができる可能な機構を明らかにした。より高レベルの統合および代償にもかかわらず、哺乳動物化学受容性臓器の機能的組織化は、解剖学的およびシグナリングレベルの両方で虫に対し多くの著しい類似性を呈する。保存されたシグナリング分子は、ＴＲＰＶチャネルファミリーのメンバーを含む。虫において、ｏｓｍ−９およびｏｃｒ−２は、嗅覚、侵害受容性およびセロトニン作動性ニューロンからシグナルを伝達するチャネル複合体として機能する（Ｃｏｌｂｅｒｔら、Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． Ｏｆｆ． Ｊ． Ｓｏｃ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１７巻：８２５９〜８２６９頁、１９９７年；Ｔｏｂｉｎら、Ｎｅｕｒｏｎ ３５巻：３０７〜３１８頁、２００２年；Ｚｈａｎｇ、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １３１巻：１６２９〜１６３８頁、２００４年）。マウスによく似て、虫におけるＴＲＰＶの喪失は、長寿増加をもたらした（図１３Ａ、表１１）。ｏｓｍ−９（ｋｙ４）およびｏｃｒ−２（ａｋ４７）の両方のヌル突然変異体を使用して、本出願人らは、どちらかのｔｒｐｖの喪失が、長寿の中程度の増加をもたらすことを観察し、この受容体ペアの機能的冗長性と一貫した（Ｃｏｌｂｅｒｔら、Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． Ｏｆｆ． Ｊ． Ｓｏｃ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１７巻：８２５９〜８２６９頁、１９９７年；Ｔｏｂｉｎら、Ｎｅｕｒｏｎ ３５巻：３０７〜３１８頁、２００２年；Ｚｈａｎｇ、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １３１巻：１６２９〜１６３８頁、２００４年）。しかし、ｏｓｍ−９およびｏｃｒ−２の両方の喪失は、対照動物と比較して最大３２％の頑強な寿命延長をもたらした。
リガンドに応答して、ＴＲＰＶ受容体は、細胞内カルシウム増加により、影響を受けた細胞の細胞質へとシグナルを伝達する（ＶｅｎｋａｔａｃｈａｌａｍおよびＭｏｎｔｅｌｌ、Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ． Ａｇｉｎｇ １４巻：２８７〜２９３頁、２００７年）。細胞におけるカルシウムフラックスの主要なトランスポンダーの１種は、カルシニューリンである（Ｍｅｌｌｓｔｒｏｍら、Ｐｈｙｓｉｏｌ． Ｒｅｖ．８８巻：４２１〜４４９頁、２００８年）。虫カルシニューリンオルソログ、カルシウム活性化カルシニューリン触媒Ａサブユニット、ｔａｘ−６は、加齢過程における入り組んだ役割を果たす（Ｄｏｎｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１７巻：６６０〜６６３頁、２００７年；Ｍａｉｒら、Ｎａｔｕｒｅ ４７０巻：４０４〜４０８頁、２０１１年）。ｔａｘ−６の喪失は、長寿命動物をもたらし、過剰活性化は、短い寿命をもたらす。虫における加齢過程を調節するためのｔａｘ−６の１つの本質的な標的は、高度に保存されたｃｒｔｃ−１（ＣＲＥＢ調節転写コアクチベーター１）である。ｔａｘ−６によるセリン７６および１７９におけるＣＲＴＣ１の脱リン酸化は、核局在、ＣＲＥＢ転写標的のモジュレーションおよび長寿低下をもたらす。カルシニューリンに反して、ＡＭＰＫは、エネルギー源をモニターし、ＣＲＴＣ１をリン酸化し、細胞質においてＣＲＴＣ１を保持する。長寿増加をもたらすｔａｘ−６の喪失と一貫して、ＡＭＰＫの活性増加は、セリン７６および１７９におけるＣＲＴＣ１のリン酸化により長寿増加をもたらし、部位は、ｔａｘ−６によって相殺される（Ｍａｉｒら、Ｎａｔｕｒｅ ４７０巻：４０４〜４０８頁、２０１１年）。長寿を調節するためのカルシニューリン下流の回路網は、十分に確立されているが、この経路の上流メディエーターは、不明である。
長寿およびカルシウム調節の間の関連のため、本出願人らは、ｔａｘ−６およびｃｒｔｃ−１が、ｔｒｐｖ媒介性長寿の下流で機能することができるか尋ねた。細胞における細胞内カルシウムを増加させる薬物であるトリカイン処置後に、ＣＲＴＣ１は、野生型動物では核へとシャトルするが、ｔａｘ−６（ｏｋ２０６５）突然変異体においては厳密に細胞質に残る（Ｍａｉｒら、Ｎａｔｕｒｅ ４７０巻：４０４〜４０８頁、２０１１年）。ｔａｘ−６突然変異体虫と同様に、ｔｒｐｖ突然変異体（ｏｓｍ−９；ｏｃｒ−２二重突然変異体動物）は、トリカイン処置後にＣＲＴＣ１の細胞質局在を保持し（図１３Ｂ）、ＴＲＰＶが、ｔａｘ−６／ｃｒｔｃ経路内の上流で機能することを示す。カルシニューリン経路における上流で機能するＴＲＰＶと一貫して、虫におけるｔｒｐｖの喪失に起因する長寿増加は、ＣＲＴＣ１長寿経路に完全に依存した。野生型動物において寿命を延長するｔａｘ−６の不活性化は、ｔｒｐｖ突然変異体の寿命をさらに増加させなかった（図１３Ｃ）。ＣＴＲＣ１の翻訳後修飾により長寿をモジュレートするｔａｘ−６と合致して、本出願人らは、ｃｒｔｃ−１が、カルシニューリン脱リン酸化部位Ｓ７６Ａ、Ｓ１７９Ａにおいて突然変異されて、構成的に核にされると、ｔｒｐｖ突然変異体の長寿増加が抑止されたことを見出した（図１３Ｄ）。したがって、ｔｒｐｖシグナリングの喪失に起因する寿命延長は、ＡＭＰＫおよびカルシニューリンによる調節に使用される同じリン酸化部位におけるＣＲＴＣ１の核排除に完全に依存した。総合すると、これらの結果は、化学受容性ニューロンのサブセットが、動物の長寿を最終的に指示するＣＲＴＣ１／ＣＲＥＢ活性をモジュレートすることにより、ＴＲＰＶカルシウムシグナリングカスケードを利用して、環境条件による虫代謝を調整することを示す。
結果：ＴＲＰＶ１は、マウスにおけるＣＲＴＣ１／ＣＲＥＢを調節する
同じシステムが、長寿命ＴＲＰＶ１突然変異体マウスに関与し得るかに関して決定された。最も豊富なＣＲＥＢ調節転写コアクチベーターの細胞分布をニューロン組織において試験し、ＣＲＴＣ１をＴＲＰＶ１突然変異体および野生型マウスから解離された後根神経節（ＤＲＧ）ニューロン培養物において試験した（図１４Ａ〜１４Ｅ）。以前の知見は、海馬培養物において、ＣＲＴＣ１が、カルシウム／カルシニューリンカスケードを使用して、グルタミン酸作動性シナプス活動下で興奮性細胞の核へとシャトルすることを示す（Ｃｈ’ｎｇら、Ｃｅｌｌ １５０巻：２０７〜２２１頁、２０１２年；Ｋｏｖａｃｓら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．１０４巻：４７００〜４７０５頁、２００７年）。ＣＲＴＣ１の核局在の持続は、ｃＡＭＰレベルによって調節される。カルシウムおよびｃＡＭＰカスケードが、ＤＲＧニューロンにおいてＣＲＴＣ１の動的シャトリングを調節するか評価するために、これらの経路を薬理学的に操作することにより、ＴＲＰＶ１突然変異体から単離されたＤＲＧニューロンの細胞体においてＣＲＴＣ１の核から細胞質への輸送を解析した（図１４Ａ）。ＴＲＰＶ１またはＴＲＰＶ１同時マーカー（ｃｏ−ｍａｒｋｅｒ）ＣＧＲＰいずれかに対して直接的な免疫反応性は、ＴＲＰＶ１を発現する小から中間サイズの侵害受容器ニューロンの認識を可能にした（Ｂｅｒｎａｒｄｉｎｉら、Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ １２６巻：５８５〜５９０頁、２００４年；Ｃａｔｅｒｉｎａら、Ｎａｔｕｒｅ ３８９巻：８１６〜８２４頁、１９９７年；ＰｒｉｃｅおよびＦｌｏｒｅｓ、Ｊ． Ｐａｉｎ Ｏｆｆ． Ｊ． Ａｍ． Ｐａｉｎ Ｓｏｃ．８巻：２６３〜２７２頁、２００７年；Ｓｚａｌｌａｓｉら、Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．７０３巻：１７５〜１８３頁、１９９５年）。ＣＲＴＣ１免疫反応性は、末梢ＤＲＧニューロンにおいて観察され、細胞分布は、海馬培養物と同様であった（Ｃｈ’ｎｇら、Ｃｅｌｌ １５０巻：２０７〜２２１頁、２０１２年；Ｋｏｖａｃｓら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．１０４巻：４７００〜４７０５頁、２００７年）。実際に、基本条件下において、ＣＲＴＣ１は、一次ニューロンの軸索、樹状突起および神経細胞体に局在化する（図１４Ｂ）。ナトリウムチャネル遮断薬テトロドトキシン（ＴＴＸ）を使用して、内在性シナプス活動を低下させ、ＮＭＤＡ受容体を介したカルシウム侵入を防止した。
ＴＴＸ前処置下で、ＣＲＴＣ１の分布は、基本条件において観察される通りに、大部分は細胞質に残った（図１４Ｃ）。ＣＲＴＣ１シャトリングをモニターするための条件を確立するために、ｃＡＭＰレベルを高め、したがってＣＲＴＣリン酸化を減少させるフォルスコリン（ＦＳＫ）（Ｋｏｖａｃｓら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．１０４巻：４７００〜４７０５頁、２００７年；Ｓｃｒｅａｔｏｎら、Ｃｅｌｌ １１９巻：６１〜７４頁、２００４年）ならびにカルシウム侵入およびカルシニューリンの活性化を誘引し、ＣＲＴＣ脱リン酸化をもたらすＫＣｌの組合せによるニューロンの刺激は、ＷＴおよびＴＲＰＶ１突然変異体ＤＲＧ細胞においてＣＲＴＣ１核侵入を誘導し、陽性対照として機能した（図１４Ｃ）。
Ｌ型電位開口型カルシウムチャネル（ＬＶＧＣＣ）の活性化は、ニューロンにおいて頑強なカルシウム電流を誘発し、海馬ＣＲＴＣ１シャトリングをもたらす（Ｃｈ’ｎｇら、Ｃｅｌｌ １５０巻：２０７〜２２１頁、２０１２年）。ＴＲＰＶ１の活性化およびその後のカルシウム侵入が、ＣＲＴＣ１を直接的にモジュレートしているか検査するために、天然ＴＲＰＶ１アゴニスト、カプサイシン（Ｃａｐ）をＤＲＧニューロンにアプライし、ＷＴ ＤＲＧ培養物のＴＲＰＶ１陽性細胞の核におけるＣＲＴＣ１の蓄積を観察した（図１４Ｃ）。核侵入は、ＦＳＫおよびＫＣｌによる処置と同様であった（図１４Ｃ）。より重要なことに、Ｃａｐ誘導性ＣＲＴＣ１シャトリングは、ＴＲＰＶ１突然変異体ＤＲＧニューロンにおいて消失した（図１４Ｃ）。ＣＲＴＣ１核シャトリングにおけるＴＲＰＶ１の役割の追加的な検査として、ＴＲＰＶ１の選択的化学的アンタゴニスト（ＳＢ−３６６７９１）によるＴＲＰＶ１の遮断は、ＷＴ ＤＲＧニューロンにおけるＣＲＴＣ１の頑強な核排除をもたらし（図１４Ｄ）、ＴＲＰＶ１突然変異体ＤＲＧニューロンに見られるものとよく似ていた。
これらの知見は、ＴＲＰＶ１によるカルシウム侵入が、ＣＲＴＣ１の核再分布の促進に十分であり、カルシニューリン活性化を引き起こす可能性があることを実証する。ＴＲＰＶ１下流のカルシニューリン経路の必要性を試験するために、本出願人らは、カルシニューリン阻害剤シクロスポリンＡ（ＣｓＡ）と共にＤＲＧニューロンをインキュベートした。海馬細胞において以前に観察された通りに（Ｋｏｖａｃｓら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．１０４巻：４７００〜４７０５頁、２００７年）、ＣｓＡは、ＴＲＰＶ１陽性ＤＲＧニューロンにおけるＦＳＫ＋ＫＣｌ媒介性ＣＲＴＣ１核蓄積を防止した（図１４Ｄ）。ＣｓＡ前処置は、ＷＴ ＤＲＧニューロンにおいてＣＲＴＣ１を核に入れるＣａｐの能力も阻害した（図１４Ｄ）。総合すると、本出願人らのデータは、ＴＲＰＶ１が、無脊椎動物および脊椎動物の両方におけるカルシニューリン活性によるＣＲＴＣ１シャトリングの強力な調節因子であることを示す。
結果：ＴＲＰＶ１は、ＤＲＧにおいてＣＲＥＢ標的遺伝子を調節する
ＴＲＰＶ１活性下で核へとシャトルするＣＲＴＣ１の能力は、外部出力に迅速に適応する柔軟な転写機構の存在を実証する。ＴＲＰＶ１突然変異体ＤＲＧニューロンにおけるＣＲＴＣ１の核排除は、ＣＲＥＢ転写活性が、ＴＲＰＶ１突然変異体マウスのＤＲＧニューロンにおいて変更される可能性があることを示唆する。炎症性条件下で、ＴＲＰＶ１発現ＤＲＧニューロンは、ＣＲＥＢシグナリングカスケードを利用して、ＣＧＲＰプロモーターへのＣＲＥＢの結合により、ＣＧＲＰの放出により神経原性炎症を誘導する（Ｎａｋａｎｉｓｈｉら、Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． Ｃｅｌｌ ２１巻：２５６８〜２５７７頁、２０１０年）。ＴＲＰＶ１突然変異体マウスにおいて、ＣＲＥＢ転写活性が、ＣＲＴＣ１の核排除により下方調節されることが仮定された。実際に、ＤＲＧニューロンのｍＲＮＡ発現解析は、以前に特徴付けられたＣＲＥＢ標的遺伝子が、野生型動物と比較して長寿命ＴＲＰＶ１突然変異体において低下したことを明らかにした（図１４Ｅ）。
結果：サブスタンスＰではなくＣＧＲＰが、インスリン分泌を調節する
長寿命ＴＲＰＶ１突然変異体マウスは、グルコース負荷後のインスリン分泌増加により改善されたグルコース恒常性を含む若々しい代謝プログラムを享受する。ＤＲＧニューロンは、膵β細胞を神経支配する高密度網目構造を形成するため（Ａｋｉｂａら、Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ．３２１巻：２１９〜２２５頁、２００４年；Ｒａｚａｖｉら、Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ Ｄｉａｂｅｔｅｓ． Ｃｅｌｌ １２７巻：１１２３〜１１３５頁、２００６年）、ＤＲＧ内のＴＲＰＶ１ニューロンが、膵β細胞からのインスリン放出を阻害する因子を分泌し、これにより、正確なインスリン恒常性を確立し得ることが仮定された。さらに、ＣＲＴＣ１局在は、ＴＲＰＶ１ニューロンにおいて変更されるため、ＤＲＧにおけるＴＲＰＶ１ニューロンから生じる分泌された因子（複数可）は、ＣＲＴＣ１／ＣＲＥＢによる転写制御下に置かれ得る。ＤＲＧニューロン内のＣＲＥＢ調節遺伝子の解析において、それぞれ２種のＴＲＰＶ１分泌ニューロペプチド、ＣＧＲＰおよびサブスタンスＰの前駆体である、カルシトニン関連ポリペプチドα（ｃａｌｃａ）およびタキキニン１（ｔａｃ１）転写産物の誘導は、ＴＲＰＶ１突然変異体マウスにおいて低下した（図１４Ｅ）。したがって、本出願人らは、サブスタンスＰまたはＣＧＲＰのいずれが、膵β細胞からのインスリン分泌に影響し得るか尋ねた。
膵β細胞グルコース媒介性インスリン放出を模倣するために、マウスインスリノーマＭＩＮ６細胞を使用した（Ｈｕｉｓｉｎｇら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．１０７巻：９１２〜９１７頁、２０１０年）。１６．８ｍＭのグルコースにより刺激されると、ＭＩＮ６細胞は、最大１５０ｎｇ／ｍｌのインスリンを放出する。しかし、同じ細胞が、アミノ酸レベルで殆ど同一である（Ｅｍｅｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３４１巻：７６〜８０頁、１９８９年）組換えラットα−ＣＧＲＰまたはβ−ＣＧＲＰのいずれかの１００ｎＭ〜５００ｎＭの間に及ぶ用量で処置されると（図１５Ａ、１５Ｂ）、インスリン放出は大幅に鈍った。特に１００ｎＭのα−ＣＧＲＰ処置は、インスリン放出を４６％も有意に低下させ、５００ｎＭのβ−ＣＧＲＰは、最大インスリン応答の５８％も低下させた。ヒトα−ＣＧＲＰも、より少ない程度ではあるが、インスリン応答の有意な遮断を示した（図１６Ａ）。さらに、１００ｎＭ〜５００ｎＭサブスタンスＰによる処置は、ＭＩＮ６細胞のインスリン分泌を変更せず、インスリン分泌におけるＣＧＲＰの効果が、ＣＧＲＰ受容体によって特異的に媒介されることを示唆する（図１５Ｃ）。興味深いことに、エキセンディン４による負荷後に観察される通り、ＣＧＲＰは、インクレチンによる高グルコース下のグルコース刺激インスリン分泌の増強を阻害しなかった（図１６Ｂ）。これらのデータは、ＣＧＲＰが、膵β細胞からのグルコース媒介性インスリン分泌を阻害するという以前の観察を確認する（Ａｈｒｅｎら、Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ ３０巻：３５４〜３５９頁、１９８７年；Ｋｏｇｉｒｅら、Ｐａｎｃｒｅａｓ ６巻：４５９〜４６３頁、１９９１年）。
結果：ＣＧＲＰ恒常性が、代謝的健康をモジュレートする
２型糖尿病の病態形成は、低度炎症を含み、これは、ＴＲＰＶ１ニューロンを連続的に刺激し、したがって、ＣＧＲＰ放出および炎症性応答の増悪を推定的に持続し得る（ＳｕｒｉおよびＳｚａｌｌａｓｉ、２００８年）。これらの結果と一貫して、ＴＲＰＶ１突然変異体マウス由来の脳および筋肉組織におけるケモカインおよび炎症促進性遺伝子を含むより低レベルの炎症性マーカーに向かう傾向が観察された（図１６Ｃ）。同様に、加齢は、慢性低度炎症をもたらし（Ｗｏｏｄｓら、Ａｇｉｎｇ Ｄｉｓ．３巻：１３０〜１４０頁、２０１１年）、循環ＣＧＲＰのレベル増加が高齢ラットにおいて検出される。総合すると、循環ＣＧＲＰのレベル減少は、代謝性機能改善および長寿に有益となり得るが、高レベルは、有害となり得る。この仮説を検査するために、対照およびＴＲＰＶ１突然変異体マウスにおける血清中の循環ＣＧＲＰレベルを測定した（図１５Ｄ）。ラットにおいて観察される通り、ＣＧＲＰの血清レベルは、ＷＴマウスにおいて年齢と共に４２％増加する（６ヶ月ｖｓ２４ヶ月）。しかし、この増加は、ＴＲＰＶ１突然変異体マウスにおいて遮断された。実際に、ＣＧＲＰレベルは、若齢および老齢ＴＲＰＶ１突然変異体マウスの間で未変化のままである。
ＣＧＲＰ増加が、より老齢の動物の健康に有害となり得るか尋ねるために、本出願人らは、ＣＧＲＰ恒常性を回復させる試みにおいて、老齢野生型マウスに、ＣＧＲＰ受容体アンタゴニスト、ＣＧＲＰ８−３７を負荷した（Ｐｏｙｎｅｒら、Ｂｒ． Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１２４巻：１６５９〜１６６６頁、１９９８年）（図１５ＥおよびＦ）。６週間の処置後に、本出願人らは、老齢マウスが、媒体対照マウスとは反対に、そのＲＥＲによって測定される代謝の若返りを示す、夜から昼へのより若々しい代謝性概日シフトの再出現を呈することを見出した。ＴＲＰＶ１突然変異体マウスにおいて観察される通り、対照と比較して、ＣＧＲＰ８−３７処置マウスにおいて酸素消費も増加した。これらのデータは、ＣＧＲＰ経路の薬理学的阻害が、老齢動物における代謝の若さの回復および野生型動物にとって有害な年齢に伴う天然ＣＧＲＰ蓄積の相殺に十分であることを示す。
考察
ＣＲＴＣ１／ＣＲＥＢ経路の遺伝子操作が、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓの加齢をモジュレートし、化学受容性知覚の破壊が、虫およびハエにおける寿命を延長することが示されたが、同様の機構が、哺乳動物の長寿を調節するか否かは不明であった。本明細書に示す結果は、侵害受容に決定的なイオンチャネルであるＴＲＰＶ１の遺伝的欠失が、末梢感覚ニューロンにおけるＣＲＴＣ１の活性を調節することにより、マウスおよびＣ．ｅｌｅｇａｎｓの寿命を延長することのエビデンスを提供する。ＴＲＰＶ１を代謝に関連付ける既存の先例を考慮すると、このようなマウスのインスリン代謝は、掘り下げて特徴付けられた。ｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏアプローチの組合せを使用して、ＴＲＰＶ１突然変異体動物が、軽度のインスリン抵抗性にもかかわらず、加齢を通して改善されたグルコース耐性および増加したエネルギー支出を有することが観察された。前者を除いて、これらの表現型は、このようなマウスの例外的な長寿の根底にあり得る。インスリン抵抗性が、改善されたグルコース耐性に関連する様々な長寿命マウスにおいて観察されており、したがって、必ずしも健康不良または寿命短縮の指標ではないことに留意されたい。反対に、エネルギー支出は、寿命延長に関連する推定長寿バイオマーカーとして出現した。加齢を通した改善されたエネルギー支出は、炭水化物および脂肪代謝の間のより健康的な移行を確実にすることにより、脂肪貯蔵および脂肪代謝に伴う全身性損傷を予防する。改善されたエネルギー支出と一貫して、ＴＲＰＶ１突然変異体マウスは、グルコース耐性および高脂肪食によって誘導される肥満に対する抵抗性に有益な効果を示す。興味深いことに、新生物リンパ系起源のがん発生率の減少は、ＴＲＰＶ１突然変異体マウスに観察される通り、エネルギー支出増加および寿命増加に以前に関連付けられ、エネルギー支出改善および若々しい加齢の間の関連を強化する。
ＣＧＲＰは、膵臓におけるＴＲＰＶ１線維から局所的に分泌されるため、本明細書のデータは、ＴＲＰＶ１が同様に存在し、海馬シナプス可塑性に影響する脳における役割ではなく、末梢神経系機能をモジュレートすることによる寿命におけるＴＲＰＶ１の役割を支持して議論する。その上、神経膠におけるＴＲＰＶ１の弱い存在は、膵島からのインスリン分泌の調節においてＤＲＧニューロンを補助するグリア細胞の寄与の根底にある可能性がある。末梢ニューロン制御と一貫して、以前の研究は、ＣＧＲＰの放出によるβ細胞におけるインスリン分泌のアンタゴナイズにおけるＴＲＰＶ１ニューロンの直接的な役割を支持し、ＴＲＰＶ１突然変異体マウスに観察される改善された認知機能が、海馬におけるＴＲＰＶ１の喪失よりもむしろ、このようなマウスにおける健康寿命改善によるものである可能性が高いことを示唆する。
ニューロンにおけるカルシウム恒常性の破壊は、加齢に伴い観察され、高度に年齢感受性の構造である加齢性海馬機能不全の文脈において実証される。ＴＲＰＶ１活性化は、ニューロンにおけるカルシウム流入を誘導し、ＣａＭＫおよびＰＫＣアイソエンザイムの活性化を含むカルシウム媒介性シグナル伝達をもたらす。したがって、ＴＲＰＶ１シグナリングを破壊することによるカルシウムバランスの保存は、有益である可能性がある。遺伝子発現を制御するカルシウムおよびｃＡＭＰ依存性経路は、セリン１３３におけるＣＲＥＢのリン酸化および転写活性化を最終的にもたらす、多くの共通のプレーヤーおよびクロストークポイントを共有するため、そのコアクチベーターＣＲＴＣ１によって調節されるＣＲＥＢ経路は、ＴＲＰＶ１シグナルを統合するために高度に可能性の高い候補を構成する。Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓおよびマウス一次ＤＲＧニューロンの両方における知見は、ＣＲＥＢ転写因子のカルシウムおよびｃＡＭＰ依存性、リン酸化非依存性活性化を媒介するための、カルシニューリン依存性様式で核を出入りするシャトリングにおけるＣＲＴＣの役割を強く支持する。結果は、ＣＲＥＢ転写調節のサイレンシングが、ＣＲＥＢ標的ＣＧＲＰの合成に影響を与えることをさらに実証する。
ＣＧＲＰレベルは、年齢と共に激しく増加し、β細胞からのインスリン分泌を遮断することにより、加齢に伴う２型糖尿病の発症に寄与し得る。この仮説と一貫して、低度炎症は、加齢発病Ｔ２Ｄに関連し、炎症促進剤は、持続的ＣＧＲＰ放出およびより高度な炎症状態の原因となるＴＲＰＶ１ニューロンを刺激し、糖尿病増悪をもたらし得る。したがって、持続的な高ＣＧＲＰレベルは、β細胞機能および代謝的健康にマイナスに影響する可能性がある。対照的に、ＴＲＰＶ１突然変異体マウスまたはＣＧＲＰ受容体アンタゴニストＣＧＲＰ８−３７による薬物処置によって達成される低ＣＧＲＰレベルの維持は、老齢マウスにおける若々しい代謝、加齢に伴う疾患の遅延および長寿増加に関連する。
総合すると、これらの知見は、ＴＲＰＶチャネルが、複数の感覚入力を統合し、ＣＲＴＣ１／ＣＲＥＢ回路を介して代謝活性を調整することにより長寿を促進する神経内分泌シグナルへとこれらを伝達する進化的に保存された系として感覚ニューロンにおいて機能することを示す。特に、これらのデータは、哺乳動物における長寿の決定的な神経内分泌調節因子ならびに予測寿命および健康寿命の可能なバイオマーカーとしてのニューロペプチドＣＧＲＰの役割を強調する。興味深いことに、３０年間を超えて生きる極めて長寿命のハダカデバネズミは、ＤＲＧにおけるＣＧＲＰを天然に欠く（Ｐａｒｋら、Ｊ． Ｃｏｍｐ． Ｎｅｕｒｏｌ．４６５巻、１０４〜１２０頁、２００３年）。ＴＲＰＶ１および／またはＣＧＲＰの薬理学的操作は、疼痛に有用なだけではなく、グルコース恒常性および加齢を改善する可能性もある。この着想と一貫して、ＴＲＰＶ１ニューロンを過剰刺激し、その死の原因となり得るカプサイシンが豊富な食事は、ヒトにおける糖尿病および代謝調節不全のより低い発生率（ｉｎｃｉｄｅｎｔ）に長年関連付けられてきた（Ｗｅｓｔｅｒｔｅｒｐ−Ｐｌａｎｔｅｎｇａら、Ｉｎｔ． Ｊ． Ｏｂｅｓ．２００５年、２９巻、６８２〜６８８頁、２００５年）。
（実施例６）
糖尿病動物の代謝的健康における抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体の効果
糖尿病動物におけるグルコースおよびインスリンの応答性、呼吸交換率ならびに酸素消費等、代謝的健康における本明細書に記載されている１種または複数の抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体の使用について研究する。１種または複数の抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体を含む組成物を使用して、糖尿病を患う対象におけるグルコース応答性、インスリン分泌および代謝的健康を増加させることができる。本明細書において、その効果について研究する。
糖尿病齧歯類モデル、例えば、ＢＫＳ−ＤＢマウスを試験のために獲得する。あるいは、齧歯類の糖尿病は、標準プロトコールに従ってストレプトゾトシン（ＳＴＺ）を齧歯類に投与することにより誘導することができる。動物は、清潔環境維持管理業務に従って、温度（約２４±１℃）および湿度制御環境（約５０〜６０％）においてほぼ定期的な明暗サイクルで、２〜５匹の群に収容される。動物は、食物および水に自由にアクセスできる。
全群に、注射により薬物媒体溶液（ＰＢＳ、０．０１％ｔｗｅｅｎ）または抗ＣＧＲＰ抗体溶液のいずれかを投与する。群は、薬物媒体溶液を投与されるＤＭモデル対照群、異なる投薬量の抗体を投与される抗ＣＧＲＰ抗体群を含む。加えて、糖尿病症状がない野生型動物の群に、対照媒体溶液を投与する。特に、齧歯類に静脈内注射する（１０ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇまたは１ｍｇ／ｋｇの４９０１またはＧ１抗体）。
全動物は、消費される水および食物の量、尿の量、全般的な精神状態、活動ならびに毛色に関して密接にモニターされる。全動物は、週に１回秤量され、その経時的な生存が記録される。１、２、３、４週間目等、特異的な時点において、動物は、グルコース耐性およびグルコース応答性ならびにインスリン抵抗性に関して評価される。
５時間の絶食後に、全群における絶食動物の血液試料を、尾静脈から得る。グルコース耐性検査（ＧＴＴ）も行って、動物のグルコース耐性およびグルコース応答性を評価する。全群由来の動物に、グルコース溶液（２ｇ／ｋｇ体重）を腹腔内投与する。全群における血液試料は、グルコース溶液投与後０時（グルコース投与前）、１５分、０．５時間、１時間、１．５時間、２時間および２．５時間目に尾静脈から得られる。グルコースの血清／血漿レベルが測定される。インスリン耐性検査（ＩＴＴ）のため、５時間絶食した齧歯類に、１ｕ／ｋｇのヒトインスリンを注射し、ＧＴＴと同様にグルコースを測定する。Ｊｏｒｄｅｎら、２０１１年に以前に記載された通りに、肝臓および筋肉組織におけるインスリン刺激シグナリングを行う。グルコースおよびインスリンレベルの絶食時血清／血漿レベル、ならびにＧＴＴおよびＩＴＴ検査の両方における各時点のこれらのレベルを測定する。呼吸交換率（ＲＥＲ）解析および酸素消費を評価する。動物の寿命も記録および比較する。
抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体が、糖尿病動物における代謝的健康を改善し、長寿を増加させるであろうことが予想される。
（実施例７）
糖尿病動物の代謝的健康における抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体およびＴＲＰＶ−１阻害の比較
糖尿病動物におけるインスリン分泌ならびにグルコースレベルおよび耐性等、代謝的健康における本明細書に記載されている抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体およびＴＲＰＶ−１阻害の効果の差について研究する。本明細書において、その効果について研究する。
糖尿病齧歯類モデル、例えば、ＢＫＳ−ＤＢマウスを使用することができる。あるいは、齧歯類の糖尿病は、標準プロトコールに従ってストレプトゾトシン（ＳＴＺ）を齧歯類に投与することにより誘導することができる。動物は、清潔環境維持管理業務に従って、温度（約２４±１℃）および湿度制御環境（約５０〜６０％）においてほぼ定期的な明暗サイクルで、２〜５匹の群に収容される。動物は、食物および水に自由にアクセスできる。
糖尿病マウスの群に、注射により抗ＣＧＲＰ抗体またはカプサゼピン（ＴＲＰＶ−１アンタゴニスト）のいずれかを含有する薬物媒体溶液（ＰＢＳ、０．０１％ｔｗｅｅｎ）を投与する。比較のため、糖尿病症状がない野生型動物の群に、同様の処置を与える。全動物は、消費される水および食物の量、尿の量、全般的な精神状態、活動ならびに毛色に関して密接にモニターされる。全動物は、週に１回秤量される。１、２、３、４週間目等、特異的な時点において、動物は、グルコース耐性およびグルコース応答性ならびにインスリン抵抗性に関して評価される。
５時間の絶食後に、全群における絶食動物の血液試料を、尾静脈から得る。グルコース耐性検査（ＧＴＴ）も行って、動物のグルコース耐性およびグルコース応答性を評価する。全群由来の動物に、グルコース溶液（２ｇ／ｋｇ体重）を腹腔内投与する。全群における血液試料は、グルコース溶液投与後０時（グルコース投与前）、１５分、０．５時間、１時間、１．５時間、２時間および２．５時間目に尾静脈から得られる。グルコースの血清／血漿レベルが測定される。インスリン耐性検査（ＩＴＴ）のため、５時間絶食した齧歯類に、１ｕ／ｋｇのヒトインスリンを注射し、ＧＴＴと同様にグルコースを測定する。Ｊｏｒｄｅｎら、２０１１年に以前に記載された通りに、肝臓および筋肉組織におけるインスリン刺激シグナリングを行う。グルコースおよびインスリンレベルの絶食時血清／血漿レベル、ならびにＧＴＴおよびＩＴＴ検査の両方における各時点のこれらのレベルを測定する。呼吸交換率（ＲＥＲ）解析および酸素消費を評価する。動物の寿命も記録および比較する。
（実施例８）
糖尿病動物の代謝的健康および長寿における異なる抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体の比較
糖尿病動物のインスリン分泌ならびにグルコースレベルおよび耐性における、異なる供給源およびベンダーから得られる抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体の効果の差について研究する。本明細書において、その効果について研究する。
糖尿病齧歯類モデル、例えば、ＢＫＳ−ＤＢマウスを使用することができる。あるいは、齧歯類の糖尿病は、標準プロトコールに従ってストレプトゾトシン（ＳＴＺ）を齧歯類に投与することにより誘導することができる。動物は、清潔環境維持管理業務に従って、温度（約２４±１℃）および湿度制御環境（約５０〜６０％）においてほぼ定期的な明暗サイクルで、２〜５匹の群に収容される。動物は、食物および水に自由にアクセスできる。
群に、注射により抗ＣＧＲＰ抗体Ｇ１（本明細書に記載されている）、ＡＬＤ４０３（Ａｌｄｅｒ ＢｉｏＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ製の抗ＣＧＲＰ抗体）またはＬＹ２９５１７４２（Ａｒｔｅａｕｓ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ製の抗ＣＧＲＰ抗体）を含有する薬物媒体溶液（ＰＢＳ、０．０１％ｔｗｅｅｎ）を投与する。抗体は、異なる濃度で投与することができる。比較のため、糖尿病症状がない野生型動物の群に、同様の処置を与える。全動物は、消費される水および食物の量、尿の量、全般的な精神状態、活動ならびに毛色に関して密接にモニターされる。全動物は、週に１回秤量される。１、２、３、４週間目等、特異的な時点において、動物は、グルコース耐性およびグルコース応答性ならびにインスリン抵抗性に関して評価される。呼吸交換率（ＲＥＲ）解析および酸素消費を評価する。動物の寿命も記録および比較する。
５時間の絶食後に、全群における絶食動物の血液試料を、尾静脈から得る。グルコース耐性検査（ＧＴＴ）も行って、動物のグルコース耐性およびグルコース応答性を評価する。全群由来の動物に、グルコース溶液（２ｇ／ｋｇ体重）を腹腔内投与する。全群における血液試料は、グルコース溶液投与後０時（グルコース投与前）、１５分、０．５時間、１時間、１．５時間、２時間および２．５時間目に尾静脈から得られる。グルコースの血清／血漿レベルが測定される。インスリン耐性検査（ＩＴＴ）のため、５時間絶食した齧歯類に、１ｕ／ｋｇのヒトインスリンを注射し、ＧＴＴと同様にグルコースを測定する。Ｊｏｒｄｅｎら、２０１１年に以前に記載された通りに、肝臓および筋肉組織におけるインスリン刺激シグナリングを行う。グルコースおよびインスリンレベルの絶食時血清／血漿レベル、ならびにＧＴＴおよびＩＴＴ検査の両方における各時点のこれらのレベルを測定する。
全ての抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体が、糖尿病動物におけるグルコースおよびインスリン耐性および応答性の増加等、代謝的健康を促進し、動物の寿命を増加させるであろうことが予想される。
（実施例９）
糖尿病ヒトにおける抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体の効果
糖尿病患者の代謝的健康における本明細書に記載されている抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体の使用について研究する。糖尿病患者の群を、試験のために登録する。全患者は、同様の食事および運動習慣、年齢および／または体重を有する。各患者の体重を毎日モニターする。全患者に、注射によってプラセボまたは抗ＣＧＲＰ抗体溶液のいずれかを投与する。
各患者に、少なくとも約２２５ｍｇの抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体の用量を投与する。抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体は、少なくとも約１５０ｍｇ／ｍＬの濃度の液体製剤として供給される。用量は、対象の身体の上腕後部への皮下注射として投与される。あるいは、用量は、静脈内注入により対象に与えることができる。かかる事例において、５．８５ｍＬの１５０ｍｇ／ｍＬ抗ＣＧＲＰ抗体は、バッグ内の総容量１３０ｍＬに対しＩＶバッグにおいて０．９％塩化ナトリウム溶液（通常の生理食塩水）と組み合わせることができる。約１００ｍＬのＩＶバッグ容量は、総用量２２５ｍｇに対し１時間の経過にわたり対象に静脈内注入することができる。投薬を反復する。全患者に、消費される水および食物の量、尿の量、全般的な精神状態および活動を毎日記録するように求める。８〜１２時間の絶食後に、全群における絶食患者の血液試料を、ベースライン（抗体またはプラセボ投与前）および生理食塩水または薬物投与後の特異的な時点で得る。グルコースの絶食時血清／血漿レベルが測定される。グルコース耐性検査（ＧＴＴ）およびインスリン抵抗性検査も行って、疾患の改善を評価する。
本開示の実施形態を本明細書に示し記載してきたが、かかる実施形態が、単なる一例として提供されていることが当業者には明らかであろう。そこで、当業者であれば、本発明から逸脱することなく多数の変種、変更および置換を思い付くであろう。本発明の実施において、本明細書に記載されている実施形態の様々な代替を用いることができることを理解されたい。次の特許請求の範囲が、本発明の範囲を定義し、かかる特許請求の範囲内の方法および構造ならびにこれらの均等物が、これにより包含されることが意図されている。

Claims (27)

  1. 代謝障害を患う対象に、治療有効量の１種または複数の抗カルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）アンタゴニスト抗体を投与するステップを含む、代謝障害を処置するための方法。
  2. 前記代謝障害が、体重増加、糖尿病および／または心血管疾患である、請求項１に記載の方法。
  3. 前記代謝障害が、糖尿病である、請求項１に記載の方法。
  4. 前記代謝障害が、インスリン分泌の阻害によって特徴付けられる障害である、請求項１に記載の方法。
  5. 前記対象が、前記投与後にインスリン分泌増加、グルコース耐性増加および長寿増加を示す、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
  6. 前記抗体が、ヒトまたはヒト化抗体である、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
  7. 前記抗体が、モノクローナル抗体である、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
  8. 前記対象が、ヒトである、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
  9. 前記１種または複数の抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体のうち少なくとも１種が、３７℃における表面プラズモン共鳴によって測定される５０ｎＭまたはそれ未満のＫＤで、カルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）に結合する、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
  10. 前記１種または複数の抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体のうち少なくとも１種が、ｉｎ ｖｉｖｏで少なくとも７日間の半減期を有する、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
  11. 前記１種または複数の抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体のうち少なくとも１種が、ＣＧＲＰのＣ末端領域に特異的に結合する、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
  12. 前記１種または複数の抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体のうち少なくとも１種が、配列ＧＳＫＡＦ（配列番号４８）によって規定されるエピトープを特異的に認識する、請求項１１に記載の方法。
  13. 前記１種または複数の抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体のうち少なくとも１種が、配列番号１または１５５に示すアミノ酸配列を有するＶＨドメインを含む、請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
  14. 前記１種または複数の抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体のうち少なくとも１種が、配列番号２または１５６に示すアミノ酸配列を有するＶＬドメインを含む、請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。
  15. 前記１種または複数の抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体のうち少なくとも１種が、（ａ）配列番号３、３３もしくは１７０に表記されているＣＤＲ Ｈ１；配列番号４もしくは１７１に表記されているＣＤＲ Ｈ２；配列番号５に表記されているＣＤＲ Ｈ３；配列番号６に表記されているＣＤＲ Ｌ１；配列番号７に表記されているＣＤＲ Ｌ２；および配列番号８に表記されているＣＤＲ Ｌ３；（ｂ）配列番号１５７、１７２もしくは１７３に表記されているＣＤＲ Ｈ１；配列番号２２もしくは１７４に表記されているＣＤＲ Ｈ２；配列番号１５９に表記されているＣＤＲ Ｈ３；配列番号１６０に表記されているＣＤＲ Ｌ１；配列番号１６１に表記されているＣＤＲ Ｌ２；および配列番号１６２に表記されているＣＤＲ Ｌ３；または（ｃ）表６に示す（ａ）に従った抗体のバリアントを含む、請求項１〜１４のいずれかに記載の方法。
  16. 前記１種または複数の抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体のうち少なくとも１種が、配列番号１に示すアミノ酸配列を有するＶＨドメインと、配列番号２に示すアミノ酸配列を有するＶＬドメインとを含む、請求項１〜１５のいずれかに記載の方法。
  17. 前記１種または複数の抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体のうち少なくとも１種が、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６８６７および／またはＰＴＡ−６８６６を有する発現ベクターによって産生される、請求項１〜１６のいずれかに記載の方法。
  18. 前記１種または複数の抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体のうち少なくとも１種が、Ｃ末端リシンを有するまたは有さない、配列番号１１に示す抗体Ｇ１重鎖完全抗体アミノ酸配列；および配列番号１２に示す抗体Ｇ１軽鎖完全抗体アミノ酸配列を含む、請求項１〜１７のいずれかに記載の方法。
  19. 前記１種または複数の抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体のうち少なくとも１種が、配列番号１６５に示す抗体Ｇ２重鎖完全抗体アミノ酸配列；および配列番号１６６に示す抗体Ｇ２軽鎖完全抗体アミノ酸配列を含む、請求項１〜１８のいずれかに記載の方法。
  20. 前記１種または複数の抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体が、末梢に投与される、請求項１〜１９のいずれかに記載の方法。
  21. 前記抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体が、経口、舌下、吸入により、経皮、皮下、静脈内、動脈内、関節内、関節周囲、局所的および／または筋肉内投与される、請求項１〜１９のいずれかに記載の方法。
  22. 前記１種または複数の抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体が、皮下または静脈内投与される、請求項２１に記載の方法。
  23. 前記１種または複数の抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体が、投与の際に末梢に作用する、請求項１〜２２のいずれかに記載の方法。
  24. 前記１種または複数の抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体のうち少なくとも１種が、（ａ）ＣＧＲＰに結合する；（ｂ）ＣＧＲＰがその受容体に結合するのを遮断する；（ｃ）ＣＧＲＰ受容体活性化を遮断もしくは減少させる；（ｄ）ＣＧＲＰの生物学的活性を阻害、遮断、抑制もしくは低下させる；（ｅ）ＣＧＲＰのクリアランスを増加させる；および／または（ｇ）ＣＧＲＰ合成、産生もしくは放出を阻害する、請求項１〜２３のいずれかに記載の方法。
  25. 前記１種または複数の抗ＣＧＲＰアンタゴニスト抗体の投与が、血清グルコースを少なくとも１０％低下させる、請求項１〜２４のいずれかに記載の方法。
  26. 前記対象が、１２６ｍｇ／ｄｌを上回る血中グルコースレベルを有する、請求項１〜２５のいずれかに記載の方法。
  27. 前記対象が、末梢血管疾患および／または末梢性ニューロパチーを有していない、請求項１〜２６のいずれかに記載の方法。
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