JP2017524362A - αＫｌｏｔｈｏに対して高親和性を有する抗体 - Google Patents

Abstract

αＫｌｏｔｈｏポリペプチド、場合により、折り畳まれたαＫｌｏｔｈｏのエピトープと特異的に、または場合により、競合的ＥＬＩＳＡアッセイにより測定した場合に約２ｎＭ以下の解離定数（ＫＤ）で結合する抗体および／またはその結合フラグメント、その生産方法および腎臓病を診断するための使用方法。

Description

関連出願の相互参照

これは２０１４年７月３１日に出願された米国仮特許出願第６２／０３１，４７７号の優先権に基づき３５ Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９の利益を主張する特許協力条約出願であり、引用することによりその全内容が本明細書の一部とされる。

本発明は、ＮＩＨグラント第Ｒ０１ＤＫ０９１３９２号、同第Ｒ０１ＤＫ０９２４６１号および同第Ｒ０１ＤＥ１３６８６号の下、一部は米国政府の支援でなされたものである。米国政府は本発明について所定の権利を持ち得る。

αＫｌｏｔｈｏポリペプチド内のエピトープと特異的に、例えば、競合的ＥＬＩＳＡアッセイにより測定した場合に約２ｎＭ以下の解離定数（Ｋ_Ｄ）で結合する抗体および／またはその結合フラグメント、ならびに例えば、腎臓病を診断するための前記抗体の作製方法および使用方法。

Ｋｌｏｔｈｏ遺伝子は、最初に、早期老化の抑制因子として同定された［１、総説としては２］。Ｋｌｏｔｈｏは主として腎臓、副甲状腺、および脈絡膜叢で発現される１回膜貫通タンパク質である［１、３、４］。βＫｌｏｔｈｏおよびγＫｌｏｔｈｏ［５、６］と呼ばれる機能および発現プロファイルが異なるパラログタンパク質も知られている。

αＫｌｏｔｈｏは、イオン輸送の調節、Ｗｎｔおよびインスリンシグナル伝達、レニン−アンギオテンシン系、幹細胞の動員、抗発癌、抗線維症、ならびに抗酸化を含む多様な作用を持つ。最高レベルのαＫｌｏｔｈｏ発現は腎臓におけるものである［１、７、８］。線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）２３の共受容体であるその膜貫通型［９〜１１］に加え、αＫｌｏｔｈｏはまた、転写産物の末端切断型ペプチドへのスプライシング［２］またはセクレターゼによるタンパク質分解性放出［１４、１５］により生じる内分泌物質［７、１２、１３］として循環、尿、および脳脊髄液中にも放出される。循環αＫｌｏｔｈｏの実質的部分は腎起源である［１６］。遺伝的なαＫｌｏｔｈｏ除去と慢性腎臓病（ＣＫＤ）の間の表現型の類似性は、αＫｌｏｔｈｏ腎発現の低下が病原であるという概念を裏づける［１、１６］。

腎臓のαＫｌｏｔｈｏ転写産物またはタンパク質レベル［１２、１８〜２４］および血清αＫｌｏｔｈｏ濃度［１２、２０］の低下がネフロン縮小手術、虚血性再潅流傷害、免疫複合体糸球体腎炎、多遺伝子性またはホルモン性高血圧症、代謝症候群、および糖尿病からの齧歯類ＣＫＤで証明されている［１２、１８〜２４］。この集束は、αＫｌｏｔｈｏ欠乏がネフロン喪失の遺伝的結果であり得ることを示唆する。αＫｌｏｔｈｏの低下はおそらくＣＫＤの高感度かつ早期バイオマーカーであり、ＣＫＤ合併症の予後のバイオマーカーでもある［２２］。齧歯類での実験的ＣＫＤにおけるαＫｌｏｔｈｏの回復は、腎臓病および腎外合併症を改善する［１２、２２、２３］。αＫｌｏｔｈｏ欠乏はまた、齧歯類およびヒト両方の急性腎障害（ＡＫＩ）でも報告されている［２５］。αＫｌｏｔｈｏは、現在知られているＡＫＩのバイオマーカーの変化よりもはるかに早期に減少するので、おそらくＡＫＩの早期バイオマーカーとして役立つ可能性がある［２６］。

αＫｌｏｔｈｏは、ＦＧＦ２３に対する選択的親和性を付与するためにＦＧＦ受容体（ＦＧＦＲ）と二元複合体を形成する［１０、２７］。αＫｌｏｔｈｏ発現の欠損は、マウス［１、２８］およびヒト［２９］においてＦＧＦ２３耐性およびリン酸保持をもたらす。従って、αＫｌｏｔｈｏおよびＦＧＦ２３は、リン酸代謝を調節する骨−腎内分泌軸の必須成分として浮上した［３０、３１］。

膜係留型αＫｌｏｔｈｏの細胞外ドメインは、可溶性タンパク質として分泌され得る。この可溶型は、膜係留型から膜係留プロテアーゼにより生成され、血液および尿中に放出される［１３、１５］。上述のように、膜係留型αＫｌｏｔｈｏはＦＧＦ２３受容体複合体の一部として働くが、分泌型αＫｌｏｔｈｏは、上述のように多面発現性の高い作用（イオン輸送の調節、Ｗｎｔおよびインスリンシグナル伝達、レニン−アンギオテンシン系、幹細胞の動員、抗発癌、抗線維症、および抗酸化）を発揮するように遠隔器官で作用を発揮する内分泌因子として働く［７］。

腎障害および腎機能の低下を特徴とする進行性ＣＫＤ（ステージ４〜５）は、推計２６０万人のカナダ人を侵し、集団の７％を越える。国家人口動態統計報告書、国民健康栄養調査および米国腎臓データシステムの最近の分析では、白人男性、白人女性、黒人男性、および黒人女性の生涯リスク、それぞれＣＫＤステージ３ａ＋、５３．６％、６４．９％、５１．８％、および６３．６％が示された［８４］。ＣＫＤおよびその関連合併症の人々の生活および医療制度への影響および負荷は大きく、数年後に増悪する［３２〜３４］。ＣＫＤを治療するための現行のアプローチには、食餌および投薬による、末期腎臓病（ＥＳＲＤ）に対しては透析および臓器移植によるリスク因子の改善が含まれる。合併症が生じる前に早期段階でＣＫＤの進行を停止または遅延させるためのさらなる療法の差し迫った必要がある。ＣＫＤの合併症の大多数は、ミネラル代謝の異常に結びつけられているＣＫＤ−骨ミネラル代謝異常(CKD-mineral bone disturbance)（ＣＫＤ−ＭＢＤ）の実体の中に包含される。リン酸保持はＣＫＤ患者に普遍的に見られ、不良な転帰に関連している［３５、３６］。高リン血症は通常、この疾患が末期への進行を運命付けられる場合の進行ステージのＣＫＤでのみ検出される［３７］。

最近、腎臓のαＫｌｏｔｈｏ発現の低下がＣＫＤにおける最も初期のイベントの１つであることが見出された［１２］。

現在のところ、市場で入手可能なαＫｌｏｔｈｏ抗体および診断キットがいくつかあるが、既存のαＫｌｏｔｈｏ抗体は十分な特異性がなく、ヒト血清からαＫｌｏｔｈｏを免疫沈降させるには有効でなく、αＫｌｏｔｈｏに関する現行の免疫に基づくアッセイは高くつき、感度および特異性が十分でない。

低αＫｌｏｔｈｏ転写産物およびタンパク質レベルは、末期腎臓の腎摘出術サンプルからのヒト腎臓およびＣＫＤ患者からの生検で記載されている［２１、３８］。免疫に基づくアッセイを用いた研究では、血清αＫｌｏｔｈｏ濃度の絶対値（異なる研究室でレベルにおいて１００倍位の範囲）およびＣＫＤおよび年齢による変化の方向（増加、減少、または変化無し）に関して広く分散した結果が示された［２１、３９〜６０］。矛盾したデータベースは進行を妨げ、有望な齧歯類でのデータが有意義なヒト適用に変換されるかどうかを決定する能力を無効にした。ＣＫＤに加え、様々な原因からの急性腎障害（ＡＫＩ）もまた、腎臓における［２５、６１〜６５］、また、齧歯類の血清中およびヒトの尿中の［２５］αＫｌｏｔｈｏの急速な低下に関連している。これまでにＡＫＩにおけるヒト血清αＫｌｏｔｈｏに関するデータは無い。ヒトにおける腎障害の早期の、高感度かつ／または特異的なマーカーの必要がある［６６］。

抗体開発のための動物の免疫誘導法は自己免疫から保護する機構を受けるので、保存されているタンパク質に対する抗体を作製することは難しい。合成抗体技術は、定義されたイン・ビトロ条件下で適用され、自己反応性抗体を除去する免疫寛容選択を受けている抗体ライブラリーを使用し、かつ、高い親和性および特異性を有する抗体を生じることが証明されている［６７〜７１］ので、有力な選択肢である。最適化された抗体フレームワーク内で、コンビナトリアル突然変異誘発により相補性決定領域（ＣＤＲ）に配列の多様性が導入される。これらのライブラリーはファージディスプレーと組み合わせられ、各ファージ粒子は内部にコードＤＮＡを保持しつつ、その表面にユニークな抗原結合フラグメント（Ｆａｂ）を提示し、従って、直接的な表現型−遺伝子型関係を達成する。対象抗原と結合するＦａｂ提示ファージは、固相支持体上の精製抗原による結合選択を用いて富化される。結合ファージクローンのＣＤＲはＤＮＡシーケンシングにより同定され、Ｆａｂタンパク質は細菌から精製されるか、または哺乳類細胞において全長ＩｇＧに変換される。

本発明開示は、αＫｌｏｔｈｏタンパク質と特異的に結合する抗体および／またはその結合フラグメントに関する。

１つの態様は、単離または精製された抗体および／またはその結合フラグメントを含み、前記抗体および／またはその結合フラグメントは、αＫｌｏｔｈｏポリペプチドのエピトープと、競合的ＥＬＩＳＡアッセイにより測定した場合に約２ｎＭ以下の解離定数（Ｋ_Ｄ）で特異的に結合する。

１つの実施形態では、抗体が特異的に結合するαＫｌｏｔｈｏポリペプチドは、折り畳まれたαＫｌｏｔｈｏポリペプチドである。

さらなる態様は、軽鎖可変領域と重鎖可変領域とを含んでなり、前記軽鎖可変領域が相補性決定領域ＣＤＲ−Ｌ３を含んでなり、かつ、前記重鎖可変領域が相補性決定領域ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３を含んでなり、前記ＣＤＲのアミノ酸配列が以下に示される配列：
ａ．ＣＤＲ−Ｌ３；Ｘ_１Ｘ_２Ｘ_３Ｘ_４ＰＸ_５（配列番号１）
（ここで、Ｘ_１はＡまたはＳであり、Ｘ_２はＧまたはＡであり、Ｘ_３はＹまたはＦであり、Ｘ_４はＳまたはＡであり、Ｘ_５はＩまたはＶである）；
ｂ．ＣＤＲ−Ｈ１： Ｘ_６Ｘ_７Ｘ_８Ｘ_９Ｘ_１０Ｘ_１１（配列番号２）
（ここで、Ｘ_６はＩまたはＶであり、Ｘ_７はＳまたはＡであり、Ｘ_８はＹ、ＦまたはＳであり、Ｘ_９はＹ、ＦまたはＳであり、Ｘ_１０はＳまたはＡであり、かつ、Ｘ_１１はＩまたはＶである）；
ｃ．ＣＤＲ−Ｈ２；Ｘ_１２Ｘ_１３Ｘ_１４Ｘ_１５Ｘ_１６Ｘ_１７Ｘ_１８Ｘ_１９Ｘ_２０Ｘ_２１（配列番号３）
（ここで、Ｘ_１２はＹ、ＦまたはＳであり、Ｘ２_１３はＩまたはＶであり、Ｘ_１４はＳまたはＡであり、Ｘ_１５はＰまたはＳであり、Ｘ_１６はＳまたはＡであり、Ｘ_１７はＹまたはＦであり、Ｘ_１８はＧまたはＡであり、Ｘ_１９はＹまたはＦであり、Ｘ_２０はＴまたはＳであり、かつ、Ｘ_２１はＳ、ＡまたはＹである）；および／または
ｄ．ＣＤＲ−Ｈ３：Ｘ_２２Ｘ_２３ＶＹＸ_２４Ｘ_２５Ｘ_２６Ｘ_２７ＷＸ_２８ＧＸ_２９ＧＭ（配列番号４）
（ここで、Ｘ_２２はＹまたはＦであり、Ｘ_２３はＹまたはＦであり、Ｘ_２４はＡまたはＳであり、Ｘ_２５はＳまたはＡであり、Ｘ_２６はＨまたはＮであり、Ｘ_２７はＧまたはＡであり、Ｘ_２８はＡまたはＳであり、かつ、Ｘ_２９はＹまたはＦである）
のうち１以上を含んでなる、抗体および／またはその結合フラグメントである。

別の態様は、本明細書に記載の抗体および／またはその結合フラグメントをコードする核酸を含む。

さらなる態様は、本明細書に記載の核酸を含んでなるベクターである。

別の態様は、本明細書に記載の抗体および／またはその結合フラグメント、核酸またはベクターを産生する組換え細胞を含む。

別の態様は、本明細書に記載の抗体および／またはその結合フラグメンを含んでなるまたは使用するイムノアッセイである。

他の態様は、本明細書に記載のαＫｌｏｔｈｏポリペプチドのエピトープに対して特異的結合親和性を有する抗体および／またはその結合フラグメントを生産する方法、サンプルにおけるαＫｌｏｔｈｏポリペプチドのレベルを測定するためのアッセイ、可溶性αＫｌｏｔｈｏポリペプチドを検出および／または測定するためのアッセイ、ならびに対象において慢性腎臓病（ＣＫＤ）および急性腎障害（ＡＫＩ）から選択される腎臓病態をスクリーニング、診断または検出する方法、ならびに疾患の進行および／または回復の予後診断を行う方法を含む。

本開示の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明から明らかとなる。しかしながら、この詳細な説明から当業者には本開示の趣旨および範囲内の様々な変化および改変が明らかとなるので、詳細な説明および具体例は、本開示の好ましい実施形態を示しつつ、単に例として示されると理解されるべきである。

以下、本開示の実施形態を図面に関して記載する。

図１は、ＩＭＧＴナンバリング法で抗αＫｌｏｔｈｏ ｓｂ１０６のｓｂ１０６（Ａ）ＣＤＲ配列の配列、特異性および親和性を示す。（Ｂ）Ｆａｂ−ファージＥＬＩＳＡによる抗αＫｌｏｔｈｏ ｓｂ１０６の特異性の決定：ｓｂ１０６ Ｆａｂ−ファージを、以下の固定化抗原とともにインキュベートした：ＦＧＦＲ１ｃ／αＫｌｏｔｈｏ複合体の複合体（ａＫＬ−Ｒ１）、ＦＧＦＲ１ｃ単独（Ｒ１）、ヒトαＫｌｏｔｈｏ（Ｈｕ ａＫＬ）およびマウスαＫｌｏｔｈｏ（Ｍｕ ａＫＬ）、または陰性対照としてのニュートラアビジン（ＮＡ）およびウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）。結合していないファージを洗い流した後、結合したファージを、ＨＲＰ結合抗ファージ抗体を用いて検出した。比色定量ＨＲＰ試薬が４５０ｎｍでの吸光度の読み取りを可能とする。（Ｃ）競合Ｆａｂ−ファージＥＬＩＳＡによる親和性の評価。ｓｂ１０６ Ｆａｂ−ファージを５０、５、．５、．０５、．００５および．０００５ｎＭの可溶性ヒトαＫｌｏｔｈｏとともにプレインキュベートした。報告される固定化ヒトαＫｌｏｔｈｏに対する結合シグナルは、２つのデータセットの平均である。固定化αＫｌｏｔｈｏへの結合の減少が可溶性Ｋｌｏｔｈｏに結合した画分を示し、従って、可溶性αＫｌｏｔｈｏ濃度が相互作用のＫ_Ｄとほぼ等しい場合には、シグナルに５０％の減少が生じる。 図２は、免疫ブロット、免疫組織化学および免疫細胞化学によるｓｂ１０６−Ｆａｂの特性を示す。（Ａ）野生型マウス（ＷＴ）、同型接合αＫｌｏｔｈｏ矮小型マウス（ｋｌ／ｋｌ）およびトランスジェニックαＫｌｏｔｈｏ過剰発現マウス（Ｔｇ−Ｋｌ）由来の腎臓溶解液の、モノクローナル抗体ＫＭ２０７６またはｓｂ１０６−Ｆａｂを用いた免疫ブロット。ＧＡＰＤＨ：グリセルアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼ（Ｂ）正常ラット腎臓（ＮＲＫ）細胞、ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）細胞、およびαＫｌｏｔｈｏの過剰発現のためのプラスミドでトランスフェクトされたＨＥＫ細胞由来の溶解液の、モノクローナル抗体ＫＭ２０７６またはｓｂ１０６−Ｆａｂを用いた免疫ブロット。（Ｃ）β−アクチンまたはｓｂ１０６−ＩｇＧｑをファロイジンでプロービングした新鮮なまたは固定したラット副甲状腺組織。（Ｄ）ベクター対照、またはαＫｌｏｔｈｏもしくはβＫｌｏｔｈｏの過剰発現のためのベクターでトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞のｓｂ１０６免疫染色。代表的な細胞を示す。ＤＡＰＩ核染色を「Ｎ」で示す。（スケールバー、１０μｍ）。Ｆａｂ ｓｂ１０６によるαＫｌｏｔｈｏ染色は、αＫｌｏｔｈｏでトランスフェクトされた細胞でのみ見られ、βＫｌｏｔｈｏでトランスフェクトされた細胞では見られなかった。 図３は、免疫沈降によるｓｂ１０６−Ｆａｂの特性を示す。（Ａ）ＨＥＫ２９３細胞を、エンプティーベクター、または種々の量（μｇ／ディッシュ）の、膜貫通全長αＫｌｏｔｈｏ（ＴＭ−αＫｌｏｔｈｏ）もしくはＣ末端ＦＬＡＧエピトープ（ｓ−αＫｌｏｔｈｏ−ＦＬＡＧ）を有するαＫｌｏｔｈｏの可溶性細胞外ドメインの発現のためのベクターでトランスフェクトした。細胞溶解液または細胞培養培地をｓｂ１０６−Ｆａｂまたは抗ＦＬＡＧ ＭＡｂのいずれかで免疫沈降（ＩＰ）させた。免疫複合体をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、モノクローナル抗αＫｌｏｔｈｏ抗体ＫＭ２０７６で免疫ブロット法（ＩＢ）を行った。（Ｂ）ラット、マウス、またはヒトからの尿をｓｂ１０６−Ｆａｂで免疫沈降させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ＫＭ２０７６で免疫ブロッティング（ＩＢ）を行った（左の３つのレーン）。サイズ選択した尿（カットオフ１００ｋＤａ）にそのままＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、免疫ブロット法を行った（右の３つのレーン）。（Ｃ）血清由来の内因性αＫｌｏｔｈｏの免疫沈降。野生型（ＷＴ）マウス、ｋｌｏｔｈｏ^−／−マウス、正常ヒト、および透析患者（ＥＳＲＤ）からの血清サンプルをｓｂ１０６−Ｆａｂとともに４℃で一晩インキュベートした。次に、抗ＦＬＡＧ抗体が結合されたセファロースビーズを加え、４℃で２時間インキュベートした。これらのビーズを洗浄し、結合したタンパク質を２×ＳＤＳサンプルローディングバッファーで溶出させた。免疫ブロット法をＫＭ２０７６で、次いで、可視化のために標準的二次抗ラットＩｇＧで行った。 図４は、組換えαＫｌｏｔｈｏを添加したヒト血清を用いたＩＰ−ＩＢアッセイのバリデーションを示す。（Ａ）既知量の可溶性ヒトαＫｌｏｔｈｏエクトドメインを、健康なボランティアまたは無腎の透析患者（ＣＫＤ患者）からの血清に加えた。ＩＰ−ＩＢアッセイを用い、血清においてαＫｌｏｔｈｏを測定した。（Ｂ）プロテアーゼ阻害剤（ＡＥＢＳＦ ０．１ｍＭ、アプロチニン０．３μＭ、ベスタチン（ベスタチン）１０μＭ、Ｅ−６４ １μＭ、ロイペプチン５０μＭ、ペプスタチンＡ １μＭ）を含めてまたはＩＰから除いて比較を行ったこと以外は、（Ａ）と同様の試験。（Ｃ）上記の４条件で、ＩＰ−ＩＢにより決定されたαＫｌｏｔｈｏレベル（ｙ軸）を添加した組換えαＫｌｏｔｈｏ（ｘ軸）に対してプロットした。無添加への外挿は、プロテアーゼ阻害剤で処理した血清における内因性のαＫｌｏｔｈｏのレベルを示す。プロテアーゼ阻害剤を含むまたは含まない健康な血清に関しては、結果が区別できなかったので１本の線のみが示されている。 図５は、慢性腎臓病を有するヒトにおける血清αＫｌｏｔｈｏのＩＰ−ＩＢアッセイを示す。（Ａ）検量線として組換えαＫｌｏｔｈｏを用いた従来の数値による病期分類を用い、正常健康なボランティアおよびＣＫＤ診療および透析装置からの患者のヒト血清においてＩＰ−ＩＢアッセイによりαＫｌｏｔｈｏを測定した。バーおよびエラーバーは平均および標準偏差を表す。データは、ＡＮＯＶＡ、次いで、ペアワイズ多重比較のためのスチューデント−ニューマン−コイルス検定により分析した。群間の統計的有意性に達するＰ値を括弧の上に示す。各群の対象の数を一番下に示す。（Ｂ）多様なヒト血清中のαＫｌｏｔｈｏの濃度を同じサンプルにおいてＩＰ−ＩＢ（ｘ軸）または市販のＥＬＩＳＡ（ｙ軸）のいずれかにより決定した。点線は識別ラインを示す。グレーの菱形は、１回以上の凍結−解凍サイクルを経た（保存されていた）血清を表し、黒い菱形は、１回のみ解凍した（新鮮な）血清を表す。（Ｃ）ヒト対象からの血清をＩＰ−ＩＢおよびＥＬＩＳＡによりアッセイした。同じ血清に示された回数の反復凍結−解凍を施した後にアッセイした。各サンプルの結果を、１回のみ解凍した同じサンプルからの読み取りに対するパーセンテージとして表した。黒い線は種々の対象の平均を表す。 図６は、ヒト尿のαＫｌｏｔｈｏレベルを示す。健康なボランティアまたは慢性腎臓病ステージ５（ＣＫＤ５）の患者の尿でαＫｌｏｔｈｏを測定した。（Ａ）定常状態条件下で各群４名の対象で、較正として組換えマウスαＫｌｏｔｈｏ（ｒＭＫｌ）を用いた代表的ＩＰ−ＩＢアッセイ。等量の尿クレアチニンをＩＰ−ＩＢに用いた。（Ｂ）ＩＰ−ＩＢアッセイおよび市販のＥＬＩＳＡからのデータの概要。バーおよびエラーバーは各群８名の対象からの平均および標準偏差を表す。健康なボランティアの平均を、参照を１００％として示した。 図７は、ｓｂ１０６−Ｆａｂを用いたＳＰＲセンサーグラムを示す。（Ａ）αＫｌｏｔｈｏ−ＦＧＦＲ１ｃ複合体に対するｓｂ１０６−Ｆａｂ（Ｆｓｂ１０６）の結合を示すＳＰＲセンサーグラム。マウスαＫｌｏｔｈｏエクトドメインおよびヒトＦＧＦＲ１ｃリガンド結合ドメインの二元複合体をバイオセンサーチップに固定化し、１００ｎＭのＦｓｂ１０６をそのチップ上に注入した。Ｆｓｂ１０６はαＫｌｏｔｈｏ−ＦＧＦＲ１ｃ複合体から極めてゆっくり解離することを注記しておく。（Ｂ）ｓｂ１０６−ＦａｂはＦＧＦ２３とαＫｌｏｔｈｏとＦＧＦＲ１ｃの間の三元複合体の形成を阻害しないことを示すＳＰＲセンサーグラムの重畳（オーバーレイ）。１０ｎＭのαＫｌｏｔｈｏ−ＦＧＦＲ１ｃ複合体単独および１０ｎＭのαＫｌｏｔｈｏ−ＦＧＦＲ１ｃ複合体と１００ｎＭのＦｓｂ１０６の混合物を、固定化ＦＧＦ２３を含有するバイオセンサーチップ上に注入した。 図８は、ｓｂ１０６のアミノ酸配列を示す。（Ａ）ｓｂ１０６の軽鎖配列（配列番号１１）。（Ｂ）重鎖配列−Ｆａｂ（配列番号１２）。（Ｃ）重鎖配列−ＩｇＧ１（配列番号１３）。（Ｄ）重鎖配列−ＩｇＧ４（配列番号１４）。下線のアミノ酸はＣＤＲ配列であり；太字のアミノ酸は可変ＣＤＲ配列（Ｌ３、Ｈ１、Ｈ２およびＨ３）であり；斜体のアミノ酸は定常ドメインである。

発明の具体的説明

Ｉ．定義
用語「αＫｌｏｔｈｏ」または「アルファーＫｌｏｔｈｏ」は、本明細書で使用する場合、用いられている文脈から決定可能なように、全長αＫｌｏｔｈｏタンパク質、エクトドメインフラグメントなどのそのフラグメントを含む、総て既知の天然αＫｌｏｔｈｏ分子、ならびに前記タンパク質およびフラグメントをコードする核酸を意味する。可溶型（タンパク質分解切断された）αＫｌｏｔｈｏ、ならびに血液もしくはその画分、尿または脳脊髄液などの体液中に存在する場合に「可溶性αＫｌｏｔｈｏ」と呼ばれ、約１３０ｋＤａの分子量を有する選択的スプライシング型αＫｌｏｔｈｏ、ならびに膜係留型のαＫｌｏｔｈｏ、限定されるものではないが、ヒトαＫｌｏｔｈｏ、または例えばマウスおよびラットαＫｌｏｔｈｏを含む齧歯類αＫｌｏｔｈｏなどの哺乳類αＫｌｏｔｈｏが含まれる。

用語「急性腎臓障害」または「ＡＫＩ」は、本明細書で使用する場合、剥離、および例えば、血中の尿素および他の化学物質の蓄積をもたらし得る、例えば傷害７日以内に生じる、腎機能の持続的低下を意味する。ＡＫＩは、疾患、骨格筋に対する挫傷などの損傷および投薬によって起こり得る。ＡＫＩは、リスク（糸球体濾過速度（ＧＦＲ）の２５％の低下）から、障害（ＧＦＲの５０％の低下）、不全（ＧＦＲの７５％の低下）、喪失（４週間を越える腎機能の完全な喪失）および末期腎臓病（３か月を越える腎機能の完全な喪失）まで異なるステージに分類される。ＡＫＩは無症候性の場合もある。

用語「早期急性腎障害」は、本明細書で使用する場合、血清クレアチニンの上昇の前を意味する。

用語「アミノ酸」は、天然アミノ酸ならびに改変アミノ酸の総てを含む。

用語「抗体」は、本明細書で使用する場合、ヒト抗体、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、一本鎖抗体およびその他のキメラ抗体を含むものとする。抗体は、組換え源由来であってもよく、および／またはトランスジェニック動物で生産されてもよい。１つの実施形態の抗体は、重鎖相補性決定領域１、重鎖相補性決定領域２および重鎖相補性決定領域３を含んでなる重鎖可変領域または重鎖、ならびに軽鎖相補性決定領域１、軽鎖相補性決定領域２および軽鎖相補性決定領域３を含んでなる軽鎖可変領域または軽鎖を含んでなる。

用語「結合フラグメント」は、本明細書で使用する場合、限定されるものではないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、ｄｓ−ｓｃＦｖ、二量体、ミニボディ、ダイアボディ、およびその多量体、多重特異性抗体フラグメントおよびドメイン抗体を含むものとする。抗体は従来の技術を用いてフラグメント化することができる。例えば、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは、抗体をペプシンで処理することにより生成することができる。得られたＦ（ａｂ’）２フラグメントを、ジスルフィド橋を還元するように処理するとＦａｂ’フラグメントを生成することができる。パパイン消化はＦａｂフラグメントの形成をもたらし得る。Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、ｄｓ−ｓｃＦｖ、二量体、ミニボディ、ダイアボディ、二重特異性抗体フラグメントおよびその他のフラグメントは組換え技術により合成することもできる。

「保存的アミノ酸置換」は、本明細書で使用する場合、タンパク質の所望の特性を損なうことなくあるアミノ酸残基が別のアミノ酸残基で置換されるものである。好適な保存的アミノ酸置換は、類似の疎水性、極性、およびＲ鎖長を有するアミノ酸で相互に置換することにより行うことができる。保存的アミノ酸置換の例としては、以下のものが挙げられる。

用語「対照」は、本明細書で使用する場合、腎臓病を有することまたはその疾患を有さないことが知られている対象または対象群からのサンプル、および／または前記対象群から決定された値を意味し、このような値以下のαＫｌｏｔｈｏレベルを有する対象はこの疾患を有する可能性がある。この疾患は例えば、慢性腎臓病（ＣＫＤ）または急性腎障害（ＡＫＩ）であり得る。この疾患はまた、例えば、ステージ１ ＣＫＤ、ステージ２ ＣＫＤ、ステージ３ ＣＫＤ、ステージ４ ＣＫＤまたはステージ５ ＣＫＤなどのＣＫＤのステージであり得、ステージが高いほど重篤である。加えて、対照は例えば、処置される対象のサンプルと同じタイプの組織に由来し得る。経過観察のために指示される方法では、対照はまた、異なる時点で採取された同じ対象由来の組織であり得、例えば、対照は、腎臓病の処置前に採取された同じ対象からのサンプルであり得る。

用語「慢性腎臓病」または「ＣＫＤ」は、腎機能に進行性の喪失を生じる疾患を意味する。ＣＤＫは、定義された糸球体濾過速度（ＧＦＲ）に従って決定される５段階のステージにより分類される。ステージ１ ＣＫＤは、≧９０ｍＬ／分／１．７３ｍ^２のＧＦＲにより定義され、ステージ２ ＣＤＫは６０〜８９ｍＬ／分／１．７３ｍ^２の間のＧＦＲにより定義され、ステージ３ ＣＫＤは３０〜５９ｍＬ／分／１．７３ｍ^２の間のＧＦＲにより定義され、ステージ４ ＣＫＤは１５〜２９ｍＬ／分／１．７３ｍ^２の間のＧＦＲにより定義され、ステージ５ ＣＫＤは１５ｍＬ／分／１．７３ｍ^２未満のＧＦＲにより定義される。正常な腎機能は、１００〜１３０ｍＬ／分／１．７３ｍ^２の間またはタンパク尿のない９０ｍＬ／分／１．７３ｍ^２により定義される。

用語「早期慢性腎臓病」は、初期段階のＣＫＤを意味し、ある実施形態では、ステージ１および／またはステージ２ ＣＫＤが早期ＣＫＤであることを意味する。多くの場合、ＦＧＦ２３、ＰＴＨ、およびリン酸塩の上昇はない。ステージ１ ＣＫＤの対象は、腎障害を示す症状をほとんど呈さない。ステージ２ ＣＫＤの対象は、腎障害を示す症状を必ずしも呈さないが、呈する場合もある。

用語「変性」は、本明細書で使用する場合、例えば、ＳＤＳサンプルローディングバッファー中で変性条件に曝された場合に、三次構造および／または二次構造（例えば、完全に折り畳まれていないタンパク質）を喪失したポリペプチドを意味する。

用語「検出可能なタグ」は、本明細書で使用する場合、組換えタンパク質に付加または導入され得るペプチド配列などの部分を意味する。

用語「エピトープ」は、本明細書で使用する場合、本明細書に開示される抗体または結合フラグメントによりされる抗原上の部位を意味する。

用語「重鎖相補性決定領域」は、本明細書で使用する場合、抗体分子の重鎖可変領域内の超可変領域を意味する。重鎖可変領域は、アミノ末端からカルボキシ末端へ、重鎖相補性決定領域１（ＣＤＲ−Ｈ１）、重鎖相補性決定領域２（ＣＤＲ−Ｈ２）および重鎖相補性決定領域３（ＣＤＲ−Ｈ３）と呼ばれる３つの相補性決定領域を有する。本明細書で使用されるナンバリングは、ＩＭＧＴナンバリングである。

用語「重鎖可変領域」は、本明細書で使用する場合、重鎖相補性決定領域１、重鎖相補性決定領域２および重鎖相補性決定領域３を含んでなる重鎖の可変ドメインを意味する。１以上のアミノ酸またはヌクレオチドは、例えばＣＤＲ配列の外側で、改変する、例えば保存的置換で置換することができる。

用語「宿主細胞」は、組換え細胞を作出するために組換えＤＮＡ発現ベクターが導入され得る細胞を意味する。宿主細胞は、大腸菌などの細菌細胞であり得るが、いずれのタイプの微生物、酵母、真菌、昆虫または哺乳類宿主細胞であってもよい。

当技術分野で認識される、用語「ＩＭＧＴナンバリング」または「ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓデータベースナンバリング」は、抗体、またはその抗原結合部分の重鎖および軽鎖可変領域の他のアミノ酸残基よりも変動の大きい（すなわち、超可変）アミノ酸残基をナンバリングするシステムを意味する（８５）。重鎖可変領域では、超可変領域は、ＣＤＲ−Ｈ１がアミノ酸３２〜３８番、ＣＤＲ−Ｈ２がアミノ酸５５〜６４番、ＣＤＲ−Ｈ３がアミノ酸１０７〜１１７番の範囲である。軽鎖可変領域では、超可変領域は、ＣＤＲ−Ｌ１がアミノ酸２４〜３９番、ＣＤＲ−Ｌ２がアミノ酸５６〜６９番、ＣＤＲ−Ｌ３がアミノ酸１０５〜１１７番の範囲である。

用語「単離された抗体またはその結合フラグメント」または「単離および精製された抗体またはその結合フラグメント」は、組換えＤＮＡ技術により生産される場合には細胞材料もしくは培養培地を、または化学的に合成される場合には化学前駆体もしくは他の化学物質、および／または例えば異なるエピトープに対する他の抗体を実質的に含まない抗体またはその結合フラグメントを意味する。

用語「Ｋ_Ｄ」は、例えば、特定の抗体−抗原相互作用の複合体の解離定数を意味する。

用語「軽鎖相補性決定領域」は、本明細書で使用する場合、抗体分子の軽鎖可変領域内の超可変領域を意味する。軽鎖可変領域は、アミノ末端からカルボキシ末端へ、軽鎖相補性決定領域１、軽鎖相補性決定領域２および軽鎖相補性決定領域３と呼ばれる３つの相補性決定領域を有する。

用語「軽鎖可変領域」は、本明細書で使用する場合、軽鎖相補性決定領域１、軽鎖相補性決定領域２および軽鎖相補性決定領域３を含んでなる軽鎖の可変ドメインを意味する。

用語「天然」または「天然の折り畳みの」は、本明細書で使用する場合、その天然コンフォメーション（例えば、３Ｄコンフォメーション）または例えば、受容体またはリガンドと結合し得る部分的に折り畳まれていないタンパク質を含め、官能性を付与するのに十分なコンフォメーションのタンパク質を意味する。例えば、折り畳まれたαＫｌｏｔｈｏタンパク質は、ＦＧＦＲ１ｃなどのＦＧＦ受容体と結合することができ、ＦＧＦＲ１ｃ：αＫｌｏｔｈｏ複合体を形成し得る。

用語「核酸配列」は、本明細書で使用する場合、天然の塩基、糖鎖および糖間（骨格）結合からなるヌクレオシドまたはヌクレオチド単量体の配列を意味する。この用語はまた、非天然単量体またはその部分を含んでなる改変または置換配列を含む。本出願の核酸配列は、デオキシリボ核酸配列（ＤＮＡ）またはリボ核酸配列（ＲＮＡ）であってよく、アデニン、グアニン、シトシン、チミジンおよびウラシルを含む天然塩基を含み得る。これらの配列はまた改変塩基も含み得る。このような改変塩基の例としては、アザおよびデアザアデニン、グアニン、シトシン、チミジンおよびウラシル；ならびにキサンチンおよびヒポキサンチンが挙げられる。核酸は二本鎖または一本鎖のいずれかであり得、センス鎖またはアンチセンス鎖に相当する。さらに、用語「核酸」は、相補的核酸配列ならびに最適化されたコドンまたは同義コドン等価物を含む。用語「単離された 核酸配列」は、本明細書で使用する場合、組換えＤＮＡ技術により生産される場合には細胞材料もしくは培養培地を、または化学的に合成される場合には化学前駆体もしくは他の化学物質を実質的に含まない核酸を意味する。単離された核酸はまた、その核酸が由来するその核酸に天然に隣接する配列（すなわち、その核酸の５’末端および３’末端に位置する配列）も実質的に含まない。

用語「ポリペプチド」は、本明細書で使用する場合、一鎖内にともに結合された多数のアミノ酸残基からなるポリマーを意味する。ポリペプチドはタンパク質の一部または全部を形成し得る。ポリペプチドは、長い、連続でかつ分岐していないペプチド鎖で構成され得る。ポリペプチドはまた、生物学的に機能的な様式で構成されてもよい。ポリペプチドは、それが定義された活性を付与する特定の３次元構造に折り畳まれていてもよい。用語「ポリペプチド」は、本明細書で使用する場合、用語「タンパク質」という用語と互換的に使用される。

用語「単離されたポリペプチド」は、本明細書で使用する場合、組換えＤＮＡ技術により生産される場合には細胞材料もしくは培養培地を、または化学的に合成される場合には化学前駆体もしくは他の化学物質を実質的に含まないことを意味する。

用語「参照薬剤」は、本明細書で使用する場合、アッセイで使用可能な、および例えば、慢性腎臓病および急性腎臓病などの腎臓病態を検出、スクリーニングまたは診断するために参照として使用される、例えば、標準的な量のαＫｌｏｔｈｏタンパク質であり得る薬剤を意味する。

用語「サンプル」は、本明細書で使用する場合、可溶性バイオマーカーなどのαＫｌｏｔｈｏに関してアッセイ可能な、対象由来の体液、細胞または組織サンプルを意味する。例えば、サンプルは、尿、血清、血漿または脳脊髄液を含んでなり得る。サンプルは例えば、１以上の処置後に得られる「処置後」サンプル、または例えば疾病進行を評価するためのベースラインとして使用される「ベースラインサンプル」であり得る。

用語「配列同一性」は、本明細書で使用する場合、２つのポリペプチド配列または２つの核酸配列間の配列同一性のパーセンテージを意味する。２つのアミノ酸配列または２つの核酸配列の同一性パーセントを決定するためには、それらの配列を最適な比較の目的でアラインする（例えば、第２のアミノ酸配列または核酸配列との最適なアラインメントのために第１のアミノ酸配列または核酸配列の配列中にギャップを導入することができる）。次に、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置のアミノ酸残基またはヌクレオチドを比較する。第１の配列中の位置が、第２の配列中の対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドで占められていれば、それらの分子はその位置で同一である。２配列間の同一性パーセントは、それらの配列が共通に持つ同一の位置の数の関数である（すなわち、同一性％＝同一の重なる位置の数／位置の総数×１００％）。一実施形態では、これら２配列は同じ長さである。２配列間の同一性パーセントの決定はまた、数学的アルゴリズムを用いて達成することもできる。２配列の比較のために使用される数学的アルゴリズムの好ましい限定されない例として、Karlin and Altschul, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:5873-5877のように改変されたKarlin and Altschul, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87:2264-2268のアルゴリズムがある。このようなアルゴリズムは、Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215:403のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラムに組み込まれている。本出願の核酸分子と相同なヌクレオチド配列を得るためには、ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、例えば、スコア＝１００、ワードレングス＝１２に関するＮＢＬＡＳＴヌクレオチドプログラムパラメーターセットを用いて行うことができる。本発明のタンパク質分子と相同なアミノ酸配列を得るためには、ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、例えば、スコア−５０、ワードレングス＝３に対するＸＢＬＡＳＴプログラムパラメーターセットを用いて行うことができる。比較目的でギャップアラインメントを得るためには、ギャップＢＬＡＳＴをAltschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402に記載の通りに使用することができる。あるいは、分子間の遠縁関係を検出する反復検索を行うためにＰＳＩ−ＢＬＡＳＴを使用することができる（同著者）。ＢＬＡＳＴ、ギャップＢＬＡＳＴ、およびＰＳＩ−ＢＬＡＳＴプログラムを使用する場合、各プログラムの（例えば、ＸＢＬＳＡＴおよびＮＢＬＡＳＴの）デフォルトパラメーターを使用することができる（例えば、ＮＣＢＩウェブサイト参照）。配列比較のために使用される数学的アルゴリズムの別の好ましい限定されない例としては、Myers and Miller, 1988, CABIOS 4:11-17のアルゴリズムがある。このようなアルゴリズムは、ＧＣＧ配列アラインメントソフトウエアパッケージの一部であるＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれている。アミノ酸配列を比較するためにＡＬＩＧＮプログラムを使用する場合、ＰＡＭ１２０ウエイトレシジュテーブル、ギャップレングスペナルティー１２、およびギャップペナルティー４が使用できる。２配列間の同一性パーセントは、ギャップを許容してまたは許容せずに、上記のものと同様の技術を用いて決定することができる。同一性パーセントを計算する際には、一般に、正確な一致のみを計数する。

「少なくとも中等度のストリンジェントのハイブリダイゼーション条件」とは、溶液中で２つの相補的核酸分子間の選択的ハイブリダイゼーションを促進する条件が選択されることを意味する。ハイブリダイゼーションは核酸配列分子の全部または一部に生じ得る。ハイブリダイズ部分は一般に、少なくとも１５（例えば、２０、２５、３０、４０または５０）ヌクレオチド長である。当業者は、核酸二重鎖、またはハイブリッドの安定性はＴｍにより決定されると認識し、これはナトリウム含有バッファーでは、ナトリウムイオン濃度と温度の関数である（Ｔｍ＝８１．５℃−１６．６（Ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］）＋０．４１（％（Ｇ＋Ｃ）−６００／ｌ）、または類似の式）。よって、ハイブリッドの安定性を決定する洗浄条件におけるパラメーターは、ナトリウムイオン濃度と温度である。既知の核酸分子と類似であるが同一ではない分子を同定するために、１％のミスマッチはＴｍに約１℃の低下をもたらすと仮定することができ、例えば、＞９５％の同一性を有する核酸分子が求められる場合には、最終洗浄温度は約５℃低くなる。これらの考慮に基づき、当業者は、適当なハイブリダイゼーション条件を容易に選択することができる。好ましい実施形態では、ストリンジェントハイブリダイゼーション条件が選択される。例として、以下の条件が、ストリンジェントハイブリダイゼーションを達成するために使用され得る：５×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）／５×デンハート液／１．０％ＳＤＳにて、上式に基づきＴｍ−５℃でハイブリダイゼーション、次いで、６０℃、０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳでの洗浄。中等度のストリンジェントのハイブリダイゼーション条件は、４２℃、３×ＳＳＣでの洗浄工程を含む。しかしながら、同等のストリンジェンシーが別のバッファー、塩および温度を用いて達成され得るものと理解される。ハイブリダイゼーション条件に関するさらなる指針は、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y., 2002, and in: Sambrook et al., Molecular Cloning: a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001に見出すことができる。

用語「対象」は、本明細書で使用する場合、動物界、好ましくは、哺乳類、より好ましくは、ヒトまたはラットもしくはマウスなどの齧歯類のいずれのメンバーも意味する。１つの実施形態では、対象は、慢性腎臓病（ＣＫＤ）または急性腎障害（ＡＫＩ）などの腎臓病を有することが疑われる。

用語「変異体」は、本明細書で使用する場合、配列（それぞれポリペプチドまたは核酸）における１以上のアミノ酸および／またはヌクレオチド改変、例えば、本明細書に開示される軽鎖および重鎖ＣＤＲと実質的に同じ機能を実質的に同様の様式で実行する本明細書に開示される軽鎖または重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）の１以上の改変を含む。例えば、本明細書に開示されるＣＤＲの変異体は、折り畳まれたαＫｌｏｔｈｏタンパク質上のエピトープと特異的に結合することができるという同じ機能を有する。１つの実施形態では、本明細書に開示されるＣＤＲの変異体は、限定されるものではないが、保存的アミノ酸置換を含む。ＣＤＲの変異体はまた、本明細書に開示されるＣＤＲ配列に対する付加および欠失も含む。加えて、変異体ヌクレオチド配列およびポリペプチド 配列は、その類似体および誘導体を含む。

用語「レベル」は、本明細書で使用する場合、サンプルにおいて検出または測定可能なαＫｌｏｔｈｏタンパク質の量（例えば、相対的量または濃度）を意味する。例えば、可溶性αＫｌｏｔｈｏレベルは、ｐＭなどの濃度または対照レベル（ここで、例えば、対照レベルは健康な対象における可溶性αＫｌｏｔｈｏのレベルである）の１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．２、２．４、２．６、２．８、３．０、３．２、３．４、３．６、３．８、４．０、４．２、４．４、４．６、４．８、５．０および／または１０倍などの相対的量であり得る。

本開示の範囲を理解する上で、用語「含んでなる」およびその派生語は、本発明で使用する場合、示されている特徴、要素、成分、基、整数、および／または工程の存在を明示するが、示されていないその他の特徴、要素、成分、基、整数および／または工程の存在を排除しないオープンエンドの用語であるものとする。以上のことはまた、用語「含む」、「有する」およびそれらの派生語などの類似の意味を有する語にも当てはまる。最後に、「実質的に」、「約」および「およそ」などの程度の用語は、本明細書で使用する場合、最終結果を有意に変化されないような修飾された用語の合理的変動量を意味する。これらの程度の用語は、この変動が、それが修飾する語の意味を否定しない限り、修飾された用語の少なくとも±５％の変動を含むものと解釈されるべきである。

本開示の範囲を理解する上で、用語「からなる」およびその派生語は、本明細書で使用する場合、示された特徴、要素、成分、基、整数、および／または工程の存在を明示し、また、示されていないその他の特徴、要素、成分、基、整数および／または工程の存在を排除するクローズエンドの用語であるものとする。

本明細書における終点による数値範囲の列挙は、その範囲内に包含される総ての数および分数を含む（例えば、１〜５は、１、１．５、２、２．７５、３、３．９０、４、および５を含む）。また、総ての数およびその分数は用語「約」により修飾されるものと仮定されると理解されるべきである。さらに、「１つの(a)」、「１つの(an)」、および「その(the)」は、文脈がそうではないことを明示しない限り、複数の指示物を含むと理解されるべきである。用語「約」は、参照される数値のプラスまたはマイナス０．１〜５０％、５〜５０％、または１０〜４０％、好ましくは１０〜２０％、より好ましくは１０％または１５％を意味する。

さらに、特定の節に記載されている定義および実施形態は、当業者により理解されているようにそれらが好適であることが記載されている本明細書の他の実施形態に当てはまり得るものとする。例えば、以下の節では、本発明の種々の態様が詳細に定義される。そのように定義される各態様は、そうではないことが明示されない限り、いずれの他の１または複数の態様と組み合わせてもよい。特に、好ましいまたは有利であることが示されているいずれの特徴も、好ましいまたは有利であることが示されている他のずれの１または複数の特徴と組み合わせてよい。

ＩＩ．抗体および／またはその結合フラグメント
本開示は、例えば、腎臓病を診断するためおよび／または予後診断を行うための抗体および／またはその結合フラグメントならびに製造方法および使用方法に関する。

よって、第１の態様は、競合的ＥＬＩＳＡアッセイにより測定した場合に約１０ｎＭ以下の解離定数（Ｋ_Ｄ）でαＫｌｏｔｈｏポリペプチドのエピトープと特異的に結合する抗体および／またはその結合フラグメントである。以下の実施例に示されるように、競合的ＥＬＩＳＡアッセイは、αＫｌｏｔｈｏに結合する抗αＫｌｏｔｈｏ ｓｂ１０６の用量反応曲線を示し、相互作用の親和性は１〜２ｎＭ前後であると見積もられた（図１Ｃ）。

１つの実施形態において、αＫｌｏｔｈｏポリペプチドは折り畳まれ、場合により天然のコンフォメーション（例えば、完全な折り畳み）である。本明細書に示されるように、抗αＫｌｏｔｈｏ ｓｂ１０６抗体は、天然の折り畳みのαＫｌｏｔｈｏなどの折り畳まれたαＫｌｏｔｈｏに対して特異的結合親和性を有する。例えば、実施例５に示されるように、ｓｂ１０６抗体は、天然条件下ではαＫｌｏｔｈｏに対して高い結合親和性を有するが、変性条件下ではαＫｌｏｔｈｏに対する結合親和性がはるかに弱いかまたは結合親和性を持たない。

よって、別の態様は、折り畳まれたαＫｌｏｔｈｏポリペプチドのエピトープと特異的に結合する抗体および／またはその結合フラグメントである。

さらに、抗αＫｌｏｔｈｏ ｓｂ１０６は、新たに調製されたまたは軽度固定細胞において高い結合親和性を有する。

よって、さらなる態様は、非固定または軽度固定サンプル中のαＫｌｏｔｈｏポリペプチドと特異的に結合する抗体および／またはその結合フラグメントである。

１つの実施形態では、非固定または軽度固定サンプル中のαＫｌｏｔｈｏポリペプチドは、折り畳まれたαＫｌｏｔｈｏである。

ｓｂ１０６のＣＤＲ領域は決定されており、図１Ａに示されている。さらに、相同な突然変異がＳＢ１０６ ＣＤＲの各アミノ酸位に導入されている（例えば、各位置に関して、元のアミノ酸が保持されているかまたは保存的アミノ酸変化が導入され、新たなＦａｂ−ファージライブラリーが構築されている）。選択は、抗原としてアルファーＫｌｏｔｈｏ−ＦＧＦＲ１ｃ複合体を用い、新たなライブラリーを用いて行われた。抗原に結合したクローンが単離され、配列が決定され、表２に示される。

よって、別の態様は、軽鎖可変領域と重鎖可変領域とを含んでなり、前記軽鎖可変領域が相補性決定領域ＣＤＲ−Ｌ３を含んでなり、かつ、前記重鎖可変領域が相補性決定領域ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３を含んでなり、前記ＣＤＲの１以上が以下に示されるアミノ酸配列：
ａ．ＣＤＲ−Ｌ３；Ｘ_１Ｘ_２Ｘ_３Ｘ_４ＰＸ_５（配列番号１）
（ここで、Ｘ_１はＡまたはＳであり、Ｘ_２はＧまたはＡであり、Ｘ_３はＹまたはＦであり、Ｘ_４はＳまたはＡであり、Ｘ_５はＩまたはＶである）；
ｂ．ＣＤＲ−Ｈ１： Ｘ_６Ｘ_７Ｘ_８Ｘ_９Ｘ_１０Ｘ_１１（配列番号２）
（ここで、Ｘ_６はＩまたはＶであり、Ｘ_７はＳまたはＡであり、Ｘ_８はＹ、ＦまたはＳであり、Ｘ_９はＹ、ＦまたはＳであり、Ｘ_１０はＳまたはＡであり、かつ、Ｘ_１１はＩまたはＶである）；
ｃ．ＣＤＲ−Ｈ２；Ｘ_１２Ｘ_１３Ｘ_１４Ｘ_１５Ｘ_１６Ｘ_１７Ｘ_１８Ｘ_１９Ｘ_２０Ｘ_２１（配列番号３）
（ここで、Ｘ_１２はＹ、ＦまたはＳであり、Ｘ２_１３はＩまたはＶであり、Ｘ_１４はＳまたはＡであり、Ｘ_１５はＰまたはＳであり、Ｘ_１６はＳまたはＡであり、Ｘ_１７はＹまたはＦであり、Ｘ_１８はＧまたはＡであり、Ｘ_１９はＹまたはＦであり、Ｘ_２０はＴまたはＳであり、かつ、Ｘ_２１はＳ、ＡまたはＹである）；および／または
ｄ．ＣＤＲ−Ｈ３：Ｘ_２２Ｘ_２３ＶＹＸ_２４Ｘ_２５Ｘ_２６Ｘ_２７ＷＸ_２８ＧＸ_２９ＧＭ（配列番号４）
（ここで、Ｘ_２２はＹまたはＦであり、Ｘ_２３はＹまたはＦであり、Ｘ_２４はＡまたはＳであり、Ｘ_２５はＳまたはＡであり、Ｘ_２６はＨまたはＮであり、Ｘ_２７はＧまたはＡであり、Ｘ_２８はＡまたはＳであり、かつ、Ｘ_２９はＹまたはＦである）
を含んでなる、抗体および／またはその結合フラグメントを含む。

表２に記載されるようなＣＤＲ配列を有する抗体フラグメントが単離された。１つの実施形態では、抗体またはその結合フラグメントは、表２に挙げられている配列番号１５〜１２０から選択されるＣＤＲ−Ｌ３、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３である。

１つの実施形態では、抗体は、配列番号１から選択される配列を有するＣＤＲ−Ｌ３、配列番号２から選択される配列を有するＣＤＲＨ１、配列番号３から選択される配列を有するＣＤＲ−Ｈ２および／または配列番号４から選択されるＣＤＲ−Ｈ３を含んでなり、約１０ｎＭ未満、約９ｎＭ未満、約８ｎＭ未満、約７ｎＭ未満、約６ｎＭ未満、約５ｎＭ未満、約４ｎＭ未満、約３ｎＭ未満、約２ｎＭ未満または約１ｎＭ未満の、αＫｌｏｔｈｏ特異的結合に関するＫ_Ｄを示す。

述べたように、Ｆａｂ 抗αＫｌｏｔｈｏ ｓｂ１０６ ＣＤＲＬ３およびＣＤＲＨ１、２、３の配列は本明細書（図１Ａ）の配列番号５〜８に示されている。クローンの結合特異性をさらに特徴付けるために、抗αＫｌｏｔｈｏ ｓｂ１０６抗体を、個々に精製した成分のパネルに対してアッセイした（図１Ｂ）。抗αＫｌｏｔｈｏ ｓｂ１０６は、αＫｌｏｔｈｏ単独に、またはＦＧＦＲ１ｃ／αＫｌｏｔｈｏ複合体に対して結合し、ヒトおよびマウスの両種に交差反応性がある。抗αＫｌｏｔｈｏ ｓｂ１０６はまた、ラット種にも交差反応性がある。

よって、別の実施形態では、相補性決定領域は、以下に示されるアミノ酸配列：
軽鎖可変領域：
ＣＤＲ−Ｌ３：ＡＧＹＳＰＩ（配列番号５）
重鎖可変領域：
ＣＤＲ−Ｈ１：ＩＳＹＹＳＩ（配列番号６）
ＣＤＲ−Ｈ２：ＹＩＳＰＳＹＧＹＴＳ（配列番号７）
ＣＤＲ−Ｈ３：ＹＹＶＹＡＳＨＧＷＡＧＹＧＭ（配列番号８）
を含んでなる。

さらなる実施形態では、軽鎖可変領域は、以下に示されるアミノ酸配列：
ＣＤＲ−Ｌ１：ＱＳＶＳＳＡ（配列番号９）
ＣＤＲ−Ｌ２：ＳＡＳ（配列番号１０）
を含んでなる相補性決定領域ＣＤＲ−Ｌ１および／またはＣＤＲ−Ｌ２をさらに含んでなる。

別の実施形態では、相補性決定領域は、配列番号５〜８、または１５〜１２０に示されるようなアミノ酸配列のうち１以上を含んでなる。１つの実施形態では、ＣＤＲ領域は、ＣＤＲ−Ｌ３、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３を含んでなる。

別の実施形態では、抗体および／またはその結合フラグメントは、以下に示されるアミノ酸配列：

を有する軽鎖を含んでなる。

別の実施形態では、抗体および／またはその結合フラグメントは、以下に示されるアミノ酸配列：

を有する重鎖可変領域を含んでなる。

抗体、場合により、ヒト抗体は、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＡまたはＩｇＥを含む免疫グロブリンの任意のクラス；ならびにＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４を含む任意のアイソタイプであり得る。

ヒト化またはキメラ抗体は、１または２以上のアイソタイプまたはクラスに由来する配列を含み得る。

さらに、本明細書に記載の抗体は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’ Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｄ、Ｆｖ、およびシングルドメイン抗体フラグメントなどの抗原結合フラグメントとして、または重鎖と軽鎖がスペーサーにより連結されている一本鎖抗体として作製され得る。また、ヒトまたはキメラ抗体は、単量体形態またはポリマー形態で存在してもよい。

キメラ抗体は、組換え技術を用いて作製することができる。実施例に記載のとおり、スクリーニングにより特定されたＦａｂを、抗体の軽鎖および重鎖の可変ドメインを哺乳類発現ベクターにサブクローニングし、例えば、実施例に示されるように、ヒト胎児腎臓細胞（ＨＥＫ２９３Ｔ）を用いてＩｇＧタンパク質を産生することにより、全長ＩｇＧへと再構成した。他所に記載するように、抗体を発現させるのに好適ないずれの細胞種も使用することができる。

さらに別の実施形態では、抗体および／またはその結合フラグメントは、場合により以下に示されるアイソタイプのアミノ酸配列：

を有する重鎖ＩｇＧ１またはＩｇＧ４アイソタイプを含んでなる。

さらに別の実施形態では、軽鎖相補性決定領域ＣＤＲ−Ｌ３および重鎖相補性決定領域ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３は、それぞれ配列番号５〜８と少なくとも７０％、少なくとも８０％または少なくとも９０％の配列同一性を有する。特異的ＣＤＲ配列は、配列番号５〜８と少なくとも７０％配列同一性を含む、表２に示されるように配列番号１５〜１２０で示される。

１つの実施形態では、抗体、その結合フラグメント、場合により、ＣＤＲ配列は、１以上の保存的置換を有する。

さらに別の実施形態では、抗体は、それぞれ配列番号１〜４に示される配列を有する軽鎖相補性決定領域ＣＤＲ−Ｌ３と重鎖相補性決定領域ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３を含んでなり、場合により、軽鎖可変領域、重鎖可変領域は、それぞれ配列番号１１および１２と少なくとも７０％、少なくとも８０％または少なくとも９０％の配列同一性を有し、または場合により、重鎖ＩｇＧ１またはＩｇＧ４に関しては、配列番号１３および１４と少なくとも７０％、少なくとも８０％または少なくとも９０％の配列同一性を有する。例えば、本明細書に記載の1以上の(one of more)ＣＤＲを最適化または選択された抗体、抗体鎖または可変領域にグラフトすることができる。

１つの実施形態では、抗体および／またはその結合フラグメントは、免疫グロブリン分子、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ジスルフィド結合Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ジスルフィド結合ｓｃＦｖ、一本鎖ドメイン抗体、ダイアボディ、ダイマー、ミニボディ、二重特異性抗体フラグメント、キメラ抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体およびポリクローナル抗体からなる群から選択される。

Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）_２、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、ｄｓ−ｓｃＦｖ、二量体、ミニボディ、ダイアボディ、二重特異性抗体フラグメントおよびその他のフラグメントは組換え技術により合成できる。

抗体はまた、従来の技術を用いてフラグメント化できる。例えば、Ｆ（ａｂ’）_２フラグメントは、抗体をペプシンで処理することにより作製できる。結果として得られるＦ（ａｂ’）_２フラグメントにジスルフィド橋を還元する処理を施すと、Ｆａｂ’フラグメントが得られる。パパイン消化はＦａｂフラグメントの形成をもたらし得る。

１つの実施形態では、抗体はヒト抗体である。

ヒト抗体は場合により、トランスジェニック動物から得られる（米国特許第６，１５０，５８４号；同第６，１１４，５９８号；および同第５，７７０，４２９号）。このアプローチでは、キメラまたは生殖細胞系突然変異マウスにおいて重鎖連結領域（Ｊ_Ｈ）遺伝子が欠失される。次に、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子アレイがこのような突然変異マウスに導入される。その後、得られたトランスジェニックマウスは、抗原刺激時にヒト抗体の完全なレパートリーを生成することができる。

１つの実施形態では、抗体は、配列番号１〜１０または配列番号１５〜１２０から選択される１以上のＣＤＲを含んでなるキメラ抗体である。

前述のように、図１Ｃは、例えば、抗αＫｌｏｔｈｏ ｓｂ１０６が、αＫｌｏｔｈｏ単独に、またはＦＧＦＲ／αＫｌｏｔｈｏ複合体，例えば、ＦＧＦＲ１ｃ／αＫｌｏｔｈｏ複合体に対して結合することを示す。抗αＫｌｏｔｈｏ ｓｂ１０６とαＫｌｏｔｈｏの間の相互作用の親和性は、競合的ＥＬＩＳＡアッセイにより測定した場合に、１桁のナノモルの範囲である（ＩＣ_５０＝１．７ｎＭ）。

１つの実施形態では、抗体および／またはその結合フラグメントは、約１０ｎＭ未満、約９ｎＭ未満、約８ｎＭ未満、約７ｎＭ未満、約６ｎＭ未満、約５ｎＭ未満、約４ｎＭ未満、約３ｎＭ未満、約２ｎＭ未満または約１ｎＭ未満の、αＫｌｏｔｈｏ特異的結合に対するＫ_Ｄを有する。

本明細書に開示される抗体および／またはその結合フラグメントは、数種に対して交差反応性がある。１つの実施形態では、結合したαＫｌｏｔｈｏポリペプチドは、哺乳類αＫｌｏｔｈｏポリペプチドであり、例えば、αＫｌｏｔｈｏポリペプチドは、ヒトαＫｌｏｔｈｏポリペプチド、またはマウスαＫｌｏｔｈｏポリペプチドまたはラットαＫｌｏｔｈｏポリペプチドなどの齧歯類αＫｌｏｔｈｏポリペプチドから選択される。

別の実施形態では、折り畳まれたαＫｌｏｔｈｏポリペプチドは、可溶性の折り畳まれたαＫｌｏｔｈｏポリペプチドである。例えば、抗体および／またはその結合フラグメントは、尿、血漿、および／または血清中に見出される可溶性の折り畳まれたαＫｌｏｔｈｏポリペプチドと結合する。

さらに別の実施形態では、抗体および／またはその結合フラグメントは、折り畳まれたαＫｌｏｔｈｏポリペプチドを含んでなる複合体と結合する。例えば、折り畳まれたαＫｌｏｔｈｏポリペプチドは、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）受容体、場合により、ＦＧＦＲ１ｃと複合体を形成する。

さらなる実施形態では、抗体および／または結合フラグメントは、例えば、診断薬を作製するためにタグで標識、および／またはタグに結合される。例えば、検出可能なタグは、Ｈｉｓタグ、ＨＡタグ、ＧＳＴタグ、ビオチンまたはＦＬＡＧタグなどの精製タグであり得る。

標識は、好ましくは、直接的または間接的に検出可能なシグナルを生成し得る。例えば、標識は、放射線不透過性であるか、または^３Ｈ、^１４Ｃ、^３２Ｐ、^３５Ｓ、^１２３Ｉ、^１２５Ｉ、^１３１Ｉなどの放射性同位元素；フルオレセインイソチオシアネート、ローダミンまたはルシフェリンなどの蛍光（蛍光団）または化学発光（発色団）化合物；アルカリ性ホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼまたはセイヨウワサビペルオキシダーゼなどの酵素；造影剤；または金属イオンであり得る。

本開示の別の態様は、抗体および／またはその結合フラグメントとαＫｌｏｔｈｏを含んでなり、場合によりＦＧＦＲ１ｃをさらに含んでなる抗体複合体に関する。

１つの実施形態では、抗体複合体はＦＧＦＲ１ｃを含んでなり、場合によりＦＧＦ２３を含んでなる。

１つの実施形態では、抗体および／またはその結合フラグメントは、単離された抗体および／またはその結合フラグメントである。

さらに別の態様は、抗体および／またはその一部、例えば、本明細書に記載のその結合フラグメントをコードする核酸である。１つの実施形態では、核酸は、軽鎖可変領域と重鎖可変領域とを含んでなり、前記軽鎖可変領域が相補性決定領域ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３を含んでなり、かつ、前記重鎖可変領域が相補性決定領域ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３を含んでなり、前記ＣＤＲのアミノ酸配列が以下に示される配列：
ＣＤＲ−Ｌ３；Ｘ_１Ｘ_２Ｘ_３Ｘ_４ＰＸ_５（配列番号１）
（ここで、Ｘ_１はＡまたはＳであり、Ｘ_２はＧまたはＡであり、Ｘ_３はＹまたはＦであり、Ｘ_４はＳまたはＡであり、Ｘ_５はＩまたはＶである）；
ＣＤＲ−Ｈ１： Ｘ_６Ｘ_７Ｘ_８Ｘ_９Ｘ_１０Ｘ_１１（配列番号２）
（ここで、Ｘ_６はＩまたはＶであり、Ｘ_７はＳまたはＡであり、Ｘ_８はＹ、ＦまたはＳであり、Ｘ_９はＹ、ＦまたはＳであり、Ｘ_１０はＳまたはＡであり、かつ、Ｘ_１１はＩまたはＶである）；
ＣＤＲ−Ｈ２；Ｘ_１２Ｘ_１３Ｘ_１４Ｘ_１５Ｘ_１６Ｘ_１７Ｘ_１８Ｘ_１９Ｘ_２０Ｘ_２１（配列番号３）
（ここで、Ｘ_１２はＹ、ＦまたはＳであり、Ｘ２_１３はＩまたはＶであり、Ｘ_１４はＳまたはＡであり、Ｘ_１５はＰまたはＳであり、Ｘ_１６はＳまたはＡであり、Ｘ_１７はＹまたはＦであり、Ｘ_１８はＧまたはＡであり、Ｘ_１９はＹまたはＦであり、Ｘ_２０はＴまたはＳであり、かつ、Ｘ_２１はＳ、ＡまたはＹである）；
ＣＤＲ−Ｈ３：Ｘ_２２Ｘ_２３ＶＹＸ_２４Ｘ_２５Ｘ_２６Ｘ_２７ＷＸ_２８ＧＸ_２９ＧＭ（配列番号４）
（ここで、Ｘ_２２はＹまたはＦであり、Ｘ_２３はＹまたはＦであり、Ｘ_２４はＡまたはＳであり、Ｘ_２５はＳまたはＡであり、Ｘ_２６はＨまたはＮであり、Ｘ_２７はＧまたはＡであり、Ｘ_２８はＡまたはＳであり、かつ、Ｘ_２９はＹまたはＦである）
のうち１以上を含んでなる、抗体および／またはその結合フラグメントをコードする。

重鎖または軽鎖をコードする、例えば、本明細書に記載のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２および／もしくはＣＤＲ−Ｈ３領域を含んでなる重鎖をコードする、または本明細書に記載のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２および／もしくはＣＤＲ−Ｌ３領域を含んでなる軽鎖をコードする核酸も提供される。

本開示はまた、本明細書に開示される抗体および／またはその結合フラグメントをコードする核酸配列の変異体も提供する。例えば、この変異体は、本明細書に開示される抗体および／またはその結合フラグメントをコードする核酸配列と少なくとも中等度のストリンジェントのハイブリダイゼーション条件下で、またはコドン縮重または最適化配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む。別の実施形態では、変異体核酸配列は配列番号１〜１２０をコードすると少なくとも７０％、最も好ましくは少なくとも８０％、いっそうより好ましくは少なくとも９０％、いっそう最も好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有する。

本明細書に記載の抗体は、本明細書に記載の特徴の１以上を含んでなる。

１つの実施形態では、核酸は単離された核酸である。

別の態様は、本明細書に開示される核酸を含んでなるベクターである。１つの実施形態では、ベクターは単離されたベクターである。

ベクターは、例えば、本明細書に記載のベクターを含む、抗体および／またはその結合フラグメントを生産するのに好適な任意のベクターであり得る。可能性のある発現ベクターとしては、限定されるものではないが、コスミド、プラスミド、または改変ウイルス（例えば、複製欠陥レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス）が挙げられる。

さらなる態様は、本明細書に開示される抗体および／もしくはその結合フラグメントまたは本明細書に開示されるベクターを生産する組換え細胞である。

組換え細胞は、ポリペプチドを生産するのに好適な、例えば、抗体および／またはその結合フラグメントを生産するのに好適ないずれの細胞を用いて作出することもできる。

好適な宿主細胞としては、多様な原核生物および真核生物宿主細胞が含まれる。例えば、本発明のタンパク質は、大腸菌などの細菌細胞、昆虫細胞（バキュロウイルスを使用）、酵母細胞または哺乳類細胞で発現されてよい。

より詳しくは、組換え抗体産生細胞を生産するのに好適な細菌宿主細胞としては、大腸菌、枯草菌(B. subtilis)、マウスチフス菌(Salmonella typhimurium)、シュードモナス属(Pseudomonas)、放線菌属(Streptomyces)、およびブドウ状球菌属(Staphylococcus)内の様々な種、ならびに当業者に周知の多くの他の細菌種が含まれる。好適な細菌発現ベクターは、好ましくは、宿主細胞で機能するプロモーター、１以上の選択可能な表現型マーカー、および細菌複製起点を含んでなる。代表的なプロモーターとしては、β−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）およびラクトースプロモーター系、ｔｒｐプロモーターおよびｔａｃプロモーターが含まれる。代表的な選択マーカーとしては、カナマイシンまたはアンピシリン耐性遺伝子などの種々の抗生物質耐性マーカーが含まれる。好適な発現ベクターとしては、限定されるものではないが、λ誘導体などのバクテリオファージ、またはｐＢＲ３２２、ｐＵＣプラスミドｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、およびｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８ａ、およびＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ Ｍ１３（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ラホヤ、カリフォルニア州）などのプラスミドが含まれる。

好適な酵母および真菌宿主細胞としては、限定されるものではないが、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、シゾサッカロミセス・ポムベ(Schizosaccharomyces pombe）、ピキア属(Pichia)またはクルイベロミセス属(Kluyveromyces)およびアスペルギルス属(Aspergillus)の種々の種が含まれる。酵母Ｓ．セレビシエでの発現のためのベクターの例としては、ｐＹｅｐＳｅｃ１、ｐＭＦａ、ｐＪＲＹ８８、およびｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、サンディエゴ、ＣＡ）が含まれる。酵母および真菌の形質転換のためのプロトコールは、当業者に周知である。

好適な哺乳類細胞としては、とりわけ、ＣＯＳ（例えば、ＡＴＣＣ Ｎｏ． ＣＲＬ １６５０または１６５１）、ＢＨＫ（例えば、ＡＴＣＣ Ｎｏ． ＣＲＬ ６２８１）、ＣＨＯ（ＡＴＣＣ Ｎｏ． ＣＣＬ ６１）、ＨｅＬａ（例えば、ＡＴＣＣ Ｎｏ． ＣＣＬ ２）、２９３（ＡＴＣＣ Ｎｏ． １５７３）、ＮＳ−１細胞およびこれらの株の任意の誘導体が含まれる。

１つの実施形態では、組換え抗体を生産するために使用される哺乳類細胞は、ＣＨＯ、ＨＥＫ２９３細胞またはＦｒｅｅｓｔｙｌｅ（商標）２９３−Ｆ細胞（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）から選択される。ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３−Ｆ細胞株は２９３細胞株に由来し、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）ＭＡＸ ２９３発現系、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）２９３発現系または他の発現系と併用可能である。

哺乳類細胞において発現を指示するための好適な発現ベクターには、一般に、プロモーター（例えば、ポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルスおよびシミアンウイルス４０などのウイルス材料に由来する）、ならびに他の転写および翻訳制御配列が含まれる。

１つの実施形態では、ベクターは、軽鎖またはＩｇＧ１重鎖の生産のために設計される。

好適な昆虫細胞としては、カイコガ属(Bombyx)またはスポドテラ属(Spodotera)種由来の細胞および細胞株が含まれる。培養昆虫細胞（ＳＦ９細胞）でのタンパク質の発現のために利用可能なバキュロウイルスベクターには、ｐＡｃ種およびｐＶＬ種が含まれる。

組換え発現ベクターはまた、組換えペプチドの発現または安定性の増強；組換えペプチドの溶解度の増強；および例えば、本明細書に記載のタグおよび標識を含むアフィニティー精製のリガンドとして働くことによる標的組換えペプチドの精製の補助をもたらす融合部分（すなわち、「融合タンパク質」）をコードする遺伝子も含み得る。さらに、タンパク質分解による切断部位は、融合タンパク質の精製の後に融合部分から組換えタンパク質の分離を可能とするために標的組換えタンパク質に付加され得る。典型的な融合発現ベクターとしては、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合タンパク質、またはタンパク質Ａをそれぞれ組換えタンパク質と融合するｐＧＥＸ（Ａｍｒａｄ Ｃｏｒｐ．、メルボルン、オーストラリア）、ｐＭＡＬ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、ベヴァリー、ＭＡ）およびｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、ピスカタウェイ、ＮＪ）が含まれる。

「作動可能に連結」とは、核酸がその核酸の発現を可能とする様式で調節配列に連結されることを意味するものとする。好適な調節配列は、細菌、真菌、ウイルス、哺乳類、または昆虫遺伝子を含む種々の起源に由来し得る。適当な調節配列の選択は、選択される宿主細胞によって異なり、当業者により容易に達成され得る。このような調節配列の例としては、転写プロモーターおよびエンハンサーまたはＲＮＡポリメラーゼ結合配列、リボゾーム結合配列（翻訳開始シグナルを含む）が含まれる。加えて、選択される宿主細胞および使用されるベクターに応じて、複製起点、付加的ＤＮＡ制限部位、エンハンサー、および転写誘導能を付与する配列などの他の配列を発現ベクターに組み込んでもよい。

１つの実施形態では、抗体またはその結合フラグメントの発現は、誘導プロモーターの制御下にある。誘導性の非融合発現ベクターの例としては、ｐＴｒｃ（２８）およびｐＥＴ １１ｄが挙げられる。

組換え発現ベクターはまた、本発明の組換え分子で形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞の選択を容易にするマーカー遺伝子も含み得る。選択マーカー遺伝子の例としては、特定の薬物に対する耐性を付与するＧ４１８およびハイグロマイシンなどのタンパク質、β−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、ホタルルシフェラーゼ、または免疫グロブリンもしくは免疫グロブリン、好ましくはＩｇＧのＦｃ部分などのその一部をコードする遺伝子がある。選択マーカー遺伝子の転写は、−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、またはホタルルシフェラーゼなどの選択マーカータンパク質の濃度の変化によって経過観察される。選択マーカー遺伝子がネオマイシン耐性などの抗生物質耐性を付与するタンパク質をコードする場合、形質転換細胞は、Ｇ４１８で選択することができる。選択マーカー遺伝子が組み込まれている細胞は生存し、他の細胞は死滅する。これにより、本発明の組換え発現ベクターの発現の可視化およびアッセイ、特に、発現および表現型に対する突然変異の影響の決定が可能となる。選択マーカーは対象核酸とは別のベクターに導入することができると認識される。他の選択マーカーとしては、対象核酸と共形質導入され得るＧＦＰなどの蛍光タンパク質が含まれる。

さらに別の態様は、抗体および／またはその結合フラグメント、本明細書に開示される核酸または本明細書に開示される組換え細胞を、場合により好適な希釈剤または担体と組み合わせて含んでなる組成物である。

本組成物は、凍結乾燥粉末または水性もしくは非水性溶液もしくは懸濁液であり得、酸化防止剤、緩衝剤、静菌剤および溶質をさらに含有してもよい。このような組成物中に存在し得る他の成分としては、例えば、水、界面活性剤（例えば、ツィーン）、アルコール、ポリオール、グリセリンおよび植物油が含まれる。

核酸に好適な希釈剤としては、限定されるものではないが、水、生理食塩水およびエタノールが含まれる。

抗体またはそのフラグメントおよび／または細胞を含め、ポリペプチドに好適な希釈剤としては、限定されるものではないが、生理食塩水、ｐＨ緩衝溶液およびグリセロール溶液またはポリペプチドおよび／もしくは細胞を凍結するために好適な他の溶液が含まれる。

本組成物は、生理学的バッファーに添加される分解防止剤、例えば、還元剤、疎水性添加剤、およびプロテアーゼ阻害剤をさらに含んでなり得る。

１つの実施形態では、本ポリペプチドは、溶液中に約０．５ｍｇ／ｍＬ以上の濃度で含まれる。

別の態様は、以下にさらに記載するように、本明細書に開示される抗体および／またはその結合フラグメントを含んでなるイムノアッセイである。

１つの実施形態では、イムノアッセイは、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）である。例えば、ＥＬＩＳＡは、サンドイッチＥＬＩＳＡである。１つの実施形態では、アッセイは、近接ライゲーションアッセイ（ＰＬＡ）である。１つの実施形態では、アッセイは、場合により免疫ブロット検出と組み合わせた免疫沈降である。１つの実施形態では、イムノアッセイは、質量分光光度アッセイと組み合わせられる。１つの実施形態では、イムノアッセイは、粒子に基づくフローサイトメトリーアッセイである。

実施例に記載されるように、抗αＫｌｏｔｈｏ ｓｂ１０６抗体は、αＫｌｏｔｈｏの細胞結合型および非結合型の両方を認識する。細胞結合試験では、抗αＫｌｏｔｈｏ ｓｂ１０６はαＫｌｏｔｈｏを発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞と結合するが、そのパラログβＫｌｏｔｈｏとは結合しない（図２Ａ）。抗αＫｌｏｔｈｏ ｓｂ１０６抗体はまた、ヒトおよびマウス両血清から非結合型のαＫｌｏｔｈｏを免疫沈降させることもできる（図２Ｂ）。この抗体は、付加的バンド無く、高い親和性および特異性でαＫｌｏｔｈｏを免疫沈降させることができる。

１つの実施形態では、イムノアッセイは、ハイスループット診断アッセイである。

ＩＩＩ．方法
本開示の別の態様は、折り畳まれたαＫｌｏｔｈｏポリペプチドのエピトープに対して特異的結合親和性を有する抗体および／またはその結合フラグメントを生産する方法である。

一実施形態では、抗体は、抗体ライブラリーから単離される。例えば、抗体ライブラリーは、抗体ファージディスプレーライブラリーであり得る。１つの実施形態では、抗体ファージディスプレーライブラリーは、ヒトＦａｂファージディスプレーライブラリーである。

以下に記載するように、ハイスループット、ファージディスプレー技術を、以下の実施例に記載される抗αＫｌｏｔｈｏ ｓｂ１０６抗体を作製するために使用をした。ファージディスプレー合成抗体ライブラリーを、確立された方法［６７，７５］を用い、抗原でスクリーニングした。抗体結合剤（ファージディスプレーまたは精製）をＥＬＩＳＡにより試験した。一次スクリーニングおよびその後のＥＬＩＳＡのための精製抗原は、マウスαＫｌｏｔｈｏ、ヒトＦＧＦＲ１ｃまたはヒトＦＧＦＲ１ｃ／マウスαＫｌｏｔｈｏ複合体を含み、作製したか、またはＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（ヒトαＫｌｏｔｈｏ）から購入した。実施例に記載されるように、Ｆａｂ’の抗体結合領域（抗体軽鎖および重鎖の相補性決定領域、またはＣＤＲ）の配列は、ユニークな結合ファージが保持しているＤＮＡから解読した。使用した合成抗体ライブラリーにおいて無作為化したＣＤＲ領域は、軽鎖３（ＣＤＲ−Ｌ３）ならびに重鎖１、２、および３（ＣＤＲ−Ｈ、−Ｈ２、−Ｈ３）であった。αＫｌｏｔｈｏと例えば少なくとも１０ｎＭまたは２ｎＭまたはそれ未満の結合親和性で結合する抗αＫｌｏｔｈｏ抗体は、記載のようにファージライブラリーを用いて単離できる。

１つの実施形態では、方法は、ＣＤＲ−Ｌ１および／またはＣＤＲ−Ｌ２を無作為化（ランダム化）することをさらに含んでなる。

以下の例に記載されるように、抗αＫｌｏｔｈｏ ｓｂ１０６抗体は、αＫｌｏｔｈｏの分泌型および膜係留型の両方に存在するαＫｌｏｔｈｏ細胞外領域を標的とすることにより作製した。抗αＫｌｏｔｈｏ ｓｂ１０６抗体は、マウスαＫｌｏｔｈｏとヒトＦＧＦＲ１ｃ受容体の精製複合体（ＦＧＦＲ１ｃ／αＫｌｏｔｈｏ）が合成抗体ファージディスプレーライブラリーに曝される選択から得られた。

１つの実施形態では、αＫｌｏｔｈｏポリペプチドを、αＫｌｏｔｈｏポリペプチドと特異的に結合する抗体を抗体ライブラリーから単離するために使用する。１つの実施形態では、ＦＧＦＲ１ｃと複合体を形成したαＫｌｏｔｈｏを、αＫｌｏｔｈｏポリペプチドと特異的に結合する抗体を抗体ライブラリーから単離するために使用する。

別の実施形態では、単離および精製された抗体および／またはその結合フラグメントは親和性成熟される。親和性成熟は、例えば実施例８に記載されるように、例えばＣＤＲ配列の変異体を含んでなるファージライブラリーを用い、プラスチックプレートに吸着させた抗原を用いて最初の選択に関して記載した通りに実行することができる。

当業者ならば、折り畳まれたαＫｌｏｔｈｏに対して特異的結合親和性を有する抗体および／またはその結合フラグメントを作製するためにはいくつかの方法が使用できることを認識するであろう。使用可能な方法は、ファージディスプレー法である。簡単に述べれば、抗体および／またはその結合フラグメントを単離および特性決定するために、二元αＫｌｏｔｈｏ−ＦＧＦ１Ｒｃ複合体を作製する（実施例１に記載の通り）。ヒトＦａｂファージディスプレーライブラリーからのファージを、数回のパンニングの後に選択する。ＥＬＩＳＡで決定されるように二元αＫｌｏｔｈｏ−ＦＧＦ１Ｒｃ複合体に対して特異的結合親和性を有するファージの配列を決定し、軽鎖または重鎖の作製のために設計されたベクターにクローニングする。重鎖は、例えば、ＩｇＧ、またはＩｇＧアイソタイプ、例えば、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４であり得る。次に、抗原結合フラグメントおよびＩｇＧポリペプチドを、例えば、Ａタンパク質アフィニティーカラムを用いてアフィニティー精製する。

別の実施形態では、本明細書に記載の抗体をコードする核酸を宿主細胞で発現させて、抗体および／またはその結合フラグメントを作製する。１つの実施形態では、この方法は、
ａ．本明細書に開示される抗体および／またはその結合フラグメントをコードする核酸を宿主細胞内で発現させること、
ｂ．前記抗体および／またはその結合フラグメントを生産するために前記宿主細胞を培養すること、および
ｃ．前記抗体および／またはその結合フラグメントを前記宿主細胞から単離および精製すること
を含んでなる。

いくつかの実施形態では、一本鎖抗体をコードする核酸が発現される。他の実施形態では、例えば、抗体軽鎖をコードする核酸および抗体重鎖をコードする核酸をコードする、複数の核酸が発現される。

好適な宿主細胞およびベクターは、上記されている。本明細書に記載の抗体をコードするベクターおよび核酸は、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウム共沈澱法、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、リポフェクチンおよび他のリポソームに基づくトランスフェクション剤、エレクトロポレーションまたはマイクロインジェクションなどの従来技術によって哺乳類細胞に導入され得る。

本明細書に記載の抗体をコードする核酸は、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクターおよびＤＮＡウイルスベクターなどの送達ビヒクルを用いて哺乳類細胞に直接導入され得る。

実施例に記載されるように、ｓｂ１０６抗体は、細胞モデルおよび動物モデルを以下のように試験した：齧歯類（マウスおよびラット）、ならびに正常者およびＣＫＤ患者からのヒト血漿および尿サンプルにおいて、抗体を、天然αＫｌｏｔｈｏを発現するかまたはαＫｌｏｔｈｏでトランスフェクトした培養細胞においてスクリーニングする。試験手順には、免疫ブロット、免疫沈降、免疫組織化学、免疫細胞化学、および蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を含んだ。

本明細書に開示される抗体および／または結合フラグメントの、可溶性αＫｌｏｔｈｏを沈降させる能力は、実施例６に記載されるような一連の免疫沈降−免疫ブロットアッセイを用いて決定することができる。

さらなる態様は、サンプルにおいてαＫｌｏｔｈｏポリペプチドを検出するためのアッセイであり、このアッセイは、
ａ）サンプルと本明細書に記載の抗体または結合フラグメントとを、抗体：αＫｌｏｔｈｏ複合体を形成する条件下で接触させること、および
ｂ）抗体：αＫｌｏｔｈｏ複合体を検出すること
を含んでなる。

１つの実施形態では、本アッセイは、折り畳まれたαＫｌｏｔｈｏを検出するためのものであり、本アッセイは、非変性または軽度変性条件下で実施される。

１つの実施形態では、前記複合体は例えば直接検出され、この場合、抗体は検出可能なタグまたは融合部分で標識される。１つの実施形態では、前記複合体は、抗体：αＫｌｏｔｈｏ複合体に特異的な二次抗体を用いて間接的に検出される。

１つの実施形態では、本アッセイは、免疫沈降、免疫ブロット、免疫組織化学または免疫細胞化学近接ライゲーションアッセイ（ＰＬＡ）、質量分析に基づく技術および蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）、近接ライゲーションアッセイ（ＰＬＡ）、ならびに質量分析に基づく技術である。本明細書に記載の抗体は、αＫｌｏｔｈｏポリペプチドを免疫沈降させるのに十分なものであり、ＫＭ２０７６および本発明者らが試験した他のもの［１３］などの抗体よりもはるかに良好である。

１つの特定の実施形態では、本方法のアッセイは、一連の免疫沈降−免疫ブロット（ＩＰ−ＩＢ）である。ＩＰ−ＩＢは、例えば以下の実施例に記載されるように実施することができる。

１つの実施形態では、本方法は、例えば可溶性αＫｌｏｔｈｏを検出するためのものであり、この場合、サンプルは体液である。

さらなる態様は、可溶性αＫｌｏｔｈｏを検出および／または測定する方法を含み、その方法は、
ａ）体液であるサンプルと本明細書に記載の抗体または結合フラグメントとを、抗体：可溶性αＫｌｏｔｈｏ複合体を形成する条件下で接触させること、および
ｂ）抗体：可溶性αＫｌｏｔｈｏ複合体を検出および／または測定すること
を含んでなる。

検出は、定性的方法、または例えば標準もしくは標準曲線と比較することによる定量的方法を用いて測定される方法を用いて実施することができる。

１つの実施形態では、体液サンプルは血液、または血清もしくは血漿などのその一部、あるいは尿である。

１つの実施形態では、アッセイは診断アッセイである。例えば、実施例７に記載されるように、本明細書に開示される抗体および／またはその結合フラグメントを含んでなるＩＰ−ＩＢアッセイが、その直線性を検定するため、およびそれが慢性腎臓病（ＣＫＤ）患者の血清αＫｌｏｔｈｏレベルを確かに検出できるかどうかを決定するために評価される。従って、健康なボランティア由来の血清とともにグレード１ ＣＫＤからグレード５ ＣＫＤまで異なる、所定量の組換えαＫｌｏｔｈｏを使用する。これらの結果は、血清レベルとＣＫＤステージの間の増加関係を示す。さらに、図６Ｂに示されるように、ｓｂ１０６を用いたＩＰ−ＩＢアッセイは、ＣＫＤ患者の尿αＫｌｏｔｈｏの重要な低下を示す。

さらに別の態様は、対象において慢性腎臓病（ＣＫＤ）および急性腎障害（ＡＫＩ）から選択される腎不全病態をスクリーニング、診断または検出する方法に関し、その方法は、
ａ．αＫｌｏｔｈｏ対象由来のサンプルにおけるレベルを場合により本明細書に開示される抗体またはアッセイを用いて測定すること、および
ｂ．サンプルにおけるαＫｌｏｔｈｏのレベルを対照と比較すること
を含んでなり、
対照と比較した前記サンプルにおけるαＫｌｏｔｈｏのレベルの低下が、前記対象がＣＫＤまたはＡＫＩから選択される腎臓病態を有することを示す。

１つの実施形態では、対照は、ＣＫＤまたはＡＫＩを持たない対象、例えば正常対照の群から導かれた対照値である。

１つの実施形態では、ＣＫＤは、早期ＣＫＤ、場合により、ステージ１、ステージ２、ステージ３、ステージ４、ステージ５またはステージ６ＣＫＤである。

本開示のさらなる態様は、αＫｌｏｔｈｏ欠乏のレベルを測定することによって評価されるＣＫＤ進行またはＡＫＩ進行またはそれがないこと（例えば、疾患の回復または増悪）、またはＣＫＤの腎外合併症の予後を診断する方法である。

よって、１つの態様は、ＡＫＩ後の回復の見込みの予後を診断する方法であり、その方法は、
ａ．対象由来のサンプルにおけるαＫｌｏｔｈｏのレベルを測定すること、および
ｂ．前記サンプルにおけるαＫｌｏｔｈｏのレベルを対照、例えば、回復または進行しなかった対象の群から導かれた対照値と比較すること
を含んでなり、
対照と比較した前記サンプルにおけるαＫｌｏｔｈｏのレベルの上昇が、前記対象がＡＫＩ後の回復の高い見込みを有することを示す。

１つの実施形態では、対照は、回復した対象の群から導かれた対照値であり、対照と比較した前記サンプルにおけるαＫｌｏｔｈｏのレベルの低下が、前記対象がＡＫＩ後の回復の低い見込みおよび／または疾患進行の高い見込みを有することを示す。

別の態様は、ＡＫＩ後の長期合併症の見込みの予後を診断する方法であり、その方法は、
ａ．対象由来のサンプルにおけるαＫｌｏｔｈｏのレベルを測定すること、および
ｂ．前記サンプルにおけるαＫｌｏｔｈｏのレベルを対照、例えば、長期合併症を有するまたは長期合併症の数が多い対象の群から導かれた対照値と比較すること
を含んでなり、
対照と比較した前記サンプルにおけるαＫｌｏｔｈｏのレベルの上昇が、前記対象が、ＡＫＩ後の長期合併症がより少ないというより高い見込みを有することを示す。

１つの実施形態では、対照は、長期合併症の無いまたは長期合併症が少ない対象の群から導かれた対照値であり、対照と比較した前記サンプルにおけるαＫｌｏｔｈｏのレベルの低下が、前記対象がＡＫＩ後に長期合併症を有するまたは長期合併症の数が多い高い見込みを有することを示す。

さらなる態様は、ＣＫＤの進行の見込みの予後を診断する方法であり、その方法は、
ａ．対象由来のサンプルにおけるαＫｌｏｔｈｏのレベルを測定すること、および
ｂ．前記サンプルにおけるαＫｌｏｔｈｏのレベルを対照と比較すること
を含んでなり、
対照（ここで、例えば、対照は、対象の群から導かれた対照値、例えば、回復しなかったまたは進行した対象の群から導かれた対照値である）と比較した前記サンプルにおけるαＫｌｏｔｈｏのレベルの上昇が、前記対象が、ＣＫＤから回復する高い見込みを有することを示す。

１つの実施形態では、対照は、回復した対象の群から導かれた対照値であり、対照と比較した前記サンプルにおけるαＫｌｏｔｈｏのレベルの低下は、前記対象がＣＫＤ後の回復の低い見込みおよび／または疾患進行の高い見込みを有することを示す。

さらに別の態様は、ＣＫＤにおける腎外合併症の予後を診断する方法であり、その方法は、
ａ．対象由来のサンプルにおけるαＫｌｏｔｈｏのレベルを測定すること、および
ｂ．前記サンプルにおけるαＫｌｏｔｈｏのレベルを対照と比較すること
を含んでなり、
対照と比較した前記サンプルにおけるαＫｌｏｔｈｏのレベルの上昇が、前記対象が、ＣＫＤに関連する腎外合併症がより少ないというより高い見込みを有することを示す。

１つの実施形態では、対照は、腎外合併症が無または腎外合併症が少ない対象の群から導かれた対照値であり、対照と比較した前記サンプルにおけるαＫｌｏｔｈｏのレベルの低下は、前記対象がＣＫＤ後の長期合併症を有するまたは腎外合併症の数が多い高い見込みを有することを示す。

さらなる態様は、ＣＫＤまたはＡＫＩなどの腎不全病態を有する対象を経過観察する方法であり、その方法は、
ａ．対象由来のサンプルにおけるαＫｌｏｔｈｏのレベルを測定すること、および
ｂ．前記サンプルにおけるαＫｌｏｔｈｏのレベルを従前の参照サンプルその他の対照と比較すること
を含んでなり、
従前の参照サンプルまたは他の対照と比較したサンプルにおけるαＫｌｏｔｈｏのレベルの上昇が、前記対象が改善中の腎臓病態を有することを示し、従前の参照サンプルまたは他の対照と比較したサンプルにおけるαＫｌｏｔｈｏのレベルの低下が、前記対象が増悪中の腎臓病態を有することを示す。

サンプルは、例えば対象が処置を受けた後に採取し、例えば処置前のサンプルと比較することができる。あるいは、患者は、処置または他の介入が必要かどうかを評価するために反復間隔の後に経過観察することができる。１つの実施形態では、試験を反復し、対象の進行を評価するためにプロットする。

１つの実施形態では、サンプルは、血液、または血漿もしくは血清などのその画分などの体液であり、本方法は、例えば、可溶性αＫｌｏｔｈｏを検出する。１つの実施形態では、体液は尿である。

別の実施形態では、サンプルは、新鮮な体液サンプルまたは組織サンプルなどの新鮮なサンプル（例えば、凍結されていないまたは１回凍結（例えば、サンプル入手時に１回の凍結）を含む）および反復凍結サンプル（例えば、凍結および解凍ならびに凍結体液サンプルまたは反復凍結組織サンプル）から選択される。１つの実施形態では、サンプルは、固定が限定された変性および／または折り畳みの解除を誘導する軽度固定サンプルなどの固定サンプルである。

１つの実施形態では、αＫｌｏｔｈｏのレベルは、本明細書に記載の抗体または結合フラグメントを用いて測定される。

本明細書に開示される腎臓病を診断、検出もしくは経過観察する、腎臓病合併症の予後を診断する方法は、腎臓病の従来の診断技術に加えて、またはそれと組み合わせて使用することができる。

ＩＶ．キット
さらなる態様は、無菌バイアルなどのバイアルまたは他の外被内に含まれる、本明細書に開示されるｉ）抗体および／またはその結合フラグメント、ｉｉ）核酸、ｉｉｉ）組成物またはｉｖ）組換え細胞ならびに場合により参照薬剤および／またはその使用のための説明書を含んでなるキットに関する。

１つの実施形態では、キットは診断キットであり、説明書は本明細書に記載の方法を対象とする。

上記の開示は一般に本出願を記載する。より完全な理解は、以下の具体例を参照することにより得られる。これらの例は単に例示のために記載され、本出願の範囲を限定するものではない。状況が示唆し得る、または便宜とし得る場合には、形態の変更および等価物との置換が企図される。本明細書で特定の用語を使用してきたが、このような用語は説明のためのものであり、限定を目的とするものではない。

以下の限定されない例は、本開示の例示である。

実施例１
合成抗体ライブラリーをスクリーニングし、ヒトおよび齧歯類αＫｌｏｔｈｏに対して高い親和性を有する抗原結合フラグメント（Ｆａｂ）を作製した。この新規な抗体ｓｂ１０６を、組換えタンパク質、培養細胞、ならびにヒトおよび齧歯類由来の体液および組織を用いて特性評価した。ヒトおよび齧歯類の血清および尿中のαＫｌｏｔｈｏレベルは正確に定量することができ、血清および尿の両方で、早期ヒトＣＫＤではαＫｌｏｔｈｏが劇的に低下していることが実証される。ｓｂ１０６抗体は、Ｋｌｏｔｈｏのα型に特異的であり、現在市販されているαＫｌｏｔｈｏ検出試薬に比べて、クリーンかつ特異的な様式で患者血清サンプルからαＫｌｏｔｈｏを上手く取り出すことが最初に知られたものである。細胞において、それはαＫｌｏｔｈｏを免疫沈降させ、それを免疫細胞化学により標識することができる。動物において、この抗体は血漿からαＫｌｏｔｈｏを免疫沈降させるのに十分である。体液から少量のαＫｌｏｔｈｏを検出するｓｂ１０６抗体の能力は、それをαＫｌｏｔｈｏのレベルが異常な疾患の診断に有価な試薬とする。さらに、ｓｂ１０６抗体は、いずれかのＦＧＦ２３介在シグナル伝達経路を含む生理学的および病理学的状態の研究で、研究試薬として有価である。この抗体は、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、近接ライゲーションアッセイ（ＰＬＡ）、および質量分析に基づく技術などの様々な技術を用いる、血清などのヒトおよび齧歯類サンプル中の可溶性αＫｌｏｔｈｏに特異的なアッセイで使用することができる。

実施例２
二元αＫｌｏｔｈｏ−ＦＧＦＲ１ｃ複合体の作製
ヒトＦＧＦＲ１ｃのリガンド結合ドメイン（Ｄ１４２〜Ｒ３６５）は大腸菌(E.coli)で発現させ、封入体からイン・ビトロで再折り畳みし、公開されている方法［７２，７３］によって精製した。マウスαＫｌｏｔｈｏの細胞外ドメイン（Ａ３５〜Ｋ９８２）は、Ｃ末端ＦＬＡＧタグを用いてＨＥＫ２９３細胞で発現させ、αＫｌｏｔｈｏエクトドメインとＦＧＦＲ１ｃリガンド結合ドメインの二元複合体を記載のように［９］作製した。

ｓｂ１０６の単離および特性評価
Ｓｂ１０６を合成ヒトＦａｂファージディスプレーライブラリー（ライブラリーＦ）から単離した［７４］。結合選択、ファージＥＬＩＳＡおよびＦａｂタンパク質の精製は記載のように行った［６７，７５，７６］。簡単に述べれば、ライブラリーＦ由来のファージを、キャプチャーターゲットとしての９６ウェルＭａｘｉｓｏｒｐ Ｉｍｍｕｎｏｐｌａｔｅ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ネピアン、ＯＮ、カナダ）上での、αＫｌｏｔｈｏ細胞外ドメインとＦＧＦＲ１ｃリガンド−結合ドメインの二元複合体を用いた複数回のパンニングにより循環させた。５回の選択後、９６ウェル形式で増殖させた個々のクローンからファージを生産し、特異的結合クローンを検出するためにファージＥＬＩＳＡを行った。結合を示したクローンにシーケンシングを行った。競合的結合ＥＬＩＳＡは、ｓｂ１０６−ファージを、ヒトαＫｌｏｔｈｏでコーティングしたＥＬＩＳＡプレートに結合させる前に、可溶性ヒトαＫｌｏｔｈｏの連続希釈液とともにプレインキュベートすることによって（５０〜０．０００５ｎＭ×１時間）行った。ｓｂ１０６の重鎖可変ドメインおよび軽鎖ドメインをコードする遺伝子を、それぞれ軽鎖またはＩｇＧ１重鎖の生産向けに設計したベクターにクローニングし、ｓｂ１０６−ＩｇＧを２９３Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ、サンディエゴ、ＣＡ． ＵＳＡ）から発現させた。ＦａｂおよびＩｇＧタンパク質をＡタンパク質アフィニティーカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ミシソーガ、ＯＮ、カナダ）でアフィニティー精製した。

タンパク質の精製
ＦＧＦＲ１ｃリガンド結合ドメインとマウスαＫｌｏｔｈｏエクトドメインの二元複合体（αＫｌｏｔｈｏ−ＦＧＦＲ１ｃ複合体と呼称）は、公開されているプロトコール［９］によって作製した。Ｎ末端にヘキサヒスチジンタグを有する成熟型のヒトＦＧＦ２３（Ｙ２５〜Ｉ２５１）を大腸菌で発現させ、公開されているプロトコール［７３，７４，７７］により精製した。

ＳＰＲ分光法によるαＫｌｏｔｈｏ−ＦＧＦＲ１ｃ複合体に結合するＦａｂの分析
リアルタイムタンパク質−タンパク質相互作用は、２５℃、ＨＢＳ−ＥＰバッファー（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．００５％（ｖ／ｖ）ポリソルベート２０）中で、２０００表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分光計（Ｂｉａｃｏｒｅ ＡＢ／ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて測定した。タンパク質をそれらの遊離アミノ基を介して研究グレードのＣＭ５バイオセンサーチップ（Ｂｉａｃｏｒｅ ＡＢ／ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）のカルボキシメチル（ＣＭ）デキストランに共有結合させた。タンパク質を５０μｌ／分の流速でバイオセンサーチップに注入し、各タンパク質注入（１８０秒）の終了時にＨＢＳ−ＥＰ バッファー（５０μｌ／分）をチップに流し、１８０秒間、解離をモニタリングした。タンパク質注入間には、１０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．５中、または１０ｍＭリン酸ナトリウム／カリウム、ｐＨ６．５中、２．０Ｍ ＮａＣｌを注入してチップ表面を再生した。データはＢｉａＥｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウエアバージョン４．１（Ｂｉａｃｏｒｅ ＡＢ／ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で処理した。各タンパク質注入に関して、対照フローチャネルに対して記録された非特異的ＳＰＲ応答をサンプルフローチャネルに対して記録された応答から差し引いた。

ＥＬＩＳＡにより選択されたＦａｂがαＫｌｏｔｈｏ−ＦＧＦＲ１ｃ複合体と結合するかどうかを調べるために、二元受容体複合体をＣＭ５チップに固定化した（フローチャネル約４２ｆｍｏｌ／ｍｍ^２）。非特異的結合に関する対照とするために、αＫｌｏｔｈｏのこれら２つの細胞外グリコシダーゼ様ドメインのそれぞれに構造的に関連するウシβ−グルクロニダーゼ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）をチップの対照フローチャネルに結合させた（約４５ｆｍｏｌ／ｍｍフローチャネル）。１００ｎＭの各Ｆａｂをチップに注入した。対照として、固定化されたαＫｌｏｔｈｏ−ＦＧＦＲ１ｃ複合体に対するＦＧＦ２３の結合を調べた。

ＦａｂがＦＧＦ２３とおよび／またはαＫｌｏｔｈｏ−ＦＧＦＲ１ｃ複合体に対する結合と競合し得るかどうかを試験するために、ＦＧＦ２３をＣＭ５チップに固定化した（約１６ｆｍｏｌ／ｍｍチップフローチャネル）。構造上ＦＧＦに類似するがＦＧＦＲ結合の無いＦＨＦ１Ｂ［７７］を非特異的結合に関する対象として使用した（約１５ｆｍｏｌ／ｍｍ対照フローチャネル）。１０ｎＭのαＫｌｏｔｈｏ−ＦＧＦＲ１ｃ複合体と混合した１００ｎＭのＦａｂ（ＨＢＳ−ＥＰバッファー）をチップに注入した。対照のため、結合競合は溶液中の競合因子ＦＧＦ２３を用いて行った。

細胞培養、動物およびヒト試験
細胞株： 天然αＫｌｏｔｈｏ発現を有する正常ラット腎臓（ＮＲＫ）細胞（ＡＴＣＣ、マナサス、ＶＡ、ＵＳＡ）、およびベクター単独、全長膜貫通マウスαＫｌｏｔｈｏ、Ｃ末端ＦＬＡＧタグを有するマウスαＫｌｏｔｈｏの細胞外ドメイン、もしくは全長マウスβＫｌｏｔｈｏでトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞［７８］。細胞を３７℃、９５％空気、５％ＣＯ_２雰囲気で培養し、１０％ウシ胎仔血清、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）、およびストレプトマイシン（１００ｍｇ／ｍｌ）を添加した高グルコース（４５０ｍｇ／ｄｌ）ＤＭＥＭで継代培養した。

動物試験は、テキサス大学サウスウェスタン医学センター所内動物実験委員会により承認されたものである。動物は総て、動物試験センターで飼育し、実験は完全に承認された実験質で実施した。用いた種には、Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（Ｈａｒｌａｎ． インディアナポリス、ＩＮ）、Ｋｌｏｔｈｏトランスジェニック過剰発現種（Ｔｇ−Ｋｌｏｔｈｏ；ＥＦｍＫＬ４６系統）［７９］、同型接合型αＫｌｏｔｈｏ低次形態 マウス（Ｋｌ／Ｋｌ）［８０］、およびそれらの野生型同腹子（１２９ｓｖバックグラウンド）を含んだ。

臨床歴および慣例の検査データは電子カルテから取得した。前肘静脈穿刺からの血液サンプルを回転させ、血清を−８０℃で凍結させた。新鮮な尿を４，０００ｇで回転させ、上清を−８０℃で凍結させた。

免疫細胞化学および免疫組織化学
ＨＥＫ２９３細胞をベクターまたは示されたαＫｌｏｔｈｏプラスミドでトランスフェクトし、ポリリシンで前処理した１２ウェルカバーガラスに播種し（１．８×１０^５細胞／ｍｌ）、一晩増殖させた。これらの細胞を洗浄し（４℃ ＰＢＳ×３）、３％パラホルムアルデヒドで固定し（４℃×１０分）、洗浄し（氷冷ＰＢＳ×３）、１％ＢＳＡでブロッキングし（ＰＢＳ ４４℃×１０分）、ｓｂ１０６−Ｆａｂ（１％ＢＳＡ、ＰＢＳ中、５ｕｇ／ｍｌ）とともにインキュベートし、洗浄し（ＰＢＳ ４℃×５）、抗ＦＬＡＧ−Ａｌｅｘａ４８８（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ；１％ＢＳＡを含有するＰＢＳ中に１：４００希釈；１時間；２０℃）とともにインキュベートし、洗浄し（ＰＢＳ；４℃×４）、次いで、１滴のアンチフェードをＤＡＰＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とともに含むスライドガラス上で反転させ、暗所、室温で乾燥させた。２４時間後、これらのスライドを−２０℃で保存した。画像はＷａｖｅＦＸスピニングディスク共焦顕微鏡で得た。

副甲状腺および甲状腺（気管と総称）は成体Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラット由来のものであった。非固定新鮮副甲状腺の場合、組織をＯＣＴ媒体に包埋し、即、イソペンタン予冷し、液体Ｎ_２中で凍結させた。固定副甲状腺サンプルの場合、組織をＰＢＳ ｐＨ７．４中、４％パラホルムアルデヒドに４℃で一晩浸漬し、ＰＢＳで洗浄し、ＯＣＴ媒体に包埋し、イソペンタン予冷して、液体Ｎ_２中で凍結させた。４μｍ厚のクリオスタット切片を作製し、ＰＢＳ中で洗浄し（１５分）、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００中で透過処理を施した（１０分）。標識については、切片をブロッキングし（ＰＢＳ、１．５％ＢＳＡ、１０％ヤギ血清；４０分）、一次抗体ｓｂ１０６（ブロッキング溶液中２１μｇ／ｍｌ；４℃で一晩）とともにインキュベートした。洗浄（ＰＢＳ）後、切片をＡｌｅｘａ ５４６ヤギ抗ヒトＩｇＧ（１：８００希釈、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とともに室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳでさらに洗浄した後、切片をＰＢＳ中、４％パラホルムアルデヒドで固定し、ＰＢＳで洗浄し、Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ５１０顕微鏡に取り付け、観察した。

実施例３：αＫｌｏｔｈｏアッセイおよび詳細な方法
ＥＬＩＳＡは、製造者（Ｉｍｍｕｎｏ−Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、日本）により説明されている通りに実施した。ＩＰ−ＩＢアッセイでは、一般に、５０μｌの血清または尿をＫＲＨバッファー［２５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．４）、１２０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、１．２ｍＭ ＭｇＳＯ４、１．３ｍＭ ＣａＣｌ２、１．３ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４］で希釈して最終容量０．５ｍｌとし、低結合性のシリコン処理済みチューブ中、４℃で一晩、２μｇのｓｂ１０６−Ｆａｂとともにインキュベートした。ＫＲＨバッファーで３回前洗浄した抗ＦＬＡＧ抗体（５０％ｖ／ｖ）を結合させたセファロースビーズ（５０μＬ）を加え、インキュベートした（４℃×２時間）、洗浄し（チューブ当たりＫＲＨ−５００μｌ ３回；２２℃）。免疫複合体を２×ＳＤＳサンプルローディングバッファー（５０μｌ；１００℃×３分；４℃×３分；回転）で溶出させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分画し、ニトロセルロース膜に転写し、抗ＫＬ１抗体（ＫＭ２０７６、１：４０００または３．１ｍｇ／ｍＬ、１：１００００希釈）および希釈剤（Ｄａｋｏ＃Ｓ３０２２、カーピンテリア、ＣＡ、ＵＳＡ）で一晩（４℃、ロッカー）ブロットした。膜を洗浄し（３回、０．１％Ｔｗｅｅｎを含むＴｒｉｓ緩衝生理食塩水；ＴＢＳ−Ｔ）、抗ラットＩｇＧ２Ａ（ＬＳＢｉｏ ｃａｔ＃ＬＳ−Ｃ５９０５１、５％ミルク／２％ヤギ血清／ＴＢＳ−Ｔ中１：２００００×１時間）に曝し、洗浄した（３回、ＴＢＳ−Ｔ）。化学発光については、膜をＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｆｅｍｔｏ Ｍａｘｉｍｕｍ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ基質（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ロックフォード、ＩＬ、ＵＳＡ）で覆い、３０〜９０秒間露光した。１３０ｋＤバンドをスキャンし、Ａｄｏｂｅ Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ ＣＳ４を用い、既知量のＫｌｏｔｈｏの内部対照サンプルと密度を比較した。

実施例４：抗αＫｌｏｔｈｏ合成Ｆａｂの同定
組換えαＫｌｏｔｈｏエクトドメインと線維芽細胞増殖因子受容体（ＦＧＦＲ）１ｃのリガンド結合ドメインとの複合体に対するファージディスプレー合成Ｆａｂライブラリーの複数回のバイオパンニングの後に、いくつかの結合ファージが同定された。クローンｓｂ１０６（図１Ａ）がさらなる特性評価のために選択された。ファージＥＬＩＳＡ（図１Ｂ）で、ヒトおよびマウスの両αＫｌｏｔｈｏと結合したｓｂ１０６−ファージは交差種反応性を示し、αＫｌｏｔｈｏ単独またはＦＧＦＲ１ｃとの複合体のいずれかと結合したｓｂ１０６−ファージは、そのエピトープが共受容体複合体形成により隠されていないことを示唆する。ｓｂ１０６−ファージは、ＦＧＦＲ１ｃ単独、ニュートラアビジン（ＮＡＶ）またはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）とは結合しなかった。ｓｂ１０６は、ヒトαＫｌｏｔｈｏと１桁のナノモル範囲（ＩＣ５０＝１．７ｎＭ、図１Ｃ）の親和性で結合する。ｓｂ１０６−Ｆａｂはまた、バイオセンサーチップ上に固定化されている二元αＫｌｏｔｈｏ−ＦＧＦＲ１ｃ複合体とも高い親和性で結合し（図７Ａ）、 ＦＧＦ２３とαＫｌｏｔｈｏとＦＧＦＲ１ｃの間の三元複合体の形成を妨げない（図７Ｂ）。

実施例５：抗αＫｌｏｔｈｏＦａｂ ｓｂ１０６の特性評価
ｓｂ１０６のユニークなＣＤＲ配列を用い（図１Ａ）、Ｆａｂおよび全長ＩｇＧタンパク質の両方を生産した（例えば、Ｆａｂは細菌細胞で、ＩｇＧタンパク質は２９３Ｆ細胞で生産した）。ｓｂ１０６は、天然条件下でαＫｌｏｔｈｏに対して高い反応性を有した。変性条件下でのマウス、ラット、およびヒト腎臓組織に対する免疫ブロットシグナルは弱かったが、αＫｌｏｔｈｏを過剰発現するトランスジェニックマウス［７９］からのサンプルでは、ｓｂ１０６−ＦａｂはαＫｌｏｔｈｏの全長細胞外ドメインに相当するバンドを検出した（図２Ａ）。培養細胞では、ｓｂ１０６−Ｆａｂは、天然αＫｌｏｔｈｏを発現するＮＲＫ細胞からの溶解液を用いた変性条件下での免疫ブロットではαＫｌｏｔｈｏを検出することができなかったが、αＫｌｏｔｈｏでトランスフェクトされた細胞ＨＥＫ２９３からの細胞溶解液では過剰発現した抗原を検出することができた（図２Ｂ）。新たに凍結された非固定ラット副甲状腺組織（およびαＫｌｏｔｈｏを発現することが知られる他の組織）を用いた免疫組織化学では、ｓｂ１０６−ＩｇＧはαＫｌｏｔｈｏを検出したが、同じ組織が固定した場合には陰性であり（図２Ｃ）、これはｓｂ１０６が天然の折り畳みのＦＧＦＲ１−αＫｌｏｔｈｏ複合体と結合することを示唆する（図１Ｂ）。新たに固定した細胞を用いた免疫細胞化学染色では、αＫｌｏｔｈｏを異種的に過剰発現するＨＥＫ２９３細胞では鮮明な染色が見られたが、βＫｌｏｔｈｏを過剰発現する細胞ではそうではなかった（図２Ｄ）。これらの細胞を、ポリリシンで処理した１２ウェルカバーガラスに１．８×１０^５／ｍｌで播種し、一晩増殖させた。細胞を氷冷ＰＢＳで３回洗浄し、氷上で１０分間固定し（３％パラホルムアルデヒド）、冷ＰＢＳで３回洗浄し、１０分間ブロッキングした（冷ＰＢＳ中１％ＢＳＡ）。次に、細胞をｓｂ１０６−Ｆａｂ（ＰＢＳ中１％ＢＳＡ中、５μｇ／ｍｌ）とともに１時間インキュベートした。細胞を冷ＰＢＳで５回洗浄し（各２分）、次いで、抗ＦＬＡＧ−Ａｌｅｘａ４８８（Ｆａｂ軽鎖のＣ末端にＦｌａｇエピトープタグを含む）（ＰＢＳ中１％ＢＳＡで１：４００）とともに１時間、光から保護しながらインキュベートした。細胞を冷ＰＢＳで４回洗浄した（各５分）。その後、カバーガラスを、１滴の退色防止剤をＤＡＰＩとともに含むスライドガラス上で反転させた。画像はスピニングディスク共焦顕微鏡で得た。αＫｌｏｔｈｏを過剰発現する細胞でさえ、長期固定はｓｂ１０６による染色を大幅に低下させるか、失わせた。これらのデータは、ｓｂ１０６は天然の折り畳みのヒト、ラット、およびマウスαＫｌｏｔｈｏと特異的に反応するが、変性したαＫｌｏｔｈｏタンパク質とは反応しないことを示す。

実施例６：αＫｌｏｔｈｏの免疫沈降
可溶性αＫｌｏｔｈｏを沈降させるｓｂ１０６−Ｆａｂの能力を、連続免疫沈降−免疫ブロット（ＩＰ−ＩＢ）アッセイを用いて試験した。Ｓｂ１０６−Ｆａｂは、全細胞溶解液および馴化細胞培養培地、ならびにαＫｌｏｔｈｏ過剰発現細胞からαＫｌｏｔｈｏを取り出した（図３Ａ）。ｓｂ１０６−Ｆａｂの取り出しを、ＨＥＫ２９３細胞においてＣ末端ＦＬＡＧタグを有する可溶性αＫｌｏｔｈｏを用い、抗ＦＬＡＧ抗体の場合と比較した。ｓｂ１０６−Ｆａｂおよび抗ＦＬＡＧは、正確に同じ電気泳動移動度を有するタンパク質を沈降させた。

ｓｂ１０６−Ｆａｂは、抗αＫｌｏｔｈｏ抗体ＫＭ２０７６と反応したヒト、マウス、およびラット血清から約１３０ｋＤａのタンパク質を沈降させた（図３Ｂ）。尿からのＩＰも約１３０ｋＤａのバンドを示したが（図３Ｂ）、ＩＰ後尿サンプルは免疫ブロットにおいてこのようなバンドを示さなかった。ｓｂ１０６によるＩＰ−ＩＢバンドが真正であることをさらに裏づけるために、このバンドの強度を正常者とＣＫＤステージ５の患者由来のヒト血清、および野生型マウスと同型接合型αＫｌｏｔｈｏ低次形態由来の血清で検討した（図３Ｃ）。約３０ｋＤａのバンド（図３Ｃ）はヒト進行性ＣＫＤでのみ減少し、αＫｌｏｔｈｏ欠損マウス（ｋｌ／ｋｌ）［８０］には存在しなかった。

実施例７：ヒトＣＫＤにおけるαＫｌｏｔｈｏレベル
ＩＰ−ＩＢ法がＣＫＤ患者の一施設データベースからの血清αＫｌｏｔｈｏレベルを確実に決定できるかどうかを試験した。アッセイの直線性ならびに外挿されるｙ切片を試験するために組換えヒトαＫｌｏｔｈｏを既知量で添加した。一定範囲の異なる濃度の組換えαＫｌｏｔｈｏを添加した正常健康ボランティアおよびステージ５のＣＫＤ患者由来の血清でＩＰ−ＩＢを実施した（図４Ａ）。外因性αＫｌｏｔｈｏの漸増接種に伴いシグナルに段階的増強が見られた。ＣＫＤ患者由来の血清も、外因性αＫｌｏｔｈｏの漸増に伴ってシグナルの増強を示したが、与えられたいずれの濃度のαＫｌｏｔｈｏでも、シグナル強度は正常血清より低かった。

興味深いことに、健康ボランティア由来の血清は、プロテアーゼ阻害剤カクテルは不在でも存在しても同じシグナルを示し、一方、ＣＫＤ患者由来の血清は、プロテアーゼ阻害剤の存在下で、測定されたαＫｌｏｔｈｏレベルに顕著な増加を示した（図４Ｂ）。これらの所見は、内因性αＫｌｏｔｈｏは尿毒症において安定な定常状態で存在するが、外から加えられたαＫｌｏｔｈｏは、尿毒症血清中ではタンパク質分解を受ける可能性があり、正常血清ではそうではないことを示唆する。添加実験の量的概要を図４Ｃに示す。健康血清とＣＫＤ血清の両方で、αＫｌｏｔｈｏ接種に対して直線的応答が示されたが、ＣＫＤ血清からのシグナルは傾きが小さい。プロテアーゼ阻害剤が含まれた場合には、ＣＫＤ直線の傾きが、その切片に影響を及ぼすことなく健康対象の傾きに近づいた。無接種に対する外挿は、正常個体由来の血清は３１．１ｐＭのαＫｌｏｔｈｏを含み、一方、ＣＫＤ患者由来の血清は８．５ｐＭのαＫｌｏｔｈｏを含んでいたことを示した。同様の外挿が、正常腎機能またはＣＫＤを有する他の複数名の対象から得られた。

ＣＫＤ診療から動員された患者の性質は、糖尿病および高血圧症が優勢であるＣＫＤの全国的特性と類似している（表１）。拡散しているものの、ＣＫＤのステージとともにαＫｌｏｔｈｏの明らかな段階的低下が見られる（図５Ａ）。血清αＫｌｏｔｈｏの低下はＣＫＤの早期に見られ、高ＦＧＦ２３、高ＰＴＨ、および高リン酸塩血症に先行した（表１）。ＩＰ−ＩＢアッセイでは、同サンプルで、市販のαＫｌｏｔｈｏ ＥＬＩＳＡキットと直接比較した（図５Ｂ）。全体的に見れば、二者の間に相関が見られるが、直線の両側に同一直線からの分離がある。新鮮サンプルでは、ＥＬＩＳＡはＩＰ−ＩＢよりも高い値を示すが（識別ライン(the line of identity)の左側のグレーの菱形、図５Ｂ）、１回以上の凍結−解凍を経たサンプルでは、ＥＬＩＳＡ値ははるかに低い（識別ラインの右側の黒い菱形、図５Ｂ）。厳密に同じサンプルが反復凍結−解凍前および後にこれらの２つの方法で試験された場合、ＩＰ−ＩＢアッセイはより安定な結果を示すが、ＥＬＩＳＡ値は急速に下降した（図５Ｃ）。

尿の直接免疫ブロットにより、ヒトＣＫＤ患者における低い尿αＫｌｏｔｈｏが従前に記載されている［１２］。ｓｂ１０６−Ｆａｂを用いたＩＰ−ＩＢアッセイは、ＣＫＤ患者における尿αＫｌｏｔｈｏの劇的な低下を示した（図６Ａ）。血清とは対照的に、ＥＬＩＳＡは、尿においてＩＰ−ＩＢアッセイにより匹敵する値を生じたが、ＥＬＩＳＡよりもＩＰ−ＩＢアッセイにより検出した場合に、αＫｌｏｔｈｏ濃度の低下の規模はより劇的である（図６Ｂ）。これらの結果は、ヒトＣＫＤは血清および尿の両方でαＫｌｏｔｈｏ欠乏の状態であることを示す。

ゆえに、免疫沈降−免疫ブロット（ＩＰ−ＩＢ）アッセイを用いて、全長可溶性αＫｌｏｔｈｏの血清レベルおよび尿レベルの両方をヒトで測定し、ヒトＣＫＤは血清および尿のαＫｌｏｔｈｏ欠乏と関連していることが確認された。αＫｌｏｔｈｏレベルは、ＣＫＤステージに伴う無機物代謝の他のパラメーターの妨害および段階的に低下するレベルに先行して早期ＣＫＤで検出可能に低かった。外から加えたαＫｌｏｔｈｏはＣＫＤ環境では本質的に不安定である。

抗体に基づく試薬は、タンパク質の検出、タンパク質の単離および精製、ならびに多くの下流適用のために、研究および臨床現場の両方で有価である。αＫｌｏｔｈｏ検出に利用可能な市販の試薬は限定され、例えば、天然の折り畳みのαＫｌｏｔｈｏタンパク質を特異的に検出するための抗体は存在しない。さらに、αＫｌｏｔｈｏ検出用の市販のＥＬＩＳＡキットは得られる結果が大きく変動する。

設計された抗原結合部位を有する合成抗体は、膨大な標的レパートリーの分子認識のために微調整し、適合させることができる。イン・ビトロファージディスプレーと組み合わせ、自己反応性抗体を排除する免疫寛容機構の不在下で選択を行う。抗体ライブラリーを用いた選択から、天然の折り畳みのヒト、マウスおよびラットαＫｌｏｔｈｏに特異性を有する抗体であるｓｂ１０６が得られた。

無機物代謝におけるその役割に加え、可溶性αＫｌｏｔｈｏは多くの体液中を循環し、体中の細胞の完全性を維持する複数の「ハウスキーピング」機能を有する。可溶性αＫｌｏｔｈｏの作用機序はまだ十分に理解されていないが、αＫｌｏｔｈｏ欠乏の生物学的影響は毎核に示される［８１］。αＫｌｏｔｈｏ転写産物は複数の器官に存在するが、圧倒的に腎臓が最高の発現を持つ［８０］。ＣＫＤは多重代謝障害の状態であり、排泄不足の内因性および外因性の毒素の蓄積ならびに健康維持を担う物質の欠乏からの複合症候群である。

試験動物において、ＡＫＩおよびＣＫＤは両方とも全身的αＫｌｏｔｈｏ欠乏の状態であるという証拠がある。これは早期かつ高感度のバイオマーカーであるだけでなく、αＫｌｏｔｈｏの回復は腎機能障害を改善し得る。その腎保護効果とは非依存的に、αＫｌｏｔｈｏはＣＫＤにおける腎外合併症を軽減することができる［１２，８２］。前臨床データに基づけば、抗αＫｌｏｔｈｏ抗体は診断的価値および予後的価値の両方を持ち得る。

ＩＰ−ＩＢアッセイのバリデーションおよび市販のＥＬＩＳＡとの比較
αＫｌｏｔｈｏに関する利用可能な市販のアッセイには、それらの間に一貫した相関が無い［４６、８３］。あるＥＬＩＳＡに基づく健常者とＣＫＤ患者の研究［５８］では、相反する結果が得られている。正常およびＣＫＤのαＫｌｏｔｈｏの絶対的レベルは、３桁半ばから後半のほとんどの読み取りで０．４［４７］〜２０００ｐｇ／ｍｌを越える［４１］までの範囲にあった［４８、５０、５５、５８〜６０、８３］。このアッセイに基づけば、αＫｌｏｔｈｏレベルは低い［４８、５２、５４、５７〜６０］、糸球体濾過過速度（ＧＦＲ）の低下と無関係［４０、４１、５０、５１、５３］またはＧＦＲの低下につれ増加とさえ［４４、４７］記載されている。同様に、αＫｌｏｔｈｏレベルは、年齢とともに変化しないまたは低下すると報告されている［４２、５３、５８、５９］。これはヒトαＫｌｏｔｈｏデータの解釈をほぼ不能とし、異なる施設から得られた集合データに価値が無いことになる。

その天然折り畳みコンフォメーションにあるαＫｌｏｔｈｏを認識する高親和性合成抗体（図１〜３）が作製された。ｓｂ１０６−ＦａｂまたはＩｇＧは細胞溶解液、培養培地、血清、および尿からαＫｌｏｔｈｏを取り出す。付加的バンドはαＫｌｏｔｈｏの短いフラグメントであり得るが、これらのバンドの強度はｋｌ／ｋｌマウスでは低下しておらず、この可能性に対しては議論がある。約１３０ｋＤａのバンドが全長可溶性αＫｌｏｔｈｏであるか分析したが、ＥＬＩＳＡでは達成できないことがあった。

添加実験の直線性は、接種されたαＫｌｏｔｈｏが総て検出されることを示す（図４）。外から加えた組換えαＫｌｏｔｈｏは尿毒症血清中でタンパク質分解を受けるが、正常血清ではこのような減少は見られなかったことは予期されない所見であった。腎臓病における低いαＫｌｏｔｈｏはもっぱら生産の低下から起こるものであり、さらなる機能および本発明の新たな達成方法を開く展望を喚起する。ＣＫＤにおけるαＫｌｏｔｈｏ欠乏のまだ明らかにされていない新たな機構に加え、これは組換えαＫｌｏｔｈｏｎの代替という点で重要な意味を持ち得る。

ＣＫＤが進行するにつれ血清αＫｌｏｔｈｏに段階的低下が見られる（図５Ａ）。ＩＰ−ＩＢアッセイの変動係数は血清で４％、尿で７％であった。ＩＰ−ＩＢアッセイはまた、進行性ＣＫＤにおいて極めて低い尿αＫｌｏｔｈｏを示した（図６）。実際に、尿αＫｌｏｔｈｏの低下は血清よりも劇的であり、より高感度のＣＫＤマーカーと言える。

ＩＰ−ＩＢおよび市販のＥＬＩＳＡは両方とも、ＣＫＤにおいて低い尿αＫｌｏｔｈｏを検出したが、αＫｌｏｔｈｏの絶対レベルはＥＬＩＳＡアッセイを用いた場合にはるかに高く、低下率はＩＰ−ＩＢアッセイと同じではない。ＣＫＤにおける尿αＫｌｏｔｈｏレベルの劇的な低下では、これら２つのアッセイは、量的には異なるが、同じ結論を示した。血清での状況は異なる。全体的には正の相関が見られるが、これらの２つのアッセイを比較すると、完全に２群に分離した（図５Ｂ）。新鮮サンプルは、ＥＬＩＳＡのほうが高い読み取りを示したが、保存サンプルはＥＬＩＳＡで極めて低い結果を示した。１つの可能性は、ＥＬＩＳＡがαＫｌｏｔｈｏと新鮮サンプル中の他のいくつかの反応性タンパク質を測定しているということである。ＩＰ−ＩＢアッセイは、反復凍結−解凍によりいくらか有効性を失ったが、これはＥＬＩＳＡではるかに重大な問題である。

ＩＰ−ＩＢアッセイももう１つの利点は、それがヒトと齧歯類両方のαＫｌｏｔｈｏを同等に良好に測定できるということであるが、現行利用可能なＥＬＩＳＡの齧歯類における使用は、全体的なαＫｌｏｔｈｏ欠乏の状態であるＣＫＤを有するラットでは極めて高い循環αＫｌｏｔｈｏレベルを検出するので、問題がある可能性がある［６８］。

実施例８
さらなるＣＤＲ配列を表２に示す。相同突然変異が各アミノ酸位に導入され、これは、各位置に関して、元のアミノ酸が保持されているか、またはそのアミノ酸に最も近い「ホモログ」（例えば、保存的アミノ酸変異）が導入されたことを意味し、新たなＦａｂ−ファージライブラリーが構築された。選択は、この新たなライブラリーを用い、抗原としてＫｌｏｔｈｏ−ＦＧＦＲ１ｃ複合体を用いて行った。抗原に結合したクローンを単離し、配列を決定し、表２に示す。結合親和性はＳｂ１０６と同等または良好であると予想される。

実施例９
ヒト試験
右心カテーテル法を受けた９名のヒト対象（４９．０６６．２歳）を本試験に登録した。右心カテーテル法の際に、副腎および腎臓下大静脈血液サンプルを採取し、すぐに４℃での遠心分離後に血清を分離し、その後の試験のために−８０℃で保存した。血清αＫｌｏｔｈｏは、本明細書に記載の免疫沈降−免疫ブロットアッセイで決定した。簡単に述べれば、０．１ｍｌの血清を合成抗αＫｌｏｔｈｏ Ｆａｂ（ｓｂ１０６）で免疫沈降させ、免疫複合体をＬａｅｍｍｌｉサンプルバッファーで溶出させ、ＫＭ２０７６抗体を用いて免疫ブロットを行った。１３０ｋＤの移動度に基づきオートラジオグラム上の特異的シグナルをＩｍａｇｅＪプログラム（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ （ＮＩＨ）、ベセズダ、メリーランド州）で定量した。

動物試験
αＫｌｏｔｈｏ低次形態（ｋｌ／ｋｌ）マウス、ｋｌ／ｋｌマウスおよびそれらの野生型（ＷＴ）同腹子をテキサス大学サウスウェスタン医学センターの動物試験センターで維持した。この時、総てのマウスが１２９ Ｓ１／ＳＶｌｍＪ（１２９ ＳＶ）バックグラウンドで、６〜８週齢である。正常なＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）ラット（体重２２０〜２５０ｇ）をＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（ウェルミントン、ＭＡ）から購入した。αＫｌｏｔｈｏクリアランス試験では、ラットに両側腎摘出術（無腎ラット）または腎臓のマニュアルマニピュレーションを伴う開腹術（偽手術ラット）を施した。ラットまたはマウスに、組換えマウスαＫｌｏｔｈｏタンパク質（ｒＭＫｌ）（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ミネアポリス、ＭＮ）の標識された全細胞外ドメインを０．１ｍｇ／ｋｇ体重の用量で１回、静脈内または腹膜内注射した。セクレターゼが血液αＫｌｏｔｈｏを調節するかどうかを調べるため、塩酸ドキシサイクリン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス、ＭＯ）、２５ｍｇ／ｋｇ／日のα−セクレターゼ阻害剤および／または２．５ｍｇ／ｋｇ／日のβ−セクレターゼ阻害剤ＩＩＩ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、ビルリカ、ＭＡ）を正常ＷＴマウスに２日毎日、腹膜内注射し、血清および腎臓のαＫｌｏｔｈｏを測定するために４８時間目に血液および腎臓を採取した。

抗体
ラットモノクローナル抗ヒトＫｌｏｔｈｏ抗体ＫＭ２０７６１，２を免疫ブロット法および免疫電子顕微鏡に用い、合成抗αＫｌｏｔｈｏ抗体ｓｂ１０６６３を血清Ｋｌｏｔｈｏの免疫沈降に用いた。

ラットおよびマウスにおける標識αＫｌｏｔｈｏのクリアランス
正常なＭｕｎｉｃｈ Ｗｉｓｔａｒラット（体重２２０〜２５０ｇ）をイナクチン（１００ｍｇ／ｋｇ体重）で麻酔し、標識αＫｌｏｔｈｏのボーラス(a bonus of)を頚静脈から注入した（０．１ｍｇ／ｋｇ体重）。１２５Ｉ標識αＫｌｏｔｈｏまたは１２５Ｉ標識アルブミンの注射試験では、本発明らの公開済みの方法を用い、ボーマン嚢腔および近位尿細管のフリーフロー微小穿刺による液体収集を行った。簡単に述べると、左腎を露出させ、尿収集のために左尿管にカテーテルを留置した。近位尿細管はリサミングリーン色素注射の後にそれらの特徴的な構造により特定し、ガラスキャピラリーで穿刺した。較正済みの一定ボアガラスキャピラリーで液体量を測定した。液体の放射活性はシンチレーション計数により決定し、液体量に対して正規化した。示された時点で血液を眼窩後静脈叢から抜き取り、スポット尿を採取した。採取した尿および血清中の１２５Ｉ標識αＫｌｏｔｈｏまたは１２５Ｉ標識アルブミンをシンチレーション計数により定量した。種々の器官のホモジネートを作製し、器官ホモジネートの放射活性をシンチレーション計数により測定し、器官ホモジネート中のタンパク質に対して正規化した。器官切片（１０ｍｍ）に対してオートラジオグラフィーを行った。

免疫電子顕微鏡
マウス組換えＫｌｏｔｈｏタンパク質（０．１ｍｇ／ｋｇ体重）をｋｌ／ｋｌマウスに１回腹膜内注射し、注射２４時間後にマウスを犠牲にした。腎臓を採取し、大動脈灌流を介して２．５％パラホルムアルデヒドで固定し、取り出し、４％パラホルムアルデヒド（４℃で４時間）で後固定した。超薄凍結組織切片の免疫金標識を記載のように行った２１。腎皮質に２．３Ｍスクロースを一晩浸潤させ、液体窒素中で凍結させ、７０〜８０ｎｍ厚の切片とし（Ｕｌｔｒａｍｉｃｒｏｔｏｍｅ Ｒｅｉｃｈｅｒｔ Ｕｌｔｒａｃｕｔ Ｅ；Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ、ウェツラー、ドイツ）、ホルムバールコーティングニッケルグリッドに取り付けた。これらの切片をＫＭ２０７６抗体とともにインキュベートした後、金結合Ａタンパク質（１０ｎｍ金粒子、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）とともに６０分間インキュベーションを行った。酢酸ウラニルで染色した後、切片をＪｅｏｌ １２００ ＥＸ透過型電子顕微鏡（日本電子株式会社(Jeol Ltd.)、昭島、日本）で観察した。

結果
循環αＫｌｏｔｈｏの生産および運用における腎臓の役割を調べた。正常ラット（直接穿刺による）および右心カテーテル法を受けたヒト対象の副腎および腎臓下静脈叢におけるαＫｌｏｔｈｏタンパク質の血清レベル。総ての患者がｅＧＦＲ≧６０ｍｌ／分／１．７３ｍ^２であった。ラットおよびヒトの両血清サンプルで、大静脈αＫｌｏｔｈｏレベルに同等の腎臓下／副腎増加が見られた。血清αＫｌｏｔｈｏレベルを、周知の腎由来ホルモンである血清エリスロポエチンに対してプロットしたところ、血清エリスロポエチンは、腎臓下／副腎下大静脈から上昇し、血清クレアチニン（ＳＣｒ）は低下していたが、αＫｌｏｔｈｏは増加していたことが判明し、これは腎臓が循環中にαＫｌｏｔｈｏを分泌することを示す。

ラットから両腎臓を摘出した場合には、血清αＫｌｏｔｈｏレベルは、１日で正常レベルの約半分に有意に低下した。無腎状態では、試験は、４０〜５０時間より長く継続できなかった。

循環からのαＫｌｏｔｈｏクリアランスの方法を検討した。無腎ラットにおける循環中の外因性αＫｌｏｔｈｏタンパク質のレベルは、注射直後の正常ラットにおけるレベルと同等であったが、正常ラットにおける外因性αＫｌｏｔｈｏタンパク質の半減期は、無腎ラットでの半減期よりもはるかに短く、腎摘出術時の内因性αＫｌｏｔｈｏの半減期は無腎ラットにおける外因性αＫｌｏｔｈｏの半減期と極めて近似している。静注した外因性標識αＫｌｏｔｈｏの解剖学的運命を調べるさらなる実験は、腎臓がαＫｌｏｔｈｏの取り込みならびにその排泄の主要な器官であり得ることを裏づけた。

注射した標識αＫｌｏｔｈｏタンパク質は、顕著に腎臓および脾臓に、少量ながら心臓に分布し、検出できなかった。血清および尿中の放射性標識された外因性αＫｌｏｔｈｏのクリアランスを追跡するさらなる実験は、αＫｌｏｔｈｏタンパク質が血液から腎臓を経て尿へと排出されることを裏づけた。

これらのまたさらなる実験に基づき、（１）腎臓は可溶性αＫｌｏｔｈｏを生産し、セクレターゼにより媒介されるαＫｌｏｔｈｏのエクトドメインの放出により体循環中へ放出されること、（２）腎臓は可溶性αＫｌｏｔｈｏを循環から排除するための重要な器官であること、（３）αＫｌｏｔｈｏは腎尿細管を通って基底外側から細胞内の場所へ移動し、その後、頂端膜を通って尿管腔へ分泌されることが決定付けられた。

本出願を目下のところ好ましい例と考えられるものに関して説明してきたが、本出願は開示されている例に限定されないと理解されるべきである。対照的に、本出願は添付の特許請求の範囲の趣旨および範囲に含まれる様々な改変および等価な配置を包含することが意図される。

総ての刊行物、特許および特許出願は、各個の刊行物、特許または特許出願が引用することによりその全内容が本明細書の一部とされることが具体的かつ個々に示される場合と同程度に、引用することによりその全内容が本明細書の一部とされる。特に、例えば、表または他所に示される受託番号および／またはバイオマーカー配列（例えば、タンパク質および／または核酸）を含め、本明細書に示される各受託番号に関連する配列は、引用することによりその全内容が本明細書の一部とされる。

参照文献

Claims (44)

1. 競合的ＥＬＩＳＡアッセイにより測定した場合に、約１０ｎＭ以下の解離定数（Ｋ_Ｄ）でαＫｌｏｔｈｏポリペプチドのエピトープと特異的に結合する、抗体および／またはその結合フラグメント。
2. 前記αＫｌｏｔｈｏポリペプチドが折り畳まれたαＫｌｏｔｈｏポリペプチドである、請求項１に記載の抗体および／またはその結合フラグメント。
3. 競合的ＥＬＩＳＡアッセイにより測定した場合に約２ｎＭ以下の解離定数（Ｋ_Ｄ）でαＫｌｏｔｈｏポリペプチドのエピトープと特異的に結合する、請求項１または２に記載の抗体および／またはその結合フラグメント。
4. 抗体またはその結合フラグメントが軽鎖可変領域と重鎖可変領域とを含んでなり、前記軽鎖可変領域が相補性決定領域ＣＤＲ−Ｌ３を含んでなり、かつ、前記重鎖可変領域が相補性決定領域ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３を含んでなり、前記ＣＤＲのアミノ酸配列が以下に示される配列：
   ａ．ＣＤＲ−Ｌ３；Ｘ_１Ｘ_２Ｘ_３Ｘ_４ＰＸ_５（配列番号１）
   （ここで、Ｘ_１はＡまたはＳであり、Ｘ_２はＧまたはＡであり、Ｘ_３はＹまたはＦであり、Ｘ_４はＳまたはＡであり、Ｘ_５はＩまたはＶである）；
   ｂ．ＣＤＲ−Ｈ１：Ｘ_６Ｘ_７Ｘ_８Ｘ_９Ｘ_１０Ｘ_１１（配列番号２）
   （ここで、Ｘ_６はＩまたはＶであり、Ｘ_７はＳまたはＡであり、Ｘ_８はＹ、ＦまたはＳであり、Ｘ_９はＹ、ＦまたはＳであり、Ｘ_１０はＳまたはＡであり、かつ、Ｘ_１１はＩまたはＶである）；
   ｃ．ＣＤＲ−Ｈ２；Ｘ_１２Ｘ_１３Ｘ_１４Ｘ_１５Ｘ_１６Ｘ_１７Ｘ_１８Ｘ_１９Ｘ_２０Ｘ_２１（配列番号３）
   （ここで、Ｘ_１２はＹ、ＦまたはＳであり、Ｘ_１３はＩまたはＶであり、Ｘ_１４はＳまたはＡであり、Ｘ_１５はＰまたはＳであり、Ｘ_１６はＳまたはＡであり、Ｘ_１７はＹまたはＦであり、Ｘ_１８はＧまたはＡであり、Ｘ_１９はＹまたはＦであり、Ｘ_２０はＴまたはＳであり、かつ、Ｘ_２１はＳ、ＡまたはＹである）；および／または
   ｄ．ＣＤＲ−Ｈ３：Ｘ_２２Ｘ_２３ＶＹＸ_２４Ｘ_２５Ｘ_２６Ｘ_２７ＷＸ_２８ＧＸ_２９ＧＭ（配列番号４）
   （ここで、Ｘ_２２はＹまたはＦであり、Ｘ_２３はＹまたはＦであり、Ｘ_２４はＡまたはＳであり、Ｘ_２５はＳまたはＡであり、Ｘ_２６はＨまたはＮであり、Ｘ_２７はＧまたはＡであり、Ｘ_２８はＡまたはＳであり、かつ、Ｘ_２９はＹまたはＦである）
   のうち１以上を含んでなる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗体および／またはその結合フラグメント。
5. 軽鎖可変領域と重鎖可変領域とを含んでなり、前記軽鎖可変領域が相補性決定領域ＣＤＲ−Ｌ３を含んでなり、かつ、前記重鎖可変領域が相補性決定領域ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３を含んでなり、前記ＣＤＲのアミノ酸配列が以下に示される配列：
   ａ．ＣＤＲ−Ｌ３；Ｘ_１Ｘ_２Ｘ_３Ｘ_４ＰＸ_５（配列番号１）
   （ここで、Ｘ_１はＡまたはＳであり、Ｘ_２はＧまたはＡであり、Ｘ_３はＹまたはＦであり、Ｘ_４はＳまたはＡであり、Ｘ_５はＩまたはＶである）；
   ｂ．ＣＤＲ−Ｈ１：Ｘ_６Ｘ_７Ｘ_８Ｘ_９Ｘ_１０Ｘ_１１（配列番号２）
   （ここで、Ｘ_６はＩまたはＶであり、Ｘ_７はＳまたはＡであり、Ｘ_８はＹ、ＦまたはＳであり、Ｘ_９はＹ、ＦまたはＳであり、Ｘ_１０はＳまたはＡであり、かつ、Ｘ_１１はＩまたはＶである）；
   ｃ．ＣＤＲ−Ｈ２；Ｘ_１２Ｘ_１３Ｘ_１４Ｘ_１５Ｘ_１６Ｘ_１７Ｘ_１８Ｘ_１９Ｘ_２０Ｘ_２１（配列番号３）
   （ここで、Ｘ_１２はＹ、ＦまたはＳであり、Ｘ_１３はＩまたはＶであり、Ｘ_１４はＳまたはＡであり、Ｘ_１５はＰまたはＳであり、Ｘ_１６はＳまたはＡであり、Ｘ_１７はＹまたはＦであり、Ｘ_１８はＧまたはＡであり、Ｘ_１９はＹまたはＦであり、Ｘ_２０はＴまたはＳであり、かつ、Ｘ_２１はＳ、ＡまたはＹである）；および／または
   ｄ．ＣＤＲ−Ｈ３：Ｘ_２２Ｘ_２３ＶＹＸ_２４Ｘ_２５Ｘ_２６Ｘ_２７ＷＸ_２８ＧＸ_２９ＧＭ（配列番号４）
   （ここで、Ｘ_２２はＹまたはＦであり、Ｘ_２３はＹまたはＦであり、Ｘ_２４はＡまたはＳであり、Ｘ_２５はＳまたはＡであり、Ｘ_２６はＨまたはＮであり、Ｘ_２７はＧまたはＡであり、Ｘ_２８はＡまたはＳであり、かつ、Ｘ_２９はＹまたはＦである）
   のうち１以上を含んでなる、抗体および／またはその結合フラグメント。
6. 前記相補性決定領域が、配列番号５〜１２０から選択される、場合により以下に示されるようなアミノ酸配列：
   軽鎖可変領域：
   ＣＤＲ−Ｌ３：ＡＧＹＳＰＩ（配列番号５）；
   重鎖可変領域：
   ＣＤＲ−Ｈ１：ＩＳＹＹＳＩ（配列番号６）；
   ＣＤＲ−Ｈ２：ＹＩＳＰＳＹＧＹＴＳ（配列番号７）；および／または
   ＣＤＲ−Ｈ３：ＹＹＶＹＡＳＨＧＷＡＧＹＧＭ（配列番号８）
   を含んでなる、請求項４または５に記載の抗体および／またはその結合フラグメント。
7. 前記軽鎖可変領域が、以下に示されるアミノ酸配列：
   ＣＤＲ−Ｌ１：ＱＳＶＳＳＡ（配列番号９）および／または
   ＣＤＲ−Ｌ２：ＳＡＳ（配列番号１０）
   を含んでなる相補性決定領域ＣＤＲ−Ｌ１および／またはＣＤＲ−Ｌ２をさらに含んでなる、請求項４〜６のいずれか一項に記載の抗体および／またはその結合フラグメント。
8. 配列番号１１に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖を含んでなる、請求項１〜７のいずれか一項に記載の抗体および／またはその結合フラグメント。
9. 配列番号１２に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含んでなる、請求項１〜８のいずれか一項に記載の抗体および／またはその結合フラグメント。
10. 配列番号１３または配列番号１４に示される前記アイソタイプのアミノ酸配列を有する重鎖ＩｇＧ１またはＩｇＧ４アイソタイプを含んでなり、、請求項１〜９のいずれか一項に記載の抗体および／またはその結合フラグメント。
11. 前記軽鎖相補性決定領域ＣＤＲ−Ｌ３および重鎖相補性決定領域ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３が、それぞれ配列番号１〜４と少なくとも７０％、少なくとも８０％または少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項１に記載の抗体および／またはその結合フラグメント。
12. モノクローナル抗体、免疫グロブリン分子、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ジスルフィド結合Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ジスルフィド結合ｓｃＦｖ、一本鎖ドメイン抗体、ダイアボディ、ダイマー、ミニボディ、二重特異性抗体フラグメント、キメラ抗体、ヒト化抗体およびポリクローナル抗体からなる群から選択される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の抗体および／またはその結合フラグメント。
13. 前記αＫｌｏｔｈｏポリペプチドが、哺乳類αＫｌｏｔｈｏポリペプチドである、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の抗体および／またはその結合フラグメント。
14. 前記哺乳類αＫｌｏｔｈｏポリペプチドが、ヒトαＫｌｏｔｈｏポリペプチドである、請求項１３に記載の抗体および／またはその結合フラグメント。
15. 前記哺乳類αＫｌｏｔｈｏが、齧歯類αＫｌｏｔｈｏポリペプチドである、請求項１３に記載の抗体および／またはその結合フラグメント。
16. 前記齧歯類αＫｌｏｔｈｏポリペプチドが、マウスαＫｌｏｔｈｏポリペプチドまたはラットαＫｌｏｔｈｏポリペプチドである、請求項１５に記載の抗体および／またはその結合フラグメント。
17. 前記折り畳まれたαＫｌｏｔｈｏポリペプチドが、可溶性の折り畳まれたαＫｌｏｔｈｏポリペプチドである、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の抗体および／またはその結合フラグメント。
18. 尿、血漿、および／または血清中に見出される可溶性の折り畳まれたαＫｌｏｔｈｏポリペプチドと結合する、請求項１７に記載の抗体および／またはその結合フラグメント。
19. 折り畳まれたαＫｌｏｔｈｏポリペプチドを含んでなる複合体と結合する、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の抗体および／またはその結合フラグメント。
20. 前記折り畳まれたαＫｌｏｔｈｏポリペプチドが、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）受容体、場合により、ＦＧＦＲ１ｃと複合体を形成する、請求項１９に記載の抗体および／またはその結合フラグメント。
21. 検出可能なタグで標識される、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の抗体および／またはその結合フラグメント。
22. 前記検出可能なタグが、Ｈｉｓタグ、ＨＡタグ、ＧＳＴタグ、またはＦＬＡＧタグである、請求項２１に記載の抗体および／またはその結合フラグメント。
23. 請求項１〜２２のいずれか一項に記載の抗体および／またはその結合フラグメントとαＫｌｏｔｈｏとを含んでなり、場合により、ＦＧＦＲ１ｃをさらに含んでなる、抗体複合体。
24. ＦＧＦＲ１ｃを含んでなり、場合により、ＦＧＦ２３をさらに含んでなる、請求項２３に記載の抗体複合体。
25. 軽鎖可変領域と重鎖可変領域とを含んでなり、前記軽鎖可変領域が相補性決定領域ＣＤＲ−Ｌ３を含んでなり、かつ、前記重鎖可変領域が相補性決定領域ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３を含んでなり、前記ＣＤＲのアミノ酸配列が以下に示される配列：
    ａ．ＣＤＲ−Ｌ３；Ｘ_１Ｘ_２Ｘ_３Ｘ_４ＰＸ_５（配列番号１）
    （ここで、Ｘ_１はＡまたはＳであり、Ｘ_２はＧまたはＡであり、Ｘ_３はＹまたはＦであり、Ｘ_４はＳまたはＡであり、Ｘ_５はＩまたはＶである）；
    ｂ．ＣＤＲ−Ｈ１：Ｘ_６Ｘ_７Ｘ_８Ｘ_９Ｘ_１０Ｘ_１１（配列番号２）
    （ここで、Ｘ_６はＩまたはＶであり、Ｘ_７はＳまたはＡであり、Ｘ_８はＹ、ＦまたはＳであり、Ｘ_９はＹ、ＦまたはＳであり、Ｘ_１０はＳまたはＡであり、かつ、Ｘ_１１はＩまたはＶである）；
    ｃ．ＣＤＲ−Ｈ２；Ｘ_１２Ｘ_１３Ｘ_１４Ｘ_１５Ｘ_１６Ｘ_１７Ｘ_１８Ｘ_１９Ｘ_２０Ｘ_２１（配列番号３）
    （ここで、Ｘ_１２はＹ、ＦまたはＳであり、Ｘ_１３はＩまたはＶであり、Ｘ_１４はＳまたはＡであり、Ｘ_１５はＰまたはＳであり、Ｘ_１６はＳまたはＡであり、Ｘ_１７はＹまたはＦであり、Ｘ_１８はＧまたはＡであり、Ｘ_１９はＹまたはＦであり、Ｘ_２０はＴまたはＳであり、かつ、Ｘ_２１はＳ、ＡまたはＹである）；
    ｄ．ＣＤＲ−Ｈ３：Ｘ_２２Ｘ_２３ＶＹＸ_２４Ｘ_２５Ｘ_２６Ｘ_２７ＷＸ_２８ＧＸ_２９ＧＭ（配列番号４）
    （ここで、Ｘ_２２はＹまたはＦであり、Ｘ_２３はＹまたはＦであり、Ｘ_２４はＡまたはＳであり、Ｘ_２５はＳまたはＡであり、Ｘ_２６はＨまたはＮであり、Ｘ_２７はＧまたはＡであり、Ｘ_２８はＡまたはＳであり、かつ、Ｘ_２９はＹまたはＦである）
    のうち１以上を含んでなる抗体および／またはその結合フラグメントをコードする核酸。
26. 請求項２５の核酸を含んでなるベクター。
27. 請求項２５の核酸または請求項２６に記載のベクターを含んでなる、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の抗体および／またはその結合フラグメントを産生する組換え細胞。
28. 請求項１〜２２のいずれか一項に記載の抗体および／またはその結合フラグメント、請求項２５に記載の核酸、請求項２６に記載のベクターまたは請求項２７に記載の細胞を含んでなる組成物。
29. 請求項１〜２２のいずれか一項に記載の抗体および／またはその結合フラグメントを含んでなるイムノアッセイ。
30. 前記イムノアッセイが酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）である、請求項２９に記載のイムノアッセイ。
31. 前記ＥＬＩＳＡがサンドイッチＥＬＩＳＡである、請求項３０に記載のイムノアッセイ。
32. 請求項１〜２２のいずれか一項に記載のαＫｌｏｔｈｏポリペプチドのエピトープに対して特異的結合親和性を有する抗体および／またはその結合フラグメントを生産する方法であって、その工程が
    ａ．請求項１〜１１のいずれか一項に記載の抗体および／またはその結合フラグメントのアミノ酸配列をコードする核酸を宿主細胞内で発現させること、
    ｂ．前記抗体および／またはその結合フラグメントを生産するために前記宿主細胞を培養すること、および
    ｃ．前記抗体および／またはその結合フラグメントを前記宿主細胞から単離および精製すること
    を含んでなる、方法。
33. サンプル中のαＫｌｏｔｈｏポリペプチドのレベルを測定するためのアッセイであって、
    ａ．サンプルと請求項１〜２２のいずれか一項に記載の抗体とを、抗体：αＫｌｏｔｈｏ複合体を形成する条件下で接触させること、および
    ｂ．抗体：αＫｌｏｔｈｏ複合体を検出すること
    を含んでなる、アッセイ。
34. 可溶性αＫｌｏｔｈｏを検出および／または測定するためのアッセイであって、
    ａ．体液であるサンプルと本明細書に記載の抗体または結合フラグメントとを、抗体：可溶性αＫｌｏｔｈｏ複合体を形成する条件下で接触させること、および
    ｂ．抗体：可溶性αＫｌｏｔｈｏ複合体を検出すること
    を含んでなる、方法。
35. 前記抗体：αＫｌｏｔｈｏ複合体が、免疫沈降、免疫ブロット、免疫組織化学、免疫細胞化学および蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）により検出される、請求項３３または３４に記載のアッセイ。
36. 対象において慢性腎臓病（ＣＫＤ）および急性腎障害（ＡＫＩ）から選択される腎臓病態を診断するためまたは検出するためのスクリーニング方法であって、
    ａ．対象由来のサンプルにおけるαＫｌｏｔｈｏのレベルを、場合により、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の抗体もしくはそのフラグメントを用いて、あるいは、請求項３３もしく３４に記載のアッセイを用いて測定すること、
    ｂ．前記サンプルにおけるαＫｌｏｔｈｏレベルを対照と比較すること
    を含んでなり、
    対照と比較した前記サンプルにおけるαＫｌｏｔｈｏのレベルの低下が、前記対象がＣＫＤまたはＡＫＩから選択される腎臓病態を有することを示す、方法。
37. 前記ＣＫＤが、早期ＣＫＤ、場合により、ステージ１、ステージ２、ステージ３、ステージ４、ステージ５またはステージ６である、請求項３６に記載の方法。
38. 前記サンプルが、新鮮組織サンプル、凍結サンプル、および軽度固定サンプルなどの固定サンプルから選択される、請求項３６または３７に記載の方法。
39. αＫｌｏｔｈｏのレベルが、免疫沈降により決定される、請求項３６〜３８のいずれか一項に記載の方法。
40. ＡＫＩ後の回復の予後を診断する方法であって、
    ａ．対象由来のサンプルにおけるαＫｌｏｔｈｏのレベルを決定すること、および
    ｂ．前記サンプルにおけるαＫｌｏｔｈｏのレベルを対照と比較すること
    を含んでなり、
    対照と比較した前記サンプルにおけるαＫｌｏｔｈｏのレベルの上昇が、前記対象がＡＫＩ後の回復のより高い見込みを有することを示す、方法。
41. ＡＫＩ後の長期合併症の予後を診断する方法であって、
    ａ．対象由来のサンプルにおけるαＫｌｏｔｈｏのレベルを決定すること、および
    ｂ．前記サンプルにおけるαＫｌｏｔｈｏのレベルを対照と比較すること
    を含んでなり、
    対照と比較した前記サンプルにおけるαＫｌｏｔｈｏのレベルの上昇が、前記対象が、ＡＫＩ後の長期合併症がより少ないというより高い見込みを有することを示す、方法。
42. ＣＫＤの進行速度の予後を診断する方法であって、
    ａ．対象由来のサンプルにおけるαＫｌｏｔｈｏのレベルを決定すること、および
    ｂ．前記サンプルにおけるαＫｌｏｔｈｏのレベルを対照と比較すること
    を含んでなり、
    対照と比較した前記サンプルにおけるαＫｌｏｔｈｏのレベルの上昇が、前記対象が のより高い見込みを有することを示す、方法。
43. ＣＫＤにおける腎外合併症の予後を診断する方法であって、
    ａ．対象由来のサンプルにおけるαＫｌｏｔｈｏのレベルを決定すること、および
    ｂ．前記サンプルにおけるαＫｌｏｔｈｏのレベルを対照と比較すること
    を含んでなり、
    対照と比較した前記サンプルにおけるαＫｌｏｔｈｏのレベルの上昇が、前記対象が、ＣＫＤに関連する腎外合併症がより少ないというより高い見込みを有することを示す、方法。
44. 請求項１〜２２のいずれか一項に記載の抗体および／またはその結合フラグメント、参照薬剤および場合によりその使用のための説明書を含んでなるキット。

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