JP2017525355A - バクテリオファージ・ラムダ・インテグラーゼの変異体 - Google Patents

Abstract

本発明は、配列番号１に記載のラムダ・インテグラーゼの４３位、３１９位及び３３６位に少なくとも１つのアミノ酸変異を含むラムダ・インテグラーゼに関する。本発明は更に、変異体ラムダ・インテグラーゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子と、これらの核酸分子を含むホスト細胞とに関する。本発明はまた、変異体ラムダ・インテグラーゼの存在下で、興味のある核酸を標的核酸に組み換える方法と、配列特異的組み換えキットとに関する。

Description

本発明は、バクテリオファージ・ラムダ・インテグラーゼの変異体及び前記変異体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子に関する。

背景

ファージ・インテグラーゼは、２つのＤＮＡ認識配列、ファージ付着部位ａｔｔＰと細菌付着部位ａｔｔＢとの間の単一指向性部位特異的組み換え(unidirectional site-specific recombination)を仲介する酵素である。インテグラーゼは、それらの触媒作用の様式に基づいて、２つの主要なファミリー、チロシンリコンビナーゼと、セリンコンビナーゼとにグループ分けされ得る。

チロシンファミリーインテグラーゼ、例えば、ラムダ・インテグラーゼなどは、触媒的チロシンを利用して、鎖切断を仲介し、より長いａｔｔＰ配列を認識する傾向があり、ファージ又はホスト細菌によってコードされた他のタンパク質を必要とする。

セリンファミリーからのファージ・インテグラーゼは、より大きく、触媒的セリンを鎖切断のために使用し、より短いａｔｔＰ配列を認識し、ホストコファクターを必要としない。ファージ・インテグラーゼは、比較的短いが、ゲノムスケールで特異的であるために十分な長さの２種類の異なる配列間の効率的な部位特異的組み換えを仲介する。

これらの特性が、生きている真核細胞、特に、哺乳類及びほとんどの植物などの大型のゲノムを有する細胞、それらのための的確なゲノム操作のための手段はほとんど存在しないのであるが、そのような細胞のための遺伝子操作に関して高まる重要性をファージ・インテグラーゼに与える。

ラムダ・インテグラーゼの使用は、触媒部位特異的ＤＮＡ組み換えのための広範囲な研究に対して供されてきた。例えば、２種類の変異体ラムダ・インテグラーゼ、Ｉｎｔｈ（Ｅ１７４Ｋ）及びその誘導体Ｉｎｔｈ／２１８（Ｅ１７４Ｋ／Ｅ２１８Ｋ）が記述されており、ヒト細胞での対応する分子内組み換え反応と少なくとも同じくらい効果的に分子内組み換え反応を触媒することが示された。アーム部位配列の存在が、インビボでのＩｎｔ−ｈ／２１８によるコア部位の組み換えを増大することが示されてきたが、ヒトゲノムでのａｔｔＢ部位の不在を考慮すると、組み換え反応は、本質的に無作為な様式で非コグネイト部位（non-cognate sites）において生じる。

これは、制御された再現可能なやり方での細胞株の操作を困難にする。

従って、より高い効率と、触媒部位特異的な組み換え反応に対する特異性とを有する変異インテグラーゼを提供する必要が依然として存在している。

１つの態様において、Ｉ４３Ｆ、Ｅ３１９Ｇ及びＤ３３６Ｖからなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸変異を含むラムダ・インテグラーゼが提供される。

もう１つの態様において、配列番号１に記載のラムダ・インテグラーゼの３３６位、３１９位及び４３位のうちの少なくとも１つでアミノ酸変異を含むラムダ・インテグラーゼが提供される。

もう１つの態様において、核酸分子が提供される。当該核酸分子は、ここで記載される通りの変異体をコードしているヌクレオチド配列を含む。

更なる態様において、ホスト細胞が提供される。当該ホスト細胞は、ここに記載される通りの核酸分子を含む。

更なるもう１つの態様において、興味のある核酸を標的核酸に対して組み換える方法が提供される。当該方法は、ここに記載される通りの変異体の存在下で、興味のある核酸を含む対象核酸を標的核酸と接触させることを含む。

更なる態様において、配列特異的組み換えキットが提供される。当該キットは、興味のある核酸が挿入できる対象核酸、及びここに記載される通りの変異体を含む。

［定義］
以下の語及びここで使用される用語は、表示された意味を有するものとする。

用語「変異体（mutant）」は、変異又は組み換えＤＮＡ手続きの結果として生じるタンパク質を指示する。

用語「Ｉｎｔ」又は「インテグラーゼ」は、ラムダ・インテグラーゼ・タンパク質を指す。

ここで使用されるとき、「核酸」は、何れかの可能な構造、例えば、線形化された一本鎖、二本鎖又はその組み合わせなどの構造にある何れかの核酸を指す。核酸は、これらに限定するものではないが、ＤＮＡ分子（例えば、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ）、ＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）、ヌクレオチド類似物を使用して、若しくは核酸化学を使用して生成されたＤＮＡ若しくはＲＮＡの類似体、ｃＤＮＡ合成ＤＮＡ、ＤＮＡ及びＲＮＡのコポリマー、オリゴヌクレオチド、並びにＰＮＡ（タンパク質核酸）を含み得る。ＤＮＡ又はＲＮＡは、ゲノム又は合成起源のものであってもよく、一本鎖又は二本鎖であってもよい。それぞれの核酸は、非天然のヌクレオチド類似体を更に含んでいてもよく、及び／又はアフィニティタグ若しくはラベルに連結されていてもよい。

ここで使用されるとき、ヌクレオチドは、ヌクレオシド一リン酸、ヌクレオシド二リン酸及びヌクレオシド三リン酸を含む。ヌクレオチドはまた、修飾ヌクレオチド、例えば、しかしながらこれらに限定するものではないが、ホスホチオエイトヌクレオチド、及びデアザプリンヌクレオチド及び他のヌクレオチド類似体などを含む。

「ａｔｔＢ／ａｔｔＰ反応」又は「Ｂ／Ｐ反応」は、Ｉｎｔにより仲介されるａｔｔＢ認識部位及びａｔｔＰ認識部位間の組み換え反応である。

「ａｔｔＨ／ａｔｔＰＨ反応」又は「Ｈ／ＰＨ反応」は、Ｉｎｔにより仲介されるａｔｔＨ認識部位及びａｔｔＰＨ認識部位間の組み換え反応である。

「ａｔｔ部位」は、インテグラーゼ又はインテグラーゼ複合体のためのＤＮＡ分子上の付着部位である。ここで使用されるとき、「ａｔｔ部位」は、一般的には、以下においてより詳細に記載される「認識部位」と交換可能に使用される。通常、「ａｔｔ部位」は、特定の種類の認識部位、例えば、ａｔｔＢ、ａｔｔＰ、ａｔｔＬ又はａｔｔＲ部位などを指示するために使用される。

「染色体に統合された（chromosomally-integrated）」又は「統合された（integrated）」は、ホストDNAと形成された共有結合によって、外来性ゲノム又はヌクレオチド配列をホストゲノムに統合することを指す。

「欠失反応」又は「切除反応」は、交換可能に使用され、同一のＤＮＡ分子上にあり、互いに順行に方向付けられている（in direct orientation）２つの認識部位間での組み換え反応を指す。この反応は、当該２つの認識部位間に位置するヌクレオチド配列の除去をもたらす。

「順行に方向付けられた」は、認識部位の１５塩基対コア領域が、同一の５’から３’への方向に方向付けられるような２つ以上の認識部位の配向性を指す。「ダイレクト・リピート」は、ここで使用されるとき、互いに順行に方向付けられた２つ以上の認識部位を指す。

「ドナー」、「ドナー分子」、「ドナー配列」及び「ドナーＤＮＡ」は、交換可能に使用され、部位指向性組み換えを使用する標的ＤＮＡ配列との組み換えを受けるために選択されたヌクレオチド配列を指す。ドナーヌクレオチド配列は、何れのヌクレオチド配列であってもよく、例えば、遺伝子、発現カセット、プロモーター、分子マーカー、選択可能なマーカー、可視的マーカー、これらの何れかの一部などであり得る。当該ドナーＤＮＡ配列は、少なくとも１つのリコンビナーゼ認識部位を含む。

「内因性」は、ここで使用されるとき、「同一の起源のもの」を意味し、即ち、１つのホスト細胞に由来することを意味する。

「発現カセット」は、ここで使用されるとき、適切なホスト細胞においてもう１つのヌクレオチド配列の発現を方向付ける又は運転することができるヌクレオチド配列を含む。発現カセットは、典型的には、ヌクレオチド配列に対して、例えば、終結シグナルに稼働可能に連結されている、例えば、興味のあるヌクレオチド配列などのヌクレオチド配列に対して稼働可能に連結されたプロモーターを含む。発現カセットはまた、典型的には、ヌクレオチド配列の適切な翻訳に必要とされる配列を含む。興味のあるヌクレオチド配列は、通常は興味のあるタンパク質をコードするものであるが、しかしながら、興味のある機能的なＲＮＡ、例えば、アンチセンスＲＮＡ又は非翻訳ＲＮＡ、これは、センス若しくはアンチセンス方向において、特定の遺伝子の発現を阻害するもの、例えば、アンチセンスＲＮＡなどをコードするものであってもよい。当該ヌクレオチド配列を含む発現カセットは、キメラであってもよく、これは、少なくとも１つのその成分が、その他の成分の少なくとも１つに関して異種性であることを意味する。発現カセットは、内因性ＤＮＡを含んでいてもよく、それは組み換え型で得られたものであってもよく、異種発現のために有用なものであってもよい。典型的には、しかしながら、発現カセットは、ホストに関して異種性であり、即ち、発現カセットの特定のＤＮＡ配列は、ホスト細胞において天然には発生するものではなく、並びにホスト細胞に導入されるべきものであるか、又はトランスフォーメーションイベントを経てホスト細胞の祖先細胞に導入されるべきものである。発現カセットにおけるヌクレオチド配列の発現は、何れかの適切なプロモーター、例えば、構造型プロモーター、又はある特異的な外的刺激にホスト細胞が暴露されたときにのみに転写を開始する誘導型プロモーターなどの何れかの制御下にあり得る。多細胞生物については、プロモーターは、特定の組織若しくは器官又は発展段階に特異的であり得る。

「外因性」遺伝子又はＤＮＡは、ホスト有機体において通常は見られないが、遺伝子導入によって導入され得る遺伝子又はヌクレオチド配列を指す。ホスト細胞のゲノムに統合されていない外因性遺伝子及びＤＮＡは、「染色体外の（extrachromosomal）」と称される。

用語「遺伝子」は、広く使用され、生物学的機能と関連するヌクレオチド配列の何れのセグメントも含む。従って、遺伝子は、その発現のために必要な調節配列を伴う又は伴わない、何れかのコーディング配列を含み得る。更に、遺伝子は、エクソン及びイントロン配列を共に含んでいてもよく、又はエクソン配列のみを含んでいてもよい。遺伝子はまた、非発現ＤＮＡセグメント、例えば、他のタンパク質のための認識配列を形成するセグメントなどを含んでいてもよい。「遺伝子の一部」又は「不完全な遺伝子」は、ここで使用されるとき、非機能的な遺伝子の一部分を意味するが、これは、機能性のために必要とされる全ての配列を含んでいないためである。当該一部分は、遺伝子の５’部分（即ち、遺伝子の３’末の配列が存在しない）であってもよく、又は当該一部分が、遺伝子の３’部分（即ち、遺伝子の５’末の配列が存在しない）であってもよい。５’及び３’部分は、それ自体では非機能的であってもよく、しかしながら、５’及び３’部分が稼働可能に連結されているときには、遺伝子は「機能的」又は「完全」である。

「興味のある遺伝子」、「興味のある配列」、「興味のある核酸」及び「興味のあるＤＮＡ」は、交換可能に使用され、細胞に移されたときに、所望される特徴、例えば、ウイルス抵抗性、害虫抵抗性、抗生物質ストレス抵抗性（antibiotic stress resistance）、耐病性、他の有害生物に対する抵抗性、除草剤耐性、改良された栄養価、産業プロセスにおける改良された性能、変更された生殖能力などを当該細胞に与える何れかのヌクレオチド配列を含む。興味のある配列はまた、商業的に価値のある酵素又は代謝産物を産生するための細胞株又は哺乳動物又は植物に移されたものであってもよい。これに関連して、「標的核酸」は、ここで使用されるとき、少なくとも１つの認識部位を含むヌクレオチド配列を指す。標的ヌクレオチド配列は、遺伝子、発現カセット、プロモーター、分子マーカー、前記何れかの一部などであり得る。標的核酸は、ホスト細胞に安定してトランスフォームされ、ゲノムにおける染色体位置に統合された標的配列を含む形質転換された細胞株を作出する。それに応じて、幾つかの実施形態においては、標的核酸は、ゲノムＤＮＡに含まれ得る。ゲノムＤＮＡは、細胞に含まれ得る。他の実施形態においては、標的核酸は、ａｔｔＨ配列（配列番号７）及びａｔｔＨ４Ｘ配列（配列番号３１）からなる群より選択される配列を含み得る。

「ゲノム」は、有機体の完全な遺伝物質を指す。

「異種の」とは、ここで使用されるとき、「異なる天然起源の」、即ち、非天然状態を意味する。例えば、ホスト細胞が別の有機体、特に別の種に由来する遺伝子で形質転換される場合、その遺伝子は、当該遺伝子を有するホスト細胞及びホスト細胞の子孫の両方に関して異種である。同様に、「異種の」は、天然又は原初の細胞タイプに由来するヌクレオチド配列、及び同じ天然又は原初の細胞タイプに挿入されるヌクレオチド配列であるが、非天然状態で存在するヌクレオチド配列、例えば、異なる調節要素などの制御下において、異なるコピー数で存在するヌクレオチド配列などを指す。

組み換え産物を「同定する」ことは、組み換え産物が検出され、標的及びドナー配列の両方から識別されることを意味する。組み換え産物を同定するための多くの手段が存在する。例えば、選択可能なマーカー遺伝子が使用でき、それにより部位特異的な統合が、組み換え産物においてのみ、プロモーターに稼働可能に連結されるようになる選択可能なマーカーをもたらす。或いは、可視的マーカー遺伝子が使用でき、それによりマーカー遺伝子発現の増加又は減少が組み換え産物を同定する。或いは、否定的に選択可能なマーカー遺伝子が使用でき、それによって当該マーカー遺伝子の減少又は不足が組み換え産物を同定する。更に、分子マーカーパターンが、組み換え産物に特有のものとなるように、標的配列及び／又はドナー配列を特徴づける分子マ−カ−が使用できる。

「インテグラーゼ」は、ここで使用されるとき、バクテリオファージ・ラムダ由来インテグラーゼを指し、野生型インテグラーゼ及び／又は多様な変異体の何れか、若しくは修飾されたインテグラーゼを含む。「インテグラーゼ複合体」は、ここで使用されるとき、インテグラーゼ及び組み込み宿主因子（integration host factor、ＩＨＦ）を含む複合体を指す。「インテグラーゼ複合体」はまた、ここで使用されるとき、インテグラーゼ、組み込み宿主因子、及びバクテリオファージ・ラムダ由来除去酵素（Ｘｉｓ）を含む複合体を指す。更にここで使用されるとき、「Ｉｎｔ」は、「インテグラーゼ」及び「インテグラーゼ複合体」の両方を指す。

「インテグラーゼ仲介組み換え産物」は、インテグラーゼ又はインテグラーゼ複合体の存在下で標的及びドナー配列の間で形成される組み換え産物である。インテグラーゼ仲介組み換えは、標的上の少なくとも１つのリコンビナーゼ認識部位と、ドナー上の少なくとも１つのリコンビナーゼ認識部位との間での鎖交換をもたらし、それによって組み換え産物が形成される。上記で定義された使用方法と一致して、「Ｉｎｔ仲介組み換え」又は「Ｉｎｔ仲介組み換え産物」は、インテグラーゼ又はインテグラーゼ複合体の何れかによって仲介される組み換え又は組み換え産物を意味する。

「分子内組み換え」は、単一核酸分子上の認識部位間での組み換えを指す。異なる分子上の認識部位間での組み換えは、「分子間組み換え」と称する。

「染色体内組み換え」は、単一染色体上の認識部位間での組み換えを指す。異なる染色体上の認識部位間での組み換えは、「染色体間組み換え」と称する。

「反転反応（inversion reaction）」は、互いに関して逆方向にある２つのａｔｔ部位間の分子内組み換え反応を指す。例えば、反転反応は、逆方向にあるａｔｔＢ部位とａｔｔＰ部位の間、又は逆方向にあるａｔｔＬ部位とａｔｔＲ部位との間の何れかでの分子内反応によってもたらされ得る。

「逆方向」は、当該認識部位の１５塩基対コア領域が、５’から３’方向の反対に方向付けられるような、２つの認識部位の配向性を指す。

「稼働可能に連結（Operably linked）」又は「稼働可能なように連結（operatively linked）」は、物理的又は機能的に相互に作用する２つ以上のヌクレオチド配列間の関係を指す。例えば、当該制御ヌクレオチド配列がコーディング又は構造ヌクレオチド配列の発現レベルに影響するような状態に、２つの配列があるときに、プロモーター又は制御ヌクレオチド配列が、ＲＮＡ又はタンパク質をコードするヌクレオチド配列に稼働可能に連結されていると言える。２つの部分が機能的な遺伝子を形成する状態にあるときに、ある遺伝子の５’部分が、ある遺伝子の３’部分と稼働可能なように、又は稼働可能に連結している。

「認識部位」又は「組み換え部位」は、リコンビナーゼタンパク質及び何れかの関連するアクセサリータンパク質によって認識されるヌクレオチド配列を指す。認識部位は、リコンビナーゼによる結合、切断及び鎖交換が行われるヌクレオチド配列である。インテグラーゼ又はインテグラーゼ複合体は、ａｔｔＢ、ａｔｔＬ、ａｔｔＲ、ａｔｔＰ及び／又は前記部位の適切な変異を含む認識部位を認識する。ａｔｔＢ部位は、約２５〜３０ｂｐであってもよく、２つの７ｂｐコア配列及び７ｂｐオーバーラップ（又はスペーサー）領域を含むのに対して、ａｔｔＰ部位は、約２４０ｂｐであってもよく、インテグラーゼ及び１つ以上のアクセサリータンパク質のための結合部位を含む。ａｔｔＢ及びａｔｔＰ部位は、Ｉｎｔによって共に組み換えされてもよく、或いは、ａｔｔＬ及びａｔｔＲ部位が、Ｉｎｔによって共に組み換えされてもよい。

「リコンビナーゼ」は、ＤＮＡの部位特異的組み換えを行うことが可能な酵素を指す。リコンビナーゼ酵素は、エンドヌクレアーゼ活性及びリガーゼ活性を有する。リコンビナーゼは、単一タンパク質としてか、又は（複数の）タンパク質の複合体の一部分としてか、何れかとして機能し得る。ここで使用されるとき、インテグラーゼ及びインテグラーゼ複合体は、リコンビナーゼである。

通常、リコンビナーゼ仲介する組み換えが、同一分子上の２つのリコンビナーゼ認識部位間で生じる場合、組み換え反応は、２つの認識部位に隣接している配列の欠失又は反転の何れかをもたらす。リコンビナーゼ仲介組み換えが、異なる分子上の２つのリコンビナーゼ認識部位間（例えば、標的配列上のリコンビナーゼ認識部位と、ドナー配列上のリコンビナーゼ認識部位との間）で生じるとき、組み換え反応は、１つの分子から他の分子への配列の挿入（例えば、標的分子へのドナー配列の挿入）をもたらす。組み換えが可能な特定の認識部位が標的及びドナーの両方に存在する場合（例えば、標的上のａｔｔＢ部位とドナー上のａｔｔＰ部位、又は標的上のａｔｔＬ部位とドナー上のａｔｔＲ部位）、組み換え産物は、２つの部位間でのヌクレオチド配列の交換を意味し、結果として２つの新しい部位が得られる。これらの新しい部位のそれぞれは、ドナー及び標的分子からの原初の認識部位の一部分を含む。例えば、組み換えが、標的上のａｔｔＢ部位とドナー上のａｔｔＰ部位との間で生じる場合には、ａｔｔＬ及びａｔｔＲ部位が、組み換え産物中に作られる。加えて、新たに形成されたａｔｔＬ及びａｔｔＲ部位は、ドナー分子から得られた配列と一方側において隣接し、標的分子から得られた配列と他方側において隣接する。

「調節要素」は、ホスト細胞に別のヌクレオチド配列、例えば、興味のある配列などを与えることに関与するヌクレオチド配列を含む。調節要素は、興味のある配列に、及び終結シグナルに、稼働可能に連結されているプロモーターを含み得る。調節要素はまた、典型的には、興味のあるヌクレオチド配列の適切な翻訳のために有用な配列を含む。

「選択可能なマーカー」又は「選択可能なマーカー遺伝子」は、特定の条件下で、細胞におけるその発現が、当該細胞に選択的優位性を与えるヌクレオチド配列を指す。選択可能なマーカー遺伝子で形質転換された細胞によって所有される選択的優位性は、非形質転換細胞の能力と比較して、否定的な選択剤、例えば、抗生物質又は除草剤の存在下での成長のために改善された能力であり得る。或いは、形質転換された細胞によって所有される選択的優位性は、非形質転換細胞と相対的に、栄養素、成長因子又はエネルギー源などの特定化合物に関する改良された利用能であり得る。

或いは、形質転換された細胞によって所有される選択的優位性は、「否定的な選択」と称されるものに効果的な、以前有されていた形質又は特徴の喪失であり得る。この最後の場合では、ホスト細胞は、典型的にはトランスジェニック親細胞である、親細胞に存在する特定の形質又は特徴（例えば、否定的な選択可能なマーカー遺伝子など）を発現する能力を失っている細胞に対してのみ毒性である化合物に暴露させる、又はそのような化合物に接触させる。

「部位指向性組み換え」はここで使用されるとき、少なくとも１つの認識部位をそれぞれに含む２つのヌクレオチド配列間での組み換えを指す。

「部位特異的」は、特定のヌクレオチド配列でということを意味し、これはホスト細胞のゲノム上での特定の位置であり得る。当該ヌクレオチド配列は、ホストゲノムにおけるその天然の位置、若しくはゲノム中の何れかの他の位置の何れかにおいて、ホスト細胞に対して内因性であってもよく、又は様々な公知の方法の何れかによってホスト細胞のゲノムに予め挿入された異種ヌクレオチド配列であってもよい。

「安定に形質転換された」は、ホスト細胞のゲノム中に安定に統合されている興味のあるヌクレオチド配列を含むホスト細胞を指示する。

「標的」、「標的分子」、「標的配列」及び「標的ＤＮＡ」は、交換可能に使用され、少なくとも１つのリコンビナーゼ認識部位を含むヌクレオチド配列を指示する。標的ヌクレオチド配列は、遺伝子、発現カセット、プロモーター、分子マーカー、これらの何れかの一部などであり得る。標的配列は、細胞中に安定にトランスフォームされ、ゲノム中の染色体位置に統合された標的配列を含む「標的株」を作出し得る。

「標的とされた統合イベント」又は「標的イベント」は、インテグラーゼ又はインテグラーゼ複合体の存在下で標的配列及びドナー配列の間で形成された組み換え産物を指す。とりわけ、それは、標的配列が細胞に安定にトランスフォームされたときのＩｎｔ仲介組み換えの結果として、標的配列へのドナー配列の統合を指す。

「可視的マーカー遺伝子」は、形質転換された細胞におけるその発現がその細胞に有利性は与えないかもしれないが、検出可能又は可視化できる遺伝子又はヌクレオチド配列を指す。可視的マ−カ−の例は、これらに限定するものではないが、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、ルシフェラーゼ（ＬＵＣ）及び蛍光タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）又はシアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）など）を含む。

単語「実質的には」は、「完全に」を排除するものではなく、例えば、Ｙを「実質的に含まない」組成物は、Ｙを完全に含まなくともよい。必要ならば、単語「実質的には」は、本発明の定義から削除され得る。

特定の他の記載がない限り、用語「含んでいる（comprising）」及び「含む（comprise）」、並びにその文法的な変形は、「オープンな（open）」又は「包含的な（inclusive）」言葉を意図しており、それによって、それらは言及された要素を含むが、付加的な、言及されていない要素も含めることを許している。

ここで使用されるとき、配合物の成分の濃度との関連において、用語「約（about）」は、典型的には定められた値の＋／−５％、より典型的には定められた値の＋／−４％、より典型的には定められた値の＋／−３％、より典型的には定められた値の＋／−２％、更により典型的には定められた値の＋／−１％、更により典型的には定められた値の＋／−０．５％を意味する。

本開示を通して、幾つかの実施形態が、様々な形式で開示されるかもしれない。様々な形式の記載は、単に便宜及び簡潔性のためのものであると理解されるべきであり、開示された範囲に柔軟性なく制限されると解釈されるべきではない。従って、ある範囲の記述は、全ての可能な部分的範囲、並びにその範囲以内の個々の数値を具体的に開示していると見なされるべきである。例えば、１〜６などの範囲の記述は、例えば、１〜３、１〜４、１〜５、２〜４、２〜６、３〜６などの部分的範囲、並びにその範囲以内の個々の数値、例えば、１、２、３、４、５及び６を具体的に開示していると見なされるべきである。これは、当該範囲の幅に拘わらず適用される。

幾つかの実施形態はまた、ここに広く、一般的に記載されているかもしれない。一般的な開示範囲内に落とし込む、それぞれのより狭い種類及び下位属性の分類も、本開示の一部分を構成する。これは、排除された構成要素がここで具体的に言及されているか否かに拘わらず、何れかの内容を（subject matter）を特定の群（the genus）から排除する条件付き、又は否定的な制限を伴う実施形態の一般的な記述を包含するものである。

［随意的な実施形態の開示］
４３位、３１９位及び３３６位で少なくとも１つのアミノ酸変異を含むラムダ・インテグラーゼの例示的、非限定的な実施形態がこれから開示される。

これに関連して、ここで記載されるラムダ・インテグラーゼに存在する変異は、何れかの変異、例えば、置換、欠失及びラムダ・インテグラーゼの天然アミノ酸配列の挿入などを含んでもよく、並びに結果として生じるポリペプチドは、３次元的に安定な構造に折り畳まれ、所望の組み換え活性を示す。ここで記載されるラムダ・インテグラーゼは、保存的変異及び／又は非保存的変異を含み得る。起こり得る変異の例は、保存的に変更された変異であり、そこにおいて変更は、化学的に類似のアミノ酸によるアミノ酸の置換である。上述のことに加えて、ラムダ・インテグラーゼは、以上のように領域の外側に変異、例えば、保存的変異を含み得る。そのような保存的な置換は、当業者には公知であり、１）アラニン、セリン、トレオニン；２）アスパラギン酸及びグルタミン酸；３）アスパラギン及びグルタミン；４）アルギニン及びリジン；５）イソロイシン、ロイシン、メチオニン、バリン；並びに６）フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン（tyroptophan）の間の置換を含み得る。

「アミノ酸残基」は、ここで使用されるとき、何れかのアミノ酸を指示し、Ｄ又はＬ形の何れであってもよく、或いはアミド結合によってポリペプチドに組み込まれ得るアミノ酸ミメティックを指示する。

従って、正電荷をもつアミノ酸残基は、例えば、生理学的条件下で正電荷をもつ天然に存在するアミノ酸残基の何れか、例えば、アルギニン又はリジンなどであってもよく、或いは非天然のミメティック、例えば、永続的な正電荷を有する（第４）アンモニウム塩を得るためにそのアルファ−アミノ基がアルキル化されているリジン残基などであり得る。

１つの実施形態において、配列番号１に記載のラムダ・インテグラーゼの４３位、３１９位及び３３６位で少なくとも１つのアミン酸置換を含むラムダ・インテグラーゼ。

もう１つの実施形態において、ここで記載されるラムダ・インテグラーゼは、配列番号１に記載のラムダ・インテグラーゼの４３位、３１９位及び３３６位でアミノ酸置換を含む。

もう１つの実施形態において、配列４３位のアミノ酸残基イソロイシンは、芳香族アミノ酸により置換される。芳香族アミノ酸は、フェニルアラニン、チロシン及びトリプトファンからなる群より選択され得る。１つの実施形態において、芳香族アミノ酸は、フェニルアラニンである。

もう１つの実施形態において、配列３１９位のアミノ酸残基グルタメート（glutamate）は、グリシンにより置換される。

もう１つの実施形態において、配列３３６位のアミノ酸残基アスパルテート（aspartate）は、疎水性アミノ酸により置換され得る。疎水性アミノ酸は、脂肪族アミノ酸であり得る。脂肪族アミノ酸は、イソロイシン、ロイシン及びバリンからなる群より選択され得る。１つの実施形態において、脂肪族アミノ酸はバリンである。

更なる実施形態において、ここで記載されるラムダ・インテグラーゼは、アミノ酸置換Ｉ４３Ｆ、Ｅ３１９Ｇ及びＤ３３６Ｖを含み得る。

別の実施形態において、ここで記載されるラムダ・インテグラーゼは、配列番号１に記載のラムダ・インテグラーゼ３３６位でアミノ酸配列を含み得る。配列３３６位のアミノ酸残基アスパルテートは、疎水性アミノ酸により置換され得る。疎水性アミノ酸は、脂肪族アミノ酸であり得る。脂肪族アミノ酸は、イソロイシン、ロイシン及びバリンからなる群より選択され得る。１つの実施形態において、脂肪族アミノ酸はバリンである。

ここで記載されるラムダ・インテグラーゼにおける変異は、リコンビナーゼ特異性及び効率性の方向において一般的に重要である。

ここで記載されるラムダ・インテグラーゼは、当業者に公知の様々な選択系を経て生成され得る。例えば、レポーター遺伝子活性又は基質関連タンパク質発生（substrate-linked protein evolution, SLiPE)）を介する機能的変異体の識別に依存する細菌選択系は、これまでに記載されてきた。これらの選択系は、リコンビナーゼにおける工学的に変更された部位特異性のための多くの異なるアプローチの１つである。例えば、酵母における遺伝子選択系はまた、産生されたＨＩＶ−１インテグラーゼ変異体提示がＤＮＡ結合親和性を変えると記載されてきた。別の例として、インビトロ区画化（in vitro compartmentalization、IVC）が変異体、例えば、ここで記載される発明の変異体などを発生及び特定するための選択系として使用できる。

バクテリオファージ・ラムダ・インテグラーゼは、大型のチロシン・リコンビナーゼ・ファミリーの原型的なメンバーである。通常、バクテリオファージ・ラムダ・インテグラーゼは、動的組み換え遺伝子複合体（dynamic recombinogenic complex）を形成する高次４量体内で協働する３つの明確なドメインを含む。これらの３つのドメインは、Ｎ末端ＤＮＡ結合ドメイン（アミノ酸残基１〜６４）；コアＤＮＡ結合ドメイン（アミノ酸残基６５〜１７５）；及びＣ末端触媒ドメイン（アミノ酸残基１７６〜３５６）である。バクテリオファージ・ラムダ・インテグラーゼは、バクテリオファージのライフサイクルの中心をなし、ホスト細菌染色体への制御された統合及びホスト細胞染色体の外への切除をそれぞれ促進している。その天然の機能において、バクテリオファージ・ラムダ・インテグラーゼは、高エネルギーのコファクターの不在下でａｔｔ部位と呼ばれる１対の標的配列間での部位特異的組み換えを触媒し得る。標的配列（バクテリオファージゲノム中のａｔｔＰ、細菌ゲノム中のａｔｔＢ）は、７ｂｐの「オーバーラップ」領域により分離された７ｂｐの逆向きの１組のコア結合部位を含む。「オーバーラップ領域」及び「オーバーラップ配列」は、ここで使用されるとき、組み換え配列の配列を定義し、そこにおいては、鎖切断及び再ライゲーションを含むＤＮＡ鎖交換が行われ、野生型ａｔｔ部位におけるコンセンサスＤＮＡ配列５’−ＴＴＴＡＴＡＣ−３’又は機能的なヌクレオチド置換を有する前記配列に関連している。バクテリオファージ・ラムダ・インテグラーゼ・ＤＮＡコア結合ドメインは、主に７ｂｐのａｔｔＰ×ａｔｔＢ・コア・ＤＮＡ配列モチーフを認識する。非常に長いａｔｔＰ部位において、コア配列の横には、アクセサリーＤＮＡ結合ファクター、例えば、組み込み宿主因子（ＩＨＦ）、逆転刺激因子（factor for inversion stimulation、ＦＩＳ）及び除去酵素（excisionase、Ｘｉｓ）などのための結合部位が配置されている。これらのアクセサリー部位に加えて、バクテリオファージ・ラムダ・インテグラーゼのＮ末端ドメインのための幾つかの「アーム」結合部位がａｔｔＰコア部位に隣接している。バクテリオファージ・ラムダ・インテグラーゼのＮ末端の「アーム」結合への結合は、結合したコア結合及び触媒ドメインをアロステリックに調節して、コア部位に対する親和性を増大させ、それは最終的にＤＮＡ鎖切断及び生産性の高いａｔｔＢ×ａｔｔＰの組み換えを可能にする。そのため、これらの「アーム」領域が、バクテリオファージ・ラムダ・インテグラーゼのＣ末端触媒ドメインによる効率的なＤＮＡ切断の活性化のために必須であり、従って、組み換え方向性の制御に寄与している。

通常、リコンビナーゼ仲介組み換えが２つの認識部位の間で生じるとき、当該組み換え反応は、２つの異なる分子において、又は同じ分子内の何れかで生じ得る（例えば、標的配列上の認識部位とドナー配列上の認識部位との間）。これに関連して、ここで記載されるラムダ・インテグラーゼは、分子間若しくは分子内何れかの組み換え反応、又は分子間及び分子内両者の組み換え反応を触媒し得る。

ここで使用されるとき、「部位特異的組み換え」又は「配列特異的組み換え」は、それぞれ少なくとも１つの認識部位又は少なくとも１つの非コグネイト部位を含む２つのヌクレオチド配列間の組み換えを指す。「部位特異的」は、特定のヌクレオチド配列でということを意味し、それは、例えば、ホスト細胞のゲノム中の特定の位置においてということであり得る。ヌクレオチド配列は、ホストゲノムにおけるその天然の位置若しくは当該ゲノムの何れか別の位置の何れかの位置で、ホスト細胞に対して内因性であってもよく、或いはそれは、様々な公知の方法の何れかによってホスト細胞のゲノムに対して予め挿入された異種のヌクレオチド配列であってもよい。

ここで記載されるとき、「認識部位」又は「コグネイト部位（cognate site）」は、リコンビナーゼタンパク質によって認識されるヌクレオチド配列を指す。「認識部位」は、リコンビナーゼタンパク質及び何れかの関連するアクセサリータンパク質よって、結合、切断及び鎖交換が実施されるヌクレオチド配列である。ラムダ・インテグラーゼは、ａｔｔＢ、ａｔｔＰ、ａｔｔＬ、ａｔｔＲを含むコグネイト部位及び／又はそのような部位の適切な変異を認識する。ａｔｔＢ及びａｔｔＰ部位は、ラムダ・インテグラーゼによって共に再結合され得るか、また或いはａｔｔＬ及びａｔｔＲ部位がラムダ・インテグラーゼによって再結合され得る。これに関連して、ここで記載されるラムダ・インテグラーゼ（Ｉｎｔ変異体）は、例えば、ａｔｔＢ及びａｔｔＰ部位の間の組み換えを促進し得る。有利に、ここで記載されるラムダ・インテグラーゼは、親のＩｎｔ−ｈ／２１８インテグラーゼに比べて、高い効率性で、非コグネイト部位（例えば、ａｔｔＨ部位）に再結合され得る。

もう１つの実施形態において、ここで記載されるラムダ・インテグラーゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子が提供される。

遺伝暗号の縮退が、あるコドンの同じアミノ酸を規定する他のコドンによる置換を可能にし、それによって同じタンパク質を生じさせることは十分に理解されるものであるし、本発明は、特定の核酸分子に限定するものではなく、ここで記載されるラムダ・インテグラーゼをコードしているヌクレオチド配列を含む全ての核酸分子を含むものである。

１つの実施形態において、核酸分子は、核酸分子の発現を可能にするための調節配列に稼働可能に連結されている。

遺伝子配列発現のために必要とされる調節領域の正確な特質は、有機体によって異なり得ることは十分に理解されるものであろうが、一般には、プロモーター領域を含むべきであり、それは、原核生物においては、プロモーターだけ、又はＲＮＡ転写開始を方向付けるプロモーター領域と、ＲＮＡに転写されたときに合成の開始を合図するＤＮＡ配列との両者を含む。そのような領域は、通常は、発現されるべきヌクレオチド配列の５’及び３’に位置し、転写及び翻訳の開始に関連する非コーディング領域、例えば、ＴＡＴＡボックス、キャッピング配列及びＣＡＡＴ配列などを含み得る。これらの領域は、例えば、エンハンサー、又は本発明の組み換えラムダ・インテグラーゼを産生するために使用されるホスト細胞の特定の区画に対して産生されたポリペプチドを対象にする翻訳されたシグナル及びリーダー配列を含み得る。１つの実施形態において、調節配列はプロモーター配列を含む。

幾つかの実施形態において、本発明の核酸は、細胞内で機能する転写開始領域、及び細胞内で機能する転写終結領域を含む。使用され得る適切なプロモーター配列は、例えば、ｌａｃプロモーター、ｔｅｔプロモーター、又は細菌性発現の場合のＴ７プロモーターなどである。真核細胞系における発現に適切なプロモーターの例は、ＳＶ４０プロモーターである。

更なる実施形態において、核酸分子は、ベクター、特に発現ベクターに含まれる。そのような発現ベクターは、上述の調節配列に加えて、ラムダ・インテグラーゼをコードする核酸配列、５’及び／又は３’方向でラムダ・インテグラーゼをコードする核酸配列に隣接する制限切断部位をコードする配列を含み得る。このベクターはまた、発現されるべきタンパク質をコードする別の核酸配列の導入を可能にする。発現ベクターはまた、発現のために使用されるべきホストに適合する種に由来する複製部位及び制御配列を含み得る。発現ベクターは、当業者に周知のプラスミド、例えば、ｐＢＲ３２２、ｐｕＣ１６、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（ＲＴＭ）などに基づき得る。

１つの実施形態において、核酸分子を含むホスト細胞も提供される。核酸分子を含むベクターは、遺伝子を発現できるホスト細胞にトランスフォームされ得る。形質転換（トランスフォーメーション）は、標準的な方法に従って実行され得る。これに関連して、形質転換されたホスト細胞は、ラムダ・インテグラーゼをコードするヌクレオチド配列のために適切な条件下で培養され得る。ホスト細胞は、血清を含まない条件下に、任意には動物起源の何れのタンパク質／ペプチドも含まない培地中に、確立、適合及び完全に培養され得る。市販の培地、例えば、ＲＰＭＩ−１６４０（シグマ）、ダルベッコ改変イーグル培地 （ＤＭＥＭ；シグマ）、最小必須培地（ＭＥＭ；シグマ）、ＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭＩＩ（インビトロジェン）、無血清ＣＨＯ培地（シグマ）及び無タンパク質ＣＨＯ培地（シグマ）などは、例示的な適切な栄養溶液である。何れの培地も、必要に応じて様々な化合物が補充されてもよく、その例は、ホルモン及び／又は他の成長因子（例えば、インスリン、トランスフェリン、上皮細胞増殖因子、インスリン様成長因子）、塩（例えば、塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、リン酸）、バッファー（例えば、ＨＥＰＥＳ）、ヌクレオシド（例えば、アデノシン、チミジン）、グルタミン、グルコース又は他の等価エネルギー源、抗生物質、微量元素である。何れの他の必要な補充物もまた、当業者に公知の適切な濃度で含まれ得る。

更なるもう１つの実施形態において、興味のある核酸を標的核酸中に組み換える方法が提供される。当該方法は、ここで記載されるラムダ・インテグラーゼの存在下で、興味のある核酸を含む対象核酸を、標的核酸と接触させることを含む。

幾つかの実施形態において、標的核酸に興味のある核酸を組み換える方法は、配列特異的組み換えである。配列特異的組み換えは、１つ以上のコファクターの存在下で行われ得る。コファクターは、組み込み宿主因子（integration host factor、ＩＨＦ）、逆転刺激因子（ＦＩＳ）及び除去酵素（Ｘｉｓ）からなる群より選択され得る。

「対象核酸（targeting nucleic acid）」は、ここで使用されるとき、少なくとも１つの認識部位を含むヌクレオチド配列を指示する。対象核酸は、標的核酸（target nucleic acid）内に対して興味のある核酸を組み込むために、本発明の変異体の存在下で当該標的核酸と接触できる。対象ヌクレオチド配列は、遺伝子、発現カセット、プロモーター、分子マーカー、前記何れかの一部などであり得る。幾つかの実施形態において、対象核酸は、ベクターであり得る。別の実施形態において、対象核酸は、ａｔｔＰＨ配列（配列番号８）及びａｔｔＰ４Ｘ配列（配列番号９）からなる群から選択される配列を含む。用語「興味のある核酸（nucleic acid of interest）」は、ここで使用されるとき、興味のある産物をコードする何れかの長さのポリヌクレオチド配列を指す。選択される配列は、全長又は切断遺伝子、融合又はタグ付き遺伝子であってもよく、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ又はＤＮＡフラグメントであってもよい。またそれは、天然配列、即ち、天然に存在する形態であってもよく、突然変異したものであってもよく、或いは別のやり方で所望通り修飾されていてもよい。これらの修飾は、選択された細胞又はホスト細胞におけるコドン使用を最適化するためのコドン最適化、ヒト化又はタグ付けを含み得る。選択された配列は、分泌された、細胞質の、核の、膜結合型の、又は細胞表面ポリペプチドをコード化し得る。「興味のある産物」は、これらに限定するものではないが、タンパク質、ポリペプチド、それらのフラグメント、ペプチド、アンチセンスＲＮＡを含んでいてもよく、それらの全ては、選択されたホスト細胞内で産生され得る。

１つの実施形態において、ゲノムＤＮＡは、細胞内に含まれる。ここで記載される方法は、全ての真核細胞において実行され得る。細胞及び細胞株が、例えば、細胞培養物中に提示されてもよく、これらに限定するものではないが、真核細胞、例えば、酵母、植物、昆虫又は哺乳類細胞を含み得る。例えば、細胞は、卵母細胞、胚幹細胞、造血幹細胞又は何れかの種類の分化した細胞であり得る。幾つかの実施形態において、本発明の方法は、哺乳類細胞中で実施され得る。哺乳類細胞株は、これらに限定するものではないが、ヒト、類人猿、ネズミ科の動物、マウス、ラット、サル、ウサギ、齧歯動物、ハムスター、ヤギ、ウシ、ヒツジ又はブタ細胞株を含み得る。例示的な細胞株は、これらに限定するものではないが、チャイニーズハムスター卵巣由来樹立細胞株（ＣＨＯ）細胞、マウス骨髄腫細胞、例えば、ＮＳＯ及びＳｐ２／０細胞、ＣＯＳ細胞、Ｈｅｌａ細胞及びヒト胚腎臓（ＨＥＫ−２９３）細胞を含み得る。

標的核酸は、ＤＮＡを含み得る。ＤＮＡはゲノムであり得る。

１つの実施形態において、標的核酸は、ａｔｔＨ配列（配列番号７）及びａｔｔＨ４Ｘ配列（配列番号３１）からなる群より選択される配列を含む。対象核酸は、ベクターであり得る。１つの実施形態において、対象核酸は、ａｔｔＨ配列（配列番号７）及びａｔｔＨ４Ｘ配列（配列番号３１）からなる群より選択される配列を含む。

もう１つの実施形態において、配列特異的組み換えは、１つ以上のコファクターの存在下で実施され得る。コファクターは、ＸＩＳ、ＦＩＳ及びＩＨＦからなる群より選択され得る。

もう１つの実施形態において、興味のある核酸が挿入できる対象核酸、並びにラムダ・インテグラーゼ又はここで記載される核酸を含む配列特異的組み換えキットが提供される。

ここで記載されるキットは、対象核酸中に興味のある核酸を挿入するための少なくとも１つの試薬を含み得る。当該試薬は、制限酵素又はリガーゼであり得る。もう１つの実施形態において、対象核酸は、ａｔｔＨ配列（配列番号７）及びａｔｔＨ４Ｘ配列（配列番号３１）からなる群より選択される配列を含み得る。

１つの実施形態において、ここで記載されるキットは、更にバッファー（単数又は複数）及び／又は問題の標的核酸によって興味のある核酸を組み換えるための説明書を含み得る。

１つの実施形態において、ここで記載されるキットは更に、達成された配列特異的組み換えイベントを決定するための少なくとも１つの試薬を含み得る。１つの実施形態において、試薬成分は、プライマー対である。プライマー対は、キットと組み合わせて提供されてもよく、又はキットとは別々に提供されてもよい。

添付の図面は、開示された実施形態を図解するものであり、当該開示された実施形態の原理を説明する役目を担っている。しかしながら、当該図面は、説明することをのみを目的として描かれており、本発明の制限を定義するものではないと理解されるべきである。
図１は、コア細菌ａｔｔＢ、並びにヒトａｔｔＨ及びａｔｔＨ４Ｘ配列の配列アラインメントを示す。灰色に強調された７塩基対（ｂｐ）は、オーバーラップ配列を示し、これは両組み換えパートナー、即ち、ａｔｔＢとａｔｔＰ、ａｔｔＨとａｔｔＰＨ、ａｔｔＨ４ＸとａｔｔＰ４Ｘにおいて等しいはずである。ａｔｔＨ部位は、７ｂｐオーバーラップ配列中の１か所及び右側アームコア結合配列中の３か所で細菌性のａｔｔＢ部位とは異なる。非コグネイトａｔｔＨ４Ｘ配列は、ヒトＬｉｎｅ１（long interspersed nuclear elements/remnants of retrotransposons/non-coding）の一部としてヒトゲノム中に約９４０回発生する。ａｔｔＨ４Ｘ配列の最初の３つのヌクレオチドは、縮退である。 図２は、ＤＮＡミニサークル及びラムダ・インテグラーゼ技術を使用する迅速大腸菌染色体統合の方法を示す。第１の工程は、適切なプロモーター（例えば、Ｔ７）の制御下にあるラムダ・インテグラーゼを含むミニサークル、並びに安定に統合されるべき遺伝子、抗生物質耐性のための選択可能なマーカー（例えば、ラクタマーゼ遺伝子カセット）及びａｔｔＰ部位を含むミニサークルを含むミニサークルを作出することである。第２の工程は、両方のミニサークルをエレクトロポレーション又は熱ショックによって大腸菌にトランスフォームし、その後、プレートに播種し、選択培地（例えば、アンピシリンプレート）上で培養することである。第３の工程は、ＰＣＲ、シーケンシング及びサザンブロットによりａｔｔＢ部位への統合を確認することである。 図３Ａは、図２に記載された適切なミニサークルで形質転換された後に１００μｇ／ｍＬ（１Ｘ）及び７０μｇ／ｍＬ（０．７Ｘ）アンピシリンプレート上で増殖したコロニーからＰＣＲ増幅により決定された通りのインテグラーゼバリアントＣ３により仲介された、大腸菌染色体ＤＮＡのａｔｔＢ部位への外因性ＤＮＡ（ラクタマーゼ遺伝子カセット）のインビボ組み換えを示す。染色体統合は、内因性ａｔｔＢ部位、ｅｃｏｌｉａｔｔＢＦ（配列番号１６）及びｅｃｏｌｉａｔｔＢＲ（配列番号１７）に隣接するＰＣＲプライマーを使用して検証された。統合がないときに、予測されるＰＣＲ産物は、〜２００ｂｐ（コロニー１、５、６について示される通り）である。ラクタマーゼ遺伝子カセットの統合は、〜１６５０ｂｐのＰＣＲ産物（コロニー２、４、７〜１０）をもたらす。 図３Ｂは、親のＩｎｔ−ｈ／２１８又はＣ３インテグラーゼにより仲介される大腸菌のａｔｔＢへの統合を対比する。親のＩｎｔ−ｈ／２１８が使用されたときには、２つのコロニーのみが観察された（その両方が、即ち、１００％が、正確に挿入されたラクタマーゼカセットを有した）。Ｃ３の場合では、２７コロニーが観察された。これらのうちの１０コロニーが試験され、９コロニー（９０％）が正確に挿入されたラクタマーゼカセットを示した。従って、２７コロニーについて、我々は、〜９０％（〜２４コロニー）が正確に挿入されたラクタマーゼカセットを含んだことを予測できる。これは、〜１２倍（２４を２で除算する）の改善に相当する。 図３Ｃは、Ｃ３含有ラクタマーゼカセットを使用して生じたインテグラント大腸菌コロニーのヌクレオチド配列を示す。当該カセットに隣接する細菌染色体のＤＮＡは、小文字としている。ａｔｔＢ及びａｔｔＰの組み換えを経て生じたａｔｔＬ及びａｔｔＲ部位は、下線を付され、太字としている。ラクタマーゼ・オープン・リーディング・フレームは、太字とした。 図４Ａは、コグネイト（ａｔｔＢ／ａｔｔＰ）及び非コグネイト（ａｔｔＨ／ａｔｔＰＨ及びａｔｔＨ４ｘ／ａｔｔＰ４ｘ）部位のためのインビトロ転写／翻訳システムを使用して発現された、親及び示されたラムダ・インテグラーゼ変異体の改善された分子内組み換え活性を示す。組み換えは、ａｔｔＢ／Ｐ基質での相対的な親のＩｎｔ−ｈ／２１８の効率を示す（１と設定する）。本発明の変異体ラムダ・インテグラーゼ・タンパク質（Ｃ２及びＣ３）は、それぞれの組み換え反応の実行時に、より高効率である。Ｃ２は、Ｄ３３６Ｖ変異を有するラムダ・インテグラーゼ変異体を示す。Ｉ４３Ｆ Ｃ２は、更にＩ４３Ｆ変異を有するＣ２・ラムダ・インテグラーゼ変異体を示す。Ｃ３は、Ｉ４３Ｆ、Ｅ３１９Ｇ、Ｄ３３６Ｖ変異を有するラムダ・インテグラーゼ変異体を示す。Ｎ＝２、バーは平均値±ＳＤを示す。 図４Ｂは、示された基質における親Ｉｎｔ−ｈ／２１８及びＣ３インテグラーゼの分子内組み換え活性を示す。分子内組み換えは、ａｔｔＢ／ａｔｔＰ部位、ａｔｔＨ／ａｔｔＰＨ部位又はａｔｔＨ４ｘ／ａｔｔＰ４ｘ部位の何れかを含む１０ｎｇのプラスミド基質でインキュベートされた５μｇの精製組み換えインテグラーゼ・タンパク質を用いて行われた。当該反応液容量は、２５μＬであり、１．５時間３７℃で、組み換えバッファー（１００ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．５、５００ｍＭのＮａＣｌ、２５ｍＭのＤＴＴ、１０ｍＭのＥＤＴＡ、５ｍｇ／ｍＬのウシ血清アルブミン）中で行われた。反応液は、組み換え効率のリアルタイムＰＣＲ定量のために２μＬを採取する前に１／１０に希釈された。リアルタイムＰＣＲ定量は、各々２５０ｎＭのプライマーｐＬＩＲ−Ｆ１（配列番号２７）及びｐＬＩＲ−Ｒ１（配列番号２８）を用いて、エッソアドバンスド^ＴＭ・ユニバーサル・ＳＹＢＲ（登録商標）グリーン・スーパーミックス（SsoAdvance（登録商標） Universal SYBR^R Green Supermix）を含む終容量２０μＬ中で行った。組み換えインテグラーゼ・タンパク質の活性は、ａｔｔＢ／ａｔｔＰプラスミド基質（値が１として設定）におけるＩｎｔ−ｈ／２１８の相対的な活性で示される。エラーバーは、２つの独立した実験の平均値±ＳＤを示す。 図５Ａは、ａｔｔＢ及びａｔｔＰ部位を有するＨＴ１０８０細胞株内のエピソーム性プラスミド基質のＣ末端核局在性配列（Ｃ２−Ｎ）を備えない、又は備える変異体インテグラーゼＣ２の分子内組み換え効率を示す。Ｙ軸は、パーセントｅＧＦＰ陽性細胞（ａｔｔＢ／ａｔｔＰ部位間での組み換えを示す）を示し、活性は、ＥＧＦＰベクタートランスフェクション（１００％）により決定された、相対的なトランスフェクション効率で示される。変異体Ｃ２は、ａｔｔＢとａｔｔＰとをＩｎｔ−ｈ／２１８に比べてより効率的に組み換えた。 図５Ｂは、ａｔｔＨ及びａｔｔＰＨ部位を有するＨＴ１０８０細胞株内のエピソーム性プラスミド基質のＣ末端核局在性配列（Ｃ２−Ｎ）を備えない、又は備える変異体インテグラーゼＣ２の分子内組み換え効率を示す。Ｙ軸は、パーセントｅＧＦＰ陽性細胞（ａｔｔＨ／ａｔｔＰＨ部位間での組み換えを示す）を示し、活性は、ＥＧＦＰベクタートランスフェクション（１００％）により決定された、相対的なトランスフェクション効率で示される。変異体Ｃ２は、ａｔｔＨとａｔｔＰＨとをＩｎｔ−ｈ／２１８に比べてより効率的に組み換えた。 図５Ｃは、ａｔｔＢ及びａｔｔＰ部位を有するＨＴ１０８０細胞株内のエピソーム性プラスミド基質の変異体インテグラーゼの分子内組み換え効率を示す。Ｙ軸は、パーセントｅＧＦＰ陽性細胞（ａｔｔＢ／ａｔｔＰ部位間での組み換えを示す）を示し、活性は、ＥＧＦＰベクタートランスフェクション（１００％）により決定された相対的なトランスフェクション効率で示される。変異体Ｃ３は、ａｔｔＢとａｔｔＰとをＩｎｔ−ｈ／２１８又はコドン最適化Ｉｎｔ−ｈ／２１８（ｏｐｔ Ｉｎｔ）に比べてより効率的に組み換えた。 図５Ｄは、ａｔｔＨ及びａｔｔＰＨ部位を有するＨＴ１０８０細胞株内のエピソーム性プラスミド基質の変異体インテグラーゼＣ３の分子内組み換え効率を示す。Ｙ軸は、パーセントｅＧＦＰ陽性細胞（ａｔｔＨ／ａｔｔＰＨ部位間での組み換えを示す）を示し、活性は、ＥＧＦＰベクタートランスフェクション（１００％）により決定された相対的なトランスフェクション効率で示される。変異体Ｃ３は、ａｔｔＨとａｔｔＰＨとをＩｎｔ−ｈ／２１８又はコドン最適化Ｉｎｔ−ｈ／２１８（ｏｐｔ Ｉｎｔ）に比べてより効率的に組み換えた。 図６Ａは、ＨＴ１０８０クローン中のＬ１遺伝子座でのａｔｔＨ４ｘ及びａｔｔＰ４ｘ組み換えイベントについてのスクリーニングＰＣＲの結果を示す。予測されたサイズ（〜１２００ｂｐ；ａｔｔＨ４ｘとａｔｔＰ４ｘとの間の組み換えを経て生じたａｔｔＬ部位について）のＰＣＲ増幅は、ＨＴ１０８０クローン３、１９及び２１について検出された。ｗ，無ＤＮＡテンプレートコントロール；ＨＴ，陰性コントロール（親ＨＴ１０８０細胞からのゲノムＤＮＡ）；Ｉｎａ，ｐＰＧＫｓｓＰｕｒｏ−ａｔｔＰ４ｘ及びｐＣＭＶｓｓＫＺ−Ｉｎａｃｔｉｖｉｅ Ｉｎｔ（不活性化変異を有するインテグラーゼを発現するプラスミドであり、そこにおいて、配列の３４２位のアミノ酸残基チロシンがアミノ酸アラニンによって置換されている）のコトランスフェクションを経て得られたピューロマイシン耐性コロニーからのゲノムＤＮＡ；＋，陽性コントロール（Ｌ１エレメントでのａｔｔＨ４ｘ及びａｔｔＰ４ｘ統合イベントを有するＨＴ１０８０クローンからのゲノムＤＮＡ）；Ｍ，１００ｂｐＤＮＡラダー；１〜３３，ｐＰＧＫｓｓＰｕｒｏ−ａｔｔＰ４ｘ及びｐＣＭＶｓｓＫＺ−ＩｎｔＣ３−ＣＮＬＳのコトランスフェクションを経て得られたピューロマイシン耐性ＨＴ１０８０コロニーからのゲノムＤＮＡ。 図６Ｂは、ＨＴ１０８０クローン３及び１９におけるａｔｔＨ４ｘ及びａｔｔＰ４ｘ間の組み換えを経て生じたａｔｔＬ部位のヌクレオチド配列を示す。ａｔｔＬ配列に隣接するヒトゲノムＤＮＡ配列は小文字とする。ＨＯＰ’配列は、イタリック、太字及び下線付きとする。ａｔｔＬ配列は、下線を付し、太字とする。ＰＧＫプロモーター配列（ｐＰＧＫｓｓＰｕｒｏ−ａｔｔＰ４ｘ対象ベクターの一部、且つピューロマイシン耐性遺伝子の発現を駆動）は大文字とする。各クローンにおいて標的とされるａｔｔＨ４ｘ配列のゲノム遺伝子座は特定されている。

［例］
ベストモード及び比較例を含む、本発明の非限定的な例が、具体例を参照することによってより詳細に更に記載されるが、それらは本発明の範囲を多少なりとも限定するものであるとは解釈されるべきではない。

材料
配列番号１
Ｉｎｔ−ｈ／２１８
MGRRRSHERRDLPPNLYIRNNGYYCYRDPRTGKEFGLGRDRRIAITEAIQANIELFSGHKHKPLTARINSDNSVTLHSWLDRYEKILASRGIKQKTLINYMSKIKAIRRGLPDAPLEDITTKEIAAMLNGYIDEGKAASAKLIRSTLSDAFREAIAEGHITTNHVAATRAAKSKVRRSRLTADEYLKIYQAAESSPCWLRLAMELAVVTGQRVGDLCKMKWSDIVDGYLYVEQSKTGVKIAIPTALHIDALGISMKETLDKCKEILGGETIIASTRREPLSSGTVSRYFMRARKASGLSFEGDPPTFHELRSLSARLYEKQISDKFAQHLLGHKSDTMASQYRDDRGREWDKIEIK。

配列番号２
Ｃ２インテグラーゼ変異体：
MGRRRSHERRDLPPNLYIRNNGYYCYRDPRTGKEFGLGRDRRIAITEAIQANIELFSGHKHKPLTARINSDNSVTLHSWLDRYEKILASRGIKQKTLINYMSKIKAIRRGLPDAPLEDITTKEIAAMLNGYIDEGKAASAKLIRSTLSDAFREAIAEGHITTNHVAATRAAKSKVRRSRLTADEYLKIYQAAESSPCWLRLAMELAVVTGQRVGDLCKMKWSDIVDGYLYVEQSKTGVKIAIPTALHIDALGISMKETLDKCKEILGGETIIASTRREPLSSGTVSRYFMRARKASGLSFEGDPPTFHELRSLSARLYEKQISDKFAQHLLGHKSVTMASQYRDDRGREWDKIEIK。

配列番号３
Ｃ３インテグラーゼ 変異体：
MGRRRSHERRDLPPNLYIRNNGYYCYRDPRTGKEFGLGRDRRFAITEAIQANIELFSGHKHKPLTARINSDNSVTLHSWLDRYEKILASRGIKQKTLINYMSKIKAIRRGLPDAPLEDITTKEIAAMLNGYIDEGKAASAKLIRSTLSDAFREAIAEGHITTNHVAATRAAKSKVRRSRLTADEYLKIYQAAESSPCWLRLAMELAVVTGQRVGDLCKMKWSDIVDGYLYVEQSKTGVKIAIPTALHIDALGISMKETLDKCKEILGGETIIASTRREPLSSGTVSRYFMRARKASGLSFEGDPPTFHELRSLSARLYGKQISDKFAQHLLGHKSVTMASQYRDDRGREWDKIEIK。

配列番号４
ラムダ・インテグラーゼ：
ATGGGAAGAAGGCGAAGTCATGAGCGCCGGGATTTACCCCCTAACCTTTATATAAGAAACAATGGATATTACTGCTACAGGGACCCAAGGACGGGTAAAGAGTTTGGATTAGGCAGAGACAGGCGAATCGCAATCACTGAAGCTATACAGGCCAACATTGAGTTATTTTCAGGACACAAACACAAGCCTCTGACAGCGAGAATCAACAGTGATAATTCCGTTACGTTACATTCATGGCTTGATCGCTACGAAAAAATCCTGGCCAGCAGAGGAATCAAGCAGAAGACACTCATAAATTACATGAGCAAAATTAAAGCAATAAGGAGGGGTCTGCCTGATGCTCCACTTGAAGACATCACCACAAAAGAAATTGCGGCAATGCTCAATGGATACATAGACGAGGGCAAGGCGGCGTCAGCCAAGTTAATCAGATCAACACTGAGCGATGCATTCCGAGAGGCAATAGCTGAAGGCCATATAACAACAAACCATGTCGCTGCCACTCGCGCAGCAAAATCAAAGGTAAGGAGATCAAGACTTACGGCTGACGAATACCTGAAAATTTATCAAGCAGCAGAATCATCACCATGTTGGCTCAGACTTGCAATGGAACTGGCTGTTGTTACCGGGCAACGAGTTGGTGATTTATGCAAAATGAAGTGGTCTGATATCGTAGATGGATATCTTTATGTCGAGCAAAGCAAAACAGGCGTAAAAATTGCCATCCCAACAGCATTGCATATTGATGCTCTCGGAATATCAATGAAGGAAACACTTGATAAATGCAAAGAGATTCTTGGCGGAGAAACCATAATTGCATCTACTCGTCGCGAACCGCTTTCATCCGGCACAGTATCAAGGTATTTTATGCGCGCACGAAAAGCATCAGGTCTTTCCTTCGAAGGGGATCCGCCTACCTTTCACGAGTTGCGCAGTTTGTCTGCAAGACTCTATGAGAAGCAGATAAGCGATAAGTTTGCTCAACATCTTCTCGGGCATAAGTCGGACACCATGGCATCACAGTATCGTGATGACAGAGGCAGGGAGTGGGACAAAATTGAAATCAAATAA。

配列番号５
ａｔｔＢ： CTGCTTTTTT ATACTAACTT G。

配列番号６
ａｔｔＰ: CAGCTTTTTT ATACTAAGTT G。

配列番号７
ａｔｔＨ： CTGCTTTCTT ATACCAAGTG G。

配列番号８
ａｔｔＰＨ： CAGCTTTCTT ATACCAAGTT G。

配列番号９
ａｔｔＰ４Ｘ： CAGCTTTATT TCATTAAGTT G。

配列番号１０
ｐｅｔＦ２： CATCGGTGATGTCGGCGAT。

配列番号１１
ｐｅｔＲ： CGGATATAGTTCCTCCTTTCAGCA。

配列番号１２
ａｔｔＰ−Ｆ： cacagaattcCGT CTG TTA CAG GTC ACT AAT ACC ATC T。

配列番号１３
ａｔｔＰＳＯＥ−Ｒ： ACA TTT CCC CGA AAA GTG CCA CCT GAA CAT CAC CGG GAA ATC AAA TAA TGA T。

配列番号１４
ＴＥＭ１ｐｒｏｍ−Ｆ： TTC AGG TGG CAC TTT TCG GGG AAA TGT。

配列番号１５
ＴＥＭ１ｐｒｏｍ−Ｒ： TGT GGA ATT CCT ACA CTA GAA GGA CAG TAT TTG GTA TCT GC。

配列番号１６
ＥｃｏｌｉＡｔｔＢ−Ｆ： CTG AAA ATG TGT TCA CAG GTT GCT。

配列番号１７
ＥｃｏｌｉａｔｔＢ−Ｒ： GCA ATG CCA TCT GGT ATC ACT。

配列番号１８
Ｃ２遺伝子配列：
ATGGGAAGAAGGCGAAGTCATGAGCGCCGGGATTTACCCCCTAACCTTTATATAAGAAACAATGGATATTACTGCTACAGGGACCCAAGGACGGGTAAAGAGTTTGGATTAGGCAGAGACAGGCGAATCGCAATCACTGAAGCTATACAGGCCAACATTGAGTTATTTTCAGGACACAAACACAAGCCTCTGACAGCGAGAATCAACAGTGATAATTCCGTTACGTTACATTCATGGCTTGATCGCTACGAAAAAATCCTGGCCAGCAGAGGAATCAAGCAGAAGACACTCATAAATTACATGAGCAAAATTAAAGCAATAAGGAGGGGTCTGCCTGATGCTCCACTTGAAGACATCACCACAAAAGAAATTGCGGCAATGCTCAATGGATACATAGACGAGGGCAAGGCGGCGTCAGCCAAGTTAATCAGATCAACGCTGAGCGATGCATTCCGAGAGGCAATAGCTGAAGGCCATATAACAACAAACCATGTCGCTGCCACTCGCGCAGCAAAGTCAAAGGTAAGGAGATCAAGACTTACGGCTGACGAATACCTGAAAATTTATCAAGCAGCAGAATCATCACCATGTTGGCTCAGACTTGCAATGGAACTGGCTGTTGTTACCGGGCAACGAGTTGGTGACTTGTGCAAAATGAAGTGGTCTGATATCGTAGATGGATATCTTTATGTCGAGCAAAGCAAAACAGGCGTAAAAATTGCCATCCCAACAGCATTGCATATTGATGCTCTCGGAATATCAATGAAGGAAACACTTGATAAATGCAAAGAGATTCTTGGCGGAGAAACCATAATTGCATCTACTCGTCGCGAACCGCTTTCATCCGGCACAGTATCAAGGTATTTTATGCGCGCACGAAAAGCATCAGGTCTTTCCTTCGAAGGGGATCCGCCTACCTTTCACGAGTTGCGCAGTTTGTCTGCAAGACTCTATGAGAAGCAGATAAGCGATAAGTTTGCTCAACATCTTCTCGGGCATAAGTCGGTCACCATGGCATCACAGTATCGTGATGACAGAGGCAGGGAGTGGGACAAAATTGAAATCAAATAA。

配列番号１９
Ｃ３遺伝子配列：
ATGGGAAGAAGGCGAAGTCATGAGCGCCGGGATTTACCCCCTAACCTTTATATAAGAAACAATGGATATTACTGCTACAGGGACCCAAGGACGGGTAAAGAGTTTGGATTAGGCAGAGACAGGCGATTCGCAATCACTGAAGCTATACAGGCCAACATTGAGTTATTTTCAGGACACAAACACAAGCCTCTGACAGCGAGAATCAACAGTGATAATTCCGTTACGTTACATTCATGGCTTGATCGCTACGAAAAAATCCTGGCCAGCAGAGGAATCAAGCAGAAGACACTCATAAATTACATGAGCAAAATTAAAGCAATAAGGAGGGGTCTGCCTGATGCTCCACTTGAAGACATCACCACAAAAGAAATTGCGGCAATGCTCAATGGATACATAGACGAGGGCAAGGCGGCGTCAGCCAAGTTAATCAGATCAACGCTGAGCGATGCATTCCGAGAGGCAATAGCTGAAGGCCATATAACAACAAACCATGTCGCTGCCACTCGCGCGGCAAAGTCAAAGGTAAGGAGATCAAGACTTACGGCTGACGAATACCTGAAAATTTATCAAGCAGCAGAATCATCACCATGTTGGCTCAGACTTGCAATGGAACTGGCTGTTGTTACCGGGCAACGAGTTGGTGACTTGTGCAAAATGAAGTGGTCTGATATCGTAGATGGATATCTTTATGTCGAGCAAAGCAAAACAGGCGTAAAAATTGCCATCCCAACAGCATTGCATATTGATGCTCTCGGAATATCAATGAAGGAAACACTTGATAAATGCAAAGAGATTCTTGGCGGAGAAACCATAATTGCATCTACTCGTCGCGAACCGCTCTCATCCGGCACAGTATCAAGGTATTTTATGCGCGCACGAAAAGCATCAGGTCTTTCCTTCGAAGGGGATCCGCCTACCTTTCACGAGTTGCGCAGTTTGTCTGCAAGACTCTATGGGAAGCAGATAAGCGATAAGTTTGCTCAACATCTTCTCGGGCATAAGTCGGTCACCATGGCATCACAGTATCGTGATGACAGAGGCAGGGAGTGGGACAAAATTGAAATCAAATAA。

配列番号２０
Ｃ３ミニサークル：
CATCGGTGATGTCGGCGATATAGGCGCCAGCAACCGCACCTGTGGCGCCGGTGATGCCGGCCACGATGCGTCCGGCGTAGAGGATCGAGATCTCGATCCCGCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGGAATTGTGAGCGGATAACAATTCCCCTCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGGGAAGAAGGCGAAGTCATGAGCGCCGGGATTTACCCCCTAACCTTTATATAAGAAACAATGGATATTACTGCTACAGGGACCCAAGGACGGGTAAAGAGTTTGGATTAGGCAGAGACAGGCGATTCGCAATCACTGAAGCTATACAGGCCAACATTGAGTTATTTTCAGGACACAAACACAAGCCTCTGACAGCGAGAATCAACAGTGATAATTCCGTTACGTTACATTCATGGCTTGATCGCTACGAAAAAATCCTGGCCAGCAGAGGAATCAAGCAGAAGACACTCATAAATTACATGAGCAAAATTAAAGCAATAAGGAGGGGTCTGCCTGATGCTCCACTTGAAGACATCACCACAAAAGAAATTGCGGCAATGCTCAATGGATACATAGACGAGGGCAAGGCGGCGTCAGCCAAGTTAATCAGATCAACGCTGAGCGATGCATTCCGAGAGGCAATAGCTGAAGGCCATATAACAACAAACCATGTCGCTGCCACTCGCGCGGCAAAGTCAAAGGTAAGGAGATCAAGACTTACGGCTGACGAATACCTGAAAATTTATCAAGCAGCAGAATCATCACCATGTTGGCTCAGACTTGCAATGGAACTGGCTGTTGTTACCGGGCAACGAGTTGGTGACTTGTGCAAAATGAAGTGGTCTGATATCGTAGATGGATATCTTTATGTCGAGCAAAGCAAAACAGGCGTAAAAATTGCCATCCCAACAGCATTGCATATTGATGCTCTCGGAATATCAATGAAGGAAACACTTGATAAATGCAAAGAGATTCTTGGCGGAGAAACCATAATTGCATCTACTCGTCGCGAACCGCTCTCATCCGGCACAGTATCAAGGTATTTTATGCGCGCACGAAAAGCATCAGGTCTTTCCTTCGAAGGGGATCCGCCTACCTTTCACGAGTTGCGCAGTTTGTCTGCAAGACTCTATGGGAAGCAGATAAGCGATAAGTTTGCTCAACATCTTCTCGGGCATAAGTCGGTCACCATGGCATCACAGTATCGTGATGACAGAGGCAGGGAGTGGGACAAAATTGAAATCAAACATCATCACCATCACCACTAATGAGAATTCgagctccgtcgacaagcttgcggccgcactcgagcaccaccaccaccaccactgagatccggctgctaacaaagcccgaaaggaagctgagttggctgctgccaccgctgagcaataactagcataaccccttggggcctctaaacgggtcttgaggggttttttgctgaaaggaggaactatatccg。

配列番号２１
ａｔｔＰ−ＴＥＭ１：
cacagaattcCGtctgttacaggtcactaataccatctaagtagttgattcatagtgactgcatatattgtgttttacagtattatgtagtctgttttttatgcaaaatctaatttaatatattgatatttatatcattttacgtttctcgttcagcttttttatactaagttggcattataaaaaagcattgcttatcaatttgttgcaacgaacaggtcactatcagtcaaaataaaatcattatttgATTTCCCGGTGATGttcaggtggcacttttcggggaaatgtgcgcggaacccctatttgtttatttttctaaatacattcaaatatgtatccgctcatgagacaataaccctgataaatgcttcaataatattgaaaaaggaagagtatgagtattcaacatttccgtgtcgcccttattcccttttttgcggcattttgccttcctgtttttgctcacccagaaacgctggtgaaagtaaaagatgctgaagatcagttgggtgcacgagtgggttacatcgaactggatctcaacagcggtaagatccttgagagttttcgccccgaagaacgttttccaatgatgagcacttttaaagttctgctatgtggcgcggtattatcccgtattgacgccgggcaagagcaactcggtcgccgcatacactattctcagaatgacttggttgagtactcaccagtcacagaaaagcatcttacggatggcatgacagtaagagaattatgcagtgctgccataaccatgagtgataacactgcggccaacttacttctgacaacgatcggaggaccgaaggagctaaccgcttttttgcacaacatgggggatcatgtaactcgccttgatcgttgggaaccggagctgaatgaagccataccaaacgacgagcgtgacaccacgatgcctgcagcaatggcaacaacgttgcgcaaactattaactggcgaactacttactctagcttcccggcaacaattaatagactggatggaggcggataaagttgcaggaccacttctgcgctcggcccttccggctggctggtttattgctgataaatctggagccggtgagcgtgggtctcgcggtatcattgcagcactggggccagatggtaagccctcccgtatcgtagttatctacacgacggggagtcaggcaactatggatgaacgaaatagacagatcgctgagataggtgcctcactgattaagcattggtaactgtcagaccaagtttactcatatatactttagattgatttaaaacttcatttttaatttaaaaggatctaggtgaagatcctttttgataatctcatgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagctaccaactctttttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaatactgtccttctagtgtagccgtagttagg。

配列番号２２
ＨＯＰ’：ATGCTTTATTTCATTAAGTTG。

配列番号２３
ａｔｔＬ：
GCATTATAAAAAAGCATTGCTTATCAATTTGTTGCAACGAACAGGTCACTATCAGTCAAAATACAATCATTATTTGATTTCAATTTTGTCCCACTCCCTCCCG。

配列番号２４
ＰＧＫプロモーター：
AATTCTACCGGGTAGGGGAGGCGCTTTTCCCAAGGCAGTCTGGAGCATGCGCTTTAGCAGCCCCGCTGGGCACTTGGCGCTACACAAGTGGCCTCTGGCCTCGCACACATTCCACATCCACCGGTAGGCGCCAACCGGCTCCGTTCTTTGGTGGCCCCTTCGCGCCACCTTCTACTCCTCCCCTAGTCAGGAAGTTCCCCCCCGCCCCGCAGCTCGCGTCGTGCAGGACGTGACAAATGGAAGTAGCACGTCTCACTAGTCTCGTGCAGATGGACAGCACCGCTGAGCAATGGAAGCGGGTAGGCCTTTGGGGCAGCGGCCAATAGCAGCT。

配列番号２５
ＨＯＰ’ａｔｔＨ４Ｘ＿Ｆ１： GAGTGTTTTCCAACTTGGTTCCATT。

配列番号２６
ＰｕｒｏＲｅｖ２４： CACCGTGGGCTTGTACTCGGTC。

配列番号２７
ｐＬＩＲ−Ｆ１： CTGCATCGATTCAGCTAGCTG。

配列番号２８
ｐＬＩＲ−Ｒ１： CTGATAGTGACCTGTTCGTTGC。

配列番号２９
ｐＰＧＫｓｓＰｕｒｏ−ａｔｔＰ４ｘ（対象ベクター）：
gaattcctctgttacaggtcactaataccatctaagtagttgattcatagtgactgcatatgttgtgttttacagtattatgtagtctgttttttatgcaaaatctaatttaatatattgatatttatatcattttacgtttctcgttcagctttatttcattaagttggcattataaaaaagcattgcttatcaatttgttgcaacgaacaggtcactatcagtcaaaataaaatcattatttgatttcaattttgtcccactccctcccgaattctaccgggtaggggaggcgcttttcccaaggcagtctggagcatgcgctttagcagccccgctggcacttggcgctacacaagtggcctctggcctcgcacacattccacatccaccggtagcgccaaccggctccgttctttggtggccccttcgcgccacttctactcctcccctagtcaggaagtttcccccccgccccgcagctcgcgtcgtgcaggacgtgacaaatggaagtagcacgtctcactagtctcgtgcagatggacagcaccgctgagcaatggaagcgggtaggcctttggggcagcggccaatagcagctttgctccttcgctttctgggctcagaggctgggaaggggtgggtccgggggcgggctcaggggcgggctcaggggcggggcgggcgcccgaaggtcctccggaggcccggcattctgcacgcttcaaaagcgcacgtctgccgcgctgttctcctcttcctcatctccgggcctttcgaccaattcgctgtctgcgagggccagctgttggggtgagtactccctctcaaaagcgggcatgacttctgcgctaagattgtcagtttccaaaaacgaggaggatttgatattcacctggcccgcggtgatgcctttgagggtggccgcgtccatctggtcagaaaagacaatctttttgttgtcaagcttgaggtgtggcaggcttgagatctggccatacacttgagtgacaatgacatccactttgcctttctctccacaggtgtccactcccaggtccaactgcagatgaccgagtacaagcccacggtgcgcctcgccacccgcgacgacgtcccccgggccgtacgcaccctcgccgccgcgttcgccgactaccccgccacgcgccacaccgtcgacccggaccgccacatcgagcgggtcaccgagctgcaagaactcttcctcacgcgcgtcgggctcgacatcggcaaggtgtgggtcgcggacgacggcgccgcggtggcggtctggaccacgccggagagcgtcgaagcgggggcggtgttcgccgagatcggcccgcgcatggccgagttgagcggttcccggctggccgcgcagcaacagatggaaggcctcctggcgccgcaccggcccaaggagcccgcgtggttcctggccaccgtcggcgtctcgcccgaccaccagggcaagggtctgggcagcgccgtcgtgctccccggagtggaggcggccgagcgcgccggggtgcccgccttcctggagacctccgcgccccgcaacctccccttctacgagcggctcggcttcaccgtcaccgccgacgtcgaggtgcccgaaggaccgcgcacctggtgcatgacccgcaagcccggtgcctgatctagagctcgctgatcagcctcgactgtgccttctagttgccagccatctgttgtttgcccctcccccgtgccttccttgaccctggaaggtgccactcccactgtcctttcctaataaaatgaggaaattgcatcgcattgtctgagtaggtgtcattctattctggggggtggggtggggcaggacagcaagggggaggattgggaagacaatagcaggcatgctggggatgcggtgggctctatggcttctgaggcggaaagaaccagctggggctcgagatccactagttctagcctcgaggctagagcggccgccaccgcggtggagctccaattcgccctatagtgagtcgtattacgcgcgctcactggccgtcgttttacaacgtcgtgactgggaaaaccctggcgttacccaacttaatcgccttgcagcacatccccctttcgccagctggcgtaatagcgaagaggcccgcaccgatcgcccttcccaacagttgcgcagcctgaatggcgaatgggacgcgccctgtagcggcgcattaagcgcggcgggtgtggtggttacgcgcagcgtgaccgctacacttgccagcgccctagcgcccgctcctttcgctttcttcccttcctttctcgccacgttcgccggctttccccgtcaagctctaaatcgggggctccctttagggttccgatttagtgctttacggcacctcgaccccaaaaaacttgattagggtgatggttcacgtagtgggccatcgccctgatagacggtttttcgccctttgacgttggagtccacgttctttaatagtggactcttgttccaaactggaacaacactcaaccctatctcggtctattcttttgatttataagggattttgccgatttcggcctattggttaaaaaatgagctgatttaacaaaaatttaacgcgaattttaacaaaatattaacgcttacaatttaggtggcacttttcggggaaatgtgcgcggaacccctatttgtttatttttctaaatacattcaaatatgtatccgctcatgagacaataaccctgataaatgcttcaataatattgaaaaaggaagagtatgagtattcaacatttccgtgtcgcccttattcccttttttgcggcattttgccttcctgtttttgctcacccagaaacgctggtgaaagtaaaagatgctgaagatcagttgggtgcacgagtgggttacatcgaactggatctcaacagcggtaagatccttgagagttttcgccccgaagaacgttttccaatgatgagcacttttaaagttctgctatgtggcgcggtattatcccgtattgacgccgggcaagagcaactcggtcgccgcatacactattctcagaatgacttggttgagtactcaccagtcacagaaaagcatcttacggatggcatgacagtaagagaattatgcagtgctgccataaccatgagtgataacactgcggccaacttacttctgacaacgatcggaggaccgaaggagctaaccgcttttttgcacaacatgggggatcatgtaactcgccttgatcgttgggaaccggagctgaatgaagccataccaaacgacgagcgtgacaccacgatgcctgtagcaatggcaacaacgttgcgcaaactattaactggcgaactacttactctagcttcccggcaacaattaatagactggatggaggcggataaagttgcaggaccacttctgcgctcggcccttccggctggctggtttattgctgataaatctggagccggtgagcgtgggtctcgcggtatcattgcagcactggggccagatggtaagccctcccgtatcgtagttatctacacgacggggagtcaggcaactatggatgaacgaaatagacagatcgctgagataggtgcctcactgattaagcattggtaactgtcagaccaagtttactcatatatactttagattgatttaaaacttcatttttaatttaaaaggatctaggtgaagatcctttttgataatctcatgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagctaccaactctttttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaatactgtccttctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagctatgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaagcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatctttatagtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcctatggaaaaacgccagcaacgcggcctttttacggttcctggccttttgctggccttttgctcacatgttctttcctgcgttatcccctgattctgtggataaccgtattaccgcctttgagtgagctgataccgctcgccgcagccgaacgaccgagcgcagcgagtcagtgagcgaggaagcggaagagcgcccaatacgcaaaccgcctctccccgcgcgttggccgattcattaatgcagctggcacgacaggtttcccgactggaaagcgggcagtgagcgcaacgcaattaatgtgagttagctcactcattaggcaccccaggctttacactttatgcttccggctcgtatgttgtgtggaattgtgagcggataacaatttcacacaggaaacagctatgaccatgattacgccaagcgcgcaattaaccctcactaaagggaacaaaagctgggtaccgggccccccctcgaggtcgacggtatcgataagcttgatatc。

配列番号３０
ｐＣＭＶｓｓＫＺ−ＩｎｔＣ３−ＣＮＬＳ（インテグラーゼ発現プラスミド）：
gaattcctcacatgttctttcctgcgttatcccctgattctgtggataaccgtattaccgccatgcattagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtgatgcggttttggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagctggtttagtgaaccgtcagatccgctagcaattcgctgtctgcgagggccagctgttggggtgagtactccctctcaaaagcgggcatgacttctgcgctaagattgtcagtttccaaaaacgaggaggatttgatattcacctggcccgcggtgatgcctttgagggtggccgcgtccatctggtcagaaaagacaatctttttgttgtcaagcttgaggtgtggcaggcttgagatctggccatacacttgagtgacaatgacatccactttgcctttctctccacaggtgtccactcccaggtccaactgcagctcgaggtccaccatgggaagaaggcgaagtcatgagcgccgggatttaccccctaacctttatataagaaacaatggatattactgctacagggacccaaggacgggtaaagagtttggattaggcagagacaggcgattcgcaatcactgaagctatacaggccaacattgagttattttcaggacacaaacacaagcctctgacagcgagaatcaacagtgataattccgttacgttacattcatggcttgatcgctacgaaaaaatcctggccagcagaggaatcaagcagaagacactcataaattacatgagcaaaattaaagcaataaggaggggtctgcctgatgctccacttgaagacatcaccacaaaagaaattgcggcaatgctcaatggatacatagacgagggcaaggcggcgtcagccaagttaatcagatcaacgctgagcgatgcattccgagaggcaatagctgaaggccatataacaacaaaccatgtcgctgccactcgcgcggcaaagtcaaaggtaaggagatcaagacttacggctgacgaatacctgaaaatttatcaagcagcagaatcatcaccatgttggctcagacttgcaatggaactggctgttgttaccgggcaacgagttggtgacttgtgcaaaatgaagtggtctgatatcgtagatggatatctttatgtcgagcaaagcaaaacaggcgtaaaaattgccatcccaacagcattgcatattgatgctctcggaatatcaatgaaggaaacacttgataaatgcaaagagattcttggcggagaaaccataattgcatctactcgtcgcgaaccgctctcatccggcacagtatcaaggtattttatgcgcgcacgaaaagcatcaggtctttccttcgaaggggatccgcctacctttcacgagttgcgcagtttgtctgcaagactctatgggaagcagataagcgataagtttgctcaacatcttctcgggcataagtcggtcaccatggcatcacagtatcgtgatgacagaggcagggagtgggacaaaattgaaatcaaatccggaggcggccctaagaagaagagaaaggtatgataatctagagctcgctgatcagcctcgactgtgccttctagttgccagccatctgttgtttgcccctcccccgtgccttccttgaccctggaaggtgccactcccactgtcctttcctaataaaatgaggaaattgcatcgcattgtctgagtaggtgtcattctattctggggggtggggtggggcaggacagcaagggggaggattgggaagacaatagcaggcatgctggggatgcggtgggctctatggcttctgaggcggaaagaaccagctggggctcgagatccactagttctagcctcgaggctagagcggccgccaccgcggtggagctccaattcgccctatagtgagtcgtattacgcgcgctcactggccgtcgttttacaacgtcgtgactgggaaaaccctggcgttacccaacttaatcgccttgcagcacatccccctttcgccagctggcgtaatagcgaagaggcccgcaccgatcgcccttcccaacagttgcgcagcctgaatggcgaatgggacgcgccctgtagcggcgcattaagcgcggcgggtgtggtggttacgcgcagcgtgaccgctacacttgccagcgccctagcgcccgctcctttcgctttcttcccttcctttctcgccacgttcgccggctttccccgtcaagctctaaatcgggggctccctttagggttccgatttagtgctttacggcacctcgaccccaaaaaacttgattagggtgatggttcacgtagtgggccatcgccctgatagacggtttttcgccctttgacgttggagtccacgttctttaatagtggactcttgttccaaactggaacaacactcaaccctatctcggtctattcttttgatttataagggattttgccgatttcggcctattggttaaaaaatgagctgatttaacaaaaatttaacgcgaattttaacaaaatattaacgcttacaatttaggtggcacttttcggggaaatgtgcgcggaacccctatttgtttatttttctaaatacattcaaatatgtatccgctcatgagacaataaccctgataaatgcttcaataatattgaaaaaggaagagtatgagtattcaacatttccgtgtcgcccttattcccttttttgcggcattttgccttcctgtttttgctcacccagaaacgctggtgaaagtaaaagatgctgaagatcagttgggtgcacgagtgggttacatcgaactggatctcaacagcggtaagatccttgagagttttcgccccgaagaacgttttccaatgatgagcacttttaaagttctgctatgtggcgcggtattatcccgtattgacgccgggcaagagcaactcggtcgccgcatacactattctcagaatgacttggttgagtactcaccagtcacagaaaagcatcttacggatggcatgacagtaagagaattatgcagtgctgccataaccatgagtgataacactgcggccaacttacttctgacaacgatcggaggaccgaaggagctaaccgcttttttgcacaacatgggggatcatgtaactcgccttgatcgttgggaaccggagctgaatgaagccataccaaacgacgagcgtgacaccacgatgcctgtagcaatggcaacaacgttgcgcaaactattaactggcgaactacttactctagcttcccggcaacaattaatagactggatggaggcggataaagttgcaggaccacttctgcgctcggcccttccggctggctggtttattgctgataaatctggagccggtgagcgtgggtctcgcggtatcattgcagcactggggccagatggtaagccctcccgtatcgtagttatctacacgacggggagtcaggcaactatggatgaacgaaatagacagatcgctgagataggtgcctcactgattaagcattggtaactgtcagaccaagtttactcatatatactttagattgatttaaaacttcatttttaatttaaaaggatctaggtgaagatcctttttgataatctcatgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagctaccaactctttttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaatactgtccttctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagctatgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaagcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatctttatagtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcctatggaaaaacgccagcaacgcggcctttttacggttcctggccttttgctggccttttgctcacatgttctttcctgcgttatcccctgattctgtggataaccgtattaccgcctttgagtgagctgataccgctcgccgcagccgaacgaccgagcgcagcgagtcagtgagcgaggaagcggaagagcgcccaatacgcaaaccgcctctccccgcgcgttggccgattcattaatgcagctggcacgacaggtttcccgactggaaagcgggcagtgagcgcaacgcaattaatgtgagttagctcactcattaggcaccccaggctttacactttatgcttccggctcgtatgttgtgtggaattgtgagcggataacaatttcacacaggaaacagctatgaccatgattacgccaagcgcgcaattaaccctcactaaagggaacaaaagctgggtaccgggccccccctcgaggtcgacggtatcgataagcttgatatc。

配列番号３１
ａｔｔＨ４Ｘ： acgctttatttcattaagttg。

例１：迅速な大腸菌染色体の統合
本例は、図２に描かれた手順に従う。Ｃ３ＩＮＴ−ＨＩＳ−ＰＥＴ２２ｂ（＋）は、ｐｅｔＦ２（配列番号１０）及びｐｅｔＲ（配列番号１１）で増幅し、その後、ＰＣＲ産物を分子内でライゲーションし、Ｃ３ＩＮＴ−ＨＩＳミニサークルを作出した。ａｔｔＰ−ＰＥＴ２２ｂ（＋）は、ａｔｔＰ−Ｆ（配列番号１２）及びａｔｔＰＳＯＥ−Ｒ（配列番号１３）で増幅し、一方でＰＥＴ２２ｂ（＋）は、ＴＥＭ１ｐｒｏｍ−Ｆ（配列番号１４）及びＴＥＭ１ｐｒｏｍＲ（配列番号１５）で増幅し、それぞれａｔｔＰ及びアンピシリン耐性遺伝子をコードするＰＣＲ産物を生成した。スプライス・オーバーラップ・エクステンション・ＰＣＲ（ＳＯＥ−ＰＣＲ）をこれら２つのＰＣＲ産物を用いてａｔｔＰ−Ｆ（配列番号１２及びＴＥＭ１ｐｒｏｍ−Ｒ（配列番号１５）を使用して行った。次いでＰＣＲ産物を分子内でライゲーションし、ａｔｔＰ−ＴＥＭ１ミニサークルを作出した。１００ｎｇのＣ３ＩＮＴ−ＨＩＳミニサークルと１００ｎｇのａｔｔＰ−ＴＥＭ１ミニサークルとを組み合わせて、２５μＬのエレクトロコンピテントＴＧ１細胞にエレクトロポレーションした。細胞は、多様な濃度（０．０１ｍｇ／ｍＬ、０．０２ｍｇ／ｍＬ、０．０５ｍｇ／ｍＬ、０．０７ｍｇ／ｍＬ及び０．１ｍｇ／ｍＬ）のアンピシリン−ＬＢ寒天プレート上への播種の前に１時間に亘って回復させた。インキュベーションを３７℃で１２〜１４時間に亘って行い、Ｃ３インテグラーゼの発現及びＣ３インテグラーゼによりアンピシリン耐性カセットの染色体統合を可能にした。コロニーＰＣＲは、ＥｃｏｌｉＡｔｔＢ−Ｆ（配列番号１６）及びＥｃｏｌｉＡｔｔＢ−Ｒ（配列番号１７）、ＴＥＭ１ｐｒｏｍ−Ｆ（配列番号１４）及びＥｃｏｌｉＡｔｔＢ−Ｆ（配列番号１６）、又はＴＥＭ１ｐｒｏｍ−Ｆ（配列番号１４）及びＥｃｏｌｉＡｔｔＢ−Ｒ（配列番号１７）で行い、アンピシリン耐性カセットの染色体統合の存在を検証した。ＰＣＲ産物はまた、同じプライマーによって配列を決定し、結果を確認した。シーケンシングは、染色体ａｔｔＢ部位への正確な統合イベントを示した（図３Ｃ）。

例２：親並びにインテグラーゼバリアントＣ２及びＣ３の組み換え活性
本例は、親Ｉｎｔ−ｈ／２１８及び選択された変異体（Ｃ２、Ｃ３及びその示されたバリアント）の組み換え活性を実証した。図４Ａは、インビトロ転写／翻訳により産生されたインテグラーゼを使用するインビトロ分子内組み換え反応からの結果を図示する。それぞれインテグラーゼ（Ｉｎｔ−ｈ／２１８、Ｃ２、Ｃ３又はそのバリアント）をコードするプラスミドをプライマーＩｎｔＲＢＳ−Ｆ及びＩＮＴｓｔｏｐ−Ｒを用いて増幅し、ＰＣＲ産物をプライマーユニバーサル及びＩＮＴｓｔｏｐ−Ｒを用いて再増幅して、インビトロ転写−翻訳（ＩＶＴ）において必要なＴ７プロモーター及びリボソーム結合部位を有するインテグラーゼアンプリコンを得た。２０ｇの各インテグラーゼアンプリコンを総容量９μＬのＰＵＲエクスプレス（登録商標）・インビトロ・タンパク質・シンセーシス・キット（PURExpressR In Vitro Protein Synthesis Kit）を使用して３０℃１時間に亘って発現させた。次に、ａｔｔＢ／ａｔｔＰ部位、ａｔｔＰＨ／ａｔｔＨ部位又はａｔｔＨ４ｘ／ａｔｔＰ４ｘ部位（図１）の何れかを含む１０ｎｇのプラスミド基質を総容量１０μＬまで添加することによって分子内組み換えを行った。混合物を３７℃で２時間インキュベートさせた。その後、組み換え効率のリアルタイムＰＣＲ定量のために１μＬ採取する前に反応液を１／１０に希釈した。リアルタイムＰＣＲ定量は、２５０ｎＭの各プライマーｐＬＩＲ−Ｆ１（配列番号２７）及びｐＬＩＲ−Ｒ１（配列番号２８）を用いて終容量２０μＬのエッソアドバンスド^ＴＭ・ユニバーサル・ＳＹＢＲ（登録商標）グリーン・スーパーミックス中で行った。組み換えインテグラーゼ・タンパク質の活性は、ａｔｔＢ／ａｔｔＰプラスミド基質（値を１に設定）の相対的活性で示す。エラーバーは、２つの独立した実験の標準偏差を示す。

結果は、親Ｉｎｔ−ｈ／２１８に比較してＣ２及びＣ３インテグラーゼの組み換え効率の有意な増大を示す。図４のデータは、分子内組み換えの効率におけるＣ３に存在するＥ３１９Ｇ変異の強い寄与を示す。Ｃ３からのこの変異の除去は、Ｉ４３Ｆ Ｃ２を産出し、これは試験された全ての基質対において〜３倍の活性低下を示す。Ｃ２へのこの変異の追加又はＣ３からの除去が組み換え効率における何れの有意な変化ももたらさないことから、Ｉ４３Ｆ変異の分子内組み換えに対する寄与は、容易には明らかにならない。しかしながら、それは、他のパラメータ、例えば、インビボでの分子間組み換え及び／又はタンパク質安定性に影響を与え得る。

図４Ｂは、大腸菌で組み換え技術によって作られたインテグラーゼを使用するインビトロ分子内組み換え反応による結果を図示する。インテグラーゼＩｎｔ−ｈ／２１８及びＣ３を発現するプラスミドを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（インビトロジェン）コンピテント細胞にトランスフォームした。細菌細胞をＬＢ培地中で３７℃で増殖させ、０．５ｍＭのＩＰＴＧを含む〜０．６のＯＤ_{６００ｎｍ}で３０℃で６時間に亘って誘導した。次に細胞を遠心によって回収し、５０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８．０、１ＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのイミダゾール中に再懸濁し、超音波処理によって溶解した。細胞溶解物を高速遠心分離によって清澄化し、次に、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１ＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのイミダゾール、０．５ｍＭのＥＤＴＡ及び２ｍＭのＤＴＴの結合バッファー中で前平衡化した１ｍＬのＨｉｓＴｒａｐ^ＴＭ・ＦＦ・カラム（ＧＥヘルスケア）に上清を加えた。カラムを結合バッファーで洗浄し、インテグラーゼ・タンパク質を５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１ＭのＮａＣｌ、５００ｍＭのイミダゾール、０．５ｍＭのＥＤＴＡ及び２ｍＭのＤＴＴによってカラムから流出させた。採取されたフラクションをＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルによって分析し、適切なフラクションを透析し、−８０℃での保存に先立って、アミコン−ウルトラ（Amicon-Ultra、10kDa MWCO）を使用して５０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８．０、１ＭのＮａＣｌ、０．５ｍＭのＥＤＴＡ及び２ｍＭのＤＴＴ中に濃縮した。

分子内組み換えは、ａｔｔＢ／ａｔｔＰ部位、ａｔｔＰＨ／ａｔｔＨ部位又はａｔｔＨ４ｘ／ａｔｔＰ４ｘ部位の何れかを含むプラスミド基質１０ｎｇでインキュベートされた５μｇの精製された組み換えインテグラーゼ・タンパク質で行った。反応液容量は２５μＬであり、組み換えバッファー（１００ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．５、５００ｍＭのＮａＣｌ、２５ｍＭのＤＴＴ、１０ｍＭのＥＤＴＡ、５ｍｇ／ｍＬのウシ血清アルブミン）中で３７℃で１．５時間に亘って行った。反応液は、組み換え効率のリアルタイムＰＣＲ定量のために２μＬを採取する前に、１／１０に希釈された。リアルタイムＰＣＲ定量は、エッソアドバンスド^ＴＭ・ユニバーサル・ＳＹＢＲ（登録商標）グリーン・スーパーミックスを含む終容量２０μＬ中で２５０ｎＭの各プライマーｐＬＩＲ−Ｆ１（配列番号２７）及びｐＬＩＲ−Ｒ１（配列番号２８）を用いて行った。組み換えインテグラーゼ・タンパク質の活性は、ａｔｔＢ／ａｔｔＰプラスミド基質におけるＩｎｔ−ｈ／２１８（ＷＴ）の活性（１の値として設定）に対して相対的に示された。エラーバーは、２つの独立した実験の平均値±ＳＤを示す。当該データは、再度、Ｉｎｔ−ｈ／２１８親に比較してＣ３インテグラーゼについて試験された全ての基質において高い組み換えを示す。

これらの実験において観察されたＣ２及びＣ３の改善された組み換え活性は（図４Ａ及び４Ｂ）、細胞ベースのアッセイにおいてみられた結果（図５）と相関する。

例３：細胞培養条件、トランスフェクション手順、及びＨＴ１０８０細胞における内因性ａｔｔＨ４ｘターゲティングのためのピューロマイシン耐性組み換え体の選択
ＨＴ１０８０細胞株における内因性ターゲティングのために、トランスフェクションの１日前に１０ｃｍの細胞培養皿当たり３×１０^６細胞をダルベッコ改変イーグル培地［１０％のＦＢＳ、１％のＬ−グルタミン及び各１００ユニット／ｍＬのペニシリン／ストレプトマイシンが補われたＤＭＥＭ（ライフ・テクノロジー）］中に播種し、トランスフェクション時には７０〜９０％のコンフルエントを達成した。トランスフェクションは、リポフェクタミン２０００試薬（ライフ・テクノロジー）を使用して行った。プラスミドＤＮＡ−脂質複合体は、５ｎｇの対象ベクター（ｐＰＧＫｓｓＰｕｒｏ−ａｔｔＰ４ｘ（配列番号２９））及び７５μＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地（ライフ・テクノロジー）中に希釈された２．５μＬのリポフェクタミン２０００試薬を含む、７５μＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地中に希釈された１００ｎｇのインテグラーゼ発現プラスミド（ｐＣＭＶｓｓＫＺ−ＩｎｔＣ３−ＣＮＬＳ（配列番号３０））を混合し、２０分間室温でインキュベートすることにより調製された。トランスフェクションミックスを（抗生物質を含まないＤＭＥＭ下で）細胞に対して添加し、４〜６時間に亘ってトランスフェクションを進めて、それに続いて、新しい培地で置き換えることによって複合体を取り除いた。トランスフェクションの４８時間後、細胞を１ｍＬ当たり３μｇのピューロマイシンを含む殖培地中で増殖させ、ピューロマイシン耐性コロニーを選択した。選択の３週間後、ピューロマイシン耐性コロニーを収穫し、展開した。ＤＮｅａｓｙ・ブラッド・アンド・ティッシュ・キット（DNeasy Blood & Tissue Kit（キアゲン））を用いてゲノムＤＡＮを抽出した。

例４：細胞培養条件、トランスフェクション手続き及びエピソーム性分子内組み換えアッセイのためのＦＡＣＳ分析
ＨＴ１０８０細胞株でのエピソーム性分子内組み換えアッセイのために、トランスフェクションの１日前に６ウェルプレートの１ウェル当たりに３×１０^５細胞をダルベッコ改変イーグル培地［１０％のＦＢＳ、１％のＬ−グルタミン及び各１００ユニット／ｍＬのペニシリン／ストレプトマイシンが補われたＤＭＥＭ（ライフ・テクノロジー）］中に播種し、トランスフェクション時には７０〜９０％のコンフルエントが達成された。トランスフェクションは、リポフェクタミン２０００試薬を使用して行った。ウェル毎の全てのトランスフェクションについて、１．５μｇのｐＬＩＲと、１００μＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地中に希釈された６μＬのリポフェクタミン２０００試薬を含む１００μＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭ中に希釈された１．５μｇのλインテグラーゼ発現プラスミドとを混合し、室温で２０分間インキュベートすることにより、プラスミドＤＮＡ−脂質複合体を調製した。トランスフェクションミックスを（抗生物質を含まないＤＭＥＭ下で）細胞に対して滴下によって添加し、トランスフェクションを４〜６時間に亘って進めて、それに続いて、新しいＤＭＥＭ培地で置き換えることによって複合体を取り除いた。トランスフェクションの４８〜７２時間後、細胞をトリプシン処理し、ＤＭＥＭでエッペンドルフチューブに回収し、遠心分離（５分間に亘り１０００×ｒｃｆ）により沈殿させ、１ｍＬの新しいＤＭＥＭに再懸濁した。ＢＤ ＦＡＣＳキャリブル（登録商標）マシーン（BD FACSCalibur（登録商標） machine、ベクトン−ディッキンソン）上でのＦＡＣＳによって、ＧＦＰ陽性細胞を定量化した。

例５：達成された配列特異的組み換えイベントの同定
ＧｏＴａｑ Ｆｌｅｘｉ ＤＮＡポリメラーゼ（プロメガ）を使用し、プライマーＨＯＰ’ ａｔｔＨ４Ｘ＿Ｆ１（配列番号２５）及びＰｕｒｏＲｅｖ２４（配列番号２６）、並びに２００ｎｇのゲノムＤＮＡをテンプレートとして用いて、ＰＣＲ反応当たり５０μＬ容量中でＰＣＲを行った。以下のサーマル・サイクリング・パラメータをＰＣＲのために使用した：９５℃５分間の初期段階、９５℃１分間、５７℃３０秒間及び７２℃１分間を３５サイクル、並びに７２℃５分間の最終段階。ＰＣＲサンプルは、Ｔｒｉｓ−ホウ酸−ＥＤＴＡバッファー中０．８％アガロースゲルでの電気泳動によって分析した。

図６Ａは、ＨＴ１０８０クローンのＬ１遺伝子座でのａｔｔＨ４Ｘ及びａｔｔＰ４Ｘ組み換えイベントについてスクリーニングしているＰＣＲ結果を図示する。予測されたサイズのＰＣＲ増幅物（〜１２００ｂｐ；ａｔｔＨ４ｘ及びａｔｔＰ４ｘ間での組み換えを経て生じるａｔｔＬ部位について）がＨＴ１０８０クローン３、１９及び２１について検出された。図６Ｂは、ＨＴ１０８０クローン３及び１９でのａｔｔＨ４ｘ及びａｔｔＰ４ｘ間での組み換えを経て生じるａｔｔＬ部位のヌクレオチド配列を示す。

適用
本発明のインテグラーゼバリアント、並びにａｔｔＨ／ａｔｔＰＨ及びａｔｔＨ４Ｘ／ａｔｔＰ４Ｘ基質対の使用によって改善されたインビトロ組み換えが、ここで記載されるインテグラーゼバリアントは生物工学的応用、例えば、組み換えを基礎にしたクローニングへの応用などのための有用な試薬手段であり得ることを示す。

本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、本発明の多様な他の変更及び適応が、上述の開示を知った後の当業者には容易に分かるということが明白であり、全てのそのような変更及び適応が添付の特許請求の範囲の範囲内に入ることが意図されている。

Claims (37)

1. 配列番号１に記載のラムダ・インテグラーゼの３３６位、３１９位及び４３位の少なくとも１つでアミノ酸変異を含むラムダ・インテグラーゼ。
2. 請求項１に記載のラムダ・インテグラーゼであって、配列番号１に記載の前記ラムダ・インテグラーゼの４３位、３１９位及び３３６位でアミノ酸変異を含むラムダ・インテグラーゼ。
3. 請求項１又は２に記載のラムダ・インテグラーゼであって、配列４３位でアミノ酸残基イソロイシンが芳香族アミノ酸により置換されているラムダ・インテグラーゼ。
4. 請求項３に記載の当該ラムダ・インテグラーゼであって、前記芳香族アミノ酸が、フェニルアラニン、チロシン及びトリプトファンからなる群より選択されるラムダ・インテグラーゼ。
5. 請求項１〜４の何れか１項に記載のラムダ・インテグラーゼであって、配列３１９位のアミノ酸残基グルタメート（glutamate）がグリシンにより置換されているラムダ・インテグラーゼ。
6. 請求項１〜５の何れか１項に記載のラムダ・インテグラーゼであって、配列３３６位のアミノ酸残基アスパルテート(aspartate)が疎水性アミノ酸により置換されているラムダ・インテグラーゼ。
7. 請求項６に記載のラムダ・インテグラーゼであって、前記疎水性アミノ酸が脂肪族アミノ酸であるラムダ・インテグラーゼ。
8. 請求項７に記載のラムダ・インテグラーゼであって、前記脂肪族アミノ酸が、イソロイシン、ロイシン及びバリンからなる群より選択されるラムダ・インテグラーゼ。
9. 請求項１〜８の何れか１項に記載のラムダ・インテグラーゼであって、配列番号３に記載のラムダ・インテグラーゼにアミノ酸変異Ｉ４３Ｆ、Ｅ３１９Ｇ及びＤ３３６Ｖを含むラムダ・インテグラーゼ。
10. 請求項１に記載のラムダ・インテグラーゼであって、配列番号１に記載のラムダ・インテグラーゼの３３６位にアミノ酸変異を含むラムダ・インテグラーゼ。
11. 請求項１０に記載のラムダ・インテグラーゼであって、配列３３６位のアミノ酸残基アスパルテート(aspartate)が疎水性アミノ酸により置換されているラムダ・インテグラーゼ。
12. 請求項１１に記載のラムダ・インテグラーゼであって、前記疎水性アミノ酸が脂肪族アミノ酸であるラムダ・インテグラーゼ。
13. 請求項１２に記載のラムダ・インテグラーゼであって、前記脂肪族アミノ酸がイソロイシン、ロイシン及びバリンからなる群より選択されるラムダ・インテグラーゼ。
14. 請求項１０〜１３の何れか１項に記載のラムダ・インテグラーゼであって、配列番号２に記載のラムダ・インテグラーゼにおいてアミノ酸変異Ｄ３３６Ｖを含むラムダ・インテグラーゼ。
15. 請求項１０〜１４の何れか１項に記載のラムダ・インテグラーゼであって、配列３１９位のアミノ酸残基グルタメート（glutamate）がグリシンにより置換されているラムダ・インテグラーゼ。
16. 請求項１５に記載のラムダ・インテグラーゼであって、配列番号３に記載のラムダ・インテグラーゼにおいてアミノ酸変異Ｅ３１９Ｇ及びＤ３３６Ｖを含むラムダ・インテグラーゼ。
17. 請求項１〜１６の何れか１項に記載のラムダ・インテグラーゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子。
18. 請求項１５に記載の核酸分子であって、当該核酸分子の発現を可能にする調節配列に稼働可能に連結されている核酸分子。
19. 請求項１６に記載の核酸分子であって、前記調節配列がプロモーター配列を含む核酸分子。
20. 請求項１７〜１９の何れか１項に記載の核酸分子であって、ベクター内に位置している核酸分子。
21. 請求項１７〜２０の何れか１項に記載の当該核酸分子を含むホスト細胞。
22. 標的核酸に対して興味のある核酸を組み換える方法であって、請求項１〜１６の何れか１項に記載のラムダ・インテグラーゼの存在下で前記興味のある核酸を含む対象核酸と前記標的核酸とを接触させることを含む方法。
23. 請求項２２に記載の方法であって、前記標的核酸がＤＮＡを含む方法。
24. 請求項２２に記載の方法であって、前記標的核酸がゲノムＤＮＡを含む方法。
25. 請求項２２〜２４の何れか１項に記載の方法であって、前記標的核酸が、ａｔｔＨ配列（配列番号７）及びａｔｔＨ４Ｘ配列（配列番号３１）からなる群より選択される配列を含む方法。
26. 請求項２２〜２５の何れか１項に記載の方法であって、前記対象核酸がベクターである方法。
27. 請求項２６に記載の方法であって、前記対象核酸が、ａｔｔＰＨ配列（配列番号８）及びａｔｔＰ４Ｘ配列（配列番号９）からなる群より選択される配列を含む方法。
28. 請求項２２〜２７の何れか１項に記載の方法であって、前記配列特異的組み換えが１種類以上のコファクターの存在下で実行される方法。
29. 請求項２８に記載の方法であって、前記コファクターがＸＩＳ、ＦＩＳ及びＩＨＦからなる群より選択される方法。
30. 請求項２４〜２９の何れか１項に記載の方法であって、前記ゲノムＤＮＡが細胞に含まれる方法。
31. 配列特異的組み換えキットであって、
    ａ．興味のある核酸が挿入できる対象核酸、及び
    ｂ．請求項１〜１６の何れか１項に記載のラムダ・インテグラーゼ、又は請求項１７〜２０の何れか１項に記載の核酸
    を含むキット。
32. 請求項３１に記載のキットであって、更に、前記対象核酸に前記興味のある核酸を挿入するための少なくとも１種類の試薬を含むキット。
33. 請求項３１又は３２に記載のキットであって、前記対象核酸が、ａｔｔＰＨ配列（配列番号８）及びａｔｔＰ４Ｘ配列（配列番号９）からなる群より選択される配列を含むキット。
34. 請求項３１又は３２に記載のキットであって、前記対象核酸がａｔｔＨ配列（配列番号７）及びａｔｔＨ４Ｘ配列（配列番号３１）からなる群より選択される配列を含むキット。
35. 請求項３１〜３４の何れか１項に記載のキットであって、更に、バッファー（複数若しくは単数）及び／又は前記興味のある核酸を問題の標的核酸と組み換えるための説明書を含むキット。
36. 請求項３１〜３５の何れか１項に記載のキットであって、更に、達成された配列特異的組み換えイベントを測定するための少なくとも１種類の試薬を含むキット。
37. 請求項３６に記載のキットであって、前記試薬がプライマー対であるキット。

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