JP2017532021A - コドン最適化組み換えプラスミド、末梢神経再生の刺激方法、及び損傷ヒト神経の治療様式 - Google Patents

コドン最適化組み換えプラスミド、末梢神経再生の刺激方法、及び損傷ヒト神経の治療様式 Download PDF

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Abstract

本発明は医薬、より具体的には神経外科学及び外傷外科学に関するものであり、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）及び繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ‐２）をコードする遺伝子治療構築物を使用して神経再生を刺激するために利用可能である。２つの因子をコードする遺伝子治療構築物はコドン最適化組み換えプラスミドをベースとしている。遺伝子治療構築物は手術中又は手術後期間に、損傷神経に直接導入するか、又は神経周囲組織に導入することが可能である。本発明は損傷した末梢神経の再建的治療の結果を大幅に改善する。
【選択図】なし

Description

様々なデータによれば、多様な病因による末梢神経損傷の発生は母集団の３〜１０％に現れる（非特許文献１〜３）。標準的な治療の質を向上させることが可能な追加的治療方法を開発する理論的根拠は、長期間（１年以上）のリハビリテーション、労働年齢患者の生活の質の著しい低下、及び高い失職率に起因する。末梢神経損傷は、就労不能の一般的な原因である。末梢神経を完全な状態に修復する方法の選択は、個々の症例における多数の傷害の特徴、すなわち傷害の機序、外傷から外科的介入までの経過時間、末梢神経障害の程度等に起因する。端端吻合を介した切断神経領域縫合は、再建的治療様式の１つである。しかし、末梢神経損傷は重大な欠陥を伴うことが多く、それによりこのアプローチを適用不能にする。この設定では、自己神経移植は神経を完全な状態に修復する最も適切な選択肢である。機能的にあまり重要でない神経は自己移植片として収穫することが可能である。様々な導管が代替物として使用可能である。これらは拡張した組織障害を置換し、末梢神経再生のための条件を作り上げるように選定した管状構造物である。
外科的修復後、末梢神経に神経支配された四肢機能回復の程度は、損傷から手術までの経過時間、障害の程度、末梢神経の損傷部位から神経支配領域までの距離等の多様な因子に依存している。しかし、神経完全再建の技術が進歩しているにもかかわらず、一般的に、最も好適な条件下でさえ、神経支配された四肢機能は部分的にのみ回復する。このため、全体として標準的な再建治療の結果及び患者の生活の質を改善する新たな治療方法を探索することになる。
末梢神経再生を誘導する増殖因子の使用はこれらのアプローチの１つである。この概念は、末梢神経再生の自然な過程において増殖因子が果たす重要な役割に関する知識の蓄積に起因している（非特許文献４）。
血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）は、末梢神経の回復に影響を及ぼす十分に研究された増殖因子の１つである。ＶＥＧＦは、血管新生及び脈管形成の主要な調節因子の１つである。ＶＥＧＦは、二量体の３４〜４２ｋＤａのジスルフィド結合した糖タンパク質である。ＶＥＧＦ‐Ａは内皮細胞（ＥＣ）に特異的なマイトジェンである。ＶＥＧＦはＥＣの増殖、その活性化、分化及びその毛細血管形成、更に成熟血管への再構築を誘導する。ＶＥＧＦは抗アポトーシスタンパク質の発現を誘導することから、ＥＣ生存を増加させる強力な因子でもある。ＶＥＧＦをコードする遺伝子が欠損すると、心血管系発生の過程に重大な欠陥がもたらされ、これは致命的である。
ヒトＶＥＧＦの遺伝子は染色体座６ｐ２１．３に位置する。そのコード領域は約１４，０００ｂｐｓである。８つのエキソンから成るｍＲＮＡの選択的スプライシングから生じるＶＥＧＦ１２１、ＶＥＧＦ１４５、ＶＥＧＦ１４８、ＶＥＧＦ１６５、ＶＥＧＦ１８３、ＶＥＧＦ１８９、ＶＥＧＦ２０６などの数種のＶＥＧＦアイソフォームが存在する。特定の細胞外局在は各ＶＥＧＦアイソフォームに対応しており、これはヘパリン及びヘパラン硫酸塩に結合する能力がそれぞれ生化学的に異なることに基づいている。例えば、ヒトＶＥＧＦ‐Ａ遺伝子の転写物は全てエキソン１〜５及び８を含み、その違いはエキソン６及び７の選択的スプライシングに起因している。
この発見の後、ＶＥＧＦは長年、血管新生の誘導因子、及び組織虚血が伴う様々な障害を治療する有力な治療剤としてのみ考えられてきた。しかし、歳月を経て、末梢神経系及び中枢神経系両方のニューロンに対するその神経保護特性に関するデータが得られている（非特許文献５、６）。ＶＥＧＦは、シュワン細胞、星状細胞、ミクログリア及び皮質ニューロンの増殖を刺激する（非特許文献７〜１０）。ラット坐骨神経挫滅損傷モデルにおいて、損傷に応答して腰椎にＶＥＧＦ及びＦｌｔ−１（ＶＥＧＦ ＩＩ型受容体）発現の有意な増加が見られた（非特許文献１１）。従って、この増殖因子を末梢神経損傷再建治療の追加的治療成分として使用するための必要条件が考案されている。導管内のマトリゲル充填物の一部としてＶＥＧＦを使用すると、断面積の単位当たりの導管における軸索数の増加として現れる軸索新芽形成が誘導される（非特許文献１２）。
腓骨神経及び脛骨神経の広範な障害を伴う外傷モデルにおいて自己静脈移植片にＶＥＧＦ添加したポリ乳酸ミクロスフェアを使用すると、神経の機能的指数が有意に改善され、移植片において有髄線維の数が増加する（非特許文献１３）。実験では、ＶＥＧＦはシュワン細胞分裂を誘導し、毛細血管及び有髄線維の増加数と相関する遠位部に向かう移植片の遊走を誘導する（非特許文献１４）。ラット海綿体神経損傷モデルにおいて、海綿体にＢＤＮＦと組み合わせたＶＥＧＦを導入すると、喪失した神経支配及び勃起機能が回復した（非特許文献１５）。
ＦＧＦは神経形成を誘導する特性を持つ別の増殖因子である。ＦＧＦは、末梢神経損傷においてシュワン細胞の増殖及び遊走を誘導する（非特許文献１６）。動物実験では、ＦＧＦ、Ｆｇｆｒ１及びＦｇｆｒ２に対する受容体の遮断は非有髄化知覚線維の神経障害及び熱痛感受性の重篤な機能障害を引き起こすことが示された（非特許文献１７）。末梢神経損傷モデルにおいて骨髄由来幹細胞を適用するとＦＧＦ発現が増加し、この増加は、著者らの意見によれば、シュワン細胞の遊走及び増殖を誘導した（非特許文献１８）。胸部脊髄損傷モデルにおいて坐骨神経移植片にＦＧＦを使用すると、上肢運動機能の改善が促進された（非特許文献１９）。従って、実験データによれば、末梢神経修復の複雑な治療においてこれら増殖因子の取り込みが有効になることが推測できる。
しかし、増殖因子の治療的適用は多数の制限があることが知られている。傷害部位への投与後、増殖因子は急速に分解されるため、増殖因子の一定濃度を維持して所望の治療効果を達成することは不可能である（非特許文献２０）。従って、遺伝子治療の利用の方がはるかに適している。治療剤をコードする遺伝子の移入機構に基づくウイルスベクター及び非ウイルスベクターの使用など２つの主要な傾向が存在する。しかし、高いトランスフェクション活性にもかかわらず、臨床におけるウイルスベクターの使用は、挿入突然変異誘発、炎症反応及び毒性のリスクにより制限されている。プラスミドＤＮＡの適用は遺伝子移入の比較的安全な方法である。端端吻合及び端側吻合による筋皮神経修復のモデルでは、ｖｅｇｆ遺伝子を有するＤＮＡプラスミドを術中に遠位領域に投与すると、吻合部から遠位にある領域の断面積単位当たりの有髄線維数が有意に増加し、これはシュワン細胞におけるＶＥＧＦ濃度の有意な増加と相関している（非特許文献２１）。
遺伝子治療構築物は神経傍節に注入することが可能である。坐骨神経損傷モデルでは、瘢痕の重症度を軽減するために、ｐｌＶＥＧＦを筋肉内に投与し、吻合部位を覆うヒアルロン酸フィルム外被と組み合わせた。当該薬物の筋肉内注射では、単剤療法としての使用に対して、筋肉応答振幅の有意な増加、及び吻合部位から遠位にある有髄線維の増加が伴った（非特許文献２２）。Ｗａｎｇ Ｆ．らが行った研究は坐骨神経切断部の端端縫合後に遺伝子治療構築物を神経内に付与したときのｐｌＶＥＧＦ用量依存的効果を実証した。比較的高い投薬量を使用したところ、神経生理学的パラメータの増加が最も顕著になり、腓腹重量指数の減少が少なくなった（非特許文献２３）。いくつかの因子の相乗作用が判明した。例えば、坐骨神経損傷モデルにおけるＶＥＧＦ遺伝子をコードするプラスミドとＣ‐ＣＳＦ遺伝子をコードするプラスミドとの併用により、端端吻合から遠位にある領域の有髄線維及び毛細血管の数がより顕著に増加し、脊髄神経節におけるニューロンがより多く維持され、更に運動機能が早期に回復することが実証された（非特許文献２４）。しかし、インビボで遺伝子治療剤を使用する場合では、細胞の一部のみにプラスミドＤＮＡがトランスフェクトされる。結果的に、細胞に２つの異なる遺伝子治療構築物を同時にトランスフェクトする機会が減少する。従って、１つのプラスミドにおいて相乗作用を有する２つの増殖因子の遺伝子配列を組み合わせることは合理的である。このアプローチの有効性は、脊髄挫傷損傷の動物モデルにおいてすでに実証されている。
この実験中、４０μｇのＶＥＧＦ及びＦＧＦ２遺伝子含有プラスミドを脊髄に直接注入する設定では、１．５ｃｍの外傷中心部に形成された切片で毛細血管数の有意な増加が見られた。また、行動試験データによれば、ＶＥＧＦ及びＦＧＦ２遺伝子含有プラスミドが与えられていない対照群の動物と比較して、運動機能の回復が有意に改善した。得られた結果に基づき、２重カセットプラスミドの適用は脊髄血管新生を改善し、脊髄灰白質及び白質の破壊領域を減少させるということが結論づけられた（非特許文献２５）。しかしこれらの結果では、ＶＥＧＦ及びＦＧＦ２遺伝子を有する２重カセットプラスミドの使用が末梢神経損傷に有効であるか否かについては全く分からない。このことは、末梢神経に比較的特異的で、その傷害の全構造に行き渡った神経断裂を伴う外傷と、挫傷による傷害の機序とが、病因及び重症度により著しく異なるという事実に起因している。しかし、最も重要な違いは、脊髄及び末梢神経の再生能力が異なるところである。従って、増殖因子遺伝子を有するプラスミドが末梢神経再生の効果的な改善に使用できるか否かを判定することが必要である。
ロシア特許第３４５９６３０号Ｃ１「Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ｆｏｒ Ｎｅｕｒｏｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｓ」
Ｈｕｄｓｏ，Ａ．Ｒ．Ｔｉｍｉｎｇ ｏｆ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｎｅｒｖｅ ｒｅｐａｉｒ：ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｌｏｃａｌ ａｎｄ ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｆａｃｔｏｒｓ／Ａ．Ｒ．Ｈｕｄｓｏｎ／／Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇｅｒｙ．‐１９７７．‐Ｖｏｌ．２４．‐Ｃ．３９１‐４０５． Ｄｅｉｔｃｈ，Ｅ．Ａ．Ｅｘｐｅｒｉｅｎｃｅ ｗｉｔｈ １１２ ｓｈｏｔｇｕｎ ｗｏｕｎｄｓ ｏｆ ｔｈｅ ｅｘｔｒｅｍｉｔｉｅｓ／Ｅ．Ａ．Ｄｅｉｔｃｈ，Ｗ．Ｒ．Ｇｒｉｍｅｓ／／Ｊ Ｔｒａｕｍａ．‐１９８４．‐Ｖｏｌ．２４．‐Ｐ．６００‐６０３． Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｕｐｐｅｒ ａｎｄ ｌｏｗｅｒ ｅｘｔｒｅｍｉｔｙ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｎｅｒｖｅ ｉｎｊｕｒｉｅｓ ｉｎ ａ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｉｎｊｕｒｉｅｓ／Ｃ．Ａ．Ｍｕｎｒｏ／／Ｊ．Ｔｒａｕｍａ．‐１９９８．‐Ｖｏｌ．４５．‐Ｐ．１１６‐１２２． Ｔｅｒｅｎｇｈｉ，Ｇ．Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｎｅｒｖｅ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒｓ／Ｇ．Ｔｅｒｅｎｇｈｉ／／Ｊ．Ａｎａｔ．１９９９．‐Ｖｏｌ．１９４．‐Ｐ． Ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｈａｓ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ ａｘｏｎａｌ ｏｕｔｇｒｏｗｔｈ，ｅｎｈａｎｃｉｎｇ ｃｅｌｌ ｓｕｒｖｉｖａｌ ａｎｄ Ｓｃｈｗａｎｎ ｃｅｌｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｎｅｒｖｏｕｓ ｓｙｓｔｅｍ／Ｍ．Ｓｏｎｄｅｌｌ，Ｍ．Ｋａｎｊｅ．Ｇ．Ｌｕｎｄｂｏｒｇ／／Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．‐１９９９．‐Ｖｏｌ．１９，Ｎｏ．１４‐Ｐ．５７３１‐４０． ＶＥＧＦ‐Ａ１６５ｂ ｉｓ ａｎ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｎｅｕｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｓｐｌｉｃｅ ｉｓｏｆｏｒｍ ｏｆ ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ Ａ ｉｎ ｖｉｖｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ／Ｎ．Ｂｅａｚｌｅｙ‐Ｌｏｎｇ［ｅｔ ａｌ．］／／Ｊ Ｐａｔｈｏｌ．‐２０１３．‐Ｖｏｌ．１８３，Ｎｏ．３‐Ｐ．９１８‐２９． Ｓｏｎｄｅｌｌ，Ｍ．Ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ Ｓｃｈｗａｎｎ ｃｅｌｌ ｉｎｖａｓｉｏｎ ａｎｄ ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｓａｔｉｏｎ ｏｆ ａｃｅｌｕｌａｒ ｎｅｒｖｅ ｇｒａｆｔｓ／Ｍ．Ｓｏｎｄｅｌｌ，Ｇ．Ｌｕｎｄｂｏｒｇ，Ｍ．Ｋａｎｊｅ／／Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．‐１９９９．‐Ｖｏｌ．８４６‐Ｐ．２１９‐２２８． Ｖａｓｃｕｌａｒ，ｇｌｉａｌ ａｎｄ ｎｅｕｒｏｎａｌ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｉｎ ｍｅｓｅｎｃｅｐｈａｌｉｃ ｅｘｐｉａｎｔｓ ｃｕｌｔｕｒｅｓ／Ｗ．Ｆ．Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ［ｅｔ ａｌ．］／／Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ．‐１９９９．‐Ｖｏｌ．９０‐Ｐ．１５２９‐１５４１． Ｆｏｒｓｔｒｅｕｔｅｒ，Ｆ．Ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｉｎｄｕｃｅｓ ｃｈｅｍｏｔａｘｉｓ ａｎｄ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｃｒｏｇｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ／Ｆ． Ｆｏｒｓｔｒｅｕｔｅｒ，Ｒ．Ｌｕｃｉｕｓ，Ｒ．Ｍｅｎｔｌｅｉｎ／／Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．‐２００２．‐Ｖｏｌ．１３２‐Ｐ．９３‐９８． Ｚｈｕ，Ｙ．Ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｒｔｉｃａｌ ｎｅｕｒｏｎ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ ｂｙ ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ Ｅ２Ｆ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ／Ｙ．Ｚｈｕ［ｅｔ ａｌ．］／／Ｊ ＦＡＳＥＢ．‐２００３．Ｖｏｌ．１７‐Ｐ．１８６‐１９３． Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ＶＥＧＦ ａｎｄ ｉｔｓ Ｆｌｔ‐１ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｆｔｅｒ ｓｃｉａｔｉｃ ｎｅｒｖｅ ｃｒｕｓｈ ｉｎｊｕｒｙ／Ｒ．Ｒ．Ｉｓｌａｍｏｖ［ｅｔ ａｌ．］／／Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏｒｔ．‐２００４．Ｖｏｌ．１５，Ｎｏ．１３‐Ｐ．２１１７‐２１． Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｏｎ ｎｅｒｖｅ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｉｎ ａｃｅｌｌｕｌａｒ ｎｅｒｖｅ ｇｒａｆｔｓ／Ｊ．Ｍ．Ｒｏｖａｋ［ｅｔ ａｌ．］／／Ｊ Ｒｅｃｏｎｓｔｒ Ｍｉｃｒｏｓｕｒｇ．‐２００４．Ｖｏｌ．２０，Ｎｏ．‐Ｐ．５３‐５８． Ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ‐ｌｏａｄｅｄ ｐｏｌｙ（ｌａｃｔｉｃ‐ｃｏ‐ｇｌｙｃｏｌｉｃ ａｃｉｄ）ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ‐ｉｎｄｕｃｅｄ ｌａｔｅｒａｌ ａｘｏｎａｌ ｓｐｒｏｕｔｉｎｇ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｖｅｉｎ ｇｒａｆｔ ｂｒｉｄｇｉｎｇ ｔｗｏ ｈｅａｌｔｈｙ ｎｅｒｖｅｓ：ｎｅｒｖｅ ｇｒａｆｔ ｐｒeｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｒｅｌｅａｓｅ ｓｙｓｔｅｍ／Ｈ．Ｋａｒａｇｏｚ［ｅｔ ａｌ．］／／Ｊ Ｍｉｃｒｏｓｕｒｇｅｒｙ．‐２０１２．Ｖｏｌ．３２，Ｎｏ．８‐Ｐ．６３５‐４１． Ｓｏｎｄｅｌｌ，Ｍ．Ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ Ｓｃｈｗａｎｎ ｃｅｌｌ ｉｎｖａｓｉｏｎ ａｎｄ ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａｃｅｌｌｕｌａｒ ｎｅｒｖｅ ｇｒａｆｔｓ／／Ｍ．Ｓｏｎｄｅｌｌ，Ｇ．Ｌｕｎｄｂｏｒｇ，Ｍ．Ｋａｎｊｅ／／Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．‐１９９９．Ｖｏｌ．８４６，Ｎｏ．２‐Ｐ．２１９‐２８． Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ａｎｄ ｂｒａｉｎ‐ｄｅｒｉｖｅｄ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ ｏｎ ｃａｖｅｒｎｏｓａｌ ｎｅｒｖｅ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｉｎ ａ ｎｅｒｖｅ‐ｃｒｕｓｈ ｒａｔ ｍｏｄｅｌ／ＰＳ．Ｈｓｉｅｈ［ｅｔ ａｌ．］／／ＢＪＵ Ｉｎｔ．‐２００３．Ｖｏｌ．９２，Ｎｏ．４‐Ｐ．４７０‐５． Ｇｒｏｔｈｅ，Ｃ．Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｕｔａｔｉｖｅ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｉｍｐａｃｔ ｏｆ ｔｈｅ ＦＧＦ‐２ ｓｙｓｔｅｍ ｉｎ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｎｅｒｖｅ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ‐ｌｅｓｓｏｎｓ ｆｒｏｍ ｉｎ ｖｉｖｏ ｓｔｕｄｉｅｓ ｉｎ ｍｉｃｅ ａｎｄ ｒａｔｓ／Ｋ．Ｈａａｓｔｅｒｔ，Ｊ．Ｊｕｎｇｎｉｃｋｅｌ，Ｃ．Ｇｒｏｔｈｅ／／Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ Ｒｅｖ．‐２００６．Ｖｏｌ．５１‐Ｐ．２９３‐２９９． Ｆｕｒｕｓｈｏｌ，Ｍ．Ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ ｏｆ Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｉｎ ｎｏｎ‐ｍｙｅｌｉｎａｔｉｎｇ Ｓｃｈｗａｎｎ ｃｅｌｌｓ ｃａｕｓｅｓ ｓｅｎｓｏｒｙ ａｘｏｎａｌ ｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ ａｎｄ ｉｍｐａｉｒｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅｒｍａｌ ｐａｉｎ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ／М．Ｆｕｒｕｓｈｏｌ［ｅｔ ａｌ．］／／Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．‐２００９．Ｖｏｌ．２９，Ｎｏ．６‐Ｐ．１６０８‐１６１４． Ｔｕｌｉｏ，Ｖ．Ｒ．Ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ‐２ ｉｎｄｕｃｅｓ ｇｌｉａｌ ｃｅｌｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｎｅｒｖｏｕｓ ｓｙｓｔｅｍ／Ｖ．Ｒ． Ｔｕｌｉｏ［ｅｔ ａｌ．］／／Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．‐２０１２．Ｖｏｌ．７，Ｎｏ．３４‐Ｐ．１‐１７． Ｓｃｉａｔｉｃ ｎｅｒｖｅ ｇｒａｆｔｉｎｇ ａｎｄ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＦＧＦ‐２ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ ｏｆ ｍｏｔｏｒ ｂｅｈａｖｉｏｒ ａｎｄ ｆｉｂｅｒ ｒｅｇｒｏｗｔｈ ｉｎ ｒａｔｓ ｗｉｔｈ ｓｐｉｎａｌ ｃｏｒｄ ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎ／Ｆ．Ｐ． Ｇｕｚｅｎ，［ｅｔ ａｌ．］／／Ｒｅｓｔｏｒａｔｉｖｅ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ．‐２０１２．Ｖｏｌ．３０‐Ｐ．２６５‐２７５． Ｚｅｎｇ，Ｗ．Ｉｏｎｉｃａｌｌｙ ｃｒｏｓｓ‐ｌｉｎｋｅｄ ｃｈｉｔｏｓａｎ ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ ｆｏｒ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｒｅｌｅａｓｅ ｏｆ ｂｉｏａｃｔｉｖｅ ｎｅｒｖｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ／Ｗ．Ｚｅｎｇ［ｅｔ ａｌ．］／／Ｉｎｔ Ｊ Ｐｈａｒｍ．‐２０１１．Ｖｏｌ．４２１‐Ｐ．２８３‐２９０． Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｏｆ ｍｕｓｃｕｌｏｃｕｔａｎｅｏｕｓ ｎｅｒｖｅ ｒｅｉｎｎｅｒｖａｔｉｏｎ ａｆｔｅｒ ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ（ＶＥＧＦ）ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ／Ｐ．Ｈａｎｉｎｅｃ［ｅｔ ａｌ．］／／ＢＭＣ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ．‐２０１２．Ｖｏｌ．１３，Ｎｏ．５７‐Ｐ． Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ＶＥＧＦ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ａｎｄ ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ ｆｉｌｍ ｓｈｅａｔｈ ｏｎ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｎｅｒｖｅ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ／Ｆ．Ｚｏｒ［ｅｔ ａｌ．］／／‐２０１４．Ｖｏｌ．３４，Ｎｏ．３‐Ｐ．２０９‐１６． Ｆａｖｏｒａｂｌｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｌｏｃａｌ ＶＥＧＦ ｇｅｎｅ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ｏｎ ａｘｏｎａｌ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｒａｔ ｓｃｉａｔｉｃ ｎｅｒｖｅ／Ｃ．Ｆｕ［ｅｔ ａｌ．］／／Ｊ Ｈｕａｚｈｏｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｃｉｎｃｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．‐２００７．Ｖｏｌ．２‐Ｐ．１８６‐９． Ｄｏｕｂｌｅ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｗｉｔｈ ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ ｃｏｌｏｎｙ‐ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ ａｎｄ ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ａｃｔｓ ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃａｌｌｙ ｔｏ ｉｍｐｒｏｖｅ ｎｅｒｖｅ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｏｕｔｃｏｍｅ ａｆｔｅｒ ｓｃｉａｔｉｃ ｎｅｒｖｅ ｉｎｊｕｒｙ ｉｎ ｍｉｃｅ／Ｆ．Ｐｅｒｅｉｒａ Ｌｏｐｅｓ［ｅｔ ａｌ．］／／Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ．‐２０１３．Ｖｏｌ．２３０‐Ｐ．１８４‐９７． Ｐａｔ．２４５９６３０ ＲＦ，ＩＰＣ Ａ６１Ｋ ４８／００，Ａ６１Ｐ ２５／２８，Ｃ１２Ｎ １５／７９，Ｃ１．Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ｆｏｒ Ｎｅｕｒｏｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｓ／Ｙｕ．Ａ．Ｃｈｅｌｙｓｈｅｖ；Ｆｅｄｅｒａｌ Ｓｔａｔｅ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ "Ｋａｚａｎ Ｆｅｄｅｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ"．‐Ｎｏ．２０１１１１６８５３／１０；２７．０４．２０１１；ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ２７．１０．２００９，Ｂｕｌｌ．Ｎｏ．３０．‐１１ｐ．［ｉｎ Ｒｕｓｓｉａｎ］ Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｓｔ‐ｔｒａｕｍａｔｉｃ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｒａｔ ｓｃｉａｔｉｃ ｎｅｒｖｅ ｗｉｔｈ ａ ｐｌａｓｍｉｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｔｈｅ ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ａｎｄ ｔｈｅ ｂａｓｉｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ．／Ｒ．Ｆ．Ｍａｓｇｕｔｏｖ［ｅｔ ａｌ］／／Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．‐２０１１．‐６（３）：６７‐７０．［ｉｎ Ｒｕｓｓｉａｎ］．
反復アプローチである。自己移植片を備えた坐骨神経全体を視覚化している。 手術前の上肢の図である。外傷後及び手術後のジグザグ形状の不規則な瘢痕が、右上腕３分の１の下部、中間部及び上部の前面及び後側面に見られる。 第２〜第５指の中間の指骨に活動的な運動がないことを示す写真である。 全指に把握障害が見られる写真である。 正中神経及び尺骨神経に神経支配される領域内での手筋の高度な萎縮、ならびに第１指を第２指に対してのみ対向させられる能力が見られる写真である。 修復した神経への組み換えプラスミドрＢｕｄ（Ｋａｎ）‐ｃｏＶＥＧＦ‐ｃｏＦＧＦ２の注射を示す写真である（本文を参照）。 組み換えプラスミドの漏出を防止するフィブリン糊の塗布を示す写真である。 手筋及び前腕筋の萎縮を示す写真である。ｃ）爪の変化：低形成；ｄ）分泌機能（発汗）：減少 フック把持（バッグの持ち手）を示す写真である。 拳把持を示す写真である。 チップ把握（第Ｉ〜ＩＩＩ指）を示す写真である。 チップ把握（第Ｉ〜ＩＩＩ指）を示す写真である。 チップ把握（第Ｉ〜ＩＶ指）を示す写真である。 母指球筋群の筋電図検査の結果の図表である。 小指球筋群の筋電図検査所見である。
発明の範囲は医学であり、その好ましい使用分野は末梢神経損傷の治療である神経外科学、外傷学及び顎顔面外科学である。
本発明の目的は、遺伝子治療構築物の使用による再建治療の結果を改善することである。ＶＥＧＦ及びＦＧＦ‐２遺伝子の遺伝子配列は２重カセット最適化組み換えプラスミドｐＢｕｄ（Ｋａｎ）‐ｃｏＶＥＧＦ‐ｃｏＦＧＦ２の主成分である。
本発明の物質は、末梢神経の再生を誘導するために、配列番号１に示されるコドン最適化組み換えプラスミドｐＢｕｄ（Ｋａｎ）‐ｃｏＶＥＧＦ‐ｃｏＦＧＦ２に構成された薬物を使用することにより後期損傷後期間を含む治療期間を有意に減少させて、損傷した神経の運動機能及び感受性機能の回復を経て、請求の技術的結果を達成する。
最も近い類似物は、２重カセットプラスミドｐＢｕｄ（Ｋａｎ）‐ＶＥＧＦ‐ＦＧＦ２を注射する際のラット脊髄を外傷後に再生する方法を記載している（特許文献１）である。本発明は以下の目的を保護するものである。
末梢神経再生のための、ヌクレオチド配列番号１に表されるＶＥＧＦ及びＦＧＦ２コード遺伝子を含むコドン最適化組み換えプラスミドｐＢｕｄ（Ｋａｎ）‐ｃｏＶＥＧＦ‐ｃｏＦＧＦ２；
術中又は術後期間内に、配列番号１に表されるコドン最適化組み換えプラスミドｐＢｕｄ（Ｋａｎ）‐ｃｏＶＥＧＦ‐ｃｏＦＧＦ２を神経内、神経周辺及び神経傍に投与することによる末梢神経再生のための刺激技術。
請求項１に記載の損傷領域に有効量のプラスミドｐＢｕｄ（Ｋａｎ）‐ｃｏＶＥＧＦ‐ｃｏＦＧＦ２を注入することによる損傷ヒト神経の治療様式。
遺伝子治療薬開発の経験に基づいて、本発明者らの研究グループは、末梢神経損傷患者を治療するための効果的な製品の創出を目指した。この目的のために、本発明者らは、コードされた導入遺伝子の数が互いに異なり、更にその導入遺伝子のヌクレオチド配列が互いに異なる様々な遺伝子治療構築物を開発した。
末梢神経回復を改善するために遺伝子治療構築物を使用した知見はすでに報告されている（非特許文献２６）。離開性末梢神経損傷モデルにおいてＶＥＧＦ及びＦＧＦ２遺伝子を同時にコードするプラスミドを使用する有効性を評価する際、遠位及び近位末端ならびに自己神経移植片に、等しく合計４５μｇで薬剤を直接注入した。実験動物としてラットを用い；それらを３つの群、すなわち無処置群、遺伝子治療構築物を投与した試験群、及び試験薬の代わりにリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）溶液を注入した対照群に分けた。
末梢神経の再生動態の評価基準には、神経伝導速度や筋肉応答振幅などの神経生理学的パラメータ、ならびに有髄線維の数や毛細血管網密度などの組織学的検査所見が含まれていた。プラスミド構築物注射から５６日目に、試験群の神経生理学的パラメータは対照群のものより優れていたが、無処置動物のものより有意に劣っていた。組織学的検査所見によれば、断面積単位当たりの有髄線維数は、対照群と比較して実験群で有意に高かったが、それにもかかわらず、四肢機能の有効な回復は観察されなかった。
実験結果から、増殖因子の遺伝子配列を含むプラスミドをベースとする構築物の使用により末梢神経の再生に対する刺激効果が現れるが、その効果の強さは最適を下回ることが示された。本発明者らは、このことは主に研究に使用したプラスミド自体の欠点に起因すると考えている。遺伝子治療構築物の特性を改善するために、その構造の重要な変更を多数行った。第１に、ベクターを修飾し：タグ配列を除去し、カナマイシン耐性遺伝子を置換した。第２に、発現効率を高めるために、ＶＥＧＦ及びＦＧＦ２遺伝子（配列番号１）のコドン最適化ｃＤＮＡ配列を使用した。その後、コドン最適化プラスミドを用い、末梢神経損傷モデルにおいて多数の実験的研究を再度行った。末梢神経を縫合した直後に、遺伝子治療構築物を神経内に投与した。結果は外科的介入及び薬物投与から６０日後に評価した（図１）。
使用した全てのプラスミドＤＮＡのうち、ＦＧＦ‐２及びＶＥＧＦの遺伝子配列を含むコドン最適化２重カセットプラスミドで最良の結果が得られた。
末梢神経再生を改善するために使用される遺伝子治療構築物ｐＢｕｄ（Ｋａｎ）‐ＶＥＧＦ‐ＦＧＦ２の有効性に関する非臨床データに基づいて、臨床研究を開始した。その結果を下記に示す。
１９８５年生まれの患者Ｂは、２０１１年４月４日、タタールスタン共和国のＭｏＨの共和国臨床病院における外傷センターに入院し、以下のように診断された：右上腕の中央３分の１に位置する正中神経及び尺骨神経損傷の後遺症（図２）。
既往歴から：２００９年に、上腕の中央３分の１にガラスによる裂傷を受け、正中神経及び尺骨神経が損傷した。直ちに正中神経及び尺骨神経を端端縫合したが、運動機能及び感受性機能の両方は手術直後の期間では完全に喪失していた。リハビリテーション療法の経過からは目に見える結果はもたらされなかった。その後、７カ月後、運動及び感受性機能回復に改善の変化が見られなかったことから、２０１０年に正中神経及び尺骨神経の神経剥離術が行われた。術後経過観察では再生にわずかな変化が認められ、すなわち感受性の完全な欠如と同時に、手及び指の軽度の屈曲を特徴とする運動機能が現れたため、外科的処置を行うことを決定した。
手術に先立って、２０１１年４月２１日に患者を検査し、次のような結果が得られた：
栄養障害：
ａ）皮膚の状態：正常な色、指の温度低下、冷感の増加；
ｂ）正常な腕と比較して、手及び前腕の筋肉の萎縮；２ｃｍ超（図２〜３）；
ｃ）爪の変化：低形成；
ｄ）分泌機能（発汗）：減少。
神経による神経支配の自律領域における患者の感受性試験：
運動機能試験
手の把握パターン；手はあらゆる形態の把握が不能（図３〜４）。
診断：２年前から持続している前腕の中央３分の１の正中神経及び尺骨神経の損傷。正中神経及び尺骨神経の縫合及び神神経剥離術後の状態（図５）。
ｖｅｇｆ及びｆｇｆ‐２遺伝子をコードするプラスミドＤＮＡの神経内投与による正中神経及び尺骨神経の神経剥離術を含む操作を２０１１年４月２６日に行われた。
手術の実施：神経ブロック麻酔下で、手術野の３重治療の後、右上腕の内面に弓状の切開を施した。正中神経と尺骨神経の単離は技術的に困難であった。
縫合線が見つかった。神経腫の症状は観察されなかったが、神経は瘢痕形成過程に関与し、周囲組織に接着していた。組み換えＶＥＧＦ及びＦＧＦ‐２を含有するプラスミドをインスリン注射針により、２．５ｍｌの生理食塩水溶液中、２５０μｇ／神経で注射した。注射は縫合領域ならびに近位及び遠位で、１０ｃｍ間に施した（図６）。その後、２ｍｌの２成分フィブリン糊「Ｔｉｓｓｕｃｏｌ」を単離神経に塗布した（図７）。止血。創傷縫合。ゴムチューブのドレナージを設置する。無菌ドレッシングを施す。石膏ギプスを施す。手術から１ヶ月後に再検査を実施した。
２０１１年５月２５日の身体検査の結果：栄養障害：
ａ）皮膚の状態：正常な色；
ｂ）正常な腕と比較して、手及び前腕の筋肉の萎縮‐２ｃｍ超（図８）；
ｃ）爪の変化：低形成；
ｄ）分泌機能（発汗）：減少。
神経による神経支配の自律領域における患者の感受性試験：
運動機能試験
手による把握パターン：手はあらゆる形態の把握が不能。
手術から６か月後に定期検査を実施した。２０１２年１１月１５日の身体検査の結果：
栄養障害：
ａ）皮膚の状態：正常な色；
ｂ）正常な腕と比較して、手及び前腕の筋肉の萎縮‐中程度（１〜２ｃｍ）、及び重度‐２ｃｍ超；
ｃ）爪の変化：正常範囲内；
ｄ）分泌機能（発汗）：正常。
神経による神経支配の自律領域における患者の感受性試験：
運動機能試験
手の把握パターン：
１）円柱形状把持‐ＹＥＳ
２）球状把持‐ＹＥＳ
３）フック把持（バッグの持ち手）‐ＹＥＳ
４）拳把持‐ＹＥＳ
５）チップ把握
ａ）末端反対側把持‐ＹＥＳ
ｂ）（末端付近反対側把持‐ＮＯ）
６）側部把握
ａ）ピンチグリップ‐ＮＯ
ｂ）（はさみグリップ‐「煙草」）‐ＮＯ。
手術の１年後に、患者は定期検査を受けた。
２０１２年４月２０日の身体検査の結果：
栄養障害：
ａ）皮膚の状態：正常な色；
ｂ）正常な腕と比較して、手及び前腕の筋肉の萎縮‐中程度、１〜２ｃｍ；
ｃ）爪の変化：正常範囲内；
ｄ）分泌機能：正常範囲内。
神経による神経支配の自律領域における患者の感受性試験：
運動機能試験
手の把握パターン：
１）円柱形状把持‐ＹＥＳ
２）球状把持‐ＹＥＳ
３）フック把持‐ＹＥＳ（図９）
４）拳把持‐ＹＥＳ（図１０）
５）チップ把握：（図１１〜１３）
ａ）末端反対側把持‐ＹＥＳ
ｂ）（末端付近反対側把持‐ＹＥＳ）
６）側部把握
ａ）ピンチグリップ‐ＹＥＳ
ｂ）はさみグリップ‐ＹＥＳ。
従って、臨床研究の結果から、四肢機能が遺伝子治療構築物の内部投与後１年で有意に改善したことが分かる。改善された四肢の機能的状態は、栄養障害の重症度の低下、正中神経及び尺骨神経の神経支配領域内の全種類の感受性の発達、ならびに運動機能の有意な改善として明らかになった。筋電図の結果によれば、母指球筋の応答振幅は１年間で０ｍＶから５ｍＶに増加し、対側四肢の値をほぼ達成した（図１４及び１５）。
２重カセットプラスミドの使用の有効性は、末梢神経再生のより効果的な誘発を促進する２つの遺伝子ＶＥＧＦ及びＦＧＦ２の同時移入の実行可能性に起因する。コドン最適化プラスミド構造に導入された変化は、コードされた遺伝子の発現を有意に増加させ、末梢神経回復の有効性を促進する外傷中心にあるこれらの増殖因子の必要治療濃度を確保することを可能にする。従って、プラスミドｐＢｕｄ（Ｋａｎ）‐ｃｏＶＥＧＦ‐ｃｏＦＧＦ２を使用する場合に達成される臨床効果は、これら２つの増殖因子の併用及びそのコドン配列の最適化により得られたと考えられる。
不都合にも、現段階では、上記の遺伝子治療構築物によって末梢神経再生誘導の機序を明確に決定することは不可能であり、更なる研究が必要である。しかし、末梢神経損傷の外科的治療の結果を改善するために上記構造物を使用する有効性が、実験及び臨床的観察において判定及び実証されている。
２重カセットプラスミドｐＢｕｄ（Ｋａｎ）‐ｃｏＶＥＧＦ１６５‐ｃｏＦＧＦ２の配列番号１：
＜１１０＞ ＯＯＯ≪НекстГен≫、ＬＬＣ「ＮｅｘｔＧｅｎ」
＜１２０＞ コドン最適化組み換えプラスミド、末梢神経再生のための刺激技術、損傷ヒト神経の治療様式
＜１６０＞ １
＜１７０＞ ＰａｔｅｎｔＩｎ バージョン３．５
＜２１１＞ ５７０１
＜２１２＞ ＤＮＡ
＜２１３＞ 人工配列
＜２２３＞ 発現プラスミド
gcgcgcgttgacattgattattgactagttattaatagtaatcaattacggggtcattag 60
ttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggct 120
gaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgc 180
caatagggactttccattgacgtcaatgggtggactatttacggtaaactgcccacttgg 240
cagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaat 300
ggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtaca 360
tctacgtattagtcatcgctattaccatggtgatgcggttttggcagtacatcaatgggc 420
gtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatggga 480
gtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgccccat 540
tgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagctctctggc 600
taactagagaacccactgcttactggcttatcgaaattaatacgactcactatagggaga 660
cccaagcttacaagtttgtacaaaaaagcaggctcaccatggcagccgggagcatcacca 720
cgctgcccgccttgcccgaggatggcggcagcggcgccttcccgcccggccacttcaagg 780
accccaagcggctgtactgcaaaaacgggggcttcttcctgcgcatccaccccgacggcc 840
gagttgacggggtccgggagaagagcgaccctcacatcaagctacaacttcaagcagaag 900
agagaggagttgtgtctatcaaaggagtgtgtgctaaccgttacctggctatgaaggaag 960
atggaagattactggcttctaaatgtgttacggatgagtgtttcttttttgaacgattgg 1020
aatctaataactacaatacttaccggtcaaggaaatacaccagttggtatgtggcactga 1080
aacgaactgggcagtataaacttggatccaaaacaggacctgggcagaaagctatacttt 1140
ttcttccaatgtctgctaagagctgaacccagctttcttgtacaaagtggtgtttgatcc 1200
ccgggaattcagacatgataagatacattgatgagtttggacaaaccacaactagaatgc 1260
agtgaaaaaaatgctttatttgtgaaatttgtgatgctattgctttatttgtaaccatta 1320
taagctgcaataaacaagttggggtgggcgaagaactccagcatgagatccccgcgctgg 1380
aggatcatccagccggcgtcccggaaaacgattccgaagcccaacctttcatagaaggcg 1440
gcggtggaatcgaaatctcgtagcacgtggtctgacgctcagtggaacgacgcgtaactc 1500
acgttaagggattttggtcatgagcttgcgccgtcccgtcaagtcagcgtaatgctctgc 1560
cagtgttacaaccaattaaccaattctgattagaaaaactcatcgagcatcaaatgaaac 1620
tgcaatttattcatatcaggattatcaataccatatttttgaaaaagccgtttctgtaat 1680
gaaggagaaaactcaccgaggcagttccataggatggcaagatcctggtatcggtctgcg 1740
attccgactcgtccaacatcaatacaacctattaatttcccctcgtcaaaaataaggtta 1800
tcaagtgagaaatcaccatgagtgacgactgaatccggtgagaatggcaaaagtttatgc 1860
atttctttccagacttgttcaacaggccagccattacgctcgtcatcaaaatcactcgca 1920
tcaaccaaaccgttattcattcgtgattgcgcctgagcgagacgaaatacgcgatcgctg 1980
ttaaaaggacaattacaaacaggaatcgaatgcaaccggcgcaggaacactgccagcgca 2040
tcaacaatattttcacctgaatcaggatattcttctaatacctggaatgctgtttttccg 2100
gggatcgcagtggtgagtaaccatgcatcatcaggagtacggataaaatgcttgatggtc 2160
ggaagaggcataaattccgtcagccagtttagtctgaccatctcatctgtaacatcattg 2220
gcaacgctacctttgccatgtttcagaaacaactctggcgcatcgggcttcccatacaag 2280
cgatagattgtcgcacctgattgcccgacattatcgcgagcccatttatacccatataaa 2340
tcagcatccatgttggaatttaatcgcggcctcgacgtttcccgttgaatatggctcata 2400
acaccccttgtattactgtttatgtaagcagacagttttattgttcatgatgatattatt 2460
ttatcttgtgcaatgtaacatcagagattttgagacacgggccagagctgctcgtcgagc 2520
tagcttcgtgaggctccggtgcccgtcagtgggcagagcgcacatcgcccacagtccccg 2580
agaagttggggggaggggtcggcaattgaaccggtgcctagagaaggtggcgcggggtaa 2640
actgggaaagtgatgtcgtgtactggctccgcctttttcccgagggtgggggagaaccgt 2700
atataagtgcagtagtcgccgtgaacgttctttttcgcaacgggtttgccgccagaacac 2760
aggtaagtgccgtgtgtggttcccgcgggcctggcctctttacgggttatggcccttgcg 2820
tgccttgaattacttccacctggctccagtacgtgattcttgatcccgagctggagccag 2880
gggcgggccttgcgctttaggagccccttcgcctcgtgcttgagttgaggcctggcctgg 2940
gcgctggggccgccgcgtgcgaatctggtggcaccttcgcgcctgtctcgctgctttcga 3000
taagtctctagccatttaaaatttttgatgacctgctgcgacgctttttttctggcaaga 3060
tagtcttgtaaatgcgggccaggatctgcacactggtatttcggtttttgggcccgcggc 3120
cggcgacggggcccgtgcgtcccagcgcacatgttcggcgaggcggggcctgcgagcgcg 3180
gccaccgagaatcggacgggggtagtctcaagctggccggcctgctctggtgcctggcct 3240
cgcgccgccgtgtatcgccccgccctgggcggcaaggctggcccggtcggcaccagttgc 3300
gtgagcggaaagatggccgcttcccggccctgctccagggggctcaaaatggaggacgcg 3360
gcgctcgggagagcgggcgggtgagtcacccacacaaaggaaaagggcctttccgtcctc 3420
agccgtcgcttcatgtgactccacggagtaccgggcgccgtccaggcacctcgattagtt 3480
ctggagcttttggagtacgtcgtctttaggttggggggaggggttttatgcgatggagtt 3540
tccccacactgagtgggtggagactgaagttaggccagcttggcacttgatgtaattctc 3600
gttggaatttgccctttttgagtttggatcttggttcattctcaagcctcagacagtggt 3660
tcaaagtttttttcttccatttcaggtgtcgtgaacacgtggtcgcggccgcaagcttca 3720
ccatgaactttctgctgtcttgggtgcattggagccttgccttgctgctctacctccacc 3780
atgccaagtggtcccaggctgcacccatggcagaaggaggagggcagaatcatcacgaag 3840
tggtgaagttcatggatgtctatcagcgcagctactgccatccaatcgagaccctggtgg 3900
acatcttccaggagtaccctgatgagatcgagtacatcttcaagccatcctgtgtgcccc 3960
tgatgcgatgcgggggctgctgcaatgacgagggcctggagtgtgtgcccactgaggagt 4020
ccaacatcaccatgcagattatgcggatcaaacctcaccaaggccagcacataggagaga 4080
tgagcttcctacagcacaacaaatgtgaatgcagaccaaagaaagatagagcaagacaag 4140
aaaatccctgtgggccttgctcagagcggagaaagcatttgtttgtacaagatccgcaga 4200
cgtgtaaatgttcctgcaaaaacacagactcgcgttgcaaggcgaggcagcttgagttaa 4260
acgaacgtacttgcagatgtgacaagccgaggcggtgatctagagtttaaacccgctgat 4320
cagcctcgactgtgccttctagttgccagccatctgttgtttgcccctcccccgtgcctt 4380
ccttgaccctggaaggtgccactcccactgtcctttcctaataaaatgaggaaattgcat 4440
cgcattgtctgagtaggtgtcattctattctggggggtggggtggggcaggacagcaagg 4500
gggaggattgggaagacaatagcaggcatgctggggatgcggtgggctctatggcttctg 4560
aggcggaaagaaccagtggcggtaatacggttatccacagaatcaggggataacgcagga 4620
aagaacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctg 4680
gcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcag 4740
aggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctc 4800
gtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcg 4860
ggaagcgtggcgctttctcatagctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgtt 4920
cgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatcc 4980
ggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagcc 5040
actggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtgg 5100
tggcctaactacggctacactagaaggacagtatttggtatctgcgctctgctgaagcca 5160
gttaccttcggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagc 5220
ggtggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagat 5280
cctttgatcttttctacggggtctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaagggatt 5340
ttggtcatgacattaacctataaaaataggcgtatcacgaggccctttcgtctcgcgcgt 5400
ttcggtgatgacggtgaaaacctctgacacatgcagctcccggagacggtcacagcttgt 5460
ctgtaagcggatgccgggagcagacaagcccgtcagggcgcgtcagcgggtgttggcggg 5520
tgtcggggctggcttaactatgcggcatcagagcagattgtactgagagtgcaccatata 5580
tgcggtgtgaaataccgcacagatgcgtaaggagaaaataccgcatcaggcgccattcgc 5640
cattcaggctgcgcaactgttgggaagggcgatcggtgcgggcctcttcgctattacgcc 5700
a
主要ベクトル要素：
カナマイシン耐性遺伝子‐１４６９〜２５１１
遺伝子ＦＧＦ２ｃＤＮＡ（コドン組成により最適化された）‐６９９〜１１６６
遺伝子ＶＥＧＦ１６５ｃＤＮＡ（コドン組成により最適化された）‐３７２３〜４２９７
コザック配列‐６９５〜６９８及び３７１９〜３７２２。

Claims (3)

  1. 末梢神経再生のための、ヌクレオチド配列番号１に表されるＶＥＧＦ及びＦＧＦ２コード遺伝子を含むコドン最適化組み換えプラスミドｐＢｕｄ（Ｋａｎ）‐ｃｏＶＥＧＦ‐ｃｏＦＧＦ２。
  2. 術中又は術後期間内に、配列番号１に表されるコドン最適化組み換えプラスミドｐＢｕｄ（Ｋａｎ）‐ｃｏＶＥＧＦ‐ｃｏＦＧＦ２を神経内、神経周辺及び神経傍に投与することによる末梢神経再生のための誘導技術。
  3. 請求項１に記載の損傷領域に有効量のプラスミドｐＢｕｄ（Ｋａｎ）‐ｃｏＶＥＧＦ‐ｃｏＦＧＦ２を注入することによる損傷ヒト神経の治療様式。
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