JP2017532030A - 診断方法及び組成物 - Google Patents

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Abstract

遺伝子に関する情報の同定のための方法及び組成物が提供される。本明細書において提供される方法の少なくとも一部分は、熱サイクリングなしで遂行され得る。方法及び組成物は、核酸ポリメラーゼ及びプライマー等の試薬を含み得る。本明細書において提供されるものは、遺伝子に関する情報の同定に関する方法及び組成物である。実施形態では、ホスト遺伝物質中の統合された遺伝子を評価するための改善された試薬及び方法が提供される。例えば、ＭＲＳＡ検出のための改善された試薬及び方法が提供される。

Description

（発明の背景）
被験者の遺伝子における変異、又は病原体への感染に苦しむ被験者を効果的に診断し、及び治療するためには、しばしば変異又は病原体に関する詳細な遺伝子の情報を得ることが望ましい。
例えば、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）は、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の一種であり、ヒトへの感染を引き起こすことができ、及びβ−ラクタム抗生物質に耐性である。特定の抗生物質に対する耐性の結果として、ＭＲＳＡ感染は治療が困難である。
黄色ブドウ球菌は、典型的には、ｍｅｃＡ遺伝子を獲得することによりメチシリン耐性となる。このｍｅｃＡ遺伝子は、典型的にはブドウ球菌カセット染色体（ｓｔａｐｈｙｌｏｃｃａｌ ｃａｓｓｅｔｔｅ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ｍｅｃ：ＳＣＣｍｅｃ）中に位置し、多重遺伝子であり、転移可能なゲノム要素である。異なるタイプのＳＣＣｍｅｃが存在し、周知のＳＣＣｍｅｃのタイプは、長さにおいて約２１，０００〜６７，０００ヌクレオチドの範囲にわたる。一般的に、ＳＣＣｍｅｃのそれぞれのタイプでは、このｍｅｃＡ遺伝子はＳＣＣｍｅｃの他の構成要素である他の遺伝子、又は要素に取り囲まれている。ＭＲＳＡ菌においては、ｍｅｃＡ遺伝子を含むＳＣＣｍｅｃは、黄色ブドウ球菌染色体に統合化されている。
ＭＲＳＡ菌を特定し、及び制御するために、ＭＲＳＡ検出のために効果的な試薬及び方法が必要とされる。加えて、ホストの遺伝物質中の他の統合された遺伝子を評価するための、及び２つ以上の遺伝学的要素が共通の分子内にあるかどうかを評価するための、改善された試薬及び方法が必要とされる。
別の例として、Ｃ型肝炎遺伝子型１ａでは、プロテアーゼ遺伝子、非構造タンパク質３（“ＮＳ３”；“ｐ−７０”としても知られる）中に、プロテアーゼ阻害剤ボセプレビル（ｂｏｃｅｐｒｅｖｉｒ）による治療の失敗に関係する多型部位Ｑ８０Ｋが存在する。プロテアーゼ阻害剤ボセプレビルは、多型がない場合には、ウイルス中のタンパク質の成熟を阻害するために効果的である。サブタイプ１ａを有する患者の、ＮＳ３遺伝子中のＱ８０多型を評価することは、治療計画の策定の一部として重要であり得る。
従って、Ｑ８０多型を評価するための、改善された試薬及び方法が必要とされる。加えて、他のＳＮＰ、点突然変異、及び他のヌクレオチドの変異を評価するための、改善された試薬及び方法が必要とされる。
（参照による組み込み）
本明細書において言及される、全ての刊行物、特許及び特許出願は、個々の刊行物、特許及び特許出願のそれぞれが、参照により組み込まれるために、あたかも明確に、及び個々に参照により示されるのと同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。しかしながら、本明細書の明確な開示の内容と、参照により本明細書に組み込まれた内容が対立する場合には、本明細書の明確な開示の内容が支配する。
（発明の要旨）
本明細書において提供されるものは、遺伝子に関する情報の同定に関する方法及び組成物である。実施形態では、ホスト遺伝物質中の統合された遺伝子を評価するための改善された試薬及び方法が提供される。例えば、ＭＲＳＡ検出のための改善された試薬及び方法が提供される。実施形態では、少なくとも第一の遺伝学的要素及び第二の遺伝学的要素の両方が、共通の核酸分子上にあるか否かを評価するための、改善された試薬及び方法が提供される。そのような実施形態では、前記第一の遺伝学的要素、及び前記第二の遺伝学的要素は、前記共通の核酸分子上で多数のヌクレオチドにより、互いに隔てられ得る。他の実施形態では、ＳＮＰ及び点突然変異を評価するための、改善された試薬及び方法が提供される。例えば、Ｃ型肝炎ＮＳ３遺伝子中のＱ８０多型を評価するための改善された試薬及び方法が提供される。
実施形態では、本明細書において提供されるものは、共通の二本鎖の核酸分子上の、第一の遺伝学的要素及び第二の遺伝学的要素を、検出するための方法であり、この方法は以下を含む：第一の増幅反応混合物中で第一の増幅反応を遂行することであって、前記第一の増幅反応混合物は：ｉ）前記共通の二本鎖の核酸分子を含み、前記共通の二本鎖の核酸分子は、第一の鎖及び第二の鎖、並びに前記第一の遺伝学的要素、及び前記第二の遺伝学的要素も含み、前記第一の遺伝学的要素は、第一の遺伝学的要素の第一の相補的配列、及び第一の遺伝学的要素の第二の相補的配列を含み、前記第二の遺伝学的要素は、第二の遺伝学的要素の第一の相補的配列、及び第二の遺伝学的要素の第二の相補的配列を含み、前記第一の遺伝学的要素の第一の相補的配列、及び前記第二の遺伝学的要素の第一の相補的配列は、前記第一の鎖の一部であり、及び前記第一の遺伝学的要素の第二の相補的配列、及び前記第二の遺伝学的要素の第二の相補的配列は、前記第二の鎖の一部であり；ｉｉ）第一の増幅反応の第一のプライマーであって、前記第一の増幅反応の第一のプライマーは、前記第一の遺伝学的要素の第一の相補的配列に相補的なヌクレオチド配列を有し；及びｉｉｉ）第一の増幅反応の第二のプライマーであって、前記第一の増幅反応の第二のプライマーは、前記第二の遺伝学的要素の第二の相補的配列に相補的なヌクレオチド配列を有し、及び第一の増幅反応生成物が、前記第一の増幅反応混合物中に生成され、前記第一の増幅反応生成物は、前記第一の遺伝学的要素の少なくとも一部分及び前記第二の遺伝学的要素の少なくとも一部分を含み、及び前記第一の増幅反応生成物は、二本鎖の、直線状形態を有し；連結反応混合物中で連結反応を遂行することであって、この連結反応混合物は：ｉ）前記第一の増幅反応生成物；及びｉｉ）リガーゼ酵素を含み、及び連結反応混合物中には環状連結生成物が、前記第一の増幅反応生成物から形成され、前記環状連結生成物は二本鎖であり、及び環状連結生成物の第一の鎖及び環状連結生成物の第二の鎖を含み、及び前記環状連結生成物の第一の鎖は、前記第一の増幅反応生成物の第一の鎖のヌクレオチドを含み、及び前記環状連結生成物の第二の鎖は、前記第一の増幅反応生成物の第二の鎖のヌクレオチドを含み；及び第二の増幅反応を第二の増幅反応混合物で遂行することであって、前記第二の増幅反応混合物は：ｉ）前記環状連結生成物；ｉｉ）第二の増幅反応の第一のプライマーを含み、前記第二の増幅反応の第一のプライマーは、前記第一の遺伝学的要素の第二の相補的配列に相補的なヌクレオチド配列を有し；及びｉｉｉ）第二の増幅反応の第二のプライマーを含み、前記第二の増幅反応の第二のプライマーは、前記第二の遺伝学的要素の第一の相補的配列に相補的なヌクレオチド配列を有し、及び第二の増幅反応生成物が、前記第二の増幅反応混合物に生成され、前記第二の増幅反応生成物は、前記第一の遺伝学的要素の少なくとも一部分及び前記第二の遺伝学的要素の少なくとも一部分を含み；及び前記第二の増幅反応生成物を検出すること。随意的に、前記方法は、更に、前記連結反応を遂行する前に、前記第一の増幅反応生成物をキナーゼ酵素とインキュベートすることを含み得る。
実施形態では、第一の遺伝学的要素及び第二の遺伝学的要素を含む二本鎖の核酸分子を含む、本明細書において提供される組成物又は方法では、前記第一の遺伝学的要素、及び前記第二の遺伝学的要素は、前記二本鎖の核酸分子上で、互いから、少なくとも１００、２００、５００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、１０，０００、１５，０００、２０，０００、２５，０００、又は３０，０００、及び２００、５００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、１０，０００、１５，０００、２０，０００、２５，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、６０，０００、７０，０００、８０，０００、９０，０００、又は１００，０００以下のヌクレオチドにより隔てられていることができる。
実施形態では、第一の増幅反応を含む、本明細書において提供される方法又は組成物では、前記第一の増幅反応は、ＰＣＲ増幅反応又は非熱サイクリング増幅反応であってよい。
実施形態では、第二の増幅反応を含む、本明細書において提供される方法又は組成物では、前記第二の増幅反応は、ＰＣＲ増幅反応又は非熱サイクリング増幅反応であってよい。
実施形態では、第一のプライマー及び第二のプライマーを含む、本明細書において提供される方法又は組成物では、前記第一のプライマー及び前記第二のプライマーは、それぞれ、長さにおいて、少なくとも４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１５、２０、又は２５、及び、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、又は１００以下のヌクレオチドであることができる。
実施形態では、第一のプライマー及び第二のプライマーを含む、本明細書において提供される方法又は組成物では、前記第一の増幅反応混合物中の、少なくとも１つ又は両方の前記第一のプライマー及び前記第二のプライマーは、これらのプライマーの５’末端においてリン酸化されている。
実施形態では、キナーゼ酵素を含む、本明細書において提供される方法又は組成物では、前記キナーゼ酵素は、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼである。
実施形態では、リガーゼ酵素を含む、本明細書において提供される方法又は組成物では、前記リガーゼ酵素は、Ｔ４ＤＮＡリガーゼである。
実施形態では、第二の増幅反応の第一のプライマー、及び第二の増幅反応の第二のプライマーを含む、本明細書において提供される方法又は組成物では。
実施形態では、第二の増幅反応の第一のプライマー、及び第二の増幅反応の第二のプライマーを含む、本明細書において提供される方法又は組成物では、前記第二の増幅反応の第一のプライマーは、第一の領域及び第二の領域を含み、前記第二の増幅反応の第一のプライマーの第二の領域は、前記第二の遺伝学的要素の第一の相補的配列に相補的であり、及び前記第二の増幅反応の第二のプライマーは第一の領域及び第二の領域を含み、前記第二の増幅反応の第二のプライマーの第二の領域は、前記第一の遺伝学的要素の第二の相補的配列に相補的であり、及び前記第二の増幅反応の第二のプライマーの第一の領域は、前記第二の増幅反応の第一のプライマーの第一の領域に相補的である。随意的に、前記第二の増幅反応の第二のプライマーの第一の領域は、前記環状連結生成物の第一の鎖の少なくとも一部分にも相補的である。
実施形態では、第二の増幅反応生成物を含む、本明細書において提供される方法又は組成物では、前記第二の増幅反応生成物は、それが生成されると、リアルタイムで検出される。
実施形態では、第一の遺伝学的要素を含む、本明細書において提供される方法又は組成物では、前記第一の遺伝学的要素は、ｍｅｃＡ遺伝子等の抗生物質耐性遺伝子である。
実施形態では、第二の遺伝学的要素を含む、本明細書において提供される方法又は組成物では、前記第二の遺伝学的要素は、黄色ブドウ球菌等の病原体遺伝子である。
実施形態では、本明細書において提供される方法は、生物学的サンプルを被験者から得ることを更に含むことができ、前記被験者からの生物学的サンプルは、共通の二本鎖の核酸分子又はポリヌクレオチドテンプレートを含む。実施形態では、前記生物学的サンプルは、被験者の指から得ることができる。実施形態では、前記生物学的サンプルは、５００、４００、３００、２００、１００、又は５０マイクロリットル以下の容積を有し得る。
実施形態では、共通の二本鎖の核酸分子を含む被験者からの生物学的サンプルを含む、本明細書において提供される方法又は組成物では、 前記サンプル は、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌生命体の中に前記共通の二本鎖の核酸分子を含む。
実施形態では、第一の増幅反応、連結反応、及び第二の増幅反応を含む、本明細書において提供される方法又は組成物では、前記第一の増幅反応、前記連結反応、及び前記第二の増幅反応のすべてが同じ容器内で生じる。
実施形態では、第一の増幅反応、連結反応、及び第二の増幅反応を含む、本明細書において提供される方法又は組成物では、前記第一の増幅反応、前記連結反応、及び前記第二の増幅反応は、異なる容器内で生じる。
実施形態では、連結反応を含む、本明細書において提供される方法又は組成物では、前記連結反応は、環状連結生成物又は末端対末端連結生成物の１つ又は両方をもたらし得る。
実施形態では、本明細書において提供されるものは、ポリヌクレオチドテンプレート中のヌクレオチド配列中の、目的の位置のヌクレオチドの身元を評価する方法であり、この方法は以下を含む：Ａ）ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅反応混合物中に、ポリヌクレオチドテンプレートの複数のコピーを生成することであって、前記ＰＣＲ増幅反応混合物は、ＰＣＲ増幅反応の第一のプライマー及びＰＣＲ増幅反応の第二のプライマーを含み、前記ＰＣＲ増幅反応混合物中では、前記ＰＣＲ増幅反応の第一のプライマーが、前記ポリヌクレオチドテンプレートにアニールし、及び前記ＰＣＲの第二のプライマーは、前記ポリヌクレオチドテンプレートに相補的なポリヌクレオチドにアニールし、前記ＰＣＲ増幅反応混合物では、ＰＣＲ増幅反応生成物の複数のコピーが形成され、前記ＰＣＲ増幅反応生成物は、第一の鎖及び第二の鎖を含む二本鎖の核酸分子であり、及び前記ＰＣＲ増幅反応生成物の第一の鎖は、前記ポリヌクレオチドテンプレートのコピーであり；Ｂ）ステップＡ）で生成された前記ＰＣＲ増幅反応生成物のコピーを、少なくとも非熱サイクリングの第一の反応混合物、及び非熱サイクリングの第二の反応混合物のそれぞれに提供することであって：前記ポリヌクレオチドテンプレートは、第一の部分、第二の部分及び第三の部分を含み、前記第三の部分は、前記ポリヌクレオチドテンプレートの中で、前記第一の部分及び前記第二の部分の間に位置し、及び目的の部分は、前記第三の部分の中にあり；前記非熱サイクリングの第一の反応混合物は、前記ポリヌクレオチドテンプレートのコピー、非熱サイクリングの第一のプライマー、及び非熱サイクリングの第二のプライマーを含み：前記非熱サイクリングの第一のプライマーは、第一の領域及び第二の領域を含み、前記第一の領域は前記プライマーの５’末端を含み、前記第二の領域は、前記プライマーの３’末端を含み、及び前記第二の領域は、前記ポリヌクレオチドテンプレートの第一の部分に相補的であり；前記非熱サイクリングの第二のプライマーは、第一の領域及び第二の領域を含み、前記第一の領域は前記プライマーの５’末端を含み、前記第二の領域は前記プライマーの３’末端を含み、及び前記第二の領域は、前記ポリヌクレオチドテンプレートの第二の部分に相補的な配列に相補的であり；前記非熱サイクリングの第一のプライマーの第一の領域は、前記非熱サイクリングの第二のプライマーの第一の領域に相補的であり；及び前記非熱サイクリングの第二のプライマーの第一の領域は、前記ポリヌクレオチドテンプレートの第三の部分に相補的であり；前記第二の反応混合物は、前記ポリヌクレオチドテンプレートのコピー、非熱サイクリングの第三のプライマー、及び非熱サイクリングの第四のプライマーを含み：前記非熱サイクリングの第三のプライマーは、第一の領域及び第二の領域を含み、前記第一の領域は前記プライマーの５’末端を含み、前記第二の領域は、前記プライマーの３’末端を含み、及び前記第二の領域は、前記ポリヌクレオチドテンプレートの第一の部分に相補的であり；前記非熱サイクリングの第四のプライマーは、第一の領域及び第二の領域を含み、前記第一の領域は前記プライマーの５’末端を含み、前記第二の領域は前記プライマーの３’末端を含み、及び前記第二の領域は、前記ポリヌクレオチドテンプレートの第二の部分に相補的である配列に相補的であり；前記非熱サイクリングの第三のプライマーの第一の領域は、前記非熱サイクリングの第四のプライマーの第一の領域に相補的であり；及び前記非熱サイクリングの第四のプライマーの第一の領域は、前記ポリヌクレオチドテンプレートの第三の部分に相補的であり；及び前記非熱サイクリングの第二のプライマーの第一の領域のヌクレオチド配列は、前記非熱サイクリングの第四のプライマーの第一の領域のヌクレオチド配列とは、１つのヌクレオチド分だけ異なり、前記非熱サイクリングの第二の及び非熱サイクリングの第四のプライマー中の異なるヌクレオチドの位置は、前記非熱サイクリングの第二のプライマーの第一の領域のヌクレオチド配列又は非熱サイクリングの第四のプライマーが、前記ポリヌクレオチドテンプレートの第三の部分のヌクレオチド配列に、配列の最大の相補のために配向する場合に、前記ポリヌクレオチドテンプレート中の目的のヌクレオチドの位置に対応し；Ｃ）前記非熱サイクリングの第一の反応混合物、及び非熱サイクリングの第二の反応混合物を、熱サイクリングのない条件下でインキュベートすること；及びＤ）前記非熱サイクリングの第一の反応混合物中の、ポリヌクレオチドテンプレートの増幅の速度及び量を、前記非熱サイクリングの第二の反応混合物中のポリヌクレオチドテンプレートの増幅の速度及び量と比較することであって、前記ポリヌクレオチドテンプレートの増幅の速度及び量は、前記非熱サイクリングの第二のプライマー、又は非熱サイクリングの第四のプライマーの第一の領域、及び前記ポリヌクレオチドテンプレートの第三の部分のヌクレオチド配列の間の相補性の程度を示す。随意的に、前記ＰＣＲ増幅反応の第一のプライマーは、長さにおいて、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、４０、５０、又は６０、及び１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、又は１００以下のヌクレオチドであり、及び次いで、前記ＰＣＲ増幅反応の第一のプライマーは、前記ポリヌクレオチドテンプレートにアニールされ、ワトソン・クリックの塩基対形成の理論に従うと、前記ＰＣＲ増幅反応の第一のプライマーの少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０ヌクレオチドは、前記ポリヌクレオチドテンプレート上のヌクレオチドに不一致である。随意的に、前記ＰＣＲ増幅反応の第二のプライマーは、長さにおいて、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、４０、５０、又は６０、及び１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、又は１００以下のヌクレオチドであり、及び前記ＰＣＲ増幅反応の第二のプライマーが前記ポリヌクレオチドテンプレートに相補的である前記ポリヌクレオチドにアニールされる時、ワトソン・クリックの塩基対形成の理論に従うと、前記ＰＣＲ増幅反応の第二のプライマーの少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０ヌクレオチドは、対応する前記ポリヌクレオチドテンプレートに相補的な、前記ポリヌクレオチド中のヌクレオチドに不一致である。
実施形態では、ポリヌクレオチドテンプレート中のヌクレオチド配列中の目的の位置を含む、本明細書において提供される方法又は組成物では、前記ポリヌクレオチドテンプレート中のヌクレオチド配列中の目的の部分は、ＳＮＰである。
実施形態では、〜本明細書において提供されるポリヌクレオチドテンプレートは、Ｃ型肝炎ウイルス、随意的に特にＣ型肝炎ＮＳ３遺伝子からのものであることができる。実施形態では、ポリヌクレオチドテンプレート中のヌクレオチド配列中の目的の位置を含む、本明細書において提供される方法又は組成物では、前記ポリヌクレオチドテンプレート中のヌクレオチド配列中の目的の部分は、Ｃ型肝炎ＮＳ３遺伝子の８０番目のアミノ酸をエンコードするコドン中に存在する。
実施形態では、本明細書において提供されるものは、ポリヌクレオチドテンプレートを増幅するための方法であって、前記方法は以下を含む：Ａ）ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅反応混合物中に、ポリヌクレオチドテンプレートの複数のコピーを生成することであって、前記ＰＣＲ増幅反応混合物は、ＰＣＲ増幅反応の第一のプライマー及びＰＣＲ増幅反応の第二のプライマーを含み、前記ＰＣＲ増幅反応混合物中では、前記ＰＣＲ増幅反応の第一のプライマーが、前記ポリヌクレオチドテンプレートにアニールし、及び前記ＰＣＲの第二のプライマーは、前記ポリヌクレオチドテンプレートに相補的なポリヌクレオチドにアニールし、前記ＰＣＲ増幅反応混合物では、ＰＣＲ増幅反応生成物の複数のコピーが形成され、前記ＰＣＲ増幅反応生成物は、第一の鎖及び第二の鎖を含む二本鎖の核酸分子であり、及び前記ＰＣＲ増幅反応生成物の第一の鎖は、前記ポリヌクレオチドテンプレートのコピーであり；Ｂ）前記ポリヌクレオチドテンプレートのコピーを、非熱サイクリング反応の第一のプライマー及び非熱サイクリング反応の第二のプライマーを含む非熱サイクリング反応混合物中でインキュベートすることであって：前記ポリヌクレオチドテンプレートは、第一の部分、第二の部分及び第三の部分を含み、前記第三の部分は、前記ポリヌクレオチドテンプレートの中で、前記第一の部分及び前記第二の部分の間に位置し；前記第一のプライマーは、第一の領域及び第二の領域を含み、前記第一のプライマーの第二の領域は、前記ポリヌクレオチドテンプレートの第一の部分に相補的であり；及び前記第二のプライマーは、第一の領域及び第二の領域を含み、前記第二のプライマーの第二の領域は、前記ポリヌクレオチドテンプレートの第二の部分に相補的な、前記ＰＣＲ増幅反応生成物の第二の鎖の中の配列に相補的であり、前記第二のプライマーの第一の領域は、前記第一のプライマーの第一の領域に相補的であり、及び前記第二のプライマーの第一の領域は、前記ポリヌクレオチドテンプレートの第三の部分に相補的である。
実施形態では、第一の部分及び第二の部分を含むポリヌクレオチドテンプレートを含む、本明細書において提供される方法又は組成物では、前記ポリヌクレオチドテンプレートの第一の部分及び第二の部分は、長さにおいて、それぞれ６〜び３０ヌクレオチドである。
実施形態では、第三の部分を含むポリヌクレオチドテンプレートを含む、本明細書において提供される方法又は組成物では、前記ポリヌクレオチドテンプレートの第三の部分は、長さにおいて、４〜１４ヌクレオチドである。
実施形態では、非熱サイクリング反応 混合物中で、ポリヌクレオチドテンプレートを増幅することを含む、本明細書において提供される方法又は組成物では前記非熱サイクリング反応 混合物中の、前記ポリヌクレオチドテンプレートのコピー 数は、前記方法の開始から６０分以内に少なくとも１０倍に増大される。
実施形態では、非熱サイクリング反応 混合物中で、ポリヌクレオチドテンプレートを増幅することを含む、本明細書において提供される方法又は組成物では、前記ポリヌクレオチドテンプレートの少なくとも３つのコピーを含むコンカテマー鎖が、非熱サイクリング反応混合物のインキュベーションの間に生成される。
実施形態では、本明細書において提供されるものは、本明細書に記載される反応 混合物の任意の１つ以上の構成要素をその中に含む容器である。
実施形態では、本明細書において提供されるものは、本明細書に記載される反応混合物の任意の１つ以上の構成要素をその中に含むキットである。随意的に、キットを含む本明細書において提供される実施形態では、キットの構成要素は、少なくとも２つの別々の流体的に分離されたコンテナーの間に分配される。
図面において、
図１Ａは、本明細書において提供される方法の例示的構成要素の特徴の概略の描写である。
図１Ｂは、本明細書において提供される方法の例示的構成要素の特徴の概略の描写である。
図１Ｃは、本明細書において提供される方法の例示的構成要素の特徴の概略の描写である。
図１Ｄは、本明細書において提供される方法の例示的構成要素の特徴の概略の描写である。
図１Ｅは、本明細書において提供される方法の例示的構成要素の特徴の概略の描写である。
図２は、本明細書において提供される方法の一般的な概略のステップである。
図３は、本明細書においてる提供され方法に従って遂行された反応からの結果を描写するグラフである。
本明細書中の図面及びその中の要素は、必ずしもその形状および尺度を描いたものではないことに注意されたい。例えば、前記図面中の要素の形状又は尺度は、説明の容易さ又は明瞭さのために、単純化又は修正され得る。本明細書中の図面及びその中の要素は、例示的な説明的な目的のみのためのものであり、いかなる方法においても、制限するものであると解釈されるべきではないことも、更に理解されたい。
（発明の詳細な説明）
本明細書において提供されるものは、遺伝子に関する情報の同定に関する方法及び組成物である。実施形態では、ホスト遺伝物質中の統合された遺伝子を評価するための改善された試薬及び方法が提供される。例えば、ＭＲＳＡ検出のための改善された試薬及び方法が提供される。実施形態では、少なくとも第一の遺伝学的要素及び第二の遺伝学的要素の両方が共通の核酸分子上にあるか否かを評価するための改善された試薬及び方法が提供される。そのような実施形態では、前記第一の遺伝学的要素及び前記第二の遺伝学的要素は、前記共通の核酸分子上で多数のヌクレオチドにより、互いに隔てられ得る。他の実施形態では、ＳＮＰ及び点突然変異を評価するための、改善された試薬及び方法が提供される。例えば、Ｃ型肝炎ＮＳ３遺伝子中のＱ８０多型を評価するための改善された試薬及び方法が提供される。本明細書において記載される様々な特徴は、以下に説明される特定の実施形態のいずれにも適用されることができるか、又は任意の他のタイプのシステム、又は遺伝子に関する情報の同定を含むものに適用され得る。本明細書において記載されるシステム及び方法は、スタンドアロンのシステム又は方法として、又は統合されたシステム又は方法の一部として応用され得る。開示されたシステム及び方法の、異なる態様は、個別に、集合的に又は互いの組み合わせにおいて評価され得ることが理解されるであろう。
実施形態では、本明細書において提供されるものは、ＭＲＳＡ検出のためのシステム、 組成物、及び方法である。ＭＲＳＡ検出のための以前の方法は、典型的にはｍｅｃＡ遺伝子及び黄色ブドウ球菌染色体からの遺伝物質について、サンプルを別々に試験する。ｍｅｃＡ遺伝子及び黄色ブドウ球菌染色体からの遺伝物質の両方が前記サンプル中に見出される場合、ＭＲＳＡが存在するという仮定の結論がなされる。しかしながら、ｍｅｃＡ遺伝子はブドウ球菌の外部に存在できる（生物間で移転可能であるＳＣＣｍｅｃの一部として）ために、この結論は正確でない可能性がある。従って、ｍｅｃＡ遺伝子及びブドウ球菌の両方を含むサンプルが実際にはＭＲＳＡを含まない可能性があり；その代わりに、非ＭＲＳＡである黄色ブドウ球菌、及び異なる菌又はｍｅｃＡ遺伝子を含む遊離の遺伝学的要素を含む可能性がある。この状況は、従ってサンプル中のＭＲＳＡの偽陽性の同定を生み出し得る。
本明細書において提供される方法及び組成物は、上記の問題に取り組み、及び黄色ブドウ球菌染色体（及び従って、真のＭＲＳＡ）中のｍｅｃＡ遺伝子を同定するための方法及び組成物を提供する。
黄色ブドウ球菌染色体中のｍｅｃＡ遺伝子を同定するための、可能性のある１つのアプローチは、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を遂行することであり、前記ＰＣＲ反応は、ＭＲＳＡ菌又はＭＲＳＡ遺伝物質を含み得るサンプルを含み、及び前記ＰＣＲ反応のためのプライマーの１つは、ｍｅｃＡ遺伝子の一部にアニールし、及び前記ＰＣＲ反応のための他のプライマーは、黄色ブドウ球菌染色体の一部にアニールするものであろう。そのようなＰＣＲ反応が、反応生成物を産生する場合、黄色ブドウ球菌染色体からのｍｅｃＡ遺伝子及び遺伝物質の両方が、同じ鎖からのものである（及び従って、前記サンプルが真のＭＲＳＡ菌を含む）ことを示すであろう。しかしながら、典型的には、殆どのＭＲＳＡ菌において、ｍｅｃＡ遺伝子は、黄色ブドウ球菌染色体の遺伝物質から数千ヌクレオチド離れているために、一般的にはこのアプローチは効果的ではない。ＭＲＳＡでは、ｍｅｃＡ遺伝子は、ＳＣＣｍｅｃの一部として黄色ブドウ球菌染色体中に統合化され、及びｍｅｃＡ遺伝子は、典型的にはＳＣＣｍｅｃの内部部分であり、その両側がＳＣＣｍｅｃ挿入物の、数千もの追加的核酸により包囲されているという事実に起因する。従来のＰＣＲ及び多くの他の核酸増幅技法は、比較的長いヌクレオチド配列の増幅においてあまり効果的ではないために、ほとんどのＭＲＳＡ菌株において、ｍｅｃＡ遺伝子及び黄色ブドウ球菌染色体の間の比較的大きなヌクレオチド距離は、従来のＰＣＲ（例えば、Ｔａｑポリメラーゼを用いる）、及び多くの他の核酸増幅技法は、比較的長いヌクレオチド配列（例えば、長さにおいて、３０００、４０００、又は５０００ヌクレオチドを超える）に対しては、あまり効果的ではないために、一般的に、上述された従来のＰＣＲ反応の不良な成績をもたらす（例えば、１つのプライマーがｍｅｃＡ遺伝子の一部にアニーリングし、及び他のプライマーが黄色ブドウ球菌染色体の一部分にアニーリングすることが生じて）。
ＳＣＣｍｅｃのタイプは、例えば、そのそれぞれが、参照により、その全体が全ての目的で本明細書に組み込まれる、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ． Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｔｈｅｒ．２００９年１２月，第５３巻１２号，４９６１〜４９６７ページ； Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２０１４年；１０８５：１３１〜４８、及びＭｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２００７年；３９１：８７〜１０２に記載されている。典型的には、このｍｅｃＡ遺伝子が黄色ブドウ球菌染色体中に存在する場合には、黄色ブドウ球菌遺伝物質からは、数千又は数万のヌクレオチドにより分離されている。
実施形態では、本明細書において提供されるものは、黄色ブドウ球菌染色体中に統合されたｍｅｃＡ遺伝子を、同定するための改善された方法及び組成物である。
実施形態では、本明細書において提供される方法は、少なくとも２つのステップを含む：１）その鎖の中でｍｅｃＡ遺伝子の少なくとも一部分、及び黄色ブドウ球菌染色体が、互いに物理的に近接している、核酸鎖を生成するためのステップ；及び２）少なくとも第一のプライマー、第二のプライマー及び前記ステップ１）の核酸鎖を用いる核酸増幅方法を遂行するステップであって、前記第一のプライマーは、ｍｅｃＡ遺伝子の部分にアニールし、及び前記第二のプライマー黄色ブドウ球菌染色体の一部にアニールし、及びｍｅｃＡ遺伝子及び黄色ブドウ球菌染色体の両方の部分を含む増幅生成物が生成される。
；システム及び本明細書において提供される方法の実施形態は以下のように記載され得る：ｍｅｃＡ遺伝子を含むＳＣＣｍｅｃカセットを含む、黄色ブドウ球菌染色体又はその一部分が提供され得る（随意的に“ＭＲＳＡ染色体”と称される）。このＭＲＳＡ染色体２００は、第一のプライマー及び第二のプライマーとインキュベートされることができ、前記第一のプライマーは、ｍｅｃＡ遺伝子の一部（又は随意的に、ＳＣＣｍｅｃカセットの他の要素）に相補的であり、及び前記第二のプライマーは、黄色ブドウ球菌染色体の一部に相補的である。加えて、プライマーの１つ又は両方の５’末端がリン酸化される。ＭＲＳＡ染色体は、第一のＤＮＡ増幅反応において、高い処理能力を有するＤＮＡポリメラーゼとインキュベートされる。例示的な高い処理能力を有するＤＮＡポリメラーゼは、ｐｈｉ２９ポリメラーゼである。前記第一のＤＮＡ増幅反応は、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応 (PCR 反応)又は等温方法であり得る。高い処理能力を有するＤＮＡポリメラーゼの使用により、少なくとも少量の増幅生成物２０２が生成されることができる。この反応からの増幅生成物は、黄色ブドウ球菌及びｍｅｃＡ遺伝物質の両方を含むが、典型的には、この増幅反応からは、少量の増幅された物質２０２だけが生成される。この増幅された物質２０２は、少量しか生成されないために、一般的には検出が困難である。従って、前記増幅された物質は、次いで増幅生成物を、前記増幅反応のために用いられた前記プライマーの５’末端のリン酸基により連結(鎖内又は鎖間連結のいずれかにより)できるＤＮＡリガーゼとインキュベートされる。前記増幅された物質とリガーゼのインキュベーションは、以下の２つの一般的なタイプの連結生成物を生じ得る：ａ）２つ以上の増幅生成物の末端対末端の連結により形成されるコンカテマー；又はｂ）前記第一の増幅反応からの増幅生成物の１つの末端と、同じ増幅生成物他の末端との連結により形成される環状化された生成物。両方のタイプの連結生成物により、ｍｅｃＡ遺伝子は、ブドウ球菌遺伝物質の物理的な近傍にもたらされる（例えば、ａｔｔＲ、ｏｒｆＸ）。従って、連結生成物の両方のタイプは、比較的小さな増幅に対する増幅において最も効果的な核酸増幅方法に対する適切なテンプレートである（例えば、２０００ヌクレオチド以下）。従って、本明細書において提供される方法の次のステップは、第二の核酸増幅ステップに対して前記連結生成物を用いることを含む。この第二の核酸増幅ステップは、少なくとも、ｍｅｃＡ遺伝子の一部分（又は随意的に、ＳＣＣｍｅｃカセットの別の部分）にアニールする第一のプライマー、及びブドウ球菌遺伝物質にアニールする第二のプライマーを用い得る。ＰＣＲ、又はその全体が参照により全ての目的で本明細書に組み込まれる、２０１４年９月１７日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ１４／５６１５１に記載される増幅方法等の、様々な核酸増幅方法を、前記第二の核酸増幅ステップに用い得る。実施形態では、前記第二の核酸増幅ステップの第一のプライマー及び第二のプライマーは、前記第一の核酸増幅ステップの第一のプライマー及び第二のプライマーとは異なる。実施形態では、前記第二の核酸増幅ステップの第一のプライマー及び第二のプライマーは、前記第一の核酸増幅ステップの第一のプライマー及び第二のプライマーと比較して反対の配向を有する。実施形態では、前記第二の核酸増幅ステップの第一のプライマー及び第二のプライマーは、前記第一の核酸増幅ステップの前記第一のプライマー及び第二のプライマーと同一である。
システム及び本明細書において提供される方法の実施形態は図１Ａ〜１Ｅを参照して記載され得る。実施形態では、図１Ａ〜１Ｅ中の、又はそれに関係する組成物及び方法は、本明細書では“遺伝学的要素分析”と称されることができる。二本鎖の核酸分子１０が提供されることができる。前記二本鎖の核酸分子１０は、第一の鎖２２及び第二の鎖２４を含む。
前記二本鎖の核酸１０は、任意の適切な形状、及びコンフォーメションのものであり得る。例えば図１は、前記二本鎖の核酸１０を直線状の二本鎖の核酸として描写しているが、前記二本鎖の核酸１０は、代替的に、例えば環状二本鎖の核酸の一部分、又は全体であることができる。環状二本鎖の核酸は、前記二本鎖の核酸のどちらの鎖にも（その環状形状により）遊離の５’又は３’末端を持たない。加えて、前記二本鎖の核酸１０は、核酸分子の全体であるか、又はより大きな二本鎖の核酸の一部分であることができる。
前記二本鎖の核酸１０は広範囲のソースから提供され得る。例えば前記二本鎖の核酸１０は、被験者から得られたサンプルの中にあるか、又はそれから調製されることができ、それは、培養された微生物から直接得られるか、又は化学的に合成され得る。
前記二本鎖の核酸１０には、１つ以上の異なる遺伝学的要素３２、３４、３６、３８があり得る。例えば、前記二本鎖の核酸１０の中には、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、５０、１００、又はそれを超える異なる遺伝学的要素があり得る。本明細書で用いられるものとしての、“遺伝学的要素”は、遺伝子配列、プロモーター配列、エンハンサー配列、イントロン、エクソン等の核酸分子の、任意の、識別可能な目的の領域を指す。遺伝学的要素は、典型的には、遺伝学的要素の配列の１つが前記第一の鎖２２上にあり、及び遺伝学的要素の他の配列が前記第二の鎖２４上にある、２つの相補的配列を含み、及び前記第一の鎖２２上の要素の配列、及び前記第二の鎖２４上の要素の配列が、ワトソン・クリックの塩基対規則（ＡとＴ；ＣとＧ）に従って、相補的である。典型的には、前記第一の鎖上の相補的配列、及び前記第二の鎖上の相補的配列は、ヌクレオチドの同じ数を含む。更に、本明細書で用いられるものとしての任意の所定の遺伝学的要素に対して、前記第一の鎖の５’から３’への方向における前記要素の配列は、“第一の相補的配列”と称されることができ、及び前記第二の鎖の５’から３’への方向における前記要素の配列は、“第二の相補的配列”と称されることができる。従って、例えば、本明細書で、二本鎖の核酸分子が、例えば第一の遺伝学的要素、第二の遺伝学的要素、及び第三の遺伝学的要素を含む場合には、前記二本鎖の核酸分子の第一の鎖が、“第一の遺伝学的要素第一の相補的配列”、 “第二の遺伝学的要素第一の相補的配列”、及び“第三の遺伝学的要素第一の相補的配列”を含むと記載でき、前記“第一の遺伝学的要素第一の相補的配列”は、第一の遺伝学的要素の第一の相補的配列であり、前記“第二の遺伝学的要素第一の相補的配列”は第二の遺伝学的要素の第一の相補的配列、及び前記“第三の遺伝学的要素第一の相補的配列”は、第三の遺伝学的要素の第一の相補的配列である。同様に、前記二本鎖の核酸分子の第二の鎖が、“第一の遺伝学的要素第二の相補的配列”、“第二の遺伝学的要素第二の相補的配列”、及び“第三の遺伝学的要素第二の相補的配列”を含むと記載されることができ、前記“第一の遺伝学的要素第二の相補的配列”は、第一の遺伝学的要素の第二の相補的配列であり、前記“第二の遺伝学的要素第二の相補的配列”は、第二の遺伝学的要素の第二の相補的配列であり、及び前記“第三の遺伝学的要素第二の相補的配列”は、第三の遺伝学的要素の第二の相補的配列である。配列中の任意の所定の遺伝学的要素の“第一の遺伝学的要素”、“第二の遺伝学的要素”、又は“第三の遺伝学的要素”等としての指定は、一般的には任意的であり、及びこれらの用語は、目的の核酸分子上の異なる目的の遺伝学的要素を指定するために適切であるように用い得る（所定の核酸分子上の同じ遺伝学的要素に対して、用語法が首尾一貫して用いられる限り）。
例えば、図１において、遺伝学的要素３２は、前記第一の鎖上の相補的配列３２ａ及び前記第二の鎖上の相補的配列３２ｂを含む（本明細書では、それぞれ“遺伝学的要素３２第一の相補的配列”及び“遺伝学的要素３２第二の相補的配列”とも称される；この命名システムは、他の遺伝学的要素でも用いることができる）；前記第一の鎖上の配列３２ａ及び前記第二の鎖上の配列３２ｂは、ワトソン・クリックの塩基対規則に従い、相補的である。同様に、遺伝学的要素３４は、前記第一の鎖上の相補的配列３４ａ及び前記第二の鎖上の相補的配列３４ｂを含み；前記第一の鎖上の配列３４ａ及び前記第二の鎖上の配列３４ｂは、ワトソン・クリックの塩基対規則に従い、相補的である。同様に、遺伝学的要素３６は、前記第一の鎖上の相補的配列３６ａ及び前記第二の鎖上の相補的配列３６ｂを含み；前記第一の鎖上の配列３６ａ及び前記第二の鎖上の配列３６ｂは、ワトソン・クリックの塩基対規則に従い、相補的である。同様に、遺伝学的要素３８は、前記第一の鎖上の相補的配列３８ａ及び前記第二の鎖上の相補的配列３８ｂを含み；前記第一の鎖上の配列３８ａ及び前記第二の鎖上の配列３８ｂは、ワトソン・クリックの塩基対規則に従い、相補的である。
強調のために、図１Ａ中の前記遺伝学的要素３２、３４、３６、及び３８は、異なる幾何学的形状により表されている（即ち、要素３２は長方形、３４は三角形等）。しかしながら、幾何学的形状が前記遺伝学的要素の特性の詳細を提供しないことに注意することは重要である（これらの形状は、単に図１Ａ〜Ｅ中に表される様々な概念を概観することを助けるものである）。更に、図１Ａは、相補的配列３２ａ、３４ａ、３６ａ、３８ａ、３２ｂ、３４ｂ、３６ｂ、及び３８ｂを、その上に相補的配列３２ａ、３４ａ、３６ａ、３８ａ、３２ｂ、３４ｂ、３６ｂ、及び３８ｂが存在する、前記第一の鎖２２及び前記第二の鎖２４とは異なる形状で描写しているが、これらの形状は、単に強調のためのものであり、及び前記相補的配列は、実際には、鎖の残りの部分と同じ構造を有する。
遺伝学的要素は、ヌクレオチドのいかなる長さでもあり得る。例えば実施形態では、遺伝学的要素は、長さにおいて、少なくとも３、４、５、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、５００、１０００、２０００、又は５０００ヌクレオチドであることができる。実施形態では、遺伝学的要素は、５、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、５００、１０００、２０００、５０００、又は１０，０００以下のヌクレオチドを含む。実施形態では、遺伝学的要素は、少なくとも３、４、５、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、５００、１０００、２０００、又は５０００、及び９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、５００、１０００、２０００、５０００、又は１０，０００以下のヌクレオチドを含む。典型的には、遺伝学的要素の相補的配列は、５’末端及び３’末端を有するものとみなされることができ、前記相補的配列のヌクレオチドは、前記配列の５’末端及び３’末端を含み、それらの間にある。例えば、遺伝学的要素の相補的配列は、５’から３’への方向において、５’ＴＧＧＡ３’の例示的配列を有し得る。この配列では、“Ｔ”がこのヌクレオチドの配列の５’末端にあり、及び“Ａ”がこのヌクレオチド配列の３’末端にある。
少なくとも第一の遺伝学的要素及び第二の遺伝学的要素を含む二本鎖の核酸分子では、前記第一の遺伝学的要素、及び前記第二の遺伝学的要素は、互いに任意の数のヌクレオチドにより分離され得る。例えば、少なくとも第一の遺伝学的要素及び第二の遺伝学的要素を含む二本鎖の核酸分子では、前記第一の遺伝学的要素及び前記第二の遺伝学的要素は、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、５００、１０００、２０００、５０００、１０，０００、２０，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、６０，０００、７０，０００、又は１００，０００ヌクレオチド、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、５００、１０００、２０００、５０００、１０，０００、２０，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、６０，０００、７０，０００、又は１００，０００以下のヌクレオチド、又は少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、５００、１０００、２０００、又は５０００、及び５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、５００、１０００、２０００、５０００、１０，０００、２０，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、６０，０００、７０，０００、又は１００，０００以下のヌクレオチドにより互いに分離され得る（即ち、前記第一の遺伝学的要素及び前記第二の遺伝学的要素の間に、上述の数のヌクレオチドが存在する）。別の例では、二本鎖の核酸分子は、少なくとも第一の遺伝学的要素及び第二の遺伝学的要素を含むことができ、及び前記二本鎖の核酸分子の第一の鎖の上で、前記第一の遺伝学的要素の第一の相補的配列が、前記第二の遺伝学的要素の第一の相補的配列に対して上流にある場合には、前記第一の遺伝学的要素の第一の相補的配列の３’末端及び前記第二の遺伝学的要素の第一の相補的配列の５’末端の間に、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、５００、１０００、２０００、５０００、１０，０００、２０，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、６０，０００、７０，０００、又は１００，０００ヌクレオチドが存在する。実施形態では、二本鎖の核酸分子は、少なくとも第一の遺伝学的要素及び第二の遺伝学的要素を含むことができ、及び前記二本鎖の核酸分子の第一の鎖の上で、前記第一の遺伝学的要素の第一の相補的配列が、前記第二の遺伝学的要素の第一の相補的配列よりも上流にある場合には、前記第一の遺伝学的要素の第一の相補的配列の３’末端及び前記第二の遺伝学的要素の第一の相補的配列の５’末端の間に、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、５００、１０００、２０００、５０００、１０，０００、２０，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、６０，０００、７０，０００、又は１００，０００以下のヌクレオチドが存在する。実施形態では、二本鎖の核酸分子は、少なくとも第一の遺伝学的要素及び第二の遺伝学的要素を含むことができ、及び前記二本鎖の核酸分子の第一の鎖の上で、前記第一の遺伝学的要素の第一の相補的配列が、前記第二の遺伝学的要素の第一の相補的配列よりも上流にある場合には、前記第一の遺伝学的要素の第一の相補的配列の３’末端及び前記第二の遺伝学的要素の第一の相補的配列の５’末端の間に、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、５００、１０００、２０００、又は５０００、及び５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、５００、１０００、２０００、５０００、１０，０００、２０，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、６０，０００、７０，０００、又は１００，０００以下のヌクレオチドが存在する。上記の言明は、前記第一の遺伝学的要素の第一の相補的配列が、前記第二の遺伝学的要素の第一の相補的配列よりも下流にある場合にも、逆に適用される。
同様に、別の例では、二本鎖の核酸分子は、少なくとも第一の遺伝学的要素及び第二の遺伝学的要素を含むことができ、及び前記二本鎖の核酸分子の第二の鎖の上で、前記第二の遺伝学的要素の第二の相補的配列が、前記第一の遺伝学的要素の第二の相補的配列に対して上流にある場合には、前記第二の遺伝学的要素の第二の相補的配列の３’末端及び前記第一の遺伝学的要素の第二の相補的配列の５’末端の間に、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、５００、１０００、２０００、５０００、１０，０００、２０，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、６０，０００、７０，０００、又は１００，０００ヌクレオチドが存在する。実施形態では、二本鎖の核酸分子は、少なくとも第一の遺伝学的要素及び第二の遺伝学的要素を含むことができ、及び前記二本鎖の核酸分子の第二の鎖の上で、前記第二の遺伝学的要素の第二の相補的配列が、前記第一の遺伝学的要素の第二の相補的配列に対して上流にある場合には、前記第二の遺伝学的要素の第二の相補的配列の３’末端及び前記第一の遺伝学的要素の第二の相補的配列の５’末端の間に、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、５００、１０００、２０００、５０００、１０，０００、２０，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、６０，０００、７０，０００、又は１００，０００以下のヌクレオチドが存在する。実施形態では、二本鎖の核酸分子は、少なくとも第一の遺伝学的要素及び第二の遺伝学的要素を含むことができ、及び前記二本鎖の核酸分子の第二の鎖の上で、前記第二の遺伝学的要素の第二の相補的配列が、前記第一の遺伝学的要素の第二の相補的配列に対して上流にある場合には、前記第二の遺伝学的要素の第二の相補的配列の３’末端及び前記第一の遺伝学的要素の第二の相補的配列の５’末端の間に、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、５００、１０００、２０００、又は５０００、及び５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、５００、１０００、２０００、５０００、１０，０００、２０，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、６０，０００、７０，０００、又は１００，０００以下のヌクレオチドが存在する。
実施形態では、第一の増幅反応は、前記二本鎖の核酸分子１０の少なくとも一部分を増幅するために遂行され得る。しばしば、目的の第一の遺伝学的要素及び目的の第二の遺伝学的要素がサンプル中に存在するか否か、特にそれらが、同じ二本鎖の核酸分子１０の一部であるかを決定することが望ましい。目的の第一の遺伝学的要素及び目的の第二の遺伝学的要素が、同じ二本鎖の核酸分子の一部分であるか否かを決定することが、例えば前記サンプル中に存在する可能性のある病原体の遺伝学的特性等を、より良く理解するために重要である。例えば特定のバクテリアの特定の抗生物質耐性菌株が、被験者からのサンプル中に存在するか否かを決定することに興味が持たれることがあり、及びこのことは、例えば抗生物質耐性遺伝子（即ち、第一の遺伝学的要素）、及びバクテリアの特定の属からの遺伝子（即ち、第二の遺伝学的要素）の両方を含む二本鎖の核酸分子があるかどうかを同定することにより決定され得る。例えばバクテリアが抗生物質耐性遺伝子を獲得し、及びこの抗生物質耐性遺伝子が、バクテリアの染色体に統合された場合に、そのような二本鎖の核酸分子が形成され得る。抗生物質耐性遺伝子は、典型的には、特定の抗生物質又は抗生物質のクラスに、抗生物質又は抗生物質のクラスへの耐性を促進するタンパク質をエンコードすることにより耐性を提供する（例えば、このタンパク質は、例えば抗生物質を化学的に不活性化すること、又は抗生物質をバクテリアの外へポンプすることを促進する）。
従って、前記二本鎖の核酸分子１０の少なくとも一部分を増幅するための第一の増幅反応を遂行することにおいては、目的の第一の遺伝学的要素の少なくとも一部分、及び目的の第二の遺伝学的要素の少なくとも一部分を含む増幅生成物を生成することが望ましい。増幅反応から、この種類の増幅生成物（即ち、目的の第一の遺伝学的要素の少なくとも一部分、及び目的の第二の遺伝学的要素の少なくとも一部分を含む）が、成功裏に生成されることは、増幅反応混合物中に、前記目的の第一の遺伝学的要素、及び前記目的の第二の遺伝学的要素を同じ二本鎖の核酸分子上に含む、テンプレートの二本鎖の核酸分子１０が存在することを示す。本明細書において提供される第一の核酸増幅からの増幅生成物は、本明細書では“第一の増幅反応生成物”と称され得る。
第一の遺伝学的要素少なくとも一部分、及び第二の遺伝学的要素少なくとも一部分を含む第一の核酸増幅生成物を生成する可能性のある第一の増幅反応を遂行するために（前記目的の第一の遺伝学的要素及び前記目的の第二の遺伝学的要素の両方を、同じ二本鎖の核酸分子上に含むテンプレート二本鎖の核酸分子１０が、前記第一の増幅反応混合物中に存在すると仮定して）、第一のプライマー４６及び第二のプライマー４８（それぞれ、“第一の増幅反応第一のプライマー”４６及び“第一の増幅反応第二のプライマー”４８）が、第一の増幅反応混合物中に提供され得る。
前記第一の増幅反応の第一のプライマー４６は、目的の第一の遺伝学的要素３６の少なくとも一部分に相補的なヌクレオチド配列を有することができ、及び実施形態では、特に前記第一の遺伝学的要素３６の第一の相補的配列３６ａの少なくとも一部分に相補的なヌクレオチド配列を有することができる。前記第一の増幅反応の第一のプライマー４６のヌクレオチド配列、及び前記第一の遺伝学的要素３６の第一の相補的配列３６ａの少なくとも一部分のヌクレオチド配列の間の相補性に起因して、前記第一の増幅反応の第一のプライマー４６は、前記第一の遺伝学的要素３６の第一の相補的配列３６ａの少なくとも一部分にアニールできる。前記第一の増幅反応の第一のプライマーを表す、図１Ａ中のブロック型の矢印４６（及び本明細書の図中の全ての他の矢印）では、矢印のとがった末端はこのプライマーの３’末端を表し、及び矢印の長方形の末端は、このプライマーの５’末端を表す。従って、このプライマーは、ポリメラーゼにより、矢印の先端の方向へと伸長される。図１Ａでは、前記第一の増幅反応の第一のプライマー４６が相補的であり、前記第一の増幅反応の第一のプライマー４６がアニールできる、前記第一の相補的配列３６ａの部分が、黒い正方形により図示されている。前記第一の増幅反応の第一のプライマー４６が相補的である、前記第一の相補的配列３６ａの部分４２は、図１Ａにおける前記第一の相補的配列３６ａの一部分であるが、前記第一の増幅反応の第一のプライマー４６が相補的である、前記第一の相補的配列３６ａの部分４２は、代替的に前記第一の相補的配列３６ａの全体であることができ、前記第一の相補的配列３６ａと比較して異なるサイズであることができ、又は前記第一の相補的配列３６ａ中の異なる位置にあることができることを理解されたい。
前記第一の増幅反応第二のプライマー４８は、目的の第二の遺伝学的要素３２少なくとも一部分に相補的なヌクレオチド配列を有することができ、及び実施形態では、特に前記第二の遺伝学的要素３２の第二の相補的配列３２ｂの少なくとも一部分に対して、相補的なヌクレオチド配列を有することができる。前記第一の増幅反応第二のプライマー４８のヌクレオチド配列、及び前記第二の遺伝学的要素３２の第二の相補的配列３２ｂの少なくとも一部分のヌクレオチド配列の間の相補性に起因して、前記第一の増幅反応第二のプライマー４８は、前記第二の遺伝学的要素３２の第二の相補的配列３２ｂの少なくとも一部分にアニールできる。図１Ａでは、前記第一の増幅反応の第二のプライマー４８が相補的であり、前記第一の増幅反応の第二のプライマー４８がアニールできる、前記第二の相補的配列３２ｂの部分が、黒い正方形４４で図示されている。前記第一の増幅反応の第一のプライマー４８が相補的である、前記第一の相補的配列３２ｂの部分４４は、図１Ａにおける前記第一の相補的配列３２ａの一部分であるが、前記第一の増幅反応の第一のプライマー４８が相補的である、前記第一の相補的配列３２ａの部分４４は、代替的に前記第一の相補的配列３２ｂの全体であることができ、前記第一の相補的配列３２ｂと比較して異なるサイズであることができ、又は前記第一の相補的配列３２ｂ中の異なる位置にあることができることを理解されたい。
実施形態では、前記第一の増幅反応第一のプライマー４６の１つ又は両方、及び前記第一の増幅反応第二のプライマー４８は、これらのプライマーの５’末端がリン酸化されることができる。実施形態では、これらのプライマーは、すでにリン酸化された形態にある前記第一の増幅反応混合物に提供され得る。プライマーがすでにリン酸化されていない場合には、プライマーをリン酸化するために、それらはキナーゼ（例えば、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ）と処理され得る。
前記第一の増幅反応は、少なくとも２つのテンプレート特異的なプライマー（例えば、前記第一の遺伝学的要素の配列にアニールするための第一のプライマー、及び前記第二の遺伝学的要素の配列にアニールするための第二のプライマー）を含む、適切な核酸複製技法を利用し得る。実施形態では、前記第一の核酸複製技法はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）である。ＰＣＲは、例えば、参照により全ての目的で本明細書に組み込まれる、米国特許第４，６８３，２０２号中に記載されている。他の実施形態では、前記第一の核酸複製技法は等温増幅反応であってよい。そのような等温増幅は、例えば、ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼ（又は処理能力が高く、鎖置換活性を有する別のＤＮＡポリメラーゼ）を用いることができ、及び最初に、前記共通の二本鎖の核酸分子（前記第一のプライマー及び第二のプライマーが、それらの相補的配列にアニールすることを可能にするために）を熱変性すること、及び次いで、等温条件（典型的には、４０〜６５Ｃの温度において）下で、プライマーが伸長されること、及びコピーが形成されることを許容することにより遂行され得る。前記第一の増幅反応は、前記第一の遺伝学的要素の少なくとも一部分及び前記第二の遺伝学的要素の少なくとも一部分を含む、第一の増幅反応生成物を生成し得る。
前記第一の増幅反応混合物は核酸ポリメラーゼ（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ）を含む。前記第一の増幅反応で用いられる核酸ポリメラーゼは、比較的高い処理能力（即ち、少なくとも長さにおいて例えば３０００ヌクレオチドのテンプレートを直ちに増幅する能力）を有するＤＮＡポリメラーゼであることができる。高い処理能力を有するＤＮＡポリメラーゼとしては、例えばＬｏｎｇＡｍｐ(R) ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ社；Ｔａｑ及びＤｅｅｐＶｅｎｔＲ（商標） ＤＮＡポリメラーゼのブレンドである）、Ｑ５(R)Ｈｉｇｈ−ＦｉｄｅｌｉｔｙＤＮＡポリメラーゼ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏＬａｂｓ社）、Ｐｈｕｓｉｏｎ(R) Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ社）、ＨＯＴＳＴＡＲ ＨＩＧＨＦＩＤＥＬＩＴＹ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｑｉａｇｅｎ）、及びｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。加えて、ａｕｓｅｄｉｎ前記第一の増幅反応において用いられる核酸ポリメラーゼは鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼであってよい。
いくつかの実施形態では、本明細書において提供される増幅反応のための方法及びそのステップは、ポリメラーゼに基づく核酸合成を支持するために十分な条件を含むか、又はその下で遂行される。ポリメラーゼに基づく核酸合成の適切な条件の例は、当技術分野では周知であり、及び例えば、参照により、その全体が本明細書に組み込まれる、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（分子のクローニング：実験室マニュアル）、Ｍ．Ｒ．Ｇｒｅｅｎ及びＪ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ著、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（２０１２年）において提供される。ポリメラーゼに基づく核酸合成反応のための、非限定的な構成要素は以下の１つ以上を含む：ポリメラーゼ酵素（例えば０．０１〜１０酵素単位／５０マイクロリットル反応容積、又はその間の、例えば０．０１〜１、０．１〜１０、０．１〜５、０．５〜１０、０．５〜５、０．５〜２、１〜１０、又は１〜５酵素単位／５０マイクロリットル反応容積を含む任意の範囲の濃度であって、酵素の１単位は、７５Ｃにおいて、３０分間で１５ｎｍｏｌのｄＮＴＰを重合生成物中に取り込む）；テンプレート（少なくとも、例えば１、１０、１００、１，０００、１０，０００、又は１００，０００コピー／反応の濃度での）；プライマー（例えば０．０１〜１０マイクロモルの濃度、又はその間の、例えば、０．０１〜１、０．１〜１０、０．１〜５、０．５〜５、又は０．５〜２マイクロモルを含む任意の範囲の濃度における）；ｄＮＴＰ（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＣＴＰ、例えば５０〜５００マイクロモルのｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＣＴＰのそれぞれの濃度におけるか、又はその間の、例えば５０〜３５０、１００〜５００、１００〜３００、２００〜５００、又は３００〜４００マイクロモルを含む任意の範囲の濃度におけるｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＣＴＰのそれぞれ）；塩（例えば、ＫＣｌ又は酢酸カリウム、例えば１及び２００ミリモルの濃度、又はその間の、例えば、１〜１００、１〜５０、１〜２０、１〜１０、１０〜２０、１０〜５０、又は１０〜２００ミリモルを含む任意の範囲の濃度における）；緩衝液（例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ又はＴｒｉｓ−酢酸、ｐＨ７．８〜８．５、例えば１〜１００ミリモルの濃度、又はその間の、例えば、１〜５０、１〜２０、１〜１０、１〜５、１０〜１００、２０〜１００、又は５０〜１００ミリモルを含む任意の範囲の濃度における）；及びマグネシウム・イオン（例えば０．１〜１０ミリモルの濃度、又はその間の、例えば、０．１〜５、０．１〜１、０．５〜１０、０．５〜５、又は０．５〜２．５ミリモルを含む任意の範囲の濃度における）。ポリメラーゼに基づく核酸合成反応のための追加的な非限定的な構成要素は、反応の速度を増大させることができ、反応の忠実性を増加させることができ、又は反応中の酵素又はＤＮＡの安定性を増加させることができ、及び以下の１つ以上を含む：ゼラチン（例えば０．０００１％〜０．１％ｗ／ｖの濃度における）、ＢＳＡ（例えば０．０１〜１ミリグラム／ミリリットルの濃度における）、ショ糖（例えば０．０１〜０．８モル濃度における）、トレハロース（例えば０．０１〜０．８モル濃度における）、ＤＭＳＯ（例えば０．０１及び１０％ｖ／ｖ濃度における）、ベタイン（例えば０．１〜１０モル濃度における）、ホルムアミド（例えば０．１及び１０％ｖ／ｖ濃度における）、グリセロール（例えば０．１及び２０％ｖ／ｖ濃度における）、ポリエチレングリコール（例えば０．１及び２０％ｖ／ｖ濃度における）、非イオン性界面活性剤[例えば、ＮＰ−４０（例えば０．０１及び１％ｖ／ｖ濃度における）、Ｔｗｅｅｎ−２０（例えば０．０１及び１％ｖ／ｖ濃度における）、又はＴｒｉｔｏｎＸ−１００（例えば０．０１及び１％ｖ／ｖ濃度における）]、アンモニウム・イオン[例えば、硫酸アンモニウム（例えば１及び１００ミリモル濃度における）]、及びＥＤＴＡ（例えば０．００１〜０．１ミリモルの濃度における）。他の試薬も、本明細書において提供されるポリメラーゼに基づく核酸合成反応中に存在できる。例えば、ＲＮＡ反応生成物又は非鎖状ヌクレオチドを含む反応生成物を合成するために十分な試薬を用い得る。ポリメラーゼに基づく核酸合成を支持するために十分な条件は、様々な温度及びｐＨ値を含み得る。例えばポリメラーゼに基づく核酸合成反応のｐＨは、例えば６．５、７、７．５、７．８、７．９、８、８．１、８．２、８．５、９、又は９．５等のｐＨ６．０〜ｐＨ１０．０の間であることができる。ポリメラーゼに基づく核酸合成反応の温度は、一定又は可変で会ってよい。一定の温度は、例えば２０、２５、３０、３５、３７、４０、４２、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、又は８５Ｃ等の、１０Ｃ〜９５Ｃの間であることができる。可変の温度は、例えば２０、２５、３０、３５、３７、４０、４２、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、又は８５Ｃから選ばれる２つ以上の温度等の、１０Ｃ〜９５Ｃの間の２つ以上の異なる温度の間であってよい。いくつかの実施形態では、可変の温度は周期的に変化することができる（例えば、ＰＣＲ反応では、９４〜９８Ｃ、次いで５０〜６５Ｃ、次いで７２〜８０、次いで９４〜９８Ｃに戻る等の間で周期的であり、及びこのサイクルを約１０〜５０サイクル継続する）試薬のうちの任意のものが、本明細書に記載される増幅反応混合物中に提供されることができ；同様に、本明細書に記載される“増幅反応”中に存在するとして記載される任意の試薬は、対応する“増幅反応混合物”中にも存在するとして記載され得る。
図１Ｂは、例示的な第一の増幅反応生成物５０を描写している。前記第一の増幅反応生成物５０は、第一の増幅反応生成物の第一の鎖５２、及び第一の増幅反応生成物の第二の鎖５４を含む。前記第一の増幅反応生成物の第一の鎖５２及び前記第一の増幅反応生成物の第二の鎖５４は、前記第一の増幅反応の第一のプライマー４６、及び前記第一の増幅反応の第二のプライマー４８がアニールする、ヌクレオチドを含むヌクレオチドの間のみが増幅されるために、ヌクレオチド長において、前記共通の二本鎖の核酸分子１０の第一の鎖２２及び第二の鎖２４よりも短い。図１Ｂに描写されるように、前記第一の増幅生成物５０は、遺伝学的要素３２、３４、及び３６を含む。更に、図１Ｂは特定の特徴を遺伝学的要素３２及び３６として標識しているが（及び、従ってこれらの特徴が、図１Ａ中の要素３２及び３６と同一である示唆する）、図１Ｂ（及び後続する図）中の前記要素３２及び３６は、図１Ａ中のものとは、わずかに異なることができることに注意されたい。特に、これらの要素は、図１Ａ中のこれらの要素の中に存在する全てのヌクレオチドは、含まない可能性がある。このことは、例えば前記第一の増幅反応の第一のプライマー４６が相補的である、前記第一の相補的配列３６ａの部分４２が、前記第一の相補的配列３６ａの中央部（末端ではなく）にあり、そのために前記第一の遺伝学的要素の一部だけが、前記第一の増幅反応において増幅されるときに生じる（又はそれに対応する前記第一の増幅反応の第二のプライマー及び前記第二の遺伝学的要素について）。それにもかかわらず、図１Ｂ及び図１内の後続する図において、３２及び３６として標識される特徴は、図Ａにおける３２及び３６の特徴に、それぞれ極めて近い関係を持つヌクレオチド配列を有し−図１Ｂ及び後続する図中のヌクレオチド配列は、図１Ａのものよりも、長さにおいて短いことができる。図１Ｂに示されるように、第一の増幅反応生成物５０は二本鎖の、直線状形態を有し得る。
実施形態では、目的の第一の遺伝学的要素の少なくとも一部分、及び目的の第二の遺伝学的要素の少なくとも一部分を含む第一の増幅反応生成物では、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、５００、１０００、２０００、５０００、１０，０００、２０，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、６０，０００、７０，０００、又は１００，０００ヌクレオチド、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、５００、１０００、２０００、５０００、１０，０００、２０，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、６０，０００、７０，０００、又は１００，０００以下のヌクレオチド、又は少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、５００、１０００、２０００、又は５０００、及び５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、５００、１０００、２０００、５０００、１０，０００、２０，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、６０，０００、７０，０００、又は１００，０００以下のヌクレオチドが、前記第一の遺伝学的要素の３’末端及び前記第二の遺伝学的要素の５’開始点の間に存在する（又はその逆も成り立つ）。
実施形態では、第一の増幅反応生成物は、前記第一の増幅反応生成物の第一の鎖５２、又は前記第一の増幅反応生成物の第二の鎖５４の１つ又は両方の５’末端がリン酸化され得る。リン酸化された第一の増幅反応生成物は、前記第一の増幅反応においてリン酸化された第一の及び第二のプライマーを用いることにより生成され得るか、又は第一の増幅反応生成物は、それが生成されるとすぐにリン酸化され得る。どちらの場合でも、それぞれの分子は、当技術分野で周知の方法によりリン酸化された得る（例えば、ポリヌクレオチドキナーゼにより）。
第一の増幅反応生成物は、その中で連結反応が生じる、連結反応混合物中に提供されることができる。前記連結反応混合物は、ＤＮＡリガーゼ（例えば、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ）を含む。前記連結反応では、ポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡ）鎖の５‘末端のリン酸基が、ポリヌクレオチド鎖の３’ＯＨ基と、ホスホジエステル共有結合を形成する。連結反応では、ポリヌクレオチド鎖の５‘リン酸基は、同じ鎖の３’ＯＨ基と連結（即ち、同じ鎖内の連結）できるか、又は５‘リン酸基は、異なる鎖の３’ＯＨ基と連結（即ち、異なる鎖間の連結）できる。図１Ｃに描写されるように、本明細書において提供される実施形態では、連結反応混合物中のリン酸化された第一の増幅反応生成物は、環状連結生成物６０を産生し得る。前記環状連結生成物６０中には、前記第一の増幅反応生成物の第一の鎖５２及び前記第一の増幅反応生成物の第二の鎖５４からそれぞれ形成された、環状連結生成物の第一の鎖６２及び環状連結生成物の第二の鎖６４が存在する（即ち、前記環状連結生成物の第一の鎖６２を形成するために、前記第一の増幅反応生成物の第一の鎖５２の５’末端を、同じ鎖３’末端に連結することにより、及び前記環状連結生成物の第二の鎖６４を形成するために、前記第一の増幅反応生成物の第二の鎖５４の５’末端を、同じ鎖の３’末端に連結することにより）。図１Ｃに示されるように、前記環状連結生成物６０では、前記第一の鎖６２の上で、遺伝学的要素３２の相補的配列３２ａが、遺伝学的要素３６の相補的配列３６ａに隣接する。更に、前記環状連結生成物の第二の鎖６４上では、遺伝学的要素３２の相補的配列３２ｂが、遺伝学的要素３６の相補的配列３６ｂに隣接する。従って、前記環状連結生成物６０の形成は、これらの遺伝学的要素が、前記共通の二本鎖の核酸分子１０中での互いの関係において生じていたよりも、前記環状連結生成物６０において、遺伝学的要素３２を遺伝学的要素３６が遥かに近接することをもたらす。
実施形態では、連結反応混合物中のリン酸化された第一の増幅反応生成物は、末端対末端連結生成物（環状連結生成物６０に加えて、又はその替わりに）を産生できる。末端対末端連結生成物では、リン酸化された第一の増幅反応生成物第一のコピーは、リン酸化された第一の増幅反応生成物の第二のコピーに末端対末端で連結される（例えば、実施形態では、前記第一の増幅反応生成物の第一のコピーの第一の鎖の３’末端は、前記第一の増幅反応生成物の第二のコピーの第一の鎖の５’末端に連結され、及び前記第一の増幅反応生成物の第二のコピーの第二の鎖の３’末端は、前記第一の増幅反応生成物の第一のコピーの第二の鎖の５’末端に連結されるので、末端対末端連結生成物の第一の鎖、及び末端対末端連結生成物の第二の鎖を含む、末端対末端連結生成物が形成され、並びにこの末端対末端連結生成物の第一の鎖は、前記第一の増幅反応生成物の第一の鎖の少なくとも２つのコピーを含み、及びこの末端対末端連結生成物の第二の鎖は、前記第一の増幅反応生成物第二の鎖少なくとも２つのコピーを含む）。末端対末端連結生成物では、遺伝学的要素３２のコピーは、遺伝学的要素３６のコピーに、これらの遺伝学的要素が、前記共通の二本鎖の核酸分子１０中での互いの関係において生じていたよりも、はるかに近接することをもたらす。
環状連結生成物又は末端対末端連結生成物の１つ又は両方が、第二の増幅反応混合物に提供され得る。図１Ｄは、第二の増幅反応での環状連結生成物６０を描写している。第二の増幅反応混合物では、第二の増幅反応の第一のプライマー７６及び第二の増幅反応の第二のプライマー７８が提供される。前記第二の増幅反応の第一のプライマー７６の少なくとも一領域は、遺伝学的要素３２（この例では、前記第二の目的の遺伝学的要素）の第一の相補的配列３２ａの部分７２に相補的であり及びアニールし、並びに前記第二の増幅反応の第二のプライマー７８の少なくとも一領域は、遺伝学的要素３６（この例では、前記目的の第一の遺伝学的要素）の第二の相補的配列３６ｂの部分７４に相補的であり、及びアニールする。前記第二の増幅反応の第一のプライマー７６、及び前記第二の増幅反応の第二のプライマー７８を表す矢印の方向性により示されるように、前記第二の増幅反応において、これらのプライマー伸長生成物は、前記第一の増幅反応におけるプライマーの伸長生成物の合成の方向とは、逆方向に合成され得る。前記第二の増幅反応における第二の増幅反応の第一のプライマー７６及び前記第二の増幅反応の第二のプライマー７８の方向性は、介在するヌクレオチド配列（又はその中の追加的な遺伝学的要素）の増幅の必要なしに、前記第一の遺伝学的要素及び前記第二の遺伝学的要素の迅速な増幅を可能にし、従って前記第一の遺伝学的要素の強い増幅及び検出を可能にする。
第二の増幅反応は少なくとも２つのテンプレート特異的プライマー（例えば、第一の遺伝学的要素の配列にアニールするための第一のプライマー、及び前記第二の遺伝学的要素の配列にアニールするための第二のプライマー）を含む、任意の適切な核酸複製技法を利用できる。前記第二の増幅反応に用い得る例示的な適切な核酸複製技法は、例えば、参照により全ての目的で本明細書に組み込まれる、ＰＣＴ／ＵＳ１４／５６１５１に記載されるＰＣＲ又は増幅方法を含む。ＰＣＴ／ＵＳ１４／５６１５１は核酸複製のための方法及び組成物を記載している。実施形態では、ＰＣＴ／ＵＳ１４／５６１５１の方法が、熱サイクリングなしで遂行され得る。実施形態では、ＰＣＴ／ＵＳ１４／５６１５１の方法が第一のプライマー及び第二のプライマーを含み得る。実施形態では、ＰＣＴ／ＵＳ１４／５６１５１の方法の第一のプライマーは第一の領域及び第二の領域を含み、前記第一の領域は前記プライマーの５’末端を含み、前記第二の領域は前記プライマーの３’末端を含み、及び前記第二の領域は、二本鎖の核酸テンプレート（即ち、二本鎖の核酸分子）の第一の鎖の少なくとも一部分に相補的である。実施形態では、ＰＣＴ／ＵＳ１４／５６１５１の方法の第二のプライマーは、第一の領域及び第二の領域を含み、前記第一の領域は前記プライマーの５’末端を含み、及び前記第一のプライマーの第一の領域に相補的であり、前記第二の領域は、前記プライマーの３’末端を含み、及び前記第二の領域は、前記二本鎖の核酸テンプレート第二の鎖の少なくとも一部分に相補的である。実施形態では、ＰＣＴ／ＵＳ１４／５６１５１の方法の第一のプライマーの第二の領域は、本明細書の方法において提供される要素の第一の相補的配列に、本明細書において提供される方法における、第一のプライマーと同じ方式でアニールすることができ、及びＰＣＴ／ＵＳ１４／５６１５１の方法の第二のプライマー第二の領域は、本明細書の方法において提供される要素の第二の相補的配列に、本明細書において提供される方法における、第二のプライマーと同じ方式でアニールすることができる。ＰＣＴ／ＵＳ１４／５６１５１方法及び組成物については、追加的な詳細が、本明細書の他の場所に記載される。
前記第二の増幅反応は、前記第一の遺伝学的要素の少なくとも一部分及び前記第二の遺伝学的要素の少なくとも一部分を含む、第二の増幅反応生成物８０を生成できる。実施形態では、前記第二の増幅反応生成物８０は、二本鎖の、直線状形態を有し得る。図１Ｅに描写されるように、前記第二の増幅反応生成物８０は、第二の増幅反応生成物の第一の鎖８２及び第二の増幅反応生成物の第二の鎖８４を含む。前記第二の増幅反応生成物の第一の鎖８２は、前記第一の遺伝学的要素３６の第一の相補的配列３６ａ及び前記第二の遺伝学的要素３２の第一の相補的配列３２ａを含む。前記第二の増幅反応生成物の第二の鎖８４は、前記第一の遺伝学的要素３６の第二の相補的配列３６ｂ及び前記第二の遺伝学的要素３２の第二の相補的配列３２ｂを含む。実施形態では、前記第二の増幅反応生成物８０は、例えば前記第二の増幅反応が、ＰＣＴ／ＵＳ１４／５６１５１に記載される方法のように遂行される場合に、前記第一の遺伝学的要素３６及び前記第二の遺伝学的要素３２の２つ以上のコピーを含むコンカテマーを形成できる。
前記第二の増幅反応生成物８０は、核酸の検出について、当技術分野で周知の方法、及び本明細書のほかの場所に記載されるように検出することができる。
実施例では、本明細書において提供される共通の二本鎖の核酸分子上の２つの遺伝学的要素の検出のための方法は、以下のように遂行され得る。この実施例では、プライマー及び遺伝学的要素の配列は、本明細書において提供される方法に対して典型的であるものより、より短い（即ち、より少ない数のヌクレオチドを有する）。しかしながら、この実施例の中の配列は、本明細書において提供される実施形態の例示的ステップについての情報を提供するためには十分である。この実施例では、第一の遺伝学的要素及び第二の遺伝学的要素が目的である。前記第一の遺伝学的要素の第一の相補的配列は：５’ＡＡＴ３’であり、及び前記第一の遺伝学的要素の第二の相補的配列は：５’ＡＴＴ３’である。前記第二の遺伝学的要素の第一の相補的配列は：５’ＴＴＧ３’であり、及び前記第二の遺伝学的要素の第二の相補的配列は５’ＣＡＡ３’である。前記第一の遺伝学的要素及び前記第二の遺伝学的要素は、共通の二本鎖の核酸分子上に存在する。本明細書で用いられるものとしての、“共通の”分子上にある２つ以上の要素の表現は、前記要素が同じ連続的な分子（即ち、同じ一本又は二本鎖のＤＮＡ分子）の一部であることを示す。前記共通の二本鎖の核酸分子の第一の鎖のヌクレオチド配列は：５’ＴＴＧＸＡＡＴ３’であり、Ｘは任意の数及び配列のヌクレオチドである。例えばＸは、少なくとも１００、５００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、又は１０，０００ヌクレオチドを含み得る。前記二本鎖の核酸分子の第二の鎖ヌクレオチド配列は：５’ＡＴＴＸ’ＣＡＡ３’であり、Ｘ’は、Ｘ配列に相補的な数及び配列のヌクレオチドである。前記第一の増幅反応混合物には、第一の増幅反応の第一のプライマー、及び第一の増幅反応の第二のプライマーが提供される。前記第一の増幅反応の第一のプライマーのヌクレオチド配列は：５’ＡＴＴ３’である。前記第一の増幅反応の第二のプライマーのヌクレオチド配列は：５’ＴＴＧ３’である。前記第一の増幅反応混合物では、第一の増幅反応生成物が生成される。前記第一の増幅反応生成物は、第一の増幅反応生成物の第一の鎖及び第一の増幅反応生成物の第二の鎖を含む。前記第一の増幅反応生成物の第一の鎖のヌクレオチド配列は：５’ＴＴＧＸＡＡＴ３’であり、Ｘは任意の数及び配列のヌクレオチドである。前記第一の増幅反応生成物の第二の鎖のヌクレオチド配列は：５’ＡＴＴＸ’ＣＡＡ３’であり、Ｘ’は、Ｘ配列に相補的な数及び配列のヌクレオチドである（この実施例では、前記第一の増幅反応生成物は、前記共通の二本鎖の核酸分子と同じサイズであるが、典型的には、本明細書の方法において提供される、前記第一の増幅反応生成物は、前記共通の二本鎖の核酸分子よりも、長さにおいて短い）。前記連結反応混合物中では、前記第一の増幅反応生成物から環状連結生成物が生成され、前記環状連結生成物の第一の鎖は：５’ＴＴＧＸＡＡＴ３’のヌクレオチド配列を有し、及び５’Ｔ及び３’Ｔは、環状ポリヌクレオチドの一部として共有結合により連結される。前記環状連結生成物の第二の鎖は：５’ＡＴＴＸ’ＣＡＡ３’のヌクレオチド配列を有し、及び５’Ａ及び３’Ａは、環状ポリヌクレオチドの一部として共有結合により連結される。前記第二の増幅反応混合物には、第二の増幅反応の第一のプライマー及び第二の増幅反応の第二のプライマーが提供される。前記第二の増幅反応の、第一のプライマーのヌクレオチド配列は：５’ＣＡＡ３’である。前記第二の増幅反応の第二のプライマーのヌクレオチド配列は：５’ＡＡＴ３’である。前記第二の増幅反応混合物中で、第二の増幅反応生成物が生成される。前記第二の増幅反応生成物は、第二の増幅反応生成物の第一の鎖及び第二の増幅反応生成物の第二の鎖を含む。前記第二の増幅反応生成物の第一の鎖のヌクレオチド配列は：５’ＡＡＴＴＴＧ３’である。前記第二の増幅反応生成物の第二の鎖のヌクレオチド配列Ｈ‘：５’ＣＡＡＡＴＴ３’である。
実施形態では、本明細書において提供される方法のステップのすべてが、同じ容器内で同時に生じることが許容され得る（例えば、本明細書において提供される方法のための試薬のすべてが同じ容器中に同時に提供され得る）。更に、本明細書において提供されるものは、本明細書において提供される方法のための試薬を含むキットである。
真のＭＲＳＡ菌の検出のために用いられることに加えて、本明細書において提供される方法は、例えば、その中に、共通の核酸鎖上又は共通の分子の一部分上に存在し得る２つ以上の遺伝学的要素があるが、それらの要素が大きなヌクレオチド距離により互いに分離されている、他の種又は分子中の他の遺伝学的要素の検出のためにも用いられることができる。本明細書において提供される一般的なアプローチ（即ち、第一の増幅反応、次いで連結反応、続いて第二の増幅反応を遂行すること）は、同様の構造的問題を示す広範囲の遺伝学的要素に対して用い得る。
加えて、実施形態では、目的の遺伝学的要素を含む分子の複数のコピーがすでに存在し、及びそのような分子が、互いに連結されて、目的の要素が、例えば、ＰＣＲ又はＰＣＴ／ＵＳ１４／５６１５１において記載される増幅方法により容易に増幅する構造を形成できる場合には、本明細書において提供される第一の増幅反応は、省かれることができる。
実施形態では、本明細書において提供されるものは、標的配列中のＳＮＰ、変異、又は他の目的のヌクレオチドを評価するための組成物及び方法である。ある場合には、標的配列は、目的のヌクレオチドの位置を取り囲む複数の異なる多型を有し得る。例えば、この目的のヌクレオチドは、１５０ヌクレオチドの標的配列の第６０番目の位置のヌクレオチドに位置することができ（最も５’側のヌクレオチドが第１番目の位置で、最も５’側のヌクレオチドの隣のヌクレオチドが第２番目の位置である等）、及び前記標的配列中の他のヌクレオチドは、しばしば可変であることもできる（例えば、番目４９番目、５１番目、５７番目のヌクレオチド位置は、しばしば変異ヌクレオチドを有するＳＮＰ部位であり得る）。
実施形態では、目的のヌクレオチドは、参照により、その全体が全ての目的で本出願に組み込まれる、２０１４年９月１７日に出願された、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ１４／５６１５１号中に提供される、ＳＮＰ検出のための方法の使用により評価されることができる。そのような方法では、プライマーのペアーが、目的のヌクレオチドを含む標的核酸を増幅するために用いられ、それぞれのプライマーが、テール／第一の領域、及びテンプレート結合／第二の領域を含む。実施形態では、前記プライマーのペアーの第二のプライマーの第一の領域／テールは、目的のヌクレオチドを含む標的核酸の一部に対して相補的である。ＰＣＴ／ＵＳ１４／５６１５１において開示される方法では、例えば、前記第一プライマーのテール領域においてわずかに異なるヌクレオチド配列（典型的にはプライマーペアーの間で、ただ１つのヌクレオチドの違い）を有する１つ以上のプライマーペアーによる目的のヌクレオチドを含む標的核酸の増幅の速度又は量の比較により、目的のヌクレオチドの識別が決定されることができる。
しかしながら、ある状況では、標的核酸の中で目的のヌクレオチドの近くの１つ以上の位置に、多くの配列バリアンスがある場合には、ＰＣＴ／ＵＳ１４／５６１５１において提供されるＳＮＰ検出法を遂行することは困難であり得る。そのような位置は、例えば、前記第一の及び／又は第二のプライマーのテンプレート結合領域に対応する領域中にあり得る。ＰＣＴ／ＵＳ１４／５６１５１に記載されるＳＮＰ検出のためのプライマーが、容易に標的核酸配列に結合できない場合には、その中に開示されている方法はＳＮＰ検出のためには効果的ではない。
従って、本明細書において提供されるものは、ＳＮＰ又は他の目的のヌクレオチドの同定を促進する組成物及び方法である。実施形態では、このタイプの方法 のための試薬及びステップは、本明細書では“ヌクレオチド分析”と称され得る。第一のステップでは、ＰＣＲ増幅生成物を生成するために目的のヌクレオチドを含む標的核酸の領域が第一の増幅反応（ＰＣＲ等；本明細書では“ＰＣＲ増幅反応”とも称される）により増幅される。ＰＣＲ増幅反応は、ＰＣＲ増幅反応混合物中で生じ得る。このＰＣＲ増幅反応では、比較的長いプライマーペアー（例えば、それぞれのプライマーが、少なくとも１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、８０、９０、又は１００ヌクレオチドを含む）が標的核酸を増幅するために用いられる。この長いプライマーは、前記テンプレート結合領域中の比較的大量の配列多様性に耐えることができる（即ち、プライマーが長いために、複数のヌクレオチドが不一致であっても、それでもそれらは、標的配列にアニールできる）。重要なことには、前記ＰＣＲ増幅反応では、どちらのプライマーも、ヌクレオチド／目的のＳＮＰの正確な位置にはアニールしない（即ち、これらのプライマーは、目的のＳＮＰの近くの領域にだけアニールしなければならない）。この理由は、本明細書において提供される方法によって、ヌクレオチド／目的のＳＮＰの身元を変更することは望ましくないためである（ヌクレオチド／目的のＳＮＰを同定することが望ましいため）。一旦ＰＣＲ増幅生成物が前記ＰＣＲ増幅反応中に生成されると、前記ＰＣＲ増幅生成物は、一般的に既知のヌクレオチド配列を有する（前記ＰＣＲ増幅生成物を生成するために前記ＰＣＲ増幅反応で用いられたプライマーのヌクレオチド配列が既知である結果）。しかしながら、前記ＰＣＲ増幅反応で使われたプライマーのどちらも、ヌクレオチド／目的のＳＮＰの位置にはアニールしていないため、前記ＰＣＲ増幅生成物中では、ヌクレオチド／目的のＳＮＰの身元は依然未知である。前記ＰＣＲ増幅生成物は、次いでＰＣＴ／ＵＳ１４／５６１５１において提供されるＳＮＰ検出のためのプライマーとインキュベートされ得る。これらのプライマーは、前記ＰＣＲ増幅生成物が既知の配列のプライマーの使用により生成されたという事実に基づいて、前記ＰＣＲ増幅生成物中に存在することが知られる配列に相補的な領域を持つように設計され得る。ＳＮＰ／目的のヌクレオチドの身元が、次いでＰＣＴ／ＵＳ１４／５６１５１に記載されるように決定され得る。
図２は、本明細書において提供される方法の一般的な概略図を提供する。標的核酸１０２を含む核酸鎖１００が提供され得る。この標的核酸１０２は、複数の多型／バリアントヌクレオチド１０４を含み得る。この標的核酸１０２はヌクレオチド／目的のＳＮＰ１０６も含む。ＰＣＲ増幅生成物１２０を生成するために、この標的核酸が、ＰＣＲ増幅反応の第一のプライマー１１２、及びＰＣＲ増幅反応の第二のプライマー１１４とインキュベートされる。前記ＰＣＲ増幅生成物１２０は、前記第一のプライマー１１２及び第二のプライマー１１４（既知のヌクレオチド配列を有する）により増幅されたために、一般的に既知のヌクレオチド配列を有する。前記ＰＣＲ増幅反応生成物１２０は、ＰＣＲ増幅反応生成物の第一の鎖及びＰＣＲ増幅反応生成物の第二の鎖を含む、二本鎖の核酸分子である。実施形態では、前記ＰＣＲ増幅反応生成物の第一の鎖は、目的のポリヌクレオチドテンプレートのコピーであり得る。前記ＰＣＲ増幅生成物１２０を生成する過程の間に、前記複数の多型／バリアントヌクレオチド１０４は前記第一のプライマー１１２及び第二のプライマー１１４のヌクレオチドにより置換される。しかしながら、前記第一の増幅生成物１２０は、それでも未知のヌクレオチド／目的のＳＮＰ１０６を有している。前記第一の増幅生成物１２０は、次いでＳＮＰ検出のためのＰＣＴ／ＵＳ１４／５６１５１において記載される方法において用いられ得る。
実施形態では、ヌクレオチド分析のための方法の一部として用いられるＰＣＲ増幅反応は、本明細書において提供される遺伝学的要素の分析の第一の増幅反応のための第一の増幅反応と同じ方法で遂行され得る（例えば、両方の増幅反応はＰＣＲ反応であることができる）。同様に、実施形態では、遺伝学的要素の分析の第一の増幅反応混合物の構成要素は、本明細書において提供されるＰＣＲ増幅反応混合物の構成要素と同じであり得る（例えばプライマー、及びテンプレートヌクレオチド配列、並びに温度又は試薬の最適化における差異を考慮して）。更に、本明細書に記載される遺伝学的要素分析又はヌクレオチド分析に関係するものとして特定の方法のステップ又は試薬を特定することが望ましい場合には、本明細書において提供されるステップ及び試薬は、一般的に接頭辞“遺伝学的要素分析”又は“ヌクレオチド分析”を付加して称されることができる。代替的に、文脈が明確に特定の方法を示す場合、又は代替的に、言明が様々なタイプのプライマー又は方法ステップに広く適用される（即ち、単に特定の方法又は試薬だけではなく）場合には、本明細書において提供される方法のステップ又は試薬は、“遺伝学的要素分析”又は“ヌクレオチド分析”の接頭辞（例えば、第一のプライマー又は第一の鎖に対して）を付加して称されなくてよい。
実施形態では、本明細書において提供される方法は、Ｃ型肝炎プロテアーゼ遺伝子、ＮＳ３中の多型部位Ｑ８０ＫにおけるＳＮＰを評価するために用い得る。Ｑ８０Ｋ部位を評価するために、本明細書において提供される方法において用いられることができる例示的プライマーのペアーは：第一のプライマー（５’から３’の方向へ）：ＧＧＡＡＣＧＡＧＧＡＣＣＡＴＣＧＣＡＴＣＡＣＣＣＡＡＧＧＧＴＣＣＴＧＴＴＡＴＣＣＡＧＡＴＧＴＡＴＡＣＣＡＡＴＧＴＡＧＡＣ（配列番号１）；第二のプライマー（５’から３’の方向へ）：ＣＧＣＡＧＧＴＧＣＡＧＧＧＴＧＴＣＡＡＴＧＡＧＣＧＧＧＣＡＣＣＴＴＧＡＧＧＡＧＣＧＧＧＣＣＡＧＣＣＣＡＣＧＡＧＧＴＣＴ（配列番号２）。本明細書において提供される方法は、多くの異なる標的核酸におけるＳＮＰを評価するために用いることができ、その標的核酸は高度の配列可変性を有する。
実施形態では、本明細書において提供される方法のステップのすべてが、同じ容器内で同時に生じることが許容され得る（例えば、本明細書において提供される方法のための試薬のすべてが同じ容器中に同時に提供され得る）。
実施形態では、本明細書において提供される方法は、以下のように遂行され得る。第一の増幅反応において、ポリヌクレオチドテンプレートが増幅されることができ、前記第一の増幅反応は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）反応である。前記第一の増幅反応においては、ＰＣＲ増幅反応生成物が生成され得る。実施形態では、本明細書において提供される方法は以下のように遂行され得る。前記ＰＣＲ増幅反応生成物は、第一の鎖及び第二の鎖を含む二本鎖の核酸分子であることができ、及び前記ＰＣＲ増幅反応生成物の第一の鎖は、前記ポリヌクレオチドテンプレートのコピーである。次に、前記ＰＣＲ反応生成物（前記ポリヌクレオチドテンプレートのコピーを含む）が、ＰＣＴ／ＵＳ１４／５６１５１において提供されるような非熱サイクリング増幅反応において、ＰＣＴ／ＵＳ１４／５６１５１に記載されるような、非熱サイクリング反応生成物を生成するための、テンプレートとして用いられ得る。そのような非熱サイクリング反応生成物は、コンカテマーを含み得る。ＰＣＲ増幅反応に続いた非熱サイクリング増幅反応を含む、この方法の実施形態においては、非熱サイクリング反応生成物のみが検出される（前記ＰＣＲ反応生成物ではなく）。実施形態では、前記非熱サイクリング反応生成物は、それらが形成されるのと同時に検出される。実施形態では、ＰＣＴ／ＵＳ１４／５６１５１の方法は、第一のプライマー及び第二のプライマーを含み得る。実施形態では、前記ＰＣＴ／ＵＳ１４／５６１５１の方法の第一のプライマーは、第一の領域及び第二の領域を含み、前記第一の領域は、前記プライマーの５’末端を含み、前記第二の領域は前記プライマーの３’末端を含み、及び前記第二の領域は、二本鎖の核酸テンプレート（即ち、ＰＣＲ増幅反応生成物等の二本鎖の核酸分子）の第一の鎖の少なくとも一部分に相補的である。実施形態では、前記ＰＣＴ／ＵＳ１４／５６１５１の方法の第二のプライマーは、第一の領域及び第二の領域を含み、前記第一の領域は、前記プライマーの５’末端を含み、及び前記第一のプライマーの第一の領域に相補的であり、前記第二の領域は、前記プライマーの３’末端を含み、及び前記第二の領域は、二本鎖の核酸テンプレートの第二の鎖の少なくとも一部分に相補的である。実施形態では、前記ＰＣＴ／ＵＳ１４／５６１５１の方法の第一のプライマーの第二の領域は、本明細書において提供されるＰＣＲ増幅反応において、第一のＰＣＲ増幅反応のプライマーがポリヌクレオチドテンプレート鎖にアニールするのと同じ様式で、本明細書における方法におけるＰＣＲ増幅反応生成物の第一の鎖にアニールすることができ、及び前記ＰＣＴ／ＵＳ１４／５６１５１の方法の第二のプライマーの第二の領域は、第二のＰＣＲ増幅反応のプライマーが、本明細書において提供される方法におけるＰＣＲ増幅反応中のポリヌクレオチドテンプレートに相補的であるポリヌクレオチドにアニールするのと同じ様式で、本明細書において提供されるＰＣＲ増幅反応生成物の第二の鎖に、アニールし得る。
本明細書において用いられる“プライマー”は、ポリヌクレオチドであって、ｉ）オリジナルの核酸鎖にハイブリダイズする能力があり、及びｉｉ）新しい核酸鎖の合成のための開始点として作用し、前記新しい核酸鎖は、プライマーの伸長された生成物であり、及びオリジナルの鎖に対して相補的である。プライマーは、その３’末端に遊離したＯＨ基（水酸基）を持つことができ、これは伸長生成物のための合成の始原として機能し得る。
Ａプライマーは標準ヌクレオチド[例えば、標準ＤＮＡデオキシリボヌクレオチド（デオキシアデノシン一リン酸、デオキシグアノシン一リン酸、チミジン一リン酸、デオキシシチジン一リン酸）又は標準ＲＮＡリボヌクレオチド（アデノシン一リン酸、グアノシン一リン酸、ウリジン一リン酸、シチジン一リン酸）]、代替的ヌクレオチド（例えば、イノシン）、修飾ヌクレオチド、ヌクレオチドアナログ、又はそれらの組み合わせを含み得る。例えばオリゴヌクレオチドプライマーは、ペプチド核酸、モルフォリノ（ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ）（例えば、ホスホロジアミデートモルフォリノオリゴ）、ロックされた核酸[例えば、Ｋａｕｒ，Ｈら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４５（２３），７３４７〜５５（２００６）を参照されたい]、グリコール核酸、又はトレオース核酸を含み得る。プライマーは、例えば、ホスホジエステル結合、ホスホロチオエート結合（架橋していないＯがイオウにより置換される）、又はペプチド結合（ペプチド核酸の一部として）を含むバックボーンを有し得る。代替的なヌクレオチド、修飾されたヌクレオチド、及びヌクレオチド・アナログは、本明細書では集合的に“非標準的ヌクレオチド”と称される。
プライマー中での非標準的ヌクレオチドの存在は、プライマーの様々な性質に影響し得る。いくつかの実施形態では、プライマー中への非標準的ヌクレオチドの包含は、その相補的配列に対するプライマーの熱力学的な安定性を増加し得るか、又は減少し得る。例えば、増加した熱力学的安定性を有するプライマーは、ロックされた核酸を含み得る。減少した熱力学的安定性を有するプライマーは、例えば、イノシン（Ａｕｅｒら、Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２４；５０２１〜５０２５（１９９６）に記載される）又はカルボキシル基等の負に荷電した化学基を含み得る。
本明細書において提供される第一のプライマー又は第二のプライマーは、任意の長さのものであり得る。前記第一のプライマー及び第二のプライマーは同じ数のヌクレオチドを含み得るか、又は異なる数のヌクレオチドを含み得る。いくつかの実施形態では第一の又は第二のプライマーは、長さにおいて、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、５００、７５０、１０００、又は１５００ヌクレオチドであり得る。いくつかの実施形態では第一の又は第二のプライマーは、長さにおいて、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、５００、７５０、１０００、又は１５００以下のヌクレオチドである。いくつかの実施形態では第一の又は第二のプライマーは、長さにおいて、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、５００、７５０、又は１０００ヌクレオチドの最小値を有し、及び長さにおいて３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、５００、７５０、１０００、又は１５００ヌクレオチドの最大値を有する範囲から選択される長さを有し得る。
増幅された核酸の存在は、例えば反応生成物（増幅された核酸又は反応副生成物）の検出、又は反応の進行に伴うプローブの検出により検定され得る。
いくつかの実施形態では、反応生成物は、生成物を染料により染色することにより同定され得る。いくつかの実施形態では、染料は核酸と結合した時に、核酸と結合していない時よりも、より大きな蛍光を有し得る。実施形態では、染料は二本鎖の核酸にインターカレートし得るか、又は染料は核酸の外部領域に結合し得る。本明細書において提供される方法及び組成物により用いられ得る核酸染料としては、例えば、シアニン染料、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ(R)、ＯｌｉＧｒｅｅｎ(R)、ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ(R)、ＳＹＢＲ(R)染料、ＳＹＢＲ(R)Ｇｏｌｄ、ＳＹＢＲ(R)ＧｒｅｅｎＩ、ＳＹＢＲ(R)ＧｒｅｅｎＩＩ、臭化エチジウム、ジヒドロエチジウム、ＢｌｕｅＶｉｅｗ（商標）、ＴＯＴＯ(R)染料、ＴＯ−ＰＲＯ(R)染料、ＰＯＰＯ(R)染料、ＹＯＹＯ(R)染料、ＢＯＢＯ(R)染料、ＪＯＪＯ(R)染料、ＬＯＬＯ(R)染料、ＳＹＴＯＸ(R)染料、ＳＹＴＯ(R)染料、ヨウ化プロピジウム、ヨウ化ヘキシジウム、メチレンブルー、ＤＡＰＩ、アクリジン・オレンジ、キナクリン、アクリジン二量体、９−アミノ−６−クロロ−２−メトキシアクリジン、ビスベンズイミド染料、ヘキスト（Ｈｏｅｃｈｓｔ）染料、７−アミノアクチノマイシンＤ、アクチノマイシンＤ、ヒドロキシスチルバミジン、ピロニンＹ、Ｄｉａｍｏｎｄ（商標）染料、ＧｅｌＲｅｄ（商標）、ＧｅｌＧｒｅｅｎ（商標）及びＬＤＳ７５１が挙げられる。
いくつかの実施形態では、反応生成物は、増幅反応の濁度の分析により同定され得る。例えば、実施形態では、増加した濁度は反応生成物及び反応副生成物の生成に相関付けられる（例えば、マグネシウムと複合化したピロリン酸）。
いくつかの実施形態では、反応生成物は、本明細書の方法に従って遂行される反応をゲル電気泳動により分離し、続いてそのゲルを核酸のための染料により染色ことにより同定され得る。前記染料は、本明細書で開示されるか、又はさもなければ当技術分野で周知の任意の核酸染料であり得る。
いくつかの実施形態では、核酸又は核酸の生成の検出のための当技術分野で周知の、任意の方法又は組成物が、本明細書において提供される方法及び組成物により用いられることができる。
いくつかの実施形態では、本明細書において提供される方法に従い遂行される反応は、光源及び光学的センサーを含む装置の中で観察され得る。ある場合には、前記反応は、光源からの光の経路の中に位置づけられることができ、及び前記サンプルにより吸収される光（例えば、濁度反応の場合）、前記サンプルにより散乱される光（例えば、濁度反応の場合）、又は前記サンプルより放射される光（例えば、蛍光分子を含む反応の場合）が測定され得る。いくつかの実施形態では、本明細書において提供される方法は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、２０１３年２月１８日に出願された、米国特許出願第１３／７６９，７７９号に開示される機器若しくはその中のモジュールの中で遂行されるか又は観察され得る。
本明細書において提供される方法を用いて、目的の核酸テンプレートの特異的な増幅生成物が、増幅反応の開始から、例えば、３０秒、１分、３分、５分、１０分、１５分、２０分、３０分、４５分、６０分、９０分、１２０分、１８０分、又は２４０分以内で同定され得る。他の実施例では、本明細書において提供される方法を用いて、目的の核酸テンプレートに対して陽性の増幅反応が、前記テンプレートの１０、５０、１００、５００、１０００、５０００、１０，０００、５０，０００、１００，０００、５００，０００、又は１，０００，０００以下のコピーが生成されたときに同定され得る。他の実施例では、本明細書において提供される方法を用いて、方法の開始時に、目的のテンプレートの、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、１００、２００、５００、１０００、５０００、又は１０，０００以下のコピーを含む、サンプル中の目的の核酸テンプレートの存在が、同定され得る。
実施形態では、本明細書において提供される方法は、標的の目的の核酸についての、サンプルの検定のために用いられ得る。特定の実施形態では、サンプル中の標的の目的の核酸の存在又は量は、反応中の核酸増幅についての変曲時間を決定することを含む方法により決定され得る。変曲時間／変曲点は、増幅反応が、核酸テンプレートに対して陽性であることが決定される時間又は点である。変曲時間／点は、例えば、選択された量の核酸が、前記反応において生成される反応の開始後の時間、反応における増幅速度がベースライン相から、指数増殖期へ変化する時間、又は反応における増殖速度が、指数増殖期から、プラトー相に変化する時間等の１つ以上のインジケーターにより、特定され得る。実施形態では、変曲時間／点は、蛍光における変化若しくは反応の吸光度、又は選択された値に達する、蛍光若しくは反応の吸光度に基づいて特定され得る。特定の実施形態では、サンプル中の標的の目的の核酸の存在又は量は、未知の量の標的の目的の核酸反応の核酸増幅についての変曲時間を、以下の１つ又は両方に対して比較することを含む方法により決定され得る：ｉ）前記標的の目的の核酸を欠くことが知られる反応（即ち、陰性対照）又はｉｉ）前記標的の目的の核酸を含むことが知られる反応（即ち、陽性対照）。実施形態では、前記標的の目的の核酸を含む反応、及び前記標的の核酸を含まない反応の両方が、選択された変曲時間について測定される。実施形態では、サンプル中の標的の目的の核酸の存在は、標的の目的の核酸を含み得るか、又は含まなくてよいサンプルを含む反応の変曲を、既知の標的の目的の核酸状況を持つ１つ以上の反応の変曲の時間との差を評価することを含む方法に基づいて決定され得る（例えば、前記標的の目的の核酸を含むことが知られるか、又は含まないことが知られる）。例えば、本明細書において提供される方法に従う、前記反応の変曲時間が、前記標的の目的の核酸を含まないことが知られる対応する反応よりも、少なくとも、３、５、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、９０、１２０、又は１８０分早い場合に、サンプルが、標的の目的の核酸を含むと特定され得る。別の実施例では、本明細書において提供される方法に従う前記反応の変曲時間が、前記標的の目的の核酸を含むことが知られる対応する反応よりも、３、５、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、９０、１２０、又は１８０分未満遅い場合に、サンプルが前記標的の目的の核酸を含むと特定される。
本明細書において提供される方法は、任意の時間の長さの間に遂行され得る。典型的には、前記方法は、例えば、核酸複製の速度、ポリメラーゼ活性の発生、又は増幅生成物の蓄積を観察するために十分な長さの間遂行される。いくつかの実施形態では、本明細書において提供される方法は、１０秒、３０秒、１分、５分、１０分、２０分、３０分、４５分、１時間、２時間、３時間、４時間、６時間、８時間、１２時間、１６時間、又は２４時間よりも短い合計時間の間遂行されることができ、その時間に、核酸複製、ポリメラーゼ活性の発生、又は増幅生成物の蓄積が測定される。
本明細書において提供される方法は、様々な方法により停止され得る。一実施形態では、方法のステップは、前記方法の１つ以上のステップに含まれる１つ以上の試薬（例えば、ｄＮＴＰ）の濃度の低下又は完全な消費に際して停止され得る。別の実施形態では、方法のステップは、前記方法の１つ以上のステップに含まれる１つ以上の酵素（例えば、ポリメラーゼ）の不活性化に際して停止され得る。酵素は、様々な方法で不活性化され得る。例えば、酵素は、経時的に酵素の構造に影響するランダムな事象に起因して酵素活性を徐々に失うか、又は酵素は、その酵素活性の不活性化を加速する条件に曝露され得る（例えば、高温、極端なｐＨ等）。
本明細書において提供される方法においては、核酸コンカテマーの生成も、前記コンカテマー中の核酸テンプレート／特定の核酸のコピー数を増幅させる。従って、本明細書におけるコンカテマーの生成のための方法及び組成物についての言及も、前記核酸の増幅に適用される。
本明細書において用いられる、“ポリヌクレオチド”は、２つ以上のヌクレオチドを含むポリマー鎖を指す。“ポリヌクレオチド”は、プライマー、オリゴヌクレオチド、核酸鎖などを指す。ポリヌクレオチドは、標準的又は非標準的ヌクレオチドを含み得る。典型的には、ポリヌクレオチドは一つの末端（“５’末端”）に５’リン酸を含み、及び鎖の他の末端（“３’末端）に３’水酸基を含む。ポリヌクレオチドのほとんどの５’ヌクレオチドは、本明細書においては、“前記ポリヌクレオチドの５’末端ヌクレオチド”と称される。ポリヌクレオチドのほとんどの３’ヌクレオチドは、本明細書では、前記ポリヌクレオチド“３’末端ヌクレオチド”と称される。
５’末端ヌクレオチド及び３’末端ヌクレオチドを含む、ポリヌクレオチドの文脈において、本明細書において用いられる用語“下流”は、前記ポリヌクレオチド内の参照点よりも前記３’末端ヌクレオチドにより近い、前記ポリヌクレオチド中の位置を指す。例えば、：５’ＡＴＡＡＧＣ３’の配列を持つプライマーにおいて、前記“Ｇ”は前記“Ｔ”及び全ての“Ａ”から下流にある。
５’末端ヌクレオチド及び３’末端ヌクレオチドを含む、ポリヌクレオチドの文脈において、本明細書において用いられる用語“上流”は、前記ポリヌクレオチド内の参照点よりも前記５’末端ヌクレオチドにより近い、前記ポリヌクレオチド中の位置を指す。例えば、：５’ＡＴＡＡＧＣ３’の配列を持つプライマーにおいて、前記“Ｔ”は前記“Ｇ”、前記“Ｃ”、及び前記“Ｇ”に最も近い、２つの“Ａ”から上流にある。
本明細書において用いられる、“核酸”は、非標準的ヌクレオチドを含むＤＮＡ及びＲＮＡを含む、ＤＮＡ及びＲＮＡの両方を含む。“核酸”は、少なくとも１つのポリヌクレオチド（“核酸鎖”）を含む。“核酸”一本鎖、又は二本鎖であり得る。
本明細書において用いられる、“コンカテマー”は、その中に、特定の核酸の２つ以上のコピーを含み、前記コピーが、直列に連結している核酸分子を指す。前記コンカテマーの中で、前記特定の核酸のコピーは、互いに直接連結することができるか、又はそれらは間接的に連結できる（例えば、前記特定の核酸のコピーの間にヌクレオチドがあり得る）。一実施例では、前記特定の核酸は、二本鎖の核酸テンプレートであることができるので、コンカテマーは、前記二本鎖の核酸テンプレートの２つ以上のコピーを含み得る。別の実施例では前記特定の核酸は、ポリヌクレオチドテンプレートであり得るので、コンカテマーは、前記ポリヌクレオチドテンプレートの２つ以上のコピーを含み得る。
本明細書において用いられる、“標的の”核酸又は分子は、目的の核酸を指す。標的の核酸／分子は、一本鎖の又は二本鎖のＤＮＡ又はＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）を含む任意のタイプであり得る。
本明細書において用いられる、“相補的”配列は、２つのヌクレオチド配列が、互いに逆平行に整列された場合に、標準的塩基対法則（例えば、Ａ−Ｔ、Ｇ−Ｃ、又はＡ−Ｕ）に従って、ペアーを形成する複数の個々のヌクレオチド塩基を含むために、配列を含む分子が、互いに特異的にアニールできる２つのヌクレオチド配列を指す。配列が“相補的”であると見なされるためには、２つの配列の全てのヌクレオチド塩基が、互いにペアーを形成する能力を有する必要はない。例えば、もし２つの配列が相補性のために最適に整列されたときに、２つの配列の中の、少なくとも３０％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、又は１００％のヌクレオチド塩基が、互いにペアーを形成できる場合に、配列が相補的であると見なされる。加えて、２つの配列の長さが、互いに顕著に異なる場合でも、“相補的”と見なされ得る。例えば、１５ヌクレオチドのプライマーは、数百のヌクレオチドを含むより長いポリヌクレオチドに対して、前記プライマーが、より長いポリヌクレオチド特定の領域に対して逆平行に整列されたときに、もし前記プライマーの複数の個別のヌクレオチド塩基が、より長いポリヌクレオチドのヌクレオチド塩基とペアを形成できれば、“相補的”と見なされ得る。加えて、“相補的”配列は、１つ以上のヌクレオチド・アナログ又は核酸塩基アナログを含み得る。本明細書において用いられる、“完全に相補的な”又は“完全な相補性”等は、互いに１００％相補的な２つの配列（即ち、配列が最大の相補性でペアーを形成した時に、配列のヌクレオチドの間に、不一致が全くない場合）を指す。更に、本明細書での第二のポリヌクレオチドに対して“相補的なヌクレオチド配列”を有する第一のポリヌクレオチド等への言及は、前記第一のポリヌクレオチドは前記第二のポリヌクレオチドに“相補的である”というのと同じ意味を有する。
本明細書において用いられる、タンパク質、核酸、又は他の生体分子に適用される用語“単離された”は、その自然に生じている環境における構成要素から、精製されたか、又は分離された分子を指す（例えば、自然に生成された細胞から精製されたタンパク質）。“単離された”分子は、他の分子との接触にあってもよい（例えば、反応混合物の一部として）。本明細書において用いられる、“単離された”分子は、更に自然に生じるアミノ酸又はヌクレオチド配列を有する、組み換え的に生成されたタンパク質又は核酸をも含む。“単離された”核酸は、ポリペプチドを通常発現する細胞内に含まれる前記ポリペプチドをエンコードする核酸分子を含み、例えば、前記核酸分子は、自然の細胞とは異なる遺伝子の染色体上の位置にある。いくつかの実施形態では“単離された”ポリペプチドは、前記ポリペプチドのＳＤＳ−ＰＡＧＥに続いてクマシー・ブルー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ ｂｌｕｅ）、銀、又は他のタンパク質染色方法により証明されるところでは、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、又は１００％の同質性まで精製される。
本明細書において用いられる、テンプレート又は他の核酸の“配列”を含むものとして記載される核酸分子は、文脈が他のものを明確に指示しない限り、前記テンプレート又は他の核酸それ自身を含むとも見なされ得る（例えば、テンプレートの配列を含むとして記載される分子は、前記テンプレートを含むものとしても記載され得る）。
本明細書において用いられる、第一のポリヌクレオチドが、第二のポリヌクレオチドに“アニールされた（ａｎｎｅａｌｅｄ）”、“アニールしている（ａｎｎｅａｌｉｎｇ）”等の場合は、前記第一のポリヌクレオチドの全体、又は任意のその一部分が、第二のポリヌクレオチドにアニールすることができ、及びその逆も成り立つ。
本明細書で用いられるものとしての、“テンプレートのコピーを生成すること”等への言及は以下の両方を含む：ｉ）テンプレートの正確なコピーの生成（例えば、ＤＮＡテンプレートのＤＮＡコピーを生成すること）；及びｉｉ）ＲＮＡテンプレートのＤＮＡバーションを生成すること。例えば、テンプレートは一本鎖ＲＮＡ分子（一本鎖のＲＮＡウイルスからのもの等）であり得る。このテンプレートは、逆転写ＰＣＲによりコピーされることができ、ＲＮＡテンプレートの数多くのＤＮＡバージョンのコピーをもたらす。
本明細書において用いられる、所定の対象を、状態又は他の対象等で“処理すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）”への言及は、所定の対象を、直接又は間接に、列挙された状態又は他の対象に曝露することを指す。従って、“処理すること”のステップが明白に区別できる関連する活動（例えば、酵素を容器に加える、容器を振盪する等）を含み得る一方で、全ての“処理すること”のステップが、明白に区別できる関連する活動を必要とはしない。例えば、１つ以上の試薬を含む反応は、容器中で設定されることができ、及び一旦この反応が開始されると、更なる人間又は機械による前記容器の内容への介入なしで、複数の事象又はステップが容器中で生じ得る。前記容器中での、これらの複数の事象又はステップの１つ以上は、反応の開始後には、前記容器の内容への個別の介入がないにも関わらず前記容器中の対象を「処理すること」と記載されることができる。
いくつかの実施形態では、核酸テンプレートは、単一の鎖又は二本鎖であり得る。核酸テンプレートの単一の鎖は、本明細書においては“ポリヌクレオチドテンプレート”と称される。本明細書において言及される“ポリヌクレオチドテンプレート”は、その相補的配列との結合からは除外されない。言い換えると、“ポリヌクレオチドテンプレート”は、例えば、単鎖の核酸テンプレートの全体であり得るか、又はそれは二本鎖の核酸テンプレートの１つの鎖であり得る。核酸テンプレートは一次核酸分子内に含まれ得る。いくつかの実施形態では、核酸テンプレートは一次核酸分子の全体を構成し得る。他の実施形態では、核酸テンプレートは、前記核酸テンプレートの一部ではない、１つ以上のヌクレオチドを含む、一次核酸の中に含まれ得る（例えば、前記核酸テンプレートは、前記核酸テンプレートを含む一次核酸よりも、長さにおいて短いことができる）。
本明細書において提供される方法により、サンプル又は反応混合物中の病原体又は遺伝子が、例えば、１０００、５００、１００、５０、１０、５、２、又は１以下のコピー／マイクロリットル未満の濃度において確実に同定され得る。実施形態では、本明細書において提供される方法は、病原体又は遺伝子の１タイプから核酸を特に増幅でき、及び関連する病原体又は遺伝子からの核酸は増幅しない。例えば、本明細書において提供される、インフルエンザＡマトリックスタンパク質遺伝子を増幅するための検定は、インフルエンザＡ複数の異なる株の中からこの遺伝子を増幅できるが、インフルエンザＢからの遺伝物質は増幅しない。
実施形態では、本明細書において提供される方法は、１つ以上の干渉する可能性のある物質の存在下でも成功裏に遂行され得る。干渉する可能性のある物質の例としては、ＢＳＡ、グルコース、ビリルビン、亜硝酸塩、β−ｈＣＧ、アセトン、低ｐＨ状態、高ｐＨ状態、アセトアミノフェン、アスピリン、プロゲスチン、エチニルエストラジオール、尿保存料、精液、潤滑剤、避妊ゼリー、殺精子剤、女性用パウダー、痔用クリーム、ミコナゾール、ヒトゲノムＤＮＡ、ローション、汎用輸送培地（ウイルス）、Ａｍｉｅｓ輸送培地（バクテリア）、血液、ムチン、アシクロビル、ヘルペス治療剤、尿、糞便、ヘモグロビン、トリグリセリド、ＥＤＴＡ、ヘパリン、コレステロール、γ−グロブリン、アンピシリン、ニコチン、コチニン、鼻腔用スプレー、点鼻薬、又はそれらの任意の組み合わせが挙げられる。実施形態では、本明細書において提供される方法は、参照により全ての目的で本明細書に組み込まれる、２０１４年５月２０日に出願されたと、最大で、少なくとも同程度の濃度までの、干渉する可能性のある物質の存在下でも成功裏に遂行され得る。実施形態では、本明細書において提供される方法は、米国仮特許出願第６２／００１，０５０号において提供されるものよりも、最大で、少なくとも１０％、２５％、５０％、又は１００％大きい濃度の、干渉する可能性のある物質の存在下でも成功裏に遂行され得る。
本明細書において開示される検定及び方法は、サンプルを処理するための機器、又はシステム上で遂行され得る。本明細書において開示される検定及び方法は、自動化された検定機器であり得るサンプル処理のための機器、及び自動化された検定システムであり得る、サンプル処理のためのシステムの中に容易に組み込まれて使用されることができる。そのような機器、及びそのようなシステムは、本明細書において開示される方法の実施に対して有用であり得る。そのような機器、及びそのようなシステムは、本明細書で開示される方法の実施に対して有用であり得る。例えば、機器は、サンプルを受け取るために有用であり得る。機器は、サンプルを調製し、又は処理するために有用であり得る。機器は、サンプルに対する検定を遂行するために有用である。機器は、サンプルからのデータを取得するために有用であり得る。機器は、サンプルから得られたデータを送信するために有用であり得る。機器は、サンプルの処理又は検定の後のサンプルの廃棄に対して有用であり得る。
機器は、システムの一部分であることができ、その構成要素がサンプル処理機器であり得る。機器はサンプル処理機器であり得る。サンプル処理機器は、サンプルの収集を促進するために、臨床検査のためにサンプルを調製するために、又は本明細書で開示される１つ以上の試薬による方法を遂行するために構成され得る。サンプル処理機器は、サンプルからデータを取得するために構成され得る。サンプル処理機器は、サンプルから取得されたデータを送信するために構成され得る。サンプル処理機器はサンプルからのデータを分析するために構成され得る。サンプル処理機器は、サンプルから取得されたデータを分析するために、別の機器、臨床検査施設、又は臨床検査施設に関係する個人と通信するために構成され得る。
サンプル処理機器は、被験者の体内又は体表上に配置されるために構成され得る。サンプル処理機器は、サンプルを被験者から、サンプルを直接的には、又は間接的にかのいずれかにより、受け取るために構成され得る。サンプルは、例えば、血液サンプル（例えば、指先穿刺、又は静脈穿刺、又は動脈血液サンプルから得られたサンプル）、尿サンプル、生検サンプル、組織切片、糞便サンプル、又は他の生物学的サンプル；水サンプル、土壌サンプル、食品サンプル、空気サンプル；又は他のサンプルであってよい。血液サンプルは、例えば、全血、血漿、又は血清を含み得る。サンプル処理機器は、前記機器の筐体を通じて、被験者からサンプルを受け取り得る。前記サンプル収集は、サンプル収集サイト、又は他の場所において生じ得る。前記サンプルは、サンプル収集サイトにおいて、前記機器に提供され得る。
いくつかの実施形態では、サンプル処理機器は、カートリッジを受け入れるか、又は保持するために構成され得る。いくつかの実施形態では、サンプル処理機器は、カートリッジを含む。前記カートリッジは、前記サンプル処理機器から取り外すことができる。いくつかの実施形態では、サンプルは、前記サンプル処理機器のカートリッジに提供され得る。代替的に、サンプルは、サンプル処理機器の別の部分に提供され得る。前記カートリッジ及び／又は機器は、サンプルを受け入れるために構成され得るサンプル収集ユニットを含み得る。
カートリッジはサンプルを含むことができ、及びサンプルの処理又は試験において使用するための試薬、サンプルの処理又は試験において使用するための消耗品、又は他の物質を含み得る。カートリッジは、本明細書で開示される方法を遂行するための本明細書で開示される試薬を含み得る。カートリッジのサンプル処理機器への配置、又はその中へのカートリッジの挿入に続いて、前記カートリッジの１つ以上の成分が、前記サンプル処理機器の他の成分と流体連通にもたらされ得る。例えば、もしサンプルがカートリッジにおいて収集される場合、前記サンプルは、前記サンプル処理機器の他の部分に輸送され得る。同様に、もし１つ以上の試薬がカートリッジ上に提供されると、この試薬は、前記サンプル処理機器の他の部分に移動され得るか、又は前記サンプル処理機器の他の成分が、前記試薬にもたらされ得る。いくつかの実施形態では、カートリッジの試薬又は成分は、カートリッジのオンボードに留まることができる。いくつかの実施形態では、チュービング又は保守管理（例えば、手動又は自動化された保守管理）を要する流体工学は含まれない。
サンプル又は試薬は、サンプル処理機器等の機器に輸送され得る。サンプル又は試薬は、機器内で移動され得る。サンプル又は試薬の、そのような移動は、カートリッジから機器までの連続的な流体の経路を提供することなしで達成され得る。サンプル又は試薬の、そのような移動は、機器内で、連続的な流体の経路を提供することなしで達成され得る。実施形態では、サンプル又は試薬のそのような移動は、サンプル取扱いシステム（例えば、ピペット）により達成されることができ；例えば、サンプル、試薬、又はそれらの等分は、開放先端を持つ、ピペットチップ等の輸送構成要成分に吸引されることができ、この輸送構成要成分は、サンプル取扱いシステムに操作可能に接続されており、サンプル取扱いシステムは、サンプル、試薬、又はそれらの等分をその中に収容するチップを、前記サンプル処理機器上の場所又はその中の場所に移動させる。前記サンプル、試薬、又はそれらの等分は、前記サンプル処理機器上の又は内部の場所に預け入れられることができる。サンプル及び試薬、又は複数の試薬は、サンプル取扱いシステムを用いて、同様の様式で混合され得る。前記カートリッジの１つ以上の成分は、自動化された様式で、前記サンプル処理機器の他の部分に移動され得るか、又はその逆も成り立ち得る。
サンプル処理機器等の機器は、流体取扱いシステムを有し得る。流体取扱いシステムは、サンプル等の液体の輸送、希釈、抽出、等分化、混合、及び他の活動を遂行し得るか、又はその遂行を支援し得る。いくつかの実施形態では、流体取扱いシステムは機器の筐体内に収納され得る。流体取扱いシステムは、流体の収集、送達、処理及び／又は輸送、乾燥試薬の溶解、液体の混合及び／又は液体と乾燥試薬の混合と同時に、非流体成分、サンプル、又は物質の収集、送達、処理及び／又は輸送を可能にする。前記流体は、サンプル、試薬、希釈剤、洗浄剤、染料、又は前記機器により用いられ得る任意の他の流体であることができ、及び限定はされないが、均一な流体、異なる液体、エマルション、懸濁液、及び他の流体を含み得る。限定はされないが、ピペットを含む流体取扱いシステムは、前記機器の周囲で、容器を輸送するためにも用いられることができる（その中に流体を含んでも、又は含まなくてもよい）。前記流体取扱いシステムは、流体を分注するか又は吸引し得る。前記サンプルは、流体中を浮遊する１つ以上の微粒子又は固体物体を含み得る。
実施形態では、流体取扱いシステムは、ピペット、ピペットチップ、注射器、毛細管、又は他の構成要素を含み得る。前記流体取扱いシステムは、内部表面及び外部表面及び開放末端を持つ部分を有し得る。前記流体取扱いシステムは、ピペットを含むことができ、これはピペット本体及びピペットノズルを含み、及びピペットチップを含み得る。ピペットチップは、ピペットノズルから取り外しできても、又はできなくてもよい。実施形態では、流体取扱いシステムは、ピペットチップに嵌合したピペットを用いることができ；ピペットチップは使い捨てであり得る。チップは、ピペットと嵌合した時に、液密の密封を形成し得る。ピペットチップは、１回、２回、又は又はそれ以上の回数用いられ得る。実施形態では、流体取扱いシステムは、ピペット又は同様の機器を、ピペットチップと共に、又はなしで、吸引、分注、混合、輸送、又はさもなければ、流体を取り扱うために用い得る。前記流体は、所望の場合に、流体取扱いシステムから分注され得る。前記流体は、分注される前に、例えば、ピペットチップにおける開口部から、ピペットチップに収納されることができる。実施形態では、又は使用中の例では、前記流体の全てが分注されることができ；他の実施形態では、又は使用中の例では、チップ内の前記流体の一部分が分注され得る。ピペットは選択的に流体を吸入し得る。前記ピペットは、選択された量の流体を吸引し得る。前記ピペットは、前記チップ、又は容器内の前記流体を撹拌する機構を作動する能力を有し得る。前記ピペットは、非液体形状である物質又は試薬を含む、混合のための継続的な流れのループを生成するチップ又は容器を組み込み得る。ピペットチップは、測定された複数の流体の同時の送達、又は２部の基質反応等におけるように順次の送達等により、混合を促進することもできる。
前記流体取扱いシステムは、１つ以上の流体的に単離された、又は水圧駆動的に独立したユニットを含み得る。例えば、前記流体取扱いシステムは１つ、２つ、又はそれを超えるピペットチップを含み得る。前記ピペットチップは、流体を受け入れて拘束するために構成され得る。前記チップは、互いに流体的に分離され得るか、又は互いに水圧駆動的に独立し得る。それぞれのチップ内に含まれる流体は、流体的に分離されているか、又は互いに、他のチップの中の流体及び前記機器内の他の流体と、水圧駆動的に独立している。この流体的に分離されているか、又は水圧駆動的に独立したユニットは、前記機器他の部分に対し、及び／又は互いに対し相対的に移動し得る。前記流体的に分離されているか、又は水圧駆動的に独立したユニットは、個別に移動可能である。流体取扱いシステムは、１つ以上の基部又は支持部を含み得る。基部又は支持部は、１つ以上のピペット又はピペットユニットを支持し得る。基部又は支持部は、前記流体取扱いシステムの１つ以上のピペットを互いに接続させ得る。
サンプル処理機器は、被験者から得られたサンプルに対する処理ステップを遂行するためか、又は活動を行うため構成され得る。サンプルの処理は、例えば、サンプル希釈、サンプルの等分への分割、抽出、試薬との接触、ろ過、分離、遠心分離、又は他の予備的な又は処理作業又はステップを含む、サンプル調製を含み得る。サンプル処理機器は、前記サンプルに対する、１つ以上のサンプル調製の活動又はステップを遂行するために構成され得る。随意的に、サンプルは、化学反応及び／又は物理的処理ステップのために調製され得る。サンプル調製の活動又はステップは、以下の１つ以上を含み得る：遠心分離、分離、ろ過、希釈、富化、精製、沈殿、インキュベーション、ピペッティング、輸送、クロマトグラフィー、細胞溶解、血球計算、粉砕、破砕、活性化、超音波処理、マイクロカラム処理、磁気ビーズによる処理、ナノ粒子による処理、又は他のサンプル調製の活動又はステップ。例えば、サンプル調製は、血液を血清及び／又は微粒子分画に分離するための、又はその他の任意のサンプルを様々な成分に分離するための、１つ以上のステップを含み得る。例えば、サンプル調製は、血液を血清に分離し、及び／又は微粒子の分画に分離するか、又は任意の他のサンプルを様々な構成要素に分離するために１つ以上のステップを含み得る。サンプル調製は、血液サンプル、又は他の生物学的サンプル等のサンプルを希釈、及び／又は濃縮する１つ以上のステップを含み得る。サンプル調製は、抗凝血剤又は他の成分をサンプルに加えることを含み得る。サンプル調製は、サンプルの精製も含み得る。実施形態では、全てのサンプル処理、調製、又は検定行為又はステップは、単一の機器により遂行され得る。実施形態では、全てのサンプル処理、調製、又は検定行為又はステップは、単一の機器の筐体内で遂行され得る。実施形態では、ほとんどのサンプル処理、調製、又は検定行為又はステップは単一の機器により遂行され、及び単一の機器の筐体内で遂行され得る。実施形態では、多くのサンプル処理、調製、又は検定行為又はステップは、単一の機器により遂行され、及び単一の機器の筐体内で遂行され得る。実施形態では、サンプル処理、調製、又は検定行為又はステップは、２つ以上の機器により遂行され得る。
サンプル処理機器は、サンプルについて１つ以上の検定、及び前記サンプルからのデータを取得するために構成され得る。サンプル処理機器は、本明細書において提供される方法と同時に、追加的な検定を遂行し得る。検定は、１つ以上の物理的な又は化学的な処理を含むことができ、及び１つ以上の化学的又は物理的な反応を実行することを含み得る。サンプル処理機器は、少量の体液サンプルに対して１つ、２つ以上の検定を遂行するために構成され得る。本明細書の他の部分に記載されるように、１つ以上の化学的反応は、容積を有するサンプルに対して生じることができる。例えば、１つ以上の化学的反応は、フェムトリットル未満の容積を有するピルの中で生じ得る。一例では、前記サンプル収集ユニットは、血液又は間質液の単一の１滴以下に相当する体液サンプルを受け取るために構成され得る。実施形態では、サンプルの容積は大変少なく、その容積は、１０００μＬ未満、約５００μＬ未満、約２５０μＬ未満、約１５０μＬ未満、約１００μＬ未満、約７５μＬ未満、約５０μＬ未満、約４０μＬ未満、約２０μＬ未満、約１０μＬ未満、約１μＬ未満、約０．５μＬ未満、約０．１μＬ未満であるか、又はその他の小さな容積を下回るものである。実施形態では、全てのサンプル検定行為又はステップは、単一のサンプルについて遂行される。実施形態では、全てのサンプル検定行為又はステップは、単一の機器により遂行される。実施形態では、全てのサンプル検定行為又はステップは、単一の機器の筐体内で遂行される。実施形態では、ほとんどのサンプル検定行為又はステップは、単一の機器により遂行され、及び単一の機器の筐体において遂行され得る。実施形態では、多くのサンプル検定行為又はステップは、単一の機器により遂行されることができ、及び単一の機器の筐体内で遂行され得る。実施形態では、サンプル処理、調製、又は検定行為又はステップは、２つ以上の機器により遂行され得る。
サンプル処理機器は、単一のサンプルに対して複数の検定を遂行するために構成され得る。いくつかの実施形態では、サンプル処理機器は本明細書において提供される方法、及び１つ、２つ、又はそれより多い追加的な検定を遂行するために構成され得る。実施形態では、サンプル処理機器は、単一のサンプルについて複数の検定を遂行するために構成され得る。実施形態では、サンプル処理機器は、単一のサンプルに対して複数の検定を遂行するために構成されることができ、前記サンプルは小量のサンプルである。例えば、少量のサンプルは、約１０００μＬ未満の、約５００μＬ、約２５０μＬ、約１５０μＬ、約１００μＬ、約７５μＬ、約５０μＬ、約４０μＬ、約２０μＬ、約１０μＬ、約５μＬ未満の、約１μＬ未満の、約０．５μＬ未満の、約０．１μＬ未満の、又は他の小量の容積の小量の容積であるサンプル容積サンプルを有し得る。サンプル処理機器は、単一のサンプルについて、多重化された検定を遂行する能力を有し得る。複数の検定は、同時に実行されることができるか；順次に遂行されることができるか；又はいくつかの検定が同時に実行され得る一方で、他の物は順次に遂行され得る。１つ以上の対照検定及び／又は校正器（例えば、検定／試験のための校正器の制御の構成を含む）も前記機器に組み込まれることができ；対照検定及び校正器に対する検定は、サンプルに対して遂行される検定と同時に検定されることができるか、又はサンプルに対する検定の前、若しくは後に、遂行され得るか、又はそれらの任意の組み合わせであってよい。実施形態では、全てのサンプル検定活動又はステップは、単一の機器により遂行される。実施形態では、複数の検定活動又はステップの全ては、単一の機器の筐体内で遂行される。実施形態では、ほとんどのサンプル検定活動又は複数の検定ステップは、単一の機器により遂行され、及び単一の機器の筐体内で遂行され得る。実施形態では、多くのサンプル検定活動又は複数の検定のステップは、単一の機器により遂行され、及び単一の機器の筐体内で遂行され得る。実施形態では、サンプル処理、調製、又は検定活動又はステップは、２つ以上の機器により遂行され得る。
実施形態では、複数の検定の全てが短い時間間隔内で遂行され得る。実施形態では、そのような短い時間間隔は、約３時間未満、約２時間未満、約１時間未満、約４０分未満、約３０分未満、約２５分未満、約２０分未満、約１５分未満、約１０分未満、約５分未満、約４分未満、約３分未満、約２分未満、約１分未満、又は他の短い時間間隔を含み得る。
サンプル処理機器は、前記サンプルに関する１つ以上の信号を検出するために構成され得る。サンプル処理機器は、前記サンプルの性質の１つ以上を特定するために構成され得る。例えば、前記サンプル処理機器は、検体の存在又は濃度（例えば、標的の核酸）又は複数の検体又は前記サンプル（例えば、体液、分泌物、組織、又は他のサンプル中の又はそれらを介して）の疾患状態を、検出するために構成され得る。代替的に、前記サンプル処理機器は、１つ以上の検体存在又は濃度を検出するために分析され得る信号（疾患状態を示す）か、又は前記サンプル中の疾患状態を、検出するために構成され得る。これらの信号は、前記機器のオンボードで分析され得るか、又は別の場所で分析され得る。臨床検査を実行することは、収集されたデータの分析又は比較を含んでも、又は含まなくてもよい。
化学的反応又は他の処理ステップは、前記サンプルと共に、又は前記サンプルなしで遂行され得る。前記機器により調製され得るか、又は実行され得るステップ、検査、又は検定の例は、限定はされないが免疫検定、核酸検定（例えば、本明細書において提供される方法）、受容体に基づく検定、血球計算検定、比色検定、酵素的検定、電気泳動的検定、電気化学的検定、分光的検定、クロマトグラフィー的検定、顕微鏡的検定、局所的検定、熱量測定的検定、比濁的検定、凝集検定、放射性同位体検定、粘度測定検定、凝固検定、凝固時間検定、タンパク合成検定、組織学的検定、培養物検定、浸透圧検定、及び／又は他のタイプの検定、遠心分離、分離、ろ過、希釈、富化、精製、沈殿、粉砕、インキュベーション、ピペッティング、輸送、細胞溶解、又は他のサンプル調製活動又はステップ、又はそれらの組み合わせが挙げられる。前記機器により調製され得るか、又は実行され得るステップ、検査、又は検定は、顕微鏡法、血球計算、及び画像を調製するか、又は利用する他の技法を含む、画像化を含むことができる。前記機器により調製され得るか、又は実行され得るステップ、検査、又は検定の例は、更に組織学、形態学、運動学、力学、及び／又は細胞に対するそのような評価を含むサンプルの状態の評価を更に含み得る。
機器は、全てのオンボードのステップ（例えば、単一の機器により遂行され得るステップ又は行為）を、短い時間の量において遂行する能力を有し得る。機器は単一のサンプルに対する全てのオンボードのステップを、短い時間の量において遂行する能力を有し得る。例えば、被験者からのサンプル収集データを送信するまで及び／又は分析までは、約３時間以下、２時間以下、１時間以下、５０分以下、４５分以下、４０分以下、３０分以下、２０分以下、１５分以下、１０分以下、５分以下、４分以下、３分以下、２分以下、又は１分以下を必要とし得る。サンプルを前記機器内に受け入れてから、前記機器からそのようなサンプルに関するデータを送信するまで、及び／又は分析までの時間の量は、前記サンプルに対して遂行されるステップ、検査、又は検定のタイプ又は数に依存し得る。前記機器からそのようなサンプルに関するデータを送信するまで、及び／又は分析までは、約３時間以下、２時間以下、１時間以下、５０分以下、４５分以下、４０分以下、３０分以下、２０分以下、１５分以下、１０分以下、５分以下、４分以下、３分以下、２分以下、又は１分以下を必要とし得る。
機器は、サンプルを処理又は検定した後に、生物学的サンプルなどのサンプルを廃棄のために準備するか、若しくは廃棄するために構成され得る。
実施形態では、サンプル処理機器は、サンプルから得られたデータを送信するために構成され得る。実施形態では、サンプル処理機器は、ネットワークを通じて通信するために構成され得る。サンプル処理機器は、ネットワークと連結できるための通信モジュールを含み得る。サンプル処理機器は、有線接続又は無線的にネットワークに接続され得る。前記ネットワークは、ローカル・エリア・ネットワーク（ＬＡＮ）またはインターネットなどの広域ネットワーク（ＷＡＮ）などのネットワークであり得る。いくつかの実施形態では、前記ネットワークはパーソナル・エリア・ネットワークであってよい。前記ネットワークはクラウドを含み得る。前記サンプル処理機器は、前記ネットワークに、仲介機器を必要とせずに接続され得るか、又は仲介機器がサンプル処理機器をネットワークに接続するために必要であり得る。サンプル処理機器は、ネットワークを通じて別の機器と通信し得る、限定はされないが、パーソナルコンピュータ、サーバーコンピュータ、又はラップトップコンピュータ；Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）ＣＥ機器等のパーソナル・デジタル・アシスタント（ＰＤＡ）、セルフォン等の電話、スマートフォン（例えば、ｉＰｈｏｎｅ（登録商標）、Ａｎｄｒｏｉｄ、Ｂｌａｃｋｂｅｒｒｙ等）、又は位置把握携帯電話（ＧＰＳ等の）；ネットワークに接続されたローミング機器等のローミング機器；無線電子メール機器等の無線機器又はコンピュータ・ネットワークと無線的に通信する能力を有する他の機器；又はネットワークを通じて通信することができ、及び電子的なやり取りを行い得る任意の他のタイプのネットワーク機器を含む、任意のタイプのネットワーク化された機器であり得る。そのような通信は、クラウドコンピューティングインフラストラクチャー、又は他の機器によりアクセスされ得る、任意の他のタイプのデータ保存インフラストラクチャーにデータを提供することを含み得る。
サンプル処理機器は、サンプルに関するデータを、例えば、ヘルスケア専門家、臨床検査施設等のヘルスケア専門家の場所、又はその関係者に提供し得る。臨床検査施設、ヘルスケア専門家、又は被験者の１つ以上は、前記サンプル処理機器から提供されるデータを受信するか、又はアクセスし得るネットワーク機器を有し得る。サンプル処理機器は、サンプルに関するデータをデータベースに提供するために構成され得る。サンプル処理機器は、サンプルに関するデータを、電子医学記録システム、臨床検査施設情報システム、臨床検査施設自動化システム、又は他のシステム又若しくはソフトウエアに提供するために構成され得る。サンプル処理機器は、データを報告書の形態で提供し得る。
臨床検査施設、機器、若しくは他の実体又はソフトウエアは、サンプルに関するデータの分析をリアルタイムで遂行し得る。ソフトウエアシステムは、化学的分析及び／又は病理学的分析を遂行し得るか、又はこれらは、臨床検査施設、臨床施設、及び専門又はエキスパートの職員の組み合わせの間で分配され得る。分析はサンプルの定性的及び／又は定量的評価を含み得る。データ分析は、サンプルの後続する定性的及び／又は定量的評価を含み得る。随意的に、生データ、前処理されたデータ、又は分析されたデータに基づいて報告書が作成され得る。そのような報告書は、前記サンプルから得られたデータ、そのサンプルが取得された被験者の身元及び他の情報、データの分析、及び他の機密情報の機密性を維持するために作成されることができる。前記報告書及び／又は前記データは、ヘルスケア専門家に送信され得る。サンプル処理機器により得られたデータ、そのようなデータの分析、又は報告書は、データベース、電子的医学記録システム、臨床検査施設情報システム、臨床検査施設自動化システム、又は他のシステム又はソフトウエアに提供されることができる。
本明細書で開示される方法、組成物、又は他の試薬を用いるか、又はそれらと共に用いられる、試薬、検定、方法、キット、機器、及びシステムの例の記載及び開示は、例えば、米国特許第８，０８８，５９３号；米国特許第８，３８０，５４１号；２０１３年２月１８日に出願された、米国特許出願第１３／７６９，７９８号；２０１３年２月１８日に出願された、米国特許出願第１３／７６９，７７９号；２０１１年９月２６日に出願された米国特許出願第１３／２４４，９４７号；２０１２年９月２５日に出願された、ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／５７１５５号；２０１１年９月２６日に出願された、米国特許出願第１３／２４４，９４６号；２０１１年９月２６日に出願された、米国特許出願第１３／２４４，９４９号；及び２０１１年９月２６日に出願された、米国特許出願第６１／６７３，２４５号；２０１４年３月１５日に出願された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ１４／３００３４号；及び２０１４年３月１５日に出願された米国特許出願第１４／２１４，８５０号の中に見出されることができ、全ての特許及び特許出願の開示は、それらの全体が、参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０１４年９月１７日に出願された米国仮特許出願第６２／０５１，９１２号；２０１４年９月１７日に出願された米国仮特許出願第６２／０５１，９４５号；２０１４年１０月２４日に出願された米国仮特許出願第６２／０６８，６０３号；２０１４年１０月２４日に出願された米国仮特許出願第６２／０６８，６０５号；２０１５年４月２２日に出願された米国仮特許出願第６２／１５１，３５８号；２０１４年３月１５日に出願された米国実用新案出願第１４／２１４，８５０号；２０１４年３月１５日に出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ１４／３００３４号；及び２０１４年９月１７日に出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ１４／５６１５１号による利益及び優先権を主張し、それぞれの開示も、参照により、その全体が全ての目的で本明細書に組み込まれる。
２０１３年１１月２２日に出願された米国仮特許出願第６１／９０８，０２７号；２０１４年３月２０日に出願された米国仮特許出願第６２／００１，０５０号；及び２０１３年３月１５日に出願された米国仮特許出願第６１／８００，６０６の開示も、参照によりその全体が全ての目的で本明細書に組み込まれる。
ＰＣＴ／ＵＳ１４／５６１５１において提供される方法及び組成物
実施形態では、本明細書において提供される方法及び組成物は、参照により、その全体が全ての目的で本明細書に組み込まれる、２０１４年９月１７日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ１４／５６１５１において提供される方法又は組成物 を含むことができる。ＰＣＴ／ＵＳ１４／５６１５１において提供される方法は、熱サイクリングなしで遂行され得る。ＰＣＴ／ＵＳ１４／５６１５１において提供される例示的方法及び組成物は、以下に提供される。以下の記載は、文脈に対して適切な場合には、本明細書において提供される方法及び組成物にも適用され得る。
いくつかの実施形態では、本明細書において提供されるものは、二本鎖の核酸テンプレートの２つ以上のコピーを含むコンカテマーを生成するための方法であり、この方法は以下のものを含む：（Ａ）二本鎖の核酸テンプレートを含む一次の二本鎖の核酸を、二本鎖の核酸テンプレートの第一の鎖にアニールされた第一のプライマーの第一のコピーの伸長された生成物が、合成される得る条件下で、第一のプライマーの第一のコピー及びポリメラーゼにより処理することであって、前記第一のプライマーは、５’末端ヌクレオチド、３’末端ヌクレオチド、並びに（ｉ）及び（ｉｉ）の２つの領域を含み：（ｉ）テール領域であって、このテール領域は以下を含む：（ａ）前記プライマーの５’末端ヌクレオチド（ｂ）最も内部のヌクレオチドであって、この最も内部のヌクレオチドは、前記５’末端ヌクレオチドから下流にあり、（ｃ）１つ以上のヌクレオチドを含む５’末端ヌクレオチド及び最も内部のヌクレオチドの間の中間部分、及び（ｉｉ）テンプレート結合領域であって、このテンプレート結合領域は以下のものを含む：（ａ）前記プライマーの３’末端ヌクレオチド、（ｂ）最も内部のヌクレオチドであって、この最も内部のヌクレオチドは前記３’末端ヌクレオチドから上流にあり、（ｃ）１つ以上のヌクレオチドを含む、前記３’末端ヌクレオチド及び前記最も内部のヌクレオチドの間の中間部分、及び前記第一のプライマーの第一のコピーのテンプレート結合領域は、二本鎖の核酸テンプレートの前記第一の鎖にアニールし、（Ｂ）ステップ（Ａ）の前記第一のプライマーの第一のコピーの伸長された生成物を、ステップ（Ａ）の前記第一のプライマーの第一のコピーの伸長された生成物がアニールされた第二のプライマーの伸長された生成物が合成される条件下で、第二のプライマー及びポリメラーゼで処理することであって、前記第二のプライマーは、５’末端ヌクレオチド，３’末端ヌクレオチド、並びに以下の（ｉ）及び（ｉｉ）の２つの領域を含み：（ｉ）テール領域であって、以下のものを含むテール領域：（ａ）前記プライマーの５’末端ヌクレオチド、（ｂ）最も内部のヌクレオチドであって、この最も内部のヌクレオチドは、前記５’末端ヌクレオチドから下流にあり、（ｃ）１つ以上のヌクレオチドを含む、前記５’末端ヌクレオチド及び前記最も内部のヌクレオチドの間の中間部分、及び（ｉｉ）テンプレート結合領域であって、以下のものを含むテンプレート結合領域：（ａ）前記プライマーの３’末端ヌクレオチド、（ｂ）最も内部のヌクレオチドであって、この最も内部のヌクレオチドは前記３’末端ヌクレオチドから上流にあり、（ｃ）１つ以上のヌクレオチドを含む、前記３’末端ヌクレオチドと前記最も内部のヌクレオチドの間の中間領域であって、前記第二のプライマーのテール領域は、前記第一のプライマーのテール領域のヌクレオチド配列と相補的である、ヌクレオチド配列を含み、もし前記第二のプライマーの５’末端ヌクレオチドが、前記第一のプライマーのテール領域の最も内部のヌクレオチドと整列される場合、及び前記第一のプライマーの５’末端ヌクレオチドが、第二のプライマーのテール領域の最も内部のヌクレオチドと整列する場合、前記第二のプライマーのテンプレート結合領域は、ステップ（Ａ）の前記第一のプライマーの第一のコピーの伸長された生成物とアニールし、及び前記第二のプライマーの伸長された生成物は、５’末端ヌクレオチド、３’末端ヌクレオチド、及び３’末端ヌクレオチドを含む、３’末端領域を含み、前記３’末端領域は、前記第二のプライマーのテール領域を、５’から３’方向に読んだ場合の、ヌクレオチド配列と同じヌクレオチド配列を含み、及び３’末端ヌクレオチドの３’末端領域の最終的なヌクレオチドは、第二のプライマーの伸長された生成物の、３’末端ヌクレオチドであり、（Ｃ）ステップ（Ｂ）の第二のプライマーの伸長された生成物を含む、二次核酸の第一のコピー、及び前記第一のプライマーの第二のコピーの伸長された生成物を生成するために、ステップ（Ｂ）の前記第二のプライマーの伸長された生成物を、前記第一のプライマーの第二のコピー及びポリメラーゼにより、ステップ（Ｂ）の前記第二のプライマーの伸長された生成物によりアニールされた、前記第一のプライマーの第二のコピーの伸長された生成物が、合成される条件下で、処理することであって、前記第一のプライマーの第二のコピーの伸長された生成物は、５’末端ヌクレオチド、３’末端ヌクレオチド、及び３’末端ヌクレオチドを含む３’末端領域を含み、前記３’末端領域は、前記第一のプライマーを５’から３’方向に読んだ場合のテール領域と同じヌクレオチド配列であり、３’末端領域の最終的なヌクレオチドは、第二のプライマーの伸長された生成物の、３’末端ヌクレオチドであり、（Ｄ）（Ｃ）の二次核酸の少なくとも第二のコピーを生成するために、少なくともステップ（Ｃ）を、１回以上の追加回数で繰り返すこと、（Ｅ）二次核酸の第一のコピーの第一のプライマーの第二のコピーの伸長された生成物、及び二次核酸の第二のコピーの第二のプライマーの伸長された生成物を含む、クロスオーバー構造を生成するために、ステップ（Ｃ）の二次核酸の第一のコピー及びステップ（Ｄ）の二次核酸の第二のコピーを、二次核酸の第一のコピーの第一のプライマーの第二のコピーの伸長化合物の３’末端領域が、二次核酸の第二のコピーの第二のプライマーの伸長生成物の３’末端領域とアニールする条件下で処理すること、（Ｆ）ステップ（Ａ）の二本鎖の核酸テンプレートの２つのコピーを含むコンカテマーを生成するために、ステップ（Ｅ）のクロスオーバー構造を、二次核酸の第一のコピーの第一のプライマーの第二のコピーの伸長された生成物の伸長された生成物が合成され、及び二次核酸の第二のコピーの第二のプライマーの伸長された生成物の伸長された生成物が合成される条件下で、ポリメラーゼで処理することであって、前記コンカテマーは、二次核酸の第一のコピーの第一のプライマーの第二のコピーの伸長された生成物の伸長された生成物、及び二次核酸の第二のコピーの第二のプライマーの伸長された生成物の伸長された生成物を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書において提供されるものは、ヌクレオチドテンプレート又はその類似した配列の２つ以上のコピーを含むコンカテマーを生成するための方法であり、この方法は以下のものを含む：（Ａ）ヌクレオチドテンプレートを含む一次の二本鎖の核酸を、ヌクレオチドテンプレートの第一の鎖にアニールされた第一のプライマーの第一のコピーの伸長された生成物が、合成される得る条件下で、第一のプライマーの第一のコピー及びポリメラーゼにより処理することであって、前記第一のプライマーは、５’末端ヌクレオチド、３’末端ヌクレオチド、並びに（ｉ）及び（ｉｉ）の２つの領域を含み：（ｉ）テール領域であって、このテール領域は以下を含む：（ａ）前記プライマーの５’末端ヌクレオチド（ｂ）最も内部のヌクレオチドであって、この最も内部のヌクレオチドは、前記５’末端ヌクレオチドから下流にあり、（ｃ）１つ以上のヌクレオチドを含む５’末端ヌクレオチド及び最も内部のヌクレオチドの間の中間部分（ｉｉ）テンプレート結合領域であって、このテンプレート結合領域は以下のものを含む：（ａ）前記プライマーの３’末端ヌクレオチド、（ｂ）最も内部のヌクレオチドであって、この最も内部のヌクレオチドは前記３’末端ヌクレオチドから上流にあり、（ｃ）１つ以上のヌクレオチドを含む、前記３’末端ヌクレオチド及び前記最も内部のヌクレオチドの間の中間部分、及び前記第一のプライマーの第一のコピーのテンプレート結合領域は、ヌクレオチドテンプレートの前記第一の鎖にアニールし、（Ｂ）ステップ（Ａ）の前記第一のプライマーの第一のコピーの伸長された生成物を、ステップ（Ａ）の前記第一のプライマーの第一のコピーの伸長された生成物がアニールされた第二のプライマーの伸長された生成物が合成される条件下で、第二のプライマー及びポリメラーゼで処理することであって、前記第二のプライマーは、５’末端ヌクレオチド，３’末端ヌクレオチド、並びに以下の（ｉ）及び（ｉｉ）の２つの領域を含み：（ｉ）テール領域であって、以下のものを含むテール領域：（ａ）前記プライマーの５’末端ヌクレオチド、（ｂ）最も内部のヌクレオチドであって、この最も内部のヌクレオチドは、前記５’末端ヌクレオチドから下流にあり、（ｃ）１つ以上のヌクレオチドを含む、前記５’末端ヌクレオチド及び前記最も内部のヌクレオチドの間の中間部分、及び（ｉｉ）テンプレート結合領域であって、以下のものを含むテンプレート結合領域：（ａ）前記プライマーの３’末端ヌクレオチド、（ｂ）最も内部のヌクレオチドであって、この最も内部のヌクレオチドは前記３’末端ヌクレオチドから上流にあり、（ｃ）１つ以上のヌクレオチドを含む、前記３’末端ヌクレオチドと前記最も内部のヌクレオチドの間の中間領域であって、前記第二のプライマーのテール領域は、前記第一のプライマーのテール領域のヌクレオチド配列と相補的である、ヌクレオチド配列を含み、もし前記第二のプライマーの５’末端ヌクレオチドが、前記第一のプライマーのテール領域の最も内部のヌクレオチドと整列され、及び前記第一のプライマーの５’末端ヌクレオチドが、第二のプライマーのテール領域の最も内部のヌクレオチドと整列する場合、前記第二のプライマーのテンプレート結合領域は、ステップ（Ａ）の前記第一のプライマーの第一のコピーの伸長された生成物とアニールし、及び前記第二のプライマーの伸長された生成物は、５’末端ヌクレオチド、３’末端ヌクレオチド、及び３’末端ヌクレオチドを含む、３’末端領域を含み、前記３’末端領域は、前記第二のプライマーのテール領域を、５’から３’方向に読んだ場合の、ヌクレオチド配列と同じヌクレオチド配列を含み、及び３’末端ヌクレオチドの３’末端領域の最終的なヌクレオチドは、第二のプライマーの伸長された生成物の、３’末端ヌクレオチドであり、（Ｃ）ステップ（Ｂ）の第二のプライマーの伸長された生成物を含む、二次核酸の第一のコピー、及び前記第一のプライマーの第二のコピーの伸長された生成物を生成するために、ステップ（Ｂ）の前記第二のプライマーの伸長された生成物を、前記第一のプライマーの第二のコピー及びポリメラーゼにより、ステップ（Ｂ）の前記第二のプライマーの伸長された生成物によりアニールされた、前記第一のプライマーの第二のコピーの伸長された生成物が、合成される条件下で、処理することであって、前記第一のプライマーの第二のコピーの伸長された生成物は、５’末端ヌクレオチド、３’末端ヌクレオチド、及び３’末端ヌクレオチドを含む３’末端領域を含み、前記３’末端領域は、前記第一のプライマーを５’から３’方向に読んだ場合のテール領域と同じヌクレオチド配列であり、３’末端領域の最終的なヌクレオチドは、第二のプライマーの伸長された生成物の、３’末端ヌクレオチドであり、（Ｄ）ステップ（Ｂ）の第二のプライマーの伸長生成物、及びステップ（Ｃ）の第一のプライマー第二の伸長生成物を含む二次核酸の少なくとも第二のコピーを生成するために、少なくともステップ（Ｃ）を、１回以上の追加回数で繰り返すこと、（Ｅ）二次核酸の第一のコピーの第一のプライマーの第二のコピーの伸長された生成物、及び二次核酸の第二のコピーの第二のプライマーの伸長された生成物を含む、クロスオーバー構造を生成するために、ステップ（Ｃ）の二次核酸の第一のコピー及びステップ（Ｄ）の二次核酸の第二のコピーを、二次核酸の第一のコピーの第一のプライマーの第二のコピーの伸長化合物の３’末端領域が、二次核酸の第二のコピーの第二のプライマーの伸長生成物の３’末端領域とアニールする条件下で処理すること、（Ｆ）ステップ（Ａ）のヌクレオチドテンプレートの２つのコピーを含むコンカテマーを生成するために、ステップ（Ｅ）のクロスオーバー構造を、二次核酸の第一のコピーの第一のプライマーの第二のコピーの伸長された生成物の伸長された生成物が合成され、及び二次核酸の第二のコピーの第二のプライマーの伸長された生成物の伸長された生成物が合成される条件下で、ポリメラーゼで処理することであって、前記コンカテマーは、二次核酸の第一のコピーの第一のプライマーの第二のコピーの伸長された生成物の伸長された生成物、及び二次核酸の第二のコピーの第二のプライマーの伸長された生成物の伸長された生成物を含む。いくつかの実施形態では、ステップ（Ａ）の核酸ポリメラーゼは、ＤＮＡポリメラーゼである。いくつかの実施形態では、ステップ（Ａ）の核酸ポリメラーゼは、逆転写酵素である。
いくつかの実施形態では、本明細書において提供されるものは、二本鎖の核酸テンプレートの２つ以上のコピーを含むコンカテマーを生成するための方法であり、この方法は以下のものを含む：（Ａ）以下を含む反応混合物を調製すること：（ｉ）二本鎖の核酸テンプレートを含む一次の二本鎖の核酸、（ｉｉ）単離された核酸ポリメラーゼ、（ｉｉｉ）５’末端ヌクレオチド、３’末端ヌクレオチド、並びに（ａ）及び（ｂ）の２つの領域を含む第一のプライマー：（ａ）テール領域であって、このテール領域は以下を含む：（１）前記プライマーの５’末端ヌクレオチド（２）最も内部のヌクレオチドであって、この最も内部のヌクレオチドは、前記５’末端ヌクレオチドから下流にあり、（３）１つ以上のヌクレオチドを含む５’末端ヌクレオチド及び最も内部のヌクレオチドの間の中間部分、及び（ｂ）テンプレート結合領域であって、このテンプレート結合領域は以下のものを含む：（１）前記プライマーの３’末端ヌクレオチド、（２）最も内部のヌクレオチドであって、この最も内部のヌクレオチドは前記３’末端ヌクレオチドから上流にあり、（３）１つ以上のヌクレオチドを含む、前記３’末端ヌクレオチド及び前記最も内部のヌクレオチドの間の中間部分であって、ここでテンプレート結合領域は、前記核酸テンプレートの第一の鎖に相補的であり、（ｉｖ）５’末端ヌクレオチド，３’末端ヌクレオチド、並びに以下の（ａ）及び（ｂ）の２つの領域を含む第二のプライマー：（ａ）テール領域であって、以下のものを含むテール領域：（１）前記プライマーの５’末端ヌクレオチド、（２）最も内部のヌクレオチドであって、この最も内部のヌクレオチドは、前記５’末端ヌクレオチドから下流にあり、（３）１つ以上のヌクレオチドを含む、前記５’末端ヌクレオチド及び前記最も内部のヌクレオチドの間の中間部分、及び（ｂ）テンプレート結合領域であって、以下のものを含むテンプレート結合領域：（１）前記プライマーの３’末端ヌクレオチド、（２）最も内部のヌクレオチドであって、この最も内部のヌクレオチドは前記３’末端ヌクレオチドから上流にあり、（３）１つ以上のヌクレオチドを含む、前記３’末端ヌクレオチドと前記最も内部のヌクレオチドの間の中間領域であって、及びもし前記第二のプライマーの５’末端ヌクレオチドが、前記第一のプライマーのテール領域の最も内部のヌクレオチドと整列され、及び前記第一のプライマーの５’末端ヌクレオチドが、第二のプライマーのテール領域の最も内部のヌクレオチドと整列する場合、前記テンプレート結合領域は、核酸テンプレートの第二の鎖に相補的であり、及び（Ｂ）反応混合物を少なくとも３分間、熱サイクリングなしでインキュベートすること。
いくつかの実施形態では、本明細書において提供されるものは、ポリヌクレオチドテンプレートの２つ以上のコピーを含むコンカテマーを生成するための方法であり、この方法は以下のものを含む：（Ａ）以下を含む反応混合物を調製すること：（ｉ）ポリヌクレオチドテンプレートを含む一次のポリヌクレオチド、（ｉｉ）単離された核酸ポリメラーゼ、（ｉｉｉ）５’末端ヌクレオチド、３’末端ヌクレオチド、並びに（ａ）及び（ｂ）の２つの領域を含む第一のプライマー：（ａ）テール領域であって、このテール領域は以下を含む：（１）前記プライマーの５’末端ヌクレオチド（２）最も内部のヌクレオチドであって、この最も内部のヌクレオチドは、前記５’末端ヌクレオチドから下流にあり、（３）１つ以上のヌクレオチドを含む５’末端ヌクレオチド及び最も内部のヌクレオチドの間の中間部分、及び（ｂ）テンプレート結合領域であって、このテンプレート結合領域は以下のものを含む：（１）前記プライマーの３’末端ヌクレオチド、（２）最も内部のヌクレオチドであって、この最も内部のヌクレオチドは前記３’末端ヌクレオチドから上流にあり、（３）１つ以上のヌクレオチドを含む、前記３’末端ヌクレオチド及び前記最も内部のヌクレオチドの間の中間部分であって、ここでテンプレート結合領域は、ポリヌクレオチドに核酸配列に相補的であり、（ｉｖ）５’末端ヌクレオチド，３’末端ヌクレオチド、並びに以下の（ａ）及び（ｂ）の２つの領域を含む第二のプライマー：（ａ）テール領域であって、以下のものを含むテール領域：（１）前記プライマーの５’末端ヌクレオチド、（２）最も内部のヌクレオチドであって、この最も内部のヌクレオチドは、前記５’末端ヌクレオチドから下流にあり、（３）１つ以上のヌクレオチドを含む、前記５’末端ヌクレオチド及び前記最も内部のヌクレオチドの間の中間部分、及び（ｂ）テンプレート結合領域であって、以下のものを含むテンプレート結合領域：（１）前記プライマーの３’末端ヌクレオチド、（２）最も内部のヌクレオチドであって、この最も内部のヌクレオチドは前記３’末端ヌクレオチドから上流にあり、（３）１つ以上のヌクレオチドを含む、前記３’末端ヌクレオチドと前記最も内部のヌクレオチドの間の中間領域であって、及びもしこれらのプライマーの配列が、前記第二のプライマーの５’末端ヌクレオチドが、前記第一のプライマーのテール領域の最も内部のヌクレオチドと整列され、及び前記第一のプライマーの５’末端ヌクレオチドが、第二のプライマーのテール領域の最も内部のヌクレオチドと整列する場合には、前記テンプレート結合領域は、核酸テンプレートの第二の鎖に相補的であり、及び（Ｂ）反応混合物を８０Ｃを超える温度において、少なくとも３分間、熱サイクリングなしでインキュベートすること。
いくつかの実施形態では、本明細書において提供されるものは、二本鎖の核酸テンプレートの２つ以上のコピーを含むコンカテマーを生成するための方法であり、この方法は、二本鎖の核酸テンプレートを含む、二本鎖の核酸分子の第一のコピー及び第二のコピー及びポリメラーゼを共にインキュベートすることを含み、前記二本鎖の核酸分子は、第一の鎖及び第二の鎖を含み、それぞれが複数のヌクレオチドを含み、前記第一の鎖は、５’末端ヌクレオチド及び３’末端ヌクレオチドを含み、並びに５’から３’方向の中に：Ａ１−Ｂ−Ａ２の一般形式の領域を含み、第二の鎖は、５’末端ヌクレオチド及び３’末端ヌクレオチドを含み、並びに５’から３’方向の中に：Ｃ１−Ｄ−Ｃ２の一般形式の領域を含み、二本鎖の核酸分子の中に、領域Ｂは、二本鎖の核酸テンプレートの第一の鎖のヌクレオチド配列を含み、領域Ｄは、二本鎖の核酸テンプレートの第二の鎖のヌクレオチド配列を含み、領域Ａ１はＣ２にアニールされ、ＢはＤにアニールされ、及びＡ２はＣ１にアニールされ、前記二本鎖の核酸分子の第一のコピーの第一の鎖、及び前記二本鎖の核酸分子の第二のコピーの第二の鎖を含む、クロスオーバー構造が生成され、前記第一の鎖のＡ２領域は、第二の鎖のＣ２領域にアニールされ、前記クロスオーバー構造の第二の鎖の伸長された生成物にアニールされた前記クロスオーバー構造の第一の鎖の伸長された生成物を含むコンカテマー生成するために、前記クロスオーバー構造の第一の鎖の伸長された生成物が合成され、及び前記クロスオーバー構造の第二の鎖の伸長された生成物が合成され、このコンカテマーは、前記二本鎖の核酸テンプレートの２つのコピーを含む。
実施形態では、本明細書において提供されるものは、ポリヌクレオチドテンプレートをコピーするための方法であり、この方法は：第一のプライマーの複数のコピー及び第二のプライマーの複数のコピーを含む反応混合物中で前記ポリヌクレオチドテンプレートをインキュベートすることを含み：前記第一のプライマーは、第一の領域及び第二の領域を含み、前記第一のプライマーの第二の領域は、前記ポリヌクレオチドテンプレートの第一の部分に相補的なヌクレオチド配列を含み；前記第二のプライマーは、第一の領域及び第二の領域を含み、前記第二のプライマーの第二の領域は、パートナーのヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列を含み、前記パートナーのヌクレオチド配列は、前記ポリヌクレオチドテンプレートの第二の部分と相補的であり；及び前記第一のプライマーの複数のコピー及び第二のプライマーの複数のコピーと前記ポリヌクレオチドテンプレートのインキュベーションにより、少なくとも１つのコンカテマー鎖が形成され、このコンカテマー鎖は、５’末端及び３’末端を含み、及び５’から３’方向の中に：Ｃ’−Ｔ−Ｃ’−Ｔ−Ｘ−Ｃ’の一般的構造を有するヌクレオチド配列を含み：Ｃ’は、前記第二のプライマーの第一の領域のヌクレオチド配列を表し、Ｔは、前記ポリヌクレオチドテンプレート又はその類似の配列のヌクレオチド配列を表し、及びＸは、ヌクレオチドの配列の数を表す。
いくつかの実施形態では、本明細書において提供される５’から３’方向の中に：Ｃ’−Ｔ−Ｃ’−Ｔ−Ｘ−Ｃ’の一般的な構造を有するヌクレオチド配列を含むコンカテマー鎖の形成を含む方法では、このコンカテマー鎖は第一のコンカテマー鎖であり、及び第二のコンカテマー鎖も形成され、第二のコンカテマー鎖は、５’末端及び３’末端を含み、及び５’から３’方向の中に：Ｃ−Ｘ’−Ｔ’−Ｃ−Ｔ’−Ｃの一般的構造を有するヌクレオチド配列を含み：Ｃは、前記第一のプライマーの第一の領域のヌクレオチド配列を表し、Ｔ’は前記ポリヌクレオチドテンプレートに相補的なヌクレオチド配列を表し、及びＸ’は、Ｘのヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を表す。
実施形態では、本明細書において提供されるものは、生物学的サンプル中の標的のポリヌクレオチドテンプレートの検定のための方法であり、この方法は以下のものを含む：Ａ）前記生物学的サンプル又はその一部分を、第一のプライマーの複数のコピー及び第二のプライマーの複数のコピーを含む反応混合物中でインキュベートすることであって：前記第一のプライマーは第一の領域及び第二の領域を含み、記第一のプライマーの第二の領域は、前記ポリヌクレオチドテンプレートの第一の部分と相補的なヌクレオチド配列を含み；前記第二のプライマーは、第一の領域及び第二の領域を含み、前記第二のプライマーの第二の領域は、パートナーのヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列を含み、このパートナーのヌクレオチド配列は前記ポリヌクレオチドテンプレートの第二の部分と相補的であり；及び前記ポリヌクレオチドテンプレートと、前記第一のプライマーの複数のコピー及び第二のプライマーの複数のコピーとのインキュベーションすると、少なくとも１つのコンカテマー鎖が形成され、このコンカテマー鎖は、５’末端及び３’末端を含み、及び５’から３’方向中に：Ｃ’−Ｔ−Ｃ’−Ｔ−Ｘ−Ｃ’の一般構造を有するヌクレオチド配列を含み：Ｃ’は、第二のプライマーの第一の領域のヌクレオチド配列を表し、Ｔは、前記ポリヌクレオチドテンプレート又はその類似した配列のヌクレオチド配列を表し、及びＸは、ヌクレオチドの任意の数及び配列を表し；及びＢ）Ａ）のステップのインキュベートを開始した後の、１つ以上の点で、Ａ）の反応混合物中の増幅された核酸の量を測定すること。実施形態では、反応混合物中の増幅された核酸の量を測定することは、反応混合物中の蛍光のレベルを決定することを含み得る。実施形態では、前記方法は、反応混合物中の核酸増幅の屈曲時間を決定することを更に含み得る。
実施形態では、本明細書において提供される、５’から３’方向に：Ｃ’−Ｔ−Ｃ’−Ｔ−Ｘ−Ｃ’の一般構造を有するヌクレオチド配列を有するコンカテマー鎖を含む、方法、反応混合物、容器、又はキットにおいては、式中でＸは、[（Ｃ’−Ｔ）Ｎ]の５’から３’方向における一般構造を有する配列を含むことができ、Ｃ’は、前記第二のプライマーの第一の領域のヌクレオチド配列を表し、Ｔは前記ポリヌクレオチドテンプレート又はその類似の配列のヌクレオチド配列を表し、及びＮは０〜２０００の間の整数を表す。実施形態では、Ｎは、０〜１０、０〜１００、０〜１０００、０〜５０００、０〜１０，０００、１〜１０，０００、１〜１０００、１〜２０００、１〜５０００、又は１〜１０，０００の間の任意の整数であり得る。
実施形態では、本明細書において提供される、５’から３’方向に：Ｃ’−Ｔ−Ｃ’−Ｔ−Ｘ−Ｃ’の一般構造を有するヌクレオチド配列を有するコンカテマー鎖を含む、方法、反応混合物、容器、又はキットにおいては、式中でＸは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、５０、１００、５００、１０００、１０，０００、５０，０００、１００，０００、又は５００，０００を超えないヌクレオチドを含み得る。実施形態では、本明細書において提供される、５’から３’方向に：Ｃ’−Ｔ−Ｃ’−Ｔ−Ｘ−Ｃ’の一般構造を有するヌクレオチド配列を有するコンカテマー鎖を含む、方法、反応混合物、容器、又はキットにおいては、式中でＸは少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、５０、１００、５００、１０００、１０，０００、５０，０００、１００，０００、又は５００，０００ヌクレオチドを含むことができる。本明細書において提供される、５’から３’方向に：Ｃ’−Ｔ−Ｃ’−Ｔ−Ｘ−Ｃ’の一般構造を有するヌクレオチド配列を有するコンカテマー鎖を含む、方法、反応混合物、容器、又はキットにおいては、Ｘは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、５０、１００、５００、１０００、１０，０００、５０，０００、１００，０００のヌクレオチドを含み、及び２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、５０、１００、５００、１０００、１０，０００、５０，０００、１００，０００、又は５００，０００以下のヌクレオチドを含み得る。
実施形態では、５’から３’方向に：Ｃ’−Ｔ−Ｃ’−Ｔ−Ｘ−Ｃ’の一般構造を有するヌクレオチド配列を有するコンカテマー鎖を含む、方法、反応混合物、容器、又はキットにおいては、少なくとも１つのＣ’及びＴの間に、Ｃ’又はＴ配列の部分ではない、１つ以上の追加のヌクレオチドが存在する。この１つ以上の追加のヌクレオチドは、例えば、１〜１０、１〜２０、１〜１００、又は１〜１０００のヌクレオチドであり得る。
実施形態では、５’から３’方向に：Ｃ’−Ｔ−Ｃ’−Ｔ−Ｘ−Ｃ’の一般構造を有するヌクレオチド配列を有するコンカテマー鎖を含む、方法、反応混合物、容器、又はキットにおいては、少なくとも１つのＣ’又はＴ配列は、１つ以上のヌクレオチドを欠失し得る。２つ以上のヌクレオチドが欠失している場合には、これらの欠失しているヌクレオチドは隣接していることができるか、又は離れた位置にあり得る。前記１つ以上の欠失ヌクレオチドは、例えば、１〜１０、１〜２０、１〜１００、又は１〜１０００ヌクレオチドであり得る。
実施形態では、５’から３’方向に：Ｃ’−Ｔ−Ｃ’−Ｔ−Ｘ−Ｃ’の一般構造を有するヌクレオチド配列を有するコンカテマー鎖を含む、方法、反応混合物、容器、又はキットにおいては、少なくとも１つのＣ’又はＴ配列は、１つ以上の点突然変異を有し得る。２つ以上の点突然変異が存在する場合、これらの点突然変異は隣接し得るか、又は離れた場所にあり得る。前記１つ以上の点突然変異は、例えば、１〜１０、１〜２０、１〜１００、又は１〜１０００の点突然変異であり得る。
実施形態では、５’から３’方向に：Ｃ’−Ｔ−Ｃ’−Ｔ−Ｘ−Ｃ’の一般構造を有するヌクレオチド配列を有するコンカテマー鎖を含む、方法、反応混合物、容器、又はキットにおいては、前記ヌクレオチド配列は、以下の特性の２つ又は３つの全てを有する：ｉ）少なくとも１つのＣ’及びＴの間に、Ｃ’又はＴ配列の一部ではない１つ以上の追加のヌクレオチドが存在する；ｉｉ）少なくとも１つのＣ’又はＴ配列は１つ以上のヌクレオチドを欠失し得る；及びｉｉｉ）少なくとも１つのＣ’又はＴ配列は、１つ以上の点突然変異を含む。
実施形態では、５’から３’方向に：Ｃ’−Ｔ−Ｃ’−Ｔ−Ｘ−Ｃ’の一般構造を有するヌクレオチド配列を有するコンカテマー鎖を含む、方法、反応混合物、容器、又はキットにおいては、前記ポリヌクレオチドテンプレートが、ＲＮＡ分子である実施形態では、前記Ｔは、前記ポリヌクレオチドテンプレートのＲＮＡ配列と類似の、ＤＮＡ配列のヌクレオチド配列を表す。
実施形態では、５’から３’方向に：Ｃ’−Ｔ−Ｃ’−Ｔ−Ｘ−Ｃ’の一般構造を有するヌクレオチド配列を有するコンカテマー鎖を含む、方法、反応混合物、容器、又はキットにおいては、前記コンカテマー鎖は、最も５’−側に存在するＣ’配列の５’末端に更に１つ以上のヌクレオチドを含む。この１つ以上のヌクレオチドは、例えば、１〜１０、１〜２０、１〜１００、又は１〜１０００のヌクレオチドであり得る。
実施形態では、５’から３’方向に：Ｃ’−Ｔ−Ｃ’−Ｔ−Ｘ−Ｃ’の一般構造を有するヌクレオチド配列を有するコンカテマー鎖を含む、方法、反応混合物、容器、又はキットにおいては、前記コンカテマー鎖は、最も３’−側に存在するＣ’配列の３’末端に更に１つ以上のヌクレオチドを含む。前記１つ以上のヌクレオチドは、例えば、１〜１０、１〜２０、１〜１００、又は１〜１０００のヌクレオチドであり得る。
実施形態では、本明細書において提供されるものは、二本鎖の核酸テンプレートの少なくとも２つのコピーを含むコンカテマーの生成方法であり、この方法は以下のものを含む：少なくとも第一のテンプレート分子及び第二のテンプレート分子を含む反応混合物中でインキュベートすることであって：前記第一のテンプレート分子は第一の核酸鎖及び第二の核酸鎖を含み：前記第一のテンプレート分子の第一の核酸鎖は、５’から３’方向の中に：Ｈ’−Ｓ−Ｙ１−Ｈ’の一般構造を有するヌクレオチド配列を含み、式中：Ｈ’は、第一の相同配列のヌクレオチド配列を表し、Ｓは、二本鎖の核酸テンプレートの第一の鎖のヌクレオチド配列を表し、及びＹ１は、ヌクレオチドの任意の数及び配列を表し；及び前記第一のテンプレート分子の第二の核酸鎖は、５’から３’方向の中に：Ｈ−Ｙ１’−Ｓ’−Ｈの一般構造を有するヌクレオチド配列を含み、式中：Ｈは、第二の相同配列のヌクレオチド配列を表し、前記第一の相同配列及び第二の相同配列は互いに相補的であり、Ｙ１’は、Ｙ１のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を表し、及びＳ’は、二本鎖の核酸テンプレートの第二の鎖のヌクレオチド配列を表し、前記二本鎖の核酸テンプレートの第一の鎖及び第二の鎖は互いに相補的であり；及び第二のテンプレート分子は第一の核酸鎖及び第二の核酸鎖を含み：前記第二のテンプレート分子の第一の核酸鎖は、５’から３’方向の中に：Ｈ’−Ｓ−Ｙ２−Ｈ’の一般構造を有するヌクレオチド配列を含み、式中：Ｈ’は、前記第一の相同配列のヌクレオチド配列を表し、Ｓは、二重鎖の核酸テンプレートの第一の鎖のヌクレオチド配列を表し、及びＹ２は、ヌクレオチドの任意の数及び配列を表し；及び前記第一のテンプレート分子の第二の核酸鎖は、５’から３’方向の中に、：Ｈ−Ｙ２’−Ｓ’−Ｈの一般構造を有する、ヌクレオチド配列を含み、式中：Ｈは、第二の相同配列のヌクレオチド配列を表し、Ｙ２’は、Ｙ２のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を表し、及びＳ’は、前記二本鎖の核酸テンプレートの第二の鎖のヌクレオチド配列を表し；及び前記反応混合物中の第一のテンプレート分子を第二のテンプレート分子とインキュベートする際に、二本鎖の核酸テンプレートの、少なくとも２つのコピーを有する、少なくとも１つのコンカテマーが生成され、前記コンカテマーは、第一のコンカテマー鎖、及び第二のコンカテマー鎖を含み、前記第一のコンカテマー鎖は、５’末端及び３’末端を含み、及び５’から３’方向の中に：Ｈ’−Ｓ−Ｙ２−Ｈ’−Ｓ−Ｙ１−Ｈ’の一般構造を有するヌクレオチド配列を含み、式中：Ｈ’、Ｙ１、Ｓ、及びＹ２のそれぞれは、上述のヌクレオチド配列を表し；及び第二のコンカテマー鎖は、５’末端及び３’末端を含み、及び５’から３’方向の中に：Ｈ−Ｙ１’−Ｓ’−Ｈ−Ｙ２’−Ｓ’−Ｈの一般構造を有する配列を含み、式中、Ｈ’、Ｙ１、Ｓ、及びＹ２は上述のヌクレオチド配列を表す。
実施形態では、５’から３’方向の中に：Ｈ’−Ｓ−Ｙ２−Ｈ’−Ｓ−Ｙ１−Ｈ’の一般構造を有するヌクレオチド配列を含む、第一のコンカテマー鎖を含む、本明細書において提供される、方法、反応混合物、容器、又はキットでは、Ｙ１及びＹ２の少なくとも１つ又は両方は、０個のヌクレオチドを表す。
実施形態では、５’から３’方向の中に：Ｈ’−Ｓ−Ｙ２−Ｈ’−Ｓ−Ｙ１−Ｈ’の一般構造を有するヌクレオチド配列を含む、第一のコンカテマー鎖を含む、本明細書において提供される、方法、反応混合物、容器、又はキットでは、Ｙ１は、５’から３’方向の中に、[（Ｈ’−Ｓ）Ｎ１]の一般構造を有する配列を含むことができ、式中：Ｈ’及びＳは上述のヌクレオチド配列を表し、及びＮ１は、０〜２０００の間の任意の整数であり得る。
実施形態では、５’から３’方向の中に：Ｈ’−Ｓ−Ｙ２−Ｈ’−Ｓ−Ｙ１−Ｈ’の一般構造を有するヌクレオチド配列を含む、第一のコンカテマー鎖を含む、本明細書において提供される、方法、反応混合物、容器、又はキットでは、Ｙ２は、５’から３’方向の中に：[（Ｈ’−Ｓ）Ｎ２]の一般構造を有する配列を含むことができ、式中：Ｈ’及びＳは、上述のヌクレオチド配列を表し、及びＮ１は、０〜２０００の間の任意の整数であり得る。
実施形態では、本明細書において提供される第一のテンプレート分子及び第二のテンプレート分子を含む、方法、反応混合物、容器、又はキットものでは、前記第一のテンプレート分子及び第二のテンプレート分子は、両方とも二本鎖のＤＮＡ分子である。
実施形態では、本明細書において提供される、第一のテンプレート分子の第一の核酸鎖を含む、方法、反応混合物、容器、又はキットは、前記第一の核酸鎖は、５’から３’方向中に：Ｈ’−Ｓ−Ｙ１−Ｈ’の一般構造を有するヌクレオチド配列を含み、式中：Ｈ’は、第一の相同配列のヌクレオチド配列を表し、前記第一の相同配列は、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、又は１００以下のヌクレオチドを含み得る。実施形態では、前記第一の相同配列は、少なくとも４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、又は１００のヌクレオチドを含み得る。実施形態では、前記第一の相同配列は、少なくとも４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、又は１００の、及び５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、又は２００以下のヌクレオチドを含み得る。
実施形態では、本明細書において提供される、反応混合物、容器、又はキットは、核酸ポリメラーゼを含む。実施形態では、核酸ポリメラーゼは、鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼである。実施形態では、核酸ポリメラーゼＲＮＡポリメラーゼである。実施形態では、核酸ポリメラーゼは逆転写酵素である。実施形態では、反応混合物、容器、又はキットは、鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼ及び逆転写酵素の両方等の２種類以上の核酸ポリメラーゼを含み得る。実施形態では、本明細書において提供される反応混合物、容器、又はキットものは、ヌクレオチド及び緩衝液を含む。
実施形態では、本明細書において提供されるポリヌクレオチドテンプレートを含む、方法、反応混合物、容器、又はキットでは、前記ポリヌクレオチドテンプレートは、一本鎖の分子である。実施形態では、本明細書において提供されるポリヌクレオチドテンプレートを含む、方法、反応混合物、容器、又はキットでは、前記ポリヌクレオチドテンプレートは、二本鎖の核酸テンプレートの一本の鎖を含む。実施形態では、本明細書において提供されるポリヌクレオチドテンプレートを含む、方法、反応混合物、容器、又はキットでは、前記ポリヌクレオチドテンプレートはＤＮＡ又はＲＮＡ分子である。
実施形態では、本明細書において提供される、核酸テンプレートを含む、方法、反応混合物、容器、又はキットでは、前記核酸テンプレートは、ＲＮＡ又はＤＮＡ分子である。実施形態では、核酸テンプレートは、単鎖の又は二本鎖の分子であり得る。
実施形態では、本明細書において提供される、反応混合物のインキュベーションを含む方法では、前記反応混合物のインキュベーションの間、反応混合物の温度は、９０、８５、８０、７５、７０、６５、６０、５５、５０、４５、４０、３７、３５、３０、２５、又は２０Ｃを超えない。実施形態では、本明細書において提供される方法では、前記方法の全てのステップは、９０、８５、８０、７５、７０、６５、６０、５５、５０、４５、４０、３７、３５、３０、２５、又は２０Ｃ以下の温度において遂行される。実施形態では、本明細書において提供される反応混合物、容器、又はキットは、９０、８５、８０、７５、７０、６５、６０、５５、５０、４５、４０、３７、３５、３０、２５、又は２０Ｃ以下の温度に維持される。実施形態では、本明細書において提供される方法は、熱サイクリングなしで遂行される。
実施形態では、本明細書において提供される、第一の部分を含むポリヌクレオチドテンプレートを含む、方法、反応混合物、容器、又はキットでは、前記第一の部分は、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、又は２００以下のヌクレオチドを含む。実施形態では、本明細書において提供される、第一の部分を含むポリヌクレオチドテンプレートを含む、方法、反応混合物、容器、又はキットでは、前記第一の部分は、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、又は２００未満のヌクレオチドを含む。実施形態では、本明細書において提供される、第一の部分を含むポリヌクレオチドテンプレートを含む、方法、反応混合物、容器、又はキットでは、前記第一の部分は、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、又は１００未満のヌクレオチドを含み、及び１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、又は２００以下のヌクレオチドを含む。
実施形態では、本明細書において提供される、第一の領域を含むプライマーを含む、方法、反応混合物、容器、又はキットでは、前記第一の領域が、少なくとも４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、又は１００のヌクレオチドを含む。実施形態では、本明細書において提供される、第一の領域を含むプライマーを含む、方法、反応混合物、容器、又はキットでは、前記第一の領域は、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、又は１００以下のヌクレオチドを含む。実施形態では、本明細書において提供される、第一の領域を含むプライマーを含む、方法、反応混合物、容器、又はキットでは、前記第一の領域は、少なくとも４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、又は９０の、及び５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０ヌクレオチドを含む。実施形態では、本明細書において提供される、第一の領域を含む第一のプライマー及び第一の領域を含む第二のプライマーを含む、方法、反応混合物、容器、又はキットでは、前記第一のプライマー及び第二のプライマーの両方は、上述のいかなる特徴も有し得る。実施形態では、本明細書において提供される、第一の領域を含む第一のプライマー、及び第一の領域を含む第二のプライマーを含む、方法、反応混合物、容器、又はキットでは、前記第一のプライマーの第一の領域及び前記第二のプライマーの第一の領域は、同じ数のヌクレオチドを含み得る。実施形態では、本明細書において提供される、第一の領域を含む第一のプライマー、及び第一の領域を含む第二のプライマーを含む、方法、反応混合物、容器、又はキットでは、前記第一のプライマーの第一の領域、及び前記第二のプライマーの第一の領域は、異なる数のヌクレオチドを含み得る。
実施形態では、本明細書において提供される、第二の領域を含むプライマーを含む、方法、反応混合物、容器、又はキットでは、この第二の領域は、少なくとも４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、又は１００のヌクレオチドを含む。実施形態では、本明細書において提供される、第二の領域を含むプライマーを含む、方法、反応混合物、容器、又はキットでは、この第二の領域は、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、又は１００以下のヌクレオチドを含む。実施形態では、本明細書において提供される、第二の領域を含むプライマーを含む、方法、反応混合物、容器、又はキットでは、この第二の領域は、少なくとも４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、又は９０の、及び５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、又は１００以下のヌクレオチドを含む。実施形態では、本明細書において提供される、第一の領域を含む第二のプライマー及び第二の領域を含む第二のプライマーを含む、方法、反応混合物、容器、又はキットでは、前記第一のプライマー及び第二のプライマーの両方は、前記第一のプライマー及び第二のプライマーの両方は、上述のいかなる特徴も有し得る。実施形態では、本明細書において提供される、第一の領域を含む第二のプライマー及び第二の領域を含む第二のプライマーを含む、方法、反応混合物、容器、又はキットでは、前記第一のプライマー及び第二のプライマーの両方は、同じ数のヌクレオチドを含み得る。実施形態では、本明細書において提供される、第二の領域を含む第一のプライマー及び第二の領域を含む第二のプライマーを含む、方法、反応混合物、容器、又はキットでは、前記第一のプライマー及び第二のプライマーの両方は、異なる数のヌクレオチドを含み得る。
形態では、本明細書において提供される、第二の領域を含む第二のプライマー、及び第二の部分を含むポリヌクレオチドテンプレートを含む、方法、反応混合物、容器、又はキットでは、前記第二のプライマーの第二の領域のヌクレオチド配列は、前記ポリヌクレオチドテンプレートの第二の部分のヌクレオチド配列と同じである。
実施形態では、本明細書において提供される、テール領域を含むプライマーを含む、方法、反応混合物、容器、又はキットでは、前記テール領域は、少なくとも４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、又は１００のヌクレオチドを含む。実施形態では、本明細書において提供される、テール領域を含むプライマーを含む、方法、反応混合物、容器、又はキットでは、前記テール領域は、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、又は１００以下のヌクレオチドを含む。実施形態では、本明細書において提供される、テール領域を含むプライマーを含む、方法、反応混合物、容器、又はキットでは、前記テール領域は、少なくとも４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、又は９０の、及び５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、又は１００以下のヌクレオチドを含む。実施形態では、本明細書において提供される、テール領域を含む第一のプライマー、及びテール領域を含む第二のプライマーを含む、方法、反応混合物、容器、又はキットでは、前記第一のプライマー及び第二のプライマーの両方が、上述のいかなる特徴も有し得る。実施形態では、本明細書において提供される、テール領域を含む第一のプライマー、及びテール領域を含む第二のプライマーを含む、方法、反応混合物、容器、又はキットでは、前記第一のプライマーのテール領域及び第二のプライマーのテール領域は、同じ数のヌクレオチドを含み得る。実施形態では、本明細書において提供される、テール領域を含む第一のプライマー、及びテール領域を含む第二のプライマーを含む、方法、反応混合物、容器、又はキットでは、前記第一のプライマーのテール領域及び第二のプライマーのテール領域は、異なる数のヌクレオチドを含み得る。
実施形態では、本明細書において提供されるテンプレート結合領域を含むプライマーを含む方法、反応混合物、容器、又はキットでは、第二の領域は、少なくとも４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、又は１００のヌクレオチドを含む。実施形態では、本明細書において提供されるテンプレート結合領域を含むプライマーを含む方法、反応混合物、容器、又はキットでは、前記テンプレート結合領域は、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、又は１００以下のヌクレオチドを含む。実施形態では、本明細書において提供されるテンプレート結合領域を含むプライマーを含む方法、反応混合物、容器、又はキットでは、前記テンプレート結合領域は、少なくとも４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、又は９０の、及び５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、又は１００以下のヌクレオチドを含む。実施形態では、本明細書において提供されるテンプレート結合領域を含む、第一のプライマー及びテンプレート−結合領域を含む第二のプライマーを含む、含む方法、反応混合物、容器、又はキットでは、前記第一のプライマー及び第二のプライマーの両方は、上述のいかなる特徴も有し得る。実施形態では、本明細書において提供されるテンプレート結合領域を含む、第一のプライマー及びテンプレート結合領域を含む第二のプライマーを含む、含む方法、反応混合物、容器、又はキットでは、前記第一のプライマーのテンプレート結合領域、及び前記第二のプライマーのテンプレート結合領域は同じ数のヌクレオチドを含み得る。実施形態では、本明細書において提供されるテンプレート結合領域を含む、第一のプライマー及びテンプレート結合領域を含む第二のプライマーを含む、含む方法、反応混合物、容器、又はキットでは、前記第一のプライマーのテンプレート結合領域、及び前記第二のプライマーのテンプレート結合領域は異なる数のヌクレオチドを含み得る。
実施形態では、本明細書において提供されるポリヌクレオチドテンプレートを含む方法、反応混合物、容器、又はキットでは、前記ポリヌクレオチドテンプレートは、少なくとも８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、５００、１０００、２０００、又は５０００のヌクレオチドを含み得る。実施形態では、本明細書において提供されるポリヌクレオチドテンプレートを含む方法、反応混合物、容器、又はキットでは、前記ポリヌクレオチドテンプレートは、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、５００、１，０００、２，０００、５，０００、又は１０，０００以下のヌクレオチドを含み得る。実施形態では、本明細書において提供されるポリヌクレオチドテンプレートを含む方法、反応混合物、容器、又はキットでは、前記ポリヌクレオチドテンプレートは、少なくとも８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、５００、１０００、２０００、又は５０００の、及び９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、５００、１，０００、２，０００、５，０００、又は１０，０００以下のヌクレオチドを含み得る。
実施形態では、本明細書において提供される二本鎖の核酸テンプレートを含む方法、反応混合物、容器、又はキットでは、前記二本鎖の核酸テンプレートのそれぞれの鎖は、少なくとも８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、５００、１０００、２０００、又は５０００のヌクレオチドを含み得る。実施形態では、本明細書において提供される二本鎖の核酸テンプレートを含む方法、反応混合物、容器、又はキットでは、前記二本鎖の核酸テンプレートのそれぞれの鎖は、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、５００、１，０００、２，０００、５，０００、又は１０，０００以下のヌクレオチドを含み得る。実施形態では、本明細書において提供される二本鎖の核酸テンプレートを含む方法、反応混合物、容器、又はキットでは、前記二本鎖の核酸テンプレートのそれぞれの鎖は、少なくとも８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、５００、１０００、２０００、又は５０００の、及び９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、５００、１，０００、２，０００、５，０００、又は１０，０００以下のヌクレオチドを含み得る。
実施形態では、本明細書において提供される反応混合物、容器、又はキットは、リコンビナーゼ酵素を含まない。
実施形態では、本明細書において提供される、方法、反応混合物、容器、又はキットは、プライマー複数のコピーを含み得るか、又は取り込み得る。前記複数のコピーは、例えば、前記プライマーの、少なくとも５、１０、１５、２０、５０、１００、５００、１０００、１０，０００、１００，０００、又は１，０００，０００コピーであり得る。
実施形態では、本明細書において提供される、反応混合物又は容器は、被験者からの生物学的サンプルの少なくとも一部分を含み得る。この生物学的サンプルは、例えば、唾液、血液、尿、頬の裏からの拭い取り、又は鼻の拭い取りであり得る。前記被験者はヒトであり得る。
いくつかの実施形態では、本明細書において提供される方法の全てのステップは、７０、６５、６０、６５、６０、５５、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、又は１０Ｃ以下の温度で遂行される。いくつかの実施形態では、本明細書において提供される方法のいくつかのステップは、７０、６５、６０、６５、６０、５５、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、又は１０Ｃ以下の温度で遂行される。
いくつかの実施形態では本明細書において提供される方法の２つ以上のステップは、同じ反応混合物中で同時に遂行される。いくつかの実施形態では、本明細書において提供される方法の全てのステップは、同じ反応混合物中で同時に遂行される。
いくつかの実施形態では、本明細書において提供される方法では、核酸テンプレートは、方法の開始から５、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１２０、又は１８０分以内に、少なくとも１０、１００、１０００、１０，０００、１００，０００、又は１，０００，０００倍に増幅される。いくつかの実施形態では、本明細書において提供される方法では、反応混合物中の核酸テンプレートのコピーの数は、方法の開始から、５、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１２０、又は１８０分以内に、少なくとも１０、１００、１０００、１０，０００、１００，０００、又は１，０００，０００倍に増幅される。
実施形態では、本明細書において提供される核酸テンプレートは、一本鎖の又は二本鎖の核酸テンプレートであり得る。
実施形態では、本明細書において提供されるものは、その中の流体連結中に以下のものを含む容器である：第一のプライマーであって、前記第一のプライマーは、第一の領域及び第二の領域を含み、及び前記第一のプライマーの第二の領域は、ポリヌクレオチドテンプレートの第一の部分と相補的なヌクレオチド配列を含み；第二のプライマーであって、前記第二のプライマーは、第一の領域及び第二の領域を含み、及び前記第二のプライマーの第二の領域は、パートナーのヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含み、前記パートナーのヌクレオチド配列は、前記ポリヌクレオチドテンプレートの第二の部分に相補的であり；及び少なくとも１つのコンカテマー鎖であって、このコンカテマー鎖は、５’末端及び３’末端を含み、並びに５’から３’方向の中に：Ｃ’−Ｔ−Ｃ’−Ｔ−Ｘ−Ｃ’の一般的構造を有するヌクレオチド配列を含み、式中：Ｃ’は、第二のプライマーの第一の領域のヌクレオチド配列を表し、Ｔは、前記ポリヌクレオチドテンプレート又はその類似の配列のヌクレオチド配列を表し、及びＸは、ヌクレオチドの任意の数及び配列を表す。
いくつかの実施形態では、本明細書において提供されるものは、その中の流体連結に以下のものを含む容器である：（Ａ）単離された核酸ポリメラーゼ、（Ｂ）少なくとも第一の鎖を含む核酸テンプレート、（Ｃ）５’末端ヌクレオチド、３’末端ヌクレオチド、及び以下の２つの領域を含む第一のプライマー
：（ｉ）テール領域であって、以下を含むテール領域（ａ）前記プライマーの５’末端ヌクレオチド（ｂ）最も内部のヌクレオチドであって、前記最も内部のヌクレオチド前記５’末端ヌクレオチドから下流にあり（ｃ）前記５’末端ヌクレオチド及び前記最も内部のヌクレオチドの間の１つ以上のヌクレオチドを含む中間部分、及び（ｉｉ）テンプレート結合領域であって、以下を含むテンプレート結合領域（ａ）前記プライマーの３’末端ヌクレオチド（ｂ）最も内部のヌクレオチドであって、前記最も内部のヌクレオチドは前記３’末端ヌクレオチドから上流にあり、（ｃ）前記３’末端ヌクレオチド及び前記最も内部のヌクレオチドの間の、１つ以上のヌクレオチドを含む中間部分であって、前記テンプレート結合領域は、前記核酸テンプレートの第一の鎖に相補的であり、並びに（Ｄ）５’末端ヌクレオチド、３’末端ヌクレオチド、及び以下の２つの領域を含む第二のプライマー：（ｉ）テール領域であって、以下を含むテール領域（ａ）前記プライマーの５’末端ヌクレオチド（ｂ）最も内部のヌクレオチドであって、前記最も内部のヌクレオチドは、前記５’末端ヌクレオチドから下流にあり（ｃ）前記５’末端ヌクレオチド及び前記最も内部のヌクレオチドの間の、１つ以上のヌクレオチドを含む中間部分、及び（ｉｉ）テンプレート結合領域であって、以下を含むテンプレート結合領域（ａ）前記プライマーの３’末端ヌクレオチド（ｂ）最も内部のヌクレオチドであって、前記最も内部のヌクレオチドは前記３’末端ヌクレオチドから上流にあり（ｃ）前記３’末端ヌクレオチド及び前記最も内部のヌクレオチドの間の、１つ以上のヌクレオチドを含む中間部分であり、及びもし前記プライマーの配列が整列される場合には、前記第二のプライマー５’末端ヌクレオチドが、前記第一のプライマーのテール領域の最も内部のヌクレオチドと整列し、及び前記第一のプライマー５’末端ヌクレオチドが、前記第二のプライマーのテール領域の最も内部のヌクレオチドと整列できる場合には、及び前記テンプレート結合領域は、前記核酸テンプレートの第一の鎖に相補的なヌクレオチド配列に対して相補的であり、及び前記第二のプライマーのテール領域は、前記第一のプライマーのテール領域のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含む。
実施形態では、本明細書において提供されるものは、２つ以上の流体的に分離された容器を含むキットであり、前記容器は集合的に以下のものを含む：第一のプライマーであって、前記第一のプライマーは、第一の領域及び第二の領域を含み、及び前記第一のプライマーの第二の領域は、ポリヌクレオチドテンプレートの第一の部分に相補的なヌクレオチド配列を含み；第二のプライマーであって、前記第二のプライマーは、第一の領域及び第二の領域を含み、及び前記第二のプライマーの第二の領域は、パートナーのヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含み、前記パートナーのヌクレオチド配列は、前記ポリヌクレオチドテンプレートの第二の部分に相補的であり；及び単離された鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼ：ここで前記第一のプライマーの第一の領域、及び前記第二のプライマー第一の領域は相補的である。
いくつかの実施形態では本明細書において提供されるものは、少なくとも第一の鎖を含む標的の目的の核酸を検出するためのキットであり、このキットは２つ以上の流体的に分離された容器を含み、前記容器は集合的に以下のものを含む：（Ａ）単離された核酸ポリメラーゼ、（Ｂ）５’末端ヌクレオチド、３’末端ヌクレオチド、及び以下の２つの領域を含む第一のプライマー：（ｉ）以下を含むテール領域（ａ）前記プライマーの５’末端ヌクレオチド（ｂ）最も内部のヌクレオチドであって、前記最も内部のヌクレオチドは、前記５’末端ヌクレオチドから下流にあり（ｃ）１つ以上のヌクレオチドを含む、前記５’末端ヌクレオチド及び前記最も内部のヌクレオチドの間の中間部分、及び（ｉｉ）以下を含むテンプレート結合領域（ａ）前記プライマーの３’末端ヌクレオチド（ｂ）最も内部のヌクレオチドであって、前記最も内部のヌクレオチドは前記３’末端ヌクレオチドから上流にあり（ｃ）１つ以上のヌクレオチドを含む、前記３’末端ヌクレオチド及び前記最も内部のヌクレオチドの間の中間部分、前記テンプレート結合領域は、前記標的の核酸の第一の鎖に相補的であり、及び（Ｃ）第二のプライマー５’末端ヌクレオチド、３’末端ヌクレオチド、及び以下の２つの領域を含み：（ｉ）以下を含むテール領域（ａ）前記プライマーの５’末端ヌクレオチド（ｂ）最も内部のヌクレオチドであって、前記最も内部のヌクレオチドは、前記５’末端ヌクレオチドから下流にあり（ｃ）１つ以上のヌクレオチドを含む、前記５’末端ヌクレオチド及び前記最も内部のヌクレオチドの間の中間部分、及び（ｉｉ）以下を含むテンプレート結合領域（ａ）前記プライマーの３’末端ヌクレオチド（ｂ）最も内部のヌクレオチドであって、前記最も内部のヌクレオチドは前記３’末端ヌクレオチドから上流にあり（ｃ）１つ以上のヌクレオチドを含む、前記３’末端ヌクレオチド及び前記最も内部のヌクレオチドの中間部分、及びもし前記プライマーの配列が、前記第二のプライマーの５’末端ヌクレオチドが、前記第一のプライマーのテール領域の最も内部のヌクレオチドと整列し、及び前記第一のプライマーの５’末端ヌクレオチドが、前記第二のプライマーのテール領域の最も内部のヌクレオチドと整列できる場合には、前記テンプレート結合領域は、標的の核酸前記第一の鎖に相補的なヌクレオチド配列に相補的であり、及び前記第二のプライマーテール領域は、前記第一のプライマーテール領域ヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態では本明細書において提供される、キットは、標的の目的の核酸のヌクレオチド配列を有する核酸を含む。
いくつかの実施形態では本明細書において提供される、反応混合物、容器又はキットは、核酸染料を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書において提供される単離された核酸ポリメラーゼを含む容器又はキットの中で、前記単離された核酸ポリメラーゼは、ＤＮＡポリメラーゼである。いくつかの実施形態では、本明細書において提供される単離された核酸ポリメラーゼを含む、容器又はキットの、単離された核酸ポリメラーゼは逆転写酵素である。いくつかの実施形態では、本明細書において提供される容器又はキットは、単離された核酸ポリメラーゼを含み、前記容器又はキットは、ＤＮＡポリメラーゼ及び逆転写酵素を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書において提供される方法、容器、又はキットは、核酸ポリメラーゼを含み、前記核酸ポリメラーゼは、鎖置換活性を有する。
いくつかの実施形態では、本明細書において提供される方法は、前記方法の１つ以上の反応成分又はステップを核酸染料により処理することを含む。
いくつかの実施形態では、本明細書において提供される、核酸テンプレートを含む、方法、容器、又はキットでは、前記テンプレートは、ＤＮＡ分子である。いくつかの実施形態では、本明細書において提供される、核酸テンプレートを含む、方法、容器、又はキットでは、前記テンプレートは、ＲＮＡ分子である。
いくつかの実施形態では、本明細書において提供される第一のプライマーを含む、方法、容器、又はキットでは、前記第一のプライマーのテール領域は、少なくとも４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、本明細書において提供される第一のプライマーを含む、方法、容器、又はキットでは、前記第一のプライマーのテール領域は、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０、４０、５０、又は６０以下のヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、本明細書において提供される、第二のプライマーを含む方法、容器、又はキットでは、前記第二のプライマーのテール領域は、少なくとも４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、本明細書において提供される、第二のプライマーを含む方法、容器、又はキットでは、前記第二のプライマーのテール領域は、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０、４０、５０、又は６０以下のヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、本明細書において提供される、第一のプライマーを含む方法、容器、又はキットでは、前記第一のプライマーのテンプレート結合領域は、少なくとも４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、本明細書において提供される、第一のプライマーを含む方法、容器、又はキットでは、前記第一のプライマーのテンプレート結合領域は、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０、４０、５０、又は６０以下のヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、本明細書において提供される、第一のプライマーを含む方法、容器、又はキットでは、前記第一のプライマーのテンプレート結合領域は、少なくとも４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、本明細書において提供される、第一のプライマーを含む方法、容器、又はキットでは、前記第一のプライマーのテンプレート結合領域は、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０、４０、５０、又は６０以下のヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、本明細書において提供される方法及び組成物では、ＲＮＡ分子が前記テンプレート分子又は一次核酸であり、前記テンプレートの増幅は、前記ＲＮＡ分子に対応するＤＮＡ鎖のコピーの生成を言及する。
いくつかの実施形態では、本明細書において提供される方法は、前記方法を含む検定からの蛍光信号を測定することを含む。
いくつかの実施形態では、核酸リガーゼが、本明細書において提供される方法又は組成物により含まれ得る。いくつかの実施形態では、核酸テンプレートは、リガーゼが、本明細書において提供される方法のための反応混合物に含まれる場合に、本明細書において提供される方法により、核酸リガーゼが前記反応に含まれない場合に比べて、より迅速に増幅されることができる。実施形態では、本明細書において提供される、反応混合物、容器、又はキットは、リガーゼ活性を有する酵素を含み得る。
実施形態では、本明細書において提供されるものは、サンプル中の病原体について検定するための方法であり、この方法は、本明細書において提供される病原体からの核酸を増幅する方法を遂行することを含む。実施形態では、本明細書において提供される組成物又は方法において用いられる前記標的の核酸は、病原体からの核酸であり得る。実施形態では、本明細書において提供される方法において使用される前記第一の及び第二のプライマーのそれぞれは、前記病原体の核酸の配列に対して相補的な領域を含むか、又は前記病原体の核酸の配列に相補的な配列に相補的な配列を含み得る。実施形態では、前記病原体の核酸は、ＤＮＡ又はＲＮＡであり得る。病原体は、限定なしで、ウイルス、微生物、真菌、及び原生生物を含む。サンプルは被験者からのものであることができ、及び本明細書の他の部分に記載されるサンプル特性のいかなるものも有し得る。
実施形態では、本明細書において提供される核酸の増幅のための方法は、ヒト又は動物の身体の外部かでの診断的な方法のために用いられ得る。例えば、サンプルは、ヒト又は動物から得られることができ、及び前記サンプルは、本明細書において提供される核酸の増幅方法により、標的の目的の核酸のために検定され得る。
実施形態では、本明細書において提供される方法は以下のものを含み得る：ａ）本明細書において提供される方法を遂行するための１つ以上の試薬を反応混合物中に提供すること、（例えば、１つ以上の第一のプライマー、第二のプライマー、核酸テンプレート、核酸ポリメラーゼ、ヌクレオチド、緩衝液、水等）、及びｂ）前記反応混合物を実質的な等温にインキュベートすることであって、この反応混合物の温度は、インキュベーションの間に、中心温度から、摂氏２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、又は１度を超えるか、又は下回ることがないこと。実施形態では、中心の温度は、例えば、摂氏３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、又は８０度であり得る。
実施形態では、本明細書において提供される方法は、実質的に等温度で遂行され得る。実施形態では、実質的に等温度であることは、摂氏３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、又は８０度から、プラス又はマイナス摂氏２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、又は１度であり得る。
実施形態では、本明細書において提供される方法のいずれも、摂氏９０、８５、８０、７５、７０、６５、６０、５５、５０、４５、４０、３５、３０、又は２５度を超えるものではない１つ以上の温度において遂行され得る。
実施形態では、本明細書において提供される方法は、熱サイクリングなしで遂行されることができ／反応混合物は熱サイクリングのない条件下でインキュベートすることができる（即ち、例えばＰＣＲに基づく方法において用いられるように、鎖を分離するか、又はプライマーのハイブリダイゼーションを可能にするためにインキュベーション温度の上昇及び下降のサイクルを用いずに）。
第一の領域を含む第一のプライマー及び第一の領域を含む第二のプライマーを含む、本明細書において提供される組成物及び方法では、前記第一のプライマーの第一の領域が、前記第二のプライマーの第一の領域に相補的であり、実施形態では、前記第一のプライマーの第一の領域、及び前記第二のプライマーの第一の領域で、ワトソン・クリック（Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ）の塩基対の法則に従う、前記第一のプライマーの第一の領域の、前記第二のプライマーの第一の領域に対するアニーリングにより、生成される二本鎖の構造のヌクレオチド配列は、制限酵素の認識配列を形成しない。
本明細書において提供される、核酸ポリメラーゼを含む、組成物及び方法では、実施形態では、前記核酸ポリメラーゼは、３’から５’へのエクソヌクレアーゼ活性を有する。
実施形態では、本明細書において提供されるものは、標的の核酸鎖を増幅するための方法であり、この方法は以下を含む：標的の核酸鎖、第一のプライマー、及び第二のプライマーを含む反応混合物を、実質的に等温条件下でインキュベートすることであって：前記標的の核酸鎖は第一の部分及び第二の部分を含み；前記第一のプライマーは第一の領域及び第二の領域を含み、前記第一の領域は前記プライマーの５’末端を含み、前記第二の領域は前記プライマーの３’末端を含み、及び前記第二の領域は、前記核酸鎖の第一の部分に相補的であり；前記第二のプライマーは第一の領域及び第二の領域を含み、前記第一の領域は前記プライマーの５’末端を含み、前記第二の領域は前記プライマーの３’末端を含み、及び前記第二の領域は、前記核酸鎖の第二の部分に相補的な配列に相補的であり；前記第一のプライマーの第一の領域は、前記非熱サイクリングの第二のプライマーの第一の領域に相補的であり；及び前記標的の核酸鎖が増幅される。随意的に、前記標的の核酸鎖は更に第三の部分を含み、この第三の部分は、前記標的の核酸鎖中で前記第一の部分及び前記第二の部分の間に位置し、及び前記第二のプライマーの第一の領域は、前記標的の核酸鎖の第三の部分に相補的である。
実施形態では、本明細書において提供される方法のいずれかにおいて、ポリヌクレオチドテンプレート、標的の核酸鎖等は、内部モチーフを含むことができ本明細書において提供される前記標的の核酸鎖を増幅するためのプライマーのテール領域は、この内部モチーフに相補的である。
実施形態では、本明細書において提供される方法は、本明細書において提供される反応混合物に、ペプチド核酸（ＰＮＡ）プローブ、及びＤＮＡ−ＰＮＡハイブリッドに結合する染料を加えることを更に含み、このＰＮＡプローブは、反応混合物中の増幅のための標的核酸、又はその相補体に相補的である。
実施形態では、本明細書において提供される反応混合物は、鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼを有し得る。
本明細書において、核酸が“増幅される”等と記載される場合、この核酸は、“コピーされる”等とも表現され得る。
実施形態では、本明細書で、プライマーが、第一の領域及び第二の領域を有すると記載される場合、前記第一の領域は前記プライマーの５’末端を含むことができ、及び前記第二の領域は前記プライマーの３’末端を含み得る。
実施形態では、本明細書で、プライマーが、テール領域及びテンプレート結合領域有すると記載される場合、前記第一の領域は前記プライマーの５’末端を含むことができ、及び前記第二の領域は前記プライマーの３’末端を含み得る。
実施形態では、本明細書において提供されるものは、ポリヌクレオチドテンプレートを増幅するための方法であり、この方法は以下を含む：ポリヌクレオチドテンプレート、第一のプライマー、及び第二のプライマーを含む反応混合物を、熱サイクリングのない条件下でインキュベートすることであって：前記ポリヌクレオチドテンプレートは第一の部分及び第二の部分を含み；前記第一のプライマーは第一の領域及び第二の領域を含み、前記第一の領域は前記プライマーの５’末端を含み、前記第二の領域は前記プライマーの３’末端を含み、及び前記第二の領域は、前記ポリヌクレオチドテンプレートの第一の部分に相補的であり；前記第二のプライマーは第一の領域及び第二の領域を含み、前記第一の領域は前記プライマーの５’末端を含み、前記第二の領域は前記プライマーの３’末端を含み、及び前記第二の領域は、前記ポリヌクレオチドテンプレートの第二の部分に相補的な配列に相補的であり；前記第一のプライマーの第一の領域は、前記第二のプライマーの第一の領域に相補的であり；及び前記ポリヌクレオチドテンプレートの複数のコピーが増幅される。随意的に、前記ポリヌクレオチドテンプレートは更に第三の部分を含み、この第三の部分は、前記標的の核酸鎖中で前記第一の部分及び前記第二の部分の間に位置し、及び前記第二のプライマーの第一の領域は、前記標的の核酸鎖の第三の部分に相補的である。
実施形態では、本明細書において提供されるものは、ポリヌクレオチドテンプレートを増幅するための方法であり、この方法は以下を含む：ポリヌクレオチドテンプレートを、第一のプライマー、及び第二のプライマーを含む反応混合物の中でインキュベートすることであって：前記ポリヌクレオチドテンプレートは、第一の部分、第二の部分及び第三の部分を含み、この第三の部分は、前記ポリヌクレオチドテンプレート中で、前記第一の部分及び前記第二の部分の間に位置し；前記第一のプライマーは第一の領域及び第二の領域を含み、前記第一のプライマーの第二の領域は前記ポリヌクレオチドテンプレートの第一の部分に相補的であり；及び前記第二のプライマーは第一の領域及び第二の領域を含み、前記第二のプライマーの第二の領域は、前記ポリヌクレオチドテンプレートの第二の部分に相補的な配列に相補的であり、前記第二のプライマーの第一の領域は、前記第一のプライマーの第一の領域に相補的であり、及び前記第二のプライマーの第一の領域は、前記ポリヌクレオチドテンプレートの第三の部分に相補的である。
実施形態では、本明細書において提供されるものは、ポリヌクレオチドテンプレート中のヌクレオチド配列中の目的の位置のヌクレオチドの同定を評価するための方法であり、この方法は以下を含む：Ａ）前記ポリヌクレオチドテンプレートのコピーを、少なくとも第一の反応混合物及び第二の反応混合物のそれぞれに提供することであって：前記ポリヌクレオチドテンプレートは、第一の部分、第二の部分及び第三の部分を含み、この第三の部分は、前記ポリヌクレオチドテンプレート中で、前記第一の部分及び前記第二の部分の間に位置し、及び目的の部分は第三の部分にあり；前記第一の反応混合物は、前記ポリヌクレオチドテンプレートのコピー、第一のプライマー、及び第二のプライマーを含み：前記第一のプライマーは第一の領域及び第二の領域を含み、前記第一の領域は前記プライマーの５’末端を含み、前記第二の領域は、前記プライマーの３’末端を含み、及び前記第二の領域は、前記ポリヌクレオチドテンプレートの第一の部分に相補的であり；前記第二のプライマーは第一の領域及び第二の領域を含み、前記第一の領域は前記プライマーの５’末端を含み、前記第二の領域は前記プライマーの３’末端を含み、及び前記第二の領域は、前記ポリヌクレオチドテンプレートの第二の部分に相補的である配列に相補的であり；前記第一のプライマーの第一の領域は、前記第二のプライマーの第一の領域に相補的であり；及び前記第二のプライマーの第一の領域は、前記ポリヌクレオチドテンプレートの第三の部分に相補的であり；前記第二の反応混合物は、前記ポリヌクレオチドテンプレートのコピー、第三のプライマー、及び第四のプライマーを含み：前記第三のプライマーは第一の領域及び第二の領域を含み、前記第一の領域は前記プライマーの５’末端を含み、前記第二の領域は前記プライマーの３’末端を含み、及び前記第二の領域は前記ポリヌクレオチドテンプレートの第一の部分に相補的であり；前記第四のプライマーは第一の領域及び第二の領域を含み、前記第一の領域は前記プライマーの５’末端を含み、前記第二の領域は前記プライマーの３’末端を含み、及び前記第二の領域は前記ポリヌクレオチドテンプレートの第二の部分に相補的である配列に相補的であり；前記第三のプライマーの第一の領域は、前記第四のプライマーの第一の領域に相補的であり；及び前記第四のプライマー第一の領域は、前記ポリヌクレオチドテンプレートの第三の部分に相補的であり；及び前記第二のプライマーの第一の領域のヌクレオチド配列は、前記第四のプライマーの第一の領域のヌクレオチド配列とは、単一のヌクレオチドにおいてのみ異なり、第二の及び第四のプライマーでの、異なるヌクレオチドの位置は、もし、前記第二のプライマー又は第四プライマーの第一の領域のヌクレオチド配列が、ポリヌクレオチドテンプレートの第三の部分のヌクレオチド配列に対して、配列における最大の相補性のために配向された場合には、前記ポリヌクレオチドテンプレート内での目的のヌクレオチドの位置に対応し、Ｂ）前記第一の反応混合物、及び第二の反応混合物を、熱サイクリングのない条件下でインキュベートすること；及びＣ）前記第一の反応混合物中での前記ポリヌクレオチドテンプレートの増幅の速度又は量を、前記第二の反応混合物中の前記ポリヌクレオチドテンプレートの増幅の速度又は量に比較することであって、前記ポリヌクレオチドテンプレートの増幅の速度又は量は、第二又は第四プライマーの第一の領域及び前記ポリヌクレオチドテンプレートの第三の部分のヌクレオチド配列との間の相補性の程度を示す。
随意的に、本明細書において提供されるポリヌクレオチドテンプレートを含む実施形態では、前記ポリヌクレオチドテンプレートはＤＮＡ鎖である。
随意的に、本明細書において提供されるポリヌクレオチドテンプレートを含む実施形態では、前記ポリヌクレオチドテンプレートはＲＮＡ鎖である。
随意的に、本明細書において提供されるポリヌクレオチドテンプレートを含む実施形態では、前記ポリヌクレオチドテンプレートは、二本鎖核酸分子の一本の鎖である。実施形態では、この二本鎖核酸分子二本鎖ＤＮＡ分子又は二本鎖ＲＮＡ分子である。
随意的に、本明細書において提供される、反応混合物、容器、又はキット実施形態では、前記反応混合物、容器、又はキットは、鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼを含む。
随意的に、本明細書において提供される、反応混合物、容器、又はキット実施形態では、前記反応混合物、容器、又はキットは、逆転写酵素を含む。
随意的に、本明細書において提供される、反応混合物、容器、又はキット実施形態では、前記反応混合物、容器、又はキットは、核酸染料、 ヌクレオチド、又は緩衝液を含む。
随意的に、本明細書において提供される、第一の部分、第二の部分、及び第三の部分を含むポリヌクレオチドテンプレートを含む実施形態では、前記ポリヌクレオチドテンプレート３’から５’の方向において：１Ｐ−１Ｓ−３Ｐ−２Ｓ−２Ｐの要素の一般的構造を有することができ、“１Ｐ”は第一の部分、“１Ｓ”は第一のスペース、“３Ｐ”は前記第三の部分、“２Ｓ”は第二のスペース、及び“２Ｐ”は第二の部分である。前記“第一のスペース”及び“第二のスペース”は、前記第一の部分、第二の部分、又は第三の部分の一部ではないヌクレオチドを含む、前記ポリヌクレオチドテンプレートの部分である。実施形態では、前記第一の部分は、例えば６〜３０ヌクレオチド、又は本明細書の他の場所に記載される任意の他の数のヌクレオチドを有し得る。実施形態では、前記第一のスペースは、例えば２〜３０ヌクレオチド、又は本明細書の他の場所に記載される任意の他の数のヌクレオチドを有し得る。実施形態では、前記第三の部分は、例えば４〜１４ヌクレオチド、又は本明細書の他の場所に記載される任意の他の数のヌクレオチドを有し得る。実施形態では、前記第一のスペースは、例えば２〜３０ヌクレオチド又は本明細書の他の場所に記載される任意の他の数のヌクレオチドを有し得る。実施形態では、前記第一の部分は、例えば６〜３０ヌクレオチド又は本明細書の他の場所に記載される任意の他の数のヌクレオチドを有し得る。
実施形態では、本明細書において提供される、反応混合物中でポリヌクレオチドテンプレートをインキュベートすることを含む、方法では、前記ポリヌクレオチドテンプレートの少なくとも２、３、４、５、又は１０コピーを含むコンカテマー鎖が、この反応混合物のインキュベーションの間に生成され得る。
実施形態では、本明細書において提供されるものは、二本鎖の核酸分子を増幅するための方法であり、この方法は以下を含む：二本鎖の核酸分子を、第一のプライマー、及び第二のプライマーを含む反応混合物の中でインキュベートすることであって：前記二本鎖の核酸分子は、第一の鎖、第二の鎖を含み、前記第一の鎖は第一の部分及び第三の部分を含み、及び前記第二の鎖は第二の部分を含み；前記第一のプライマーは第一の領域及び第二の領域を含み、前記第一のプライマーの第二の領域は、前記第一の鎖の第一の部分に相補的であり；及び前記第二のプライマーは第一の領域及び第二の領域を含み、前記第二のプライマーの第二の領域は、前記第二の鎖の第二の部分に相補的であり、前記第二のプライマーの第一の領域は、前記第一の鎖の第三の部分に相補的であり、及び前記第二のプライマーの第一の領域は、第一のプライマーの第一の領域に相補的である。
実施形態では、本明細書において提供されるものは、以下を含む反応混合物である：ポリヌクレオチドテンプレート、ポリヌクレオチドテンプレートを、第一のプライマー、及び第二のプライマーであって：前記ポリヌクレオチドテンプレートは、第一の部分、第二の部分及び第三の部分を含み、この第三の部分は、前記ポリヌクレオチドテンプレート中で、前記第一の部分及び前記第二の部分の間に位置し；前記第一のプライマーは第一の領域及び第二の領域を含み、前記第一の領域は前記プライマーの５’末端を含み、前記第二の領域は前記プライマーの３’末端を含み、及び前記第二の領域は、前記ポリヌクレオチドテンプレートの第一の部分に相補的であり；前記第二のプライマーは第一の領域及び第二の領域を含み、前記第一の領域は前記プライマーの５’末端を含み、前記第二の領域は前記プライマーの３’末端を含み、及び前記第二の領域は、前記ポリヌクレオチドテンプレートの第二の部分に相補的な配列に相補的であり；前記第一のプライマーの第一の領域は、前記第二のプライマーの第一の領域に相補的であり；及び前記第二のプライマーの第一の領域は前記ポリヌクレオチドテンプレートの第三の部分に相補的である。
実施形態では、本明細書において提供されるものは、ポリヌクレオチドテンプレートの増幅のためのキットであり、このは以下を含む：第一のプライマー及び第二のプライマーであって：前記第一のプライマーは第一の領域及び第二の領域を含み、前記第一の領域は前記プライマーの５’末端を含み、前記第二の領域は前記プライマーの３’末端を含み、及び前記第二の領域は、前記ポリヌクレオチドテンプレートの第一の部分に相補的であり；前記第二のプライマーは第一の領域及び第二の領域を含み、前記第一の領域は前記プライマーの５’末端を含み、前記第二の領域は前記プライマーの３’末端を含み、及び前記第二の領域は、前記ポリヌクレオチドテンプレートの第二の部分に相補的である配列に相補的であり；前記第一のプライマーの第一の領域は、前記第二のプライマーの第一の領域に相補的であり；及び前記第二のプライマーの第一の領域は前記ポリヌクレオチドテンプレートの第三の部分に相補的であ、前記第三の部分は前記ポリヌクレオチドテンプレートの中で前記第一の部分及び前記第二の部分の間に位置する。
随意的に、本明細書において提供されるキットを含む実施形態では、このキットの構成要素は、少なくとも２つの別個の流体的に分離された容器の間で分配される。
実施形態では、本明細書において提供されるものは、２つ以上の流体的に分離された容器を含むキットであり、この容器は、集合的に：第一のプライマー、第二のプライマー、第三のプライマー、及び第四プライマを含み：前記第一のプライマーは第一の領域及び第二の領域を含み、前記第一の領域は前記プライマーの５’末端を含み、前記第二の領域は前記プライマーの３’末端を含み、及び前記第二の領域は、ポリヌクレオチドテンプレートの第一の部分に相補的であり；前記第二のプライマーは第一の領域及び第二の領域を含み、前記第一の領域は前記プライマーの５’末端を含み、前記第二の領域は前記プライマーの３’末端を含み、及び前記第二の領域は、前記ポリヌクレオチドテンプレートの第二の部分に相補的である配列に相補的であり；前記第三のプライマーは第一の領域及び第二の領域を含み、前記第一の領域は前記プライマーの５’末端を含み、前記第二の領域は前記プライマーの３’末端を含み、及び前記第二の領域は、前記ポリヌクレオチドテンプレートの第一の部分に相補的であり；前記第四のプライマーは第一の領域及び第二の領域を含み、前記第一の領域は前記プライマーの５’末端を含み、前記第二の領域は前記プライマーの３’末端を含み、及び前記第二の領域は、前記ポリヌクレオチドテンプレートの第二の部分に相補的である配列に相補的であり；前記第一のプライマーは、前記第二のプライマーの第一の領域に相補的であり；前記第三のプライマーの第一の領域は、前記第四のプライマーの第一の領域に相補的であり；及び前記第一のプライマーの第一の領域のヌクレオチド配列は、前記第三のプライマーの第一の領域のヌクレオチド配列とは、単一のヌクレオチド分だけ異なる。随意的に、前記第二のプライマーの第一の領域、及び前記第四のプライマーの第一の領域の両方ともが、前記ポリヌクレオチドテンプレートの第三の部分に相補的であり、前記第三の部分は前記ポリヌクレオチドテンプレートの中で前記第一の部分及び前記第二の部分の間に位置する。随意的に、前記記第一のプライマー、第二のプライマー、第三のプライマー、及び第四プライマーのそれぞれの第二の領域は、長さにおいて６〜３０ヌクレオチドである。随意的に、前記第一のプライマー、第二のプライマー、第三のプライマー、及び第四プライマーのそれぞれの第二の領域は、長さにおいて６〜３０ヌクレオチドである。
本明細書において提供される、キットを含む実施形態では、このキットは、前記キットの試薬により検出されるべきポリヌクレオチドテンプレートのヌクレオチド配列を含む対照核酸鎖を含み得る。
本明細書において提供される方法及び組成物では、随意的に、ＰＮＡプローブ及び染料ＤｉＳｃ２（５）が含まれ得る。このＰＮＡプローブは、関連する反応、及びそのコピーでの増幅のための標的配列に特にアニールすることができ、ＤＮＡ−ＰＮＡ二本鎖が形成される。本明細書において提供される方法は、染料ＤｉＳｃ２（５）のＤＮＡ−ＰＮＡ二本鎖への結合の際の、染料ＤｉＳｃ２（５）の色の変化を検出することを含み得る。実施形態では、ＰＮＡプローブ及び染料が、本明細書において提供される反応混合物に、反応の開始後、又は完了後に加えられることができる。実施形態では、ＰＮＡプローブ及び染料は、本明細書において提供される反応混合物に、反応の開始後、少なくとも５、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０又は１００分で加えられることができる。実施形態では、ＰＮＡプローブ及び染料は、本明細書において提供される反応混合物に、反応の開始後、５、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０又は１００分以下で加えられることができる。
ポリヌクレオチドテンプレート又は核酸テンプレートのコピーの生成又は増幅に対する言及は、文脈が他のものを明確に指示しない限り、前記ポリヌクレオチドテンプレート／核酸テンプレートの配列を含むコピーを生成することと同時に、前記ポリヌクレオチドテンプレート／核酸テンプレートの類似する配列を含むコピーを生成することを含む。例えば、もしポリヌクレオチドテンプレートがＲＮＡである場合、テンプレートのコピーを生成することは、前記ポリヌクレオチドテンプレートのＲＮＡ配列のＤＮＡバージョンを含むＤＮＡ分子を含むコピーを生成することとを含む（即ち、このＤＮＡ配列は、“Ｕ”の替わりに“Ｔ”を含む）。
いくつかの実施形態では、本明細書において提供される方法又はは、標的核酸中での目的の特定のヌクレオチドの有無を検出するために用いられることができる（例えば、変異又はＳＮＰの場合における）。例えば標的核酸中の、目的のヌクレオチドを含むか、又はそれに隣接する領域に選択的に結合する第一の又は第二のプライマーを選択できる。これらのプライマーは：ｉ）その領域が目的のヌクレオチドを含む場合に、その領域に結合するか、又はｉｉ）その領域が目的のヌクレオチドを含む場合に、その領域に結合しないかのいずれかのために、選択的に設計され得る。本明細書に記載される方法は、選択されたプライマーにより遂行されることができ、及び増幅反応の結果は、前記標的核酸中の目的のヌクレオチドの有無に関する情報を提供し得る。例えば、第一のプライマーのテンプレート結合領域が、特定の目的のヌクレオチド（例えば、変異又はＳＮＰ）を含む、標的核酸中の配列に相補的なヌクレオチド配列を持つように設計される場合、サンプルからの、前記標的核酸の、選択されたプライマーによる増幅の成功は、前記サンプルが、特定の目的のヌクレオチドを有する標的核酸を含むことを示し得る。いくつかの実施形態では、標的核酸中の目的のヌクレオチドの分析に用いられるプライマーは、重要なヌクレオチド（即ち、前記標的核酸中の目的のヌクレオチドの位置と同じ位置に対応するヌクレオチド）を、このプライマーの３’末端に含み得る。そのような場合には、このプライマーの３’末端ヌクレオチドのアニーリングは、前記標的核酸中での目的のヌクレオチドの存在に依存し得る。もし、このプライマーの３’末端ヌクレオチドが、前記標的核酸中のヌクレオチドにアニールしない場合（例えば、ヌクレオチド間の不一致に起因して）、この不一致は、核酸ポリメラーゼが、このプライマーから伸長生成物を合成することを大幅に損なう。従って、いくつかの実施形態では、目的のヌクレオチドに対応する、３’末端ヌクレオチドを有するプライマーは、標的核酸中の特定のヌクレオチドの有無を決定するために有用である。そのような実施形態では、ある場合には、前記プライマーの３’末端における重要なヌクレオチドは、前記標的核酸中の目的のヌクレオチドに相補的であるように選択されることができ、及びほかの場合には、前記プライマーの３’末端におけるヌクレオチドは、前記標的核酸中の目的のヌクレオチドに非相補的であるように選択されることができる。前記目的のヌクレオチドは、例えば、標的の核酸の野生型、変異型、又は多型を表現する。
他の実施形態では、特定の標的核酸中の目的のヌクレオチド（例えば、変異又はＳＮＰ）は、第一の又は第二のプライマーのテンプレート結合領域に相補的ではない領域中の標的核酸中に、目的のヌクレオチドが存在するように、プライマーを選択することによって検出され得る。例えば、この目的のヌクレオチドは、標的核酸配列のほぼ中央にあり得る。実施形態では、前記目的のヌクレオチドは、本明細書のほかの場所に記載される“内部モチーフ”中にあることができる。目的のヌクレオチドが内部モチーフ中にある場合、実施形態では、プライマーペアーは、内部モチーフ又はその相補体に相補的であり、及び前記標的配列中の内部モチーフ中の前記目的のヌクレオチドの有無の検定のために用い得る、それらのプライマーのテール領域中に、ヌクレオチド配列を含むように調製されることができる。本明細書のほかの場所で説明されるように、プライマーのテール領域のヌクレオチド配列の、そのプライマーの伸長生成物中の内部モチーフへの一時的なアニーリングは、本明細書において提供される反応の速度を増大させ得る。ある状況では、前記プライマーのテール領域のヌクレオチド配列の、そのプライマーの伸長生成物中の内部モチーフに対する親和性が大きいほど、その反応は、より早く起こり得る。更に、典型的には、前記プライマーの伸長生成物中の内部モチーフ中のヌクレオチドに結合し得る、前記プライマーのテール領域中のヌクレオチド配列中のヌクレオチドの数が大きいほど、伸長生成物中の前記内部モチーフについての伸長生成物のテール領域中のヌクレオチド配列に対する親和性が高くなる。従って、及び本明細書において提供される組成物及び方法により、実施形態では、標的配列中の目的のヌクレオチドの有無は、標的配列又はその相補体中の前記内部モチーフに結合でき、及び前記テール領域中では、前記内部モチーフ又はその相補体中の特定の目的のヌクレオチドに特異的に結合するヌクレオチドを有するか、又は有さない、前記プライマーのテール領域中のヌクレオチド配列を有するプライマーの使用を介して決定され得る。典型的には、前記プライマーのテール領域中のヌクレオチド配列が、前記標的中の目的のヌクレオチドに対応する、そのプライマーの伸長生成物中のヌクレオチドに相補的であるヌクレオチドを含む場合に、前記プライマーのテール領域中の、関連するヌクレオチドが、前記標的中の目的のヌクレオチドに対応する、そのプライマーの伸長生成物中のヌクレオチドに相補性ではない場合よりも、反応はより早く生じる。例えば、標的核酸鎖の野生型の内部モチーフは、ヌクレオチド配列：５’ＴＡＴＴＧＣＡＴ３’を有し得る。しかしながら、配列中の“Ｇ”は、集団中の多くの個体で、前記配列中で、“Ａ”に変異する。特定の標的核酸が“Ｇ”又は他のヌクレオチドを配列中に有するかを決定するために、そのテール領域中に配列：５’ＡＴＧＣＡＡＴＡ３’のヌクレオチド配列を含むプライマーが調製され得る。もし、このプライマー（及び適切な第二のプライマー）が、本明細書において提供される方法に従う、標的核酸の増幅に用いられる場合、前記内部モチーフ中に“Ｇ”が存在する場合には増幅反応は、前記内部モチーフ“Ｇ”の部分に異なるヌクレオチドが存在する場合に比較して、特定の反応速度を有することができる。この理由は、前記プライマーのテール領域中のヌクレオチド配列で、前記内部モチーフ中に“Ｇ”が存在する場合には、前記内部モチーフに対して完全に相補性であるが、Ｇの正常な位置に“Ｇ”以外のヌクレオチドが存在する場合には、そうはならないためである。一般的に、この実施例においては、もし“Ｇ”が前記内部モチーフ中に存在する場合、前記プライマーのテール領域は、前記内部モチーフに対して、“Ｇ”が存在しない場合に比べて、より高い頻度でアニールし、及びこのことは、回り回って“Ｇ”が存在する場合に、存在しない場合よりも、より速い反応を導く。本明細書において提供されるシステム及び方法では、プライマーは、目的のヌクレオチドの有無のいずれかを検定するために調製され得る（例えば、プライマーは、もし変異型のヌクレオチドが存在する場合に、野生型のヌクレオチドが存在するよりも、反応が、より迅速に生じることができるように調製され得るか、又はその逆も可能である）。更に、実施形態では、プライマーは、標的中の内部モチーフ中の目的の位置の未知のヌクレオチドの識別を決定できるように調製され得る。例えば、標的核酸中の目的のヌクレオチドに対して適切な対応をするＡ、Ｔ、Ｇ、又はＣのいずれかのそれぞれを含む４つの異なるプライマーペアーが形成され得る。実施形態では、最も反応結果を生じる、プライマーペアーが、標的核酸中の内部モチーフ中の目的の部分中にどのヌクレオチドが存在するかを示し得る。例えば、標的核酸は、５’から３’の方向において：ＧＴＡＡＣＧＡＧの配列を通常は有する内部モチーフを有し得る。しかしながら、標的核酸の異なるバリアントは、前記内部モチーフ中の５番目の位置（即ち、“Ｃ”の位置）に、異なったヌクレオチドを有し得る。この実施例を続けるが、もし前記内部モチーフの５番目の位置にどのヌクレオチドが存在する不明である、標的核酸を含むサンプルが提供された場合、そのサンプルは少なくとも４つの部分に分割され、及びその４つの部分は第一の反応混合物、第二の反応混合物、第三の反応混合物、及び第四の反応混合物として用いられることができる。５’から３’の方向において、それぞれ：ＣＴＣＧＴＴＡＣ及びＧＴＡＡＣＧＡＧの配列を持ったテール領域を有するプライマーである、第一のプライマーペアーが前記第一の反応混合物に提供される。これらのテール領域は、もし“Ｃ”が、内部モチーフの５番目の位置に存在する場合には、前記内部モチーフ又はその相補体に完全に相補性である。従って、もし前記標的が、この反応混合物中で、最も速く増幅される場合には、そのことは前記標的中の内部モチーフ中の目的のヌクレオチドの位置に“Ｃ”が存在することを示す。５’から３’の方向において、それぞれ：ＣＴＣＡＴＴＡＣ及びＧＴＡＡＴＧＡＧの配列を持ったテール領域を有するプライマーである第二のプライマーペアーが、前記第二の反応混合物に提供される。これらのテール領域は、もし“Ｔ”が内部モチーフの５番目の位置に存在する場合には、前記内部モチーフ又はその相補体に完全に相補性である。従って、もし前記標的が、この反応混合物中で、最も速く増幅される場合には、そのことは前記標的中の内部モチーフ中の目的のヌクレオチドの位置に“Ｔ”が存在することを示す。５’から３’の方向においてそれぞれ：ＣＴＣＣＴＴＡＣ及びＧＴＡＡＧＧＡＧの配列を持つテール領域を有するプライマーである、第三のプライマーペアーが前記第三の反応混合物に提供される。これらのテール領域は、もし“Ｇ”が、内部モチーフの５番目の位置に存在する場合には、前記内部モチーフ又はその相補体に完全に相補性である。従って、もし前記標的が、この反応混合物中で、最も速く増幅される場合には、そのことは前記標的中の内部モチーフ中の目的のヌクレオチドの位置に“Ｇ”が存在することを示す。５’から３’の方向においてそれぞれ：ＣＴＣＴＴＴＡＣ及びＧＴＡＡＡＧＡＧの配列を持ったテール領域を有するプライマーである第四のプライマーペアーが、前記第四の反応混合物に提供される。これらのテール領域は、もし“Ａ”が、内部モチーフの５番目の位置に存在する場合には、前記内部モチーフ又はその相補体に完全に相補性である。従って、もし前記標的が、この反応混合物中で、最も速く増幅される場合には、そのことは前記標的中の内部モチーフ中の目的のヌクレオチドの位置に“Ａ”が存在することを示す。実施形態では、上記に一般的に記載された方法又は組成物は、随意的には、例えば、全ての可能なヌクレオチド変異体をスクリーンすることが望まれていない場合（例えば、目的の位置に、典型的には２つの異なるヌクレオチドが見出される場合）には、目的の位置におけるヌクレオチドに対して、２又は３つだけの選択肢に対応するプライマーペアーを持つ、２又は３つだけの反応混合物を持つように調製されることができる。
実施形態では、標的核酸を含むサンプルは、少なくとも第一の及び第二の部分に分割されることができ、本明細書において提供される方法に従い、前記第一の部分が、第一のプライマーペアーを持つ第一の反応混合物中でインキュベートされ、及び前記第二の部分が、第二のプライマーペアーを持つ第二の反応混合物中でインキュベートされる。実施形態では、前記第一のプライマーペアー及び前記第二のプライマーペアーは、それぞれのプライマーのテール／第一の領域において単一のヌクレオチドの分だけ互いに異なる（例えば、前記第一のペアーの第一のプライマーの第一の領域の配列は、前記第二のペアーの第一のプライマーの第一の領域の配列とは、単一のヌクレオチド分だけ異なる）。前記プライマーのテール領域において異なる、この単一のヌクレオチドは、標的核酸中の目的のヌクレオチドの位置に対応し得る。前記第一の反応混合物中の標的核酸の増幅の量又は速度を、前記第二の反応混合物中のものと比較することにより、標的核酸中の目的のヌクレオチドの身元が決定され得る。実施形態では、上記で概観した方法は、サンプルの第一の、第二の、第三の、及び第四の部分、並びに第一のプライマーペアー、第二のプライマーペアー、第三のプライマーペアー、及び第四のプライマーペアーにより遂行されることができ、前記第一のプライマーペアー、第二のプライマーペアー、第三のプライマーペアー、及び第四のプライマーペアーは、プライマーのそれぞれのテール／第一の領域において、上述したように単一のヌクレオチド分だけ異なる。
実施形態では、少なくとも第一の標的核酸及び第二の標的核酸が提供されることができ、前記第一の標的核酸及び前記第二の標的核酸は、本明細書の他の部分に記載されるように、内部モチーフの目的の位置における、単一のヌクレオチドにより異なる。実施形態では、本明細書において提供される方法に従い、前記第一の標的核酸は、本明細書に記載されるプライマーペアーを含む第一の反応混合物中でインキュベートされることができ、及び前記第二の標的核酸は、同じプライマーペアーを含む第二の反応混合物中でインキュベートされ得る。前記第一の反応混合物中の前記第一の標的核酸の増幅の速度又は量を、前記第二の反応混合物中の前記第二の標的核酸のもの、又は絶対的な値と比較することにより、本明細書の他の部分に記載される原理により、前記第一の標的核酸及び前記第二の標的核酸の１つ又は両方の中の目的のヌクレオチドの身元が決定され得る。
加えて、実施形態では、本明細書に記載される、単一の目的のヌクレオチドを決定するための組成物又は方法は、複数のヌクレオチド突然変異体又は多型を決定するためにも使用され得る。
実施例
以下の実施例は説明の目的のためにのみ提供され、いかなる方法でも本開示を制限することを意図しない。
実施例１−ＭＲＳＡ検出のためのプライマー
共通の二本鎖の核酸分子からの第一の遺伝学的要素（ｍｅｃＡ）及び第二の遺伝学的要素（黄色ブドウ球菌からのｏｒｆＸ）を増殖するための、第一の増幅反応において用いるためのプライマーが調製された。例示的な遺伝学的要素の分析の第一の増幅反応の第一のプライマーは、５’から３’の方向において、以下の配列を有する：ＧＡＡＣＣＡＡＣＧＣＡＴＧＡＣＣＣＡＡＧ（配列番号３）；ＴＴＧＡＡＣＣＡＡＣＧＣＡＴＧＡＣＣＣ（配列番号４）；ＣＡＧＡＣＧＡＡＡＡＡＧＣＡＣＣＡＧＡＡ（配列番号５）；ＧＣＡＣＣＡＧＡＡＡＡＴＡＴＧＡＧＣＧＡＣ（配列番号６）．例示的な遺伝学的要素の分析の第一の増幅反応の第二のプライマーは、５’から３’の方向において、以下の配列を有する：ＡＴＣＣＧＧＴＡＣＴＧＣＡＧＡＡＣＴＣＡ（配列番号７）；ＧＣＡＡＡＴＣＣＧＧＴＡＣＴＧＣＡＧＡＡ（配列番号８）；ＡＴＴＧＧＣＡＡＡＴＣＣＧＧＴＡＣＴＧＣ（配列番号９）；ＧＧＣＡＧＡＣＡＡＡＴＴＧＧＧＴＧＧＴＴ（配列番号１０）。例示的な遺伝学的要素の分析の第二の増幅反応の第一のプライマーは、５’から３’の方向において、以下の配列を有する：ＧＣＣＡＡＴＧＡＣＧＡＡＴＡＣＡＡＡＧＴＣ（配列番号１１）。例示的な遺伝学的要素の分析の第二の増幅反応の第二のプライマーは、５’から３’の方向において、以下の配列を有する：ＴＡＡＴＡＧＣＣＡＴＣＡＴＣＡＴＧＴＴＴＧＧ（配列番号１２）。
実施例２−野生型及び変異Ｃ型肝炎ＮＳ３遺伝子の増幅
９個の異なる反応混合物が調製された。それぞれの反応混合物は、同じ試薬及びプライマー濃度を含んだが、反応混合物は、プライマー及びテンプレートにおいて異なった。９個の反応混合物のうち、３個は、３個の異なるテンプレートのそれぞれに対して調製された：テンプレート１：野生型ＮＳ３[ヌクレオチド配列、５’から３’の方向において：ＧＧＡＡＣＧＡＧＧＡＣＣＡＴＣＧＣＡＴＣＡＣＣＣＡＡＧＧＧＴＣＣＴＧＴＴＡＴＣＣＡＧＡＴＧＴＡＴＡＣＣＡＡＴＧＴＡＧＡＣＣＡＡＧＡＣＣＴＣＧＴＧＧＧＣＴＧＧＣＣＣＧＣＴＣＣＴＣＡＡＧＧＴＧＣＣＣＧＣＴＣＡＴＴＧＡＣＡＣＣＣＴＧＣＡＣＣＴＧＣＧ（配列番号１３）]；テンプレート２：Ｑ８０Ｋ変異ＮＳ３[ヌクレオチド配列、５’から３’の方向において：ＧＧＡＡＣＧＡＧＧＡＣＣＡＴＣＧＣＡＴＣＡＣＣＣＡＡＧＧＧＴＣＣＴＧＴＴＡＴＣＣＡＧＡＴＧＴＡＴＡＣＣＡＡＴＧＴＡＧＡＣＡＡＡＧＡＣＣＴＣＧＴＧＧＧＣＴＧＧＣＣＣＧＣＴＣＣＴＣＡＡＧＧＴＧＣＣＣＧＣＴＣＡＴＴＧＡＣＡＣＣＣＴＧＣＡＣＣＴＧＣＧ（配列番号１４）]；テンプレート３：テンプレート対照なし。それぞれの異なるテンプレートに対して、３個の異なる反応混合物が調製され、それぞれの異なる反応混合物は、異なるプライマーペアーを有し：プライマーペアー１：第一のプライマー[ヌクレオチド配列、５’から３’の方向において：ＴＴＴＧＴＣＴＡＡＡＧＧＧＴＣＣＴＧＴＴＡＴＣＣ（配列番号１５）]、第二のプライマー[ヌクレオチド配列、５’から３’の方向において：ＴＡＧＡＣＡＡＡＣＡＧＣＣＣＡＣＧＡＧＧ（配列番号１６）]；プライマーペアー２：第一のプライマー[ヌクレオチド配列、５’から３’の方向において：ＴＴＴＧＴＣＴＡＧＴＴＡＴＣＣＡＧＡＴＧＴＡＴ（配列番号１７）]、第二のプライマー[ヌクレオチド配列、５’から３’の方向において：ＴＡＧＡＣＡＡＡＣＣＡＧＣＣＣＡＣＧＡＧＧＴＣ（配列番号１８）]；プライマーペアー３：第一のプライマー[ヌクレオチド配列、５’から３’の方向において：ＴＣＴＴＧＧＴＣＣＡＡＧＧＧＴＣＣＴＧＴＴＡＴＣ（配列番号１９）]、第二のプライマー[ヌクレオチド配列、５’から３’の方向において：ＧＡＣＣＡＡＧＡＡＧＧＧＴＧＴＣＡＡＴＧＡＧＣ（配列番号２０）]である。反応混合物のそれぞれは、以下の試薬を含んでいた：酢酸カリウム（５０ｍＭ）；酢酸マグネシウム（１０ｍＭ）；ＤＴＴ（１ｍＭ）；Ｔｗｅｅｎ−２０(R)（０．０８％）；Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．９（２０ｍＭ）；ベタイン（８００ｍＭ）；ｄＮＴＰ混合物（１．４ｍＭのそれぞれのｄＮＴＰ）；ＳｙｔｏＲｅｄ(R)（２ｕＭ）；ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ（０．８Ｕ／ｕｌ）；ＡＭＶ逆転写酵素（０．０１６Ｕ／ｕｌ）；それぞれの第一のプライマー及び第二のプライマー（それぞれ０．８ｕＭ）；及びそれぞれのテンプレート。前記テンプレート配列はプラスミド中に提供された。図３は、異なる増幅反応の結果を提供し、Ｙ軸は、異なる反応に対する屈曲時間（分）を示す。無テンプレート反応は、バックグラウンドの信号に起因する、最終的な屈曲時間を示す。Ｘ軸では、プライマーペアーに基づいて、反応が一緒にグループ化されている。左から右へ、プライマーペアー１を持つ反応の第一のグループ、次いでプライマーペアー２、次いでプライマーペアー３である。それぞれのプライマーペアーに対する３つのバーの、それぞれのグループ内で、これらのバーは左から右へ、以下のテンプレートに対するものである：野生型ＮＳ３；Ｑ８０Ｋ変異ＮＳ３；無テンプレート対照。図３に示されるように、野生型及びＱ８０Ｋ変異テンプレートは、配列を増幅するために用いられたプライマーペアーに依存して異なる屈曲時間を有する。
本明細書において本発明の好適な実施形態が示され及び記載されるが、当業者にとってはそのような実施形態は、例としてのみ提供されていることが明白であろう。本発明を逸脱することなく、当業者は膨大な変形、変更、及び置換を思いつくであろう。本明細書に記載される本発明の実施形態に対するさまざまな代替物が、本発明の実施に使用できることを理解されたい。例えば、そのような組み合わせが本明細書に記載されるか否かには関わらず、１つの実施形態の特徴は、別の実施形態の特徴と組み合わされることができる。本明細書において提供される発明が、本明細書において、便宜性の目的ために、限定された数の用語及び語句で記載されるが、本明細書において提供されていないが、本発明を正確に記載する用語又は語句を用いても記載され得るであろうことも理解されたい。
本明細書の記載、以下の特許請求範囲の全体を通して用いられるように、「ａ（１つ）」「ａｎ（１つ）」「ｔｈｅ（前記の）」は、文脈において明白に示さない限り、複数の意味を含むことを理解されたい。例えば、“ａｎ ａｓｓａｙ”は単一の検定又は複数の検定を指し得る。更に、本明細書の記載、以下の特許請求範囲の全体を通して用いられるように、「ｉｎ（〜の中に）」の意味は、文脈で明白に示されない限り、「ｉｎ（〜の中に）」、および「ｏｎ（〜の上に）」を含む。添付された所定の請求項に、「〜のための手段（ｍｅａｎｓ ｆｏｒ）」の語句を用いる制限が明確に言明されていない限り、添付された請求項は、手段プラス機能の限定を含むものとは解釈されない。本明細書の記載、以下の特許請求範囲の全体を通して用いられるように、第二の対象の“少なくとも一部分”を含むとして記載された、第一の対象は、第二の対象の全量／完全な第二の対象を含み得る。
本明細書の記載、以下の特許請求範囲の全体を通して用いられるように、用語“ｃｏｍｐｒｉｓｅ”、“ｉｎｃｌｕｄｅ”、及び“ｃｏｎｔａｉｎ”、並びに関係する時制は、包括的であり、及び制約が無く、及び追加的な、列挙されていない要素又は方法のステップを排除しない。更に、広げる言葉（ｂｒｏａｄｅｎｉｎｇ ｗｏｒｄ）及び“１つ以上の”、“少なくとも”、“限定はされないが”等の語句は、ある場合には、より狭いケースが意図されていると読まれるべきではなく、又はそのような広げる言葉がない例の中で、意図されるか若しくは要求されると読まれるべきではない。最後に、更に、本明細書の記載、および以下の特許請求の範囲の全体を通して用いられる、「ｏｒ（又は）」の意味は、文脈で明白に示されない限り、接続詞および離接的接続詞の両方を含む。従って、用語“ｏｒ（又は）”は文脈で明白に指示しない限り、“及び／又は”を含む。
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配列リスト
配列番号１：ＧＧＡＡＣＧＡＧＧＡＣＣＡＴＣＧＣＡＴＣＡＣＣＣＡＡＧＧＧＴＣＣＴＧＴＴＡＴＣＣＡＧＡＴＧＴＡＴＡＣＣＡＡＴＧＴＡＧＡＣ
配列番号２：ＣＧＣＡＧＧＴＧＣＡＧＧＧＴＧＴＣＡＡＴＧＡＧＣＧＧＧＣＡＣＣＴＴＧＡＧＧＡＧＣＧＧＧＣＣＡＧＣＣＣＡＣＧＡＧＧＴＣＴ
配列番号３：ＧＡＡＣＣＡＡＣＧＣＡＴＧＡＣＣＣＡＡＧ
配列番号４：ＴＴＧＡＡＣＣＡＡＣＧＣＡＴＧＡＣＣＣ
配列番号５：ＣＡＧＡＣＧＡＡＡＡＡＧＣＡＣＣＡＧＡＡ
配列番号６：ＧＣＡＣＣＡＧＡＡＡＡＴＡＴＧＡＧＣＧＡＣ
配列番号７：ＡＴＣＣＧＧＴＡＣＴＧＣＡＧＡＡＣＴＣＡ
配列番号８：ＧＣＡＡＡＴＣＣＧＧＴＡＣＴＧＣＡＧＡＡ
配列番号９：ＡＴＴＧＧＣＡＡＡＴＣＣＧＧＴＡＣＴＧＣ
配列番号１０：ＧＧＣＡＧＡＣＡＡＡＴＴＧＧＧＴＧＧＴＴ
配列番号１１：ＧＣＣＡＡＴＧＡＣＧＡＡＴＡＣＡＡＡＧＴＣ
配列番号１２：ＴＡＡＴＡＧＣＣＡＴＣＡＴＣＡＴＧＴＴＴＧＧ
配列番号１３：ＧＧＡＡＣＧＡＧＧＡＣＣＡＴＣＧＣＡＴＣＡＣＣＣＡＡＧＧＧＴＣＣＴＧＴＴＡＴＣＣＡＧＡＴＧＴＡＴＡＣＣＡＡＴＧＴＡＧＡＣＣＡＡＧＡＣＣＴＣＧＴＧＧＧＣＴＧＧＣＣＣＧＣＴＣＣＴＣＡＡＧＧＴＧＣＣＣＧＣＴＣＡＴＴＧＡＣＡＣＣＣＴＧＣＡＣＣＴＧＣＧ
配列番号１４：
ＧＧＡＡＣＧＡＧＧＡＣＣＡＴＣＧＣＡＴＣＡＣＣＣＡＡＧＧＧＴＣＣＴＧＴＴＡＴＣＣＡＧＡＴＧＴＡＴＡＣＣＡＡＴＧＴＡＧＡＣＡＡＡＧＡＣＣＴＣＧＴＧＧＧＣＴＧＧＣＣＣＧＣＴＣＣＴＣＡＡＧＧＴＧＣＣＣＧＣＴＣＡＴＴＧＡＣＡＣＣＣＴＧＣＡＣＣＴＧＣＧ
配列番号１５：ＴＴＴＧＴＣＴＡＡＡＧＧＧＴＣＣＴＧＴＴＡＴＣＣ
配列番号１６：ＴＡＧＡＣＡＡＡＣＡＧＣＣＣＡＣＧＡＧＧ
配列番号１７：ＴＴＴＧＴＣＴＡＧＴＴＡＴＣＣＡＧＡＴＧＴＡＴ
配列番号１８：ＴＡＧＡＣＡＡＡＣＣＡＧＣＣＣＡＣＧＡＧＧＴＣ
配列番号１９：ＴＣＴＴＧＧＴＣＣＡＡＧＧＧＴＣＣＴＧＴＴＡＴＣ
配列番号２０：ＧＡＣＣＡＡＧＡＡＧＧＧＴＧＴＣＡＡＴＧＡＧＣ

Claims (40)

  1. 共通の二本鎖の核酸分子上の第一の遺伝学的要素及び第二の遺伝学的要素を検出するための方法であって、以下を含む方法：
    第一の増幅反応混合物中で第一の増幅反応を遂行することであって、前記第一の増幅反応混合物は：ｉ）前記共通の二本鎖の核酸分子を含み、前記共通の二本鎖の核酸分子は第一の鎖及び第二の鎖、及び前記第一の遺伝学的要素及び前記第二の遺伝学的要素も含み、前記第一の遺伝学的要素は、第一の遺伝学的要素の第一の相補的配列、及び第一の遺伝学的要素の第二の相補的配列を含み、前記第二の遺伝学的要素は、第二の遺伝学的要素の第一の相補的配列、及び第二の遺伝学的要素の第二の相補的配列を含み、前記第一の遺伝学的要素の第一の相補的配列、及び前記第二の遺伝学的要素の第一の相補的配列は、前記第一の鎖の一部であり、及び前記第一の遺伝学的要素の第二の相補的配列、及び前記第二の遺伝学的要素の第二の相補的配列は、前記第二の鎖の一部であり；ｉｉ）第一の増幅反応の第一のプライマーであって、前記第一の増幅反応の第一のプライマーは、前記第一の遺伝学的要素の第一の相補的配列に相補的なヌクレオチド配列を有し；及びｉｉｉ）第一の増幅反応の第二のプライマーであって、前記第一の増幅反応の第二のプライマーは、前記第二の遺伝学的要素の第二の相補的配列に相補的なヌクレオチド配列を有し、及び第一の増幅反応生成物が、前記第一の増幅反応混合物中に生成され、前記第一の増幅反応生成物は、前記第一の遺伝学的要素の少なくとも一部分及び前記第二の遺伝学的要素の少なくとも一部分を含み、及び前記第一の増幅反応生成物は、二本鎖の、直線状形態を有し；連結反応混合物中で連結反応を遂行することであって、この連結反応混合物は：ｉ）前記第一の増幅反応生成物；及びｉｉ）リガーゼ酵素を含み、及び連結反応混合物中には、前記第一の増幅反応生成物から環状連結生成物が形成され、前記環状連結生成物は二本鎖であり、及び環状連結生成物の第一の鎖及び環状連結生成物の第二の鎖を含み、及び前記環状連結生成物の第一の鎖は、前記第一の増幅反応生成物の第一の鎖のヌクレオチドを含み、及び前記環状連結生成物の第二の鎖は、前記第一の増幅反応生成物の第二の鎖のヌクレオチドを含み；及び第二の増幅反応を第二の増幅反応混合物で遂行することであって、前記第二の増幅反応混合物は：ｉ）前記環状連結生成物；ｉｉ）第二の増幅反応の第一のプライマーを含み、前記第二の増幅反応の第一のプライマーは、前記第一の遺伝学的要素の第二の相補的配列に相補的なヌクレオチド配列を有し；及びｉｉｉ）第二の増幅反応の第二のプライマーを含み、前記第二の増幅反応の第二のプライマーは、前記第二の遺伝学的要素の第一の相補的配列に相補的なヌクレオチド配列を有し、及び第二の増幅反応生成物が、前記第二の増幅反応混合物に生成され、前記第二の増幅反応生成物は、前記第一の遺伝学的要素の少なくとも一部分及び前記第二の遺伝学的要素の少なくとも一部分を含み；及び
    前記第二の増幅反応生成物を検出すること。
  2. 前記第一の遺伝学的要素、及び前記第二の遺伝学的要素が、前記二本鎖の核酸分子上で、互いに少なくとも２０００及び５００００以下のヌクレオチドにより隔てられている、請求項１の方法。
  3. 前記第一の遺伝学的要素、及び前記第二の遺伝学的要素が、前記二本鎖の核酸分子上で、互いに少なくとも４０００及び５００００以下のヌクレオチドにより隔てられている、請求項１の方法。
  4. 前記第一の増幅反応がポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅反応である、請求項１〜３のいずれかの反応。
  5. 前記第一の増幅反応の第一のプライマー、及び前記第一の増幅反応の第二のプライマーが、それぞれ、長さにおいて、少なくとも６ヌクレオチドから５０以下のヌクレオチドである、請求項１〜４のいずれかの反応。
  6. 前記第一の増幅反応混合物中で、前記第一の増幅反応の第一のプライマー、及び前記第一の増幅反応の第二のプライマーの少なくとも１つが、プライマーの５’末端において、リン酸化される、請求項１〜５のいずれかの反応。
  7. 前記第一の増幅反応混合物中で前記第一の増幅反応の第一のプライマー、及び前記第一の増幅反応の第二のプライマーの両方が、プライマーの５’末端において、リン酸化される、請求項１〜６のいずれかの反応。
  8. 前記連結反応を遂行する前に、前記第一の増幅反応生成物をキナーゼ酵素とインキュベートする、請求項１〜５のいずれかの方法。
  9. 前記キナーゼ酵素がＴ４ポリヌクレオチドキナーゼである、請求項８の方法。
  10. 前記リガーゼ酵素がＴ４ＤＮＡリガーゼである、請求項１〜９のいずれかの方法。
  11. 前記第二の増幅反応の第一のプライマー、及び前記第二の増幅反応の第二のプライマーが、それぞれ長さにおいて、少なくとも６ヌクレオチドから６０ヌクレオチド以下である、請求項１〜１０のいずれかの方法。
  12. 前記第二の増幅反応がＰＣＲである、請求項１〜１１のいずれかの方法。
  13. 前記第二の増幅反応が熱サイクリングなしで遂行される、請求項１〜１１のいずれかの方法。
  14. 前記第二の増幅反応の第一のプライマーは、第一の領域及び第二の領域を含み、前記第二の増幅反応の第一のプライマーの第二の領域は、前記第二の遺伝学的要素の第一の相補的配列に相補的であり、及び前記第二の増幅反応の第二のプライマーは、第一の領域及び第二の領域を含み、前記第二の増幅反応の第二のプライマーの第二の領域は、前記第一の遺伝学的要素の第二の相補的配列に相補的であり、及び前記第二の増幅反応の第二のプライマーの第一の領域は、前記第二の増幅反応の第一のプライマーの第一の領域に相補的である、請求項１３の方法。
  15. 前記第二の増幅反応の第二のプライマーの第一の領域が、前記環状連結生成物の第一の鎖の少なくとも一部分にも相補的である、請求項１４の方法。
  16. 前記第二の増幅反応生成物が生成されると、リアルタイムで検出される、請求項１〜１５のいずれかの方法。
  17. 前記第一の遺伝学的要素が、抗生物質耐性遺伝子である、請求項１〜１６のいずれかの方法。
  18. 前記第二の遺伝学的要素が、病原体遺伝子である、請求項１〜１７のいずれかの方法。
  19. 前記第一の遺伝学的要素がｍｅｃＡ遺伝子である、請求項１〜１８のいずれかの方法。
  20. 前記第二の遺伝学的要素が黄色ブドウ球菌からの遺伝子である、請求項１〜１９のいずれかの方法。
  21. 生物学的サンプルを被験者から得ることを更に含み、前記被験者からの生物学的サンプルが、前記共通の二本鎖の核酸分子を含む、請求項１〜２０のいずれかの方法。
  22. 前記被験者からの前記共通の二本鎖の核酸分子を含む生物学的サンプルが、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌生命体中の共通の二本鎖の核酸分子を含む、請求項２１の方法。
  23. 前記第一の増幅反応、前記連結反応、及び前記第二の増幅反応のすべてが、同じ容器内で生じる、請求項１〜２２のいずれかの方法。
  24. 前記第一の増幅反応、前記連結反応、及び前記第二の増幅反応のすべてが、異なる容器内で生じる、請求項１〜２２のいずれかの方法。
  25. ポリヌクレオチドテンプレート中のヌクレオチド配列中の、目的の位置のヌクレオチドの身元を評価する方法で会って、以下を含む方法：
    Ａ）ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅反応混合物中に、ポリヌクレオチドテンプレートの複数のコピーを生成することであって、前記ＰＣＲ増幅反応混合物は、ＰＣＲ増幅反応の第一のプライマー及びＰＣＲ増幅反応の第二のプライマーを含み、前記ＰＣＲ増幅反応混合物中では、前記ＰＣＲ増幅反応の第一のプライマーが、前記ポリヌクレオチドテンプレートにアニールし、及び前記ＰＣＲの第二のプライマーは、前記ポリヌクレオチドテンプレートに相補的なポリヌクレオチドにアニールし、前記ＰＣＲ増幅反応混合物では、ＰＣＲ増幅反応生成物の複数のコピーが形成され、前記ＰＣＲ増幅反応生成物は、第一の鎖及び第二の鎖を含む二本鎖の核酸分子であり、及び前記ＰＣＲ増幅反応生成物の第一の鎖は、前記ポリヌクレオチドテンプレートのコピーであり；
    Ｂ）ステップＡ）で生成された前記ＰＣＲ増幅反応生成物のコピーを、少なくとも非熱サイクリングの第一の反応混合物、及び非熱サイクリングの第二の反応混合物のそれぞれに提供することであって：前記ポリヌクレオチドテンプレートは、第一の部分、第二の部分、及び第三の部分を含み、前記第三の部分は、前記ポリヌクレオチドテンプレートの中で、前記第一の部分及び前記第二の部分の間に位置し、及び目的の部分は、前記第三の部分の中にあり；前記非熱サイクリングの第一の反応混合物は、前記ポリヌクレオチドテンプレートのコピー、非熱サイクリングの第一のプライマー、及び非熱サイクリングの第二のプライマーを含み：前記非熱サイクリングの第一のプライマーは、第一の領域及び第二の領域を含み、前記第一の領域は前記プライマーの５’末端を含み、前記第二の領域は、前記プライマーの３’末端を含み、及び前記第二の領域は、前記ポリヌクレオチドテンプレートの第一の部分に相補的であり；前記非熱サイクリングの第二のプライマーは、第一の領域及び第二の領域を含み、前記第一の領域は前記プライマーの５’末端を含み、前記第二の領域は前記プライマーの３’末端を含み、及び前記第二の領域は、前記ポリヌクレオチドテンプレートの第二の部分に相補的な配列に相補的であり；前記非熱サイクリングの第一のプライマーの第一の領域は、前記非熱サイクリングの第二のプライマーの第一の領域に相補的であり；及び前記非熱サイクリングの第二のプライマーの第一の領域は、前記ポリヌクレオチドテンプレートの第三の部分に相補的であり；前記第二の反応混合物は、前記ポリヌクレオチドテンプレートのコピー、非熱サイクリングの第三のプライマー、及び非熱サイクリングの第四のプライマーを含み：前記非熱サイクリングの第三のプライマーは、第一の領域及び第二の領域を含み、前記第一の領域は前記プライマーの５’末端を含み、前記第二の領域は、前記プライマーの３’末端を含み、及び前記第二の領域は、前記ポリヌクレオチドテンプレートの第一の部分に相補的であり；前記非熱サイクリングの第四のプライマーは、第一の領域及び第二の領域を含み、前記第一の領域は前記プライマーの５’末端を含み、前記第二の領域は前記プライマーの３’末端を含み、及び前記第二の領域は、前記ポリヌクレオチドテンプレートの第二の部分に相補的である配列に相補的であり；前記非熱サイクリングの第三のプライマーの第一の領域は、前記非熱サイクリングの第四のプライマーの第一の領域に相補的であり；及び前記非熱サイクリングの第四のプライマーの第一の領域は、前記ポリヌクレオチドテンプレートの第三の部分に相補的であり；及び前記非熱サイクリングの第二のプライマーの第一の領域のヌクレオチド配列は、前記非熱サイクリングの第四のプライマーの第一の領域のヌクレオチド配列とは、１つのヌクレオチド分だけ異なり、前記非熱サイクリングの第二の、及び非熱サイクリングの第四のプライマー中の、異なるヌクレオチドの位置は、前記非熱サイクリングの第二のプライマーの第一の領域のヌクレオチド配列、又は非熱サイクリングの第四のプライマーが、前記ポリヌクレオチドテンプレートの第三の部分のヌクレオチド配列に、配列の最大の相補性のために配向する場合に、前記ポリヌクレオチドテンプレート中の目的のヌクレオチドの位置に対応し；
    Ｃ）前記非熱サイクリングの第一の反応混合物、及び非熱サイクリングの第二の反応混合物を、熱サイクリングのない条件下でインキュベートすること；及び
    Ｄ）前記非熱サイクリングの第一の反応混合物中の、ポリヌクレオチドテンプレートの増幅の速度及び量を、前記非熱サイクリングの第二の反応混合物中の、ポリヌクレオチドテンプレートの増幅の速度及び量と、比較することであって、前記ポリヌクレオチドテンプレートの増幅の速度及び量は、前記非熱サイクリングの第二のプライマー、又は非熱サイクリングの第四のプライマーの第一の領域、及び前記ポリヌクレオチドテンプレートの第三の部分のヌクレオチド配列の間の相補性の程度を示す。
  26. 前記ＰＣＲ増幅反応の第一のプライマーが、長さにおいて、少なくとも１０から８０以下のヌクレオチドであり、及び前記ＰＣＲ増幅反応の第一のプライマーが、前記ポリヌクレオチドテンプレートにアニールされるときに、前記ＰＣＲ増幅反応の第一のプライマーの少なくとも３ヌクレオチドが、ワトソン・クリックの塩基対規則に従い、前記ポリヌクレオチドテンプレート上の対応するヌクレオチドに不一致である、請求項２５の方法。
  27. 前記ＰＣＲ増幅反応の第一のプライマーが、長さにおいて、少なくとも１０から８０以下のヌクレオチドであり、及び前記ＰＣＲ増幅反応の第一のプライマーが、前記ポリヌクレオチドテンプレートにアニールされるときに、前記ＰＣＲ増幅反応の第一のプライマーの少なくとも５ヌクレオチドが、ワトソン・クリックの塩基対規則に従い、前記ポリヌクレオチドテンプレート上の対応するヌクレオチドに不一致である、請求項２５〜２６のいずれかの方法。
  28. 前記ＰＣＲ増幅反応の第一のプライマーが、長さにおいて、少なくとも１０から８０以下のヌクレオチドであり、及び前記ＰＣＲ増幅反応の第一のプライマーが、前記ポリヌクレオチドテンプレートにアニールされるときに、前記ＰＣＲ増幅反応の第一のプライマーの少なくとも３ヌクレオチドが、ワトソン・クリックの塩基対規則に従い、前記ポリヌクレオチドテンプレートに相補的な前記ポリヌクレオチド上の対応するヌクレオチドに不一致である、請求項２５〜２７のいずれかの方法。
  29. 前記ＰＣＲ増幅反応の第一のプライマーが、長さにおいて、少なくとも１０から８０以下のヌクレオチドであり、及び前記ＰＣＲ増幅反応の第一のプライマーが、前記ポリヌクレオチドテンプレートにアニールされるときに、前記ＰＣＲ増幅反応の第一のプライマーの少なくとも５ヌクレオチドが、ワトソン・クリックの塩基対規則に従い、前記ポリヌクレオチドテンプレートに相補的な前記ポリヌクレオチド上の対応するヌクレオチドに不一致である、請求項２５〜２８のいずれかの方法。
  30. 前記ポリヌクレオチドテンプレート中のヌクレオチド配列中の目的の部分がＳＮＰである、請求項２５〜２９のいずれかの方法。
  31. 前記ポリヌクレオチドテンプレートが、Ｃ型肝炎ウイルスからのものである、請求項２５〜３０のいずれかの方法。
  32. 前記ポリヌクレオチドテンプレートが、Ｃ型肝炎ＮＳ３遺伝子からのものである、請求項３１の方法。
  33. 前記ポリヌクレオチドテンプレート中のヌクレオチド配列中の目的の部分が、ＮＳ３遺伝子の８０番目のアミノ酸をエンコードするコドン中にある、請求項３２の方法。
  34. ポリヌクレオチドテンプレートを増幅する方法であって、以下を含む方法：
    （Ａ）ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅反応混合物中で、ポリヌクレオチドテンプレートの複数のコピーを生成することであって：前記ＰＣＲ増幅反応混合物では、ＰＣＲ増幅反応の第一のプライマーが、前記ポリヌクレオチドテンプレートにアニールし、及び前記ＰＣＲの第二のプライマーは、前記ポリヌクレオチドテンプレートに相補的なポリヌクレオチドにアニールし、前記ＰＣＲ増幅反応混合物では、ＰＣＲ増幅反応生成物の複数のコピーが形成され、前記ＰＣＲ増幅反応生成物は、第一の鎖及び第二の鎖を含む二本鎖の核酸分子であり、及び前記ＰＣＲ増幅反応生成物の第一の鎖は、前記ポリヌクレオチドテンプレートのコピーであり；
    Ｂ）前記ポリヌクレオチドテンプレートのコピーを、非熱サイクリング反応の第一のプライマー、及び非熱サイクリング反応の第二のプライマーを含む非熱サイクリング反応混合物で、インキュベートすることであって：前記ポリヌクレオチドテンプレートは、第一の部分、第二の部分、及び第三の部分を含み、前記第三の部分は、前記ポリヌクレオチドテンプレートの中で、前記第一の部分、及び前記第二の部分の間に位置し、及び目的の部分は、前記第三の部分の中にあり；前記第一のプライマーは第一の領域、及び第二の領域を含み、前記第一のプライマーの第二の領域は、前記ポリヌクレオチドテンプレートの第一の部分に相補的であり；及び前記第二のプライマーは、第一の領域及び第二の領域を含み、前記第二のプライマーの第二の領域は、前記ポリヌクレオチドテンプレートの第二の部分に相補的である、前記ＰＣＲ増幅反応生成物の第二の鎖の中の配列に相補的であり、前記第二のプライマーの第一の領域は前記第一のプライマーの第一の領域に相補的であり、及び前記第二のプライマーの第一の領域は、前記ポリヌクレオチドテンプレートの第三の部分に相補的である。
  35. 前記ポリヌクレオチドテンプレートの第一の部分、及び第二の部分のそれぞれが、長さにおいて、６〜３０ヌクレオチドである、請求項２５〜３４のいずれかの方法。
  36. 前記ポリヌクレオチドテンプレートの第三の部分が、長さにおいて、４〜１４ヌクレオチドである、請求項２５〜３５のいずれかの方法。
  37. 前記非熱サイクリング反応混合物中の、前記ポリヌクレオチドテンプレートのコピーが、前記方法の開始から６０分以内で、少なくとも１０倍に増加する、請求項２５〜３６のいずれかに記載の方法。
  38. 前記ポリヌクレオチドテンプレートの少なくとも３つのコピーを含むコンカテマー鎖が、前記非熱サイクリング反応混合物のインキュベーションの間に生成される、請求項２５〜３７のいずれかの方法。
  39. 請求項１〜３８の、いずれかにおいて提供される反応混合物の、いずれかの１つ以上の構成要素を、その中に含む容器。
  40. 請求項１〜３８の、いずれかにおいて提供される反応混合物の、いずれかの１つ以上の構成要素を、その中に含むキット。
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