JP2018004354A

JP2018004354A - Method for detecting encephalopathy, biomarker, composition for diagnosis, and kit for diagnosis

Info

Publication number: JP2018004354A
Application number: JP2016129018A
Authority: JP
Inventors: 華林小島; Karin Kojima; 崇倫山形; Takanori YAMAGATA; 憲二黒岩; Kenji Kuroiwa; 遠藤　仁司; Hitoshi Endo; 仁司遠藤
Original assignee: Jichi Medical University
Current assignee: Jichi Medical University
Priority date: 2016-06-29
Filing date: 2016-06-29
Publication date: 2018-01-11
Anticipated expiration: 2036-06-29
Also published as: JP6802554B2

Abstract

【課題】けいれん重積型（二相性）急性脳症（ＡＥＳＤ）を検出する検出方法を提供する。【解決手段】ＭｏｎｏｃｙｔｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎａｎｔｉｇｅｎＣＤ１４、ＡｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎＥ、Ｇｅｌｓｏｌｉｎ、Ｃｌｕｓｔｅｒｉｎ、及びα２−Ｍａｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎからなる群の一種のタンパク質の髄液中での発現量変化を指標として、けいれん重積型（二相性）急性脳症であることを検出する。この検出は、ＭｏｎｏｃｙｔｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎａｎｔｉｇｅｎＣＤ１４については発現量が増加し、ＡｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎＥ、Ｇｅｌｓｏｌｉｎ、Ｃｌｕｓｔｅｒｉｎ、及びα２−Ｍａｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎについては発現量が減少することに基づく。【選択図】図１The present invention provides a detection method for detecting convulsive intussusception (biphasic) acute encephalopathy (AESD). A convulsive stack type (biphasic) acute encephalopathy using a change in the expression level of a protein of the group consisting of Monocyte differentiation antigen CD14, Apolipoprotein E, Gelsolin, Clusterin, and α2-Macroglobulin as an index. Is detected. This detection is based on the increase in the expression level for Monocyte differentiation antigen CD14 and the decrease in the expression level for Apolipoprotein E, Gelsolin, Clusterin, and α2-Macroglobulin. [Selection] Figure 1

Description

本発明は、特に脳症の検出方法、バイオマーカー、診断用組成物、及び診断用キットに関する。 The present invention particularly relates to a method for detecting encephalopathy, a biomarker, a diagnostic composition, and a diagnostic kit.

急性脳症は、小児期に多く発症する脳症である。我が国における急性脳症の定義は、ＪａｐａｎＣｏｍａＳｃａｌｅ２０以上（ＧｌａｓｇｏｗＣｏｍａＳｃａｌｅ１０〜１１以下）の意識障害が急性に発症し、２４時間以上持続することである。急性脳症は、（１）ほとんどは、インフルエンザ、ＨＨＶ−６（突発性発疹）、ロタウィルス、ＲＳウィルス等の感染症の経過中に発症する、（２）多くは頭部ＣＴ、ＭＲＩで脳浮腫が描出される、（３）脳炎、髄膜炎等の他の疾患が否定される（髄液中の細胞数増加がない）という特徴がある。
急性脳症では、多くが死亡したり後遺症を生じたりするため、医学的、社会的に大きな問題を生じている。 Acute encephalopathy is an encephalopathy that often develops in childhood. The definition of acute encephalopathy in Japan is that a consciousness disorder of Japan Coma Scale 20 or more (Glasgow Coma Scale 10 to 11 or less) develops acutely and lasts for 24 hours or more. Acute encephalopathy (1) mostly develops during the course of infectious diseases such as influenza, HHV-6 (spontaneous rash), rotavirus, RS virus, etc. (2) brain edema mostly with head CT and MRI (3) Other diseases such as encephalitis and meningitis are denied (no increase in the number of cells in cerebrospinal fluid).
In acute encephalopathy, many deaths or sequelae cause serious medical and social problems.

ここで、急性脳症には、重篤な脳症である急性壊死性脳症（ＡｃｕｔｅＮｅｃｒｏｔｉｚｉｎｇＥｎｃｅｐａｈｌｏｐａｔｈｙ、以下「ＡＮＥ」と記載する。）、予後が比較的良好な脳梁膨大部脳症（Ｃｌｉｎｉｃａｌｌｙｍｉｌｄｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ／ｅｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｙｗｉｔｈａｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅｓｐｌｅｎｉａｌｌｅｓｉｏｎ、以下、「ＭＥＲＳ」と記載する。）、及び、けいれん重積型（二相性）急性脳症（Ａｃｕｔｅｅｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｙｗｉｔｈｂｉｐｈａｓｉｃｓｅｉｚｕｒｅｓａｎｄｌａｔｅｒｅｄｕｃｅｄｄｉｆｆｕｓｉｏｎ、以下「ＡＥＳＤ」と記載する。）と呼ばれる症候群が存在する。また、症候群として確立していないが、「一相性脳症」と考えられる、感染症による発熱後、けいれんを発症し、その後長時間（概ね２４時間以上）にわたり意識障害が遷延するが、時間経過とともに意識障害が改善する脳症が存在する。 Here, acute encephalopathy includes acute necrotizing encephalopathy (Acne Necrotizing Encephalopathy, hereinafter referred to as “ANE”), corpus callosal encephalopathy with relatively good prognosis (clinically mild encephalopathy / encephalopathy). “with a reversible spleenial ration” (hereinafter referred to as “MERS”) and convulsive status (biphasic) acute encephalopathy with biphasic seizures and alate deduce. There is a so called syndrome. In addition, although it has not been established as a syndrome, convulsion develops after fever due to infection, which is considered to be “single-phase encephalopathy”, and consciousness disorder is prolonged for a long time (generally 24 hours or more). There is encephalopathy that improves consciousness disorder.

これらのうち一相性脳症及びＡＥＳＤでは、感染症により急激に発症して、けいれん及び意識障害を呈する１回目の発作が生じる。その後、一相性脳症では、自然軽快することが期待できるのに対し、ＡＥＳＤでは、１回目の発作からの数日後に、２回目のけいれん及び意識障害を呈する発作を起こすことが、臨床的な特徴である。すなわち、発作が１回だけ（一相性）の一相性脳症に対して、ＡＥＳＤ（二相性）では２回目の発作が起こる。そして、ＡＥＳＤは、罹病率が我が国で年間４００〜７００人と少ないものの、患者には、その後、麻痺、知的障害、てんかん等の厳しい神経学的後遺症が生じることが多いという問題があった。 Of these, monophasic encephalopathy and AESD develop suddenly due to infection, resulting in the first seizure that presents convulsions and impaired consciousness. Later, in monophasic encephalopathy, it can be expected to relieve spontaneously, whereas in AESD, a few days after the first seizure, a seizure presenting a second seizure and disturbance of consciousness is a clinical feature. It is. That is, AESD (biphasic) has a second seizure, whereas monophasic encephalopathy has only one seizure (uniphasic). AESD has a low morbidity rate of 400 to 700 people per year in Japan. However, patients often have severe neurological sequelae such as paralysis, intellectual disability, and epilepsy.

ここで、従来の急性脳症の診断方法として、特許文献１を参照すると、（１）脳症が疑われる患者から採取した血液中のキノリン酸含有量及び／又はキヌレニン含有量を測定する、及び（２）前記キノリン酸含有量及び／又はキヌレニン含有量を、脳症非発症者又は脳症発症者の基準レベルと比較することで脳症を簡易かつ迅速に検出する技術が開示されている（以下、従来技術１とする。）。 Here, as a conventional method for diagnosing acute encephalopathy, with reference to Patent Document 1, (1) measuring quinolinic acid content and / or kynurenine content in blood collected from a patient suspected of having encephalopathy, and (2 ) A technique for easily and rapidly detecting encephalopathy by comparing the quinolinic acid content and / or kynurenine content with a reference level of a person without encephalopathy or a person with encephalopathy (hereinafter, referred to as Prior Art 1). And).

特開２０１４−１９４３９６号公報JP 2014-194396 A

ここで、上述のように、病初期の１回目の発作では一相性脳症及びＡＥＳＤ共に、発熱、けいれん、意識障害を呈するものの、上述のように、予後が比較的良好な一相性脳症と異なり、ＡＥＳＤは、重篤な後遺症を残すことが多い。
しかしながら、ＡＥＳＤ用の診断用マーカーは知られておらず、従来技術１の診断方法でも、一相性脳症とＡＥＳＤとを区別することはできなかった。
このため、病初期にＡＥＳＤであることを検出することは難しかった。 Here, as described above, in the first seizure in the early stage of the disease, both monophasic encephalopathy and AESD exhibit fever, convulsions, and disturbance of consciousness, but as described above, unlike monophasic encephalopathy with a relatively good prognosis, AESD often leaves severe sequelae.
However, a diagnostic marker for AESD is not known, and even the diagnostic method of Prior Art 1 cannot distinguish monophasic encephalopathy from AESD.
For this reason, it was difficult to detect AESD in the early stage of the disease.

本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、上述の問題を解消することを目的とする。 The present invention has been made in view of such a situation, and an object thereof is to solve the above-described problems.

本発明の脳症の検出方法は、脳症の検出方法であって、ＭｏｎｏｃｙｔｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎａｎｔｉｇｅｎＣＤ１４、ＡｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎＥ、Ｇｅｌｓｏｌｉｎ、Ｃｌｕｓｔｅｒｉｎ、及びα２−Ｍａｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎからなる群の一種以上のタンパク質の髄液中での発現量変化を指標として、けいれん重積型（二相性）急性脳症であることを検出することを特徴とする。
本発明の脳症の検出方法は、前記指標は、ＭｏｎｏｃｙｔｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎａｎｔｉｇｅｎＣＤ１４については発現量が増加し、ＡｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎＥ、Ｇｅｌｓｏｌｉｎ、Ｃｌｕｓｔｅｒｉｎ、及びα２−Ｍａｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎについては発現量が減少することに基づくことを特徴と。
本発明のバイオマーカーは、けいれん重積型（二相性）急性脳症の診断用のバイオマーカーであって、髄液中のＭｏｎｏｃｙｔｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎａｎｔｉｇｅｎＣＤ１４、ＡｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎＥ、Ｇｅｌｓｏｌｉｎ、Ｃｌｕｓｔｅｒｉｎ、及びα２−Ｍａｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎからなる群の一種以上のタンパク質マーカーであることを特徴とする。
本発明の診断用組成物は、けいれん重積型（二相性）急性脳症を診断するための診断用組成物であって、ＭｏｎｏｃｙｔｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎａｎｔｉｇｅｎＣＤ１４、ＡｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎＥ、Ｇｅｌｓｏｌｉｎ、Ｃｌｕｓｔｅｒｉｎ、及びα２−Ｍａｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎからなる群の一種以上のタンパク質に特異的に結合する抗体を含むことを特徴とする。
本発明の診断用キットは、けいれん重積型（二相性）急性脳症を診断するための診断用キットであって、ＭｏｎｏｃｙｔｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎａｎｔｉｇｅｎＣＤ１４、ＡｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎＥ、Ｇｅｌｓｏｌｉｎ、Ｃｌｕｓｔｅｒｉｎ、及びα２−Ｍａｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎからなる群の一種以上のタンパク質に特異的に結合する抗体を含むことを特徴とする。 The method for detecting encephalopathy of the present invention is a method for detecting encephalopathy, wherein the expression level change in one or more proteins of the group consisting of Monocyte differentiation antigen CD14, Apolipoprotein E, Gelsolin, Clusterin, and α2-Macroglobulin is changed. It is characterized by detecting convulsive status (biphasic) acute encephalopathy using as an index.
The encephalopathy detection method of the present invention is characterized in that the index is based on an increase in the expression level for Monocyte differentiation antigen CD14, and a decrease in the expression level for Apolipoprotein E, Gelsolin, Clusterin, and α2-Macroglobulin. .
The biomarker of the present invention is a biomarker for diagnosing convulsive status type (biphasic) acute encephalopathy, which consists of monocytic differentiation antigen CD14, Apolipoprotein E, Gelsolin, Clusterin, and α2-Macroglobulin in cerebrospinal fluid It is characterized by being one or more protein markers.
The diagnostic composition of the present invention is a diagnostic composition for diagnosing convulsive intussusception (biphasic) acute encephalopathy, comprising Monocytosis differentiation antigen CD14, Apolipoprotein E, Gelsolin, Clusterin, and α2-Macroglobulin. It comprises an antibody that specifically binds to one or more proteins of the group.
The diagnostic kit of the present invention is a diagnostic kit for diagnosing convulsive intussusception (biphasic) acute encephalopathy, which is a group consisting of Monocyte differentiation antigen CD14, Apolipoprotein E, Gelsolin, Clusterin, and α2-Macroglobulin. It comprises an antibody that specifically binds to one or more proteins.

本発明によれば、ＭｏｎｏｃｙｔｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎａｎｔｉｇｅｎＣＤ１４、ＡｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎＥ、Ｇｅｌｓｏｌｉｎ、Ｃｌｕｓｔｅｒｉｎ、及びα２−Ｍａｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎからなる群の一種以上のタンパク質の髄液中での発現量変化を指標とすることで、病初期にＡＥＳＤであることを検出することが可能な脳症の検出方法を提供することができる。 According to the present invention, the change in the expression level of one or more proteins of the group consisting of Monocyte differentiation antigen CD14, Apolipoprotein E, Gelsolin, Clusterin, and α2-Macroglobulin is used as an index, and it is AESD in the early stage of the disease. It is possible to provide a encephalopathy detection method capable of detecting this.

本発明の実施例に係る髄液の２Ｄ−ＤＩＧＥ法のプロット結果を示す写真である。It is a photograph which shows the plot result of 2D-DIGE method of the spinal fluid which concerns on the Example of this invention.

＜実施の形態＞
本発明の発明者らは、一相性脳症と、二相性のＡＥＳＤとを病初期に判別するバイオマーカーを探索するため、鋭意実験を行った。その結果、髄液中に発現するタンパクのうち、いくつかのものの発現量が変化することを早期診断マーカーとして用いることで脳症を検出する方法を見いだし、本発明を完成するに至った。 <Embodiment>
The inventors of the present invention conducted intensive experiments to search for biomarkers that discriminate between monophasic encephalopathy and biphasic AESD in the early stage of the disease. As a result, the inventors have found a method for detecting encephalopathy by using, as an early diagnosis marker, a change in the expression level of some proteins expressed in cerebrospinal fluid, and have completed the present invention.

具体的には、本発明の発明者らは、ＡＥＳＤ患者３名と一相性脳症患者３名の病初期に採取したヒト髄液中で、プロテオーム解析を行った。髄液は１回目の発作から１０時間以内に集められた。この髄液について、ゲル電気泳動法（２Ｄ−ＤＩＧＥ）を使用し、発現が変化しているタンパク質を２Ｄ−ＤＩＧＥ法によって確認した。この結果として、ＡＥＳＤ患者からの髄液では、ＭｏｎｏｃｙｔｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｏｎａｎｔｉｇｅｎＣＤ１４及び免疫グロブリンの発現が上昇していた。これらは、免疫応答に関連するタンパク質であった。また、ＡｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎＥ、Ｇｅｌｓｏｌｉｎ、Ｃｌｕｓｔｅｒｉｎ、及びα２−Ｍａｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎの発現が減少していた。これら発現が減少したタンパク質は、後述するようにアポトーシス、免疫学的応答、及び神経修復に関係していた。
患者の髄液中で、これらのタンパク質をバイオマーカーとして発現の定性、定量を行うことでＡＥＳＤの早期診断、早期治療が可能となることが期待される。 Specifically, the inventors of the present invention performed proteome analysis in human cerebrospinal fluid collected at the early stage of disease of 3 patients with AESD and 3 patients with monophasic encephalopathy. Cerebrospinal fluid was collected within 10 hours of the first seizure. About this cerebrospinal fluid, the gel electrophoresis method (2D-DIGE) was used, and the protein in which expression was changing was confirmed by 2D-DIGE method. As a result, in the cerebrospinal fluid from AESD patients, the expression of Monocyte differentiated onion CD14 and immunoglobulin was increased. These were proteins associated with the immune response. Moreover, the expression of Apolipoprotein E, Gelsolin, Clusterin, and α2-Macroglobulin was decreased. These reduced expression proteins have been implicated in apoptosis, immunological response, and nerve repair as described below.
It is expected that early diagnosis and early treatment of AESD will be possible by qualitative and quantitative expression of these proteins as biomarkers in the cerebrospinal fluid of patients.

より具体的に説明すると、本発明の実施の形態に係る脳症の検出方法、バイオマーカー、診断用組成物、及び診断用キットの対象となる脳症は、けいれん重積型（二相性）急性脳症（ＡＥＳＤ）である。上述したように、ＡＥＳＤは、発熱に伴い、けいれん重積（１回目の発作）を起こした後に、一時的に意識状態が改善した後、２〜４日後に、再度けいれん発作や意識障害（２回目の発作）を起こす二相性の経過を示し、麻痺、知的障害やてんかん等の後遺症を残すことが多い疾患である。
本実施形態に係る脳症の検出方法の被験者は、急性脳症が疑われる患者であり、脳症非発症者、急性でない脳症発症者、及び脳症を引き起こす各種感染症の患者を含む。 More specifically, the encephalopathy that is the target of the encephalopathy detection method, biomarker, diagnostic composition, and diagnostic kit according to the embodiment of the present invention is a convulsive stack type (biphasic) acute encephalopathy ( AESD). As described above, AESD causes a convulsive seizure or disturbance of consciousness (2) after 2-4 days after convulsions (first seizure) occur due to fever and temporarily improves the state of consciousness. It is a disease that shows a biphasic course that causes the second seizure) and often has sequelae such as paralysis, intellectual disability and epilepsy.
Subjects of the encephalopathy detection method according to the present embodiment are patients suspected of having acute encephalopathy, including non-encephalopathy patients, non-acute encephalopathy patients, and patients with various infectious diseases that cause encephalopathy.

また、本実施形態においては、上述のように、初回けいれん発症（１回目の発作）後、早期に髄液を採取し、この髄液中内で発現が変化しているタンパク質の発現量を、プロテオーム解析にて同定した。プロテオームは、特定の細胞若しくは生体試料が特定条件下に置かれた時に、その中に存在する全てのタンパク質を意味する。プロテオーム解析は、タンパク質の機能や各タンパク質が構築する機能ネットワークを明らかにする研究手法であり、こうして得られた知見は、疾病の早期診断や病態の解明、さらには創薬研究へと応用されている。 Further, in the present embodiment, as described above, after the first seizure onset (first seizure), cerebrospinal fluid is collected early, and the expression level of the protein whose expression is changed in the cerebrospinal fluid, It was identified by proteome analysis. Proteome means all proteins present in a particular cell or biological sample when placed under a particular condition. Proteome analysis is a research technique to clarify the function of proteins and the functional network constructed by each protein, and the knowledge gained in this way has been applied to early diagnosis of diseases, elucidation of disease states, and drug discovery research. Yes.

本発明の実施の形態に係るプロテオーム解析には、二次元電気泳動（Ｔｗｏ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ、２−ＤＥ）と質量分析（ｍａｓｓｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ、ＭＳ）を基礎としたプロテオーム解析を用いることが可能である。二次元電気泳動は、個々のタンパク質が持つ等電点の違いを利用した等電点電気泳動と、分子量の違いを利用したポリアクリルアミド電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）とを組み合わせることによって、タンパク質を分離する方式である。これにより数百から数千種類のタンパク質を同時に分離し、タンパク質スポットとして可視化することができる。このタンパク質スポットは、酵素処理を行いペプチド断片とした後に、後述する質量分析にて、ペプチド断片の質量データ（ＭＳスペクトル）を計測する。ペプチドフィンガープリント法により、このＭＳスペクトラムを、既存のデータベースに登録されているタンパク質のＭＳスペクトラムと照合し、タンパク質の同定を行うことが可能である。また、タンデムマス質量分析（ＭＳ／ＭＳ）装置を用いることでより詳細な情報（ＭＳ／ＭＳスペクトル）を取得でき、高精度にタンパク質の同定が可能となる。 For the proteome analysis according to the embodiment of the present invention, it is possible to use proteome analysis based on two-dimensional electrophoresis (2-DE) and mass spectrometry (MS). Two-dimensional electrophoresis separates proteins by combining isoelectric focusing using the difference in isoelectric points of individual proteins and polyacrylamide electrophoresis (SDS-PAGE) using the difference in molecular weight. It is a method to do. Thereby, several hundred to several thousand kinds of proteins can be simultaneously separated and visualized as protein spots. This protein spot is subjected to enzyme treatment to form a peptide fragment, and then mass data (MS spectrum) of the peptide fragment is measured by mass spectrometry to be described later. By the peptide fingerprint method, this MS spectrum can be collated with the MS spectrum of the protein registered in the existing database, and the protein can be identified. Further, more detailed information (MS / MS spectrum) can be obtained by using a tandem mass mass spectrometry (MS / MS) apparatus, and protein identification can be performed with high accuracy.

また、本発明の実施の形態に係るプロテオーム解析には、特に、蛍光標識二次元ディファレンスゲル電気泳動（２−ＤｉｍｅｎｓｉｏｎａｌＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅＤｉｆｆｅｒｅｎｃｅＧｅｌＥｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ、２Ｄ−ＤＩＧＥ法）を用いることが好適である。２Ｄ−ＤＩＧＥ法では、異なる蛍光波長を持つ色素（ＣｙＤｙｅ：Ｃｙ２，Ｃｙ３，Ｃｙ５）を用い、泳動する前に各サンプルのタンパク質をあらかじめ標識（Ｃｙ３，Ｃｙ５）することで、同一のゲルで２群の発現量比較を行う。また、比較するサンプルを等量ずつ混合した内部標準（Ｃｙ２）を用いる。これにより、従来の二次元電気泳動法に比べて、２Ｄ−ＤＩＧＥ法では、ゲル間での泳動誤差が改善され、高感度で高精度に発現差異を解析可能である。さらに、２Ｄ−ＤＩＧＥではタンパク質を直接蛍光色素標識することで、比較的少量のタンパク質量でもスポットとして検出することが可能である。
本実施形態において、２Ｄ−ＤＩＧＥ法による急性脳症患者髄液を用いたプロテオーム解析により、初回けいれん後、早期に二相性の脳症を発症するリスクを判定するバイオマーカーを同定することが可能となった。
これにより、髄液内で変化している分子を測定することで、ＡＥＳＤの発症機序と病態を解明することが可能となる。
なお、本実施形態のプロテオーム解析として、その他の高性能な分析機器を駆使した解析法を用いてもよい。 In addition, it is particularly preferable to use fluorescence-labeled two-dimensional difference gel electrophoresis (2-Dimensional Fluorescence Difference Electrophoresis, 2D-DIGE method) for proteome analysis according to the embodiment of the present invention. In the 2D-DIGE method, dyes having different fluorescence wavelengths (CyDye: Cy2, Cy3, Cy5) are used, and the proteins of each sample are labeled in advance (Cy3, Cy5) before electrophoresis, so that two groups of the same gel are used. Comparison of the expression level of Further, an internal standard (Cy2) in which equal amounts of samples to be compared are mixed is used. Thereby, compared with the conventional two-dimensional electrophoresis method, the 2D-DIGE method improves the migration error between gels, and can analyze the expression difference with high sensitivity and high accuracy. Further, in 2D-DIGE, a protein can be directly labeled with a fluorescent dye, so that a relatively small amount of protein can be detected as a spot.
In this embodiment, the proteome analysis using cerebrospinal fluid of an acute encephalopathy patient by the 2D-DIGE method makes it possible to identify a biomarker that determines the risk of developing biphasic encephalopathy early after the first convulsion. .
This makes it possible to elucidate the onset mechanism and pathology of AESD by measuring molecules changing in the cerebrospinal fluid.
In addition, as a proteome analysis of the present embodiment, an analysis method using other high-performance analysis equipment may be used.

具体的には、本発明の実施の形態に係る脳症の検出方法は、ＭｏｎｏｃｙｔｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎａｎｔｉｇｅｎＣＤ１４、ＡｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎＥ、Ｇｅｌｓｏｌｉｎ、Ｃｌｕｓｔｅｒｉｎ、及びα２−Ｍａｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎからなる群の一種以上のタンパク質の髄液中での発現量変化を指標として、けいれん重積型（二相性）急性脳症であることを検出することを特徴とする。
また、本発明の実施の形態に係る脳症の検出方法は、指標として、ＭｏｎｏｃｙｔｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎａｎｔｉｇｅｎＣＤ１４については発現量が増加し、ＡｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎＥ、Ｇｅｌｓｏｌｉｎ、Ｃｌｕｓｔｅｒｉｎ、及びα２−Ｍａｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎについては発現量が減少することに基づくことを特徴とする。
なお、本実施形態において、「一種以上」とは、各構成のうち一つ又は複数の組み合わせのいずれかであることを示す。すなわち、いずれか一つを用いてもよいし、これらのうち二つ〜全てについての任意の組み合わせを含む。
つまり、上述の脳症の検出方法の例においては、ＭｏｎｏｃｙｔｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎａｎｔｉｇｅｎＣＤ１４、ＡｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎＥ、Ｇｅｌｓｏｌｉｎ、Ｃｌｕｓｔｅｒｉｎ、及びα２−Ｍａｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎからなる群のタンパク質については、一つ又は複数のタンパク質の組み合わせのいずれかの変動を検出する。 Specifically, the method for detecting encephalopathy according to an embodiment of the present invention includes the expression of one or more proteins from the group consisting of Monocyte differentiation antigen CD14, Apolipoprotein E, Gelsolin, Clusterin, and α2-Macroglobulin in the cerebrospinal fluid. It is characterized by detecting convulsive status (biphasic) acute encephalopathy with the change in amount as an index.
In addition, in the encephalopathy detection method according to the embodiment of the present invention, as an index, the expression level increases for Monocyte differentiation antigen CD14, and the expression level decreases for Apolipoprotein E, Gelsolin, Clusterin, and α2-Macroglobulin. It is based on.
In the present embodiment, “one or more” indicates one or a combination of a plurality of components. That is, any one of them may be used, and any combination of two to all of these may be included.
That is, in the example of the detection method of encephalopathy described above, for a group of proteins consisting of Monocyte differentiation antigen CD14, Apolipoprotein E, Gelsolin, Clusterin, and α2-Macroglobulin, any variation of one or a plurality of protein combinations Is detected.

また、本発明の実施の形態に係るバイオマーカーは、けいれん重積型（二相性）急性脳症の診断用のバイオマーカーであって、髄液中のＭｏｎｏｃｙｔｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎａｎｔｉｇｅｎＣＤ１４、ＡｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎＥ、Ｇｅｌｓｏｌｉｎ、Ｃｌｕｓｔｅｒｉｎ、及びα２−Ｍａｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎからなる群の一種以上であることを特徴とする。 In addition, the biomarker according to the embodiment of the present invention is a biomarker for diagnosing convulsive status type (biphasic) acute encephalopathy, which is monocytic differentiation antigen CD14, Apolipoprotein E, Gelsolin, Clusterin, And α2-Macroglobulin.

ここで、本発明の実施の形態に係るバイオマーカーとして、ＡＥＳＤで発現量が増加していたＭｏｎｏｃｙｔｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｏｎａｎｔｉｇｅｎＣＤ１４（以下、「ＣＤ１４」と記載する。）は、中枢神経系の感染及び傷害に対するマイクログリア応答に対応する重要なタンパクである。具体的に、ＣＤ１４は、ＴＬＲ（トール様受容体）４の補助受容体であり、ＬＰＳ（リポ多糖類）に対する応答を促進する。また、ＣＤ１４は、ＴＬＲ４及び関連する免疫受容体の機能を組み合わせて、ＴＬＲ及び非ＴＬＲの系により制御される。これにより、ＣＤ１４は、中枢神経系の感染及び無感染時のミクログリアのダメージ検出の機能を微調整し、ミクログリア活性化を補助する。 Here, as a biomarker according to an embodiment of the present invention, Monocyte differentiateon antigen CD14 (hereinafter referred to as “CD14”) whose expression level was increased by AESD is a micromarker for infection and injury of the central nervous system. It is an important protein corresponding to the glial response. Specifically, CD14 is a co-receptor for TLR (Toll-like receptor) 4 and promotes a response to LPS (lipopolysaccharide). CD14 is also regulated by TLR and non-TLR systems, combining the functions of TLR4 and related immune receptors. As a result, CD14 finely adjusts the function of detecting damage to the microglia when the central nervous system is infected and uninfected, and assists microglia activation.

また、本発明の実施の形態に係るバイオマーカーとして、ＡＥＳＤで発現量が減少していたＡｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎＥ（以下、「ＡｐｏＥ」と記載する。）は、アストロサイトやミクログリアでも産生、分泌されるタンパクである。また、ＡｐｏＥ受容体は、ニューロン、アストロサイト及びミクログリアの中で広く発現している。ＡｐｏＥは、髄液中のリポタンパクと結合し、神経細胞内に取り込まれる。すなわち、ＡｐｏＥは、神経細胞損傷後の修復期に必要なコレステロール等の脂質の神経細胞への輸送に関与している。また、コレステロール及び他の脂質はシナプス構造及び修復に重要な役割を果たす。具体的に、コレステロールは、薄膜とミエリン鞘の需要な原料であり、シナプスの完全性及び神経機能には必須の化合物である。
また、本発明の実施の形態に係るバイオマーカーとして、ＡＥＳＤで発現量が減少していたＧｅｌｓｏｌｉｎは、細胞分化や接着、アポトーシスに関係しているタンパクである。
また、本発明の実施の形態に係るバイオマーカーとして、ＡＥＳＤで発現量が減少していたＣｌｕｓｔｅｒｉｎ（以下、「ＣＬＵ」と記載する。）は、免疫グロブリンや補体等と複合体を形成する糖タンパク質である。ＣＬＵは、脳を含む多くの組織で広く発現され、マクロファージの誘引、補体攻撃抑制、アポトーシス阻害、膜の再形成等に関連する。また、ＣＬＵは、けいれん誘発性の神経細胞障害に対する保護に関連している。 As a biomarker according to an embodiment of the present invention, Apolipoprotein E (hereinafter referred to as “ApoE”) whose expression level was reduced by AESD is a protein that is also produced and secreted by astrocytes and microglia. is there. ApoE receptors are also widely expressed in neurons, astrocytes and microglia. ApoE binds to lipoproteins in cerebrospinal fluid and is taken up into nerve cells. That is, ApoE is involved in transport of lipids such as cholesterol necessary for the repair phase after nerve cell damage to nerve cells. Cholesterol and other lipids also play an important role in synaptic structure and repair. Specifically, cholesterol is a demanding raw material for thin films and myelin sheaths and is an essential compound for synaptic integrity and nerve function.
Further, as a biomarker according to an embodiment of the present invention, Gelsolin whose expression level has been reduced by AESD is a protein related to cell differentiation, adhesion, and apoptosis.
Further, as a biomarker according to an embodiment of the present invention, Clusterin (hereinafter referred to as “CLU”) whose expression level has been reduced by AESD is a saccharide that forms a complex with immunoglobulin, complement, and the like. It is a protein. CLU is widely expressed in many tissues including the brain and is associated with macrophage attraction, inhibition of complement attack, inhibition of apoptosis, membrane remodeling, and the like. CLU is also associated with protection against seizure-induced neuronal damage.

これらをまとめると、従来、ＡＥＳＤの病理的な機構は、ニューロンの興奮毒性であると考えられていた。
これに対して、本実施形態によれば、ＡＥＳＤの免疫学的応答の関与が機構のうちの１つであることを示唆した。すなわち、脳症の初期で大量のステロイドを投与するステロイドパルス療法及び免疫抑制療法により、ＡＥＳＤの２回目の発作を抑える療法の開発が期待できる。
一方、本実施形態によれば、ＡＥＳＤでは、発現量減少したタンパク質はアポトーシス、免疫学的応答及び神経修復に関係していた。このため、ＡＥＳＤ患者においては、神経修復能力が他の脳症患者より低い可能性が示唆される。このため、各種の神経修復を促進する薬剤による治療により、ＡＥＳＤの後遺症を抑制することが期待できる。
なお、本実施形態のバイオマーカーは、患者がＡＥＳＤを発症していることを確認する発症マーカー、又は患者がＡＥＳＤを発症していないことを確認する健常マーカーのいずれとしても使用可能である。 In summary, conventionally, the pathological mechanism of AESD was thought to be neuronal excitotoxicity.
In contrast, according to the present embodiment, it was suggested that the involvement of the immunological response of AESD is one of the mechanisms. That is, the development of a therapy that suppresses the second attack of AESD can be expected by steroid pulse therapy and immunosuppressive therapy in which a large amount of steroid is administered at an early stage of encephalopathy.
On the other hand, according to this embodiment, in AESD, the protein whose expression level was decreased was related to apoptosis, immunological response, and nerve repair. This suggests that in AESD patients, nerve repair ability may be lower than in other encephalopathy patients. For this reason, it is expectable that the aftereffects of AESD will be suppressed by the treatment with various agents that promote nerve repair.
In addition, the biomarker of this embodiment can be used as either an onset marker for confirming that a patient has developed AESD or a healthy marker for confirming that a patient has not developed AESD.

また、本発明の実施の形態に係る診断用組成物は、けいれん重積型（二相性）急性脳症を診断するための診断用組成物であって、ＭｏｎｏｃｙｔｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎａｎｔｉｇｅｎＣＤ１４、ＡｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎＥ、Ｇｅｌｓｏｌｉｎ、Ｃｌｕｓｔｅｒｉｎ、及びα２−Ｍａｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎからなる群の一種以上のタンパク質に特異的に結合する抗体を含むことを特徴とする。
また、本発明の実施の形態に係る診断用キットは、けいれん重積型（二相性）急性脳症を診断するための診断用キットであって、ＭｏｎｏｃｙｔｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎａｎｔｉｇｅｎＣＤ１４、ＡｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎＥ、Ｇｅｌｓｏｌｉｎ、Ｃｌｕｓｔｅｒｉｎ、及びα２−Ｍａｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎからなる群の一種以上のタンパク質に特異的に結合する抗体を含むことを特徴とする。 In addition, the diagnostic composition according to the embodiment of the present invention is a diagnostic composition for diagnosing convulsive status type (biphasic) acute encephalopathy, which is monocyte differentiation antigen CD14, Apolipoprotein E, Gelsolin, Clusterin. And an antibody that specifically binds to one or more proteins of the group consisting of α2-Macroglobulin.
A diagnostic kit according to an embodiment of the present invention is a diagnostic kit for diagnosing convulsion status (biphasic) acute encephalopathy, including Monocyte differentiation antigen CD14, Apolipoprotein E, Gelsolin, Clusterin, and It comprises an antibody that specifically binds to one or more proteins of the group consisting of α2-Macroglobulin.

ここで、従来、ＡＥＳＤにおいては、二相性の経過を見ないと診断が困難であるが、２回目のけいれん、意識障害の発症後に治療しても、予後の改善が見られないことが多かった。
これに対して本実施形態の診断用組成物、診断用キットにより、病初期の１回目のけいれん等の発作後に、髄液中のＭｏｎｏｃｙｔｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｏｎａｎｔｉｇｅｎＣＤ１４、ＡｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎＥ、Ｇｅｌｓｏｌｉｎ、Ｃｌｕｓｔｅｒｉｎ、及びα２−Ｍａｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎの一種以上の発現変化を診断し、早期治療を行うことで、予後の改善が得られる可能性がある。すなわち、髄液を取得して、本実施形態のバイオマーカーを計測することで、ＡＥＳＤの早期診断により適切な治療が行われ、後遺症が抑えられる可能性がある。
また、従来、ＡＥＳＤの治療は大量のステロイドを投与するステロイドパルス療法が適応であるものの、本実施形態の診断用組成物、診断用キットによりＡＥＳＤでなく「一相性脳症」であると診断された場合、自然軽快が期待される。このため、副作用の可能性のあるステロイドパルス療法をしなくてもよくなる。 Here, conventionally, in AESD, diagnosis is difficult unless a biphasic course is observed, but even after treatment after the onset of the second seizure and consciousness disorder, the prognosis is often not improved. .
On the other hand, with the diagnostic composition and diagnostic kit of the present embodiment, after the first seizure, etc. in the early stage of the disease, monocyte differentiated on antigen CD14, Apolipoprotein E, Gelsolin, Clusterin, and α2-Macroglobulin in cerebrospinal fluid The prognosis may be improved by diagnosing one or more expression changes and performing early treatment. That is, by acquiring cerebrospinal fluid and measuring the biomarker of this embodiment, appropriate treatment can be performed by early diagnosis of AESD, and sequelae can be suppressed.
Conventionally, although steroid pulse therapy in which a large amount of steroid is administered is indicated for the treatment of AESD, it was diagnosed as “monophasic encephalopathy” instead of AESD by the diagnostic composition and diagnostic kit of this embodiment. In case, natural lightening is expected. This eliminates the need for steroid pulse therapy with potential side effects.

ここで、本実施形態の診断用組成物及び診断用キットにおいて、バイオマーカーの各タンパク質の含有量は、公知の測定方法で測定可能である。この測定方法は、抗体を用いた方法及び質量分析法を用いることが可能である。 Here, in the diagnostic composition and diagnostic kit of the present embodiment, the content of each protein of the biomarker can be measured by a known measurement method. As this measurement method, a method using an antibody and a mass spectrometry can be used.

本実施形態のバイオマーカーの含有量を測定する際に抗体を用いる方法としては、例えば、一般的な、ウェスタンブロッティングやＥＬＩＳＡ（酵素免疫吸着測定法）を用いることが可能である。ウェスタンブロッティングは、髄液を必要に応じ緩衝液で希釈し、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を含むバッファーで溶解し、髄液をＳＤＳ−ＰＡＧＥで電気泳動して分子量に応じて分離する方式である。ゲル上の分離したタンパク質をニトロセルロース膜やＰＶＤＦ膜等に転写し、転写した膜をこれに一次抗体および二次抗体を添加し、二次抗体の識別標識を検出することにより、本実施形態のバイオマーカーのタンパク質を検出することが可能である。
また、ＥＬＩＳＡ法は、検出対象タンパク質について、特異的に結合する一次抗体と、この一次抗体に特異的に結合し、かつ標識（ラベル）する二次抗体により検出する方式である。検出は、例えば、それぞれの基質を加えた後、蛍光若しくは化学発光物質または酵素反応による可視光を計測する。 As a method of using an antibody when measuring the content of the biomarker of the present embodiment, for example, general Western blotting or ELISA (enzyme immunosorbent assay) can be used. Western blotting is a system in which cerebrospinal fluid is diluted with a buffer solution as necessary, dissolved in a buffer containing sodium dodecyl sulfate (SDS), and cerebrospinal fluid is electrophoresed by SDS-PAGE and separated according to the molecular weight. The separated protein on the gel is transferred to a nitrocellulose membrane, a PVDF membrane or the like, the primary antibody and the secondary antibody are added to the transferred membrane, and the identification label of the secondary antibody is detected. It is possible to detect biomarker proteins.
The ELISA method is a method in which a detection target protein is detected by a primary antibody that specifically binds and a secondary antibody that specifically binds to and labels (labels) the primary antibody. For the detection, for example, after adding each substrate, visible light by a fluorescent or chemiluminescent substance or an enzyme reaction is measured.

ここで、本実施形態のバイオマーカーのタンパク質を検出する抗体は、ポリクローナル抗体でも、モノクローナル抗体でも、ＶＨ領域やＶＬ領域のみ合成された抗体、ＶＨ領域や接着部位だけ合成された抗体様ペプチド等であってもよい。また、動物由来の抗体の場合には、例えば、ウサギ、ヤギ、マウス、ラット、ブタ、ヒツジ、イヌ、トリ、昆虫、その他の脊椎動物及び無脊椎動物等のものであってもよい。また、植物、酵母、古細菌、及び真正細菌、ｉｎｖｉｔｒｏの合成系等により合成された抗体を用いてもよい。また、抗体の作製は、本実施形態のバイオマーカーのタンパク質を用い、一般の方法で、動物を免疫して作成可能である。また、抗体としてモノクローナル抗体を用いる場合には、ハイブリドーマやファージディスプレイ法等により、一般的な方法で作成することが可能である。 Here, the antibody for detecting the biomarker protein of this embodiment may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody, such as an antibody synthesized only in the VH region or VL region, an antibody-like peptide synthesized only in the VH region or adhesion site, and the like. There may be. In the case of an antibody derived from an animal, for example, it may be a rabbit, goat, mouse, rat, pig, sheep, dog, bird, insect, other vertebrate or invertebrate. Moreover, you may use the antibody synthesize | combined by the plant, yeast, archaea, eubacteria, the in vitro synthesis system, etc. The antibody can be prepared by immunizing an animal by a general method using the biomarker protein of the present embodiment. When a monoclonal antibody is used as the antibody, it can be prepared by a general method such as a hybridoma or a phage display method.

また、本実施形態のバイオマーカーの含有量を測定する際に質量分析法を用いる場合には、高速液体クロマトグラフィー−質量分析計（ＬＣ−ＭＳ）法、ガスクロマトグラフィー−質量分析計（ＧＣ−ＭＳ）法、キャピラリー電気泳動−質量分析計（ＣＥ−ＭＳ）法、ＭＳ／ＭＳ分析、ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦＭＳ分析、ＮＭＲ分析、酸アルカリ中和滴定、アミノ酸分析、酵素法、比色定量法、高速液体クロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィー等の各種の手法を用いることが可能である。 Moreover, when using mass spectrometry when measuring content of the biomarker of this embodiment, a high performance liquid chromatography-mass spectrometer (LC-MS) method, a gas chromatography-mass spectrometer (GC-) MS) method, capillary electrophoresis-mass spectrometer (CE-MS) method, MS / MS analysis, MALDI / TOFMS analysis, NMR analysis, acid-alkali neutralization titration, amino acid analysis, enzyme method, colorimetric method, high-speed liquid Various methods such as chromatography and gas chromatography can be used.

また、本実施形態のバイオマーカーの含有量は、上述の各タンパク質の濃度が上昇しているか、減少しているかについて、特定の閾値や統計的有意性を基に判定することが可能である。この判定により、ＡＥＳＤとして２回目の発作が生じるか否かの危険性を推定することも可能である。 In addition, the content of the biomarker of the present embodiment can be determined based on a specific threshold or statistical significance as to whether the concentration of each protein described above is increasing or decreasing. By this determination, it is also possible to estimate the risk of whether or not the second seizure occurs as AESD.

この本実施形態のバイオマーカーの特定の閾値は、例えば、ＬＣ−ＭＳ法を用いた測定で得られるグラフのピーク面積を標準化した値について、ＡＥＳＤと診断された患者が閾値以上に特定の割合で含まれ、一相性の患者が閾値未満に特定の割合で含まれ、カイ二乗検定値が最も有意となるような値を、各種統計分析プログラム等で算出可能である。また、本実施形態のバイオマーカーの各タンパク質の統計的有意差がある組み合わせについて算出し、この組み合わせについての閾値を設定してもよい。 The specific threshold value of the biomarker of this embodiment is, for example, a value obtained by standardizing the peak area of the graph obtained by measurement using the LC-MS method, and the number of patients diagnosed with AESD at a specific ratio that exceeds the threshold value. It is possible to calculate such a value that the included monophasic patients are included in a specific ratio below the threshold and the chi-square test value is most significant by various statistical analysis programs. Moreover, it calculates about the combination with a statistical significant difference of each protein of the biomarker of this embodiment, and you may set the threshold value about this combination.

また、本実施形態の特定の閾値の設定により、バイオマーカーの感度及び特異度を算出してもよい。この場合の感度とはＡＥＳＤを正常に検出する割合であり、特異度は偽陽性の割合である。感度が低いと実際にＡＥＳＤである患者を正常と判定し辛くなり、得意度が低いとＡＥＳＤを誤判定することが多くなる。また、閾値、感度及び偽陽性率から、受診者動作特性（ＲＯＣ）曲線を求めてもよい。ＲＯＣ曲線の曲線下面積（ＲＯＣ−ＡＵＣ）は、バイオマーカーの性能を示す値である。このＲＯＣ−ＡＵＣのｐ値をｚ検定により算出してもよい。 Further, the sensitivity and specificity of the biomarker may be calculated by setting a specific threshold value in the present embodiment. In this case, the sensitivity is the rate at which AESD is normally detected, and the specificity is the rate of false positives. If the sensitivity is low, it is difficult to determine that the patient who is actually AESD is normal, and if the skill level is low, AESD is often erroneously determined. Moreover, you may obtain | require a patient operating characteristic (ROC) curve from a threshold value, a sensitivity, and a false positive rate. The area under the ROC curve (ROC-AUC) is a value indicating the performance of the biomarker. The p value of ROC-AUC may be calculated by z test.

なお、本実施形態のＡＥＳＤを発症する実験動物（モデル動物）により、ＡＥＳＤの治療に効果がある低分子の化合物等の薬剤をスクリーニングすることも可能である。すなわち、このモデル動物に治療薬の候補である化合物を投与し、投与前後で髄液を取得し、バイオマーカーの各タンパク質の発現量を測定し、比較する。そして、化合物の投与後に、バイオマーカーの各タンパク質の発現量が非ＡＥＳＤの患者の範囲に近づけば、投与した化合物は脳症の治療に効果的に用いられる可能性がある。
このように、本実施形態のバイオマーカーを用いることで、効果がある化合物を容易にスクリーニングすることも可能となる。 In addition, it is also possible to screen for drugs such as low molecular weight compounds that are effective in the treatment of AESD by the experimental animals (model animals) that develop AESD of the present embodiment. That is, a compound that is a therapeutic drug candidate is administered to this model animal, cerebrospinal fluid is obtained before and after the administration, and the expression level of each protein of the biomarker is measured and compared. If the expression level of each protein of the biomarker approaches the range of non-AESD patients after the administration of the compound, the administered compound may be effectively used for the treatment of encephalopathy.
Thus, by using the biomarker of this embodiment, it becomes possible to easily screen for effective compounds.

次に図面に基づき本発明を実施例によりさらに説明するが、以下の具体例は本発明を限定するものではない。 EXAMPLES Next, although an Example demonstrates this invention further based on drawing, the following specific examples do not limit this invention.

〔実験方法〕
（髄液サンプル）
対象は、患者の親権者のインフォームドコンセントを得たＡＥＳＤが３例（年齢：１１か月〜１歳３か月）の髄液（Ｓ１〜Ｓ３）であった。また、比較対象（ｃｏｎｔｒｏｌ）は、一相性脳症が３例（年齢：１１か月〜２歳０か月）の髄液（Ｃ１〜Ｃ３）であった。髄液は、初回けいれん後、１０時間以内（２時間〜１０時間）に採取した。髄液のタンパク濃度は採取直後に計測した。
各患者の臨床症状の特徴は、下記の表１の通りであった。〔experimental method〕
(Cerebrospinal fluid sample)
The subjects were cerebrospinal fluid (S1 to S3) with 3 cases (age: 11 months to 1 year and 3 months) of AESD who obtained informed consent of the parental authority of the patient. Moreover, the cerebrospinal fluid (C1-C3) whose monophasic encephalopathy was 3 cases (age: 11 months-2 years 0 months) was compared with (control). Cerebrospinal fluid was collected within 10 hours (2-10 hours) after the first convulsion. The protein concentration of cerebrospinal fluid was measured immediately after collection.
The characteristics of clinical symptoms of each patient were as shown in Table 1 below.

（２Ｄ−ＤＩＧＥ用タンパク質サンプルの調整）
２Ｄ−ＤＩＧＥに適したタンパク質サンプルとするため、タンパク質３０μｇ分の髄液を２−ＤＣｌｅａｎ−ｕｐＫｉｔ（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を用いて、塩等の夾雑物を除去した。タンパク質サンプルは６μｌのＬｙｓｉｓＢｕｆｆｅｒ［３０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５），７ＭＵｒｅａ，２ＭＴｈｉｏｕｒｅａ，４％（ｗ／ｖ）ＣＨＡＰＳ］で再溶解し、タンパク濃度５μｇ／μｌとした。 (Preparation of protein sample for 2D-DIGE)
In order to obtain a protein sample suitable for 2D-DIGE, impurities such as salt were removed from the cerebrospinal fluid of 30 μg of protein using 2-D Clean-up Kit (manufactured by GE Healthcare). The protein sample was redissolved with 6 μl of Lysis Buffer [30 mM Tris-HCl (pH 8.5), 7M Urea, 2M Thiourea, 4% (w / v) CHAPS] to a protein concentration of 5 μg / μl.

（タンパク質サンプルの蛍光標識）
蛍光試薬として、ＣｙＤｙｅＤＩＧＥｆｌｕｏｒｍｉｎｉｍａｌｄｙｅ −ｆｏｒ２−Ｄｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を用い、標準的なプロトコルに従って、タンパク質サンプルの蛍光標識を行った。各１５μｇ（３μｌ）のタンパク質サンプルに対して、４００ｐｍｏｌのＣｙ３標識試薬乃至Ｃｙ５標識試薬を０．３μｌずつ混合し、暗所、氷上で３０分間静置して標識反応を行った。さらに内部標準として、全てのタンパク質サンプルから５μｇずつ集めた内部標準サンプルプールを作製し、内部標準サンプル３０μｇ（６μｌ）に対して、４００ｐｍｏｌのＣｙ２標準試薬を０．６μｌ混和し、同様に標識反応を行った。標識反応後のサンプルは、１０ｍＭリジンを蛍光標識試薬と等量添加し、氷上で１０分以上静置して反応を停止した。
同一ゲルに添加するタンパク質サンプルを、下記の表２のように混合した。 (Fluorescent labeling of protein samples)
As a fluorescent reagent, CyDye DIGE full minimal dye-for 2-D fluorescence difference gel electrophoresis (manufactured by GE Healthcare) was used, and a protein sample was fluorescently labeled according to a standard protocol. Each 15 μg (3 μl) of protein sample was mixed with 400 μmol of Cy3 labeling reagent to Cy5 labeling reagent 0.3 μl each and allowed to stand for 30 minutes in the dark in ice to carry out the labeling reaction. Furthermore, as an internal standard, an internal standard sample pool in which 5 μg was collected from all protein samples was prepared, and 0.6 μl of 400 pmol of Cy2 standard reagent was mixed with 30 μg (6 μl) of the internal standard sample. went. The sample after the labeling reaction was added with an equal amount of 10 mM lysine and the fluorescent labeling reagent, and left on ice for 10 minutes or more to stop the reaction.
Protein samples added to the same gel were mixed as shown in Table 2 below.

（２Ｄ−ＤＩＧＥ法）
標識反応後、混合した２Ｄ−ＤＩＧＥサンプルは、２ｘｓａｍｐｌｅｂｕｆｆｅｒ［７ＭＵｒｅａ，２ＭＴｈｉｏｕｒｅａ，４％（ｗ／ｖ）ＣＨＡＰＳ，１％（ｖ／ｖ）ＩＰＧＢｕｆｆｅｒｐＨ３−１１ＮＬ（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ社製），２％（ｗ／ｖ）ＤＴＴ］を添加し、氷上で１０分間静置した。これに膨潤ｂｕｆｆｅｒ［７ＭＵｒｅａ，２ＭＴｈｉｏｕｒｅａ，４％（ｗ／ｖ）ＣＨＡＰＳ，０．５％（ｖ／ｖ）ＩＰＧＢｕｆｆｅｒｐＨ３−１１ＮＬ（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ社製），０．２％（ｗ／ｖ）ＤＴＴ，０．０００４％ＢＰＢ］を添加し、総タンパク質量１５０μｇに対して、総液体量が３５０μｌとなるように調整した。
このサンプルを固定化ｐＨ勾配（ＩＰＧ）ゲルであるＩｍｍｏｂｉｌｉｎｅＤｒｙｓｔｒｉｐ１８ｃｍｐＨ３−１１ＮＬ（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）に添加し、等電点電気泳動を行った。等電点電気泳動には、ＥｔｔａｎＩＰＧｐｈｏｒＩｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃＦｏｃｕｓｉｎｇＵｎｉｔ（ＡｍｅｒｓｈａｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用い、サンプルを添加したＩＰＧゲルを２０℃、１２時間膨潤させた後、（１）５００Ｖ，１時間、（２）１０００Ｖ，１時間、（３）８０００Ｖ，８時間のプログラムで３７．５ｋＶｈｒに達するまで泳動した。
等電点電気泳動を行ったＩＰＧゲルは、ＳＤＳ化／還元処理Ｂｕｆｆｅｒ［５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，６ＭＵｒｅａ，３０％（ｖ／ｖ）Ｇｌｙｃｅｒｏｌ，１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ，０．２５％（ｗ／ｖ）ＤＴＴ］中で、１５分間、振盪した後、さらにＳＤＳ化／アルキル化処理Ｂｕｆｆｅｒ［５０ｍＭＴｒｉｓ−Ｈｃｌ，６ＭＵｒｅａ，３０％（ｖ／ｖ）Ｇｌｙｃｅｒｏｌ，１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ，４．５％（ｗ／ｖ）Ｉｏｄｏａｃｅｔａｍｉｄｅ，０．００１％（ｖ／ｖ）ＢＰＢ］中で１５分間振盪し、ＳＤＳ化と還元アルキル化を行った。
２次元目のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動には、ＳＥ６００ＶｅｒｔｉｃａｌＥｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓＳｙｓｔｅｍ（Ｈｏｅｆｅｒ社製）を用いた。無蛍光ガラスプレート（１８ｃｍ×１６ｃｍ）を用いて作製した１２％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上に一次元展開したＩＰＧゲルを設置し、０．５％アガロースゲルで封入した。（１）８００Ｖ，２０ｍＡ，１５分間、（２）１０００Ｖ，６０ｍＡ，５時間のプログラムで、泳動の先端がゲルの底面に達するまで泳動を行った。 (2D-DIGE method)
After the labeling reaction, the mixed 2D-DIGE sample was 2x sample buffer [7M Urea, 2M Thiourea, 4% (w / v) CHAPS, 1% (v / v) IPG Buffer pH 3-11 NL (manufactured by GE Healthcare). ), 2% (w / v) DTT] was added and allowed to stand on ice for 10 minutes. To this, swelling buffer [7M Urea, 2M Thiorea, 4% (w / v) CHAPS, 0.5% (v / v) IPG Buffer pH 3-11 NL (manufactured by GE Healthcare), 0.2% (w / v) DTT, 0.0004% BPB] was added to adjust the total liquid amount to 350 μl with respect to the total protein amount of 150 μg.
This sample was added to Immobiline Drystrip 18 cm pH 3-11 NL (manufactured by GE Healthcare), which was an immobilized pH gradient (IPG) gel, and isoelectric focusing was performed. For isoelectric focusing, Ettan IPGphor Isoelectric Focusing Unit (manufactured by Amersham Biosciences) was used to swell the IPG gel to which the sample was added at 20 ° C. for 12 hours, and then (1) 500 V, 1 hour, (2) The electrophoresis was performed at 1000 V for 1 hour, and (3) 8000 V for 8 hours until reaching 37.5 kVhr.
The IPG gel subjected to isoelectric focusing was subjected to SDS conversion / reduction treatment Buffer [50 mM Tris-HCl, 6M Urea, 30% (v / v) Glycerol, 1% (w / v) SDS, 0.25% ( w / v) DTT] for 15 minutes and then SDS / alkylated buffer [50 mM Tris-Hcl, 6M Urea, 30% (v / v) Glycerol, 1% (w / v) SDS , 4.5% (w / v) Iodoacetamide, 0.001% (v / v) BPB] for 15 minutes to perform SDS and reductive alkylation.
SE600 Vertical Electrophoresis System (manufactured by Hoefer) was used for the second-dimensional SDS-polyacrylamide gel electrophoresis. An IPG gel developed one-dimensionally was placed on a 12% SDS-polyacrylamide gel prepared using a non-fluorescent glass plate (18 cm × 16 cm), and sealed with 0.5% agarose gel. Electrophoresis was performed with a program of (1) 800 V, 20 mA, 15 minutes, (2) 1000 V, 60 mA, 5 hours until the tip of the electrophoresis reached the bottom of the gel.

（画像解析及び発現差異解析）
２Ｄ−ＤＩＧＥゲルは、Ｔｙｐｈｏｏｎ９４１０（ＡｍｅｒｓｈａｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いて、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ５の蛍光色素に対応する励起光／蛍光フィルター（Ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ／ＥｍｉｓｓｉｏｎＣｙ２＝４８８／５２２ｎｍ，Ｃｙ３＝５３２／５８０ｎｍ，Ｃｙ５＝６３３／６７０ｎｍ）で蛍光標識タンパク質ゲル画像を取得した（ＰｉｘｅｌＳｉｚｅ＝１００μｍ）。
画像解析には、二次元電気泳動ゲル画像解析ソフトウェアであるＰｒｏｇｅｎｅｓｉｓＳａｍｅＳｐｏｔｓ（ＮｏｎｌｉｎｅａｒＤｙｎａｍｉｃｓ社製）を用い、ゲル画像の歪み補正とゲル間のスポットマッチングを行った。スポットマッチングとは、複数のゲルで同一位置に存在するスポットを検出することであり、対応するスポットがないものや適切なスポットの形態をなしていないものは解析から除外した。最終的にすべてのスポットについて、適切なマッチングができているか手動で確認した。そして、すべてのゲル画像に共通して存在するスポットを同定し、内部標準サンプルを介した定量値の標準化、Ａｎｏｖａによる有意差検定を行った。 (Image analysis and differential expression analysis)
2D-DIGE gel was obtained by using Typhoon 9410 (Amersham Biosciences), excitation light / fluorescence filter corresponding to fluorescent dyes of Cy2, Cy3, Cy5 (Excitation / Emission Cy2 = 488/522 nm, Cy3 = 532/580 nm). , Cy5 = 633/670 nm), fluorescence-labeled protein gel images were acquired (Pixel Size = 100 μm).
For image analysis, two-dimensional electrophoresis gel image analysis software, Progenesis SameSpots (manufactured by Nonlinear Dynamics), was used to correct distortion of the gel image and perform spot matching between the gels. Spot matching refers to detecting spots that exist at the same position in a plurality of gels, and those that do not have a corresponding spot or that do not have an appropriate spot form are excluded from the analysis. Finally, all the spots were manually checked for proper matching. And the spot which exists in common in all the gel images was identified, the standardization of the quantitative value through the internal standard sample, and the significant difference test by Anova were performed.

（質量分析用サンプルの調整とゲル内消化）
２Ｄ−ＤＩＧＥ解析に使用したサンプルと同様に調整したタンパク質サンプル１５０μｇを用いて、上述の方法で二次元電気泳動を行い、質量分析用ゲルを作成した。質量分析用ゲルは、固定液［４０％（ｖ／ｖ）ｅｔｈａｎｏｌ、１０％（ｖ／ｖ）ａｃｅｔｉｃａｃｉｄ］中で１８時間振盪し、固定した後、ＦｌａｍｉｎｇｏＦｌｕｏｒｓｃｅｎｔＧｅｌＳｔａｉｎ（Ｂｉｏ−ＲａｄＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）染色液（１ｘ）中で３時間、遮光、振盪して、染色した。次に染色後の質量分析用ゲルから、ＦｌｕｏｒｏＰｈｏｒｅｓｔａｒ３０００（Ａｎａｔｅｃｈ社製）を用いて、タンパク質スポットの切り出しを行った。発現差異のあったタンパク質スポットを直径１．８ｍｍのゲルピッカーで切り出し、回収した。ゲル片は超純水とアセトニトリルで洗浄した後、減圧下で乾燥させた。次にゲル片に１０ｍＭＤＴＴ／１００ｍＭＮＨ₄ＨＣＯ₃溶液を加え、５６度で４５分間反応させた後、５５ｍＭＩｏｄｏａｃｅｔａｍｉｄｅ／１００ｍＭＮＨ₄ＨＣＯ₃溶液を加え、室温で３０分間反応させ、還元アルキル化を行った。ゲル片を再度、超純水、アセトニトリル、１００ｍＭＮＨ₄ＨＣＯ₃で洗浄、乾燥させた後、トリプシン溶液（１２．５ｎｇ／μｌトリプシン、５０ｍＭＮＨ₄ＨＣＯ₃）を添加し、氷上で４５分間静置した。続いて溶液を除去し、５０ｍＭＮＨ₄ＨＣＯ₃を加えて、３７℃で１６時間反応させた。トリプシンによってゲル内で消化されたペプチド断片は、２５ｍＭＮＨ₄ＨＣＯ₃、アセトニトリル、５％（ｖ／ｖ）ギ酸で回収し、減圧下で乾燥させた。 (Sample preparation for mass spectrometry and in-gel digestion)
Using 150 μg of a protein sample prepared in the same manner as the sample used for 2D-DIGE analysis, two-dimensional electrophoresis was performed by the method described above to prepare a gel for mass spectrometry. The gel for mass spectrometry was shaken in a fixative [40% (v / v) ethanol, 10% (v / v) acetic acid] for 18 hours, fixed, and then Flamingo Fluorscent Gel Stain (manufactured by Bio-Rad Laboratories). ) Staining was carried out in a staining solution (1 ×) for 3 hours by shading and shaking. Next, protein spots were cut out from the stained gel for mass spectrometry using FluoroPhorestar 3000 (manufactured by Anatech). Protein spots with different expression were cut out with a gel picker having a diameter of 1.8 mm and collected. The gel piece was washed with ultrapure water and acetonitrile and then dried under reduced pressure. Next, 10 mM DTT / 100 mM NH ₄ HCO ₃ solution was added to the gel piece and reacted at 56 ° C. for 45 minutes, then 55 mM Iodoacetamide / 100 mM NH ₄ HCO ₃ solution was added, and reacted at room temperature for 30 minutes to reduce the alkylation. went. The gel piece was again washed with ultrapure water, acetonitrile, 100 mM NH ₄ HCO ₃ , dried, and then a trypsin solution (12.5 ng / μl trypsin, 50 mM NH ₄ HCO ₃ ) was added and left on ice for 45 minutes. did. Subsequently, the solution was removed, 50 mM NH ₄ HCO ₃ was added, and the mixture was reacted at 37 ° C. for 16 hours. Peptide fragments digested in gel with trypsin were recovered with 25 mM NH ₄ HCO ₃ , acetonitrile, 5% (v / v) formic acid and dried under reduced pressure.

（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳとＭＳ／ＭＳｉｏｎｓｅａｒｃｈによるタンパク質同定）
ペプチド断片抽出液は、液体クロマトグラフ／タンデム質量分析装置として高速液体クロマトグラフＰａｒａｄｉｇｍＭＳ４（ＭｉｃｈｒｏｍＢｉｏＲｅｓｏｕｒｃｅｓ社製）及び質量分析装置ＦｉｎｎｉｇａｎＬＴＱ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を使用して、抽出液に含まれるペプチド断片の質量分析を行った。サンプルは、トラップカートリッジ（ＰｅｐｔｉｄｅＣａｐＴｒａｐ，ＭｉｃｈｒｏｍＢｉｏＲｅｓｏｕｒｃｅｓ社製）によりオンラインで脱塩・濃縮処理を行った後、ＬＣ部に導入した。ＬＣ部では、流速１５０μｌ／ｍｉｎで、固定相にＬ−ｃｏｌｕｍｎＭｉｃｒｏ（０．１×５０ｍｍ、３μｍ、１２ｎｍ、化学物質評価研究機構社製）、移動相にＡ溶媒（２％アセトニトリル、０．１％ギ酸）とＢ溶媒（９０％アセトニトリル、０．１％ギ酸）を使用し、Ｂ溶媒の濃度を５％（０ｍｉｎ）から４５％（２０ｍｉｎ）まで直線勾配で上げ、ペプチド断片を連続的に溶出した。ペプチド断片は、ＭＳ部において、エレクトロスプレー法によるイオン化を行った後、イオントラップによって分離し、ＭＳスペクトル（質量範囲ｍ／ｚ４５０−２０００）を取得した。さらに特定のｍ／ｚのイオン（プリカーサーイオン）を選択し、このイオンの衝突誘起解離によって生じるプロダクトイオンのＭＳ／ＭＳスペクトル（ＭＳ／ＭＳ解析）を取得した。得られたＭＳスペクトル及びＭＳ／ＭＳスペクトルについては、タンパク質同定解析ソフトＭＡＳＣＯＴＴＭ（ＭａｔｒｉｘＳｃｉｅｎｃｅ社製）に供し、ＭＳ／ＭＳｉｏｎｓｅａｒｃｈによるタンパク質同定を行った。なおタンパク質データベースとして、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔを使用した。 (Protein identification by LC-MS / MS and MS / MS ion search)
The peptide fragment extract is contained in the extract using a high-performance liquid chromatograph Paradigm MS4 (manufactured by Michrom BioResources) and a mass spectrometer Finnigan LTQ (manufactured by Thermo Fisher Scientific) as a liquid chromatograph / tandem mass spectrometer. Mass spectrometry of peptide fragments was performed. The sample was desalted and concentrated online with a trap cartridge (Peptide Cap Trap, manufactured by Chrome BioResources), and then introduced into the LC section. In the LC section, the flow rate was 150 μl / min, the stationary phase was L-column Micro (0.1 × 50 mm, 3 μm, 12 nm, manufactured by Chemical Substances Research Institute), and the mobile phase was A solvent (2% acetonitrile, 0.1%). % Formic acid) and B solvent (90% acetonitrile, 0.1% formic acid), increasing the concentration of B solvent from 5% (0 min) to 45% (20 min) with a linear gradient to elute peptide fragments continuously did. Peptide fragments were ionized by electrospray method in the MS part and then separated by an ion trap to obtain an MS spectrum (mass range m / z 450-2000). Further, a specific m / z ion (precursor ion) was selected, and an MS / MS spectrum (MS / MS analysis) of a product ion generated by collision-induced dissociation of the ion was obtained. The obtained MS spectrum and MS / MS spectrum were subjected to protein identification analysis software MASCOTTM (manufactured by Matrix Science), and protein identification by MS / MS ion search was performed. Swiss-Prot was used as the protein database.

（候補タンパク質抽出）
同定タンパク質をＡＥＳＤで増加したタンパク質、減少したタンパク質に分け、Ｓｃａｆｆｏｌｄ（ＰｒｏｔｅｏｍｅＳｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｒｏｔｅｏｍｅｓｏｆｔｗａｒｅ．ｃｏｍ）を用いて、ＧＯ（ＧｅｎｅＯｎｔｏｌｏｇｙ）解析を行いこれらがどのような機能、特徴を有するかを検討し、バイオマーカーの候補となるタンパク質を抽出した。 (Candidate protein extraction)
The identified proteins are divided into proteins increased or decreased by AESD, and Scaffold (Proteome Software, Inc., http://www.proteomesoftware.com) is used to perform GO (Gene Ontology) analysis. We examined whether it has a function and a feature, and extracted a protein as a biomarker candidate.

〔結果〕
（２Ｄ−ＤＩＧＥを用いた網羅的なタンパク質発現解析と有意差を示すタンパク質スポットの同定）
図１に示すように、上記方法にてＡＥＳＤ症例の髄液、一相性脳症症例の髄液から抽出したタンパク質を２Ｄ−ＤＩＧＥによって分離し、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ５の蛍光色素に対応する励起画像を取得した結果、それぞれのゲル画像においてタンパク質スポットを検出した。この検出スポットについて、スポットマッチングを行い、すべてのゲル画像において共通して存在するタンパク質スポット（マッチングスポット）を１１６３個同定した。
このマッチングスポットについて、発現差異解析を行ったところ、ＡＥＳＤと一相性脳症との間に１．３倍以上の発現量の有意差を認めたタンパク質スポットを２１個同定した。また、目視で２群に差があると思われたタンパク質スポットを２個、計２３個を同定した。〔result〕
(Comprehensive protein expression analysis using 2D-DIGE and identification of protein spots showing significant differences)
As shown in FIG. 1, proteins extracted from the cerebrospinal fluid of AESD cases and the cerebrospinal fluid of monophasic encephalopathy cases by the above method are separated by 2D-DIGE, and excitation images corresponding to fluorescent dyes of Cy2, Cy3, and Cy5 As a result, protein spots were detected in each gel image. This detection spot was spot-matched to identify 1163 protein spots (matching spots) that exist in common in all gel images.
When expression difference analysis was performed on this matching spot, 21 protein spots were identified that showed a significant difference in expression level of 1.3 times or more between AESD and monophasic encephalopathy. Further, two protein spots that were considered to be visually different between the two groups were identified, for a total of 23 protein spots.

（ＡＥＳＤ髄液で発現差異を認めたタンパク質の同定）
発現差異を認めたタンパク質スポットについては、質量分析用ゲルからスポットの切り出しを行い、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳとＭＳ／ＭＳｉｏｎｒｅｓｅａｒｃｈによるタンパク質同定を行った。発現差異を認めた２３個のタンパク質スポットのうち、１６個のスポットで解析が可能であった。同定したタンパク質の重複を除いた１１種類のタンパク質について、解析ソフトウェア「Ｓｃａｆｆｏｌｄ」を用いてＧＯ解析を行った。７種類はＡＥＳＤで発現が増加し、他の４種類のタンパク質はＡＥＳＤで発現が減少していた。
これらのタンパク質、発現増加の割合、ａｎｏｖａの算出結果等を、下記の表３に示す： (Identification of protein with differential expression in AESD cerebrospinal fluid)
For protein spots in which expression differences were observed, the spots were excised from the gel for mass spectrometry, and protein identification was performed by LC-MS / MS and MS / MS ion research. The analysis was possible in 16 spots among 23 protein spots in which the expression difference was recognized. With respect to 11 types of proteins excluding duplication of the identified proteins, GO analysis was performed using analysis software “Scaffold”. Seven types had increased expression by AESD and the other four types had decreased expression by AESD.
These proteins, the rate of expression increase, the results of annova calculation, etc. are shown in Table 3 below:

具体的には、ＡＥＳＤで発現が上昇したタンパク質は、ＭｏｎｏｃｙｔｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎａｎｔｉｇｅｎＣＤ１４（図１の符号Ｅ、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ：Ｐ０８５７１）、Ｉｇ γ−１ｃｈａｉｎＣｒｅｇｉｏｎ（図１の符号Ａ、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ：Ｐ０１８５７．１）、Ｉｇ γ−２ｃｈａｉｎＣｒｅｇｉｏｎ（図１の符号Ｂ、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ：Ｐ０１８５９．２）、Ｉｇ κ ｃｈａｉｎＶ−Ｉｒｅｇｉｏｎ（図１の符号Ｃ）、Ｉｇ κ ｃｈａｉｎＶ−ＩＩＩｒｅｇｉｏｎ（図１の符号Ｃ、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ：Ｐ０１６２０．１）、Ｉｇ λ−２ｃｈａｉｎＣｒｅｇｉｏｎ（図１の符号Ｄ、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ：Ｐ０ＣＧ０５．１）、ＩｇｈｅａｖｙｃｈａｉｎＶ−ＩＩＩｒｅｇｉｏｎ（ＰＩＲ：Ｓ３４０１２）であった。
また、ＡＥＳＤで低下したタンパク質は、ＡｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎＥ（図１の符号ａ、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ：Ｐ０２６４９）、Ｇｅｌｓｏｌｉｎ（図１の符号ｂ、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ：Ｐ０６３９６）、Ｃｌｕｓｔｅｒｉｎ（図１の符号ｃ、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ：Ｐ１０９０９）、α２−Ｍａｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ（図１の符号ｄ、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ：Ｐ０１０２３）であった。 Specifically, the proteins with increased expression by AESD include Monocyte differentiation antigen CD14 (symbol E in FIG. 1, UniProtKB / Swiss-Prot: P08571), Ig γ-1 chain C region (symbol A in FIG. 1, UniProtKB / Swiss-Prot: P01857.1), Ig γ-2 chain C region (symbol B in FIG. 1, UniProtKB / Swiss-Prot: P018859.2), Ig κ chain V-I region (symbol C in FIG. 1), Ig κ chain V-III region (symbol C in FIG. 1, UniProtKB / Swiss-Prot: P01620.1), Ig λ-2 chain C region (symbol D in FIG. 1, UniProtKB / wiss-Prot: P0CG05.1), Ig heavy chain V-III region (PIR: S34012) was.
Proteins decreased by AESD are Apolipoprotein E (reference symbol a in FIG. 1, UniProtKB / Swiss-Prot: P02649), Gelsolin (reference symbol b in FIG. 1, UniProtKB / Swiss-Prot: P06396), Clusterin (reference symbol in FIG. 1). c, UniProtKB / Swiss-Prot: P10909), α2-Macrobulin (symbol d in FIG. 1, UniProtKB / Swiss-Prot: P01023).

以下に同定されたタンパク質の特徴を示す。
いずれのタンパク質も細胞外に局在する性質を有した。特にＡＥＳＤで上昇したタンパク質群は、炎症（免疫応答）に関連するタンパク質であった。一方、ＡＥＳＤで低下するタンパク質群として、ＧＳＮ（Ｇｅｌｓｏｌｉｎ）は繊毛形成に関与し、ＣＬＵ（Ｃｌｕｓｔｅｒｉｎ）は細胞外シャペロンとして働き、ストレス誘導性のタンパク質凝集を阻害する。ＡｐｏＥ（ＡｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎＥ）は抗酸化作用を示し、アミロイドβやｔａｕの重合を阻害する。Ａ２Ｍ（α２−Ｍａｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）はプロテアーゼの阻害作用を有する。興味深いことにＡｐｏＥとＡ２Ｍは同じレセプターＬＲＰ−１（ＵｎｉＰｒｏｔＩＤ：Ｑ０７９５４）を共有している。ＬＲＰ−１は肝臓、肺臓以外に脳にも多く発現しており、神経機能にも関与している。 The characteristics of the identified protein are shown below.
All proteins had the property of being localized extracellularly. In particular, the protein group elevated by AESD was a protein related to inflammation (immune response). On the other hand, as a protein group that decreases with AESD, GSN (Gelsolin) is involved in cilia formation, and CLU (Clusterin) acts as an extracellular chaperone to inhibit stress-induced protein aggregation. ApoE (Apolipoprotein E) exhibits an antioxidant action and inhibits the polymerization of amyloid β and tau. A2M (α2-Macroglobulin) has a protease inhibitory action. Interestingly, ApoE and A2M share the same receptor LRP-1 (UniProt ID: Q07954). LRP-1 is highly expressed in the brain in addition to the liver and lungs, and is also involved in nerve function.

なお、上記実施の形態の構成及び動作は例であって、本発明の趣旨を逸脱しない範囲で適宜変更して実行することができることは言うまでもない。 Note that the configuration and operation of the above-described embodiment are examples, and it is needless to say that the configuration and operation can be appropriately changed and executed without departing from the gist of the present invention.

本発明の脳症の検出方法、バイオマーカー、診断用組成物、及び診断用キットは、医師以外の検査技師等がＡＥＳＤの検出に用いることができ、産業上に利用することができる。 The encephalopathy detection method, biomarker, diagnostic composition, and diagnostic kit of the present invention can be used for detection of AESD by laboratory technicians other than doctors, and can be used industrially.

Claims

A method for detecting encephalopathy,
Monocytic differentiation antigen CD14, Apolipoprotein E, Gelsolin, Clusterin, and α2-Macroglobulin in the cerebrospinal fluid with changes in expression level as an index A method for detecting encephalopathy, comprising detecting

The indicator is
The method for detecting encephalopathy according to claim 1, wherein the expression level is increased for Monocyte differentiation antigen CD14, and the expression level is decreased for Apolipoprotein E, Gelsolin, Clusterin, and α2-Macroglobulin.

A biomarker for the diagnosis of convulsive intussusception (biphasic) acute encephalopathy,
A biomarker characterized by being one or more protein markers of the group consisting of Monocyte differentiation antigen CD14, Apolipoprotein E, Gelsolin, Clusterin, and α2-Macrobululin in cerebrospinal fluid.

A diagnostic composition for diagnosing convulsive intussusception (biphasic) acute encephalopathy,
A diagnostic composition comprising an antibody that specifically binds to one or more proteins of the group consisting of Monocyte differentiation antigen CD14, Apolipoprotein E, Gelsolin, Clusterin, and α2-Macroglobulin.

A diagnostic kit for diagnosing convulsive intussusception (biphasic) acute encephalopathy,
A diagnostic kit comprising an antibody that specifically binds to one or more proteins of the group consisting of Monocyte differentiation antigen CD14, Apolipoprotein E, Gelsolin, Clusterin, and α2-Macroglobulin.