JP2018186830A - 酵素構築物 - Google Patents

Abstract

【課題】膜貫通ポア（ナノポア）を用いた、ポリヌクレオチド配列決定及び同定技術の提供。【解決手段】（ａ）標的ポリヌクレオチドを膜貫通ポア並びにヘリカーゼ及び追加的ポリヌクレオチド結合成分を含む構築物と、構築物がポアを通る標的ポリヌクレオチドの移動を制御するように接触させるステップであって、ヘリカーゼがポリヌクレオチド結合成分に付着されており、構築物がポリヌクレオチドの移動を制御する能力を有するステップ、並びに（ｂ）ポリヌクレオチドがポアに関して移動するときに１つ又は複数の測定値を取るステップであって、測定値が標的ポリヌクレオチドの１つ又は複数の特性を示し、それにより標的ポリヌクレオチドを特性決定するステップを含む方法。【選択図】なし

Description

本発明は、ヘリカーゼおよび追加的ポリヌクレオチド結合成分を含む構築物を使用する
方法に関する。ヘリカーゼは、ポリヌクレオチド結合成分に付着されており、構築物はポ
リヌクレオチドの移動を制御する能力を有する。構築物は、ポリヌクレオチドの移動を制
御するために使用でき、ポリヌクレオチドを配列決定するために特に有用である。

迅速で安価なポリヌクレオチド（例えばＤＮＡまたはＲＮＡ）配列決定および同定技術
が、幅広い応用にわたって現在必要である。既存の技術は、主にそれらが、大量のポリヌ
クレオチドを生成するための増幅技術に依存し、シグナル検出のために多量の専門的な蛍
光化学物質を必要とするために、遅く高価である。

膜貫通ポア（ナノポア）は、ポリマーおよび種々の小分子のための直接的、電気的バイ
オセンサーとして大きな将来性を有する。特に、将来性のあるＤＮＡ配列決定技術として
ナノポアが近年注目されている。

電位がナノポア全体に印加される場合、ヌクレオチドなどの分析物が一定時間バレルに
一過的に存在する場合に電流が変化する。ヌクレオチドのナノポア検出は、既知のサイン
および持続時間での電流変化をもたらす。「鎖配列決定」法では、１本のポリヌクレオチ
ド鎖がポアを通り、ヌクレオチドのアイデンティティが得られる。鎖配列決定は、ポアを
通るポリヌクレオチドの移動を制御するためのヌクレオチドハンドリングタンパク質の使
用を含み得る。

本発明者らは、２つ以上のヘリカーゼを互いに付着させるなどヘリカーゼに追加的ポリ
ヌクレオチド結合成分を付着することが、ポリヌクレオチドの移動を制御する改善された
能力を有する構築物を生じることを驚くべきことに実証した。具体的には本発明者らは、
そのような構築物が４００ヌクレオチド以上を含むポリヌクレオチドなどの長いポリヌク
レオチドに強く結合し、全てではないが大部分のポリヌクレオチドの移動を離れることな
く制御することを驚くべきことに実証した。これは、ポリヌクレオチドの移動の有効な制
御を、特に鎖配列決定法の際に可能にする。

したがって、本発明は、標的ポリヌクレオチドを特性決定する方法であって、
（ａ）標的ポリヌクレオチドを膜貫通ポアならびにヘリカーゼおよび追加的ポリヌクレオ
チド結合成分を含む構築物と、構築物がポアを通る標的ポリヌクレオチドの移動を制御す
るように接触させるステップであって、ヘリカーゼがポリヌクレオチド結合成分に付着さ
れており、構築物がポリヌクレオチドの移動を制御する能力を有するステップ、ならびに
（ｂ）ポリヌクレオチドがポアに関して移動するときに１つまたは複数の測定値を取るス
テップであって、測定値が標的ポリヌクレオチドの１つまたは複数の特性を示し、それに
より標的ポリヌクレオチドを特性決定するステップを含む方法
を提供する。

本発明は、
− ２つ以上のヘリカーゼを含む構築物であって、ヘリカーゼが互いに付着しており、構
築物がポリヌクレオチドの移動を制御する能力を有する構築物；
− 本発明の構築物をコードしているポリヌクレオチド配列であって、２つ以上のヘリカ
ーゼが遺伝子的に融合されているポリヌクレオチド配列；
− ポリヌクレオチドの移動を制御する方法であって、ポリヌクレオチドを本発明の構築
物に接触させ、それによりポリヌクレオチドの移動を制御するステップを含む方法；
− 標的ポリヌクレオチドを特性決定するためのセンサーを形成する方法であって、ポア
と、上で定義した構築物との間で複合体を形成し、それにより標的ポリヌクレオチドを特
性決定するためのセンサーを形成するステップを含む方法；
− ポアと、上で定義した構築物との間の複合体を含む、標的ポリヌクレオチドを特性決
定するためのセンサー；
− ポアを通る標的ポリヌクレオチドの移動を制御するための、上で定義した構築物の使
用；
− （ａ）ポア、および（ｂ）上で定義した構築物を含む、標的ポリヌクレオチドを特性
決定するためのキット；
− 複数のポア、および上で定義した複数の構築物を含む、試料中の標的ポリヌクレオチ
ドを特性決定するための装置；ならびに
− 本発明の構築物を産生する方法であって、２つ以上のヘリカーゼを一緒に付着させ、
それにより構築物を産生するステップを含む方法
も提供する。

いくつかのＨｅｌ３０８Ｍｂｕヘリカーゼ構築物の単量体および二量体のゲルを示す図である。レーン１および６は適切なタンパク質ラダーを示す。レーン２はＨｅｌ３０８Ｍｂｕ（Ｒ６８７Ａ／Ａ７００Ｃ）単量体（変異Ｒ６８７Ａ／Ａ７００Ｃを有する配列番号１０）に対応し、レーン３はＨｅｌ３０８Ｍｂｕ（Ｒ６８１Ａ／Ｒ６８７Ａ／Ａ７００Ｃ）単量体（変異Ｒ６８１Ａ／Ｒ６８７Ａ／Ａ７００Ｃを有する配列番号１０）に対応し、レーン４はＨｅｌ３０８Ｍｂｕ（Ｒ６８７Ａ／Ａ７００Ｃ）−２ｋＤａ二量体（ここで各単量体単位は変異Ｒ６８７Ａ／Ａ７００Ｃを有する配列番号１０を含み、１つの単量体単位は２ｋＤａ ＰＥＧリンカーを使用して各単量体単位の位置７００を介して他に連結されている）に対応し、レーン５はＨｅｌ３０８Ｍｂｕ（Ｒ６８１Ａ／Ｒ６８７Ａ／Ａ７００Ｃ）−２ｋＤａ二量体（ここで各単量体単位は変異Ｒ６８１Ａ／Ｒ６８７Ａ／Ａ７００Ｃを有する配列番号１０を含み、１つの単量体単位は２ｋＤａ ＰＥＧリンカーを使用して各単量体単位の位置７００を介して他に連結されている）に対応する。Ａと標識したバンドは単量体に対応し、Ｂと標識したバンドは二量体に対応する。 Ｈｅｌ３０８ Ｍｈｕ多量体のゲルを示す図である。レーン１は適切なタンパク質ラダーを示し、レーン２はＨｅｌ３０８ Ｍｈｕ多量体（配列番号１９の複数単位）に対応する。 形成および精製の際の種々の段階でのＨｅｌ３０８ Ｔｇａ（Ｒ６５７Ａ／Ｎ６７４Ｃ）−２ｋＤａ二量体および単量体のゲルを示す図である（レーン１＝タンパク質ラダー、レーン２＝Ｈｅｌ３０８ Ｔｇａ（Ｒ６５７Ａ／Ｎ６７４Ｃ）−２ｋＤａ二量体、９０℃、１０分間での加熱後、レーン３＝Ｈｅｌ３０８ Ｔｇａ（Ｒ６５７Ａ／Ｎ６７４Ｃ）−２ｋＤａ二量体（ここで各単量体単位は変異Ｒ６５７Ａ／Ｎ６７４Ｃを有する配列番号１６を含み、１つの単量体単位は２ｋＤａ ＰＥＧリンカーを使用して各単量体単位の位置６７４を介して他に連結されている）、レーン４＝Ｓｔｒｅｐ−Ｔａｃｔｉｎ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ精製からの溶出ピーク、レーン５＝初期反応混合物およびレーン６＝Ｈｅｌ３０８ Ｔｇａ（Ｒ６５７Ａ／Ｎ６７４Ｃ）単量体（変異Ｒ６５７Ａ／Ｎ６７４Ｃを有する配列番号１６））。Ａと標識したバンドは単量体に対応し、Ｂと標識したバンドは二量体に対応する。 ヘリカーゼ／ＤＮＡ結合を検査するための蛍光アッセイを示す図である。通例の蛍光基質が、１本鎖ＤＮＡに結合する種々のヘリカーゼの能力をアッセイするために使用された。８８ｎｔ１本鎖ＤＮＡ基質（最終１ｎＭ、配列番号６９、Ａと標識）は、その５’末端にカルボキシフルオレセイン（carboxyfluorescein）（ＦＡＭ）塩基を有する（円、Ｂと標識）。ヘリカーゼ（Ｃと標識）が緩衝溶液（４００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ８．０、１ｍＭ ＭｇＣｌ_２）中のオリゴヌクレオチドに結合することから、蛍光偏光（溶液中のオリゴヌクレオチドの自由回転の速度に関連する特性）は増大する。偏光を増大させるために必要なヘリカーゼの量が少ないほど、ＤＮＡとヘリカーゼとの間の結合親和性は強い。酵素が結合していない状態１がより早い回転および低い偏光を有する一方で、酵素が結合している状態２はより遅い回転および高い偏光を有する。Ｘと標識の黒いバーは、ヘリカーゼ濃度の増加に対応する（バーが厚いほどヘリカーゼ濃度は高い）。 種々のＨｅｌ３０８Ｍｂｕ構築物の量を増加させてＤＮＡオリゴヌクレオチド（配列番号６９、その５’末端にカルボキシフルオレセイン塩基を有する）の偏光における変化を示す図である（ｙ軸標識＝偏光（ブランク減算）、ｘ軸標識＝タンパク質濃度（ｎＭ））。黒四角点でのデータはＨｅｌ３０８Ｍｂｕ単量体（配列番号１０）に対応する。空丸でのデータはＨｅｌ３０８Ｍｂｕ Ａ７００Ｃ ２ｋＤａ二量体（ここで各単量体単位は変異Ａ７００Ｃを有する配列番号１０を含み、１つの単量体単位は２ｋＤａ ＰＥＧリンカーを使用して各単量体単位の位置７００を介して他に連結されている）に対応する。偏光を増大させるためにより低い濃度のＨｅｌ３０８Ｍｂｕ Ａ７００Ｃ ２ｋＤａ二量体が必要であることから、二量体は単量体よりもＤＮＡに対する高い結合親和性を有する。 種々のＨｅｌ３０８（Ｍｂｕ）構築物の量を増加させてＤＮＡオリゴヌクレオチド（配列番号６９、その５’末端にカルボキシフルオレセイン塩基を有する）の偏光における変化を示す図である（ｙ軸標識＝偏光（ブランク減算）、ｘ軸標識＝タンパク質濃度（ｎＭ））。黒四角点でのデータはＨｅｌ３０８Ｍｂｕ単量体（配列番号１０）に対応する。空丸でのデータはＨｅｌ３０８Ｍｂｕ−ＧＴＧＳＧＡ−（ＨｈＨ）２（ここでヘリカーゼ単量体単位（配列番号１０）はリンカー配列ＧＴＧＳＧＡによってＨｈＨ２ドメイン（配列番号７５）に付着されている）に対応し、空三角でのデータはＨｅｌ３０８Ｍｂｕ−ＧＴＧＳＧＡ−（ＨｈＨ）２−（ＨｈＨ）２（ここでヘリカーゼ単量体単位（配列番号１０）はリンカー配列ＧＴＧＳＧＡによって（ＨｈＨ）２−（ＨｈＨ）２ドメイン（配列番号７６）に付着されている）に対応する。付着している追加的ヘリックス−ヘアピン−ヘリックス結合ドメインを有するＨｅｌ３０８Ｍｂｕヘリカーゼは、単量体よりも低い濃度で偏光における増大を示す。これは、追加的結合ドメインを有するＨｅｌ３０８Ｍｂｕ構築物が単量体よりも強い結合親和性をＤＮＡに対して有することを示唆している。４個のＨｈＨドメインを有するＨｅｌ３０８Ｍｂｕ−ＧＴＧＳＧＡ−（ＨｈＨ）２−（ＨｈＨ）２が、２個のＨｈＨドメインだけを有するＨｅｌ３０８Ｍｂｕ−ＧＴＧＳＧＡ−（ＨｈＨ）２よりもさらに強くＤＮＡに結合することが観察された。 種々のＨｅｌ３０８（Ｍｂｕ）構築物の量を増加させてＤＮＡオリゴヌクレオチド（配列番号６９、その５’末端にカルボキシフルオレセイン塩基を有する）の偏光における変化を示す図である（ｙ軸標識＝偏光（ブランク減算）、ｘ軸標識＝タンパク質濃度（ｎＭ））。黒四角点のデータはＨｅｌ３０８Ｍｂｕ単量体（配列番号１０）に対応する。空丸でのデータはＨｅｌ３０８Ｍｂｕ−ＧＴＧＳＧＡ−ＵＬ４２ＨＶ１−Ｉ３２０Ｄｅｌ（ヘリカーゼ単量体単位（配列番号１０）はリンカー配列ＧＴＧＳＧＡによってＵＬ４２ＨＶ１−Ｉ３２０Ｄｅｌ（配列番号６３）に付着されている）に対応し、上向き空三角でのデータはＨｅｌ３０８Ｍｂｕ−ＧＴＧＳＧＡ−ｇｐ３２ＲＢ６９ＣＤ（ヘリカーゼ単量体単位（配列番号１０）はリンカー配列ＧＴＧＳＧＡによってｇｐ３２ＲＢ６９ＣＤ（配列番号６４）に付着されている）に対応し、下向き空三角でのデータはＨｅｌ３０８Ｍｂｕ−ＧＴＧＳＧＡ−ｇｐ２．５Ｔ７−Ｒ２１１Ｄｅｌ（ヘリカーゼ単量体単位（配列番号１０）がリンカー配列ＧＴＧＳＧＡによってｇｐ２．５Ｔ７−Ｒ２１１Ｄｅｌ（配列番号６５）に付着されている）に対応する。付着している追加的結合ドメインを有する全てのＨｅｌ３０８Ｍｂｕヘリカーゼ（Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ−ＧＴＧＳＧＡ−ＵＬ４２ＨＶ１−Ｉ３２０Ｄｅｌ、Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ−ＧＴＧＳＧＡ−ｇｐ３２ＲＢ６９ＣＤおよびＨｅｌ３０８Ｍｂｕ−ＧＴＧＳＧＡ−ｇｐ２．５Ｔ７−Ｒ２１１Ｄｅｌ）は、単量体よりも低い濃度で偏光における増大を示す。これは、追加的結合ドメインを有するＨｅｌ３０８Ｍｂｕ構築物が単量体よりもＤＮＡに対して強い結合親和性を有することを示す。 種々のＨｅｌ３０８（Ｍｂｕ）構築物の量を増加させてＤＮＡオリゴヌクレオチド（配列番号６９、その５’末端にカルボキシフルオレセイン塩基を有する）の偏光における変化を示す図である（ｙ軸標識＝偏光（ブランク減算）、ｘ軸標識＝タンパク質濃度（ｎＭ））。黒四角点のデータはＨｅｌ３０８Ｍｂｕ単量体に対応する。空丸でのデータは（ｇｐ３２ＲＢ６９ＣＤ）−Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ（ｇｐ３２ＲＢ６９ＣＤ（配列番号６４）はリンカー配列ＧＴＧＳＧＴによってヘリカーゼ単量体単位（配列番号１０）に付着されている）に対応する。（ｇｐ３２ＲＢ６９ＣＤ）−Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕヘリカーゼ構築物は、単量体よりも低い濃度で偏光における増大を示し、ＤＮＡに対するより強い結合が単量体と比較して観察されたことを示している。 Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して図５〜８に示すデータを二相解離結合曲線にフィットすることを通じて得られた種々のＨｅｌ３０８（Ｍｂｕ）構築物についての相対平衡解離定数（Ｋ_ｄ）（Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ単量体に関する）を示すグラフである（ｙ軸標識＝相対Ｋ_ｄ、ｘ軸標識＝参照番号）。参照番号は次のＨｅｌ３０８（Ｍｂｕ）構築物に対応する、３６１４＝Ｈｅｌ３０８（Ｍｂｕ）、３６９４＝（ｇｐ３２−ＲＢ６９ＣＤ）−Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ、３７３３＝Ｈｅｌ３０８（Ｍｂｕ）−Ａ７００Ｃ ２ｋＤａ ＰＥＧ二量体、４４０１＝Ｈｅｌ３０８（Ｍｂｕ）−ＧＴＧＳＧＡ−（ＨｈＨ）２、４４０２＝Ｈｅｌ３０８（Ｍｂｕ）−ＧＴＧＳＧＡ−（ＨｈＨ）２−（ＨｈＨ）２、４３９４＝Ｈｅｌ３０８（Ｍｂｕ）−ＧＴＧＳＧＡ−ｇｐ３２ＲＢ６９ＣＤ、４３９５＝Ｈｅｌ３０８（Ｍｂｕ）−ＧＴＧＳＧＡ−ｇｐ２．５Ｔ７−Ｒ１１２Ｄｅｌおよび４３９６＝Ｈｅｌ３０８（Ｍｂｕ）−ＧＴＧＳＧＡ−ＵＬ４２ＨＶ１−Ｉ３２０Ｄｅｌ。付着している追加的結合ドメインを有する全てのヘリカーゼ構築物はＨｅｌ３０８Ｍｂｕ単量体単独よりも低い平衡解離定数を示す。 膜中のナノポアを通るポリヌクレオチドの移動を制御するヘリカーゼ単量体の模式図である。Ａ）印加された場の下で（印加された場の方向は破線黒矢印によって示されている）ｃｉｓコンパートメント中のＤＮＡはナノポアによって捕捉され、第１のヘリカーゼ（灰色半円）がナノポアの最上部に接触するまでナノポアを通って運ばれる。この時点後、ヘリカーゼはＤＮＡに沿って移動し（ｄＮＴＰおよび好適な金属イオンの存在下で）ナノポアを通るＤＮＡの移動を制御する（酵素移動の方向は空矢印によって示されている）。示されている実施ではＤＮＡ鎖は、ポアによって５’末端で捕捉され、酵素は場とは反対にＤＮＡを引いて３’から５’へ移動する。酵素が解離しない限り、鎖は同様に全て５’末端で終わり、最終的にｃｉｓ側に押し戻される。代替的にナノポアによって３’末端で捕捉された鎖は、ＤＮＡに沿って３’から５’へ移動する酵素によってポアに供給され、最終的にはｔｒａｎｓ側に出される。５’から３’への極性を示す酵素では、これらのモードは逆になる。Ｂ）酵素単量体について、酵素の１つが解離する場合（矢印１によって示される）ＤＮＡは印加された場によって反対方向にポアを通って移行し始め、ＤＮＡをｃｉｓコンパートメントに引く。Ｃ）ＤＮＡは、第２のヘリカーゼ（黒輪郭半円）がナノポアの最上部に接触するまで印加された場に沿って移動し続ける。 膜中のナノポアを通るポリヌクレオチドの移動を制御するヘリカーゼ−ヘリカーゼ二量体の模式図である。Ａ）印加された場の下で（印加された場の方向は破線黒矢印によって示されている）ｃｉｓコンパートメント中のＤＮＡはナノポアによって捕捉され、ヘリカーゼがナノポアの最上部に接触するまでナノポアを通って運ばれる。この時点後、ヘリカーゼはＤＮＡに沿って移動し（ｄＮＴＰおよび好適な金属イオンの存在下で）ナノポアを通るＤＮＡの移動を制御する。示される実施ではＤＮＡ鎖は、ポアによって５’末端で捕捉され、酵素は場とは反対にＤＮＡを引いて３’から５’へ移動する。酵素が解離しない限り、鎖は同様に全て５’末端で終わり、最終的にｃｉｓ側に押し戻される。代替的にナノポアによって３’末端で捕捉された鎖は、ＤＮＡに沿って３’から５’へ移動する酵素によってポアに供給され、最終的にはｔｒａｎｓ側に出される。５’から３’での酵素では、これらのモードは逆になる。Ｂ）酵素二量体について、酵素の１つが解離する場合（矢印１によって示される）それは他の酵素に付着したままであり、それによりＤＮＡにあるままである。Ｃ）これは、解離した酵素のＤＮＡへの再結合を増強し、それはＤＮＡに沿って移動し続けられる。この増強された再結合は、二量体構築物がＤＮＡ上のままであり、最終的にＤＮＡの末端まで移動する可能性を改善し、全体的な前進性を改善する。酵素再結合は、矢印２によって示される。ポアの最上部上の酵素がＤＮＡから解離する場合、Ｃ）からＡ）に戻る遷移が観察される可能性がある。ＤＮＡは、付着したトレイル（trailing）酵素に達するまで印加された場によってポアを通って引き戻される。次いで解離した酵素はそれ自体に再付着できる。この工程は、Ｃ）からＡ）へ戻る薄灰色矢印によって強調される。 実施例５、６および７において使用したＤＮＡ基質設計を示す図である。鎖Ａは、配列番号７０（４００塩基長）に対応し、鎖Ｂは配列番号７１（３’末端にコレステロールタグを有するプライマー（黒丸２個によって示される））に対応する。 ヘリカーゼ単量体が制御された様式でナノポアを通ってＤＮＡを移動させることができ、ＤＮＡがナノポアを通って移動するときに電流に段階的変化を生じさせることを示す図である。単量体ヘリカーゼがＭＳ（Ｂ１−Ｌ８８Ｎ）８ＭｓｐＡナノポア（配列番号２に示す８単量体単位、変異Ｌ８８Ｎを有する）を通してＤＮＡの移行を制御するときに観察された電流トレース例（（１２０ｍＶ、１Ｍ ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ８．０、０．１５ｎＭ ４００塩基長ＤＮＡ、１００ｎＭ Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ単量体（配列番号１０）、１ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ ＡＴＰ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２）（トレースＡおよびＢについて、ｙ軸標識＝電流（ｐＡ）、ｘ軸標識＝時間（分））。Ａ）Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ単量体制御４００塩基長ＤＮＡ移動の電流対捕捉時間のセクション。印加された電位の下で結合したヘリカーゼを有するＤＮＡは、ナノポアにより捕捉される。これは、オープンポアレベル（約２６０ｐＡ）からＤＮＡレベル（約２０〜６０ｐＡ）への電流における遮断を生じる。次いでＤＮＡレベルは、酵素がＤＮＡをポアを通して移動させるときに電流における段階的変化を示す。示すヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動例は、ナノポアを出る前に特徴的な長いポリＴレベルで終わる。Ｂ）特徴的なポリＴレベルで終わるヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動の拡大図。 ヘリカーゼ−ヘリカーゼ二量体が制御された様式でナノポアを通ってＤＮＡを移動させることができ、ＤＮＡがナノポアを通って移動するときに電流に段階的変化を生じさせることを示す図である。二量体ヘリカーゼがＭＳ（Ｂ１−Ｌ８８Ｎ）８ＭｓｐＡナノポア（配列番号２、変異Ｌ８８Ｎを有する）を通してＤＮＡの移行を制御するときに観察された電流トレース例（（１２０ｍＶ、１Ｍ ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ８．０、０．１５ｎＭ ４００塩基長ＤＮＡ、１０ｎＭ Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ Ａ７００Ｃ ２ｋＤａ 二量体（ここで各単量体単位は変異Ａ７００Ｃを有する配列番号１０を含み、１つの単量体単位は２ｋＤａ ＰＥＧリンカーを使用して各単量体単位の位置７００を介して他に連結されている）、１ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ ＡＴＰ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２）（トレースＡおよびＢについて、ｙ軸標識＝電流（ｐＡ）、ｘ軸標識＝時間（分））。Ａ）Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ Ａ７００Ｃ ２ｋＤａ二量体制御４００塩基長ＤＮＡ移動の電流対捕捉時間のセクション。印加された電位の下で結合したヘリカーゼを有するＤＮＡは、ナノポアにより捕捉される。これは、オープンポアレベル（約２６０ｐＡ）からＤＮＡレベル（約２０〜６０ｐＡ）への電流における遮断を生じる。次いでＤＮＡレベルは、酵素がＤＮＡをポアを通して移動させるときに電流における段階的変化を示す。示すヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動例は、ナノポアを出る前に特徴的な長いポリＴレベルで終わる。Ｂ）特徴的なポリＴレベルで終わるヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動の拡大図。 ナノポアを通るＤＮＡの移動を制御するために単量体Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ（配列番号１０）を使用する実験についての鎖移動の全長（状態の数、移動した塩基の数に対応する）を示す図である（＋１２０ｍＶ、１Ｍ ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ８．０、０．１５ｎＭ ４００塩基長ＤＮＡ、１００ｎＭ Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ単量体、１ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ ＡＴＰ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、ＭＳ（Ｂ１−Ｌ８８Ｎ）８ＭｓｐＡ、ｙ軸標識＝状態の数、ｘ軸標識＝鎖）。点線は、５００に対応する状態の数を強調する。単量体実行について測定されたヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動の３７％がＤＮＡ鎖の末端のポリＴに達した。 ナノポアを通るＤＮＡの移動を制御するためにＨｅｌ３０８Ｍｂｕ Ａ７００Ｃ ２ｋＤａ二量体（ここで各単量体単位は変異Ａ７００Ｃを有する配列番号１０を含み、１つの単量体単位は２ｋＤａ ＰＥＧリンカーを使用して各単量体単位の位置７００を介して他に連結されている）を使用する実験についての鎖移動の全長（状態の数、移動した塩基の数に対応する）を示す図である（＋１２０ｍＶ、１Ｍ ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ８．０、０．１５ｎＭ ４００塩基長ＤＮＡ、１０ｎＭ Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ Ａ７００Ｃ ２ｋＤａ二量体、１ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ ＡＴＰ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、ＭＳ（Ｂ１−Ｌ８８Ｎ）８ＭｓｐＡ、ｙ軸標識＝状態の数、ｘ軸標識＝鎖）。二量体によって制御されるＤＮＡ移動は、単量体ヘリカーゼによって制御されるものよりも典型的には長い（点線は、５００に対応する状態の数を強調する）。これは、酵素再結合およびしたがって酵素解離の低減を示している。二量体実行について測定されたヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動の４７％がＤＮＡ鎖の末端のポリＴに達し、二量体の解離の低減および前進性の改善を示している。 状態指数の関数としてのＨｅｌ３０８Ｍｂｕ単量体制御鎖移動に関する状態フィットデータの公知のＤＮＡ配列における位置（ｙ軸標識＝配列における位置）の６例を示す図である（ｘ軸標識＝状態指数）。Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ単量体（配列番号１０）データは、酵素解離およびトレイル酵素に出会うまで印加された場の下でＤＮＡが逆戻りした結果である配列の先行部分への周期的な後退転位を含む、配列を通じた前進性直線移動を示す。ヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動の多数は、酵素解離のために配列の末端までたどり着けない。 状態指数の関数としてのＨｅｌ３０８Ｍｂｕ Ａ７００Ｃ ２ｋＤａホモ二量体（ここで各単量体単位は変異Ａ７００Ｃを有する配列番号１０を含み、１つの単量体単位は２ｋＤａ ＰＥＧリンカーを使用して各単量体単位の位置７００を介して他に連結されている）制御鎖移動に関する状態フィットデータの公知のＤＮＡ配列における位置（ｙ軸標識＝位置配列）の６例を示す図である（ｘ軸標識＝状態指数）。二量体データは、酵素解離の結果である配列の先行部分への周期的な後退転位を含む、配列を通じた前進性直線移動を示す。しかし単量体データとは異なり、酵素はより長くＤＮＡの移動を制御し続け、解離後に酵素はＤＮＡに再結合する。 ヘリカーゼ−ヘリカーゼ二量体が制御された様式でナノポアを通ってＤＮＡを移動させることができ、ＤＮＡがナノポアを通って移動するときに電流に段階的変化を生じさせることを示す図である。二量体ヘリカーゼがＭＳ（Ｂ１−Ｌ８８Ｎ）８ＭｓｐＡナノポアを通してＤＮＡの移行を制御するときに観察された電流トレース例（１８０ｍＶ、４００ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ８．０、０．１５ｎＭ ４００塩基長ＤＮＡ、およそ１ｎＭ Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ Ｑ４４２Ｃ ２ｋＤａリンカーホモ二量体（ここで各単量体単位は変異Ｑ４４２Ｃを有する配列番号１０を含み、１つの単量体単位は２ｋＤａ ＰＥＧリンカーを使用して各単量体単位の位置４４２を介して他に連結されている）または１ｎＭ Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ Ｑ４４２Ｃ ３．４ｋＤａリンカーホモ二量体（ここで各単量体単位は変異Ｑ４４２Ｃを有する配列番号１０を含み、１つの単量体単位は３．４ｋＤａ ＰＥＧリンカーを使用して各単量体単位の位置４４２を介して他に連結されている）、１ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ ＡＴＰ、１ｍＭ ＭｇＣｌ_２）（トレースＡおよびＢについて、ｙ軸標識＝電流（ｐＡ）、ｘ軸標識＝時間（分））。Ａ）Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ Ｑ４４２Ｃ ２ｋＤａリンカーホモ二量体制御４００塩基長ＤＮＡ移動の電流対捕捉時間のセクション。印加された電位の下で結合したヘリカーゼを有するＤＮＡは、ナノポアにより捕捉される。これは、オープンポアレベル（約１７０ｐＡ）からＤＮＡレベル（約４０〜８０ｐＡ）への電流における遮断を生じる。次いでＤＮＡレベルは、酵素がＤＮＡをポアを通して移動させるときに電流における段階的変化を示す。示すヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動例は、ナノポアを出る前に特徴的な長いポリＴレベルで終わる。Ｂ）Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ Ｑ４４２Ｃ ３．４ｋＤａリンカーホモ二量体制御４００塩基長ＤＮＡ移動の電流対捕捉時間のセクション。印加された電位の下で結合したヘリカーゼを有するＤＮＡは、ナノポアにより捕捉される。これは、オープンポアレベル（約１７０ｐＡ）からＤＮＡレベル（約４０〜８０ｐＡ）への電流における遮断を生じる。次いでＤＮＡレベルは、酵素がＤＮＡをポアを通して移動させるときに電流における段階的変化を示す。示すヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動例は、ナノポアを出る前に特徴的な長いポリＴレベルで終わる。 追加的結合ドメインに付着しているヘリカーゼが制御された様式でナノポアを通ってＤＮＡを移動させることができ、ＤＮＡがナノポアを通って移動するときに電流に段階的変化を生じさせることを示す図である。ヘリカーゼがＭＳ（Ｂ１−Ｌ８８Ｎ）８ＭｓｐＡナノポアを通してＤＮＡの移行を制御するときに観察された電流トレース例（１４０ｍＶ、４００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ８．０、０．６ｎＭ ４００塩基長ＤＮＡ、１００ｎＭ Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ＋Ｈｅｌ３０８ Ｈｌａ第５ドメイン（ヘリカーゼ単量体単位（配列番号１０）はＨｅｌ３０８ Ｈｌａ（配列番号６６））の第５ドメインに付着されている、または１００ｎＭ Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ＋Ｈｅｌ３０８ Ｈｖｏ第５ドメイン（ヘリカーゼ単量体単位（配列番号１０）はＨｅｌ３０８Ｈｖｏ（配列番号６７）の第５ドメインに付着されている）、１ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ ＡＴＰ、１ｍＭ ＭｇＣｌ_２）（トレースＡおよびＢについて、ｙ軸標識＝電流（ｐＡ）、ｘ軸標識＝時間（分））。Ａ）Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ＋Ｈｅｌ３０８Ｈｌａ第５ドメイン制御４００塩基長ＤＮＡ移動の電流対捕捉時間のセクション。印加された電位の下で結合したヘリカーゼを有するＤＮＡは、ナノポアにより捕捉される。これは、オープンポアレベル（約１００ｐＡ）からＤＮＡレベル（約１０〜４０ｐＡ）への電流における遮断を生じる。次いでＤＮＡレベルは、酵素がＤＮＡをポアを通して移動させるときに電流における段階的変化を示す。示すヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動例は、ナノポアを出る前に特徴的な長いポリＴレベルで終わる。Ｂ）Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ＋Ｈｅｌ３０８Ｈｖｏ第５ドメイン制御４００塩基長ＤＮＡ移動の電流対捕捉時間のセクション。印加された電位の下で結合したヘリカーゼを有するＤＮＡは、ナノポアにより捕捉される。これは、オープンポアレベル（約１００ｐＡ）からＤＮＡレベル（約１０〜４０ｐＡ）への電流における遮断を生じる。次いでＤＮＡレベルは、酵素がＤＮＡをポアを通して移動させるときに電流における段階的変化を示す。示すヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動例は、ナノポアを出る前に特徴的な長いポリＴレベルで終わる。 実施例８において使用されたＤＮＡ基質設計を示す図である。鎖Ａは配列番号７２（９００塩基長）に対応し、鎖Ｂは配列番号７３（アンチセンス配列より４塩基対少ないリーダー）に対応する。鎖Ｃは配列番号７４（コレステロールタグを３’末端に有するプライマー（黒丸２個によって示される））に対応する。 追加的ヘリックス−ヘアピン−ヘリックス結合ドメインに付着しているヘリカーゼが制御された様式でナノポアを通してＤＮＡを移動でき、ＤＮＡがポアを通って移動するときに電流における段階的変化を生じることを示す図である。ヘリカーゼがＭＳ（Ｂ１−Ｇ７５Ｓ−Ｇ７７Ｓ−Ｌ８８Ｎ−Ｑ１２６Ｒ）８ＭｓｐＡナノポア（配列番号２に示され、変異Ｇ７５Ｓ／Ｇ７７Ｓ／Ｌ８８Ｎ／Ｑ１２６Ｒを有する８単量体単位））を通してＤＮＡの移行を制御するときに観察された電流トレース例（１４０ｍＶ、４００ｍＭ ＮａＣｌ、１００ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ８．０、０．１ｎＭ ９００塩基長ＤＮＡ、１００ｎＭ Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ−ＧＴＧＳＧＡ−（ＨｈＨ）２（ヘリカーゼ単量体単位（配列番号１０）はリンカー配列ＧＴＧＳＧＡによってＨｈＨ２ドメイン（配列番号７５）に付着されている）または１００ｎＭ Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ−ＧＴＧＳＧＡ−（ＨｈＨ）２−（ＨｈＨ）２（ヘリカーゼ単量体単位（配列番号１０）はリンカー配列ＧＴＧＳＧＡによって（ＨｈＨ）２−（ＨｈＨ）２ドメイン（配列番号７６）に付着されている）、１０ｍＭフェロシアン化カリウム、１０ｍＭフェリシアン化カリウム、１ｍＭ ＡＴＰ、１ｍＭ ＭｇＣｌ_２）（トレースＡおよびＢについて、ｙ軸標識＝電流（ｐＡ）、ｘ軸標識＝時間（分））。Ａ）Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ−ＧＴＧＳＧＡ−（ＨｈＨ）２制御９００塩基長ＤＮＡ移動の電流対捕捉時間のセクション。印加された電位の下で結合したヘリカーゼを有するＤＮＡは、ナノポアにより捕捉される。これは、オープンポアレベル（約１１０ｐＡ）からＤＮＡレベル（約１０〜４０ｐＡ）への電流における遮断を生じる。次いでＤＮＡレベルは、酵素がＤＮＡをポアを通して移動させるときに電流における段階的変化を示す。示すヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動例は、ナノポアを出る前に特徴的な長いポリＴレベルで終わる。Ｂ）Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ−ＧＴＧＳＧＡ−（ＨｈＨ）２−（ＨｈＨ）２制御９００塩基長ＤＮＡ移動の電流対捕捉時間のセクション。印加された電位の下で結合したヘリカーゼを有するＤＮＡは、ナノポアにより捕捉される。これは、オープンポアレベル（約１１０ｐＡ）からＤＮＡレベル（約１０〜４０ｐＡ）への電流における遮断を生じる。次いでＤＮＡレベルは、酵素がＤＮＡをポアを通して移動させるときに電流における段階的変化を示す。示すヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動例は、ナノポアを出る前に特徴的な長いポリＴレベルで終わる。 酵素活性を検査するための蛍光アッセイを示す図である。通例の蛍光基質が、ハイブリダイズしたｄｓＤＮＡを置換するヘリカーゼ／ヘリカーゼ二量体（ａ）の能力をアッセイするために使用された。１）蛍光基質鎖（５０ｎＭ最終、配列番号９１および９２）は、３’および５’の両方のｓｓＤＮＡオーバーハングおよびハイブリダイズしたｄｓＤＮＡの４４塩基セクションを有する。上部鎖（ｂ）はカルボキシフルオレセイン塩基（ｃ）を５’末端（配列番号９１中、５と標識）に有し、ハイブリダイズされた相補物（ｄ）はブラックホールクエンチャー（ＢＨＱ−１）塩基（ｅ）を３’末端（配列番号９２中、６と標識）に有する。ハイブリダイズされた場合、フルオレセインからの蛍光は局在ＢＨＱ−１によって消光され、基質は実質的に非蛍光性である。蛍光基質鎖の下部に部分的に相補的である捕捉鎖（ｆ、配列番号９３）１μＭがアッセイに含まれる。２）ＡＴＰ（１ｍＭ）およびＭｇＣｌ_２（１ｍＭ）の存在下で、基質に添加されたヘリカーゼ（１００ｎＭ）は、蛍光基質の３’尾部に結合し、上部鎖に沿って移動し、示されるとおり相補鎖（ｄ）を置換する。３）ＢＨＱ−１を有する相補鎖が完全に置換されると主要な鎖上のフルオレセインは蛍光を発する。４）置換された下部鎖（ｄ）は過剰量の捕捉鎖（ｆ）に優先的にアニールし、初期基質の再アニールおよび蛍光の消失を防ぐ。 ＴｒｗＣ Ｃｂａ 単量体（Ａと標識、配列番号８７）およびＴｒｗＣ Ｃｂａ−ＴｏｐｏＶ Ｍｋａ（Ｂと標識、ＴｒｗＣ ＣｂａはリンカーＡＹＤＶＧＡによって、配列番号９０に示すトポイソメラーゼＶ Ｍｋａ全長配列のドメインＨ−Ｌに付着されている）についての４００ｍＭ ＮａＣｌでの緩衝液溶液（１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ８．０、１ｍＭ ＡＴＰ、１ｍＭ ＭｇＣｌ_２、５０ｎＭ蛍光基質ＤＮＡ（配列番号９１および９２）、１μＭ捕捉ＤＮＡ（配列番号９３））中の活性の初期速度のグラフ（ｙ軸＝１０００ｘｄｓＤＮＡ代謝回転（分子／分／酵素）、ｘ軸＝酵素）である。 ＴｒｗＣ Ｃｂａ Ｑ２７６Ｃ−３．４ｋＤａ二量体（ここで各単量体単位は変異Ｑ２７６Ｃを有する配列番号８７を含み、１つの単量体単位は３．４ｋＤａ ＰＥＧリンカーを使用して各単量体単位の位置２７６を介して他に連結されている）およびＴｒｗＣ Ｃｂａ Ｑ２７６Ｃ単量体（ここで各単量体単位は変異Ｑ２７６Ｃを有する配列番号８７を含む）の形成および精製中の種々の段階でのゲルを示す図である。レーンＭ＝タンパク質ラダー、レーン１＝Ｅ３−Ｑ２７６Ｃ単量体出発材料、レーン２および３＝反応混合物。ＴｒｗＣ Ｃｂａ Ｑ２７６Ｃ−３．４ｋＤａ二量体（ここで各単量体単位は変異Ｑ２７６Ｃを有する配列番号８７を含み、１つの単量体単位は３．４ｋＤａ ＰＥＧリンカーを使用して各単量体単位の位置２７６を介して他に連結されている）に対応するバンドは灰色矢印によって示されている。 ＴｒｗＣ Ｃｂａ Ｑ２７６Ｃ−３．４ｋＤａ二量体（ここで各単量体単位は変異Ｑ２７６Ｃを有する配列番号８７を含み、１つの単量体単位は３．４ｋＤａ ＰＥＧリンカーを使用して各単量体単位の位置２７６を介して他に連結されている）およびＴｒｗＣ Ｃｂａ Ｑ２７６Ｃ単量体（ここで各単量体単位は変異Ｑ２７６Ｃを有する配列番号８７を含む）の形成および精製中の種々の段階でのゲルを示す図である。レーンＭ＝タンパク質ラダー、レーンＸ＝ＴｒｗＣ Ｃｂａ Ｑ２７６Ｃ−３．４ｋＤａ二量体についての参照レーン、レーン４〜１４はＴｒｗＣ Ｃｂａ Ｑ２７６Ｃ−３．４ｋＤａ二量体（ここで各単量体単位は変異Ｑ２７６Ｃを有する配列番号８７を含み、１つの単量体単位は３．４ｋＤａ ＰＥＧリンカーを使用して各単量体単位の位置２７６を介して他に連結されている））の溶出物からの精製画分を含有する。ＴｒｗＣ Ｃｂａ Ｑ２７６Ｃ−３．４ｋＤａ二量体（ここで各単量体単位は変異Ｑ２７６Ｃを有する配列番号８７を含み、１つの単量体単位は３．４ｋＤａ ＰＥＧリンカーを使用して各単量体単位の位置２７６を介して他に連結されている）に対応するバンドは灰色矢印によって示されている。 Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ−Ａ５７７Ｆａｚ−ＰＥＧ４リンカー−ＴｒｗＣ Ｃｂａ Ｑ２７６Ｃ二量体（Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ単量体単位（２と標識）は、位置５７７のアミノ酸が４−アジド−Ｌ−フェニルアラニン（Ｆａｚ）に変異されている配列番号１０を含み、ＰＥＧ４リンカー（黒点線）によってＴｒｗＣ Ｃｂａ単量体単位（１と標識）変異Ｑ２７６Ｃを有する配列番号８７に付着されており、リンカーはＨｅｌ３０８Ｍｂｕ単量体上の位置５７７およびＴｒｗＣ Ｃｂａ上の位置２７６で各単量体に付着されている）を形成するために必要である化学反応ステップの模式図である。ステップ１は、ＴｒｗＣ Ｃｂａの表面上の位置２７６のシステインとＰＥＧ４リンカーの一方の端のマレイミド官能基（Ｘと標識）とが反応する。ステップ２は、Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕの表面上の位置５７７の４−アジド−Ｌ−フェニルアラニン（Ｆａｚ）アミノ酸とＰＥＧ４リンカーの他方の端のＤＢＣＯ官能基（Ｙと標識）とがクリック化学を使用して反応する。 実施例１２由来の試料の４〜１２％ゲルを示す図である。各レーンの試料は次のとおり−レーンａ）ＴｒｗＣ Ｃｂａ−Ｑ２７６Ｃ単量体（変異Ｑ２７６Ｃを有する配列番号８７）、レーンｂ）Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ−Ａ５７７Ｆａｚ（ここで各単量体単位は変異Ａ５７７Ｆａｚを有する配列番号１０を含む）、レーンｃ）ＴｒｗＣ Ｃｂａ−Ｑ２７６Ｃ単量体（変異Ｑ２７６Ｃを有する配列番号８７）＋Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ−Ａ５７７Ｆａｚ（ここで各単量体単位は変異Ａ５７７Ｆａｚを有する配列番号１０を含む）、レーンｄ）ＴｒｗＣ Ｃｂａ−Ｑ２７６Ｃ単量体（変異Ｑ２７６Ｃを有する配列番号８７）＋５ｋＤａ ＰＥＧ、レーンｅ）ＴｒｗＣ Ｃｂａ−Ｑ２７６Ｃ単量体（変異Ｑ２７６Ｃを有する配列番号８７）＋アジドが付着している５ｋＤａ ＰＥＧ、レーンｆ）ＴｒｗＣ Ｃｂａ−Ｑ２７６Ｃ単量体（変異Ｑ２７６Ｃを有する配列番号８７）＋Ａｚｉｄｅ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５５５（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、フルオロフォアとＴｒｗＣ Ｃｂａ−Ｑ２７６Ｃ単量体との非特異的相互作用を確認するために使用）、レーンｇ）ＴｒｗＣ Ｃｂａ−Ｑ２７６Ｃ単量体（変異Ｑ２７６Ｃを有する配列番号８７）＋Ｍａｌ−ＰＥＧ４−ＤＢＣＯ、レーンｈ）ＴｒｗＣ Ｃｂａ−Ｑ２７６Ｃ−ＰＥＧ４−ＤＢＣＯ（ＰＥＧ４−ＤＢＣＯリンカーに付着されている変異Ｑ２７６Ｃを有する配列番号８７）＋Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ（配列番号１０）、レーンｉ）Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ−Ａ５７７Ｆａｚ−ＰＥＧ４リンカー−ＴｒｗＣ Ｃｂａ Ｑ２７６Ｃ二量体（Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ単量体単位は、位置５７７のアミノ酸が４−アジド−Ｌ−フェニルアラニン（Ｆａｚ）に変異されている配列番号１０を含み、ＰＥＧ４リンカーによってＴｒｗＣ Ｃｂａ単量体単位、変異Ｑ２７６Ｃを有する配列番号８７に付着されており、リンカーはＨｅｌ３０８Ｍｂｕ単量体上の位置５７７およびＴｒｗＣ Ｃｂａ上の位置２７６で各単量体に付着されている）に加えて未反応ＴｒｗＣ Ｃｂａ−Ｑ２７６Ｃ単量体（変異Ｑ２７６Ｃを有する配列番号８７）＋Ｍａｌ−ＰＥＧ４−ＤＢＣＯ＋Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ−Ａ５７７Ｆａｚ単量体（ここで各単量体単位は変異Ａ５７７Ｆａｚを有する配列番号１０を含む）、レーンｊ）ＴｒｗＣ Ｃｂａ−Ｑ２７６Ｃ単量体（変異Ｑ２７６Ｃを有する配列番号８７）＋Ｍａｌ−ＰＥＧ４−ＤＢＣＯ＋アジドが付着している５ｋＤａ ＰＥＧ、レーンｋ）ＴｒｗＣ Ｃｂａ−Ｑ２７６Ｃ単量体（変異Ｑ２７６Ｃを有する配列番号８７）＋Ｍａｌ−ＰＥＧ４−ＤＢＣＯ＋Ａｚｉｄｅ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５５５（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、フルオロフォアとＴｒｗＣ Ｃｂａ−Ｑ２７６Ｃ単量体との非特異的相互作用を確認するために使用）。所望の二量体産生物（Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ−Ａ５７７Ｆａｚ−ＰＥＧ４リンカー−ＴｒｗＣ Ｃｂａ Ｑ２７６Ｃ二量体（Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ単量体単位は、位置５７７のアミノ酸が４−アジド−Ｌ−フェニルアラニン（Ｆａｚ）に変異されている配列番号１０を含み、ＰＥＧ４リンカーによってＴｒｗＣ Ｃｂａ単量体単位、変異Ｑ２７６Ｃを有する配列番号８７に付着されており、リンカーはＨｅｌ３０８Ｍｂｕ単量体上の位置５７７およびＴｒｗＣ Ｃｂａ上の位置２７６で各単量体に付着されている））に対応するバンドは灰色矢印によって示されている。

配列表の記載
配列番号１は、ＭＳ−Ｂ１変異ＭｓｐＡ単量体をコードするコドン最適化ポリヌクレチ
ド配列を示す。この変異体は、シグナル配列を欠失しており、次の変異：Ｄ９０Ｎ、Ｄ９
１Ｎ、Ｄ９３Ｎ、Ｄ１１８Ｒ、Ｄ１３４ＲおよびＥ１３９Ｋを含む。

配列番号２は、ＭｓｐＡ単量体のＭＳ−Ｂ１変異体の成熟形態のアミノ酸配列を示す。
この変異体は、シグナル配列を欠失しており、以下の変異：Ｄ９０Ｎ、Ｄ９１Ｎ、Ｄ９３
Ｎ、Ｄ１１８Ｒ、Ｄ１３４ＲおよびＥ１３９Ｋを含む。

配列番号３は、α−ヘモリジン−Ｅ１１１Ｎ／Ｋ１４７Ｎ（α−ＨＬ−ＮＮ；Stoddart
ら、PNAS、2009;106(19):7702-7707）の１つの単量体をコードするポリヌクレオチド配列
を示す。

配列番号４は、α−ＨＬ−ＮＮの１つの単量体のアミノ酸配列を示す。

配列番号５から７は、ＭｓｐＢ、ＣおよびＤのアミノ酸配列を示す。

配列番号８は、Ｈｅｌ３０８モチーフのアミノ酸配列を示す。

配列番号９は、拡張Ｈｅｌ３０８モチーフのアミノ酸配列を示す。

配列番号１０はＨｅｌ３０８Ｍｂｕのアミノ酸配列を示す。

配列番号１１はＨｅｌ３０８ＭｂｕおよびＨｅｌ３０８ＭｈｕのＨｅｌ３０８モチーフ
を示す。

配列番号１２はＨｅｌ３０８ＭｂｕおよびＨｅｌ３０８Ｍｈｕの伸長されたＨｅｌ３０
８モチーフを示す。

配列番号１３はＨｅｌ３０８ Ｃｓｙのアミノ酸配列を示す。

配列番号１４はＨｅｌ３０８ ＣｓｙのＨｅｌ３０８モチーフを示す。

配列番号１５はＨｅｌ３０８ Ｃｓｙの伸長されたＨｅｌ３０８モチーフを示す。

配列番号１６はＨｅｌ３０８ Ｔｇａのアミノ酸配列を示す。

配列番号１７はＨｅｌ３０８ ＴｇａのＨｅｌ３０８モチーフを示す。

配列番号１８はＨｅｌ３０８ Ｔｇａの伸長されたＨｅｌ３０８モチーフを示す。

配列番号１９はＨｅｌ３０８ Ｍｈｕのアミノ酸配列を示す。

配列番号２０はＲｅｃＤ様モチーフＩを示す。

配列番号２１、２２および２３は伸長されたＲｅｃＤ様モチーフＩを示す。

配列番号２４はＲｅｃＤモチーフＩを示す。

配列番号２５は好ましいＲｅｃＤモチーフＩ、すなわちＧ−Ｇ−Ｐ−Ｇ−Ｔ−Ｇ−Ｋ−
Ｔを示す。

配列番号２６、２７および２８は伸長されたＲｅｃＤモチーフＩを示す。

配列番号２９はＲｅｃＤ様モチーフＶを示す。

配列番号３０はＲｅｃＤモチーフＶを示す。

配列番号３１から３８はＭｏｂＦモチーフＩＩＩを示す。

配列番号３９から４５はＭｏｂＱモチーフＩＩＩを示す。

配列番号４６はＴｒａＩ Ｅｃｏのアミノ酸配列を示す。

配列番号４７はＴｒａＩ ＥｃｏのＲｅｃＤ様モチーフＩを示す。

配列番号４８はＴｒａＩ ＥｃｏのＲｅｃＤ様モチーフＶを示す。

配列番号４９はＴｒａＩ ＥｃｏのＭｏｂＦモチーフＩＩＩを示す。

配列番号５０はＸＰＤモチーフＶを示す。

配列番号５１はＸＰＤモチーフＶＩを示す。

配列番号５２はＸＰＤ Ｍｂｕのアミノ酸配列を示す。

配列番号５３はＸＰＤ ＭｂｕのＸＰＤモチーフＶを示す。

配列番号５４はＸＰＤ ＭｂｕのＸＰＤモチーフＶＩを示す。

配列番号５５は好ましいＨｈＨドメインのアミノ酸配列を示す。

配列番号５６はｇｐ３２遺伝子によってコードされる、バクテリオファージＲＢ６９由
来ＳＳＢのアミノ酸配列を示す。

配列番号５７はｇｐ２．５遺伝子によってコードされるバクテリオファージＴ７由来Ｓ
ＳＢのアミノ酸配列を示す。

配列番号５８はヘルペスウイルス１由来ＵＬ４２前進性因子のアミノ酸配列を示す。

配列番号５９はＰＣＮＡのサブユニット１のアミノ酸配列を示す。

配列番号６０はＰＣＮＡのサブユニット２のアミノ酸配列を示す。

配列番号６１はＰＣＮＡのサブユニット３のアミノ酸配列を示す。

配列番号６２はＰｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列を示す。

配列番号６３はヘルペスウイルス１由来ＵＬ４２前進性因子のアミノ酸配列（１から３
１９）を示す。

配列番号６４はバクテリオファージＲＢ６９由来ＳＳＢのアミノ酸配列、すなわちＣ末
端が欠失している（ｇｐ３２ＲＢ６９ＣＤ）配列番号５６を示す。

配列番号６５はバクテリオファージＴ７（ｇｐ２．５Ｔ７−Ｒ２１１Ｄｅｌ）由来のＳ
ＳＢのアミノ酸配列（１から２１０）を示す。全長タンパク質は配列番号５７において示
されている。

配列番号６６はＨｅｌ３０８Ｈｌａの第５ドメインのアミノ酸配列を示す。

配列番号６７はＨｅｌ３０８Ｈｖｏの第５ドメインのアミノ酸配列を示す。

配列番号６８はヘリカーゼ二量体産生において使用されるＤＮＡ鎖のポリヌクレオチド
配列を示す。

配列番号６９はヘリカーゼ蛍光アッセイにおいて使用されるＤＮＡ鎖のポリヌクレオチ
ド配列を示す。

配列番号７０は実施例５、６および７において使用されるｓｓＤＮＡ鎖のポリヌクレオ
チド配列を示す。配列番号７０の５’末端に、ナノポアによる捕捉を補助するために５０
Ｔリーダー配列に付着している４個の２’−Ｏ−メチルウラシル塩基がある。

配列番号７１は実施例５、６および７において使用されるｓｓＤＮＡ鎖のポリヌクレオ
チド配列を示す。

配列番号７２および７３は実施例８において使用されるｓｓＤＮＡ鎖のポリヌクレオチ
ド配列を示す。

配列番号７４は実施例８において使用されるｓｓＤＮＡ鎖のポリヌクレオチド配列を示
す。

配列番号７５は（ＨｈＨ）２ドメインのアミノ酸配列を示す。

配列番号７６は（ＨｈＨ）２−（ＨｈＨ）２ドメインのアミノ酸配列を示す。

配列番号７７はヒトミトコンドリアＳＳＢ（ＨｓｍｔＳＳＢ）のアミノ酸配列を示す。

配列番号７８はＰｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ由来ｐ５タンパク質のアミノ酸配列を
示す。

配列番号７９は大腸菌（E. coli）由来野生型ＳＳＢのアミノ酸配列を示す。

配列番号８０は、ｇｐ３２遺伝子によってコードされるバクテリオファージＴ４由来ｓ
ｓｂのアミノ酸配列を示す。

配列番号８１はＥｃｏＳＳＢ−ＣｔｅｒＡｌａのアミノ酸配列を示す。

配列番号８２はＥｃｏＳＳＢ−ＣｔｅｒＮＧＧＮのアミノ酸配列を示す。

配列番号８３はＥｃｏＳＳＢ−Ｑ１５２ｄｅｌのアミノ酸配列を示す。

配列番号８４はＥｃｏＳＳＢ−Ｇ１１７ｄｅｌのアミノ酸配列を示す。

配列番号８５はＧＴＧＳＧＡリンカーを示す。

配列番号８６はＧＴＧＳＧＴリンカーを示す。

配列番号８７はアミノ酸配列ＴｒｗＣ Ｃｂａを示す。

配列番号８８は実施例９において使用されるポリヌクレオチド配列の一部を示す。この
配列の５’末端に付着しているのは２８個のｉＳｐＣ３スペーサー単位であり、その最後
はスペーサー群の５’末端に付着している追加的な２個のＴを有する。この配列の３’末
端に付着しているのは４つのｉＳｐＣ３スペーサー単位であり、配列番号１０４の５’末
端に付着している。

配列番号８９はトポイソメラーゼＶ Ｍｋａ（メタノピュルス・カンドレリ（Methanop
yrus Kandleri））のアミノ酸配列を示す。

配列番号９０はＴｒｗＣ Ｃｂａ−ＴｏｐｏＶ Ｍｋａのアミノ酸配列を示し、Ｔｒｗ
Ｃ ＣｂａはリンカーＡＹＤＶＧＡによってトポイソメラーゼＶ ＭｋａのドメインＨ−
Ｌに付着されている。

配列番号９１〜９３は実施例１０において使用されるポリヌクレオチド配列を示す。

配列番号９４はトポイソメラーゼＶ Ｍｋａ（メタノピュルス・カンドレリ（Methanop
yrus Kandleri））のドメインＨ−Ｌのアミノ酸配列を示す。

配列番号９５から１０３は表２に示すＴｒａＩ配列のいくつかを示す。

配列番号１０４は実施例９において使用されるポリヌクレオチド配列の部分を示す。こ
の配列の５’末端に付着しているのは４個のｉＳｐＣ３スペーサー単位であり、その最後
は配列番号８８に付着されている。配列番号８８の５’末端に付着しているのは２８個の
ｉＳｐＣ３スペーサー単位であり、その最後はスペーサー群の５’末端に付着している追
加的な２個のＴを有する。

配列番号１０５は変異体Ｓ（大腸菌（Escherichia coli））のアミノ酸配列を示す。

配列番号１０６はＳｓｏ７ｄ（スルホロブス・ソルファタリカス（Sufolobus solfatar
icus））のアミノ酸配列を示す。

配列番号１０７はＳｓｏ１０ｂ１（スルホロブス・ソルファタリカス（Sulfolobus sol
fataricus）Ｐ２）のアミノ酸配列を示す。

配列番号１０８はＳｓｏ１０ｂ２（スルホロブス・ソルファタリカス（Sulfolobus sol
fataricus）Ｐ２）のアミノ酸配列を示す。

配列番号１０９はトリプトファンリプレッサー（大腸菌（Escherichia coli））のアミ
ノ酸配列を示す。

配列番号１１０はラムダリプレッサー（腸内細菌（Enterobacteria）ファージラムダ）
のアミノ酸配列を示す。

配列番号１１１はＣｒｅｎ７（ヒストン・クレンアーキア（Histone crenarchaea）Ｃ
ｒｅｎ７ Ｓｓｏ）のアミノ酸配列を示す。

配列番号１１２はヒトヒストン（ヒト（Homo sapiens））のアミノ酸配列を示す。

配列番号１１３はｄｓｂＡ（腸内細菌ファージＴ４）のアミノ酸配列を示す。

配列番号１１４はＲａｄ５１（ヒト（Homo sapiens））のアミノ酸配列を示す。

配列番号１１５はＰＣＮＡスライディングクランプ（sliding clamp）（シトロミクロ
ビウム・バチオマリヌム（Citromicrobium bathyomarinum）ＪＬ３５４）のアミノ酸配列
を示す。

発明の詳細な記載
本開示の生成物および方法のさまざまな応用が当技術分野における具体的な必要性に適
合され得ることは理解される。本明細書で用いられる用語は本発明の詳細な実施形態を記
載する目的のためのみであり、限定されることを意図しないことも理解される。

付加的に、本明細書および添付の特許請求の範囲で用いられる場合、単数形「ａ」、「
ａｎ」および「ｔｈｅ」は、内容が他を明確に記す場合を除いて複数の参照物を含む。し
たがって例えば、「構築物（a construct）」を参照することは「構築物（constructs）
」を含み、「ヘリカーゼ（a helicase）」を参照することは２つ以上のそのようなヘリカ
ーゼを含み、「膜貫通タンパク質ポア（a transmembrane protein pore）」を参照するこ
とは２つ以上のそのようなポアを含む、など。

本明細書に引用する全ての刊行物、特許および特許出願は（上記または下記に関わらず
）それら全体が参照により本明細書に組み込まれる。

本発明における使用のための構築物
本発明は、ポリヌクレオチドの移動を制御するために役立つ構築物を使用する方法を提
供する。構築物は、ヘリカーゼおよび追加的ポリヌクレオチド結合成分を含む。ヘリカー
ゼは、ポリヌクレオチド結合成分に付着されている。構築物はポリヌクレオチドの移動を
制御する能力を有する。構築物は、人工または非天然である。

下により詳細に考察されるとおり構築物は、２つ以上のヘリカーゼを含む場合がある（
すなわち追加的ポリヌクレオチド結合成分は１つまたは複数の追加的ヘリカーゼである）
。そのような実施形態では構築物中の各ヘリカーゼは、そのままでヘリカーゼとして機能
できる。構築物それ自体は、二量体ヘリカーゼなどの多量体またはオリゴマーヘリカーゼ
ではない。換言すると、構築物それ自体は、二量体などの多量体またはオリゴマーとして
天然に存在するヘリカーゼではない。構築物は二量体などの多量体ヘリカーゼを含んでよ
いが、それは別のヘリカーゼなどの追加的ポリヌクレオチド結合成分に付着されていなけ
ればならない。ヘリカーゼは、好ましくは単量体である。ヘリカーゼは好ましくはヘリカ
ーゼ酵素由来のヘリカーゼドメインではない。これは下でより詳細に考察される。

本明細書に記載の構築物は、鎖配列決定法の際にポリヌクレオチドの移動を制御するた
めの有用な手段である。ポリヌクレオチド、特に、５００ヌクレオチド以上のものを配列
決定することにおいて生じる問題は、ポリヌクレオチドの移行を制御する分子モーターが
ポリヌクレオチドから離される場合があることである。これは、ポリヌクレオチドが印加
された場の方向に急速かつ制御されない様式でポアを通って引かれるようにする。本明細
書に記載の構築物は、配列決定されているポリヌクレオチドから離されにくい。構築物は
、ナノポアを通るポリヌクレオチドの移行を制御することからポリヌクレオチドの読み取
り長さの増大を提供できる。本明細書に記載の構築物の制御下でポリヌクレオチド全体を
ナノポアを通して移行させる能力は、その配列などのポリヌクレオチドの特性を改善され
た確度でおよび公知の方法を超える速度で推定できるようにする。鎖長が長くなるにつれ
てこれはより重要になり、分子モーターは前進性の改善を必要とする。本明細書に記載の
構築物は、５００ヌクレオチド以上、例えば１０００ヌクレオチド、５０００、１０００
０、２００００、５００００、１０００００またはそれ以上の標的ポリヌクレオチドの移
行を制御することにおいて特に有効である。

特異的ポリヌクレオチド配列に結合する標的化構築物も設計できる。下により詳細に考
察されるとおりポリヌクレオチド結合成分は、特異的ポリヌクレオチド配列に結合でき、
それにより構築物のヘリカーゼ部分を特異的配列に標的化できる。

本明細書に記載の構築物は、等温ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のための有用な手段
でもある。そのような方法においては、２本鎖ＤＮＡの鎖は典型的には最初に本明細書に
記載の構築物によって分離され、１本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）−結合タンパク質によって
コートされる。第二ステップでは、２個の配列特異的プライマーが、典型的にはＤＮＡ鋳
型の各辺縁にハイブリダイズする。次いでＤＮＡポリメラーゼは鋳型にアニールしたプラ
イマーを、２本鎖ＤＮＡを産生するように伸長するために使用でき、２個の新たに合成さ
れたＤＮＡ産生物は、次いで本明細書に記載の構築物によって基質として使用され、次の
回の反応に入ることができる。したがって鎖反応が同時に進行し、選択された標的配列の
指数関数的増幅が生じる。

構築物は、ポリヌクレオチドの移動を制御する能力を有する。ポリヌクレオチドの移動
を制御する構築物の能力は、当技術分野において公知の任意の方法を使用してアッセイで
きる。例えば構築物は、ポリヌクレオチドに接触されてよく、ポリヌクレオチドの位置は
、標準的方法を使用して決定され得る。ポリヌクレオチドの移動を制御する構築物の能力
は、実施例において記載のとおり典型的にはアッセイされる。

構築物は、単離、実質的に単離、精製または実質的に精製されていてよい。構築物は、
それが脂質、ポリヌクレオチド、またはポア単量体などの任意の他の構成成分を完全に含
まない場合に単離または精製されている。構築物は、その目的の使用を妨害しない担体ま
たは希釈剤と混合されている場合に実質的に単離されている。例えば構築物は、１０％未
満、５％未満、２％未満または１％未満の脂質、ポリヌクレオチド、またはポア単量体な
どの他の構成成分を含む形態で存在する場合に実質的に単離または実質的に精製されてい
る。

付着
ヘリカーゼは、追加的ポリヌクレオチド結合成分に付着されている。ヘリカーゼは、好
ましくは共有結合的に追加的ポリヌクレオチド結合成分に付着している。ヘリカーゼは、
２個または３個などの１個以上の点で成分に付着していてよい。

ヘリカーゼは、当技術分野において公知の任意の方法を使用して成分に共有結合的に付
着できる。ヘリカーゼおよび成分は、別々に産生され、次いで一緒に付着されてよい。２
つの構成成分は、任意の立体配置で付着されてよい。例えばそれらは、それらの末端（す
なわちアミノまたはカルボキシ末端）アミノ酸を介して付着してよい。好適な立体配置は
、これだけに限らないが、成分のアミノ末端がヘリカーゼのカルボキシ末端に付着してい
るおよびその逆を含む。代替的に２つの構成成分は、それらの配列内のアミノ酸を介して
付着され得る。例えば成分は、ヘリカーゼのループ領域中の１つまたは複数のアミノ酸に
付着する場合がある。好ましい実施形態では成分の末端アミノ酸は、ヘリカーゼのループ
領域中の１つまたは複数のアミノ酸に付着する。末端アミノ酸およびループ領域は、当技
術分野において公知の方法（Edman P., Acta Chemica Scandinavia, (1950), 283-293）
を使用して同定できる。例えば、ループ領域はタンパク質モデリングを使用して同定でき
る。これは、相同体においてタンパク質構造がタンパク質配列よりも保存されているとい
う事実を活用する。それにより、タンパク質の原子分解モデルを作成することは、クエリ
ー配列の構造に類似していると考えられる１つまたは複数のタンパク質構造の同定に依存
する。タンパク質モデルを構築するための「鋳型」として使用するための好適なタンパク
質構造が存在するかどうかを評価するために、タンパク質データバンク（ＰＤＢ）データ
ベースの検索を実施する。タンパク質構造は、クエリー配列と合理的なレベルの配列同一
性を共有している場合に好適な鋳型であると考えられる。そのような鋳型が存在する場合
、次いで鋳型配列はクエリー配列と「配列比較」される、すなわちクエリー配列中の残基
が鋳型残基に位置付けられる。配列の配列比較および鋳型構造は、次いでクエリー配列の
構造モデルを作成するために使用される。そのためタンパク質モデルの品質は、配列の配
列比較および鋳型構造の品質に依存する。

２つの構成成分は、システイン、スレオニン、セリン、アスパラギン酸、アスパラギン
、グルタミン酸およびグルタミンなどのそれらの天然に存在するアミノ酸を介して付着し
てよい。天然に存在するアミノ酸は、付着を促進するために修飾されてよい。例えば天然
に存在するアミノ酸は、アシル化、リン酸化、グリコシル化またはファルネシル化によっ
て修飾されてよい。他の好適な修飾は、当技術分野において公知である。天然に存在する
アミノ酸への修飾は、翻訳後修飾であってよい。２つ以上の部分は、それらの配列に導入
されるアミノ酸を介して付着してよい。そのようなアミノ酸は、好ましくは置換によって
導入される。導入されるアミノ酸は、システインまたは付着を促進する非天然アミノ酸で
あってよい。好適な非天然アミノ酸は、これだけに限らないが、４−アジド−Ｌ−フェニ
ルアラニン（Ｆａｚ）、およびLiu C. C. and Schultz P. G.、Annu. Rev. Biochem.、20
10、79、413-444の図１に含まれている１〜７１と番号付けられたアミノ酸のいずれか１
つを含む。導入されるアミノ酸は、上に考察したとおり修飾されてよい。

好ましい実施形態ではヘリカーゼは、成分に、例えばリンカー分子を介して化学的に付
着されている。リンカー分子は、下により詳細に考察される。化学的な付着の１つの好適
な方法は、システイン連結である。これは下でより詳細に考察される。

ヘリカーゼは、ヘキサｈｉｓタグまたはＮｉ−ＮＴＡによって成分に一過的に繋がれて
よい。ヘリカーゼおよび成分は、それらが相互に一過的に付着されるようにも修飾されて
よい。

別の好ましい実施形態ではヘリカーゼは、成分に遺伝子的に融合される。構築物全体が
１本のポリヌクレオチド配列から発現される場合にヘリカーゼは、遺伝子的に成分に融合
されている。ヘリカーゼおよび成分のコード配列は、構築物をコードしている１本のポリ
ヌクレオチド配列を形成するために任意の方法で組み合わされてよい。核酸結合タンパク
質へのポアの遺伝子的融合は、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ０９／００１６７９号（ＷＯ２０
１０／００４２６５として公開）において考察されている。

ヘリカーゼおよび成分は、任意の立体配置で遺伝的に融合され得る。ヘリカーゼおよび
成分は、それらの末端アミノ酸を介して融合され得る。例えば成分のアミノ末端はヘリカ
ーゼのカルボキシ末端に融合でき、逆も同様である。成分のアミノ酸配列は、ヘリカーゼ
のアミノ酸配列にインフレームで好ましくは付加される。換言すると成分は、ヘリカーゼ
の配列内に好ましくは挿入される。そのような実施形態ではヘリカーゼおよび成分は、２
つの点で、すなわち成分のアミノおよびカルボキシ末端アミノ酸を介して典型的には付着
される。成分がヘリカーゼの配列内に挿入される場合、成分のアミノおよびカルボキシ末
端アミノ酸が近接近にあり、ヘリカーゼまたはその変種の配列内の隣接アミノ酸にそれぞ
れ付着していることは好ましい。好ましい実施形態では成分は、ヘリカーゼのループ領域
に挿入される。

構築物は、ポリヌクレオチドの移動を制御するヘリカーゼの能力を保持している。ヘリ
カーゼのこの能力は、そのβ鎖およびαヘリックスによって典型的には提供されるその三
次元構造により典型的には提供される。αヘリックスおよびβ鎖は、ループ領域により典
型的には繋がれている。ポリヌクレオチドの移動を制御するヘリカーゼの能力に影響を与
えることを回避するために、成分は好ましくはヘリカーゼのいずれかの末端に遺伝子的に
融合される、またはヘリカーゼの表面露出ループに挿入される。特異的ヘリカーゼのルー
プ領域は、当技術分野において公知の方法を使用して同定できる。例えば、ループ領域は
、タンパク質モデリング、結晶状態におけるタンパク質のＸ線回折測定（Rupp B (2009).
Biomolecular Crystallography: Principles、Practice and Application to Structura
l Biology. New York: Garland Science.）、溶液におけるタンパク質の核磁気共鳴（Ｎ
ＭＲ）分光法（Mark Rance; Cavanagh、John; Wayne J. Fairbrother; Arthur W. Hunt I
II; Skelton、Nicholas J. (2007). Protein NMR spectroscopy: principles and practi
ce (2nd ed.). Boston: Academic Press.）または凍結水和状態におけるタンパク質のク
リオ電子顕微鏡（van Heel M、Gowen B、Matadeen R、Orlova EV、Finn R、Pape T、Cohe
n D、Stark H、Schmidt R、Schatz M、Patwardhan A (2000). ”Single-particle electr
on cryo-microscopy: towards atomic resolution.”. Q Rev Biophys. 33: 307-69を使
用して同定できる。上に述べた方法によって決定されたタンパク質の構造情報は、タンパ
ク質バンク（ＰＤＢ）データベースから公開で入手可能である。

Ｈｅｌ３０８ヘリカーゼ（配列番号１０、１３、１６および１９）に関して、β鎖は２
個のＲｅｃＡ様エンジン（RecA-like engine）ドメイン（ドメイン１および２）において
だけ見出すことができる。これらのドメインは、燃料ヌクレオチド（通常はＡＴＰ）の加
水分解と移動との連関に関与する。ポリヌクレオチドに沿って徐々に動かすための重要な
ドメインは、ドメイン３および４であるが、中でもドメイン４である。興味深いことにド
メイン３および４の両方はαヘリックスだけを含む。ドメイン４中にラチェットヘリック
スと称される重要なαヘリックスがある。結果として本発明のＨｅｌ３０８実施形態では
、成分は好ましくはα−ヘリックスのいずれにも遺伝子的に融合されていない。

別の実施形態ではヘリカーゼは、インテインタグ配列を使用して成分に付着される。２
つのタンパク質は、各タンパク質の末端に適合性の分割インテイン（split intein）タグ
配列を遺伝的にコードすることによって連結され得る。インテインは、触媒または酵素を
必要とせず、２つのタンパク質を連結する際に自己遊離（self release）する。連結は、
痕跡がなく、１本鎖ペプチドを残す。この方法は、一般的にはタンパク質の末端を連結す
るためである。

ヘリカーゼは、成分に直接付着されていてよい。ヘリカーゼは、２つまたは３つなどの
１つまたは複数のリンカーを使用して成分に好ましくは付着されている。１つまたは複数
のリンカーは、成分の可動性を制限するように設計される場合がある。リンカーは、ヘリ
カーゼおよび／または成分における１つまたは複数の反応性システイン残基、反応性リシ
ン残基または非天然アミノ酸に付着してよい。非天然アミノ酸は、上に考察した任意のも
のであってよい。非天然アミノ酸は、好ましくは４−アジド−Ｌ−フェニルアラニン（Ｆ
ａｚ）である。好適なリンカーは、当技術分野において十分公知である。

ヘリカーゼは、１つもしくは複数の化学的架橋剤または１つもしくは複数のペプチドリ
ンカーを使用して好ましくは成分に付着される。好適な化学的架橋剤は、当技術分野にお
いて十分公知である。好適な化学的架橋剤は、これだけに限らないが、次の官能基：マレ
イミド、活性エステル、サクシニミド、アジド、アルキン（ジベンゾシクロオクチノール
（ＤＩＢＯまたはＤＢＣＯ）、ジフルオロシクロアルカンおよび直鎖アルカンなど）、ホ
スフィン（無痕跡および無痕跡でないシュタウディンガーライゲーションにおいて使用さ
れるものなど）、ハロアセチル（ヨードアセトアミドなど）、ホスゲン型試薬、スルホニ
ルクロリド試薬、イソチオシアン酸、ハロゲン化アシル、ヒドラジン、ジスルフィド、ビ
ニルスルホン、アジリジンおよび光反応性試薬（アリールアジド、ジアジリジンなど）を
含むものを含む。架橋剤は、好ましくはビス（スルホサクシニミジル）スベレート（ＢＳ
^３）ではない。ヘリカーゼおよび成分は、好ましくはホルムアルデヒドを使用して架橋結
合されない。

システイン／マレイミドなど、アミノ酸と官能基との間の反応は自発的であってよく、
またはアジドと直鎖状アルキンを連結するためのＣｕ（Ｉ）など、他の試薬を必要として
よい。

リンカーは、必要な距離にわたって伸びる任意の分子を含んでよい。リンカーは、炭素
１個（ホスゲン型リンカー）から多数のオングストロームに長さが変化できる。直鎖状分
子の例に含まれるのは、これだけに限らないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポ
リペプチド、多糖、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、トレオース
核酸（ＴＮＡ）、グリセロール核酸（ＧＮＡ）、飽和および不飽和炭化水素、ポリアミド
である。これらのリンカーは不活性または反応性であってよく、具体的にはそれらは、規
定の位置で化学的に切断可能であってよい、またはフルオロフォアもしくはリガンドでそ
れ自体が修飾されてよい。リンカーは、好ましくはジチオスレイトール（dithiothreitol
）（ＤＴＴ）に抵抗性である。

切断可能なリンカーは、非付着構成成分からの構築物の分離への補助として使用でき、
合成反応をさらに制御するために使用できる。例えばヘテロ二機能性リンカーは、ヘリカ
ーゼと反応できるが、成分とはできない。ヘリカーゼタンパク質を表面に結合するために
リンカーの遊離末端が使用できる場合、最初の反応由来の未反応ヘリカーゼは混合物から
除去され得る。続いてリンカーは、成分と反応する基を露出させるために切断され得る。
付加的に、一連の連結反応に続いて、条件は最初にヘリカーゼへの反応のために、次いで
リンカーの切断後の成分への反応のために最適化され得る。第二の反応は、リンカーが既
に付着している領域に限定されることから、成分との正確な反応部位に向けてさらに方向
付けられる。

好ましい架橋剤は、２，５−ジオキソピロリジン−１−イル３−（ピリジン−２−イル
ジスルファニル）プロパノエート、２，５−ジオキソピロリジン−１−イル４−（ピリジ
ン−２−イルジスルファニル）ブタノエート、２，５−ジオキソピロリジン−１−イル８
−（ピリジン−２−イルジスルファニル）オクタノエート、ジ−マレイミドＰＥＧ １ｋ
、ジ−マレイミドＰＥＧ ３．４ｋ、ジ−マレイミドＰＥＧ ５ｋ、ジ−マレイミドＰＥ
Ｇ １０ｋ、ビス（マレイミド）エタン（ＢＭＯＥ）、ビス−マレイミドヘキサン（ＢＭ
Ｈ）、１，４−ビス−マレイミドブタン（ＢＭＢ）、１，４ビス−マレイミジル−２，３
−ジヒドロキシブタン（ＢＭＤＢ）、ＢＭ［ＰＥＯ］２（１，８−ビス−マレイミドジエ
チレングリコール）、ＢＭ［ＰＥＯ］３（１，１１−ビス−マレイミドトリエチレングリ
コール）、トリス［２−マレイミドエチル］アミン（ＴＭＥＡ）、ＤＴＭＥジチオビスマ
レイミドエタン、ビスマレイミドＰＥＧ３、ビスマレイミドＰＥＧ１１、ＤＢＣＯ−マレ
イミド、ＤＢＣＯ−ＰＥＧ４−マレイミド、ＤＢＣＯ−ＰＥＧ４−ＮＨ２、ＤＢＣＯ−Ｐ
ＥＧ４−ＮＨＳ、ＤＢＣＯ−ＮＨＳ、ＤＢＣＯ−ＰＥＧ−ＤＢＣＯ ２．８ｋＤａ、ＤＢ
ＣＯ−ＰＥＧ−ＤＢＣＯ ４．０ｋＤａ、ＤＢＣＯ−１５原子−ＤＢＣＯ、ＤＢＣＯ−２
６原子−ＤＢＣＯ、ＤＢＣＯ−３５原子−ＤＢＣＯ、ＤＢＣＯ−ＰＥＧ４−Ｓ−Ｓ−ＰＥ
Ｇ３−ビオチン、ＤＢＣＯ−Ｓ−Ｓ−ＰＥＧ３−ビオチン、ＤＢＣＯ−Ｓ−Ｓ−ＰＥＧ１
１−ビオチンを含む。最も好ましい架橋剤は、サクシニジミル３−（２−ピリジルジチオ
）プロピオン酸（ＳＰＤＰ）およびマレイミド−ＰＥＧ（２ｋＤａ）−マレイミド（アル
ファ，オメガ−ビス−マレイミドポリ（エチレングリコール））である。

ヘリカーゼは、ヘリカーゼ／架橋剤複合体が成分に共有結合的に付着する前に、二機能
性架橋剤に共有結合的に付着されてよい。代替的に成分は、二機能性架橋剤／成分複合体
がヘリカーゼに付着する前に、二機能性架橋剤に共有結合的に付着してよい。ヘリカーゼ
および成分は、化学的架橋剤に同時に共有結合的に付着してよい。

ヘリカーゼは、相互に特異的である２つの異なるリンカーを使用して成分に付着される
場合がある。リンカーの一方は、ヘリカーゼに付着しており、他方は成分に付着している
。一度一緒に混合されると、リンカーは、本明細書に記載の構築物を形成するように反応
しなければならない。ヘリカーゼは、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ１０／０００１３２号（Ｗ
Ｏ２０１０／０８６６０２として公開）に記載のハイブリダイゼーションリンカーを使用
して成分に付着されてよい。具体的にはヘリカーゼは、ハイブリダイズ可能な領域および
共有結合を形成できる基をそれぞれ含む２つ以上のリンカーを使用して成分に付着されて
よい。リンカーにおけるハイブリダイズ可能な領域は、成分にハイブリダイズし、連結す
る。連結された成分は、次いで基の間の共有結合の形成を介してカップリングされる。国
際出願第ＰＣＴ／ＧＢ１０／０００１３２号（ＷＯ２０１０／０８６６０２として公開）
に開示の任意の特異的リンカーは、本発明により使用できる。

ヘリカーゼおよび成分は、修飾される場合があり、次いで２つの修飾に特異的である化
学的架橋剤を使用して付着されてよい。上に考察した任意の架橋剤は、使用できる。

代替的にリンカーは、アミノ酸配列を好ましくは含む。そのようなリンカーは、ペプチ
ドリンカーである。ペプチドリンカーの長さ、可動性および親水性は、ヘリカーゼおよび
成分の機能を妨害しないように典型的には設計される。好ましい可動性ペプチドリンカー
は４、６、８、１０または１６などの２から２０のセリンおよび／またはグリシンアミノ
酸のストレッチである。より好ましい可動性リンカーは（ＳＧ）_１、（ＳＧ）_２、（ＳＧ
）_３、（ＳＧ）_４、（ＳＧ）_５、（ＳＧ）_８、（ＳＧ）_１０、（ＳＧ）_１５または（ＳＧ
）_２０を含み、式中Ｓはセリンであり、Ｇはグリシンである。好ましい硬いリンカーは、
４、６、８、１６または２４などの２から３０のプロリンアミノ酸のストレッチである。
より好ましい硬いリンカーは（Ｐ）_１２を含み、式中Ｐはプロリンである。

リンカーは、標識されてよい。好適な標識は、これだけに限らないが、蛍光分子（Ｃｙ
３またはＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）５５５など）、放射性同位元素、例えば ^１
２５Ｉ、^３５Ｓ、酵素、抗体、抗原、ポリヌクレオチドおよび、ビオチンなどのリガンド
を含む。そのような標識は、リンカーの量を定量できるようにする。標識は、ビオチンな
どの切断可能な精製タグ、またはタンパク質自体には存在しないがトリプシン消化によっ
て遊離されるペプチドなどの同定方法において明らかになる特異的配列であってもよい。

ヘリカーゼを成分に付着させる好ましい方法は、システイン連結を介する。これは、二
機能性化学的リンカーにより、または末端に存在するシステイン残基を有するポリペプチ
ドリンカーにより調節できる。連結は、ヘリカーゼおよび／または成分中の天然システイ
ンを介して生じてよい。代替的にシステインは、ヘリカーゼおよび／または成分に導入さ
れる場合がある。ヘリカーゼがシステイン連結を介して成分に付着される場合、１つまた
は複数のシステインは、置換によってヘリカーゼおよび／または成分に好ましくは導入さ
れる。

任意の二機能性リンカーの長さ、反応性、特異性、硬さおよび溶解度は、成分がヘリカ
ーゼとの関連で正確に位置付けられ、ヘリカーゼおよび成分の両方の機能が保持されるこ
とを確実にするように設計され得る。好適なリンカーは、１，４−ビス（マレイミド）ブ
タン（ＢＭＢ）またはビス（マレイミド）ヘキサンなどのビスマレイミド架橋剤を含む。
特異的部位での付着が好ましい場合に、表面の利用可能なシステイン残基への二機能性リ
ンカーの結合は制御することが困難である場合があり、基質結合または活性に影響を与え
る場合があることから、二機能性リンカーを引き戻すものは、さらなる表面の利用可能な
システイン残基を含まないヘリカーゼおよび成分の必要性である。ヘリカーゼおよび／ま
たは成分がいくつかの利用可能なシステイン残基を含有する場合は、修飾がヘリカーゼお
よび成分のフォールディングまたは活性に影響を与えないことを確実にしながら、それら
を除去するためにヘリカーゼおよび／または成分の修飾が必要である場合がある。これは
、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ１０／０００１３３号（ＷＯ２０１０／０８６６０３として公
開）において考察されている。好ましい実施形態では反応性システインは、成分に遺伝子
的に付着されているペプチドリンカー上に存在する。これは、成分から他の利用可能なシ
ステイン残基を除去するために追加的修飾が必ずしも必要ではないことを意味する。シス
テイン残基の反応性は隣接残基の、例えばペプチドリンカー上の修飾によって増強できる
。例えば近接するアルギニン、ヒスチジンまたはリシン残基の塩基性基は、システインチ
オール基のｐＫａをさらに反応性のＳ⁻基のものに変化させる。システイン残基の反応性
は、５，５’−ジチオビス−（２−ニトロ安息香酸）（ｄＴＮＢ）などのチオール保護基
によって保護できる。これらは、リンカーが付着される前に成分またはヘリカーゼの１つ
または複数のシステイン残基と、単量体またはオリゴマーの部分としてのいずれかで反応
され得る。表面の利用可能なシステインの選択的脱保護は、ビーズに固定した還元試薬（
例えば固定化トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン、ＴＣＥＰ）を使用して可能で
ある。２つ以上のヘリカーゼのシステイン連結は、下により詳細に考察される。

ヘリカーゼを成分に付着させる別の好ましい方法は、４−アジド−Ｌ−フェニルアラニ
ン（Ｆａｚ）連結を介する。これは、二機能性化学的リンカーによってまたは末端に存在
するＦａｚ残基を有するポリペプチドリンカーによって調節できる。１つまたは複数のＦ
ａｚ残基は、置換によってヘリカーゼおよび／または成分に好ましくは導入される。２つ
以上のヘリカーゼのＦａｚ連結は、下により詳細に考察される。

ヘリカーゼまたは成分のそれ自体への交差結合は、リンカーの濃度をヘリカーゼおよび
／または成分の大過剰に維持することによって妨げることができる。代替的に「鍵と鍵穴
」配置は、２つのリンカーが使用される場合に使用できる。各リンカーの一方の末端だけ
が長いリンカーを形成するために併せて反応でき、リンカーの他方の末端は構築物の異な
る部分（すなわちヘリカーゼまたは成分）とそれぞれ反応する。これは下でより詳細に考
察される。

付着の部位は、構築物がポリヌクレオチドと接触する場合に、ヘリカーゼおよび成分の
両方がポリヌクレオチドに結合でき、その移動を制御できるように選択される。

付着は、ヘリカーゼおよび成分のポリヌクレオチド結合活性を使用して促進され得る。
例えば相補的ポリヌクレオチドは、ヘリカーゼおよび成分を、それらがハイブリダイズす
ることから、併せて運ぶために使用できる。ヘリカーゼは一方のポリヌクレオチドに結合
でき、成分は相補的ポリヌクレオチドに結合できる。次いで２つのポリヌクレオチドは、
相互にハイブリダイズできるようになる。これは、ヘリカーゼを成分と密接に接触するよ
うにして、連結反応をさらに効率的にする。これは、標的ポリヌクレオチドの移動を制御
するための正確な方向で２つ以上のヘリカーゼを付着させるために特に有益である。使用
できる相補的ポリヌクレオチドの一例は、下に示されている。

ヘリカーゼ−Ｐｈｉ２９構築物に関して、下のＤＮＡは使用され得る。

構築物の精製を容易にするためにタグが構築物に付加され得る。これらのタグは、次い
でそれらの除去が必要である場合に、化学的にまたは酵素的に切断除去され得る。フルオ
ロフォアまたはクロモフォアも含まれる場合があり、これらも切断可能であってよい。

構築物を精製するための簡単な方法は、各タンパク質（すなわちヘリカーゼおよび成分
）上に、ヘキサ−Ｈｉｓ−タグおよびＳｔｒｅｐ−タグ（登録商標）などの異なる精製タ
グを含むことである。２つのタンパク質が互いに異なる場合、この方法は特に有用である
。２つのタグの使用は、両方のタグを含む分子種だけが容易に精製されるようにする。

２つのタンパク質が２つの異なるタグを有さない場合、他の方法が使用できる。例えば
遊離表面システインを有するタンパク質または構築物を形成するために反応していない付
着リンカーを有するタンパク質は、例えばマレイミドリンカーに対するヨードアセトアミ
ドレジンを使用して除去され得る。

構築物は、未反応タンパク質から異なるＤＮＡ前進性特徴に基づいても精製され得る。
具体的には構築物は、未反応タンパク質からポリヌクレオチドに対する親和性の増大、既
に結合したポリヌクレオチドから離れる可能性の低減および／またはナノポアを通るポリ
ヌクレオチドの移行を制御するときのポリヌクレオチドの読み取り長さの増大に基づいて
精製され得る。

ヘリカーゼ
任意のヘリカーゼは、本明細書に記載の構築物に使用してよい。ヘリカーゼは、しばし
ばトランスロカーゼとして公知であり、２つの用語は互換的に使用できる。好適なヘリカ
ーゼは、当技術分野において十分公知である（M. E. Fairman-Williamsら、Curr. Opin.
Struct Biol.、2010、20 (3)、313-324、T. M. Lohmanら、Nature Reviews Molecular Ce
ll Biology、2008、9、391-401）。ヘリカーゼは典型的にはスーパーファミリー１から６
の内の１つのメンバーである。ヘリカーゼは、好ましくは成分分類（ＥＣ）群３．６．１
．−および２．７．７．−．のいずれかのメンバーである。ヘリカーゼは、好ましくはＡ
ＴＰ−依存性ＤＮＡヘリカーゼ（ＥＣ群３．６．４．１２）、ＡＴＰ−依存性ＲＮＡヘリ
カーゼ（ＥＣ群３．６．４．１３）またはＡＴＰ非依存性ＲＮＡヘリカーゼである。

ヘリカーゼは、多量体またはオリゴマーヘリカーゼであってよい。換言するとヘリカー
ゼは、機能するために二量体などの多量体またはオリゴマーを形成する必要がある場合が
ある。しかし上に考察したとおり構築物それ自体は、多量体またはオリゴマーヘリカーゼ
であることはできない。多量体またはオリゴマーヘリカーゼは追加的ポリヌクレオチド結
合成分に付着されていなければならない。ヘリカーゼは、好ましくは単量体である。換言
するとヘリカーゼは、好ましくは機能するために二量体などの多量体またはオリゴマーを
形成する必要はない。Ｈｅｌ３０８、ＲｅｃＤ、ＴｒａＩおよびＸＰＤヘリカーゼは、全
て単量体ヘリカーゼである。これらは下により詳細に考察される。ヘリカーゼは、好まし
くはＣ型肝炎ウイルスＮＳ３ヘリカーゼ（ＮＳ３ｈとしても公知）ではない。ＮＳ３ヘリ
カーゼは、オリゴマーとして作用し、単量体ではない。

単量体ヘリカーゼは、一緒に付着しているいくつかのドメインを含んでよい。例えばＴ
ｒａＩヘリカーゼおよびＴｒａＩサブグループヘリカーゼは２つのＲｅｃＤヘリカーゼド
メイン、レラクサーゼ（relaxase）ドメインおよびＣ末端ドメインを含有する場合がある
。ドメインは、オリゴマーを形成することなく機能できる単量体ヘリカーゼを典型的には
形成する。

ヘリカーゼは、典型的には完全なＨｅｌ３０８、ＲｅｃＤ、ＴｒａＩまたはＸＰＤヘリ
カーゼなどの完全なヘリカーゼである。ヘリカーゼは、好ましくはヘリカーゼ酵素由来の
ヘリカーゼドメインではない。例えばヘリカーゼは、好ましくはブロムモザイクウイルス
（Brome mosaic virus）（ＢＭＶ）ウイルス複製タンパク質１ａ由来のＲｅｃＤドメイン
またはヘリカーゼドメインではない。構築物は、それ自体が、互いに付着している２つの
ＲｅｃＤドメインを含むＴｒａＩヘリカーゼなどの、互いに付着している２つ以上のヘリ
カーゼドメインを含むヘリカーゼであることはできない。構築物は、ＴｒａＩヘリカーゼ
などの２つ以上のヘリカーゼドメインを含むヘリカーゼを含む場合があるが、追加的ポリ
ヌクレオチド結合成分に付着されていなければならない。ヘリカーゼは、内部ヌクレオチ
ドで標的ポリヌクレオチドに好ましくは結合できる。内部ヌクレオチドは、標的ポリヌク
レオチド中の末端ヌクレオチドではないヌクレオチドである。例えばそれは３’末端ヌク
レオチドまたは５’末端ヌクレオチドではない。環状ポリヌクレオチド中の全てのヌクレ
オチドは内部ヌクレオチドである。

一般に内部ヌクレオチドで結合できるヘリカーゼは、末端ヌクレオチドでも結合できる
が、いくつかのヘリカーゼについて内部ヌクレオチドで結合する傾向は、他よりも大きい
。本発明において使用に好適なヘリカーゼは、ポリヌクレオチドへのその結合の典型的に
は少なくとも１０％が内部ヌクレオチドにである。典型的には、その結合の少なくとも２
０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％または少なくとも５０％が内部ヌクレオチド
にである。末端ヌクレオチドでの結合は、末端ヌクレオチドおよび隣接内部ヌクレオチド
の両方へ結合を同時に含み得る。本発明の目的のためにこれは、内部ヌクレオチドでの標
的ポリヌクレオチドへの結合ではない。換言すると本発明において使用されるヘリカーゼ
は、１つまたは複数の隣接内部ヌクレオチドとの組合せで末端ヌクレオチドに結合できる
だけではない。ヘリカーゼは、末端ヌクレオチドに同時に結合することなく内部ヌクレオ
チドに結合できる。

内部ヌクレオチドで結合できるヘリカーゼは、１個より多い内部ヌクレオチドに結合で
きる。典型的にはヘリカーゼは、少なくとも２個の内部ヌクレオチド、例えば少なくとも
３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも１０個または少なくとも１５個の内
部ヌクレオチドに結合する。典型的にはヘリカーゼは、少なくとも２個の隣接する内部ヌ
クレオチド、例えば少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも１０
個または少なくとも１５個の隣接する内部ヌクレオチドに結合する。少なくとも２個の内
部ヌクレオチドは、隣接または非隣接であってよい。

内部ヌクレオチドでポリヌクレオチドに結合するヘリカーゼの能力は、競合アッセイを
実行することによって決定できる。対照ポリヌクレオチドＡに結合するモーターの能力は
、同じだが末端ヌクレオチドに付着しているブロッキング基を含むポリヌクレオチド（ポ
リヌクレオチドＢ）に結合する能力と比較される。ブロッキング基は、鎖Ｂの末端ヌクレ
オチドでのいかなる結合も妨げ、それによりヘリカーゼの内部結合だけを可能にする。

内部ヌクレオチドで結合できるヘリカーゼの例は、これだけに限らないが、Ｈｅｌ３０
８Ｔｇａ、Ｈｅｌ３０８ＭｈｕおよびＨｅｌ３０８Ｃｓｙを含む。したがって分子モータ
ーは、好ましくは（ａ）Ｈｅｌ３０８Ｔｇａ（すなわち配列番号１６）の配列もしくはそ
の変種または（ｂ）Ｈｅｌ３０８Ｃｓｙ（すなわち配列番号１３）の配列もしくはその変
種または（ｃ）Ｈｅｌ３０８Ｍｈｕ（すなわち配列番号１９）の配列もしくはその変種を
含む。これらの配列の変種は、下により詳細に考察される。変種は、上に考察したとおり
付着を促進するために１つもしくは複数の置換システイン残基および／または１つもしく
は複数の置換Ｆａｚ残基を好ましくは含む。

ヘリカーゼは、好ましくはＨｅｌ３０８ヘリカーゼである。Ｈｅｌ３０８ヘリカーゼは
、それらがオリゴマーを形成することなく機能することから単量体である。本発明に従っ
て、任意のＨｅｌ３０８ヘリカーゼを使用し得る。Ｈｅｌ３０８ヘリカーゼはｓｋｉ２様
ヘリカーゼとしても公知であり、２つの用語は互換的に用いられ得る。好適なＨｅｌ３０
８ヘリカーゼは、米国特許出願第６１，５４９，９９８号の表４および第６１／５９９，
２４４ならびに国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０１２／０５２５７９号（ＷＯ２０１３／０５
７４９５として公開）に開示されている。

Ｈｅｌ３０８ヘリカーゼは、アミノ酸モチーフＱ−Ｘ１−Ｘ２−Ｇ−Ｒ−Ａ−Ｇ−Ｒ（
本明細書以下でＨｅｌ３０８モチーフと称する；配列番号８）を典型的には含む。Ｈｅｌ
３０８モチーフは、典型的にはヘリカーゼモチーフＶＩの部分である（Tuteja and Tutej
a、Eur.J.Biochem.271 1849-1863(2004)）。Ｘ１は、Ｃ、ＭまたはＬであってよい。Ｘ１
は、好ましくはＣである。Ｘ２は、任意のアミノ酸残基であってよい。Ｘ２は、典型的に
は疎水性または中性残基である。Ｘ２は、Ａ、Ｆ、Ｍ、Ｃ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｐまた
はＲであってよい。Ｘ２は、好ましくはＡ、Ｆ、Ｍ、Ｃ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｓ、ＴまたはＰで
ある。Ｘ２は、より好ましくはＡ、ＭまたはＬである。Ｘ２は、最も好ましくはＡまたは
Ｍである。

Ｈｅｌ３０８ヘリカーゼは、好ましくはモチーフＱ−Ｘ１−Ｘ２−Ｇ−Ｒ−Ａ−Ｇ−Ｒ
−Ｐ（本明細書以下で伸張されたＨｅｌ３０８モチーフと称される；配列番号９）を含み
、式中Ｘ１およびＸ２は上に記載のとおり。

最も好ましいＨｅｌ３０８モチーフおよび伸張されたＨｅｌ３０８モチーフは、下の表
１に示される。

最も好ましいＨｅｌ３０８モチーフは、配列番号１７に示されている。最も好ましい伸
長されたＨｅｌ３０８モチーフは、配列番号１８に示されている。他の好ましいＨｅｌ３
０８モチーフおよび伸長されたＨｅｌ３０８モチーフは、米国特許出願第６１，５４９，
９９８号の表５および第６１／５９９，２４４号ならびに国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０１
２／０５２５７９号（ＷＯ ２０１３／０５７４９５として公開）に見出すことができる
。

Ｈｅｌ３０８ヘリカーゼは、Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ（すなわち配列番号１０）の配列また
はその変種を好ましくは含む。Ｈｅｌ３０８ヘリカーゼは、より好ましくは（ａ）Ｈｅｌ
３０８Ｔｇａの配列（すなわち、配列番号１６）もしくはその変種、（ｂ）Ｈｅｌ３０８
Ｃｓｙの配列（すなわち、配列番号１３）もしくはその変種、または（ｃ）Ｈｅｌ３０８
Ｍｈｕの配列（すなわち配列番号１９）もしくはその変種を含む。最も好ましくはＨｅｌ
３０８ヘリカーゼは、配列番号１６またはその変種に示されている配列を含む。

Ｈｅｌ３０８ヘリカーゼの変種は、野生型ヘリカーゼの配列から変化しているアミノ酸
配列を有し、ポリヌクレオチド結合活性を保持している酵素である。特に、配列番号１０
、１３、１６または１９の変種は、配列番号１０、１３、１６または１９の配列から変化
しているアミノ酸配列を有し、ポリヌクレオチド結合活性を保持している酵素である。ポ
リヌクレオチド結合活性は、当技術分野において公知の任意の方法を使用して決定できる
。好適な方法は、これだけに限らないが、蛍光偏光測定、トリプトファン蛍光および電気
泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）を含む。例えば１本鎖ポリヌクレオチドに結合す
る変種の能力は、実施例に記載のとおり決定できる。

変種はヘリカーゼ活性を保持している。これは、種々の方法において測定できる、例え
ばポリヌクレオチドに沿って移行させる変種の能力は電気生理化学、蛍光アッセイまたは
ＡＴＰ加水分解を使用して測定され得る。

変種は、ヘリカーゼをコードするポリヌクレオチドの操作を促進するならびに／または
高塩濃度および／もしくは室温でのその活性を促進する修飾を含む場合がある。変種は、
上で考察したＨｅｌ３０８モチーフまたは伸張されたＨｅｌ３０８モチーフの外の領域に
おいて野生型ヘリカーゼとは典型的には異なる。しかし変種は、これらのモチーフ（複数
可）内に修飾を含む場合がある。

配列番号１０、１３、１６または１９のアミノ酸配列全長にわたって、変種は好ましく
は、アミノ酸同一性に基づいてその配列に対して少なくとも３０％相同である。より好ま
しくは、変種ポリペプチドは、配列番号１０、１３、１６または１９のアミノ酸配列に対
して、配列全長にわたるアミノ酸同一性に基づいて、少なくとも４０％、少なくとも４５
％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少な
くとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９
０％およびより好ましくは少なくとも９５％、９７％または９９％相同であってよい。少
なくとも７０％、例えば少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または
少なくとも９５％のアミノ酸同一性が１５０以上のストレッチ、例えば２００、３００、
４００、５００、６００、７００、８００、９００または１０００以上の連続するアミノ
酸にわたってあり得る（「高い相同性」）。相同性は上に記載のとおり決定される。変種
は配列番号２および４を参照して下に考察したいずれの方法においても野生型配列と異な
っていてよい。

配列番号１０、１３、１６または１９の変種は、上で表１に示されたとおり、野生型配
列のＨｅｌ３０８モチーフまたは伸張されたＨｅｌ３０８モチーフを好ましくは含む。し
かし変種は、異なる野生型配列由来のＨｅｌ３０８モチーフまたは伸長されたＨｅｌ３０
８モチーフを含む場合がある。例えば配列番号１２の変種は、Ｈｅｌ３０８モチーフまた
は配列番号１３から伸張されたＨｅｌ３０８モチーフ（すなわち配列番号１４または１５
）を含んでもよい。配列番号１０、１３、１６または１９の変種は、関連する野生型配列
のＨｅｌ３０８モチーフまたは伸長されたＨｅｌ３０８モチーフ内に修飾を含む場合もあ
る。Ｘ１およびＸ２での好適な修飾は、２つのモチーフを定義する際に上に考察されてい
る。配列番号１０、１３、１６または１９の変種は、上に考察したとおり付着を促進する
ために１つもしくは複数の置換システイン残基および／または１つもしくは複数の置換Ｆ
ａｚ残基を好ましくは含む。

配列番号１０の変種は、配列番号１０の最初の１９アミノ酸を欠失しているおよび／ま
たは配列番号１０の最後の３３アミノ酸を欠失している場合がある。配列番号１０の変種
は、配列番号１０のアミノ酸２０から２１１または２０から７２７にアミノ酸同一性に基
づいて少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少
なくとも９０％またはより好ましくは少なくとも９５％、少なくとも９７％もしくは少な
くとも９９％相同である配列を好ましくは含む。

配列番号１０（Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ）は５個の天然システイン残基を含有する。しかし
、これらの残基の全ては酵素のＤＮＡ結合グローブ（grove）内または周辺に位置付けら
れている。ＤＮＡ鎖が酵素内に結合されると、これらの天然システイン残基は、外からの
修飾に関して利用しにくくなる。これは、上に考察したとおり配列番号１０の特異的シス
テイン変異体の設計を可能にし、システイン連結を使用して成分に付着できるようにする
。配列番号１０の好ましい変種は、次の置換：Ａ２９Ｃ、Ｑ２２１Ｃ、Ｑ４４２Ｃ、Ｔ５
６９Ｃ、Ａ５７７Ｃ、Ａ７００ＣおよびＳ７０８Ｃの１つまたは複数を有する。これらの
位置の１つまたは複数でのシステイン残基の導入は、上に考察したとおりシステイン連結
を促進する。配列番号１０の他の好ましい変種は次の置換：Ｍ２Ｆａｚ、Ｒ１０Ｆａｚ、
Ｆ１５Ｆａｚ、Ａ２９Ｆａｚ、Ｒ１８５Ｆａｚ、Ａ２６８Ｆａｚ、Ｅ２８４Ｆａｚ、Ｙ３
８７Ｆａｚ、Ｆ４００Ｆａｚ、Ｙ４５５Ｆａｚ、Ｅ４６４Ｆａｚ、Ｅ５７３Ｆａｚ、Ａ５
７７Ｆａｚ、Ｅ６４９Ｆａｚ、Ａ７００Ｆａｚ、Ｙ７２０Ｆａｚ、Ｑ４４２Ｆａｚおよび
Ｓ７０８Ｆａｚの１つまたは複数を有する。これらの位置の１つまたは複数でのＦａｚ残
基の導入は、上に考察したとおりＦａｚ連結を促進する。

ヘリカーゼは、好ましくはＲｅｃＤヘリカーゼである。ＲｅｃＤヘリカーゼは、それら
がオリゴマーを形成することなく機能することから単量体である。任意のＲｅｃＤヘリカ
ーゼが本発明により使用できる。ＲｅｃＤヘリカーゼの構造は、当技術分野において公知
である（FEBS J. 2008 Apr;275(8):1835-51. Epub 2008 Mar 9. ATPase activity of Rec
D is essential for growth of the Antarctic Pseudomonas syringae Lz4W at low temp
erature. Satapathy AK、Pavankumar TL、Bhattacharjya S、Sankaranarayanan R、Ray M
K; EMS Microbiol Rev. 2009 May;33(3):657-87. The diversity of conjugative relaxa
ses and its application in plasmid classification. Garcillan-Barcia MP、Francia
MV、de la Cruz F; J Biol Chem. 2011 Apr 8;286(14):12670-82. Epub 2011 Feb 2. Fun
ctional characterization of the multidomain F plasmid TraI relaxase-helicase. Ch
eng Y、McNamara DE、Miley MJ、Nash RP、Redinbo MR）。

ＲｅｃＤヘリカーゼは、アミノ酸モチーフＸ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｇ−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−
Ｘ７（本明細書以下でＲｅｃＤ様モチーフＩと称する；配列番号２０）を典型的には含み
、式中Ｘ１はＧ、ＳまたはＡであり、Ｘ２は任意のアミノ酸であり、Ｘ３はＰ、Ａ、Ｓま
たはＧであり、Ｘ４はＴ、Ａ、Ｖ、ＳまたはＣであり、Ｘ５はＧまたはＡであり、Ｘ６は
ＫまたはＲおよびＸ７はＴまたはＳである。Ｘ１は好ましくはＧである。Ｘ２は好ましく
はＧ、Ｉ、ＹまたはＡである。Ｘ２はより好ましくはＧである。Ｘ３は好ましくはＰまた
はＡである。Ｘ４は好ましくはＴ、Ａ、ＶまたはＣである。Ｘ４は好ましくはＴ、Ｖまた
はＣである。Ｘ５は好ましくはＧである。Ｘ６は好ましくはＫである。Ｘ７は好ましくは
ＴまたはＳである。ＲｅｃＤヘリカーゼは、Ｑ−（Ｘ８）_{１６〜１８}−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３
−Ｇ−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７（本明細書以下で伸長されたＲｅｃＤ様モチーフＩと称す
る；配列番号２１、２２および２３）を好ましくは含み、式中Ｘ１からＸ７は上に定義の
とおりであり、Ｘ８は任意のアミノ酸である。好ましくは伸長されたＲｅｃＤ様モチーフ
Ｉ中に１６個のＸ８残基がある（すなわち（Ｘ８）_１６）。（Ｘ８）_１６についての好適
な配列は、米国特許出願第６１／５８１，３３２号の配列番号１４、１７、２０、２３、
２６、２９、３２、３５、３８、４１、４４、４７および５０ならびに国際出願第ＰＣＴ
／ＧＢ２０１２／０５３２７４号（ＷＯ２０１２／０９８５６２として公開）の配列番号
１８、２１、２４、２５、２８、３０、３２、３５、３７、３９、４１、４２および４４
で同定できる。

ＲｅｃＤヘリカーゼは、アミノ酸モチーフＧ−Ｇ−Ｐ−Ｇ−Ｘａ−Ｇ−Ｋ−Ｘｂ（本明
細書以下でＲｅｃＤモチーフＩと称する；配列番号２４）を好ましくは含み、式中Ｘａは
Ｔ、ＶまたはＣであり、ＸｂはＴまたはＳである。Ｘａは好ましくはＴである。Ｘｂは好
ましくはＴである。ＲｅｃＤヘリカーゼは、配列Ｇ−Ｇ−Ｐ−Ｇ−Ｔ−Ｇ−Ｋ−Ｔ（配列
番号２５）を好ましくは含む。ＲｅｃＤヘリカーゼは、アミノ酸モチーフＱ−（Ｘ８）_{１
６〜１８}−Ｇ−Ｇ−Ｐ−Ｇ−Ｘａ−Ｇ−Ｋ−Ｘｂ（本明細書以下で伸長されたＲｅｃＤモ
チーフＩと称する；配列番号２６、２７および２８）をより好ましくは含み、式中Ｘａお
よびＸｂは上に定義のとおりであり、Ｘ８は任意のアミノ酸である。伸長されたＲｅｃＤ
モチーフＩ中に好ましくは１６個のＸ８残基がある（すなわち（Ｘ８）_１６）。（Ｘ８）
_１６についての好適な配列は、米国特許出願第６１／５８１，３３２号の配列番号１４、
１７、２０、２３、２６、２９、３２、３５、３８、４１、４４、４７および５０ならび
に国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０１２／０５３２７４号（ＷＯ２０１２／０９８５６２とし
て公開）の配列番号１８、２１、２４、２５、２８、３０、３２、３５、３７、３９、４
１、４２および４４で同定できる。

ＲｅｃＤヘリカーゼは、アミノ酸モチーフＸ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−（Ｘ６）_３
−Ｑ−Ｘ７（本明細書以下でＲｅｃＤ様モチーフＶと称する；配列番号２９）を典型的に
は含み、式中Ｘ１はＹ、ＷまたはＦであり、Ｘ２はＡ、Ｔ、Ｓ、Ｍ、ＣまたはＶであり、
Ｘ３は任意のアミノ酸であり、Ｘ４はＴ、ＮまたはＳであり、Ｘ５はＡ、Ｔ、Ｇ、Ｓ、Ｖ
またはＩであり、Ｘ６は任意のアミノ酸であり、Ｘ７はＧまたはＳである。Ｘ１は好まし
くはＹである。Ｘ２は好ましくはＡ、Ｍ、ＣまたはＶである。Ｘ２はより好ましくはＡで
ある。Ｘ３は好ましくはＩ、ＭまたはＬである。Ｘ３はより好ましくはＩまたはＬである
。Ｘ４は好ましくはＴまたはＳである。Ｘ４はより好ましくはＴである。Ｘ５は好ましく
はＡ、ＶまたはＩである。Ｘ５はより好ましくはＶまたはＩである。Ｘ５は最も好ましく
はＶである。（Ｘ６）_３は好ましくはＨ−Ｋ−Ｓ、Ｈ−Ｍ−Ａ、Ｈ−Ｇ−ＡまたはＨ−Ｒ
−Ｓである。（Ｘ６）_３はより好ましくはＨ−Ｋ−Ｓである。Ｘ７は好ましくはＧである
。ＲｅｃＤヘリカーゼは、アミノ酸モチーフＸａ−Ｘｂ−Ｘｃ−Ｘｄ−Ｘｅ−Ｈ−Ｋ−Ｓ
−Ｑ−Ｇ（本明細書以下でＲｅｃＤモチーフＶと称する；配列番号３０）を好ましくは含
み、式中ＸａはＹ、ＷまたはＦであり、ＸｂはＡ、Ｍ、ＣまたはＶであり、ＸｃはＩ、Ｍ
またはＬであり、ＸｄはＴまたはＳであり、ＸｅはＶまたはＩである。Ｘａは好ましくは
Ｙである。Ｘｂは好ましくはＡである。Ｘｄは好ましくはＴである。Ｘｄは好ましくはＶ
である。好ましいＲｅｃＤモチーフＩは米国特許出願第６１／５８１，３３２号の表５お
よび国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０１２／０５３２７４号（ＷＯ２０１２／０９８５６２と
して公開）に示されている。好ましいＲｅｃＤ様モチーフＩは米国特許出願第６１／５８
１，３３２号の表７および国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０１２／０５３２７４号（ＷＯ２０
１２／０９８５６２として公開）に示されている。好ましいＲｅｃＤ様モチーフＶは米国
特許出願第６１／５８１，３３２号の表５および７ならびに国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０
１２／０５３２７４号（ＷＯ２０１２／０９８５６２として公開）に示されている。

ＲｅｃＤヘリカーゼは、好ましくは米国特許出願第６１／５８１，３３２号の表４もし
くは５および国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０１２／０５３２７４号（ＷＯ２０１２／０９８
５６２として公開）に示されているヘリカーゼの１つまたはその変種である。変種は米国
特許出願第６１／５８１，３３２号および国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０１２／０５３２７
４号（ＷＯ２０１２／０９８５６２として公開）に記載されている。

ＲｅｃＤヘリカーゼは、好ましくはＴｒａＩヘリカーゼまたはＴｒａＩサブグループヘ
リカーゼである。ＴｒａＩヘリカーゼおよびＴｒａＩサブグループヘリカーゼは、オリゴ
マーを形成することなく機能することから単量体である。ＴｒａＩヘリカーゼおよびＴｒ
ａＩサブグループヘリカーゼは、２つのＲｅｃＤヘリカーゼドメイン、レラクサーゼドメ
インおよびＣ末端ドメインを含有する場合がある。ＴｒａＩサブグループヘリカーゼは、
好ましくはＴｒｗＣヘリカーゼである。ＴｒａＩヘリカーゼまたはＴｒａＩサブグループ
ヘリカーゼは、好ましくは米国特許出願第６１／５８１，３３２号の表６および国際出願
第ＰＣＴ／ＧＢ２０１２／０５３２７４号（ＷＯ２０１２／０９８５６２として公開）に
示すヘリカーゼの１つまたはその変種である。変種は、米国特許出願第６１／５８１，３
３２号および国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０１２／０５３２７４号（ＷＯ２０１２／０９８
５６２として公開）に記載されている。

ＴｒａＩヘリカーゼまたはＴｒａＩサブグループヘリカーゼは、上に定義のＲｅｃＤ様
モチーフＩ（配列番号２０）および／または上に定義のＲｅｃＤ様モチーフＶ（配列番号
２９）を典型的には含む。ＴｒａＩヘリカーゼまたはＴｒａＩサブグループヘリカーゼは
、ＲｅｃＤ様モチーフＩ（配列番号２０）およびＲｅｃＤ様モチーフＶ（配列番号２９）
の両方を好ましくは含む。ＴｒａＩヘリカーゼまたはＴｒａＩサブグループヘリカーゼは
、次の２つのモチーフの１つを典型的にはさらに含む：
− アミノ酸モチーフＨ−（Ｘ１）_２−Ｘ２−Ｒ−（Ｘ３）_５〜１２−Ｈ−Ｘ４−Ｈ（本
明細書以下でＭｏｂＦモチーフＩＩＩと称する；配列番号３１から３８）、式中Ｘ１およ
びＸ２は任意のアミノ酸であり、Ｘ２およびＸ４はＤ、Ｅ、ＫおよびＲを除く任意のアミ
ノ酸から独立に選択される。（Ｘ１）_２は当然ながらＸ１ａ−Ｘ１ｂである。Ｘ１ａおよ
びＸ１ｂは、同じまたは異なるアミノ酸であってよい。Ｘ１ａは、好ましくはＤまたはＥ
である。Ｘ１ｂは、好ましくはＴまたはＤである。（Ｘ１）_２は、好ましくはＤＴまたは
ＥＤである。（Ｘ１）_２は、最も好ましくはＤＴである。（Ｘ３）_５〜１２中の５から１
２個のアミノ酸は同じまたは異なっていてよい。Ｘ２およびＸ４はＧ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｌ、
Ｉ、Ｍ、Ｃ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｈ、Ｑ、Ｎ、ＳおよびＴから独立に選択される。Ｘ２およびＸ
４は、好ましくは荷電していない。Ｘ２およびＸ４は、好ましくはＨではない。Ｘ２は、
より好ましくはＮ、ＳまたはＡである。Ｘ２は、最も好ましくはＮである。Ｘ４は、最も
好ましくはＦまたはＴである。（Ｘ３）_５〜１２は、好ましくは長さ６または１０残基で
ある。（Ｘ３）_５〜１２の好適な実施形態は、米国特許出願第６１／５８１，３３２号の
表７に示す配列番号５８、６２、６６および７０、ならびに国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０
１２／０５３２７４号（ＷＯ２０１２／０９８５６２として公開）の配列番号６１、６５
、６９、７３、７４、８２、８６、９０、９４、９８、１０２、１１０、１１２、１１３
、１１４、１１７、１２１、１２４、１２５、１２９、１３３、１３６、１４０、１４４
、１４７、１５１、１５２、１５６、１６０、１６４および１６８由来であってよい。
− アミノ酸モチーフＧ−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｈ−（Ｘ８）_{６
〜１２}−Ｈ−Ｘ９（本明細書以下でＭｏｂＱモチーフＩＩＩと称する；配列番号３９から
４５）、式中Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７およびＸ９はＤ、Ｅ、ＫおよびＲを除
く任意のアミノ酸から独立に選択され、Ｘ４はＤまたはＥであり、Ｘ８は任意のアミノ酸
である。Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７およびＸ９はＧ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ
、Ｃ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｈ、Ｑ、Ｎ、ＳおよびＴから独立に選択される。Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、
Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７およびＸ９は、好ましくは荷電していない。Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ５、
Ｘ６、Ｘ７およびＸ９は、好ましくはＨではない。（Ｘ８）_６〜１２中の６から１２個の
アミノ酸は、同じまたは異なっていてよい。好ましいＭｏｂＦモチーフＩＩＩは、米国特
許出願第６１／５８１，３３２号の表７および国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０１２／０５３
２７４号（ＷＯ２０１２／０９８５６２として公開）に示されている。

ＴｒａＩヘリカーゼまたはＴｒａＩサブグループヘリカーゼは、より好ましくは米国特
許出願第６１／５８１，３３２号の表６または７および国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０１２
／０５３２７４号（ＷＯ２０１２／０９８５６２として公開）に示すヘリカーゼの１つま
たはその変種である。ＴｒａＩヘリカーゼは、配列番号４６に示す配列またはその変種を
最も好ましくは含む。配列番号４６はＴｒａＩ Ｅｃｏ（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿０６
１４８３．１；Ｇｅｎｂａｎｋ ＡＡＱ９８６１９．１；配列番号４６）である。Ｔｒａ
Ｉ Ｅｃｏは、次のモチーフ：ＲｅｃＤ様モチーフＩ（ＧＹＡＧＶＧＫＴ；配列番号４７
）、ＲｅｃＤ様モチーフＶ（ＹＡＩＴＡＨＧＡＱＧ；配列番号４８）およびＭｏｂ Ｆモ
チーフＩＩＩ（ＨＤＴＳＲＤＱＥＰＱＬＨＴＨ；配列番号４９）を含む。

ＴｒａＩヘリカーゼまたはＴｒａＩサブグループヘリカーゼは、下の表２に示すヘリカ
ーゼの１つの配列、すなわち配列番号４６、８７、９８および１０２の１つまたはその変
種をより好ましくは含む。

ＲｅｃＤヘリカーゼ、ＴｒａＩヘリカーゼまたはＴｒａＩサブグループヘリカーゼの変
種は、野生型ヘリカーゼのものから変化しているアミノ酸配列を有し、ポリヌクレオチド
結合活性を保持している酵素である。これは、上に記載のとおり測定され得る。具体的に
は配列番号４６、８７、９８または１０２の変種は、配列番号４６、８７、９８または１
０２のものから変化しているアミノ酸配列を有し、ポリヌクレオチド結合活性を保持して
いる酵素である。変種は、ヘリカーゼ活性を保持している。変種は、下に考察する２つの
モードの少なくとも１つで作動しなければならない。好ましくは、変種は両方のモードで
作動する。変種は、ヘリカーゼをコードするポリヌクレオチドの操作を促進するならびに
／または高塩濃度および／もしくは室温でのその活性を促進する修飾を含む場合がある。
変種は、上で考察したモチーフの外の領域において野生型ヘリカーゼとは典型的には異な
る。しかし変種は、これらのモチーフ（複数可）内に修飾を含む場合がある。

配列番号４６、８７、９８および１０２の任意の１つのアミノ酸配列の全長にわたって
、変種はアミノ酸同一性に基づいてその配列に好ましくは少なくとも１０％相同性である
。より好ましくは変種ポリペプチドは、配列全長にわたるアミノ酸同一性に基づいて配列
番号４６、８７、９８および１０２の任意の１つのアミノ酸配列に少なくとも２０％、少
なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも
５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、
少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％およびより
好ましくは少なくとも９５％、９７％または９９％相同性であってよい。少なくとも７０
％、例えば少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９
５％のアミノ酸同一性が１５０以上のストレッチ、例えば２００、３００、４００、５０
０、６００、７００、８００、９００または１０００以上の連続するアミノ酸にわたって
あり得る（「高い相同性」）。相同性は上に記載のとおり決定される。変種は配列番号２
および４を参照して上に考察したいずれの方法においても野生型配列と異なっていてよい
。

配列番号４６、８７、９８および１０２の任意の１つの変種は、野生型配列のＲｅｃＤ
様モチーフＩおよび／またはＲｅｃＤ様モチーフＶを好ましくは含む。しかし配列番号４
６、８７、９８または１０２の変種は、野生型配列とは異なるＲｅｃＤ様モチーフＩおよ
び／または伸長されたＲｅｃＤ様モチーフＶを含んでよい。例えば変種は、米国特許出願
第６１／５８１，３３２号の表５および７ならびに国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０１２／０
５３２７４号（ＷＯ２０１２／０９８５６２として公開）に示す好ましいモチーフの任意
の１つを含んでよい。配列番号４６、８７、９８および１０２の変種は、野生型配列のＲ
ｅｃＤ様モチーフＩおよびＶ内に修飾を含んでよい。配列番号４６、８７、９８または１
０２の変種は、上に考察したとおり付着を促進するために１つもしくは複数の置換システ
イン残基および／または１つもしくは複数の置換Ｆａｚ残基を好ましくは含む。

ヘリカーゼは好ましくはＸＰＤヘリカーゼである。ＸＰＤヘリカーゼは、オリゴマーを
形成することなく機能することから単量体である。任意のＸＰＤヘリカーゼが本発明によ
り使用できる。ＸＰＤヘリカーゼはＲａｄ３ヘリカーゼとしても公知であり、２つの用語
は互換的に使用できる。

ＸＰＤヘリカーゼの構造は、当技術分野において公知である（Cell. 2008 May 30;133(
5):801-12. Structure of the DNA repair helicase XPD. Liu H、Rudolf J、Johnson KA
、McMahon SA、Oke M、Carter L、McRobbie AM、Brown SE、Naismith JH、White MF）。
ＸＰＤヘリカーゼは、アミノ酸モチーフＸ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｇ−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｅ−
Ｇ（本明細書以下でＸＰＤモチーフＶと称する；配列番号５０）を典型的には含む。Ｘ１
、Ｘ２、Ｘ５およびＸ６はＤ、Ｅ、ＫおよびＲを除く任意のアミノ酸から独立に選択され
る。Ｘ１、Ｘ２、Ｘ５およびＸ６は、Ｇ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｃ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｈ
、Ｑ、Ｎ、ＳおよびＴから独立に選択される。Ｘ１、Ｘ２、Ｘ５およびＸ６は、好ましく
は荷電していない。Ｘ１、Ｘ２、Ｘ５およびＸ６は、好ましくはＨではない。Ｘ１は、よ
り好ましくはＶ、Ｌ、Ｉ、ＳまたはＹである。Ｘ５は、より好ましくはＶ、Ｌ、Ｉ、Ｎま
たはＦである。Ｘ６は、より好ましくはＳまたはＡである。Ｘ３およびＸ４は、任意のア
ミノ酸残基であってよい。Ｘ４は、好ましくはＫ、ＲまたはＴである。

ＸＰＤヘリカーゼは、アミノ酸モチーフＱ−Ｘａ−Ｘｂ−Ｇ−Ｒ−Ｘｃ−Ｘｄ−Ｒ−（
Ｘｅ）_３−Ｘｆ−（Ｘｇ）_７−Ｄ−Ｘｈ−Ｒ（本明細書以下でＸＰＤモチーフＶＩと称す
る；配列番号５１）を典型的には含む。Ｘａ、ＸｅおよびＸｇは任意のアミノ酸残基であ
ってよい。Ｘｂ、ＸｃおよびＸｄはＤ、Ｅ、ＫおよびＲを除く任意のアミノ酸から独立に
選択される。Ｘｂ、ＸｃおよびＸｄは、典型的にはＧ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｃ、Ｆ
、Ｙ、Ｗ、Ｈ、Ｑ、Ｎ、ＳおよびＴから独立に選択される。Ｘｂ、ＸｃおよびＸｄは、好
ましくは荷電していない。Ｘｂ、ＸｃおよびＸｄは、好ましくはＨではない。Ｘｂは、よ
り好ましくはＶ、Ａ、Ｌ、ＩまたはＭである。Ｘｃは、より好ましくはＶ、Ａ、Ｌ、Ｉ、
ＭまたはＣである。Ｘｄは、より好ましくはＩ、Ｈ、Ｌ、Ｆ、ＭまたはＶである。Ｘｆは
、ＤまたはＥであってよい。（Ｘｇ）_７はＸ_ｇ１、Ｘ_ｇ２、Ｘ_ｇ３、Ｘ_ｇ４、Ｘ_ｇ５、Ｘ
_ｇ６およびＸ_ｇ７である。Ｘ_ｇ２は、好ましくはＧ、Ａ、ＳまたはＣである。Ｘ_ｇ５は、
好ましくはＦ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ａ、ＷまたはＹである。Ｘ_ｇ６は、好ましくはＬ、Ｆ、
Ｙ、Ｍ、ＩまたはＶである。Ｘ_ｇ７は、好ましくはＡ、Ｃ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、ＭまたはＳであ
る。

ＸＰＤヘリカーゼは、ＸＰＤモチーフＶおよびＶＩを好ましくは含む。最も好ましいＸ
ＰＤモチーフＶおよびＶＩは、米国特許出願第６１／５８１，３４０号の表５および国際
出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０１２／０５３２７３号（ＷＯ２０１２／０９８５６１として公開
）に示されている。

ＸＰＤヘリカーゼは、硫化鉄（ＦｅＳ）コアを２つのウォーカーＡおよびＢモチーフ（
モチーフＩおよびＩＩ）の間に好ましくはさらに含む。ＦｅＳコアは、システイン残基の
スルフィド基の間に配位した鉄原子を典型的には含む。ＦｅＳコアは、典型的には四面体
である。

ＸＰＤヘリカーゼは、好ましくは米国特許出願第６１／５８１，３４０号の表４または
５および国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０１２／０５３２７３号（ＷＯ２０１２／０９８５６
１として公開）に示されているヘリカーゼの１つまたはその変種である。ＸＰＤヘリカー
ゼは、配列番号５２に示されている配列またはその変種を最も好ましくは含む。配列番号
５２は、ＸＰＤ Ｍｂｕ（メタノコッコイデス・ブルトニイ（Methanococcoides burtoni
i）；ＹＰ＿５６６２２１．１；ＧＩ：９１７７３５２９）である。ＸＰＤ Ｍｂｕは、
ＹＬＷＧＴＬＳＥＧ（モチーフＶ；配列番号５３）およびＱＡＭＧＲＶＶＲＳＰＴＤＹＧ
ＡＲＩＬＬＤＧＲ（モチーフＶＩ；配列番号５４）を含む。

ＸＰＤヘリカーゼの変種は、野生型ヘリカーゼのものから変化しているアミノ酸配列を
有し、ポリヌクレオチド結合活性を保持している酵素である。これは、上に記載のとおり
測定され得る。具体的には配列番号５２の変種は、配列番号５２のものから変化している
アミノ酸配列を有し、ポリヌクレオチド結合活性を保持している酵素である。変種は、ヘ
リカーゼ活性を保持している。変種は、下に考察する２つのモードの少なくとも１つで作
動しなければならない。好ましくは、変種は両方のモードで作動する。変種は、ヘリカー
ゼをコードするポリヌクレオチドの操作を促進するならびに／または高塩濃度および／も
しくは室温でのその活性を促進する修飾を含む場合がある。変種は、上で考察したＸＰＤ
モチーフＶおよびＶＩの外の領域において野生型ヘリカーゼとは典型的には異なる。しか
し変種は、これらのモチーフの１つまたは両方の内に修飾を含む場合がある。

配列番号５２のアミノ酸配列の全長にわたって、配列番号１０などの変種は、アミノ酸
同一性に基づいてその配列に好ましくは少なくとも１０％、好ましくは３０％相同性であ
る。より好ましくは変種ポリペプチドは、配列番号５２のアミノ酸配列に配列全体にわた
るアミノ酸同一性に基づいて少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、
少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくと
も７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％およびより好ましく
は少なくとも９５％、９７％または９９％相同性であってよい。少なくとも７０％、例え
ば少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％のア
ミノ酸同一性が１５０以上のストレッチ、例えば２００、３００、４００、５００、６０
０、７００、８００、９００または１０００以上の連続するアミノ酸にわたってあり得る
（「高い相同性」）。相同性は上に記載のとおり決定される。変種は配列番号２および４
を参照して上に考察したいずれの方法においても野生型配列と異なっていてよい。

配列番号５２の変種は、野生型配列のＸＰＤモチーフＶおよび／またはＸＰＤモチーフ
ＶＩを好ましくは含む。配列番号５２の変種は、配列番号５２のＸＰＤモチーフＶおよび
ＶＩの両方をより好ましくは含む。しかし、配列番号５２の変種は、野生型配列とは異な
るＸＰＤモチーフＶおよび／またはＶＩを含む場合がある。例えば、配列番号５２の変種
は、米国特許出願第６１／５８１，３４０号の表５および国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０１
２／０５３２７３号（ＷＯ２０１２／０９８５６１として公開）に示されている好ましい
モチーフの任意の１つを含む場合がある。配列番号５２の変種は、野生型配列のＸＰＤモ
チーフＶおよび／またはＸＰＤモチーフＶＩ内に修飾も含む場合がある。これらのモチー
フへの好適な修飾は、２つのモチーフを定義する際に上に考察されている。配列番号５２
の変種は、上に考察したとおり付着を促進するために１つもしくは複数の置換システイン
残基および／または１つもしくは複数の置換Ｆａｚ残基を好ましくは含む。

ヘリカーゼは、米国仮特許出願第６１／６７３，４５２号（２０１２年７月１９日出願
）、米国仮特許出願第６１／７７４，８６２号（２０１３年３月８日出願）および本出願
と同時に出願された国際出願に記載および特許請求されているいずれの修飾ヘリカーゼで
あってもよい（Ｏｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅ Ｒｅｆ：ＯＮＴ ＩＰ ０３３）。

ヘリカーゼは、Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ（配列番号１０）中のＤ２７２、Ｎ２７３、Ｄ２７
４、Ｇ２８１、Ｅ２８４、Ｅ２８５、Ｅ２８７、Ｓ２８８、Ｔ２８９、Ｇ２９０、Ｅ２９
１、Ｄ２９３、Ｔ２９４、Ｎ３００、Ｒ３０３、Ｋ３０４、Ｎ３１４、Ｓ３１５、Ｎ３１
６、Ｈ３１７、Ｒ３１８、Ｋ３１９、Ｌ３２０、Ｅ３２２、Ｒ３２６、Ｎ３２８、Ｓ６１
５、Ｋ７１７、Ｙ７２０、Ｎ７２１およびＳ７２４に対応する１つまたは複数の位置への
１つもしくは複数のシステイン残基および／または１つもしくは複数の非天然アミノ酸が
、より好ましくは導入されるＨｅｌ３０８ヘリカーゼであり、ここでヘリカーゼはポリヌ
クレオチドの移動を制御する能力を保持している。

Ｈｅｌ３０８ヘリカーゼは、Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ（配列番号１０）中のＤ２７２、Ｎ２
７３、Ｄ２７４、Ｇ２８１、Ｅ２８４、Ｅ２８５、Ｅ２８７、Ｓ２８８、Ｔ２８９、Ｇ２
９０、Ｅ２９１、Ｄ２９３、Ｔ２９４、Ｎ３００、Ｒ３０３、Ｋ３０４、Ｎ３１４、Ｓ３
１５、Ｎ３１６、Ｈ３１７、Ｒ３１８、Ｋ３１９、Ｌ３２０、Ｅ３２２、Ｒ３２６、Ｎ３
２８、Ｓ６１５、Ｋ７１７、Ｙ７２０、Ｎ７２１およびＳ７２４に対応する位置の１つま
たは複数に１つもしくは複数のシステイン残基および／または１つもしくは複数の非天然
アミノ酸を含む、配列番号１０、１３、１６または１９の１つの変種を好ましくは含む。

Ｈｅｌ３０８ヘリカーゼは、Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ（配列番号１０）中のＤ２７４、Ｅ２
８４、Ｅ２８５、Ｓ２８８、Ｓ６１５、Ｋ７１７、Ｙ７２０、Ｅ２８７、Ｔ２８９、Ｇ２
９０、Ｅ２９１、Ｎ３１６およびＫ３１９に対応する位置の１つまたは複数に１つもしく
は複数のシステイン残基および／または１つもしくは複数の非天然アミノ酸を含む、配列
番号１０、１３、１６または１９の１つの変種を好ましくは含む。

下の表３ａおよび３ｂは、Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ（配列番号１０）中のＤ２７４、Ｅ２８
４、Ｅ２８５、Ｓ２８８、Ｓ６１５、Ｋ７１７、Ｙ７２０、Ｅ２８７、Ｔ２８９、Ｇ２９
０、Ｅ２９１、Ｎ３１６およびＫ３１９に対応する、他のＨｅｌ３０８ヘリカーゼにおけ
る位置を示す。別のＨｅｌ３０８ヘリカーゼにおける対応する位置の欠如は「−」と印を
付ける。

Ｈｅｌ３０８ヘリカーゼは、Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ（配列番号１０）中のＤ２７４、Ｅ２
８４、Ｅ２８５、Ｓ２８８、Ｓ６１５、Ｋ７１７およびＹ７２０に対応する位置の１つま
たは複数に１つもしくは複数のシステイン残基および／または１つもしくは複数の非天然
アミノ酸を含む、配列番号１０、１３、１６または１９の１つの変種を好ましくは含む。
ヘリカーゼは、表３ａの各列にＡからＧと標識の位置の次の任意の組合せに１つもしくは
複数のシステイン残基および／または１つもしくは複数の非天然アミノ酸を含んでよい：
｛Ａ｝、｛Ｂ｝、｛Ｃ｝、｛Ｄ｝、｛Ｇ｝、｛Ｅ｝、｛Ｆ｝、｛ＡおよびＢ｝、｛Ａおよ
びＣ｝、｛ＡおよびＤ｝、｛ＡおよびＧ｝、｛ＡおよびＥ｝、｛ＡおよびＦ｝、｛Ｂおよ
びＣ｝、｛ＢおよびＤ｝、｛ＢおよびＧ｝、｛ＢおよびＥ｝、｛ＢおよびＦ｝、｛Ｃおよ
びＤ｝、｛ＣおよびＧ｝、｛ＣおよびＥ｝、｛ＣおよびＦ｝、｛ＤおよびＧ｝、｛Ｄおよ
びＥ｝、｛ＤおよびＦ｝、｛ＧおよびＥ｝、｛ＧおよびＦ｝、｛ＥおよびＦ｝、｛Ａ、Ｂ
およびＣ｝、｛Ａ、ＢおよびＤ｝、｛Ａ、ＢおよびＧ｝、｛Ａ、ＢおよびＥ｝、｛Ａ、Ｂ
およびＦ｝、｛Ａ、ＣおよびＤ｝、｛Ａ、ＣおよびＧ｝、｛Ａ、ＣおよびＥ｝、｛Ａ、Ｃ
およびＦ｝、｛Ａ、ＤおよびＧ｝、｛Ａ、ＤおよびＥ｝、｛Ａ、ＤおよびＦ｝、｛Ａ、Ｇ
およびＥ｝、｛Ａ、ＧおよびＦ｝、｛Ａ、ＥおよびＦ｝、｛Ｂ、ＣおよびＤ｝、｛Ｂ、Ｃ
およびＧ｝、｛Ｂ、ＣおよびＥ｝、｛Ｂ、ＣおよびＦ｝、｛Ｂ、ＤおよびＧ｝、｛Ｂ、Ｄ
およびＥ｝、｛Ｂ、ＤおよびＦ｝、｛Ｂ、ＧおよびＥ｝、｛Ｂ、ＧおよびＦ｝、｛Ｂ、Ｅ
およびＦ｝、｛Ｃ、ＤおよびＧ｝、｛Ｃ、ＤおよびＥ｝、｛Ｃ、ＤおよびＦ｝、｛Ｃ、Ｇ
およびＥ｝、｛Ｃ、ＧおよびＦ｝、｛Ｃ、ＥおよびＦ｝、｛Ｄ、ＧおよびＥ｝、｛Ｄ、Ｇ
およびＦ｝、｛Ｄ、ＥおよびＦ｝、｛Ｇ、ＥおよびＦ｝、｛Ａ、Ｂ、ＣおよびＤ｝、｛Ａ
、Ｂ、ＣおよびＧ｝、｛Ａ、Ｂ、ＣおよびＥ｝、｛Ａ、Ｂ、ＣおよびＦ｝、｛Ａ、Ｂ、Ｄ
およびＧ｝、｛Ａ、Ｂ、ＤおよびＥ｝、｛Ａ、Ｂ、ＤおよびＦ｝、｛Ａ、Ｂ、ＧおよびＥ
｝、｛Ａ、Ｂ、ＧおよびＦ｝、｛Ａ、Ｂ、ＥおよびＦ｝、｛Ａ、Ｃ、ＤおよびＧ｝、｛Ａ
、Ｃ、ＤおよびＥ｝、｛Ａ、Ｃ、ＤおよびＦ｝、｛Ａ、Ｃ、ＧおよびＥ｝、｛Ａ、Ｃ、Ｇ
およびＦ｝、｛Ａ、Ｃ、ＥおよびＦ｝、｛Ａ、Ｄ、ＧおよびＥ｝、｛Ａ、Ｄ、ＧおよびＦ
｝、｛Ａ、Ｄ、ＥおよびＦ｝、｛Ａ、Ｇ、ＥおよびＦ｝、｛Ｂ、Ｃ、ＤおよびＧ｝、｛Ｂ
、Ｃ、ＤおよびＥ｝、｛Ｂ、Ｃ、ＤおよびＦ｝、｛Ｂ、Ｃ、ＧおよびＥ｝、｛Ｂ、Ｃ、Ｇ
およびＦ｝、｛Ｂ、Ｃ、ＥおよびＦ｝、｛Ｂ、Ｄ、ＧおよびＥ｝、｛Ｂ、Ｄ、ＧおよびＦ
｝、｛Ｂ、Ｄ、ＥおよびＦ｝、｛Ｂ、Ｇ、ＥおよびＦ｝、｛Ｃ、Ｄ、ＧおよびＥ｝、｛Ｃ
、Ｄ、ＧおよびＦ｝、｛Ｃ、Ｄ、ＥおよびＦ｝、｛Ｃ、Ｇ、ＥおよびＦ｝、｛Ｄ、Ｇ、Ｅ
およびＦ｝、｛Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＧ｝、｛Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥ｝、｛Ａ、Ｂ、Ｃ
、ＤおよびＦ｝、｛Ａ、Ｂ、Ｃ、ＧおよびＥ｝、｛Ａ、Ｂ、Ｃ、ＧおよびＦ｝、｛Ａ、Ｂ
、Ｃ、ＥおよびＦ｝、｛Ａ、Ｂ、Ｄ、ＧおよびＥ｝、｛Ａ、Ｂ、Ｄ、ＧおよびＦ｝、｛Ａ
、Ｂ、Ｄ、ＥおよびＦ｝、｛Ａ、Ｂ、Ｇ、ＥおよびＦ｝、｛Ａ、Ｃ、Ｄ、ＧおよびＥ｝、
｛Ａ、Ｃ、Ｄ、ＧおよびＦ｝、｛Ａ、Ｃ、Ｄ、ＥおよびＦ｝、｛Ａ、Ｃ、Ｇ、ＥおよびＦ
｝、｛Ａ、Ｄ、Ｇ、ＥおよびＦ｝、｛Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＧおよびＥ｝、｛Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｇおよ
びＦ｝、｛Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＥおよびＦ｝、｛Ｂ、Ｃ、Ｇ、ＥおよびＦ｝、｛Ｂ、Ｄ、Ｇ、Ｅ
およびＦ｝、｛Ｃ、Ｄ、Ｇ、ＥおよびＦ｝、｛Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＧおよびＥ｝、｛Ａ、Ｂ
、Ｃ、Ｄ、ＧおよびＦ｝、｛Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＥおよびＦ｝、｛Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｇ、Ｅおよ
びＦ｝、｛Ａ、Ｂ、Ｄ、Ｇ、ＥおよびＦ｝、｛Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｇ、ＥおよびＦ｝、｛Ｂ、Ｃ
、Ｄ、Ｇ、ＥおよびＦ｝、または｛Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｇ、ＥおよびＦ｝。

Ｈｅｌ３０８ヘリカーゼは、Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ（配列番号１０）中のＤ２７４、Ｅ２
８４、Ｅ２８５、Ｓ２８８およびＳ６１５に対応する位置の１つまたは複数に１つもしく
は複数のシステイン残基および／または１つもしくは複数の非天然アミノ酸を含む配列番
号１０、１３、１６または１９の１つの変種をより好ましくは含む。

ポリヌクレオチド結合成分
本明細書に記載の構築物は、追加的ポリヌクレオチド結合成分を含む。ポリヌクレオチ
ド結合成分は、ポリヌクレオチドに結合できるポリペプチドである。成分は、規定のポリ
ヌクレオチド配列に好ましくは特異的結合できる。換言すると成分は、特異的ポリヌクレ
オチド配列に好ましくは結合するが、少なくとも１０分の１の結合を異なる配列に、また
はより好ましくは少なくとも１００分の１の結合を異なる配列に、または最も好ましくは
少なくとも１０００分の１の結合を異なる配列に示す。異なる配列は無作為配列であって
よい。いくつかの実施形態では成分は、特異的ポリヌクレオチド配列に結合するが、異な
る配列への結合は測定できない。特異的配列に結合する成分は、そのような配列に標的化
される構築物を設計するために使用され得る。

成分は、典型的にはポリヌクレオチドの少なくとも１つの特徴と相互作用および改変す
る。成分は、個々のヌクレオチドまたは、ジまたはトリヌクレオチドなどのヌクレオチド
の短い鎖を形成するように切断することによってポリヌクレオチドを修飾できる。成分は
、ポリヌクレオチドを特異的位置に方向付けるまたは移動させること、すなわちその移動
を制御することによってそれを修飾できる。

核酸などのポリヌクレオチドは、２個以上のヌクレオチドを含む巨大分子である。ポリ
ヌクレオチドまたは核酸は、任意のヌクレオチドの任意の組合せを含み得る。ヌクレオチ
ドは、天然に存在するものまたは人工的であってよい。標的ポリヌクレオチド中の１つま
たは複数のヌクレオチドは、酸化またはメチル化され得る。標的ポリヌクレオチド中の１
つまたは複数のヌクレオチドは、損傷をうけ得る。例えばポリヌクレオチドは、ピリミジ
ン二量体を含む場合がある。そのような二量体は、紫外光による障害に典型的には関連し
、皮膚メラノーマの主原因である。標的ポリヌクレオチド中の１つまたは複数のヌクレオ
チドは、例えば標識またはタグで、修飾され得る。好適な標識は、上に記載されている。
標的ポリヌクレオチドは、１つまたは複数のスペーサーを含み得る。

ヌクレオチドは、典型的には、核酸塩基、糖および少なくとも１つのリン酸基を含有す
る。核酸塩基は典型的には複素環である。核酸塩基は、これだけに限らないがプリンおよ
びピリミジンならびにより具体的にはアデニン、グアニン、チミン、ウラシルおよびシト
シンを含む。糖は典型的には五炭糖である。ヌクレオチド糖は、これだけに限らないがリ
ボースおよびデオキシリボースを含む。ヌクレオチドは、典型的にはリボヌクレオチドま
たはデオキシリボヌクレオチドである。ヌクレオチドは典型的には一リン酸、二リン酸ま
たは三リン酸を含有する。リン酸は、ヌクレオチドの５’または３’側に付着できる。

ヌクレオチドは、これだけに限らないがアデノシン一リン酸（ＡＭＰ）、グアノシン一
リン酸（ＧＭＰ）、チミジン一リン酸（ＴＭＰ）、ウリジン一リン酸（ＵＭＰ）、シチジ
ン一リン酸（ＣＭＰ）、環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）、環状グアノシン一リン酸
（ｃＧＭＰ）、デオキシアデノシン一リン酸（ｄＡＭＰ）、デオキシグアノシン一リン酸
（ｄＧＭＰ）、デオキシチミジン一リン酸（ｄＴＭＰ）、デオキシウリジン一リン酸（ｄ
ＵＭＰ）およびデオキシシチジン一リン酸（ｄＣＭＰ）を含む。ヌクレオチドは、好まし
くはＡＭＰ、ＴＭＰ、ＧＭＰ、ＣＭＰ、ＵＭＰ、ｄＡＭＰ、ｄＴＭＰ、ｄＧＭＰ、ｄＣＭ
ＰおよびｄＵＭＰから選択される。

ヌクレオチドは、塩基を持たない場合がある（すなわち核酸塩基を欠失している）。ヌ
クレオチドは、核酸塩基および糖も欠失している場合がある（すなわちＣ３スペーサーで
ある）。

ポリヌクレオチド中のヌクレオチドは、任意の様式で相互に付着されてよい。ヌクレオ
チドは、核酸においてと同様にそれらの糖およびリン酸基により典型的には付着されてい
る。ヌクレオチドは、ピリミジン二量体においてと同様にそれらの核酸塩基を介して繋が
れてよい。

ポリヌクレオチドは、１本鎖または２本鎖であってよい。ポリヌクレオチドの少なくと
も一部は、好ましくは２本鎖である。

ポリヌクレオチドは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）などの核
酸であってよい。標的ポリヌクレオチドは、ＤＮＡの１本鎖にハイブリダイズしたＲＮＡ
の１本鎖を含む場合がある。ポリヌクレオチドは、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、グリセロー
ル核酸（ＧＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）またはヌクレオ
チド側鎖を有する他の合成ポリマーなどの当技術分野において公知の任意の合成核酸であ
ってよい。

成分の三次構造が公知であることは好ましい。成分の三次元構造の知識は、構築物にお
けるその機能を促進するために成分に修飾を作製できるようにする。

成分は、任意のサイズであってよく、任意の構造を有してよい。例えば成分は、二量体
または三量体などのオリゴマーである場合がある。成分は、好ましくは１つの単量体から
形成された小さな球状ポリペプチドである。そのような成分は操作が容易であり、ポリヌ
クレオチドの移動を制御するヘリカーゼの能力を、特にヘリカーゼの配列に融合または挿
入された場合に、干渉しにくい。

成分のアミノおよびカルボキシ末端は、好ましくは近接近にある。成分のアミノおよび
カルボキシ末端は、成分の同じ面により好ましくは存在する。そのような実施形態は、ヘ
リカーゼの配列中への成分の挿入を促進する。例えば成分のアミノおよびカルボキシ末端
が近接近にある場合、それぞれはヘリカーゼの配列中の隣接アミノ酸への遺伝子的融合に
よって付着され得る。

成分の活性部位の位置および機能が公知であることも好ましい。これは、成分の活性を
消滅させる活性部位に修飾が作製されることを防ぐ。これは成分がヘリカーゼに付着でき
るようにし、成分はポリヌクレオチドに結合し、その移動を制御する。成分がポリヌクレ
オチドに結合および方向付けられる方法の知識は、有効な構築物を設計できるようにする
。

本明細書に記載の構築物は鎖配列決定法において有用である。成分は、鎖配列決定法お
よびヌクレオチドの識別に適合性である緩衝液バックグラウンドにおいてポリヌクレオチ
ドに好ましくは結合する。成分は、１００ｍＭから２Ｍなどの通常の生理学的レベルを大
幅に上回る塩濃度において少なくとも残存活性を好ましくは有する。成分は、高塩濃度で
のその活性を増大させるためにより好ましくは修飾される。成分は、その前進性、安定性
および有効期間を改善するために修飾されてもよい。

好適な修飾は、好塩性、中度好塩性細菌、好熱性および中等度好熱性生物などの好極限
性細菌（extremphile）、ならびに中温性または好熱性エキソヌクレアーゼの耐塩性、安
定性および温度依存性を変更するための定向進化手法由来のポリヌクレオチド結合成分の
特性決定から決定され得る。

ポリヌクレオチド結合成分は、ヘリックス−ヘアピン−ヘリックス（helix-hairpin-he
lix）（ＨｈＨ）ドメイン、真核生物１本鎖結合タンパク質（single-stranded binding p
rotein）（ＳＳＢ）、細菌性ＳＳＢ、古細菌ＳＳＢ、ウイルス性ＳＳＢ、２本鎖結合タン
パク質、スライディングクランプ、前進性因子（processivity factor）、ＤＮＡ結合ル
ープ、複製開始タンパク質、テロメア結合タンパク質、リプレッサー、亜鉛フィンガーお
よび増殖細胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen）（ＰＣＮＡ）から独立に選
択される１つまたは複数のドメインを好ましくは含む。

ヘリックス−ヘアピン−ヘリックス（ＨｈＨ）ドメインは、ＤＮＡに配列非特異的様式
で結合するポリペプチドモチーフである。それらは、ポリメラーゼに融合された場合に塩
安定性および前進性を付与し、それらの熱安定性を増大させることが示されている。好適
なドメインは、メタノピュルス・カンドレリ（Methanopyrus kandleri）由来のトポイソ
メラーゼＶ（配列番号８９）由来のドメインＨ（残基６９６〜７５１）およびドメインＨ
Ｉ（残基６９６〜８０２）を含む。下の考察のとおり、ポリヌクレオチド結合成分は、配
列番号９４に示す配列番号８９のドメインＨ〜Ｌであってよい。メタノピュルス・カンド
レリ（Methanopyrus kandleri）由来のトポイソメラーゼＶは、下に考察の２本鎖結合タ
ンパク質の一例である。

ＨｈＨドメインは、配列番号５５もしくは７５もしくは７６に示す配列またはその変種
を好ましくは含む。このドメインは、本明細書に記載の構築物において使用された場合に
ヘリカーゼの前進性および耐塩性を増大させる。配列番号５５もしくは７５もしくは７６
の変種は、配列番号５５または７５または７６のものから変化しているアミノ酸配列を有
し、ポリヌクレオチド結合活性を保持しているタンパク質である。これは、上に記載のと
おり測定され得る。変種は、アミノ酸同一性に基づいてその配列全体にわたって、配列番
号５５または７５または７６に少なくとも５０％相同性（またはヘリカーゼと関連して上
に考察した任意の％相同性）を典型的には有し、ポリヌクレオチド結合活性を保持してい
る。変種はヘリカーゼと関連して上にまたはポアと関連して下に考察したいずれの方法に
おいても配列番号５５または７５または７６と異なっていてよい。変種は、上に考察した
とおりヘリカーゼへの付着を促進するために１つもしくは複数の置換システイン残基およ
び／または１つもしくは複数の置換Ｆａｚ残基を好ましくは含む。

ＳＳＢは、高親和性で配列非特異的様式で１本鎖ＤＮＡに結合する。それらは、全ての
生き物に種々の形態で存在し、単量体または多量体としてＤＮＡに結合する。アミノ酸配
列の配列比較およびアルゴリズム（Ｈｉｄｄｅｎ Ｍａｒｋｏｖモデルなど）を使用して
、ＳＳＢはそれらの配列相同に従って分類され得る。Ｐｆａｍファミリー、ＰＦ００４３
６は、全てが公知のＳＳＢに配列類似性を示すタンパク質を含む。ＳＳＢのこの群は、次
いでタンパク質の構造分類（Structural Classification of Proteins）（ＳＣＯＰ）に
従ってさらに分類され得る。ＳＳＢは、次の系列に分けられる：クラス；全てのベータタ
ンパク質、フォールド；ＯＢ−フォールド、スーパーファミリー：核酸結合タンパク質、
ファミリー；１本鎖ＤＮＡ結合ドメイン、ＳＳＢ。このファミリー内でＳＳＢは、各サブ
ファミリー内でしばしば特性決定されるいくつかの型の分子種を含むサブファミリーに分
類され得る。

ＳＳＢは、ヒト、マウス、ラット、真菌、原虫または植物など由来の真核生物由来、細
菌および古細菌などの原核生物由来またはウイルス由来であってよい。

真核性ＳＳＢは、複製タンパク質Ａ（ＲＰＡ）として公知である。多くの場合それらは
、さまざまなサイズの単位から形成されたヘテ三量体である。大きな単位（例えばサッカ
ロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）のＲＰＡ７０）のいくつかは安定
であり、単量体形態でｓｓＤＮＡに結合する。

細菌性ＳＳＢは安定なホモ四量体（例えば大腸菌（E.coli）、マイコバクテリウム・ス
メグマチス（Mycobacterium smegmatis）およびヘリコバクター・ピロリ（Helicobacter
pylori））またはホモ二量体（例えばディノコッカス・ラディオデュランス（Deinococcu
s radiodurans）およびサーモトガ・マリティマ（Thermotoga maritima））としてＤＮＡ
に結合する。古細菌ゲノム由来のＳＳＢは、真核ＲＰＡと関連すると考えられている。ク
レン古細菌門スルホロブス・ソルファタリカス（Sulfolobus solfataricus）によってコ
ードされるＳＳＢなどのそのいくつかは、ホモ四量体である。他の大部分の種由来のＳＳ
Ｂは、真核生物由来の複製タンパク質に密接に関連しており、ＲＰＡと称される。これら
の種のいくつかにおいて、それらは単量体であることが示されている（メタノコッカス・
ジャンナスキイ（Methanococcus jannaschii）およびメタノサーモバクター・サーモオー
トトロフィクカム（Methanothermobacter thermoautotrophicum）。さらに、アーケオグ
ロブス・フルギダス（Archaeoglobus fulgidus）およびメタノコッコイデス・ブルトニイ
（Methanococcoides burtonii）を含む古細菌の他の種は、ＲＰＡに配列類似性を有する
２つのオープンリーディングフレームをそれぞれ含有すると考えられている。タンパク質
レベルでの証拠はなく、それらのＤＮＡ結合能力またはオリゴマー状態に関する公表され
たデータもない。しかし、これらの各遺伝子中の２つのオリゴヌクレオチド／オリゴ糖（
oligonucleotide/oligosaccharide）（ＯＢ）フォールドの存在（Ｍ．ブルトニイ（M.bur
tonii）ＯＲＦの１つの場合にはＯＢフォールド３個）はそれらも１本鎖ＤＮＡに結合す
ることを示唆している。

ウイルス性ＳＳＢは、単量体としてＤＮＡに結合する。このことおよびそれらの比較的
小さなサイズは、それらを、例えば可動性ペプチドリンカーを介して他のタンパク質に遺
伝子的に融合しやすくする。代替的にＳＳＢは、別々に発現され、化学的方法（例えばシ
ステイン、非天然アミノ酸）によって他のタンパク質に付着される場合がある。これは下
でより詳細に考察される。

ＳＳＢは、好ましくは（ｉ）正味の負電荷を有さないカルボキシ末端（Ｃ末端）領域を
含むＳＳＢ（ｉｉ）Ｃ末端領域の正味の負電荷を減少させる１つまたは複数の修飾をその
Ｃ末端領域に含む修飾ＳＳＢのいずれかである。そのようなＳＳＢは、膜貫通ポアを遮断
せず、したがって標的ポリヌクレオチドの特性決定を可能にする。

正味の負電荷を有さないＣ末端領域を含むＳＳＢの例は、これだけに限らないが、ヒト
ミトコンドリアＳＳＢ（ＨｓｍｔＳＳＢ；配列番号７７、ヒト複製タンパク質Ａ ７０ｋ
Ｄａサブユニット、ヒト複製タンパク質Ａ １４ｋＤａサブユニット、オキシトリカ・ノ
バ（Oxytricha nova）由来テロメア末端結合タンパク質アルファサブユニット、オキシト
リカ・ノバ（Oxytricha nova）由来テロメア末端結合タンパク質ベータサブユニットのコ
アドメイン、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）由来のテロ
メアタンパク質１（Ｐｏｔ１）の保護、ヒトＰｏｔ１、マウスまたはラット由来ＢＲＣＡ
２のＯＢ−フォールドドメイン、ｐｈｉ２９由来のｐ５タンパク質（配列番号７８）また
はこれらのタンパク質のいずれかの変種を含む。変種は、野生型タンパク質から変化した
アミノ酸配列を有し、１本鎖ポリヌクレオチド結合活性を保持しているタンパク質である
。ポリヌクレオチド結合活性は、当技術分野において公知の任意の方法を使用して決定で
きる（上に記載のとおり）。例えば、１本鎖ポリヌクレオチドに結合する変種の能力は、
実施例に記載のとおり決定され得る。

配列番号７７または７８の変種は、アミノ酸同一性に基づいてその配列全体にわたって
、配列番号７７または７８に少なくとも５０％相同性（またはヘリカーゼと関連して上に
考察した任意の％相同性）を典型的には有し、１本鎖ポリヌクレオチド結合活性を保持し
ている。変種はヘリカーゼと関連して上に考察したいずれの方法においても配列番号７７
または７８と異なっていてよい。具体的には変種は、表８および９に示す１つまたは複数
の保存的置換を有する場合がある。

正味の負電荷を減少させる１つまたは複数の修飾をそれらのＣ末端領域に必要とするＳ
ＳＢの例は、これだけに限らないが、大腸菌（E. coli）のＳＳＢ（ＥｃｏＳＳＢ；配列
番号７９、マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Mycobacterium tuberculosis）のＳ
ＳＢ、ディノコッカス・ラディオデュランス（Deinococcus radiodurans）のＳＳＢ、サ
ーマス・サーモフィルス（Thermus thermophiles）のＳＳＢ、スルホロブス・ソルファタ
リカス（Sulfolobus solfataricus）由来ＳＳＢ、ヒト複製タンパク質Ａ ３２ｋＤａサ
ブユニット（ＲＰＡ３２）断片、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevi
siae）由来ＣＤＣ１３ ＳＳＢ、大腸菌（E. coli）由来プライモソーム複製タンパク質
Ｎ（Primosomal replication protein N）（ＰｒｉＢ）、シロイヌナズナ（Arabidopsis
thaliana）由来ＰｒｉＢ、仮説タンパク質Ａｔ４ｇ２８４４０、Ｔ４由来ＳＳＢ（ｇｐ３
２；配列番号８０）、ＲＢ６９由来ＳＳＢ（ｇｐ３２；配列番号５６）、Ｔ７由来ＳＳＢ
（ｇｐ２．５；配列番号５７）またはこれらの任意のタンパク質の変種を含む。したがっ
て本発明の方法において使用されるＳＳＢは、これらのタンパク質のいずれかに由来して
よい。

Ｃ末端領域中の１つまたは複数の修飾に加えて、方法において使用されるＳＳＢはＣ末
端領域の外側にあるまたはＣ末端領域の正味の負電荷を減少させない追加的修飾を含んで
よい。換言すると本発明の方法において使用されるＳＳＢは、野生型タンパク質の変種に
由来する。変種は、野生型タンパク質のものから変化しているアミノ酸配列を有し、１本
鎖ポリヌクレオチド結合活性を保持しているタンパク質である。ポリヌクレオチド結合活
性は、上に考察したとおり決定され得る。

本発明において使用されるＳＳＢは、配列番号５６、５７、７９または８０の変種に由
来してよい。換言すると配列番号５６、５７、７９または８０の変種は、本発明において
使用されるＳＳＢのための出発点として使用できるが、実際に使用されるＳＳＢは、Ｃ末
端領域の正味の負電荷を減少させる１つまたは複数の修飾をそのＣ末端領域にさらに含む
。配列番号５６、５７、７９または８０の変種は、配列番号５６、５７、７９または８０
にアミノ酸同一性に基づいてその配列全体にわたって少なくとも５０％相同性（またはヘ
リカーゼと関連して上に考察した任意の％相同性）を典型的には有し、１本鎖ポリヌクレ
オチド結合活性を保持している。変種はヘリカーゼと関連して上に考察したいずれの方法
においても配列番号５６、５７、７９または８０と異なっていてよい。具体的には変種は
、表８および９に示す１つまたは複数の保存的置換を有してよい。

通常のタンパク質ＮからＣへの命名法に従ってＳＳＢのＣ末端領域を同定することは容
易である。ＳＳＢのＣ末端領域は、ＳＳＢのＣ末端の最後の３分の１などの好ましくはＳ
ＳＢのＣ末端の最後の約３分の１である。ＳＳＢのＣ末端領域は、より好ましくはＳＳＢ
のＣ末端の最後の４分の１、５分の１または８分の１などのＳＳＢのＣ末端の最後の約４
分の１、５分の１または８分の１である。ＳＳＢの最後の３分の１、４分の１、５分の１
または８分の１は、アミノ酸の数を単位としてまたはＳＳＢタンパク質の一次構造の実際
の長さを単位として測定されてよい。ＮからＣ方向での種々のアミノ酸の長さは、当技術
分野において公知である。

Ｃ末端領域は、好ましくはＳＳＢのＣ末端の最後の約１０から最後の約６０アミノ酸で
ある。Ｃ末端領域は、より好ましくはＳＳＢのＣ末端の最後の約１５、最後の約２０、最
後の約２５、最後の約３０、最後の約３５、最後の約４０、最後の約４５、最後の約５０
または最後の約５５アミノ酸である。

Ｃ末端領域は、グリシンおよび／またはプロリンのリッチ領域を典型的には含む。この
プロリン／グリシンリッチ領域は、Ｃ末端領域に可動性を与え、Ｃ末端領域を同定するた
めに使用され得る。

正味の負電荷を減少させるための好適な修飾は、米国仮特許出願第６１／６７３，４５
７号（２０１２年７月１９日出願）、米国仮特許出願第６１／７７４，６８８号（２０１
３年３月８日出願）および本出願と同時に出願された国際出願に開示されている（Ｏｘｆ
ｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅ Ｒｅｆ：ＯＮＴ ＩＰ ０３５）。ＳＳＢは、米国仮特許出
願および国際出願に開示されているいずれのＳＳＢであってもよい。

修飾ＳＳＢは、配列番号６４、６５および８１から８４に示されるものから選択される
配列を最も好ましくは含む。

２本鎖結合タンパク質は高親和性で２本鎖ＤＮＡに結合する。好適な２本鎖結合タンパ
ク質は、これだけに限らないがミューテーターＳ（ＭｕｔＳ；ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿
４１７２１３．１；配列番号１０５）、Ｓｓｏ７ｄ（スルホロブス・ソルファタリカス（
Sufolobus solfataricus）Ｐ２；ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿３４３８８９．１；配列番号
１０６；Nucleic Acids Research、2004、Vol 32、No. 3、1197-1207）、Ｓｓｏ１０ｂ１
（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿３４２４４６．１；配列番号１０７）、Ｓｓｏ１０ｂ２（Ｎ
ＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿３４２４４８．１；配列番号１０８）トリプトファンリプレッサ
ー（Ｔｒｐリプレッサー；ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿２９１００６．１；配列番号１０９
）、ラムダリプレッサー（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿０４０６２８．１；配列番号１１０
）、Ｃｒｅｎ７（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿３４２４５９．１；配列番号１１１）、主な
ヒストンクラスＨ１／Ｈ５、Ｈ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３およびＨ４（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ
＿０６６４０３．２；配列番号１１２）、ｄｓｂＡ（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿０４９８
５８．１；配列番号１１３）、Ｒａｄ５１（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿００２８６６．２
；配列番号１１４）、スライディングクランプおよびトポイソメラーゼＶ Ｍｋａ（配列
番号８９）またはこれらのタンパク質のいずれかの変種を含む。配列番号８９、１０５、
１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３または１１４の変種
は、アミノ酸同一性に基づいてその配列全体にわたって、配列番号８９、１０５、１０６
、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３または１１４に少なくとも
５０％相同性（またはヘリカーゼと関連して上に考察した任意の％相同性）を典型的には
有し、１本鎖ポリヌクレオチド結合活性を保持している。変種は、ヘリカーゼと関連して
上に考察したいずれの方法においても配列番号８９、１０５、１０６、１０７、１０８、
１０９、１１０、１１１、１１２、１１３または１１４と異なっていてよい。具体的には
変種は、表８および９に示す１つまたは複数の保存的置換を有する場合がある。大部分の
ポリメラーゼは、スライディングクランプと相互作用することにより前進性を達成してい
る。一般にこれらは、ｄｓＤＮＡの周囲を囲む多量体タンパク質（ホモ二量体またはホモ
三量体）である。これらのスライディングクランプは、ＡＴＰ依存性プロセスでそれらを
ＤＮＡヘリックスの周囲に会合させるためにアクセサリータンパク質（クランプローダー
）を必要とする。それらもＤＮＡと直接接触せず、形態的テザーとして作用する。スライ
ディングクランプがポリメラーゼドメインを介する特異的様式で同族ポリメラーゼと相互
作用することから、この断片はヘリカーゼのスライディングクランプへの動員刺激のため
にヘリカーゼに融合され得る。この相互作用は共有結合の作製によってさらに安定化され
得る（システインまたは非天然アミノ酸の導入）。

ＤＮＡスライディングクランプに関して前進性因子は、それらの同族ポリメラーゼをＤ
ＮＡに固着させるウイルス性タンパク質であり、作製される断片の長さの劇的な増大を導
く。それらは、単量体（単純ヘルペスウイルス（Herpes simplex virus）１由来ＵＬ４２
についての場合）または多量体（サイトメガロウイルス（Cytomegalovirus）由来ＵＬ４
４は二量体である）であってよく、それらはＤＮＡ鎖周囲に閉じた環を形成せず、それら
はＤＮＡに直接接触する。ＵＬ４２は、その対応するポリメラーゼの速度を低減すること
なく前進性を増大させることが示されており、それがＳＳＢとは異なるモードでＤＮＡと
相互作用することを示唆している。ＵＬ４２は、配列番号５８もしくは配列番号６３に示
す配列またはその変種を好ましくは含む。配列番号５８または６３の変種は、配列番号５
８または６３のものから変化しているアミノ酸配列を有し、ポリヌクレオチド結合活性を
保持しているタンパク質である。これは、上に記載のとおり測定され得る。変種は、アミ
ノ酸同一性に基づいてその配列全体にわたって、配列番号５８または６３に少なくとも５
０％相同性（またはヘリカーゼと関連して上に考察した任意の％相同性）を典型的には有
し、ポリヌクレオチド結合活性を保持している。変種はヘリカーゼと関連して上にまたは
ポアと関連して下に考察したいずれの方法においても配列番号５８または配列番号６３と
異なっていてよい。変種は、上に考察したとおりヘリカーゼへの付着を促進するために１
つもしくは複数の置換システイン残基および／または１つもしくは複数の置換Ｆａｚ残基
を好ましくは含む。

ＵＬ４２をヘリカーゼに付着させることは、遺伝子的融合または化学的付着（システイ
ン、非天然アミノ酸）を介して行われ得る。ＵＬ４２に結合しているポリメラーゼポリペ
プチドが結晶構造において観察できることから、これらの３５アミノ酸（残基１２００〜
１２３５）はヘリカーゼのＣ末端に融合でき、このポリペプチドと前進性因子との間の天
然の親和性は複合体を形成するために使用される。相互作用は、共有結合相互作用（シス
テインまたは非天然アミノ酸）を導入することによって安定化され得る。選択肢の１つは
、ポリペプチド相互作用部位近くに位置付けられている天然ＵＬ４２システイン（Ｃ３０
０）を利用し、ポリメラーゼポリペプチドに点変異（例えばＬ１２３４Ｃ）を導入するこ
とである。

ポリメラーゼ前進性を増大する報告された方法は、大腸菌（E.coli）チオレドキシン（
Ｔｒｘ）とバクテリオファージＴ７ＤＮＡポリメラーゼのチオレドキシン結合ドメイン（
ＴＢＤ）（残基２５８〜３３３）との間の相互作用を活用することである。ＴｒｘからＴ
ＢＤへの結合は、ＤＮＡに結合するものへのコンホメーション変化をポリペプチドに生じ
させる。ＴＢＤは、ＤＮＡ鎖上に固定され、ポリメラーゼオフ速度を限定し、それにより
前進性を増大させると考えられている。キメラポリメラーゼは、ＴＢＤを非前進性ポリメ
ラーゼに転移することによって作製され、重合された断片長の１０００倍増加を生じる。
ＴＢＤを任意の他のクラスのタンパク質に付着させる試みはなかったが、ＴＢＤとＴｒｘ
との間の共有結合は操作され、相互作用を安定化するために使用できる。

いくつかのヘリカーゼは、前進性を達成するためにアクセサリータンパク質をｉｎ−ｖ
ｉｖｏで使用する（例えば大腸菌（E.coli）Ｒｅｐヘリカーゼに関して、ファージΦｘ１
７４由来ｃｉｓＡおよびファージＭ１３由来ｇｅｎｅ ＩＩタンパク質）。これらのタン
パク質のいくつかは、１つより多いヘリカーゼと相互作用することが示されている（例え
ばＭｕｔＬは同程度ではないがＵｖｒＤおよびＲｅｐの両方に作用する）。これらのタン
パク質は内在性ＤＮＡ結合能力を有し、それらのいくつかは特異的ＤＮＡ配列を認識する
。いくつかのこれらのアクセサリータンパク質のそれら自体を特異的ＤＮＡ配列に共有結
合的に付着させる能力は、ヘリカーゼ活性についての一連の開始点を作出するためにも使
用できる。

染色体の末端を保護するタンパク質は、テロメアｓｓＤＮＡ配列に高特異性の様式で結
合する。この能力は、そのまままたは配列特異性を消滅させる点変異を使用することによ
ってのいずれかで活用され得る。

小さなＤＮＡ結合モチーフ（ヘリックス−ターン−ヘリックスなど）は、特異的ＤＮＡ
配列を認識する。バクテリオファージ４３４リプレッサーの場合、６２残基断片が操作さ
れ、ＤＮＡ結合能力および特異性を保持していることが示されている。

真核生物タンパク質における豊富なモチーフ、亜鉛フィンガーは特異的様式でＤＮＡに
結合するおよそ３０アミノ酸からなる。典型的には各亜鉛フィンガーは３個のＤＮＡ塩基
だけを認識するが、マルチプルフィンガーはより長い配列を認識するために連結されてよ
い。

増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）は、ｄｓＤＮＡまたはｓｓＤＮＡを引き上げるおよび下げ
る非常に堅固なクランプ（ドーナツ）を形成する。クレン古細菌門（crenarchaeota）由
来ＰＣＮＡは、ヘテロ三量体になることが特有であり、それにより１つのサブユニットを
機能化し、活性を保持することが可能である。そのサブユニットは、配列番号５９、６０
および６１に示されている。ＰＣＮＡは、好ましくは配列番号５９、６０および６１に示
す配列またはその変種を含む三量体である。ｐＣＮＡスライディングクランプ（ＮＣＢＩ
参照配列：ＺＰ＿０６８６３０５０．１；配列番号１１５）は二量体を形成する。ｐＣＮ
Ａは、好ましくは配列番号１１５またはその変種を含む二量体である。変種は、配列番号
５９、６０、６１または１１５から変化しているアミノ酸配列を有し、ポリヌクレオチド
結合活性を保持しているタンパク質である。これは、上に記載のとおり測定され得る。変
種は、アミノ酸同一性に基づいてその配列全体にわたって配列番号５９、６０、６１およ
び１１５のそれぞれに少なくとも５０％相同性（またはヘリカーゼと関連して上に考察し
た任意の％相同性）を有する配列を含む典型的には三量体であり、ポリヌクレオチド結合
活性を保持している。変種はヘリカーゼと関連して上にまたはポアと関連して下に考察し
たいずれの方法においても配列番号５９、６０、６１または１１５と異なっている配列を
含んでよい。変種は、上に考察したとおりヘリカーゼへの付着を促進するために１つもし
くは複数の置換システイン残基および／または１つもしくは複数の置換Ｆａｚ残基を好ま
しくは含む。好ましい実施形態では、サブユニット１および２（すなわち配列番号５９お
よび６０またはその変種）は、遺伝子的に融合されるなど付着し、得られたタンパク質は
構築物を形成するようにヘリカーゼに付着される。構築物の使用の際にサブユニット３（
すなわち配列番号６１またはその変種）は、構築物がポリヌクレオチドに結合すると、Ｐ
ＣＮＡクランプ（またはドーナツ）を完了するために付加される場合がある。好ましい実
施形態では、１つの単量体（すなわち配列番号１１１またはその変種）は、遺伝子的に融
合されているなど、付着されていて、得られるタンパク質は本発明の構築物を形成するよ
うにヘリカーゼに付着されている。構築物の使用の際に第二の単量体（すなわち配列番号
１１１またはその変種）は、構築物がポリヌクレオチドに結合すると、ＰＣＮＡクランプ
（またはドーナツ）を完了するために付加される場合がある。

ポリヌクレオチド結合モチーフは、下の表４に示すもののいずれかから選択されてよい
。

ポリヌクレオチド結合成分は、ポリヌクレオチド結合酵素に好ましくは由来する。ポリ
ヌクレオチド結合酵素は、ポリヌクレオチドに結合でき、ポリヌクレオチドの少なくとも
１つの特徴と相互作用し、修飾するポリペプチドである。酵素は、個々のヌクレオチドま
たは、ジまたはトリヌクレオチドなどのヌクレオチドの短い鎖を形成するように切断する
ことによってポリヌクレオチドを修飾できる。酵素は、ポリヌクレオチドを特異的位置に
方向付けるまたは移動させることによってそれを修飾できる。ポリヌクレオチド結合成分
は、ポリヌクレオチドに結合でき、その移動を制御できる限り酵素活性を示す必要はない
。例えば成分は、その酵素活性を除去するように修飾されている酵素由来であってよく、
またはそれが酵素として作用することを妨げる条件下で使用されてよい。

ポリヌクレオチド結合成分は、好ましくは核酸分解酵素由来である。酵素は、より好ま
しくは酵素分類（ＥＣ）群３．１．１１、３．１．１３、３．１．１４、３．１．１５、
３．１．１６、３．１．２１、３．１．２２、３．１．２５、３．１．２６、３．１．２
７、３．１．３０および３．１．３１のいずれかのメンバー由来である。酵素は、国際出
願第ＰＣＴ／ＧＢ１０／０００１３３号（ＷＯ２０１０／０８６６０３として公開）に開
示のもののいずれかであってよい。

好ましい酵素は、エキソヌクレアーゼ、ポリメラーゼ、ヘリカーゼおよび、ジャイレー
スなどのトポイソメラーゼである。好適なエキソヌクレアーゼは、これだけに限らないが
、大腸菌（E. coli）由来エキソヌクレアーゼＩ、大腸菌（E. coli）由来エキソヌクレア
ーゼＩＩＩ酵素、高度好熱菌（T. thermophilus）由来ＲｅｃＪならびにバクテリオファ
ージラムダエキソヌクレアーゼおよびその変種を含む。

ポリメラーゼは、好ましくは成分分類（ＥＣ）群２．７．７．６、２．７．７．７、２
．７．７．１９、２．７．７．４８および２．７．７．４９のいずれかのメンバーである
。ポリメラーゼは、好ましくはＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポ
リメラーゼ、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼまたはＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼで
ある。ポリヌクレオチド結合成分は、好ましくはＰｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ（配列
番号６２）由来である。成分は、配列番号６２に示す配列またはその変種を含む場合があ
る。配列番号６２の変種は、配列番号６２のものから変化しているアミノ酸配列を有し、
ポリヌクレオチド結合活性を保持している酵素である。変種は、ポリヌクレオチドの結合
を促進するならびに／または高塩濃度および／もしくは室温での活性を促進する修飾を含
む場合がある。

配列番号６２のアミノ酸配列の全長にわたって変種は、アミノ酸同一性に基づいてその
配列に好ましくは少なくとも５０％相同性である。より好ましくは変種ポリペプチドは、
アミノ酸同一性に基づいて配列の全長にわたって配列番号６２のアミノ酸配列に少なくと
も５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％
、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％およびより好ましくは少なく
とも９５％、９７％または９９％相同性であってよい。少なくとも８０％、例えば少なく
とも８５％、９０％または９５％のアミノ酸同一性が２００以上のストレッチ、例えば２
３０、２５０、２７０または２８０以上の連続するアミノ酸にわたってあり得る（「高い
相同性」）。相同性は下に記載のとおり決定される。変種は配列番号２および４を参照し
て下に考察したいずれの方法においても野生型配列と異なっていてよい。

ヘリカーゼは、上に考察したもののいずれであってもよい。ヘリカーゼ二量体および多
量体は下に詳細に考察される。ポリヌクレオチド結合成分は、ヘリカーゼ由来のポリヌク
レオチド結合ドメインであってよい。例えばポリヌクレオチド結合成分は、配列番号６６
または６７に示す配列またはその変種を好ましくは含む。配列番号６６または６７の変種
は、配列番号６６または６７のものから変化しているアミノ酸配列を有し、ポリヌクレオ
チド結合活性を保持しているタンパク質である。これは、上に記載のとおり測定され得る
。変種は、ポリヌクレオチドの結合を促進するならびに／または高塩濃度および／もしく
は室温での活性を促進する修飾を含む場合がある。

配列番号６６または６７のアミノ酸配列の全長にわたって変種は、アミノ酸同一性に基
づいてその配列に好ましくは少なくとも５０％相同性である。より好ましくは変種ポリペ
プチドは、アミノ酸同一性に基づいて配列番号６６または６７のアミノ酸配列の配列の全
長にわたって少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０
％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％および
より好ましくは少なくとも９５％、９７％または９９％相同性であってよい。少なくとも
８０％、例えば少なくとも８５％、９０％または９５％のアミノ酸同一性が４０以上のス
トレッチ、例えば５０、６０、７０または８０以上の連続するアミノ酸にわたってあり得
る（「高い相同性」）。相同性は上に記載のとおり決定される。変種は配列番号２および
４を参照して下に考察したいずれの方法においても野生型配列と異なっていてよい。

トポイソメラーゼは、好ましくは成分分類（ＥＣ）群５．９９．１．２および５．９９
．１．３のいずれかのメンバーである。

ポリヌクレオチド結合成分は、上に考察したいずれの酵素であってもよい。構築物は、
ポリメラーゼ、トポイソメラーゼまたはプライマーゼに付着しているヘリカーゼを好まし
くは含まない。構築物は、互いに付着している２つ以上のＮＳ３ヘリカーゼを好ましくは
含まない。構築物は、ビス（スルホサクシニミジル）スベレート（ＢＳ^３）を使用して互
いに付着している２つ以上のＮＳ３ヘリカーゼをより好ましくは含まない。

成分は、明示用標識（revealing label）で標識されてよい。標識は、上に記載のもの
のいずれであってもよい。

成分は、大腸菌（E. coli）、Ｔ．サーモフィルス（T. thermophilus）またはバクテリ
オファージ、などの任意の成分産生生物から単離され得る、または合成的もしくは組換え
的手段によって作製できる。例えば成分は、下に記載のとおりｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳およ
び転写によって合成できる。成分は、下に記載のとおり大規模に産生されてよく、精製が
続く。

好ましい構築物
上の考察から明らかであるとおり、ポリヌクレオチド結合成分は、ヘリカーゼに好まし
くは由来する。例えばそれは、ヘリカーゼ由来ポリヌクレオチドドメインであってよい。
成分は、１つまたは複数のヘリカーゼをより好ましくは含む。ヘリカーゼは、上に考察し
たもののいずれであってもよい。そのような実施形態では構築物は、互いに付着している
２個以上のヘリカーゼを当然ながら含む。本発明は、互いに付着している２つ以上のヘリ
カーゼを含む構築物を提供する。上に考察したとおり各ヘリカーゼは、そのままでヘリカ
ーゼとして機能できなければならない。本発明の方法において使用できる構築物、具体的
には使用できるヘリカーゼの型および付着方法を参照して上に考察の任意の実施形態は、
本発明の構築物に等しく適用可能である。２つ以上のヘリカーゼは、好ましくは単量体ヘ
リカーゼである。２つ以上のヘリカーゼは、好ましくはヘリカーゼ酵素由来の２つ以上の
ヘリカーゼドメインではない。

本発明の構築物は、互いに付着している２つ以上のＮＳ３ヘリカーゼを好ましくは含ま
ない。本発明の構築物は、ビス（スルホサクシニミジル）スベレート（ＢＳ^３）を使用し
て互いに付着している２つ以上のＮＳ３ヘリカーゼをより好ましくは含まない。

構築物は、２つ、３つ、４つ、５つまたはそれ以上のヘリカーゼを含んで良い。換言す
ると本発明の構築物は、ヘリカーゼ二量体、ヘリカーゼ三量体、ヘリカーゼ四量体、ヘリ
カーゼ五量体などを含んでよい。

２つ以上のヘリカーゼは、任意の方向で互いに付着していてよい。同一または類似のヘ
リカーゼは、各ヘリカーゼ中の同一のアミノ酸残基（すなわち同じ位置）または空間的に
近接しているアミノ酸残基（すなわち空間的に近接している位置）を介して付着してよい
。これは、「ヘッドトゥーヘッド」編成と呼ばれる。代替的に同一または類似のヘリカー
ゼは、各ヘリカーゼの反対または異なる側のアミノ酸残基（または位置）を介して付着し
てよい。これは、「ヘッドトゥーテール」編成と呼ばれる。３つの同一のまたは類似のヘ
リカーゼを含むヘリカーゼ三量体は、ヘッドトゥーヘッドおよびヘッドトゥーテール編成
の両方を含む場合がある。

２つ以上のヘリカーゼは、互いに異なっていてよい（すなわち構築物はヘテロ二量体、
三量体、四量体または五量体などである）。例えば本発明の構築物は：（ａ）１つもしく
は複数のＨｅｌ３０８ヘリカーゼおよび１つもしくは複数のＸＰＤヘリカーゼ；（ｂ）１
つもしくは複数のＨｅｌ３０８ヘリカーゼおよび１つもしくは複数のＲｅｃＤヘリカーゼ
；（ｃ）１つもしくは複数のＨｅｌ３０８ヘリカーゼおよび１つもしくは複数のＴｒａＩ
ヘリカーゼ；（ｄ）１つもしくは複数のＸＰＤヘリカーゼおよび１つもしくは複数のＲｅ
ｃＤヘリカーゼ；（ｅ）１つもしくは複数のＸＰＤヘリカーゼおよび１つもしくは複数の
ＴｒａＩヘリカーゼ；または（ｆ）１つもしくは複数のＲｅｃＤヘリカーゼおよび１つも
しくは複数のＴｒａＩヘリカーゼを含む場合がある。構築物は、同じヘリカーゼの２つの
異なる変種を含む場合がある。例えば構築物は、各変種において異なる位置に導入された
１つまたは複数のシステイン残基またはＦａｚ残基を有する、上に考察したヘリカーゼの
内の１つの２つの変種を含む場合がある。この場合ヘリカーゼは、ヘッドトゥーテール編
成であってよい。好ましい実施形態では、Ｑ４４２Ｃを含む配列番号１０の変種はシステ
イン連結を介してＱ５５７Ｃを含む配列番号１０の変種に付着されてよい。Ｈｅｌ３０８
ＭｂｕのＣｙｓ変異体は、必要に応じてヘテロ二量体に作製されてもよい。この手法では
Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ−Ｑ４４２ＣおよびＨｅｌ３０８Ｍｂｕ−Ｑ５７７Ｃなどの２つの異
なるＣｙｓ変異体対は、ヘッドトゥーテール様式で連結されてよい。ヘテロ二量体は、２
つの可能な方法で形成されてもよい。第一は、上に考察したホモ二機能性リンカーの使用
を含む。ヘリカーゼ変種の１つは、１つのリンカーがタンパク質の１分子に付着されるよ
うに大過剰量のリンカーで修飾されてよい。このリンカー修飾変種は、次いで未修飾タン
パク質、潜在的ホモ二量体、および他のヘリカーゼ変種と反応する未反応リンカーから精
製されてよい。得られた二量体は、次いで他の分子種から精製されてよい。

第二は、ヘテロ二機能性リンカーの使用を含む。例えばヘリカーゼ変種の１つは、一方
の末端にマレイミドまたはヨードアセトアミド官能基および他方の末端にシクロオクチン
官能基（ＤＩＢＯ）を含有する第一のＰＥＧリンカーで修飾されてよい。この一例は下に
示される：

第二のヘリカーゼ変種は、一方の末端にマレイミドまたはヨードアセトアミド官能基お
よび他方の末端にアジド官能基を含有する第二のＰＥＧリンカーで修飾されてよい。一例
を下に示す：

２つの異なるリンカーを有する２つのヘリカーゼ変種は、次いで精製され、二量体を作
製するために合わせてクリック（Ｃｕ^２＋フリークリックケミストリーを使用する）され
てよい。銅フリークリックケミストリーは、その望ましい特徴によりこれらの応用におい
て使用されている。例えばそれは、迅速、清潔およびタンパク質に無毒である。しかし他
の好適な生体直交型化学は、これだけに限らないが、シュタウディンガー化学、ヒドラジ
ンまたはヒドラジド／アルデヒドまたはケトン試薬（ＨｙＮｉｃ＋４ＦＢ化学、全てのＳ
ｏｌｕｌｉｎｋ（商標）試薬を含む）、ディール・アルダー試薬対およびボロン酸／サリ
チルヒドロキサム酸試薬を含む。

同じヘリカーゼの２つの異なる変種を連結するこれらの２つの方法は、２つの異なるヘ
リカーゼの二量体およびヘリカーゼポリメラーゼ二量体などのヘリカーゼと成分とが互い
に異なっている上に考察した構築物のいずれについても有効である。

類似の方法がさまざまなＦａｚ変種を連結するために使用され得る。１つのＦａｚ変種
（Ｑ４４２Ｃを含む配列番号１０など）は、１つのリンカーがタンパク質の１つの分子に
付着されるように大過剰量のリンカーで修飾されてよい。このリンカー修飾Ｆａｚ変種は
、次いで未修飾タンパク質、潜在的ホモ二量体、および第二のＦａｚ変種（Ｑ５７７Ｆａ
ｚを含む配列番号１０など）と反応する未反応リンカーから精製されてよい。得られた二
量体は、次いで他の分子種から精製されてよい。

ヘテロ二量体は、同じヘリカーゼまたは異なるヘリカーゼのシステイン変種とＦａｚ変
種とを連結することによっても作製できる。例えば任意の上のシステイン変種（Ｑ４４２
Ｃを含む配列番号１０など）は、任意の上のＦａｚ変種（Ｑ５７７Ｆａｚを含む配列番号
１０など）と二量体を作製するために使用できる。一方の末端にマレイミドまたはヨード
アセトアミド官能性および他方の末端にＤＢＣＯ官能性を有するヘテロ二機能性ＰＥＧリ
ンカーは、この変異体の組合せにおいて使用できる。そのようなリンカーの一例は、下に
示されている（ＤＢＣＯ−ＰＥＧ４−マレイミド）：

リンカーの長さは、２つの官能基間のＰＥＧ単位の数を変えることによって変更できる
。

ヘリカーゼヘテロ三量体は、Ｈｅｌ３０８ヘリカーゼ、ＸＰＤヘリカーゼ、ＲｅｃＤヘ
リカーゼ、ＴｒａＩヘリカーゼおよびこれらの変種から選択される３種の異なる型のヘリ
カーゼを含んでよい。３個より多いヘリカーゼを含むオリゴマーについても同様である。
構築物中の２つ以上のヘリカーゼは、配列番号１０、１３、１６または１９の異なる変種
などの同じヘリカーゼの異なる変種であってよい。異なる変種は、異なる位置を介する付
着を促進するために異なる位置で修飾されてよい。ヘテロ三量体は、したがってヘッドト
ゥーテールおよびヘッドトゥーヘッド編成である場合がある。

本発明の構築物中の２つ以上のヘリカーゼは、互いに同じであってよい（すなわち構築
物はホモ二量体、三量体、四量体または五量体などである）。ホモオリゴマーは、２つ以
上のＨｅｌ３０８ヘリカーゼ、２つ以上のＸＰＤヘリカーゼ、２つ以上のＲｅｃＤヘリカ
ーゼ、２つ以上のＴｒａＩヘリカーゼまたは２つ以上の上に考察した任意の変種を含んで
よい。そのような実施形態ではヘリカーゼは、各ヘリカーゼ中の同じアミノ酸残基（すな
わち同じ位置）を使用して好ましくは付着している。ヘリカーゼは、したがってヘッドト
ゥーヘッドで付着している。ヘリカーゼは、同じ位置でヘリカーゼに置換されているシス
テイン残基またはＦａｚ残基を使用して連結されてよい。同一のヘリカーゼ変種中のシス
テイン残基は、マレイミドまたはヨードアセトアミドなどのチオール反応性基を含有する
ホモ二機能性リンカーを使用して連結されてよい。これらの官能基は、次の例のとおりポ
リエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖の末端にあってよい：

リンカーの長さは、必要とされる応用に合わせて変更できる。例えばｎは、２、３、４
、８、１１、１２、１６またはそれ以上であってよい。ＰＥＧリンカーは、水溶性などの
好都合な特徴を有することから好適である。他の非ＰＥＧリンカーもシステイン連結にお
いて使用できる。

同様の手法を使用することによって同一のＦａｚ変種は、ホモ二量体に作製され得る。
ＤＩＢＯ官能基を有するホモ二機能性リンカーは、Ｃｕ^２＋フリークリック化学を使用し
てホモ二量体を作製するために、同じＦａｚ変種の２分子を連結するために使用できる。
リンカーの一例は下に示されている：

ＰＥＧリンカーの長さは、２、４、８、１２、１６またはそれ以上のＰＥＧ単位を含ん
で変化してよい。そのようなリンカーは、定量を容易にするために蛍光タグを組み込んで
作製されてもよい。そのような蛍光タグは、マレイミドリンカーにも組み込まれ得る。

本発明の好ましい構築物は下の表５に示されている。

本発明の好ましい構築物は、下の表６に示されている。各列は、左側のカラムのヘリカ
ーゼが右側のカラムの追加的ポリヌクレオチド結合成分に本発明により付着している好ま
しい構築物を示す。

本発明は、ヘリカーゼおよび配列番号９４（メタノピュルス・カンドレリ（Methanopyr
us kandleri）由来トポイソメラーゼＶ由来Ｈ−Ｌドメイン；配列番号８９）または配列
番号９４の配列全体にわたってアミノ酸同一性に基づいて配列番号９４に少なくとも８０
％相同性を有するその変種を含むアミノ酸配列を含む構築物であって、ヘリカーゼがアミ
ノ酸配列に付着されており、構築物がポリヌクレオチドの移動を制御する能力を有する構
築物も提供する。ヘリカーゼは、上に考察したいずれの方法でアミノ酸配列に付着されて
いてもよい。

構築物は、配列番号９０または配列番号９０の配列全体にわたってアミノ酸同一性に基
づいて配列番号９０に少なくとも８０％相同性を有するその変種を好ましくは含む。

配列番号９４または９０のアミノ酸配列の全長にわたって、変種はアミノ酸同一性に基
づいて配列に好ましくは少なくとも８０％相同性である。より好ましくは変種ポリペプチ
ドは、その配列全体にわたってアミノ酸同一性に基づいて配列番号９４または９０のアミ
ノ酸配列に少なくとも８５％、少なくとも９０％およびより好ましくは少なくとも９５％
、９７％または９９％相同性であり得る。少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、
９０％または９５％のアミノ酸同一性が２００以上のストレッチ、例えば２３０、２５０
、２７０または２８０以上の連続するアミノ酸にわたってあり得る（「高い相同性」）。
相同性は下に記載のとおり決定される。変種は配列番号２および４を参照して下に考察し
たいずれの方法においても野生型配列と異なっていてよい。

ポリヌクレオチド配列
本発明は、２つ以上のヘリカーゼが遺伝子的に融合されている構築物をコードしている
ポリヌクレオチド配列も提供する。標準的技術を使用してそのようなポリヌクレオチド配
列を作製することは容易である。ヘリカーゼをコードしているポリヌクレオチド配列は、
別のヘリカーゼをコードしているポリヌクレオチド配列に融合または挿入されてもよい。
融合または挿入は、典型的にはインフレームである。ヘリカーゼをコードしているポリヌ
クレオチド配列が別のヘリカーゼをコードしているポリヌクレオチド配列に挿入される場
合、成分をコードしている配列はＢｓｐＥ１によって認識されるものなどの制限エンドヌ
クレアーゼ部位によって典型的には両端で隣接されている。それは、セリンまたはグリシ
ンをそれぞれコードしている５から１０コドンなどのリンカーをコードしているポリヌク
レオチド配列によって両端で隣接されている場合もある。

ポリヌクレオチド配列は、当技術分野における標準的方法を使用して単離および複製さ
れ得る。染色体ＤＮＡは、メタノコッコイデス・ブルトニイ（Methanococcoides burtoni
i）などのヘリカーゼ産生生物からおよび／または大腸菌（E. coli）、サーマスサーモフ
ィルス（T. thermophilus）またはバクテリオファージ（bacteriophage）などの成分産生
生物から抽出され得る。ヘリカーゼおよび成分をコードしている遺伝子は、特異的プライ
マーを伴うＰＣＲを使用して増幅され得る。増幅された配列は、次いでクローニングベク
ターなどの組換え複製可能ベクターに組み込まれてよい。ベクターは、適合性の宿主細胞
においてポリヌクレオチドを複製するために使用され得る。したがってヘリカーゼおよび
／または成分をコードしているポリヌクレオチド配列は、ヘリカーゼおよび／または成分
をコードしているポリヌクレオチドを複製可能ベクターに導入し、ベクターを適合性の宿
主細胞に導入し、ベクターの複製をもたらす条件下で宿主細胞を増殖させることによって
作製され得る。ベクターは宿主細胞から回収され得る。ポリヌクレオチドのクローニング
のために好適な宿主細胞は、当技術分野において公知であり、下により詳細に記載される
。

ポリヌクレオチド配列は、好適な発現ベクターにクローニングされてよい。発現ベクタ
ーでは構築物をコードしているポリヌクレオチド配列は、典型的には、宿主細胞によるコ
ード配列の発現をもたらすことができる制御配列に作動可能に連結される。そのような発
現ベクターは構築物を発現するために使用され得る。

用語「作動可能に連結する」は、記載される構成成分がそれらが意図する様式で機能す
る関係の近位にあることを指す。コード配列に「作動可能に連結される」制御配列は、コ
ード配列の発現が制御配列と適合性である条件下で達成されるような方法でライゲーショ
ンされる。同じまたは異なるポリヌクレオチドの複数のコピーは、ベクターに導入されて
よい。

発現ベクターは、次いで好適な宿主細胞に導入されてよい。それにより構築物は、構築
物をコードしているポリヌクレオチド配列を発現ベクターに挿入し、ベクターを適合性の
細菌宿主細胞に導入し、ポリヌクレオチド配列の発現をもたらす条件下で宿主細胞を増殖
させることによって産生され得る。

ベクターは、複製開始点、場合により前記ポリヌクレオチド配列の発現のためのプロモ
ーターおよび場合によりプロモーターのレギュレーターと共に提供される例えば、プラス
ミド、ウイルスまたはファージベクターであってよい。ベクターは、１つまたは複数の選
択可能マーカー遺伝子、例えばアンピリシン耐性遺伝子を含有してよい。プロモーターお
よび他の発現調節シグナルは、発現ベクターが設計された宿主細胞に適合性であるように
選択されてよい。Ｔ７、ｔｒｃ、ｌａｃ、ａｒａまたはλ_Ｌプロモーターは典型的には使
用される。

宿主細胞は、典型的には高いレベルで構築物を発現する。構築物をコードしているポリ
ヌクレオチド配列で形質転換される宿主細胞は、細胞を形質転換するために使用される発
現ベクターに適合性であるように選ばれる。宿主細胞は、典型的には細菌性、好ましくは
大腸菌（E. coli）である。λＤＥ３溶原菌を有する任意の細胞、例えばＣ４１（ＤＥ３
）、ＢＬ２１（ＤＥ３）、ＪＭ１０９（ＤＥ３）、Ｂ８３４（ＤＥ３）、ＴＵＮＥＲ、Ｏ
ｒｉｇａｍｉおよびＯｒｉｇａｍｉ Ｂは、Ｔ７プロモーターを含むベクターを発現でき
る。

本発明の方法
本発明は、本発明の構築物、すなわち互いに付着している２つ以上のヘリカーゼを含む
構築物を使用して標的ポリヌクレオチドの移動を制御する方法を提供する。方法は、標的
ポリヌクレオチドを本発明の構築物と接触させ、それによりポリヌクレオチドの移動を制
御するステップを含む。方法は、好ましくはポアに電位が印加されて実行される。下によ
り詳細に考察されるとおり、印加された電位は、ポアと構築物との複合体の形成を典型的
には生じる。印加された電位は、電圧電位であってよい。代替的に印加された電位は、化
学電位であってよい。この一例は、両親媒性層全体に塩勾配を用いている。塩勾配は、Ho
ldenら、J Am Chem Soc. 2007 Jul 11;129(27):8650-5に開示されている。

本発明は標的ポリヌクレオチドを特性決定する方法も提供する。方法は、
（ａ）標的ポリヌクレオチドを膜貫通ポアおよび本明細書に記載の構築物に接触させて、
構築物がポアを通る標的ポリヌクレオチドの移動を制御するステップを含む。方法は、（
ｂ）ポリヌクレオチドがポアに関して移動するときに１つまたは複数の測定値を取るステ
ップであって、測定値が標的ポリヌクレオチドの１つまたは複数の特性の指標であり、そ
れにより標的ポリヌクレオチドを特性決定するステップも含む。

ステップ（ａ）および（ｂ）は、上に考察したとおり好ましくはポアに電位が印加され
て実行される。いくつかの場合では、ポリヌクレオチドがポアに関して移動するときにポ
アを通る電流が標的ポリヌクレオチドの配列を決定するために使用される。これは、鎖配
列決定法である。

本発明の方法は、標的ポリヌクレオチドを特性決定するためである。ポリヌクレオチド
は上に定義されている。

標的ポリヌクレオチドの全体または部分だけは、本方法を用いて特性付けられ得る。標
的ポリヌクレオチドは、任意の長さであってよい。例えばポリヌクレオチドは、長さ少な
くとも１０、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも１５０、少なくとも２００
、少なくとも２５０、少なくとも３００、少なくとも４００または少なくとも５００ヌク
レオチド対であってよい。ポリヌクレオチドは、１０００ヌクレオチド対以上、長さ５０
００ヌクレオチド対以上または長さ１０００００ヌクレオチド対以上であってよい。

標的ポリヌクレオチドは、任意の好適な試料中に存在する。本発明は、標的ポリヌクレ
オチドを含有することが公知であるまたは含有すると考えられる試料について典型的には
実行される。代替的に本発明は、１つまたは複数の標的ポリヌクレオチドの同一性を確認
するために試料中でのその存在が公知であるまたは期待される試料について実行され得る
。

試料は生物学的試料であってよい。本発明は、任意の生物または微生物から得られたま
たは抽出された試料についてｉｎ ｖｉｔｒｏで実行されてよい。生物または微生物は典
型的には古細菌のもの、原核性または真核性であり、典型的には五界：植物界、動物界、
菌界、モネラ界および原生生物界の１つに属する。本発明は、任意のウイルスから得られ
たまたは抽出された試料についてｉｎ ｖｉｔｒｏで実行されてよい。試料は、好ましく
は液体試料である。試料は典型的には、患者の体液を含む。試料は尿、リンパ液、唾液、
粘液または羊水であってよいが、好ましくは血液、血漿または血清である。典型的には試
料は、ヒト由来であるが、代替的に、ウマ、ウシ、ヒツジまたはブタなどの商業的に飼育
される動物由来などの別の哺乳動物由来であってもよく、代替的にネコまたはイヌなどの
愛玩動物であってもよい。代替的に植物由来の試料は、穀類、マメ、果実または野菜など
の商品作物（例えばコムギ、オオムギ、カラスムギ、セイヨウアブラナ、トウモロコシ、
ダイズ、イネ、バナナ、リンゴ、トマト、ジャガイモ、ブドウ、タバコ、マメ、レンズマ
メ、サトウキビ、ココア、ワタ）から典型的には得られる。

試料は、非生物学的試料であってよい。非生物学的試料は、好ましくは液体試料である
。非生物学的試料の例は、手術用液（surgical fluids）、水（飲料水、海水または河川
水など）および検査室検査のための試薬を含む。

試料は、典型的にはアッセイされる前に例えば遠心分離によってまたは、不要の分子ま
たは細胞（赤血球細胞など）をろ過して除く膜を通すことによって処理される。試料は採
取されてから直ちに測定されてよい。試料は、典型的にはアッセイの前に好ましくは−７
０℃より低くで、保存されてもよい。

膜貫通ポアは、ある程度膜を超える構造である。それは印加された電位によって駆動さ
れた水和イオンが膜を超えてまたは膜内に流れるようにする。膜貫通ポアは、典型的には
膜全体を超え、それにより水和イオンは膜の一方の側から膜の他方の側へ流れられる。し
かし膜貫通ポアは、膜を超えている必要はない。それは、一方の端で閉じていてもよい。
例えばポアは、水和イオンが膜に沿ってまたは膜内に流れ得る穴であってもよい。

任意の膜貫通ポアが本発明において使用され得る。ポアは、生物学的または人工であっ
てよい。好適なポアは、これだけに限らないが、タンパク質ポア、ポリヌクレオチドポア
およびソリッドステートポアを含む。

任意の膜が本発明により用いられ得る。好適な膜は、当技術分野において周知である。
膜は、好ましくは両親媒性層である。両親媒性層は、少なくとも１つの親水性の部分およ
び少なくとも１つの親油性または疎水性の部分の両方を有するリン脂質などの両親媒性分
子から形成される層である。両親媒性層は単層または二重層であってよい。両親媒性分子
は合成または天然に存在するものでよい。天然に存在しない両親媒性物質、および単層を
形成する両親媒性物質は当技術分野において公知であり、例えばブロック共重合体（Gonz
alez-Perezら、Langmuir、2009、25、10447-10450）を含む。ブロック共重合体は、２つ
以上の単量体サブユニットが１本のポリマー鎖を作るように併せて重合されている重合体
材料である。ブロック共重合体は、典型的には各単量体サブユニットによって寄与される
特徴を有する。しかし、ブロック共重合体は、個々のサブユニットから形成されたポリマ
ーが有さない特有の特徴を有する場合がある。ブロック共重合は、単量体サブユニットの
１つが疎水性（すなわち親油性）である一方で他のサブユニット（複数可）が水性媒体中
では親水性であるように操作されてよい。この場合ブロック共重合体は、両親媒性特徴を
有する場合があり、生物学的膜を模倣する構造を形成できる。ブロック共重合体は、ジブ
ロック（２個の単量体サブユニットからなる）であってよいが、両親媒性物質として振る
舞うさらに複雑な配置を形成するために２個より多い単量体サブユニットから構築されて
もよい。共重合体はトリブロック、テトラブトックまたはペンタブロック共重合体であっ
てもよい。

両親媒性層は、典型的には平面状脂質二重層または支持された二重層である。

両親媒性層は典型的には、脂質二重層である。脂質二重層は細胞膜のモデルであり、さ
まざまな実験研究のための優れたプラットフォームとして役立つ。例えば、脂質二重層は
、単一チャネル記録による膜タンパク質のｉｎ ｖｉｔｒｏ調査のために用いられ得る。
代替的に脂質二重層は、さまざまな物質の存在を検出するためのバイオセンサーとして用
いられ得る。脂質二重層は、任意の脂質二重層であってよい。好適な脂質二重層は、これ
だけに限らないが平面状脂質二重層、支持された二重層またはリポソームを含む。脂質二
重層は好ましくは平面状脂質二重層である。好適な脂質二重層は、国際出願第ＰＣＴ／Ｇ
Ｂ０８／０００５６３号（ＷＯ２００８／１０２１２１として公開）、国際出願第ＰＣＴ
／ＧＢ０８／００４１２７号（ＷＯ２００９／０７７７３４として公開）および国際出願
第ＰＣＴ／ＧＢ２００６／００１０５７号（ＷＯ２００６／１００４８４として公開）に
開示されている。

脂質二重層を形成するための方法は、当技術分野において公知である。好適な方法は実
施例に開示する。脂質二重層は、脂質単層が水溶液／空気界面にその界面に垂直である開
口部のいずれかの端を通って運ばれる、モンタルおよびミューラーの方法（Proc.Natl.Ac
ad.Sci.USA.、1972;69:3561-3566）によって一般的には形成される。

モンタルおよびミューラーの方法は、タンパク質ポア挿入のために好適である良質な脂
質二重層を形成する対費用効果が高くて比較的簡単な方法であることから一般的である。
二重層形成の他の一般的方法は、チップディッピング、ペインティング二重層およびリポ
ソーム二重層のパッチクランピングを含む。

好ましい実施形態では、脂質二重層は国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ０８／００４１２７号（
ＷＯ２００９／０７７７３４として公開）に記載のとおり形成される。別の好ましい実施
形態では、膜は、ソリッドステート層である。ソリッドステート層は生物由来ではない。
換言すると、ソリッドステート層は、生物または細胞などの生物学的環境由来でなく、ま
たはそれから単離されず、生物学的に入手可能な構造の合成的に製造されたバージョンで
もない。ソリッドステート層は、これだけに限らないがミクロ電子材料、Ｓｉ_３Ｎ_４、Ａ
１_２０_３およびＳｉＯなどの絶縁材料、ポリアミドなどの有機および無機ポリマー、Ｔｅ
ｆｌｏｎ（登録商標）などのプラスチックまたは２要素添加硬化シリコンゴム（two-comp
onent addition-cure silicone rubber）などのエラストマーならびにガラスを含む有機
材料ならびに無機材料の両方から形成され得る。ソリッドステート層は、グラフェン（gr
aphene）などの一原子層からまたは数原子厚だけである層から形成され得る。好適なグラ
フェン（graphene）層は、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０１０６３７号（ＷＯ２０
０９／０３５６４７として公開）に開示されている。

方法は、（ｉ）ポアを含む人工両親媒性層、（ｉｉ）ポアを含む単離された天然に存在
する脂質二重層、または（ｉｉｉ）挿入されたポアを有する細胞を用いて典型的には実行
される。方法は、人工脂質二重層などの人工両親媒性層を用いて典型的には実行される。
両親媒性層は、ポアに加えて他の膜貫通タンパク質および／または膜内タンパク質ならび
に他の分子を含んでもよい。好適な装置および条件は、下に考察される。本発明の方法は
、典型的にはｉｎ ｖｉｔｒｏで実行される。ポリヌクレオチドは、膜にカップリングさ
れ得る。これは、任意の公知の方法を用いてされ得る。膜が脂質二重層などの両親媒性層
である場合は（下に詳細に考察されるとおり）、ポリヌクレオチドは、膜に存在するポリ
ペプチドまたは膜に存在する疎水性アンカーを介して膜に好ましくはカップリングされる
。疎水性アンカーは、好ましくは脂質、脂肪酸、ステロール、カーボンナノチューブまた
はアミノ酸である。

ポリヌクレオチドは膜に直接カップリングされ得る。ポリヌクレオチドは好ましくは膜
にリンカーを介してカップリングされる。好ましいリンカーは、これだけに限らないがポ
リヌクレオチド、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびポリペプチドなどのポリマー
を含む。ポリヌクレオチドが膜に直接カップリングされる場合、膜とヘリカーゼとの間の
距離のためにポリヌクレオチドの末端まで特性決定が継続できないことから、いくらかの
データが失われる。リンカーが用いられる場合、ポリヌクレオチドは完了まで処理され得
る。リンカーが用いられる場合、リンカーはポリヌクレオチドの任意の位置に付着され得
る。リンカーは、テールポリマーでポリヌクレオチドに好ましくは付着される。

カップリングは、安定または一過的であってよい。ある種の応用に関してカップリング
の一過的な性質は好ましい。安定カップリング分子がポリヌクレオチドの５’末端または
３’末端のいずれかに直接付着された場合、二重層とヘリカーゼ活性部位との間の距離の
ためにポリヌクレオチドの末端まで特性決定が継続できないことから、いくらかのデータ
が失われる。カップリングが一過的である場合、カップリングされた端は無作為に二重層
から遊離し、ポリヌクレオチドは完了まで処理され得る。安定なまたは一過的連結を膜と
形成する化学基は、下により詳細に考察される。ポリヌクレオチドは、コレステロール（
cholesterol）または脂肪酸アシル鎖を用いて脂質二重層などの両親媒性層に一過的にカ
ップリングされ得る。ヘキサデカン酸などの長さ６から３０までの炭素原子を有する任意
の脂肪酸アシル鎖は用いられ得る。

好ましい実施形態では、ポリヌクレオチドは、両親媒性層にカップリングされる。合成
脂質二重層へのポリヌクレオチドのカップリングは、種々の異なるテザーリング戦略で既
に実行されている。これらを下の表７に要約する。

ポリヌクレオチドは、合成反応において修飾ホスホラミダイトを用いて官能基化される
ことができ、チオール、コレステロール（cholesterol）、脂質およびビオチン基などの
反応基の付加に容易に適合される。これらのさまざまな付着化学物質は、ポリヌクレオチ
ドに一連の付着選択肢をもたらす。さまざまな各修飾基は、わずかに異なる方法でポリヌ
クレオチドを繋ぎ止め、カップリングは常に永久的ではなく、二重層へのさまざまな残存
時間をポリヌクレオチドにもたらす。一過的カップリングの有利点は、上に考察される。

ポリヌクレオチドのカップリングは、反応基がポリヌクレオチドに付加され得る限り多
数の他の手段によっても達成され得る。ＤＮＡのいずれかの端への反応基の付加は既に報
告されている。チオール基はポリヌクレオチドキナーゼおよびＡＴＰγＳを用いてｓｓＤ
ＮＡの５’に付加され得る（Grant,G.P.およびP.Z.Qin (2007) "A facile method for at
taching nitroxide spin labels at the 5' terminus of nucleic acids." Nucleic Acid
s Res 35(10):e77）。ビオチン、チオールおよびフルオロフォア（fluorophore）などの
化学基のより多様な選択は、修飾オリゴヌクレオチドをｓｓＤＮＡの３’に組み込むため
にターミナルトランスフェラーゼを用いて付加され得る（Kumar,A.,P.Tchenら、(1988)."
Nonradioactive labeling of synthetic oligonucleotide probes with terminal deoxyn
ucleotidyl transferase." Anal Biochem 169(2):376-82）。

代替的に反応基は、二重層に既にカップリングされたものに相補的なＤＮＡの短片の付
加のために考慮される場合があり、付着はハイブリダイゼーションを介して達成され得る
。ｓｓＤＮＡの短片のライゲーションは、Ｔ４ＲＮＡリガーゼＩを用いて報告されている
（Troutt,A.B.,M.G.McHeyzer-Williamsら、(1992)."Ligation-anchored PCR: a simple a
mplification technique with single-sided specificity." Proc Natl Acad Sci U S A
89(20):9823-5）。代替的にｓｓＤＮＡまたはｄｓＤＮＡのいずれかは、天然ｄｓＤＮＡ
にライゲーションされることができ、次いで２本鎖は熱的または化学的変性によって分離
された。天然ｄｓＤＮＡについて、ｓｓＤＮＡの１片を二重鎖の１つもしくは両方の端に
、またはｄｓＤＮＡを１つまたは両方の端へのいずれかで付加できる。次いで、二重鎖が
融解される際に、ｓｓＤＮＡが５’末端、３’末端もしくは両端でのライゲーションもし
くは修飾のために用いられ、ｄｓＤＮＡがライゲーションのために用いられた場合、各一
重鎖は５’または３’修飾のいずれかを有する。ポリヌクレオチドが合成鎖である場合、
カップリング化学はポリペプチドの化学合成の際に組み込まれ得る。ここ例えばポリヌク
レオチドは、付着された反応基を有するプライマーを用いて合成され得る。

ゲノムＤＮＡのセクションの増幅のための一般的技術は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣ
Ｒ）を用いている。本明細書では、２個の合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いてＤ
ＮＡの同じセクションの多数の複製物が作製される場合があり、各複製物について二重鎖
中の各鎖の５’は合成ポリヌクレオチドである。コレステロール（cholesterol）、チオ
ール（thiol）、ビオチン（biotin）または脂質などの反応基を有するアンチセンスプラ
イマーを用いるステップによって、増幅された標的ＤＮＡの各複製物は、カップリングの
ための反応基を含有する。

膜貫通ポアは、好ましくは膜貫通タンパク質ポアである。膜貫通タンパク質ポアは、分
析物などの水和イオンが膜の一方の側から膜の他方の側へ流れるようにするポリペプチド
またはポリペプチドの集積物である。本発明では膜貫通タンパク質ポアは、水和イオンが
印加された電位によって膜の一方の側から他方へ流れるように駆動されるようにするポア
を形成できる。膜貫通タンパク質ポアは、ヌクレオチドなどの分析物が膜（脂質二重層な
ど）の一方の側から他方へ流れるように好ましくはする。膜貫通タンパク質ポアは、ＤＮ
ＡまたはＲＮＡなどのポリヌクレオチドがポアを通って移動されることを可能にする。

膜貫通タンパク質ポアは、単量体またはオリゴマーであってよい。ポアは、いくつかの
反復サブユニット（６、７、８または９サブユニット）から好ましくは作られる。ポアは
好ましくは六量体、七量体、八量体または九量体ポアである。

膜貫通タンパク質ポアは、イオンが通って流れることができるバレルまたはチャネルを
典型的には含む。ポアのサブユニットは、典型的には中央軸を取り囲み、膜貫通βバレル
もしくはチャネルまたは膜貫通αヘリックス束もしくはチャネルに鎖を供する。

膜貫通タンパク質ポアのバレルまたはチャネルは、ヌクレオチド、ポリヌクレオチドま
たは核酸などの分析物との相互作用を促進するアミノ酸を典型的には含む。これらのアミ
ノ酸は、バレルまたはチャネルの狭窄部付近に好ましくは位置する。膜貫通タンパク質ポ
アは、アルギニン、リシンもしくはヒスチジンなどの１つもしくは複数の正に荷電したア
ミノ酸またはチロシンもしくはトリプトファンなどの芳香族アミノ酸を典型的には含む。
これらのアミノ酸は、ポアとヌクレオチド、ポリヌクレオチドまたは核酸との間の相互作
用を典型的には促進する。

本発明による使用のための膜貫通タンパク質ポアは、β−バレルポアまたはα−ヘリッ
クス束ポアから生じ得る。β−バレルポアは、β−鎖から形成されるバレルまたはチャネ
ルを含む。好適なβ−バレルポアは、これだけに限らないが、α−ヘモリジン（hemolysi
n）、炭疽毒素およびロイコシジン（leukocidin）などのβ−毒素、スメグマ菌（Mycobac
terium smegmatis）ポリン（porin）（Ｍｓｐ）、例えばＭｓｐＡ、ＭｓｐＢ、ＭｓｐＣ
またはＭｓｐＤ、外膜ポリン（porin）Ｆ（ＯｍｐＦ）、外膜ポリン（porin）Ｇ（Ｏｍｐ
Ｇ）、外膜ホスホリパーゼＡおよびナイセリア（Neisseria）オートトランスポーターリ
ポタンパク質（ＮａｌＰ）などの細菌の外膜タンパク質／ポリン（porin）を含む。α−
ヘリックス束ポアは、α−ヘリックスから形成されたバレルまたはチャネルを含む。好適
なα−ヘリックス束ポアは、これだけに限らないが内膜タンパク質ならびに、ＷＺＡおよ
びＣｌｙＡ毒などのα外膜タンパク質を含む。膜貫通ポアは、Ｍｓｐ由来またはα−ヘモ
リジン（α−ＨＬ）由来である場合がある。

膜貫通タンパク質ポアは、好ましくはＭｓｐに由来し、好ましくはＭｓｐＡに由来する
。そのようなポアはオリゴマーであり、典型的にはＭｓｐ由来の７、８、９または１０個
の単量体を含む。ポアは、同一の単量体を含むＭｓｐ由来のホモオリゴマーポアであって
よい。代替的にポアは、少なくとも１個の他とは異なる単量体を含むＭｓｐ由来のヘテロ
オリゴマーポアであってもよい。好ましくはポアは、ＭｓｐＡまたはその相同体もしくは
パラログ由来である。

Ｍｓｐ由来の単量体は典型的には、配列番号２に示す配列またはその変種を含む。配列
番号２はＭｓｐＡ単量体のＭＳ−（Ｂ１）８変異体である。それは次の変異：Ｄ９０Ｎ、
Ｄ９１Ｎ、Ｄ９３Ｎ、Ｄ１１８Ｒ、Ｄ１３４ＲおよびＥ１３９Ｋを含む。配列番号２の変
種は、配列番号２のものから変化し、ポアを形成する能力を保持しているアミノ酸配列を
有するポリペプチドである。ポアを形成する変種の能力は、当技術分野において公知の任
意の方法を用いてアッセイされ得る。例えば変種は、他の適切なサブユニットと共に両親
媒性層に挿入されることができ、ポアを形成するためにオリゴマー化するその能力は測定
され得る。サブユニットを両親媒性層などの膜に挿入するための方法は、当技術分野にお
いて公知である。例えばサブユニットは、脂質二重層に拡散し、脂質二重層に結合するス
テップおよび機能的状態に会合するステップによって挿入されるように脂質二重層を含有
する溶液中に精製された形態で懸濁され得る。代替的にサブユニットは、M.A.Holden,H.B
ayley.J.Am.Chem.Soc.2005、127、6502-6503および国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２００６／０
０１０５７号（ＷＯ２００６／１００４８４として公開）に記載の「ピックアンドプレー
ス」法を用いて膜に直接挿入され得る。

配列番号２のアミノ酸配列の全長にわたって変種は、アミノ酸同一性に基づいてその配
列に好ましくは少なくとも５０％相同である。より好ましくは変種は、配列全体にわたっ
て配列番号２のアミノ酸配列にアミノ酸同一性に基づいて少なくとも５５％、少なくとも
６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、
少なくとも８５％、少なくとも９０％およびより好ましくは少なくとも９５％、９７％ま
たは９９％相同である。少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、９０％または９５
％のアミノ酸同一性が１００以上（例えば１２５、１５０、１７５もしくは２００または
それ以上）のストレッチの連続アミノ酸にわたってある場合がある（「高い相同性」）。

相同性を決定するために当技術分野における標準的方法が用いられ得る。例えばＵＷＧ
ＣＧパッケージは、相同性を算出するために用いられ得るＢＥＳＴＦＩＴプログラム（例
えばその初期設定で用いられる）を提供する（Devereuxら、(1984) Nucleic Acids Resea
rch 12、387-395頁）。ＰＩＬＥＵＰおよびＢＬＡＳＴアルゴリズムは、相同性を算出す
るためまたは配列を列挙するために（等価残基または対応する配列を同定するステップな
ど（典型的にはその初期設定で））用いられ得る、例えばAltschul S.F.(1993)J Mol Evo
l 36:290-300；Altschul,S.Fら、(1990) J Mol Biol 215:403-10に記載のとおり。ＢＬＡ
ＳＴ分析を実施するためのソフトウェアは、ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ
ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ
．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を通じて公開で入手可能である。

配列番号２は、ＭｓｐＡ単量体のＭＳ−（Ｂ１）８変異体である。変種は、ＭｓｐＡと
比較してＭｓｐＢ、ＣまたはＤ単量体中の任意の変異を含み得る。ＭｓｐＢ、ＣおよびＤ
の成熟形態は配列番号５から７に示される。詳細には変種は、ＭｓｐＢに存在する次の置
換：Ａ１３８Ｐを含む場合がある。変種は、ＭｓｐＣに存在する次の置換：Ａ９６Ｇ、Ｎ
１０２ＥおよびＡ１３８Ｐの１つまたは複数を含む場合がある。変種はＭｓｐＤに存在す
る次の置換：Ｇ１の欠失、Ｌ２Ｖ、Ｅ５Ｑ、Ｌ８Ｖ、Ｄ１３Ｇ、Ｗ２１Ａ、Ｄ２２Ｅ、Ｋ
４７Ｔ、Ｉ４９Ｈ、Ｉ６８Ｖ、Ｄ９１Ｇ、Ａ９６Ｑ、Ｎ１０２Ｄ、Ｓ１０３Ｔ、Ｖ１０４
Ｉ、Ｓ１３６ＫおよびＧ１４１Ａの１つまたは複数を含む場合がある。変種は、ＭｓｐＢ
、ＣおよびＤ由来の１つまたは複数の変異および置換の組合せを含み得る。変種は、好ま
しくは変異Ｌ８８Ｎを含む。配列番号２の変種は、ＭＳ−Ｂ１の全変異に加えて変異Ｌ８
８Ｎを有し、ＭＳ−（Ｂ２）８と称される。本発明において用いられるポアは、好ましく
はＭＳ−（Ｂ２）８である。配列番号２の変種は変異Ｇ７５Ｓ／Ｇ７７Ｓ／Ｌ８８Ｎ／Ｑ
１２６ＲをＭＳ−Ｂ１の全ての変異に加えて含み、ＭＳ−Ｂ２Ｃと称される。本発明にお
いて使用されるポアは、好ましくはＭＳ−（Ｂ２）８またはＭＳ−（Ｂ２Ｃ）８である。

アミノ酸置換は、上に考察したものに加えて配列番号２のアミノ酸配列に作出され得る
（例えば１、２、３、４、５、１０、２０または３０置換まで）。保存的置換は、アミノ
酸を同様の化学構造、同様の化学的特性または同様の側鎖容積を有する他のアミノ酸で置
き換える。導入されるアミノ酸は、それらが置き換えるアミノ酸と同様の極性、親水性、
疎水性、塩基性度、酸性度、中性度または電荷を有してよい。代替的に保存的置換は、既
存の芳香族または脂肪族アミノ酸の代わりに芳香族または脂肪族である別のアミノ酸を導
入する場合がある。保存的アミノ酸変更は、当技術分野において周知であり、下の表８に
定義のとおり２０種の主なアミノ酸の特性に従って選択され得る。アミノ酸が同様の極性
を有する場合、これは表９におけるアミノ酸側鎖についてのハイドロパシースケールを参
照することによっても決定され得る。

配列番号２のアミノ酸配列の１つまたは複数のアミノ酸残基は、上に記載のポリペプチ
ドから追加的に欠失され得る。１、２、３、４、５、１０、２０または３０残基までまた
はそれ以上が欠失され得る。

変種は、配列番号２の断片を含み得る。そのような断片は、ポア形成活性を保持する。
断片は、長さ少なくとも５０、１００、１５０または２００アミノ酸であってよい。その
ような断片は、ポアを生成するために用いられ得る。断片は、配列番号２のポア形成ドメ
インを好ましくは含む。断片は、配列番号２の残基８８、９０、９１、１０５、１１８お
よび１３４の１つを含まなければならない。典型的には断片は、配列番号２の残基８８、
９０、９１、１０５、１１８および１３４の全てを含む。

１つまたは複数のアミノ酸は、上に記載のポリペプチドに代替的または追加的に付加さ
れ得る。伸長は、配列番号２のアミノ酸配列またはそのポリペプチド変種もしくは断片の
アミノ末端またはカルボキシ末端に与えられ得る。伸長は極めて短い（例えば長さ１から
１０アミノ酸）場合がある。代替的に伸長はより長くても（例えば５０または１００アミ
ノ酸まで）よい。担体タンパク質は、本発明によるアミノ酸配列に融合され得る。他の融
合タンパク質は、下により詳細に考察される。

上に考察したとおり変種は、配列番号２から変更され、ポアを形成する能力を保持して
いるアミノ酸配列を有するポリペプチドである。変種は、ポア形成に関与する配列番号２
の領域を典型的には含有する。β−バレルを含有するＭｓｐのポア形成能力は、各サブユ
ニットのβシートによって与えられる。配列番号２の変種は、β−シートを形成する配列
番号２中の領域を典型的には含む。１つまたは複数の修飾が、得られる変種がポアを形成
する能力を保持する限り、β−シートを形成する配列番号２の領域に作出され得る。配列
番号２の変種は、置換、付加または欠失などの１つまたは複数の修飾をα−ヘリックスお
よび／またはループ領域内に好ましくは含む。

Ｍｓｐ由来の単量体は、それらの同定または精製を支援するために、例えばヒスチジン
残基（ｈｉｓｔタグ）、アスパラギン酸残基（ａｓｐタグ）、ストレプトアビジンタグも
しくはフラッグタグの付加によって、または（細胞からのそれらの分泌を促進するための
シグナル配列の付加によってポリペプチドが天然でそのような配列を含有しない場合に）
修飾され得る。遺伝子タグを導入するための別法は、ポア上の天然のまたは操作された位
置にタグを化学的に反応させることである。この例は、ポアの外側に操作されたシステイ
ンにゲルシフト試薬を反応させることである。これは、ヘモリジンヘテロ−オリゴマーを
分離するステップのための方法として実証されている（Chem Biol.1997 Jul;4(7):497-50
5）。

Ｍｓｐ由来の単量体は、明示標識（revealing label）で標識され得る。明示標識は、
ポアが検出されるようにする任意の好適な標識であってよい。好適な標識は、上に記載さ
れている。

Ｍｓｐ由来の単量体は、Ｄ−アミノ酸を用いても生成され得る。例えばＭｓｐ由来の単
量体は、Ｌ−アミノ酸とＤ−アミノ酸との混合物を含み得る。これは、そのようなタンパ
ク質またはペプチドを生成するための当技術分野における従来法である。

Ｍｓｐ由来の単量体は、ヌクレオチド識別を促進するために１つまたは複数の特異的修
飾を含有する。Ｍｓｐ由来の単量体は、他の非特異的な修飾をそれらがポア形成を干渉し
ない限り含有できる。多数の非特異的側鎖修飾が当技術分野において公知であり、Ｍｓｐ
由来の単量体の側鎖に作出され得る。そのような修飾は、例えばアルデヒドとの反応に続
くＮａＢＨ_４での還元によるアミノ酸の還元的アルキル化、メチルアセトイミデート（me
thylacetimidate）でのアミジン化または無水酢酸でのアシル化を含む。

Ｍｓｐ由来の単量体は、当技術分野において公知の標準的方法を用いて生成され得る。
Ｍｓｐ由来の単量体は、合成的にまたは組換え手段によって作出され得る。例えばポアは
ｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳および転写（ＩＶＴＴ）によって合成され得る。ポアを生成するた
めの好適な方法は、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ０９／００１６９０号（ＷＯ２０１０／００
４２７３として公開）、第ＰＣＴ／ＧＢ０９／００１６７９号（ＷＯ２０１０／００４２
６５として公開）または第ＰＣＴ／ＧＢ１０／０００１３３号（ＷＯ２０１０／０８６６
０３として公開）に考察されている。ポアを膜に挿入するための方法は考察されている。

膜貫通タンパク質ポアは、好ましくはα−ヘモリジン（α−ＨＬ）由来でもある。野生
型α−ＨＬポアは、７個の同一単量体またはサブユニットから形成される（すなわち七量
体である）。α−ヘモリジン−ＮＮの１個の単量体またはサブユニットの配列は配列番号
４に示されている。膜貫通タンパク質ポアは、配列番号４に示す配列またはその変種をそ
れぞれ含む７個の単量体を好ましくは含む。配列番号４のアミノ酸１、７から２１、３１
から３４、４５から５１、６３から６６、７２、９２から９７、１０４から１１１、１２
４から１３６、１４９から１５３、１６０から１６４、１７３から２０６、２１０から２
１３、２１７、２１８、２２３から２２８、２３６から２４２、２６２から２６５、２７
２から２７４、２８７から２９０および２９４はループ領域を形成する。配列番号４の残
基１１３および１４７はα−ＨＬのバレルまたはチャネルの狭窄の一部を形成する。

そのような実施形態では、配列番号４に示す配列またはその変種をそれぞれ含む７個の
タンパク質または単量体を含むポアは、本発明の方法において好ましくは用いられる。７
個のタンパク質は、同じ（ホモ七量体）または異なっていて（ヘテロ七量体）よい。

配列番号４の変種は、配列番号４のものから変化したアミノ酸配列を有し、ポア形成能
力を保持しているタンパク質である。ポアを形成する変種の能力は、当技術分野において
公知の任意の方法を用いてアッセイされ得る。例えば変種は、他の適切なサブユニットと
共に脂質二重層などの両親媒性層に挿入されることができ、ポアを形成するためにオリゴ
マー化するその能力は決定され得る。サブユニットを脂質二重層などの両親媒性層に挿入
するための方法は当技術分野において公知である。好適な方法は上に考察されている。

変種は、構築物への共有結合付着または相互作用を促進する修飾を含み得る。変種は、
構築物への付着を促進する１つまたは複数の反応性システイン残基を好ましくは含む。例
えば変種は、配列番号４の位置８、９、１７、１８、１９、４４、４５、５０、５１、２
３７、２３９および２８７ならびに／またはアミノ末端もしくはカルボキシ末端の１つま
たは複数にシステインを含み得る。好ましい変種は、配列番号４の位置８、９、１７、２
３７、２３９および２８７の残基のシステインでの置換を含む（Ａ８Ｃ、Ｔ９Ｃ、Ｎ１７
Ｃ、Ｋ２３７Ｃ、Ｓ２３９ＣまたはＥ２８７Ｃ）。変種は、好ましくは国際出願第ＰＣＴ
／ＧＢ０９／００１６９０号（ＷＯ２０１０／００４２７３として公開）、第ＰＣＴ／Ｇ
Ｂ０９／００１６７９号（ＷＯ２０１０／００４２６５として公開）、または第ＰＣＴ／
ＧＢ１０／０００１３３号（ＷＯ２０１０／０８６６０３として公開）に記載の変種のい
ずれか１つである。

変種は、ヌクレオチドとの任意の相互作用を促進する修飾も含み得る。

変種は、生物（例えば細菌ブドウ球菌（Staphylococcus））によって天然で発現される
天然に存在する変種であってよい。代替的に変種は、大腸菌（Escherichia coli）などの
細菌によってｉｎ ｖｉｔｒｏでまたは組換え的に発現されてもよい。変種は、組換え技
術によって生成される天然に存在しない変種も含む。配列番号４のアミノ酸配列の全長に
わたって変種は、アミノ酸同一性に基づいてその配列に好ましくは少なくとも５０％相同
である。より好ましくは変種ポリペプチドは、配列全体にわたって配列番号４のアミノ酸
配列にアミノ酸同一性に基づいて少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５
％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少な
くとも９０％およびより好ましくは少なくとも９５％、９７％または９９％相同である。
少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、９０％または９５％のアミノ酸同一性が２
００以上（例えば２３０、２５０、２７０もしくは２８０またはそれ以上）のストレッチ
の連続アミノ酸にわたってある場合がある（「高い相同性」）。相同性は上に考察のとお
り決定され得る。

アミノ酸置換は、上に考察したものに加えて配列番号４のアミノ酸配列に作出され得る
（例えば１、２、３、４、５、１０、２０または３０置換まで）。保存的置換は、上に考
察の通り作出され得る。

配列番号４のアミノ酸配列の１つまたは複数のアミノ酸残基は、上に記載のポリペプチ
ドから追加的に欠失され得る。１、２、３、４、５、１０、２０または３０残基までまた
はそれ以上が欠失され得る。

変種は、配列番号４の断片であり得る。そのような断片はポア形成能力を保持する。断
片は、長さ少なくとも５０、１００、２００または２５０アミノ酸であってよい。断片は
、配列番号４のポア形成ドメインを好ましくは含む。断片は典型的には配列番号４の残基
１１９、１２１、１３５、１１３および１３９を含む。

１つまたは複数のアミノ酸は、上に記載のポリペプチドに代替的にまたは追加的に付加
され得る。伸長は、配列番号４のアミノ酸配列またはその変種もしくは断片のアミノ末端
またはカルボキシ末端に与えられ得る。伸長は極めて短い（例えば長さ１から１０アミノ
酸）場合がある。代替的に伸長は、より長くても（例えば５０または１００アミノ酸まで
）良い。担体タンパク質は、ポアまたは変種に融合されてもよい。

上に考察したとおり、配列番号４の変種は、配列番号４のものから変更され、ポアを形
成する能力を保持しているアミノ酸配列を有するサブユニットである。変種は、ポア形成
に関与する配列番号４の領域を典型的には含有する。β−バレルを含有するα−ＨＬのポ
ア形成能力は、各サブユニットのβシートによって与えられる。配列番号４の変種は、β
鎖を形成する配列番号４の領域を典型的には含む。β鎖を形成する配列番号４のアミノ酸
は上に考察されている。１つまたは複数の修飾が、得られる変種がポアを形成する能力を
保持する限りβ−鎖を形成する配列番号４の領域に作出され得る。配列番号４のβ鎖領域
に作られ得る具体的な修飾は、上に考察されている。

配列番号４の変種は、置換、付加または欠失などの１つまたは複数の修飾をα−ヘリッ
クスおよび／またはループ領域内に好ましくは含む。α−ヘリックスおよびループを形成
するアミノ酸は、上に考察されている。

変種は、上に考察のとおり、その同定または精製を支援するために修飾され得る。

α−ＨＬ由来のポアは、Ｍｓｐ由来のポアに関連して上に考察のとおり作出され得る。

いくつかの実施形態では膜貫通タンパク質ポアは、化学的に修飾される。ポアは、任意
の方法および任意の部位で化学的に修飾され得る。膜貫通タンパク質ポアは、１つもしく
は複数のシステインへの分子の付着（システイン連結）、１つもしくは複数のリシンへの
分子の付着、１つもしくは複数の非天然アミノ酸への分子の付着、エピトープの酵素修飾
または末端の修飾によって好ましくは化学的に修飾される。そのような修飾を実行するた
めの好適な方法は、当技術分野において周知である。膜貫通タンパク質ポアは、任意の分
子の付着によって化学的に修飾され得る。例えばポアは、色素またはフルオロフォアの付
着によって化学的に修飾され得る。

ポア中の任意の数の単量体は、化学的に修飾され得る。１つまたは複数（２、３、４、
５、６、７、８、９または１０個など）の単量体は、上に考察のとおり好ましくは化学的
に修飾される。

システイン残基の反応性は、隣接残基の修飾によって増強され得る。例えば近接アルギ
ニン、ヒスチジンまたはリシン残基の塩基性基は、システインチオール基のｐＫａをより
反応性のＳ⁻基のものに変化させる。システイン残基の反応性は、ｄＴＮＢなどのチオー
ル保護基によって保護され得る。これらは、リンカーが付着する前にポアの１つまたは複
数のシステイン残基と反応できる。

（ポアが化学的に修飾される）分子は、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ０９／００１６９０号
（ＷＯ２０１０／００４２７３として公開）、第ＰＣＴ／ＧＢ０９／００１６７９号（Ｗ
Ｏ２０１０／００４２６５として公開）または第ＰＣＴ／ＧＢ１０／０００１３３号（Ｗ
Ｏ２０１０／０８６６０３として公開）に開示のとおりポアに直接付着され得るか、また
はリンカーを介して付着され得る。

構築物は、ポアに共有結合的に付着されていてもよい。構築物は、好ましくはポアに共
有結合的に付着されていない。ポアおよび構築物への電圧の印加は、典型的には標的ポリ
ヌクレオチドを配列決定できるセンサーの形成を生じる。これは、下により詳細に考察さ
れる。

本明細書に記載の任意のタンパク質、すなわち膜貫通タンパク質ポアまたは構築物は、
それらの同定または精製を支援するために、例えばヒスチジン残基（ｈｉｓタグ）、アス
パラギン酸残基（ａｓｐタグ）、ストレプトアビジンタグ、フラッグタグ、ＳＵＭＯタグ
、ＧＳＴタグもしくはＭＢＰタグの付加によって、または、それらの細胞からの分泌を促
進するために（ポリペプチドが天然でそのような配列を含有していない場合に）シグナル
配列の付加によって修飾され得る。遺伝子タグを導入するための別法は、ポアまたは構築
物上の天然のまたは操作された位置にタグを化学的に反応させることである。この例は、
ポアの外側の操作されたシステインにゲルシフト試薬を反応させることである。これは、
ヘモリジンヘテロ−オリゴマーを分離するステップのための方法として実証されている（
Chem Biol.1997 Jul;4(7):497-505）。

ポアおよび／または構築物は明示標識（revealing label）で標識され得る。明示標識
は、ポアが検出されるようにする任意の好適な標識であってよい。好適な標識は、これだ
けに限らないが蛍光分子、放射性同位元素（例えば^１２５Ｉ、^３５Ｓ）、酵素、抗体、抗
原、ポリヌクレオチドおよびリガンド（ビオチンなど）を含む。

タンパク質は、合成的にまたは組換え手段によって作出され得る。例えばポアおよび／
または構築物は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳および転写（ＩＶＴＴ）によって合成され得る。
ポアおよび／または構築物のアミノ酸配列は、天然に存在しないアミノ酸を含むようにま
たはタンパク質の安定性を増大させるように修飾され得る。タンパク質が合成的手段によ
って生成される場合、そのようなアミノ酸は、生成の際に導入され得る。ポアおよび／ま
たは構築物は、合成的にまたは組換え生成のいずれかに続いて変更され得る。

ポアおよび／または構築物は、Ｄ−アミノ酸を用いても生成し得る。例えばポアまたは
構築物は、Ｌ−アミノ酸とＤ−アミノ酸との混合物を含み得る。これは、そのようなタン
パク質またはペプチドを生成するための当技術分野における従来法である。

ポアおよび／または構築物は、他の非特異的修飾もそれらがポア形成または構築物機能
を干渉しない限り含有できる。多数の非特異的側鎖修飾が当技術分野において公知であり
、タンパク質（複数可）の側鎖に作出され得る。そのような修飾は、例えばアルデヒドと
の反応に続くＮａＢＨ_４での還元によるアミノ酸の還元的アルキル化、メチルアセトイミ
デート（methylacetimidate）でのアミジン化または無水酢酸でのアシル化を含む。

ポアおよび構築物は、当技術分野において公知の標準的方法を用いて生成され得る。ポ
アまたは構築物をコードするポリヌクレオチド配列は、当技術分野における標準的方法を
用いて得られ、複製され得る。ポアまたは構築物をコードするポリヌクレオチド配列は、
当技術分野における標準的技術を用いて細菌宿主細胞において発現され得る。ポアおよび
／または構築物は、組換え発現ベクターからのポリペプチドの原位置での発現によって細
胞において生成され得る。場合により発現ベクターは、ポリペプチドの発現を制御するた
めに誘導性プロモーターを保持する。これらの方法は、Sambrook,J.and Russell,D.(2001
).Molecular Cloning:A Laboratory Manual、3rd Edition.Cold Spring Harbor Laborato
ry Press、Cold Spring Harbor、NYに記載されている。

ポアおよび／または構築物は、大規模に生成されることができ、タンパク質生成生物ま
たは組換え発現からの任意のタンパク質液体クロマトグラフィー系による精製が続く。典
型的なタンパク質液体クロマトグラフィー系は、ＦＰＬＣ、ＡＫＴＡ ｓｙｓｔｅｍｓ、
Ｂｉｏ−Ｃａｄ ｓｙｓｔｅｍ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ ＢｉｏＬｏｇｉｃ ｓｙｓｔｅｍおよ
びＧｉｌｓｏｎ ＨＰＬＣ ｓｙｓｔｅｍを含む。

本発明の方法は、標的ポリヌクレオチドの１つまたは複数の特性を測定するステップを
含む。方法は、標的ポリヌクレオチドの２つ、３つ、４つまたは５つ以上の特性を測定す
るステップを含み得る。１つまたは複数の特性は、好ましくは（ｉ）標的ポリヌクレオチ
ドの長さ、（ｉｉ）標的ポリヌクレオチドの同一性、（ｉｉｉ）標的ポリヌクレオチドの
配列、（ｉｖ）標的ポリヌクレオチドの二次構造および（ｖ）標的ポリヌクレオチドが修
飾されているか否か、から選択される。（ｉ）から（ｖ）の任意の組合せは本発明により
測定され得る。

（ｉ）に関して、ポリヌクレオチドの長さは、例えば標的ポリヌクレオチドとポアとの
間の相互作用の数または標的ポリヌクレオチドとポアとの間の相互作用の持続時間を測定
することによって測定され得る。

（ｉｉ）に関して、ポリヌクレオチドの同一性は、多数の方法において測定され得る。
ポリヌクレオチドの同一性は、標的ポリヌクレオチドの配列の測定を伴ってまたは標的ポ
リヌクレオチドの配列の測定を伴わずに測定され得る。前者は、簡単であり、ポリヌクレ
オチドは配列決定され、それにより同定される。後者は、いくつかの方法で行われ得る。
例えばポリヌクレオチド中の具体的なモチーフの存在は（ポリヌクレオチドの残りの配列
を測定するステップを伴わずに）測定され得る。代替的に、方法における具体的な電気的
および／または光学的シグナルの測定は、標的ポリヌクレオチドを具体的な供給源由来で
あるとして同定できる。

（ｉｉｉ）に関して、ポリヌクレオチドの配列は、以前記載されたとおり決定され得る
。好適な配列決定方法、詳細には電気的測定を用いるものは、Stoddart Dら、Proc Natl
Acad Sci、12;106(19):7702-7、Lieberman KRら、J Am Chem Soc.2010;132(50):17961-72
および国際出願第ＷＯ２０００／２８３１２号に記載されている。

（ｉｖ）に関して、二次構造は、種々の方法において測定され得る。例えば方法が電気
的測定を含む場合、二次構造は残存時間における変化またはポアを通って流れる電流にお
ける変化を用いて測定され得る。これは、１本鎖と２本鎖のポリヌクレオチドの領域を区
別できるようにする。

（ｖ）に関して、任意の修飾の存在または非存在は、測定され得る。方法は、好ましく
は標的ポリヌクレオチドが、メチル化によって、酸化によって、損傷によって、１つまた
は複数のタンパク質でまたは１つまたは複数の標識、タグもしくはスペーサーで修飾され
ているかどうかを決定するステップを含む。具体的な修飾は、下に記載の方法を用いて測
定され得るポアとの特異的な相互作用を生じる。例えばメチルシトシンは、各ヌクレオチ
ドとのその相互作用の際にポアを通って流れる電流に基づいてシトシンから区別され得る
。

種々の異なる種類の測定が作出されてよい。これは、非限定的に：電気的測定および光
学的測定を含む。可能性のある電気的測定は、電流測定：インピーダンス測定、トンネル
測定（Ivanov APら、Nano Lett.2011 Jan 12;11(1):279-85）およびＦＥＴ測定（国際出
願第ＷＯ２００５／１２４８８８号）を含む。光学的測定は、電気的測定（Soni GVら、R
ev Sci Instrum. 2010 Jan;81(1):014301）と組み合わされ得る。測定は、ポアを通って
流れるイオン電流の測定などの膜貫通電流測定であってよい。

電気的測定は、Stoddart Dら、Proc Natl Acad Sci、12;106(19):7702-7、Lieberman K
Rら、J Am Chem Soc.2010;132(50):17961-72および国際出願第ＷＯ−２０００／２８３１
２号に記載の標準的単一チャネル記録機器を用いて作出され得る。代替的に電気的測定は
、例えば国際出願第ＷＯ−２００９／０７７７３４号および国際出願第ＷＯ−２０１１／
０６７５５９号に記載のマルチチャネル系を用いても作出され得る。

好ましい実施形態では、方法は、
（ａ）標的ポリヌクレオチドを膜貫通ポアおよび本明細書に記載の構築物と、標的ポリヌ
クレオチドがポアを通って移動し、構築物がポアを通る標的ポリヌクレオチドの移動を制
御するように接触させるステップ、ならびに
（ｂ）ポリヌクレオチドがポアに関して移動するときにポアを通る電流を測定するステッ
プであって、電流が標的ポリヌクレオチドの特性の１つまたは複数を示し、それにより標
的ポリヌクレオチドを特性決定するステップ
を含む。

方法は、ポアが膜内に存在している膜／ポア系を調べるのに好適である任意の装置を用
いて実行され得る。方法は、膜貫通ポアセンシングに好適である任意の装置を用いて実行
され得る。例えば装置は、水性溶液および、チャンバーを２つのセクションに分離する障
壁を含むチャンバーを含む。障壁は典型的にはポアを含有する膜が形成される開口部を有
する。代替的に障壁は、ポアが存在する膜を形成する。

方法は、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ０８／０００５６２号（ＷＯ２００８／１０２１２０
）に記載の装置を用いて実行され得る。

方法は、ポリヌクレオチドがポアに関して移動するときにポアを通る電流を測定するス
テップを含んでよい。したがって装置は、電位を印加でき、膜およびポアを通る電気シグ
ナルを測定できる電気回路も含む。方法は、パッチクランプまたは電圧クランプを用いて
も実行され得る。方法は、電圧クランプの使用を好ましくは含む。

本発明の方法は、ポリヌクレオチドがポアに関して移動するときにポアを通過する電流
の測定を含み得る。膜貫通タンパク質ポアを通るイオン電流を測定するための好適な条件
は、当技術分野において公知であり、実施例で開示される。方法は、膜およびポア全体に
印加される電圧と共に典型的には実行される。用いられる電圧は典型的には、＋２Ｖから
−２Ｖまで、典型的には−４００ｍＶから＋４００ｍＶまでである。好ましくは用いられ
る電圧は、−４００ｍＶ、−３００ｍＶ、−２００ｍＶ、−１５０ｍＶ、−１００ｍＶ、
−５０ｍＶ、−２０ｍＶおよび０ｍＶから選択される下限値および＋１０ｍＶ、＋２０ｍ
Ｖ、＋５０ｍＶ、＋１００ｍＶ、＋１５０ｍＶ、＋２００ｍＶ、＋３００ｍＶおよび＋４
００ｍＶから独立に選択される上限値を含む範囲内である。用いられる電圧は、より好ま
しくは１００ｍＶから２４０ｍＶまでの範囲内、最も好ましくは１２０ｍＶから２２０ｍ
Ｖまでの範囲内である。印加される電位を増加させることによってポアによるさまざまな
ヌクレオチド間の識別を向上させることは可能である。

方法は、金属塩（例えばアルカリ金属塩）、ハロゲン化塩（例えばアルカリ金属塩化物
塩などの塩化物塩）などの任意の電荷担体の存在下で典型的には実行される。電荷担体は
、イオン液体または有機塩、例えばテトラメチル塩化アンモニウム、トリメチルフェニル
塩化アンモニウム、フェニルトリメチル塩化アンモニウムもしくは１−エチル−３メチル
イミダゾリウムクロリド（1-ethyl-3-methyl imidazolium chloride）を含み得る。上に
考察した例示的装置では、塩はチャンバー中の水性溶液中に存在する。塩化カリウム（Ｋ
Ｃｌ）、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、塩化セシウム（ＣｓＣｌ）またはフェロシアン化
カリウムとフェリシアン化カリウムとの混合物が典型的には使用される。ＫＣｌ、ＮａＣ
ｌおよびフェロシアン化カリウムとフェリシアン化カリウムとの混合物は好ましい。塩濃
度は飽和であってよい。塩濃度は、３Ｍ以下があり得、典型的には０．１から２．５Ｍま
で、０．３から１．９Ｍまで、０．５から１．８Ｍまで、０．７から１．７Ｍまで、０．
９から１．６Ｍまでまたは１Ｍから１．４Ｍまでである。塩濃度は、好ましくは１５０ｍ
Ｍから１Ｍまでである。Ｈｅｌ３０８、ＸＰＤ、ＲｅｃＤおよびＴｒａＩヘリカーゼは、
高塩濃度下で驚くべきことに作用する。方法は、少なくとも０．４Ｍ、少なくとも０．５
Ｍ、少なくとも０．６Ｍ、少なくとも０．８Ｍ、少なくとも１．０Ｍ、少なくとも１．５
Ｍ、少なくとも２．０Ｍ、少なくとも２．５Ｍまたは少なくとも３．０Ｍなどの少なくと
も０．３Ｍの塩濃度を用いて好ましくは実行される。高塩濃度は、高い信号対雑音比を提
供し、通常の電流変動のバックグラウンドに対してヌクレオチドの存在を示す電流が同定
されることを可能にする。

方法は、緩衝剤の存在下で典型的には実行される。上に考察した例示的装置では、緩衝
剤はチャンバー中の水性溶液に存在する。任意の緩衝剤が本発明の方法において用いられ
得る。典型的には、緩衝剤はＨＥＰＥＳである。別の好適な緩衝剤はＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩
衝剤である。方法は、４．０から１２．０まで、４．５から１０．０まで、５．０から９
．０まで、５．５から８．８まで、６．０から８．７までまたは７．０から８．８までま
たは７．５から８．５までのｐＨで典型的には実行される。用いられるｐＨは好ましくは
約７．５である。

方法は、０^ｏＣから１００^ｏＣまで、１５^ｏＣから９５^ｏＣまで、１６^ｏＣから９０^ｏ
Ｃまで、１７^ｏＣから８５^ｏＣまで、１８^ｏＣから８０^ｏＣまで、１９^ｏＣから７０^ｏＣ
までまたは２０^ｏＣから６０^ｏＣまでで実行され得る。方法は典型的には室温で実行され
る。方法は、約３７℃などの酵素機能を支持する温度で場合により実行される。

方法は、遊離ヌクレオチドまたは遊離ヌクレオチド類似物および／または構築物の作用
を促進する酵素補因子の存在下で実行されてもよい。方法は、遊離ヌクレオチドまたは遊
離ヌクレオチド類似物の非存在下でおよび酵素補因子の非存在下で実行されてもよい。遊
離ヌクレオチドは、上に考察した個々のヌクレオチドの任意の１つまたは複数であってよ
い。遊離ヌクレオチドは、これだけに限らないがアデノシン一リン酸（ＡＭＰ）、アデノ
シン二リン酸（ＡＤＰ）、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、グアノシン一リン酸（ＧＭＰ
）、グアノシン二リン酸（ＧＤＰ）、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）、チミジン一リン酸
（ＴＭＰ）、チミジン二リン酸（ＴＤＰ）、チミジン三リン酸（ＴＴＰ）、ウリジン一リ
ン酸（ＵＭＰ）、ウリジン二リン酸（ＵＤＰ）、ウリジン三リン酸（ＵＴＰ）、シチジン
一リン酸（ＣＭＰ）、シチジン二リン酸（ＣＤＰ）、シチジン三リン酸（ＣＴＰ）、環状
アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）、環状グアノシン一リン酸（ｃＧＭＰ）、デオキシアデ
ノシン一リン酸（ｄＡＭＰ）、デオキシアデノシン二リン酸（ｄＡＤＰ）、デオキシアデ
ノシン三リン酸（ｄＡＴＰ）、デオキシグアノシン一リン酸（ｄＧＭＰ）、デオキシグア
ノシン二リン酸（ｄＧＤＰ）、デオキシグアノシン三リン酸（ｄＧＴＰ）、デオキシチミ
ジン一リン酸（ｄＴＭＰ）、デオキシチミジン二リン酸（ｄＴＤＰ）、デオキシチミジン
三リン酸（ｄＴＴＰ）、デオキシウリジン一リン酸（ｄＵＭＰ）、デオキシウリジン二リ
ン酸（ｄＵＤＰ）、デオキシウリジン三リン酸（ｄＵＴＰ）、デオキシシチジン一リン酸
（ｄＣＭＰ）、デオキシシチジン二リン酸（ｄＣＤＰ）およびデオキシチジン三リン酸（
ｄＣＴＰ）を含む。遊離ヌクレオチドは、好ましくはＡＭＰ、ＴＭＰ、ＧＭＰ、ＣＭＰ、
ＵＭＰ、ｄＡＭＰ、ｄＴＭＰ、ｄＧＭＰまたはｄＣＭＰから選択される。遊離ヌクレオチ
ドは、好ましくはアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）である。酵素補因子は、構築物を機能さ
せる因子である。酵素補因子は、好ましくは二価金属カチオンである。二価金属カチオン
は好ましくはＭｇ^２＋、Ｍｎ^２＋、Ｃａ^２＋またはＣｏ^２＋である。酵素補因子は、最も
好ましくはＭｇ^２＋である。

標的ポリヌクレオチドは、構築物およびポアと任意の順序で接触され得る。標的ポリヌ
クレオチドが構築物およびポアと接触される場合、標的ポリヌクレオチドは最初に構築物
と複合体を形成することは好ましい。ポアに電圧が印加される場合、標的ポリヌクレオチ
ド／構築物複合体は次いでポアと複合体を形成し、ポアを通るポリヌクレオチドの移動を
制御する。

上に考察したとおり、ヘリカーゼは、ポアに関して２つのモードで作動できる。そのよ
うなヘリカーゼを含む本明細書に記載の構築物は、２つのモードでも作動できる。第一に
、方法は、印加された電圧から生じる場に沿ってポアを通って標的配列を移動させるよう
に構築物を用いて好ましくは実行される。このモードでは、ＤＮＡの５’末端が最初にポ
アに捕捉され、標的配列が最終的に二重層のｔｒａｎｓ側に移行されるまで場に沿ってポ
アを通るように構築物は、ＤＮＡをポア中に移動させる。代替的に、方法は、印加された
電圧から生じる場とは反対に構築物が標的配列をポアを通して移動させるように好ましく
は実行される。このモードでは、ＤＮＡの３’末端が最初にポアに捕捉され、構築物は、
標的配列が最終的に二重層のｃｉｓ側に戻って放されるまで印加された場とは反対にポア
の外側へ引かれるようにＤＮＡをポアを通して移動させる。

他の方法
本発明は、標的ポリヌクレオチドを特性決定するためのセンサーの形成方法も提供する
。方法は、ポアと本明細書に記載の構築物との複合体を形成するステップを含む。複合体
は、ポアと構築物とを標的ポリヌクレオチドの存在下で接触させ、次いで、ポアに電位を
印加するステップによって形成され得る。印加される電位は、上に記載のとおり化学電位
または電圧電位であってよい。代替的に複合体は、ポアを構築物に共有結合的に付着する
ステップによっても形成され得る。共有結合付着のための方法は、当技術分野において公
知であり、例えば国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ０９／００１６７９号（ＷＯ２０１０／００４
２６５として公開）および第ＰＣＴ／ＧＢ１０／０００１３３号（ＷＯ２０１０／０８６
６０３として公開）において開示されている。複合体は、標的ポリヌクレオチドを特性決
定するためのセンサーである。方法は、Ｍｓｐ由来のポアと本明細書に記載の構築物との
複合体を形成するステップを好ましくは含む。本発明の方法を参照して上に考察した任意
の実施形態は、この方法に等しく適用される。本発明は、本発明の方法を使用して産生さ
れるセンサーも提供する。

キット
本発明は、標的ポリヌクレオチドを特性決定するためのキットも提供する。キットは、
（ａ）ポアおよび（ｂ）本明細書に記載の構築物を含む。本発明の方法に関連して上に考
察された任意の実施形態は、キットに等しく適用する。

キットは、脂質二重層などの両親媒性層を形成するために必要なリン脂質などの膜の構
成成分をさらに含んでよい。

本発明のキットは、上に述べた任意の実施形態が実行されるようにする１つまたは複数
の他の試薬または器具を追加的に含んでよい。そのような試薬または器具は、次の：好適
な緩衝剤（複数可）（水性溶液）、対象から試料を得るための手段（容器もしくは、針を
含む器具など）、ポリヌクレオチドを増幅および／もしくは発現するための手段、上に定
義の膜または電圧もしくはパッチクランプ装置、の１つまたは複数を含む。試薬は、液体
試料が試薬を再懸濁するように乾燥状態でキット中に存在する場合がある。キットは、キ
ットが本発明の方法において用いられ得るようにする説明書、またはいずれの患者に方法
が用いられ得るかに関する詳細も場合により含む場合がある。キットは、場合によりヌク
レオチドを含み得る。

装置
本発明は、標的ポリヌクレオチドを特性決定するための装置も提供する。装置は、複数
のポアおよび複数の本明細書に記載の構築物を含む。装置は、本発明の方法を実行するた
めの説明書を好ましくはさらに含む。装置は、アレイまたはチップなどのポリヌクレオチ
ド分析のための任意の従来装置であってよい。本発明の方法に関連して上に考察された任
意の実施形態は、本発明の装置に等しく適用可能である。

装置は、本発明の方法を実行するために好ましくはセットアップされている。

装置は、好ましくは：
複数のポアを支持でき、ポアおよび構築物を用いてポリヌクレオチド特性決定を実施する
ために作動可能であるセンサーデバイス；ならびに
特性決定を実施するための材料を保持するための少なくとも１つのリザーバー；
を含む。

装置は、好ましくは：
膜および複数のポアを支持でき、ポアおよび構築物を用いてポリヌクレオチド特性決定を
実施するために作動可能であるセンサーデバイス；
特性決定を実施するための材料を保持するための少なくとも１つのリザーバー；
少なくとも１つのリザーバーからセンサーデバイスに材料を制御可能に供給するように構
成された流体系；および
各試料を受けるための１つまたは複数の容器を含み、
流体系は、１つまたは複数の容器からセンサーデバイスに試料を選択的に供給するように
構成されている。装置は、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ０８／００４１２７号（ＷＯ２００９
／０７７７３４として公開）、第ＰＣＴ／ＧＢ１０／０００７８９号（ＷＯ２０１０／１
２２２９３として公開）、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ１０／００２２０６号（未公開）また
は国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ９９／２５６７９号（ＷＯ００／２８３１２として公開）にお
いて記載の任意のものであってよい。

本発明の構築物を産生する方法
本発明は、本発明の構築物を産生する方法も提供する。一実施形態では方法は、２つ以
上のヘリカーゼを付着するステップ、好ましくは共有結合で付着するステップを含む。別
の実施形態では方法は、ヘリカーゼを、配列番号９４または配列番号９４の配列全体にわ
たってアミノ酸同一性に基づいて配列番号９４に少なくとも８０％相同性を有するその変
種を含むアミノ酸配列に付着させる、好ましくは共有結合で付着させ、それにより構築物
を産生するステップを含む。上に考察した任意のヘリカーゼが方法において使用できる。
付着の部位および方法は上に考察したとおり選択される。

方法は、構築物がポリヌクレオチドの移動を制御できるかどうかを決定するステップを
さらに含んでもよい。これを行うためのアッセイは、上に記載されている。ポリヌクレオ
チドの移動が制御され得る場合、ヘリカーゼは正しく付着され、本発明の構築物が産生さ
れている。ポリヌクレオチドの移動が制御され得ない場合、本発明の構築物は産生されて
いない。

次の実施例は本発明を例示する。
実施例

本実施例および続く全ての実施例では、ビスマレイミド官能性ＰＥＧリンカーはそれら
の分子量を参照して同定される。例えば「２ｋＤａ」、「２ｋＤＡリンカー」または「２
ｋＤＡ ＰＥＧリンカー」は２ｋＤａの分子量を有するビスマレイミド官能性ＰＥＧリン
カーを指す。

本実施例は、Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ（Ｒ６８７Ａ／Ａ７００Ｃ）−２ｋＤａ二量体（ここ
で各単量体単位は変異Ｒ６８７Ａ／Ａ７００Ｃを有する配列番号１０を含み、１つの単量
体単位は２ｋＤａ ＰＥＧリンカーを使用して各単量体単位の位置７００を介して他に連
結されている）およびＨｅｌ３０８Ｍｂｕ（Ｒ６８１Ａ／Ｒ６８７Ａ／Ａ７００Ｃ）−２
ｋＤａ二量体（ここで各単量体単位は変異Ｒ６８１Ａ／Ｒ６８７Ａ／Ａ７００Ｃを有する
配列番号１０を含み、１つの単量体単位は２ｋＤａ ＰＥＧリンカーを使用して各単量体
単位の位置７００を介して他に連結されている）の合成する方法を記載する。これらの二
量体の場合にはＡ７００Ｃは、二量体タンパク質（Ｍｂｕ／Ｒ６８７Ａ Ａ７００Ｃ−２
ｋＤａ ＰＥＧリンカー−Ａ７００Ｃ Ｍｂｕ／Ｒ６８７ＡおよびＭｂｕ／Ｒ６８１Ａ／
Ｒ６８７Ａ Ａ７００Ｃ−２ｋＤａ ＰＥＧリンカー−Ａ７００Ｃ Ｍｂｕ／Ｒ６８１Ａ
／Ｒ６８７Ａ）においてリンカーへの接続として役立つ追加変異である。Ｈｅｌ３０８Ｍ
ｂｕ（配列番号１０）中には天然でシステイン５個が存在するが、これらはあまり反応性
ではなく、したがって反応はほとんどＡ７００Ｃ上が中心である。

ＤＴＴをＨｅｌ３０８Ｍｂｕ Ｒ６８７Ａ／Ａ７００Ｃ（２ｍｇ／ｍＬ）（変異Ｒ６８
７Ａ／Ａ７００Ｃを有する配列番号１０）に５ｍＭで添加し、３０分間ローテータに置い
た。還元したタンパク質を１００ｍＭリン酸カリウム、５００ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ
ＥＤＴＡ、０．１％ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．２に緩衝液交換した。３０塩基長ｓｓＤＮ
Ａ（配列番号６８）をヘリカーゼ（１０倍過剰）に内部システインを保護するために添加
し、タンパク質が安定のままである可能性を増大させる。タンパク質／ＤＮＡ溶液を緩衝
液で１．５ｍｇ／ｍＬに希釈し、窒素雰囲気下に置き、室温、３０分間インキュベートし
た。０．０１６ｍＭビスマレイミド−ＰＥＧ（２ｋＤａ）を添加し、反応を室温、窒素雰
囲気下で２時間進行させた。１０ｍＭ ＤＴＴを反応をクエンチするために添加し、いか
なるジスルフィド架橋分子種も壊した。Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ（Ｒ６８７Ａ／Ａ７００Ｃ）
−２ｋＤａ変異体二量体をＤＮＡおよび試薬を除去するために初回Ｓｔｒｅｐ−ｔａｃｔ
ｉｎステップ、続いて溶液中に存在する全ての他の分子種から二量体を分離するためにア
ニオン交換クロマトグラフィーステップを使用して直ちに精製した。

ＡＫＴＡ精製装置を精製のために使用した。ストレップ（Ｓｔｒｅｐ）精製を１ｍＬ
ＳｔｒｅｐＴａｃｔｉｎ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅカラ
ムで実施した。タンパク質溶液をカラムに添加する前に結合緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ
、５００ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、２ｍＭ ＤＴＴ、０．０５％ｔｗｅｅｎ２
０、ｐＨ８．０）に緩衝液交換した。全ての未結合材料を除去するための初回洗浄ステッ
プ後、緩衝液中の１０ｍＭデスチオビオチンで溶出する前にタンパク質からＤＮＡを解離
するためにタンパク質を２Ｍ塩を含有する同じ緩衝液で洗浄した。二量体と溶液中に存在
する全ての他の分子種との分離用に調製するために、溶出されたタンパク質をＬＯＷ緩衝
液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、８０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＤＴＴ、０．０５％ｔｗｅｅｎ
２０、ｐＨ８．０）に緩衝液交換した。イオン交換ステップをＧＥ Ｍｉｎｉ Ｑ ＰＣ
３．２／３カラム、流速０．４ｍＬ／分、ＬＯＷからＨＩＧＨ緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒ
ｉｓ、２Ｍ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＤＴＴ、０．０５％ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ８．０）での
グラジエントで実施した。溶出された二量体ピークの開始時、中央および終了時を別々に
プールし、別々のＩＤ番号を付けた。中央ピークを電気生理学での検査に使用する前に３
つ全てを活性アッセイした。図１は、Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ（Ｒ６８７Ａ／Ａ７００Ｃ）単
量体（変異Ｒ６８７Ａ／Ａ７００Ｃを有する配列番号１０、レーン２）およびＨｅｌ３０
８Ｍｂｕ（Ｒ６８７Ａ／Ａ７００Ｃ）−２ｋＤａ二量体（レーン４）のゲルを示す。上記
手順はＨｅｌ３０８Ｍｂｕ（Ｒ６８１Ａ／Ｒ６８７Ａ／Ａ７００Ｃ）単量体（変異Ｒ６８
１Ａ／Ｒ６８７Ａ／Ａ７００Ｃを有する配列番号１０、図１、レーン３）からＨｅｌ３０
８Ｍｂｕ（Ｒ６８１Ａ／Ｒ６８７Ａ／Ａ７００Ｃ）−２ｋＤａ二量体（図１、レーン５）
を形成するために使用できる。

本実施例は、Ｈｅｌ３０８Ｍｈｕ多量体（配列番号１９複数単位）を合成する方法を記
載する。Ｈｅｌ３０８Ｍｈｕ（配列番号１９）に追加的変異は無く、そのためＷＴに含有
されるシステインは、連結のための部位として使用される。

ＤＴＴをＨｅｌ３０８ Ｍｈｕ（１．８３ｍｇ／ｍＬ）（配列番号１９）に１０ｍＭで
添加し、３０分間ローテータに置いた。還元したタンパク質を１００ｍＭリン酸カリウム
、５００ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．２に緩
衝液交換した。３０塩基長ｓｓＤＮＡ（配列番号６８）をヘリカーゼ（６倍過剰）に内部
システインを保護するために添加し、タンパク質が安定のままである可能性を増大させる
。タンパク質／ＤＮＡ溶液を緩衝液で１．６ｍｇ／ｍＬに希釈し、窒素雰囲気下に置き、
室温、３０分間インキュベートした。０．００９５ｍＭビスマレイミド−ＰＥＧ（２ｋＤ
ａ）を添加し、反応を室温、窒素雰囲気下で２時間進行させた。１０ｍＭ ＤＴＴを反応
をクエンチするために添加し、いかなるジスルフィド架橋分子種も壊した。Ｈｅｌ３０８
Ｍｈｕ多量体をＤＮＡおよび試薬を除去するために初回Ｓｔｒｅｐ−ｔａｃｔｉｎステ
ップ、続いて溶液中に存在する全ての他の分子種から単量体を除去するためにアニオン交
換およびゲルろ過クロマトグラフィーステップを使用して直ちに精製した。

ＡＫＴＡ精製装置を精製のために使用した。ストレップ精製を５ｍＬ ＳｔｒｅｐＴａ
ｃｔｉｎ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅカラムで実施した。
タンパク質溶液をカラムに添加する前に結合緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、５００ｍＭ
ＮａＣｌ、０．１％ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ８．０）に緩衝液交換した。全ての未結合材料
を除去するための初回洗浄ステップ後、緩衝液中の１０ｍＭデスチオビオチンで溶出する
前にタンパク質からＤＮＡを解離するためにタンパク質を２Ｍ ＮａＣｌを含有する同じ
緩衝液で洗浄した。二量体と溶液中に存在する全ての他の分子種との分離用に調製するた
めに、溶出されたタンパク質をＬＯＷ緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、８０ｍＭ ＮａＣｌ
、２ｍＭ ＤＴＴ、０．０５％ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ８．０）に緩衝液交換した。イオン
交換ステップをＧＥ Ｍｏｎｏ Ｑ ５／５０ＧＬカラム、流速１ｍＬ／分、ＬＯＷから
ＨＩＧＨ緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、２Ｍ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＤＴＴ、０．０５％ｔ
ｗｅｅｎ２０、ｐＨ８．０）でのグラジエントで実施した。溶出されたピークをアニオン
交換によって同じカラムで３回さらに精製した。最後の精製ステップから回収した溶出ピ
ークを回収し、０．２５ｍＬに濃縮し、緩衝液を５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、５００ｍＭ Ｎａ
Ｃｌ、２ｍＭ ＤＴＴ、ｐＨ８．０に交換し、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（商標）１０／３００
ＧＬカラムでのゲルろ過によって精製した。最終タンパク質は、単量体：二量体：三量体
：多量体（ＯＮＴ Ｒｅｆ−ＯＮＬＰ４４５４）の比がおよそ１：１：１：１であった。
図２は、Ｈｅｌ３０８ Ｍｈｕ多量体試料（レーン２）のゲルを示す。

本実施例は、Ｈｅｌ３０８ Ｔｇａ（Ｒ６５７Ａ／Ｎ６７４Ｃ）−２ｋＤａ二量体（こ
こで各単量体単位は変異Ｒ６５７Ａ／Ｎ６７４Ｃを有する配列番号１６を含み、１つの単
量体単位は２ｋＤａ ＰＥＧリンカーを使用して各単量体単位の位置６７４を介して連結
されている）を合成する方法を記載する。この二量体の場合Ｎ６７４Ｃは、二量体タンパ
ク質（Ｔｇａ Ｎ６７４Ｃ−２ｋＤａ ＰＥＧリンカー−Ｎ６７４Ｃ Ｔｇａ）において
リンカーへの接続として役立つ追加変異である。

ＤＴＴをＨｅｌ３０８ Ｔｇａ（Ｒ６５７Ａ／Ｎ６７４Ｃ）（２ｍｇ／ｍＬ）（ここで
各単量体単位は変異Ｒ６５７Ａ／Ｎ６７４Ｃを有する配列番号１６を含み、１つの単量体
単位は２ｋＤａ ＰＥＧリンカーを使用して各単量体単位の位置６７４を介して他に連結
されている）に１０ｍＭで添加し、３０分間ローテータに置いた。還元したタンパク質を
１００ｍＭリン酸カリウム、５００ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％ｔｗｅ
ｅｎ２０、ｐＨ７．２に緩衝液交換した。３０塩基長ｓｓＤＮＡ（配列番号６８）をヘリ
カーゼに添加し、タンパク質が安定のままである可能性を増大させる。タンパク質／ＤＮ
Ａ溶液を緩衝液で１．６ｍｇ／ｍＬに希釈し、窒素雰囲気下に置き、室温、３０分間イン
キュベートした。０．０３８ｍＭビスマレイミド−ＰＥＧ（２ｋＤａ）を添加し、反応を
２３℃、窒素雰囲気下で２．５時間進行させた。１０ｍＭ ＤＴＴを反応をクエンチする
ために添加し、いかなるジスルフィド架橋分子種も壊した。Ｈｅｌ３０８ Ｔｇａ（Ｒ６
５７Ａ／Ｎ６７４Ｃ）変異体二量体をＤＮＡおよび試薬を除去するために初回Ｓｔｒｅｐ
−ｔａｃｔｉｎステップ、続いて溶液中に存在する全ての他の分子種から二量体を分離す
るためにアニオン交換クロマトグラフィーステップを使用して直ちに精製した。

ＡＫＴＡ精製装置を精製のために使用した。ストレップ精製を５ｍＬ ＳｔｒｅｐＴａ
ｃｔｉｎ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅカラムで実施した。
タンパク質溶液をカラムに添加する前に結合緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、２００ｍＭ
ＮａＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、２ｍＭ ＤＴＴ、０．０５％ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ８．
０）に緩衝液交換した。全ての未結合材料を除去するための初回洗浄ステップ後、緩衝液
中の１０ｍＭデスチオビオチンで溶出する前にタンパク質からＤＮＡを解離するためにタ
ンパク質を４ｍＭ ＡＴＰを含有する同じ緩衝液で洗浄した。溶出されたタンパク質を０
．２５ｍｌに濃縮し、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、２５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＤＴＴ、１
ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．０５％ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ８．０に緩衝液交換し、Ｓｕｐｅｒ
ｄｅｘ（商標）１０／３００ ＧＬカラムでのゲルろ過により精製した。図３は、Ｈｅｌ
３０８Ｔｇａ（Ｒ６５７Ａ／Ｎ６７４Ｃ）−２ｋＤａ二量体および単量体の形成および精
製の際の種々の段階でのゲルを示す（レーン１＝タンパク質ラダー、レーン２＝Ｈｅｌ３
０８Ｔｇａ（Ｒ６５７Ａ／Ｎ６７４Ｃ）−２ｋＤａ二量体加熱処置後、レーン３＝Ｈｅｌ
３０８Ｔｇａ（Ｒ６５７Ａ／Ｎ６７４Ｃ）−２ｋＤａ二量体（ここで各単量体単位は変異
Ｒ６５７Ａ／Ｎ６７４Ｃを有する配列番号１６を含み、１つの単量体単位は２ｋＤａ Ｐ
ＥＧリンカーを使用して各単量体単位の位置６７４を介して他に連結されている）、レー
ン４＝ｓｔｒｅｐ溶出、レーン５＝初期反応混合物およびレーン６＝Ｈｅｌ３０８Ｔｇａ
（Ｒ６５７Ａ／Ｎ６７４Ｃ）単量体（変異Ｒ６５７Ａ／Ｎ６７４Ｃを有する配列番号１６
））。

本実施例は、蛍光に基づくアッセイを使用して種々のＨｅｌ３０８Ｍｂｕヘリカーゼ構
築物のＤＮＡ結合能力をＨｅｌ３０８Ｍｂｕ単量体（配列番号１０）のものと比較する。

通例の蛍光基質を１本鎖ＤＮＡに結合する種々のヘリカーゼの能力をアッセイするため
に使用した。８８ｎｔ１本鎖ＤＮＡ基質（最終１ｎＭ、配列番号６９）は、その５’末端
にカルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）塩基を有する。ヘリカーゼが緩衝溶液（４００ｍ
Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ８．０、１ｍＭ ＭｇＣｌ_２）中のオリゴヌ
クレオチドに結合することから、蛍光偏光（溶液中のオリゴヌクレオチドの自由回転の速
度に関連する特性）は増大する。偏光を増大させるために必要なヘリカーゼの量が少ない
ほど、ＤＮＡとヘリカーゼとの間の結合親和性は強い（図４）。図５〜８は、種々のＨｅ
ｌ３０８（Ｍｂｕ）構築物の量を増加させてＤＮＡオリゴヌクレオチド（配列番号６９、
その５’末端にカルボキシフルオレセイン塩基を有する）の偏光における変化を示す。検
査した全ての構築物は、単量体よりも低い濃度で偏光における増大を示す。検査した構築
物は：
１．Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ Ａ７００Ｃ ２ｋＤａ二量体（各単量体単位は変異Ａ７００Ｃ
を有する配列番号１０を含み、１つの単量体単位は２ｋＤａ ＰＥＧリンカーを使用して
各単量体単位の位置７００を介して他に連結されているヘリカーゼ二量体）、
２．Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ−ＧＴＧＳＧＡ−（ＨｈＨ）２（ここでヘリカーゼ単量体単位（
配列番号１０）はリンカー配列ＧＴＧＳＧＡによってヘリックス−ヘアピン−ヘリックス
（ＨｈＨ２）ドメイン（配列番号７５）に付着されている）、
３．Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ−ＧＴＧＳＧＡ−（ＨｈＨ）２−（ＨｈＨ）２（ここでヘリカー
ゼ単量体単位（配列番号１０）はリンカー配列ＧＴＧＳＧＡによって（ＨｈＨ）２−（Ｈ
ｈＨ）２ドメイン（配列番号７６）に付着されており、ＨｈＨはヘリックス−ヘアピン−
ヘリックスドメインである）、
４．Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ−ＧＴＧＳＧＡ−ＵＬ４２ＨＶ１−Ｉ３２０Ｄｅｌ（ここでヘリ
カーゼ単量体単位（配列番号１０）はリンカー配列ＧＴＧＳＧＡによって前進性因子ＵＬ
４２ＨＶ１−Ｉ３２０Ｄｅｌ（配列番号６３）に付着されている）、
５．Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ−ＧＴＧＳＧＡ−ｇｐ３２ＲＢ６９ＣＤ（ここでヘリカーゼ単量
体単位（配列番号１０）はリンカー配列ＧＴＧＳＧＡによってＳＳＢ ｇｐ３２ＲＢ６９
ＣＤ（配列番号６４）に付着されている）、
６．Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ−ＧＴＧＳＧＡ−ｇｐ２．５Ｔ７−Ｒ２１１Ｄｅｌ（ここでヘリ
カーゼ単量体単位（配列番号１０）はリンカー配列ＧＴＧＳＧＡによってＳＳＢ ｇｐ２
．５Ｔ７−Ｒ２１１Ｄｅｌ（配列番号６５）に付着されている）および
７．（ｇｐ３２ＲＢ６９ＣＤ）−Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ）（ここでＳＳＢ ｇｐ３２ＲＢ６
９ＣＤ（配列番号６４）はリンカー配列ＧＴＧＳＧＴによってヘリカーゼ単量体単位（配
列番号１０）に付着されている）。
である。

図９は、Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して図５〜８に示すデータ
を二相解離結合曲線にフィットすることを通じて得られた種々のＨｅｌ３０８（Ｍｂｕ）
構築物についての相対平衡解離定数（Ｋ_ｄ）（Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ単量体（配列番号１０
）に対して）を示す。付着した追加的結合ドメインを有するヘリカーゼ構築物の全ては、
Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ単量体（配列番号１０）単独よりも低い平衡解離定数を示す。したが
って追加的結合構築物を有するＨｅｌ３０８Ｍｂｕヘリカーゼは、全てＨｅｌ３０８Ｍｂ
ｕ単量体よりもＤＮＡにより強い結合を示す。

本実施例は、ナノポアを通るインタクトなＤＮＡ鎖（４００塩基長）の移動を制御する
Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ単量体（配列番号１０）の能力をＨｅｌ３０８Ｍｂｕ Ａ７００Ｃ
２ｋＤａ二量体（ここで各単量体単位は変異Ａ７００Ｃを有する配列番号１０を含み、１
つの単量体単位は２ｋＤａ ＰＥＧリンカーを使用して各単量体単位の位置７００を介し
て他に連結されている）のものと比較する。単量体による制御されたＤＮＡ移行のための
一般的方法を図１０に、二量体によるものを図１１に示す。

材料および方法
４００塩基長ＤＮＡ配列：
プライマーをＰｈｉＸ１７４の約４００ｂｐ断片を増幅するために設計した。これらの
プライマーの各５’末端は５０ヌクレオチド非相補性領域、同種重合体ストレッチまたは
１０ヌクレオチド同種重合体セクションの反復単位のいずれかを含んだ。これらは、ナノ
ポアを通る鎖の制御された移行についての識別子として役立ち、移行の方向を決定する。
付加的にフォワードプライマーの５’末端は４個の２’−Ｏ−メチル−ウラシル（ｍＵ）
ヌクレオチドを含んで「キャップ」され、リバースプライマーの５’末端は化学的にホス
ホリル化された。次いでこれらのプライマー修飾は、ラムダエキソヌクレアーゼを使用す
るアンチセンス鎖だけの優先的な制御された消化を可能にする。ｍＵキャッピングはセン
ス鎖をヌクレアーゼ消化から保護する一方で、アンチセンス鎖の５’のＰＯ４はそれを促
進する。したがってラムダエキソヌクレアーゼとのインキュベーション後に２本鎖のセン
ス鎖だけが、ここでは１本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）としてインタクトのまま残る。作製し
たｓｓＤＮＡを次いで既に記載のとおりＰＡＧＥ精製した。

本明細書に記載の全ての実験において使用されるＤＮＡ基質設計を図１２に示す。ＤＮ
Ａ基質は、ナノポアによる捕捉を助けるために５０Ｔ ５’−リーダーに付着している４
個の２’−Ｏ−メチルウラシル塩基を配列の５’末端に含むＰｈｉＸ由来ｓｓＤＮＡの４
００塩基セクションからなる（配列番号７０、配列番号７０の５’末端にナノポアによる
捕捉を助けるために５０Ｔリーダー配列に付着している４個の２’−Ｏ−メチルウラシル
塩基がある）。５０Ｔリーダーの直後でこの鎖にアニールするのは、二重層の表面上のＤ
ＮＡを増やし、それにより捕捉効率を改善するための３’コレステロールＴＥＧ（配列番
号７１）を含有するプライマーである。

緩衝溶液：１Ｍ ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ８．０、１ｍＭ ＡＴＰ、１０
ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１ｍＭ ＤＴＴ
ナノポア：大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＭＳ（Ｂ１−Ｌ８８Ｎ）８ＭｓｐＡ（配列番号２、変
異Ｌ８８Ｎを有する）
単量体酵素：Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ（配列番号１０）最終１００ｎＭで添加
二量体酵素：Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ Ａ７００Ｃ ２ｋＤａホモ二量体（ここで各単量体単
位は変異Ａ７００Ｃを有する配列番号１０を含み、１つの単量体単位は２ｋＤａ ＰＥＧ
リンカーを使用して各単量体単位の位置７００を介して他に連結されている）最終１０ｎ
Ｍで添加

１，２−ジフィタノイル−グリセロ−３−ホスホコリン脂質（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａ
ｒ Ｌｉｐｉｄｓ）二重層に挿入された単一のＭｓｐＡナノポアから電気計測値を得た。
二重層は、モンタル−ミューラー技術によって開口部直径約１００ｕｍ、厚さ２０ｕｍの
ＰＴＦＥフィルム（Ｄｅｌｒｉｎ ｃｈａｍｂｅｒｓ注文生産）で形成され、２個の１ｍ
Ｌ緩衝溶液に分けた。全ての実験は、上記の緩衝溶液中で実行した。単一チャネル電流を
１４４０Ａデジタイザーを備えたＡｘｏｐａｔｃｈ ２００Ｂ ａｍｐｌｉｆｉｅｒｓ（
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）で測定した。Ａｇ／ＡｇＣｌ電極を緩衝溶液に繋
ぎ、ｃｉｓコンパートメント（ナノポアおよび酵素／ＤＮＡの両方が添加されている）を
Ａｘｏｐａｔｃｈ ｈｅａｄｓｔａｇｅのアースに繋ぎ、ｔｒａｎｓコンパートメントを
ｈｅａｄｓｔａｇｅの探査電極に繋ぐ。

二重層中に単一ポアを達成後、ＤＴＴ（１ｍＭ）およびＭｇＣｌ２をｃｉｓチャンバー
に添加し、十分に混合した。次いでＤＮＡ構築物およびヘリカーゼを緩衝液１００ｕＬに
添加し、５分間予備インキュベートした（ＤＮＡ＝１．５ｎＭ（配列番号７０および７１
（３’コレステロールＴＥＧを有する））、単量体酵素＝１ｕＭまたは二量体酵素＝０．
１ｕＭ）。この予備インキュベーション混合物をＭｓｐＡナノポア中でのヘリカーゼ−Ｄ
ＮＡ複合体の捕捉を開始するために電気生理化学チャンバーのｃｉｓコンパートメント中
の緩衝液９００ｕＬに添加した（最終濃度、ＤＮＡ＝０．１５ｎＭ、単量体酵素＝０．１
ｕＭまたは二量体酵素＝０．０１ｕＭをもたらす）。ヘリカーゼＡＴＰａｓｅ活性を必要
に応じてｃｉｓコンパートメントへのｄＮＴＰ（最終ＡＴＰ１ｍＭ）の付加によって開始
した。実験は、＋１２０ｍＶの一定電位で実行した。

結果および考察
図１３に示すとおり、ヘリカーゼ−単量体ＤＮＡ基質のＭｓｐＡナノポア（図１０に示
す）への添加は、特徴的電流遮断を生じる。所与の基質について本発明者らは、各ヘリカ
ーゼ制御ＤＮＡ移動に関してＤＮＡ配列を反映する特徴的な電流遷移のパターンを観察し
た。ヘリカーゼが結合していないＤＮＡは、ナノポアと一過的に相互作用し、電流におい
て一時的な遮断をもたらす（＜＜１秒間）。結合し、活性な（すなわちＡＴＰａｓｅ作用
の下でＤＮＡ鎖に沿って移動する）Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ単量体（配列番号１０）を有する
ＤＮＡは、図１３に示すとおり電流における段階的変化を伴う長い特徴的な遮断レベルを
生じる。ナノポア中の異なるＤＮＡモチーフは、特有の電流遮断レベルを生じる。

ＭｓｐＡナノポア（図１１に示す）へのヘリカーゼ二量体−ＤＮＡ基質の添加は、図１
４に示す特徴的な電流遮断を生じる。結合し、活性な（すなわちＡＴＰａｓｅ作用の下で
ＤＮＡ鎖に沿って移動する）Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ Ａ７００Ｃ ２ｋＤａ二量体（ここで
各単量体単位は変異Ａ７００Ｃを有する配列番号１０を含み、１つの単量体単位は２ｋＤ
ａ ＰＥＧリンカーを使用して各単量体単位の位置７００を介して他に連結されている）
を有するＤＮＡは、図１４に示すとおり電流における段階的変化を伴う長い特徴的な遮断
レベルを生じる。二量体の１０分の１濃度を使用することも可能であり、これらの特徴的
な電流遮断をまだ観察できる。

Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ単量体（配列番号１０）がポアを通る４００塩基長ＤＮＡ鎖の移行
を制御する場合に産生される電流遮断は、Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ Ａ７００Ｃ ２ｋＤａ二
量体（ここで各単量体単位は変異Ａ７００Ｃを有する配列番号１０を含み、１つの単量体
単位は２ｋＤａ ＰＥＧリンカーを使用して各単量体単位の位置７００を介して他に連結
されている）によって産生されるものに類似している。しかし、２回の実験（同一条件下
で単量体Ｈｅｌ３０８ＭｂｕまたはＨｅｌ３０８Ｍｂｕ Ａ７００Ｃ ２ｋＤａ二量体の
いずれかで実行する）についてヘリカーゼ制御鎖移動の全長を比較する場合、二量体での
ヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動（図１６）は典型的には単量体（図１５）によって観察される
ものよりも長い。これは、酵素再結合を示し、したがって酵素解離を低減する。付加的に
単量体実行について測定したヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動の３７％がＤＮＡ鎖の末端のポリ
Ｔに達した一方で、二量体実行について測定したヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動の４７％がポ
リＴに達し、二量体の解離の低減および前進性の改善を示している。図８および９は、Ｄ
ＮＡ運動がＨｅｌ３０８Ｍｂｕ単量体（図１７）またはＨｅｌ３０８Ｍｂｕ Ａ７００Ｃ
２ｋＤａ二量体（図１８）のいずれかによって制御されている場合の状態指数（横軸）
の関数としての鎖移動についての状態フィットデータの公知のＤＮＡ配列における位置（
縦軸）の６例をそれぞれ示す。単量体データは、酵素解離およびトレイル酵素に出会うま
で印加された場の下でＤＮＡが逆戻りした結果である配列の先行部分への周期的な後退転
位（破線円で強調）を含む、配列を通じた前進性直線移動を示す。ヘリカーゼ制御ＤＮＡ
移動の多数は、酵素解離のために配列の末端までたどり着けない。一方二量体データにつ
いては、酵素はより長くＤＮＡの移動を制御し続け、解離後に酵素はＤＮＡに再結合する
。

本実施例は、実施例５において考察のＨｅｌ３０８Ｍｂｕ Ａ７００Ｃ ２ｋＤａホモ
二量体と比較して異なるアミノ酸位置を介して繋がれており、異なる長さのリンカー（２
ｋｂおよび３．４ｋｂリンカー）を有する２つの異なるＨｅｌ３０８Ｍｂｕホモ二量体が
、ナノポアを通るインタクトなＤＮＡ鎖（４００塩基長）の移動を制御できたことを示す
。二量体による制御されたＤＮＡ移行のための一般的方法を図１１に示す。

緩衝溶液：４００ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ８．０、１ｍＭ ＡＴＰ
、１ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１ｍＭ ＤＴＴ
ナノポア：大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＭＳ（Ｂ１−Ｌ８８Ｎ）８ＭｓｐＡ（変異Ｌ８８Ｎを
有する配列番号２）
二量体酵素：Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ Ｑ４４２Ｃ ２ｋＤａリンカーホモ二量体（ここで各
単量体単位は変異Ｑ４４２Ｃを有する配列番号１０を含み、１つの単量体単位は２ｋＤａ
ＰＥＧリンカーを使用して各単量体単位の位置４４２を介して他に連結されている）は
およそ最終１ｎＭで添加、Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ Ｑ４４２Ｃ ３．４ｋＤａリンカーホモ
二量体（ここで各単量体単位は変異Ｑ４４２Ｃを有する配列番号１０を含み、１つの単量
体単位は３．４ｋＤａ ＰＥＧリンカーを使用して各単量体単位の位置４４２を介して他
に連結されている）は最終およそ１ｎＭで添加。

電気的実験を脂質二重層中に挿入された単一ポアを達成するために実施例５に記載のと
おり設定した。二重層中に単一ポアを達成した後、ＤＴＴ（１ｍＭ）およびＭｇＣｌ_２（
１ｍＭ）をｃｉｓチャンバーに添加し、十分に混合した。次いでＤＮＡポリヌクレオチド
配列番号７０および７１（３’コレステロールＴＥＧを有する）（ＤＮＡ＝０．１５ｎＭ
）、ＡＴＰ（１ｍＭ）およびＨｅｌ３０８Ｍｂｕ Ｑ４４２Ｃ ２ｋＤａリンカーホモ二
量体またはＨｅｌ３０８Ｍｂｕ Ｑ４４２Ｃ ３．４ｋＤａリンカーホモ二量体のいずれ
かをＭｓｐＡナノポア中でのヘリカーゼ−ＤＮＡ複合体の捕捉を開始するために電気生理
化学チャンバーのｃｉｓコンパートメントに添加した。実験は、＋１８０ｍＶの一定電位
で実行した。

結果および考察
ＭｓｐＡナノポアを通るＤＮＡ基質移行を制御するためのＨｅｌ３０８Ｍｂｕ Ｑ４４
２Ｃ ２ｋＤａリンカーホモ二量体（ここで各単量体単位は変異Ｑ４４２Ｃを有する配列
番号１０を含み、１つの単量体単位は２ｋＤａ ＰＥＧリンカーを使用して各単量体単位
の位置４４２を介して他に連結されている）ヘリカーゼの使用は、図１９Ａに示す特徴的
な電流遮断を生じる。所与の基質について本発明者らは、各ヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動に
関してＤＮＡ配列を反映する特徴的な電流遷移のパターンを観察する。ヘリカーゼが結合
していないＤＮＡは、ナノポアと一過的に相互作用し、電流において一時的な遮断をもた
らす（＜＜１秒間）。結合し、活性な（すなわちＡＴＰａｓｅ作用の下でＤＮＡ鎖に沿っ
て移動する）ヘリカーゼ二量体を有するＤＮＡは、図１９Ａに示すとおり電流における段
階的変化を伴う長い特徴的な遮断レベルを生じる。ナノポア中の異なるＤＮＡモチーフは
、特有の電流遮断レベルを生じる。ＭｓｐＡナノポアを通るＤＮＡ移動を制御するための
Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ Ｑ４４２Ｃ ３．４ｋＤａリンカーホモ二量体ヘリカーゼ（ここで
各単量体単位は変異Ｑ４４２Ｃを有する配列番号１０を含み、１つの単量体単位は３．４
ｋＤａ ＰＥＧリンカーを使用して各単量体単位の位置４４２を介して他に連結されてい
る）の使用も、図１９Ｂに示す特徴的な電流遮断を生じる。これは、２つのヘリカーゼを
２つの異なるリンカー長を使用して異なる位置で互いに付着させ、酵素活性を保持できる
ことを例示する。

本実施例は、Ｃ末端に融合された追加的結合ドメインを有するヘリカーゼを使用する、
ナノポアを通るヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動を示す。示す２つの例は、Ｃ末端に遺伝子的に
融合されたＨｅｌ３０８ Ｈｌａ（ここでヘリカーゼ単量体単位（配列番号１０）はＨｅ
ｌ３０８ Ｈｌａ（配列番号６６）の第５ドメインに付着されている）またはＨｅｌ３０
８Ｈｖｏ（ここでヘリカーゼ単量体単位（配列番号１０）はＨｅｌ３０８ Ｈｖｏ（配列
番号６７）の第５ドメインに付着されている）由来の追加的第５ドメインを含むＨｅｌ３
０８Ｍｂｕである。

緩衝溶液：４００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ８．０、１ｍＭ ＡＴ
Ｐ、１ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１ｍＭ ＤＴＴ
ナノポア：大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＭＳ（Ｂ１−Ｌ８８Ｎ）８ＭｓｐＡ（変異Ｌ８８Ｎを
有する配列番号２）
二量体酵素：Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ＋Ｈｅｌ３０８ Ｈｌａ第５ドメイン（ここでヘリカー
ゼ単量体単位（配列番号１０）はＨｅｌ３０８ Ｈｌａ（配列番号６６）の第５ドメイン
に付着されている）は最終１００ｎＭで添加され、Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ＋Ｈｅｌ３０８
Ｈｖｏ第５ドメイン（ここでヘリカーゼ単量体単位（配列番号１０）はＨｅｌ３０８ Ｈ
ｖｏ（配列番号６７）の第５ドメインに付着されている）は最終１００ｎＭで添加される
。

電気的実験を脂質二重層中に挿入された単一ポアを達成するために実施例５に記載のと
おり設定した。二重層中に単一ポアを達成した後、ＤＴＴ（１ｍＭ）およびＭｇＣｌ_２（
１ｍＭ）をｃｉｓチャンバーに添加し、十分に混合した。＋１４０ｍＶでの対照記録を５
分間実行した。次いでＤＮＡポリヌクレオチド配列番号７０および７１（３’コレステロ
ールＴＥＧを有する）（ＤＮＡ＝０．６ｎＭ）および、Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ＋Ｈｅｌ３０
８ Ｈｌａ第５ドメイン（１００ｎＭ、ここでヘリカーゼ単量体単位（配列番号１０）は
Ｈｅｌ３０８ Ｈｌａ（配列番号６６）の第５ドメインに付着されている）またはＨｅｌ
３０８Ｍｂｕ＋Ｈｅｌ３０８ Ｈｖｏ第５ドメイン（１００ｎＭ、ここでヘリカーゼ単量
体単位（配列番号１０）はＨｅｌ３０８ Ｈｖｏ（配列番号６７）の第５ドメインに付着
されている）のいずれかをＭｓｐＡナノポア中でのヘリカーゼ−ＤＮＡ複合体の捕捉を開
始するために電気生理化学チャンバーのｃｉｓコンパートメントに添加した。＋１４０ｍ
Ｖでの第２の対照記録を１０分間実行した。最終的にヘリカーゼＡＴＰａｓｅ活性を必要
に応じてｃｉｓコンパートメントへのＡＴＰ（１ｍＭ）の添加によって開始した。実験は
、＋１４０ｍＶの一定電位で実行した。

結果および考察
ＭｓｐＡナノポアを通るＤＮＡ基質移行を制御するためのＨｅｌ３０８Ｍｂｕ＋Ｈｅｌ
３０８ Ｈｌａヘリカーゼ第５ドメイン（ここでヘリカーゼ単量体単位（配列番号１０）
はＨｅｌ３０８ Ｈｌａ（配列番号６６）の第５ドメインに付着されている）の使用は、
図２０Ａに示す特徴的な電流遮断を生じる。所与の基質について本発明者らは、各ヘリカ
ーゼ制御ＤＮＡ移動に関してＤＮＡ配列を反映する特徴的な電流遷移のパターンを観察し
た。ヘリカーゼが結合していないＤＮＡは、ナノポアと一過的に相互作用し、電流におい
て一時的な遮断をもたらす（＜＜１秒間）。結合し、活性な（すなわちＡＴＰａｓｅ作用
の下でＤＮＡ鎖に沿って移動する）Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ＋Ｈｅｌ３０８Ｈｌａヘリカーゼ
第５ドメインを有するＤＮＡは、図２０Ａに示すとおり電流における段階的変化を伴う長
い特徴的な遮断レベルを生じる。ナノポア中の異なるＤＮＡモチーフは、特有の電流遮断
レベルを生じる。ＭｓｐＡナノポアを通るＤＮＡ移動を制御するためのＨｅｌ３０８Ｍｂ
ｕ＋Ｈｅｌ３０８ Ｈｖｏヘリカーゼ（ここでヘリカーゼ単量体単位（配列番号１０）第
５ドメインはＨｅｌ３０８ Ｈｖｏ（配列番号６７）の第５ドメインに付着されている）
の使用も、図２０Ｂに示す特徴的な電流遮断を生じる。これは、ヘリカーゼの追加的結合
ドメインを別のヘリカーゼに付着させ、酵素活性を保持できることを例示する。

本実施例は、付着した追加的ヘリックス−ヘアピン−ヘリックス（ＨｈＨ）ドメインを
有するヘリカーゼを使用して、ナノポアを通るヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動を示す。示され
る２例は２個または４個いずれかのヘリックス−ヘアピン−ヘリックスドメインがＣ末端
に付着しているＨｅｌ３０８Ｍｂｕである。

材料および方法
５０−ポリＴ５’リーダーをＰｈｉＸ ｄｓＤＮＡの約９００塩基断片にライゲーショ
ンすることによって、ＤＮＡを形成した。リーダーは、ＤＮＡが二重層に挿入されるよう
にするために配列番号７４（配列の３’末端に２個のチミン残基に付着している６個のｉ
Ｓｐ１８スペーサーおよび３’コレステロールＴＥＧを有する）がハイブリダイズされた
相補性セクションも含有する。最終的にＡＣＧＴの４ｎｔ ３’−オーバーハングを得る
ためにＰｈｉＸ ｄｓＤＮＡの３’末端をＡａｔＩＩ消化酵素で消化した（ＤＮＡ基質設
計の図に関して図２１を参照されたい）。

緩衝溶液：４００ｍＭ ＮａＣｌ、１００ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ８．０、１０ｍＭフ
ェロシアン化カリウム、１０ｍＭフェリシアン化カリウム、１ｍＭ ＡＴＰ、１ｍＭ Ｍ
ｇＣｌ_２、
ナノポア：大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＭＳ（Ｂ１−Ｇ７５Ｓ−Ｇ７７Ｓ−Ｌ８８Ｎ−Ｑ１２
６Ｒ）８ＭｓｐＡ（変異Ｇ７５Ｓ／Ｇ７７Ｓ／Ｌ８８Ｎ／Ｑ１２６Ｒを有する配列番号２
）
二量体酵素：Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ−ＧＴＧＳＧＡ−（ＨｈＨ）２（ここでヘリカーゼ単量
体単位（配列番号１０）はリンカー配列ＧＴＧＳＧＡによってＨｈＨ２ドメイン（配列番
号７５）に付着されている）最終１００ｎＭで添加、およびＨｅｌ３０８Ｍｂｕ−ＧＴＧ
ＳＧＡ−（ＨｈＨ）２−（ＨｈＨ）２（ここでヘリカーゼ単量体単位（配列番号１０）は
リンカー配列ＧＴＧＳＧＡによって（ＨｈＨ）２−（ＨｈＨ）２ドメイン（配列番号７６
）に付着されている）最終１００ｎＭで添加。

電気的実験を脂質二重層中に挿入された単一ポアを達成するために実施例５に記載のと
おりだが、白金電極をＡｇ／ＡｇＣｌ電極の代わりに使用して設定した。二重層中に単一
ポアを達成した後、ＭｇＣｌ_２（１ｍＭ）およびＡＴＰ（１ｍＭ）をチャンバーに添加し
た。＋１４０ｍＶでの対照記録を５分間実行した。次いでＤＮＡポリヌクレオチド配列番
号７２、７３および７４（配列の３’末端に２個のチミン残基に付着している６個のｉＳ
ｐ１８スペーサーおよび３’コレステロールＴＥＧを有する）（ＤＮＡ＝０．１ｎＭ）を
電気生理化学チャンバーのｃｉｓコンパートメントに添加し、ＤＮＡ移行事象を観察した
。最後にＨｅｌ３０８Ｍｂｕ−ＧＴＧＳＧＡ−（ＨｈＨ）２（１００ｎＭ、ここでヘリカ
ーゼ単量体単位（配列番号１０）はリンカー配列ＧＴＧＳＧＡによってＨｈＨ２ドメイン
（配列番号７５）に付着されている）またはＨｅｌ３０８Ｍｂｕ−ＧＴＧＳＧＡ−（Ｈｈ
Ｈ）２−（ＨｈＨ）２（１００ｎＭ、ここでヘリカーゼ単量体単位（配列番号１０）はリ
ンカー配列ＧＴＧＳＧＡによって（ＨｈＨ）２−（ＨｈＨ）２ドメイン（配列番号７６）
に付着されている）のいずれかをＭｓｐＡナノポア中でのヘリカーゼ−ＤＮＡ複合体の捕
捉を開始するために電気生理化学チャンバーのｃｉｓコンパートメントに添加した。実験
は、＋１４０ｍＶの一定電位で実行した。

結果および考察
ＭｓｐＡナノポアを通るＤＮＡ基質移行を制御するためのＨｅｌ３０８Ｍｂｕ−ＧＴＧ
ＳＧＡ−（ＨｈＨ）２（ここでヘリカーゼ単量体単位（配列番号１０）はリンカー配列Ｇ
ＴＧＳＧＡによってＨｈＨ２ドメイン（配列番号７５）に付着されている）の使用は、図
２２Ａに示す特徴的な電流遮断を生じる。所与の基質について本発明者らは、各ヘリカー
ゼ制御ＤＮＡ移動に関してＤＮＡ配列を反映する特徴的な電流遷移のパターンを観察した
。ヘリカーゼが結合していないＤＮＡは、ナノポアと一過的に相互作用し、電流において
一時的な遮断をもたらす（＜＜１秒間）。結合し、活性な（すなわちＡＴＰａｓｅ作用の
下でＤＮＡ鎖に沿って移動する）Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ−ＧＴＧＳＧＡ−（ＨｈＨ）２を有
するＤＮＡは、図２２Ａに示すとおり電流における段階的変化を伴う長い特徴的な遮断レ
ベルを生じる。ナノポア中の異なるＤＮＡモチーフは、特有の電流遮断レベルを生じる。
ＭｓｐＡナノポアを通るＤＮＡ移動を制御するためのＨｅｌ３０８Ｍｂｕ−ＧＴＧＳＧＡ
−（ＨｈＨ）２−（ＨｈＨ）２（ここでヘリカーゼ単量体単位（配列番号１０）はリンカ
ー配列ＧＴＧＳＧＡによって（ＨｈＨ）２−（ＨｈＨ）２ドメイン（配列番号７６）に付
着されている）の使用も、図２２Ｂに示す特徴的な電流遮断を生じる。これは、ヘリカー
ゼに追加的ヘリックス−ヘアピン−ヘリックスドメインを付着させ、酵素活性を保持でき
ることを例示する。

本実施例は、ナノポアを通るインタクトなＤＮＡ鎖（配列番号８８の５’末端に付着し
ているのは２８個のｉＳｐＣ３スペーサー単位であり、その最後はスペーサー基の５’末
端に付着している２つの追加的Ｔ’を有する、配列番号８８の３’末端に付着しているは
配列番号１０４の５’末端に付着されているさらに４個のｉＳｐＣ３スペーサーである）
の移動を制御するＴｒｗＣ Ｃｂａ単量体（配列番号８７）の能力を、ＴｒｗＣ Ｃｂａ
Ｑ２７６Ｃ−３．４ｋＤａ二量体（ここで各単量体単位は変異Ｑ２７６Ｃを有する配列
番号８７を含み、１つの単量体単位は３．４ｋＤａ ＰＥＧリンカーを使用して各単量体
単位の位置２７６を介して他に連結されている）のものと比較する。二量体は、単量体よ
りも高い百分率のヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動の長い滞留（移動の長い滞留は、ヘリカーゼ
制御ＤＮＡ移動の主な集団での平均から３標準偏差を超えて離れているヘリカーゼ制御Ｄ
ＮＡ移動である）を生じる。

材料および方法
実験を設定する前に、ＤＮＡ（１ｎＭ、配列番号８８の５’末端に付着しているのは２
８個のｉＳｐＣ３スペーサー単位であり、その最後はスペーサー基の５’末端に付着して
いる２つの追加的Ｔ’を有する、配列番号８８の３’末端に付着しているは配列番号１０
４の５’末端に付着されているさらに４個のｉＳｐＣ３スペーサーである）および酵素（
ＴｒｗＣ Ｃｂａ単量体（１ｎＭ、配列番号８７）またはＴｒｗＣ Ｃｂａ Ｑ２７６Ｃ
−３．４ｋＤａ二量体（０．３ｎＭ、ここで各単量体単位は変異Ｑ２７６Ｃを有する配列
番号８７を含み、１つの単量体単位は３．４ｋＤａ ＰＥＧリンカーを使用して各単量体
単位の位置２７６を介して他に連結されている）のいずれか）を合わせて＞１６時間予備
インキュベートした。

緩衝液（６２５ｍＭ ＫＣｌ、１００ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、７５ｍＭフェロシアン化カリ
ウム（ＩＩ）、２５ｍＭフェリシアン化カリウム（ＩＩＩ）、ｐＨ８）中のブロック共重
合体に挿入された単一ＭｓｐＡナノポアＭＳ（Ｇ７５Ｓ／Ｇ７７Ｓ／Ｌ８８Ｎ／Ｄ９０Ｎ
／Ｄ９１Ｎ／Ｄ９３Ｎ／Ｄ１１８Ｒ／Ｑ１２６Ｒ／Ｄ１３４Ｒ／Ｅ１３９Ｋ）８ＭｓｐＡ
（変異Ｇ７５Ｓ／Ｇ７７Ｓ／Ｌ８８Ｎ／Ｄ９０Ｎ／Ｄ９１Ｎ／Ｄ９３Ｎ／Ｄ１１８Ｒ／Ｑ
１２６Ｒ／Ｄ１３４Ｒ／Ｅ１３９Ｋを有する配列番号２）から電気測定値を得た。ＭｇＣ
ｌ_２（１０ｍＭ）およびｄＴＴＰ（５ｍＭ）を緩衝液（６２５ｍＭ ＫＣｌ、１００ｍＭ
Ｈｅｐｅｓ、７５ｍＭフェロシアン化カリウム（ＩＩ）、２５ｍＭフェリシアン化カリ
ウム（ＩＩＩ）、ｐＨ８）と一緒に混合し、次いでＤＮＡ（配列番号８８の５’末端に付
着しているのは２８個のｉＳｐＣ３スペーサー単位であり、その最後はスペーサー基の５
’末端に付着している２つの追加的Ｔ’を有する、配列番号８８の３’末端に付着してい
るのは配列番号１０４の５’末端に付着されているさらに４個のｉＳｐＣ３スペーサーで
ある）、酵素予備混合物（ＴｒｗＣ Ｃｂａ単量体（１ｎＭ、配列番号８７）またはＴｒ
ｗＣ Ｃｂａ Ｑ２７６Ｃ−３．４ｋＤａ二量体（１ｎＭ、ここで各単量体単位は変異Ｑ
２７６Ｃを有する配列番号８７を含み、１つの単量体単位は３．４ｋＤａ ＰＥＧリンカ
ーを使用して各単量体単位の位置２７６を介して他に連結されている）と合わせて混合し
た。二重層中に単一ポアを達成した後、予備混合物を単一ナノポア実験系に添加した。実
験は、＋１２０ｍＶの一定電位で実行し、ヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動をモニターした。

結果および考察
ヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動をヘリカーゼＴｒｗＣ Ｃｂａ単量体（配列番号８７）およ
びＴｒｗＣ Ｃｂａ Ｑ２７６Ｃ−３．４ｋＤａ二量体（ここで各単量体単位は変異Ｑ２
７６Ｃを有する配列番号８７を含み、１つの単量体単位は３．４ｋＤａ ＰＥＧリンカー
を使用して各単量体単位の位置２７６を介して他に連結されている）について観察した。
観察したヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動について検出された移動のおよそ９５％を占める主要
な集団がある、しかし、滞留時間が顕著に長い（ヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動の主な集団で
の平均から３標準偏差を超えて離れている）移動のわずかな百分率がある。これらの長い
移動は、データ分析の改善を可能にする。ＴｒｗＣ Ｃｂａ Ｑ２７６Ｃ−３．４ｋＤａ
二量体（１ｎＭ、ここで各単量体単位は変異Ｑ２７６Ｃを有する配列番号８７を含み、１
つの単量体単位は３．４ｋＤａ ＰＥＧリンカーを使用して各単量体単位の位置２７６を
介して他に連結されている）をＤＮＡ移動を制御するために使用した場合、これらのより
長い滞留時間移動（ヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動の主な集団での平均から３標準偏差を超え
て離れている）のより高い百分率（ＴｒｗＣ Ｃｂａ Ｑ２７６Ｃ−３．４ｋＤａ二量体
と比較して２０％、およびＴｒｗＣ Ｃｂａ 単量体に対して５％）が観察された。二量
体ヘリカーゼの使用は、ナノポア配列決定系におけるデータ分析の改善を可能にすること
から単量体を超える有利点を提供する。

本実施例は、酵素活性を検査するための蛍光アッセイを使用してＴｒｗＣ Ｃｂａ−Ｔ
ｏｐｏＶ Ｍｋａ（ここでＴｒｗＣ ＣｂａはリンカーＡＹＤＶＧＡによって配列番号９
０に示すトポイソメラーゼＶ Ｍｋａ全長配列のドメインＨ−Ｌに付着されている）の耐
塩性を例示する。

材料および方法
通例の蛍光基質をＴｒｗＣ Ｃｂａ−Ｔｏｐｏ Ｖ Ｍｋａ（ここでＴｒｗＣ Ｃｂａ
はリンカーＡＹＤＶＧＡによって配列番号９０に示すトポイソメラーゼＶ Ｍｋａ全長配
列のドメインＨ−Ｌに付着されている）のハイブリダイズされたｄｓＤＮＡを置換する能
力をアッセイするために使用した。図２３の１）に示すとおり、蛍光基質鎖（最終５０ｎ
Ｍ）は３’および５’ｓｓＤＮＡオーバーハングの両方、ならびにハイブリダイズされた
ｄｓＤＮＡの４４塩基セクションを有する。３’ｓｓＤＮＡオーバーハングを含有する上
部鎖は、５’末端にカルボキシフルオレセイン塩基（配列番号９１において５と標識）を
有し、ハイブリダイズした相補体は３’末端にブラックホールクエンチャー（ＢＨＱ−１
）塩基（配列番号９２において６と標識）を有する。ハイブリダイズされると、フルオレ
セインからの蛍光は局在ＢＨＱ−１によってクエンチされ、基質は実質的に非蛍光性であ
る。蛍光基質の下の鎖に部分的に相補的である捕捉鎖（配列番号９３）１μＭはアッセイ
に含まれる。２）に示すとおりＡＴＰ（１ｍＭ）およびＭｇＣｌ_２（１ｍＭ）の存在下で
、基質に添加されたヘリカーゼ（１００ｎＭ）は、蛍光基質の３’尾部に結合し、上部鎖
に沿って移動し、相補鎖を置換する。３）に示すとおりＢＨＱ−１を有する相補鎖が完全
に置換されると主要な鎖の上のフルオレセインは蛍光を発する。４）に示すとおり置換さ
れた鎖は過剰量の捕捉鎖に優先的にアニールし、初期基質の再アニールおよび蛍光の消失
を防ぐ。

結果および考察
図２４のグラフは、ＴｒｗＣ Ｃｂａ単量体（図２４においてＡと標識；配列番号８７
）およびＴｒｗＣ Ｃｂａ−Ｔｏｐｏ Ｖ Ｍｋａ（図２４においてＢと標識；ここでＴ
ｒｗＣ ＣｂａはリンカーＡＹＤＶＧＡによって配列番号９０に示すトポイソメラーゼＶ
Ｍｋａ全長配列のドメインＨ−Ｌに付着されている）についての緩衝液溶液（１０ｍＭ
Ｈｅｐｅｓ ｐＨ８．０、１ｍＭ ＡＴＰ、１ｍＭ ＭｇＣｌ_２、５０ｎＭ蛍光基質Ｄ
ＮＡ（配列番号９１および９２）、１μＭ捕捉ＤＮＡ（配列番号９３））中の４００ｍＭ
のＮａＣｌでの活性の初期速度を示す。調査した塩濃度では、ＴｒｗＣ Ｃｂａ−Ｔｏｐ
ｏ Ｖ Ｍｋａ（ここでＴｒｗＣ ＣｂａはリンカーＡＹＤＶＧＡによって配列番号９０
に示すトポイソメラーゼＶ Ｍｋａ全長配列のドメインＨ−Ｌに付着されている）はＴｒ
ｗＣ Ｃｂａ単量体（配列番号８７）よりも高いｄｓＤＮＡ代謝回転の速度を示した（図
２４を参照されたい）。

本実施例は、ＴｒｗＣ Ｃｂａ Ｑ２７６Ｃ−３．４ｋＤａ二量体（ここで各単量体単
位は変異Ｑ２７６Ｃを有する配列番号８７を含み、１つの単量体単位は３．４ｋＤａ Ｐ
ＥＧリンカーを使用して各単量体単位の位置２７６を介して他に連結されている）を合成
する方法を記載する。

材料および方法
ＤＴＴをＴｒｗＣ Ｃｂａ Ｑ２７６Ｃ単量体（２ｍｇ／ｍＬ、ここで各単量体単位は
変異Ｑ２７６Ｃを有する配列番号８７を含む）に１０ｍＭで添加し、３０分間ローテータ
に置いた。還元したタンパク質を１００ｍＭリン酸カリウム、５００ｍＭ ＮａＣｌ、５
ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．２に緩衝液交換した。ＴｒｗＣ Ｃ
ｂａ Ｑ２７６Ｃ 単量体（２ｍｇ／ｍＬ）（ここで各単量体単位は変異Ｑ２７６Ｃを有
する配列番号８７を含む）を２ｍｇ／ｍｌで添加した。ビスマレイミド−ＰＥＧ（３．４
ｋＤａ；０．０３８ ｍＭ）を添加し、反応を２３℃、窒素雰囲気下で２．５時間進行さ
せた。ＤＴＴ（１０ｍＭ）を反応をクエンチするために添加し、いかなるジスルフィド架
橋分子種も壊した。ＴｒｗＣ Ｃｂａ Ｑ２７６Ｃ−３．４ｋＤａ二量体（ここで各単量
体単位は変異Ｑ２７６Ｃを有する配列番号８７を含み、１つの単量体単位は３．４ｋＤａ
ＰＥＧリンカーを使用して各単量体単位の位置２７６を介して他に連結されている）を
試薬を除去するために初回Ｓｔｒｅｐ−ｔａｃｔｉｎステップ、続いて溶液中に存在する
全ての他の分子種から二量体を分離するためにＧＦ−クロマトグラフィーステップを使用
して直ちに精製した。

ＡＫＴＡ精製装置を精製のために使用した。ストレップ精製を５ｍＬ ＳｔｒｅｐＴａ
ｃｔｉｎ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅカラムで実施した。
タンパク質溶液をカラムに添加する前に結合緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、２００ｍＭ
ＮａＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、２ｍＭ ＤＴＴ、０．０５％ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ８．
０）に緩衝液交換した。全ての未結合材料を除去するための初回洗浄ステップ後、それを
緩衝液中の１０ｍＭデスチオビオチンで溶出した。溶出されたタンパク質を０．２５ｍｌ
に濃縮し、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、２５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ Ｍｇ
Ｃｌ２、０．０５％ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ８．０に緩衝液交換し、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（商
標）１０／３００ ＧＬカラムでのゲルろ過により精製した。図２５および２６は、形成
および精製の際の種々の段階でのＴｒｗＣ Ｃｂａ Ｑ２７６Ｃ−３．４ｋＤａ二量体（
ここで各単量体単位は変異Ｑ２７６Ｃを有する配列番号８７を含み、１つの単量体単位は
３．４ｋＤａ ＰＥＧリンカーを使用して各単量体単位の位置２７６を介して他に連結さ
れている）およびＴｒｗＣ Ｃｂａ Ｑ２７６Ｃ単量体（ここで各単量体単位は変異Ｑ２
７６Ｃを有する配列番号８７を含む）のゲルを示す（図２５−レーンＭ＝タンパク質ラダ
ー、レーン１＝Ｅ３−Ｑ２７６Ｃ単量体出発材料、レーン２＝反応混合物、レーン３＝反
応混合物。図２６−レーンＭ＝タンパク質ラダー、レーンＸ＝ＴｒｗＣ Ｃｂａ Ｑ２７
６Ｃ−３．４ｋＤａ二量体についての参照レーン、レーン４〜１４はＴｒｗＣ Ｃｂａ
Ｑ２７６Ｃ−３．４ｋＤａ二量体（ここで各単量体単位は変異Ｑ２７６Ｃを有する配列番
号８７を含み、１つの単量体単位は３．４ｋＤａ ＰＥＧリンカーを使用して各単量体単
位の位置２７６を介して他に連結されている））の溶出物からの精製画分を含有する。Ｔ
ｒｗＣ Ｃｂａ Ｑ２７６Ｃ−３．４ｋＤａ二量体（ここで各単量体単位は変異Ｑ２７６
Ｃを有する配列番号８７を含み、１つの単量体単位は３．４ｋＤａ ＰＥＧリンカーを使
用して各単量体単位の位置２７６を介して他に連結されている）に対応するバンドを図２
５および２６の両方において灰色矢印によって示す。

本実施例に記載のものと類似の手順を使用して、次のＴｒｗＣ Ｃｂａ Ｑ２７６Ｃ−
１ｋＤａ二量体（ここで各単量体単位は変異Ｑ２７６Ｃを有する配列番号８７を含み、１
つの単量体単位は１ｋＤａ ＰＥＧリンカーを使用して各単量体単位の位置２７６を介し
て他に連結されている）を作製することができた。

本実施例は、Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ−Ａ５７７Ｆａｚ−ＰＥＧ４リンカー−ＴｒｗＣ Ｃ
ｂａ Ｑ２７６Ｃ二量体（ここでＨｅｌ３０８Ｍｂｕ単量体単位は、位置５７７のアミノ
酸が４−アジド−Ｌ−フェニルアラニン（Ｆａｚ）に変異されている配列番号１０を含み
、ＰＥＧ４リンカーによってＴｒｗＣ Ｃｂａ単量体単位、変異Ｑ２７６Ｃを有する配列
番号８７に付着されており、リンカーはＨｅｌ３０８Ｍｂｕ単量体上の位置５７７および
ＴｒｗＣ Ｃｂａ上の位置２７６で各単量体に付着されている）を合成する方法を記載す
る。２つの単量体単位に付着する方法の模式図を図２７に示す。

材料および方法
ＤＴＴ（１０ｍＭ）をＴｒｗＣ Ｃｂａ Ｑ２７６Ｃ単量体（０．９ｍｇ／ｍＬ、１ｍ
Ｌ、ここで各単量体単位は変異Ｑ２７６Ｃを有する配列番号８７を含む）に添加し、試料
を室温に１時間置いた。ＴｒｗＣ Ｃｂａ Ｑ２７６Ｃ単量体（０．９ｍｇ／ｍＬ、ここ
で各単量体単位は変異Ｑ２７６Ｃを有する配列番号８７を含む）試料の緩衝液交換を１０
０ｍＭ Ｔｒｉｓ ４００ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ ７．５中の４０Ｋ Ｚｅｂａカラムを
使用して二回実施した。Ｍａｌ−ＰＥＧ４−ＤＢＣＯ（５００μＭ）を緩衝液交換された
ＴｒｗＣ Ｃｂａ Ｑ２７６Ｃ単量体（０．９ｍｇ／ｍＬ、ここで各単量体単位は変異Ｑ
２７６Ｃを有する配列番号８７を含む）に添加し、試料を室温に３時間置いた。ＴｒｗＣ
Ｃｂａ Ｑ２７６Ｃ単量体（０．９ｍｇ／ｍＬ、ここで各単量体単位は変異Ｑ２７６Ｃ
を有する配列番号８７を含む）Ｍａｌ−ＰＥＧ４−ＤＢＣＯを次いで４０Ｋ Ｚｅｂａカ
ラムを使用して１００ｍＭ Ｔｒｉｓ ４００ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．５に２回緩衝液
交換した。Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ−Ａ５７７Ｆａｚ（１．１ｍｇ／ｍＬ、１ｍＬ、ここで各
単量体単位は変異Ａ５７７Ｆａｚを有する配列番号１０を含む）を４０Ｋ Ｚｅｂａカラ
ムを使用して１００ｍＭ Ｔｒｉｓ ４００ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．５に緩衝液交換し
た。２つの緩衝液交換タンパク質を合わせて混合し、室温に３時間置いた。最終的に次の
試料を４〜１２％ゲル（図２８に示す）で実行した、レーンａ）ＴｒｗＣ Ｃｂａ−Ｑ２
７６Ｃ単量体（変異Ｑ２７６Ｃを有する配列番号８７）、レーンｂ）Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ
−Ａ５７７Ｆａｚ（ここで各単量体単位は変異Ａ５７７Ｆａｚを有する配列番号１０を含
む）、レーンｃ）ＴｒｗＣ Ｃｂａ−Ｑ２７６Ｃ単量体（変異Ｑ２７６Ｃを有する配列番
号８７）＋Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ−Ａ５７７Ｆａｚ（ここで各単量体単位は変異Ａ５７７Ｆ
ａｚを有する配列番号１０を含む）、レーンｄ）ＴｒｗＣ Ｃｂａ−Ｑ２７６Ｃ単量体（
変異Ｑ２７６Ｃを有する配列番号８７）＋５ｋＤａ ＰＥＧ、レーンｅ）ＴｒｗＣ Ｃｂ
ａ−Ｑ２７６Ｃ単量体（変異Ｑ２７６Ｃを有する配列番号８７）＋アジドが付着している
５ｋＤａ ＰＥＧ、レーンｆ）ＴｒｗＣ Ｃｂａ−Ｑ２７６Ｃ単量体（変異Ｑ２７６Ｃを
有する配列番号８７）＋Ａｚｉｄｅ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５５５（Ｌｉ
ｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、フルオロフォアとＴｒｗＣ Ｃｂａ−Ｑ２７６Ｃ単量
体との非特異的相互作用を確認するために使用）、レーンｇ）ＴｒｗＣ Ｃｂａ−Ｑ２７
６Ｃ単量体（変異Ｑ２７６Ｃを有する配列番号８７）＋Ｍａｌ−ＰＥＧ４−ＤＢＣＯ、レ
ーンｈ）ＴｒｗＣ Ｃｂａ−Ｑ２７６Ｃ−ＰＥＧ４−ＤＢＣＯ（ＰＥＧ４−ＤＢＣＯリン
カーに付着されている変異Ｑ２７６Ｃを有する配列番号８７）＋Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ（配
列番号１０）、レーンｉ）Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ−Ａ５７７Ｆａｚ−ＰＥＧ４リンカー−Ｔ
ｒｗＣ Ｃｂａ Ｑ２７６Ｃ二量体（Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ単量体単位は、位置５７７のア
ミノ酸が４−アジド−Ｌ−フェニルアラニン（Ｆａｚ）に変異されている配列番号１０を
含み、ＰＥＧ４リンカーによってＴｒｗＣ Ｃｂａ単量体単位、変異Ｑ２７６Ｃを有する
配列番号８７に付着されており、リンカーはＨｅｌ３０８Ｍｂｕ単量体上の位置５７７お
よびＴｒｗＣ Ｃｂａ上の位置２７６で各単量体に付着されている）に加えて未反応Ｔｒ
ｗＣ Ｃｂａ−Ｑ２７６Ｃ単量体（変異Ｑ２７６Ｃを有する配列番号８７）＋Ｍａｌ−Ｐ
ＥＧ４−ＤＢＣＯ＋Ｈｅｌ３０８Ｍｂｕ−Ａ５７７Ｆａｚ単量体（ここで各単量体単位は
変異Ａ５７７Ｆａｚを有する配列番号１０を含む）、レーンｊ）ＴｒｗＣ Ｃｂａ−Ｑ２
７６Ｃ単量体（変異Ｑ２７６Ｃを有する配列番号８７）＋Ｍａｌ−ＰＥＧ４−ＤＢＣＯ＋
アジドが付着している５ｋＤａ ＰＥＧ、レーンｋ）ＴｒｗＣ Ｃｂａ−Ｑ２７６Ｃ単量
体（変異Ｑ２７６Ｃを有する配列番号８７）＋Ｍａｌ−ＰＥＧ４−ＤＢＣＯ＋Ａｚｉｄｅ
Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５５５（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、
フルオロフォアとＴｒｗＣ Ｃｂａ−Ｑ２７６Ｃ単量体との非特異的相互作用を確認する
ために使用）。

Claims (55)

1. 標的ポリヌクレオチドを特性決定する方法であって、
   （ａ）標的ポリヌクレオチドを膜貫通ポアならびにヘリカーゼおよび追加的ポリヌクレオ
   チド結合成分を含む構築物と、構築物がポアを通る標的ポリヌクレオチドの移動を制御す
   るように接触させるステップであって、ヘリカーゼがポリヌクレオチド結合成分に付着さ
   れており、構築物がポリヌクレオチドの移動を制御する能力を有するステップ；および
   （ｂ）ポリヌクレオチドがポアに関して移動するときに１つまたは複数の測定値を取るス
   テップであって、測定値が標的ポリヌクレオチドの１つまたは複数の特性を示し、それに
   より標的ポリヌクレオチドを特性決定するステップ
   を含む方法。
2. ヘリカーゼとポリヌクレオチド結合成分とが共有結合的に付着されている、請求項１に
   記載の方法。
3. ヘリカーゼとポリヌクレオチド結合成分とが化学的に付着されている、または遺伝子的
   に融合されている、請求項１または２に記載の方法。
4. ヘリカーゼとポリヌクレオチド結合成分とが１つまたは複数のリンカーによって付着さ
   れている、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
5. １つまたは複数のリンカーがアミノ酸配列である、請求項４に記載の構築物。
6. ポリヌクレオチド結合成分が１つまたは複数のヘリカーゼを含む、前記請求項のいずれ
   か一項に記載の方法。
7. 構築物中の２つ以上のヘリカーゼが互いに異なっている、請求項６に記載の方法。
8. ２つ以上のヘリカーゼが同じであるまたは類似している、請求項６に記載の方法。
9. ２つ以上のヘリカーゼが各ヘリカーゼ中の同じアミノ酸残基を使用して付着されている
   、請求項８に記載の方法。
10. ポリヌクレオチド結合成分が、ヘリックス−ヘアピン−ヘリックス（ＨｈＨ）ドメイン
    、真核生物１本鎖結合タンパク質（single-stranded binding protein）（ＳＳＢ）、細
    菌性ＳＳＢ、古細菌ＳＳＢ、ウイルス性ＳＳＢ、２本鎖結合タンパク質、スライディング
    クランプ、前進性因子、ＤＮＡ結合ループ、複製開始タンパク質、テロメア結合タンパク
    質、リプレッサー、亜鉛フィンガーおよび増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）から独立に選択さ
    れる１つまたは複数のドメインを含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
11. ポリヌクレオチド結合成分が表４に示されるものおよびその変種から選択される、請求
    項１０に記載の方法。
12. ポリヌクレオチド結合成分がエキソヌクレアーゼ、ポリメラーゼまたはトポイソメラー
    ゼ由来である、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
13. ポリメラーゼがＰｈｉ２９ポリメラーゼ（配列番号６２）またはその変種である、請求
    項１２に記載の方法。
14. １つまたは複数のヘリカーゼがスーパーファミリー１〜６から独立に選択される、前記
    請求項のいずれか一項に記載の方法。
15. １つまたは複数のヘリカーゼが単量体である、前記請求項のいずれか一項に記載の方法
    。
16. １つまたは複数のヘリカーゼが、Ｈｅｌ３０８ヘリカーゼ、ＲｅｃＤヘリカーゼ、Ｔｒ
    ａｌヘリカーゼ、Ｔｒａｌサブグループヘリカーゼ、ＸＰＤヘリカーゼおよびその変種か
    ら独立に選択される、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
17. （ａ）Ｈｅｌ３０８ヘリカーゼがアミノ酸モチーフＱ−Ｘ１−Ｘ２−Ｇ−Ｒ−Ａ−Ｇ−
    Ｒ（配列番号８）（式中、Ｘ１はＣ、ＭもしくはＬであり、Ｘ２は任意のアミノ酸残基で
    ある）を含み；
    （ｂ）ＲｅｃＤヘリカーゼが、
    − アミノ酸モチーフＸ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｇ−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７（配列番号８）（
    式中、Ｘ１はＧ、ＳもしくはＡであり、Ｘ２は任意のアミノ酸であり、Ｘ３はＰ、Ａ、Ｓ
    もしくはＧであり、Ｘ４はＴ、Ａ、Ｖ、ＳもしくはＣであり、Ｘ５はＧもしくはＡであり
    、Ｘ６はＫもしくはＲであり、Ｘ７はＴもしくはＳである）；および／または
    − アミノ酸モチーフＸ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−（Ｘ６）_３−Ｑ−Ｘ７（配列番号
    １２）（式中、Ｘ１はＹ、ＷもしくはＦであり、Ｘ２はＡ、Ｔ、Ｓ、Ｍ、ＣもしくはＶで
    あり、Ｘ３は任意のアミノ酸であり、Ｘ４はＴもしくはＮであり、Ｘ５はＡ、Ｔ、Ｇ、Ｓ
    、ＶもしくはＩであり、Ｘ６は任意のアミノ酸であり、Ｘ７はＧもしくはＳである）
    を含み；
    （ｃ）ＴｒａＩヘリカーゼまたはＴｒａＩサブグループヘリカーゼが、
    − アミノ酸モチーフＨ−（Ｘ１）_２−Ｘ２−Ｒ−（Ｘ３）_５〜１２−Ｈ−Ｘ４−Ｈ（配
    列番号３１〜３８）（式中、Ｘ１およびＸ２は任意のアミノ酸であり、Ｘ２およびＸ４は
    Ｄ、Ｅ、ＫおよびＲを除く任意のアミノ酸から独立に選択される）；または
    − アミノ酸モチーフＧ−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｈ−（Ｘ８）_{６
    〜１２}−Ｈ−Ｘ９（配列番号３９〜４５）（式中、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７
    およびＸ９はＤ、Ｅ、ＫおよびＲを除く任意のアミノ酸から独立に選択され、Ｘ４はＤま
    たはＥであり、Ｘ８は任意のアミノ酸である）
    を含み；または
    （ｄ）ＸＰＤヘリカーゼが、
    （ａ）アミノ酸モチーフＸ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｇ−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｅ−Ｇ（配列番号８
    ）（式中、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ５およびＸ６はＤ、Ｅ、ＫおよびＲを除く任意のアミノ酸から
    独立に選択され、Ｘ３およびＸ４は任意のアミノ酸残基であってよい）；および／または
    （ｂ）アミノ酸モチーフＱ−Ｘａ−Ｘｂ−Ｇ−Ｒ−Ｘｃ−Ｘｄ−Ｒ−（Ｘｅ）_３−Ｘｆ−
    （Ｘｇ）_７−Ｄ−Ｘｈ−Ｒ（配列番号９）（式中、Ｘａ、ＸｅおよびＸｇは任意のアミノ
    酸残基であってよく、式中、Ｘｂ、ＸｃおよびＸｄはＤ、Ｅ、ＫおよびＲを除く任意のア
    ミノ酸から独立に選択される）
    を含む、請求項１６に記載の方法。
18. Ｈｅｌ３０８ヘリカーゼ中のＸ２がＡ、Ｆ、Ｍ、Ｃ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｓ、ＴまたはＰであ
    る、請求項１７に記載の方法。
19. Ｈｅｌ３０８ヘリカーゼが表１に示すヘリカーゼの１つまたはその変種である、請求項
    １７または１８に記載の方法。
20. Ｈｅｌ３０８ヘリカーゼが、（ａ）配列番号１０、１３、１６もしくは１９のいずれか
    １つに示す配列、または（ｂ）その配列全体にわたってアミノ酸同一性に基づいて関連配
    列に少なくとも４０％相同性を有し、ヘリカーゼ活性を保持しているその変種を含む、請
    求項１９に記載の方法。
21. ＴｒａＩヘリカーゼが、（ａ）配列番号４６、８７、９８もしくは１０２に示す配列、
    または（ｂ）その配列全体にわたってアミノ酸同一性に基づいて関連配列に少なくとも４
    ０％相同性を有し、ヘリカーゼ活性を保持しているその変種を含む、請求項１７に記載の
    方法。
22. ＸＰＤヘリカーゼ中のＸ１、Ｘ２、Ｘ５およびＸ６ならびに／またはＸｂ、Ｘｃおよび
    ＸｄがＧ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｃ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｈ、Ｑ、Ｎ、ＳおよびＴから独立
    に選択される、請求項１７に記載の方法。
23. ＸＰＤヘリカーゼが、（ａ）配列番号５２のいずれか１つに示す配列、または（ｂ）そ
    の配列全体にわたってアミノ酸同一性に基づいて関連配列に少なくとも４０％相同性を有
    し、ヘリカーゼ活性を保持しているその変種を含む、請求項１７または２２に記載の方法
    。
24. １つまたは複数のヘリカーゼが付着を促進するために修飾されている、前記請求項のい
    ずれか一項に記載の方法。
25. １つまたは複数のヘリカーゼが、１つもしくは複数の非天然システイン残基および／ま
    たは１つもしくは複数の４−アジド−Ｌ−フェニルアラニン（Ｆａｚ）残基の導入によっ
    て修飾されている、請求項２４に記載の方法。
26. １つまたは複数の特性が、（ｉ）標的ポリヌクレオチドの長さ、（ｉｉ）標的ポリヌク
    レオチドの同一性、（ｉｉｉ）標的ポリヌクレオチドの配列、（ｉｖ）標的ポリヌクレオ
    チドの二次構造および（ｖ）標的ポリヌクレオチドが修飾されているか否か、から選択さ
    れる、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
27. 標的ポリヌクレオチドがメチル化によって、酸化によって、損傷によって、１つまたは
    複数のタンパク質でまたは１つまたは複数の標識、タグもしくはスペーサーで修飾されて
    いる、請求項２６に記載の方法。
28. 標的ポリヌクレオチドの１つまたは複数の特性が電気的測定および／または光学的測定
    によって測定される、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
29. 電気的測定が電流測定、インピーダンス測定、トンネル測定または電界効果トランジス
    タ（ＦＥＴ）測定である、請求項２８に記載の方法。
30. （ａ）標的ポリヌクレオチドを膜貫通ポアならびにヘリカーゼおよび追加的ポリヌクレ
    オチド結合成分を含む構築物と、構築物がポアを通る標的ポリヌクレオチドの移動を制御
    するように接触させるステップであって、ヘリカーゼがポリヌクレオチド結合成分に付着
    されており、構築物がポリヌクレオチドの移動を制御する能力を有するステップ；および
    （ｂ）ポリヌクレオチドがポアに関して移動するときにポアを通過する電流を測定するス
    テップであって、電流が標的ポリヌクレオチドの１つまたは複数の特性を示し、それによ
    り標的ポリヌクレオチドを特性決定するステップ
    を含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
31. ポアに電圧を印加して、ポアと構築物との複合体を形成するステップをさらに含む、前
    記請求項のいずれか一項に記載の方法。
32. ポリヌクレオチドの少なくとも一部が２本鎖である、前記請求項のいずれか一項に記載
    の方法。
33. ポアが、膜貫通タンパク質ポアまたはソリッドステートポアである、前記請求項のいず
    れか一項に記載の方法。
34. 膜貫通タンパク質ポアが、ヘモリジン（hemolysin）、ロイコシジン（leukocidin）、
    スメグマ菌（Mycobacterium smegmatis）ポリン（porin）Ａ（ＭｓｐＡ）、ＭｓｐＢ、Ｍ
    ｓｐＣ、ＭｓｐＤ、外膜ポリン（porin）Ｆ（ＯｍｐＦ）、外膜ポリン（porin）Ｇ（Ｏｍ
    ｐＧ）、外膜ホスホリパーゼＡ、ナイセリア（Neisseria）オートトランスポーターリポ
    タンパク質（ＮａｌＰ）およびＷＺＡ由来である、請求項３３に記載の方法。
35. ２つ以上のヘリカーゼを含む構築物であって、ヘリカーゼが互いに付着しており、構築
    物がポリヌクレオチドの移動を制御する能力を有する構築物。
36. 構築物が請求項７から９のいずれか一項に定義されており、および／または２つ以上の
    ヘリカーゼが請求項１４から２５のいずれか一項に定義されている、請求項３５に記載の
    構築物。
37. ヘリカーゼと、配列番号９４または配列番号９４の配列全体にわたってアミノ酸同一性
    に基づいて配列番号９４に少なくとも８０％相同性を有するその変種を含むアミノ酸配列
    とを含む構築物であって、ヘリカーゼがアミノ酸配列に付着されており、構築物がポリヌ
    クレオチドの移動を制御する能力を有する構築物。
38. 配列番号９０、または配列番号９０の配列全体にわたってアミノ酸同一性に基づいて配
    列番号９０に少なくとも８０％相同性を有するその変種を含む、請求項３７に記載の構築
    物。
39. 請求項３５から３８のいずれか一項に記載の構築物をコードしているポリヌクレオチド
    配列であって、２つ以上のヘリカーゼが遺伝子的に融合されているポリヌクレオチド配列
    。
40. ポリヌクレオチドの移動を制御する方法であって、ポリヌクレオチドを請求項３５から
    ３８のいずれか一項に記載の構築物に接触させ、それによりポリヌクレオチドの移動を制
    御するステップを含む方法。
41. 標的ポリヌクレオチドを特性決定するためのセンサーを形成する方法であって、ポアと
    、請求項１から２５のいずれか一項に記載の構築物または請求項３５から３８のいずれか
    一項に記載の構築物との複合体を形成し、それにより標的ポリヌクレオチドを特性決定す
    るためのセンサーを形成するステップを含む方法。
42. 複合体が、（ａ）標的ポリヌクレオチドの存在下で構築物とポアとを接触させるステッ
    プおよび（ｂ）ポアに電位を印加するステップによって形成される、請求項４１に記載の
    方法。
43. 電位が、電圧電位または化学電位である、請求項４２に記載の方法。
44. 複合体が、ポアを構築物に共有結合的に付着するステップによって形成される、請求項
    ４２に記載の方法。
45. ポアと、請求項１から２５のいずれか一項に定義されている、構築物または請求項３５
    から３８のいずれか一項に記載の構築物との間の複合体を含む、標的ポリヌクレオチドを
    特性決定するためのセンサー。
46. ポアを通る標的ポリヌクレオチドの移動を制御するための請求項３５から３８のいずれ
    か一項に記載の構築物または請求項１から２５のいずれか一項に定義されている、構築物
    の使用。
47. （ａ）ポアおよび（ｂ）請求項１から２５のいずれか一項に定義されている、構築物ま
    たは請求項３５から３８のいずれか一項に記載の構築物を含む、標的ポリヌクレオチドを
    特性決定するためのキット。
48. 両親媒性膜を含むチップをさらに含む、請求項４７に記載のキット。
49. 複数のポア、および請求項１から２５のいずれか一項に定義されている、複数の構築物
    または請求項３５から３８のいずれか一項に記載の複数の構築物を含む、試料中の標的ポ
    リヌクレオチドを特性決定するための装置。
50. 複数のポアを支持でき、ポアおよび構築物を使用してポリヌクレオチド特性決定を実施
    するために作動可能であるセンサーデバイス；ならびに
    特性決定を実施するための材料を保持するための少なくとも１つのリザーバー
    を含む、請求項４９に記載の装置。
51. 複数のポアを支持でき、前記ポアおよび構築物を用いてポリヌクレオチド特性決定を実
    施するために作動可能であるセンサーデバイス；
    特性決定を実施するための材料を保持するための少なくとも１つのリザーバー；
    前記少なくとも１つのリザーバーから前記センサーデバイスに材料を制御可能に供給する
    ように構成された流体系；および
    各試料を受けるための１つまたは複数の容器
    を含み、前記流体系が前記１つまたは複数の容器から前記センサーデバイスに前記試料を
    選択的に供給するように構成されている、請求項４９または５０に記載の装置。
52. 請求項３５および３６に記載の構築物を産生する方法であって、２つ以上のヘリカーゼ
    を互いに付着させ、それにより構築物を産生するステップを含む方法。
53. 請求項３７または３８に記載の構築物を産生する方法であって、ヘリカーゼを、配列番
    号９４または配列番号９４の配列全体にわたってアミノ酸同一性に基づいて配列番号９４
    に少なくとも８０％相同性を有するその変種を含むアミノ酸配列に付着させ、それにより
    構築物を産生するステップを含む方法。
54. 得られた構築物がポリヌクレオチドの移動を制御できるかどうかを決定するステップを
    さらに含む、請求項５２または５３に記載の方法。
55. （ａ）請求項３９に記載のポリヌクレオチドを提供するステップ；および
    （ｂ）ポリヌクレオチド配列を発現するステップ
    を含む、請求項５２から５４のいずれか一項に記載の方法。

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