JP2018536699A

JP2018536699A - 癌治療への使用のための、アミノチオールエステル化合物、またはその薬学的に許容される塩

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Publication number: JP2018536699A
Application number: JP2018538937A
Authority: JP
Inventors: セイラン、イズマル; カーシュ、ジェリー; ペレズ−アレア、ミレイディズ; マルタン、ギヨーム
Original assignee: アドバンストバイオデザイン
Priority date: 2015-10-15
Filing date: 2016-10-14
Publication date: 2018-12-13
Anticipated expiration: 2036-10-14
Also published as: IL258610B; US20230149378A1; SMT202100271T1; IL258610A; HK1251476A1; ES2867965T3; BR112018007310A2; CY1123950T1; EP3362056A1; HUE053725T2; WO2017064247A1; CN108348485A; CA3001204A1; MX381721B; CA3001204C; DK3362056T3; PL3362056T3; US20180296548A1; HRP20210359T1; JP7062593B2

Abstract

本発明は、対象の癌細胞がＨ２Ｏ２を過剰産生し、２５０００細胞に対して０．５ｎｍｏｌ未満のＧＳＨ濃度を有し、アミノチオールエステル化合物またはその薬学的に許容される塩、特にＳ−メチル４−（ジメチルアミノ）−４−メチルペント−２−インチオエートまたは薬学的に許容されるその塩、より具体的には４−（ジメチルアミノ）−４−メチル−２−ペンタンチオ酸Ｓ−メチルエステルフマレートを用いた対象の癌の治療に関する。本発明はまた、癌を患っており、アミノチオールエステル化合物またはその薬学的に許容される塩、特にＳ−メチル４−（ジメチルアミノ）−４−メチルペント−２−インチオエートまたはその薬学的に許容される塩、より具体的には４−（ジメチルアミノ）−４−メチル−２−ペンタンチオ酸Ｓ−メチルエステルフマレートを含む治療から利益を得られる可能性が最も高い対象を選択する方法に関する。【選択図】なし

Description

本発明は、対象の癌細胞がＨ_２Ｏ_２を過剰産生し、かつ２５０００細胞に対して０.５ｎｍｏｌ未満のＧＳＨ濃度を有している対象の癌の、アミノチオールエステル化合物またはその薬学的に許容される塩、特に、Ｓ−メチル４−（ジメチルアミノ）−４−メチルペント−２−インチオエートもしくはその薬学的に許容される塩、より具体的には、４−（ジメチルアミノ）−４−メチル−２−ペンチンチオ酸Ｓ−メチルエステルフマレートでの治療に関する。それはまた、癌を患っており、アミノチオールエステル化合物またはその薬学的に許容される塩、特に、Ｓ−メチル４−（ジメチルアミノ）−４−メチルペント−２−インチオエートもしくはその薬学的に許容される塩、より具体的には、４−（ジメチルアミノ）−４−メチル−２−ペンチンチオ酸Ｓ−メチルエステルフマレートでの治療から利益を得られる可能性が最も高い対象を選択する方法に関する。

細胞のレドックスバランスは、正常な細胞生理にとって重要である。それは３つの系：ＧＳＨ／ＧＳＳＧ、ＮＡＤＰＨ／ＮＡＤＰ、チオレドキシン（赤色）／チオレドキシン（ｏｘｄ）によって維持される。これらの３つの系のうち、ＧＳＨ／ＧＳＳＧは、病気の状態におけるその含意および合理的な治療アプローチの発展のために最も広く研究されている（非特許文献１）。ＧＳＨ／ＧＳＳＧの不均衡に関連する罹患状態には、癌のような主要な病理が含まれる（非特許文献２および非特許文献３）。それらの共通の病因は、ＲＯＳおよびＲＮＳの直接解毒によるグルタチオン（ＧＳＨ）の減少を最初に引き起こすＲＯＳおよび／または反応性窒素種（ＲＮＳ）によっておおよそもたらされる酸化ストレスである。細胞脂質に対するＲＯＳ攻撃によって産生される４−ヒドロキシノネナール（ＨＮＥ）およびマロンジアルデヒド（ＭＤＡ）のようなＲＯＳ／ＲＮＳおよび新たに形成された求電子性生成物の解毒を継続するために、このＧＳＨの最初減少は、細胞が行うようになるＧＳＨ合成の補償的な増大によって実質的にフォローされる（非特許文献４）。

ＲＯＳの増加は、様々なヒトの癌で報告されてきた（非特許文献５）。

癌細胞におけるＧＳＨパラドックスは、予想されるであろう細胞内ＧＳＨの欠損の代わりに、多くの異なる癌細胞において実験的に見出されたものとは正反対である（非特許文献２）。しかし、ＧＳＨのこの増大は、化学療法および放射線療法から癌細胞を保護するので、治療上の悪影響を負っている（非特許文献６）。

さらに、有効である化学療法に関して癌細胞において低濃度のＧＳＨを得られなければならない場合、これは、正常細胞に関してそれに付随する損傷を誘導しないためのものではない。

癌細胞の化学療法抵抗性に対抗し、ＧＳＨ自体またはＧＳＨ合成、ＧＳＨ分解およびＧＳＨ流出に関与する酵素を標的とするために細胞ＧＳＨを低下させるのに使用されている治療アプローチがある。抗癌剤として臨床試験のフェーズＩ、ＩＩおよびＩＩＩにある１０のＧＳＨ低下化合物が既に存在する（非特許文献７）。

しかし、それらは全て、標準的な抗癌剤、例えば、シクロホスファミド、タキソール、ビンクリスチン、メルファランなどと組み合わせて投与しなければならない。

さらに、これらのＧＳＨ低下薬の標的となる酵素は、ＧＳＨ合成（ガンマグルタミルシステインリガーゼ）、ＧＳＨ分解（ガンマ−グルタミルトランスペプチダーゼ）およびＧＳＨ流出（ＧＳＨ−Ｓ−トランスフェラーゼ）に関与するものである。しかしながら、これらの同じ酵素は正常細胞をＲＯＳ攻撃から保護するために不可欠である。従って、癌細胞および癌細胞のみに選択的に薬物を送達することができないので、正常細胞に対する付随的損傷の可能性が非常に高い。

このことから、癌細胞を特異的かつ選択的に標的とする他の治療解決策を見出す必要がある。

Ｔｏｗｎｓｅｎｄ，Ａ．Ｊ．，Ｌｅｏｎｅ−Ｋａｂｌｅｒ，Ｓ．，Ｈａｙｎｅｓ，Ｒ．Ｌ．，Ｗｕ，Ｙ．，Ｓｚｗｅｄａ，Ｌ．，ａｎｄＢｕｎｔｉｎｇ，Ｋ．Ｄ．（２００１）．ＳｅｌｅｃｔｉｖｅｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎｂｙｓｔａｂｌｙｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄｈｕｍａｎＡＬＤＨ３Ａ１（ｂｕｔｎｏｔｈｕｍａｎＡＬＤＨ１Ａ１）ａｇａｉｎｓｔｔｏｘｉｃｉｔｙｏｆａｌｉｐｈａｔｉｃａｌｄｅｈｙｄｅｓｉｎＶ７９ｃｅｌｌｓ．１３０−１３２，２６１−２７３Ｅｓｔｒｅｌａ，Ｊ．Ｍ．，Ｏｒｔｅｇａ，Ａ．，ａｎｄＯｂｒａｄｏｒ，Ｅ．（２００６）．Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅｉｎｃａｎｃｅｒｂｉｏｌｏｇｙａｎｄｔｈｅｒａｐｙ．Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ．Ｓｃｉ．４３，１４３−１８１；Ｏ’Ｂｒｉｅｎ，Ｍ．Ｌ．，ａｎｄＴｅｗ，Ｋ．Ｄ．（１９９６）．Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅａｎｄｒｅｌａｔｅｄｅｎｚｙｍｅｓｉｎｍｕｌｔｉｄｒｕｇｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ．Ｅｕｒ．Ｊ．ＣａｎｃｅｒＯｘｆ．Ｅｎｇｌ．１９９０３２Ａ，９６７−９７８Ｅｓｔｅｒｂａｕｅｒ，Ｈ．，Ｓｃｈａｕｒ，Ｒ．Ｊ．，ａｎｄＺｏｌｌｎｅｒ，Ｈ．（１９９１）．Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙｏｆ４−ｈｙｄｒｏｘｙｎｏｎｅｎａｌ，ｍａｌｏｎａｌｄｅｈｙｄｅａｎｄｒｅｌａｔｅｄａｌｄｅｈｙｄｅｓ．１１，８１−１２８Ｒｅｕｔｅｒ，Ｓ．，Ｇｕｐｔａ，Ｓ．Ｃ．，Ｃｈａｔｕｒｖｅｄｉ，Ｍ．Ｍ．，ａｎｄＡｇｇａｒｗａｌ，Ｂ．Ｂ．（２０１０）．Ｏｘｉｄａｔｉｖｅｓｔｒｅｓｓ，ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ，ａｎｄｃａｎｃｅｒ：ｈｏｗａｒｅｔｈｅｙｌｉｎｋｅｄ？ＦｒｅｅＲａｄｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．４９，１６０３−１６１６Ｃａｒｒｅｔｅｒｏ，Ｊ．，Ｏｂｒａｄｏｒ，Ｅ．，Ｅｓｔｅｖｅ，Ｊ．Ｍ．，Ｏｒｔｅｇａ，Ａ．，Ｐｅｌｌｉｃｅｒ，Ｊ．Ａ．，Ｓｅｍｐｅｒｅ，Ｆ．Ｖ．，ａｎｄＥｓｔｒｅｌａ，Ｊ．Ｍ．（２００１）．Ｔｕｍｏｒｉｃｉｄａｌａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌｓ．ＩｎｈｉｂｉｔｉｏｎｏｆｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｎｉｔｒｉｃｏｘｉｄｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎａｂｒｏｇａｔｅｓｔｕｍｏｒｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙｉｎｄｕｃｅｄｂｙｈｅｐａｔｉｃｓｉｎｕｓｏｉｄａｌｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍｉｎｒｅｓｐｏｎｓｅｔｏＢ１６ｍｅｌａｎｏｍａａｄｈｅｓｉｏｎｉｎｖｉｔｒｏ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６，２５７７５−２５７８２Ｔｅｗ，Ｋ．ａｎｄＴｏｗｎｓｅｎｄＤ（２０１１）Ｒｅｄｏｘｐｌａｔｆｏｒｍｓｉｎｃａｎｃｅｒｄｒｕｇｄｉｓｃｏｖｅｒｙａｎｄｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１５，１５６−１６１

本発明の発明者らは、アミノチオールエステル化合物またはその薬学的に許容される塩、特に、Ｓ−メチル４−（ジメチルアミノ）−４−メチルペント−２−インチオエートもしくはその薬学的に許容される塩が、対象の癌を治療することができ、対象の癌細胞が、Ｈ_２Ｏ_２を過剰産生することを予期せず見出した。特に、彼らは、アミノチオールエステル化合物またはその薬学的に許容される塩、特に、Ｓ−メチル４−（ジメチルアミノ）−４−メチルペント−２−インチオエートもしくはその薬学的に許容される塩が、対象の癌を治療することができ、対象の癌細胞が、Ｈ_２Ｏ_２を過剰産生し、かつ２５０００細胞に対して０．５ｎｍｏｌ未満のＧＳＨ濃度を有することを予期せず見出した。

いずれの理論にも縛られないが、これらの化合物、特に、Ｓ−メチル４−（ジメチルアミノ）−４−メチルペント−２−インチオエートまたはその薬学的に許容される塩は、Ｈ_２Ｏ_２攻撃によって産生される細胞内代謝産物の濃度を増加させ、同時に、これらの求電子性代謝産物の解毒にＧＳＨが消費されるであろう。その結果、不十分なＧＳＨがＨ_２Ｏ_２のスカベンジャーとして働くようになる。従って、Ｈ_２Ｏ_２の濃度は増大し、アポトーシスのミトコンドリア（内因性）経路においてＨ_２Ｏ_２依存性機構を引き起こすはずである。従って、ミトコンドリアＥＴＣ（電子輸送鎖）の機能障害に起因する癌細胞に存在する高濃度のＨ_２Ｏ_２に加えて、これらの化合物、特にＳ−メチル４−（ジメチルアミノ）−４−メチルペント−２−インチオエートまたはその薬学的に許容される塩は、アポトーシス閾値を超える癌細胞をもたらすＨ_２Ｏ_２濃度のさらなる発現を誘導することになる。反対に、Ｈ_２Ｏ_２攻撃を受けていない正常細胞において、細胞内ＧＳＨ濃度は既に高いため（Ｈ_２Ｏ_２が存在しないため）、癌の対応物においてそれらを特異的に増加させるために用いられる療法によって標的とされるＨ_２Ｏ_２誘導求電子剤はない。

この新しい療法は、正常細胞がＨ_２Ｏ_２攻撃の被害が少ないので正常細胞が保護されるという利点、および、臨床試験中であり、標準的な化学療法剤と組み合わせて使用されるピペロロングミン（ＰＬＭ）およびパテノリド（ＰＴＬ）のような既に知られているＧＳＨホメオスタシスのパーチュベータ（ｐｅｒｔｕｂａｔｏｒ）と比較して（Ｐｅｉ，ＳｅｔａｌＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（２０１３）Ｔａｒｇｅｔｉｎｇａｂｅｒｒａｎｔｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅｍｅｔａｂｏｌｉｓｍｔｏｅｒａｄｉｃａｔｅｈｕｍａｎａｃｕｔｅｍｙｅｌｏｇｅｎｏｕｓｌｅｕｋｅｍｉｃｃｅｌｌｓ；２８８，３３５４２．−３３５４８）、本発明の化合物、特にＳ−メチル４−（ジメチルアミノ）−４−メチルペント−２−インチオエートまたはその薬学的に許容される塩は、単薬剤レジメンとして有効であるという利点を有する。

従って、本発明は、対象の癌の治療に使用するための、式（Ｉ）の化合物、またはその薬学的に許容される塩であって、（Ｉ）式中、Ｘ１およびＸ２は、同一であっても異なっていてもよく、Ｃ_１〜Ｃ_７アルキル基、フェニル、ベンジル中から選択され、またはＸ１およびＸ２は、それらが結合する窒素原子と共に、ヘテロ環、特に、ピペリジンまたはモルホリンを形成し、
対象の癌細胞は、
−対照値と比較してＨ_２Ｏ_２を過剰産生し、
−２５０００細胞に対して０．５ｎｍｏｌ未満のＧＳＨ濃度を有する化合物に関する。

特に、対象の癌細胞はまた、式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容される塩でのｉｎｖｉｔｒｏ治療後に、全タンパク質１μｇ当たり７５ｎｇを超えるＭＤＡ付加物濃度および／または全タンパク質１μｇ当たり１μｇを超えるＨＮＥ付加物濃度を有する。

特に、対象は、対象の癌細胞のＨ_２Ｏ_２濃度およびＧＳＨ濃度を測定することによって特定される。

本発明は、癌を患っており、式（Ｉ）の化合物、またはその薬学的に許容される塩での治療から利益を得られる可能性が最も高い対象を選択する方法であって、
（Ｉ）式中、Ｘ１およびＸ２は、同一であっても異なっていてもよく、Ｃ_１〜Ｃ_７アルキル基、フェニル、ベンジル中から選択され、またはＸ１およびＸ２は、それらが結合する窒素原子と共に、ヘテロ環、特に、ピペリジンまたはモルホリンを形成し、
方法は、
ａ）対象の癌細胞サンプルのＨ_２Ｏ_２濃度を測定すること、
ｂ）対照値と工程ａで得られた濃度とを比較すること、ならびに／または、
ｃ）対象の癌細胞サンプルのＧＳＨ濃度を測定すること、を含み、
−対照値超の対象の癌細胞サンプルのＨ_２Ｏ_２濃度、ならびに／または、
−２５０００細胞に対して０．５ｎｍｏｌ未満の対象の癌細胞サンプルのＧＳＨ濃度は、
対象が、前述の化合物、またはその薬学的に許容される塩での治療から利益を得られる可能性が高いことを示す、方法にさらに関する。

一実施形態では、方法は、
ａ）対象の癌細胞サンプルのＨ_２Ｏ_２濃度を測定すること、
ｂ）対照値と工程ａで得られた濃度とを比較すること、ならびに／または、
ｃ）対象の癌細胞サンプルのＧＳＨ濃度を測定すること、ならびに／または、
ｄ）対象の癌細胞サンプル中の本発明による式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容される塩でのｉｎｖｉｔｒｏ治療の後にＭＤＡ付加物および／もしくはＨＮＥ付加物濃度を測定すること、を含み、
−対照値超の対象の癌細胞サンプルのＨ_２Ｏ_２濃度、ならびに／または、
−２５０００細胞当たり０．５ｎｍｏｌ未満の対象の癌細胞サンプルのＧＳＨ濃度、ならびに／または、
−全タンパク質１μｇ当たり７５ｎｇを超えるＭＤＡ付加物濃度および／またはタンパク質１μｇ当たり１μｇを超えるＨＮＥ付加物濃度は、
対象が前述の化合物、またはその薬学的に許容される塩での治療から利益を得られる可能性が高いことを示す。

本明細書に記載されるように、「Ｈ_２Ｏ_２」は「過酸化水素」を意味し、当業者に周知である。それは、酸素を含む化学反応性分子を表す。それは、酸素の正常な代謝の天然の副産物として形成され、細胞シグナル伝達および恒常性において重要な役割を果たす。しかしながら、環境ストレス（例えば、ＵＶまたは熱暴露）の期間中、その濃度は劇的に増加し得る。これは、細胞構造に重大な損傷をもたらし得る。累積的に、これは酸化的ストレスとして知られている。過酸化水素はまた、電離放射線のような外因性線源によって生成される。

特に、２０００〜４０００００の相対蛍光強度の間、例えば１００００〜１０００００の相対蛍光強度または１５０００〜１０００００の相対蛍光強度の間に含まれる値超のＨ_２Ｏ_２濃度、より具体的には、２００００相対蛍光強度超のＨ_２Ｏ_２濃度、なおより具体的には、２１５９８相対蛍光強度超であることは、対象が式（Ｉ）の化合物、またはその薬学的に許容される塩での治療から利益を得られる可能性が高いことを示す。

特に、２０００〜４０００００の相対蛍光強度の間、例えば１００００〜１０００００の相対蛍光強度または１５０００〜１０００００の相対蛍光強度の間に含まれる値超の濃度、より具体的には、２００００相対蛍光強度超のＨ_２Ｏ_２濃度、なおより具体的には、２１５９８相対蛍光強度超であることは、ＴｏｔａｌＲＯＳ／スーパーオキシド検出キット（Ｅｎｚｏｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅ）、より具体的にはＡｐｐｌｉｓｋａｎ蛍光マイクロプレートリーダー（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）（Ｅｘ／Ｅｍ＝４８８／５２０ｎｍおよびＥｘ／Ｅｍ＝５５０／６１０ｎｍ）で測定する。

蛍光強度を測定することにより、Ｈ_２Ｏ_２のカットオフ濃度を、ここに、および本明細書の他の箇所に示す場合、この方法は非排他的であり、Ｈ_２Ｏ_２のカットオフ濃度は、当業者に利用可能な任意の他の方法によって決定され得、カットオフをどこに置くべきかを決定するパラメータは、本発明による製品のＩＣ_５０とＨ_２Ｏ_２の濃度との間の相関関係である。ＩＣ_５０は、当業者に周知の尺度である。

本明細書に記載されるように、「ＧＳＨ」は「グルタチオン」を意味し、当業者に周知である。これは、グルタメート側鎖のカルボキシル基とシステインのアミン基との間のガンマペプチド結合を有するトリペプチドであり、システインのカルボキシル基はグリシンへの通常のペプチド結合によって結合される。

特に、本発明の範囲内で、ＧＳＨ濃度は、２５０００細胞に対して０．５ｎｍｏｌ未満、特に２５０００細胞に対して０．４５ｎｍｏｌ未満、より具体的には２５０００細胞に対して０．４ｎｍｏｌ未満である。

ＧＳＨの濃度は、当業者に利用可能な任意の方法によって決定される。例えば、ＧＳＨの濃度は、例えばＰｒｏｍｅｇａＧＳＨ−Ｇｌｏキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて発光によって決定される。

ＧＳＨのカットオフ濃度が、ここに、および本明細書中の他の箇所において、発光によって与えられる場合、この方法は非排他的であり、ＧＳＨのカットオフ濃度は、当業者に利用可能な他の任意の方法によって決定され得る。

本明細書に記載されるように、「ＭＤＡ」は、式ＣＨ_２（ＣＨＯ）_２を有する有機化合物である「マロンジアルデヒド」に使用される。この反応種は、当業者に周知であり、天然に存在し、細胞内のマーカー脂質過酸化である。さらに、本発明による「ＭＤＡ付加物」は、ＭＤＡと癌細胞のタンパク質ならびに癌細胞のＤＮＡとの間に形成される付加物である。

特に、本発明の範囲内で、発明による式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容される塩でのｉｎｖｉｔｒｏ治療後のＭＤＡ付加物は、全タンパク質１μｇ当たり７５ｎｇ超、特に全タンパク質１μｇ当たり９０ｎｇ超、より具体的には全タンパク質１μｇ当たり１００ｎｇ超である。ＭＤＡ付加物の濃度は、当業者に利用可能な任意の方法によって決定される。例えば、ＭＤＡ付加物の濃度は、免疫モニタリング、例えばＯｘｉＳｅｌｅｃｔ（商標）ＭＤＡ−付加物競合ＥＬＩＳＡキット（ＣＥＬＬＢＩＯＬＡＢＳ）によって決定される。

本明細書に記載されるように、「ＨＮＥ」は、式Ｃ_９Ｈ_１６Ｏ_２の有機化合物である「４−ヒドロキシ−２−ノネナール」に使用される。この反応種は、当業者に周知であり、天然に存在し、細胞内のマーカー脂質過酸化である。

さらに、本発明による「ＨＮＥ付加物」は、ＨＮＥと癌細胞のタンパク質ならびに癌細胞のＧＳＨと共に形成される付加物の間に形成される付加物である。

特に、本発明の範囲内で、本発明の式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容される塩でのｉｎｖｉｔｒｏ治療後のＨＮＥ付加物は、全タンパク質１μｇ当たり７５０ｎｇ超、特に全タンパク質１μｇ当たり９００ｎｇ超、より具体的には全タンパク質１μｇ当たり１μｇ超である。

ＨＮＥ付加物の濃度は、当業者に利用可能な任意の方法によって決定される。例えば、ＨＮＥ付加物の濃度は、免疫モニタリング、例えばＯｘｉＳｅｌｅｃｔ（商標）ＨＮＥ−付加物競合ＥＬＩＳＡキット（ＣＥＬＬＢＩＯＬＡＢＳ）によって決定される。

「全タンパク質」とは、癌細胞の全タンパク質の含有量を意味する。

「本発明による式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容される塩によるｉｎｖｉｔｒｏ治療」とは、ＭＤＡ付加物および／またはＨＮＥ付加物の濃度が、例えば実験の節に記載される条件で、対象の癌細胞サンプルに対してｉｎｖｉｔｒｏで治療する工程の後に測定され、投与され得る本発明による式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容される塩の用量が６０μＭまでであることを考慮に入れる。

「Ｃ_１−Ｃ_７アルキル基」とは、他に特定しない限り、鎖中に１〜７個の炭素原子を有する直鎖または分岐鎖であり得る脂肪族炭化水素基を意味する。特に、アルキル基は、鎖中に１〜３個の炭素原子を有する（Ｃ_１−Ｃ_３アルキル）。分岐鎖は、メチル、エチルまたはプロピルなどの１つ以上のアルキル基が直鎖アルキル鎖に結合していることを意味する。例示的なアルキル基には、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、２，２−ジメチルブチル、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシル、オクチル、特にメチルが挙げられる。

特に、式（Ｉ）の化合物は、上記の化合物であり、式中、Ｘ１およびＸ２は、同一であっても異なっていてもよく、メチル、フェニル、ベンジルの中から選択され、Ｘ１およびＸ２の少なくとも１つがメチルであり、またはＸ１およびＸ２は、それらが結合する窒素原子と共にピペリジンもしくはモルホリンを形成する。

より具体的には、化合物は、
・Ｓ−メチル４−メチル−４−（ピペリジン−１−イル）ペント−２−インチオエート、
・Ｓ−メチル４−［ベンジル（メチル）アミノ］−４−メチルペント−２−インチオエート、
・Ｓ−メチル４−メチル−４−［メチル（フェニル）アミノ］ペント−２−インチオエート、
・Ｓ−メチル４−メチル−４−（モルホリン−４−イル）ペント２−インチオエート、および
・Ｓ−メチル４−（ジメチルアミノ）−４−メチルペント−２−インチオエートから選択される。

好ましい実施形態では、化合物は、Ｓ−メチル４−（ジメチルアミノ）−４−メチルペント−２−インチオエートである。

これらの化合物は、当業者に周知の方法に従って調製され得る。特に、これらの化合物は、ＢｕＬｉ、ＣＯＳおよびＭｅｌにより連続的に処理された対応するアセチレン系アミンから調製され得る。詳細な調製方法は、例えば、Ｇ．Ｑｕａｓｈｅｔａｌ．，ＥｕｒｏｐｅａｎＪｏｕｒｎａｌｏｆＭｅｄｉｃｉｎａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ４３（２００８）９０６−９１６に見出され得、その内容、特に材料および方法節の第２部、は参照により組み込まれ得る。

ＤＩＭＡＴＥの名称でも知られている、Ｓ−メチル４−（ジメチルアミノ）−４−メチルペント−２−インチオエート（ＣＡＳ番号３５０２２９−２９−７、化学式量：１８５．２９ｇ．ｍｏｌ^−１、式：Ｃ_９Ｈ_１５ＮＯＳ）は、式（ＩＩ）の化合物である。

この化合物およびその調製方法は、例えば、欧州特許第１２９６９４６号明細書（特に実施例１）に記載されており、その内容は参照により組み込まれる。

式（Ｉ）の化合物の「薬学的に許容される塩」とは、化合物がその酸性塩または塩基性塩を作製することによって修飾されることを意味する。薬学的に許容される塩には、化合物の従来の非毒性塩または第四級アンモニウム塩、例えば非毒性の無機酸または有機酸が含まれる。例えば、そのような従来の非毒性塩には、フマレート、ホスフェート、シトレート、クロリドレート（ｃｈｌｏｒｙｄｒａｔｅ）などの塩が含まれる。式（Ｉ）の化合物の薬学的に許容される塩は、従来の化学的方法によって親化合物から合成され得る。概してこのような塩は、これらの化合物の遊離酸または遊離塩基の形態を、化学量論量の適切な塩基または酸と、水中または有機溶媒中で、またはこれら２つの混合物中で反応させることによって調製され得る。概して、エーテル、酢酸エチル、エタノール、イソプロパノール、またはアセトニトリルのような非水性媒体が好ましい。好ましい塩のリストは、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，１７^ｔｈｅｄ．，ＭａｃｋＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，１９８５，ｐ．１４１８に見出される。

特に、式（Ｉ）の化合物は、Ｓ−メチル４−（ジメチルアミノ）−４−メチルペント−２−インチオエートであり、その薬学的に許容される塩はそのフマレート塩、すなわち４−（ジメチルアミノ）−４−メチル−２−ペンチンチオ酸Ｓ−メチルエステルフマレート（化学式量：３０１．４ｇ．ｍｏｌ^−１、式：Ｃ_１３Ｈ_１９ＮＯ_５Ｓ）である。このようなフマレート塩は、無水エタノール中のフマル酸溶液を添加した無水エーテル中のＳ−メチル４−（ジメチルアミノ）−４−メチルペント−２−インチオエートから調製され得る。モノフマレート塩を濾過により回収し、エーテルで洗浄し、乾燥する。

本発明の範囲内において、式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容される塩、Ｓ−メチル４−（ジメチルアミノ）−４−メチルペント−２−インチオエートまたは薬学的に許容されるその塩、特に４−（ジメチルアミノ）−４−メチル−２−ペンチンチオ酸Ｓ−メチルエステルフマレートは、用語「本発明による化合物」と互換的に使用される。

本明細書中で使用される場合、用語「治療する（ｔｒｅａｔ）」、「治療すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」、「治療される（た）（ｔｒｅａｔｅｄ）」または「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」は、対象の症状を排除または軽減する治療学的治療を指す。有益なまたは望ましい臨床結果には、限定されないが、症状の排除、症状の緩和、状態の程度の減少、状態の安定化（すなわち、悪化させない）、状態の進行の遅延または鈍化、疾患もしくは障害の発症、再発もしくは広がりの予防、あるいはその１つ以上の症状の予防を含む。特定の実施形態では、この用語は、症状の発症前に本明細書で提供される化合物での治療またはその投与を指す。この用語は、特定の疾患の症状の阻害または低減を包含する。特に疾患の家族歴を有する対象は、特定の実施形態において治療レジメンの候補である。また、特定の疾患の遺伝的配置が示されている対象は、特定の実施形態では、治療レジメンの候補である。さらに、再発症状の既往歴のある対象も治療の候補となり得る。これに関して、用語「治療」は、用語「予防的治療」と交換可能に使用され得る。

本明細書中で使用される場合、他に定義されない限り、「癌」は、体内の異常な細胞の成長、分裂または増殖を指す。本発明による癌は、対照値と比べてＨ_２Ｏ_２の過剰産生が観察される癌、特に、対照値と比較してＨ_２Ｏ_２の過剰産生が観察されかつ２５０００細胞に対して０．５ｎｍｏｌ未満のＧＳＨ濃度がある癌である。このような癌には、膀胱癌、脳腫瘍、乳癌、メラノーマ、多発性骨髄腫、白血病、リンパ腫、前立腺癌、子宮頸癌、胃癌、肝臓癌、舌癌、卵巣癌、膵臓癌、腎癌、胸膜平滑筋腫、骨肉腫、筋腫瘍、肺癌、腎臓癌、頭頸部癌、大腸癌、血液癌、中枢神経系の癌、および肉腫が含まれるが、これらに限定されず、より好ましくは、膀胱癌、脳腫瘍、多発性骨髄腫、子宮頸癌、胃癌、肝臓癌、舌癌、卵巣癌、膵臓癌、腎癌、胸膜平滑筋腫、骨肉腫、筋腫瘍、腎臓癌、頭頚部癌、大腸癌、血液癌、白血病、中枢神経系の癌および肉腫から選択される。

このように、本発明は、本発明による使用または方法のための式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容される塩、特にＳ−メチル４−（ジメチルアミノ）−４−メチルペント−２−インチオエートまたはその薬学的に許容される塩に関し、対象の癌は、膀胱癌、脳腫瘍、乳癌、メラノーマ、多発性骨髄腫、白血病、リンパ腫、前立腺癌、子宮頸癌、胃癌、肝臓癌、舌癌、卵巣癌、膵臓癌、腎癌、胸膜平滑筋腫、骨肉腫、筋腫瘍、肺癌、腎臓癌、頭頸部癌、大腸癌、血液癌、中枢神経系の癌および肉腫から選択され、特に膀胱癌、脳腫瘍、多発性骨髄腫、子宮頸癌、胃癌、肝臓癌、舌癌、卵巣癌、膵臓癌、腎癌、胸膜平滑筋腫、骨肉腫、筋腫瘍、腎臓癌、頭頚部癌、大腸癌、血液癌、白血病、中枢神経系の癌および肉腫から選択される。

さらに具体的には、癌は化学療法抵抗性および／または放射線抵抗性癌である。

「化学療法抵抗性」とは、化学療法が作用しないかまたは作用することを停止する、本明細書に記載の癌を意味する。

「放射線抵抗性」とは、放射線療法が作用しないかまたは作用することを停止する、本明細書に記載の癌を意味する。

特に、癌は、式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容される塩でのｉｎｖｉｔｒｏ治療後に、全タンパク質１μｇ当たり７５ｎｇを超えるＭＤＡ付加物濃度および／または全タンパク質１μｇ当たり１μｇを超えるＨＮＥ付加物濃度が観察される癌である。

本明細書で使用される場合、用語「対象」は、哺乳動物、動物またはヒトなどの温血動物、特に、本明細書に記載の１つ以上の疾患および症状に罹患しているか、または１つ以上の疾患および症状に罹患する可能性があるヒト、より具体的には、対照値と比較してＨ_２Ｏ_２を過剰産生する癌細胞を有するヒト、さらに具体的には、対照値と比較してＨ_２Ｏ_２を過剰産生し、かつ２５０００細胞に対して０．５ｎｍｏｌ未満のＧＳＨ濃度を有する癌細胞を有するヒトを指す。より具体的には、癌細胞はヒト癌細胞である。さらに具体的には、対照値と比較してＨ_２Ｏ_２を過剰産生する対象の癌細胞、より具体的には、対照値と比較してＨ_２Ｏ_２を過剰産生し、かつ２５０００細胞に対して０．５ｎｍｏｌ未満のＧＳＨ濃度を有する対照の癌細胞は、化学療法抵抗性および／または放射線抵抗性癌細胞である。さらにより具体的には、対照値と比較してＨ_２Ｏ_２を過剰産生する対象の癌細胞、より具体的には、対照値と比較してＨ_２Ｏ_２を過剰産生し、かつ２５０００細胞に対して０．５ｎｍｏｌ未満のＧＳＨ濃度を有する対象の癌細胞はまた、式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容される塩でのｉｎｖｉｔｏｒｏ治療後に全タンパク質１μｇ当たり７５ｎｇを超えるＭＤＡ付加物濃度および／または全タンパク質１μｇ当たり１μｇを超えるＨＮＥ付加物濃度を有する。

本明細書で使用される場合、用語「過剰産生する」、「過剰産生し」は、疾患細胞または疾患組織において、対照値と称する対応する対照細胞または対照組織と比較して過剰量で化合物が産生される状況を説明する。

従って、特に、本発明は、本発明による使用のための化合物に関し、対象は、対象の癌細胞のＨ_２Ｏ_２濃度とＧＳＨ濃度を測定することによって特定される。一実施形態では、対象はまた、本発明による式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容される塩でのｉｎｖｉｔｒｏ治療後に、ＭＤＡ付加物濃度および／またはＨＮＥ付加物濃度を測定することによって、特定される。

Ｈ_２Ｏ_２の濃度は、例えば、当業者に知られた任意の方法、例えば、トータルＲＯＳ／スーパーオキシド検出キット（Ｅｎｚｏｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅ）により行われ得る相対蛍光強度のレベルを決定することにより、特にＡｐｐｌｉｓｋａｎ蛍光マイクロプレートリーダー（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）（Ｅｘ／Ｅｍ＝４８８／５２０ｎｍおよびＥｘ／Ｅｍ＝５５０／６１０ｎｍ）での測定により測定され得る。

従って、特に、本発明は、本発明による使用のための化合物に関し、Ｈ_２Ｏ_２濃度は、蛍光強度のレベルを定量することによって決定される。

より具体的には、それは、本発明による使用のための化合物に関し、Ｈ_２Ｏ_２濃度は、２０００〜４０００００の相対蛍光強度の間、例えば１００００〜１０００００の相対蛍光強度または１５０００〜１０００００の相対蛍光強度の間に含まれる値超、より具体的には、２００００相対蛍光強度超、なおより具体的には、２１５９８相対蛍光強度超である。

当業者は、細胞のＨ_２Ｏ_２濃度を決定するのに適した任意の他のパラメータを本発明と併せて用いることができることを容易に理解するであろう。

従って、Ｈ_２Ｏ_２濃度を検出するために当業者に知られている他の任意の方法を、本発明の範囲から逸脱することなく使用し得る。

従って、より具体的には、本発明は、本発明による使用のための化合物に関し、Ｈ_２Ｏ_２濃度は、トータルＲＯＳ／スーパーオキシド検出キット（Ｅｎｚｏｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅ）により、蛍光強度のレベルを定量することにより、より具体的には、Ａｐｐｌｉｓｋａｎ蛍光マイクロプレートリーダー（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）（Ｅｘ／Ｅｍ＝４８８／５２０ｎｍおよびＥｘ／Ｅｍ＝５５０／６１０ｎｍ）で測定される。

実験部分で使用される方法が平均蛍光強度によるＨ_２Ｏ_２濃度の決定である場合、この方法は非排他的であり、Ｈ_２Ｏ_２濃度は、当業者に利用可能な他の方法により決定され得る。

当業者は、細胞のＧＳＨ濃度を決定するのに適した任意の他のパラメータを本発明と併せて用いることができることを容易に理解するであろう。

従って、ＧＳＨ濃度を検出するために当業者に知られている他の任意の方法を、本発明の範囲から逸脱することなく使用し得る。

従って、特に、本発明は、本発明による使用のための化合物に関し、ＧＳＨ濃度は、発光、より具体的にはＰｒｏｍｅｇａＧＳＨ−Ｇｌｏキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）によって決定される。

ＭＤＡ付加物の濃度は、当業者に利用可能な任意の方法によって決定される。例えば、ＭＤＡ付加物の濃度は、免疫モニタリング、例えばＯｘｉＳｅｌｅｃｔ（商標）ＭＤＡ−付加物競合ＥＬＩＳＡキット（ＣＥＬＬＢＩＯＬＡＢＳ）によって決定される。

当業者は、細胞のＭＤＡ付加物を決定するのに適した任意の他のパラメータを本発明と併せて用いることができることを容易に理解するであろう。

従って、ＭＤＡ付加物を検出するために当業者に知られている他の任意の方法を、本発明の範囲から逸脱することなく使用し得る。

従って、一実施形態では、ＭＤＡ付加物の濃度は、本発明による式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容される塩でのｉｎｖｉｔｒｏ治療の後に測定される。

当業者は、細胞のＨＮＥ付加物を決定するのに適した任意の他のパラメータを本発明と併せて用いることができることを容易に理解するであろう。

従って、ＨＮＥ付加物を検出するために当業者に知られている他の任意の方法を、本発明の範囲から逸脱することなく使用し得る。

従って、一実施形態では、ＨＮＥ付加物の濃度は、本発明による式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容される塩でのｉｎｖｉｔｒｏ治療の後に測定される。

本明細書で使用される場合、用語「サンプル」は、生物起源の物質を意味する。生物学的サンプルの例としては、限定されないが、体液サンプルおよび生検が挙げられる。体液には、血液、尿、唾液または任意の他の身体分泌物またはその誘導体が含まれる。本明細書中で使用される場合、「血液」は、全血、血漿、血清、循環上皮細胞、成分、または任意の血液の誘導体を含む。本発明の生物学的サンプルは、当業者に知られている任意の適切なサンプリング手段によって対象から得られ得る。

癌細胞におけるＨ_２Ｏ_２濃度、ＧＳＨ濃度および／またはＭＤＡ付加物濃度および／またはＨＮＥ付加物濃度を決定するため、特に膀胱腫瘍、脳腫瘍、乳房腫瘍、メラノーマ腫瘍、多発性骨髄腫瘍、白血病腫瘍、リンパ腫瘍、前立腺腫瘍、子宮頸部腫瘍、胃腫瘍、肝腫瘍、舌腫瘍、卵巣腫瘍、膵臓腫瘍、腎腫瘍、胸膜平滑筋腫瘍、骨肉腫瘍、筋腫瘍、肺腫瘍、腎臓腫瘍、頭頸部癌腫瘍、大腸腫瘍、血液腫瘍、中枢神経系の腫瘍および肉腫瘍のような腫瘍の生検をサンプルとした。

Ｈ_２Ｏ_２の濃度の比較に関して、好ましくは、対照値は、癌細胞のサンプルまたは癌サンプルと同じ組織起源のサンプル中で測定され、より好ましくは癌細胞のサンプルまたは同じ対象の癌サンプルと同じ組織起源のサンプル中で測定される。

好ましくは、「対照値」はＨ_２Ｏ_２の正常濃度に対応する。

本明細書で意図するように、Ｈ_２Ｏ_２の「正常濃度」は、サンプル中のＨ_２Ｏ_２の濃度がＨ_２Ｏ_２の標準カットオフ値内にあることを意味する。標準は、サンプルのタイプおよびサンプル中のＨ_２Ｏ_２の濃度を測定するために使用される方法に依存する。特に、Ｈ_２Ｏ_２の基準値は、正常細胞、好ましくは同じ組織、より好ましくは、同じ対象の同じ組織の正常細胞におけるＨ_２Ｏ_２の不存在または基礎濃度に対応し得、あるいは好ましくは同じ組織の、より好ましくは同じ対象の同じ組織のＮＡＣでインキュベートされる癌細胞におけるＨ_２Ｏ_２値に対応し得る。

ＮＡＣは、過酸化水素（速度定数：０．３８Ｍ^−１，ｓ^−１）とゆっくりと反応し、スーパーオキシドアニオンとの反応を示さないヒドロキシラジカル（速度定数：１．３６Ｘ１０^１０Ｍ^−１，ｓ^−１）の熱心なスカベンジャーである（Ａｒｕｏｍａｅｔａｌ；ＦｒｅｅＲａｄｉｃＢｉｏｌＭｅｄ，（１９８９）ＴｈｅａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔａｃｔｉｖｉｔｙｏｆＮ−ａｃｅｔｙｌｃｙｓｔｅｉｎｅ：ｉｔｓｒｅａｃｔｉｏｎｗｉｔｈｈｙｄｒｏｇｅｎｐｅｒｏｘｉｄｅ，ｈｙｄｒｏｘｙｒａｄｉｃａｌ，ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅａｎｉｏｎ，ａｎｄｈｙｐｏｃｈｌｏｒｏｕｓａｃｉｄ：，６，５９３−５９７）。

対象の癌サンプル中のＨ_２Ｏ_２濃度がＨ_２Ｏ_２の正常濃度よりも増加する場合、濃度は、統計的により高いと考えられる。特に、患者の癌サンプル中のＨ_２Ｏ_２濃度が、Ｈ_２Ｏ_２の濃度の対照値と比べて少なくとも１０または１５または２０または２５または３０または３５または４０または４５または５０または６０または７０または８０または９０または１００または２００または３００または４００または５００または６００％のオーダーで増加する場合、Ｈ_２Ｏ_２の濃度は、統計的により高いと考えられる。

同じように、対象の癌サンプルのＨ_２Ｏ_２の濃度が、Ｈ_２Ｏ_２の正常濃度よりも増加する場合、より具体的には、Ｈ_２Ｏ_２の濃度の対照値と比べて少なくとも１０または１５または２０または２５または３０または３５または４０または５０または６０または７０または８０または９０または１００または２００または３００または４００または５００または６００％のオーダーで増加する場合、特に、約３００％のオーダーで増加する場合、濃度は、過剰産生していると考えられる。

対象の癌サンプル中のＨ_２Ｏ_２の濃度が、ＮＡＣと共にインキュベートされた癌細胞中のＨ_２Ｏ_２の濃度よりも増加した場合、濃度は、統計的に高いと考えられる。特に、患者の癌サンプル中のＨ_２Ｏ_２濃度が、このましくは同じ組織、より好ましくは同じ対象の同じ組織のＮＡＣと共にインキュベートされた癌サンプルのＨ_２Ｏ_２の濃度の値と比べて少なくとも１０または１５または２０または２５または３０または３５または４０または５０または６０または７０または８０または９０または１００または２００または３００または４００または５００または６００％のオーダーで増加する場合、Ｈ_２Ｏ_２の濃度は、統計的により高いと考えられる。

同じように、対象の癌サンプルのＨ_２Ｏ_２の濃度が、ＮＡＣと共にインキュベートされた癌細胞におけるＨ_２Ｏ_２の濃度よりも増加する場合、より具体的には、Ｈ_２Ｏ_２の濃度の対照値と比べて少なくとも１０または１５または２０または２５または３０または３５または４０または４５または５０または６０または７０または８０または９０または１００または２００または３００または４００または５００または６００％のオーダーで増加する場合、濃度は、過剰産生していると考えられる。

対照値（１または複数）は、対照細胞集団、すなわち正常細胞、特に癌細胞と同じ組織起源であり、さらには同じ対象由来でもある正常細胞の集団において、あるいはすなわちＮＡＣと共にインキュベートされる癌細胞の集団において、特に、同じ組織起源であり、さらには同じ対象からの組織起源でもあるＮＡＣと共にインキュベートされる癌細胞の集団において測定されたＨ_２Ｏ_２の濃度に基づいて決定される単一の値または値の範囲として決定され得る。

本発明による治療対象の特定は、癌細胞サンプルからのＨ_２Ｏ_２濃度と上記対照値との比較に依存する。対照値は、そこで予め定められた値であってもよいし、または測定値と共に決定される値であってもよい。

典型的には、分析された集団は、測定されたＨ_２Ｏ_２の濃度に基づいて分位数に分割され得る。対照値は、中央値、または第２三分位、または第２もしくは第３四分位、または第３もしくは第４五分位などとして定義され得る。

Ｈ_２Ｏ_２の対照値は、測定に使用される方法に応じて変化し得る。

一実施形態では、治療すべき癌が白血病である場合、ＨＬ６０細胞中のＨ_２Ｏ_２の濃度を用いて基準値を決定する。ＨＬ６０細胞株は、当業者に周知の確立されたヒト前骨髄球性白血病細胞株である。

特に、実施形態では、「ｙ」が２ｘ／３以上、「ｘ」がＨＬ６０細胞中のＨ_２Ｏ_２の濃度であり、「ｙ」が対象の癌サンプル中のＨ_２Ｏ_２の濃度である場合、Ｈ_２Ｏ_２の濃度は、統計的にそれよりも高いか、または過剰産生されると考えられる。

対照値（１または複数）は、対照細胞、すなわちＨＬ６０細胞の集団において測定されたＨ_２Ｏ_２の濃度に基づいて決定される単一の値または値の範囲として決定され得る。

典型的には、分析された集団は、測定されたＨ_２Ｏ_２の濃度に基づいて分位数に分割され得る。対照値は、中央値、または第２三分位、または第２もしくは第３四分位、または第３もしくは第４五分位などとして定義され得る。Ｈ_２Ｏ_２の対照値は、測定に使用される方法に応じて変化し得る。

治療すべき癌が白血病である場合のＨＬ６０細胞について記載されたものと同じ比較方法が、参照値として以下の対応する細胞株と共に以下の表１に述べられている癌のタイプに適用される。

本発明はさらに、対象における癌の治療方法に関し、対象の癌細胞は、対照値と比べてＨ_２Ｏ_２を過剰産生し、特に対照値と比べてＨ_２Ｏ_２を過剰産生しかつ２５０００細胞に対して０．５ｎｍ未満のＧＳＨ濃度を有し、方法は、式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容される塩、特にＳ−メチル４−（ジメチルアミノ）−４−メチルペント−２−インチオエートもしくはその薬学的に許容される塩、より具体的には、４−（ジメチルアミノ）−４−メチル−２−ペンチンチオ酸Ｓ−メチルエステルフマレートを含む治療的有効量の投与を含む。

一実施形態では、対象の癌細胞はまた、式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容される塩でのｉｎｖｉｔｒｏ治療後に、全タンパク質１μｇ当たり７５ｎｇを超えるＭＤＡ付加物濃度および／または全タンパク質１μｇ当たり１μｇを超えるＨＮＥ付加物濃度を有する。

一実施形態では、本発明はまた、癌を患っており、式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容される塩での治療から利益を得られる可能性が最も高い対象を選択する方法に関し、
（Ｉ）式中、Ｘ１およびＸ２は、同一であっても異なっていてもよく、Ｃ_１〜Ｃ_７アルキル基、フェニル、ベンジル中から選択され、またはＸ１およびＸ２は、それらが結合する窒素原子と共に、ヘテロ環、特に、ピペリジンまたはモルホリンを形成し、
方法は、
ａ）対象の癌細胞サンプルのＨ_２Ｏ_２濃度を測定すること、
ｂ）対照値と工程ａで得られた濃度と比較すること、ならびに／または、
ｃ）対象の癌細胞サンプルのＧＳＨ濃度を測定すること、を含み、
−対象の癌細胞サンプルのＨ_２Ｏ_２濃度が対照値超であり、ならびに／または、
−対象の癌細胞サンプルのＧＳＨ濃度が２５０００細胞に対して０．５ｎｍｏｌ未満である場合、
方法は、
ｄ）対象を式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容される塩、特にＳ−メチル４−（ジメチルアミノ）−４−メチルペント−２−インチオエートもしくはその薬学的に許容される塩で治療すること、をさらに含む。

一実施形態では、方法は、
ａ）対象の癌細胞サンプルのＨ_２Ｏ_２濃度を測定すること、
ｂ）対照値と工程ａで得られた濃度と比較すること、ならびに／または、
ｃ）対象の癌細胞サンプルのＧＳＨ濃度を測定すること、ならびに／または、
ｃ’）本発明による式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容される塩での対象の癌細胞サンプルにおけるｉｎｖｉｔｒｏ治療後にＭＤＡ付加物および／またはＨＮＥ付加物濃度を測定すること、を含み、
−対象の癌細胞サンプルのＨ_２Ｏ_２濃度が対照値超であり、ならびに／または、
−対象の癌細胞サンプルのＧＳＨ濃度が２５０００細胞に対して０．５ｎｍｏｌ未満であり、および／または、
−ＭＤＡ付加物濃度が全タンパク質１μｇ当たり７５ｎｇを超えるおよび／またはＨＮＥ付加物濃度がタンパク質１μｇ当たり１μｇを超える、場合、
方法は、
ｄ）対象を式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容される塩、特にＳ−メチル４−（ジメチルアミノ）−４−メチルペント−２−インチオエートもしくはその薬学的に許容される塩で治療すること、をさらに含む。

本発明の化合物は、様々な合成経路によって調製され得る。試薬および出発物質は、市販されているか、または当業者によって周知の技術によって容易に合成される。

本明細書に記載の疾患および状態の治療を必要とする対象の特定は、上記のように行われ、十分、当業者の能力および知識の範囲内である。臨床医は、上記の技術によって、そのような治療を必要とする対象を容易に特定し得る。

治療的有効量は、当業者であれば、従来の技術の使用によって、および類似の状況下で得られた結果を観察することにより、試みる診断者によって容易に決定され得る。治療的有効量を決定することにおいて、限定されないが、対象の種、サイズ、年齢、および一般的な健康状態、関与する特定の疾患、疾患の関与程度または重症度、個々の対象の応答、投与される特定の化合物、投与の様式、投与される製剤の生物学的利用能特性、選択された投与レジメン、付随する薬の使用、その他の関連する状況を含む多くの要因は、試みる診断者によって考慮される。

本明細書で使用される場合、「治療的有効量」は、本明細書に記載の疾患および状態の症状を軽減、排除、治療または制御するのに有効な量を指す。用語「制御する」は、本明細書に記載の疾患および状態の進行の遅延、中断、休止、または停止であり得る全ての方法を指すことを意図しているが、全ての疾患および状態症状の完全な排除を必ずしも示すものではなく、予防的治療および慢性的な使用を含むことが意図される。

所望の生物学的効果を達成するのに必要な本発明による化合物の量は、投与される薬物の用量、使用される化合物の化学的特性（例えば、疎水性）、化合物の効力、疾患のタイプ、患者の疾患状態、および投与経路を含む多くの要因に依存して変化するであろう。

本発明による化合物は、１つ以上の薬学的に許容される添加剤との混合によって医薬組成物に製剤化され得る。

本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される添加剤」とは、哺乳動物、特にヒトに適切に投与された場合に、有害な、アレルギー性の、または他の有害な反応を生じない分子実体および組成物を指す。薬学的に許容される添加剤は、任意のタイプの非毒性の固体、半固体または液体の充填剤、希釈剤、カプセル化材料または製剤助剤を指す。

そのような組成物は、経口投与、特に錠剤またはカプセルの形態で、特に口腔内（リオ）錠剤の形態で、あるいは非経口投与、特に液体溶液、懸濁液またはエマルジョンの形態で使用のために調製され得る。

それは、医薬分野で周知のいずれかの方法、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：ＴｈｅＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＰｒａｃｔｉｃｅｏｆＰｈａｒｍａｃｙ，２０^ｔｈｅｄ．；Ｇｅｎｎａｒｏ，Ａ．Ｒ．，Ｅｄ．；ＬｉｐｐｉｎｃｏｔｔＷｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ：Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ，２０００に記載されるように調製され得る。薬学的に適合性の結合剤および／またはアジュバント材料は、組成物の一部として含められ得る。経口組成物は概して、不活性希釈剤担体または食用担体を含むだろう。それらは、単位用量形態で投与され、ここで、用語「単位用量」は、患者に投与され得る単一用量、簡単に扱い梱包され得る単一用量を指し、以下に記載されるように、活性化合物自体または薬学的に許容される組成物のいずれかを含む物理的および化学的に安定な単位用量として残る。

錠剤、丸剤、粉剤、カプセル剤、トローチ剤などは、以下の成分、微結晶セルロースもしくはトラガカントゴムのような結合剤、デンプンもしくは乳糖のような希釈剤、デンプンおよびセルロース誘導体のような崩壊剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、コロイド状二酸化ケイ素のような流動促進剤、スクロースもしくはサッカリンのような甘味剤、またはペパーミントもしくはサリチル酸メチルなどの香味剤、または類似の性質の化合物のいずれかの１つ以上を含み得る。カプセル剤は、硬カプセル剤または軟カプセル剤の形態であってもよく、これらは概して、任意に可塑剤とブレンドされたゼラチンブレンド、およびデンプンカプセルから作製される。さらに、用量単位形態は、用量単位の物理的形態を修飾する種々の他の材料、例えば、糖、シェラックまたは腸溶性物質のコーティングを含有し得る。他の経口剤形シロップまたはエリキシル剤は、甘味剤、防腐剤、染料、着色料および香味料を含み得る。さらに、活性化合物は、速溶性、調節放出調製物または徐放性調製物および製剤に組み込まれ得、そのような徐放性製剤は、好ましくはバイモーダルである。

液体調製物、特に、静脈内または経口投与のための液体調製物には、滅菌水溶液または非水性溶液、懸濁液およびエマルジョンが含まれる。液体組成物はまた、結合剤、緩衝剤、防腐剤、キレート剤、甘味剤、香味剤および着色剤などを含み得る。非水性溶媒には、アルコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、アクリレートコポリマー、オリーブ油などの植物油、およびオレイン酸エチルなどの有機エステルが含まれる。水性担体には、アルコールと水の混合物、ヒドロゲル、緩衝媒体、および生理食塩水が含まれる。特に、生体適合性、生分解性ラクチドポリマー、ラクチド／グリコリドコポリマー、またはポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンコポリマーは、活性化合物の放出を制御するのに有用な添加剤であり得る。静脈内ビヒクルは、液体および栄養補充剤、電解質補充剤、リンガーデキストロースに基づくものなどのなどを含み得る。

投与様式の例としては、非経口、例えば、皮下、筋肉内、静脈内、皮内、および経口投与が挙げられる。それは、特に、経口投与のための錠剤または静脈内投与のための注射用溶液のための粉末としての製剤を含む。

本発明の範囲内で、「使用のための式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容される塩」とは、「式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容される塩の使用」と同義であり、特に「治療に使用される式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容される塩」とは、「治療のための式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容される塩の使用」および「治療のために意図される医薬の製造のための式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容される塩の使用」と同義である。

本発明は、以下の図および実施例によってさらに説明される。

様々な癌細胞株でのＳ−メチル４−（ジメチルアミノ）−４−メチルペント−２−インチオエート生存率アッセイ（レサズリン、ＸＴＴまたはＭＴＴ）の効能Ｈ_２Ｏ_２／Ｓ−メチル４−（ジメチルアミノ）−４−メチルペント−２−インチオエートＩＣ_５０相関：μＭでのＳ−メチル４−（ジメチルアミノ）−４−メチルペント−２−インチオエートおよび癌細胞における内因性Ｈ_２Ｏ_２活性濃度の間の関係Ｈ_２Ｏ_２／Ｓ−メチル４−（ジメチルアミノ）−４−メチルペント−２−インチオエートＩＣ_５０相関：カットオフの決定Ｈ_２Ｏ_２／Ｓ−メチル４−（ジメチルアミノ）−４−メチルペント−２−インチオエートＩＣ_５０相関：組織起源による研究メラノーマ細胞（癌細胞）およびメラノサイト細胞（対応する正常細胞）のＨ_２Ｏ_２濃度の比較Ｓ−メチル４−（ジメチルアミノ）−４−メチルペント−２−インチオエートの、Ｈ_２Ｏ_２を過剰産生するＨＬ６０癌細胞における影響、および２５０００細胞に対して０．５ｎｍｏｌ未満のＧＳＨ濃度を有するまたは有しないかの影響Ｈ_２Ｏ_２を過剰産生する細胞におけるＧＳＨ濃度を上昇させることによるＳ−メチル４−（ジメチルアミノ）−４−メチルペント−２−インチオエート効能の阻害Ｈ_２Ｏ_２を過剰産生し、２５０００細胞に対して５ｎｍｏｌよりも高いＧＳＨ濃度を有するＣｏｌｏ３５７細胞におけるＳ−メチル４−（ジメチルアミノ）−４−メチルペント−２−インチオエート効能感受性および耐性細胞で観察された２５０００細胞当たりのｎｍｏｌでの総ＧＳＨ濃度Ｓ−メチル４−（ジメチルアミノ）−４−メチルペント−２−インチオエート感受性細胞（ＨＬ−６０、ＮＴ２／Ｄ１）（Ａ）および２４時間の間５または１０μｍｏｌ．Ｌ^−１のＳ−メチル４−（ジメチルアミノ）−４−メチルペント−２−インチオエートで処理したＳ−メチル４−（ジメチルアミノ）−４−メチルペント−２−インチオエート耐性細胞（ＭＳＣ）（Ｂ）におけるＭＤＡおよびＨＮＥ付加物の定量

注：上記のすべての図において、ＤＩＭＡＴＥは、Ｓ−メチル４−（ジメチルアミノ）−４−メチルペント−２−インチオエートを示す。

（実施例）
（実施例１）
材料および方法
細胞株
１０個の組織型を表す５２のヒト腫瘍細胞のパネルを、様々な異なる癌遺伝子の広範なセットをカバーするように選択し、様々な標準化学療法剤に対するそれらの応答に従って選択した。細胞は、ｔｈｅＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、ｔｈｅＥｕｒｏｐｅａｎＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎｏｆＣｅｌｌＣｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ）から、および患者の腫瘍由来の癌細胞の初代培養から得られた（ＲｅｓｅａｒｃｈＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＶａｌｌｄ’Ｈｅｂｒｏｎ（ＶＨＩＲ），Ｂａｒｃｅｌｏｎｅ，Ｓｐａｉｎ；Ｖａｌｌｄ’ＨｅｂｒｏｎＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＯｎｃｏｌｏｇｙ（ＶＨＩＯ），Ｂａｒｃｅｌｏｎｅ，Ｓｐａｉｎ；Ｏｎｃｏｔｅｓｔ，Ｆｒｅｉｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ；Ｏｎｃｏｄｅｓｉｇｎ，Ｄｉｊｏｎ，Ｆｒａｎｃｅ；ＵｎｉｖｅｒｓｉｔａＤｅｇｌｉＳｔｕｄｉｄｉＰａｌｅｒｍｏ，ＯｎｃｏｌｏｇｙａｎｄＳｕｒｇｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐａｌｅｒｍｏ，Ｉｔａｌｙ；ａｎｄＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＰｒｅｄｉｃｔｉｖｅａｎｄＰｅｒｓｏｎａｌｉｚｅｄＭｅｄｉｃｉｎｅｏｆＣａｎｃｅｒ（ＩＭＰＰＣ），Ｂａｒｃｅｌｏｎａ，Ｓｐａｉｎ（腫瘍細胞パネルの記載について表２を参照のこと））。
供給業者の推奨に従って適切な培地で全ての細胞を培養した。

Ｓ−メチル４−（ジメチルアミノ）−４−メチルペント−２−インチオエートでの治療
細胞は、実験終了時（０．５×１０^４〜５×１０^４細胞／ウェル）の対照（未処理細胞）において約８０％信頼性を確保するのに必要な濃度で９６ウェル細胞培養プレートに播種される。４８時間後、Ｓ−メチル４−（ジメチルアミノ）−４−メチルペント−２−インチオエートへの感受性は、様々な薬物の濃度（０．０１〜１００μＭ）を使用して決定された。４８時間後、製造業者の指示に従って、Ａｌａｍａｒｂｌｕｅを用いて薬物の成長阻害効果を分析した。Ａｌａｍａｒｂｌｕｅアッセイは、早期の観察に基づいて使用され、同様の結果がＡｌａｍａｒｂｌｕｅを用いた場合にテトラゾリウムの低減として観察された（ＸＴＴアッセイ）。良好なデータ品質を確保し、ピペッティングエラーの影響を最小限に抑えるために、８つの別々のウェルからの平均蛍光強度に基づいて各特定の薬物濃度を評価した。薬物応答は、各特定の細胞株の半最大阻害濃度（ＩＣ_５０）によって定量し、対数−用量／応答曲線の非線形回帰分析によって決定した。耐性に対するカットオフ値対Ｓ−メチル４−（ジメチルアミノ）−４−メチルペント−２−インチオエートは、統計的に決定された（＞２Ｓ．Ｄ．ＩＣ_５０幾何平均超）。薬物に対する過感受性のｉｎ−ｖｉｔｒｏ閾値は、＜ＩＣ_５０幾何平均として定義されている。

３Ｄクローン原性アッセイ、９６ウェルフォーマット
クローン原性アッセイ試験は、９６ウェルプレートフォーマットで実施された。各試験のために、腫瘍異種移植片から調製された腫瘍細胞の凍結アリコートを解凍され、試験化合物の有無にかかわらず、各試験ウェルは同体積の３層、半固体培地（底層および上層）の２層、培地上清の１層、のようにアッセイプレートを調製した。底層は、２０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（Ｓｉｇｍａ）、０．０１％（ｗ／ｖ）ゲンタマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および０．７５％（ｗ／ｖ）寒天（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を補充したイスコフ改変ダルベッコ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）０．０５ｍＬ／ｖ）からなる。０．４％（ｗ／ｖ）寒天を補充した同じ培養培地０．０５ｍＬに腫瘍細胞を添加し、底層に播種した。２４時間後、試験化合物をＤＭＳＯ中で連続希釈後添加し、細胞培養培地中に移し、実験期間中（連続曝露、０．０５ｍＬの薬物オーバーレイ）、細胞を放置した。各ディッシュには６つの未処理の対照ウェルおよび薬物処理群が１０の濃度で２通り含まれている。培養物を加湿雰囲気中、３７℃および７．５％ＣＯ_２で８〜１３日間インキュベートし、倒立顕微鏡を用いてコロニー成長について注意深くモニターした。この期間内に、ｅｘｖｉｖｏでの腫瘍の成長は、５０μｍよりも大きな直径を有するコロニーの形成をもたらす。最大コロニー形成時に、自動画像解析システムを用いてカウントを行った。評価の２４時間前に、生存コロニーは、２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−フェニルテトラゾリウムクロリド（１ｍｇ／ｍＬ、１００μＬ／ウェル）の滅菌水溶液で染色された。シグモイド濃度−応答曲線は、４パラメータの非線形曲線適合（ＯｎｃｏｔｅｓｔＷａｒｅｈｏｕｓｅＳｏｆｔｗａｒｅ）を用いて各腫瘍モデルについて得られたデータポイントに適合させた。ＩＣ_５０値は、相対的ＩＣ_５０値として報告され、これはシグモイド濃度−応答曲線（曲線の変曲点）の上部および底部プレートの中間（コロニー形成／生存率の阻害）応答を与える試験化合物の濃度であり、または絶対的ＩＣ_５０値として報告され、これは濃度−応答曲線とＴ／Ｃ＝５０％との交点における試験化合物の濃度である。平均ＩＣ_５０値の計算のために、幾何平均が使用された。結果は、試験した全ての腫瘍モデルにわたって平均グラフプロットまたはヒートマップ（幾何平均ＩＣ_５０値に対する個々のＩＣ_５０値）として示された。

Ｈ_２Ｏ_２産生の測定
生細胞における細胞内Ｈ_２Ｏ_２産生を、トータルＲＯＳ／スーパーオキシド検出キット（ＥｎｚｏＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅ）を用いて、製造業者の指示に従って測定した。このアッセイでは、Ｈ_２Ｏ_２およびＲＮＳ種との反応時に迅速に高蛍光性化合物に酸化される特定のＨ_２Ｏ_２／ＲＮＳプローブが使用された。蛍光強度は、サンプル内の全Ｈ_２Ｏ_２／ＲＮＳ濃度に比例する。実験的試験は、未処理細胞、またはＳ−メチル４−（ジメチルアミノ）−４−メチルペント−２−インチオエート（１〜５ｕＭ）、ビヒクルＨＥＰＥＳ、Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン（ＮＡＣ）（１０ｍＭ）で処理された細胞を用いて行われた。細胞供給業者の指示に従って、分析の前日に、ＦＢＳ（１０％ｖ／ｖ）、１０単位のペニシリン／ｍｌおよび１００ｍｇのストレプトマイシンを補充した、培養培地中で２×１０^４の密度で９６ウェルの黒色／透明底プレートに細胞を播種した。細胞を９５％空気、５％ＣＯ_２の湿潤雰囲気中で３７℃に一晩保った。分析の日に、細胞培地を上記のように補充した１００μＬのフェノールフリー培地に置き換えて、何ら処理もせず放置、Ｓ−メチル４−（ジメチルアミノ）−４−メチルペント−２−インチオエートと共に６時間、ビヒクルＨＥＰＥＳと共に６時間、またはＮＡＣと共に２０分間処理した。インキュベーション期間後、ウェルを、それぞれの処理剤または対照を含有する１００μＬのＨ_２Ｏ_２検出溶液で充填し、暗所で３７℃で６０分間インキュベートした。いくつかのウェルは、バックグラウンド蛍光対照測定のために細胞なしで放置された。蛍光マイクロプレートリーダー（ｅｘ＝５６０ｎｍ、Ｅｍ＝６００）を用いてプレートを読み取った。データは、等しい量の細胞から産出され、全タンパク質入力値に対して正規化された任意の蛍光単位における変化として表された。

ＧＳＨ生産量の測定
細胞を９６ウェル黒色ウォールプレート（５×１０^４細胞／ｍＬ）に播種し、付着のために一晩インキュベートした。２４時間、ビヒクル、ＤＭＳＯ、ＢＣＮＵ１００μＭ、Ｓ−メチル４−（ジメチルアミノ）−４−メチルペント−２−インチオエート２０μＭのいずれかで細胞を処理した。全グルタチオンをキットの指示（ＧＳＨ−Ｇｌｏ（商標）、Ｐｒｏｍｅｇａ）に従って測定し、結果を２５０００細胞に関して得た。

ＥＬＩＳＡによるＨＮＥタンパク質付加物およびＭＤＡ／タンパク質付加物の定量的決定
ＯｘｉｃｌｅｃｔＨＮＥＡｄｄｕｃｔＥｌｉｓａキット（ＣｅｌｌＢｉｏｌａｂｓ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）およびＯｘｉＳｅｌｅｃｔＭＤＡＡｄｄｕｃｔＥＬＩＳＡキット（ＣｅｌｌＢｉｏｌａｂｓ）を用いて、ＨＮＥ付加物およびＭＤＡ付加物の形成をそれぞれ定量した。簡潔に、２４時間のＳ−メチル４−（ジメチルアミノ）−４−メチルペント−２−インチオエートでの処理後、還元ＳＤＳサンプル緩衝液中での超音波処理によって細胞を溶解した。ホモジネートを、１０μｇタンパク質／ｍＬに希釈し、３７℃で少なくとも２時間インキュベートすることにより９６ウェルタンパク質結合プレートに吸着させた。ウェルを、ＰＢＳで２回洗浄し、オービタルシェーカーで室温でさらに２時間インキュベートした。ＰＢＳで３回洗浄した後、１００μＬの抗ＨＮＥ抗体または抗ＭＤＡ抗体を、ウェルに加え、室温で１時間インキュベートした。続いて、ヤギ抗ウサギ二次抗体−ＨＲＰコンジュゲート（アッセイ希釈液で１／１０００希釈）を加え、インキュベートを１時間続けた。ウェルをＰＢＳで５回洗浄し、ＨＲＰ−基質を添加した。酸性溶液で反応を停止させ、吸光度をマイクロプレートリーダーで４５０ｎｍで読み取った。ＨＮＥ付加物およびＭＤＡ付加物の濃度は、製造者によって供給されたＨＮＥ−ＢＳＡおよびＭＤＡ−ＢＳＡ標準から調製された標準曲線との比較によって決定された。

Ｓ−メチル４−（ジメチルアミノ）−４−メチルペント−２−インチオエート処理細胞に対する耐性の誘導
Ｓ−メチル４−（ジメチルアミノ）−４−メチルペント−２−インチオエート誘導細胞死を元に戻すために、薬物感受性細胞ＨＬ−６０は、１０ｍＭの濃度の還元グルタチオン類似体グルタチオンモノエチルエステル（ＧＳＨ−ＭＥＥ）の存在下、または組み合わせたＳ−メチル４−（ジメチルアミノ）−４−メチルペント−２−インチオエートの存在下で、Ｓ−メチル４−（ジメチルアミノ）−４−メチルペント−２−インチオエート（１０μＭ）に暴露された。ＨＬ−６０は、グルタチオンモノエチルエステル（ＧＳＨ−ＭＥＥ）１０ｍＭを補充した補完培地１００μＬ中に、５×１０^４細胞／ウェルの濃度で９６ウェルプレートに播種された。９０分間のインキュベート後、細胞をＰＢＳで洗浄し、細胞を異なる濃度の薬物（０．０１〜１００μＭ）を用いてインキュベートした。２４時間および４８時間後、細胞生存率を、上記のようなレザスリンアッセイを用いて測定した。

統計的解析
値は、平均±ＳＤまたは頻度および比率として表される。群間の差は、適切な場合、不対ｔ検定、カイ二乗検定、フィッシャーの正確検定またはＡＮＯＶＡによって決定した。Ｐ＜０．０５は統計的に有意であると考えられた。解析は、ＧｒａｐｈＰａｄｐｒｉｓｍバージョン５．０（ＧｒａｐｈＰａｄｓｏｆｔｗａｒｅ，ＳａｎＤｉｅｇｏＣａｌｉｆｏｒｎｉａＵＳＡ）およびＪＭＰソフトウェアバージョン１２．０１（ＳＡＳＩｎｓｔｉｔｕｔｅＩｎｃ．ＮｏｒｔｈＣａｒｏｌｉｎａＵＳＡ）を用いて行った。

結果
得られた結果を図１〜１０に示す。

ｉｎｖｉｔｒｏにおけるＳ−メチル４−（ジメチルアミノ）−４−メチルペント−２−インチオエートの効能
図１に示すように、Ｓ−メチル４−（ジメチルアミノ）−４−メチルペント−２−インチオエートは、Ｈ_２Ｏ_２を過剰産生する様々な癌細胞株において有効である（生存率アッセイ−上記で説明したレサズリン、ＸＴＴまたはＭＴＴ）。

Ｈ_２Ｏ_２／Ｓ−メチル４−（ジメチルアミノ）−４−メチルペント−２−インチオエートＩＣ_５０相関
図２は、高いＨ_２Ｏ_２活性と低いＩＣ_５０との間に相関が観察されることを示している（上述のトータルＲＯＳ／スーパーオキシド検出キットによるモニタリング）。

さらに、図３は、カットオフ（２００００相対蛍光強度）で２つの部分に細胞を分離することによって、低Ｈ_２Ｏ_２からの高Ｈ_２Ｏ_２のＳ−メチル４−（ジメチルアミノ）−４−メチルペント−２−インチオエート感受性の差が明らか（Ｐ値＜０．０５）であることを示す。

図４では、高いＨ_２Ｏ_２活性と低いＩＣ_５０との間の相関関係が組織起源別に示されている。

さらに、癌細胞に対するＳ−メチル４−（ジメチルアミノ）−４−メチルペント−２−インチオエートの選択をコントロールするため、本発明の化合物も上述したのと同様の方法を用いて、正常細胞を試験した。以下の表３に結果が示されるように、本発明の化合物は正常細胞への影響を有しない。

さらに、表２の細胞株ＤＵ１４５（前立腺癌株）および細胞株ＨＬ６０（白血病）について、上記材料および方法に従って、本発明による他の化合物を試験した。

これらの化合物の有効性に関する結果を以下の表４に示す。

Ｈ_２Ｏ_２濃度とＧＳＨ濃度の相関
図６は、Ｈ_２Ｏ_２を過剰産生し、２５０００細胞に対して０．５ｎｍｏｌ未満のＧＳＨ濃度を有するまたは有していないＨＬ６０癌細胞におけるＳ−メチル４−（ジメチルアミノ）−４−メチルペント−２−インチオエートの影響を示す。
特に、図６（Ａ）は、相対蛍光強度（ＲＦＵ）におけるＨ_２Ｏ_２活性濃度が、２４時間、５μＭのＳ−メチル４−（ジメチルアミノ）−４−メチルペント−２−インチオエートで処理した後に増加したことを示す。しかし、２．５ｍＭのＮ−アセチル−システイン（ＮＡＣ）に加えて、Ｓ−メチル４−（ジメチルアミノ）−４−メチルペント−２−インチオエートの処理を用いてＨ_２Ｏ_２の増加は観察されなかった。図６（Ｂ）において、ＧＳＨ濃度は、２．５ｍＭのＮＡＣで処理したＨＬ−６０細胞で有意に増加し、その細胞はＨ_２Ｏ_２を過剰産生し、２５０００細胞に対して０．５ｎｍｏｌよりも高いＧＳＨ濃度を有する。
図６（Ｃ）は、Ｓ−メチル４−（ジメチルアミノ）−４−メチルペント−２−インチオエート（５，１０μｍｏｌ．Ｌ−１）および／または２．５ｍＭＮＡＣで処理したＨＬ−６０細胞の生存率を示し、Ｓ−メチル４−（ジメチルアミノ）−４−メチルペント−２−インチオエートの効能の阻害は、ＮＡＣで処置したＨＬ−６０細胞において有意に観察された。

さらに、図７は、１０ｍＭのＧＳＨ−ＭＥＥの前処理の後、ＧＳＨの膜／脂質透過性誘導体であるグルタチオン還元エチルエステル（ＧＳＨ−ＭＥＥ）が、ＧＳＨ供給を部分的に補うために使用され得て、ＧＳＨ−ＭＥＥを用いたＨＬ−６０細胞の処理は、Ｓ−メチル４−（ジメチルアミノ）−４−メチルペント−２−インチオエートの細胞傷害効果を阻害することを示す。細胞内にＧＳＨをより多く添加することによって、細胞の状態は、Ｈ_２Ｏ_２を過剰産生し、２５０００細胞に対して０．５ｎｍｏｌよりも高いＧＳＨ濃度になり、Ｓ−メチル４−（ジメチルアミノ）−４−メチルペント−２−インチオエートはもはや有効ではなくなった。

さらに、これらの結果を確認するために、図８は、（Ａ）Ｃｏｌｏ３５７細胞を１００μＭのカルムスチン（ＢＣＮＵ）で処理すると、ＧＳＨ濃度を５０％減少させ、および細胞の状態を変化させ、Ｈ_２Ｏ_２の過剰産生および２５０００細胞に対する０．５ｎｍｏｌ未満のＧＳＨ濃度にさせ、結果として、（Ｂ）Ｓ−メチル４−（ジメチルアミノ）−４−メチルペント−２−インチオエートは、これらの細胞に対して影響を与え、５０％の生存率を減少させることを示す。

図９では、２５０００細胞当たりのｎｍｏｌでの総ＧＳＨ濃度が、感受性および耐性細胞で観察されている。有意差（＊＊＊、Ｐ値＜０．００１）が観察された。低ＧＳＨ細胞からの高ＧＳＨ細胞を区別するために２５０００細胞当たり０．５ｎｍｏｌの閾値を用いると、１００％の感受性細胞が低ＧＳＨであり、１００％の耐性細胞が高ＧＳＨである。

図１０は、Ｓ−メチル４−（ジメチルアミノ）−４−メチルペント−２−インチオエート感受性細胞（ＨＬ−６０、ＮＴ２／Ｄ１）（Ａ）および２４時間の間５または１０μｍｏｌ．Ｌ^−１のＳ−メチル４−（ジメチルアミノ）−４−メチルペント−２−インチオエートで処理したＳ−メチル４−（ジメチルアミノ）−４−メチルペント−２−インチオエート耐性細胞（ＭＳＣ）（Ｂ）におけるＭＤＡ付加物およびＨＮＥ付加物の定量を示す。ＭＤＡ付加物の場合、感受性Ｓ−メチル４−（ジメチルアミノ）−４−メチルペント−２−インチオエート細胞における閾値は、全タンパク質１μｇ当たり１００ｎｇ超であり、耐性細胞における閾値は、この閾値未満である。ＨＮＥ付加体では、総タンパク質１μｇ当たり１μｇの閾値で同じ観察を行うことができる。

（実施例２）
メラノーマ細胞サンプルからのＨ_２Ｏ_２濃度は、これらの細胞が本発明による化合物での治療に適格であるかどうかを決定するために対照値と比較された。
ヒトメラノーマ細胞（実施例１で得られた）は、対応正常細胞−ここではヒトメラノサイト（Ｐｒｏｍｏｃｅｌｌのメラノサイト増殖培地Ｍ２で培養した若年包皮由来の正常ヒト上皮メラノサイト、Ｐｒｏｍｏｃｅｌｌ（ＮＨＥＭ、プール））からのＨ_２Ｏ_２濃度と共に測定される。
２つのサンプルは、ＴｏｔａｌＲＯＳ／スーパーオキシド検出キット（Ｅｎｚｏライフサイエンス）を用いてＨ_２Ｏ_２濃度の測定に供される。Ａｐｐｌｉｓｋａｎ蛍光マイクロプレートリーダー（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）（Ｅｘ／Ｅｍ＝４８８／５２０ｎｍおよびＥｘ／Ｅｍ＝５５０／６１０ｎｍ）において、両方のサンプルの相対蛍光強度を測定する。
図５から分かるように、癌細胞サンプルのＨ_２Ｏ_２濃度は、対照サンプル（すなわち正常細胞）のＨ_２Ｏ_２濃度を２８０％超えている。
したがって、これらの癌細胞は、本発明の化合物による治療に適格であり、特にＧＳＨ濃度が２５０００細胞に対して５ｎｍｏｌ未満である場合において、４−（ジメチルアミノ）−４−メチル−２−ペンタンチオ酸Ｓ−メチルエステルフマレートでの治療に適格である。

（付記）
（付記１）
対象の癌の治療に使用される式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容される塩であって、
（Ｉ）式中、Ｘ１およびＸ２は、同一であっても異なっていてもよく、Ｃ_１〜Ｃ_７アルキル基、フェニル、ベンジルの中から選択され、またはＸ１およびＸ２は、それらが結合する窒素原子と共に、ヘテロ環、特に、ピペリジンまたはモルホリンを形成し、
前記対象の癌細胞は、
−対照値と比較してＨ_２Ｏ_２を過剰産生し、
−２５０００細胞に対して０．５ｎｍｏｌ未満のＧＳＨ濃度を有する、
式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容される塩。

（付記２）
前記対象は、前記対象の癌細胞における前記Ｈ_２Ｏ_２濃度および前記ＧＳＨ濃度を測定することによって特定される、付記１に記載の使用のための式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容される塩。

（付記３）
前記Ｈ_２Ｏ_２濃度は、蛍光強度のレベルを定量することによって決定される、付記２に記載の使用のための式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容される塩。

（付記４）
前記Ｈ_２Ｏ_２濃度は、２００００相対蛍光強度超である、付記３に記載の使用のための式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容される塩。

（付記５）
前記対象の癌細胞はまた、式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容される塩でのｉｎｖｉｔｒｏ治療後に、全タンパク質１μｇ当たり７５ｎｇを超えるＭＤＡ付加物濃度および／または全タンパク質１μｇ当たり１μｇを超えるＨＮＥ付加物濃度を有する、付記１〜３のいずれか１つに記載の使用のための式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容される塩。

（付記６）
癌を患っており、式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容される塩での治療から利益を得られる可能性が最も高い対象を選択する方法であって、
（Ｉ）式中、Ｘ１およびＸ２は、同一であっても異なっていてもよく、Ｃ_１〜Ｃ_７アルキル基、フェニル、ベンジルの中から選択され、またはＸ１およびＸ２は、それらが結合する窒素原子と共に、ヘテロ環、特に、ピペリジンまたはモルホリンを形成し、
前記方法は、
ａ．前記対象の癌細胞サンプルのＨ_２Ｏ_２濃度を測定すること、
ｂ．対照値と工程ａで得られた濃度とを比較すること、および、
前記対象の癌細胞サンプルのＧＳＨ濃度を測定すること、を含み、
−前記対照値超の前記対象の前記癌細胞サンプルのＨ_２Ｏ_２濃度、および
−２５０００細胞に対して０．５ｎｍｏｌ未満の前記対象の前記癌細胞サンプルのＧＳＨ濃度は、
前記対象が、前記化合物またはその薬学的に許容される塩での治療から利益を得られる可能性が高いことを示す、
方法。

（付記７）
前記方法は、
ａ）前記対象の癌細胞サンプルのＨ_２Ｏ_２濃度を測定すること、
ｂ）対照値と工程ａで得られた濃度とを比較すること、
ｃ）前記対象の癌細胞サンプルのＧＳＨ濃度を測定すること、ならびに
ｄ）前記対象の癌細胞サンプル中の式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容される塩でのｉｎｖｉｔｒｏ治療の後にＭＤＡ付加物および／またはＨＮＥ付加物濃度を測定すること、を含み、
−前記対照値超の前記対象の前記癌細胞サンプルのＨ_２Ｏ_２濃度、
−２５０００細胞当たり０．５ｎｍｏｌ未満の前記対象の前記癌細胞サンプルのＧＳＨ濃度、ならびに
−全タンパク質１μｇ当たり７５ｎｇを超えるＭＤＡ付加物濃度および／またはタンパク質１μｇ当たり１μｇを超えるＨＮＥ付加物濃度は、
前記対象が、前記化合物またはその薬学的に許容される塩での治療から利益を得られる可能性が高いことを示す、付記６に記載の方法。

（付記８）
２００００相対蛍光強度超のＨ_２Ｏ_２濃度は、前記対象が、式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容される塩での治療から利益を得られる可能性が高いことを示す、
付記６または７に記載の方法。

（付記９）
前記ＧＳＨ濃度が、発光によって決定される、付記２〜５のいずれか１つに記載の使用のための式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容される塩、または付記６〜８のいずれか１つに記載の方法。

（付記１０）
前記ＭＤＡ付加物濃度および／またはＨＮＥ付加物濃度は、免疫モニタリングによって決定される、付記５に記載の使用のための式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容される塩、または付記７〜９のいずれか１つに記載の方法。

（付記１１）
前記癌は、膀胱癌、脳腫瘍、乳癌、メラノーマ、多発性骨髄腫、白血病、リンパ腫、前立腺癌、子宮頸癌、胃癌、肝臓癌、舌癌、卵巣癌、膵臓癌、腎癌、胸膜平滑筋腫、骨肉腫、筋腫瘍、肺癌、腎臓癌、頭頸部癌、大腸癌、血液癌、中枢神経系の癌、および肉腫から選択される、付記１〜５、９および１０のいずれか１つに記載の使用のための式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容される塩、または付記６〜１０のいずれか１つに記載の方法。

（付記１２）
前記式（Ｉ）の化合物において、Ｘ１およびＸ２は、同一であっても異なっていてもよく、メチル、フェニル、ベンジルの中から選択され、Ｘ１またはＸ２の少なくとも１つがメチルであり、またはＸ１およびＸ２は、それらに結合する窒素原子と共にピペリジンもしくはモルホリンを形成する、付記１〜５および９〜１１のいずれか１つに記載の使用のための化合物、または付記６〜１１のいずれか１つに記載の方法。

（付記１３）
式（Ｉ）の化合物が、
・Ｓ−メチル４−メチル−４−（ピペリジン−１−イル）ペント−２−インチオエート（ｙｎｅｔｈｉｏａｔｅ）、
・Ｓ−メチル４−［ベンジル（メチル）アミノ］−４−メチルペント−２−インチオエート、
・Ｓ−メチル４−メチル−４−［メチル（フェニル）アミノ］ペント−２−インチオエート、
・Ｓ−メチル４−メチル−４−（モルホリン−４−イル）ペント２−インチオエート、および、
・Ｓ−メチル４−（ジメチルアミノ）−４−メチルペント−２−インチオエート、
から選択される化合物である、付記１〜５および９〜１２のいずれか１つに記載の使用のための化合物、または付記６〜１２のいずれか１つに記載の方法。

（付記１４）
前記式（Ｉ）の化合物は、Ｓ−メチル４−（ジメチルアミノ）−４−メチルペント−２−インチオエートまたはその薬学的に許容される塩である、付記１〜５および９〜１３のいずれか１つに記載の使用のための化合物、または付記６〜１３のいずれか１つに記載の方法。

（付記１５）
前記薬学的に許容される塩は、４−（ジメチルアミノ）−４−メチル−２−ペンチンチオ酸Ｓ−メチルエステルフマレートである、付記１４に記載の使用のための化合物、または付記１４に記載の方法。

Claims

対象の癌の治療に使用される式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容される塩であって、
（Ｉ）式中、Ｘ１およびＸ２は、同一であっても異なっていてもよく、Ｃ_１〜Ｃ_７アルキル基、フェニル、ベンジルの中から選択され、またはＸ１およびＸ２は、それらが結合する窒素原子と共に、ヘテロ環、特に、ピペリジンまたはモルホリンを形成し、
前記対象の癌細胞は、
−対照値と比較してＨ_２Ｏ_２を過剰産生し、
−２５０００細胞に対して０．５ｎｍｏｌ未満のＧＳＨ濃度を有する、
式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容される塩。
前記対象は、前記対象の癌細胞における前記Ｈ_２Ｏ_２濃度および前記ＧＳＨ濃度を測定することによって特定される、請求項１に記載の使用のための式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容される塩。
前記Ｈ_２Ｏ_２濃度は、蛍光強度のレベルを定量することによって決定される、請求項２に記載の使用のための式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容される塩。
前記Ｈ_２Ｏ_２濃度は、２００００相対蛍光強度超である、請求項３に記載の使用のための式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容される塩。
前記対象の癌細胞はまた、式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容される塩でのｉｎｖｉｔｒｏ治療後に、全タンパク質１μｇ当たり７５ｎｇを超えるＭＤＡ付加物濃度および／または全タンパク質１μｇ当たり１μｇを超えるＨＮＥ付加物濃度を有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の使用のための式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容される塩。
癌を患っており、式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容される塩での治療から利益を得られる可能性が最も高い対象を選択する方法であって、
（Ｉ）式中、Ｘ１およびＸ２は、同一であっても異なっていてもよく、Ｃ_１〜Ｃ_７アルキル基、フェニル、ベンジルの中から選択され、またはＸ１およびＸ２は、それらが結合する窒素原子と共に、ヘテロ環、特に、ピペリジンまたはモルホリンを形成し、
前記方法は、
ａ．前記対象の癌細胞サンプルのＨ_２Ｏ_２濃度を測定すること、
ｂ．対照値と工程ａで得られた濃度とを比較すること、および、
前記対象の癌細胞サンプルのＧＳＨ濃度を測定すること、を含み、
−前記対照値超の前記対象の前記癌細胞サンプルのＨ_２Ｏ_２濃度、および
−２５０００細胞に対して０．５ｎｍｏｌ未満の前記対象の前記癌細胞サンプルのＧＳＨ濃度は、
前記対象が、前記化合物またはその薬学的に許容される塩での治療から利益を得られる可能性が高いことを示す、
方法。
前記方法は、
ａ）前記対象の癌細胞サンプルのＨ_２Ｏ_２濃度を測定すること、
ｂ）対照値と工程ａで得られた濃度とを比較すること、
ｃ）前記対象の癌細胞サンプルのＧＳＨ濃度を測定すること、ならびに
ｄ）前記対象の癌細胞サンプル中の式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容される塩でのｉｎｖｉｔｒｏ治療の後にＭＤＡ付加物および／またはＨＮＥ付加物濃度を測定すること、を含み、
−前記対照値超の前記対象の前記癌細胞サンプルのＨ_２Ｏ_２濃度、
−２５０００細胞当たり０．５ｎｍｏｌ未満の前記対象の前記癌細胞サンプルのＧＳＨ濃度、ならびに
−全タンパク質１μｇ当たり７５ｎｇを超えるＭＤＡ付加物濃度および／またはタンパク質１μｇ当たり１μｇを超えるＨＮＥ付加物濃度は、
前記対象が、前記化合物またはその薬学的に許容される塩での治療から利益を得られる可能性が高いことを示す、請求項６に記載の方法。
２００００相対蛍光強度超のＨ_２Ｏ_２濃度は、前記対象が、式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容される塩での治療から利益を得られる可能性が高いことを示す、
請求項６または７に記載の方法。
前記ＧＳＨ濃度が、発光によって決定される、請求項２〜５のいずれか１項に記載の使用のための式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容される塩、または請求項６〜８のいずれか１項に記載の方法。
前記ＭＤＡ付加物濃度および／またはＨＮＥ付加物濃度は、免疫モニタリングによって決定される、請求項５に記載の使用のための式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容される塩、または請求項７〜９のいずれか１項に記載の方法。
前記癌は、膀胱癌、脳腫瘍、乳癌、メラノーマ、多発性骨髄腫、白血病、リンパ腫、前立腺癌、子宮頸癌、胃癌、肝臓癌、舌癌、卵巣癌、膵臓癌、腎癌、胸膜平滑筋腫、骨肉腫、筋腫瘍、肺癌、腎臓癌、頭頸部癌、大腸癌、血液癌、中枢神経系の癌、および肉腫から選択される、請求項１〜５、９および１０のいずれか１項に記載の使用のための式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容される塩、または請求項６〜１０のいずれか１項に記載の方法。
前記式（Ｉ）の化合物において、Ｘ１およびＸ２は、同一であっても異なっていてもよく、メチル、フェニル、ベンジルの中から選択され、Ｘ１またはＸ２の少なくとも１つがメチルであり、またはＸ１およびＸ２は、それらに結合する窒素原子と共にピペリジンもしくはモルホリンを形成する、請求項１〜５および９〜１１のいずれか１項に記載の使用のための化合物、または請求項６〜１１のいずれか１項に記載の方法。
式（Ｉ）の化合物が、
・Ｓ−メチル４−メチル−４−（ピペリジン−１−イル）ペント−２−インチオエート（ｙｎｅｔｈｉｏａｔｅ）、
・Ｓ−メチル４−［ベンジル（メチル）アミノ］−４−メチルペント−２−インチオエート、
・Ｓ−メチル４−メチル−４−［メチル（フェニル）アミノ］ペント−２−インチオエート、
・Ｓ−メチル４−メチル−４−（モルホリン−４−イル）ペント２−インチオエート、および、
・Ｓ−メチル４−（ジメチルアミノ）−４−メチルペント−２−インチオエート、
から選択される化合物である、請求項１〜５および９〜１２のいずれか１項に記載の使用のための化合物、または請求項６〜１２のいずれか１項に記載の方法。
前記式（Ｉ）の化合物は、Ｓ−メチル４−（ジメチルアミノ）−４−メチルペント−２−インチオエートまたはその薬学的に許容される塩である、請求項１〜５および９〜１３のいずれか１項に記載の使用のための化合物、または請求項６〜１３のいずれか１項に記載の方法。
前記薬学的に許容される塩は、４−（ジメチルアミノ）−４−メチル−２−ペンチンチオ酸Ｓ−メチルエステルフマレートである、請求項１４に記載の使用のための化合物、または請求項１４に記載の方法。