JP2019019082A - 誤りがちｄｎａ修復経路の抑制によるがんの治療 - Google Patents
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Abstract
【課題】ＤＮＡ修復の誤りの蓄積による遺伝的不安定性の増幅と、それに伴う二次性発がんの発症や転移等がんの悪性化を長期的且つ副作用が無い状態で抑えることが可能となる新規治療手段を提供する。【解決手段】白金製剤を用いた化学療法又は放射線療法と併用される、ＳＳＡ阻害剤を含む剤であって、ここで前記剤が、対象への前記白金製剤の投与後、又は前記放射線の照射後、前記対象におけるがん細胞中のＳＳＡの活性化前、又は活性化時に投与される、該剤。【選択図】図１２
Description
本発明は、誤りがちＤＮＡ修復経路を標的とするＳＳＡ阻害剤を含むがん細胞増殖抑制剤及び晩期障害低減剤、ＳＳＡ阻害剤及び白金製剤を含む併用剤、並びにＳＳＡ阻害剤並びに白金製剤及び／又は放射線を用いたがん治療方法に関する。
従来の薬剤によるがん治療方法では、高価な抗がん剤による医療費の高騰、費用対延命効果、副作用や二次性発がんの問題が常に伴っており、サステナブルな抗がん剤開発は世界的に見ても厳しい状況である。また、このような状況を鑑みて、既存の抗がん剤の治療効果を高めるために、例えば、他の薬剤との併用療法が検討されている。
特許文献１には、（−）ガロカテキン‐３‐ガラート（以下、ＧＣＧと略記する場合がある）、（−）エピガロカテキン‐３‐ガラート（以下、ＥＧＣＧと略記する場合がある）、（−）カテキン‐３‐ガラート（以下、ＣＧと略記する場合がある）、（−）エピカテキン‐３‐ガラート（以下、ＥＣＧと略記する場合がある）等からなる群から選択される化学感作物質を、抗がん剤（例えば、フラボピリドール、アドリアマイシン、エトポシド、タキソール、シスプラチン）と組み合わせて対象に投与することを含む、対象におけるがんの治療方法が記載されている。また、特許文献１には、化学感作物質及び抗がん剤が同時に投与される治療方法、並びに化学感作物質が抗がん剤よりも先に投与される治療方法も記載されている。
特許文献２には、エピガロカテキン‐３‐ガレートを含む組成物等の投与と、放射線療法、化学療法（例えば、シスプラチンの投与など）等を組み合わせた、増殖性疾患の治療方法が記載されている。
しかしながら、シスプラチンなどの抗がん剤や放射線を用いたがん治療による副作用、例えば、二次性発がんについては、現在、その分子生物学的な機序がほとんど解明されておらず、そのため、二次性発がんの発生を抑制するための抗がん剤との併用に適した薬剤や、併用のための用法・用量等についても研究が進んでおらず、未だ有効な解決策がない。
放射線や抗がん剤などを用いたがん治療により、ＤＮＡは様々なタイプの損傷を受ける。このような損傷に対応するために細胞は、多様な修復機構を有しており、例えば、ＤＮＡ損傷の１つであるＤＮＡ二本鎖切断では、その修復機構として、相同組換え修復（homologous recombination（以下、ＨＲと略記する場合がある））、非相同末端再結合、代替非相同末端再結合、マイクロホモロジー媒介末端結合（microhomology-mediated end-joining）、ＤＮＡ鎖切断誘発複製(break-induced replication)、一本鎖アニーリング（single-strand annealing（以下、ＳＳＡと略記する場合がある））などの経路がある。これらの修復経路のうち、非相同末端再結合、代替非相同末端再結合、マイクロホモロジー媒介末端結合、ＤＮＡ鎖切断誘発複製、及び一本鎖アニーリングは、ＤＮＡの塩基配列のエラーが起こりやすい修復であり、ＤＮＡの誤りがち修復経路（error-prone repair pathway）として知られている。
最近、ＳＳＡが活性化する様々ながんが見つかりつつある。現在までに、ＳＳＡが活性化しやすい特殊ながんの例として、ＢＲＣＡ１遺伝子とＢＲＣＡ２遺伝子に変異をもつ乳がんや卵巣がん、ＡＰＣ遺伝子変異による家族性大腸腺腫症などが発見されている。
また近年、誤りがち修復経路阻害剤としてＥＧＣが同定され、タンパク質の構造解析の結果から、この阻害剤ＥＧＣが、誤りがち修復経路の主要なタンパク質であるＲａｄ５２の機能部位にファンデルワールス力を介した特殊な結合をすることで、従来のＥＧＣ使用濃度範囲である１０〜５００μM（Bigelow and Cardelli, Oncogene, 2006, 25, 1922-30; Sugiharaら、Free Radic Biol Med, 1999, 27, 1313-23）よりも低い１μＭ周辺の低濃度で、Ｒａｄ５２阻害効果が生じることが明らかとなった（Hengelら、elife, 2016; 5:e14740）。
しかし、放射線や抗がん剤、該修復機構、及び放射線や抗がん剤に起因する晩期障害、例えば、二次性発がんの間の関連性についての分子レベルでの研究や、該ＳＳＡ阻害剤の低濃度効果の研究は進んでおらず、特にマウスを用いた個体レベルでの研究は皆無に等しい。該ＳＳＡ阻害剤ＥＧＣの低濃度効果の研究が進んでいない原因は、緑茶成分であるポリフェールの抗がん作用が、緑茶中の含有量が最も多いＥＧＣＧの抗酸化作用や免疫系転写因子ＮＦｋＢ調節作用によるものと長年考えられてきたからである(Surh, Cancer chemoprevention with dietary phytochemicals. 2003, Nat Rev Cancer, 3, 768-780; Yangら, Cancer prevention by tea: animal studies, molecular mechanisms and human relevance. 2009, Nat Rev Cancer, 9: 429-439)。このような経緯から、細胞レベルでも、動物実験でもＥＧＣＧが専ら集中的に研究されており、ＥＧＣＧより緑茶中含有量が少なく且つ生理活性の低いＥＧＣを用いて、しかも従来よりも桁違いに低い濃度での細胞を用いた実験や、特に動物実験を行う発想は生まれ難い状況であった。
本発明の目的は、ＤＮＡ修復、ＤＮＡ複製、及びＤＮＡ組換えの誤りの蓄積による遺伝的不安定性の増幅と、それに伴う二次性発がんの発症や転移等がんの悪性化を長期的かつ副作用が無い状態で抑えることが可能となる新規治療手段を提供することにある。
本発明者は、今までにロスムンド・トムソン症候群関連がん抑制遺伝子ＲＥＣＱＬ４欠損細胞に着目し(Kitaoら, Nature Genet, 1999, 22, 82-84)、独自にヒトＢリンパ球性白血病細胞Ｎａｌｍ‐６を用いてＲＥＣＱＬ４ノックイン細胞を樹立して表現型解析を行ったところ、ＲＥＣＱＬ４欠損細胞が放射線とシスプラチンに高感受性であることを明らかにした(Kohzakiら, Carcinogenesis, 2012, 33, 1203-1210)。
該知見に基づいて、上記の課題を解決するために鋭意検討した結果、まず、Ｎａｌｍ‐６以外のＲＥＣＱＬ４欠損がんＨＣＴ１１６細胞や非がんＲＥＣＱＬ４欠損ＭＣＦ１０Ａ細胞を独自に樹立して、ＲＥＣＱＬ４欠損による放射線とシスプラチンに対する高感受性が、がん細胞に特異的で普遍的な特性であることを見出した。
次に、抗がん治療でよく使われる放射線やシスプラチンに対して高感受性を示すＲＥＣＱＬ４欠損がんＨＣＴ１１６細胞が、どのようなＤＮＡ修復経路で生存して二次性発がんを誘導するのかについて分子レベルで研究を進め、がん細胞の新しい弱点を解明することを目的として研究を行った。その結果、抗がん剤や放射線処理後に、がん細胞がＳＳＡを活性化して生存しようとするメカニズムと具体的なタイミングを、分子レベルから個体レベルにわたって見出した。本発明者らは、これらの知見に基づいて、更に検討を重ねた結果、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、以下の通りである。
［１］白金製剤を用いた化学療法又は放射線療法と併用される、ＳＳＡ阻害剤を含むがん細胞増殖抑制剤であって、ここで前記がん細胞増殖抑制剤が、対象への前記白金製剤の投与後、又は前記放射線の照射後、前記対象におけるがん細胞中のＳＳＡの活性化前、又は活性化時に投与される、増殖抑制剤。
［２］前記ＳＳＡ阻害剤が、Ｒａｄ５２阻害剤である、［１］に記載のがん細胞増殖抑制剤。
［３］前記Ｒａｄ５２阻害剤が、（−）エピガロカテキン、又は5-アミノ-1-((2R,3R,4S,5R)-3,4-ジヒドロキシ-5-(ヒドロキシメチル)-テトラヒドロフラン-2-イル)-1H-イミダゾール-4-カルボキサミドである、［２］に記載のがん細胞増殖抑制剤。
［４］前記白金製剤が、オキサリプラチン、カルボプラチン、シスプラチン、及びネダプラチンからなる群から選択される、［１］〜［３］のいずれか１つに記載のがん細胞増殖抑制剤。
［５］前記がん細胞増殖抑制剤が、前記白金製剤の投与後、又は前記放射線の照射後、２日以内に投与される、［１］〜［４］のいずれか１つに記載のがん細胞増殖抑制剤。
［６］前記がん細胞が、Ｒａｄ５２因子を含むＳＳＡ活性が増加するがん細胞である、［１］〜［５］のいずれか１つに記載のがん細胞増殖抑制剤。
［７］前記Ｒａｄ５２因子を含むＳＳＡ活性が増加するがん細胞が、ＲＥＣＱＬ４欠損がん細胞、ＢＲＣＡ１及び／又はＢＲＣＡ２欠損がん細胞、並びにＡＰＣ欠損がん細胞からなる群から選択される、［６］に記載のがん細胞増殖抑制剤。
［８］白金製剤を用いた化学療法又は放射線療法と併用される、ＳＳＡ阻害剤を含む、前記化学療法又は放射線療法に起因する晩期障害低減剤であって、ここで前記晩期障害低減剤が、対象への前記白金製剤の投与後、又は前記放射線の照射後、前記対象におけるがん細胞中のＳＳＡの活性化前、又は活性化時に投与される、晩期障害低減剤。
［９］前記晩期障害が二次性発がんである、［８］に記載の晩期障害低減剤。
［１０］前記ＳＳＡ阻害剤が、Ｒａｄ５２阻害剤である、［８］又は［９］に記載の晩期障害低減剤。
［１１］前記Ｒａｄ５２阻害剤が、（−）エピガロカテキン、又は5-アミノ-1-((2R,3R,4S,5R)-3,4-ジヒドロキシ-5-(ヒドロキシメチル)-テトラヒドロフラン-2-イル)-1H-イミダゾール-4-カルボキサミドである、［１０］に記載の晩期障害低減剤。
［１２］前記白金製剤が、オキサリプラチン、カルボプラチン、シスプラチン、及びネダプラチンからなる群から選択される、［８］〜［１１］のいずれか１つに記載の晩期障害低減剤。
［１３］前記晩期障害低減剤が、前記白金製剤の投与後、又は前記放射線の照射後、２日以内に投与される、［８］〜［１２］のいずれか１つに記載の晩期障害低減剤。
［１４］前記がん細胞が、Ｒａｄ５２因子を含むＳＳＡ活性が増加するがん細胞である、［８］〜［１３］のいずれか１つに記載の晩期障害低減剤。
［１５］前記がん細胞が、ＲＥＣＱＬ４欠損がん細胞、ＢＲＣＡ１及び／又はＢＲＣＡ２欠損がん細胞、並びにＡＰＣ欠損がん細胞からなる群から選択される、［１４］に記載の晩期障害低減剤。
［１６］白金製剤とＳＳＡ阻害剤とを組み合わせてなる併用剤であって、ここで前記ＳＳＡ阻害剤が、対象への前記白金製剤の投与後、前記対象におけるがん細胞中のＳＳＡの活性化前、又は活性化時に投与される、がん細胞増殖抑制剤。
［１７］さらに放射線療法と併用される、［１６］に記載のがん細胞増殖抑制剤。
［１８］白金製剤とＳＳＡ阻害剤とを組み合わせてなる併用剤であって、ここで前記ＳＳＡ阻害剤が、対象への前記白金製剤の投与後、前記対象におけるがん細胞中のＳＳＡの活性化前、又は活性化時に投与される、前記白金製剤の投与に起因する晩期障害低減剤。
［１９］前記晩期障害が二次性発がんである、［１８］に記載の晩期障害低減剤。
［２０］がんを治療し、且つ化学療法及び／又は放射線療法に起因する晩期障害を低減するための方法であって、前記方法が、それを必要とする対象に、以下：
（ｉ）治療有効量の白金製剤を投与し、及び／又は放射線を照射し、及び
（ii）前記白金製剤の投与後、及び／又は放射線の照射後、前記対象におけるがん細胞中のＳＳＡの活性化前、若しくは活性化時に、治療有効量のＳＳＡ阻害剤を投与する
ことを含む、方法。
［２１］前記治療有効量のＳＳＡ阻害剤が、前記白金製剤の投与後、及び／又は放射線の照射後、２日以内の間に投与される、［２０］に記載の方法。
［２２］前記がん細胞が、ＲＥＣＱＬ４欠損がん細胞、ＢＲＣＡ１及び／又はＢＲＣＡ２欠損がん細胞、並びにＡＰＣ欠損がん細胞からなる群から選択される、［２０］又は［２１］に記載の方法。
［２３］前記がんが、大腸がん、卵巣がん又は乳がんである、［２０］〜［２２］のいずれか１つに記載の方法。
［１］白金製剤を用いた化学療法又は放射線療法と併用される、ＳＳＡ阻害剤を含むがん細胞増殖抑制剤であって、ここで前記がん細胞増殖抑制剤が、対象への前記白金製剤の投与後、又は前記放射線の照射後、前記対象におけるがん細胞中のＳＳＡの活性化前、又は活性化時に投与される、増殖抑制剤。
［２］前記ＳＳＡ阻害剤が、Ｒａｄ５２阻害剤である、［１］に記載のがん細胞増殖抑制剤。
［３］前記Ｒａｄ５２阻害剤が、（−）エピガロカテキン、又は5-アミノ-1-((2R,3R,4S,5R)-3,4-ジヒドロキシ-5-(ヒドロキシメチル)-テトラヒドロフラン-2-イル)-1H-イミダゾール-4-カルボキサミドである、［２］に記載のがん細胞増殖抑制剤。
［４］前記白金製剤が、オキサリプラチン、カルボプラチン、シスプラチン、及びネダプラチンからなる群から選択される、［１］〜［３］のいずれか１つに記載のがん細胞増殖抑制剤。
［５］前記がん細胞増殖抑制剤が、前記白金製剤の投与後、又は前記放射線の照射後、２日以内に投与される、［１］〜［４］のいずれか１つに記載のがん細胞増殖抑制剤。
［６］前記がん細胞が、Ｒａｄ５２因子を含むＳＳＡ活性が増加するがん細胞である、［１］〜［５］のいずれか１つに記載のがん細胞増殖抑制剤。
［７］前記Ｒａｄ５２因子を含むＳＳＡ活性が増加するがん細胞が、ＲＥＣＱＬ４欠損がん細胞、ＢＲＣＡ１及び／又はＢＲＣＡ２欠損がん細胞、並びにＡＰＣ欠損がん細胞からなる群から選択される、［６］に記載のがん細胞増殖抑制剤。
［８］白金製剤を用いた化学療法又は放射線療法と併用される、ＳＳＡ阻害剤を含む、前記化学療法又は放射線療法に起因する晩期障害低減剤であって、ここで前記晩期障害低減剤が、対象への前記白金製剤の投与後、又は前記放射線の照射後、前記対象におけるがん細胞中のＳＳＡの活性化前、又は活性化時に投与される、晩期障害低減剤。
［９］前記晩期障害が二次性発がんである、［８］に記載の晩期障害低減剤。
［１０］前記ＳＳＡ阻害剤が、Ｒａｄ５２阻害剤である、［８］又は［９］に記載の晩期障害低減剤。
［１１］前記Ｒａｄ５２阻害剤が、（−）エピガロカテキン、又は5-アミノ-1-((2R,3R,4S,5R)-3,4-ジヒドロキシ-5-(ヒドロキシメチル)-テトラヒドロフラン-2-イル)-1H-イミダゾール-4-カルボキサミドである、［１０］に記載の晩期障害低減剤。
［１２］前記白金製剤が、オキサリプラチン、カルボプラチン、シスプラチン、及びネダプラチンからなる群から選択される、［８］〜［１１］のいずれか１つに記載の晩期障害低減剤。
［１３］前記晩期障害低減剤が、前記白金製剤の投与後、又は前記放射線の照射後、２日以内に投与される、［８］〜［１２］のいずれか１つに記載の晩期障害低減剤。
［１４］前記がん細胞が、Ｒａｄ５２因子を含むＳＳＡ活性が増加するがん細胞である、［８］〜［１３］のいずれか１つに記載の晩期障害低減剤。
［１５］前記がん細胞が、ＲＥＣＱＬ４欠損がん細胞、ＢＲＣＡ１及び／又はＢＲＣＡ２欠損がん細胞、並びにＡＰＣ欠損がん細胞からなる群から選択される、［１４］に記載の晩期障害低減剤。
［１６］白金製剤とＳＳＡ阻害剤とを組み合わせてなる併用剤であって、ここで前記ＳＳＡ阻害剤が、対象への前記白金製剤の投与後、前記対象におけるがん細胞中のＳＳＡの活性化前、又は活性化時に投与される、がん細胞増殖抑制剤。
［１７］さらに放射線療法と併用される、［１６］に記載のがん細胞増殖抑制剤。
［１８］白金製剤とＳＳＡ阻害剤とを組み合わせてなる併用剤であって、ここで前記ＳＳＡ阻害剤が、対象への前記白金製剤の投与後、前記対象におけるがん細胞中のＳＳＡの活性化前、又は活性化時に投与される、前記白金製剤の投与に起因する晩期障害低減剤。
［１９］前記晩期障害が二次性発がんである、［１８］に記載の晩期障害低減剤。
［２０］がんを治療し、且つ化学療法及び／又は放射線療法に起因する晩期障害を低減するための方法であって、前記方法が、それを必要とする対象に、以下：
（ｉ）治療有効量の白金製剤を投与し、及び／又は放射線を照射し、及び
（ii）前記白金製剤の投与後、及び／又は放射線の照射後、前記対象におけるがん細胞中のＳＳＡの活性化前、若しくは活性化時に、治療有効量のＳＳＡ阻害剤を投与する
ことを含む、方法。
［２１］前記治療有効量のＳＳＡ阻害剤が、前記白金製剤の投与後、及び／又は放射線の照射後、２日以内の間に投与される、［２０］に記載の方法。
［２２］前記がん細胞が、ＲＥＣＱＬ４欠損がん細胞、ＢＲＣＡ１及び／又はＢＲＣＡ２欠損がん細胞、並びにＡＰＣ欠損がん細胞からなる群から選択される、［２０］又は［２１］に記載の方法。
［２３］前記がんが、大腸がん、卵巣がん又は乳がんである、［２０］〜［２２］のいずれか１つに記載の方法。
本発明によれば、白金製剤の投与による化学療法や放射線療法後、所定の期間内に、ＳＳＡ阻害剤を投与することで、がん細胞で特異的に活性化されるＳＳＡ経路を選択的に抑制し、さらなるＤＮＡ修復、ＤＮＡ複製、及びＤＮＡ組換えの誤りの蓄積による遺伝的不安定性の誘導と、それに伴う二次性発がんや転移などのがんの悪性化等を、長期的かつ副作用が無い状態で効果的に抑制することができ、がんの治療効果が期待される。
本明細書において、（ポリ）ヌクレオチドなどの略号による表示は、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢの規定〔IUPAC-IUB Communication on Biological Nomenclature, Eur. J. Biochem., 138: 9 (1984)〕、「塩基配列またはアミノ酸配列を含む明細書等の作成のためのガイドライン」（日本国特許庁編）、及び当該分野における慣用記号に従う。
１．定義
本明細書における用語の定義を以下に記すが、以下の定義は本発明の範囲を限定するものではない。
本明細書における用語の定義を以下に記すが、以下の定義は本発明の範囲を限定するものではない。
本明細書において「誤りがち（ＤＮＡ）修復経路」とは、細胞の有する様々なＤＮＡ修復機構のうち、例えば、非相同末端再結合、代替非相同末端再結合、マイクロホモロジー媒介末端結合、ＤＮＡ鎖切断誘発複製及び一本鎖アニーリング（ＳＳＡ）を介した修復経路を指し、より好ましくは、一本鎖アニーリング（ＳＳＡ）を介した修復経路である。
その他の本明細書で使用する用語は、特に言及しない限り、当該技術分野で通常用いられる意味で用いることができる。
２．本発明の剤及び併用剤
本発明は、（１）白金製剤を用いた化学療法又は放射線療法と併用される、ＳＳＡ阻害剤を含むがん細胞増殖抑制剤、及び（２）白金製剤を用いた化学療法又は放射線療法と併用される、ＳＳＡ阻害剤を含む、該化学療法又は放射線療法に起因する晩期障害低減剤を提供する。
本発明のがん細胞増殖抑制剤、及び晩期障害低減剤は、対象への白金製剤の投与後、又は放射線の照射後、該対象におけるがん細胞中のＳＳＡの活性化前、又は活性化時に投与されることを特徴とする。
本発明は、（１）白金製剤を用いた化学療法又は放射線療法と併用される、ＳＳＡ阻害剤を含むがん細胞増殖抑制剤、及び（２）白金製剤を用いた化学療法又は放射線療法と併用される、ＳＳＡ阻害剤を含む、該化学療法又は放射線療法に起因する晩期障害低減剤を提供する。
本発明のがん細胞増殖抑制剤、及び晩期障害低減剤は、対象への白金製剤の投与後、又は放射線の照射後、該対象におけるがん細胞中のＳＳＡの活性化前、又は活性化時に投与されることを特徴とする。
また、本発明は、（３）白金製剤とＳＳＡ阻害剤とを組み合わせてなる併用剤を提供し、該ＳＳＡ阻害剤が、対象への該白金製剤の投与後、前記対象におけるがん細胞中のＳＳＡの活性化前、又は活性化時に投与されることを特徴とする。
本発明の併用剤は、白金製剤とＳＳＡ阻害剤とを合剤として単一の製剤に製剤化することもできるが、白金製剤とＳＳＡ阻害剤とが別々に製剤化されることが好ましい。
本発明の併用剤は、がん細胞増殖抑制剤、又は白金製剤の投与に起因する晩期障害低減剤として適している。
本発明の併用剤は、白金製剤とＳＳＡ阻害剤とを合剤として単一の製剤に製剤化することもできるが、白金製剤とＳＳＡ阻害剤とが別々に製剤化されることが好ましい。
本発明の併用剤は、がん細胞増殖抑制剤、又は白金製剤の投与に起因する晩期障害低減剤として適している。
本発明の「化学療法」とは、具体的にはがんの化学療法を意味し、抗がん剤によるがんの治療全般を指す。
本発明の「白金製剤」とは、白金錯体に分類される抗がん剤を指し、具体的には、例えば、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、ネダプラチンが挙げられるが、好ましくは、シスプラチンである。
本発明の「放射線療法」とは、対象の悪性腫瘍部に放射線を照射してがん細胞の増殖を抑制することを目的とした治療であり、その治療に使用される放射線としては、Ｘ線、電子線、γ線、粒子線などが挙げられる。また本発明の放射線療法では、がん細胞の致死量に近い放射線量を照射してもよく、また致死量未満の放射線量を照射してもよく、具体的には、局所的照射や反復照射を含めれば、例えば、０．０１ｍＧｙ〜１００Ｇｙ／日の範囲であってもよい。
本発明の「ＳＳＡ阻害剤」は、本明細書中に記載の「誤りがち修復経路阻害剤」と互換的に使用され、ＳＳＡの活性化を減弱、又は消失させて、ＳＳＡを介したＤＮＡ修復を抑制することができる剤を指す。具体的には、例えば、Ｒａｄ５２阻害剤が挙げられ、より具体的には、例えば、（−）エピカテキン、（−）エピガロカテキン（以下、ＥＧＣと略記する場合がある）、（−）エピカテキンガレート、（−）エピガロカテキンガレート、5-アミノ-1-((2R,3R,4S,5R)-3,4-ジヒドロキシ-5-(ヒドロキシメチル)-テトラヒドロフラン-2-イル)-1H-イミダゾール-4-カルボキサミド（以下、ＡＩＣＡＲと略記する場合がある）が挙げられる。本発明では、（−）エピガロカテキン、又は5-アミノ-1-((2R,3R,4S,5R)-3,4-ジヒドロキシ-5-(ヒドロキシメチル)-テトラヒドロフラン-2-イル)-1H-イミダゾール-4-カルボキサミドが好ましい。また、ここで「ＳＳＡの活性化」とは、化学療法、放射線療法等により、細胞においてＳＳＡによるＤＮＡ修復が亢進することを指す。
本発明の「対象」とは、ヒトを始めとする哺乳動物であり、哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等のげっ歯類やウサギ等の実験動物、ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ、ミンク等の家畜、イヌ、ネコ等のペット、ヒト、サル、カニクイザル、アカゲザル、マーモセット、オランウータン、チンパンジー、ゴリラなどの霊長類等が挙げられる。
本発明の「がん」とは、悪性腫瘍全般を指す。本発明の剤及び併用剤が適用可能な悪性腫瘍の種類としては、例えば、星細胞腫、悪性の髄芽腫、胚細胞腫瘍、頭蓋咽頭腫及び上衣腫からなる群から選ばれる小児の脳腫瘍；グリオーマ、神経膠腫、髄膜腫、下垂体腺腫及び神経鞘腫からなる群から選ばれる成人の脳腫瘍；上顎洞癌、咽頭癌（例えば、上咽頭癌、中咽頭癌、下咽頭癌）、喉頭癌、口腔癌、口唇癌、舌癌及び耳下腺癌からなる群から選ばれる頭頚部癌；小細胞肺癌、非小細胞肺癌、胸腺腫及び中皮腫からなる群から選ばれる胸部癌及び腫瘍；食道癌、肝臓癌、原発性肝癌、胆嚢癌、胆管癌、胃癌、大腸癌、結腸癌、直腸癌、肛門癌、膵癌及び膵内分泌腫瘍からなる群から選ばれる消化器癌及び腫瘍；陰茎癌、腎盂・尿管癌、腎細胞癌、精巣腫瘍（睾丸腫瘍とも称される）、前立腺癌、膀胱癌、ウイルムス腫瘍及び尿路上皮癌からなる群から選ばれる泌尿器癌及び腫瘍；外陰癌、子宮頸部癌、子宮体部癌、子宮内膜癌、子宮肉腫、絨毛癌、膣癌、乳癌、卵巣癌及び卵巣胚細胞腫瘍からなる群から選ばれる婦人科癌及び腫瘍；成人及び小児の軟部肉腫；骨肉腫及びユーイング腫瘍からなる群から選ばれる骨の腫瘍；副腎皮質癌及び甲状腺癌からなる群から選ばれる内分泌組織の癌及び腫瘍；悪性リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、ホジキン病、多発性骨髄腫、形質細胞性腫瘍、急性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、成人Ｔ細胞白血病リンパ腫、慢性骨髄性白血病及び慢性リンパ性白血病からなる群から選ばれる悪性リンパ腫及び白血病；又は、慢性骨髄増殖性疾患、悪性黒色腫、有棘細胞癌、基底細胞癌及び菌状息肉症からなる群から選ばれる皮膚の癌及び腫瘍が挙げられる。
本発明の「Ｒａｄ５２因子を含むＳＳＡ活性が増加するがん細胞」とは、例えば、化学療法や放射線療法などに起因してＲａｄ５２因子を含むＳＳＡ活性が増加するがん細胞、及びこれらの治療とは無関係にＲａｄ５２因子を含むＳＳＡ活性が増加するがん細胞を意味するが、好ましくは、化学療法や放射線療法などに起因してＲａｄ５２因子を含むＳＳＡ活性が増加するがん細胞である。また、「化学療法や放射線療法などに起因してＲａｄ５２因子を含むＳＳＡ活性が増加するがん細胞」とは、化学療法や放射線療法前にＳＳＡが活性化されていてもされていなくてもよく、活性化されている場合、化学療法や放射線療法後にその活性がさらに増加されるがん細胞を意味する。Ｒａｄ５２因子を含むＳＳＡ活性が増加するがん細胞としては、例えば、ＲＥＣＱＬ４欠損がん細胞、ＢＲＣＡ１及び／又はＢＲＣＡ２欠損がん細胞、ＡＰＣ欠損がん細胞などが挙げられるが、これらに限定されない。
本発明の「ＲＥＣＱＬ４欠損がん細胞」とは、ＲＥＣＱＬ４遺伝子に変異を有し、その結果、ＲＥＱＣＬ４タンパク質が正常な機能を有しないがん細胞、特に、ＲＥＱＣＬ４のヘリカーゼ活性が喪失しているがん細胞を指す。また、ＲＥＣＱＬ４欠損がんとしては、例えば、骨肉腫やリンパ腫や皮膚がんなどが挙げられるが(Wang, Am J Med Genet, 2001, 102, 11-17; Siitonen, Eur J Hum Genet, 2009, 17, 151-158)、これらに限定されない。
本発明の「ＢＲＣＡ１及び／又はＢＲＣＡ２欠損がん細胞」及び「ＡＰＣ欠損がん細胞」とは、ＢＲＣＡ１遺伝子及び／又はＢＲＣＡ２遺伝子変異による乳がんや卵巣がん細胞、ＡＰＣ遺伝子変異による家族性大腸腺腫症細胞が挙げられるが、これらに限定されない。
本発明の「化学療法又は放射線療法に起因する晩期障害」とは、化学療法や放射線療法などによる治療が終了してから、数か月から数十年経過した後に生じる健康上の問題を意味し、例えば、二次性発がん、転移、内分泌障害、運動障害などが挙げられる。また、「二次性発がん」とは、抗がん剤や放射線による細胞の障害のために、治療を終えた数か月から数十年後に、もとの病気とは別の種類のがんや白血病を生じることを指す。
本発明のがん細胞増殖抑制剤、及び晩期障害低減剤の投与時期について、該剤は、対象への白金製剤の投与時、又は放射線の照射時に一緒に投与してもよいが、対象への白金製剤の投与後、又は放射線の照射後、対象におけるがん細胞中のＳＳＡの活性化前、又は活性化時に投与することが好ましい。具体的には、対象への白金製剤の投与後、又は放射線の照射後２日以内が好ましく、８〜４４時間以内がより好ましく、１６〜４０時間以内がさらに好ましく、２０〜３６時間以内が特に好ましい。
本発明の併用剤の投与時期について、対象への該併用剤における白金製剤及びＳＳＡ阻害剤を同時に投与してもよいが、対象への該併用剤における白金製剤の投与後、対象におけるがん細胞中のＳＳＡの活性化前、又は活性化時に、該併用剤におけるＳＳＡ阻害剤を投与することが好ましい。具体的には、対象への白金製剤の投与後、又は放射線の照射後２日以内が好ましく、８〜４４時間以内がより好ましく、１６〜４０時間以内がさらに好ましく、２０〜３６時間以内が特に好ましい。
本発明のがん細胞増殖抑制剤、及び晩期障害低減剤は、後述の実施例に示すように、特に上記所定の時期に対象に投与されることで、抗がん剤や放射線処理後に、がん細胞がＳＳＡを活性化して生存しようとするメカニズムを特異的に阻害し、結果、がん細胞の増殖を抑制し、さらに抗がん剤や放射線処理によって誘導されるＤＮＡ修復、ＤＮＡ複製、及びＤＮＡ組換えの誤りの蓄積による遺伝的不安定性に起因する晩期障害も低減することができ、長期的かつ副作用が無い状態でのがんの治療効果が期待できる。
本発明の併用剤は、後述の実施例に示すように、特に上記該併用剤における白金製剤の対象への投与後の所定の期間内に、該併用剤におけるＳＳＡ阻害剤を投与することで、がん細胞がＳＳＡを活性化して生存しようとするメカニズムを特異的に阻害し、結果、がん細胞の増殖を抑制し、さらに抗がん剤や放射線処理によって誘導されるＤＮＡ複製の誤りの蓄積による遺伝的不安定性に起因する晩期障害も低減することができ、長期的かつ副作用が無い状態でのがんの治療効果が期待できる。
本発明のがん細胞増殖抑制剤、晩期障害低減剤、及び併用剤の投与時期以外の他の使用条件等は、特に制限されず、例えば、投与対象、投与経路、疾患の程度等に応じて、投与形態、投与方法、投与量等を適宜設定することができ、具体的には、例えば、以下のように例示される。
本発明のがん細胞増殖抑制剤、晩期障害低減剤、及び併用剤は、それ自体公知の方法で、例えば、慣用的な混合、造粒、コーティング、可溶化、凍結乾燥等の工程を用いて製造することができる。
また、本発明のがん細胞増殖抑制剤、晩期障害低減剤、及び併用剤は、任意の医薬的に許容される担体、例えば、慣用の各種有機又は無機担体物質を含んでもよく、例えば、固形製剤における賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤、あるいは液状製剤における溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤、無痛化剤等が挙げられる。
さらに、本発明のがん細胞増殖抑制剤、晩期障害低減剤、及び併用剤は、必要に応じて、通常の防腐剤、抗酸化剤、着色剤、甘味剤、吸着剤、湿潤剤等の添加物を適宜、適量含んでもよい。
賦形剤としては、例えば、乳糖、ショ糖、Ｄ−マンニトール、デンプン、コーンスターチ、結晶セルロース、軽質無水ケイ酸等が挙げられる。
滑沢剤としては、例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、タルク、コロイドシリカ等が挙げられる。
結合剤としては、例えば、結晶セルロース、ショ糖、Ｄ−マンニトール、デキストリン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、デンプン、ゼラチン、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム等が挙げられる。
崩壊剤としては、例えば、デンプン、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、カルボキシメチルスターチナトリウム、Ｌ−ヒドロキシプロピルセルロース等が挙げられる。
溶剤としては、例えば、注射用水、アルコール、プロピレングリコール、マクロゴール、ゴマ油、トウモロコシ油、オリーブ油等が挙げられる。
溶解補助剤としては、例えば、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、Ｄ−マンニトール、安息香酸ベンジル、エタノール、トリスアミノメタン、コレステロール、トリエタノールアミン、炭酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム等が挙げられる。
懸濁化剤としては、例えば、ステアリルトリエタノールアミン、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリルアミノプロピオン酸、レシチン、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、モノステアリン酸グリセリン等の界面活性剤；例えばポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース等の親水性高分子等が挙げられる。
等張化剤としては、例えば、ブドウ糖、Ｄ−ソルビトール、塩化ナトリウム、グリセリン、Ｄ−マンニトール等が挙げられる。
緩衝剤としては、例えば、リン酸塩、酢酸塩、炭酸塩、クエン酸塩等の緩衝液等が挙げられる。
無痛化剤としては、例えば、ベンジルアルコール等が挙げられる。
防腐剤としては、例えば、パラオキシ安息香酸エステル類、クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェネチルアルコール、デヒドロ酢酸、ソルビン酸等が挙げられる。
抗酸化剤としては、例えば、亜硫酸塩、アスコルビン酸、α−トコフェロール等が挙げられる。
滑沢剤としては、例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、タルク、コロイドシリカ等が挙げられる。
結合剤としては、例えば、結晶セルロース、ショ糖、Ｄ−マンニトール、デキストリン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、デンプン、ゼラチン、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム等が挙げられる。
崩壊剤としては、例えば、デンプン、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、カルボキシメチルスターチナトリウム、Ｌ−ヒドロキシプロピルセルロース等が挙げられる。
溶剤としては、例えば、注射用水、アルコール、プロピレングリコール、マクロゴール、ゴマ油、トウモロコシ油、オリーブ油等が挙げられる。
溶解補助剤としては、例えば、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、Ｄ−マンニトール、安息香酸ベンジル、エタノール、トリスアミノメタン、コレステロール、トリエタノールアミン、炭酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム等が挙げられる。
懸濁化剤としては、例えば、ステアリルトリエタノールアミン、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリルアミノプロピオン酸、レシチン、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、モノステアリン酸グリセリン等の界面活性剤；例えばポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース等の親水性高分子等が挙げられる。
等張化剤としては、例えば、ブドウ糖、Ｄ−ソルビトール、塩化ナトリウム、グリセリン、Ｄ−マンニトール等が挙げられる。
緩衝剤としては、例えば、リン酸塩、酢酸塩、炭酸塩、クエン酸塩等の緩衝液等が挙げられる。
無痛化剤としては、例えば、ベンジルアルコール等が挙げられる。
防腐剤としては、例えば、パラオキシ安息香酸エステル類、クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェネチルアルコール、デヒドロ酢酸、ソルビン酸等が挙げられる。
抗酸化剤としては、例えば、亜硫酸塩、アスコルビン酸、α−トコフェロール等が挙げられる。
本発明のがん細胞増殖抑制剤、晩期障害低減剤、及び併用剤の投与形態としては、液剤、錠剤、丸剤、飲用液剤、散剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤、エキス剤、細粒剤、シロップ剤、浸剤、煎剤、点眼剤、トローチ剤、パップ剤、リニメント剤、ローション剤、眼軟膏剤、硬膏剤、カプセル剤（ソフトカプセルを含む）、坐剤、浣腸剤、注射剤（液剤、懸濁剤など）、貼付剤、軟膏剤、ゼリー剤、パスタ剤、吸入剤、クリーム剤、スプレー剤、点鼻剤、エアゾール剤、徐放性製剤（例えば、徐放性マイクロカプセル剤）、速放性製剤などが挙げられ、好ましくは、ＳＳＡ活性化の阻害効果が最も期待できるタイミングに長時間効力を持続させることができる徐放製剤である。
本発明のがん細胞増殖抑制剤、晩期障害低減剤、及び併用剤は、その使用に際し、各種形態に応じた方法で安全に投与される。例えば、外用剤の場合には、皮膚、粘膜などの所要部位に直接噴霧、貼付又は塗布され、錠剤、丸剤、飲用液剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤及びカプセル剤等の場合には経口投与され、注射剤の場合には静脈内、筋肉内、皮内、皮下、関節腔内、腹腔内若しくは腫瘍組織内に投与され、坐剤の場合には直腸内投与される。
本発明の併用剤について、白金製剤とＳＳＡ阻害剤とが別々に製剤化される場合、それぞれの製剤が同一の方法で投与されてもよく、またそれぞれの製剤が異なる方法で投与されてもよい。
本発明のがん細胞増殖抑制剤、及び晩期障害低減剤中に含まれるＳＳＡ阻害剤の含有量は、通常製剤全体に対して、約０．０１〜１００重量％、好ましくは、約０．１〜５０重量％程度である。
また、本発明の併用剤について、該併用剤における白金製剤、及びＳＳＡ阻害剤の含有量は、通常製剤全体に対して、それぞれ、約０．０１〜１００重量％、好ましくは、約０．１〜５０重量％程度である。
本発明のがん細胞増殖抑制剤、晩期障害低減剤、及び併用剤に含むことができる医薬的に許容される担体等の添加剤の含有量は、製剤の形態によって相違するが、通常製剤全体に対して、約１〜９９．９９重量％、好ましくは約１０〜９０重量％程度である。
本発明のがん細胞増殖抑制剤、晩期障害低減剤、及び併用剤の投与量は、有効成分の活性や種類、投与様式（例えば、経口、非経口）、疾患の程度、投与対象となる動物種、投与対象の薬物受容性、体重、年齢等に応じて適宜選択することができる。
例えば、本発明のがん細胞増殖抑制剤、及び晩期障害低減剤の投与量は、成人（体重６０ｋｇ）１日あたり、該剤中に含まれるＳＳＡ阻害剤、例えば（−）エピガロカテキンが、通常、５ｍｇ〜１０００ｍｇ程度、好ましくは５０ｍｇ〜１００ｍｇ程度であり、また例えば、5-アミノ-1-((2R,3R,4S,5R)-3,4-ジヒドロキシ-5-(ヒドロキシメチル)-テトラヒドロフラン-2-イル)-1H-イミダゾール-4-カルボキサミドが、通常、２０ｍｇ〜２０ｇ程度、好ましくは２００ｍｇ〜２０００ｍｇ程度である。
また、例えば、本発明の併用剤の投与量は、成人（体重６０ｋｇ）１日あたり、該併用剤における白金製剤、例えば、シスプラチンが、通常、１ｍｇ〜１０００ｍｇ程度、好ましくは、１０ｍｇ〜１００ｍｇ程度であり、そして該併用剤におけるＳＳＡ阻害剤、例えば、（−）エピガロカテキンが、通常、５ｍｇ〜１０００ｍｇ程度、好ましくは、５０ｍｇ〜１００ｍｇ程度であり、また例えば、5-アミノ-1-((2R,3R,4S,5R)-3,4-ジヒドロキシ-5-(ヒドロキシメチル)-テトラヒドロフラン-2-イル)-1H-イミダゾール-4-カルボキサミドが、通常、２０ｍｇ〜２０ｇ程度、好ましくは、２００ｍｇ〜２０００ｍｇ程度である。
上述の白金製剤、及びＳＳＡ阻害剤の量は、１日１回〜３回に分けて投与することができる。また、複数回のシスプラチン処理や放射線照射を行う場合は、その都度、本明細書中に記載の用法と用量で、ＳＳＡ阻害剤を投与することが好ましい。
なお、上記は、剤及び併用剤を例に本発明を説明したが、本発明のがんを治療し、かつ化学療法及び／又は放射線療法に起因する副作用を低減するための方法の場合にも、上記はそのまま援用される。
以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
（材料及び方法）
実施例１：細胞培養
ＨＣＴ１１６細胞を、５６℃、３０分間の処理で熱不活性化させたウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Sigma, Cat. No. 172012）を１０％、及び１００Ｕ／ｍｌ ペニシリン＋０．１ｍｇ／ｍｌ ストレプトマイシン（Wako, Cat. No. 168-23191）を１％含んだダルベッコ改変イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ）（Wako, Cat. No. 043-30085）培養液中で、加湿３７℃インキュベーターを用いて培養した。
実施例１：細胞培養
ＨＣＴ１１６細胞を、５６℃、３０分間の処理で熱不活性化させたウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Sigma, Cat. No. 172012）を１０％、及び１００Ｕ／ｍｌ ペニシリン＋０．１ｍｇ／ｍｌ ストレプトマイシン（Wako, Cat. No. 168-23191）を１％含んだダルベッコ改変イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ）（Wako, Cat. No. 043-30085）培養液中で、加湿３７℃インキュベーターを用いて培養した。
ＭＣＦ１０Ａ細胞の培養を、５６℃、３０分間の処理で熱不活性化させたウマ血清（Bioconcept, Cat. No. 205F00I）、１μＭ デキサメタゾン（Sigma, Cat. No. D8893）、５μｇ／ｍｌ インスリン（Sigma, Cat. No. I9278）、ヒトＥＧＦ １０ｎｇ／ｍｌ（Sigma, Cat. No. E9644）、及び１００Ｕ／ｍｌ ペニシリン＋０．１ｍｇ／ｍｌ ストレプトマイシン（Wako, 168-23191）を１％含んだダルベッコ改変イーグル培地‐Ｆ１２（ＤＭＥＭ／Ｆ１２）（Wako, Cat. No. 048-29785）培養液中で、加湿３７℃インキュベーターを用いて培養した（Costantinoら, Science, 2014, 343, 88-91）。
実施例２：ベクター構築
ＲｅｃＱＬ４タンパク質の４９３番目のアミノ酸部位にストップコドンを導入して、ＲＥＣＱＬ４ノックインベクターを構築した（Kohzakiら, Carcinogenesis, 2012, 33, 1203-1210）。全長ＲｅｃＱＬ４ｃＤＮＡを、ｐＡｐｕｒｏベクターのＥｃｏＲＩ部位に挿入し、ＲｅｃＱＬ４タンパク質発現ベクターを作製した（Takataら, EMBO J, 1994, 13, 1341-1349）。ＲｅｃＱＬ４タンパク質の発現に関しては、Ａｍａｘａ ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ ２ｂによるトランスフェクション（Lonza, Nucleofector kit V, Cat. No. VCA-1003; program, D-032）、Ｘ‐ｔｒｅｍｅＧＥＮＥ ＨＰ ＤＮＡ（Roche, Cat. No. 6366244001）、及びＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＬＴＸ ｗｉｔｈ ＰＬＵＳ Ｒｅａｇｅｎｔ（Thermo Fisher Scientific, Cat. No. 15338100）を用いて一過性に発現させて、発現量をウェスタンブロッティング法によって定量した。
ＲｅｃＱＬ４タンパク質の４９３番目のアミノ酸部位にストップコドンを導入して、ＲＥＣＱＬ４ノックインベクターを構築した（Kohzakiら, Carcinogenesis, 2012, 33, 1203-1210）。全長ＲｅｃＱＬ４ｃＤＮＡを、ｐＡｐｕｒｏベクターのＥｃｏＲＩ部位に挿入し、ＲｅｃＱＬ４タンパク質発現ベクターを作製した（Takataら, EMBO J, 1994, 13, 1341-1349）。ＲｅｃＱＬ４タンパク質の発現に関しては、Ａｍａｘａ ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ ２ｂによるトランスフェクション（Lonza, Nucleofector kit V, Cat. No. VCA-1003; program, D-032）、Ｘ‐ｔｒｅｍｅＧＥＮＥ ＨＰ ＤＮＡ（Roche, Cat. No. 6366244001）、及びＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＬＴＸ ｗｉｔｈ ＰＬＵＳ Ｒｅａｇｅｎｔ（Thermo Fisher Scientific, Cat. No. 15338100）を用いて一過性に発現させて、発現量をウェスタンブロッティング法によって定量した。
実施例３：Ｃａｓ９‐ＣＲＩＳＰＲ技術によるノックイン細胞樹立
Ｃａｓ９‐ＣＲＩＳＰＲ技術を用いて（Congら, Science, 2013, 339, 819-823）、ＲＥＣＱＬ４遺伝子ｅｘｏｎ６を標的としたｓｇＲＮＡ1と、ｅｘｏｎ９を標的としたｓｇＲＮＡ２作製用のプライマー対を用いた。
Ｃａｓ９‐ＣＲＩＳＰＲ技術を用いて（Congら, Science, 2013, 339, 819-823）、ＲＥＣＱＬ４遺伝子ｅｘｏｎ６を標的としたｓｇＲＮＡ1と、ｅｘｏｎ９を標的としたｓｇＲＮＡ２作製用のプライマー対を用いた。
０．５ｇ Ｃａｓ９ ｓｇＲＮＡ１、０．５ ｇ Ｃａｓ９ ｓｇＲＮＡ２と、制限酵素ＰｖｕＩで直鎖状にした１ｇ ＲＥＱＬ４ノックインコンストラクトの、計２ｇのＤＮＡを用いて、１×１０６個のＨＣＴ１１６細胞に対してＡｍａｘａ ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ ２ｂによるトランスフェクションを行った（Lonza, Nucleofector kit V, Cat. No. VCA-1003; program, D-032）。２４時間後に、６ｇ／ｍｌ、又は１０ｇ／ｍｌ濃度のブラストサイジン（Bsr; Wako, Cat. No. 029-18701）培地を９６穴プレートで培養することで、単一クローンを樹立した。２及び３週間後に、薬剤耐性単一コロニーを増幅させて、スクリーニングによってノックイン細胞を樹立した。
実施例４：コロニー形成法
薬剤や放射線の感受性を、コロニー形成法で決定した。ＨＣＴ１１６細胞を、３ｍｌ（６穴プレート）、１ｍｌ（１２穴プレート）、及び０．５ｍｌ（２４穴プレート）の培養液が入ったプレートに播種し、接着させた。翌日、接着させた細胞に、シスプラチン／ＣＤＤＰ／ｃｉｓ‐ジアミンジクロロ‐白金（ＩＩ）；ＣＡＳ １５６６３‐２７‐１（１０〜２０ｇ／ｍｌ）（Wako, Cat No. 033-20091）を添加し、２時間、３７℃インキュベーターで培養し、ＰＢＳで洗浄した後、通常培地を加えた。放射線照射を、１３７Ｃｓ Ｇａｍｍａｃｅｌｌ ４０ Ｅｘａｃｔｏｒ (０．７Ｇｙ／分；ＭＤＳ Ｎｏｒｄｉｏｎ)を用いて行った。いずれも約２週間程度培養後に、コロニーをメタノールで固定した後、ギムザ染色し、コロニーの数をカウントした。
薬剤や放射線の感受性を、コロニー形成法で決定した。ＨＣＴ１１６細胞を、３ｍｌ（６穴プレート）、１ｍｌ（１２穴プレート）、及び０．５ｍｌ（２４穴プレート）の培養液が入ったプレートに播種し、接着させた。翌日、接着させた細胞に、シスプラチン／ＣＤＤＰ／ｃｉｓ‐ジアミンジクロロ‐白金（ＩＩ）；ＣＡＳ １５６６３‐２７‐１（１０〜２０ｇ／ｍｌ）（Wako, Cat No. 033-20091）を添加し、２時間、３７℃インキュベーターで培養し、ＰＢＳで洗浄した後、通常培地を加えた。放射線照射を、１３７Ｃｓ Ｇａｍｍａｃｅｌｌ ４０ Ｅｘａｃｔｏｒ (０．７Ｇｙ／分；ＭＤＳ Ｎｏｒｄｉｏｎ)を用いて行った。いずれも約２週間程度培養後に、コロニーをメタノールで固定した後、ギムザ染色し、コロニーの数をカウントした。
実施例５：ウェスタンブロッティング法
従来のウェスタンブロッティング法を用いて(Laemmli, Nature, 1970, 227, 680-5)、以下の抗体：ｍｏｕｓｅ ａｎｔｉ‐α‐Ａｃｔｉｎｉｎ（1/2000, Millipore, clone AT6/172, Cat. No. 05-384）、ｍｏｕｓｅ ａｎｔｉ‐β‐Ｔｕｂｕｌｉｎ（1/2000, Wako, Cat. No. 014-25041）、ｒａｂｂｉｔ ａｎｔｉ‐Ｒａｄ５１（1/2000, Bioacademia, Cat. No. 70-001）、ｍｏｕｓｅ ａｎｔｉ‐Ｒａｄ５１（1/1000, GeneTex, 14B4, Cat. No. GTX70230）、ｍｏｕｓｅ ａｎｔｉ‐ｐｈｏｓｐｈｏ‐Ｈｉｓｔｏｎｅ Ｈ２Ａ．Ｘ（Ser139）（1/2000, Millipore, clone JBW301, Cat. No. 05-636）、ｒａｂｂｉｔ ａｎｔｉ‐Ｒａｄ５２（1/1000, SantaCruz, H-300, Cat. No. sc-8350）、ｒａｂｂｉｔ ａｎｔｉ‐Ｒａｄ５２（1/1000, Abcam, Cat. No. ab103067）、ｒａｂｂｉｔ ａｎｔｉ‐ＲＰＡ３２（1/1000, GeneTex, Cat. No. GTX70258）、ｒａｂｂｉｔ ａｎｔｉ‐ＲｅｃＱＬ４（1/1000, Novus, Cat. No. 25470002）、ｒａｂｂｉｔ ａｎｔｉ‐Ｈｉｓｔｏｎｅ Ｈ３（1/2000, Cell Signaling, Cat. No. 9715）を使用して、それぞれのタンパク質量を定量した。
従来のウェスタンブロッティング法を用いて(Laemmli, Nature, 1970, 227, 680-5)、以下の抗体：ｍｏｕｓｅ ａｎｔｉ‐α‐Ａｃｔｉｎｉｎ（1/2000, Millipore, clone AT6/172, Cat. No. 05-384）、ｍｏｕｓｅ ａｎｔｉ‐β‐Ｔｕｂｕｌｉｎ（1/2000, Wako, Cat. No. 014-25041）、ｒａｂｂｉｔ ａｎｔｉ‐Ｒａｄ５１（1/2000, Bioacademia, Cat. No. 70-001）、ｍｏｕｓｅ ａｎｔｉ‐Ｒａｄ５１（1/1000, GeneTex, 14B4, Cat. No. GTX70230）、ｍｏｕｓｅ ａｎｔｉ‐ｐｈｏｓｐｈｏ‐Ｈｉｓｔｏｎｅ Ｈ２Ａ．Ｘ（Ser139）（1/2000, Millipore, clone JBW301, Cat. No. 05-636）、ｒａｂｂｉｔ ａｎｔｉ‐Ｒａｄ５２（1/1000, SantaCruz, H-300, Cat. No. sc-8350）、ｒａｂｂｉｔ ａｎｔｉ‐Ｒａｄ５２（1/1000, Abcam, Cat. No. ab103067）、ｒａｂｂｉｔ ａｎｔｉ‐ＲＰＡ３２（1/1000, GeneTex, Cat. No. GTX70258）、ｒａｂｂｉｔ ａｎｔｉ‐ＲｅｃＱＬ４（1/1000, Novus, Cat. No. 25470002）、ｒａｂｂｉｔ ａｎｔｉ‐Ｈｉｓｔｏｎｅ Ｈ３（1/2000, Cell Signaling, Cat. No. 9715）を使用して、それぞれのタンパク質量を定量した。
実施例６：蛍光免疫染色法
カバーガラス（Matsunami Glass, Cat. No. C015001）を入れた１２穴プレートに、野生型とＲＥＣＱＬ４欠損ＨＣＴ１１６細胞を播種し、２日以上培養して接着させた。接着した細胞に放射線を照射して、２、８、及び２０時間後に、２％スクロース（Wako, Cat. No. 193-00025）と３％パラホルムアルデヒド（Wako, Cat. No. 160-16061）をＰＢＳで調整した溶液で、室温で１５分間固定した。室温で５分間、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ‐Ｘ１００（Wako, Cat. No. 160-24751）ＰＢＳ溶液で処理して細胞膜を透過させ、３０分間以上、１％ＢＳＡ（Roche, Fraction V, Cat. No. 10735078001）含有ＰＢＳ溶液で、ブロッキング処理を行った。蛍光免疫染色法で用いた一次抗体は、以下：ｒａｂｂｉｔ ａｎｔｉ‐Ｒａｄ５１（1/1000, Bioacademia, Cat. No. 70-001）、ｍｏｕｓｅ ａｎｔｉ‐Ｒａｄ５１（1/500, GeneTex, 14B4, Cat. No. GTX70230）、ｍｏｕｓｅ ａｎｔｉ‐ｐｈｏｓｐｈｏ‐Ｈｉｓｔｏｎｅ Ｈ２Ａ.Ｘ（Ser139）（1/1000, Millipore, clone JBW301, Cat. No. 05-636）、ｒａｂｂｉｔ ａｎｔｉ‐Ｒａｄ５２（1/500, SantaCruz, H-300, Cat. No. sc-8350）、ｒａｂｂｉｔ ａｎｔｉ‐Ｒａｄ５２（1/500, Abcam, Cat. No. ab103067）、ｒａｂｂｉｔ ａｎｔｉ‐ＲＰＡ３２（1/500, GeneTex, Cat. No. GTX70258）である。これらの一次抗体を室温で１時間反応させた後、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０（MP Biomedicals, Cat. No. 103168）含有ＰＢＳ（以下、ＰＢＳＴと略記する場合がある）で、５分間で３回洗浄した。次に、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５９４‐ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｇｏａｔ ａｎｔｉ‐ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ（1/2000, Thermo Fisher, Cat. No. A11037）と、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８‐ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｇｏａｔ ａｎｔｉ‐ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ（1/2000, Thermo Fisher, Cat. No. A11001）の二次抗体で、室温で４５分間反応させた後に、ＰＢＳＴで、５分間で２回洗浄した。最後に、ＤＡＰＩ（Dojindo, Cat. No. 342-07431）で染色し、ＰＢＳＴで、５分間で１回洗浄した後、Ｆｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔ‐Ｇ（Southern Biotech, Cat. No. 0100-01）で封入した。作製したサンプルを、Ｚｅｉｓｓ ＡｘｉｏＯｂｓｅｒｖｅｒ蛍光顕微鏡で観察し、各タンパク質のｆｏｃｉをカウントして解析した。
カバーガラス（Matsunami Glass, Cat. No. C015001）を入れた１２穴プレートに、野生型とＲＥＣＱＬ４欠損ＨＣＴ１１６細胞を播種し、２日以上培養して接着させた。接着した細胞に放射線を照射して、２、８、及び２０時間後に、２％スクロース（Wako, Cat. No. 193-00025）と３％パラホルムアルデヒド（Wako, Cat. No. 160-16061）をＰＢＳで調整した溶液で、室温で１５分間固定した。室温で５分間、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ‐Ｘ１００（Wako, Cat. No. 160-24751）ＰＢＳ溶液で処理して細胞膜を透過させ、３０分間以上、１％ＢＳＡ（Roche, Fraction V, Cat. No. 10735078001）含有ＰＢＳ溶液で、ブロッキング処理を行った。蛍光免疫染色法で用いた一次抗体は、以下：ｒａｂｂｉｔ ａｎｔｉ‐Ｒａｄ５１（1/1000, Bioacademia, Cat. No. 70-001）、ｍｏｕｓｅ ａｎｔｉ‐Ｒａｄ５１（1/500, GeneTex, 14B4, Cat. No. GTX70230）、ｍｏｕｓｅ ａｎｔｉ‐ｐｈｏｓｐｈｏ‐Ｈｉｓｔｏｎｅ Ｈ２Ａ.Ｘ（Ser139）（1/1000, Millipore, clone JBW301, Cat. No. 05-636）、ｒａｂｂｉｔ ａｎｔｉ‐Ｒａｄ５２（1/500, SantaCruz, H-300, Cat. No. sc-8350）、ｒａｂｂｉｔ ａｎｔｉ‐Ｒａｄ５２（1/500, Abcam, Cat. No. ab103067）、ｒａｂｂｉｔ ａｎｔｉ‐ＲＰＡ３２（1/500, GeneTex, Cat. No. GTX70258）である。これらの一次抗体を室温で１時間反応させた後、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０（MP Biomedicals, Cat. No. 103168）含有ＰＢＳ（以下、ＰＢＳＴと略記する場合がある）で、５分間で３回洗浄した。次に、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５９４‐ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｇｏａｔ ａｎｔｉ‐ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ（1/2000, Thermo Fisher, Cat. No. A11037）と、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８‐ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｇｏａｔ ａｎｔｉ‐ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ（1/2000, Thermo Fisher, Cat. No. A11001）の二次抗体で、室温で４５分間反応させた後に、ＰＢＳＴで、５分間で２回洗浄した。最後に、ＤＡＰＩ（Dojindo, Cat. No. 342-07431）で染色し、ＰＢＳＴで、５分間で１回洗浄した後、Ｆｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔ‐Ｇ（Southern Biotech, Cat. No. 0100-01）で封入した。作製したサンプルを、Ｚｅｉｓｓ ＡｘｉｏＯｂｓｅｒｖｅｒ蛍光顕微鏡で観察し、各タンパク質のｆｏｃｉをカウントして解析した。
実施例７：クロマチン分画の濃縮
ホルムアルデヒドによるクロスリンク処理を行わずに、クロマチン分画の濃縮方法を行った（Mendez及びStillman, MCB, 2000, 20, 8602-12; Petermannら, Mol Cell, 2010, 37, 492-502)。２×１０７個のＨＣＴ１１６細胞を集めて、該細胞を含む低張緩衝液（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７）（Wako, Cat. No. 340-08233）、５０ｍＭ ＮａＣｌ（Wako, Cat. No. 191-01665）、０．３Ｍスクロース、０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ‐１００、プロテアーゼ インヒビター カクテル（Roche, Cat. No. 05892791001））を、氷上で10分間処理して、１５００ｇで５分間遠心して細胞質タンパク質を除いた。
ホルムアルデヒドによるクロスリンク処理を行わずに、クロマチン分画の濃縮方法を行った（Mendez及びStillman, MCB, 2000, 20, 8602-12; Petermannら, Mol Cell, 2010, 37, 492-502)。２×１０７個のＨＣＴ１１６細胞を集めて、該細胞を含む低張緩衝液（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７）（Wako, Cat. No. 340-08233）、５０ｍＭ ＮａＣｌ（Wako, Cat. No. 191-01665）、０．３Ｍスクロース、０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ‐１００、プロテアーゼ インヒビター カクテル（Roche, Cat. No. 05892791001））を、氷上で10分間処理して、１５００ｇで５分間遠心して細胞質タンパク質を除いた。
次に、核緩衝液（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７）、２００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ（Wako, Cat. No. 311-90075）、０．５％ ＮＰ‐４０（Wako, Cat. No. 145-09701）、プロテアーゼ インヒビター カクテル）を、氷上で１０分間処理して、１３０００ｇで２分間遠心して核可溶分画タンパク質を除いた。ペレットに、溶解緩衝液（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７）、５００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１％ ＮＰ‐４０、プロテアーゼ インヒビター カクテル）を加えて、十分混合した後に低振幅(ｌｅｖｅｌ３)で超音波処理（TAITEC, VP-15S）を１０秒間で３回行い、１３０００ｇで３０秒間遠心後に、上清を新しいエッペンドルフチューブに移し、タンパク質量を、Ｌｏｗｒｙ法を基にしたＤＣプロテインアッセイ（BioRad, Cat. No. 5000116JA）で測定し、４０μｇ以下のタンパク質をウェスタンブロッティングに使用した。
実施例８：ＧＦＰレポーターを用いたＤＮＡ二本鎖切断修復アッセイ
誤りがち修復経路であるｓｉｎｇｌｅ‐ｓｔｒａｎｄ ａｎｎｅａｌｉｎｇを計測するために、ｈｐｒｔＳＡＧＦＰベクターを用いた（Addgene, Plasmid No. 41594）。野生型とＲＥＣＱＬ４欠損ＨＣＴ１１６細胞に、ＫｐｎＩ／ＳａｃＩで直線化したｈｐｒｔＳＡＧＦＰベクターをＡｍａｘａで導入し（Starkら, MCB, 2004, 24, 9305-9316）、２４時間後に、９６穴プレートにおけるピューロマイシン（Wako, Cat. No. 160-23151）含有培地で培養し、安定的にベクターを保持している数クローンを得た。その後、ｐＣＢＡＳｃｅＩベクター（Addgene, Plasmid No. 26477）で、Ｉ‐ＳｃｅＩを発現させてＧＦＰ陽性になるクローンを樹立し、これらの数クローンを用いて修復効率を定量した。
誤りがち修復経路であるｓｉｎｇｌｅ‐ｓｔｒａｎｄ ａｎｎｅａｌｉｎｇを計測するために、ｈｐｒｔＳＡＧＦＰベクターを用いた（Addgene, Plasmid No. 41594）。野生型とＲＥＣＱＬ４欠損ＨＣＴ１１６細胞に、ＫｐｎＩ／ＳａｃＩで直線化したｈｐｒｔＳＡＧＦＰベクターをＡｍａｘａで導入し（Starkら, MCB, 2004, 24, 9305-9316）、２４時間後に、９６穴プレートにおけるピューロマイシン（Wako, Cat. No. 160-23151）含有培地で培養し、安定的にベクターを保持している数クローンを得た。その後、ｐＣＢＡＳｃｅＩベクター（Addgene, Plasmid No. 26477）で、Ｉ‐ＳｃｅＩを発現させてＧＦＰ陽性になるクローンを樹立し、これらの数クローンを用いて修復効率を定量した。
実施例９：ｓｉＲＮＡ処理とＲａｄ５２阻害剤処理
ＡｌｌＳｔａｒｓ Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｉＲＮＡ（Qiagen, Cat. No. SI03650318）を、対照として用いた。Ｒａｄ５２のｓｉＲＮＡの配列情報は、ｓｉＲＮＡ#１；5'-GGAGUGACUCAAGAAUUAATT-3'（配列番号５）と、ｓｉＲＮＡ#２；5'-GGCCCAGAAUACAUAAGUATT-3'（配列番号６）であり、これら２つのｓｉＲＮＡを等量混合し、ＨｉＰｅｒＦｅｃｔ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Qiagen, Cat. No. 301704）で細胞に導入し、３６時間〜４８時間後に実験に用いた。Ｒａｄ５２阻害剤は、（−）エピガロカテキン（ＥＧＣ）；ＣＡＳ ９７０‐７４‐１（Tokyo Chemical Industry, Cat. No. E1084）と、5-アミノ-1-((2R,3R,4S,5R)-3,4-ジヒドロキシ-5-(ヒドロキシメチル)-テトラヒドロフラン-2-イル)-1H-イミダゾール-4-カルボキサミド（ＡＩＣＡＲ）；ＣＡＳ ２６２７‐６９‐２（Wako, Cat. No. 011-22533）を用いた。ＡＩＣＡＲ以外のＡＭＰＫ活性化剤は、直接活性化剤としてサリチレート（ｓａｌｉｃｙｌａｔｅ）；ＣＡＳ ５４‐２１‐７（Wako, Cat. No. 191-03142）、間接活性化剤として2-デオキシ-D-グルコース（以下、２ＤＧと略記する場合がある）；ＣＡＳ １５４‐１７‐６（Wako, Cat. No. 040-06481）を使用した。それぞれの薬剤についてＰＢＳ溶液を作製し、分注後に−３０℃で保存し、使用時に解凍することで、同じ条件の阻害剤溶液として用いた。
ＡｌｌＳｔａｒｓ Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｉＲＮＡ（Qiagen, Cat. No. SI03650318）を、対照として用いた。Ｒａｄ５２のｓｉＲＮＡの配列情報は、ｓｉＲＮＡ#１；5'-GGAGUGACUCAAGAAUUAATT-3'（配列番号５）と、ｓｉＲＮＡ#２；5'-GGCCCAGAAUACAUAAGUATT-3'（配列番号６）であり、これら２つのｓｉＲＮＡを等量混合し、ＨｉＰｅｒＦｅｃｔ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Qiagen, Cat. No. 301704）で細胞に導入し、３６時間〜４８時間後に実験に用いた。Ｒａｄ５２阻害剤は、（−）エピガロカテキン（ＥＧＣ）；ＣＡＳ ９７０‐７４‐１（Tokyo Chemical Industry, Cat. No. E1084）と、5-アミノ-1-((2R,3R,4S,5R)-3,4-ジヒドロキシ-5-(ヒドロキシメチル)-テトラヒドロフラン-2-イル)-1H-イミダゾール-4-カルボキサミド（ＡＩＣＡＲ）；ＣＡＳ ２６２７‐６９‐２（Wako, Cat. No. 011-22533）を用いた。ＡＩＣＡＲ以外のＡＭＰＫ活性化剤は、直接活性化剤としてサリチレート（ｓａｌｉｃｙｌａｔｅ）；ＣＡＳ ５４‐２１‐７（Wako, Cat. No. 191-03142）、間接活性化剤として2-デオキシ-D-グルコース（以下、２ＤＧと略記する場合がある）；ＣＡＳ １５４‐１７‐６（Wako, Cat. No. 040-06481）を使用した。それぞれの薬剤についてＰＢＳ溶液を作製し、分注後に−３０℃で保存し、使用時に解凍することで、同じ条件の阻害剤溶液として用いた。
実施例１０：シスプラチン誘導ゲノム欠失に対するＥＧＣ処理の効果の検討
ＨＣＴ１１６細胞間のゲノムの不均一性を排除するために、９６穴プレートを用いて一細胞が一穴に入るように細胞を播種し、３週間培養して一つの細胞を１ｘ１０６まで増やし、この細胞を対照ゲノムとして使用した。この対照細胞に対して、シスプラチン処理有/無を行い、９６穴プレートを用いて一細胞が一穴に入るように細胞を播種し、ＥＧＣ含有培地又は通常培地にて２週間培養した。２週間目にＥＧＣ含有培地を通常培地と交換し、計３週間培養して一つの細胞を１ｘ１０６まで増やし、これらの細胞を標的ゲノムとして用いて、対照ゲノムとの比較解析を行った（図７Ａ）。アレイＣＧＨ（comparative genomic hybridization; array）を、Ａｆｆｉｍｅｔｒｉｘ社のＣｙｔｏＳｃａｎ（登録商標）ＨＤ Ａｒｒａｙを使用し(徳島大学大学院 医歯薬学研究部 総合研究支援センター)、Ａｆｆｉｍｅｔｒｉｘ社の解析ソフトＣｙｔｏＳｃａｎ（登録商標）ＨＤ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｕｉｔｅ（ChAS）を用いて、一色法による比較解析を行った（図７Ｂ）。
ＨＣＴ１１６細胞間のゲノムの不均一性を排除するために、９６穴プレートを用いて一細胞が一穴に入るように細胞を播種し、３週間培養して一つの細胞を１ｘ１０６まで増やし、この細胞を対照ゲノムとして使用した。この対照細胞に対して、シスプラチン処理有/無を行い、９６穴プレートを用いて一細胞が一穴に入るように細胞を播種し、ＥＧＣ含有培地又は通常培地にて２週間培養した。２週間目にＥＧＣ含有培地を通常培地と交換し、計３週間培養して一つの細胞を１ｘ１０６まで増やし、これらの細胞を標的ゲノムとして用いて、対照ゲノムとの比較解析を行った（図７Ａ）。アレイＣＧＨ（comparative genomic hybridization; array）を、Ａｆｆｉｍｅｔｒｉｘ社のＣｙｔｏＳｃａｎ（登録商標）ＨＤ Ａｒｒａｙを使用し(徳島大学大学院 医歯薬学研究部 総合研究支援センター)、Ａｆｆｉｍｅｔｒｉｘ社の解析ソフトＣｙｔｏＳｃａｎ（登録商標）ＨＤ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｕｉｔｅ（ChAS）を用いて、一色法による比較解析を行った（図７Ｂ）。
実施例１１：ＢＡＬＢ／ｃＡＪｃｌ‐ｎｕ／ｎｕマウスを用いたＸｅｎｏｇｒａｆｔ実験
マウス実験を、産業医科大学によって承認された動物実験計画承認申請書（ＡＥ１５‐０１６）に基づいて行った。対数増殖している３×１０６個の野生型、ＲＥＣＱＬ４欠損、及びｐ５３欠損ＨＣＴ１１６細胞を、それぞれ遠心分離して回収し、ＰＢＳで洗浄後、１００μｌ ＰＢＳで細胞ペレットを氷上で充分懸濁した。氷上のまま等量の１００μｌ マトリゲル（Matrigel）（登録商標）（Corning, Cat. No. 356234）を加えて充分懸濁し、１：１の投与用細胞溶液を作製した。６〜８週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃＡＪｃｌ‐ｎｕ／ｎｕマウス（CLEA Japan）の左右の横腹に計２か所、氷上に置いておいた投与用細胞溶液を皮下投与した（Buzzaiら, Cancer Res, 2007, 67, 6745-52）。マウスの体重を１週間に１回計測し、がん容量（ｍｍ３）を１週間に２回計測した。がん容量（ｍｍ３）を、ｄを最小直径、Ｄを最大直径として、ｄ２×Ｄ／２（≒６／π）の計算式を用いて計算した。
マウス実験を、産業医科大学によって承認された動物実験計画承認申請書（ＡＥ１５‐０１６）に基づいて行った。対数増殖している３×１０６個の野生型、ＲＥＣＱＬ４欠損、及びｐ５３欠損ＨＣＴ１１６細胞を、それぞれ遠心分離して回収し、ＰＢＳで洗浄後、１００μｌ ＰＢＳで細胞ペレットを氷上で充分懸濁した。氷上のまま等量の１００μｌ マトリゲル（Matrigel）（登録商標）（Corning, Cat. No. 356234）を加えて充分懸濁し、１：１の投与用細胞溶液を作製した。６〜８週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃＡＪｃｌ‐ｎｕ／ｎｕマウス（CLEA Japan）の左右の横腹に計２か所、氷上に置いておいた投与用細胞溶液を皮下投与した（Buzzaiら, Cancer Res, 2007, 67, 6745-52）。マウスの体重を１週間に１回計測し、がん容量（ｍｍ３）を１週間に２回計測した。がん容量（ｍｍ３）を、ｄを最小直径、Ｄを最大直径として、ｄ２×Ｄ／２（≒６／π）の計算式を用いて計算した。
（結果）
Ｎａｌｍ‐６などのＢリンパ球は、放射線に高感受性であることがよく知られている。そこで、ＲＥＣＱＬ４欠損細胞の放射線やシスプラチン高感受性が、がん細胞で一般的な表現型であることを確認するために、大腸がん細胞ＨＣＴ１１６と、非がん細胞である不死化乳腺上皮細胞ＭＣＦ１０Ａに対して、Ｃａｓ９‐ＣＲＩＳＰＲ技術を用いてＲＥＣＱＬ４欠損細胞を樹立した（図１Ａ及びＣ）。その結果、ＲＥＣＱＬ４欠損大腸がん細胞もシスプラチンに高感受性であることを確認したが(図１Ｂ)、興味深いことに、ＲＥＣＱＬ４欠損ＭＣＦ１０Ａ非がん細胞では高感受性を示さなかった（図１Ｄ)。これらの結果から、がん細胞でＲＥＣＱＬ４機能が欠損すると、放射線やシスプラチンに高感受性となることを見出した。
Ｎａｌｍ‐６などのＢリンパ球は、放射線に高感受性であることがよく知られている。そこで、ＲＥＣＱＬ４欠損細胞の放射線やシスプラチン高感受性が、がん細胞で一般的な表現型であることを確認するために、大腸がん細胞ＨＣＴ１１６と、非がん細胞である不死化乳腺上皮細胞ＭＣＦ１０Ａに対して、Ｃａｓ９‐ＣＲＩＳＰＲ技術を用いてＲＥＣＱＬ４欠損細胞を樹立した（図１Ａ及びＣ）。その結果、ＲＥＣＱＬ４欠損大腸がん細胞もシスプラチンに高感受性であることを確認したが(図１Ｂ)、興味深いことに、ＲＥＣＱＬ４欠損ＭＣＦ１０Ａ非がん細胞では高感受性を示さなかった（図１Ｄ)。これらの結果から、がん細胞でＲＥＣＱＬ４機能が欠損すると、放射線やシスプラチンに高感受性となることを見出した。
次に、放射線とシスプラチン高感受性の分子機序を明らかにするために、ＨＣＴ１１６細胞での放射線とシスプラチン処理後のＤＮＡ修復タンパクの挙動を、蛍光免疫染色法で可視的に定量解析した。ＤＮＡ二本鎖切断修復経路の一つである相同組換え修復（ＨＲ）の主要因子であるＲａｄ５１は（Shinoharaら, Cell, 1992, 69, 457-470）、ＤＮＡ二本鎖切断認識マーカーであるγＨ２ＡＸと同様に（Rogakouら, JBC, 1998, 273, 5858-68）、放射線照射後の時間経過と共に減少した(図２Ａ及びＢ)。一方、ＤＮＡ一本鎖切断認識マーカーであるＲＰＡは（Raderschallら, PNAS, 1999, 96, 1921-1926）、放射線照射後の時間経過と共に増加した（図２Ｃ）。ＲＰＡは、ＤＮＡ二本鎖切断修復経路の一つである一本鎖アニーリング修復（ＳＳＡ）の主要因子であり、その他のＳＳＡ主要因子であるＲａｄ５２の挙動も調べると（Shinohara及びOgawa, Nature, 1998, 391, 404-407）、ＲＰＡと同様の挙動を示した（図２Ｄ）。ＲＰＡとＲａｄ５２タンパク質の蓄積は、ＲＥＣＱＬ４欠損細胞で有意に増加し、ＲｅｃＱＬ４タンパク質を異所性発現させると抑制された（図２Ｅ及びＦ）。この結果から、ＲＥＣＱＬ４欠損細胞では、放射線やシスプラチン処理によるＤＮＡダメージによって、ＳＳＡ修復経路が有意に活性化することを見出した。
ＤＮＡの二本鎖切断とＤＮＡを折りたたんでいるクロマチン領域は密接に関係しており、密に折りたたんでいるヘテロクロマチン領域は切断されにくく、緩く折りたたんでいるユークロマチン領域は切断されやすいことが分かっている（Goodarziら, Mol Cell, 2008, 31, 167-77）。そこで、ＳＳＡ修復因子のＤＮＡダメージ部位への蓄積を、クロマチン分画を濃縮して生化学的に解析した。図２の結果と相関するように、Ｒａｄ５１とγＨ２ＡＸの一過性の増加と減少がみられたが、Ｒａｄ５２とＲＰＡ２は時間経過と共にクロマチン分画に蓄積し、ＲＥＣＱＬ４欠損細胞ではこの増加が顕著であった(図３Ａ及びＢ)。ホルムアルデヒドによるタンパク質とクロマチンの架橋方法を用いていないので、ＳＳＡ因子とクロマチンとの結合は比較的強いと考えられる。上記の結果から、ＲＥＣＱＬ４欠損がん細胞では、放射線照射によるＤＮＡ傷害後に、遅延的にＤＮＡ修復ＳＳＡ因子がクロマチンに蓄積することを見出した。
ＲＥＣＱＬ４欠損がん細胞でのＳＳＡ活性化を決定付けるために、ＧＦＰレポーターアッセイを用いて、定量的なＳＳＡ活性測定を行った（Starkら, MCB, 2004, 24, 9305-9316）。ＲＥＣＱＬ４欠損がん細胞では、ＳＳＡ活性の有意な増加が見られたが、ＲｅｃＱＬ４タンパク質の異所性発現によってＳＳＡ活性が抑制されたので(図４Ａ〜Ｃ)、ＲｅｃＱＬ４タンパク質が、がん細胞でＳＳＡを抑制する働きを担うことを見出した。
ＲＥＣＱＬ４欠損がん細胞では、ＳＳＡ活性が増加していることを見出したので、ＳＳＡ活性が、がん細胞の生存に必要かどうかを検討するために、ｓｉＲＮＡによって人為的にＳＳＡ活性を抑制した（図５Ａ）。その結果、Ｒａｄ５２タンパク質発現を抑えることで、ＲＥＣＱＬ４欠損がん細胞が有意に減少することが判明した。また、ＲＥＣＱＬ４タンパク質を異所性発現させた場合、表現型が元に戻ることから、ＲＥＣＱＬ４欠損がん細胞は、生存のためにＳＳＡ活性を増加させていることを見出した（図５Ｂ）。
次に、図５の結果を確認するために、最近Ｒａｄ５２阻害剤として同定された、緑茶の成分であるエピガロカテキン（Hengelら, eLife, 2016; 5:e14740）と、代謝調節薬ＡＩＣＡＲを用いて実験を行った（Sullivanら, PLoS One, 2016, 11, e0147230）。その結果、どちらの薬剤処理でも同様に、濃度依存的にＲＥＣＱＬ４欠損がん細胞を有意に抑制することを見出した（図６Ａ〜Ｃ）。ＡＩＣＡＲは、ＡＭＰＫ活性化剤として知られているが（Sullivanら, FEBS Lett, 1994, 353,33-6）、直接的ＡＭＰＫ活性化剤であるサリチレートや、間接的ＡＭＰＫ活性化剤である２ＤＧ処理では（Vincentら, Oncogene, 2015, 34, 3627-39）、ＲＥＣＱＬ４欠損がん細胞への特異的な抑制効果が見られなかった（図６Ｅ及びＦ）。これらの結果から、ＲＥＣＱＬ４欠損がん細胞の抑制効果は、Ｒａｄ５２を標的とする特異的な抑制効果であることが明らかとなった。
最後に、エピガロカテキンがＳＳＡ経路を選択的に抑制し、さらなるＤＮＡ修復、ＤＮＡ複製、及びＤＮＡ組換えの誤りの蓄積による遺伝的不安定性の誘導と、それに伴う二次性発がんや転移などのがんの悪性化等を抑制することを裏付けるために実験を行った。実験結果を、図７に示す。図７の結果に示されるように、エピガロカテキン処理により、シスプラチン処理によって誘導されるゲノム欠失が抑制されることが明らかになった。
上記研究によって、誤りがちＤＮＡ修復経路におけるＳＳＡの阻害が、ＲＥＣＱＬ４欠損がん細胞の抑制に効果的であることを、分子・細胞レベルでの解析により見出した。
次に、個体レベルでのＳＳＡ阻害効果を実証するために、野生型とＲＥＣＱＬ４欠損ＨＣＴ１１６細胞を、ＢＡＬＢ／ｃＡＪｃｌ‐ｎｕ／ｎｕマウスに皮下投与して、生体内でのがん細胞増殖能力を調べるｘｅｎｏｇｒａｆｔ実験を行った。ＡＩＣＡＲ処理でｐ５３欠損ＨＣＴ１１６細胞の増殖が抑制されることが分かっているので（Buzzaiら, Cancer Res, 2007, 67, 6745-52）、ｐ５３欠損ＨＣＴ１１６細胞を対照として用いた。報告通り、野生型細胞に比べてｐ５３欠損細胞は、ＡＩＣＡＲ処理で増殖が抑制された（図８Ａ〜Ｃ）。興味深いことに、ＲＥＣＱＬ４欠損細胞の方が、ｐ５３欠損細胞よりもＡＩＣＡＲ処理による増殖抑制効果が大きかった（図８Ａ〜Ｃ）。
もう１つのＳＳＡ阻害剤であるＥＧＣは、ＥＧＣＧ（エピガロカテキン ガレート）に比べて生物効果が小さく、ＥＧＣＧが集中的に研究されてきた経緯があり（例えば、ＰｕｂＭｅｄにおいて「epigallocatechin gallate」を検索した場合４５２４件ヒットするが、「epigallocatechin NOT gallate」を検索した場合、３０５件しかヒットしない)、マウスへのＥＧＣ投与研究は皆無に等しい。しかしながら、ヒトでの臨床応用がし易いこと等を考慮して、マウスへのＥＧＣ経口投与を試みることにした。動物へのＥＧＣ投与に関する研究は、マウスでは腹腔内投与（i.p.）２０ｍｇ／ｋｇの報告のみなので（Wang et al, PLoS One, 2013; e56631）、より低濃度１５ｍｇ／ｋｇの経口投与(p.o.)を行ってＳＳＡの阻害効果をマウスで調べた。その結果、ＡＩＣＡＲ同様に、ＲＥＣＱＬ４欠損がん細胞で、有意なＥＧＣによる増殖抑制効果を観察した(図９Ａ〜Ｃ)。
ＳＳＡ抑制によるがん細胞の増殖抑制効果をマウス個体レベルで確認したので、次に、抗がん剤であるシスプラチン処理後に活性化されるＳＳＡをタイミング良く阻害することで、効果的に相乗的ながん細胞抑制効果が得られるのではないか、という仮説を検証した。ＲＥＣＱＬ４欠損がん細胞は、ＡＩＣＡＲとシスプラチン単独処理でも感受性を示すが（図１Ｂ、及び図６Ｂ）、２つを同時に処理すると、相乗的ながん細胞抑制効果を確認した（図１０Ａ）。さらに、２４時間以降のＳＳＡが遅延的に活性化するタイミングでＳＳＡ阻害剤を処理することで、初期２４時間処理に比べて効果的ながん細胞抑制効果を見出した(図１０Ｂ)。
最後に、細胞レベルでのがん細胞の増殖抑制相乗効果を、マウス個体レベルでも検証した。抗がん剤であるシスプラチンを投与した翌日に、ＥＧＣを経口投与する投与方法を選択した。その結果、ＥＧＣ単独ではＲＥＣＱＬ４欠損がん細胞の抑制効果が見られなかったが、これは、今回の投与方法が、図９に示すものよりもＥＧＣ投与頻度が少なく、投与間隔が空いたことに起因すると考えられる。シスプラチン単独投与でのがん細胞抑制効果と、シスプラチンとＥＧＣの併用投与による相乗的ながん細胞抑制効果を観察した（図１１Ａ〜Ｅ）。これらの結果から、抗がん剤であるシスプラチンでの処理によって活性化されるＳＳＡを阻害することで、マウス個体レベルでもＲＥＣＱＬ４欠損がん細胞の相乗的増殖抑制効果を確認した。
（結論）
上記の結果から、抗がん剤処理後や放射線照射後に生存するために、ＳＳＡが活性化し易い特殊ながん細胞、具体的には、例えば、ＢＲＣＡ１遺伝子とＢＲＣＡ２遺伝子に変異をもつ乳がんや卵巣がんの細胞や、ＡＰＣ遺伝子変異による家族性大腸腺腫症の細胞に対して、抗がん剤処理後や放射線照射後に遅延的にタイミング良くＳＳＡ阻害剤で処理することで、抗がん剤処理や放射線照射に起因する副作用を低減し且つ相乗的にがん細胞の増殖を抑制することができることが、分子レベルから個体レベルまでを通して明らかになった。
上記の結果から、抗がん剤処理後や放射線照射後に生存するために、ＳＳＡが活性化し易い特殊ながん細胞、具体的には、例えば、ＢＲＣＡ１遺伝子とＢＲＣＡ２遺伝子に変異をもつ乳がんや卵巣がんの細胞や、ＡＰＣ遺伝子変異による家族性大腸腺腫症の細胞に対して、抗がん剤処理後や放射線照射後に遅延的にタイミング良くＳＳＡ阻害剤で処理することで、抗がん剤処理や放射線照射に起因する副作用を低減し且つ相乗的にがん細胞の増殖を抑制することができることが、分子レベルから個体レベルまでを通して明らかになった。
自己の生存のために抗がん剤処理後や放射線照射後にＳＳＡが活性化し易い特殊ながん細胞、具体的には、例えば、ＢＲＣＡ１遺伝子とＢＲＣＡ２遺伝子に変異をもつ乳がんや卵巣がんの細胞や、ＡＰＣ遺伝子変異による家族性大腸腺腫症の細胞に対して、抗がん剤処理後や放射線照射後に遅延的にタイミング良くＳＳＡ阻害剤で処理することで、抗がん剤処理や放射線照射に起因する副作用を低減しつつ相乗的にがん細胞の増殖を抑制することができるため、がんに対する新規且つ有用な治療手段となり得る点で有用である。
また特殊ながんとは言っても世界全体でのこれらのがん患者数は、大腸がんの１％がＡＰＣ変異によるものと考えても毎年数千人単位で発症しており（Kinzler及びVogelstein, Cell, 1996, 87, 159-70）、乳がんでは毎年１００万人以上が乳がんと診断されて４０万人以上が亡くなっている現状を考えると（Parkinら, CA Cancer J Clin. 2005, 55, 74-108）、該治療手段が有効であるがん患者数は、数万人単位で存在し、十分に産業上の利用可能性がある。
また特殊ながんとは言っても世界全体でのこれらのがん患者数は、大腸がんの１％がＡＰＣ変異によるものと考えても毎年数千人単位で発症しており（Kinzler及びVogelstein, Cell, 1996, 87, 159-70）、乳がんでは毎年１００万人以上が乳がんと診断されて４０万人以上が亡くなっている現状を考えると（Parkinら, CA Cancer J Clin. 2005, 55, 74-108）、該治療手段が有効であるがん患者数は、数万人単位で存在し、十分に産業上の利用可能性がある。
以上、本発明の具体的な態様のいくつかを詳細に説明したが、当業者であれば示された特定の態様には、本発明の教示と利点から実質的に逸脱しない範囲で様々な修正と変更をなすことは可能である。従って、そのような修正および変更も、すべて後記の特許請求の範囲で請求される本発明の精神と範囲内に含まれるものである。
Claims (9)
- 白金製剤を用いた化学療法又は放射線療法と併用される、ＳＳＡ阻害剤を含むがん細胞増殖抑制剤であって、ここで前記がん細胞増殖抑制剤が、対象への前記白金製剤の投与後、又は前記放射線の照射後、前記対象におけるがん細胞中のＳＳＡの活性化前、又は活性化時に投与される、増殖抑制剤。
- 前記ＳＳＡ阻害剤が、Ｒａｄ５２阻害剤である、請求項１に記載のがん細胞増殖抑制剤。
- 前記Ｒａｄ５２阻害剤が、（−）エピガロカテキン、又は5-アミノ-1-((2R,3R,4S,5R)-3,4-ジヒドロキシ-5-(ヒドロキシメチル)-テトラヒドロフラン-2-イル)-1H-イミダゾール-4-カルボキサミドである、請求項２に記載のがん細胞増殖抑制剤。
- 前記白金製剤が、オキサリプラチン、カルボプラチン、シスプラチン、及びネダプラチンからなる群から選択される、請求項1〜３のいずれか１項に記載のがん細胞増殖抑制剤。
- 前記がん細胞増殖抑制剤が、前記白金製剤の投与後、又は前記放射線の照射後、２日以内の間に投与される、請求項1〜４のいずれか１項に記載のがん細胞増殖抑制剤。
- 前記がん細胞が、Ｒａｄ５２因子を含むＳＳＡ活性が増加するがん細胞である、請求項１〜５のいずれか１項に記載のがん細胞増殖抑制剤。
- 前記Ｒａｄ５２因子を含むＳＳＡ活性が増加するがん細胞が、ＲＥＣＱＬ４欠損がん細胞、ＢＲＣＡ１及び／又はＢＲＣＡ２欠損がん細胞、並びにＡＰＣ欠損がん細胞からなる群から選択される、請求項６に記載のがん細胞増殖抑制剤。
- 白金製剤を用いた化学療法又は放射線療法と併用される、ＳＳＡ阻害剤を含む、前記化学療法又は放射線療法に起因する晩期障害低減剤であって、ここで前記晩期障害低減剤が、対象への前記白金製剤の投与後、又は前記放射線の照射後、前記対象におけるがん細胞中のＳＳＡの活性化前、又は活性化時に投与される、晩期障害低減剤。
- 前記晩期障害が二次性発がんである、請求項８に記載の晩期障害低減剤。
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