JP2019123742A

JP2019123742A - Ｒｇｄモチーフ含有ペプチドまたはその断片を含む、視神経を保護するための医薬組成物

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Publication number: JP2019123742A
Application number: JP2019071434A
Authority: JP
Inventors: キ−アンオム; Key-An Um; ヨン−モクキム; Yeong-Mok Kim; ジョンファンイム; Jong Hwan Lim
Original assignee: Huons Co Ltd
Current assignee: Huons Co Ltd
Priority date: 2014-12-31
Filing date: 2019-04-03
Publication date: 2019-07-25
Anticipated expiration: 2035-12-31
Also published as: JP6805287B2; KR102412659B1; KR102412658B1; JP2019123743A; US20170368153A1; US10463720B2; JP6910391B2; KR20210034559A; JP2018502116A; JP6510054B2; KR101832121B1; US10632181B2; KR20160081858A; EP3241557A1; CN107206047A; CN107206047B; WO2016108669A1; EP3241557B1; EP3241557A4; KR20180021764A

Abstract

【課題】視神経を保護して緑内障の治療または予防効果を有する組成物の提供。【解決手段】ＲＧＤモチーフ含有ペプチドまたはこの断片。これを用いれば、火傷および緑内障を効果的に治療することができることから、化粧料組成物及び薬学的組成物に活用することができる。【選択図】図１

Description

本発明は、視神経の保護に効果があるペプチドまたはその断片を含む医薬組成物に関する。

本出願は、２０１４年１２月３１日出願の韓国特許出願第１０−２０１４−０１９５００８号に基づく優先権を主張し、該当出願の明細書及び図面に開示された内容は、すべて本出願に援用される。

ディスインテグリン・メタロプロテアーゼ（ＡＤｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎａｎｄＭｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ、以下、「ＡＤＡＭ」とする）は、ディスインテグリン及びメタロプロテアーゼドメインを含む多機能たんぱく質であり、細胞−細胞及び細胞−マトリクスの相互作用における付着及びたんぱく質分解機能をともに果たすことと知られている。それらのうち、ＡＤＡＭ１５は、そのディスインテグリン様ドメイン内にＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）モチーフを有する独特のたんぱく質である。ＡＤＡＭ１５は、平滑筋細胞、メサンジウム細胞及び内皮細胞において発現する。ＡＤＡＭ系列は、受精、筋形成、神経発生及びサイトカイン分泌のような多様な生物学的過程に関与する（ＢｌｏｂｅｌＣＰ，外；Ｎａｔｕｒｅ１９９２．３５６：２４８−２５２．；Ａｉｔｋｅｎ，Ｊ．Ｎａｔｕｒｅ１９９２；３５６：１９６−１９７．；ＢｌｏｂｅｌＣＰ，外Ｊ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．１９９０；１１１：６９−７８．；ＷｈｉｔｅＪＭ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２００３；１５：５９８−６０６）。ＡＤＡＭ１５のＥＧＦ（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ）様ドメインとして知られたディスインテグリン様ドメインは、特にインテグリンβ鎖（ｉｎｔｅｇｒｉｎｂｅｔａ３）と特異的に結合し、Ｓｒｃ族たんぱく質のイロシンカイネーズと結合して細胞間の信号伝達及び接着（ａｄｈｅｓｉｏｎ）の機能を果たすことと知られている。ＡＤＡＭ１５たんぱく質は、リウマチのような炎症性疾患及び乳房癌、前立腺癌などの多様な疾患にも連関すると知られ、さらなる研究が必要な実情である。

一方、人の皮膚は、角質層を含む表皮と真皮、及び結合組織から構成されており、その中で角質層は表皮（ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ）の基底細胞であるケラチノサイト（ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ）の分化過程により形成される死んだ細胞層から構成されており、外部環境の影響から人体を保護する役割を担当する。また、皮膚の内部に存在する真皮層は、繊維性たんぱく質であるコラーゲンとエラスチンから構成され、皮膚に弾力を与えて皮膚が弛まないようにする役割を果たし、血管と神経が存在し、アレルギー反応に関与する肥満細胞、及びＮａ−ＰＣＡまたはヒアルロン酸などの天然保湿因子も含んでいる。

皮膚のしわ生成の原因については、大きく二つに分類され、一つは、「内的老化」であって年齢の増加による肌の構成単位である細胞の機能変化に起因することであり、他の一つは、「外的老化」であって外部環境、即ち、紫外線、公害、ストレスなどによることに分けられる。皮膚老化の原因の中でも最も大きい部分を占めている光老化は、ＵＶによる持続的な露出によって皮膚癌などの急性及び慢性的な皮膚傷害を誘発してしわを誘発する。これは、太陽光に存在する波長帯によってＵＶＡ（３２０〜４００ｎｍ）、ＵＶＢ（２９０〜３２０ｎｍ）及びＵＶＣ（２００〜２９０ｎｍ）の３種に分けられ、このうちＵＶＣは、オゾン層によってほとんどが完全に吸収されるのに対し、ＵＶＡ及びＵＶＢは、地球の表面にまで到達して肌傷害を誘発する致命的な因子として作用する。ＵＶＡよりも短い波長帯であってさらに強いＵＶＢは、真皮の上部に存在する表皮を貫いてケラチノサイトに傷害を加えてコラーゲン繊維を損じてしまい、その結果、しわの生成、皮膚変色または皮膚癌を誘発すると知られている。また、最近、細胞と細胞外基質たんぱく質（コラーゲン、フィブリリン、フィブロネクチン）との相互作用が、皮膚細胞の生存と増殖、組織の再建に重要な役割を果たすことが分かった。

火傷は主に事故によって発生し、原因によって、熱による火傷、電流による火傷、化学物質による火傷、放射線による火傷などに分けられる。火傷の重症度は、火傷を負った広さ、深さ、火傷を誘発した物体の温度と接触時間、皮膚状態などによって、１度、２度、３度及び４度火傷に分けられ、２度火傷からは傷跡を残し得、病院治療を要する。

１度火傷は、肌が赤くなり、ひりひりするなどの痛症を伴う。皮膚層における最も外層である表皮の損傷をもたらし、痛症と紅斑を伴いながらはれ上がったりする。数日後に症状が消えるが、その箇所に軽い落屑と色素沈着がある場合もある。回復後は瘢痕が残らない。日焼けによる火傷の場合が最も一般的な１度火傷の例である。

２度火傷は、表皮と真皮とも影響を及ぼし、紅斑、痛症、浮腫み、そして火傷後２４時間内に水疱を誘発する。この火傷はまた、汗線や毛穴に影響を与えることもある。自覚的には灼熱感と痛症がひどい。水疱が裂ければ糜爛面が現われ、多量の分泌液が出る。火傷を負った面積が体表面積の約１５％以上に至る場合は、特に注意を要する。数週内に癒されるが、その個所に色素沈着や色素脱失が生じることが多い。２次感染を起こせば局所症状はさらにひどくなり、経過も長くなる。

３度火傷は、表皮、真皮、そして下皮にまで影響を及ぼし、皮膚が黒くなるか半透明白色となり、皮膚表面真下の血管を凝固させる。この火傷部位は、無感覚となることもあるが、患者は極甚な痛症を感じ、皮膚組織と構造が壊死してしまい、治療に多い時間がかかり、後に傷跡が残るようになる。事故後２週が経つと、瘡蓋が剥げて潰瘍面が現われる。分泌液が多く、出血しやすいが、次第に新しい組織が生じて表皮が再生し、瘢痕が残り、癒される。皮膚壊死が深い場合、または２次感染を起こした場合、治癒が遅くなり、瘢痕の表面が不規則になってケロイドが生じたり変形や運動障害が残ったりする。火傷を負った面積が身体表面積の１０％以上となる場合は、特に注意を要する。

４度火傷は、火傷を負った部位組織が炭化してしまい黒く変わった場合であり、皮膚層の下に位置する脂肪層、靭帯、筋膜、筋肉、骨組織などにまで火傷を負った場合をいう。高圧電気火傷において主に発生し、たまに深在性２、３度火傷において菌感染が発生した場合に現われ得る。火傷の範囲が２０％以上である場合、全身反応が起きることがあるが、過度な体液損失による低血圧、ショック、急性腎臓機能不全などが発生し得、追って傷の感染や肺炎、敗血症、多発性臓器機能不全症候群などが発生することもある。

火傷においては、皮膚及び皮膚付属器官の再生に重点を置いているが、現在の開発技術では完全な治療が困難であるという問題がある。

緑内障とは、視神経萎縮証の形態を帯び、網膜神経叢細胞を含み視神経に発生する疾患の総称である。治療しない緑内障は、永久的に視力に影響を与え得る。過去は、正常よりも高い眼圧によって視神経損傷及びこれによる視野障害を誘発する疾患として定義されていたが、最近は、緑内障性視神経損傷の原因として高い眼圧の他に多様な要素が関与すると報告され、視神経の特徴的な変化及びこれによる視野障害が招来される進行型視神経病症と定義される。

緑内障は、原因または症状によって開放隅角緑内障、閉塞隅角緑内障、先天性緑内障、続発性緑内障、水晶体融解緑内障、偽落屑緑内障、水晶体形態性緑内障、新生血管緑内障、ステロイド緑内障などに分けられる。

緑内障患者にとって、薬物治療及びレーザ治療でも眼圧が調節されないか、または十分な薬物治療でも視野検査において視野障害が進行し、眼底検査所見において緑内障性視神経変化が進行する場合、薬物の副作用によって薬物を使いにくい場合は、手術的治療を考えるようになり、線維柱帯切除術が代表的な手術方法の一つである。線維柱帯切除術は、ろ布によって人為的に房水を排出することで眼圧下降を誘発する。手術により形成されたろ布の創傷の治癒過程及び傷跡生成は房水流出路の閉塞をもたらし、次第にろ布の機能を低下させ、結果として手術の失敗をもたらす。現在、線維柱帯切除術の長期手術成功率を高めるために、抗代謝剤である５−ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ（５−ＦＵ）またはｍｉｔｏｍｙｃｉｎＣ（ＭＭＣ）を補助的に用いており、これは線維柱帯切除術の成功率は高めたが、低眼圧、ろ布漏出、ろ布による感染などの後期合併症を増加させた。これについて、最近はＯｃｕｌｕｓＧｅｎ^ＴＭ（ＯｃｕｌｕｓＧｅｎＢｉｏｍｅｄｉｃａｌＩｎｃ．，Ｔａｉｐｅｉ，Ｔａｉｗａｎ）を用いて、線維芽細胞の増殖を「任意に組織化」するように骨格を提供し、「任意に配列された線維芽細胞」を、コラーゲンを細胞周りの多くの方向へ生産、配列して傷跡組織ではなく正常組織におけるコラーゲン構造に似ている様態を形成するようすることで、線維柱帯切除術に用いることができるという報告がある。しかし、線維柱帯切除術の外にも緑内障を治療できる代替方案が必要な実情である。

毛髪は通常３成長周期を有し、これは、成長期（ａｎａｇｅｎ）、停滞期（ｃａｔａｇｅｎ）、衰退期（ｔｅｌｏｇｅｎ）である。成長期は、毛髪が旺盛に育つ時期であって、毛髪成長週期の多くを占める。停滞期は、アポトーシスが起きて毛髪が抜ける準備となる時期であり、衰退期は、毛髪が毛嚢から抜けた状態の時期をいう。

脱毛（Ａｌｏｐｅｃｉａまたはｈａｉｒｌｏｓｓ）は、毛髪が、成長期−停滞期−衰退期を繰り返す過程で毛根が小さくなって毛髪の太さが薄くなり、究極には綿毛のように変わりながら誘発される。このような脱毛誘発の原因には、遺伝的な要素、性ホルモンであるテストステロン（Ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｅ）の過多分泌、毛嚢の血流量低下、皮脂の過多分泌、ストレス、不均衡的な食生活、大気汚染、過多な紫外線露出などがあり、主に多様な要因が複合的に作用する。

脱毛は、大きく男性型脱毛症（ａｎｄｒｏｇｅｎｅｔｉｃａｌｏｐｅｃｉａ）、女性型脱毛症（ｆｅｍａｌｅｐａｔｔｅｒｎｈａｉｒｌｏｓｓ）、円形脱毛症（ａｌｏｐｅｃｉａａｒｅａｔａ）、その他の原因による脱毛症に分けられる。男性型脱毛症は、男性の性徴を発現させ、思春期の筋肉発達、男性器官の発達などに作用するホルモンであるテストステロンという男性ホルモンによって現われる現象であり、このテストステロンが５α−リダクターゼ（α−ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）という酵素によってさらに強いホルモンであるジヒドロテストステロン（Ｄｉｈｙｄｒｏｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｅ：ＤＨＴ）に変われば、このホルモンが毛嚢に存在する毛乳頭細胞に作用し、毛嚢を成長期の段階から退化期の段階へ誘導して脱毛を起こす。女性型脱毛症は、主に閉経期以後、エストステロン量の減少によって発生する。女性の脱毛症は、男性型脱毛症の様態とは少し相違に頭の前部は抜けず中間部分の髪が主に脱毛される。女性の脱毛症は、５α−リダクターゼとの連関関係が男性より少なく作用する。したがって、５α−リダクターゼを抑制する薬物は、閉経期以後の脱毛症の女性にとってはあまり効果がない。円形脱毛症は、自家免疫疾患や精神的ストレス、遺伝的素因によって発生する。円形または卵円形の脱毛が起こり、頭部白癬や抜毛癖が生ずる特徴を有する。このような円形脱毛症は、男性型脱毛症とは根本的に原因が異なり、治療法も異なることから、副腎皮質ホルモン剤を処方する方法を用いるか、ミノキシジルを患部に塗る。

かかる脱毛による問題点を解決するために、脱毛防止及び治療効果を有する多様な有効成分と、これを含む組成物について研究されつつある。このような研究において目的とする主な効果として、毛髪の太さを維持するか、太くする効果、毛髪の成長期が早く渡来するか長く維持させる効果、毛髪の衰退期の到来を遅らせるか短く維持させる効果、５α−リダクターゼの活性を阻害する効果、毛嚢への血行を促進する効果、保湿効果、抗酸化効果、ふけ防止効果、殺菌効果、細胞外マトリクス（Ｅｘｔｒａ−Ｃｅｌｌｕａｒｍａｔｒｉｘ；ＥＣＭ）の発現促進効果などが挙げられる。

現在、医薬品として登録されて用いられている物質には、ミノキシジルがある。ミノキシジルは、本来、平滑筋血管の拡張作用をする高血圧治療剤として作られたが、その副作用から全身に毛の育つ現象が発見された後、発毛剤として開発された（米国特許登録第４，５９６，８１２号：第４，１３９，６１９号）。この科学的な作用機転の詳細は知られていないが、毛嚢への血流量を増加させるなどの複合的な作用により毛髪の成長を促進すると推測されている。このような効果に基づき、ＦＤＡで一般医薬品として承認されたが、皮膚刺激、かゆみ、紅潮、希望しない部位での発毛、脱毛の悪化などの副作用が報告されており、薬効を維持するために持続的に使わなければならないなどの問題点を有している。

本発明が解決しようとする課題は、特定配列及び構造を有するペプチドを提供することで上述の問題点を解消し、視神経を保護する効果を奏する医薬組成物を提供することを目的とする。

上記の課題を達成するために、ＲＧＤモチーフを含む配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチドまたはその断片を有効成分として含み、以下の一つ以上の効果を奏する組成物を提供する：
火傷治療；
緑内障治療；
皮膚のしわ改善；または
脱毛防止、頭皮改善または発毛及び育毛促進。

望ましくは、断片は、下記より選択された一種以上であり得る。

１）配列番号１のアミノ酸配列の、ＲＧＤモチーフを含む５〜４５個のアミノ酸からなり、選択的に断片内におけるシステイン間の二硫化結合がないか、または三つ以下の二硫化結合が形成されたことを特徴とする断片；
２）配列番号１のアミノ酸配列の３０〜３８番目のアミノ酸を含み、選択的に断片内におけるシステイン間の二硫化結合がないか、または一つ以上の二硫化結合が形成されたことを特徴とする断片；
３）配列番号１のアミノ酸配列の３２〜４３番目のアミノ酸を含み、選択的に断片内におけるシステイン間の二硫化結合がないか、または一つ以上の二硫化結合が形成されたことを特徴とする断片；
４）配列番号１のアミノ酸配列の３０〜４４番目のアミノ酸を含み、選択的に断片内におけるシステイン間の二硫化結合がないか、または一つ以上の二硫化結合が形成されたことを特徴とする断片；
５）配列番号１のアミノ酸配列の１８〜５４番目のアミノ酸を含み、選択的に断片内におけるシステイン間の二硫化結合がないか、または一つ以上の二硫化結合が形成されたことを特徴とする断片；及び
６）配列番号１のアミノ酸配列の１０〜５４番目のアミノ酸を含み、選択的に断片内におけるシステイン間の二硫化結合がないか、または一つ以上の二硫化結合が形成されたことを特徴とする断片。

より望ましくは、ペプチドの断片は、下記より選択された一種以上であり得る。

１）配列番号１のアミノ酸配列の、ＲＧＤモチーフを含む９個、１２個または１５個のアミノ酸からなり、選択的に断片内におけるシステイン間の二硫化結合がないか、または三つ以下の二硫化結合が形成されたことを特徴とする断片；
２）配列番号１のアミノ酸配列の３０〜３８番目のアミノ酸からなることを特徴とする断片；
３）配列番号１のアミノ酸配列の３２〜４３番目のアミノ酸からなり、３６番目のシステインと４２番目のシステインとの間に二硫化結合が形成されることを特徴とする断片；
４）配列番号１のアミノ酸配列の３０〜４４番目のアミノ酸からなり、断片内におけるシステイン間の二硫化結合がないことを特徴とする断片；または
５）配列番号１のアミノ酸配列の３０〜４４番目のアミノ酸からなり、断片内におけるシステイン間に一つの二硫化結合が形成されることを特徴とする断片。

本発明による組成物は、医薬組成物、化粧料組成物、健康機能食品組成物、医薬外品組成物などとして用いることができる。

また、本発明は、ＲＧＤモチーフ（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐｍｏｔｉｆ）を含む配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチドまたはその断片を投与し、以下のいずれか一つ以上の効果を奏する方法を提供する（以下、単に「方法」とする。）。

火傷治療；
緑内障治療；
皮膚のしわ改善；または
脱毛防止、頭皮改善または発毛及び育毛促進。

また、本発明は、ＲＧＤモチーフを含む配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチドまたはその断片の、以下のいずれか一つ以上の効果を発揮するための用途を提供する（以下、単に「用途」とする。）。

本発明において、前記「組成物」、「方法」及び「用途」ともＲＧＤモチーフを含む配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチドまたはその断片の火傷治療；緑内障治療；皮膚のしわ改善；または脱毛防止、頭皮改善または発毛及び育毛促進の効果に基づき、以下、「組成物」についての説明は、特に制限的に記載しない限り、「方法」、「用途」についても同一に適用し、重複記載を避けるために、「方法」、「用途」についての説明は省略する。

本発明によるペプチドまたはその断片を用いれば、火傷及び緑内障を効果的に治療することができ、皮膚のしわ改善に優れた効果を奏し、脱毛防止は勿論、育毛及び発毛促進にも効果的であることから、化粧料組成物及び薬学的組成物に活用することができる。

ＨＵ０２４のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法で測定した結果を示した図である。ＨＵ０２５のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法で測定した結果を示した図である。ＨＵ０２６のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法で測定した結果を示した図である。ＨＵ０２７のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法で測定した結果を示した図である。Ｇ１〜Ｇ６の体重変化を測定した結果を示した図である。（Ｇ１：正常群，ｎ＝５；Ｇ２：陰性対照群，ｎ＝９〜１０；Ｇ３：試験群（３．３μｇ／匹／日），ｎ＝１０；Ｇ４：試験群（１０μｇ／匹／日），ｎ＝１０；Ｇ５：試験群（３０μｇ／匹／日），ｎ＝１０；Ｇ６：陽性対照群（１０μｇ／匹／日），ｎ＝９〜１０）。Ｇ１〜Ｇ６の火傷面積変化を測定した結果を示した図である。（Ｇ２：陰性対照群，ｎ＝９〜１０；Ｇ３：試験群（３．３μｇ／匹／日），ｎ＝１０；Ｇ４：試験群（１０μｇ／匹／日），ｎ＝１０；Ｇ５：試験群（３０μｇ／匹／日），ｎ＝１０；Ｇ６：陽性対照群（１０μｇ／匹／日），ｎ＝９〜１０）。Ｇ２〜Ｇ６の火傷面積得減少率を示した図である。（Ｇ１：正常群，ｎ＝５；Ｇ２：陰性対照群，ｎ＝９〜１０；Ｇ３：試験群（３．３μｇ／匹／日），ｎ＝１０；Ｇ４：試験群（１０μｇ／匹／日），ｎ＝１０；Ｇ５：試験群（３０μｇ／匹／日），ｎ＝１０；Ｇ６：陽性対照群（１０μｇ／匹／日），ｎ＝９〜１０）。Ｇ１〜Ｇ６の痂皮形成及び炎症細胞浸潤の変化を示した図である。（Ｇ１：正常群，ｎ＝５；Ｇ２：陰性対照群，ｎ＝９〜１０；Ｇ３：試験群（３．３μｇ／匹／日），ｎ＝１０；Ｇ４：試験群（１０μｇ／匹／日），ｎ＝１０；Ｇ５：試験群（３０μｇ／匹／日），ｎ＝１０；Ｇ６：陽性対照群（１０μｇ／匹／日），ｎ＝９〜１０）。Ｇ１〜Ｇ６の皮膚付属器官再生、結合組織増殖、上皮細胞再生変化を示した図である。（Ｇ１：正常群，ｎ＝５；Ｇ２：陰性対照群，ｎ＝９〜１０；Ｇ３：試験群（３．３μｇ／匹／日），ｎ＝１０；Ｇ４：試験群（１０μｇ／匹／日），ｎ＝１０；Ｇ５：試験群（３０μｇ／匹／日），ｎ＝１０；Ｇ６：陽性対照群（１０μｇ／匹／日），ｎ＝９〜１０）。Ｇ１〜Ｇ６の痂皮形成及び炎症細胞浸潤の程度を示した図である。（ｅ：表皮、ｄ：真皮、ｈｄ：下皮），（Ａ：正常群，Ｂ：陰性対照群，Ｃ：試験群（３．３μｇ／匹／日），Ｄ：試験群（１０μｇ／匹／日），Ｅ：試験群（３０μｇ／匹／日），Ｆ：陽性対照群（１０μｇ／匹／日））。試験製品（ＨＵ０２２）及び対照製品の使用によるＲ１の数値変化を示した図である。試験製品（ＨＵ０２２）及び対照製品の使用によるＲ２の数値変化を示した図である。試験製品（ＨＵ０２２）及び対照製品の使用によるＲ３の数値変化を示した図である。試験製品（ＨＵ０２２）及び対照製品の使用によるＲ４の数値変化を示した図である。試験製品（ＨＵ０２２）及び対照製品の使用によるＲ５の数値変化を示した図ある。試験製品（ＨＵ０２２）及び対照製品の使用によるＲａの数値変化を示した図である。試験製品（ＨＵ０２２）及び対照製品の使用によるＲｍａｘの数値変化を示した図である。試験製品（ＨＵ０２２）及び対照製品の使用によるＲｔの数値変化を示した図である。試験製品（ＨＵ０２２）及び対照製品の使用によるＲｐの数値変化を示した図である。試験製品（ＨＵ０２２）及び対照製品の使用によるＲｖの数値変化を示した図である。試験製品（ＨＵ０２２）及び対照製品の使用による専門家の目視評価点数値の変化を示した図である。試験製品（ＨＵ０２４）及び対照製品の使用によるＲ１の数値変化を示した図である。試験製品（ＨＵ０２４）及び対照製品の使用によるＲ２の数値変化を示した図である。試験製品（ＨＵ０２４）及び対照製品の使用によるＲ３の数値変化を示した図である。試験製品（ＨＵ０２４）及び対照製品の使用によるＲ４の数値変化を示した図である。試験製品（ＨＵ０２４）及び対照製品の使用によるＲ５の数値変化を示した図である。試験製品（ＨＵ０２４）及び対照製品の使用によるＲａの数値変化を示した図である。試験製品（ＨＵ０２４）及び対照製品の使用によるＲｍａｘの数値変化を示した図である。試験製品（ＨＵ０２４）及び対照製品の使用によるＲｔの数値変化を示した図である。試験製品（ＨＵ０２４）及び対照製品の使用によるＲｐの数値変化を示した図である。試験製品（ＨＵ０２４）及び対照製品の使用によるＲｖの数値変化を示した図である。試験製品（ＨＵ０２４）及び対照製品の使用による専門家の目視評価点数値の変化を示した図である。Ｇ１〜Ｇ１０の体重変化を測定した結果を示した図である。（Ｇ１：陰性対照群（滅菌注射用水），ｎ＝１０；Ｇ２：試験群Ｉ（ＨＵ０２４２０μｇ／匹／日），ｎ＝１０；Ｇ３：試験群Ｉ（ＨＵ０２４６０μｇ／匹／日），ｎ＝１０；Ｇ４：試験群ＩＩ（ＨＵ０２５２０μｇ／匹／日），ｎ＝１０；Ｇ５：試験群ＩＩ（ＨＵ０２５６０μｇ／匹／日），ｎ＝１０；Ｇ６：試験群ＩＩＩ（ＨＵ０２６２０μｇ／匹／日），ｎ＝１０；Ｇ７：試験群ＩＩＩ（ＨＵ０２６６０μｇ／匹／日），ｎ＝１０；Ｇ８：試験群ＩＶ（ＨＵ０２７２０μｇ／匹／日），ｎ＝１０；Ｇ９：試験群ＩＶ（ＨＵ０２７６０μｇ／匹／日），ｎ＝１０；Ｇ１０：陽性対照群（マイノキシル３％）、ｎ＝１０）。Ｇ１〜Ｇ１０の毛髪の面積変化を測定した結果を示した図である。（Ｇ１：陰性対照群（滅菌注射用水）、ｎ＝１０；Ｇ２：試験群Ｉ（ＨＵ０２４２０μｇ／匹／日）、ｎ＝１０；Ｇ３：試験群Ｉ（ＨＵ０２４６０μｇ／匹／日）、ｎ＝１０；Ｇ４：試験群ＩＩ（ＨＵ０２５２０μｇ／匹／日）、ｎ＝１０；Ｇ５：試験群ＩＩ（ＨＵ０２５６０μｇ／匹／日）、ｎ＝１０；Ｇ６：試験群ＩＩＩ（ＨＵ０２６２０μｇ／匹／日）、ｎ＝１０；Ｇ７：試験群ＩＩＩ（ＨＵ０２６６０μｇ／匹／日）、ｎ＝１０；Ｇ８：試験群ＩＶ（ＨＵ０２７２０μｇ／匹／日）、ｎ＝１０；Ｇ９：試験群ＩＶ（ＨＵ０２７６０μｇ／匹／日）、ｎ＝１０；Ｇ１０：陽性対照群（マイノキシル３％）、ｎ＝１０）。毛髪の重さ変化を測定した結果を示した図である。（Ｇ１：陰性対照群（滅菌注射用水）、ｎ＝１０；Ｇ２：試験群Ｉ（ＨＵ０２４２０μｇ／匹／日）、ｎ＝１０；Ｇ３：試験群Ｉ（ＨＵ０２４６０μｇ／匹／日）、ｎ＝１０；Ｇ４：試験群ＩＩ（ＨＵ０２５２０μｇ／匹／日）、ｎ＝１０；Ｇ５：試験群ＩＩ（ＨＵ０２５６０μｇ／匹／日）、ｎ＝１０；Ｇ６：試験群ＩＩＩ（ＨＵ０２６２０μｇ／匹／日）、ｎ＝１０；Ｇ７：試験群ＩＩＩ（ＨＵ０２６６０μｇ／匹／日）、ｎ＝１０；Ｇ８：試験群ＩＶ（ＨＵ０２７２０μｇ／匹／日）、ｎ＝１０；Ｇ９：試験群ＩＶ（ＨＵ０２７６０μｇ／匹／日）、ｎ＝１０；Ｇ１０：陽性対照群（マイノキシル３％）、ｎ＝１０）。眼圧上昇の動物モデルに試料１〜５を投与し、眼圧の変化を測定した結果を示した図である。Ｎｏｒ：正常のマウス；Ｍｉｃｒｏｂｅａｄ：眼圧上昇動物モデル；試料１：タフルプロスト＋ＨＵ０２４（２０μｇ／ｍｌ）；試料２：ＨＵ０２４（２０μｇ／ｍｌ）；試料３：ＨＵ０２５（２０μｇ／ｍｌ）；試料４：ＨＵ０２６（２０μｇ／ｍｌ）；試料５：ＨＵ０２７（２０μｇ／ｍｌ）；ＰｏｓＣｏｎｔ：タフルプロスト。眼圧上昇の動物モデルに試料１〜５を投与し、視神経細胞の変化を測定した結果を示した図である。Ｃｏｎｔｒｏｌ：正常のマウス；Ｍｉｃｒｏｂｅａｄ：眼圧上昇動物モデル；試料１：タフルプロスト＋ＨＵ０２４（２０μｇ／ｍｌ）；試料２：ＨＵ０２４（２０μｇ／ｍｌ）；試料３：ＨＵ０２５（２０μｇ／ｍｌ）；試料４：ＨＵ０２６（２０μｇ／ｍｌ）；試料５：ＨＵ０２７（２０μｇ／ｍｌ）；（＋）Ｃｏｎｔｒｏｌ：タフルプロスト。

以下、本発明を詳しく説明する。

本発明は、ＲＧＤモチーフ（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐｍｏｔｉｆ）を含む特定配列及び構造のペプチドを投与すれば、コラーゲンの生成を促進し、火傷治療、緑内障治療、発毛促進及び皮膚のしわ改善に効果的であることを確認した。

本発明による組成物には、ＲＧＤモチーフを含む配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチドまたはその断片を含む。

前記配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチドは、ＲＧＤアミノ酸を含み、５８個のアミノ酸からなり、該当のペプチド内においてシステイン間の二硫化結合が形成できるため、選択的に断片内におけるシステイン間の二硫化結合がないか、１個以上の二硫化結合が形成されたペプチドを意味し得る。望ましくは、前記配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチドは、ＡＤＡＭメタロペプチダーゼドメイン１５（ＡＤＡＭｍｅｔａｌｌｏｐｅｐｔｉｄａｓｅｄｏｍａｉｎ１５；ＡＤＡＭ１５）（ＧｅｎＢａｎｋａｃｃｅｓｓｉｏｎｎｏ．ＡＡＨ１４５６６．１）の４５２〜５０９番目のアミノ酸からなるポリペプチドであり得る。例えば、前記配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチドはＨＵ０２２であり得、前記ＨＵ０２２はペプチド内のシステイン間の二硫化結合は含まない。

前記配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチドの断片は、ＲＧＤモチーフを含む３個以上のアミノ酸からなる断片であり得る。望ましく、ＲＧＤモチーフを含む５〜４５個のアミノ酸からなり得る。より望ましくは、ＲＧＤモチーフを含む９個、１２個または１５個のアミノ酸からなり得る。ＲＧＤモチーフは、前記配列番号１のアミノ酸配列のうち、３３、３４、３５番目のアミノ酸である。前記配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチドの断片は、前記ＲＧＤモチーフ、即ち、前記配列番号１の３３、３４、３５番目のアミノ酸を含めばよく、必ずしもＲＧＤモチーフと連続したアミノ酸を含むことに制限されない。前記配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチドの断片は、該当の断片に含まれているシステイン間の二硫化結合を含むことができる。前記該当の断片に含まれているシステイン間の二硫化結合は、該当の断片内の一つのシステインと、該当の断片外の一つのシステインとの二硫化結合とは区別される。該当の断片に含まれているシステイン間の二硫化結合は、該当の断片に含まれているシステインの個数によって０個以上の二硫化結合を含むことができ、選択的に二硫化結合がないか、１個以上の二硫化結合を含むことができ、望ましくは、二硫化結合がないか、３個以下の二硫化結合を含むことができる。

望ましくは、前記配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチドの断片は、以下のいずれか一種であり得る。

１）配列番号１のアミノ酸配列の、ＲＧＤモチーフを含む５〜４５個のアミノ酸からなり、選択的に断片内のシステイン間の二硫化結合がないか、３個以下の二硫化結合が形成されたことを特徴とする断片；
２）配列番号１のアミノ酸配列のうち、３０〜３８番目のアミノ酸を含み、選択的に断片内のシステイン間の二硫化結合がないか、１個以上の二硫化結合が形成されたことを特徴とする断片；
３）配列番号１のアミノ酸配列のうち、３２〜４３番目のアミノ酸を含み、選択的に断片内のシステイン間の二硫化結合がないか、１個以上の二硫化結合が形成されたことを特徴とする断片；
４）配列番号１のアミノ酸配列のうち、３０〜４４番目のアミノ酸を含み、選択的に断片内のシステイン間の二硫化結合がないか、１個以上の二硫化結合が形成されたことを特徴とする断片；
５）配列番号１のアミノ酸配列のうち、１８〜５４番目のアミノ酸を含み、選択的に断片内のシステイン間の二硫化結合がないか、１個以上の二硫化結合が形成されたことを特徴とする断片；及び
６）配列番号１のアミノ酸配列のうち、１０〜５４番目のアミノ酸を含み、選択的に断片内のシステイン間の二硫化結合がないか、１個以上の二硫化結合が形成されたことを特徴とする断片。

これらの断片は、前記２）〜６）で特定したアミノ酸を含み、５８個以下のアミノ酸配列からなり、該当の断片に含まれているシステイン間の二硫化結合を含むことができる。該当の断片に含まれているシステインの個数に応じて０個以上の二硫化結合を含むことができ、望ましくは、０個以上３個以下の二硫化結合を含むことができる。

より望ましくは、前記配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチドの断片は、以下のいずれか一種であり得る。

１）配列番号１のアミノ酸配列の、ＲＧＤモチーフ含む９個、１２個または１５個のアミノ酸からなり、選択的に断片内のシステイン間の二硫化結合がないか、３個以下の二硫化結合が形成されたことを特徴とする断片；
２）配列番号１のアミノ酸配列のうち、３０〜３８番目のアミノ酸からなることを特徴とする断片；
３）配列番号１のアミノ酸配列のうち、３２〜４３番目のアミノ酸からなり、３６番目のシステインと４２番目のシステインとの間に二硫化結合が形成されることを特徴とする断片；
４）配列番号１のアミノ酸配列のうち、３０〜４４番目のアミノ酸からなり、断片内のシステイン間の二硫化結合がないことを特徴とする断片；または
５）配列番号１のアミノ酸配列のうち、３０〜４４番目のアミノ酸からなり、断片内のシステイン間に１個の二硫化結合が形成されることを特徴とする断片。

前記２）の断片は、本発明の具体的な実施例によれば、ＨＵ０２７であり得、これは配列番号５である。

前記３）の断片は、本発明の具体的な実施例によれば、ＨＵ０２６であり得、これは配列番号４である。

前記４）の断片は、本発明の具体的な実施例によれば、ＨＵ０２５であり得、これは配列番号３である。

前記５）の断片は、本発明の具体的な実施例によれば、ＨＵ０２４であり得、これは配列番号２である。

本発明による「ペプチドまたはその断片」は、これらの薬学的に許容可能な誘導体を包括して定義され、薬学的に許容可能な誘導体は、本発明によるペプチドまたは断片と等しい生物学的機能及び／または活性を有するか、提供することと認識されるべきであり、本発明の目的を害しない以上、本発明によるペプチドまたは断片の薬学的に許容可能な塩を含み得る。

前記「薬学的に許容可能な塩」とは、前記化合物の、所望の生物学的及び／または生理学的活性を保有し、希望しない毒物学的効果は最小限にした全ての塩を意味する。塩としては、薬学的に許容可能な遊離酸によって形成された酸付加塩が有用である。酸付加塩は、通常の方法、例えば、化合物を過量の酸水溶液に溶解させ、この塩を水混和性有機溶媒、例えば、メタノール、エタノール、アセトンまたはアセトニトリルを用いて沈殿させて製造する。同モル量の化合物及び水中の酸またはアルコール（例えば、グリコールモノメチルエーテル）を加熱し、続いて前記混合物を蒸発させて乾燥させるか、または析出した塩を吸引ろ過することができる。この際、遊離酸としては、無機酸及び有機酸を用いることができ、無機酸には、塩酸、臭化水素酸、リン酸、窒酸、硫酸、スズ酸などが挙げられ、有機酸には、メタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、アセト酸、トリフルオロアセト酸、マレイン酸、コハク酸、シュウ酸、安息香酸、酒石酸、フマル酸、マンデル酸、プロピオン酸、クエン酸、乳酸、グリコール酸、グルコン酸、ガラクツロン酸、グルタミン酸、グルタル酸、グルクロン酸、アスパラギン酸、アスコルビン酸、カルボン酸、バニリン酸、ヨウ化水素酸などが挙げられるが、これらに制限されない。また、塩基を用いて薬学的に許容可能な金属塩を形成することができる。アルカリ金属またはアルカリ土類金属塩は、例えば、化合物を過量のアルカリ金属水酸化物またはアルカリ土類金属水酸化物溶液中に溶解させ、非溶解化合物塩をろ過した後、余液を蒸発、乾燥することで得る。ここで、金属塩としては、特に、ナトリウム、カリウムまたはカルシウム塩を製造することが製薬上望ましいが、これに制限されることではない。また、これに対応する銀塩は、アルカリ金属またはアルカリ土類金属塩を適当な銀塩（例えば、窒酸銀）と反応させることで得ることができる。本発明によるペプチドまたはその断片は、特に示さない限り、本発明によるペプチドまたは断片に存在し得る酸性または塩基性基の塩をほとんど含む。例えば、薬学的に許容可能な塩としては、ヒドロキシ基のナトリウム、カルシウム及びカリウム塩などが含まれ得、アミノ基のその他薬学的に許容可能な塩としては、臭化水素酸塩、硫酸塩、水素硫酸塩、リン酸塩、水素リン酸塩、二水素リン酸塩、アセテート、コハク酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、乳酸塩、マンデル酸塩、メタンスルホン酸塩（メチレート）及びｐ−トルエンスルホン酸塩（トシレート）などがあり、当業界で知られた塩の製造方法により製造され得る。

本発明によるペプチドまたはその断片は、当分野における公知の多様な方法によって製造することができ、望ましくは、たんぱく質合成法によって製造することができる（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｒ．Ｂ．，Ｊ．Ａｍ．ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９，１９６３）。

本発明によるペプチドまたはその断片は、以下のいずれか一つ以上の効果を発揮する。

また、本発明によるペプチドまたはその断片は、医薬組成物または化粧料組成物の形態で提供され得、前記医薬組成物及び化粧料組成物を総括し、以下、「本発明による組成物」ともする。

本発明において、「促進」、「改善」または「治療」とは、本発明による組成物の投与によって症状が好転するか、良子に変わる全ての行為を意味する。また、「防止」とは、本発明による組成物の投与によって症状が抑制されるか、発病が遅延する全ての行為を意味する。

前記効果別の望ましい本発明によるペプチドまたはその断片は、以下のようである。

火傷治療
本発明において、「火傷」とは、高温の気体、液体、固体または火炎などに皮膚が触れることにより発生する損傷を意味し、やけどした広さ、深さ、火傷を誘発した物体の温度と接触時間、皮膚状態などによって多様な症状及び合併症が発生し得る。火傷の重症度によって、表皮、真皮及び／または下皮が損傷し、皮膚付属器官である毛嚢、汗腺、皮脂腺などが損傷し、皮膚層の下に位置する脂肪層、靭帯、筋膜、筋肉、骨組織などまで損傷し得る。また、痂皮、紅斑、痛症、浮腫み、水疱、灼熱感などが伴われ得る。

本発明による火傷治療用組成物には、ＲＧＤモチーフ（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐｍｏｔｉｆ）を含む配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチドまたはその断片を含む。最も望ましくは、配列番号１のアミノ酸配列からなる二硫化結合を含まないペプチドを含むことができる。

緑内障治療
本発明において、「緑内障」とは、視神経萎縮症の形態を帯びながら、網膜神経叢細胞を含んで視神経に生じる疾患の総称である。緑内障の症状には、眼圧上昇、視野変化、角膜浮腫、羞明、流涙、まぶた痙攣、散瞳、頭痛、嘔吐、充血、視力減退、眼球のひどい痛症などがある。

本発明による緑内障治療用組成物には、ＲＧＤモチーフを含む配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチドまたはその断片を含む。

望ましくは、本発明による緑内障治療用組成物には、ＲＧＤモチーフを含む配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチド断片が含まれ得る。

前記ＲＧＤモチーフを含む配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチド断片は望ましくは以下のようである。

より望ましくは、前記配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチドの断片は以下のいずれか一種であり得る。

１）配列番号１のアミノ酸配列の、ＲＧＤモチーフ含む９個、１２個または１５個のアミノ酸からなり、選択的に断片内のシステイン間の二硫化結合がないか、３個以下の二硫化結合が形成されたことを特徴とする断片；または、
４）配列番号１のアミノ酸配列のうち、３０〜４４番目のアミノ酸からなり、断片内の二硫化結合がないことを特徴とする断片。

皮膚のしわ改善
本発明において、「皮膚のしわ」とは、皮膚変性、弾力減少などによって皮膚が老化して弛むことで生成されるものを意味する。

本発明による皮膚のしわ改善用組成物には、ＲＧＤモチーフを含む配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチドまたはその断片を含む。

望ましくは、本発明による皮膚のしわ改善用組成物には、配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチド内のシステイン間の二硫化結合が形成されていないペプチドを含むことができる。

または、望ましく、本発明による皮膚のしわ改善用組成物には、ＲＧＤモチーフを含む配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチド断片が含まれ得る。

前記ＲＧＤモチーフを含む配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチド断片は、望ましくは以下のようである。

さらに望ましくは、前記配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチドの断片は、以下のいずれか一種であることができる。

１）配列番号１のアミノ酸配列の、ＲＧＤモチーフ含む９個、１２個または１５個のアミノ酸からなり、選択的に断片内のシステイン間の二硫化結合がないか、３個以下の二硫化結合が形成されたことを特徴とする断片；または
５）配列番号１のアミノ酸配列のうち、３０〜４４番目のアミノ酸からなり、断片内のシステイン間の１個の二硫化結合が形成されたことを特徴とする断片。

脱毛防止、頭皮改善または発毛及び育毛の促進
本発明において、「脱毛（Ａｌｏｐｅｃｉａまたはｈａｉｒｌｏｓｓ）」は、毛根が小さくなることで毛髪の太さが薄くなり、究極に、正常に毛髪が存在すべき部位に毛髪が消失する状態を意味する。このような脱毛を誘発する原因としては、遺伝的な要素、性ホルモンであるテストステロンの過多分泌、毛嚢の血流量低下、皮脂の過多分泌、ストレス、不均衡的な食生活、大気汚染、過多な紫外線露出などがあり、主に色々な要因が複合的に作用する。

また、本発明において、「頭皮」とは、皮膚（Ｓｋｉｎ）、結合組織（Ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅｔｉｓｓｕｅ）、腱膜（Ａｐｏｎｅｕｒｏｓｉｓ）、疎性結合組織（Ｌｏｏｓｅｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅｔｉｓｓｕｅ）、頭蓋骨膜（Ｐｅｒｉｃｒａｎｉｕｍ）の５つの層から構成され、頭皮を構成する主要構造物には毛髪が含まれる。

本発明による脱毛防止、頭皮改善または発毛及び育毛促進用組成物には、ＲＧＤモチーフを含む配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチドまたはその断片を含む。

１）配列番号１のアミノ酸配列の、ＲＧＤモチーフ含む９個、１２個または１５個のアミノ酸からなり、選択的に断片内のシステイン間の二硫化結合がないか、３個以下の二硫化結合が形成されたことを特徴とする断片と、
２）配列番号１のアミノ酸配列のうち、３０〜３８番目のアミノ酸からなることを特徴とする断片；
３）配列番号１のアミノ酸配列のうち、３２〜４３番目のアミノ酸からなり、３６番目のシステインと４２番目のシステインとの間に二硫化結合が形成されることを特徴とする断片；
４）配列番号１のアミノ酸配列のうち、３０〜４４番目のアミノ酸からなり、断片内のシステイン間の二硫化結合がないことを特徴とする断片；または
５）配列番号１のアミノ酸配列のうち、３０〜４４番目のアミノ酸からなり、断片内のシステイン間の１個の二硫化結合が形成されることを特徴とする断片。

本発明による組成物は、薬学的組成物または化粧料組成物の形態に製造できる。このような薬学的組成物または化粧料組成物は、薬学的に（または化粧学的に）許容される賦形剤、崩壊剤、結合剤、滑沢剤、湿潤剤、乳化剤または懸濁化剤などを含み得る。本発明による組成物は、単独またはいかなる便利な運搬剤、賦形剤などとともに混合して使用可能であり、そのような使用剤形は、単回投与または反復投与剤形であり得る。

本発明による組成物は、臨床投与時、非経口投与が可能である。

本発明による組成物は、固形製剤、半固形剤または液状製剤であり得る。固形製剤としては、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、坐剤などがあるが、これらに限定されることではない。固形製剤には、賦形剤、着香剤、結合剤、防腐剤、崩壊剤、滑沢剤、充填剤などが含まれ得るが、これらに限定されることではない。半固形製剤としては、クリーム剤、ローション剤、乳化剤、リニメント剤などがあるが、これらに限定されず、適当な着色剤、着香剤、安定化剤、粘性化剤、界面活性剤などを添加して製造することができる。液状製剤としては、水、アルコール、プロピレングリコール溶液のような溶液剤、懸濁液剤、油剤などがあるが、これらに限定されず、適当な着色剤、着香剤、安定化剤、粘性化剤などを添加して製造することができる。例えば、散剤は、本発明の有効成分と、乳糖、でん粉、微結晶セルロースなど、薬剤学的に許容される適当な賦形剤とを単純混合することで製造することができる。顆粒剤は、本発明の有効成分；薬剤学的に許容される適当な賦形剤；及びポリビニールピロリドン、ヒドロキシプロピルセルロースなどの薬剤学的に許容される適当な結合剤を混合した後、水、エタノール、イソプロパノールなどの溶媒を用いた湿式顆粒法または圧縮力を用いた乾式顆粒法を用いて製造できる。また、錠剤は、前記顆粒剤をマグネシウムステアレートなどの薬剤学的に許容される適当な滑沢剤と混合した後、打錠機を用いて打錠することで製造することができる。また、例えば、皮膚外用剤は、バセリン、ステアリルアルコールなどの薬剤学的に許容される適当な基剤；ポリソルベート、ソルビタンセスキオレートなどの薬剤学的に許容される適当な界面活性剤；グリセリンなどの薬剤学的に許容される適当な保湿剤；薬剤学的に許容される適当な溶剤；及び着香剤、着色剤、安定化剤、粘性化剤などを均質に混合する通常の皮膚外用剤の製造方法によって製造することができる。

本発明による組成物において、本発明によるペプチドまたはその断片の含量は、組成物全体重量に対し０．０１〜１０重量％であることが望ましい。０．０１重量％未満の場合、目的とする効果（皮膚のしわ、火傷、緑内障及び脱毛など）が充分発揮できず、１０重量％超過の場合、産業上の利用可能性面でペプチドの合成費用を考慮すれば、経済的競争力が弱いだけでなく、免疫原性（ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ）を誘発して初期活性を有するが、反復投与時、抗体形成による効力減衰を誘発し得る。

本発明による化粧料組成物は、基礎化粧用またはメイクアップ用製品類である化粧水類、エッセンス類、オイル類、クリーム類、パウダー類、パック類、ファンデーション類、メークアップベース類、スティック類などの剤形で製造されて用いられ得る。また、このような化粧料組成物は、液状、クリーム状、ペースト状、固体状などの多様な性状に適用可能であり、通常の化粧料製造法により製造できる。例えば、本発明の組成物は、カーボマー、ブチレングリコール、グリセリン、ＰＥＧ、エタノール、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、トリエタノールアミン、精製水などを用いて柔軟化粧水として製造でき、または、セテアリルアルコール、グリセリルステアレート／ＰＥＧ−１００ステアレート、ポリソルベート６０、ソルビタンセスキオレエート、セチルオクタノエート、スクアラン、アプリコットカーネルオイル、ブチレングリコール、カーボマー、キサンタンガム、防腐剤、精製水、アルギニンなどの成分を用いてローションタイプに製造できるが、本発明はかかる剤形に限定されない。

本発明による薬学的組成物は、本発明が属する技術分野における公知の通常の方法によって、軟膏、クリーム、ゲル、フィルム剤、錠剤、カプセル、顆粒剤、懸濁液、またはシロップなどの多様な剤形に剤形化して使用可能である。

本発明による薬学的組成物の薬学的有効量、有効投与量は、薬学的組成物の製剤化方法、投与方式、投与時間及び／または投与経路などによって変わり得る。また、前記医薬組成物の投与によって達成しようとする反応の種類と程度、投与対象となる個体の種類、年齢、体重、一般的な健康状態、疾病の症状や程度、性別、食餌、排泄、該当個体に同時または異時にともに用いられる薬物、その他の組成物の成分などを含め、多くの因子及び医薬分野においてよく知らている類似因子によって変わり得る。当該技術分野における通常の知識を有する者は、目的とする治療に効果的な投与量を容易に決定して処方することができる。本発明による医薬組成物の投与は、一日に１回投与され得、数回に分けて投与され得る。したがって、前記投与量は、いかなる面においても本発明の範囲を限定しない。本発明による薬学的組成物の望ましい投与量は、１日に０．０１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇであり得る。

本発明による組成物は、本発明によるペプチドまたはその断片の他に、本発明が目的とする主な効果を損じない範囲内において、望ましくは、主な効果に相乗効果を与える他の成分などを含んでもよい。

例えば、本発明の組成物が脱毛防止のために用いられる場合、毛髪の特性を考慮して付加的な機能付与のために、ふけ防止剤、毛根強化剤、毛髪補修剤、頭皮保護剤、清凉剤などの補助成分を添加してもよい。これらの通常の発毛及び育毛用組成物に配合される防止剤、毛根強化剤、毛髪補修剤、頭皮保護剤、清凉剤などの補助成分は、通常のものを用いることができるが、これらに限定されない。

以下、本発明を具体的な実施例を挙げて説明する。しかし、本発明による実施例は本発明をより具体的に説明するためのものであり、本発明の範囲が後述する実施例に限定されないことは、当業界における通常の知識を有する者にとって自明である。

実施例１．ペプチドの合成
ＡＤＡＭメタロペプチダーゼドメイン１５（ＡＤＡＭｍｅｔａｌｌｏｐｅｐｔｉｄａｓｅｄｏｍａｉｎ１５，ＡＤＡＭ１５）（ＧｅｎＢａｎｋａｃｃｅｓｓｉｏｎｎｏ．ＡＡＨ１４５６６．１）の４５２〜５０９番目のアミノ酸からなるポリペプチドをＨＵ０２２（配列番号１）とし、これはディスインテグリン（ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎ）の一部を含む。

また、ＡＤＡＭ１５たんぱく質（ＮＣＢＩＲｅｆｅｒｅｎｃｅＳｅｑｕｅｎｃｅ：ＮＭ＿００１２６１４６４）のディスインテグリン部分のうち、ＲＧＤモチーブを中心でペプチドを構成し、ＲＧＤモチーブを中心で３次的構造で主な役割を果すシステイン（ｃｙｓｔｅｉｎｅ）を含み、これらのシステイン間の二硫化（ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ）結合が形成されるようにデザインすることで総１５個のアミノ酸から構成されたペプチドを製作し、これをＨＵ０２４とした（配列番号２）。

また、ＨＵ０２４と等しいアミノ酸配列を有するが、二硫化結合を含まないように構成されたペプチドを製作し、これをＨＵ０２５とした（配列番号３）。

また、追加的に、ＡＤＡＭ１５たんぱく質のディスインテグリン部分のうち、ＲＧＤモチーブを中心でペプチドを構成し、かつより小さいサイズのペプチドを製作し、総１２個のアミノ酸から構成されたペプチドをＨＵ０２６とし（配列番号４）、そして総９個のアミノ酸から構成されたペプチドをＨＵ０２７とした（配列番号５）。

以下、これらのペプチドの製作方法をより詳しく説明する。

本発明のＲＧＤモチーフを含む新規ペプチドの合成のために、固相ペプチド合成法（ｓｏｌｉｄ−ｐｈａｓｅｍｅｔｈｏｄ）を用いた（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｒ．Ｂ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９，１９６３）。合成しようとする目的のペプチドＨＵ０２４、ＨＵ０２５、ＨＵ０２６、ＨＵ０２７は、Ｆｍｏｃｃｈｅｍｉｓｔｒｙを用いてリンクアミドＭＢＨＡ樹脂（ＲｉｎｋａｍｉｄｅＭＢＨＡｒｅｓｉｎ）を合成し、ここに用いられたアミノ酸は、Ｎ−末端と測鎖部分が９−フルオレニルメトキシカルボニル基（９−ｆｌｕｏｒｅｎｙｌｍｅｔｈｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌｇｒｏｕｐ）により保護されているものを用い、合成時に用いられるアミノ酸の量は、レジンの量０．１ｍｍｏｌを基準で３当量である０．３ｍｍｏｌを用いた。各段階別のカップリング時、Ｃ−末端の活性化試薬（ａｃｔｉｖａｔｉｏｎｒｅａｇｅｎｔ）として、ＤＩＣ（Ｎ，Ｎ’−ＤｉｉｓｏｐｒｐｙｌＣａｂｏｄｉｉｍｉｄｅ）とのラセミ化（ｒａｃｅｍｉｚａｔｉｏｎ）を防ぐための試薬としてＣｌ−ＨＯＢｔ（６−Ｃｈｌｏｒｏ−１−ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌｅ）を用いてそれぞれの配列に合わせて順次添加して反応させ、前記ペプチドのＦｍｏｃ基を除去するために５０％ピペリジン／ＤＭＦ（５０／５０，ｖ／ｖ）溶液を常温で１０〜２０分間処理することで除去した。ペプチド合成が完了した後、固相から分離して測鎖の脱保護（ｄｅｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ）のためにＴＦＡ（Ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｉｃａｃｉｄ）／水（９．５／０．５，ｖ／ｖ）の混合溶液を常温で２時間処理した。ペプチド内の二硫化結合の形成のために高希釈（Ｈｉｇｈｄｉｌｕｔｉｏｎ）の空気酸化（ａｉｒｏｘｉｄａｔｉｏｎ）方法を用いて分子内のＳ−Ｓ結合を形成した。ここで、反応を加速化するために触媒量のＤＭＳＯを用いた。

前記合成されたペプチドを逆相のＣ１８カラムを用いてＨＰＬＣで分離し、分析用ＨＰＬＣで９５％以上の純度を確認し、それぞれのペプチド分子量をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（ｍａｔｒｉｘ−ａｓｓｏｃｉａｔｉｅｄｌａｓｅｒｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ）質量分析法で測定した結果、測定値と一致した（図１、図２、図３及び図４）。

合成されたポリペプチドの構成、アミノ酸配列及び特徴を表１に示した。

併せて、目的のペプチドＨＵ０２２は、商業的に製造された市販のもの（ＥＹＥＧＥＮＥＩｎｃ．）を用いた。

実施例２．火傷治療効果
雄ＳＤ（Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ）ラット５５匹を５群に分け、正常群５匹（１群、Ｇ１）、陰性対照群９〜１０匹（１群、Ｇ２）、試験群３０匹（１０匹ずつ３群、Ｇ３、Ｇ４、Ｇ５）、及び陽性対照群９〜１０匹（１群、Ｇ６）に分けて実験を行った。正常群を除いた残りの群では火傷誘発の雄ＳＤラットを実験対象として用い、ＳＤラットを麻酔した後、アルミ電気ごてで直径２ｃｍの２度火傷を誘発した。

火傷誘発の雄ＳＤラットに試験物質ＨＵ０２２（Ｇ３、Ｇ４、Ｇ５）、生理食塩水（Ｇ２）及びフィブラスト（Ｆｉｂｌａｓｔ）（Ｇ６）を、１日１回、１週に７回、７日間繰り返して皮膚に塗布した。対照群（Ｇ６）には、フィブラスト１０μｇ／回／匹塗布し、試験群は、３群に分けて各群に３．３μｇ／回／匹（Ｇ３）、１０μｇ／回／匹（Ｇ４）、３０μｇ／回／匹（Ｇ５）塗布した。

火傷誘発後、試験物質の塗布前に写真撮影を行い、１、４、８、１１、１５日目に写真撮影を行い、写真撮影後、試験物質を塗布して塗布部位をガーゼで覆った後テガダーム（ｔｅｇａｄｅｒｍ、登録商標）で巻いた。また、火傷面積の測定のために撮影した写真を画像分析プログラムを用いて分析した。

火傷誘発後１４日目に、火傷を誘発した部位を真皮部位まで摘出して１０％中性緩衝ホルマリン溶液に固定した後、Ｈ＆Ｅ染色により組織病理学的検査を行った。皮膚組織は、光学顕微鏡（ＯｌｙｍｐｕｓＢＸ４１、Ｏｌｙｍｐｕｓ、Ｊａｐａｎ）で観察し、表皮（ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ）、真皮（ｄｅｒｍｉｓ）、下皮（ｈｙｐｏｄｅｒｍｉｓ）及び皮下筋肉（ｍｕｓｃｌｅ）における火傷治療に係わる組織学的変化を、次の６項目について分析した；
１）痂皮（Ｅｓｃｈａｒ）、（０；なし、１＋；微弱、２＋；中程度、３＋；ひどい、４＋；非常にひどい）
２）炎症細胞浸潤（Ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎｏｆｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙｃｅｌｌｓ）、（０；なし、１＋；上皮浸潤、２＋；真皮浸潤、３＋；下皮浸潤、４＋；筋肉浸潤）
３）血管形成（Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）（４００倍率でランダムで３ヶ所を選定して観察される全ての血管の個数を数えて平均値を求めた）
４）皮膚付属器官再生（Ｐｉｌｏｓｅｂａｃｅｏｕｓ）、（０；なし、１＋；再生程度が微弱、２＋；再生が複数の箇所で観察される、３＋；付属器官の再生が形態は正常であるが、正常に比べて数が足りない場合、４＋；正常群に等しい水準）
５）結合組織増殖（Ｆｉｂｒｏｐｌａｓｉａ）（０；正常群水準、１＋；真皮または下皮の一部でのみ観察される、２＋；真皮及び下皮で観察される、３＋；真皮及び下皮で広範囲に観察される、４＋；火傷部位の全領域で観察される）
６）上皮再生（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）（０；再生が観察されない、１＋；一部で基底細胞の一層として観察される、２＋；基底細胞が列をなして観察される、３＋；損傷した皮膚の多くの箇所で基底細胞が一層または多層として観察され、有棘層または顆粒層に区分される場合、４＋；正常群の上皮構造）で評価した後、群ごとに平均値を計算した。

測定結果において、母数的な比較は、スチューデントｔ検定（Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓｔ−ｔｅｓｔ）及び一元配置分散分析（Ｏｎｅ−ＷａｙＡＮＯＶＡ）によって有意性を確認し、陰性対照群との有意性を検定した。また、火傷の組織病理学的検査結果は、クラスカル・ウォリスＨ検定（Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ’Ｈ−ｔｅｓｔ）を行い、群間有意性が認められれば、マン・ホイットニーＵ検定（Ｍａｎｎ−ＷｈｉｔｎｅｙＵ−ｔｅｓｔ）によって群間比較を行った。統計のための電算プログラムとしては、ＳＰＳＳ１０．１Ｋを用いた。Ｐ＜０．０５である場合、統計学的に有意であると判定した。

その結果、試験物質塗布による特別な異常症状は観察されず、正常群に比べて火傷誘発群において８日目（Ｄａｙ８）に統計学的に有意な体重減少が観察されたが（Ｐ＜０．０１）、火傷誘発によることと判断した（表２及び図５）。

火傷面積の測定結果、面積絶対値の比較においては、陰性対照群に比べて全ての試験群から統計学的に有意な変化は観察されなかった（表３及び図６）。火傷面積減少率（％）を比べた結果、試験物質３０μｇ／匹／日群（Ｇ５）が、陰性対照群に比べて４日目において統計学的に有意な面積減少が観察され（Ｐ＜０．０５）、残りの試験物質投与群では差が観察されなかった（表４及び図７）。

組織病理学的検査結果は、以下のようである（表５、図８、図９及び図１０）：
１）痂皮（Ｅｓｃｈａｒ）
火傷で損傷した皮膚上皮には、繊維素、白血球、凝固した滲出液及び壊死組織がともに凝固して痂皮を形成する。痂皮形成の程度を５段階（０〜４点）で評価した。正常群Ｇ１では痂皮が観察されない正常の皮膚組織であった。陰性対照群（Ｇ２）及び試験物質３．３μｇ／匹／日投与群（Ｇ３）では、平均４．０±０．０及び４．０±０．０点であって、厚く形成された痂皮が火傷が誘発した全体部位で観察され、「非常にひどい」と評価した。試験物質１０μｇ／匹／日投与群（Ｇ４）は、３．２±０．６点であって、火傷誘発部位の全体面積の約８０％水準で痂皮が観察され、試験物質３０μｇ／匹／日投与群（Ｇ５）及び陽性対照群（Ｇ６）は、２．７±０．７及び２．６±０．５点であって痂皮形成が減少した。また、試験物質１０μｇ／匹／日投与群（Ｇ４）、３０μｇ／匹／日投与群（Ｇ５）及び陽性対照群（Ｇ６）では、痂皮形成が減少したことに加え、痂皮の厚さも減少したことが観察され、統計学的分析結果、陰性対照群（Ｇ２）に比べて有意性があると確認された（Ｐ＜０．０１）。

２）炎症細胞浸潤（Ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎｏｆｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙｃｅｌｌｓ）
火傷誘発後、急性炎症反応が起き、この際、リンパ球と好中球の浸潤が主に観察される。炎症細胞浸潤の程度を５段階（０〜４点）で評価した。正常群（Ｇ１）では、炎症細胞浸潤が観察されない正常組織であった。陰性対照群（Ｇ２）、全ての試験物質投与群（Ｇ３、Ｇ４、Ｇ５）及び陽性対照群（Ｇ６）は、上皮、真皮及び下皮層でリンパ球、好中球及び単球などの炎症細胞の浸潤が観察され、各群間の差はなかった。

３）皮膚付属器官再生（Ｐｉｌｏｓｅｂａｃｅｏｕｓ）
真皮層に位置している毛嚢、汗腺、皮脂腺などのような皮膚付属器官の火傷後の再生程度は、上皮再生と共に皮膚再生程度を判断する重要な基準となる。皮膚付属器官は上皮細胞で構成されており、付属器官に位置している微分化した細胞は分化して上皮へ移動し、上皮の再生過程に参与する。皮膚付属器官の再生程度は、５段階（０〜４点）として評価した。正常群（Ｇ１）は、毛嚢及び皮脂腺などの皮膚付属器官が正常構造に観察され、４点で評価した。陰性対照群（Ｇ２）は、皮膚付属器官の再生が全く観察されないか、再生程度が非常に微々たることに観察された。試験物質１０μｇ／匹／日投与群（Ｇ４）及び試験物質３０μｇ／匹／日投与群（Ｇ５）では、試験物質の濃度依存的に皮膚付属器官の再生が促進する様相を示し、皮膚付属器官の再生水準が陰性対照群（Ｇ２）に比べて統計学的有意性があることが示された（Ｐ＜０．０５またはＰ＜０．０１）。陽性対照群（Ｇ６）においても皮膚付属器官の再生促進が観察され、統計学的には有意であった（Ｐ＜０．０１）。

４）結合組織増殖（Ｆｉｂｒｏｐｌａｓｉａ）
火傷誘発後、治癒過程において、線維芽細胞の増殖及びこれらの細胞から生産されるコラーゲンの増加が観察される。結合組織増殖の程度は、５段階（０〜４点）で評価した。皮膚再生とともに真皮で線維細胞の増殖及びコラーゲンの形成が緻密に行われた後、再生が終わって行きながら増殖した線維細胞と増加したコラーゲンは、徐々に減少して正常な水準に戻る。正常群（Ｇ１）は、線維芽細胞が観察されない正常組織であった。陰性対照群（Ｇ２）、全ての試験物質投与群（Ｇ３、Ｇ４、Ｇ５）と陽性対照群（Ｇ６）は、真皮及び下皮において非常に活発な線維細胞の増殖とコラーゲンの増加が観察され、各群間差はなかった。

５）上皮再生（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）
上皮細胞再生は、基底細胞の増殖が行われながら、皮膚上皮細胞に分化して損傷または脱落した上皮を再生する。表皮上皮の再生程度は、上皮形成及び基底細胞の増殖程度を観察して５段階（０〜４点）で評価した。正常群（Ｇ１）において、上皮組織は、基底層、有棘層、顆粒層及び角質層が正常に観察された。陰性対照群（Ｇ２）は、ほとんどの動物から上皮再生が全く観察されなかった。試験物質３．３μｇ／匹／日投与群（Ｇ３）においては、一部領域で微々たる水準の基底層細胞の再生が観察され、試験物質１０μｇ／匹／日投与群（Ｇ４）及び３０μｇ／匹／日投与群（Ｇ５）と陽性対照群（Ｇ６）において、より広い基底層の再生が観察されることから、陰性対照群に比べて統計学的に有意な上皮細胞の再生促進の効果があると評価された（Ｐ＜０．０５）。

実施例３．しわの改善効果
満３０〜６５歳の成人女性であって、目元にしわがある者を対象として実験を進んだ。４週間、試験製品（ＨＵ０２２またはＨＵ０２４）と対照製品（ＤＩ−ｗａｔｅｒ）をランダムで割り当て、顔面の左右にそれぞれ１日２回使用し、被験者は、訪問１において、４週間使用する試験製品と対照製品を受領するとともに、製品使用前の評価及び調査を完了した。訪問２、３は、製品使用開始後２週間隔で、各訪問時には計画書に定められた各種評価及び調査に応じるようにした。

評価項目、試験方法及び結果は、以下のようである。

（１）試験製品ＨＵ０２２のしわ改善効果の評価
機器を用いて目元のしわの程度を測定した。しわ程度の測定対象部位は、被験者の目元部位であって、顔を半分に分けて左側と右側を測定部位にした。しわ程度の測定のために、被験者は、測定部位を水で洗った後、室内温度２０〜２５℃、湿度４０〜６０％の恒温恒湿条件の控え室で３０分間安定を取って皮膚表面の温度と湿度を測定空間の環境に適応するようにし、安定を取る間の水分攝取は制限した。客観的測定のために研究者１人が測定し、製品使用前である訪問１と製品使用２、４週後である訪問２、訪問３の各測定時、同一部位を測定した。試験製品の使用前と、使用後２、４週に試験製品と対照製品を適用した部位の皮膚レプリカをＶｉｓｉｏｍｅｔｅｒＳＶ６００（Ｃｏｕｒａｇｅ−ＫｈａｚａｋａｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃＧｍｂＨ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてｔｒａｎｓｐａｒｅｎｃｙｐｒｏｆｉｌｏｍｅｔｒｙａｎａｌｙｓｉｓを行い、対照群と試験群のそれぞれで製品使用４週後に差があるかを検証するために、使用前に対する製品使用２週、４週後のＲ１、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ５測定値の変化率を分析した。

しわ程度のパラメーターは、以下のようである。

試験製品（ＨＵ０２２）の使用によるＲ３数値の変化を確認するために、使用前、使用２週後、使用４週後のＲ３数値を測定した。試験製品のＲ３数値は、使用前が３４．２４±３．５１、使用２週後が２４．４１±４．１６、使用４週後が１８．６２±２．７９で示され、対照製品のＲ３数値は、使用前が２２．４８±２．７４、使用２週後が２０．７０±１．７６、使用４週後が１８．１３±０．９１で示され、このようなＲ３数値の変化をより明確に分かるように各時間帯ごとのＲ３変化率を計算して表した（表７、図１３）。

試験製品（ＨＵ０２２）の使用によるＲ１の数値変化を確認するために、使用前、使用２週後、使用４週後のＲ１数値を測定した。試験製品のＲ１数値は、使用前が７６．２３±１２．１５、使用２週後が５４．５９±１０．９９、使用４週後が５１．０６±１９．２８で示され、対照製品のＲ１数値は、使用前が５５．７４±１２．４８、使用２週後が５６．１７±１１．１１、使用４週後が５０．８６±４．６７で示された（表８、図１１）。

試験製品（ＨＵ０２２）の使用によるＲ２の数値変化を確認するために、使用前、使用２週後、使用４週後のＲ２数値を測定した。試験製品のＲ２数値は、使用前が５４．２６±５．７０、使用２週後が３６．８７±６．０２、使用４週後が２９．１６±２．７４で示され、対照製品のＲ２数値は、使用前が３５．２４±５．１２、使用２週後が３１．６４±４．３７、使用４週後が２７．５７±２．８９で示された（表９、図１２）。

試験製品（ＨＵ０２２）の使用によるＲ４数値の変化を確認するために、使用前、使用２週後、使用４週後のＲ４数値を測定した。試験製品のＲ４数値は、使用前が３０．４１±７．０１、使用２週後が２３．６４±５．１１、使用４週後が２２．９４±１０．０３で示され、対照製品のＲ４数値は、使用前が２４．５０±５．４３、使用２週後が２５．０６±５．４９、使用４週後が２４．４２±４．５７で示された（表１０、図１４）。

試験製品（ＨＵ０２２）の使用によるＲ５数値の変化を確認するために、使用前、使用２週後、使用４週後のＲ５数値を測定した。試験製品のＲ５数値は、使用前が１３．５７±３．６５、使用２週後が９．４４±２．４４、使用４週後が１０．１０±５．９７で示され、対照製品のＲ５数値は、使用前が１１．０２±２．９４、使用２週後が１１．４４±３．１４、使用４週後が１０．５１±１．９０で示された（表１１、図１５）。

また、３次元イメージ撮影によるしわの程度を測定した。しわ程度の測定対象部位は、被験者の目元部位であって、顔の右側を測定部位にした。しわ程度の測定のために被験者は、測定部位を水で洗った後、室内温度２０〜２５℃、湿度４０〜６０％の恒温恒湿条件の控え室で３０分間安定を取って皮膚表面の温度と湿度を測定空間の環境に適応するようにし、安定を取る間の水分攝取は制限した。客観的測定のために研究者１人が測定し、製品使用前である訪問１と製品使用２、４週後である訪問２、訪問３の各測定時、同一部位を測定した。試験製品（ＨＵ０２２）の使用前と、使用後２、４週に試験製品（ＨＵ０２２）を適用した部位を、３Ｄ皮膚撮影装置（ＰＲＩＭＯＳＰｒｅｍｉｕｍ）で撮影し、対照群と試験群のそれぞれで製品使用４週後に差があるかを検証するために、使用前に対する製品使用２週、４週後の保存されたイメージのしわパラメーターであるＲａ、Ｒｍａｘ、Ｒｔ、Ｒｐ、Ｒｖ値を分析した。

しわ程度のパラメーターは、以下のようである。

試験製品の使用によるＲａ数値の変化を確認するために、使用前、使用２週後、使用４週後のＲａ数値を測定した。

試験製品のＲａ数値は、使用前が１９．１９±４．２７、使用２週後が１８．２０±３．９４、使用４週後が１７．００±３．８８で示され、対照製品のＲａ数値は、使用前が１４．８６±４．４８、使用２週後が１４．９４±４．７３、使用４週後が１４．６０±４．５８で示された（表１３、図１６）。

試験製品の使用によるＲｍａｘ数値の変化を確認するために、使用前、使用２週後、使用４週後のＲｍａｘ数値を測定した。試験製品のＲｍａｘ数値は、使用前が１７６．２９±２７．７９、使用２週後が１６８．８３±２９．６１、使用４週後が１６８．８０±３３．２１で示され、対照製品のＲｍａｘ数値は、使用前が１６２．８１±６４．１５、使用２週後が１５９．５２±６１．８５、使用４週後が１５８．３６±６２．８０で示された（表１４、図１７）。

試験製品の使用によるＲｔ数値の変化を確認するために、使用前、使用２週後、使用４週後のＲｔ数値を測定した。試験製品のＲｔ数値は、使用前が１９５．０５±３１．３１、使用２週後が１８７．８５±３４．１０、使用４週後が１８４．６３±３６．８３で示され、対照製品のＲｔ数値は、使用前が１７４．１２±６８．９６、使用２週後が１７１．１３±６６．７６、使用４週後が１６９．８６±６５．８０で示された（表１５、図１８）。

試験製品の使用によるＲｐ数値の変化を確認するために、使用前、使用２週後、使用４週後のＲｐ数値を測定した。試験製品のＲｐ数値は、使用前が１２２．７３±３１．５５、使用２週後が１１６．４７±３５．７５、使用４週後が１２１．８８±３８．０６で示され、対照製品のＲｐ数値は、使用前が１２３．２９±５７．５１、使用２週後が１２０．３２±５３．５７、使用４週後が１１９．５７±５６．７７で示された（表１６、図１９）。

試験製品の使用によるＲｖ数値の変化を確認するために、使用前、使用２週後、使用４週後のＲｖ数値を測定した。試験製品のＲｖ数値は、使用前が７２．３２±１７．１６、使用２週後が７１．３８±１６．４４、使用４週後が６２．７５±１１．９２で示され、対照製品のＲｖ数値は、使用前が５０．８３±１６．１３、使用２週後が５０．８１±１６．２９、使用４週後が５０．２９±１１．７５で示された（表１７、図２０）。

また、目視評価を行った。試験製品の使用前及び使用後の訪問時ごとに専門家がグローバルフォトデミージスコア（ｇｌｏｂａｌｐｈｏｔｏｄａｍａｇｅｓｃｏｒｅ、ＢｒＪＤｅｒｍａｔｏｌ．２０１０；１６２（３）：４９７−５０２）を用いて点数化してしわの程度を評価した。対照群と試験群の各々で製品使用４週後に差があるかを検証するために、使用前に対する製品使用２週、４週後の目視評価点数値の変化率を分析した。Ｖｉｓｕａｌａｓｓｅｓｓｍｅｎｔｓｃｏｒｅは、以下のようである（表１８）。

その結果、試験製品の専門家の目視評価点数は、使用前が２．１７±０．７５、使用２週後が２．１７±０．７５、使用４週後が１．６７±１．０３で示され、対照製品の専門家の目視評価点数は、使用前が２．３３±１．０３、使用２週後が２．３３±１．０３、使用４週後が２．３３±１．０３で示された（表１９、図２１）。

また、被験者による有効性のアンケート調査を行った。試験製品の使用後に被験者が感じるしわ改善の程度について、改善された（４）、やや改善された（３）、変化なし（２）、やや悪くなった（１）、悪くなった（０）の５段階にし、被験者本人が応答するようにした。研究者は、各答弁に対する被験者数の百分率を求めて試験製品の効能有無を判断した。

しわ改善についてのアンケートの評価結果、試験製品と対照製品とも使用４週後である訪問３でしわが改善し、特に、対照製品に比べて試験製品においてさらに高い改善度として応答した。このような結果から、本試験に参与した被験者は、試験製品のしわ改善の効能に対して優秀であると感じることに示された（表２０）。

また、使用感及び嗜好度のアンケート調査を行った結果、臨床試験製品使用４週後に被験者が感じる製品の使用感について被験者が直接アンケートに応答するようにした。評価項目は、「しっとりさ、滑らかさ、伸び、吸収性、べたつき及び香り」の程度について調査し、「非常に良い、良い、普通、悪い、非常に悪い」の５段階で評価した。

調査結果、全般的に試験製品に対して肯定的な嗜好度を持っていることが確認された。特に、べたつき面で対照製品に比べて優れた嗜好度を示した（表２１）。

また、順応度評価を行い、訪問２、訪問３で試験用の製品使用日誌を回収して試験製品の使用回数を確認して順応度を求めた。各訪問時、順応度において８０％未満または６回以上連続使用しなかった場合は、試験参与を中止させた。その結果、試験を終了した全体順応度は１００％であり、最大順応度は１００．００％、最低順応度は１００．００％であった。本試験において８０％以下の順応度を示された被験者はいなかったため、全体被験者のデータを結果分析に使った。

また、安全性評価を行い、臨床試験製品の安全性は１回以上試験製品を用いた全ての被験者を対象として、製品使用後２週目、４週目に確認された異常反応と、試験期間中報告された全ての異常反応を総合して製品の安全性評価資料として使用した。異常反応についての報告は全くなく、皮膚科専門医による理学的検査においても、紅斑、発疹及び掻痒感などの皮膚異常所見は見られなかった。したがって、試験製品は、皮膚に刺激のない安全な製品であることが分かった。

（２）試験製品ＨＵ０２４のしわ改善効果の評価
評価項目及び試験方法は、試験製品ＨＵ０２２の評価と同様に行った。

機器を用いて目元のしわ部位を測定した後、試験製品の使用によるＲ３の数値変化を確認するために、使用前、使用２週後、使用４週後のＲ３の数値を測定した。試験製品のＲ３数値は、使用前が２９．１５±５．５６、使用２週後が２０．８０±３．９７、使用４週後が１７．８１±４．００で示され、対照製品のＲ３数値は、使用前が２４．４３±３．１２、使用２週後が２３．５６±３．５３、使用４週後が１８．５７±１．８６で示された（表２２、図２４）。

試験製品のＲ１数値は、使用前が７１．３３±１５．８６、使用２週後が５７．２９±３．２１、使用４週後が４５．２３±１３．７７で示され、対照製品のＲ１数値は、使用前が５８．０１±２１．０９、使用２週後が５６．１７±１５．８９、使用４週後が４５．０３±１４．７４で示された（表２３、図２２）。

試験製品のＲ２数値は、使用前が４６．０６±１１．６２、使用２週後が３０．７１±６．５７、使用４週後が２８．６７±７．４７で示され、対照製品のＲ２数値は、使用前が３５．９７±５．８２、使用２週後が３７．１５±４．９６、使用４週後が２６．６８±３．３０で示された（表２４、図２３）。

試験製品のＲ４数値は、使用前が３１．４４±１１．０４、使用２週後が２６．２４±２．９０、使用４週後が２０．６４±６．０７で示され、対照製品のＲ４数値は、使用前が２６．２２±１１．３８、使用２週後が２４．１１±８．８２、使用４週後が２０．６７±８．４３で示された（表２５、図２５）。

試験製品のＲ５数値は、使用前が１３．５２±５．４３、使用２週後が１１．５８±０．８９、使用４週後が８．４２±３．４８で示され、対照製品のＲ５数値は、使用前が１０．９３±６．７２、使用２週後が１０．６８±５．５６、使用４週後が８．７９±４．９５で示された（表２６、図２６）。

３次元イメージ撮影によるしわの程度を測定した後、試験製品の使用によるＲａ数値の変化を確認するために、使用前、使用２週後、使用４週後のＲａ数値を測定した。

試験製品のＲａ数値は、使用前が１８．６４±３．１９、使用２週後が１８．３３±２．１２、使用４週後が１７．７１±２．４３で示され、対照製品のＲａ数値は、使用前が１５．４９±２．７７、使用２週後が１５．２３±２．５１、使用４週後が１５．５３±２．４６で示された（表２７、図２７）。

試験製品のＲｍａｘ数値は、使用前が２０６．５５±４０．５４、使用２週後が１９８．７７±３９．７４、使用４週後が１９６．８５±３９．０２で示され、対照製品のＲｍａｘ数値は、使用前が１６２．８６±３５．１７、使用２週後が１５８．０９±４０．６８、使用４週後が１６５．２６±３９．７７で示された（表２８、図２８）。

試験製品のＲｔ数値は、使用前が２２５．９４±４５．００、使用２週後が２１６．３７±４１．７６、使用４週後が２１０．６０±３８．６１で示され、対照製品のＲｔ数値は、使用前が１７４．５５±３４．６６、使用２週後が１６７．６５±４１．２８、使用４週後が１７６．１４±３９．４３で示された（表２９、図２９）。

試験製品のＲｐ数値は、使用前が１６０．８５±３７．５１、使用２週後が１５５．２４±４３．１８、使用４週後が１５３．７８±３６．１２で示され、対照製品のＲｐ数値は、使用前が１１８．８０±３９．０２、使用２週後が１１２．７７±４４．１６、使用４週後が１２３．３９±４２．８１で示された（表３０、図３０）。

試験製品のＲｖ数値は、使用前が６５．０９±１１．９５、使用２週後が６１．１２±８．０２、使用４週後が５６．８２±１２．０１で示され、対照製品のＲｖ数値は、使用前が５５．７５±１７．９８、使用２週後が５４．８７±２１．７２、使用４週後が５２．７５±１５．００で示された（表３１、図３１）。

目視評価点数値の変化を確認するために、使用前、使用２週後、使用４週後の専門家の目視評価点数を評価した。

試験製品の専門家の目視評価点数は、使用前が２．００±０．６３、使用２週後が２．００±０．６３、使用４週後が１．６７±０．８２で示され、対照製品の専門家目視評価点数は、使用前が２．００±０．６３、使用２週後が２．００±０．６３、使用４週後が２．００±０．６３で示された（表３２、図３２）。

しわ改善についてのアンケート評価結果、試験製品と対照製品とも、４週後である訪問３でしわが改善し、特に、対照製品に比べて試験製品においてさらに高い改善度で応答された。このような結果から、本試験に参与した被験者は、試験製品のしわ改善の効能に対して優秀であると感じることに示された（表３３）。

試験製品のしっとりさ、滑らかさ、伸び、吸収性、べたつき、香りに対して被験者が感じる嗜好度を調査した結果、全般的に試験製品に対して肯定的な嗜好度を持っていることが確認された。特に、べたつき面で対照製品に比べて優れた嗜好度を示した（表３４）。

また、本試験製品を４週間被験者が用いる間、異常反応についての報告は全くなく、皮膚科専門医による理学的検査においても、紅斑、発疹及び掻痒感などの皮膚異常所見は見られなかった。したがって、試験製品は、皮膚に刺激のない安全な製品であることが分かった。

実施例４．発毛試験効果
本試験は、試験物質ＨＵ０２４、ＨＵ０２５、ＨＵ０２６、ＨＵ０２７の４種を、１４日間皮膚に塗布したとき、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの発毛に及ぶ影響を評価するために行った。

群の構成は、陰性対照群（滅菌注射用水Ｇ１）、試験物質ＨＵ０２４２０μｇ／匹／日（Ｇ２）、試験物質ＨＵ０２４６０μｇ／匹／日（Ｇ３）、試験物質ＨＵ０２５２０μｇ／匹／日（Ｇ４）、試験物質ＨＵ０２５６０μｇ／匹／日（Ｇ５）、試験物質ＨＵ０２６２０μｇ／匹／日（Ｇ６）、試験物質ＨＵ０２６６０μｇ／匹／日（Ｇ７）、試験物質ＨＵ０２７２０μｇ／匹／日（Ｇ８）、試験物質ＨＵ０２７６０μｇ／匹／日（Ｇ９）及び陽性対照群マイノキシル３％（Ｇ１０）投与群に設定した。各群当り動物は１０匹で行った。

動物は、ゾレチル（１ｍＬ／ｋｇ、ｉ．ｐ）を用いて麻酔させた後、動物の背部位を除毛機を用いて１次除毛した後、市販のＶｅｅｔ除毛剤を背部位に均一に塗布した。約５分経過後、塗布部位を滅菌注射用水に濡らしたガーゼを用いてきれいに拭き取った。毛が除去された動物の背部位の皮膚色が鮮紅色である動物のみを群分離に用いた。１回／日、７回／週、１４日間塗布し、毎日同一部位にガラス棒で約１０回擦って除毛部位（背部位）に均一に塗布した。

試験項目としては、死亡動物、一般症状、体重変化、発毛面積及び毛重さの測定を施し、陰性対照群と比較した。

試験物質の塗布面積に対する育毛面積（％）を測定して判定し、画像分析プログラム（ＩｍｇａｅＰｒｏＰｌｕｓｖｅｒ．６．３，Ｃｙｂｅｒｍｅｔｉｃｓ，ＵＳＡ）を用いて測定した。測定は、試験物質投与後、１、３、７、１０及び１４日目に測定した。写真撮影は、毛面積測定日に共に行った。塗布終了翌日、動物をＣＯ_２ガスで計画致死後、発毛部位の毛を除毛機で除毛して毛重さを測定した。

測定結果は、ＳＰＳＳ（ｖｅｒ．１０．１Ｋ）を用い、体重変化は一元配置分散分析によるダンカンｔ検定（Ｄｕｎｃａｎｔ−ｔｅｓｔ）を施し、毛重さはスチューデントｔ検定（Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓｔ−ｔｅｓｔ）で群間比較を行い、発毛面積は非母数的な多重比較（ｎｏｎｐａｒａｍｅｔｒｉｃｍｕｌｔｉｐｌｅｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ）であるマン・ホイットニー検定（Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙｍｅｔｈｏｄｓ）によって群間比較を行った。Ｐ＜０．０５である場合、統計学的に有意であると判定した。

試験結果は、次のようである。

体重変化に係わり、陰性対照群と比較して試験物質投与群では差が観察されなかった。但し、対照物質のマイノキシル３％投与群は、投与７日目及び１１日目に陰性対照群に比べ統計学的に有意な体重増加が観察された（Ｐ＜０．０５またはＰ＜０．０１）。対照物質のマイノキシル３％投与群における体重増加はマイノキシルの有効成分であるミノキシジルによる副作用と判断した（表３６、図３３）。

発毛面積の測定結果、塗布７日目までは試験物質投与群と陰性対照群との比較においては差が観察されなかった。１０日目及び１４日目に、試験物質ＨＵ０２５６０μｇ／匹／日投与群（Ｇ５）において、陰性対照群と比較して統計学的に有意な発毛面積の増加が観察された（Ｐ＜０．０５）。試験物質ＨＵ０２５２０μｇ／匹／日投与群を除いた他の試験物質投与群においても、１０日目及び１４日目に陰性対照群と比較して約２０％以上の発毛面積の増加が観察された。対照物質であるマイノキシル３％投与群は、陰性対照群と比較して４日目、１０日目及び１４日目に、統計学的に有意な発毛面積の増加が観察された（Ｐ＜０．０１）（表３７、図３４）。

毛重さの測定結果、試験物質ＨＵ０２６６０μｇ／匹／日投与群においては、陰性対照群と比較して統計学的に有意な毛重さの増加が観察された（Ｐ＜０．０５）。その外の試験物質投与群においては、ＨＵ０２５２０μｇ／匹／日及びＨＵ０２７２０μｇ／匹／日投与群を除いた残りの試験物質投与群から、陰性対照群と比較して約１００％以上の重さの増加が観察された。対照物質のマイノキシル３％投与群においては、陰性対照群と比較して統計学的に有意な毛重さの増加が観察された（Ｐ＜０．０１）（表３８、図３５）。

実施例５．緑内障試験の効果
対照薬としてはタフロタン点眼液（韓国参天製薬株式会社）を用い、試験薬としてはタフロタン点眼液＋ＨＵ０２４（試料１）、ＨＵ０２４（試料２）、ＨＵ０２５（試料３）、ＨＵ０２６（試料４）、ＨＵ０２７（試料５）を用いてマイクロビードで眼圧を上昇させた緑内障動物モデルを対象として試験を行った。実験動物モデルは、ロンプン（Ｒｏｍｐｕｎ）注射液とゾレチルを混合して実験動物を麻酔した後、眼球に局所麻酔剤であるアルカインを点眼し、マイクロガラスニードルを用いて前房（ａｎｔｅｒｉｏｒｃｈａｍｂｅｒ）に１×１０^６ｍｉｃｒｏｂｅａｄ／ｍＬ１μＬを注入して２週間眼圧上昇を誘導した（ＩＯＶＳ２０１１Ｖｏｌ．５２３６〜）。

対照薬及び試料５種は、２週間眼圧が上昇した実験動物に提供し、試料５種を１日１回点眼して薬効を比較検証し、４週間の投与により眼圧下降と網膜視神経細胞を観察した。

眼圧（Ｉｎｔｒａｏｃｕｌａｒｐｒｅｓｓｕｒｅ）は、接触式眼圧計であるＴｏｎｏＬａｂのｔｏｎｏｍｅｔｅｒＴＶ０２モデルを用いて測定した。また、緑内障動物モデルの網膜視神経細胞を分析するために麻酔されたラットの頭皮を切開して頭蓋骨を露出させた後、ブレグマ（Ｂｒｅｇｍａ）、ラムダ（Ｌａｍｄａ）を基点で視神経と連結された脳部位である上丘（ｓｕｐｅｒｉｏｒｃｏｌｌｉｃｕｌｕｓ）の座標を確認し、座標にマークした後に打ち抜いて３％フルオロゴールド（Ｆｌｕｏｒｏｇｏｌｄ）を注入した。蛍光プローブを注入してから５〜７日後に眼球を摘出して４％パラホルムアルデヒド（ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ）に常温で４時間固定した。固定した眼球は脈絡膜から網膜を分離してスライドの上にマウントした。各実験群のスライドは、蛍光顕微鏡を用いて蛍光を発現する視神経細胞を確認し、４０倍、２００倍で撮影してデータを収集した。

眼圧試験結果、２週間上昇した眼圧は、２１．９±８．３ｍｍＨｇまで上昇した。眼圧上昇確認後、１〜５番試料を投与した結果は、図３６のとおりである。２番、３番試料において眼圧下降が観察され、残りの試料においては有意性が観察されなかった。全体的に眼圧が微細に下がることはマイクロビードモデル特性に起因したことであって、試料の眼圧下降効果とは無関係なことと思料される。陽性対照群は、報告されたように眼圧下降がなされ、陰性対照群に比べて大幅下降した眼圧数値（１５．９±２．９，２０．８９％）を示した（図３６）。

視神経細胞の分析結果、陰性対照群は、対照群に比べて有意な視神経細胞死滅が観察され、３番試料、４番試料の投与群及び陽性対照群であるタフルプロストを点眼した群において視神経細胞の死滅から保護される結果を示した。３番試料の場合、図３６のように下降した眼圧によることと判断され、４番試料の場合、眼圧は下降しなかったが、視神経細胞の保護効果が示された（図３７）。

結論的に、３番試料であるＨＵ０２５試料の場合が、緑内障の特徴である眼圧下降の効果があった。しかのみならず、国内の緑内障患者の多くの場合、眼圧が高くないながらも視神経損傷によって視力を失うことが多いが、ＨＵ０２５試料の場合、損傷した視神経の回復にも効能があったため、緑内障治療剤として用いることができると判断される。

本発明によるペプチドまたはその断片を用いれば、火傷及び緑内障を効果的に治療することができ、皮膚のしわ改善に優れた効果が得られ、脱毛防止に加え育毛及び発毛促進にも効果的であることから、化粧料組成物及び薬学的組成物に活用することができる。

Claims

ＲＧＤモチーフを含む配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチドまたはその断片を有効成分として含む、視神経を保護するための医薬組成物。
前記組成物は、視神経を保護して緑内障の治療または予防効果を奏することを特徴とする請求項１に記載の医薬組成物。
前記断片が、下記の断片からなる群より選択された一種以上であることを特徴とする請求項１に記載の医薬組成物。
１）配列番号１のアミノ酸配列の、ＲＧＤモチーフを含む５〜４５個のアミノ酸からなり、選択的に断片内におけるシステイン間の二硫化結合がないか、または三つ以下の二硫化結合が形成されたことを特徴とする断片；
２）配列番号１のアミノ酸配列の３０〜３８番目のアミノ酸を含み、選択的に断片内におけるシステイン間の二硫化結合がないか、または一つ以上の二硫化結合が形成されたことを特徴とする断片；
３）配列番号１のアミノ酸配列の３２〜４３番目のアミノ酸を含み、選択的に断片内におけるシステイン間の二硫化結合がないか、または一つ以上の二硫化結合が形成されたことを特徴とする断片；
４）配列番号１のアミノ酸配列の３０〜４４番目のアミノ酸を含み、選択的に断片内におけるシステイン間の二硫化結合がないか、または一つ以上の二硫化結合が形成されたことを特徴とする断片；
５）配列番号１のアミノ酸配列の１８〜５４番目のアミノ酸を含み、選択的に断片内におけるシステイン間の二硫化結合がないか、または一つ以上の二硫化結合が形成されたことを特徴とする断片；及び
６）配列番号１のアミノ酸配列の１０〜５４番目のアミノ酸を含み、選択的に断片内におけるシステイン間の二硫化結合がないか、または一つ以上の二硫化結合が形成されたことを特徴とする断片。
前記断片が、下記の断片からなる群より選択された一種以上であることを特徴とする請求項３に記載の医薬組成物。
１）配列番号１のアミノ酸配列の、ＲＧＤモチーフを含む９個、１２個または１５個のアミノ酸からなり、選択的に断片内におけるシステイン間の二硫化結合がないか、または三つ以下の二硫化結合が形成されたことを特徴とする断片；
２）配列番号１のアミノ酸配列の３０〜３８番目のアミノ酸からなることを特徴とする断片；
３）配列番号１のアミノ酸配列の３２〜４３番目のアミノ酸からなり、３６番目のシステインと４２番目のシステインとの間に二硫化結合が形成されることを特徴とする断片；
４）配列番号１のアミノ酸配列の３０〜４４番目のアミノ酸からなり、断片内におけるシステイン間の二硫化結合がないことを特徴とする断片；または
５）配列番号１のアミノ酸配列の３０〜４４番目のアミノ酸からなり、断片内におけるシステイン間に一つの二硫化結合が形成されることを特徴とする断片。
前記組成物は、局所投与剤形であることを特徴とする請求項１〜４のうちいずれか一項に記載の医薬組成物。