JP2019128317A - 多発性硬化症の診断マーカー又は診断キット - Google Patents

多発性硬化症の診断マーカー又は診断キット Download PDF

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浩輝 山下
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崇 韮澤
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伸人 角田
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Abstract

【課題】多発性硬化症を的確に検出でき、且つ、多発性硬化症の発症を予測できる診断マーカーを提供する。【解決手段】S100A9タンパク質であることを特徴とする、多発性硬化症の検出又は発症予測のための診断マーカーである。診断マーカーの存在する生物学的試料は、被検者の血液、血清、血漿、脳脊髄液、尿又は唾液である。特に、本発明によれば多発性硬化症の発症を予測できるため発症を遅延させる、治療計画を立てるなどの対策が可能となる。【選択図】図３

Description

本発明は、多発性硬化症を検出又は発症予測するための診断マーカーに関する。また、本発明は、多発性硬化症を検出又は発症予測するための診断キットに関する。
多発性硬化症（multiple sclerosis; MS）とは中枢性脱髄疾患の一つで、神経のミエリン鞘が破壊され脳、脊髄、視神経などに病変が起こり、多様な神経症状が再発と寛解を繰り返す疾患で、日本では特定疾患に認定されている指定難病である。病名は、神経を包む組織（ミエリン鞘）が破壊されて生じる硬化が多数の領域で発生することに由来している。
多発性硬化症の判定には、MRI検査や、脳脊髄液採取により蛋白質の総量を測定することが行われる（非特許文献１）。しかし、MRI検査では、病巣の一部しか発見できない場合があり、また脳脊髄液検査でも、疼痛や神経損傷の可能性など患者に負担がかかるという問題がある。
近年、多発性硬化症等の中枢神経系の炎症性疾患の患者において、脳の炎症部位でTSPO（Translocator protein 18kDa）の発現がある程度上昇していること（非特許文献２および３）が複数報告されている。TSPOは、MBR（ミトコンドリア型ベンゾジアゼピン受容体）、またはPBR（末梢性ベンゾジアゼピン受容体）とも呼ばれるタンパク質であり、IBS（過敏性腸症候群）に代表されるストレス性疾患の薬理標的として注目されている。しかしながらこの検出方法は多発性硬化症を明確に検出できるものではなく、また多発性硬化症の発症を予測できるものでもない。
多発性硬化症の患者には、寛解期と再発期とが交互に現れる。寛解期とは、比較的健康に過ごせる時期であり、再発期とは、症状が急に出現し悪化する時期である。多発性硬化症の治療法としては、再発期には副腎皮質ステロイドの大量投与等の炎症を和らげる治療を行い、寛解期には抗痙攣剤や筋弛緩剤の投与を行なう方法が適用される。しかしこれらの薬剤では、多発性硬化症の進行を食い止める事はできない。
多発性硬化症の効果的な治療法としてインターフェロン療法がある（非特許文献４）。インターフェロン療法は多発性硬化症の長期的な予後を改善する治療薬の中心的な薬剤として、インターフェロンβ1a(IFNβ-1a)とβ1b(IFNβ-1b)が国際的に利用されている。しかしながら、インターフェロン療法の効果には個人差が認められ、神経細胞の障害を抑制する効果は少なくとも１年程度の長期間にわたる投与の後でないと判定する事ができない。インターフェロン療法では自己注射を必要とする事、注射部位の発赤、頭痛、関節痛等の副作用が認められる場合もある。
Tourtelotte W. Cerebrospinal fluid in multiple sclerosis. In: Vinken PJ, Bruyn GW. editors. Handbook of clinical neurology, Vol. 9. Amsterdam: North-Holland, 1970年:324-382頁. ブレイン（Brain）、第123巻、2321-2337頁、2000年 ジャーナル・オブ・ニューロイミューン・ファーマコロジー（Jornal of Neuroimmune Pharmacology）、第8巻第1号、51-57頁、2013年 Hong J.et al.Journal of Neuroimmunology152(2004年)126-139頁
本発明はかかる問題点に鑑みてなされたものであって、多発性硬化症を的確に検出でき、且つ、多発性硬化症の発症を予測できる診断マーカーを提供することを目的とする。
本発明にかかる多発性硬化症の検出又は発症予測のための診断マーカーは、S100A9タンパク質であることを特徴とする。
本発明にかかる多発性硬化症の検出又は発症予測のための診断キットは、検体から単離された生物学的試料から、多発性硬化症を検出又は発症予測するための診断キットであって、S100A9タンパク質に対する特異的結合物質又はS100A9を増幅するプライマーセットを備えることを特徴とする。
本発明によれば、多発性硬化症を的確に検出でき、また多発性硬化症の発症を予測できる。特に、本発明によれば多発性硬化症の発症を予測できるため発症を遅延させる、治療計画を立てるなどの対策が可能となり、本発明により得られる社会的利益は大きい。
controlマウスとacute-EAEマウスとにおいて、脳組織のHE染色(a,b)と、抗S100A9抗体を用いた免疫組織化学による解析(c,d)と、イメージング質量分析(e,f)とを示す図である。 controlマウスとacute-EAEマウスとにおいて、脳切片のイメージング質量分析による解析結果を示す図であり、そのうち(a)はcontrolであり、(b)はpre-EAEマウス脳であり、(c)はacute-EAEマウス脳であり、(d)はchronic-EAEマウス脳である。 controlマウスとacute-EAEマウスとにおいて、脳組織のHE染色を示す図であり、そのうち(a)はcontrolであり、(b)はpre-EAEマウス脳であり、(c)はacute-EAEマウス脳であり、(d)はchronic-EAEマウス脳である。 controlマウスとS100A9タンパク質の特異的阻害剤投与マウスとにおいて、EAEの臨床スコアを示す解析図である。
以下、添付の図面を参照して本発明の実施形態について具体的に説明するが、当該実施形態は本発明の原理の理解を容易にするためのものであり、本発明の範囲は、下記の実施形態に限られるものではなく、当業者が以下の実施形態の構成を適宜置換した他の実施形態も、本発明の範囲に含まれる。
本発明にかかる多発性硬化症の検出又は発症予測のための診断マーカーは、S100A9タンパク質である。
S100A9タンパク質としては、配列番号１、２または３に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質が例示できるが、これらに限定されるものではない。本発明のS100A9タンパク質には、配列番号１、２または３に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質と機能的に同等なタンパク質も含まれる。そのようなタンパク質としては、例えば、配列番号１、２または３に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなり、配列番号１、２または３に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質と機能的に同等な単離されたタンパク質が挙げられる。
本発明にかかる多発性硬化症の検出又は発症予測のための診断キットは、検体から単離された生物学的試料から、多発性硬化症を検出又は発症予測するための診断キットであって、S100A9タンパク質に対する特異的結合物質又はS100A9を増幅するプライマーセットを備える。
特異的結合物質としては、例えば、抗体、抗体断片、アプタマー等が挙げられる。抗体は、例えば、マウス等の動物にS100A9タンパク質又はその部分ペプチドを抗原として免疫することにより作製することができる。あるいは、ファージライブラリー等の抗体ライブラリーのスクリーニング等により作製することができる。抗体断片としては、Fv、Fab、scFv等が挙げられる。上記の抗体又は抗体断片は、ポリクローナルであってもよく、モノクローナルであってもよい。
アプタマーとは、標識物質に対する特異的結合能を有する物質である。アプタマーとしては、核酸アプタマー、ペプチドアプタマー等が挙げられる。S100A9タンパク質に特異的結合能を有する核酸アプタマーは、例えば、systematic evolution of ligand by exponential enrichment(SELEX)法等により選別することができる。
特異的結合物質は、S100A9タンパク質に特異的に結合することができれば特に制限されず、市販のものであってもよい。また、特異的結合物質は、担体上に固定されてプロテインチップ等を構成していてもよい。
S100A9を増幅するプライマーセットとしては、診断の対象とする動物種に由来するS100A9のcDNAを増幅することができるものであれば特に限定されない。例えば、S100A9のcDNAを増幅するプライマーとしては、配列番号４に示す塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号５に示す塩基配列からなるリバースプライマーのセット等が挙げられる。
本実施形態の診断キットを用いた診断は、例えば次のようにして行うことができる。
診断キットがS100A9タンパク質に対する特異的結合物質を用いるものである場合、まず、患者から採取された生検試料及び対照となる正常組織を試料として、上記の特異的結合物質を用いた組織染色、ELISA、ウエスタンブロッティング、フローサイトメトリー等を行うことにより、生検試料及び正常組織中のS100A9タンパク質の発現量を測定する。
続いて、生検試料中のS100A9タンパク質の発現量が、正常組織中のS100A9タンパク質の発現量と比較して高い場合には、多発性硬化症を発症していると診断できるか、又は、発症の可能性が高いと診断できる。
または、正常組織中のS100A9タンパク質の発現量を予め測定して基準値を設定しておき、生検試料中のS100A9タンパク質の発現量が上記基準値と比較して高い場合には、多発性硬化症を発症していると診断できるか、又は、発症の可能性が高いと診断できる。
診断キットがS100A9遺伝子を増幅するプライマーセットを用いるものである場合、まず、患者から採取された生検試料及び対照となる正常組織を試料として、定量的RT-PCR等を行うことにより、生検試料及び正常組織中のS100A9のmRNAの発現量を測定する。
続いて、生検試料中のS100A9のmRNAの発現量が、正常組織中のS100A9のｍＲＮＡの発現量と比較して高い場合には、多発性硬化症を発症していると診断できるか、又は、発症の可能性が高いと診断できる。
あるいは、正常組織中のS100A9のmRNAの発現量を予め測定して基準値を設定しておき、生検試料中のS100A9のmRNAの発現量が前記基準値と比較して高い場合には、多発性硬化症を発症していると診断できるか、又は、発症の可能性が高いと診断できる。
１．EAE誘導
SJL/Jマウス(雌性，10週齢)に、Proteolipid proteinの139-151番目のアミノ酸配列(配列番号６：HCLGKWLGHPDKF,His Cys Leu GlyLys Trp Leu Gly His Pro Asp Lys Phe)に該当するペプチド(PLP139-151)を、完全フロイントアジュバントと共に免疫し、EAEを誘導した。なお、実験的アレルギー性脳脊髄炎(EAE：Experimental autoimmune encephalomyelitis)は、中枢神経組織由来の蛋白質抗原やペプチドを免疫することによって誘導される自己免疫モデルである。多発性硬化症(MS)と多くの病態を共有することから、MSの病態研究、治療法開発において使用されている。定法に従い、臨床症状を6段階で毎日評価した。
ペプチド免疫後、9日目(pre-EAE)、12日目(acute-EAE)、21日目(chronic-EAE)にマウスを解剖し、中枢神経系(Central nervous system; CNS)試料を採取した。図１は、controlマウスとacute-EAEマウスとにおいて、小脳白質、延髄、海馬采と視床の間の軟膜領域におけるヘマトキシリン・エオシン(HE)染色図(a,b)と、抗S100A9抗体を用いた免疫組織化学(Immunohistochemistry; IHC)による解析図(c,d)と、イメージング質量分析(Imaging mass spectrometry; IMS)による解析図(e,f)とである。図１において、a,b,c,dのスケールバーは5 mmであり、e,fのスケールバーは1 mmである。
２．イメージング質量分析(Imaging mass spectrometry; IMS)
acute-EAEマウス脳から、クリオスタットで10 μm厚の新鮮凍結切片を作製した。組織切片を、エタノール、カルノア液で洗浄後、マトリックスとしてシナピン酸を噴霧した。質量分析装置は、UltrafleXtreme(Bruker Daltonics)を用いた。UltrafleXtremeは、最高性能のMALDI-TOF&TOF/TOFシステムであり、TOF/TOFモードで2 kHzの解析が可能である。データ解析は、fleximaging(Bruker Daltonics)ソフトウェアを用いて、EAEマウス組織に特異的なm/z 値を検索し、描出した。
IMSにより、EAEマウス脳に特異的に検出されるm/z 12,971を見出した(図1f黒矢印)。この分子群は健常マウス脳には見られない(図1e)。m/z 12,917を調べたところ、S100A9タンパク質であることが判明した(Caldwell et al, Wound Repair Reagen 16(3):442-449 (2008))。S100A9タンパク質は、EAE病巣の進行と深く関わっており、多発性硬化症のバイオマーカーであることが判明した。
３．免疫組織化学(Immunohistochemistry; IHC)
新鮮凍結切片を4%パラホルムアルデヒド含有リン酸緩衝生理食塩水にて固定を行った。0.3%過酸化水素含有メタノールで内在性Peroxidaseを不活性化後、10%ヤギ血清でブロッキングを行った。一次抗体として、抗S100A9抗体、二次抗体として、ビオチン標識抗ラットIgG抗体を用いた。アビジン-ビオチン複合体を形成させ、3,3’-diaminobenzidine(DAB)法により検出を行った。
ヘマトキシリン・エオシン(HE)染色により、acute-EAEマウス脳の小脳白質、延髄、海馬采と視床の間の軟膜領域において異所性細胞集塊(浸潤細胞群)を認めた(図.b矢印)。この細胞集塊は健常マウス脳には見られない(図1a)。抗S100A9抗体を用いたIHCによる検証の結果、S100A9タンパク質の陽性反応はm/z 12,971と一致した(図.d,f実線矢柱)。本所見は、浸潤細胞群と共局在した。さらに、小脳分子層においても、m/z 12,971及びS100A9タンパク質陽性領域を認めた(図d,f点線矢柱)。
４．発症前から慢性期までの解析
図２は、controlマウスとacute-EAEマウスとにおいて脳切片のIMS法による解析結果を示す図であり、そのうち(a)はcontrolであり、(b)はpre-EAEマウス脳であり、(c)はacute-EAEマウス脳であり、(d)はchronic-EAEマウス脳である。UltrafleXtreme(Bruker Daltonics)を用いた質量分析による結果、IMSにより、EAEマウス脳に特異的に検出されるm/z 12,971は、acute-EAEマウス脳のみならず、chronic-EAEマウス脳においても、更には、pre-EAEマウス脳においても認められた。
図３は、controlマウスとacute-EAEマウスとにおいて、小脳白質、延髄、海馬采と視床の間の軟膜領域におけるHE染色図であり、そのうち(a)はcontrolであり、(b)はpre-EAEマウス脳であり、(c)はacute-EAEマウス脳であり、(d)はchronic-EAEマウス脳である。免疫組織化学分析による結果、EAEマウス脳に特異的に検出されるS100A9タンパク質は、acute-EAEマウス脳のみならず、chronic-EAEマウス脳においても、更には、pre-EAEマウス脳においても認められた。
これらの結果から、S100A9タンパク質は、多発性硬化症の発症前においても認められ、発症予測のための診断マーカーとしても利用できることが判明した。
５．S100A9タンパク質の特異的阻害剤タスキニモド投与による治療効果
SJL/Jマウス(雌性，10週齢)にペプチド(PLP139-151)を完全フロイントアジュバントと共に免疫し、EAEを誘導したEAEマウスに、ペプチド免疫後、S100A9タンパク質の特異的阻害剤としてタスキニモドを2日に1回、経口投与した。Controlにはタスキニモドを投与しなかった。
EAEの臨床スコアは、０：正常、１：尾の完全下垂、２：歩行困難、３：後肢の完全脱力、４：体幹部の麻痺、５：前肢麻痺を含む後肢の完全脱力、６：死亡にて評価した。臨床症状は、ペプチド免疫後９〜14日程度から明らかとなり、その後数日で最大スコアに達する。
図４は、controlマウスとS100A9タンパク質の特異的阻害剤投与マウスとにおいて、EAEの臨床スコアを示す解析図である。図４から、S100A9タンパク質の特異的阻害剤は、多発性硬化症の発症を遅らせることが認められる。また、S100A9タンパク質の特異的阻害剤は、多発性硬化症の治療に十分な効果があることが認められる。なお、図４において、経過日数０日〜８日は臨床症状が現れておらず、図面の煩雑さを裂けるために、day21(非投与群)のみ記載し、その他の記号は省略されている。また経過日数９日目ではday9(非投与群)、day9(投与群)及びday12(非投与群)の記号が省略されているが、これは臨床スコアが０に近いものであったからである。
多発性硬化症の診断に利用できる。
配列番号４，５：プライマー
配列番号６：ペプチド

Claims (3)

  1. S100A9タンパク質であることを特徴とする、多発性硬化症の検出又は発症予測のための診断マーカー。
  2. 検体から単離された生物学的試料から、多発性硬化症を検出又は発症予測するための診断キットであって、
    S100A9タンパク質に対する特異的結合物質又はS100A9を増幅するプライマーセットを備える、多発性硬化症の検出又は発症予測のための診断キット。
  3. 前記生物学的試料が被検者の血液、血清、血漿、脳脊髄液、尿又は唾液である請求項２記載の多発性硬化症の検出又は発症予測のための診断キット。
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