JP2019150065A

JP2019150065A - ポリペプチド組成物用ペプチドリンカーおよびその使用方法

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Publication number: JP2019150065A
Application number: JP2019111936A
Authority: JP
Inventors: マーティーニパオロ; Martini Paolo; コンシーノマイケル; Concino Michael
Original assignee: Shire Human Genetics Therapies Inc
Current assignee: Shire Human Genetics Therapies Inc
Priority date: 2011-03-04
Filing date: 2019-06-17
Publication date: 2019-09-12
Also published as: JP2016187358A; AU2019202865B2; JP2014515595A; CN103764162B; CN106279433A; EP2680879A4; AU2019202865A1; BR112013022557A2; CA3080181A1; EP2680879B1; AU2017204405B2; CA2828966C; EP2680879A2; JP6175372B2; JP6594833B2; AU2012225766B9; CN103764162A; AU2012225766B2; AU2017204405A1; CA2828966A1

Abstract

【課題】ポリペプチド組成物用ペプチドリンカーおよびその使用方法を提供すること。【解決手段】新規なペプチドリンカーおよびこのリンカーを含むポリペプチド組成物（例えば、キメラポリペプチド）およびこのポリペプチド組成物を使用する方法が、本明細書において開示される。この組成物およびこの方法は、様々な疾患または障害（例えばリソソーム蓄積障害）を治療するために、目的の細胞、組織、または器官へと、目的のポリペプチドまたはタンパク質（例えば、治療用ポリペプチド）を標的化する／送達するのに特に有用である。【選択図】なし

Description

関連出願
本願は、２０１１年３月４日に出願された米国仮出願第６１／４４９，２２５号（代理人文書番号ＳＨＩＲ−０１８−００１）に対する優先権を主張し、そして本願は２０１１年６月２５日に出願された米国出願第１３／１６８，９６９号および２０１１年６月２５日に出願された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０４１９２８号の一部継続出願である。これらの教示全体は、本明細書に参考として援用される。

発明の分野
本発明は、新規なペプチドリンカーならびにそのようなリンカーを含むポリペプチド組成物（例えばキメラポリペプチド）ならびにそれらを使用および調製する方法に関する。

発明の背景
リソソーム蓄積障害は、特定のリソソーム酵素の欠損または不活性によって引き起こされる、４０を超えるまれな遺伝性の代謝障害のグループを表す。特に、リソソーム蓄積障害は、脂質またはグリコサミノグリカンとして知られている複合糖タンパク質の段階的な代謝を触媒するリソソーム酵素の欠損または不活性によって引き起こされる。この代謝欠損の結果として、代謝前駆体は、細胞、組織、特に、罹患被験体の細胞リソソーム中に進行的に蓄積する。このタンパク質蓄積は、外観、身体能力、器官および系の機能、ならびにほとんどの症例において、罹患被験体の精神発達に影響を及ぼす、永久的で進行性の細胞の損傷を引き起こす。この酵素欠損症は、あらゆる組織に影響を及ぼすが、患者の臨床的発現は、例えば、酵素欠損症または機能障害の程度に依存して、頻繁に変化し得る。リソソーム蓄積障害はまた、ある程度のニューロン細胞損失にも関連し得、精神遅滞、重度の運動障害、身体障害、寿命の短縮、および／または前述のものの組み合わせを始めとする神経症状を主にもたらす。

リソソーム蓄積障害に対する治療法はなく、治療は、多くの場合待機療法であり、主として、被験体の生活の質を改善するために被験体に提供される。酵素補充療法（ＥＲＴ）は、リソソーム性蓄積症を有する被験体に対する有用な治療選択肢であった。ＥＲＴは、一般的に、天然の、または組換えによって誘導された、タンパク質および／または酵素を患者へ非経口投与することを含む。承認された療法は、患者に静脈内投与され、根底にある酵素欠損症の身体症状または末梢症状を治療するのに一般的に有効である。リソソーム蓄積障害を有効に治療するために、投与された治療剤（例えば欠損したリソソーム酵素）は、患者の血流に注入された後に、罹患細胞および罹患組織に分布しなければならない。

罹患細胞および罹患組織への必要とされる酵素の分布を達成するために、この酵素は、受容体媒介性エンドサイトーシスを通して細胞の中にこの酵素を輸送する特異的な細胞表面受容体へと一般的に標的化される。例えば、ゴーシェ病において、欠損した酵素であるグルコセレブロシダーゼは、標的細胞（細網内皮細胞（ｒｅｔｉｃｕｌｏｅｎｄｏｔｈｅｉｌｉａｌｃｅｌｌ））上に豊富に発現されるマンノース受容体への、酵素上の露出したマンノース残基の結合を通して、適切な細胞へと標的化される。マンノース受容体を欠く細胞では、インスリン様増殖因子／カチオン非依存性マンノース−６−リン酸受容体（ＩＧＦ−ＩＩ／ＣＩ−ＭＰＲ）の使用が、欠損したリゾチームの細胞への送達に提唱された（非特許文献１）。ＩＧＦ−ＩＩ／ＣＩ−ＭＰＲ受容体は、多くの哺乳動物細胞型の表面上に存在し、したがって、この受容体のリガンド（例えばＩＧＦＩＩまたはマンノース−６リン酸）を含有するタンパク質が中枢神経系を始めとする種々様々の細胞および組織を標的にする手段を提供する。しかしながら、欠乏しているリソソーム酵素を適切な組織へと標的化する方法についてのいくらかの知識にもかかわらず、多くのリソソーム蓄積障害（例えばサンフィリポ症候群、ファーバー病、およびその他同種のもの）にとって有効な療法はまだない。したがって、組成物、特に非経口的に投与することができる組成物、および疾患（例えばリソソーム蓄積症）を治療するために、必要な組織に作用因子（ａｇｅｎｔ）を導くのに有用な方法についての必要性が当該技術分野において残っている。

Ｋｏｒｎｆｅｌｄ，Ｓ．、１９８７ＢｉｏｃｈｅｍＳｏｃＴｒａｎｓ１８：３６７−３７４

発明の概要
所望の組織への機能的な治療剤（例えばタンパク質、ポリペプチド）の輸送および送達を促進する組成物および方法についての必要性がある。そのような組成物および方法は、多くの疾患または障害の治療において、特に、サンフィリポ症候群のようなリソソーム蓄積障害の治療において有用であってもよい。

ペプチドリンカーを含む新規な組成物、ペプチドリンカーによってつながれるポリペプチドを含むポリペプチド組成物、ならびに関係するポリヌクレオチド、ベクター、細胞、および医薬組成物が本明細書において記載される。記載されるリンカー配列は、リンカーによって接続されるポリペプチドの発現および活性（例えば受容体結合および／または酵素活性）に耐久性があり、最適であるように、目的の２つのペプチド／ポリペプチドを作動可能につなぐ。ペプチドリンカーを含むポリペプチド組成物は、特定の細胞および／または組織への目的のポリペプチド／タンパク質の標的化された送達を促進する。

したがって、本発明の１つの実施形態は、第１のペプチド／ポリペプチド、第２のペプチド／ポリペプチド、ならびに第１のペプチドと第２のペプチドとの間に配置される配列番号１のアミノ酸配列（ＧＡＰＧＧＧＧＧＡＡＡＡＡＧＧＧＧＧ）の１個以上のシーケンシャルリピートまたはタンデムリピートを含むリンカーを含むポリペプチド組成物を提供する。いくつかの実施形態では、ポリペプチド組成物のリンカーが、配列番号１の３つのシーケンシャルリピートまたはタンデムリピートを含み、いくつかの実施形態では、リンカーが、配列番号１の３’末端にアミノ酸配列グリシンアラニンプロリン（ＧＡＰ）をさらに含む。他の実施形態では、リンカーの１個以上のアラニン残基が、１個以上のセリン残基で置換されてもよい。ある実施形態では、ポリペプチド組成物の第１のペプチドが、配列番号４のアミノ酸配列を含む。さらに他の実施形態では、第２のペプチドが、受容体結合ドメインを含み、さらなる実施形態では、第２のペプチドが、配列番号６のアミノ酸配列を含む。

ある実施形態では、ポリペプチド組成物が、配列番号４のアミノ酸配列を含む第１のペプチド；配列番号６のアミノ酸配列を含む第２のペプチド；ならびに第１のペプチドと第２のペプチドとの間に配置される配列番号１のアミノ酸配列の１個以上のシーケンシャルリピートまたはタンデムリピートを含むリンカーを含む。いくつかの実施形態では、このリンカーが、配列番号１の３つのシーケンシャルリピートを含む。他の実施形態では、このリンカーが、配列番号１の３’末端にアミノ酸配列グリシンアラニンプロリン（ＧＡＰ）をさらに含んでいてもよい。さらに他の実施形態では、このリンカーの１個以上のアラニン残基が、１個以上のセリン残基で置換されている。

いくつかの実施形態では、ポリペプチド組成物が、配列番号４のアミノ酸配列を含む第１のペプチド；配列番号６のアミノ酸配列を含む第２のペプチド；ならびに第１のペプチドと第２とのペプチドの間に配置される配列番号２のアミノ酸配列を含むリンカーを含む。ある実施形態では、このリンカーの１個以上のアラニン残基が、１個以上のセリン残基で置換されている。

本発明はまた、本明細書において記載されるペプチド／ポリペプチドリンカーをも提供する。例えば、いくつかの実施形態では、ポリペプチドリンカーが、１８個連続したアミノ酸残基を含み、ここで、このリンカーが、このリンカーの最初の５個のアミノ酸残基内の１つのプロリン残基ならびに１個以上のグリシン残基および１個以上のアラニン残基からなる群から選択される１７個のアミノ酸残基を含む。他の実施形態では、このポリペプチドリンカーの３’末端が、１つのプロリン残基ならびにグリシンおよびアラニンからなる群から選択される２つのアミノ酸残基を含む３個連続したアミノ酸をさらに含む。いくつかの実施形態では、このリンカーの１個以上のアラニン残基が、１個以上のセリン残基で置換されている。

いくつかの実施形態では、ポリペプチドリンカーが、２１個連続したアミノ酸残基を含み、このリンカーが、このリンカーの最初の５個のアミノ酸残基内にある第１のプロリン残基；１個以上のグリシン残基および１個以上のアラニン残基からなる群から選択される１９個のアミノ酸残基；ならびにこのリンカーの最後の５個のアミノ酸内にある第２のプロリン残基を含む。

ある実施形態では、このリンカーの１個以上のアラニン残基が、１個以上のセリン残基で置換されている。さらに他の実施形態では、このポリペプチドリンカーが、アラニン残基の２倍の数のグリシン残基およびセリン残基を含む。

いくつかの実施形態では、このポリペプチドリンカーが、配列番号７のアミノ酸配列（ＧＧＧＧＧＡＡＡＡＡＧＧＧＧＧ）からなる。

他の実施形態では、本発明は、配列番号７のアミノ酸配列からなるポリペプチドリンカーの１個以上のシーケンシャルリピートを含むポリペプチドリンカー組成物を提供する。他の実施形態では、このポリペプチドリンカー組成物の５’末端が、１つのプロリン残基ならびにグリシンおよびアラニンからなる群から選択される２つのアミノ酸残基を含む３個連続したアミノ酸をさらに含む。

さらに他の実施形態では、ポリペプチドリンカーが、配列番号１のアミノ酸配列からなる。ある実施形態では、本発明は、配列番号１からなるポリペプチドリンカーの１個以上のシーケンシャルリピートを含むポリペプチドリンカー組成物を提供する。

さらなる実施形態では、上記のポリペプチドリンカー組成物の３’末端が、１つのプロリン残基ならびにグリシンおよびアラニンからなる群から選択される２つのアミノ酸残基を含む３個連続したアミノ酸をさらに含む。ある実施形態では、この３個連続したアミノ酸残基が、アミノ酸配列グリシンアラニンプロリン（ＧＡＰ）を含む。

いくつかの実施形態では、ポリペプチドリンカーが、配列番号２のアミノ酸配列（ＧＡＰＧＧＧＧＧＡＡＡＡＡＧＧＧＧＧＧＡＰＧＧＧＧＧＡＡＡＡＡＧＧＧＧＧＧＡＰＧＧＧＧＧＡＡＡＡＡＧＧＧＧＧＧＡＰ）からなる。

ある実施形態では、本発明は、第１のペプチド；第２のペプチド；ならびに第１のペプチドと第２のペプチドとの間に配置されるポリペプチドリンカーを含むポリペプチド組成物であって、ここで、このリンカーが、前述のポリペプチドリンカーまたはポリペプチドリンカー組成物のいずれかを含むポリペプチド組成物を提供する。

他の実施形態では、本発明はまた、本明細書において記載されるポリペプチドリンカーおよび／またはポリペプチド組成物をコードするポリヌクレオチドをも提供する。したがって、いくつかの実施形態は、配列番号１；配列番号２；または配列番号１の１個以上のシーケンシャルリピートのアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態では、このポリペプチドの１個以上のアラニン残基が、１個以上のセリン残基で置換されており、このポリヌクレオチドが、この１個以上の置換されたセリン残基をコードする。

他の実施形態では、ポリヌクレオチドが、第１のペプチド；第２のペプチド；ならびにこの第１のペプチドとこの第２のペプチドとの間に配置される配列番号１のアミノ酸配列の１個以上のシーケンシャルリピートを含むリンカーのアミノ酸配列を含むポリペプチド組成物をコードする。ある実施形態では、このポリペプチド組成物のリンカーが、配列番号１の３つのシーケンシャルリピートまたはタンデムリピートを含む。さらに他の実施形態では、このポリペプチド組成物のリンカーの１個以上のアラニン残基が、１個以上のセリン残基で置換されており、このポリヌクレオチドが、この１個以上の置換されたセリン残基をコードする。前述のポリヌクレオチドのさらなる実施形態では、このポリペプチド組成物のリンカーの３’末端が、アミノ酸配列グリシンアラニンプロリン（ＧＡＰ）をさらに含み、このポリヌクレオチドが、ＧＡＰアミノ酸配列をコードする。

ある実施形態では、ポリヌクレオチドが、配列番号４のアミノ酸配列を含むポリペプチド組成物の第１のペプチドをコードする。他の実施形態では、このポリヌクレオチドが、受容体結合ドメインを含むポリペプチド組成物の第２のペプチドをコードし、いくつかの実施形態では、この第２のペプチドが、配列番号６のアミノ酸配列を含む。

本明細書において記載されるポリペプチド組成物をコードする前述のポリヌクレオチドを含む発現ベクターもまた、本明細書において記載される。本明細書において記載される他の実施形態は、前述のポリヌクレオチドおよび発現ベクターを含む組換え細胞に関する。

さらに、本発明は、本明細書において記載されるポリペプチド組成物および薬学的に許容され得るキャリアを含む医薬組成物を提供する。例えば、いくつかの実施形態では、この医薬組成物が、配列番号４のアミノ酸配列を含む第１のペプチドおよび配列番号６のアミノ酸配列を含む第２のペプチドを含むポリペプチド組成物を含む。これらの実施形態のうちのいくつかでは、この第１のペプチドとこの第２のペプチドとの間に配置されるリンカーが、配列番号１の１個以上のシーケンシャルリピートまたはタンデムリピート（例えば、配列番号１の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれより多くのシーケンシャルリピートまたはタンデムリピート）を含み、これらの実施形態のうちの他のものでは、このリンカーが、配列番号２のアミノ酸配列を含む。

ある実施形態では、本発明はまた、本明細書において記載されるポリヌクレオチドおよび薬学的に許容され得るキャリアを含む医薬組成物をも提供する。本発明は、本明細書において記載される組換え細胞および薬学的に許容され得るキャリアを含む医薬組成物をさらに提供する。

ポリペプチド組成物を産生する方法であって、このポリペプチドの発現に適した条件下で本明細書において記載される組換え細胞を培養することを含む方法もまた、本明細書において記載される。

治療用ポリペプチドを送達する必要のある被験体に治療用ポリペプチドを送達する方法もまた、本明細書において記載される。したがって、本明細書において開示されるいくつかの実施形態は、治療用ポリペプチドを送達する必要のある被験体に治療用ポリペプチドを送達する方法であって、本明細書において記載される前述のポリペプチド組成物のいずれかをこの被験体に投与することを含む方法である。

他の実施形態では、治療用ポリペプチドを送達する必要のある被験体に治療用ポリペプチドを送達する方法は、配列番号４のアミノ酸配列を含む第１のペプチド；配列番号６のアミノ酸配列を含む第２のペプチド；ならびにこの第１のペプチドとこの第２のペプチドとの間に配置される配列番号１のアミノ酸配列の１個以上のシーケンシャルリピートを含むリンカーを含むポリペプチド組成物をこの被験体に投与することを含む。この方法の他の実施形態では、このリンカーが、配列番号１の３’末端にＧＡＰをさらに含む。この方法のある実施形態では、このリンカーが、配列番号２のアミノ酸配列を含む。この方法のさらに他の実施形態では、このリンカーの１個以上のアラニン残基が、１個以上のセリン残基で置換されている。

いくつかの実施形態では、治療用ポリペプチドを送達する必要のある被験体に治療用ポリペプチドを送達する方法は、本明細書において記載される前述の発現ベクターのうちの１個以上をこの被験体に投与することを含む。ある他の実施形態は、治療用ポリペプチドを送達する必要のある被験体に治療用ポリペプチドを送達する方法であって、本明細書において記載される前述の組換え細胞のうちの１個以上をこの被験体に投与することを含む方法に関する。

リソソーム蓄積症を治療する方法であって、いくつかの実施形態では、その必要のある被験体に対して、有効量の、本明細書において記載されるいずれか１つのまたは前述の医薬組成物（例えば、本明細書において記載されるポリペプチド組成物、ポリヌクレオチド、および／または宿主細胞を含む）を投与することを含む、方法もまた、本明細書において記載される。ある実施形態では、リソソーム蓄積症が、サンフィリポ症候群である。

本明細書において記載されるさらに他の実施形態は、サンフィリポ症候群を治療する方法に関する。いくつかの実施形態では、この方法は、本明細書において記載される有効量の前述の医薬組成物をその必要のある患者に投与することを含む。

他の実施形態では、サンフィリポ症候群を治療する方法は、その必要のある患者に対して、配列番号４のアミノ酸配列を含む第１のペプチド；配列番号６のアミノ酸配列を含む第２のペプチド；ならびにこの第１のペプチドとこの第２のペプチドとの間に配置される配列番号１の１個以上のシーケンシャルリピートを含むリンカーを含む、有効量の医薬組成物を投与することを含む。この方法のある実施形態では、このリンカーが、配列番号１の３’末端にアミノ酸配列ｇａｐをさらに含む。この方法の他の実施形態では、このリンカーが、配列番号２のアミノ酸配列を含む。

この方法のある実施形態では、この医薬組成物が、非経口的に投与される。
特定の実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
ａ）第１のペプチド、
ｂ）第２のペプチド、ならびに
ｃ）該第１のペプチドと該第２のペプチドとの間に配置された配列番号１のアミノ酸配列の１個以上のシーケンシャルリピートを含むリンカー
を含む、ポリペプチド組成物。
（項目２）
前記リンカーが、配列番号１の３つのシーケンシャルリピートを含む、項目１に記載のポリペプチド組成物。
（項目３）
前記リンカーが、配列番号１の３’末端にアミノ酸配列グリシン−アラニン−プロリン（ＧＡＰ）をさらに含む、項目１または２に記載のポリペプチド組成物。
（項目４）
前記リンカーの１個以上のアラニン残基が、１個以上のセリン残基で置換されている、項目３に記載のポリペプチド組成物。
（項目５）
前記第１のペプチドが、配列番号４のアミノ酸配列を含む、項目１〜４のいずれか一項に記載のポリペプチド組成物。
（項目６）
前記第２のペプチドが、受容体結合ドメインを含む、項目１〜５のいずれか一項に記載のポリペプチド組成物。
（項目７）
前記第２のペプチドが、配列番号６のアミノ酸配列を含む、項目１〜６のいずれか一項に記載のポリペプチド組成物。
（項目８）
ａ）配列番号４のアミノ酸配列を含む第１のペプチド、
ｂ）配列番号６のアミノ酸配列を含む第２のペプチド、ならびに
ｃ）該第１のペプチドと該第２のペプチドとの間に配置された配列番号１のアミノ酸配列の１個以上のシーケンシャルリピートを含むリンカー
を含む、ポリペプチド組成物。
（項目９）
前記リンカーが、配列番号１の３つのシーケンシャルリピートを含む、項目８に記載のポリペプチド組成物。
（項目１０）
前記リンカーが、配列番号１の３’末端にアミノ酸配列グリシン−アラニン−プロリン（ＧＡＰ）をさらに含む、項目８または９に記載のポリペプチド組成物。
（項目１１）
前記リンカーの１個以上のアラニン残基が、１個以上のセリン残基で置換されている、項目８〜１０のいずれか一項に記載のポリペプチド組成物。
（項目１２）
ａ）配列番号４のアミノ酸配列を含む第１のペプチド、
ｂ）配列番号６のアミノ酸配列を含む第２のペプチド、ならびに
ｃ）該第１のペプチドと該第２のペプチドとの間に配置された配列番号２のアミノ酸配列を含むリンカー
を含む、ポリペプチド組成物。
（項目１３）
前記リンカーの１個以上のアラニン残基が、１個以上のセリン残基で置換されている、項目１２に記載のポリペプチド組成物。
（項目１４）
１８個連続したアミノ酸残基を含むポリペプチドリンカーであって、該リンカーが、該リンカーの最初の５個のアミノ酸残基内の１個のプロリン残基ならびに１個以上のグリシン残基および１個以上のアラニン残基からなる群から選択される１７個のアミノ酸残基を含む、ポリペプチドリンカー。
（項目１５）
前記リンカーの３’末端が、１個のプロリン残基ならびにグリシンおよびアラニンからなる群から選択される２つのアミノ酸残基を含む３個連続したアミノ酸をさらに含む、項目１４に記載のポリペプチドリンカー。
（項目１６）
２１個連続したアミノ酸残基を含むポリペプチドリンカーであって、該リンカーが、
ａ）該リンカーの最初の５個のアミノ酸内の第１のプロリン残基、
ｂ）１個以上のグリシン残基および１個以上のアラニン残基からなる群から選択される１９個のアミノ酸残基、ならびに
ｃ）該リンカーの最後の５個のアミノ酸内の第２のプロリン残基
を含む、ポリペプチドリンカー。
（項目１７）
前記１個以上のアラニン残基のいずれかが、１個以上のセリン残基で置換されている、項目１４〜１６のいずれか一項に記載のポリペプチドリンカー。
（項目１８）
前記リンカーが、アラニン残基の２倍の数のグリシン残基およびセリン残基を含む、項目１７に記載のポリペプチドリンカー。
（項目１９）
配列番号７のアミノ酸配列（ＧＧＧＧＧＡＡＡＡＡＧＧＧＧＧ）からなるポリペプチドリンカー。
（項目２０）
項目１９に記載のポリペプチドリンカーの１個以上のシーケンシャルリピートを含む、ポリペプチドリンカー組成物。
（項目２１）
前記ポリペプチドリンカー組成物の５’末端が、１つのプロリン残基ならびにグリシンおよびアラニンからなる群から選択される２つのアミノ酸残基を含む３個連続したアミノ酸をさらに含む、項目２０に記載のポリペプチドリンカー組成物。
（項目２２）
配列番号１のアミノ酸配列（ＧＡＰＧＧＧＧＧＡＡＡＡＡＧＧＧＧＧ）からなるポリペプチドリンカー。
（項目２３）
項目２２に記載のポリペプチドリンカーの１個以上のシーケンシャルリピートを含む、ポリペプチドリンカー組成物。
（項目２４）
前記ポリペプチドリンカー組成物の３’末端が、１つのプロリン残基ならびにグリシンおよびアラニンからなる群から選択される２つのアミノ酸残基を含む３個連続したアミノ酸をさらに含む、項目２１または２３に記載のポリペプチドリンカー組成物。
（項目２５）
前記３個連続したアミノ酸が、アミノ酸配列グリシンアラニンプロリン（ＧＡＰ）を含む、項目２１、２３、または２４に記載のポリペプチドリンカー組成物。
（項目２６）
配列番号２のアミノ酸配列（ＧＡＰＧＧＧＧＧＡＡＡＡＡＧＧＧＧＧＧＡＰＧＧＧＧＧＡＡＡＡＡＧＧＧＧＧＧＡＰＧＧＧＧＧＡＡＡＡＡＧＧＧＧＧＧＡＰ）からなるポリペプチドリンカー。
（項目２７）
ａ）第１のペプチド、
ｂ）第２のペプチド、ならびに
ｃ）該第１のペプチドと該第２のペプチドとの間に配置されたリンカー
を含み、該リンカーが、項目１４〜２６に記載のポリペプチドリンカーまたはポリペプチドリンカー組成物のいずれか１つを含む、ポリペプチド組成物。
（項目２８）
ａ）配列番号１、
ｂ）配列番号２、または
ｃ）配列番号１に記載の１個以上のシーケンシャルリピート
のアミノ酸配列を含むポリペプチドリンカーをコードするポリヌクレオチド。
（項目２９）
前記リンカーの１個以上のアラニン残基が、１個以上のセリン残基で置換されており、前記ポリヌクレオチドが、前記１個以上の置換されたセリン残基をコードする、項目２３に記載のポリヌクレオチド。
（項目３０）
ａ）第１のペプチド、
ｂ）第２のペプチド、ならびに
ｃ）該第１のペプチドと該第２のペプチドとの間に配置される配列番号１のアミノ酸配列の１個以上のシーケンシャルリピートを含むリンカー
のアミノ酸配列を含むポリペプチド組成物をコードするポリヌクレオチド。
（項目３１）
前記ポリペプチド組成物の前記リンカーが、配列番号１の３つのシーケンシャルリピートを含む、項目３０に記載のポリヌクレオチド。
（項目３２）
前記ポリペプチド組成物の前記リンカーの３’末端が、アミノ酸配列グリシンアラニン
プロリン（ＧＡＰ）をさらに含み、前記ポリヌクレオチドが、前記ＧＡＰアミノ酸配列をコードする、項目３０または３１に記載のポリヌクレオチド。
（項目３３）
前記ポリペプチド組成物の前記リンカーが、配列番号２を含む、項目３１に記載のポリヌクレオチド。
（項目３４）
前記ポリペプチド組成物の前記リンカーの１個以上のアラニン残基が、１個以上のセリン残基で置換されており、前記ポリヌクレオチドが、該１個以上の置換されたセリン残基をコードする、項目３０〜３３に記載のポリヌクレオチド。
（項目３５）
前記ポリペプチド組成物の前記第１のペプチドが、配列番号４のアミノ酸配列を含む、項目３０〜３４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
（項目３６）
前記ポリペプチド組成物の前記第２のペプチドが、受容体結合ドメインを含む、項目３０〜３５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
（項目３７）
前記第２のペプチドが、配列番号６のアミノ酸配列を含む、項目２８〜３６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
（項目３８）
項目２８〜３７のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
（項目３９）
項目２８〜３７のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む組換え細胞。
（項目４０）
項目３８に記載の発現ベクターを含む組換え細胞。
（項目４１）
項目１〜７または２７のいずれか一項に記載のポリペプチド組成物および薬学的に許容
され得るキャリアを含む、医薬組成物。
（項目４２）
項目８〜１３のいずれか一項に記載のポリペプチド組成物を含む医薬組成物。
（項目４３）
項目２８〜３４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドおよび薬学的に許容され得るキャリアを含む、医薬組成物。
（項目４４）
項目３５〜３７のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む医薬組成物。
（項目４５）
項目３９または４０に記載の組換え細胞および薬学的に許容され得るキャリアを含む医薬組成物。
（項目４６）
ポリペプチド組成物を産生する方法であって、該ポリペプチドの発現に適した条件下で項目３９または４０に記載の組換え細胞を培養することを含む、方法。
（項目４７）
治療用ポリペプチドを送達する必要のある被験体に治療用ポリペプチドを送達する方法であって、項目１〜１３または項目２７に記載のポリペプチド組成物のいずれか１つを該被験体に投与することを含む、方法。
（項目４８）
治療用ポリペプチドを送達する必要のある被験体に治療用ポリペプチドを送達する方法であって、
ａ）配列番号４のアミノ酸配列を含む第１のペプチド、
ｂ）配列番号６のアミノ酸配列を含む第２のペプチド、ならびに
ｃ）該第１のペプチドと該第２のペプチドとの間に配置される配列番号１のアミノ酸配列の１個以上のシーケンシャルリピートを含むリンカー
を含むポリペプチド組成物を該被験体に投与することを含む、方法。
（項目４９）
前記リンカーが、配列番号１の３’末端にアミノ酸配列グリシンアラニンプロリン（ＧＡＰ）をさらに含む、項目４８に記載の方法。
（項目５０）
前記リンカーが、配列番号２のアミノ酸配列を含む、項目４８に記載の方法。
（項目５１）
前記リンカーの１個以上のアラニン残基が、１個以上のセリン残基で置換されている、項目４８〜５０のいずれか一項に記載の方法。
（項目５２）
治療用ポリペプチドを送達する必要のある被験体に治療用ポリペプチドを送達する方法であって、項目３８に記載の１つ以上の発現ベクターを該被験体に投与することを含む、方法。
（項目５３）
治療用ポリペプチドを送達する必要のある被験体に治療用ポリペプチドを送達する方法であって、項目３９または４０に記載の１つ以上の組換え細胞を該被験体に投与することを含む、方法。
（項目５４）
リソソーム蓄積症を治療する方法であって、その必要のある被験体に、有効量の、項目４１〜４５に記載の医薬組成物のいずれか１つを投与することを含む、方法。
（項目５５）
前記リソソーム蓄積症が、サンフィリポ症候群である、項目５４に記載の方法。
（項目５６）
サンフィリポ症候群を治療する方法であって、有効量の、項目４２〜４５に記載の医薬組成物のいずれか１つをその必要のある患者に投与することを含む、方法。
（項目５７）
サンフィリポ症候群を治療する方法であって、その必要のある患者に対して、
ａ）配列番号４のアミノ酸配列を含む第１のペプチド、
ｂ）配列番号６のアミノ酸配列を含む第２のペプチド、ならびに
ｃ）該第１のペプチドと該第２のペプチドとの間に配置された配列番号１のアミノ酸配列の１個以上のシーケンシャルリピートを含むリンカー
を含むポリペプチド組成物を含む有効量の医薬組成物を投与することを含む、方法。
（項目５８）
前記リンカーが、配列番号１の３’末端にアミノ酸配列グリシンアラニンプロリン（ＧＡＰ）をさらに含む、項目５７に記載の方法。
（項目５９）
前記リンカーが、配列番号２のアミノ酸配列を含む、項目５７に記載の方法。
（項目６０）
前記リンカーの１個以上のアラニン残基が、１個以上のセリン残基で置換されている、項目５４〜５９のいずれか一項に記載の方法。
（項目６１）
前記医薬組成物が、非経口的に投与される、項目５４〜６０のいずれか一項に記載の方法。
（項目６２）
前記医薬組成物が、経口的に投与される、項目５４〜６０のいずれか一項に記載の方法。

本発明の上記に議論される特徴および付随する利点、ならびに他の多くの特徴および付随する利点は、添付の実施例と共に解釈される場合、以下の発明の詳細な説明に対する参照によってよく理解されるようになるであろう。本明細書において記載される様々な実施形態は、補足的な（ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔａｒｙ）ものであり、本明細書において含有される教示を考慮して、当業者によって理解されるように、ともに組み合わせるまたは使用することができる。

図１は、グリシンアラニングリシン（ＧＡＧ）リピート配列につながれたグリシンアラニンプロリン（ＧＡＰ）配列を含むペプチドリンカーのアミノ酸配列を示す（配列番号１）。図２は、ＧＡＰの配列に３’末端でつながれた配列番号１の３つのシーケンシャルリピートまたはタンデムリピートを含むペプチドリンカーのアミノ酸配列を示す（配列番号２）。図３Ａは、ＧＡＰリンカーによってつながれたα−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ−インスリン様増殖因子（ＮａＧｌｕ−ＩＧＦＩＩ）構築物を示す。図３Ｂは、配列番号２のリンカーによってつながれるＮａＧｌｕ−ＩＧＦＩＩ構築物を示す図（ＮａＧｌｕ−ＧＡＧ_３−ＩＧＦＩＩ）。図４Ａは、ヒトＮａＧｌｕのヌクレオチド配列（配列番号３）を示す。図４Ｂは、ヒトＮａＧｌｕのアミノ酸配列（配列番号４）を示す。図４Ａは、ヒトＮａＧｌｕのヌクレオチド配列（配列番号３）を示す。図４Ｂは、ヒトＮａＧｌｕのアミノ酸配列（配列番号４）を示す。図４Ａは、ヒトＮａＧｌｕのヌクレオチド配列（配列番号３）を示す。図４Ｂは、ヒトＮａＧｌｕのアミノ酸配列（配列番号４）を示す。図５Ａは、ヒトＩＧＦＩＩのヌクレオチド配列（配列番号５）を示す。図５Ｂは、ヒトＩＧＦＩＩのアミノ酸配列（配列番号６）を示す。図６は、ＧＡＧリピート配列を含むペプチドリンカーのアミノ酸配列（配列番号７）を示す。図７は、図３Ａにおいて示されるＮａＧｌｕ−ＩＧＦＩＩ構築物のアミノ酸配列（配列番号８）を示す。図８は、図３Ｂにおいて示されるＮａＧｌｕ−ＩＧＦＩＩ構築物のアミノ酸配列（配列番号９）を示す。図９は、ＨＴ１０８０細胞における２つの異なるＮａＧｌｕ−ＩＧＦＩＩタンパク質構築物（ＮａＧｌｕ−ＧＡＧ_３−ＩＧＦＩＩおよびＮａＧｌｕ−ＩＧＦＩＩ）の活性レベルの比較を示し、野生型ＮａＧｌｕと比較して、ＮａＧｌｕ−ＧＡＧ_３−ＩＧＦＩＩは非常に高いレベルの活性を有するが、ＮａＧｌｕ−ＩＧＦＩＩは活性をほとんど有していないことを実証する。図１０は、ウエスタンブロットによるＮａＧｌｕ−ＧＡＧ_３−ＩＧＦＩＩおよびＮａＧｌｕ−ＩＧＦＩＩポリペプチドの発現を示し、ＮａＧｌｕ−ＩＧＦＩＩタンパク質は分解を受けたが、野生型ＮａＧｌｕおよびＮａＧｌｕ−ＧＡＧ_３−ＩＧＦＩＩは受けなかったことを示す。図１１は、ヒト線維芽細胞（ＨＦ１１５６）によるＮａＧｌｕ−ＧＡＧ_３−ＩＧＦＩＩポリペプチドの取込みを示し、ＮａＧｌｕ−ＧＡＧ_３−ＩＧＦＩＩがヒト細胞によって容易に取り込まれたことを実証する。図１２は、ペプチドリンカーのアミノ酸配列（配列番号１０）を示す。図１３は、ペプチドリンカーのアミノ酸配列（配列番号１１）を示す。図１４は、ペプチドリンカーのアミノ酸配列（配列番号１２）を示す。

（発明の詳細な説明）
キメラポリペプチドまたは融合ポリペプチドを作製する（例えば設計する、操作する）手段を提供する組成物が、本明細書において記載される。このポリペプチド組成物はまた、目的の細胞、組織、または器官への、作用因子（例えばポリペプチド／ペプチド、タンパク質、および／または酵素）の送達を促進する手段を提供することもできる。特に、この組成物および方法は、その必要のある被験体の適切な組織に作用因子を選択的に送達し、それによって、疾患または障害を治療するために使用することができる。これらの治療用組成物は、治療剤および／または標的化作用因子の適切な発現、フォールディング、および活性を可能にするリンカー配列によって標的化作用因子（例えば、細胞受容体リガンドタンパク質）につながれた治療剤（例えば、タンパク質／酵素）を含むポリヌクレオチドまたはポリペプチドであってもよい。いくつかの態様では、この治療用組成物が、リンカー配列によって細胞表面受容体リガンドタンパク質に接続されたリソソームタンパク質またはリソソーム酵素を含む。この治療用ポリペプチド組成物は、リソソーム蓄積症のような障害を治療するために使用することができる。

本明細書において使用される場合、語句「リソソーム蓄積障害」（ｌｙｓｏｓｏｍａｌ
ｓｔｏｒａｇｅｄｉｓｏｒｄｅｒ）または「リソソーム蓄積症」（ｌｙｓｏｓｏｍａｌｓｔｏｒａｇｅｄｉｓｅａｓｅ）は、１つ以上のリソソーム酵素の異常な発現または欠損に関係する遺伝病のクラスを指す。これらの酵素欠損症は、罹患被験体のリソソームにおいて代謝産物の有害な蓄積をもたらす。代表的なリソソーム蓄積障害は、アスパルチルグルコサミン尿症、コレステリルエステル貯蔵病、シスチン蓄積症、ダノン病、ファブリー病、ファーバー病、フコース蓄積症、フラクトシアリドーシス（ｆａｌａｃｔｏｓｉａｌｉｄｏｓｉｓ）Ｉ／ＩＩ型、ゴーシェ病１、２、３型、グロボイド細胞白質ジストロフィー（ｇｌｏｂｏｉｄｃｅｌｌｌｅｕｃｏｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）／クラッベ病、グリコーゲン蓄積症ＩＩ／ポンペ病、ＧＭ１−ガングリオシドーシスＩ／ＩＩＩ型、ＧＭ２−ガングリオシドーシスＩ型／テイ−サックス病、ＧＭ２−ガングリオシドーシスＩＩ型／サンドホフ病、α−マンノシドーシスＩ／ＩＩ型、β−マンノシドーシス、異染性白質ジストロフィー（ＭＬＤ）、ムコリピドーシスＩ型／シアリドーシスＩ／ＩＩ型、ムコリピドーシスＩＩ／ＩＩＩ型、ムコリピドーシスＩＩＩ型偽ハーラー多発性ジストロフィー、ムコ多糖症（例えばＩ、ＩＩ、ＩＩＩＡ、ＩＩＩＢ、ＩＩＩＣ、ＩＩＩＤ、ＩＶＡ、ＩＶＢ、ＶＩ、ＶＩＩ、およびＩＸ型）、多発性スルファターゼ欠損症（ｍｕｌｔｉｐｌｅｓｕｌｐｈａｔａｓｅｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ）、神経セロイドリポフスチン症（例えば、バッテン、小児性、遅発型小児性、および成人型）、ニーマン−ピック病（例えば、Ａ、Ｂ、Ｃ１、Ｃ２型）、シンドラー病Ｉ／ＩＩ型、シアル酸蓄積症、サンフィリポ病（Ｓａｎｆｉｌｉｐｐｏｄｉｓｅａｓｅ）、ならびにウォルマン病（酸性リパーゼ欠損症）を含む。本発明の一態様では、この組成物が、その欠損がリソソーム蓄積障害に関連づけられる治療剤を含む。

ポリペプチド組成物およびこのポリペプチド組成物をコードするポリヌクレオチドが、本明細書において記載され、このポリペプチド組成物は、本明細書において開示されるリンカー配列によって接続された第１および第２のペプチド／ポリペプチドを含む。本発明者らは、２つのタンパク質配列（例えば第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチド）を接続する配列番号１（ＧＡＰＧＧＧＧＧＡＡＡＡＡＧＧＧＧＧ）の１個以上のシーケンシャルリピートまたはタンデムリピートを含むリンカーが、十分に発現され、かつ非常に活性が高い（例えば、生物学的に活性である）ポリペプチドの産生をもたらすことを驚くべきことに見出した。本明細書において使用される場合、用語「ポリペプチド」または「ペプチド」は、自然に（例えば単離する、本質的に精製する、もしくは精製する）または合成的に（例えば化学合成によって）産生することができる、もっぱらペプチド結合によって典型的につながれるアミノ酸残基のポリマーを指す。非宿主ＤＮＡ分子の発現によって産生されるポリペプチドは、「異種」のペプチドまたはポリペプチドである。このポリペプチドを含む「アミノ酸残基」は、ペプチド結合および／またはペプチド結合とは異なる結合によって連結された天然または非天然アミノ酸残基であってもよい。これらのアミノ酸残基は、Ｄ−立体配置またはＬ−立体配置にあってもよい。いくつかの態様では、本明細書において言及されるポリペプチドが、組換え核酸の発現によって産生されるタンパク質、ペプチド、またはその断片である。いくつかの実施形態では、本明細書において記載されるポリペプチド組成物が、リンカー配列（例えば配列番号２）によって接続された２つのポリペプチドを含み、この２つのポリペプチドのうちの一方は、疾患または障害を治療するために投与することができるペプチド（例えば治療用ペプチド）であり、他方のポリペプチドは、標的細胞、組織、または器官に治療用ペプチドを送達するために使用することができるペプチド（例えば標的化ペプチド）である。

本明細書において記載されるリンカーまたはポリペプチドリンカーは、２つのタンパク質配列を接続する（例えばつなぐ、連結する）ように設計されたペプチド配列を指し、このリンカーペプチド配列は典型的に、自然界においてこの２つのタンパク質配列の間に配置されていない。本発明との関連において、語句「連結される」または「つながれる」または「接続される」は、一般的に自然界において存在しないポリペプチドを産生するための、２つの連続したかまたは隣接したアミノ酸配列の間の機能的なリンケージを一般的に指す。ある実施形態では、リンケージが、例えば、１つ以上の治療用ペプチド作用因子および１つ以上の標的化作用因子（例えば結合ペプチドまたは受容体リガンドペプチド）のアミノ酸配列の共有結合を指すために使用されてもよい。一般的に、連結されたタンパク質は、互いに連続しているかまたは隣接しており、つながれた場合にそれらのそれぞれの使用可能性および機能を保持する。本明細書において開示されるキメラポリペプチドを含むペプチドは、１個以上のアミノ酸を含む、介在したペプチドリンカーによって連結される。そのようなリンカーは、キメラポリペプチドの所望の発現、活性、および／または立体配置的な位置決めを可能にするために望ましい可撓性（ｆｌｅｘｉｂｉｌｉｔｙ）を提供してもよい。典型的なアミノ酸リンカーは、可撓性となるように、またはこの２つのタンパク質部分の間に、アルファ−ヘリックスのような構造を介在させるために、一般的に設計される。リンカーは、リソソーム酵素をコードするポリペプチドのＮ末端もしくはＣ末端に融合するかまたは内部に挿入することができる。リンカーはまた、スペーサーとも呼ばれる。

リンカーペプチド配列は、目的の１個以上のタンパク質を接続するために任意の適切な長さのものであることができ、好ましくは、それが接続するペプチドのうちの一方または両方の適切なフォールディングおよび／または機能および／または活性を可能にするために、十分に可撓性となるように設計される。したがって、このリンカーペプチドは、３以下の、５以下の、１０以下の、１５以下の、２０以下の、２５以下の、３０以下の、３５以下の、４０以下の、４５以下の、５０以下の、５５以下の、６０以下の、６５以下の、７０以下の、７５以下の、８０以下の、８５以下の、９０以下の、９５以下の、または１００以下のアミノ酸の長さを有することができる。いくつかの実施形態では、このリンカーペプチドが、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１２、少なくとも１５、少なくとも１８、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、または少なくとも５０のアミノ酸の長さを有することができる。いくつかの実施形態では、このリンカーが、少なくとも１０でありかつ６０以下のアミノ酸、少なくとも１０でありかつ５５以下のアミノ酸、少なくとも１０でありかつ５０以下のアミノ酸、少なくとも１０でありかつ４５以下のアミノ酸、少なくとも１０でありかつ４０以下のアミノ酸、少なくとも１０でありかつ３５以下のアミノ酸、少なくとも１０でありかつ３０以下のアミノ酸、少なくとも１０でありかつ２５以下のアミノ酸、少なくとも１０でありかつ２０以下のアミノ酸、または少なくとも１０でありかつ１５以下のアミノ酸を含む。ある実施形態では、このリンカーが、１２〜５７のアミノ酸を含み、特定の実施形態では、５７個のアミノ酸を含む。リンカーを含むポリペプチド組成物において、このリンカーペプチド配列（例えばアミノ酸配列）の５’末端（５’ ｅｎｄ）（例えば末端部（ｔｅｒｍｉｎａｌ））は、あるタンパク質配列（例えば完全長タンパク質もしくはタンパク質ドメイン、断片、または改変体）の３’末端に隣接し、かつ共有結合しており、さらに、このリンカーアミノ酸配列の３’末端は、別のタンパク質配列の５’末端に隣接し、かつ共有結合している。このようにして産生されたポリペプチド組成物は、一般に、融合またはキメラのタンパク質／ポリペプチドを指し、適切な系における、ポリペプチド組成物をコードする核酸配列の発現（例えば転写、翻訳）によって典型的に作製される。融合および／またはキメラのポリペプチドを作製するための手段は、当該技術分野においてよく知られている（例えば、その全体が本明細書において参照によって組み込まれるＳａｍｂｒｏｏｋら、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇｓＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９９２）ＮｅｗＹｏｒｋを参照されたい）。

ある実施形態では、このリンカーアミノ酸配列は、グリシン、アラニン、および／またはセリンアミノ酸残基から構成される。本発明者らは、これらのアミノ酸上に分岐側鎖がないことにより、このリンカー内で、したがってポリペプチド組成物内で、より優れた可撓性（例えば二次元または三次元可撓性）がもたらされるので、単純アミノ酸（例えば、単純側鎖（例えばＨ、ＣＨ_３、もしくはＣＨ_２ＯＨ）を有するアミノ酸および／または非分岐のアミノ酸）が、ペプチドリンカーにおいて使用するのに好都合であることを見出した。さらに、本発明者らは、グリシン残基、アラニン残基、および／またはセリン残基が交互に存在することにより、このリンカー内に、さらにより優れた秩序およびより優れた可撓性がもたらされることを見出した。これらのアミノ酸は、このリンカーが機能的なまま存続する（例えば、発現される、および／または活性ポリペプチドをもたらす）のと適合する任意の様式で、交互に存在する／繰り返すことができる。このリンカーのいずれにおいても、アラニンアミノ酸残基は、セリンで置換され得る。したがって、このリンカー中のアミノ酸は、１個おきに（例えばＧＡＧＡ、ＧＳＧＳ）、２個おきに（例えばＧＧＡＡＧＧＡＡ、ＧＧＳＳＧＧＳＳ）、３個おきに、４個おきに、５個おきに、６個おきに、７個おきに、８個おきに、９個おきに、もしくは１０個おきに、またはそれより多くのアミノ酸おきに繰り返すことができるか、またはこれらのアミノ酸は、前述のものの任意の組み合わせで繰り返すことができる。ある実施形態では、これらのアミノ酸が、５アミノ酸おきに繰り返され、このリンカーが、１個以上のグリシンアラニングリシンの繰り返しからなる。例えば、このペプチドリンカーは、ＧＧＧＧＧＡＡＡＡＡＧＧＧＧＧ（配列番号７）またはＧＧＧＧＧＳＳＳＳＳＧＧＧＧＧ（配列番号１０）の繰り返しからなることができる。

さらに、本発明者らは、このリンカーの最初の（例えば５’末端）および／または最後の（例えば３’末端）５個のアミノ酸内にプロリン残基を配置することにより、このリンカー内にさらなる利点がもたらされることを見出した。例えば、リンカーまたはスペーサーは、ＧＡＰ（配列番号１１）またはＧＧＧＧＧＰ（配列番号１２）であり得る。理論によって拘束されるものではないが、可撓性のアミノ酸であるグリシン、アラニン、およびセリンと異なり、その環状側鎖が非可撓性をもたらすプロリンは、そうでなければ可撓性のリンカーの末端の近くにねじれをもたらし得、それによって、このリンカーによって接続されたポリペプチドを適切に分離させ得ると考えられる。したがって、このリンカーのアミノ酸配列は、このリンカー内の、１番目の、２番目の、３番目の、４番目の、もしくは５番目のアミノ酸残基にプロリンを有することができる、および／または最後の、最後から２番目の、最後から３番目の、最後から４番目の、もしくは最後から５番目のアミノ酸残基内にプロリンを有することができる。ある実施形態では、このペプチドリンカーが、１８個連続したアミノ酸残基を含むことができ、アミノ酸残基のうちの１つが、このリンカーの最初の５つのアミノ残基のいずれか１つに位置するプロリンであり、残りの１７個のアミノ酸残基が、グリシン残基およびアラニン残基（例えば１個以上のグリシン残基および１個以上のアラニン残基）から構成される。このリンカーのグリシンアミノ酸残基およびアラニンアミノ酸残基は、前述のグリシンアラニングリシンのリピートを含む、グリシン残基およびアラニン残基の任意の組み合わせを含むことができる。このリンカーは、２１個のアミノ酸を含むペプチドリンカーを産生するために、第２のプロリン、グリシン残基、および／またはアラニン残基を含む３個連続したアミノ酸をさらに含むことができる。この第２のプロリンもまた、リンカーアミノ酸配列における最後の５個のアミノ酸のいずれか１つであってもよい。

前述のペプチドリンカーは、所望の制限エンドヌクレアーゼ部位によってコードされる、１個以上のアミノ酸配列が側面に位置することができる。多数のエンドヌクレアーゼ切断部位（例えば、ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＡｓｃＩ部位、およびその他同種のもの）は、当該技術分野においてよく知られており、このリンカー（および／またはポリペプチド）核酸配列中にどの切断部位を含めるかについての選択は、当業者によって最良に決定され、この部位は、連結されるそれぞれの核酸配列に関して一般的に選ばれる。このエンドヌクレアーゼ制限部位は、必要に応じておよび／または所望される場合、このリンカー配列のそれぞれの末端上の同じ部位であってもよく、または異なる制限部位であってもよい。いくつかの実施形態では、リンカーのグリシンアラニングリシンというアミノ酸のリピートは、リンカーアミノ酸配列（例えば配列番号２）の５’末端および／または３’末端でグリシンアラニンプロリン（ＧＡＰ）というアミノ酸配列が側面に位置する。この例におけるＧＡＰの配列は、ＡｓｃＩ制限エンドヌクレアーゼ部位を表す核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、このリンカーアミノ酸配列が、配列番号１（ＧＡＰＧＧＧＧＧＡＡＡＡＡＧＧＧＧＧ）を含む。他の実施形態では、このリンカーアミノ酸配列が、配列番号１の１個以上の（例えば１、２、３、４、またはそれより多くの）シーケンシャルリピートを含む。本発明者らは、配列番号１の１個のリピートでさえ、リンカーの機能性を改善し、配列番号１の３個および４個のリピートが、連結されたポリペプチドの発現および／または活性を可能にするのに最も有効であることを見出した。ある実施形態では、配列番号１の１個以上のシーケンシャルリピートが、このリンカーのアミノ酸配列の３’末端／末端部のｇａｐ配列からさらに構成される。いくつかの実施形態では、このリンカーアミノ酸配列が、配列番号２（ＧＡＰＧＧＧＧＧＡＡＡＡＡＧＧＧＧＧＧＧＡＰＧＧＧＧＧＡＡＡＡＡＧＧＧＧＧＧＡＰＧＧＧＧＧＡＡＡＡＡＧＧＧＧＧＧＡＰ）を含む。

いくつかの実施形態では、適したリンカーまたはスペーサーが、配列番号２の配列と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％同一の配列を含有していてもよい。

本明細書において記載されるポリペプチド組成物において、２つのポリペプチド（例えば第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチド）は、上記に記載されるリンカーポリペプチドのいずれかによって組換えによりつなぐことができ、このリンカーは、この２つのポリペプチドの間に配置される。例えば、ある実施形態では、これらのポリペプチドまたは組成物が、配列番号１または配列番号２を含むリンカーによって組換えによりつながれた第１および第２のポリペプチドを含む。この２つのポリペプチドは、２つの異なるタンパク質または同じタンパク質のいずれかの完全長タンパク質、タンパク質断片または部分、機能タンパク質断片または部分、機能タンパク質ドメイン、およびその他同種のものを含む任意のアミノ酸配列とすることができる。本明細書において使用される場合、「機能的断片」または「部分」は、成熟タンパク質またはネイティブ（ｎａｔｉｖｅ）タンパク質の所望の生物学的活性のうちの１つ以上を保持するのに十分である（例えば、治療されることとなる障害に関する治療上のまたは寛解性の生物学的活性を保持するのに十分である）、成熟またはネイティブなタンパク質全体とはいえないタンパク質を指すことが意図される。したがって、アミノ酸配列またはポリペプチドは、改変することができる、例えば、改変が機能的な作用因子をコードするポリペプチドの能力を実質的に妨害しない様式で、アミノ酸を挿入した、欠失させた、および／または置換したポリペプチド配列とすることができる。

いくつかの実施形態では、このポリペプチド組成物の１つのタンパク質が、所望の活性を有するペプチドであり、一方、他方のポリペプチドが、特定の細胞または組織に、所望の活性を有するポリペプチドを送達するかまたは標的化する。本明細書において使用される場合、標的化リガンドまたは結合ペプチドという語句は、所望の活性について特定の部位に作用因子（例えば、タンパク質、ポリペプチド）を導き、送達するように働くアミノ酸配列を指す。特定の実施形態では、これらのポリペプチドのうちの１つの所望の活性が、治療上のまたは予防的な活性（例えば治療、置換、阻害、予防、増強、低下、または改善）である。例えば、いくつかの実施形態では、本明細書において記載されるポリペプチド組成物が、リソソーム蓄積症／リソソーム蓄積障害において欠損している１つ以上の酵素および／またはタンパク質を含む。例えば、開示される組成物は、アスパルチルグルコサミニダーゼ、酸性リパーゼ、システイントランスポーター、Ｌａｍｐ−２、α−ガラクトシダーゼＡ、リポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）、セラミダーゼ、α−Ｌ−フコシダーゼ、β−ヘキソサミニダーゼＡ、β−グルクロニダーゼ（β−ｇｌｕｃｏｒｏｎｉｄａｓｅ）、ＧＭ２ガングリオシドアクチベータータンパク質、α−Ｄ−マンノシダーゼ、β−Ｄ−マンノシダーゼ、アリールスルファターゼＡ、サポシンＢ、ノイラミニダーゼ、α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ、ホスホトランスフェラーゼ、ホスホトランスフェラーゼ、Ｌ−イズロニダーゼ、イズロネート−２−スルファターゼ、イズルスルファーゼ、ヘパラン−Ｎ−スルファターゼ、ヘパリンスルファミダーゼ、α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ、Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミン６−スルファターゼ、ガラクトース６−スルファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、Ｎ−アセチルガラクトサミン４−スルファターゼ、Ｎ−アセチルグルコサミン６−スルファターゼ、ヒアルロノ−グルコサミニダーゼ、多種スルファターゼ、パルミトイルタンパク質チオエステラーゼ、トリペプチジルペプチダーゼＩ、酸性スフィンゴミエリナーゼ、α−ガラクトシダーゼＢ、シアル酸、ならびに上記の機能的断片、サブユニット、および組み合わせのうちの１つに由来するアミノ酸配列を含むまたはそれからなる１つ以上の治療剤を含んでいてもよい。ある実施形態では、ポリペプチド組成物のタンパク質（例えば治療用タンパク質）のうちの１つが、Ｎ−アセチル−アルファ−グルコサミニダーゼ（ＮａＧｌｕ）、特にヒトＮａＧｌｕ、またはＮａＧｌｕの機能的部分、断片、改変体、変異体、もしくは誘導体を含む。リソソーム酵素ＮａＧｌｕの損失は、リソソーム蓄積障害、サンフィリポ症候群の原因であると考えられる。

いくつかの実施形態では、このポリペプチド組成物のポリペプチドのうちの１つが、細胞表面受容体リガンドを含み、特定の実施形態では、このポリペプチドが、ＩＧＦＩＩ／カチオン非依存性マンノース６−リン酸受容体（ＩＧＦＩＩ／ＣＩ−ＭＰＲ）のリガンドのうちの１つであるＩＧＦＩＩである。このＩＧＦＩＩ／ＣＩ−ＭＰＲは、哺乳動物細胞において新しく合成されたリソソーム酵素上のオリゴ糖に追加されたマンノース６−リン酸（Ｍａｎ６−Ｐ）部分を認識する。このＩＧＦＩＩ／ＣＩ−ＭＰＲとのＭａｎ６−Ｐ相互作用が、新しく合成された酵素をリソソームに運ぶ正常な細胞内輸送を調節するので、ＩＧＦＩＩ／ＣＩ−ＭＰＲは、このリソソーム酵素を細胞に送達するために使用することができる受容体メカニズムであると考えられる。上記に記載される組成物は、その後、受容体媒介性トランスサイトーシスメカニズムを頼りにして、目的の細胞（例えば、内皮細胞、マクロファージ、またはニューロン細胞）に対して、連結されたタンパク質（例えば治療用タンパク質）を送達するであろう。生理学的に、受容体媒介性の輸送は、細胞内に高分子（例えば、タンパク質、ポリペプチド）を輸送するために頼りにされ、一般的に、標的とされた細胞上の特異的な受容体結合ドメイン（例えばカチオン非依存性マンノース６−リン酸受容体（ＣＩ−ＭＰＲ）、ＩＧＦＩ受容体、ＩＧＦＩＩ受容体、またはＩＧＦＩＩ／ＣＩ−ＭＰＲ）への高分子（例えばＩＧＦＩまたはＩＧＦＩＩ部分）のリガンド認識および結合を伴う。この受容体上のこの結合ドメインへのこのリガンドの認識および結合の後に、受容体−リガンド複合体は、この細胞（例えば内皮細胞またはマクロファージ）によるエンドサイトーシスを受け、この複合体はそれによって内部移行される。このリガンドは、その後、細胞（例えば、内皮細胞、ニューロン細胞、グリア細胞、脈管周囲細胞、および／または髄膜細胞）の反管腔側の膜を横切り、適切な組織（例えば、脳または脊髄組織のような中枢神経系の組織）の中に輸送され得る。本明細書において記載されるある実施形態では、ポリペプチド組成物の結合ペプチドまたは標的化ペプチドが、配列番号４、ＩＧＦＩＩのアミノ酸残基８〜６７を含む。

翻訳されたポリペプチドまたはタンパク質を単離するおよび／または検出するさらなる手段を提供するための、開示される組成物の中への機能タンパク質標識またはタグを含めることもまた、本明細書において企図される。適した標識およびタグは、当該技術分野においてよく知られており、例えば、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質、アルカリホスファターゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、ｍｙｃ−タグ、ＦＬＡＧタグ、ｅＴａｇ、およびポリヒスチジンタグを含むが、これらに限定されない。好ましい実施形態では、そのような標識およびタグが、例えば、所望の細胞および組織（例えばＣＮＳ組織）内にそのポリペプチド組成物をコードするアミノ酸配列が分布する際に、そのような標識またはタグの同定を促進する、検出可能なシグナルを提供することができる。

リンカー配列によって接続される２つのポリペプチドを含む、本明細書において記載されるポリペプチド組成物は、合成的に産生することができる（例えば化学合成によって）またはポリヌクレオチド（例えば核酸）配列によってコードし、発現する（例えば転写し、翻訳する）ことができる。本明細書において使用される場合、「ポリヌクレオチド」は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）もしくはリボ核酸（ＲＮＡ）、オリゴヌクレオチド、当該技術分野において知られている任意の適切な手段（例えばライゲーションもしくはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ））によって生成される断片、ならびに／またはライゲーション、切断、エンドヌクレアーゼ作用、およびエキソヌクレアーゼ作用のいずれかによって生成される断片のような連続した共有結合した核酸または核酸分子を指す。ポリヌクレオチド分子は、天然に存在するヌクレオチド（ＤＮＡおよびＲＮＡのような）である単量体から構成することができる。いくつかの実施形態では、本明細書において記載されるポリペプチド組成物が、相同なポリヌクレオチド配列によってコードされる。ポリヌクレオチドは、当業者らに知られている組換えＤＮＡ技術を使用して産生される（例えばＳａｍｂｒｏｏｋら、１９９２を参照されたい）。一般的に、本発明に従って、１つ以上の標的化作用因子（例えばＩＧＦＩＩのようなリガンド／結合タンパク質またはその生物学的に活性な断片）は、治療剤（例えば酵素ＮａＧｌｕまたはその生物学的に活性な断片）をコードする核酸またはアミノ酸配列に作動可能に連結される。リンカー配列によってつながれる少なくとも２つの遺伝子のヌクレオチド配列から構成される、本明細書において記載されるポリヌクレオチド分子のうちのいくつかは、２つのタンパク質のハイブリッドを表し得る融合ポリペプチドまたはキメラポリペプチドを産生することができる。本明細書において記載されるポリペプチド組成物はまた、発現ベクターの中にクローニングし、適した宿主において発現させることができる適した調節エレメントを含んでいてもよい。融合タンパク質を設計し、発現し、精製するための組換え方法は、当該技術分野において知られている（例えばＳａｍｂｒｏｏｋら、１９９２を参照されたい）。

上記に記載されるポリヌクレオチドを含有する発現ベクターおよびポリヌクレオチドまたは発現ベクターを含む組換え細胞もまた、本明細書において企図される。「発現ベクター」は、宿主細胞において発現される遺伝子をコードするポリヌクレオチド分子である。典型的に、発現ベクターは、転写プロモーター、遺伝子、および転写ターミネーターを含む。遺伝子発現は、通常、プロモーターの制御下に置かれ、そのような遺伝子は、このプロモーター「に作動可能に連結されている」と言われる。同様に、調節エレメントがプロモーターの活性を調整する場合、調節エレメントおよびプロモーターは、作動可能に連結することができる。ベクターの発現に使用される「組換え」または「宿主」細胞は、本明細書において記載されるポリヌクレオチドのようなポリヌクレオチド分子を含有する細胞である。大量のタンパク質が、そのような発現ベクターおよび／または組換え細胞を使用して、インビトロにおいて産生されてもよく、したがって、開示されるポリペプチド組成物を産生するための方法が、本明細書において企図される。そのような方法は、ポリヌクレオチドからのポリペプチドの発現に適した条件下でポリヌクレオチド（例えば発現ベクター）を含む組換えおよび／または宿主の細胞を培養することを含む。タンパク質合成能力を有する任意の細胞が、この目的のために使用されてもよい（例えば動物、細菌、酵母、または昆虫細胞）。特定のタンパク質改変が必要とされる場合、動物細胞、特に哺乳動物細胞が必要であってもよい。そのポリペプチド組成物を発現するために使用されてもよい細胞は、ＨＴ１０８０、ＨＦ１１５６、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＣＨＯ−Ｋ１細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ＦＡＯ（肝細胞）、ヒト３Ｔ３細胞、Ａ２０細胞、ＥＬ４細胞、ＨｅｐＧ２細胞、Ｊ７４４Ａ細胞、Ｊｕｒｋａｔ細胞、Ｐ３８８Ｄ１細胞、ＲＣ−４Ｂ／ｃ細胞、ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞、Ｓｐ２／ｍＩＬ−６細胞、ＳＷ４８０細胞、３Ｔ６Ｓｗｉｓｓ細胞、およびその他同種のものが挙げられるが、これらに限定されない。様々な細胞／系におけるタンパク質発現に適した条件は、細胞／系に依存性であり、当該技術分野においてよく知られている（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９９２）。

所望の治療効果（例えば目的の細胞および組織内への分布）を達成するために、被験体（例えば疾患または障害を有する被験体）に投与することができる医薬組成物もまた、企図される。本明細書において企図される医薬組成物は、例えば、１つ以上の標的化リガンド（例えばＩＧＦＩＩの断片）に作動可能に連結された１つ以上の治療剤（例えばリソソーム酵素ＮａＧｌｕ）をコードする核酸配列もしくはアミノ酸配列、またはこの核酸配列もしくはアミノ酸配列を含むベクターもしくは細胞を含む。そのようなアミノ酸または核酸は、単独で投与されてもよいが、少なくとも１つの他の作用因子または賦形剤（例えば緩衝化食塩水、デキストロース、および精製水のような薬学的に許容され得るキャリア）と組み合わせて好ましくは投与される。

適した薬学的に許容され得るキャリアは、その中に懸濁されたかまたは溶解されたタンパク質、酵素、核酸、アミノ酸、および／またはポリペプチドを好ましくは安定化し、被験体に投与され得る医薬組成物への、そのようなタンパク質、酵素、核酸、アミノ酸、および／またはポリペプチドの加工を促進する。記載される医薬組成物は、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、髄内、鞘内、室内、経皮的、皮下、腹腔内、鼻腔内、非経口、局所（ｔｏｐｉｃａｌ）、舌下、または直腸手段が挙げられるが、これらに限定されない任意の数の経路によって投与することができる。

非経口投与に適した医薬製剤は、水溶液中で、好ましくは、生理学的緩衝化食塩水のような生理学的に適合性の緩衝液中で製剤とすることができる。水性注射用懸濁液は、カルボキシルメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、またはデキストランのような懸濁液の粘度を増大させる物質を含有することができる。必要に応じて、この懸濁液はまた、化合物の溶解度を増大させて高濃縮溶液の調製を可能にする、適した安定剤または作用因子をも含有することができる。製剤および投与についての技術についてのさらなる詳細は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅ（ＭａａｃｋＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．）の最新版において見つけることができる。医薬組成物が調製された後に、それらは、適切な容器中に入れ、示される状態の治療について（例えばサンフィリポ症候群の治療について）ラベルを付けることができる。そのようなラベリングは、被験体に投与されることとなる医薬組成物の有効量を計算するための説明書、適切な投薬スケジュール、許容され得る投与経路、および予想される副作用を含んでいてもよいが、これらに限定されない。

本明細書において開示されるポリペプチド組成物および／または発現ベクターおよび／または組換え細胞をその必要のある被験体に投与することによって、治療用ポリペプチドを送達する必要のある被験体に治療用ポリペプチドを送達する方法もまた、企図される。有効量の、開示されるポリペプチド組成物をリソソーム蓄積障害（例えばサンフィリポ症候群）を治療する必要のある被験体に投与することによって、リソソーム蓄積障害（例えばサンフィリポ症候群）を治療する方法が、さらに企図される。本明細書において使用される場合、用語「被験体」は、任意の哺乳動物（例えばヒト、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ブタ、サル、ウマ）、特にヒトを指すことを意味する。ある実施形態では、その被験体が、成体、青年、または乳児である。この組成物の投与および／または子宮内の治療方法の実行もまた、本発明によって企図される。本明細書において開示される組成物および方法は、上記に記載される投与経路のいずれを使用して投与されてもよく、ある実施形態では、このポリペプチド組成物が、非経口的に投与される。

本明細書において使用される場合、語句「有効量」は、所望の臨床効果を達成するために必要とされる治療剤および／またはポリペプチドの量を指し、医薬組成物中に含有される治療剤の総量に基づいて概して決定される。一般的に、治療剤の有効量は、被験体にとって意味のある利点を達成する（例えば根底にある疾患または状態を治療する、調整する、治癒する、予防する、および／または改善する）のに十分である。例えば、本明細書において記載される医薬組成物の有効量は、リソソーム酵素受容体またはそれらの活性を調整し、それによって、そのようなリソソーム蓄積障害またはその症状を治療するのに十分な量のような、所望の治療および／または予防の効果を達成するのに十分な量であってもよい。一般的に、その必要のある被験体に投与される治療剤（例えば組換えリソソーム酵素）の量は、この被験体の特徴に依存する。そのような特徴としては、この被験体の状態、全般的健康状態、年齢、性別、および体重が挙げられる。当業者は、これらのおよび他の関係する要因に依存して、適切な投薬量を容易に決定することができる。さらに、客観的アッセイおよび主観的アッセイの両方が、最適な投薬量範囲を同定するために必要に応じて用いられてもよい。

（例示）
リソソーム酵素Ｎ−アセチル−アルファ−グルコサミニダーゼ（Ｎａｇｌｕ）の取込みを最大限にするために、成熟ＩＧＦＩＩの残基８〜６７をコードするカセットを、完全長ヒトＮａｇｌｕオープンリーディングフレームのＣ末端にインフレームで融合した。この構築物の設計は、ＬｅＢｏｗｉｔｚら（ＰＮＡＳ１０１（９）：３０８３−３０８８、２００４）によって記載される同様のグルクロニダーゼ（ｇｌｕｃｏｒｏｎｉｄａｓｅ）−ＩＧＦＩＩ融合タンパク質とし、彼らは、ＩＧＦＩＩカチオン非依存性マンノース−６−リン酸受容体を通してのグルクロニダーゼ（ｇｌｕｃｏｒｏｎｉｄａｓｅ）の細胞取込みが、その受容体上の別個の部位に高い親和性で結合するＩＧＦＩＩに融合された場合に非常に改善されたことを観察した。そのような融合タンパク質の利点を確立するために、一方は完全長野生型ヒトＮａｇｌｕを発現し、他方は３つの残基（グリシンアラニンプロリン（ＧＡＰ））からなるリンカー領域を有するＮａｇｌｕ−ＩＧＦＩＩ融合タンパク質を発現する２つの発現プラスミドを生成した（図３Ａ）（ＬｅＢｏｗｉｔｚ、２００４）。

ＨＴ１０８０哺乳動物安定細胞株を、野生型ＮａｇｌｕおよびＮａｇｌｕ−ＩＧＦＩＩの両方について生成した。１×１０^６細胞／ｍｌでの安定細胞株の播種および３３℃での２４時間の培養の後に、タンパク質発現を、ウエスタンブロットによって馴化培地中でモニターし、活性を、蛍光発生基質４ＭＵ−Ｎ−アセチル−アルファ−Ｄ−グルコサミニドの切断を測定することによって決定した。Ｎａｇｌｕ−ＩＧＦＩＩの、細胞数によって標準化した活性は、タグ付けされていないＮａｇｌｕについて観察されたものの１０分の１であったことが決定された（図９を参照されたい）。ウエスタンブロットによって、試料充填量を細胞数によって標準化した場合、Ｎａｇｌｕ−ＩＧＦＩＩ発現が、タグ付けされていないＮａｇｌｕよりも著しく低かったことが明らかであった（図１０）。さらに、ウエスタンブロットのＮａｇｌｕ−ＩＧＦＩＩレーン中の上の方のバンドの下に広がる、より低分子量のバンドによって証明されるように、かなりの量の分解もまた、Ｎａｇｌｕ−ＩＧＦＩＩ発現の間に起こっていた（矢印、図１０）。この発現および崩壊のレベルは、３つの別々の安定したトランスフェクションを含め、開発したすべてのＮａｇｌｕ−ＩＧＦＩＩ安定クローン中で観察された。実際に、様々なＮａｇｌｕ−ＩＧＦＩＩクローンの発現レベルおよび活性を分析する場合、ウエスタンブロットによって観察された分解の量および試料中のＮａｇｌｕ−ＩＧＦＩＩ活性のレベルの間に非常に明白な相関性があった。したがって、馴化培地中でより高度なレベルのＮａｇｌｕ−ＩＧＦＩＩを示すクローンは、典型的に、ウエスタンブロットにおいて対応する、より高度なレベルの分解を有した。Ｎａｇｌｕ−ＩＧＦＩＩは、ＩＧＦＩＩタンパク質の配置により比較的不活性であり、Ｎａｇｌｕ−ＩＧＦＩＩクローンから採取された試料中で観察された活性のレベルは、主として、ＩＧＦＩＩタンパク質が切り取られたことによるものであり、細胞馴化培地試料において、活性でタグ付けされていないＮａｇｌｕのレベルの増加がもたらされたことが疑われた。

ＮａｇｌｕとＩＧＦＩＩとの間のリンカーの長さを増加させることにより、より立体配置的に安定したフォールドされたタンパク質を可能にすることによって、Ｎａｇｌｕ−ＩＧＦＩＩ融合タンパク質の発現および活性が改善されるかもしれず、ならびに／またはＩＧＦＩＩ活性部位とＮａｇｌｕ活性部位との間のあらゆる妨害の可能性を予防するかもしれないと仮定した。リンカーの長さを増加させるために、ＡｓｃＩ制限エンドヌクレアーゼ部位によってコードされるもともとのｇａｐリンカーが側面に位置する、グリシンアラニングリシンのリピートからなる補足的なオリゴを生成した。このオリゴを、その後、ＡｓｃＩ部位にライゲーションした。このライゲーションにおいて、３つのｇａｇオリゴをこのリンカーに組み込み、５７アミノ酸長のリンカーがもたらされた（図３Ｂおよび図８）。この構築物から生成された安定したクローンは、Ｎａｇｌｕと同じくらい活性であり（図９）、Ｎａｇｌｕと同様のレベルまで発現された（図１０）、Ｎａｇｌｕ−ＧＡＧ_３−ＩＧＦＩＩタンパク質を生じた。これにより、より長いリンカーが、Ｎａｇｌｕ−ＩＧＦＩＩ融合タンパク質の適切なフォールディングおよび酵素活性を可能にしたことが確認された。さらに、組換えＮａｇｌｕ−ＧＡＧ_３−ＩＧＦＩＩおよびＮａｇｌｕを、ヒト線維芽細胞（ＨＦ１１５６）における取込みについて試験した。Ｎａｇｌｕ−ＧＡＧ_３−ＩＧＦＩＩは、この細胞によって容易に取り込まれ、その取込みは、ＩＧＦＩＩによって用量依存性の様式で阻害されたが、マンノース６−リン酸（Ｍ６Ｐ）によっては阻害されなかった（図１１）。予期されるように、Ｍ６Ｐを欠く組換えＮａｇｌｕはこの細胞における取込みを示さなかった（図１１）。

したがって、本発明者らは、驚くべきことに、高度に発現された活性なＮａｇｌｕ−ＩＧＦＩＩポリペプチドをもたらしたペプチドリンカーを見出した。この研究から、より長いリンカー（例えば、３アミノ酸よりも長い）が、タンパク質の適切なフォールディング／活性をもたらし、その分解を予防したと考えられる。したがって、このペプチドリンカーおよび同様のペプチドリンカーは、他のタンパク質を連結し、かつ異種ポリペプチドを作り出すために一般的に使用することができる。

本発明のある組成物および方法が、ある実施形態に従って特定して記載されたが、以下の例は、本発明の化合物を例示するためのみの役目をし、本発明の化合物を限定するようには意図されない。

本明細書および請求項において、本明細書において使用される場合、冠詞「１つの（ａ）」および「１つの（ａｎ）」は、反対のことが明らかに示されない限り、複数の指示物を含むことが理解されるべきである。１つの群の１つ以上のメンバーの間に「または」を含む請求項または説明は、反対のことが示されるかまたは文脈からそうでないことが明白でない限り、群のメンバーのうちの１つ、１つを超えるもの、またはすべてが、所定の産物またはプロセスにおいて存在する、用いられる、またはさもなければ関連しているならば、満たされるものであると考えられる。本発明は、その群のまさに１つのメンバーが、所定の産物またはプロセスにおいて存在する、用いられる、またはさもなければ関連している実施形態を含む。本発明はまた、群の１つを超えるメンバーまたは群の全メンバーが、所定の産物またはプロセスにおいて存在する、用いられる、またはさもなければ関連している実施形態をも含む。さらに、本発明は、他に指定のない限りまたは矛盾もしくは不整合性が生じることが当業者に明白でない限り、列挙される請求項のうちの１つ以上からの１つ以上の限定、エレメント、節、記述的な用語などが、同じ基本請求項（または適宜、任意の他の請求項）に依存して、別の請求項に導入されるバリエーション、組み合わせ、および並べ換えをすべて包含することを理解されたい。エレメントがリストとして（例えばマーカッシュグループまたは同様の形式で）示される場合、エレメントのそれぞれのサブグループもまた開示され、任意のエレメントをその群から取り除くことができることを理解されたい。一般に、本発明または本発明の態様が、特定のエレメント、特徴などを含むと言及される場合、本発明のある実施形態または本発明の態様は、そのようなエレメント、特徴などからなる、または、から本質的になることが理解されるべきである。簡潔さの目的のために、それらの実施形態は、すべての場合において、本明細書において、あまり多くの単語では詳細には記載しなかった。具体的な除外が本明細書において記載されているかどうかにかかわらず、本発明の任意の実施形態または態様を、請求項から明示的に除外することができることもまた、理解されるべきである。本発明の背景を記載し、かつその実施に関するさらなる詳細について提供するために本明細書において参照された刊行物、ウェブサイト、および他の参考資料は、参照によって本明細書に援用される。

Claims

ポリペプチドまたはポリヌクレオチドまたは薬学的組成物または方法。