JP2019503401A

JP2019503401A - ピロロキノリンキノン、その誘導体及び／又は塩の乾燥症候群における使用ならびに医薬組成物

Info

Publication number: JP2019503401A
Application number: JP2018558471A
Authority: JP
Inventors: 温伝俊; 孫奮勇
Original assignee: Nanjing Shupeng Lifescience Co Ltd
Current assignee: Nanjing Shupeng Lifescience Co Ltd
Priority date: 2016-02-04
Filing date: 2017-01-22
Publication date: 2019-02-07
Anticipated expiration: 2037-01-22
Also published as: US10702519B2; CN107007606A; EP3412292A1; EP3412292B1; US20190030024A1; CN107007606B; WO2017133523A1; EP3412292A4; JP6638092B2; EP3412292B8

Abstract

本発明は、原発性乾燥症候群、続発性乾燥症候群、乾燥症候群による口腔乾燥や眼乾燥症状、及び他の外分泌腺と腺以外の器官にわたる複数システムの身体障害の治療及び/又は予防剤を製造するための、式(I)で示されるピロロキノリンキノン、その誘導体及び/又は塩（PQQ）の使用に関する。式中、R1、R2とR3が相同又は異なって、独立して、低級アルキル、低級アルケニル、低級アルキニル、アラルキル、アラカリル、フェニル、水素原子、ナトリウム原子又はカリウム原子を示す。本発明は、PQQ又はPQQと活性ビタミンD、NAC、レスベラトロール、エピガロカテキン没食子酸、クルクミン、アントシアニン、ビタミンE、ビタミンC、ビタミンD等併用の医薬組成物も関する。当該医薬組成物は乾燥症候群と乾燥症候群の関連疾患を治療できる。本発明は、体内の過剰な酸素ラジカルを除去し、酸化ストレスによるNF-κBの活性化を阻害し、自己免疫を阻害することができ、そこで乾燥症候群の炎症反応を減少させる。【選択図】図１

Description

本発明は、ピロロキノリンキノン、その誘導体及び/又は塩の乾燥症候群における使用ならびに医薬組成物に関する。より詳細には、乾燥症候群、乾燥症候群による口腔乾燥や眼乾燥症状、及び他の外分泌腺と腺以外の器官にわたる複数システムの身体障害の治療及び/又は予防剤を製造するための、ピロロキノリンキノン、その誘導体及び/又は塩の使用に関する。

乾燥症候群(Sjogren's syndrome，SS)は、主に外分泌腺にわたる慢性炎症性自己免疫疾患であり、その炎症反応が主に外分泌腺の上皮細胞に現れる。臨床的症状としては、口腔乾燥や眼乾燥等の唾液腺と涙腺が損傷されて機能低下に起因する症状以外に、他の外分泌腺と腺以外の器官にわたる複数システムの身体障害の症状も見られる。患者の血清には自己抗体と高濃度の免疫グロブリンが多く存在している。本症候群は、原発性と続発性の2種類に分けられ、前者が世界的な疾患であり、中国における発症率が0.3%〜0.7%である。本症候群の患者は、90%以上が女性であり、男女比が1:9〜1:20、発症年齢が主に40〜50歳である。乾燥症候群は、19世紀末に初めて記載されて以来、それについての研究が百年を超えている。SSの発症メカニズムは、まだ完全に解明されていないが、90年代に入ってから、免疫学、分子生物学技術の発展に伴い、研究に一定の進展をみており、病因が遺伝、免疫、内分泌やウイルス感染などの要因に関連し得ると推察されている。今、基本的な共通認識として、多数の学者はSSが遺伝的感受性を有すると考えている。その上で、局所非特異的な炎症は、細胞因子IFN-γ、TNF-aの発現を誘発して、一連の免疫反応を引き起こすことができる(Ann Rheum Dis, 2003, 62(4):359-62. Clin Rev Allergy Immunol, 2007, 32(3):252-64)。炎症は、患者の免疫調節メカニズムの乱れによって慢性に持続して外分泌腺を損傷する。従って、その病理学的な主要な変化は、リンパ細胞とパルプ細胞が腺組織へ浸潤して進行性の破壊を引き起こし、その結果、唾液と涙液の分泌が減少し、口や目の乾燥症状が発生することである。

本症候群に対して、まだ安全かつ有効な治療法はないが、症状を改善し、免疫反応に起因する組織損傷の進展と続発性感染を抑制および遅延する療法が主に行われている。非ステロイド抗炎症薬(NSAIDS)は、主にSSによる筋肉痛、関節痛、軽度漿膜炎や発熱などの症状を治療するために使用されて、通常速く効く、投与してから数日間効果が見られる。しかし、対症治療しかできない。副作用としては、消化管反応(出血まで)、腎損傷や骨髄抑制などが挙げられ、肝機能損害を引き起こした場合もあり、たまに発疹、血細胞減少や膵炎も見られる。乾燥症候群患者は、例えば神経系、血液系、重度の間質性肺疾患、血管炎、肝損傷や筋炎などの複数システムの内臓障害が発生した場合に、普通にグルココルチコイドを投与する治療を受け、重態の患者に対して、ホルモン・ショックの治療法を採用できる。注意すべきことは、グルココルチコイドの長期投与が、例えば医原性副腎皮質機能亢進、感染症の誘発と増悪、消化性潰瘍の誘発と増悪、骨粗鬆症や無菌性骨壊死などの副作用を引き起こす恐れがある。病状が急速に進んでいた患者に対して、例えばシクロホスファミド、アザチオプリンなどの免疫抑制剤を併用できる。

SSについて、百年も超えた研究が行われていたが、その病因と発症メカニズムはまだ判明しておらず、SS発症が免疫、遺伝、環境、感染、神経の調節異常などの要因に関連する可能性がある。研究(Journal of Autoimmunity, 2001，17：141-153)により、細胞因子は、SSと広範かつ密接に繋がって、SSの発症過程において重要な役割を果たしている。例えば、インターフェロンは、唾液腺の上皮細胞(SGEC)の成長と分化も抑制できるし、SGECの分離とアポトーシスも誘導できる(J．Immunol，2000，164：1277-1285)。腫瘍壊死因子(TNF-α)は、腺細胞の溶解を促進して、内皮細胞の接着性を変えることができる(Adv Exp Med Biol，1998，438：909-915)。インターロイキンは、SSの外分泌腺組織の病変に細胞の成長と分化を調節し、様々な細胞の挙動と特徴を影響し、炎症反応に参加し、免疫応答を調節する (Arthritis Rheum，1997，40：987-990)。Foxら(Cur Opi Rheum，2000，12：391-398)は、SS患者におけるSGECから産生されたIL-1α，6とTNF-α mRNAが正常なSGECの40倍以上であることを発見した。ELISA法による検出では、SS患者における耳下腺のIL -1β、IL-6、IL-10、TNF-αとIFN-γはいずれも増加した(Lab Invest．1999．12：1719-1726)。従って、細胞因子媒介性炎症反応がSSの重要な発症メカニズムであると考えられる。

核因子-κB (nuclear factor kappa B、NF-κB)は、遺伝子の発現を調節と制御するDNA結合蛋白質であり、多くの重要な細胞因子、接着分子とケモカインの遺伝子の発現を調節と制御することを通して、生体の様々な生理、病理的な過程に参加する。その中で、最も重要なのは免疫と炎症反応である。NF-κBは炎症と免疫反応における一般的に存在する重要な転写因子であることが確認された。NF-κBは、急速に反応する転写因子であり、炎症反応における炎症メディエーター(IL-1β、IL-6、IL-10やTNF-α等)、接着分子や酵素などを発現して働く。炎症反応において、NF-κBは、マクロファージと白血球の活性化に参加し、かつ、多くの細胞因子と炎症性蛋白質、炎症性サイトカインの遺伝子の発現を制御する。この調節と制御の暴走は、炎症反応の拡大または組織損傷を引き起こしてしまう。研究(Arthritis Res Ther.2012 Mar 14;14(2):R64)により、TOLL様受容体2 (toll-like receptor 2，TLR 2) の活性化は、NF-κBを介してIL-23/IL-17の発現を誘導でき、この過程がSSの形成と密接に関係する。Lisi Siらは、核因子κBの抑制因子α(IκBα)の発現低下がNF-κBの経路を向上させることができ、SSに関連する細胞因子の産生量と炎症反応を増加させ、こうしてSSの発生を引き起こすことを発見した(Lisi ら，Pathology.2012 Oct;44(6):557-61)。

酸化ストレス(Oxidative Stress，OS)は、体内の酸化と抗酸化作用がアンバランスであり、活性酸素種(ROS)と活性窒素種(RNS)等の高活性分子が過剰に産生され、酸化が酸化物の除去を超えるように進行し、そのため、中性粒細胞の炎症性浸潤と組織の損傷を引き起こすことを意味する。ROSとしては、スーパーオキシドアニオン、ヒドロキシラジカルや過酸化水素などが挙げられる。RNSとしては、一酸化窒素、二酸化窒素やパーオキシナイトライトなどが挙げられる。酸化ストレスの代表的なバイオマーカーとしては、8‐ヒドロキシデオキシグアノシン(8-OHdG)、チオレドキシン(TRX)などが挙げられる。

8-OHdGは酸化ストレスのDNA損害の感受性マーカーである。研究により、8-OHdGはSS患者の唾液において増加したが、他の唾液腺機能障害患者と健常者において増加しない(Ryoら、Pathobiology.2006;73(5):252-60)；SS患者において、PC(蛋白質カルボニル)とAPOO(高度酸化蛋白質産物)の2種類の蛋白質酸化マーカーはいずれも増加した(Free Radic Res.2012 Feb;46(2):141-6)。ある研究者は、涙実験、フルオレセインクリアランス試験、涙液層破壊時間(BUT scores)と眼表面疾患指数(OSDI)で、眼乾燥症の動物モデルとSS患者の結膜上皮細胞における眼乾燥症患者と無眼乾燥症者の酸化ストレスを比較した結果(Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol.2015 Mar;253(3):425-30)、無眼乾燥症者より眼乾燥症患者における酸化ストレスが増加したことを発見した。SSのNOD(NOD.B10.Sn-H2)マウスモデル、膵臓外分泌腺細胞及び人工培養の人唾液腺細胞において、エピガロカテキンという抗酸化剤は、マイトゲン活性化プロテインキナーゼ信号経路を通じて防御的な抗酸化能力を向上させた(Autoimmunity.2014 May;47(3):177-84)。前記の文献は、いずれも酸化ストレスがSSにおける唾液腺組織の破壊に参加し、SSの病理学的プロセスに参加することを示唆した。

最近の研究(Pagano ら、Free Radic Res.2013 Feb;47(2):71-3)では、SS患者の血漿において、蛋白質酸化、ミエロペルオキシダーゼ活性、TNF-α、ニトロチロシンおよびグルタチオンのレベルはいずれも明らかに変化したことを発見した。SS患者において、細胞内のミトコンドリアは、変化して機能障害が発生し、酸化ストレスに関する乱れを引き起こし、酸化ストレスの形成に関与する。

1. また、ある報告では、チオレドキシン(TRX)は、SS患者における唾液腺の酸化ストレスによる組織損傷に対抗して保護作用を発揮する(J Rheumatol.2007 Oct;34(10):2035-43)。SS患者の唾管細胞に大量の8-OHdGとTRXが産生され、かつTRXが唾液の流率との間に明確な負の相関がある。更に、TRXは、人の唾液腺細胞に作用してから、IFN-γによって誘導されるIL-6の発現とFasによって調節と制御されるアポトーシスを著しく抑制する。TRXは、細胞内に重要な抗酸化剤であり、単独に存在しても単態酸素とヒドロキシラジカルを除去することができる。IL-6の発現とFasによって調節と制御されるアポトーシスは、典型的な炎症反応の病理過程である。抗酸化剤は、炎症因子とアポトーシスの炎症反応を抑制して、SS患者の唾液腺を炎症反応に起因する組織損傷が発生しないように保護する。これは、酸化ストレスが腺の炎症反応を誘発することによって組織損傷を引き起こし、SSの発症メカニズムに参加できると意味している。

以上から分かるように、抗酸化剤は、酸化ストレスを解消し、酸化ストレスによるSS病理プロセスにおける炎症損傷を抑制し、SSの病理プロセスを阻止することができる。なお、炎症損傷の過程は、NF-κB経路を活性化することによって進行する可能性がある。従って、抗酸化が新たなSS治療法となることが推定されて、適切な抗酸化剤を見つけることは今後の開発の重要な方向となっている。

普通の抗酸化剤としては、例えば、スーパーオキシドジスムターゼ、カタラーゼ、チオレドキシン、Ｎ‐アセチルシステイン、エルゴチオネイン、ビタミンC、ビタミンD、ビタミンE、グルタチオン、メラトニン、α-リポ酸、カロチノイド、銅、亜鉛やセレン(Se)等の微量元素が挙げられる。

ビタミンDは、Th17細胞媒介性自己免疫を抑制することを含む広い作用を有する(Mol. Cell. Biol. 2011, 31(17):3653)。ビタミンD(VitD)不足はSS患者に普通であり、特に女性SS患者にはVitD不足のリスクが高い(Ertenら，Int J Rheum Dis.2015 Jan;18(1):70-5)。SS患者にビタミンDの不足は、リンパ腫や末梢神経障害などの重度な合併症に関連する可能性がある。ビタミンDの補給はSSの最適化治療の追加ツールである可能性がある。ビタミンDは、SS患者には神経病の病理プロセスと疾患の発現に役割を果たし、それに上記合併症を監視と治療するために使用し得る。ビタミンD不足症が重度のss合併症に明らかに関連するから、あらゆるSS患者にビタミンDを補給すると推薦される(BMC Med.2013 Apr 4;11:93)。しかし、ビタミンD自体は、生物活性がないので、体内でさらに代謝されてこそ活性化1，25 -ジヒドロキシビタミンD3(1,25-Dihydroxyvitamin D3)にヒドロキシル化される。また、その臨床応用には投与量が大きいので、治療効果を保証するために注射投与の場合がある。

N-アセチルシステイン(NAC)は、体内で合成されたグルタチオンの前体であり、重要な抗酸化剤である。26例の原発や続発性乾燥症候群の患者を選択してランダム化二重盲検試験によって研究を行ったが、実験群と対照群に対して、それぞれ4日間のN-アセチルシステイン(NAC)とプラシーボ治療が採用された。結果として、NACで治療した後、目の痛み、敏感、口臭や昼間の喉の渇きがいずれも改善されたことを発見した。これは、NACがSS患者の目の症状に対して、真実な治療効果があり、継続研究される価値があることを表明した(Waltersら，Scand J Rheumatol Suppl.1986;61:253-8)。しかし、NACの臨床応用に明らかな不足がある。NACは体内の安定性が高くないので、治療効果を保証するために大量に投与される必要がある；同時に、NACは酸性物質であり、ヒト試験では1日投与量として1.2ｇまでに達し (Altern Med Rev.2000 Oct;5(5):467-71)、一部の患者に消化器症状を引き起こす恐れがある。また、中国薬局方(2010)の記載により、NACは公知の去痰剤として、中毒まで多くの不良反応を引き起こす可能性がある。

上記の現状に鑑み、乾燥症候群の治療剤として、より安定、安全かつ有効な薬学活性物質あるいは医薬組成物が望まれている。

本発明は、従来のSS薬物治療法に存在している欠陥、および既知のSS治療剤VitD、NACの悪い安定性、単一的な薬学活性、治療効果を保証するための大投与量、並びにそれによる多くの不良反応を解決すべき課題とした。

ピロロキノリンキノン(Pyrroloquinoline quinone，PQQと略記する)は、下記式(I)：
で示され、3つのカルボン酸基を有するオルト-キノンである。式中、R₁、R₂とR₃は相同又は異なって、独立して、低級アルキル、低級アルケニル、低級アルキニル、アラルキル、アラカリル、フェニル、水素原子、ナトリウム原子又はカリウム原子を示す。純化されたトリカルボン酸形態のPQQは、赤い煉瓦色であり、分子量が330.21である。PQQ に対して、1979年にその構造が確認された以来、その自然分布、生物合成及び生物学機能に関して幅広い研究が行なわれてきた。PQQは、特定のグラム陰性菌によって産生されて、その生物合成の前体がグルタミン酸とチロシンであり、その合成に必要な遺伝子も既にクローンニングされた。PQQは、痕跡量で様々な微生物、植物、動物の体内に広く存在している。PQQは、水溶性のアニオン性錯体であり、電子の受容体あるいは供給体として酸化還元酵素の酵素反応に参加できる。PQQは、初期生物が発生と進化していた過程中に既に存在して、多くの微生物によって合成されることができ、そして生物自身の成長に重要な役割を持っている。今では、PQQが新規なビタミンであるかどうかについて論争しているが(Bishopら、Nutr Rev, 1998, 56(10): 287-93)、認められないことは、PQQがヒトや動物の体内で、例えば栄養作用、アルコール性肝障害防止、虚血再潅流障害の防止、フリーラジカル除去、生体をフリーラジカル障害が発生しないように保護する、星状細胞における神経成長因子を向上させるなどの多くの重要な生理機能を発揮している(Matsushita等人，Appl Microbiol Biotechnol, 2002, 58(1): 13-22)。PQQは、独特なオルト-キノン構造を持っているから、他の補酵素が有しない生理的特性を有し、化学的に安定であり、20000回までの酸化還元サイクルに参加できる(Altern Med Rev. 2009 Sep;14(3):268-77)。

現在、PQQの生物学的機能について、まだ探索的段階であり、主に認識された機能は以下のことである。(1)微生物、植物、動物及び人体の細胞の成長を刺激する、(2)動物の成長、発育と繁殖に必要な栄養素である、(3)過剰のフリーラジカルを除去し、生体を酸化による損傷が発生しないように保護する；(4)神経栄養と保護作用を提供する。ヒト試験により、PQQは、睡眠と認知を改善し、血漿に炎症因子IL-6とC反応性蛋白質(CRP)の発現を低減することができる。PQQは、第14種のビタミンとしてB族ビタミンカテゴリーに入れられる提案があったが、現在、既に保健品としてアメリカと日本で発売された。

本発明者は、実験を重ね検討した結果、PQQが乾燥症の動物モデルにおけるＮＯＤマウスの唾液分泌機能を著しく改善でき、かつ、活性化ビタミンDと併用する時、この改善作用がさらに顕著であるが、同量の活性化ビタミンD単独では効果がないことを驚いたことに発見した。

本発明者は、更なる研究と実験を行った結果、PQQ、PQQと活性化ビタミンDの併用が、NODマウスにおける顎下腺組織の酸化ストレスとリンパ球浸潤を顕著に抑制し、重要な炎症シグナル伝達経路であるNF-kappaBシグナル経路の活性化を著しく軽減し、Il-1、 Il-6、 γインターフェロンなどの細胞因子の発現を明らかに減少できることも驚いたことに発見した。

前述の他の抗酸化剤として、例えばN-アセチル-L-システイン、レスベラトロール、エピガロカテキン没食子酸、クルクミン、アントシアニン、茶ポリフェノール、ビタミンB12、ビタミンE、ビタミンCやビタミンD等が挙げられる。

本発明は、ピロロキノリンキノン、その誘導体及び/又は塩の新規な医薬用途を提供し、かつ、ピロロキノリンキノン、その誘導体及び/又は塩を有效成分として含有する医薬組成物を提供する。活性ビタミンD又はNAC単独を有効成分とする薬物に比べて、ピロロキノリンキノン、その誘導体及び/又は塩を有効成分として含有する医薬組成物、および活性ビタミンD又はNACとの併用の方は、次のような利点と進歩を持っている：
1) 安定であり、PQQが独特なオルト-キノンの構造を有し、化学的に安定であり、20000回までの酸化還元循環に参加でき、NAC又はビタミンDより、より高いフリーラジカルを除去する活性を有する；
2) 投与量が小さい、この薬物療法でラットに投与したPQQが１日当たり1mg/kg体重で、動物実験に使用したNACの１日当たり44-1300 mg/kg体重の量より遥かに少ない(The American Journal of Pathology, Vol. 175, No. 1, July 2009. Fertil Steril_ 2010;94:2905-8.)；
3) 安全であり、PQQのラット半数致死量が1000-2000 mg/kg体重で、１日当たり100mg/kg体重の用量で14日間連続投与して、何も不良反応が認められない(Regul Toxicol Pharmacol. 2014 Oct;70(1):107-21)；
4) PQQが、活性化ビタミンDと明らかな相乗効果があり、活性化ビタミンDの投与量を大幅に低減させ、活性化ビタミンDの副作用を低下させたから、乾燥症候群を治療する医薬組成物として良い見込みがある。

ピロロキノリンキノン、その誘導体及び/又は塩を、乾燥症候群、乾燥症候群による口腔乾燥や眼乾燥症状、及び他の外分泌腺と腺以外の器官にわたる複数システムの身体障害の治療及び/又は予防剤を製造するに使用したことは、また報告されていない。また、ビタミンD又はNACより、乾燥症候群による眼乾燥、口腔乾燥症状などの外分泌腺症状に対してより良い治療効果がある。

すなわち、本発明は以下の発明に関する。
項1. ピロロキノリンキノン、その誘導体及び/又は塩の、乾燥症候群、乾燥症候群による口腔乾燥、眼乾燥症状、及び他の外分泌腺と腺以外の器官にわたる複数システムの身体障害の治療及び/又は予防剤を製造するための使用。
項2. 前記の乾燥症候群が原発性乾燥症候群と続発性乾燥症候群を含むことを特徴とする項1の使用。
項3. 前記の腺以外の器官にわたる複数システムの身体障害が乾燥症候群による慢性疲労を含むことを特徴とする項1の使用。
項4. 前記のピロロキノリンキノン、その誘導体又は塩が下記式(I)で示されることを特徴とする項1の使用。
式中、R₁、R₂とR₃が相同又は異なって、独立して、低級アルキル、低級アルケニル、低級アルキニル、アラルキル、アラカリル、フェニル、水素原子、ナトリウム原子又はカリウム原子を示す。
項5. 治療及び/又は予防有效量の、項1-4のいずれか一項に記載の使用におけるピロロキノリンキノン、その誘導体及び/又は塩を有效成分として使用することを特徴とする医薬組成物。
項6. 更に活性ビタミンD (1,25-Dihydroxyvitamin D3)を含むことを特徴とする項5の医薬組成物。
項7. 前記のピロロキノリンキノンがトリカルボン酸の形であることを特徴とする項5の医薬組成物。
項8. 前記のピロロキノリンキノンが二ナトリウム塩の形であることを特徴とする項5の医薬組成物。
項9. 更に、N -アセチル- L -システイン、レスベラトロール、エピガロカテキン没食子酸、クルクミン、アントシアニン、茶ポリフェノール、ビタミンB12、ビタミンE、ビタミンCとビタミンDからなる群から選択される１種又は1種以上任意の割合の混合物を含むことを特徴とする項5の医薬組成物。

各PQQと活性ビタミンD処置群におけるNF-κBに関する蛋白質の発現を示す図面である。炎症因子Il-1、 Il-6、 γインターフェロンの発現がPQQと活性ビタミンDの併用で相乗的に抑制された結果を示す図面である。マウス顎下腺のリンパ球浸潤に対して、PQQと活性ビタミンD処置の影響を示す図面である。マウスの唾液流量(SFR)に対して、PQQと活性ビタミンD処置の影響を示す図面である。 PQQと活性ビタミンD処置におけるマウス最初8週間の飲水量を示す図面である。

実験化合物のソースと処理
PQQ(トリカルボン酸の形、純化された)：実施例1-5参照、
活性ビタミンD(1,25-Dihydroxyvitamin D3)
いずれもsigma会社から購入された。PQQと活性ビタミンDは、濃度が1mg/mlと1μg/mlとなるように、それぞれに二重の蒸留水に溶解された。
PQQ(二ナトリウム塩の形、PQQ-Na₂，日本三菱ガス化学MGCによって寄付)：実施例6参照
濃度が1mg/mlとなるように水に溶解された。

実施例1：PQQによって実験動物の乾燥症候群の予防と治療
方法：
モデル：NODマウスモデル。NOD(Non-obese Diabetes)マウスは、遺伝子欠損の自発性糖尿病動物モデルである。雌マウスは、14週齢から糖尿病が発生し、30週齢までの発症率が80%にも達する。NODマウスは、乾燥症候群動物モデルでもある。マウスは、12週齢から顎下腺の炎症性細胞浸潤が発生するに伴って、複数の炎症性因子の発現が増加し、16-20週齢から唾液分泌が減少し、唾液の塩の濃度が増加する。
群に分ける：上海SLE 実験動物株式会社から購入された8週齢の雌性NODマウスは、群ごと10匹で、対照群、活性ビタミンD群、PQQ群及びPQQと活性ビタミンD併用群の4つの群に分けられ、それぞれ12、24、36週齢で唾液流速が測定された。PQQと活性ビタミンDの投与量は、別々に１日あたり1mg/kg体重と0.1μg/kg体重であった。

唾液流量測定：
a. 腹腔内に1.2% avertin(中国名：トリブロモエタノール)が注射された。投与量：0.2 ml/10g体重，製法：（1） 0.4g avertinを0.25mlｔ−アミルアルコールに溶けて、完全に溶解させるように12時間振動した；（2） 19.75ml 0.9%のNaCl溶液を加えて、 1.2% avertinを得た。マウスが穏やかに麻酔された。
b. 首にピロカルピンが皮下注射された。投与量：0.5mg/kg=0.01mg/20g 体重，母液濃度：0.5g/10ml生理食塩水=50mg/ml=0.05×103mg/ml，溶液濃度：母液が1000倍までに、すなわち0.05mg/mlに希釈され、唾液の分泌が刺激された。
c. 5分間後、唾液を集め始めた。即ち、無菌脱脂綿で乾燥重量が約8mgのボールを作れ、1.5mLのEP管にいれて乾燥重量を測定した。唾液の分泌を測定する時に、そのボールをマウスの後頬部に入れて、10分間後取り出してEP管に入れて、電子天秤で湿重量を秤量した。唾液分泌量=ボールの湿重量-ボールの乾燥重量。

結果：
12週齢まで治療された時、対照群に比べ、各実験群では唾液流量の有意差がない。
24週齢まで治療された時、対照群に比べ、PQQと活性ビタミンD併用群では唾液流量が明らかに増加した(P＜0.05)、一方、活性ビタミンD単独群とPQQ単独群では有意差がない。
36週齢まで治療された時、対照群に比べ、PQQと活性ビタミンD併用群及びPQQ単独群では、いずれも唾液流量が明らかに増加した、統計学的有意差がある(P＜0.05)。また、PQQ単独群と比較し、PQQと活性ビタミンD併用群の方がより有効である(P＜0.05)。対照群に比べ、活性ビタミンD単独群では、統計学的有意差がない。

上記の結果から、PQQが有効に乾燥症候群の症状を緩和でき、少量の活性ビタミンD単独では治療効果がないが、PQQとの相乗効果が明らかであることが見られた。

注：* 各群が対照群と比較したことを示す、P＜0.05；
＃ PQQ+活性ビタミンD群がPQQ群と比較したことを示す、P＜0.05

実施例2：PQQ によってNF-κBの活性化の阻害
方法：
Western Blot法によるマウスの顎下腺組織にNF-κBの活性化を測定した
各サンプルから相同のタンパク総量を採取し、4X SDSローディングバッファーをタンパク量：4X SDSが3：1となるように加えて、よく混ぜて、95℃の沸騰水に5分間煮って、10%の分離ゲルと5%の濃縮ゲルを調製してSDS-PAGE電気泳動を行った。膜を転送し、5%の脱脂乳を含有したTBST 溶液によるPVDF膜を室温で1時間ブロックした又は4℃で一晩インキュベートした。ブロッキング溶液で抗体を希釈して、室温で2時間又は4℃で一晩インキュベートした。膜を洗濯し、二次抗体でインキュベートしてから、膜を再度洗濯した。発光キットにおける液体AとBを容器に容積比 1:1で混合して、PVDF膜へ混合液を均一に滴下し、遮光して3-5分間反応させた。

結果：
36週齢まで治療された時、マウスの顎下腺組織を採取し、Western Blot法による組織におけるNF-κBの活性化を測定した結果、以下のことを発見した。即ち、対照群に比べ、Vit D単独群では有意的な変化がないが、PQQ単独群とPQQ+活性ビタミンD併用群ではP65のリン酸化が大幅に軽減された。なお、P65はNF-κBの蛋白質サブユニットであり、そのリン酸化レベルがNF-κBの活性化を直接に反映する。また、IκBは、NF-κBに結合してNF-κBが核へ入り活性を発揮することを防ぐ。IκBは、一旦リン酸化されたら、劣化されてNF-κBを放出する。ここで、 PQQ単独群とPQQ+活性ビタミンD併用群ではIκBのリン酸化が大幅に軽減されたことは、NF-κBの活性化が有意に抑制されたことを表明した。図1参照。

実施例3：PQQと活性ビタミンDによって組織炎症性因子の発現の相乗阻害
方法：
実験マウスの顎下腺組織を採取し、TrizolでRNAが抽出され、Superscript IIIを用いて逆転写を行い、42℃で30分間反応させた。逆転写のプライマーとして、Oligo dTとRandom Hexamerを用いた。
Realtime定量PCR反応系：2×PCR premix 10μl、プライマー 0.8μl、 cDNA 1μl、20μlまでH₂Oを加えた。
反応条件： 95℃ 10分間、 95℃ 15s、60℃ 60s、数値を読み取り、50回循環させた。
融解曲線分析：温度55℃-95℃、1分間に1回読む。各サンプルに対して3つの平行したウェルが設置された。

結果：
定量PCR技術を採用し、マウスの顎下腺組織に炎症性因子の発現を分析した結果、以下のことを発見した。即ち、36週齢までのPQQ処置は炎症性因子IL-1β、 IL-6、 IL-10、 TNF-α的発現を顕著に抑制できるが(p＜0.05)、活性ビタミンD単独での処置は抑制効果が検出されていない。また、PQQと活性ビタミンD併用では効果がより明らかであり、PQQ単独に比べて有意差がある(p＜0.05)，図2参照。

実施例4：酸素ラジカルの検出
方法：
MDA含有量の検出：実験マウスの顎下腺組織を採取し、氷の生理食塩水で組織ホモジネートを作成した。BCA法により蛋白質含量を定量した。ホモジネートを1ml取って、それに順番30％トリクロロ酢酸1mlと0.67％TBA 1mlを加えて、お湯の中に30分間放置してから室温に冷却した。3000gで10分間遠心分離してから、535nmにおける上澄液の吸光度(A)を測定し、標準曲線からMDA含有量を計算した、nmol／mg組織で結果を示した。
SOD含有量の検出：実験マウスの顎下腺組織を採取し、氷の生理食塩水で組織ホモジネートを作成した。BCA法により蛋白質含量を定量した。キットの説明を参照して、サンプルを0.2ml取って、それに検出液1.3mlを混ぜて、37℃の水浴で40分間反応させた。その後、発色剤を2ml加えて、室温で10分間置いて、550nmにおけるODを測定し、U／mg蛋白質で結果を示した。なお、1mg蛋白質当たり1ml反応液中のSOD抑制率が50％に達した時対応するSOD量は１つのSOD活性単位と規定された。

結果：
酸素ラジカルが脂質過酸化反応に参加したことは、炎症反応を惹起する重要な要因である。酸素ラジカルは、脂質過酸化反応に参加して、マロンジアルデヒド(MDA)等の脂質過酸化物を産生した。脂質過酸化反応と脂質過酸化物の分解産物は、いずれも細胞膜の構造に損害を引き起こすことができ、炎症性メディエーターが大量に放出された。脂質過酸化物は、特定の炎症性メディエーターの産生にも関与し、例えば、シクロオキシゲナーゼの活性化を介して、アラキドン酸からプロスタグランジンへの合成を促進する。細胞組織の損傷程度は、MDAの検出による脂質過酸化程度を反映することを介して、間接的に評価できる。SODは、酸素ラジカルを有効に除去することによって腸組織中の脂質過酸化反応を抑制でき、細胞膜のSOD活性を安定させるから、細胞膜機能と体の抗炎症応答を反映する主要な指標である。

結果によると、対照群に比べ、36週齢までPQQ単独で処置された時は、MDAの含有量が有意に低減したが(P＜0.05)、SODの含有量が明らかに増加した。Vit D単独で処置された時は、有意差がない。一方、PQQとVit Dを併用した時、対照群に比べ、MDAとSODの含有量が共に明らかに変化し、顕著な相乗効果が見られた(P＜0.05)。PQQが酸素ラジカルによる脂質過酸化反応を有効に抑制でき、そしてビタミンDと相乗的に細胞を酸素ラジカルに起因する損害を受けないように保護できることが十分に証明された。

実施例5：マウスの顎下腺組織スライスの検出
方法：
36週齢マウスの顎下腺組織を分離し、パラフィン包埋とスライスし、ヘマトキシリンエオジンで染色し、倒立型顕微鏡で撮影した。

結果：
図3に示されるように、腺にリンパ球浸潤の集塊が見られた。健常C57マウスにおける乾燥症症状がない、リンパ球浸潤の集塊もないが、NODマウスの顎下腺に明らかなリンパ球浸潤が見られた。PQQ群では、リンパ球浸潤の範囲が顕著に縮小した。PQQと活性ビタミンD併用群では、PQQ群と比較して、リンパ球浸潤の範囲がより縮小した。

実施例6： PQQによって実験動物の乾燥症候群の予防と治療
材料と方法：
本実施例は、二ナトリウム塩の形でPQQを使用した(PQQ-Na₂)以外に、実施例1と同様に行われた。薬物投与時間は24週間であった。
投与後、ケージごとに、マウス1週当たりの飲水量を測定して、ml/1日/g体重に換算した。その結果、第8週から、薬物投与群に比べて、対照群マウスの飲水量が明らかに増加したと見られた。それは、対照群が第8週から発症したが、薬物投与群が正常であったことを示唆した。図4-5参照。

投与量と剤型：
PQQ投与量
本発明では、動物実験におけるPQQの投与量は1mg/kg体重/１日であった。該投与量は動物実験の常用量であり、大人に対応しては60mg/１日である。ヒトと鼠の代謝率の違いを考えると、大人に対応する量は約1日当たり10mgである(大人の体重が60kgと仮定、以下同様) 。
活性ビタミンDの投与量は0.1μg/kg体重/１日であって、大人に対応しては0.6μg/１日であり、人体が耐える安全な量である。
前記の薬物はいずれも経口投与剤であり、即ち、水溶液の調製を行ってから、飲用水に混入されて、鼠の毎日飲水量によって微調節される。当業者は、本出願の開示によって、限られた実験を通して、いかなる創造性労働もいらないで、適切な用量範囲と経口投与剤型を決定できる。従って、本発明の目的に適合する投与量範囲と経口投与剤は、本発明の保護範囲内にも入る。

Claims

ピロロキノリンキノン、その誘導体及び/又は塩の、乾燥症候群、乾燥症候群による口腔乾燥、眼乾燥、及び他の外分泌腺と腺以外の器官にわたる複数システムの身体障害の治療及び/又は予防剤を製造するための使用。
前記の乾燥症候群が原発性乾燥症候群、続発性乾燥症候群を含むことを特徴とする請求項1の使用。
前記の腺以外の器官にわたる複数システムの身体障害が乾燥症候群による慢性疲労を含むことを特徴とする請求項1の使用。
前記のピロロキノリンキノン、その誘導体又は塩が下記式(I)で示されることを特徴とする請求項1の使用。
式中、R₁、R₂とR₃が相同又は異なって、独立して、低級アルキル、低級アルケニル、低級アルキニル、アラルキル、アラカリル、フェニル、水素原子、ナトリウム原子又はカリウム原子を示す。
治療及び/又は予防有效量の、請求項1-4のいずれか一項に記載の使用におけるピロロキノリンキノン、その誘導体及び/又は塩を有效成分として使用することを特徴とする医薬組成物。
更に活性ビタミンD (1,25-Dihydroxyvitamin D3)を含むことを特徴とする請求項5の医薬組成物。
前記のピロロキノリンキノンがトリカルボン酸の形であることを特徴とする請求項5の医薬組成物。
前記のピロロキノリンキノンが二ナトリウム塩の形であることを特徴とする請求項5の医薬組成物。
更に、N-アセチル-L-システイン、レスベラトロール、エピガロカテキン没食子酸、クルクミン、アントシアニン、茶ポリフェノール、ビタミンB12、ビタミンE、ビタミンCとビタミンDからなる群から選択される１種又は1種以上任意の割合の混合物を含むことを特徴とする請求項5の医薬組成物。