JP2019508043A - 自動化ネステッドリコンビナーゼポリメラーゼ増幅 - Google Patents

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Abstract

サンプルモジュール、マイクロ流体核酸増幅デバイス、および分析装置を含み、サンプルモジュールを介して核酸増幅デバイスに送達されるサンプルにおける全自動ネステッドリコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）を促進するインフルエンザアッセイシステム。アッセイはサンプルをマイクロ流体デバイスに加え、サンプルにおける標的ポリヌクレオチド配列を増幅することを含む。標的ポリヌクレオチド配列を増幅することは、サンプルに増幅の第一ラウンドを実施して第一増幅産物を得、第一増幅産物に増幅の第二ラウンドを実施して第二増幅産物を得ることを含む。第二増幅産物は、増幅の第一ラウンドの増幅の際に産生される第一増幅産物内に完全に含まれる、より小さい配列を含む。
【選択図】図１９Ａ

Description

関連案件の相互参照
本出願は、２０１６年３月４日に出願された米国特許出願第６２／３０３、９３４号、名称「自動化ネステッドリコンビナーゼポリメラーゼ増幅」の優先権を主張し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
政府の権利の記載
本発明は米国保健福祉省によって認可されたＨＨＳＯ１００２０１４０００１１Ｃの下で政府支援がなされた。政府は本発明に特定の権利を有する。
技術分野
本発明はインフルエンザアッセイシステム、特に、サンプルモジュール、マイクロ流体核酸増幅デバイス、および分析装置を含み、サンプルモジュールを介して核酸増幅デバイスに送達されるサンプルにおける全自動ネステッドリコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）を促進するシステムに関する。
背景
ポリヌクレオチド配列の微量検出は、病原体および遺伝性疾患の検出において重要な役割を担うでき、特定の感染または遺伝子型に対して適応する治療処方計画を立てるのに役立つ。特定の等温核酸増幅法は、標的ポリヌクレオチド配列を微量から非常に高い検出可能な量まで短時間で増幅することができる。このような等温法、例えば、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）、またはニッキングおよび伸長増幅反応（ＮＥＡＲ）は、使用者が微量の特定配列を検出することができるようにし、ポイントオブケア検査を促進し、診断の利用し易さおよび速さを高める。
本明細書で開示される核酸増幅デバイスは、第一および第二反応チャンバーを検出チャンバーと相互接続するマイクロ流体チャンネルの列を含むように構成される。一体化されたポンプモジュールも、適切な時にデバイスを通る液体の選択的な移動を可能にするように備えられる。ＲＰＡの第一ラウンドを生じる第一反応チャンバーが備えられ、対象の標的ポリヌクレオチド配列の増幅をもたらす。ＲＰＡの第一ラウンド後、サンプル液体が特異的ＲＰＡプライマーと混合され、第二反応チャンバーに移動される。第二増幅の際、第一反応産物に完全に含まれる配列が増幅されて第二反応産物を生成し、続いて第二反応産物の検出が実施される。検出は光学的または電気化学的手段を用いて達成され得る。
ＲＰＡの第一ラウンドから得られる産物混合物は複数流に分離されて試薬容器を通過され得、そして産物混合物は同一または異なるＲＰＡプライマーと混合されてから複数の第二反応チャンバーに導入される。この方式では、核酸増幅デバイスは対象の１つを超える標的を検出するために使用され得る（例えば、インフルエンザＡウイルスおよびインフルエンザＢウイルス）。場合によっては、第二反応チャンバーの一つはコントロールとして使用され得る。
第一の一般的態様は、サンプルをマイクロ流体デバイスに加え、サンプル中の標的ポリヌクレオチド配列を増幅させることを含む。標的ポリヌクレオチド配列を増幅することは、サンプルに増幅の第一ラウンドを実施して第一増幅産物を生じ、第一増幅産物に増幅の第二ラウンドを実施して第二増幅産物を生じることを含む。第二増幅産物は、増幅の第一ラウンドの際に産生される第一増幅産物内に完全に含まれる、より小さい配列を含む。
第一の一般的態様の実施は、次の特徴の１つ以上を含み得る。
いくつかの実施態様は、第二増幅産物を検出することを含む。
いくつかの実施形態では、第二増幅産物を検出することは、第二増幅産物をフルオロフォアおよびクエンチャーと結合された第一オリゴヌクレオチドによって標識して標識第二産物を得、標識第二増幅産物からクエンチャーを切断して、フルオロフォアから生じるシグナルを光学的に検出することを含み得、ここで検出可能なシグナルは第二増幅産物の存在の指標である。クエンチャーを切断することはヌクレアーゼを用いて実施され得る。ヌクレアーゼは二本鎖ＤＮＡを標的にし得る。場合によっては、ヌクレアーゼはホルムアミドピリミン−ＤＮＡグリコシラーゼである。
いくつかの実施形態では、第二増幅産物を検出することは、第二増幅産物を酸化還元部分と結合された第一オリゴヌクレオチドによって標識して標識第二増幅産物を得、標識第二増幅産物から酸化還元部分を切断して、切断した酸化還元部分から生じるシグナルを電気化学的に検出することを含み、ここで検出可能なシグナルは第二増幅産物の存在の指標である。酸化還元部分は一般的に、フェノチアジン、フェノキサジン、フェロセン、フェリシアン化物、ルテニウム（ＩＩＩ）、オスミウム（ＩＩ）、アントラキノン、フェナジン、およびこれらの誘導体からなる群から選択される。酸化還元部分を切断することはヌクレアーゼを用いて実施され得る。ヌクレアーゼは二本鎖ＤＮＡを標的にし得る。場合によっては、ヌクレアーゼはホルムアミドピリミン−ＤＮＡグリコシラーゼである。
いくつかの実施態様は、第二増幅産物に増幅の第三ラウンドを実施して第三増幅産物を得、第三増幅産物を検出することを含み、ここで第三増幅産物は増幅の第二ラウンドの際に産生される第二増幅産物内に完全に含まれる、より小さい配列を含む。
サンプルは動物から得ることができる。例えば、サンプルは動物の血液、喀痰、粘液、唾液、涙、または尿から得ることができる。場合によっては、サンプルはヒトから得られる。
標的核酸は標的ポリヌクレオチド配列を含み得る。いくつかの実施形態では、標的核酸は動物病原体から得られる。動物病原体は一本鎖ＤＮＡウイルス、二本鎖ＤＮＡウイルス、または一本鎖ＲＮＡウイルスであり得る。動物病原体は細菌であり得る。標的核酸は、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、またはＲＮＡであり得る。場合によっては、標的核酸はゲノムＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成二本鎖ＤＮＡ、および合成一本鎖ＤＮＡからなる群から選択される。標的核酸はウイルスＤＮＡまたはウイルスＲＮＡであり得る。特定の例では、動物病原体はインフルエンザＡウイルスまたはインフルエンザＢウイルスである。
いくつかの実施態様では、サンプル中の２種類以上の標的ポリヌクレオチド配列が増幅される。一つの例では、インフルエンザＡ遺伝子配列を含む標的ポリヌクレオチド配列およびインフルエンザＢ遺伝子配列を含む標的ポリヌクレオチド配列が増幅される。
いくつかの実施態様では、２種類以上の増幅産物が検出される。特定の実施態様では、インフルエンザＡ遺伝子配列を含む第二増幅産物、およびインフルエンザＢ遺伝子配列を含む第二増幅産物が検出される。
第二の一般的態様では、診断カードはカード本体を含む。カード本体は、第一反応チャンバー、１つ以上の第二反応チャンバー、サンプル流体を第一反応チャンバーに供給するための通路、１つ以上の第二反応チャンバーと流体接続される１つ以上の検出チャンバー、および各検出チャンバーと連結される検出モジュールを含む。第一反応チャンバーは、反応チャンバーにおいてサンプル流体に第一核酸増幅を実施して第一増幅産物を生成するように構成される。各第二反応チャンバーは、第一増幅産物に第二核酸増幅を実施して第二増幅産物を生成するように構成される。
第二の一般的態様の実施は、次の特徴の１つ以上を含み得る。
いくつかの実施形態では、検出モジュールは蛍光検出器のような光学的モジュールである。蛍光検出器は、１つ以上の検出チャンバーに照明光を送る単一光パイプ、および各検出チャンバーから反射する光を受容する別の光パイプを含み得る。
いくつかの実施形態では、検出モジュールは電極モジュールである。検出モジュールは各検出チャンバー用の電極で終結する一連の伝導路を含み得る。デバイスは、マイクロ流体カード全体における流体の位置を検出するために、追加の伝導路および電極を含み得る。
いくつかの実施態様では、増幅はリコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）反応を含む。
いくつかの実施態様では、診断カードは混合手段、ポンプ、およびサンプルモジュールに接続するための接続ポートを含む。第一反応チャンバーはヒーターと結合され得る。第一反応チャンバーは混合手段を含み得、あるいは混合手段と結合され得る。場合によっては、第一反応チャンバーは試薬を含む。試薬はＲＰＡ試薬を含み得る。ＲＰＡ試薬は凍結乾燥され得る。
いくつかの実施態様では、各第二反応チャンバーは試薬を含む。試薬はＲＰＡ試薬を含み得る。ＲＰＡ試薬は凍結乾燥され得る。
いくつかの実施態様では、サンプル流体は動物から得られる。サンプルは動物の血液、喀痰、粘液、唾液、涙、または尿から得ることができる。場合によっては、サンプル流体はヒトから得られるサンプルである。サンプル流体は標的核酸を含み得る。標的核酸は動物病原体から得ることができる。動物病原体は一本鎖ＤＮＡウイルス、二本鎖ＤＮＡウイルス、または一本鎖ＲＮＡウイルスであり得る。場合によっては、動物病原体は細菌である。標的核酸は、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、またはＲＮＡであり得る。特定の例では、標的核酸はゲノムＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成二本鎖ＤＮＡ、および合成一本鎖ＤＮＡからなる群から選択される。標的核酸はウイルスＤＮＡまたはウイルスＲＮＡであり得る。動物病原体はインフルエンザＡウイルスまたはインフルエンザＢウイルスであり得る。
いくつかの実施態様では、第二増幅産物は、サンプル流体の診断カードへの送達後、３０分以内、１５分以内、１０分以内、または５分以内に産生される。診断カードは一般的には使い捨てである。
いくつかの実施態様では、診断カードは追加の反応チャンバーを含み、それぞれは核酸増幅反応の追加ラウンドを実施して追加増幅産物を生成するように構成され、これによって、増幅の各連続したｎ＋１ラウンドから得られる増幅産物は、前ｎ回目ラウンドの増幅産物内に完全に含まれる、より小さい配列である。
第三の一般な態様は、第二の一般的態様の診断カードを受容するように構成されるリーダーを含む。リーダーは第二反応チャンバー内の第二増幅産物の存在を検出するように構成される検出器を含む。
第四の一般的態様は核酸増幅デバイスを含む。核酸増幅デバイスは、第一流入口および第一流出口と流体接続された第一反応チャンバー、第二流入口および第二流出口と流体接続された第二反応チャンバー、検出チャンバー、第一ポンプ、第二ポンプ、ならびに第三ポンプを含む。第一流入口は第一ポンプを介して第一反応チャンバーと流体接続され、第一流出口は第一反応チャンバーと流体接続される。第一反応チャンバーは第二ポンプを介して第二反応チャンバーと流体接続され、第二流出口は第二反応チャンバーと流体接続される。第二流入口は第三ポンプを介して第二反応チャンバーと流体接続される。
第四の一般的態様の実施は、次の特徴の１つ以上を含み得る。
いくつかの実施態様では、核酸増幅デバイスはマイクロ流体デバイスである。第一反応チャンバーは一般的に試薬を含む。場合によっては、第一反応チャンバーは触媒を含む。触媒はマグネシウムを含み得る。
いくつかの実施態様では、核酸増幅デバイスは試薬リサーバを含み、第二ポンプおよび第三ポンプは各第二チャンバーに第一試薬リサーバを介して流体接続される。第二ポンプおよび第三ポンプは各第二反応チャンバーに第一試薬リサーバおよび第二試薬リサーバを介して流体接続される。場合によっては、第一試薬リサーバおよび第二試薬リサーバは直列である。第一試薬リサーバはオリゴマーを含み得る。第二試薬リサーバはマグネシウムを含み得る。
いくつかの実施態様では、各第二反応チャンバーは検出チャンバーである。各検出チャンバーの一部は光学的に透明である。場合によっては、電極は各検出チャンバーと接続される。一つの例では、３つの電極が各検出チャンバーと接続される。
いくつかの実施態様では、核酸増幅デバイスは流体検出領域を含む。第一ポンプおよび第一反応チャンバーは、第一検出領域を介して接続され得る。第二ポンプおよび第二反応チャンバーは、第二検出領域を介して接続され得る。第三ポンプおよび第二反応チャンバーは、第三検出領域を介して接続され得る。第三ポンプおよび第一反応チャンバーは、第四検出領域を介して接続され得る。場合によっては、各検出領域の一部は光学的に透明である。流体検出チャンバーは各検出領域と接続され得る。
いくつかの実施態様では、核酸増幅デバイスは第一反応チャンバーと接続されるヒーターを含む。第一反応チャンバーはスターラーを含み得る。特定の実施態様では、第一ポンプは第一流入口を介して核酸増幅デバイスに送達されるサンプルを第一反応チャンバーに供給するように構成される。第二および第三ポンプは核酸増幅デバイス本体に送達される試薬を、第二流入口を介して第一反応チャンバーからの産物と混合して反応物混合を生じるように構成され得る。第二および第三ポンプは反応物混合の一部を第二反応チャンバーのそれぞれに供給するように構成され得る。
本発明の他の特性および利点は、次に詳細される説明および図から、そして請求項から明らかになるであろう。
核酸増幅デバイスにサンプルモジュールを介して送達されたサンプルに全自動ネステッドＲＰＡを実施するためのシステムの構成要素を示す図である。 図１に示すシステムの代替えとなるワークフローを示す図である。 サンプルモジュールの受容器モジュール部分の斜視図を示す図である。 サンプルモジュールの移送モジュール部分の斜視図を示す図である。 接続した受容器モジュールおよび移送モジュールを有するサンプルモジュールにサンプルを加えるワークフローを示す図である。 別々の受容器モジュールおよび移送モジュールを有するサンプルモジュールにサンプルを加えるワークフローを示す図である。 ヒンジ式サンプルモジュールの斜視図を示す図である。 代替えとなるサンプルモジュールを示す図である。 図８Ａおよび８Ｂで示されるサンプルモジュールにサンプルを加えるワークフローを示す図である。 光学的プローブの検出のためのマイクロ流体核酸増幅デバイスの分解図を示す図である。 図１０に示すマイクロ流体核酸増幅デバイスの機能構成要素を示す図である。 電気化学的プローブの検出のためのマイクロ流体核酸増幅デバイスの分解図を示す図である。 図１２に示すマイクロ流体核酸増幅デバイスの中間層の上面透視図を示す図である。 図１２に示すマイクロ流体核酸増幅デバイスのセンサー層を通る上面透視図を示す図である。 分析装置に挿入された核酸増幅デバイスの斜視図を示す図である。 光学的分析装置の透視図を示す図である。 図１６に示す光学的分析装置における光パイプの詳細図を示す図である。 図１６に示す光学的分析装置に関して説明する励起および放出座標系を示す図である。 本明細書で説明されるネステッドＲＰＡ増幅の結果を示す図である。 本明細書で説明されるネステッドＲＰＡ増幅の結果を示す図である。 本明細書で説明されるネステッドＲＰＡ増幅の結果を示す図である。 本明細書で説明されるネステッドＲＰＡ増幅の結果を示す図である。
図１Ａ〜１Ｄは、マイクロ流体核酸増幅デバイスに加えられたサンプルに全自動ネステッドＲＰＡを実施するためのシステム１００の構成要素を示す。図１Ａはサンプルモジュール１０２を示し、受容器モジュール１０４および移送モジュール１０６を含む。図１Ｂはマイクロ流体核酸増幅デバイス１１０を示す。図１Ｃに示すように、サンプルモジュール１０２および核酸増幅デバイス１０８は接続されて核酸増幅アセンブリ１１０を形成する。図１Ｄはシステム１００を示し、サンプルモジュール１０２から核酸増幅デバイス１０８に加えられるサンプルにおける標的核酸の存在の評価のための分析装置１１２に挿入される核酸増幅アセンブリ１１０を含む。
システム１００は、サンプルモジュール１０２の受容器モジュール１０４に加えられるサンプルにおける標的核酸の存在の評価に使用される。サンプルモジュール１０２の受容器モジュール１０４および移送モジュール１０６、ならびに核酸増幅デバイス１０８は、ＲＰＡの第一ラウンド、続いて標的核酸がサンプルに存在する場合に増幅するためのＲＰＡの第二ラウンドを実施するのに必要とされる試薬を含む。サンプルモジュール１０２および核酸増幅デバイス１０８を接続することによって、サンプルモジュールと核酸増幅デバイスの間に流路が生じ、ＲＰＡ反応混合物の核酸増幅デバイスへの送達を可能にする。場合によっては、システム１００はサンプルにおける２種類以上の標的核酸の存在を評価するために使用される。一つの例では、システム１００はサンプルにおけるインフルエンザＡウイルスおよびインフルエンザＢウイルスの存在を評価するために使用される。特定の例では、サンプルモジュール１０２および核酸増幅デバイス１０８は、ネステッドＲＰＡの３回以上のラウンドを実施するように構成される。
図２Ａ〜２Ｅは、システム１００の代替えとなるワークフローを示す。図２Ａに示されるように、核酸増幅デバイス１０８は分析装置１１２に挿入される。図２Ｂでは、サンプルモジュール１０２が分析装置中の核酸増幅デバイス１０８に向けて進められる。分析装置１１２接触面の位置決め形状がサンプルモジュール１０２を接続前に二次元で制限し、サンプルモジュールと核酸増幅デバイス１０８を嵌合させて、流体をサンプルモジュールから核酸増幅デバイス、およびこの逆で通過させる通路を形成させる。図２Ｃは分析装置１１２における核酸増幅アセンブリ１１０を示す。サンプルモジュール１０２を核酸増幅デバイス１０８に接続することによって、サンプルモジュールから核酸増幅デバイスへの反応物の流れを開始し得、それによってサンプルにおける標的核酸の存在の評価を開始する。評価が終了すると、図２Ｄに示すように、分析装置１１２の位置決め形状は核酸増幅アセンブリ１１０を解放するように噛み合わされ得る。図２Ｅは分析装置１１２から解放後の核酸増幅アセンブリ１１０を示す。核酸増幅アセンブリ１１０は、分析装置１１２から解放された後に処分され得る。
図３Ａおよび３Ｂはサンプルモジュール１０２の受容器モジュール１０４の実施形態の斜視図を示す。図３Ａは受容器モジュール１０４の斜視図を示し、試薬を含むサンプル、または両方を受容するためにチャンバー３００を有する。受容器モジュール１０４はまた、受容器モジュールを移送モジュール１０６と一列に配置するための位置決め形状３０２を含む。図３Ｂは図３Ａの裏側斜視図を示し、チャンバー３００の底３０４の外面を示す。
図４Ａおよび４Ｂは受容器モジュール１０４と結合するように構成される移送モジュール１０６の実施形態の斜視図を示す。図４Ａはチャンバー４００を有する移送モジュール１０６の斜視図を示し、各チャンバーは流入口４０２および流出口４０４を有する。移送モジュール１０６はまた、移送モジュールを受容器モジュール１０４と一列に配置するための位置決め形状４０６を含む。図４Ｂは図４Ａの裏側の斜視図を示し、底４０８、ならびにチャンバー４００の流入口４０２および流入口４０４の外面を示す。
図５Ａ〜５Ｇは、結合された受容器モジュール５０２および移送モジュール５０４を有するサンプルモジュール５００にサンプルを加えるワークフローを示す。図５Ａに示すように、サンプルモジュール５００は、密封ポーチ５０６で提供され得る。密封ポーチ５０６はホイルポーチであり得る。図５Ｂはポーチ５０６から取り出した後のサンプルモジュール５００を示し、ヒンジ５０８を開いて受容器モジュール５０２および移送モジュール５０４のそれぞれ密封シール５１０および５１２を露出させる。
図５Ｃで示されるように、シール５１０は受容器モジュール５０２から取り除かれて、サンプルモジュール５１４およびブランクチャンバー５１６を露出し得る。サンプルチャンバー５１４およびブランクチャンバー５１６は一般的に緩衝溶液のような液体メディウムを含む。サンプル（例えば、体液）は、サンプルチャンバー５１４にデバイス５１８（例えば、綿棒）を介して送達され得、これによってサンプルをサンプルチャンバー５１４中の液体メディウムに導入する。ブランクチャンバー５１６は閉塞構成要素５２０でカバーされてブランクチャンバーへのサンプルの挿入を防止し得る。ガスケット５２２および５２４がそれぞれサンプルチャンバー５１４およびブランクチャンバー５１６の外部の周りに配置され得、サンプルチャンバー５１４にサンプルが加えられた後、受容器モジュール５０２と移送モジュール５０４の間の密封形成を促進する。受容器モジュール５０２上の位置決め形状５２６は、移送モジュール５０４上の相当する位置決め形状と嵌合するように構成される。
図５Ｄおよび５Ｅで示されるように、シール５１２が移送モジュール５０４から取り除かれて、サンプルモジュール５２８およびブランクチャンバー５３０を露出し得る。保持構成要素５３２および５３４はそれぞれサンプルチャンバー５２８およびブランクチャンバー５３０に配置され、サンプルチャンバー、ブランクチャンバー、または両方に固体試薬を保持し得る。一つの例では、保持構成要素５３２は、サンプルチャンバー５２８に試薬ペレットを保持する。試薬ペレットはＲＰＡ反応用のオリゴマーを含み得る。場合によっては、ペレットは凍結乾燥ペレットである。ブランクチャンバー５３０は固体試薬を無含有であり得る。保持構成要素５３２および５３４は一般的に、孔のような開口を定める。場合によっては、保持構成要素５３２および５３４はフリットである。フリットは受容器モジュール５０２から移送モジュール５０４への流体の移送を容易にするために選択される。一つの例では、保持構成要素５３２および５３４は親水性フリットである。移送モジュール５０４は、受容器モジュール５０２の位置決め形状５２６と嵌合するように構成される位置決め形状５３６を含む。
シール５１２が移送モジュール５０４から取り除かれた後、図５Ｆに示されるように、移送モジュールはヒンジ５０８を中心に回転されて受容器モジュール５０２に固定され得、保持構成要素５３２および５３４は、それぞれサンプルチャンバー５２８およびブランクチャンバー５３０に存在する試薬を保持する。受容器モジュール５０２および移送モジュール５０４が互いに押し付けられるとき、図５Ｇに示されるように、位置決め形状５２６および５３６が係止的に噛み合い、ガスケット５２２がサンプルチャンバー５１４および５２８をともに密封し、ガスケット５２４がブランクチャンバー５１６および５３０をともに密封する。サンプルモジュール５０２が示されるように回転されて、受容器モジュール５０２の上に移送モジュール５０４を有するとき、反転が生じている前に、サンプルチャンバー５１４およびブランクチャンバー５１６中の液体メディウムは受容器モジュール中にあり続け、それぞれ移送モジュール５０４におけるサンプルチャンバー５２８およびブランクチャンバー５３０に向けて流れない。位置決め形状５２６および５３６は、不可逆的に受容器モジュール５０２および移送モジュール５０４を密封するように構成され得、サンプルモジュール５００は意図せずに開くことができない。
サンプルモジュール５００を核酸増幅デバイスと結合する前に、サンプルモジュールを反転させて受容器モジュール５０２における液体メディウムの移送モジュール５０４に向けた移動を生じさせ、これによって移送モジュール内の固体試薬を水和化して水和化反応混合物を調製する。一つの例では、移送モジュール中の凍結乾燥ＲＰＡ試薬は水和化された水和化反応混合物を生成する。
図６Ａ〜６Ｈは、サンプルを分離した受容器モジュール６０２および移送モジュール６０４を有するサンプルモジュール６００に加える、代替えとなるワークフローを示す。図６Ａに示されるように、受容器モジュール６０２および移送モジュール６０４は、別々の密封ポーチ６０６、６０６’でそれぞれ提供され得る。密封ポーチ６０６はホイルポーチであり得る。
図６Ｂは密封ポーチ６０６’から取り出された後の移送モジュール６０４を示す。移送モジュール６０４はシール６１２で密封される。図６Ｃはポーチ６０６から取り出された受容器モジュール６０２を示す。受容器モジュール６０２はシール６１０で密封される。シール６１０を移送モジュール６０２から取り除いた後、図６Ｄに示されるように、サンプルチャンバー６１４およびブランクチャンバー６１６が露出される。サンプルチャンバー６１４およびブランクチャンバー６１６は一般的に緩衝溶液のような液体メディウムを含む。サンプル（例えば、体液）は、サンプルチャンバー６１４にデバイス６１８（例えば、綿棒）を介して送達され得、これによってサンプルをサンプルチャンバー中の液体メディウムに導入する。ブランクチャンバー６１６は閉塞構成要素６２０でカバーされてブランクチャンバーへのサンプルの挿入を防止し得る。ガスケット６２２および６２４がそれぞれサンプルチャンバー６１４およびブランクチャンバー６１６の外部の周りに配置され得、受容器モジュール６０２と移送モジュール６０４の間の密封形成を促進する。受容器モジュール６０２上の位置決め形状６２６は、移送モジュール６０４上の相当する位置決め形状と嵌合するように構成される。
図６Ｅに示されるように、シール６１２は移送モジュール６０４から取り除かれ得る。シール６１２を移送モジュール６０４から取り外し、サンプルチャンバーおよびブランクチャンバーを露出させる（図示なし）。保持構成要素（図示なし）はそれぞれサンプルチャンバーおよびブランクチャンバーに配置され、サンプルチャンバー、ブランクチャンバー、または両方に固体試薬を保持し得る。一つの例では、固体試薬はＲＰＡ反応用のオリゴマーを含む。場合によっては、固体試薬は凍結乾燥ペレットである。ブランクチャンバーは固体試薬を無含有であり得る。保持構成要素は一般的に孔のような開口を定める。場合によっては、保持構成要素はフリットである。フリットは受容器モジュール６０２から移送モジュール６０４への流体の移動を容易にするために選択される。一つの例では、保持構成要素は親水性フリットである。移送モジュール６０２は、受容器モジュール６０２の位置決め形状６２６と嵌合するように構成される位置決め形状６３６を含む。
シール６１２を移送モジュール６０４から取り除いた後、図６Ｆに示されるように、移送モジュールは位置決め形状６２６および６３６を一列に配置するように反転され得る。この反転の際、移送モジュール６０４における保持構成要素は、移送モジュールのサンプルチャンバーおよびブランクチャンバーに存在する試薬を保持する。受容器モジュール６０２および移送モジュール６０４が互いに押し付けられるとき、図６Ｇに示されるように、位置決め形状６２６および６３６が係止的に噛み合い、ガスケット６２２が受容器モジュールおよび移送モジュールのサンプルチャンバーをともに密封し、ガスケット６２４が受容器モジュールおよび移送モジュールのブランクチャンバーをともに密封する。図６Ｇに示されるように受容器モジュール６０２の上に移送モジュール６０４があることにより、サンプルチャンバー６１４およびブランクチャンバー６１６中の液体メディウムは受容器モジュール中にあり続け、それぞれ移送モジュールにおけるサンプルチャンバーおよびブランクチャンバーに向けて流れない。位置決め形状６２６および６３６は、図６Ｈに示されるように、不可逆的に受容器モジュール６０２および移送モジュール６０４を密封するように構成され得、サンプルモジュール６００は意図せずに開くことができない。
サンプルモジュール６００を核酸増幅デバイスに結合する前に、サンプルモジュールを反転させて受容器モジュール６０２における液体メディウムの移送モジュール６０４に向けた移動を生じさせ得、これによって移送モジュール内の固体試薬を水和化して水和化反応混合物を調製する。一つの例では、移送モジュール中の凍結乾燥ＲＰＡ試薬は水和化されて水和化反応混合物を生成する。
図７はサンプルモジュール５００の斜視図である。移送モジュール５００は、核酸増幅デバイスと結合するように構成される移送モジュールの一部をカバーするシール７００によってパッキングされ得る。シール７００は流入口７０２および７０４ならびに流出口７０６および７０８の開口をカバーするために不透明表面を備えるホイルシールであり得る。シール７００は反転時にサンプルモジュール５００における水和化反応混合物を保持し得る。場合によっては、シール７００がサンプルモジュール５００から取り除かれ、核酸増幅デバイスはサンプルデバイスと結合され、サンプルモジュール５００はこれが核酸増幅デバイスと密封化された後に初めて反転される。流入口７０２および７０４ならびに流出口７０６および７０８は核酸増幅デバイスに挿入されるように構成される先細端（すなわち、低い形状のルアーコネクター）を有し得る。場合によっては、ガスケット７１０、７１２、７１４、および７１６はそれぞれ流入口７０２、７０４、７０６、および７０８に配置されて、核酸増幅デバイスと気密を形成し得る。
図８Ａおよび８Ｂは、サンプルモジュールの代替えとなる実施形態を示す。図８Ａは受容器モジュール８０２および移送モジュール８０４を含むサンプルモジュール８００の斜視図である。図８Ｂはサンプルモジュール８００の断面斜視図である。図８Ｂに示されるように、受容器モジュール８０２は開口８０８を有するサンプルチャンバー８０６を定める。サンプルチャンバー８０６は液体メディウム８１０を保持する。液体メディウム８１０は緩衝溶液であり得る。受容器モジュール８０２は流入口８１２および流出口８１４を含む。受容器モジュール８０２はまた、移送モジュール８０４の位置決め形状と噛み合うように構成される位置決め形状８１６を含む。
移送モジュール８０４は、伸長８２０を有して、受容器モジュール８０２のサンプルチャンバー８０６を受容するように構成される開口８２２を定めるハウジング８１８を含む。ラム８２４はハウジングに配置され、ラムのアーム８２６に配置される伸長８２０を有する。アーム８２６はスプリング８２８内に配置され、スプリングは係脱８３０を有する負荷位置に保持される。多孔性構成要素８３２はラム８２４と開口８２２の間に配置される。多孔性構成要素８３２は固体試薬（例えば、凍結乾燥ＲＰＡ試薬）を含む。位置決め形状８３４は受容器モジュール８０２の位置決め形状８１６と噛み合うように構成され、ガスケット８３６が受容器モジュールと移送モジュール８０４の間の密封を形成する。示されるように、受容器モジュール８０２は移送モジュール８０４の開口８２２内で密封される。位置決め形状８１６および８３４は、受容器モジュール８０２および移送モジュール８０４をガスケット８３６を介して密封するように係止的に噛み合う。位置決め形状８１６および８３４は、不可逆的に受容器モジュール８０２および移送モジュール８０４を密封するように構成され得、サンプルモジュール８００は意図せずに開くことができない。
図９Ａ〜９Ｅは、サンプルをサンプルモジュール８００に加えるためのワークフローを示す。図９Ａでは、シール９００は受容器モジュール８０２から取り外される。図９Ｂでは、サンプルは受容器モジュール８０２のサンプルチャンバー８０６における液体メディウム８１０に開口８０８を通して加えられる。図９Ｃでは、移送モジュール８０４が受容器モジュール８０２に向けて進められ、位置決め形状８１６と８３４を係止的に噛み合わせる。受容器モジュール８０２が移送モジュール８０４にガスケット８３６を介して密封された後、力が係脱８３０に加えられて、図９Ｄに示されるようにスプリング負荷ラム８２４を解放し得る。スプリング負荷ラム８２４を解放すると多孔性構成要素８３２が開口８２２を通って進み、多孔性構成要素における固体試薬が受容器モジュール８０２の液体メディウム８１０中で水和化される。図９Ｅは受容器モジュール８０２において停止しているラム８２４を有する密封サンプルモジュール８００を示し、固体試薬多孔性構成要素８３２を液体メディウム８１０に推し進めている。密封サンプルモジュール８００は核酸増幅デバイスと結合されて、受容器モジュール８０２に加えられるサンプル中の標的核酸の存在が評価され得る。
図１０は、光学的検出のための核酸増幅デバイス１０００の分解図を示す。核酸増幅デバイス１０００は積層化マイクロ流体デバイスであり、天面層１００２、中間層１００４、および基底層１００６を含む。基底層１００６は１つを超える構成部品を含み得る。示されるように、基底層１００６は２つの構成部品１００８および１０１０を含む。
中間層１００４は、流入口１０１２および１０１４ならびに流出口１０１６および１０１８を含み、それぞれサンプルモジュールの流出口および流入口に接続する。中間層１００４は一般的にＲＰＡ試薬のような試薬を含む。図１０に示されるように、第一反応チャンバー１０２０は固体試薬１０２２（例えば、酢酸マグネシウムの形態でＭｇ２＋）を含む。中間層１００４は試薬リサーバ１０２４および１０２６を含み、固体試薬１０２８および１０３０を含む。一つの例では、固体試薬１０２８は乾燥した（例えば、凍結乾燥）オリゴマーを含み、固体試薬１０３０はＭｇ２＋（例えば、酢酸マグネシウムの形態）を含む。第二反応チャンバー１０３２もまた、標的核酸が分析装置によって光学的シグナルを介して検出される検出チャンバーとしても機能し得る。第二反応チャンバー１０３２は光学的に透明なカバーを有し、フルオロフォアとクエンチャーがエクソヌクレアーゼによって分離されるときに生じる蛍光シグナルを、核酸増幅デバイスが挿入されるように構成される分析装置の光学的センサーによって検出することができる。位置決め形状１０３６によって、分析装置に核酸増幅デバイス１０００が位置合わせされる。
中間層１００４もまた、フロー検出チャンバー１０３４を含み、それぞれが透明カバーを有し、それを通して流体の存在が分析装置によって光学的にモニタリングされて液流を検出する。核酸増幅デバイス１０００を受容するように構成される分析装置は、構成される各フロー検出チャンバーに向けられる光源を含む。分析装置は各フロー検出チャンバーにおける液体の存在を検出するように（例えば、光散乱によって）構成される。フロー検出チャンバーにおける液体の検出は様々な操作を引き起こし得（例えば、ポンピングの開始または終了）、分析装置のコントローラーはフロー検出チャンバーにおける液体の検出に基づいて様々なパラメータ（例えば、ポンピング時間、反応時間、混合時間、フロー時間）を実行するように構成され得、試薬は所定容量で加えられ、所定時間反応させられる。
核酸増幅デバイス１０００は図１０に示されないポンプおよびマイクロ流体経路のような追加の特徴を含み得る。ポンプの１つ以上は蠕動ポンプまたはシリンジポンプであり得る。ポンプは光学的分析装置における光学的センサーによって検出されるフロー検出チャンバーを通る経過時間または流体流量に基づいてサンプルモジュールおよび第一反応チャンバー１０２０から第二反応チャンバー１０３２に向けて試薬を選択的に駆動し得、必要に応じて小分けを計量する。
サンプルモジュールを有する核酸増幅デバイス１０００の操作は、図１１と関連して説明される。サンプルモジュールが核酸増幅デバイス１０００と接続されるとき、サンプルモジュールの流出口は核酸増幅デバイスの流入口１０１２および１０１４と接続され、サンプルモジュールの流入口は核酸増幅デバイスの流出口１０１６および１０１８と接続される。サンプルモジュールの試薬は核酸増幅デバイス１０００の流入口１０１２および１０１４にサンプルモジュールの流出口を介して流入し、核酸増幅モジュールから移された流体（例えば、ガス、液体、または両方）が核酸増幅モジュールの流出口１０１６および１０１８を介してサンプルモジュールの流入口に流入する。
より詳細には、サンプルおよび緩衝液は、移送モジュールのサンプルチャンバーにおけるＲＰＡ試薬（例えば、乾燥オリゴマー）を水和化するために、受容器モジュールのサンプルチャンバーから流出口を通って流入口１０１２に流入する。第一ポンプ１０４０はこの第一反応混合物を第一フロー検出チャンバー１０４２に通して進める。
フロー検出チャンバーから、第一反応混合物が混合チャンバー１０４４を通って第二フロー検出チャンバー１０４６まで第一ポンプに引き出され、第一反応チャンバー１０２０に流入する。第一反応チャンバー１０２０はＲＰＡ試薬１０２２（例えば、酢酸マグネシウムの形態におけるＭｇ２＋）を含み、ヒーターおよび混合装置と接続される。混合装置は磁気混合装置１０４８として存在し得る。十分な混合時間後、第一ポンプ１０４０は第一反応チャンバー１０２０で産生される産物を第三フロー検出チャンバー１０５０に前進させる。第三フロー検出チャンバー１０５０から、エアーおよび第一反応チャンバーからの第一ＲＰＡ反応産物の一部が、流出口１０１６を介してサンプルモジュールに向けて流れる。
第一反応チャンバー１０２０からの産物の小分けが第二ポンプ１０５４によって分岐１０５２から引き出され、第四フロー検出チャンバー１０５６に向けて流れる。第三ポンプ１０５８が第二ＲＰＡ反応用の試薬（例えば、緩衝液）を、移送モジュールの流出口を介して移送モジュールのブランクチャンバーから核酸増幅デバイス１０００の流入口１０１４に引き出し、第五フロー検出チャンバー１０６０に通す。第四フロー検出チャンバー１０５６および第五フロー検出チャンバー１０６０は、Ｙ字接合点１０６２で合流し、第一ＲＰＡ反応からの産物の選択された量を第二ＲＰＡ反応用の試薬と混合する。この混合物は第二ポンプ１０５４および第三ポンプ１０５８によって、混合構成要素の第一シリーズ１０６４および混合構成要素の第二シリーズ１０６６を通ってポンプによって送られる。混合構成要素１０６６を通過後、混合物は接合点１０６８で分岐され、再度接合点１０７０で分岐されて反応混合物の４つの流れを生じる。各液流は反応混合物を試薬１０２８（例えば、酢酸マグネシウムの形態におけるＭｇ２＋）と混合するように構成される混合シリンダー１０７２を有する第一試薬リサーバ１０２４を通って流れる。第一試薬リサーバ１０２４から、各混合物が試薬１０３０を含む第二試薬リサーバ１０２６を通って流れる。第二試薬リサーバ１０２６における試薬１０３０は同一または異なり得る。一つの例では、試薬１０３０の少なくとも２つは、インフルエンザＡウイルスおよびインフルエンザＢウイルスのような、対象の特定標的に対する異なるＲＰＡプライマーを含む。
第二試薬リサーバ１０２６から、第三ポンプ１０５８が混合物を混合構成要素１０７４に通して第二反応チャンバー１０３２に移動させる。第二増幅が第二反応チャンバー１０３２で生じる。第二反応チャンバー１０３２はまた、検出チャンバーとして機能し得る。核酸増幅デバイス１０００では、第二反応チャンバー１０３２は光学的に透明なカバーを有し、フルオロフォアとクエンチャーがエクソヌクレアーゼによって分離されるときに生じる蛍光シグナルを、図１５〜１８と関連して説明される分析装置のような、核酸増幅デバイスが挿入されるように構成される分析装置において光学的に検出することができる。
図１２は、電気化学的検出のための核酸増幅デバイス１２００の分解図を示す。核酸増幅デバイス１２００は積層化マイクロ流体デバイスであり、センサー層１２０１、天面層１２０２、中間層１２０４、および基底層１００６を含む。基底層１２０６は１つを超える構成部品を含み得る。示されるように、基底層１２０６は２つの構成部品１２０８および１２１０を含む。
中間層１２０４は、流入口１２１２および１２１４ならびに流出口１２１６および１２１８を含み、それぞれサンプルモジュールの流出口および流入口に接続する。中間層１２０４は一般的にＲＰＡ試薬のような試薬を含む。図１２に示されるように、第一反応チャンバー１２２０は固体試薬１２２２（例えば、酢酸マグネシウムの形態でＭｇ２＋）を含む。スターラー１２２３が固体試薬１２２２に埋め込まれ得る。一つの例では、スターラーは磁気パックである。第二反応チャンバー１２３２はまた、検出チャンバーとして機能し得、天面層１２０２に開口１２２５を有して、反応チャンバー中の液体をセンサー層１２０１の裏面で電極と接触させる。中間層１２０４はまた、フロー検出チャンバー１２３４を含み、流体の存在が天面層１２０２の開口の上に重ねられるセンサー層１２０１における電極によって電気的にモニタリングされ、フロー検出チャンバーを通って流れる液体が電極と接触する。位置決め形状１２３６によって、分析装置に核酸増幅デバイス１２００が位置合わせされる。
核酸増幅デバイス１２００は図１２に示されないポンプおよびマイクロ流体経路のような追加の特徴を含み得る。ポンプの１つ以上は蠕動ポンプまたはシリンジポンプであり得る。ポンプは電気的分析装置におけるセンサーによって検出されるフロー検出チャンバーを通る経過時間または流体流量に基づいてサンプルモジュールおよび第一反応チャンバー１２２０から第二反応チャンバー１２３２に向けて試薬を選択的に駆動し得、必要に応じて小分けを計量する。
サンプルモジュールを有する核酸増幅デバイス１２００の操作は、中間層の上部透視図を示す図１３と関連して説明される。サンプルモジュールが核酸増幅デバイス１２００と接続されるとき、サンプルモジュールの流出口は核酸増幅デバイスの流入口１２１２および１２１４と接続され、サンプルモジュールの流入口は核酸増幅デバイスの流出口１２１６および１２１８と接続される。サンプルモジュールの試薬は、サンプルモジュールの流出口を介して核酸増幅デバイス１２００の流入口１２１２および１２１４に流入し、核酸増幅モジュールから移された流体（例えば、ガス、液体、または両方）が核酸増幅モジュールの流出口１２１６および１２１８を介してサンプルモジュールの流入口に流入する。
より詳細には、サンプルおよび緩衝液は、移送モジュールのサンプルチャンバーにおけるＲＰＡ試薬（例えば、乾燥オリゴマー）を水和化するために、受容器モジュールのサンプルチャンバーから流出口を通って流入口１２１２に流入する。第一ポンプ１２４０はこの第一反応混合物をフロー検出チャンバー１２４２を通して第一ポンプに進め、混合チャンバー１２４４を通って第二フロー検出チャンバー１２４６まで進めて、第一反応チャンバー１２２０に流入させる。第一反応チャンバー１２２０は、ＲＰＡ試薬１２２２（例えば、酢酸マグネシウムの形態でＭｇ２＋）を含み、ヒーターおよび混合装置と接続される。混合装置は磁気混合装置１２４８として存在し得る。十分な混合時間後、第一ポンプ１２４０は第一反応チャンバー１２２０で産生される産物を第三フロー検出チャンバー１２５０に進める。第三フロー検出チャンバー１２５０から、エアーおよび第一反応チャンバーからの第一ＲＰＡ反応産物の一部が流出口１２１６を介してサンプルモジュールに向けて流れる。
第一反応チャンバー１２２０からの産物の小分けが第二ポンプ１２５４によって分岐１２５２から引き出され、第四フロー検出チャンバー１２５６に向けて流れる。第三ポンプ１２５８が第二ＲＰＡ反応用の試薬（例えば、緩衝液）を、移送モジュールの流出口を介して移送モジュールのブランクチャンバーから核酸増幅デバイス１２００の流入口１２１４に引き出し、第五フロー検出チャンバー１２６０に通す。第四フロー検出チャンバー１２５６および第五フロー検出チャンバー１２６０は、Ｙ字接合点１２６２で合流し、第一ＲＰＡ反応からの産物の選択された量を第二ＲＰＡ反応用の試薬と混合する。この混合物は第二ポンプ１２５４および第三ポンプ１２５８によって混合構成要素の第一シリーズ１２６４および混合構成要素の第二シリーズ１２６６を通ってポンプによって送られる。混合構成要素１２６６を通過後、混合物は接合点１２６８で分岐され、再度接合点１２７０で分岐されて反応混合物の４つの流れを生じる。各液流は反応混合物を試薬１２２８（例えば、酢酸マグネシウムの形態におけるＭｇ２＋）と混合するように構成される混合シリンダー１２７２を有する第一試薬リサーバ１２２４を通って流れる。第一試薬リサーバ１２２４から、各混合物が試薬１２３０を含む第二試薬リサーバ１２２６を通って流れる。第二試薬リサーバ１２２６における試薬１２３０は同一または異なり得る。一つの例では、試薬１２３０の少なくとも２つは、インフルエンザＡウイルスおよびインフルエンザＢウイルスのような、対象の特定標的に対する異なるＲＰＡプライマーを含む。
第二試薬リサーバ１２２６から、第三ポンプ１２５８が混合物を混合構成要素１２７４に通して第二反応チャンバー１２３２に移動させる。第二増幅が第二反応チャンバー１２３２で生じる。第二反応チャンバー１２３２はまた、検出チャンバーとして機能し得る。核酸増幅デバイス１２００では、第二反応チャンバー１２３２における液体がセンサー層１２０１の裏側の電極と接触し、米国第６２／３００，２４２号で報告されているように、酸化還元活性化合物によって標識されているＲＰＡプローブから切断されている酸化還元活性化合物の酸化から生じる電子が、核酸増幅デバイスが挿入されるように構成される分析装置によって検出される。
図１４は天面層１２０２および中間層１２０４の開口の上に重ねられるセンサー層１２０１における電極を有する核酸増幅デバイス１２００の上部透視図を示す。電極はセンサー層１２０１の裏側に配置され、フローセンサー検出器１２４６、１２５０、１２５６、および１２６０、ならびに反応チャンバー１２３２における液体と接触する。一つの例では、感知電極ならびに分析装置と電気的に接続する末端に感知電極を電気的に接続する伝導路は、センサー層に第一伝導層を配置することによって形成され得る。別の例では、第一伝導層はセンサー層で第二伝導層の上に配置され得る。電極は伝導層をマスキングして暴露される領域に誘電層を配置することによって電気的に分離され得る。一つの例では、第一伝導材はカーボンを含む。別の例では、第二伝導材は銀を含む。本明細書で使用されるとき、「配置する」はスクリーンプリンティングのようなプリンティング法を含む。銀層がカーボン層の下に配置されるとき、得られる伝導路は一般的にカーボンが単独で用いられて形成される伝導路と比べて低い抵抗を有する。両例では、電気化学的測定はカーボン表面で実施される。
フローセンサー検出器１２４６および１２５０はそれぞれ２つの液体感知電極と電気的に接続される。フローセンサー検出器１２４６では、液体感知電極１４００および１４０２は配線１４０４および１４０６と電気的に接続され、それぞれ連結１４０８および１４１０と電気的に接続される。フローセンサー検出器１２５６および１２６０はそれぞれ４つの液体感知電極と電気的に接続される。フローセンサー検出器１２６０では、液体感知電極１４１２および１４１４は配線１４２０および１４２２と電気的に接続され、それぞれ連結１４２８および１４３０と電気的に接続され、電極１４１６および１４１８は配線１４２４および１４２６と電気的に接続され、それぞれ連結１４３２および１４３４と電気的に接続される。各検出チャンバー１２３２は３つの測定電極と接続され、参照電極１４３６、作用電極１４３８、および対電極１４４０を含み、各電極は配線を介して連結と電気的に接続される。配線は伝導材（例えば、銀）を含む伝導路であり得る。連結は分析装置における末端と係合するように構成される。
液体感知電極は伝導性の原理で作用する。すなわち、電圧が末端を通して加えられ、流体が各チャンバー内の感知電極と接触するとき、電流が液体を通り、分析装置が電流を検出する。測定電極のため、電位は対電極と作用電極の間に加えられ、参照電極は加えられた電位が予測通りであることを確実にするために作用する。電流測定モードで操作されるとき、電流は作用電極と接触する電気活性種の濃度に比例して流れる（標的種の酸化または還元が特異的電位で生じるかどうかに依存して効果的に電子が受容または供与される）。示差パルスボルタメトリーモードでは、電位は一つの電圧から別に変えられ、記録される得られる電流が電気活性種の酸化または還元の結果としてピークへの上昇および／または谷をもたらす。
図１５は核酸増幅システム１５００を示し、分析装置１５０４に挿入される核酸増幅デバイス１５０２を含む。核酸増幅デバイス１５０２および分析装置は、ＲＰＡ産物の光学的または電気化学的検出のために構成され得る。場合によっては、分析装置における核酸増幅デバイスの挿入は、核酸増幅デバイスに加えられたサンプルにおける標的核酸の存在の評価を開始する。他の例では、核酸増幅デバイスへのサンプルモジュールのその後の接続が、サンプルにおける標的核酸の存在の評価を開始する。さらに別の例では、核酸増幅デバイスに加えられたサンプルにおける標的核酸の存在の評価は、核酸増幅デバイスまたはアセンブリの分析装置への挿入後に使用者によって開始される。
図１６に示されるように、核酸増幅デバイス１５０２および分析装置１５０４は、ＲＰＡ産物の光学的検出のために構成される。特に、分析装置１５０４は核酸増幅デバイス１５０２の検出チャンバーにおけるＲＰＡ産物と結合される蛍光プローブからの蛍光を検出するように構成される。分析装置１５０４は、光源、各光源に対応する励起光ガイド１６００、各放出光ガイド１６０２に対応する放出光ガイド、および光検出器を含む。光源は一般的に光放出ダイオード（ＬＥＤ）であり、ＬＥＤ放出ピークと標的蛍光標識の吸収の間の優れた適合性を達成するように選択される。分析装置１５０４は傾斜形状を取り入れて、単一光源放出フィルターを用いて複数の反応セルからの蛍光測定を可能にする。
図１７は図１６の一部の拡大図を示す。図１７に示されるように、分析装置１５０４は４つの光源を含み、核酸増幅デバイス１５０２における４つの検出チャンバー１７００から蛍光測定を可能にする。励起光ガイド１６００は光を光源から検出チャンバー１７００に向かわせ、放出光ガイド１６０２は蛍光放出を検出チャンバーから光学的フィルターを介して共通光ダイオードに向かわせる。４つの測定チャンネル間は４つの光源の時分割多重化によって区別される。各励起光ガイド１６００は光源の１つからの入射光を平面における標的に向けるように構成され、入射光と平面の間の角度は３０°と６０°の間（例えば、４０°）であり、各放出光ガイド１６０２は放出光を標的から光検出装置に向けるように構成され、放出光の間の角度は４０°と６０°の間（例えば、３０°）である。分析装置１５０４は一般的に各光源に対応する第一レンズおよび第二レンズを含み、その相当する光源から第一レンズを通って送られる光を調整し、全内部反射を介して、調整された光を第二レンズに対する角度で向かわせるように構成されるそれぞれに相当する励起光ガイドを有する。
図１８Ａ〜１８Ｃは分析装置１５０４の傾斜形状を示す。図１８Ａ〜１８Ｃに示される角度は、例示的なものであり、説明を容易にするために選択されているが、これらの角度は分析装置１５００の実施形態で変更され得る。図１８Ａに示されるように、回転軸は反応チャンバー１７００の中心と接続するラインに対して４５°で方向付けられる。この構成は励起光ガイドと放出光ガイドの間の位置的な衝突を避け易くする。図１８Ｂは検出チャンバー表面基準に対して３０°の光学的な励起軸を示す（ｙ軸を中心としてｘ面で回転させる）。図１８Ｃは検出チャンバー表面基準に対して４０°の光学的な放出軸を示す（回転の直交軸を中心として、すなわち、ｘ軸を中心としてをｙｚ面で回転させる）。回転の中心は基準液体表面位置の下である（例えば、０．１〜１ｍｍ下）。傾斜角度の他の組み合わせを下表１に示す。励起光ガイドと放出光ガイドにおける最大屈曲角度は、一般的に４５°以下である。
分析装置１５０４は光源および光検出器と作動的に連結されるコントローラーを含む。コントローラーは光源によって入射光の発生を開始し、検出チャンバーから放出された光の収集を開始する。分析装置１５０４は一般的に単一光検出器および放出光ガイドと光検出器の間に作動的に配置される単一放出フィルターを含むが、いくつかの実施形態では、１つ以上の追加の光検出器、放出フィルター、または両方が存在し得る。
本明細書で説明されるデバイスおよび方法はリコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）技術の適用として説明されているが、標的核酸を増幅して検出するための他の等温技術も本明細書で説明されるデバイスで実施され得、例えばニッキングおよび伸長増幅反応（ＮＥＡＲ）技術が挙げられる。本明細書で説明されるＲＰＡ増幅およびＲＰＡ増幅産物の検出の方法は、米国特許第７，３９９，５９０号、第８，５８０，５０７号、第７，２７０，９８１号、第７，３９９，５９０号、第７，６６６，５９８号、第７，４３５，５６１号、第９，４６９，８６７号、第９，０５７，０９７号、第８，０７１，３０８号、第８，６３７，２５３号、および第８，０６２，８５０号で詳細に報告されている。ＮＥＡＲ法は米国特許出願公開第２００９／００８１６７０号および第２００９／００１７４５３号で報告されている。前述の参照文献のそれぞれは、その全体が本明細書に参照により組み込まれ、本開示の一部と考えられる。
本明細書で説明されるように、ＲＰＡはオリゴヌクレオチドプライマーを鋳型二本鎖核酸における相同配列と対を形成することができる、リコンビナーゼとして知られている酵素を使用する。ＲＰＡは、２種類のプライマーを鋳型とともに二本鎖ＤＮＡに挿入するためのリコンビナーゼ、ＤＮＡの置換された鎖を安定化してプライマーが置換されることを防ぐための一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質、および鋳型ＤＮＡに結合されるプライマーを伸長するための鎖置換ポリメラーゼを導入する。この方法では、ＤＮＡ合成は鋳型二本鎖核酸における定められた地点に向けられる。２種類以上の配列特異的（例えば、遺伝子特異的）プライマーを用いて、鋳型核酸が存在する場合、指数関数的増幅反応が開始される。反応は急速に進行し、数分で鋳型核酸のわずか数コピーから検出可能な増幅産物の量まで、鋳型二本鎖核酸内に存在する配列の特異的増幅をもたらす。ＲＰＡプロセスは生理学的な温度（例えば、３７〜４２℃）下の等温条件で進行する。ＲＰＡ法は、例えば、ＵＳ７，２７０，９８１、ＵＳ７，３９９，５９０、ＵＳ７，６６６，５９８、ＵＳ７，４３５，５６１、ＵＳ２００９／００２９４２１、およびＷＯ２０１０／１４１９４０で開示されており、そのすべてが本明細書に参照により組み込まれている。
ＲＰＡは細胞ＤＮＡ複製および修復機構の成分を組み入れ、特定の密集剤の存在下で達成される高レベルの組換え活性を維持するリコンビナーゼの負荷および解除の両方の十分な速度を有する、「動的」組換え環境を確立する。ＲＰＡは、感度、特異性、およびＰＣＲのほとんど他の特徴を併せもつが、サーモサイクリングを必要とせず、驚くほどの速度および温度非設定に対する頑強性を有する。ＲＰＡは、耐熱性である同等物、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質のようなアクセサリータンパク質を伴わない不十分な調節、またはこれらの組み合わせの少なくとも部分的な必要性のため、他のプロセスによって使用されていない既知の修復エンドヌクレアーゼのような、幅広い様々な核酸処理酵素の使用の可能性による利点を有する。
簡単に説明すると、ＲＰＡは次のステップを含む。最初に、リコンビナーゼ剤を第一および第二核酸プライマーと接触させて第一および第二核タンパク質プライマーを形成させる。第二に、第一および第二核タンパク質プライマーを二本鎖標的配列と接触させて第一鎖の第一部分に第一二本鎖構造を形成させ、第二鎖の第二部分に二本鎖構造を形成させ、そして当該第一核酸プライマーおよび当該第二核酸プライマーの３’端を所定の鋳型ＤＮＡ分子で互い同士に向き合わせる。第三に、第一および第二核タンパク質プライマーの３’端がＤＮＡポリメラーゼによって伸長されて、第一および第二二本鎖核酸、ならびに核酸の第一および第二置換鎖を産生する。第二および第三ステップは、所望の増幅度に達するまで繰り返される。
本開示はまた、マイクロ流体カートリッジまたはデバイス内でネステッドＲＰＡを実施する方法を提供する。ネステッドＲＰＡでは、核酸の第一領域はＲＰＡによって増幅され、第一増幅領域を形成する。ついで、完全に第一増幅領域内にある核酸の第二領域を、ＲＰＡを用いて増幅して第二増幅領域を形成する。このプロセスは複数回反復され得る。例えば、核酸の第三領域は、完全に第二領域内であり、第二増幅領域からＲＰＡによって増幅され得る。
本明細書で開示されるＲＰＡ試薬は、標的核酸配列を増幅するプライマーセットを含むことができる。プライマーは標的核酸配列と相補的である、または標的核酸配列と１つ以上の位置で異なる核酸を含むことができる。本明細書で説明されるように、標的核酸配列と１つ以上の位置で異なるプライマーによるＲＰＡの増幅産物は、１つ以上の位置で標的配列と異なり得る。本明細書で説明されるＲＰＡ反応の増幅産物は、標的切断配列を含むことができる。
ＲＰＡプライマーセットは、標的核酸配列を増幅する、または標的核酸配列と１つ以上の位置で異なる配列を導入することができる。この導入された配列は標的切断配列からなることができる。第一プライマーは標的核酸配列と相補的であることができる。第二プライマーは標的核酸配列と相補的である第一部分、および標的核酸配列と１つ以上の位置で異なる第二部分を含むことができる。２つのプライマーが核酸配列を増幅するとき、第二プライマーは１つ以上の異なる位置を増幅産物に組み込む。この増幅領域は標的核酸配列と１つ以上の位置で異なり、標的切断配列からなることができる。
本明細書で開示されるＲＰＡ組成物はリコンビナーゼを含み、原核生物、ウイルス、または真核生物起源を由来とし得る。例示的なリコンビナーゼには、ＲｅｃＡおよびＵｖｓＸ（例えば、いずれかの種から得られるＲｅｃＡタンパク質またはＵｖｓＸタンパク質）、およびこれらのフラグメントまたは変異体、ならびにこれらの組み合わせが含まれる。ＲｅｃＡおよびＵｖｓＸタンパク質はいずれかの種から得ることができる。ＲｅｃＡおよびＵｖｓＸフラグメントまたは変異体タンパク質はまた、利用可能なＲｅｃＡおよびＵｖｓＳタンパク質および核酸配列、ならびに分子生物学技術（例えば、米国特許第８，０７１，３０８号に記載されるＵｖｓＸの変異型を参照）を用いて産生することができる。例示的なＵｖｓＸタンパク質にはミオウイルス科由来のものが含まれ、Ｔ４、Ｔ２、Ｔ６、Ｒｂ６９、Ａｅｈ１、ＫＶＰ４０、アシネトバクターファージ１３３、アエロモナスファージ６５、シアノファージＰ−ＳＳＭ２、シアノファージＰＳＳＭ４、シアノファージＳ−ＰＭ２、Ｒｂ１４、Ｒｂ３２、アエロモナスファージ２５、ビブリオファージｎｔ−１、ｐｈｉ−１、Ｒｂ１６、Ｒｂ４３、ファージ３１、ファージ４４ＲＲ２．８ｔ、Ｒｂ４９、ファージＲｂ３、およびファージＬＺ２が挙げられる。追加の例示的なリコンビナーゼタンパク質には、古細菌ＲＡＤＡおよびＲＡＤＢタンパク質、ならびに真核生物（例えば、植物、哺乳動物、および真菌）Ｒａｄ５１タンパク質（例えば、ＲＡＤ５１、ＲＡＤ５１Ｂ、ＲＡＤ５１Ｃ、ＲＡＤ５１Ｄ、ＤＭＣ１、ＸＲＣＣ２、ＸＲＣＣ３、およびｒｅｃＡ）が挙げられる（例えば、Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０３：１０３２８−１０３３３，２００６を参照）。
本開示のいずれかのプロセスでは、リコンビナーゼ（例えば、ＵｖｓＸ）は変異体またはハイブリッドリコンビナーゼであり得る。いくつかの実施形態では、変異体ＵｖｓＸは、Ｒｂ６９ ＵｖｓＸアミノ酸配列に少なくとも１つの変異を含むＲｂ６９ ＵｖｓＸであり、ここで変異は６４位でのヒスチジンではないアミノ酸、６４位でのセリン、Ｃ端での１つ以上のグルタミン酸残基の付加、Ｃ端での１つ以上のアスパラギン酸残基の付加、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される。他の実施形態では、変異体ＵｖｓＸはＴ６ ＵｖｓＸアミノ酸配列に少なくとも１つの変異を有するＴ６ ＵｖｓＸであり、ここで変異は、（ａ）６６位でのヒスチジンではないアミノ酸、（ｂ）６６位でのセリン、（ｃ）Ｃ端での１つ以上のグルタミン酸残基の付加、（ｄ）Ｃ端での１つ以上のアスパラギン酸残基の付加、および（ｅ）これらの組み合わせからなる群から選択される。ハイブリッドリコンビナーゼタンパク質が使用される場合、ハイブリッドタンパク質は、例えば、異なるＵｖｓＸ種由来のアミン酸配列を含む少なくとも１つの領域を含むＵｖｓＸタンパク質であり得る。領域は、例えば、ＵｖｓＸのＤＮＡ結合ループ−２領域であり得る。
本明細書で開示されるＤＮＡポリメラーゼは、真核生物または原核生物ポリメラーゼであり得る。真核生物ポリメラーゼの例には、ｐｏｌ−アルファ、ｐｏｌ−ベータ、ｐｏｌ−デルタ、ｐｏｌ−イプシロン、およびこれらの変異体またはフラグメント、あるいはこれらの組み合わせが含まれる。原核生物ポリメラーゼの例には、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ（例えば、クレノウフラグメント）、バクテリオファージＴ４ ｇｐ４３ ＤＮＡポリメラーゼ、バシルス・ステアロサーモフィルスポリメラーゼＩ大型フラグメント、Ｐｈｉ−２９ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ、バシルス・スブチリスＰｏｌ Ｉ、スタフィロコックス・アウレウスＰｏｌ Ｉ、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩＩ、大腸菌ポリメラーゼＩＩＩ、 大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩＶ、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＶ、およびこれらの変異体またはフラグメント、あるいはこれらの組み合わせが含まれる。いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼは３’−５’エクソヌクレアーゼ活性を欠如する。いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼは鎖置換特性、例えば、クラスｐｏｌ Ｉまたはｐｏｌ Ｖの原核生物ポリメラーゼの大型フラグメントを有する。
さらに、１つ以上の一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質を、反応中に進行する様々な交換反応の際に核酸を安定化するために使用することができる。１つ以上の一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質はいずれかの種、例えば、原核生物、ウイルス、または真核生物種由来、またはこれらから得ることができる。非限定的な例の一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質には、大腸菌ＳＳＢおよびミオウイルス科ファージ由来のものが含まれ、Ｔ４、Ｔ２、Ｔ６、Ｒｂ６９、Ａｅｈ１、ＫＶＰ４０、アシネトバクターファージ１３３、アエロモナスファージ６５、シアノファージＰ−ＳＳＭ２、シアノファージＰＳＳＭ４、シアノファージＳ−ＰＭ２、Ｒｂ１４、Ｒｂ３２、アエロモナスファージ２５、ビブリオファージｎｔ−１、ｐｈｉ−１、Ｒｂ１６、Ｒｂ４３、ファージ３１、ファージ４４ＲＲ２．８ｔ、Ｒｂ４９、ファージＲｂ３、およびファージＬＺ２が挙げられる。一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質の追加の例には、Ａ．デニトリフィカンスＡｌｉｄｅ＿２０４７、バークホルデリア・タイランデンシスＢｔｈａＢ＿３３９５１、プレボテラ・パレンスＨＭＰＲＥＦ９１４４＿０１２４、および真核生物一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質複製タンパク質Ａが含まれる。
本開示のＲＰＡプロセスのいずれかは密集剤の存在下で実施され得る。いくつかの実施形態では、密集剤はポリエチレングリコール、ポリエチレンオキシド、ポリビニルアルコール、ポリスチレン、フィコール、デキストラン、ポリ（ビニルピロリドン）（ＰＶＰ）、トライトン−Ｘ、およびアルブミンの１種類以上を含み得る。いくつかの実施形態では、密集剤は２００，０００ダルトン未満の分子量を有する。本明細書で説明される態様のいずれかのいくつかの実施形態では、組成物はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（例えば、ＰＥＧ１４５０、ＰＥＧ３０００、ＰＥＧ８０００、ＰＥＧ１００００、ＰＥＧ１４０００、ＰＥＧ１５０００、ＰＥＧ２００００、ＰＥＧ２５００００、ＰＥＧ３００００、ＰＥＧ３５０００、ＰＥＧ４００００、１５，０００と２０，０００ダルトンの間の分子量を有するＰＥＧ化合物、またはこれらの組み合わせ）、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、トライトン−Ｘ、およびフィコールからなる群から選択される密集剤を含む。いくつかの実施形態では、密集剤は反応混合物の重量または容量で１〜１５％の濃度で反応混合物中に存在し、例えば、１．０％、１．５％、２．０％、２．５％、３．０％、３．５％、４．０％、４．５％、５．０％、５．５％、６．０％、６．５％、７．０％、７．５％、８．０％、８．５％、９．０％、９．５％、１０．０％、１０．５％、１１．０％、１１．５％、１２．０％、１２．５％、１３．０％、１３．５％、１４．０％ １４．５％、および１５．０％から選択されるいずれかの２濃度値の間である。
リコンビナーゼ含有タンパク質が使用される場合、リコンビナーゼ含有タンパク質は原核生物、ウイルス、または真核生物由来のものであり得る。例示的なリコンビナーゼ含有タンパク質には、大腸菌ＲｅｃＯ、大腸菌ＲｅｃＲ、ＵｖｓＹ、およびこれらの変異体またはフラグメント、あるいはこれらの組み合わせが含まれる。例示的なＵｖｓＹタンパク質にはミオウイルス科ファージ由来のものが含まれ、Ｔ４、Ｔ２、Ｔ６、Ｒｂ６９、Ａｅｈ１、ＫＶＰ４０、アシネトバクターファージ１３３、アエロモナスファージ６５、シアノファージＰ−ＳＳＭ２、シアノファージＰＳＳＭ４、シアノファージＳ−ＰＭ２、Ｒｂ１４、Ｒｂ３２、アエロモナスファージ２５、ビブリオファージｎｔ−１、ｐｈｉ−１、Ｒｂ１６、Ｒｂ４３、ファージ３１、ファージ４４ＲＲ２．８ｔ、Ｒｂ４９、ファージＲｂ３、およびファージＬＺ２が挙げられる。本開示のプロセスのいずれかでは、リコンビナーゼ含有剤はミオウイルス科ファージ由来であり得る。ミオウイルス科ファージは、例えば、Ｔ４、Ｔ２、Ｔ６、Ｒｂ６９、Ａｅｈ１、ＫＶＰ４０、アシネトバクターファージ１３３、アエロモナスファージ６５、シアノファージＰ−ＳＳＭ２、シアノファージＰＳＳＭ４、シアノファージＳ−ＰＭ２、Ｒｂ１４、Ｒｂ３２、アエロモナスファージ２５、ビブリオファージｎｔ−１、ｐｈｉ−１、Ｒｂ１６、Ｒｂ４３、ファージ３１、ファージ４４ＲＲ２．８ｔ、Ｒｂ４９、ファージＲｂ３、またはファージＬＺ２であり得る。
本発明の方法における使用に適した増幅方法は、増幅の際に二本鎖ポリヌクレオチドを変性させるのに十分な温度にポリヌクレオチドをさらすことなく実施される増幅方法を含む。例えば、ポリヌクレオチドの増幅は、増幅の際に約９０℃、約８０℃、約７０℃、または約６０℃を超える温度にポリヌクレオチドをさらすことなく実施され得る。実施形態では、ポリヌクレオチドの増幅は、増幅の際に二本鎖ポリヌクレオチドを変性させるのに十分な条件にポリヌクレオチドをさらすことなく実施される。例えば、増幅はポリヌクレオチドを増幅の際に二本鎖ポリヌクレオチドを変性させるのに十分な物理的、化学的、または温度的条件にポリヌクレオチドをさらすことなく実施され得る。
本発明の方法における使用に適した増幅方法は、サンプルに存在する二本鎖ポリヌクレオチドを変性させるのに十分な温度に、ポリヌクレオチドを最初にさらすことなく実施される増幅方法を含む。例えば、ポリヌクレオチドの増幅は、約９０℃、約８０℃、約７０℃、約６０℃、または約５５℃を超える温度に、ポリヌクレオチドを最初にさらすことなく実施され得る。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドおよび／またはこのアンプリコンはこのような過剰な温度に、ポリヌクレオチドを最初にさらすことなく検出される。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドの増幅は、サンプルに存在する二本鎖ポリヌクレオチドを変性させるのに十分な条件に、ポリヌクレオチドを最初にさらすことなく実施される。例えば増幅は、サンプルに存在する二本鎖ポリヌクレオチドを変性させるのに十分な物理的、化学的、または温度的条件に、ポリヌクレオチドを最初にさらすことなく実施され得る。
本発明の方法における使用に適した増幅方法は、増幅を実施するのに十分な試薬とポリヌクレオチドを混合するステップで開始し、増幅がポリヌクレオチドまたはこのアンプリコンの定性的または定量的測定を可能にするのに十分な量まで進行しているときに終了する全時間（Ｔ）で実施される増幅方法を含む。このような実施形態のいずれかでは、全時間Ｔは約４５分以内、約３０分以内、約２０分以内、または約１５分以内であり得る。
ポリヌクレオチドの増幅は、例えば、ポリヌクレオチドを少なくとも約１０６倍、少なくとも約１０７倍、少なくとも約１０８倍、少なくとも約１０９倍、少なくとも約１０１０倍、少なくとも約１０１１倍、または少なくとも約１０１２倍で増幅することを含む。このような増幅は時間Ｔ以内で実施され得る。
本発明の方法における使用に適した増幅方法は、当業者に知られている「リアルタイム」または「定量的」ポリヌクレオチド増幅方法を含む。このような方法は反応が進行するときにリアルタイムで各増幅サイクル後のポリヌクレオチド増幅産物の蓄積を検出し、増幅動態を測定することができる。リアルタイム法は、増幅される産物の特異的閾値濃度に到達する時間（例えば、サイクル数）が標的ポリヌクレオチドの最初のコピー数と直接的に関連するため、定量的である。いくつかの実施形態によれば、増幅反応は本明細書で説明されるオリゴヌクレオチドプローブを用いた電気化学的検出によってモニタリングされる。
例
例１：ネステッドＲＰＡ増幅
図１９Ａ〜１９Ｄは本明細書で説明されるマイクロ流体カードでネステッドＲＰＡを実施する方法を用いて行われた分析結果を示す。結果は異なる既知標的を有するサンプル間を区別するネステッドＲＰＡアッセイの能力を示す。サンプルはインフルエンザ陽性およびインフルエンザ陰性サンプル材料の供給業者から得た。一連の測定を全９０例のサンプルを用いて実施し、３０例のサンプルはインフルエンザＡ（ＩｎｆＡ）が陽性であることが分かっており、１０例のサンプルはインフルエンザＢ（ＩｎｆＢ）が陽性であることが分かっており、５０例のサンプルはインフルエンザＡまたはＢが含まれないこと（陰性）が分かっていた。各サンプルを単一のアッセイデバイスに加え、測定をアッセイカードの４つの検出チャンバーのそれぞれから得た。
図１９Ａ〜１９Ｄに示されるそれぞれの実験では、反応産物の検出を蛍光的に標識したプローブを用いて実施した。標識プローブによるＲＰＡ試薬の検出は、既に説明されているが、一般的に、標的が存在している場合、増幅される標的の検出用の検出可能な標識を有する少なくとも１種類のプローブを含む。プローブは蛍光およびクエンチャーを含み得、増幅反応産物が存在する場合、プローブが相補的なポリヌクレオチド配列とハイブリダイゼーションするときにヌクレアーゼによる切断によって分離される。同様な結果（図示なし）は、サンプルを電気化学的に標識したプローブを用いて試験したとき、サンプルがインフルエンザＡ陽性、インフルエンザＢ陽性、または陰性コントロールかどうかの特定に関して９０例のサンプルで得られた。
蛍光的および電気化学的プローブ測定の両方を合わせた結果を表２Ａ〜２Ｄに示す。各表はインフルエンザサンプル材料の供給業者によって実施された標準的な市販ｑＰＣＲアッセイを用いてなされた比較測定を含む。ｑＰＣＲはサンプル材料の供給業者によるサンプル取得時に実施され、結果を用いてサンプルを陽性または陰性、同様にｆｌｕＡおよびｆｌｕＢに分類し、分類したサンプルは適切に保存され、ウイルス輸送メディウム（ＶＴＭ）で供給された。ＲＰＡの実施においてＶＴＭの明らかな影響はなかった。
インフルエンザＡの核酸配列は年ごとに頻繁に変化することが知られており、ＲＰＡアッセイは、サンプルをインフルエンザＡについて陽性に特定する可能性を最大にする異なるヌクレオチド領域に向けられる、２種類の異なるプライマーおよびプローブセットを組み込むように開発された。
本明細書で説明されるＲＰＡアッセイで使用されたプライマーおよびアッセイをＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１〜２１として下記に示す。ネステッド増幅の第一ラウンドの際、第一プライマー配列を第一反応チャンバーで全サンプルと接触させるために使用して、第一増幅を実施した。そして第一増幅産物を使用して個別第二反応チャンバー内で第二プライマーおよびプローブと接触させ、ＩｎｆＡ ＰＡ、ＩｎｆＡ ＰＢ２、ＩｎｆＢ ＰＡ、およびＩＣを用いて各標的種を特異的に増幅して、ＦｌｕＡまたはｆｌｕＢが患者サンプルに存在する場合に、シグナルを生じた。プローブが蛍光測定を行うために使用されるとき、これらはヌクレアーゼエクソヌクレアーゼＩＩＩ（Ｅｘｏ）によって切断されるように設計され、電気化学で使用されるプローブはヌクレアーゼ８−オキソグアニンＤＮＡグリコシラーゼ（ｆｐｇ）を用いて使用するように設計された。適切な電気化学的プローブの例は、２０１７年２月２４日に出願された同時係属中の出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０１９４４６で説明され、その全体が参照によって本明細書に組み込まれている。
ＩｎｆＡ［ＰＡ］第一増幅プライマー
＞ＦｌｕＡＰＡＲ１１１
ＴＧＣＡＴＧＴＧＴＧＡＧＧＡＡＧＧＡＧＴＴＧＡＡＣＣＡＡＧ＊Ａ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１）
＞ＦｌｕＡＰＡＦ５２３
ＡＡＡＴＴＧＣＴＴＣＴＣＡＴＴＧＴＴＣＡＧＧＣＡＣＴＴＡＧＧＧ＊Ａ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２）
ＩｎｆＡ［ＰＢ２］第一増幅プライマー
＞ＦｌｕＡＰＢ２Ｆ２０１
ＧＡＡＣＴＧＡＧＴＡＡＣＣＴＴＧＣＡＡＡＲＧＧＧＧＡＡＡＡＧＧ＊Ｃ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３）
＞ＦｌｕＡＰＢ２Ｆ２１８
ＧＡＡＣＴＧＡＧＴＡＡＣＣＴＴＧＣＡＡＡＡＧＧＧＧＡＡＡＡＡＧ＊Ｃ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４）
＞ＦｌｕＡＰＢ２Ｒ１０３
ＡＹＴＡＡＴＴＧＡＴＧＧＣＣＡＴＣＣＧＡＡＴＴＣＴＴＴＴＧＧＴＣＧＣＴ＊Ｇ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５）
ＩｎｆＢ［ＰＡ］第一増幅プライマー
＞ＦｌｕＢＰＡＦ４４
ＡＡＧＧＡＴＴＧＧＣＴＧＡＴＧＡＴＴＡＣＴＴＴＴＧＧＡＡＡＡＡＧＡＡＡ＊Ｇ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６）
＞ＦｌｕＢＰＡＲ４２
ＴＡＡＴＴＣＡＧＣＣＴＧＡＡＧＴＴＣＴＧＴＧＡＧＴＣＴＧＣＴＴＡＧ＊Ｃ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７）
Ｘｃｏｎ第一増幅プライマー
＞ＸＣｏｎＦ７
ＡＡＴＣＡＴＧＡＡＣＣＴＣＡＴＧＧＣＡＴＣＴＴＣＣＣＴＣＧＣＣＧＣ＊Ｃ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．８）
＞ＸＣｏｎＲ６
ＡＣＡＡＴＧＣＡＡＴＣＡＴＡＴＧＣＴＴＣＴＧＣＴＡＴＧＴＴＡＡＧＣ＊Ｇ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．９）
ＩｎｆＡ［ＰＡ］第二増幅プライマー
＞ＦＬＵＰＡＦ５０７ｉｉ
ＡＡＣＣＴＧＧＧＡＣＣＴＴＴＧＡＴＣＴＴＧＧＧＧＧＧＣＴＡＴＡＴ＊Ｇ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１０）
＞ＦＬＵＡＰＡＲ１０６ｉｉ
ＡＴＧＴＧＴＴＡＧＧＡＡＧＧＡＧＴＴＧＡＡＣＣＡＡＧＡＡＧＣＡＴ＊Ｔ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１１）
ＩｎｆＡ［ＰＡ］Ｅｘｏプローブ
＞ＦｌｕＡＰＡＥｘｏＰ１２ｄＦＡＭ Ｆ＝ｄＴ−ＦＡＭ、Ｈ＝ＴＨＦ（脱塩基部位模倣体）、Ｑ＝ｄＴ−ＢＨＱ−１、３’＝ブロックＣ３スペーサー
ＧＡＡＣＣＡＡＧＡＴＧＣＡＴＴＲＡＧＣＡＡＡＡＣＣＣＡＧＧＧＡＦＨＡＱＴＡＡＴＣＡＧＧＣＡＣＴＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１２）
ＩｎｆＡ［ＰＢ２］第二増幅プライマー
＞ＦｌｕＡＰＢ２Ｆ４０３
ＡＡＴＧＴＧＣＴＡＡＴＹＧＧＧＣＡＡＧＧＡＧＡＣＧＴＧＧＴＧＴＴＧ＊Ｇ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１３）
＞ＦｌｕＡＰＢ２Ｒ７０３
ＧＧＣＣＡＴＣＣＧＡＡＴＴＣＴＴＴＴＧＧＴＣＧＣＴＧＴＣＴＧＧ＊Ｃ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１４）
ＩｎｆＡ［ＰＢ２］Ｅｘｏプローブ
＞ＦｌｕＡＰＢ２ＥｘｏＰ２ Ｆ＝ｄＴ−ＦＡＭ、Ｈ＝ＴＨＦ（脱塩基部位模倣体）、Ｑ＝ｄＴ−ＢＨＱ−１、３’＝ブロックＣ３スペーサー
ＣＧＡＡＴＴＣＴＴＴＴＧＧＴＣＧＣＴＧＴＣＴＧＧＣＴＧＴＣＡＧＴＡＡＧＦＨＱＧＣＴＡＧＡＧＴＣＣＣＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１５）
ＩｎｆＢ［ＰＡ］第二増幅プライマー
＞ＭＳＦＢＰＡ＿Ｆ６＋１−２
ＧＧＡＡＡＡＡＧＡＡＡＧＡＡＡＡＧＣＴＧＧＧＡＡＡＴＡＧＣＡＴＧ＊Ｇ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１６）
＞ＭＳＦＢＰＡ＿Ｒ６＋１
ＧＣＴＴＡＧＣＡＣＴＣＴＣＣＣＴＴＴＣＣＣＴＴＣＣＴＣＡＴＣＣＡＡＴ＊Ｇ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１７）
ＩｎｆＢ［ＰＡ］Ｅｘｏプローブ
＞ＭＳＦＢＰＡｘ１ Ｆ＝ｄＴ−ＦＡＭ、Ｈ＝ＴＨＦ（脱塩基部位模倣体）、Ｑ＝ｄＴ−ＢＨＱ−１、３’＝ブロックＣ３スペーサー
ＡＣＴＧＡＴＧＡＴＡＴＴＣＡＧＣＴＡＣＡＡＴＣＡＡＧＡＣＦＡＨＱＣＧＴＴＡＡＧＴＡＡＴＧＡＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１８）
Ｘｃｏｎ第二増幅プライマー
＞ＸＣｏｎＲ１３
ＴＴＣＣＡＧＴＣＡＧＴＣＣＴＡＧＴＣＡＧＡＡＡＣＧＧＴＣＣＴＴＡＧＡＣ＊Ｇ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１９）
＞ＡＰＯＢＥＸＴＦ
ＧＣＣＡＧＧＴＴＴＡＴＡＧＣＡＣＡＣＴＴＧＴＣＡＣＣＴＡ＊Ｃ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２０）
Ｘｃｏｎ Ｅｘｏプローブ
＞ＡＰＯＢ１ＦＡＭ Ｆ＝ｄＴ−ＦＡＭ、Ｈ＝ＴＨＦ（脱塩基部位模倣体）、Ｑ＝ｄＴ−ＢＨＱ−１、３’＝ブロックＣ３スペーサー
ＧＣＣＡＧＧＴＴＴＡＴＡＧＣＡＣＡＣＴＴＧＴＣＡＣＣＴＡＣＡＱＴＨＣＦＧＡＴＴＧＧＴＧＧＡＣＴＣＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２１）
図１９Ａはサンプル９０例がＩｎｆＡ ＰＡ ＲＰＡプライマーおよびプローブに暴露されたときに得られた結果を表す。結果は、ＩｎｆＡ ＰＡプライマーがＩｎｆＡ陽性サンプル３０例中２４例を検出し、ＩｎｆＢまたは陰性サンプルはＩｎｆＡ ＰＡプライマーによる反応を示さなかったことを示す。図１９ＢはＩｎｆＡサンプルのすべてがＩｎｆＡ ＰＢ２プライマーおよびプローブに暴露されたときに陽性反応をもたらし、ＩｎｆＢおよび陰性サンプルはＩｎｆＡ ＰＢ２プライマーおよびプローブともにいずれの反応も示さなかったことを表す。図１９ＣはＩｎｆＢサンプルのすべてがＩｎｆＢ ＰＡプライマーおよびプローブに暴露されたときに陽性反応をもたらし、ＩｎｆＡおよび陰性コントロールサンプルはいずれも反応しなかったことを示す。図１９Ｄは、陰性コントロールプライマー（Ｘｃｏｎ）およびプローブが使用されたとき、陽性シグナルを示すサンプルはなかったことを示す。
図１９Ａ〜１９Ｄのそれぞれにおいて、破線はベースライン閾値を示し、最大陰性結果より３標準偏差高いものとして決定された。データは、ＩｎｆＡ ＰＡおよびＩｎｆＡ ＰＢ２領域に対するＲＰＡプライマーおよびプローブの組み合わせた使用がインフルエンザＡ陽性サンプルの１００％同定をもたらし、異なるヌクレオチド配列を有するインフルエンザウイルスの存在を首尾よく測定する本明細書で説明されるアッセイ方式の能力を実証する。
他の実施形態
本発明の多くの実施形態が説明されている。しかし、様々な変更が本発明の精神および範囲から逸脱することなくなされ得ることが理解されるであろう。従って、他の実施形態は後述の請求項の範囲内である。

Claims (85)

  1. サンプルをマイクロ流体デバイスに加え、前記サンプルにおける標的ポリヌクレオチド配列を増幅することを含む方法であって、前記増幅が、前記サンプルに増幅の第一ラウンドを実施して第一増幅産物を産生し、前記第一増幅産物に増幅の第二ラウンドを実施して第二増幅産物を産生することを含み、前記第二増幅産物は増幅の前記第一ラウンドの際に産生される前記第一増幅産物内に完全に含まれる、より小さい配列を含む、方法。
  2. 前記第二増幅産物を検出することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
  3. 前記第二増幅産物の検出が、前記第二増幅産物をフルオロフォアおよびクエンチャーと連結された第一オリゴヌクレオチドによって標識して標識第二産物を得、前記標識第二増幅産物からクエンチャーを切断し、フルオロフォアからのシグナルを光学的に検出することを含み、検出可能なシグナルが前記第二増幅産物の存在の指標である、請求項２に記載の方法。
  4. 前記クエンチャーを切断することがヌクレアーゼを用いて実施される、請求項３に記載の方法。
  5. 前記ヌクレアーゼが二本鎖ＤＮＡを標的にする、請求項４に記載の方法。
  6. 前記ヌクレアーゼがホルムアミドピリミン−ＤＮＡグリコシラーゼである、請求項５に記載の方法。
  7. 前記第二増幅産物の検出が、前記第二増幅産物を酸化還元部分と連結された第一オリゴヌクレオチドによって標識して標識第二増殖産物を得、前記標識第二増幅産物から酸化還元部分を切断し、前記切断酸化還元部分からシグナルを電気化学的に検出することを含み、検出可能なシグナルが前記第二増幅産物の存在の指標である、請求項２に記載の方法。
  8. 前記酸化還元部分がフェノチアジン、フェノキサジン、フェロセン、フェリシアン化物、ルテニウム（ＩＩＩ）、オスミウム（ＩＩ）、アントラキノン、フェナジン、およびこれらの誘導体からなる群から選択される、請求項７に記載の方法。
  9. 前記酸化還元がヌクレアーゼを用いて実施される、請求項７に記載の方法。
  10. 前記ヌクレアーゼが二本鎖ＤＮＡを標的にする、請求項９に記載の方法。
  11. 前記ヌクレアーゼがホルムアミドピリミン−ＤＮＡグリコシラーゼである、請求項１０に記載の方法。
  12. 前記第二増幅産物に増幅の第三ラウンドを実施して第三増幅産物を産生し、前記第三増幅産物を検出することをさらに含み、前記第三増幅産物は増幅の第二ラウンドの際に産生される前記第二増幅産物内に完全に含まれる、より小さい配列を含む、請求項１に記載の方法。
  13. 前記サンプルが動物から得られる、請求項１に記載の方法。
  14. 動物から得られる前記サンプルが前記動物の血液、喀痰、粘液、唾液、涙、または尿から得られる、請求項１３に記載の方法。
  15. 前記サンプルがヒトから得られる、請求項１３に記載の方法。
  16. 前記標的ポリヌクレオチド配列が、標的核酸に含まれる、請求項１に記載の方法。
  17. 前記標的核酸が、動物病原体から得られる、請求項１６に記載の方法。
  18. 前記動物病原体が、一本鎖ＤＮＡウイルス、二本鎖ＤＮＡウイルス、または一本鎖ＲＮＡウイルスである、請求項１７に記載の方法。
  19. 前記動物病原体が細菌である、請求項１７に記載の方法。
  20. 前記標的核酸が、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、またはＲＮＡである、請求項１６に記載の方法。
  21. 前記標的核酸が、ゲノムＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成二本鎖ＤＮＡ、および合成一本鎖ＤＮＡからなる群から選択される、請求項１６に記載の方法。
  22. 前記標的核酸がウイルスＤＮＡまたはウイルスＲＮＡである、請求項１６に記載の方法。
  23. 前記動物病原体が、インフルエンザＡウイルスまたはインフルエンザＢウイルスである、請求項１７に記載の方法。
  24. 前記サンプルにおける２種類以上の標的ポリヌクレオチド配列が増幅される、請求項１に記載の方法。
  25. インフルエンザＡ遺伝子配列を含む標的ポリヌクレオチド配列およびインフルエンザＢ遺伝子配列を含む標的ポリヌクレオチド配列が増幅される、請求項２４に記載の方法。
  26. ２種類以上の増幅産物が検出される、請求項２に記載の方法。
  27. インフルエンザＡ遺伝子配列を含む第二増幅産物およびインフルエンザＢ遺伝子配列を含む第二増幅産物が検出される、請求項２６に記載の方法。
  28. （ｉ）第一反応チャンバーであって、前記反応チャンバーにおけるサンプル流体に第一核酸増幅を実施して第一増幅産物を生成するように構成される第一反応チャンバー、および
    （ｉｉ）１つ以上の第二反応チャンバーであって、前記第一増幅産物に第二核酸増幅を実施して第二増幅産物を生成するように構成される各第二反応チャンバー
    を含む、カード本体、
    前記サンプル流体を前記第一反応チャンバーに供給するための通路、
    前記１つ以上の第二反応チャンバーと流体接続される１つ以上の検出チャンバー、ならびに
    各検出チャンバーと結合される検出モジュール
    を含む、診断カード。
  29. 前記検出モジュールが光学的モジュールである、請求項２８に記載の診断カード。
  30. 前記検出モジュールが蛍光検出器である、請求項２８に記載の診断カード。
  31. 前記蛍光検出器が、照明光を前記１つ以上の検出チャンバーに向ける単一光パイプ、および各検出チャンバーから反射した光を受容する個別光パイプを含む、請求項３０に記載の診断カード。
  32. 前記検出モジュールが電極モジュールである、請求項２８に記載の診断カード。
  33. 前記検出モジュールが、各検出チャンバー用の電極で終結する一連の伝導路を含む、請求項３２に記載の診断カード。
  34. 前記デバイスが追加の伝導路および電極を含んでマイクロ流体カード全体を通して液体の位置を検出する、請求項３２に記載の診断カード。
  35. 前記増幅がリコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）反応を含む、請求項２８に記載の診断カード。
  36. 混合手段、ポンプ、およびサンプルモジュールに接続するための接続ポートをさらに含む、請求項２８に記載の診断カード。
  37. 前記第一反応チャンバーがヒーターと結合される、請求項２８に記載の診断カード。
  38. 前記第一反応チャンバーが混合手段を含む、または混合手段と結合される、請求項２８に記載の診断カード。
  39. 各第二反応チャンバーが試薬を含む、請求項２８に記載の診断カード。
  40. 前記試薬がＲＰＡ試薬を含む、請求項３９に記載の診断カード。
  41. 前記ＲＰＡ試薬が凍結乾燥されている、請求項４０に記載の診断カード。
  42. 前記第一反応チャンバーが試薬を含む、請求項２８に記載の診断カード。
  43. 前記試薬がＲＰＡ試薬を含む、請求項４２に記載の診断カード。
  44. 前記ＲＰＡ試薬が凍結乾燥されている、請求項４３に記載の診断カード。
  45. 前記サンプル流体が動物から得られるサンプルである、請求項２８に記載の診断カード。
  46. 動物から得られる前記サンプルが、前記動物の血液、喀痰、粘液、唾液、涙、または尿から得られる、請求項４５に記載の診断カード。
  47. 前記サンプル流体がヒトから得られるサンプルである、請求項４５に記載の診断カード。
  48. 前記サンプル流体が標的核酸を含む、請求項２８に記載の診断カード。
  49. 前記標的核酸が動物病原体から得られる、請求項４８に記載の診断カード。
  50. 前記動物病原体が、一本鎖ＤＮＡウイルス、二本鎖ＤＮＡウイルス、または一本鎖ＲＮＡウイルスである、請求項４９に記載の診断カード。
  51. 前記動物病原体が細菌である、請求項４９に記載の診断カード。
  52. 前記標的核酸が二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、またはＲＮＡである、請求項４８に記載の診断カード。
  53. 前記標的核酸が、ゲノムＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成二本鎖ＤＮＡ、および合成一本鎖ＤＮＡからなる群から選択される、請求項４８に記載の診断カード。
  54. 前記標的核酸がウイルスＤＮＡまたはウイルスＲＮＡである、請求項４８に記載の診断カード。
  55. 前記動物病原体が、インフルエンザＡウイルスまたはインフルエンザＢウイルスである、請求項４９に記載の診断カード。
  56. 前記第二増幅産物が、前記サンプル流体の前記診断カードへの送達後、３０分以内、１５分以内、１０分以内、または５分以内で産生される、請求項２８に記載の診断カード。
  57. 前記診断カードが使い捨てである、請求項２８に記載の診断カード。
  58. さらに追加の反応チャンバーを含み、それぞれが核酸増幅反応の追加のラウンドを実施して追加の増幅産物を生成し、これによって増幅の各連続したｎ＋１ラウンドから得られる前記増幅産物は、前ｎ回目ラウンドの前記増幅産物内に完全に含まれる、より小さい配列である、請求項２８に記載の診断カード。
  59. 請求項２８に記載の診断カードを受容するように構成されるリーダーであって、前記リーダーが前記第二反応チャンバーにおける前記第二増幅産物の存在を検出するように構成される検出器を含む、リーダー。
  60. 第一流入口および第一流出口と流体接続される第一反応チャンバー、
    第二流入口および第二流出口と流体接続される第二反応チャンバー、
    検出チャンバー、
    第一ポンプ、ここで前記第一流入口が前記第一ポンプを介して前記第一反応チャンバーと流体接続され、前記第一流出口が第一反応チャンバーと流体接続され、
    第二ポンプ、ここで前記第一反応チャンバーが前記第二ポンプを介して前記第二反応チャンバーと流体接続され、前記第二流出口が前記第二反応チャンバーと流体接続され、
    第三ポンプ、ここで前記第二流入口は前記第三ポンプを介して前記第二反応チャンバーと流体接続される、
    を含む、核酸増幅デバイス。
  61. 前記核酸増幅デバイスがマイクロ流体デバイスである、請求項６０に記載の核酸増幅デバイス。
  62. 前記第一反応チャンバーが試薬を含む、請求項６０に記載の核酸増幅デバイス。
  63. 前記第一反応チャンバーが触媒を含む、請求項６２に記載の核酸増幅デバイス。
  64. 前記触媒がマグネシウムを含む、請求項６３に記載の核酸増幅デバイス。
  65. 試薬リサーバをさらに含み、前記第二ポンプおよび前記第三ポンプが第一試薬リサーバを介して各第二反応チャンバーと流体接続される、請求項６０に記載の核酸増幅デバイス。
  66. 前記第二ポンプおよび前記第三ポンプが第一試薬リサーバおよび第二試薬リサーバを介して各第二反応チャンバーと流体接続される、請求項６０に記載の核酸増幅デバイス。
  67. 前記第一試薬リサーバおよび前記第二試薬リサーバが直列である、請求項６６に記載の核酸増幅デバイス。
  68. 前記第一試薬リサーバがオリゴマーを含む、請求項６７に記載の核酸増幅デバイス。
  69. 前記第二試薬リサーバがマグネシウムを含む、請求項６７に記載の核酸増幅デバイス。
  70. 各第二反応チャンバーが検出チャンバーである、請求項６６に記載の核酸増幅デバイス。
  71. 各検出チャンバーの一部が光学的に透明である、請求項７０に記載の核酸増幅デバイス。
  72. 各検出チャンバーと接続される電極をさらに含む、請求項７０に記載の核酸増幅デバイス。
  73. ３つの電極が各検出チャンバーに接続される、請求項７２に記載の核酸増幅デバイス。
  74. 流体検出領域をさらに含む、請求項６０に記載の核酸増幅デバイス。
  75. 前記第一ポンプおよび前記第一反応チャンバーが第一検出領域を介して接続される、請求項７４に記載の核酸増幅デバイス。
  76. 前記第二ポンプおよび前記第二反応チャンバーが第二検出領域を介して接続される、請求項７４に記載の核酸増幅デバイス。
  77. 前記第三ポンプおよび前記第二反応チャンバーが第三検出領域を介して接続される、請求項７４に記載の核酸増幅デバイス。
  78. 前記第三ポンプおよび前記第一反応チャンバーが第四検出領域を介して接続される、請求項７４に記載の核酸増幅デバイス。
  79. 各検出領域の一部が光学的に透明である、請求項７４に記載の核酸増幅デバイス。
  80. 各検出領域と接続されるフロー検出チャンバーをさらに含む、請求項７４に記載の核酸増幅デバイス。
  81. 前記第一反応チャンバーと接続されるヒーターをさらに含む、請求項６０に記載の核酸増幅デバイス。
  82. 前記第一反応チャンバーがスターラーを含む、請求項６０に記載の核酸増幅デバイス。
  83. 前記第一ポンプが、前記核酸増幅デバイスに送達されるサンプルを、前記第一流入口を介して前記第一反応チャンバーに供給するように構成される、請求項６０に記載の核酸増幅デバイス。
  84. 前記第二および第三ポンプが、前記第二流入口を介して核酸増幅デバイス本体に送達される試薬を、前記第一反応チャンバーからの産物と混合して反応物混合を生じるように構成される、請求項６０に記載の核酸増幅デバイス。
  85. 前記第二および第三ポンプが、前記反応物混合の一部を前記第二反応チャンバーのそれぞれに供給するように構成される、請求項８４に記載の核酸増幅デバイス。
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