JP2019508468A - 新規の多糖体−タンパク質コンジュゲート及びそれを得る方法 - Google Patents

Abstract

本発明は新規の多糖体−タンパク質コンジュゲート及びそれを得る方法に関する。さらに詳しくは、本発明は、一価のワクチンまたは多価の混合ワクチンと同様に診断ツールの作製に使用することができるカルバメート化学を用いて製造される多糖体−タンパク質コンジュゲートに関する。さらに具体的には、本発明は、カルバメート化学を用いた髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）の血清型Ｘ、Ａ、Ｃ、Ｙ及びＷ１３５の多糖体−キャリアタンパク質コンジュゲート及びそれを得る方法に関する。
【選択図】なし

Description

本発明は新規の多糖体−タンパク質コンジュゲート及びそれを得る方法に関する。さらに詳しくは、本発明は、一価のワクチンまたは多価の混合ワクチンと同様に診断ツールの作製に使用することができるカルバメート化学を用いて作製される多糖体−タンパク質コンジュゲートに関する。さらに具体的には、本発明はカルバメート化学を用いたＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ（髄膜炎菌）の血清型Ｘ、Ａ、Ｃ、Ｙ及びＷ１３５の多糖体−キャリアタンパク質のコンジュゲート及びそれを得る方法に関する。

Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ（髄膜炎菌）は、主として１３の血清型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、２９Ｅ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｗ１３５、Ｘ、Ｙ及びＺに血清学上分類される好気性のグラム陰性細菌である。型判定方式は生物における莢膜多糖体（capsular polysaccharide）に基づく。ＷＨＯの公式ウェブサイトは、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）が世界で細菌性髄膜炎の最も一般的な原因の１つであり、髄膜炎の大きな流行を生成することができる唯一の細菌であることに言及している。１００，０００人の住民当たり１０００症例の発生率での爆発的に広まる流行病が、特にサハラ以南のアフリカで報告されている。

Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓは患者または健常なヒトキャリアの呼吸分泌物とのエアロゾル接触または直接接触を介して伝染する。その結果、この流行性疾患は、３〜１２ヵ月齢の乳児での発病率を最高に、主として小児及び思春期に発生する一方、流行には、年長児や若者がさらに含まれることもある。しかしながら、髄膜炎菌性疾患の迅速な進行は発症後１〜２日以内に死に至ることが多い。Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの感染はワクチン接種によって防ぐことができる。

Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（インフルエンザ菌）ｂ型は主として小児で髄膜炎及び急性呼吸器感染を引き起こすグラム陰性細菌である。ＷＨＯの公式ウェブサイトは、先進国及び開発途上国の双方で、それは年少児における非流行性髄膜炎の重要な原因であり、抗生剤を即座に与えたとしても重度の神経学的後遺症に関連することが多いことに言及している。

Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅの感染は感染した（しかし、必ずしも症候性ではない）人々の飛沫によって伝染する。Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（インフルエンザ菌）ｂ型はワクチン接種によって防ぐことができる。

髄膜炎菌性疾患の大半は、６つの血清型、すなわち、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｙ、Ｗ１３５及びＸが原因で生じる。歴史的には、髄膜炎ベルトにおける症例の大半は血清型Ａの髄膜炎菌が原因で生じている。血清型Ｃの髄膜炎菌は１９８０年代の髄膜炎ベルトにおける大流行に関与したが、新しい大流行は２０１５年ニジェールでも経験した一方で、血清型Ｗ（以前のＷ−１３５）は２０００年以来流行性髄膜炎の原因として出現している。血清型Ｙの流行はアフリカでは最小であるが、その血清型は南アメリカにおける髄膜炎症例ではより顕著である。ＮＣＢＩの出版物の１つによれば、血清型Ｘの髄膜炎菌は散発的な髄膜炎の稀な原因と以前見なされてきたが、２００６〜２０１０年の間に、血清型Ｘの髄膜炎の大流行がニジェール、ウガンダ、ケニヤ、トーゴ及びブルキナファソで発生し、後者では報告された６７３２症例のうち少なくとも１３００症例が血清型Ｘの髄膜炎だった。

別のＮＣＢＩの出版物によれば、トーゴでは２００６〜２００９年の間に血清型Ｘの髄膜炎菌は７０２の確認された細菌性髄膜炎症例の１６％を占めた。Ｋｏｚａｈ地方は、３３／１００，０００の血清型Ｘの髄膜炎菌の季節的な累積発生率を伴った２００７年３月の血清型Ｘの髄膜炎菌の大流行を経験した。ブルキナファソでは２００７〜２０１０年の間に血清型Ｘの髄膜炎菌は７７８の確認された細菌性髄膜炎症例の７％を占め、２００９年から２０１０年まで増加した（それぞれ確認された症例の４％から３５％に）。２０１０年、血清型Ｘの髄膜炎菌性の流行病はブルキナファソの北部と中央部の領域で発生し、血清型Ｘの髄膜炎菌の地域での最高の累積発生率は３月から４月の間で１３０／１００，０００と推定された。

上記の事実に基づいて、５価のＡＣＹＷＸ多糖体−タンパク質コンジュゲートワクチンは血清型Ｂを除いて髄膜炎菌性疾患に対するさらに広い適用範囲を提供することができた。免疫が髄膜炎菌性疾患を制御する唯一の理に適ったアプローチである。現在、血清型Ａ、Ｃ、Ｙ及びＷ１３５の多糖体コンジュゲートを含む種々の一価または多価のワクチンが市場で販売のためにライセンスが与えられているが、血清型Ｘの髄膜炎菌に対してはライセンスを与えられたワクチンはない。血清型Ｘの多糖体−タンパク質コンジュゲートは、公衆衛生のニーズがある場合に備えた多価の髄膜炎菌コンジュゲートワクチンの開発への新しい追加となるであろう。

幾つかの研究は、糖部分のサイズがコンジュゲートワクチンの免疫原性に影響を与え得ることを示唆している。デキストラン−タンパク質コンジュゲートの免疫原性に関する当初の研究によって、ニワトリ血清アルブミンにコンジュゲートした低分子量のデキストランはマウスにて強い抗デキストラン反応を誘導する一方で、デキストランのサイズを増すことは免疫原性の低下を生じることが見いだされた。Ｌａｆｅｒｒｉｅｒｅらは、マウスにおける肺炎球菌コンジュゲートワクチンの免疫原性に対して炭水化物鎖の長さはほとんど影響しないことを見いだした。これらの研究は多糖体の鎖長とコンジュゲートワクチンの免疫原性との間では明瞭な相関がないことを示唆している。しかしながら、Ｒａｎａらは、免疫原性のＨｉｂ多糖体コンジュゲートワクチンを開発するために最適な糖鎖長を立証することは重要であることを見いだした。

多糖体のＣＤＩとの反応は幾つかの参考文献で示されている。特に好適な試薬であるカルボニルジイミダゾールは、ヒドロキシル基と反応して多糖体のイミダゾリルウレタンを形成し、また、たとえば、クロロギ酸ニトロフェニルを含むクロロギ酸アリールと反応して多糖体の混合炭酸塩を作り出す。それぞれの場合、得られる活性化多糖体はアミンのような求核試薬に非常に感受性であり、それによってそれぞれウレタンに変換される。

結合化学については、多糖体構造は非常に重要な役割を担う。多糖体をキャリアタンパク質にコンジュゲートするための選択の化学的性質はその多糖体で利用できる官能基に左右される。一部の多糖体が結合に好都合に利用できる化学基、たとえば、アミン、カルボキシルまたはアルデヒドを含有する一方で、多数のものはそれらがタンパク質に結合され得る前に活性化または誘導体化を必要とする。文献で明らかなように、多糖体−タンパク質コンジュゲートワクチンはリンカーの有無にかかわらず作製することができ、その際、リンカーは多糖体の一部であることができ、またはキャリアタンパク質に連結することができる。

たとえば、キャリアタンパク質にコンジュゲートしたＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅの血清型Ｂ（Ｈｉｂ）、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの血清型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｗ、Ｙから得られたサッカライド断片を含む免疫原性組成物を開示している米国特許出願番号ＵＳ２０１５／００４４２５３のような既存の先端技術は、Ｎ.ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの血清型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｗ及びＹを含む種々の血清型の治療のためのワクチンを開示している。しかしながら、ＵＳ２０１５／００４４２５３では、カルバメートリンカーがキャリアタンパク質のアミノ基に直接連結され、低いコンジュゲート効率を生じている。

ＷＯ２００４／０１９９９２も、修飾した莢膜サッカライドと、還元性アミノ化によって得られたＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの血清型Ａについてのサッカライドタンパク質コンジュゲートとを開示しているが、その出願は血清型Ａしか話題にしていない。

たとえば、還元性アミノ化の結合化学によって得られるＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの血清型Ｘのコンジュゲートを開示しているＷＯ２０１３／１７４８３２のように、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの血清型Ｘで利用できる開示はわずかしかない。

既存の先端技術における主要な欠点は、カルバメート化学を用いたいずれの従来技術も、多糖体を有機溶媒に溶解してコンジュゲート過程を促す点を開示していないことである。現在利用できるコンジュゲートは安定性の課題に悩まされている。さらに具体的には、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの血清型Ｘについての安定で且つ商業的に実現可能なコンジュゲートはない。

発明の目的
既存の先端技術における欠点を取り除くために、本発明の主な目的は、新規の多糖体−タンパク質コンジュゲートを提供することである。

本発明の別の目的は、新規のコンジュゲートワクチンを調製するのに使用することができる安定な多糖体−タンパク質コンジュゲートを提供することである。

本発明のさらに別の目的は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの血清型Ｘの多糖体−キャリアタンパク質コンジュゲートを提供して現在ライセンスを与えられているワクチンによって防がれる髄膜炎菌性疾患の発生のさらに広い適用範囲を拡大することである。

本発明のさらに別の目的は、前記新規の多糖体−タンパク質コンジュゲートを得る方法を提供することである。

本発明のさらに別の目的は、カルバメート化学を用いて前記新規の多糖体−タンパク質コンジュゲートを得る方法を提供することである。
本発明のさらに別の目的は、非水性非プロトン性溶媒における多糖体の迅速な可溶化の方法を提供することである。

本発明のさらに別の目的は、広いｐＨ範囲で結合反応を実施することである。

本発明のさらに別の目的は、高い収率で非常に短い期間にて結合過程を完了することである。

本発明のさらに別の目的は、ワクチンにて及び診断ツールとして使用することができる高い免疫原性を持つ新規の多糖体−タンパク質コンジュゲートを得ることである。

発明の要約
従って、本発明は新規の多糖体（ＰＳ）−タンパク質コンジュゲート及びそれを得る方法を提供する。さらに詳しくは、本発明は、新規のコンジュゲートワクチンの調製のためにカルバメート化学によって多糖体−タンパク質コンジュゲートを得ることに関する。さらに具体的には、本発明は、カルバメート化学を用いたＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの血清型Ｘ、Ａ、Ｃ、Ｙ及びＷ１３５の多糖体−タンパク質コンジュゲート及びそれを得る方法に関する。

本発明は、莢膜多糖体をキャリアタンパク質との結合に適切な小さなサイズに分解してさらに高い抗原性を持つコンジュゲートを得る結合の方法に関する。

キャリアタンパク質は、ＴＴ（破傷風トキソイド）、ＤＴ（ジフテリアトキソイド）、ＣＲＭ１９７（ＤＴの非毒性変異体）、ＯＭＰＶ（外膜タンパク質小胞）または他の適切なキャリアタンパク質から選択される。多糖体断片は、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ｂ型（Ｈｉｂ）、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ（Ｍｅｎ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（肺炎レンサ球菌）を含むが、これらに限定されないグラム陰性細菌の群から得られる。

Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ莢膜多糖体の結合の方法、さらに好ましくは、Ｍｅｎ Ａ、Ｃ、Ｙ、ＷまたはＸの莢膜多糖体は分解される。そのような分解は従来技術で利用できる幾つかの技法を用いて実施される。さらに好ましくは、分解は、実験室規模ではプローブ音波処理及び／または超音波処理によって、及び大規模ではマイクロ流動化によって実施される。ネイティブのＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ莢膜多糖体は、高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）にてゲル浸透クロマトグラフィ（ＧＰＣ）によって決定されるような０．３８＋０．０６ｋＤの分配係数のサイズ範囲で分解される。

分解工程の後、前記分解された多糖体は対イオン交換のために、ハロゲン化リチウム、塩化リチウム及び四級アンモニウムハロゲン化水和物を含むが、これらに限定されない強力な電解質塩に溶解される。溶液は６０±３０分間適正な混合を許容される。回転蒸発のような任意の乾燥法によって、得られた莢膜多糖体から水分を取り除く。乾燥させた莢膜多糖体を次いで、無水ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、Ｎ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）またはジメチルアセトアミドを含むが、これらに限定されない非水性非プロトン性溶媒に溶解する。非水性非プロトン性溶媒中の前記分解し、乾燥させた莢膜多糖体を、Ｎ，Ｎ’−カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）、Ｎ，Ｎ’−ジ−スクシンイミジルカーボネート（ＤＳＣ）またはＮ，Ｎ’−ジ−スクシンイミジルオキサレート（ＤＳＯ）を含むが、これらに限定されない、５〜５０モル過剰濃度の水分を含まない活性化剤と反応させ、混合物を４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）またはピリジンの存在下で所定の時間保持して反応を完了させる。

得られた活性化された莢膜多糖体を、酢酸エチル、ジクロロメタン、酢酸ｎ−ブチルを含むが、これらに限定されない過剰の低極性溶媒または異なる比率でのそれらの混合物にて多糖体を沈殿させることによって精製し、その後、沈殿させた多糖体を水性緩衝化生理食塩水に溶解して精製した活性化莢膜多糖体を得る。

そのように得られた精製した活性化莢膜多糖体を活性化キャリアタンパク質と共に水性緩衝液に溶解する。活性化されたキャリアタンパク質はカルボヒドラジド標識されてもよく、またはＡＤＨ標識されてもよく、またはヒドラジン標識されてもよい。

精製した活性化莢膜多糖体と活性化キャリアタンパク質の溶液を室温にて所定の時間、好ましくは１５±５時間、前記多糖体がＣＤＩで活性化されるか、ＤＳＣで活性化されるか、またはＤＳＯで活性化されるかに応じて様々なｐＨ範囲にて混合するのを可能にする。ＣＤＩで活性化された多糖体についてのｐＨ範囲は８〜１０である一方で、ＤＳＣで活性化されたまたはＤＳＯで活性化された多糖体についてのｐＨ範囲は６〜９である。この反応の間に、タンパク質におけるヒドラジド部分のアミンと活性化多糖体におけるカルバメート部分またはカーボネート部分の−Ｎ−含有芳香族残基が反応して、安定なカルバメート結合−Ｏ−（Ｃ＝Ｏ）−Ｎ−を持つ多糖体−タンパク質コンジュゲートの形成を生じる。従って、式ＰＳ−Ｌ１−Ｌ２−ＣＲを持つ最終的なコンジュゲートが作製され、式中、ＰＳは多糖体であり、Ｌ１はカルバメート結合であり、Ｌ２はヒドラジド結合であり、ＣＲはキャリアタンパク質である。精製されたコンジュゲートは、限外濾過、硫酸アンモニウム沈殿、ゲル浸透クロマトグラフィを含むが、これらに限定されない精製法によって得られる。本発明は、一方のリンカー、好ましくはカルバメートの多糖体への連結及びもう１つのリンカー、好ましくはヒドラジドのキャリアタンパク質への連結、その後の、コンジュゲートを生成するための別々のリンカーを有する活性化多糖体と活性化タンパク質との反応も開示する。

結合の改善された本方法は、短時間で完了し、広い作用範囲のｐＨにてさらに安定な共有結合のコンジュゲートを得る。本発明の新規の多糖体−タンパク質コンジュゲートはさらなる安定性、高い収率及び高い免疫原性を示す。

本発明はまた、多糖体とカルバメート形成剤との間の結合反応を促し、結合過程を短時間で完了させる非水性非プロトン性溶媒への多糖体の溶解の方法も開示する。

本発明の改善された方法の最も重大な成果は、ワクチンにて及び診断ツールとして使用することができる新規の多糖体−タンパク質コンジュゲートを提供することである。前記新規の多糖体−タンパク質コンジュゲートは特異的で且つ同種の免疫応答を引き出すので、一価のワクチンまたは多価の混合ワクチンの作製に、ならびに診断ツールとして有用である。

ＥＤＣ（カルボジイミド）の架橋反応のスキーム（Ｒ−ＮＨ_２はヒドラジン（Ｈ_２Ｎ−ＮＨ_２）またはアジピン酸ジヒドラジド（ＡＤＨ）（ＮＨ_２ＮＨＣＯ（ＣＨ_２）_４ＣＯＮＨＮＨ_２のいずれかである）を示す図である。 ＭｅｎＸ莢膜多糖体の化学構造の単量体単位を示す図である。 空隙容量、総容量及び試料溶出容量を示す１ｍｌ／分の流速でのＴＳＫゲルＰＷＸＬ５０００−ＰＷＸＬ４０００カラムにおける溶出容量を示すＨＰＬＣ−ＳＥＣのプロファイルを示す図である。 ネイティブのＭｅｎＸ多糖体のサイズで分けた多糖体とのＨＰＬＣ−ＳＥＣプロファイルの比較を示す図である。 ヒドラジンで誘導体化したＴＴのネイティブＴＴとのＨＰＬＣ−ＳＥＣプロファイルの比較を示す図である。 セファデックスＧ２５におけるヒドラジンで誘導体化したＴＴの精製を示すクロマト図である。 完全なカルバメート結合のスキームを示す図である。 ヒドラジンで誘導体化したＴＴの粗精製のＭｅｎＸコンジュゲートとのＨＰＬＣ−ＳＥＣプロファイルの比較を示す図である。

本発明は新規の多糖体−タンパク質コンジュゲート及びそれを得る方法を提供する。さらに詳しくは、本発明は、カルバメート化学によって化学的に安定な多糖体−タンパク質コンジュゲートを得ることに関する。多糖体断片は、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ｂ型（Ｈｉｂ）、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ（Ｍｅｎ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（肺炎レンサ球菌）を含むが、これらに限定されないグラム陰性細菌の群から、さらに好ましくはＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ ＭｅｎＡ、Ｃ、Ｙ、Ｗ、及び好ましくはＭｅｎＸから得られる。本発明はまた、個々にもしくは組み合わせでワクチンにてまたは診断ツールとして使用することができる新規の多糖体−タンパク質を得ることにも関する。

本発明はまた、キャリアタンパク質との結合に適切な小さなサイズに前記莢膜多糖体を分解して高い抗原性を持つコンジュゲートを得る結合の方法にも関する。

本発明は、ヒドロキシル基の活性化のためにＣＤＩを用い、カルバメート化学によって多糖体−タンパク質コンジュゲートを形成する結合の方法を提供する。

キャリアタンパク質は、ＴＴ（破傷風トキソイド）、ＤＴ（ジフテリアトキソイド）、ＣＲＭ１９７（ＤＴの非毒性変異体）、ＯＭＰＶ（外膜タンパク質小胞）または他の適切なキャリアタンパク質から選択される。

前記莢膜多糖体は従来技術で利用できる幾つかの技法を用いて分解される。さらに好ましくは、分解は、実験室規模ではプローブの音波処理及び／または超音波処理によって、及び大規模ではマイクロ流動化によって実施される。ネイティブのＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの莢膜多糖体は、０．３８＋０．０６ｋＤの分配係数のサイズ範囲に分解される。多糖体のサイズは高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）にてゲル浸透クロマトグラフィ（ＧＰＣ）によって決定される。

分解工程の後、前記分解された多糖体は対イオン交換のために、ハロゲン化リチウム、塩化リチウム及びハロゲン化四級アンモニウム水和物を含むが、これらに限定されない強力な電解質塩に溶解される。溶液を６０±３０分間適正に混合させる。回転蒸発のような任意の乾燥法によって水分を得られた莢膜多糖体から取り除く。乾燥させた莢膜多糖体を次いで、無水ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、Ｎ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）またはジメチルアセトアミドを含むが、これらに限定されない非水性非プロトン性溶媒に溶解する。非水性非プロトン性溶媒中の前記分解し、乾燥させた莢膜多糖体を、Ｎ，Ｎ’−カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）、Ｎ，Ｎ’−ジ−スクシンイミジルカーボネート（ＤＳＣ）またはＮ，Ｎ’−ジ−スクシンイミジルオキサレート（ＤＳＯ）を含むが、これらに限定されない、５〜５０モル過剰濃度の水分を含まない活性化剤と反応させ、混合物を４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）またはピリジンの存在下で所定の時間保持して反応を完了させる。Ｍｅｎ ＰＳはその反復単位の中に遊離のヒドロキシル基を有し、それは、カルボニル−ジイミダゾール（ＣＤＩ）と反応させると中間体カルバミン酸イミダゾリルとイミダゾール副産物を形成する。

得られた活性化された莢膜多糖体を、酢酸エチル、ジクロロメタン、酢酸ｎ−ブチルまたは様々な比率でのそれらの混合物を含むが、これらに限定されない過剰の極性の低い溶媒にて多糖体を沈殿させることによって精製し、その後、沈殿させた多糖体を水性緩衝化生理食塩水に溶解して精製した活性化莢膜多糖体を得る。

ヒドラジンまたはＡＤＨの存在下でキャリアタンパク質を水溶性のカルボジイミドＥＤＣ（Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ−エチルカルボジイミド塩酸塩）と反応させて伸長する末端ヒドラジド基を伴った安定なイミド結合を得る。ＥＤＣは利用できるカルボン酸基と反応して中間体、高度に反応性のｏ−アシリソウレアを形成する。この活性のあるエステルはさらにヒドラジドのような求核試薬と反応して安定な最終生成物を得る（図１）。ＥＤＣの架橋配置（Ｒ−ＮＨ２）はヒドラジンまたはＡＤＨのいずれかである。

カルボニルはｐＨ５〜７でヒドラジド及びアミンと反応する。ＥＤＣの加水分解はカップリングの間での競合反応であり、温度、ｐＨ及び緩衝液の組成に左右される。４−モルフォリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）は有効なカルボジイミド反応緩衝液である。リン酸緩衝液はＥＤＣの反応効率を低下させるが、ＥＤＣの量を増やすことは低下した効率を補うことができる。トリス、グリシン及び酢酸塩の緩衝液は結合緩衝液として使用されなくてもよい。

ＴＴにおけるヒドラジド標識はＴＮＢＳアッセイによって判定され；タンパク質濃度はＬｏｗｒｙのアッセイによって決定される。誘導体化の程度は生成されるヒドラジドのモルをタンパク質のモルで割ることによって算出される。

そのように得られた精製した活性化莢膜多糖体を活性化キャリアタンパク質と共に水性緩衝液に溶解する。活性化キャリアタンパク質はカルボヒドラジド標識されてもよく、またはＡＤＨ標識されてもよく、またはヒドラジン標識されてもよい。

精製した活性化莢膜多糖体と活性化キャリアタンパク質の溶液を室温にて１５±５時間、前記多糖体がＣＤＩで活性化されるか、ＤＳＣで活性化されるか、またはＤＳＯで活性化されるかに応じて異なるｐＨ範囲にて混合することを可能にする。ＣＤＩで活性化された多糖体についてのｐＨ範囲は８〜１０である一方で、ＤＳＣで活性化されたまたはＤＳＯで活性化された多糖体についてのｐＨ範囲は６〜９である。この反応の間に、タンパク質におけるヒドラジド部分のアミンと活性化多糖体におけるカルバメート部分またはカーボネート部分の−Ｎ−含有芳香族残基とが反応し、安定なカルバメート結合−Ｏ−（Ｃ＝Ｏ）−Ｎ−を持つ多糖体−タンパク質コンジュゲートの形成を生じる。従って、式ＰＳ−Ｌ１−Ｌ２−ＣＲを持つ最終的なコンジュゲートが作製され、式中、ＰＳは多糖体であり、Ｌ１はカルバメート結合であり、Ｌ２はヒドラジド結合であり、ＣＲはキャリアタンパク質である。精製されたコンジュゲートは、限外濾過、硫酸アンモニウム沈殿、ゲル浸透クロマトグラフィを含むが、これらに限定されない精製法によって得られる。

カルバメート化学を用いて調製したコンジュゲートを調べて多糖体／タンパク質の比、コンジュゲートにおける遊離の多糖体の量、及び分子の大きさの分布を決定している。本発明では、種々の最適化実験を行って０．３０から１．０までに及ぶ範囲での多糖体／タンパク質の比及び３０±５％の平均で６０％までのコンジュゲートの収率を達成している。

好適な一実施形態では、細菌発酵に由来するＭｅｎ ＰＳを下流精製法によって精製し、精製後、重要な品質パラメータすべてについて分析する。Ｍｅｎ ＰＳの化学構造は遊離のヒドロキシル基（複数可）を伴った反復単位から成り、たとえば、ＭｅｎＸ ＰＳ（図２）はリン酸主鎖及び３位でのＮ−アセチル化を有する反復単位から成る。４位と７位のヒドロキシル基はＣＤＩのような化学的性質を誘導するカルバメートとの結合のための反応性官能基として作用する。単量体の反復単位は単糖類と呼ばれ、単糖類単位間での共有結合によって形成される長鎖は多糖体を構成する。単糖類の型は特定の血清型に特異的である（表１）。

ネイティブのＭｅｎ ＰＳはプルラン標準を用いたＨＰＬＣでのＳＥＣによって決定されるような０．３８＋０．０６ｋＤの分配係数のサイズ範囲を有する。本発明のカルバメート化学及び多糖体の構造は、単独でまたは組み合わせでワクチン候補として使用される安定な多糖体−タンパク質コンジュゲートの形成のために寄与する。

分解された多糖体の内容は物理化学的なアッセイ、たとえば、ＭｅｎＸ及びＭｅｎＡについてはリンアッセイによって決定されており、当初の多糖体の内容に類似することが見いだされている。

様々な実験を行って分配係数を最適化し、０．３８±０．０６ｋＤの最適範囲に到達している。当初の分子の大きさ及び個々の多糖体の構造に応じて異なるバッチについて変化する状態には可変条件を使用している。

好適な一実施形態では、ＭｅｎＸ多糖体をキャリアタンパク質との結合に適切な小さなサイズに分解して高い抗原性を持つコンジュゲートを得る。破傷風トキソイド（ＴＴ）がキャリアタンパク質として使用される。前記分解したＭｅｎＸ多糖体を塩化リチウムに溶解する。溶液を６０±３０分の持続時間の間、適正に混合させる。ロータリーエバポレーションのような既知の乾燥法によって水分は得られた莢膜多糖体から取り除かれる。次いで、分解し、乾燥させた莢膜多糖体を無水ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解する。非水性非プロトン性溶媒中の乾燥させた莢膜多糖体を５〜５０モル過剰、好ましくは３０モル過剰の濃度の活性化剤、Ｎ，Ｎ’−カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）と反応させ、混合物を２時間〜３時間の時間、混合のために保持し、反応を完了させる。反応混合物のｐＨは７〜１０、好ましくは９．０で維持する。得られた活性化ＭｅｎＸ多糖体は過剰の低極性溶媒、酢酸エチルにて多糖体を沈殿させることによって精製し、その後、沈殿した多糖体を水性緩衝化生理食塩水に溶解して精製した活性化莢膜多糖体を得る。

別の好適な実施形態では、リンカーはキャリアタンパク質に連結されるヒドラジンまたはその誘導体である。サイズで分けた活性のある多糖体と誘導体化したキャリアタンパク質を、ｐＨ７．０〜１０．０の緩衝液、好ましくは０．１Ｍの炭酸ナトリウム、０．１ＭのＮａＣｌ、ｐＨ９．０にて０．５：１〜１：０．５ｗ／ｗ、さらに好ましくは１：１ｗ／ｗの比率で混合する。この反応の間に、タンパク質におけるヒドラジド部分のアミンと活性化多糖体におけるカルバメート部分またはカーボネート部分の−Ｎ−含有の芳香族残基とが反応し、非常に安定なカルバメート結合−Ｏ−（Ｃ＝Ｏ）−Ｎ−を持つ多糖体−タンパク質コンジュゲートの形成を生じる。前記コンジュゲートは既知の技法によって精製され、合計の多糖体含量、タンパク質含量、遊離の多糖体、多糖体−タンパク質の比及びコンジュゲートの収率について分析される。精製したコンジュゲートを２〜８℃で保存する。

本発明のコンジュゲートは３７℃の高温条件にさらされた場合安定である。本発明のＭｅｎコンジュゲートは、血清殺菌アッセイ（ＳＢＡ）及びＥＬＩＳＡのような種々の免疫原アッセイによって明らかにされたように高い抗原性及び高い免疫原性を示す。

実施例１：ＭｅｎＸ多糖体のサイズ分け
２００ｍｇのＭｅｎＸ多糖体を１０ｍｇ／ｍｌの濃度で氷槽上のガラス製ビーカーに取った。２０％の振幅で３時間の時間、超音波破砕機を動かした。屈折率（ＲＩ）検出器を用いてＨＰ−ＧＰＣ（表２）で実行することによって分配係数（Ｋｄ）という点で分解した多糖体のサイズを決定した。一連のＴＳＫゲルＧ５０００ＰＷＸＬ＋Ｇ４０００ＰＷＸＬカラムにおける定組成方式でｐＨ７．２の０．１ＭのＮａＮＯ_３にて試料を溶出した。溶出容量を保持時間という点で測定した。それぞれ、カラムの空隙容量（Ｖｏ）は高分子量デキストランの注入の保持時間から算出し、カラムの総容量（Ｖｔ）はアジ化ナトリウム注入の保持時間によって決定した。Ｋｄは式Ｋｄ＝（Ｖｅ−Ｖｏ／Ｖｔ−Ｖｏ）から算出した。Ｖｅは試料の溶出容量の保持時間（ＲＴ）である（図３）。ＲＩ検出器を用いて記録されたデータが右に向かってピークのシフトを示すということは、ネイティブ多糖体の脱重合を示唆している（図４）。

実施例２：ＣＤＩによる多糖体の活性化
２００ｍｇのサイズ分けした多糖体とＬｉＣｌをＲＴにて１時間ゆっくり撹拌しながら混合し、その後、４０℃でのロータリーエバポレーターにて乾燥させた。次いで１５ｍｌの無水ＤＭＳＯに溶解し、２時間混合を保った。次いで３０×モルのカルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）を多糖体に加えた。トリエチルアミン（ＴＥＡ）を加えることによってｐＨを９．０に調整した。ゆっくりとした撹拌をＲＴで２時間行い、氷上で試料を冷却して反応を止めた。酢酸エチルを加え、上から上清を取り除いた。再び酢酸エチルを加え、上から上清を取り除いた。高真空で３０分間乾燥させた。

実施例３：ＴＴの活性化
５０ｋＤａの分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）遠心フィルターを用いて２５０ｍｇのＴＴを濃縮して最終的な１０ｍｌにした。ＴＴの重量の１０×と等量である、ストック５Ｍに由来するヒドラジン一水和物または２．５ｇのＡＤＨを、１０ｍｌの反応緩衝液、すなわち、０．２ＭのＮａＣｌを含有する０．１５ＭのＭＥＳ緩衝液ｐＨ５．７５に加え、上記ＴＴに加えた。この混合物に、１ｍｌの反応緩衝液中の等量のＥＤＡＣ（２５０ｍｇ）を加え、およそ３０ｍＭの最終濃度にした。反応混合物のｐＨを５．８５に調整し、反応混合物の最終容量を２５ｍｌに調整した。反応混合物におけるＴＴの濃度は１０ｍｇ／ｍｌであった。氷槽にて１．０時間反応混合物をゆっくりとした撹拌で保持した。誘導体化したＴＴをさらに精製し、活性化の程度及びＳＥＣ−ＨＰＬＣについて分析し、ピークのプロファイルをモニターした。ヒドラジンで活性化したＴＴのネイティブＴＴとのＨＰＬＣ−ＳＥＣプロファイルの比較を図５に示し、その際、試料は定組成方式でのクロマトグラフィカラムにかけ、データはＰＤＡ検出器を用いて記録されていた。

実施例４：活性化したＴＴの精製
精製は、方法及びＴＴ活性化において最も重要な工程の１つである。我々は未反応のヒドラジンまたはＡＤＨを可能な限り確かに取り除く必要がある。精製はセファデックスＧ２５脱塩法によって行われた。７５ｍＭのＮａＣｌを含有する５０ｍＭのリン酸緩衝液ｐＨ７．５に対してセファデックスＧ２５カラムにて反応混合物を脱塩し、誘導体化したタンパク質を精製した。７５ｍＭのＮａＣｌを含有する５０ｍＭのリン酸緩衝液ｐＨ７．５によってクロマトグラフィカラムを平衡化し、その後、試料を負荷し、１１０ｃｍ／時間で溶出した。各１０ｍｌの溶出した分画を回収し、ＵＶでの２８０ｎｍのピークに相当する分画（図６）をプールし、５０ｋＤａのＭＷＣＯ Ａｍｉｋｏｎ膜によって濃縮した。ＴＴを有する選択した分画をそのような容量に濃縮しておよそ３０〜５０ｍｇ／ｍｌのＴＴ濃度（脱塩後の活性化ＴＴのおよそ７５％の回収と見なす）を有していた。最終的な活性化ＴＴをＬｏｗｒｙアッセイによってタンパク質濃度について及びＴＮＢＳアッセイによってヒドラジン標識について分析した。双方の値をＴＴの活性化の程度（ＤＯＡ）の算出に使用した。ＰＷＸＬ５０００−ＰＷＸＬ４０００カラムを連続して用いた１ｍｇ／ｍｌの濃度でのＨＰＬＣに活性化ＴＴをかけてその完全性についてピークプロファイルをチェックした。
本発明の方法は、様々な活性化剤、好ましくはカルボニルジイミダゾールによって様々な多糖体、好ましくはＭｅｎＸ ＰＳのヒドロキシル基を活性化し、それをキャリアタンパク質に向かって反応性にして安定なＰＳ−ＴＴコンジュゲートを形成する（図７）。

実施例５：活性化ＭｅｎＸと誘導体化ＴＴの結合反応
ｐＨ９．０での０．１Ｍの炭酸ナトリウム、０．１ＭのＮａＣｌ緩衝液の溶液３ｍｌにおける活性化したＭｅｎＸ ＰＳに誘導体化したＴＴを直接加え、ｐＨ９．０を維持した。活性化した多糖体及び誘導体化したＴＴを結合反応のために１：１ｗ／ｗの比率で混合した。コンジュゲートの形成は３時間の時間のみで確認されるが、粗コンジュゲート混合物を室温で一晩混合し続けた。次いで、５〜１０モル過剰のグリシンのようなアミン含有試薬を使用することによって反応を止めた。

活性化ＴＴの保持時間の変化及びピークの左への移動を伴ったＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析によって結合の経過をモニターした。コンジュゲートのＨＰＬＣ−ＳＥＣプロファイルは結合反応が３〜４時間以内で最大に完了することを示している。ネイティブＴＴ及び活性化ＴＴ及びコンジュゲートのＨＰＬＣ−ＳＥＣプロファイルは、活性化の際、活性化ＴＴのサイズがネイティブＴＴから変化しないままであることを示すということは、凝集がほとんど発生しないまたは発生しないことを示唆している。定組成方式で０．１Ｍの硝酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７．２を用いた１．０ｍｌ／分の流速でのクロマトグラフィカラムで試料を流し、ＰＤＡ検出器を用いてデータを記録した。結合の後、高分子量のピークが誘導体化したＴＴの左に現れるということはＰＳ−ＴＴコンジュゲートの形成を示している（図８）。

実施例６：硫酸アンモニウム沈殿による粗コンジュゲートからの未反応（遊離の）の多糖体の除去
さらに、粗コンジュゲートをタンパク質沈殿法によって精製し、遊離のまたは未反応の多糖体を取り除いた。精製は、コンジュゲートが溶液の外に析出するまで反応混合物に固体の硫酸アンモニウムをゆっくり加えることによって実施した。５０００×ｇにて４５分間の遠心分離によって沈殿物を分離した。上清を捨て、１００ｍＭのＮａＣｌを含有する５０ｍＭのＭＥＳ緩衝液ｐＨ６．５の３０ｍｌに沈殿物を再溶解した。

実施例７：接線流濾過（ＴＦＦ）のよる多糖体−タンパク質コンジュゲートの精製
Ｐａｌｌの３００ｋＤａのＭＷＣＯカセットを用いて、硫酸アンモニウム精製後のコンジュゲート試料をさらに精製した。この工程はコンジュゲート由来のものがあれば遊離のタンパク質の除去を保証し、結合されたＰＳからさらに遊離のＰＳを分離することを保証する。コンジュゲートを２０×容量のＭＥＳ緩衝液ｐＨ６．５で透析濾過し、最終的に３５ｍｌの容量に濃縮した。

従って、結合過程全体の間で使用される残留試薬の除去は、４つの異なる工程、ＰＳについての第１：活性化ＰＳの沈殿工程のとき、キャリアタンパク質についての第２：ＧＰＳ精製工程、結合過程全体についての第３：硫酸アンモニウム沈殿による、及び第４：３００ｋＤａの透析濾過工程にて保証される。それはさらに最終的に０．２μのフィルターで濾過し、２〜８℃で保存した。

実施例８：ＭｅｎＸ−ＴＴコンジュゲートの特徴付け
ＭｅｎＸ−ＴＴコンジュゲートについてのリンアッセイによって多糖体の総含量について精製したコンジュゲートを分析した。タンパク質含量はＬｏｗｒｙアッセイによって決定された。遊離の多糖体はデオキシコール酸ナトリウム法によって沈殿させることによって決定し、各比色アッセイによって上清を分析した。それをさらに製剤化に使用する前に種々の残留物を測定する様々なアッセイを行った。精製したコンジュゲートを２〜８℃で保存した。

本発明のコンジュゲートは、種々の品質パラメータについて分析すると、０．３〜０．７（ｗ／ｗ）の範囲で多糖体／タンパク質の比を与えることが見いだされる。遊離の多糖体の量は様々なコンジュゲートで異なるが、全体にわたって遊離の多糖体は精製したコンジュゲートにて１０％未満であった。コンジュゲートの収率も様々なコンジュゲートについて１８％から４３％まで変化した。本発明では、種々のコンジュゲートの規模が２０ｍｇから２３０ｍｇまでで試した。

実施例９：カルバメート化学によって得られるＭｅｎＡ、Ｃ、Ｙ、Ｗコンジュゲートの特徴付け
ＭｅｎＸと同様の方法で、本発明を用いて血清型ＭｅｎＡ、Ｃ、Ｙ、及びＷのコンジュゲートを調製した。コンジュゲートはすべて種々の品質パラメータについて特徴付け、所望の結果（表４）を与えることが見いだされた。

実施例１０：ＭｅｎＸ−ＴＴコンジュゲートの安定性
本発明のコンジュゲートを３７℃の高温条件に２８日間さらす。試料を７、１４、２１及び２８日目に取り出し、生成された遊離の多糖体をモニターした。この実施形態にて定義されたカルバメート化学によって調製されたＭｅｎＸコンジュゲートの安定性は極度に安定なコンジュゲートを生成する方法の妥当性を証明した（表５）。

実施例１１：ＭｅｎＸコンジュゲートの免疫原性
１μｇの用量レベルでの生理食塩水で製剤化したＭｅｎＸをコンジュゲートしたＰＳ抗原の２つの異なるロット（表６）で０、１４及び２８日目に５〜９週齢の８匹のメスＢＡＬＢ／ｃマウスの群を免疫した。免疫はすべて皮下の経路を介して２００μｌのワクチン希釈物を投与することによって実施した。陰性対照群には生理食塩水のみを使用する。血清は２及び３回目の投与の後７〜１４日で採取した。特異的な抗ＰＳＩｇＧ抗原の力価は２及び３回目の投与の後ＥＬＩＳＡによって推定した。

２回の追加免疫の後、ＭｅｎＸコンジュゲートについての最大ＩｇＧ力価が達成された。ＭｅｎＸについては、３回目の投与の後、陰性対照に比べて力価値の上昇はＭｅｎＸコンジュゲートのロット１ではおよそ１００倍であり、ＭｅｎＸコンジュゲートのロット２では１５０倍であることが観察された（表６）。

実施例１２：ＭｅｎＸコンジュゲートについての血清殺菌アッセイ（ＳＢＡ）
マウスの群に属する血清試料のそれぞれから等しい容量を一緒にプールして血清殺菌アッセイによって調べるための群の血清プールを作った。アッセイは以下のように行う：単一コロニーの単離のためにヒツジ血液寒天プレート上でＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清型Ｘ標的株の画線を作り、３７℃にて５％ＣＯ_２と共に一晩インキュベートする。別のヒツジ血液寒天プレートの表面全体に細胞を広げることによって株を継代培養し、次いで新たな増殖のために３７℃にて５％ＣＯ_２と共にインキュベートする。細菌を約５ｍｌの殺菌アッセイ緩衝液に再浮遊させた。浮遊液のＯＤ_６５０をおよそ１×１０^５ｃｆｕ／ｍｌの相当するコロニー数に合わせた。血清を２倍連続希釈し、アッセイ緩衝液を対照ウェルに加える。細菌の作用溶液１０μｌをウェルごとに加えた。１０μｌの熱非働化（５６℃で３０分間保持する）補体を不活性の補体対照ウェルすべてに加え、前記非働化補体１０μｌを血清含有ウェル及び活性のある補体対照ウェルに加えた。プレートを振盪し、３７℃でプレートを１時間インキュベートした。

インキュベートの後、斜めの血液寒天プレート上で各ウェルからの１０μｌをスポットした。寒天プレートすべてを３７℃にて５％ＣＯ_２と共に一晩インキュベートした。プレートの各スポットにおけるコロニーの数を数えた。補体対照と比較したとき細菌の≧５０％殺傷を示す最高の血清希釈をその血清試料のＳＢＡ力価と見なした。
ＳＢＡのデータは３回投与の後の溶剤免疫からは無視できる応答を示すのに対して、試験のもとでのＭｅｎＸコンジュゲートの双方のロットが溶剤対照と比べて有意に高いＳＢＡ力価を示したということは、マウスモデルにて生体内で有効であるワクチンを示している（表７）。

Claims (26)

1. 高い免疫原性を持つ新規の多糖体−タンパク質コンジュゲートであって、
   前記多糖体−タンパク質コンジュゲートが
   インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ｔｙｐｅ ｂ（Ｈｉｂ））、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ（Ｍｅｎ））、肺炎レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）を含むが、これらに限定されないグラム陰性細菌から選択される群から得られる少なくとも１つの多糖体；
   少なくとも１つのキャリアタンパク質を含み、
   前記多糖体−タンパク質コンジュゲートは安定なカルバメート結合−Ｏ−（Ｃ＝Ｏ）−Ｎ−を有し、
   前記コンジュゲートの式はＰＳ−Ｌ１−Ｌ２−ＣＲであり、式中、ＰＳは多糖体であり、Ｌ１はカルバメート結合であり、Ｌ２はヒドラジド結合であり、ＣＲはキャリアタンパク質である、前記多糖体−タンパク質コンジュゲート。
2. 前記多糖体が好ましくは髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）の莢膜多糖体、さらに好ましくは血清型Ａ、Ｃ、Ｙ、ＷまたはＸの髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）の莢膜多糖体である請求項１に記載の新規の多糖体−タンパク質コンジュゲート。
3. 前記多糖体が、血清型Ｘの髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）の莢膜多糖体である請求項２に記載の新規の多糖体−タンパク質コンジュゲート。
4. 前記キャリアタンパク質が、ＴＴ（破傷風トキソイド）、ＤＴ（ジフテリアトキソイド）、ＣＲＭ１９７（ＤＴの非毒性変異体）、ＯＭＰＶ（外膜タンパク質小胞）から選択されるが、これらに限定されない請求項１に記載の新規の多糖体−タンパク質コンジュゲート。
5. 前記コンジュゲートが安定であり、且つ単独でまたは組み合わせでワクチン候補として使用することができる請求項１に記載の新規の多糖体−タンパク質コンジュゲート。
6. 前記コンジュゲートが室温で安定である請求項１に記載の新規の多糖体−タンパク質コンジュゲート。
7. 前記コンジュゲートが、３７℃で２８日間保存された場合、遊離の多糖体の増加量１０．５％未満を有する請求項１に記載の新規の多糖体−タンパク質コンジュゲート。
8. 前記コンジュゲートの前記高い免疫原性が、陰性対照との比較において３回の投与後の力価値で１００倍から１５０倍の上昇に及ぶ請求項１に記載の新規の多糖体−タンパク質コンジュゲート。
9. 前記コンジュゲートが、溶剤対照との比較において２回の投与の後３２倍から１２８倍、及び、３回の投与の後１１８倍から１９８倍に及ぶ血清殺菌アッセイの力価を示す請求項１に記載の新規の多糖体−タンパク質コンジュゲート。
10. 高い免疫原性を持つ新規の多糖体−タンパク質コンジュゲートを得る方法であって、
    前記方法が、
    （ａ）前記少なくとも１つの莢膜多糖体を最適なサイズ範囲に分解する工程と、
    （ｂ）工程（ａ）の前記分解された多糖体を強力な電解質塩に溶解し、得られた混合物を所定の時間、適正に混合させ、前記所定の時間が３０分から９０分までに及ぶ工程と、
    （ｃ）凍結乾燥、ロータリーエバポレーションまたは真空乾燥を含むが、これらに限定されない既知の技法によって、工程（ｂ）で得られた結果的な混合物から水分を取り除いて乾燥させた多糖体を得る工程と、
    （ｄ）工程（ｃ）の前記乾燥させた多糖体を少なくとも１つの非水性非プロトン性溶媒に溶解する工程と、
    （ｅ）工程（ｄ）の得られた溶液を所定の濃度の少なくとも１つの水分を含まない活性化剤と反応させる工程と、
    （ｆ）工程（ｅ）の得られた混合物を所定の時間保持して活性化された多糖体である少なくとも１つのリンカーを伴った多糖体を得ること、前記所定の時間は２時間から３時間までに及ぶ工程と、
    （ｇ）硫酸アンモニウム沈殿、透析濾過、サイズ排除クロマトグラフィ及び／またはそれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない既知の方法によって工程（ｆ）の前記活性化された多糖体を精製する工程と、
    （ｈ）工程（ｇ）の前記精製された活性化された多糖体を、少なくとも１つの組込みリンカーを有する少なくとも１つの活性化されたキャリアタンパク質と広い範囲のｐＨにて所定の時間反応させ、前記所定の時間が２時間から２０時間に及ぶ工程とを含む、前記方法。
11. 前記分解された多糖体の前記最適なサイズ範囲は０．３６＋０．０６ｋＤの分配係数の幅がある請求項１０に記載の新規の多糖体−タンパク質コンジュゲートを得る方法。
12. 前記非水性非プロトン性溶媒が、無水のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、Ｎ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）またはジメチルアセトアミドから選択されるが、これらに限定されない請求項１０に記載の新規の多糖体−タンパク質コンジュゲートを得る方法。
13. 前記少なくとも１つの水分を含まない活性化剤がＮ，Ｎ’−カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）、Ｎ，Ｎ’−ジ−スクシンイミジルカーボネート（ＤＳＣ）またはＮ，Ｎ’−ジ−スクシンイミジルオキサレート（ＤＳＯ）である請求項１０に記載の新規の多糖体−タンパク質コンジュゲートを得る方法。
14. 前記少なくとも１つの活性化されたキャリアタンパク質が、ＴＴ（破傷風トキソイド）、ＤＴ（ジフテリアトキソイド）、ＣＲＭ１９７（ＤＴの非毒性変異体）、ＯＭＰＶ（外膜タンパク質小胞）から選択されるが、これらに限定されない請求項１０に記載の新規の多糖体−タンパク質コンジュゲートを得る方法。
15. 少なくとも１つの水分を含まない活性化剤の前記所定の濃度が５〜５０モル過剰、好ましくは３０モル過剰に及ぶ請求項１０に記載の新規の多糖体−タンパク質コンジュゲートを得る方法。
16. 前記広いｐＨ範囲がｐＨ６〜ｐＨ１０である請求項１０に記載の新規の多糖体−タンパク質コンジュゲートを得る方法。
17. 前記多糖体−タンパク質コンジュゲートが安定なカルバメート結合−Ｏ−（Ｃ＝Ｏ）−Ｎ−を有する請求項１０に記載の新規の多糖体−タンパク質コンジュゲートを得る方法。
18. 前記方法が式ＰＳ−Ｌ１−Ｌ２−ＣＲのコンジュゲートを産出し、式中、ＰＳは多糖体であり、Ｌ１はカルバメート結合であり、Ｌ２はヒドラジド結合であり、ＣＲはキャリアタンパク質である請求項１０に記載の新規の多糖体−タンパク質コンジュゲートを得る方法。
19. 前記活性化された多糖体における前記少なくとも１つのリンカーがカルバメートである請求項１０に記載の新規の多糖体−タンパク質コンジュゲートを得る方法。
20. 前記活性化されたキャリアタンパク質における前記少なくとも１つのリンカーがヒドラジドである請求項１０に記載の新規の多糖体−タンパク質コンジュゲートを得る方法。
21. 前記分解され、且つ活性化された多糖体と前記活性化されたキャリアタンパク質が、ｐＨ７．０〜１０．０、好ましくはｐＨ９．０の緩衝液にて０．５：１から１：０．５ｗ／ｗに及ぶ比率、さらに好ましくは１：１ｗ／ｗの比率で混合される請求項１０に記載の新規の多糖体−タンパク質コンジュゲートを得る方法。
22. 前記緩衝液が、炭酸緩衝液、ホウ酸緩衝液から選択されるが、これらに限定されない請求項２１に記載の新規の多糖体−タンパク質コンジュゲートを得る方法。
23. 前記コンジュゲートにおける多糖体／タンパク質の比が０．３から１．０（ｗ／ｗ）までに及ぶ請求項１０に記載の新規の多糖体−タンパク質コンジュゲートを得る方法。
24. 前記コンジュゲートが精製コンジュゲートにて１０％未満の遊離の多糖体を有する請求項１０に記載の新規の多糖体−タンパク質コンジュゲートを得る方法。
25. 前記結合法によって得られるコンジュゲートの収率が６０％までである請求項１０に記載の新規の多糖体−タンパク質コンジュゲートを得る方法。
26. 前記結合法によって得られるコンジュゲートの平均収率が３０±５％である請求項１０に記載の新規の多糖体−タンパク質コンジュゲートを得る方法。