JP2019509014A - Ｃｄ３９血管アイソフォームターゲティング剤 - Google Patents

Ｃｄ３９血管アイソフォームターゲティング剤 Download PDF

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Abstract

本発明は、ＣＤ３９を阻害する抗原結合化合物に関する。本発明はまた、このような化合物を生成する細胞；このような化合物並びにその抗体、フラグメント、突然変異体、及び誘導体の作製方法；それを含む医薬組成物；疾患、例えば、癌を診断、治療又は予防するための化合物の使用方法にも関する。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１５年１１月２３日に提出された米国仮特許出願第６２／２５８，７０１号、２０１５年１２月７日に提出された米国仮特許出願第６２／２６３，７６０号、２０１５年１２月１５日に提出された米国仮特許出願第６２／２６７，３４３号、２０１６年４月１１日に提出された米国仮特許出願第６２／３２０，７３８号及び２０１６年１０月６日に提出された米国仮特許出願第６２／４０４，７７９号の利益を請求する。尚、これら出願は全て、全図面を含むその全内容を参照として本明細書に組み込むものとする。
配列表の参照
本出願は、電子フォーマットの配列表と一緒に提出されている。この配列表は、サイズが５５ＫＢの２０１６年１１月２１日に作成された「ＣＤ３９−１＿ＳＴ２５」という名称のファイルとして提供される。配列表の電子フォーマット中の情報は、参照として本明細書に組み込むものとする。
本発明は、ＣＤ３９を阻害する抗原結合化合物（例えば、抗体）に関する。本発明はまた、このような化合物を生成する細胞；このような化合物並びにその抗体、フラグメント、突然変異体、及び誘導体の作製方法；それを含む医薬組成物；疾患、例えば、癌を診断、治療又は予防するための化合物の使用方法にも関する。
８つの異なるＥＮＴＰＤ遺伝子が、ＮＴＰＤａｓｅタンパク質ファミリーのメンバーをコードする。個々のＮＴＰＤａｓｅサブタイプは、細胞位置及び機能的特性が異なる。血漿膜結合ヌクレオシド三リン酸ジホスホヒドロラーゼは、ヌクレオチドのｃ及びｂリン酸塩を加水分解することによって細胞表面のヌクレオチドレベルを制御する。
細胞外アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）及びアデノシン二リン酸（ＡＤＰ）を加水分解してアデノシンを産生するために、ＣＤ３９／ＥＮＴＰＤ１又は血管ＣＤ３９としても知られているＮＴＰＤａｓｅ１（エクトヌクレオシド三リン酸ジホスホヒドロラーゼ）が、別の酵素、ＣＤ７３（エクト−５‘−ヌクレオチダーゼ）と共に機能し、これはアデノシン受容体に結合し、Ｔ細胞及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞応答を阻害し、それによって免疫系を抑制する。ＣＤ７３／ＣＤ３９経路を介したアデノシンの産生は、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）免疫抑制機能の主要メカニズムとして認識されている。一部のヒト癌ではＣＤ３９＋Ｔｒｅｇの数が増加し、腫瘍増殖及び転移を促進する上でのＣＤ３９＋Ｔｒｅｇの重要性はいくつかのｉｎ ｖｉｖｏモデルを用いて示されてきた。しかしながら、ＣＤ３９も腫瘍細胞によって発現され、ＣＤ３９＋腫瘍細胞はアデノシン経路を介した免疫抑制を媒介し得る。癌細胞中のＣＤ３９はＡＴＰａｓｅ活性を示し、ＣＤ７３と共にアデノシンを産生する。ＣＤ７３＋ＣＤ３９＋癌細胞は、ＣＤ３９及びアデノシン依存的な方法で、ＣＤ４及びＣＤ８ Ｔ細胞の増殖並びに細胞毒性エフェクターＣＤ８ Ｔ細胞（ＣＴＬ）の産生を阻害した。ＣＤ３９抗体に結合し阻害する抗体は、特許文献１に開示されている。非特許文献１は、ＦｃγＲに結合し、エフェクター機能を有する抗ＣＤ３９を利用するが、これは遮断もしていると述べた。
治療標的としてのＣＤ３９への長年の関心にもかかわらず、最も有効な抗ＣＤ３９抗体の特性は依然として決定されていない。ＮＴＰＤａｓｅファミリーは、その発現及び基質選好が異なる少なくとも８つのメンバーを含む。特に、ＮＴＰＤａｓｅファミリーには、血管ＣＤ３９、ＣＤ３９Ｌ１（ＮＴＰＤａｓｅ２）、ＣＤ３９Ｌ２（ＮＴＰＤａｓｅ６）、ＣＤ３９Ｌ３（ＮＴＰＤａｓｅ３）及びＣＤ３９Ｌ４（ＮＴＰＤａｓｅ５）を含むいくつかのＣＤ３９アイソフォームが存在する。ＣＤ３９、ＣＤ３９−Ｌ１及びＣＤ３９−Ｌ３遺伝子は、そのカルボキシ及びアミノ末端に疎水性部分をコードして、ＣＤ３９酵素を細胞の表面に固定し、細胞外に酵素活性を配置する膜貫通ドメインとして働く。ＣＤ３９−Ｌ２及びＣＤ３９−Ｌ４遺伝子は、それらのアミノ末端に疎水性部分をコードし、分泌された可溶性形態での存在と一致する。例えば、非特許文献２を参照。ＣＤ３９は、一般に、とりわけ内皮細胞で発現される膜結合タンパク質である「血管」ＣＤ３９と呼ばれ、血液中のヌクレオチドの循環レベルを調節する役割を有すると当初記載されていた。ＣＤ３９Ｌ２及びＣＤ３９Ｌ４は膜結合型及び可溶性型の両方として存在し得るＣＤ３９の一種を表す。ＡＴＰに対するＡＤＰの加水分解の特異性は、これらのＬ２及びＬ４形態が、血栓症に至り得る過剰の血小板凝集を防止する役割を有する可能性のある調節因子として関連することが報告されている。膜結合アイソフォームＣＤ３９−Ｌ３は、インスリン分泌を調節することができる膵臓β細胞における主要なエクトヌクレオチダーゼであることが報告されている（非特許文献３）。
結果的に、実際にＣＤ３９を遮断しないか又は純粋な遮断剤ではない抗体の使用と組み合わせられた、白血球及び腫瘍細胞を含む異なる細胞型でのＣＤ３９発現は、抗体の基礎活性を評価するための複雑な設定を生み出す。
国際公開第２００９／０９５４７８号パンフレット
Ｈａｙｅｓ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ａｍ．Ｊ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｒｅｓ．７（６）：１１８１−１１８８ Ｙｅｕｎｇ ｅｔ ａｌ．、（２０００）Ｂｉｏｃｈｅｍ．３９：１２９１６−１２９２３ Ｓｙｅｄ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｅｎｄｏｃｒｉｎ．Ｍｅｔａｂｏｌ．３０５（１０）：Ｅ１３１９−１３２６
本発明者らは、腫瘍細胞を含む細胞表面に発現するヒトＣＤ３９上に存在するエピトープに結合し、細胞表面（膜結合）酵素を含む、ＣＤ３９酵素の酵素的（ＡＴＰａｓｅ活性）活性を強力に阻害し、さらにはＣＤ３９インターナライゼーションを実質的に誘発又は増加させる能力に依存しない、抗体を発見した。
ＣＤ３９はヒト組織内で広く発現されており、これは持続的な抗体媒介受容体飽和を維持することが困難であり得ることを示唆している。受容体インターナライゼーションの誘導を回避することによって、抗体は遊離ＣＤ３９の細胞表面への再循環を減少させ、細胞表面ＣＤ３９の飽和を維持するために必要な抗体の濃度を減少させる。それにより、本開示の抗体は、抗ＣＤ３９抗体がより低い頻度で、例えば、毎日未満、（例えば、静脈内投与によって）投与される、（例えば、癌、感染性疾患を有する個体の）治療方法を可能にする。例えば、抗体は、毎週約１回、２週間に１回、１ヶ月に１〜４回、１ヶ月に１〜２回、２ヶ月に１〜２回、又はそれより少ない頻度で（例えば、静脈内投与によって）投与することができる。
別の態様では、細胞表面（膜結合）酵素を含む、ＣＤ３９酵素の酵素的（ＡＴＰａｓｅ活性）活性を強力に阻害する抗体を同定するための、さらには受容体インターナライゼーションを誘導又は増加させる能力に依存しない、アッセイ法が提供される。
別の実施形態では、本発明者らは、抗体のＣＤ３９との共結晶構造を（Ｆａｂフラグメントとして）決定し、これにより、例えば細胞表面ＣＤ３９ポリペプチドのドメイン運動を阻害するために、抗体がＣＤ３９のＮ末端ドメイン及びＣＤ３９のＣ末端ドメインに結合することができる、抗体の作用機序の根底にある重要な構造的特徴を同定した。このような構造的特徴の開示は、ＣＤ３９阻害における機能性を維持しながら抗体の改変を可能にする。
また、さらなる実施形態において、主要な構造的特徴が複数の芳香族アミノ酸残基を含むＶＨＣＤＲ３を含む抗ＣＤ３９抗体が提供される。
また、さらなる実施形態において、抗体はＶＨ及びＶＬを含み、ＶＨは、ＶＬの残基と相互作用することができる少なくとも１つの第１芳香族アミノ酸残基及びＣＤ３９の残基と相互作用することができる少なくとも１つの第２芳香族アミノ酸残基を含む、Ｋａｂａｔ ＣＤＲ３を含む。任意選択で、第１及び第２芳香族残基は、それぞれ独立して、チロシン又はフェニルアラニンである。有利には、抗体は、抗体のｉｎ ｖｉｔｒｏ及び／又はｉｎ ｖｉｖｏ安定性を増強する１つ以上のアミノ酸改変（例えば、置換）を含むＦｃドメインを含み得る。
また、さらなる実施形態において、本開示は、高い疎水性（例えば、予測される疎水性）、及び／又は表面が曝露された複数のそのＣＤＲ中の芳香族アミノ酸残基の存在を特徴とする抗体への物理的安定性（例えば、医薬製剤における）の増加をもたらす改変ヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインを提供する。これらの改変Ｆｃドメインは、そのＫａｂａｔ ＣＤＲ３に芳香族アミノ酸残基を含む本明細書に記載の抗ＣＤ３９抗体の安定性を改善するために使用できるが、改変ＦｃドメインはＣＤ３９以外の抗原に結合する抗体の安定性を増加させるためにも使用され得ることが理解されよう。例えば、改変Ｆｃドメインは、非消失抗体、例えば、エフェクター機能（例えば、ＡＤＣＣ）を媒介する必要なく可溶性又は細胞発現タンパク質に結合する抗体、例えば、機能遮断抗体又は抗体−薬物結合体、の安定性を増加させるために使用され得る。一実施形態において、１つ以上のＣＤＲ（例えば、ＶＨＣＤＲ２及び／又はＶＨＣＤＲ３）に複数の芳香族アミノ酸残基を含むモノクローナル抗体が提供され、抗体は、抗体に対する物理的安定性及び／又は溶解性（例えば、医薬製剤中の）の増加をもたらす改変ヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインを含む。このような改変Ｆｃドメインは、拡張ＶＨＣＤＲ３を有する、例えば、長さが９、１０、１１、１２、１３又は１４アミノ酸のＫａｂａｔ ＣＤＲ３を含むか、又はＫａｂａｔ位置１００ａ〜１００ｆの１つ以上（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ又は６つ又は７つ）に存在するアミノ酸残基を含む、抗体において、特に有用であり得る。一実施形態において、抗体のＣＤＲ（例えば、ＶＨＣＤＲ３）は、式Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５（配列番号５）を有するアミノ酸残基の配列を含み、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４及びＸ５の任意の２つ、３つ又はそれ以上が芳香族アミノ酸、任意選択でチロシン又はフェニルアラニンを表す。一実施形態において、３つ、４つ又はそれ以上の芳香族酸残基を含むＫａｂａｔ ＶＨＣＤＲ２を含む重鎖を含むモノクローナル抗体が提供される。一実施形態において、３、４、５、６又は７個（又はそれ以上）の芳香族酸残基を含むＫａｂａｔ ＶＨＣＤＲ３を含む重鎖を含むモノクローナル抗体が提供される。一実施形態において、３つ、４つ、５つ、６つ又は７つ（又はそれ以上）の芳香族酸残基を含むＫａｂａｔ ＶＨＣＤＲ３を含む重鎖を含むモノクローナル抗体、並びにＫａｂａｔ位置２３４、２３５及び３３１、任意選択でＫａｂａｔ位置２３４、２３５、２３７及び３３１、又は任意選択でＫａｂａｔ位置２３４、２３５、２３７、３３０及び３３１の重鎖定常領域内にアミノ酸置換（例えば、基準Ｆｃドメイン、例えば、野生型ヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインと比較して）を含むヒトＩｇＧ１アイソタイプのＦｃドメインが提供される。一実施形態において、改変Ｆｃドメインは、配列番号２１、２２、２３又は２４のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。一実施形態において、芳香族酸残基は、チロシン及びフェニルアラニンから選択される。一実施形態において、ＶＨは、ヒトフレームワークアミノ酸配列を含む。一実施形態において、抗体は、ＶＬ、任意選択でヒトフレームワークアミノ酸配列を含むＶＬを含む軽鎖を含む。一実施形態において、抗体は、２つの軽鎖及び２つの重鎖を含む全長ＩｇＧ抗体である。一実施形態において、このような抗体を含む医薬製剤が提供される。
一態様では、ヒトＣＤ３９ポリペプチドに結合し、その活性を阻害することができる抗ＣＤ３９抗体が提供され、抗原結合タンパク質は、それぞれがフレームワーク（例えば、ヒト起源のアミノ酸配列を有するフレームワーク）並びにＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む、ＶＨ及びＶＬを含み、抗原結合タンパク質は、ＣＤ３９のＮ末端ドメイン及びＣＤ３９のＣ末端ドメインに結合することができる。一実施形態において、抗原結合タンパク質は、ＣＤ３９に結合した場合にＣＤ３９のドメイン移動を制限する。任意選択で、ＶＨ及び／又はＶＬフレームワーク（例えば、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及び／又はＦＲ４）はヒト由来である。一実施形態において、ＶＨは、ＣＤ３９のＮ末端ドメインに結合することができる第１ＣＤＲ（又は抗原結合ドメイン）及びＣＤ３９のＣ末端ドメインのアミノ酸残基に結合することができる第２ＣＤＲ（又は抗原結合ドメイン）を含む。
本発明の一態様（例えば、本明細書のいずれかの態様）では、抗ＣＤ３９抗体は、それぞれＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含むＶＨ及びＶＬドメインを含み、ＶＨのＫａｂａｔ ＣＤＲ２は（任意選択でＦＲ３と共に）アミノ酸残基に、及び／又はＣＤ３９のＣ末端ドメイン中のＮ２９２結合グリカンに結合する。任意選択で、ＶＨのＫａｂａｔ ＣＤＲ１は、ＣＤ３９のＮ末端ドメインのアミノ酸残基に結合する。任意選択で、ＶＨのＫａｂａｔ ＣＤＲ３は、ＣＤ３９のＮ末端ドメインのアミノ酸残基に結合する。任意選択で、ＶＨのＣＤＲ２は、ＣＤ３９のＮ末端ドメインに結合する第１アミノ酸セグメントと、ＦＲ３残基と共にＣＤ３９のＣ末端ドメインと結合するアミノ酸セグメントとを含む。任意選択で、ＣＤＲ３は、ＣＤ３９のＮ末端ドメイン中のアミノ酸残基に結合することができる芳香族残基（例えば、チロシン）及びＶＬ中のアミノ酸残基と接触することができる第２芳香族アミノ酸残基（例えば、チロシン、フェニルアラニン）を含む。任意選択で、結合分子又は抗原結合フラグメントは、Ｋａｂａｔ ＣＤＲ中の残基を介してＶＨのＫａｂａｔ ＣＤＲ３に結合するＶＬを含む。
一態様では、純粋なアンタゴニスト、又は例えば、エフェクター機能、アポトーシス促進活性又は毒素結合を欠く薬剤、による細胞ＣＤ３９のＡＴＰａｓｅ活性を、ｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏで実質的に完全に阻害する組成物（例えば、結合分子）及び方法が提供される。一実施形態において、アンタゴニスト（例えば、抗ＣＤ３９抗体）は、毎日未満の頻度で、任意選択で週１回未満の頻度で、例えば、毎日未満、約１週間に１回、２週間に１回、１ヶ月に１〜４回、１ヶ月に２〜４回、１ヶ月に１〜２回、２ヶ月に１〜２回、又はより少ない頻度で投与する。
一態様では、ＣＤ３９発現細胞における細胞内インターナライゼーションを受け、及び／又はレセプターインターナライゼーションを誘導又は増加させる抗ＣＤ３９抗体の能力を調節するための方法が提供される。また、細胞、特に免疫細胞（例えば、Ｂ細胞、Ｔ細胞）及び腫瘍細胞においてＣＤ３９インターナライゼーションを引き起こす改変された能力を有する抗原結合分子（その抗原結合フラグメントを含む）も提供される。
ＣＤ３９は（免疫細胞に加えて）腫瘍細胞上で発現され、ＣＤ３９はまた、免疫調節（腫瘍細胞及び免疫細胞上）のために有利に標的化され得る。提供されるＣＤ３９結合分子は、例えば、細胞毒性薬剤と結合せずに細胞内のＣＤ３９ ＡＴＰａｓｅ活性を低下させ、ＣＤ３９発現細胞に対してアポトーシス又はＡＤＣＣの誘導を誘導することによって、ＣＤ３９の純粋な阻害剤として作用することが予定されている薬剤として、特に有利である。
この抗体は、二価の方法でＣＤ３９ポリペプチドに結合する能力を保持しているにもかかわらず、細胞上でＣＤ３９下方制御を誘導又は増加させない（実施例において使用される抗体は、それぞれＣＤ３９ポリペプチドに結合することができる２つの抗原結合ドメインを有する）。有利には、一実施形態において、抗体は、ヒトＦｃγ受容体、例えば、ヒトＣＤ１６、ＣＤ３２ａ、ＣＤ３２ｂ及びＣＤ６４の１つ以上（又は全て）、への結合を減少させるか又は実質的に欠くように改変されたヒトＦｃドメインを含み、それによりＣＤ３９下方制御（例えば、ｉｎ ｖｉｖｏ；Ｆｃγ受容体発現細胞の存在下）の潜在的誘導を排除する。非インターナライゼーション及び非下方制御の特性は、ｉｎ ｖｉｖｏでの改善された薬理学をもたらし、ｉｎ ｖｉｖｏでのＣＤ３９活性のより完全な中和を導き得る。一実施形態において、結合分子（例えば、抗体）は、本明細書に記載のＣＤＲ１、２及び３を含む可変重鎖ドメイン（ＶＨ）、及び本明細書に記載のＣＤＲ１、２及び３を含む可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）を含む。一実施形態において、結合分子（例えば、抗体）は、式Ｉの可変重鎖ドメイン（ＶＨ）及び式ＩＩの可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）を含む。
別の実施形態では、Ｆｃドメインを介してエフェクター機能を保持及び／又は媒介するように、結合分子を生成することができる。一実施形態において、抗体は、ヒトＦｃγ受容体に結合するヒトＦｃドメイン、例えば、ヒトＣＤ１６、ＣＤ３２ａ、ＣＤ３２ｂ及びＣＤ６４の１つ以上（又は全て）を含む。
別の実施形態では、Ｆｃドメインは、任意選択で１つ以上のヒトＦｃγ受容体への結合を保持するが、１つ以上の他のヒトＦｃγ受容体への結合の減少を有することにより、Ｆｃγ受容体結合を減少させるように改変することができる。
本明細書中の任意の実施形態の一態様では、結合分子（例えば、抗体）は、本明細書に記載の可変軽鎖ドメイン（ＶＨ）ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及び／又はＣＤＲ３を含む。本明細書中の任意の実施形態の一態様では、結合分子（例えば、抗体）は、本明細書に記載の可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及び／又はＣＤＲ３を含む。
本明細書中の任意の実施形態の一態様では、結合分子（例えば、抗体）は、本明細書に記載の可変軽鎖ドメイン（ＶＨ）、本明細書に記載の可変重鎖ドメイン（ＶＬ）を含む。本明細書中の任意の実施形態の一態様では、結合分子（例えば、抗体）は、本明細書に記載の式Ｉの可変軽鎖ドメイン（ＶＨ）及び式ＩＩの可変重鎖ドメイン（ＶＬ）を含む。
一態様では、ＣＤ３９に結合するＶＨとＶＨのＫａｂａｔ ＣＤＲ３に結合するＶＬとを含む抗体又は抗体フラグメントが提供され、任意選択でＶＨのＫａｂａｔ ＣＤＲ３が拡張ＶＨＣＤＲ３であり、例えば、長さが９、１０、１１、１２、１３又は１４アミノ酸のＫａｂａｔ ＣＤＲ３を含むか、又はＫａｂａｔ位置１００ａ〜１００ｆの１つ以上（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ又は６つ又は７つ）に存在するアミノ酸残基を含み、ＶＨのＫａｂａｔ ＣＤＲ３は、少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、６つ又はそれ以上の芳香族アミノ酸残基を含む。一実施形態において、芳香族アミノ酸残基は、チロシン及びフェニルアラニンから独立して選択される。一実施形態において、ＶＨのＫａｂａｔ ＣＤＲ３は、少なくとも２、３、４、５、６又はそれ以上のチロシン残基を含む。一実施形態において、ＶＨのＫａｂａｔ ＣＤＲ３は、ＣＤ３９のアミノ酸残基と接触することができる第１芳香族アミノ酸残基、及びＶＬのアミノ酸残基と接触することができる第２芳香族アミノ酸残基を含む。
一態様では、抗体又は抗体フラグメントは、ＣＤ３９に結合するＶＨと、ＶＨのＣＤＲ３に結合するＶＬとを含み、ＶＨは以下を含む：
（ａ）ＣＤ３９のＮ末端ドメインに接触することができ、任意選択で、ＣＤ３９のアミノ酸残基と接触することができるＫａｂａｔ位置３３に、任意選択で位置３１及び３３の両方に、残基を含むＣＤＲ１；
（ｂ）以下を含むＣＤＲ２−ＦＲ３ドメイン：
ａ．任意選択で、ＣＤ３９のＮ末端ドメインに接触することができるアミノ酸残基を含むセグメントであって、任意選択でセグメントがＫａｂａｔ位置５０〜５６に残基を含み、任意選択でセグメントがＫａｂａｔ位置５０、５２、５２ａ、５３及び／又は５６に、１、２、３、４個又はそれ以上の（又は全ての）残基を含み、任意選択で位置５３の芳香族残基がアミノ酸残基である、セグメント；
ｂ．ＣＤ３９のＣ末端ドメインと接触することができるアミノ酸残基を含むセグメントであって、任意選択でセグメントがＫａｂａｔ位置５９〜７１に残基を含み、任意選択でセグメントがＫａｂａｔ位置５９、６５、６７、６８、６９、７０及び／又は７１に１、２、３、４又はそれ以上の（又は全ての）残基を含み、任意選択でセグメントがさらにＫａｂａｔ位置５４に残基を含み、任意選択でＫａｂａｔ位置７２、７２ａ及び／又は７２ｂに残基を含む、セグメント；及び
（ｃ）ＣＤ３９のＮ末端に接触することができるＣＤＲ３（例えば、Ｋａｂａｔによる）であって、任意選択でＣＤ３９及びＶＬのＮ末端ドメインに接触することができ、任意選択でＣＤ３９のアミノ酸残基と接触することができる第１芳香族アミノ酸残基、及びＶＬのアミノ酸残基と接触することができる第２芳香族アミノ酸残基を含み、任意選択でさらに第１及び第２芳香族残基がＫａｂａｔ位置１００、１００ｂ、１００ｃ、１００ｄ、１００ｅ及び／又は１００ｆのいずれか（残基が特定のＫａｂａｔ位置に存在する範囲で）に存在する、ＣＤＲ３。任意選択で、抗体又は抗体フラグメントは、本明細書に開示されるＦｃドメイン、例えば、Ｋａｂａｔ位置２３４、２３５及び３３１、任意選択でＫａｂａｔ位置２３４、２３５、２３７及び３３１、又は任意選択でＫａｂａｔ位置２３４、２３５、２３７、３３０及び３３１の重鎖定常領域内にアミノ酸置換（例えば、基準Ｆｃドメイン、例えば、野生型ヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインと比較して）を含む、ヒトＩｇＧ１アイソタイプのＦｃドメインなどの、抗体安定性を改善する改変Ｆｃドメインを含む。
本明細書における任意の実施形態の一態様では、抗体又は抗体フラグメントは、以下を含むＶＨを含む：
（ａ）ＣＤ３９のＮ末端ドメインに接触することができるＣＤＲ１であって、任意選択で、Ｋａｂａｔ位置３１、３２及び３３の残基が式Ｘ１Ｘ２Ｘ３を有し、Ｘ１は任意のアミノ酸、任意選択でヒスチジン又はアスパラギンを表し、Ｘ２は任意のアミノ酸、任意選択で芳香族残基、任意選択でチロシン、又は任意選択でプロリン又はグリシン以外のアミノ酸残基を表し、Ｘ３はグリシン又は立体障害を回避する別のアミノ酸を表す、ＣＤＲ１；
（ｂ）ＣＤ３９のＣ末端ドメインに接触することができるＣＤＲ２−ＦＲ３セグメントであって、任意選択でＫａｂａｔ位置５９〜７１の残基は、式Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１３（配列番号１２）を有し、Ｘ１はチロシンを表し、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５及びＸ６の各々はそれぞれ任意のアミノ酸を表し、Ｘ７はグリシン又は抗原結合を低下させる立体障害を導入しない別の残基を表し、Ｘ８は任意のアミノ酸を表し、Ｘ９はフェニルアラニン又はβ−ストランドの位置及びＶＨドメイン構造の完全性を維持することができる別の疎水性残基を表し、Ｘ１０はアラニン又はバリン、任意選択でロイシン、任意選択でスレオニン、任意選択で疎水性残基を表し、Ｘ１１はフェニルアラニン又はβ−ストランドの位置及びＶＨドメイン構造の完全性を維持することができる別の疎水性残基（例えば、イソロイシン）を表し、及びＸ１２はセリンを表し、任意選択でさらにＸ１３は任意のアミノ酸、任意選択でロイシン、任意選択でアラニン、バリン、スレオニン又はアルギニンを表し、任意選択でＣＤＲ２−ＦＲ３セグメントはＫａｂａｔ位置７２、７２ａ及び７２ｂに式Ｘ２４Ｘ２５Ｘ２６を有する残基をさらに含み、Ｘ２４はアスパラギン酸、グルタミン酸又はアラニンを表し、Ｘ２５は任意のアミノ酸、任意選択でアラニン又はスレオニンを表し、Ｘ２６はセリン、任意選択でアラニンを表す、ＣＤＲ２−ＦＲ３セグメント；及び
（ｃ）ＣＤ３９のＮ末端と接触することができるＣＤＲ３であって、任意選択でＫａｂａｔ位置１００〜１００ｆの残基が、残基がこれらの位置に存在する範囲で、式Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５（配列番号１５）（式中、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４及びＸ５のいずれか２つ、３つ又はそれ以上は芳香族アミノ酸を表す）を有するアミノ酸残基の配列を含む、ＣＤＲ３。
本明細書における任意の実施形態の一態様では、抗体又は抗体フラグメントは、以下を含むＶＬを含む：
Ｋａｂａｔ位置３１、３２、３３及び３４の残基が式Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４を有し、Ｘ１はスレオニン、セリン又はその保存的置換を表し、Ｘ２はアラニン若しくはアスパラギン又はその保存的置換を表し、Ｘ３はバリン又はその保存的置換を表し、Ｘ４はアラニン又はその保存的置換を表す、ＣＤＲ１；
Ｋａｂａｔ位置４９に芳香族残基、任意選択でチロシンを含むＦＲ２；
Ｋａｂａｔ位置５０の残基がセリン、リシン若しくはスレオニン又はその保存的置換であるＣＤＲ２；及び
Ｋａｂａｔ位置８９の残基がグルタミン若しくはヒスチジン又はその保存的置換であり、位置９１の残基がチロシン、スレオニン若しくはヒスチジン又はその保存的置換であり、任意選択で位置９５の残基がプロリン又はその保存的置換であり、任意選択で位置９６の残基が芳香族残基、任意選択でチロシン若しくはフェニルアラニン又はその保存的置換である、ＣＤＲ３。
例示的な抗体は、「血管」ＣＤ３９として知られているＣＤ３９の細胞膜結合アイソフォームに特異的に有利に結合することができるが、他のＮＴＰＤａｓｅ、特にＣＤ３９−Ｌ１、−Ｌ２、Ｌ３及び／又は−Ｌ４として知られているＣＤ３９形態には実質的に結合しない。分泌された可溶性Ｌ２及びＬ４アイソフォームへの結合の欠如は、とりわけ有利な薬理学的プロフィールを提供し得る。分泌されたアイソフォーム並びに膜結合Ｌ１及びＬ３への結合を回避することは、ＣＤ３９遮断の望ましくない副作用を回避する上でさらに役立つ。
本開示の抗体は、細胞表面で発現される膜結合ＣＤ３９タンパク質の酵素活性を阻害することができ、特定の実施形態では、細胞表面発現ＣＤ３９の細胞内インターナライゼーション、又はより一般には下方制御を、実施的に誘導又は増加させない。
一態様では、抗体は細胞内インターナライゼーションを実質的に誘発又は増加させず、従って、ＣＤ３９阻害活性に対するＣＤ３９発現細胞のＣＤ３９下方制御又はＡＤＣＣ、ＣＤＣ若しくは毒素媒介枯渇に依存しない。これらの抗体は、免疫調節活性を許容する、血管ＣＤ３９を標的とする「純粋な」ＣＤ３９ブロッカーとして使用することができる。
本開示の抗体は、ＣＤ３９インターナライゼーションの誘導を伴い若しくは伴わず、及びＣＤ１６（ＦｃγＩＩＩ受容体）の結合を伴い若しくは伴わず、並びに／又はＡＤＣＣ及び／若しくはＣＤＣのＣＤ３９発現細胞への指向を伴い若しくは伴わず、細胞表面で発現される膜結合ＣＤ３９タンパク質の酵素活性を阻害することができる。任意選択で、抗体はＦｃドメインを保持し、ヒトＦｃＲｎへの結合を保持する。
また、細胞上のＣＤ３９発現のダウンレギュレーションに対する感受性が低い方法及びアッセイが提供される。このようなアッセイは、抗体又は他の抗原結合剤をＣＤ３９を中和する能力についてスクリーニング又は試験するために有利に用いることができ、任意選択でインターナライゼーションを受ける能力を有するか若しくは欠く抗体を分離するため、又はＣＤ３９の細胞内インターナライゼーションを増加又は誘導するために有用であり得る。このようなアッセイの一実施形態において、この方法は、（ｉ）ＣＤ３９発現細胞、任意選択でＲａｍｏｓリンパ腫細胞（例えば、本明細書の実施例で使用されるもの、例えばＡＴＣＣから入手可能、基準ＣＲＬ−１５９６）を、試験抗体（例えば、複数の試験抗体）に接触させること、及び（ｉｉ）産生ＡＭＰの減少がＡＴＰａｓｅ活性の中和を示す、質量分析によりＡＭＰの生成を評価（例えば、ネガティブコントロール、例えばアイソタイプコントロール抗体と比較して）すること、を含む。任意選択で、抗体は、このアッセイにおいて少なくとも７０％、８０％又は９０％の産生ＡＭＰの減少を引き起こす。任意選択で、本方法は、産生ＡＭＰの少なくとも７０％、８０％又は９０％の減少を生じる抗体を（例えば、治療での使用のために、抗体のバッチの生成のために、さらなる処理又は評価のために）選択することをさらに含む。
有利には、本明細書中に例示された抗体は、可溶性ＣＤ３９アイソフォーム、例えばアイソフォームＬ２及び／又はＬ４、に結合することなく、ＣＤ３９の膜結合血管アイソフォーム（配列番号１に示されるポリペプチド）を標的とする。さらに、本明細書に例示される抗体は、ＣＤ３９のＬ１及び／又はＬ３アイソフォームにさらに結合しない。
ＡＤＣＣ及び／又はＣＤＣを誘導することによって機能する抗体は、ＡＤＣＣを誘導するのに十分な抗体がＣＤ３９発現細胞に結合されている限り、ＣＤ３９のＡＴＰａｓｅ活性の完全な中和／阻害なしでも効率的であり得るが、中和非枯渇抗体は、ＡＴＰａｓｅの酵素活性の強力な阻害を必要とすると考えられている。一実施形態において、非枯渇抗体は、ヒトへの抗体の投与と適合する濃度において、ＣＤ３９発現細胞のＡＴＰａｓｅ活性（例えば、質量分析によって測定される、Ｂ細胞、Ｒａｍｏｓ細胞などのＣＤ３９＋細胞によるＡＭＰ産生の減少によって評価される）の少なくとも７０％、８０％、９０％の減少をもたらす。次いで、これらの方法によって同定された抗体を、精製抗体を用いた細胞酵素活性アッセイで試験し、血管ヒトＣＤ３９の酵素活性を強く中和する（Ｂ細胞（Ｒａｍｏｓ）による９０％超のＡＭＰ産生の阻害）ことが判明した。これらの抗体によって結合されたＣＤ３９上のエピトープは、ある範囲の細胞、例えば、ＣＤ４ Ｔ細胞、ＣＤ８ Ｔ細胞、Ｂ細胞、トランスフェクションされた細胞によって発現されるＣＤ３９ポリペプチド上に存在し、フローサイトメトリーによって決定される高親和性で結合する。例えば、抗体は、その表面にＣＤ３９ポリペプチドを発現する細胞への結合について、２μｇ／ｍｌ以下、１μｇ／ｍｌ以下、０．５μｇ／ｍｌ以下、０．１μｇ／ｍｌ以下、又は０．０５μｇ／ｍｌ以下の、フローサイトメトリーによって決定されるＥＣ５０を特徴とすることができる。一実施形態において、細胞は、その表面にＣＤ３９を発現させるように作製された細胞である。一実施形態において、細胞は、その表面で内在的にＣＤ３９を発現する細胞、例えば、制御性Ｔ（ＴＲｅｇ）細胞、Ｂ細胞、癌細胞、リンパ腫細胞（例えば、Ｒａｍｏｓ細胞）、白血病細胞、膀胱癌細胞、神経膠腫細胞、神経膠芽腫細胞、卵巣癌細胞、メラノーマ細胞、前立腺癌細胞、甲状腺癌細胞、食道癌細胞又は乳癌細胞である。
一態様では、ヒト「血管」ＣＤ３９（例えば配列番号１のポリペプチド）上に存在するが、可溶性ＣＤ３９アイソフォーム、例えばＣＤ３９−Ｌ２及び／又は−Ｌ４上には存在しない抗原決定基に結合するＣＤ３９結合剤が提供される。一態様では、「血管」ＣＤ３９（例えば、配列番号１のポリペプチド）上に存在するが、ＣＤ３９のＬ２、Ｌ３及び／又はＬ４アイソフォームのいずれか１つ以上（又は全て）上で欠損している、抗原決定基に結合するＣＤ３９結合剤が提供される。任意選択で、ＣＤ３９結合剤は、それらの表面にヒト非ヒト霊長類ＣＤ３９ポリペプチド（例えば、カニクイザルＣＤ３９ポリペプチド）を発現する細胞にさらに結合する。
本明細書中のいずれかの実施形態の一態様では、ヒトＣＤ３９に結合する抗体は、ＦｃドメインとヒトＣＤ１６Ａ、ＣＤ１６Ｂ、ＣＤ３２Ａ、ＣＤ３２Ｂ及び／又はＣＤ６４ポリペプチドとの間の結合を減少させるように改変（同じアイソタイプの野生型Ｆｃドメインと比較して）されたＦｃドメインを含み、Ｆｃドメインは、Ｋａｂａｔ位置２３４、２３５、２３７及び３３１、任意選択でＫａｂａｔ位置２３４、２３５、２３７及び３３１、又は任意選択でＫａｂａｔ位置２３４、２３５、２３７、３３０及び３３１の重鎖定常領域内にアミノ酸置換（例えば、基準Ｆｃドメイン、例えば、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインと比較して）を含む。一実施形態において、抗体は、２３４、２３５、２３７、３２２、３３０及び３３１（Ｋａｂａｔ番号付け）からなる群から選択される任意の３、４、５又はそれ以上の残基において重鎖定常領域にアミノ酸置換を有する。任意選択で、フェニルアラニン又はアラニンは、Ｋａｂａｔ位置２３４に存在する。任意選択で、２３５位にグルタミン酸が存在する。任意選択で、２３７位にアラニンが存在する。任意選択で、３３０位にセリンが存在する。任意選択で、３３１位にセリンが存在する。一実施形態において、抗体のＶＨＣＤＲ３は複数の表面露出芳香族残基を含み、任意選択で、Ｋａｂａｔ ＶＨＣＤＲ３は式Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５（配列番号５）を有するアミノ酸残基の配列を含み得、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４及びＸ５の任意の３つ以上は芳香族アミノ酸を表す。任意選択で、芳香族残基のうち少なくとも３つはチロシンである。任意選択で、少なくとも２つの芳香族残基がチロシンであり、少なくとも１つの芳香族残基がフェニルアラニンである。任意選択で、ＶＨＣＤＲ３中の芳香族残基の少なくとも１つはＣＤ３９と相互作用することができ、任意選択でさらに、ＶＨＣＤＲ３内の芳香族アミノ酸の少なくとも１つがＶＬの残基と相互作用することができる。一実施形態において、Ｆｃドメインにおける置換は、医薬特性、任意選択で抗体のｉｎ ｖｉｔｒｏ及び／又はｉｎ ｖｉｖｏでの安定性を改善し、任意選択で置換が抗体の凝集傾向を減少させる。
一態様では、ＦｃドメインとヒトＣＤ１６Ａ、ＣＤ１６Ｂ、ＣＤ３２Ａ、ＣＤ３２Ｂ及び／又はＣＤ６４ポリペプチドとの間の結合を減少させるように改変（同じアイソタイプの野生型Ｆｃドメインと比較して）されたＦｃドメインを含む抗体が提供され、抗体は、（ｉ）配列番号６の重鎖可変領域のＣＤ１、２及び３を含む重鎖、及び（ｉｉ）配列番号７の軽鎖可変領域のＣＤ１、２及び３を含む軽鎖を含む。一態様では、Ｆｃドメインは、ＦｃドメインとヒトＣ１ｑポリペプチドとの間の結合を（同じアイソタイプの野生型Ｆｃドメインと比較して）減少させるように改変される。一実施形態において、抗体は、２２０、２２６、２２９、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２４３、２６４、２６８、２９７、２９８、２９９、３０９、３１０、３１８、３２０、３２２、３２７、３３０及び３３１（ＫａｂａｔＥＵ番号付け）からなる群から選択される任意の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ又はそれ以上の残基において重鎖定常領域にアミノ酸置換を含む。一実施形態において、抗体は、２３４、２３５、２３７、３２２、３３０及び３３１からなる群から選択される任意の３、４、５又はそれ以上の残基（Ｋａｂａｔ番号付け）において重鎖定常領域にアミノ酸置換を有する。
一態様では、ＦｃドメインとヒトＣＤ１６Ａ、ＣＤ１６Ｂ、ＣＤ３２Ａ、ＣＤ３２Ｂ及び／又はＣＤ６４ポリペプチドとの間の結合を減少させるように改変（同じアイソタイプの野生型Ｆｃドメインと比較して）されたＦｃドメインを含む抗体が提供され、抗体は、（ｉ）配列番号８の重鎖可変領域のＣＤ１、２及び３を含む重鎖、及び（ｉｉ）配列番号９の軽鎖可変領域のＣＤ１、２及び３を含む軽鎖を含む。一態様では、Ｆｃドメインは、ＦｃドメインとヒトＣ１ｑポリペプチドとの間の結合を（同じアイソタイプの野生型Ｆｃドメインと比較して）減少させるように改変される。一実施形態において、抗体は、２２０、２２６、２２９、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２４３、２６４、２６８、２９７、２９８、２９９、３０９、３１０、３１８、３２０、３２２、３２７、３３０及び３３１（ＫａｂａｔＥＵ番号付け）からなる群から選択される任意の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ又はそれ以上の残基において重鎖定常領域にアミノ酸置換を含む。一実施形態において、抗体は、２３４、２３５、２３７、３２２、３３０及び３３１からなる群から選択される任意の３、４、５又はそれ以上の残基において重鎖定常領域にアミノ酸置換を有する。
一態様では、ヒトＣＤ１６（及び／又は他のＦｃγ受容体）及び／若しくはＣ１ｑに実質的に結合することなく、並びに／又はＡＤＣＣ及び／若しくはＣＤＣを実質的にＣＤ３９発現細胞に指向させることなく、細胞の表面に発現した膜結合ＣＤ３９タンパク質（血管ＣＤ３９；配列番号１のポリペプチド）の酵素活性を特異的に阻害することができる抗ＣＤ３９抗体が提供される。
一態様では、ＣＤ３９表面発現細胞の下方制御（例えば、インターナライゼーション）を実質的に起こすことなく、細胞の表面に発現した膜結合血管ＣＤ３９タンパク質（配列番号１のアミノ酸配列）の酵素活性を阻害することができる抗ＣＤ３９抗体が提供される。一実施形態において、抗体は、ヒトＦｃγ受容体（例えば、ＣＤ１６、ＣＤ３２ａ、ＣＤ３２ｂ、ＣＤ６４）及び／若しくはＣ１ｑに実質的に（例えば、Ｆｃドメインを介して）結合せず、並びに／又はＡＤＣＣ及び／若しくはＣＤＣを実質的にＣＤ３９発現細胞に指向させない。任意選択で、抗体はＦｃドメインを保持し、ヒトＦｃＲｎへの結合を保持する。
一態様では、ＣＤ３９結合剤は、ヒトＣＤ３９の１つ以上の可溶性アイソフォーム（例えば、アイソフォームＬ２及び／又はＬ４）との結合が低下しているか、又は結合を実質的に欠いている。一態様では、ＣＤ３９結合剤は、ヒトＣＤ３９の１つ以上の（又は全ての）アイソフォームＬ１、Ｌ２、Ｌ３及びＬ４への結合が低下しているか、又は実質的に結合を欠いている。
一実施形態において、抗体は、ＣＤ３９の酵素活性を所望の期間、例えば、１週間、２週間、１ヶ月間、抗ＣＤ３９抗体の次の連続投与まで、中和するのに有効な量で投与される。
一実施形態において、抗体は、ＡＴＰａｓｅ活性の阻害について少なくともＥＣ５０、ＥＣ７０又はＥＣ１００に等しい抗体の血中濃度を提供する用量及び／又は頻度で投与され、任意選択で濃度は少なくとも１週間、２週、１ヶ月間、又は抗ＣＤ３９抗体の次の連続的な投与まで維持される。一実施形態において、血中濃度は、ＣＤ１６結合を媒介するＦｃドメインを有する同等の抗体、例えば、ＩｇＧ１（例えば、腫瘍細胞、ＴＲｅｇ細胞及び／又はＢ細胞）によるＣＤ３９発現細胞に対するＡＤＣＣ活性について、それぞれＥＣ５０、ＥＣ７０又はＥＣ１００よりも高い。
一態様では、細胞表面発現ＣＤ３９の実質的な細胞内インターナライゼーション、より一般的には下方制御、を引き起こさず、及び／又はそれらのＣＤ３９阻害活性に依存しない中和抗ＣＤ３９抗体が提供される。
一態様における開示は、腫瘍細胞を含むがこれに限定されない細胞の表面で発現されるヒトＣＤ３９ポリペプチド上に存在するエピトープに結合し、実質的に細胞表面発現ＣＤ３９細胞内インターナライゼーション、又はより一般には下方制御を引き起こさずにＣＤ３９酵素の酵素的（ＡＴＰａｓｅ）活性を阻害し、及び／又はそれらのＣＤ３９阻害活性につきそれに依存しない抗体を提供する。
一態様では、Ｑ９６、Ｎ９９、Ｅ１４３及びＲ１４７（配列番号１に関する）からなる群から選択されるアミノ酸残基（例えば、１つ、２つ、３つ又は４つの残基）を含むＣＤ３９上のエピトープに結合する抗ＣＤ３９抗体を提供する。
一態様では、Ｑ９６、Ｎ９９、Ｅ１４３及びＲ１４７（配列番号１に関する）からなる群から選択される１つ、２つ、３つ又は４つの残基に突然変異を有するＣＤ３９ポリペプチドへの結合が減少した抗ＣＤ３９抗体が提供され、任意選択で、突然変異ＣＤ３９ポリペプチドは、突然変異：Ｑ９６Ａ、Ｎ９９Ａ、Ｅ１４３Ａ及びＲ１４７Ｅを有する。
一実施形態において、ＣＤ３９中和抗体は、ＣＤ３９の細胞のＡＴＰａｓｅ活性の低下を引き起こすこと、任意選択でＣＤ３９発現細胞によるＡＭＰ産生の少なくとも７０％、８０％又は９０％の低下を引き起こすこと、ができることを特徴とする。一実施形態において、ＣＤ３９中和抗体は、１μｇ以下、任意選択でない０．５μｇ以下、任意選択で０．２μｇ以下の細胞によって発現されるＣＤ３９のＡＴＰａｓｅ活性の阻害についてＥＣ５０（例えば、ＣＤ３９発現細胞によるＡＭＰ産生の阻害についてＥＣ５０）を特徴とし得る。
任意選択で、細胞によって発現されるＣＤ３９のＡＴＰａｓｅ活性の阻害は、ＡＴＰの加水分解によって産生されるＡＭＰを定量することによってＲａｍｏｓ細胞におけるＡＴＰａｓｅ活性の中和を評価することにより決定される（例えば、実施例６を参照）。
一態様では、ＡＴＰａｓｅ活性の中和は、ＣＤ３９発現細胞（例えば、本明細書で使用されるＲａｍｏｓリンパ腫細胞、例えばＡＴＣＣから入手可能、基準ＣＲＬ−１５９６）を、抗体に接触させること、及び産生ＡＭＰの減少がＡＴＰａｓｅ活性の中和を示す、例えば質量分析により、ＡＭＰの生成を評価することにより決定される。任意選択で、抗体は、このアッセイにおいて少なくとも７０％、８０％又は９０％の産生ＡＭＰの減少を引き起こす。任意選択で、抗体は、少なくとも７０％、８０％又は９０％のＢ細胞による細胞外ＡＴＰａｓｅ活性の低下を引き起こす。
一態様では、細胞表面で発現するが膜結合ＣＤ３９アイソフォームＬ１及びＬ３を欠くＣＤ３９上に存在する抗原決定基に結合する、中和抗ＣＤ３９抗体が提供される。
一態様では、Ｉ−３９１によって結合されたＣＤ３９上のエピトープとの結合について競合する（例えば、ＣＤ３９ポリペプチド上のエピトープと重鎖及び軽鎖ＣＤＲ又はＩ−３９１の任意の可変領域を有する抗体との結合について競合する）中和抗ＣＤ３９抗体が提供される。
本明細書の実施形態のいずれかの一態様では、同一エピトープに結合する及び／又はＣＤ３９ポリペプチドとモノクローナル抗体Ｉ−３９１との結合について競合する（例えば、ＣＤ３９ポリペプチドと重鎖及び軽鎖ＣＤＲ又はＩ−３９１の可変領域を有する抗体との結合について競合する）抗原結合化合物が提供される。一実施形態において、抗原結合化合物が、配列番号６及び７のそれぞれＶＨ及びＶＬ領域を有する抗体と同じエピトープに結合し、及び／又はＣＤ３９ポリペプチドとの結合について競合することが提供される。
一実施形態において、抗ＣＤ３９抗体は、Ｉ−３９１によって結合されるＣＤ３９上のアミノ酸残基からなる群から選択される１、２又は３個のアミノ酸残基を含むエピトープに結合する。
本明細書の実施形態のいずれかの一態様では、抗体は、抗体Ｉ−３９１の重鎖可変領域（ＶＨ）の３つのＣＤＲを含む重鎖及び抗体Ｉ−３９１の軽鎖可変領域（ＶＬ）の３つのＣＤＲを含む軽鎖を含み得る。
本明細書の実施形態のいずれかの一態様では、抗体は、抗体Ｉ−３９２の重鎖可変領域（ＶＨ）の３つのＣＤＲを含む重鎖及び抗体Ｉ−３９２の軽鎖可変領域（ＶＬ）の３つのＣＤＲを含む軽鎖を含み得る。
本明細書の任意の実施形態において、抗ＣＤ３９抗体は、細胞（例えば、腫瘍細胞、ＣＤ３９を発現するように作製された細胞（例えば、Ｒａｍｏｓ腫瘍細胞株）又は実施例に示されるようにＣＤ３９を発現するように作製された組換え宿主細胞）の表面上に発現されるヒトＣＤ３９ポリペプチドに結合することを特徴とし得、及び任意選択で、抗体はフローサイトメトリーによって決定される高親和性をもって結合する。例えば、抗体は、その表面にＣＤ３９ポリペプチド、例えば、ＣＤ３９を発現する腫瘍細胞、表面にＣＤ３９ポリペプチドを発現する細胞、ＣＤ３９を発現するリンパ球など、を発現する細胞への結合について、１μｇ／ｍｌ以下、０．５μｇ／ｍｌ以下、０．１μｇ／ｍｌ以下、又は０．０５μｇ／ｍｌ以下の、フローサイトメトリーによって決定されるＥＣ５０を特徴とすることができる。任意選択で、抗原結合化合物は、（ｉ）その表面ヒトＣＤ３９で発現する細胞（例えば、アミノ酸配列１を有するポリペプチド）及び／又は（ｉｉ）ヒト非ヒト霊長類ＣＤ３９（例えば、カニクイザルＣＤ３９）をその表面に発現する細胞への結合について、１μｇ／ｍｌ以下、任意選択で０．５μｇ／ｍｌ以下、０．１μｇ／ｍｌ以下、又は０．０５μｇ／ｍｌ以下のＥＣ５０を有する。
本明細書中の実施形態のいずれかの一態様では、抗ＣＤ３９抗体は、２つの重鎖及び２つの軽鎖を含む四量体抗体であり、重鎖はヒトＦｃγ受容体（例えば、ＣＤ１６Ａ、ＣＤ１６Ｂ、ＣＤ３２Ａ、ＣＤ３２Ｂ及び／又はＣＤ６４）への結合を実質的に欠き、さらにヒトＣ１ｑポリペプチドへの結合を実質的に欠くヒトアイソタイプのＦｃ領域を含む。
一実施形態において、抗体は、腫瘍微小環境におけるＣＤ３９の活性を中和するのに十分な量及び頻度で癌を有する個体に投与される。一実施形態において、抗体は、腫瘍微小環境におけるアデノシンの産生及び／又は濃度を減少させるのに十分な量及び頻度で投与される。一実施形態において、抗体は、腫瘍微小環境におけるＡＭＰ及び／又はアデノシンの産生及び／又は濃度を減少させるのに十分な量及び頻度で投与される。一実施形態において、抗体は、腫瘍細胞によって発現されるＣＤ３９の活性を中和するのに十分な量及び頻度で投与される。一実施形態において、抗体は、白血球又はリンパ球によって発現されるＣＤ３９、例えばＣＤ４ Ｔ細胞、ＣＤ８ Ｔ細胞、ＴＲｅｇ細胞及び／又はＢ細胞の活性を中和するのに十分な量及び頻度で投与される。
抗体は、ＣＤ３９媒介ＡＴＰ加水分解を阻害するのに有用であり、それにより腫瘍微小環境におけるアデノシン濃度の低下につながる。従って、これらの抗体は、Ｔ細胞、Ｂ細胞及びアデノシン受容体（Ａ２Ａ受容体）を発現する他の細胞上の、例えば癌の治療における、ＣＤ３９及び／又はアデノシンの免疫抑制効果を逆転させるのに有用である。一実施形態において、抗ＣＤ３９抗体は、Ｔ細胞における増殖、サイトカイン生成、細胞毒性及び／又はＮＦＫＢ活性のアデノシン媒介阻害を中和する。
抗体は、腫瘍微小環境へのアデノシンの生成、量及び／又は濃度の阻害に有用であろう。
別の態様では、本明細書に記載の抗ＣＤ３９抗原結合化合物の治療有効量を個体（例えば、疾患、腫瘍などを有する個体）に投与することを含む、個体を治療する方法が提供される。一態様では、個体を治療する方法であって、方法は、個体（例えば、疾患、腫瘍などを有する個体）に治療的に活性な量の、ＣＤ３９ポリペプチドを阻害する本開示の抗原結合化合物を投与することを含むか、実質的にそれからなるか、又はそれからなる。一実施形態において、抗ＣＤ３９抗原結合化合物（例えば、抗体）は、第２治療剤、任意選択でヒトＰＤ−１の阻害活性を中和する治療剤（例えば、抗体）、任意選択で抗ＰＤ−１抗体、任意選択で抗ＰＤ−Ｌ１抗体と組み合わせて個体に投与される。一実施形態において、抗ＣＤ３９抗原結合化合物（例えば、抗体）は、癌を有し、ヒトＰＤ−１の阻害活性を中和する薬剤による処置に対する応答が不良であるか、又は応答の予後を有する個体に投与される。一実施形態において、抗体は、細胞アッセイにおいてＣＤ３９ポリペプチドを阻害する。化合物は、一実施形態において、非枯渇抗体（結合する細胞を枯渇させない抗体、例えばＦｃサイレント抗体）である。任意選択で、化合物は二価の方法でＣＤ３９ポリペプチドに結合する。任意選択で、抗体は、キメラ、ヒト化又はヒト抗体である。任意選択で、抗体は、ヒトＦｃγ受容体への結合を排除するよう改変された、ＩｇＧの重鎖定常領域（例えば、ＩｇＧ１）アイソタイプ（例えば、ＣＤ１６Ａ、ＣＤ１６Ｂ、ＣＤ３２Ａ、ＣＤ３２Ｂ及び／又はＣＤ６４）を含む。
別の態様では、従来の医薬製剤における安定性及び／又は溶解度が増大した抗体は、他の抗体と薬学的製剤中で有利に組み合わせることができる。一実施形態において、（ｉ）ＣＤ３９ポリペプチドを阻害し、かつ増大した安定性を示す抗体、例えば、ＣＤＲ中に複数の芳香族残基を含むＣＤ３９ポリペプチドを阻害する抗体、及びＫａｂａｔ位置２３４、２３５、２３７、３２２、３３０及び３３１の残基のいずれか３つ、４つ、５つ又はそれ以上のアミノ酸置換を含む改変ヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメイン、及び（ｉｉ）ヒトＩｇＧアイソタイプの第２抗体（任意選択で第２抗体は抗癌活性を有する）を含む医薬製剤が提供される。一実施形態において、第２抗体は、結合している細胞に向けてＡＤＣＣを誘導することができ、任意選択で第２抗体は腫瘍細胞上に存在する抗原（腫瘍抗原）に結合する。一実施形態において、第２抗体は、その超可変領域が結合するタンパク質の活性を中和することができる。一実施形態において、（ｉ）ＣＤ３９ポリペプチドを阻害し、かつ増大した安定性を示す抗体、例えば、ＣＤＲ中に複数の芳香族残基を含むＣＤ３９ポリペプチドを阻害する抗体、及びＫａｂａｔ位置２３４、２３５、２３７、３２２、３３０及び３３１の残基のいずれか３つ、４つ、５つ又はそれ以上のアミノ酸置換を含む改変ヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメイン、及び（ｉｉ）ヒトＩｇＧアイソタイプの第２抗体（第２抗体はヒトＰＤ−１、任意選択で抗ＰＤ−１抗体、任意選択で抗ＰＤ−Ｌ１抗体を中和する）を含む医薬製剤が提供される。一実施形態において、抗ＣＤ３９抗体及び第２抗体の両方が、Ｋａｂａｔ位置２３４、２３５、２３７、３２２、３３０及び３３１の残基のいずれか３つ、４つ、５つ又はそれ以上のアミノ酸置換を含む改変ヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインを含む。
一態様では、ＣＤ３９発現細胞（例えば、個体における白血球及び／又は腫瘍細胞）によるＡＴＰ加水分解を減少させる方法、又は細胞ＣＤ３９の酵素活性を中和する方法であって、ＣＤ３９発現細胞をＣＤ３９を阻害する本発明の抗体と接触させることを含むか、実質的にそれからなるか、又はそれからなる方法が提供される。一実施形態において、ＣＤ３９発現細胞を本開示の抗原結合化合物と接触させるステップは、個体にＣＤ３９を阻害する抗体の治療有効量を投与することを含む。一実施形態において、個体は癌を有する。
一態様では、腫瘍環境（例えば、個体における）に存在するアデノシンを減少させる方法であって、方法は、個体に治療的に活性な量の、ＣＤ３９ポリペプチドを阻害する本開示の抗体を投与することを含むか、実質的にそれからなるか、又はそれからなる。一実施形態において、個体は癌を有する。
一実施形態において、ＣＤ３９ポリペプチドを阻害する抗体の活性量は、個体のＡＴＰのＡＭＰへのＣＤ３９媒介代謝の阻害について、少なくともＥＣ５０、任意選択でＥＣ７０、任意選択で実質的にＥＣ１００の血中濃度を達成及び／又は維持（例えば、抗原結合化合物のその後の投与まで）するのに有効な量である。一実施形態において、ＣＤ３９ポリペプチドを阻害する抗原結合化合物の活性量は、個体の血管外組織におけるＡＴＰのＡＭＰへのＣＤ３９媒介代謝の阻害について、ＥＣ５０、任意選択でＥＣ７０、任意選択で実質的にＥＣ１００を達成するのに有効な量である。一実施形態において、ＣＤ３９ポリペプチドを阻害する抗原結合化合物の活性量は、個体のＡＴＰのＡＭＰへのＣＤ３９媒介代謝の阻害について、ＥＣ５０、任意選択でＥＣ７０、任意選択で実質的にＥＣ１００を達成するのに有効な量である。一実施形態において、ＣＤ３９ポリペプチドを阻害する抗原結合化合物の活性量は、１〜２０ｍｇ／ｋｇ体重である。一実施形態において、活性量は、個体に毎週、２週間ごと、毎月又は２ヶ月ごとに投与される。
任意選択で、個体は、癌を有するか、又は癌を有しやすいヒトである。任意選択で、個体は、血管ＣＤ３９を発現する悪性細胞を特徴とする癌を有するか、又は有しやすいヒトである。任意選択で、個体は、癌を有するか、又は有しやすく、血管ＣＤ３９を発現する循環性又は腫瘍浸潤性白血球の検出可能なレベルを有するヒトである。任意選択で、本開示の血管ＣＤ３９特異的抗体で処置された個体は、検出可能なレベルの可溶性ＣＤ３９アイソフォーム、例えば、アイソフォームＬ２及び／又はＬ４（例えば、アイソフォームは循環中又は血管外組織中で検出可能なレベルにある）を有する。
抗体は、任意選択で、１０−９Ｍ未満（より良好）、好ましくは１０−１０Ｍ未満、又は好ましくは１０−１１Ｍ未満のヒトＣＤ３９ポリペプチドに対する結合親和性（ＫＤ）及び／又はヒトＣＤ３９を１μｇ／ｍｌよりも低い（より良好な結合）ＥＣ５０で結合することを特徴とし、好ましくは抗体は、細胞表面でヒトＣＤ３９を発現する細胞（例えば腫瘍細胞）への結合につき、０．５μｇ／ｍｌ以下、任意選択で０．２μｇ／ｍｌ以下、任意選択で０．１μｇ／ｍｌ以下のＥＣ５０を有する。
抗体は、任意選択で、キメラ、ヒト又はヒト化抗体である。
抗体は、任意選択で、ＣＤ３９発現細胞中のＣＤ３９の酵素活性の中和につき、１μｇ未満（より良好）、任意選択で０．５μｇ未満であることを特徴とするＥＣ５０によって特徴付けられる。
一実施形態において、抗体は、ＣＤ３９の酵素活性を中和する結合特異性及び能力を保持するモノクローナル抗体又はそのフラグメントである。一実施形態において、抗体は、ＩｇＧ１抗体である。例えば、抗体は、ＦｃドメインとＦｃγ受容体との間の結合を減少させるように改変されたヒトＩｇＧアイソタイプのＦｃドメインを含む抗体（例えば、ＣＤ１６）であってもよい。一実施形態において、抗原結合化合物は、抗体媒介細胞毒性（ＡＤＣＣ）及び／又はＣＤＣを誘導することができるＦｃドメインを含まず；任意選択で、抗原結合化合物は、ＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６）ポリペプチドに実質的に結合することができるＦｃドメインを含まず（例えば、ＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６）ポリペプチドに実質的に結合できないＦｃドメインを含み；Ｆｃドメインを欠く（例えば、ＣＨ２及び／又はＣＨ３ドメインを欠き；ＩｇＧ４アイソタイプのＦｃドメインを含む）。一実施形態において、Ｆｃドメイン（例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４アイソタイプ）のＦｃドメインは、野生型Ｆｃドメインと比較してアミノ酸改変（例えば、置換）を含み、その置換により、Ｆｃγ受容体（例えば、ＣＤ１６）に結合する及び／又は補体に結合するＦｃドメインの能力が低減される。任意選択で、置換は、複数（例えば、３つ、４つ、５つ、６つ又はそれ以上）の芳香族アミノ酸残基、任意選択でチロシン及び／又はフェニルアラニンを含むＣＤＲ（例えば、ＶＨＣＤＲ３）を含む抗体のｉｎ ｖｉｖｏ及び／又はｉｎ ｖｉｔｒｏ安定性を増加又は改善する（例えば、凝集傾向を低下させる）。一実施形態において、抗原結合化合物は毒性部分に結合していない。
上記のいずれかの特性を有するヒト若しくはヒト化抗体又は抗体フラグメントをコードする核酸、このような核酸を含むベクター、このようなベクターを含む細胞、及びこのような細胞を抗ＣＤ３９抗体の発現に適した条件下で培養することを含むヒト抗ＣＤ３９抗体の製造方法も提供される。本開示はまた、このようなタンパク質、核酸、ベクター、及び／又は細胞、並びに典型的には製剤、送達、安定性、又は組成物の他の特徴（例えば、様々な担体）を促進する活性成分又は不活性成分であり得る１つ以上の追加の成分を含む、薬学的に許容される組成物などの組成物及びキットに関する。本開示はさらに、ＣＤ３９媒介生物学的活性の調節などにおいて、例えばそれに関連する疾患、特に癌の治療において、このような抗体、核酸、ベクター、細胞、生物、及び／又は組成物を作製及び使用する様々な新規かつ有用な方法に関する。
本開示はまた、前記組成物のいずれかの有効量を対象に投与することを含む、それを必要とする対象におけるリンパ球（例えば、Ｔ細胞）の活性を増強する方法、又はリンパ球（例えば、Ｔ細胞）の活性を回復させる方法、又はリンパ球（例えば、Ｔ細胞）のアデノシン媒介阻害を緩和する方法を提供する。一実施形態において、対象は癌に罹患している患者である。例えば、患者は固形腫瘍、例えば結腸直腸癌、腎癌、卵巣癌、肺癌、乳癌又は悪性黒色腫に罹患している可能性がある。あるいは、患者は、造血性癌、例えば、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、多発性骨髄腫、又は非ホジキンリンパ腫に罹患していてもよい。
本開示はまた、個体における疾患の治療方法を提供し、治療は、個体に少なくとも１回の投与サイクルにおいてＣＤ３９の酵素活性を中和する抗ＣＤ３９抗体を投与することを含み、抗ＣＤ３９抗体は少なくとも１回、任意選択で少なくとも２回、抗ＣＤ３９抗体の２回の連続投与の間においてＣＤ３９の酵素活性の中和（例えば、ＥＣ１００は０．０５〜１μｇ／ｍｌ、０．１〜１μｇ／ｍｌ）について、少なくともＥＣ５０（例えば、０．０１〜０．５μｇ／ｍｌ）、任意選択でＥＣ７０、又は任意選択でＥＣ１００に対応する血液（血清）又は血管外組織（例えば、腫瘍環境）中の濃度を達成及び／又は維持するのに有効な量で投与される。抗体は、例えば、少なくとも約０．１μｇ／ｍｌ、０．５μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ又は２μｇ／ｍｌ）の循環中又は血管外組織（例えば、腫瘍環境）中の濃度を達成及び／又は維持する量で投与することができる。例えば、０．０５〜１μｇ／ｍｌ又は０．１〜１μｇ／ｍｌの血管外組織中の濃度を達成するために、抗ＣＤ３９抗体は、０．５〜１０μｇ／ｍｌ、又は１〜１０μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３９抗体の循環中の濃度を達成するのに有効な量で投与される。任意選択で、抗ＣＤ３９抗体は、少なくとも２回、抗ＣＤ３９抗体の濃度を少なくとも１週間、２週間、３週間、４週間、抗ＣＤ３９抗体の２回の連続投与の間及び／又は投与サイクル全体を通じて、少なくとも上記の濃度に維持するために有効な量で投与される。
本開示はまた、個体における疾患の治療方法を提供し、治療は、個体に少なくとも１回の投与サイクルにおいてＣＤ３９の酵素活性を中和する抗ＣＤ３９抗体を投与することを含み、抗ＣＤ３９抗体は少なくとも１回、任意選択で少なくとも２回、抗ＣＤ３９抗体の２回の連続投与の間において、少なくとも１μｇ／ｍｌ、任意選択で１０μｇ／ｍｌ、任意選択で１〜１００μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３９抗体の血液又は組織濃度を達成及び／又は維持するのに有効な量で投与される。任意選択で、抗ＣＤ３９抗体は、少なくとも２回、抗ＣＤ３９抗体の連続的な血液又は組織濃度を、少なくとも１週間、２週間、３週間、４週間、抗ＣＤ３９抗体の２回の連続投与の間、及び／又は投与サイクルを通じて、少なくとも１μｇ／ｍｌ、任意選択で少なくとも１０μｇ／ｍｌ、任意選択で１〜１００μｇ／ｍｌに維持するために有効な量で投与される。
これらの態様は、本明細書で提供される記述において、より完全に記載され、さらなる態様、特徴及び利点は、当該記述から明らかになる。
組換えヒト及びカニクイザルＣＤ３９への結合に対するＥＬＩＳＡによる滴定を示す。 組換えヒトＣＤ３９アイソフォーム：血管ＣＤ３９、ＣＤ３９−Ｌ１、ＣＤ３９−Ｌ２、ＣＤ３９−Ｌ３及びＣＤ３９−Ｌ４に対するＩ−３９１抗体による結合に対するＥＬＩＳＡによる滴定を示す。抗体Ｉ−３９１は、−Ｌ１、ＣＤ３９−Ｌ２、ＣＤ３９−Ｌ３又はＣＤ３９−Ｌ４に結合することなく、血管ＣＤ３９のみに結合した。ＨＵＳ２又はマウスＩｇＧ２ａフォーマット抗体のアイソタイプ対照（ＩＣ）は、ＣＤ３９又はＣＤ３９−Ｌ分子に結合しない。上のパネルは、ヒトＦｃγ受容体（ＨＵＳ２）への結合を失うように突然変異したヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインを有する抗体Ｉ−３９１又はアイソタイプ対照を示す。下のパネルは、マウスＩｇＧａアイソタイプ（ＭＯＧＡ）のＦｃドメインを有する抗体を示す。 Ｉ−３９１とのインキュベーション後、ＣＤ３９発現は安定し、Ａｂの非存在下でのインキュベーションと同等のままであり、結合Ｉ−３９１の減少は検出されなかったことを示す。これは、Ｉ−３９１がＣＤ３９下方制御もＣＤ３９インターナライゼーションも誘導しなかったことを示す。ＣＤ３９の発現は、ＣＤ３９とＩ−３９１との結合について競合しないＡ１抗体を用いて評価される。 抗ＣＤ３９／ＣＤ３９複合体のＸ線回折による試験の結果を示す。 抗ＣＤ３９／ＣＤ３９複合体のＸ線回折による試験の結果を示す。中和抗ＣＤ３９の標的抗原ＣＤ３９への結合が完全に重鎖可変ドメインに依存することを示す、３次元構造が示されている。抗ＣＤ３９抗体軽鎖は抗原と直接接触しない。 抗ＣＤ３９／ＣＤ３９複合体のＸ線回折による試験の結果を示す。抗ＣＤ３９重鎖は、ＣＤ３９のＮ末端ドメイン１及びＣＤ３９のＣ末端ドメイン２の両方に結合する）。抗ＣＤ３９結合部位は、２つのＣＤ３９ドメインの尖部及び触媒間隙の入口に位置する。 抗ＣＤ３９／ＣＤ３９複合体のＸ線回折による試験の結果を示す。ヒトＣＤ３９／抗ＣＤ３９凍結立体配座は、ｐｄｂ結晶３ＺＸ３のラットＣＤ３９ Ａ型と完全に重なり合う。従って、両方のドメインへの抗体の同時結合は、ドメイン運動を阻害し、所定の凍結状態で酵素を遮断する可能性が高い。 野生型ヒトＦｃドメインと比較してより高い凝集温度（ＴＡｇｇ）及び改善された抗体の安定性を示した、いくつかのヒトＩｇＧ１Ｆｃドメイン突然変異体を示す。
定義
本明細書で用いる「ａ」又は「ａｎ」は、１つ以上を意味し得る。用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」と併せて使用される場合、特許請求の範囲で使用される用語「ａ」又は「ａｎ」は、１つ以上を意味し得る。本明細書で用いる「別の」は、少なくとも第２又はそれ以上を意味し得る。
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」が使用される場合、これは、任意選択で「から実質的になる」又は「からなる」で置換され得る。
「血管」ＣＤ３９、ＮＴＰｄａｓｅ１、ＥＮＴＰＤ１、ＡＴＰＤａｓｅ及び血管ＡＴＰジホスホヒドロラーゼとしても知られているヒトＣＤ３９は、ＡＴＰａｓｅ活性を示す。ＣＤ３９は、細胞外ＡＴＰ及びＡＤＰをＡＭＰに加水分解し、ＡＭＰはさらに別の酵素である５−プライムヌクレオチダーゼによってアデノシンに変換される。「血管」ヒトＣＤ３９成熟ポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、受託番号Ｐ４９９６１としてＧｅｎｂａｎｋに示されており、その全開示は参照により本明細書に組み込まれ、以下の通りである：
ＮＴＰＤａｓｅ２又はＥＮＴＰＤ２としても知られているヒトＣＤ３９−Ｌ１は、Ｇｅｎｂａｎｋに受託番号ＮＰ＿００１２３７で示されており、その全開示は参照により本明細書に組み込まれ、以下の通りである：
ＮＴＰＤａｓｅ６又はＥＮＴＰＤ６としても知られているヒトＣＤ３９−Ｌ２；ＥＮＴＰＤ６アイソフォーム１は、受託番号ＮＰ＿００１２３８としてＧｅｎｂａｎｋに示されており、その全開示は参照により本明細書に組み込まれ、以下の通りである：
ＮＴＰＤａｓｅ３又はＥＮＴＰＤ３としても知られているヒトＣＤ３９−Ｌ３；ＥＮＴＰＤ３アイソフォームは、Ｇｅｎｂａｎｋに受託番号ＮＰ＿００１２３９として示されており、その全開示は参照により本明細書に組み込まれ、以下の通りである：
ＮＴＰＤａｓｅ５又はＥＮＴＰＤ５としても知られているヒトＣＤ３９−Ｌ４は、受託番号ＮＰ＿００１２４０（前駆体）としてＧｅｎｂａｎｋに示されており、その全開示は参照により本明細書に組み込まれ、以下の通りである：
本明細書において、「中和する」又は「中和」とは、ＣＤ３９ポリペプチドに関する場合（例えば、「ＣＤ３９を中和する」、「ＣＤ３９の活性を中和する」又は「ＣＤ３９の酵素活性を中和する」）、ＣＤ３９のＡＴＰ加水分解（ＡＴＰａｓｅ）活性が阻害される処理を指す。これは、特に、ＡＭＰ及び／又はＡＤＰのＣＤ３９媒介産生の阻害、すなわちＡＭＰ及び／又はＡＤＰに対するＡＴＰのＣＤ３９媒介代謝の阻害を含む。これは、例えばＡＴＰのＡＭＰ及び／又はＡＤＰへの直接的又は間接的な変換を阻害する試験化合物の能力を測定する細胞アッセイで測定することができる。例えば、本明細書に記載のように、ＡＴＰの消失及び／又はＡＭＰの産生を評価することができる。一実施形態において、抗体調製物は、例えば本明細書に記載のアッセイ（例えば、ＡＴＰの消失及び／又はＡＭＰの産生）に関し、ＡＴＰのＡＭＰへの変換の少なくとも６０％の減少、ＡＴＰのＡＭＰへの変換の少なくとも７０％の減少、又はＡＴＰのＡＭＰへの変換の少なくとも８０％又は９０％の減少を引き起こす。
抗ＣＤ３９結合剤（例えば、抗体）に関して「癌の治療」などが言及されるときはいつでも、以下を含み得る：（ａ）癌の治療方法であって、前記方法がこのような治療を必要とする個体、哺乳動物、特にヒトに、抗ＣＤ３９結合剤（好ましくは薬学的に許容される担体物質中）を、癌の治療を可能にする用量で（治療有効量）、好ましくは本明細書に記載の用量（量）で、投与する（少なくとも１つの治療で）ステップを含む方法；（ｂ）癌の治療のための抗ＣＤ３９結合剤の使用、又は前記治療（特にヒトにおいて）における使用のための、抗ＣＤ３９結合剤；（ｃ）癌の治療のための医薬調製物の製造のための抗ＣＤ３９結合剤の使用、抗ＣＤ３９結合剤と薬学的に許容される担体とを混合することを含む癌の治療のための医薬調製物の製造のための抗ＣＤ３９結合剤の使用方法、又は癌の治療に適切な有効量の抗ＣＤ３９結合剤を含む医薬調製物。（ｄ）本出願が提出された国における特許取得のために許容される主題に従う、ａ）、ｂ）、及びｃ）のいずれかの組み合わせ。
本明細書で用いる「抗体」という用語は、ポリクローナル及びモノクローナル抗体を指す。重鎖における定常ドメインの種類に応じて、抗体は５つの主要クラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭのうちの１つに割り当てられる。これらのいくつかは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４などのサブクラス又はアイソタイプにさらに区分される。例示的免疫グロブリン（抗体）構造単位は、四量体を含む。各四量体は、ポリペプチド鎖の２つの同じ対から構成され、各対は、１つの「軽」鎖（約２５ｋＤａ）と１つの「重」鎖（約５０〜７０ｋＤａ）を有する。各鎖のＮ末端は、主に抗原認識を担う約１００〜１１０個以上のアミノ酸の可変領域を画定する。可変軽鎖（ＶＬ）及び可変重鎖（ＶＨ）という用語は、それぞれこれらの軽鎖及び重鎖を指す。様々なクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれ「α」、「δ」、「ε」、「γ」及び「μ」と呼ばれる。様々なクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造及び３次元配置がよく知られている。ＩｇＧは、生理学的状況において最も一般的な抗体であり、実験室環境で最も容易に作製されるため、本明細書で使用される例示的なクラスの抗体である。任意選択的に、抗体は、モノクローナル抗体である。抗体の特定の例は、ヒト化、キメラ、ヒト、又は他のヒトに好適な抗体である。「抗体」はまた、本明細書に記載する抗体の任意のフラグメント又は誘導体も含む。
「〜に特異的に結合する」という用語は、タンパク質のいずれかの組換え形態、その中のエピトープ、又は単離した標的細胞の表面上に存在するネイティブタンパク質を用いて評価されるように、ある抗体が、好ましくは競合的結合アッセイにおいて、結合パートナー、例えば、ＣＤ３９に結合することができることを意味する。特異的結合を決定するための競合的結合アッセイ及び他の方法は、以下に詳しく説明され、また当分野においても公知である。
抗体が、特定のモノクローナル抗体と「競合する」と言うとき、組換えＣＤ３９分子又は表面発現ＣＤ３９分子のいずれかを用いた結合アッセイにおいて、前記抗体が、モノクローナル抗体と競合することを意味する。例えば、試験抗体が、結合アッセイにおいて、参照抗体とＣＤ３９ポリペプチド又はＣＤ３９発現細胞との結合を低減する場合、前記抗体は、参照抗体と「競合する」と言う。
本明細書で用いる「親和性」という用語は、抗体とエピトープの結合の強度を意味する。抗体の親和性は、［Ａｂ］ｘ［Ａｇ］／［Ａｂ−Ａｇ］として定義される解離定数Ｋｄによって示されるが、ここで、［Ａｂ−Ａｇ］は、抗体−抗原複合体のモル濃度であり、［Ａｂ］は、非結合抗体のモル濃度であり、［Ａｇ］は、非結合抗原のモル濃度である。親和定数Ｋａは、１／Ｋｄによって定義される。ｍＡｂの親和性を決定する方法は、Ｈａｒｌｏｗ，ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８８）、Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃ．Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ．Ｙ．，（１９９２，１９９３），Ｍｕｌｌｅｒ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．９２：５８９−６０１（１９８３）に記載されており、これらの参照文献は、全体を参照として本明細書に組み込む。ｍＡｂの親和性を決定する上で公知の標準的な一方法は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）スクリーニング（ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）ＳＰＲ分析装置での分析によるものなど）の使用である。
本明細書に関連する限り、「決定基」は、ポリペプチド上の相互作用部位又は結合部位を意味する。
「エピトープ」という用語は、抗原決定基と称され、抗体が結合する抗原上の区画又は領域である。タンパク質エピトープは、結合に直接関与するアミノ酸残基、並びに特定の抗原結合抗体又はペプチドによって有効に阻止されるアミノ酸残基、すなわち、抗体の「フットプリント」内のアミノ酸残基を含んでよい。これは、例えば、抗体又は受容体と結合することができる複合抗原分子上の最も単純な形態、又は最小の構造区画である。エピトープは、直線状又は立体的／構造的であってよい。「直線状エピトープ」は、アミノ酸の直線状配列上の連続したアミノ酸残基から構成されるエピトープとして定義される（一次構造）。「立体的又は構造的エピトープ」は、全てが連続的ではなく、従って、分子のフォールディングにより互いに近接した位置に置かれるアミノ酸の直線状配列の分離した部分を表す（二次、三次及び／又は四次構造）アミノ酸から構成されるエピトープとして定義される。立体的エピトープは、三次元構造に応じて異なる。従って、「立体的」という用語は、往々にして「構造的」と置換え可能に用いられる。
「インターナライゼーション」という用語は、「細胞内インターナライゼーション」と互換的に用いられ、細胞の細胞外表面から細胞の細胞内表面に分子を移動させるプロセスに関連する分子、生化学及び細胞事象を指す。分子の細胞内インターナライゼーションを担うプロセスは周知であり、とりわけ、細胞外分子（ホルモン、抗体、及び有機小分子など）；膜結合分子（細胞表面受容体など）；及び細胞外分子に結合した膜結合分子の複合体（例えば、膜貫通受容体に結合したリガンド又は膜結合分子に結合した抗体）のインターナライゼーションを含み得る。従って、「インターナライゼーションを誘導及び／又は増加させる」とは、細胞内インターナライゼーションが開始される事象並びに／又は細胞内インターナライゼーションの速度及び／若しくは程度が増大する事象を含む。
「薬剤」という用語は、本明細書では、化学化合物、化学化合物の混合物、生物学的高分子、又は生物学的材料から作製された抽出物を示すために使用される。「治療薬」という用語は、生物学的活性を有する薬剤を指す。
本明細書の目的のために、「ヒト化」又は「ヒト」抗体は、１つ又は複数のヒト免疫グロブリンの定常及び可変フレームワーク領域は、動物免疫グロブリンの結合領域、例えば、ＣＤＲと融合する。このような抗体は、結合領域が由来する非ヒト抗体の結合特異性を維持するが、非ヒト抗体に対する免疫反応を回避するように設計されている。このような抗体は、抗原の攻撃に応答して特定のヒト抗体を産生するように「改変」されたトランスジェニックマウス又は他の動物から得ることができる（例えば、Ｇｒｅｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９４） Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ ７：１３；Ｌｏｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．（１９９４） Ｎａｔｕｒｅ ３６８：８５６；Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｉｎｔ Ｉｍｍｕｎ ６：５７９を参照；尚、これらの全教示内容は、参照として本明細書に組み込まれる）。完全なヒト抗体はまた、遺伝子又は染色体トランスフェクション方法、並びにファージディスプレイ技術により構築することも可能であり、これらは全て当分野において公知である（例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ ３４８：５５２−５５３を参照）。また、ヒト抗体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ活性化Ｂ細胞により産生することも可能である（例えば、米国特許第５，５６７，６１０号明細書及び同第５，２２９，２７５号明細書を参照；尚、これらは、その全体が参照として本明細書に組み込まれる）。
「キメラ抗体」は、（ａ）抗原結合部位（可変領域）が、キメラ抗体に新しい特性を付与する別の、若しくは改変されたクラス、エフェクター機能及び／又は種、又は完全に異なる分子（例えば、酵素、毒素、ホルモン、成長因子、薬物など）と連結されるように、定常領域、又はその部分が改変、置換又は交換されているか；あるいは（ｂ）可変領域、又はその部分が、別の、若しくは改変された抗原特異性を有する可変領域で改変、置換又は交換されている、抗体分子である。
「超可変領域」という用語は、本明細書で使用される場合、抗原結合に関与する抗体のアミノ酸残基を指す。超可変領域は、一般に、「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」由来のアミノ酸残基（例えば、軽鎖可変ドメイン中の残基２４〜３４（Ｌ１）、５０〜５６（Ｌ２）及び８９〜９７（Ｌ３）並びに重鎖可変ドメイン中の３１〜３５（Ｈ１）、５０〜６５（Ｈ２）及び９５−１０２（Ｈ３）；Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．１９９１）、及び／又は「超可変ループ」由来のアミノ酸残基（例えば、軽鎖可変ドメイン中の残基２６〜３２（Ｌ１）、５０〜５２（Ｌ２）及び９１〜９６（Ｌ３）並びに重鎖可変ドメイン中の２６〜３２（Ｈ１）、５３〜５５（Ｈ２）及び９６−１０１（Ｈ３）；Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ １９８７；１９６：９０１−９１７）、又は抗原結合に関与する必須アミノ酸を決定するための同様の系を含む。典型的には、この領域におけるアミノ酸残基の番号付けは、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．（上記）に記載の方法によって実施される。本明細書における「Ｋａｂａｔ位置」、「Ｋａｂａｔにおける可変ドメイン残基番号付け」及び「Ｋａｂａｔによる」などのフレーズは、重鎖可変ドメイン又は軽鎖可変ドメインのためのこの番号付けシステムを指す。Ｋａｂａｔ番号付けシステムを使用して、ペプチドの実際の線形アミノ酸配列は、可変ドメインのＦＲ又はＣＤＲの短縮又は挿入に対応する、より少ない又は追加のアミノ酸を含み得る。例えば、重鎖可変ドメインは、ＣＤＲ Ｈ２の残基５２の後の単一アミノ酸挿入物（Ｋａｂａｔによる残基５２ａ）及び重鎖ＦＲ残基８２の後の挿入残基（例えば、Ｋａｂａｔによる残基８２ａ、８２ｂ及び８２ｃなど）を含み得る。残基のＫａｂａｔ番号付けは、抗体の配列の相同性領域での「標準的な」Ｋａｂａｔ番号付け配列とのアラインメントにより、所与の抗体について決定され得る。
本明細書で用いる「フレームワーク」又は「ＦＲ」残基とは、ＣＤＲとして定義される領域を除いた抗体可変ドメインの領域を意味する。各抗体可変ドメインフレームワークは、ＣＤＲ（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４）によって分離された連続領域にさらに細分することができる。
「Ｆｃドメイン」、「Ｆｃ部分」、及び「Ｆｃ領域」は、例えば、アミノ酸（ａａ）２３０前後〜ａａ４５０前後のヒトγ（γ）重鎖又は他のタイプの抗体重鎖（例えば、ヒト抗体の場合、α、δ、ε及びμ）内のその対応部分配列、あるいは、それらの天然に存在するアロタイプからの、抗体重鎖のＣ末端断片を指す。特に記載のない限り、本開示全体を通して、一般に受け入れられているＫａｂａｔアミノ酸番号付け（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ ｅｄ．，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ， Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤを参照）が用いられる。
「単離された」、「精製された」又は「生物学的に純粋な」という用語は、ネイティブな状態で見出されるようなそれに通常付随する成分を実質的に、又はほとんど含まない物質を指す。純度及び等質性は、典型的に、ポリアクリルアミドゲル電気泳動又は高性能液体クロマトグラフィーなどの解析化学技術を用いて決定する。調製物中に存在する主要な種であるタンパク質を実質的に精製する。
「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」という用語は、本明細書では置換え可能に用いられ、アミノ酸残基のポリマーを指す。これらの用語は、１つ又は複数のアミノ酸残基が、対応する天然アミノ酸の人工的化学模倣物であるアミノ酸ポリマー、並びに天然のアミノ酸ポリマー及び非天然のアミノ酸ポリマーに適用する。
「組換え」という用語は、例えば、細胞、又は核酸、タンパク質、又はベクターに関して用いられる場合、細胞、核酸、タンパク質若しくはベクターが、異種核酸若しくはタンパク質の導入又はネイティブ核酸若しくはタンパク質の改変によって修飾されているか、あるいは、細胞がそのように修飾された細胞に由来するものであることを示す。従って、例えば、組換え細胞は、細胞のネイティブ（非組換え）形態内で見出されない遺伝子を発現するか、又は他の場合には異常に発現される、過小発現されるか、若しくは全く発現されないネイティブ遺伝子を発現する。
本明細書に関連する限り、ポリペプチドに「結合する」抗体という用語は、特異性及び／又は親和性で、前記決定基に結合する抗体を意味する。
「同一性」又は「同一の」という用語は、２つ以上のポリペプチドの配列同士の関係について用いられる場合、ポリペプチド同士の配列関係性の程度を指し、これは、２つ以上のアミノ酸残基の鎖同士の一致の数によって決定する。「同一性」は、ギャップアラインメントにより２つ以上の配列のより小さいもの同士の完全な一致（もしあれば）の割合（％）を計るもので、これは、特定の数学的モデル又はコンピュータプログラム（すなわち「アルゴリズム」）によって処理される。関連ポリペプチド同士の同一性は、公知の方法により容易に計算することができる。このような方法として、限定しないが、以下に記載されているものが挙げられる：Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８８；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９３；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ １，Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．、及びＧｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，ｅｄｓ．，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ，１９９４；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９８７；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ，Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｄｓ．，Ｍ．Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９１；並びにＣａｒｉｌｌｏ ｅｔ ａｌ．，ＳＩＡＭ Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ．４８，１０７３（１９８８）。
同一性を決定するための方法は、試験対象の配列同士の最大の一致をもたらすように設計される。同一性を決定する方法は、一般に入手可能なコンピュータプロフラムに記載されている。２つの配列同士の同一性を決定するためのコンピュータプログラム方法としては、ＧＣＧプログラムパッケージがあり、以下のものが挙げられる：ＧＡＰ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．１２，３８７（１９８４）；Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、及びＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５，４０３−４１０（１９９０））。ＢＬＡＳＴＸプログラムは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）及び他の供給源（ＢＬＡＳＴ Ｍａｎｕａｌ，Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．ＮＣＢ／ＮＬＭ／ＮＩＨ Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．２０８９４；Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．、前掲）から一般に入手可能である。また、公知のＳｍｉｔｈ Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを用いて、同一性を決定することもできる。
抗体の生成
癌及び／又は他の疾患（例えば、感染性疾患）の処置に使用され得る抗ＣＤ３９抗体は、ヒトＣＤ３９ポリペプチドの細胞外部分に結合し、細胞（例えば、腫瘍細胞）の表面上に発現されるＣＤ３９の酵素活性を中和する。一実施形態において、薬剤はＣＤ３９のＡＴＰａｓｅ活性を阻害する。一実施形態において、抗体はＣＤ３９媒介アデノシン産生を阻害する。一実施形態において、抗体は、ＡＭＰに対するＡＴＰのＣＤ３９媒介異化を阻害する。一実施形態において、抗体は、リンパ球活性（例えば、Ｔ細胞）のアデノシン媒介阻害を阻害する。一態様では、抗体は、全長抗体、抗体フラグメント、及び合成又は半合成抗体由来の分子から選択される。
ＣＤ３９酵素の酵素的（ＡＴＰａｓｅ活性）活性を強力に阻害する抗体は、酵素をその立体配座の１つに固定化し、それによりその基質を加水分解することを妨げることによって、そうするようである。抗体は、同時にＣＤ３９のＣ末端ドメイン及びＮ末端ドメインの両方に結合することによって、これを達成する。
従って、任意の実施形態において、抗ＣＤ３９抗体は、ＣＤ３９のＣ末端ドメイン及びＮ末端ドメインの両方に、それらのＶＨＣＤＲを介して結合することができる（ＶＬＣＤＲがＣＤ３９に結合する必要は全くない）。実施例に示すように、ＣＤ３９のＮ末端ドメイン（ドメイン１）への結合は、２つのＣＤＲ（ＣＤＲ１及びＣＤＲ３、並びにＫａｂａｔ ＣＤＲ２の第１セグメントによって達成することができ、Ｃ末端ドメイン（ドメイン２）は、単一のＣＤＲ（ＣＤＲ２）（Ｋａｂａｔ ＦＲ３中に延びるＣＤＲ２）を介して達成することができる。ＣＤＲ２の寄与が驚くべきであるのみならず、さらにＣＤＲ２はＣＤ３９との結合においてＦＲ３と協同する。さらに、ＣＤ３９に対するＣＤＲ２−ＦＲによる結合は、ＣＤ３９のＮ２９２でのグリカンを含む（Ｎ２９２グリカンは、Ｃ末端ドメインの尖端表面の有意な量をカバーする）。ＶＨによるドメイン１及び２両方への結合は、基質の加水分解を防ぐためにＣＤ３９酵素を固定化するのに重要であると考えられている。従って、抗体は、ＦＲ３残基と組み合わせて、ＣＤＲ２の第１部分を介してＣＤ３９のＮ末端ドメインに結合し、ＣＤＲ２の第２部分を介してＣＤ３９のＣ末端ドメイン（Ｎ２９２のグリカンを含む）に結合するＶＨＣＤＲ２を有する。
本発明者らはさらに、ＶＨＣＤＲ３がＶＬＣＤＲとＣＤ３９との間に捕捉された、ＶＬＣＤＲ／ＶＨＣＤＲ３／ＣＤ３９結合マトリックスを含む驚くべき機構によって、ＣＤ３９への結合のためのＶＨＣＤＲ３の配置が起こることを観察した。ＶＬＣＤＲは、ＶＨのＣＤＲ３に結合するパラトープを形成する。ＶＨＣＤＲ３は多数の芳香族残基を含み、ＶＨＣＤＲ３中の芳香族残基の１つはＣＤ３９と相互作用し、ＶＨＣＤＲ３内の他の芳香族アミノ酸はＶＬの残基と相互作用する。ＶＨＣＤＲ３は、一面においてＶＬと、及び別の面においてＣＤ３９とπ相互作用を形成する複数の芳香族残基を含み、ＶＬＣＤＲとＣＤ３９の間にＶＨＣＤＲ３を捕捉し、ＣＤ３９の表面にわたる大きな結合領域を可能にするπ相互作用構造のマトリックスを生じる。さらに驚くべきことに、ＶＨＣＤ３９相互作用及びＶＨＣＤＲ３−ＶＬ相互作用の両方が、全体の接触残基がＫａｂａｔ ＦＲ残基と組み合わされた限定されたＫａｂａｔ ＣＤＲのセットを含むように、フレームワーク残基（Ｋａｂａｔ番号付けによる）を含み、構造は特定のフレームワーク残基との関連で生じたようである。
全体的な構造は、ＶＨが、酵素活性部位の一方の側でＣＤ３９のＮ末端ドメイン（例えば、配列番号１のＣＤ３９アミノ酸配列に関して、ＣＤ３９の残基Ｖ９５、Ｑ９６、Ｋ９７、Ｌ１３７、Ｅ１４０、Ｌ１４４）と結合し、及び酵素活性部位の反対側でＣＤ３９のＣ末端ドメイン（例えば、ＣＤ３９の残基Ｓ２９４、Ｋ２９８、及びＣＤ３９のＮ２９２に連結されたグリカン）と結合することを許容する。
これらの知見は、作用機序を保持し、所望のアミノ酸配列及び特徴を組み込むことを可能にする広範囲のＣＤ３９結合ポリペプチドの産生を可能にする。とりわけ、Ｎ末端ドメインに結合するＶＨＣＤＲ２セグメント、Ｃ末端ドメインに結合することができるＶＨＣＤＲ２−ＦＲ３セグメント（及び特にＮ２９２連結グリコシル化）、及びＣ末端ドメインに結合し、ＶＬＣＤＲ−ＶＨＣＤＲ３−ＣＤ３９マトリックスを生じるＶＨＣＤＲ３を含む、抗体及び他のＶＨ／ＶＬ含有タンパク質を設計することができる。ＶＬドメインのアミノ酸配列は、例えばＶドメイン相互作用に影響を及ぼさずにＶＨ又はＶＬドメイン全体の構造を維持する置換を導入することによって、及びＶドメイン相互作用が改変されるであろう場所において、アミノ酸置換をＶＨ及びＶＬの両方で、それぞれの接触位置で対のようにすることによって、所望のＶＨ配列との関連で選択され得る。得られたタンパク質は、ＶＨドメインを介してＣＤ３９に実質的又は排他的に結合し、ＶＬドメインはＶＨＣＤＲ３に結合するが、ＣＤ３９との結合には関与しない。広範囲の両方のＶＬＣＤＲアミノ酸配列をこのようなタンパク質に用いることができ、任意選択でＶＬＣＤＲ残基及びそれぞれのＶＨ残基を選択し、ＶＨ／ＶＬＣＤＲ接触が維持されるように対として置換することができる。同様に、ＶＨＣＤＲ−ＶＬＣＤＲ接触及びＶＨＣＤＲ−ＣＤ３９接触を維持する特定の位置に存在するアクセプターフレームワークとして、広範囲のヒト（又は非ヒト）ＶＨ及びＶＬフレームワーク配列を選択することができる。
その結果、一実施形態において、抗ＣＤ３９抗原結合ドメイン、又は抗原結合ドメイン（例えば、抗体又は抗体フラグメント、多重特異性結合タンパク質、二重特異性抗体など）を含む抗原結合タンパク質は、相補的決定領域（ＣＤＲ）及びフレームワーク領域（ＦＲ）を含む。抗原結合ドメインは、所望の及び／又は改善された特性を提供するように設計又は改変することができる。
一実施形態において、抗ＣＤ３９抗原結合タンパク質は、ヒトＣＤ３９ポリペプチドに結合し、その活性を阻害することができ、抗原結合タンパク質は、それぞれがフレームワーク（例えば、ヒト起源のアミノ酸配列を有するフレームワーク）並びにＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む、ＶＨ及びＶＬを含み、抗原結合タンパク質は、ＣＤ３９のＮ末端ドメイン及びＣＤ３９のＣ末端ドメインに結合することができる。一実施形態において、抗原結合タンパク質は、ＣＤ３９に結合した場合にＣＤ３９のドメイン移動を制限する。任意選択で、ＶＨ及び／又はＶＬフレームワーク（例えば、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及び／又はＦＲ４）はヒト由来である。一実施形態において、ＶＨは、ＣＤ３９のＮ末端ドメインに結合することができる第１ＣＤＲ（又は抗原結合ドメイン）及びＣＤ３９のＣ末端ドメインのアミノ酸残基に結合することができる第２ＣＤＲ（又は抗原結合ドメイン）を含む。
一態様（例えば、本明細書のいずれかの態様）では、結合分子又はその抗原結合フラグメントは、ＶＨ及びＶＬを含むＣＤ３９に結合し、ＣＤ３９の活性を阻害することができ、ＶＨのＫａｂａｔ ＣＤＲ１は、ＣＤ３９のＮ末端ドメインのアミノ酸残基に結合し、ＶＨのＫａｂａｔ ＣＤＲ２は（任意選択でＦＲ３と共に）アミノ酸残基に、及び／又はＣＤ３９のＣ末端ドメイン中のＮ２９２結合グリカンに結合し、ＶＨのＫａｂａｔ ＣＤＲ３は、ＣＤ３９のＮ末端ドメインのアミノ酸残基に結合する。任意選択で、ＶＨのＣＤＲ２は、ＣＤ３９のＮ末端ドメインに結合する第１アミノ酸セグメントと、ＦＲ３残基と共にＣＤ３９のＣ末端ドメインと結合するアミノ酸セグメントとを含む。任意選択で、ＣＤＲ３は、ＣＤ３９のＮ末端ドメイン中のアミノ酸残基に結合することができる芳香族残基（例えば、チロシン）及びＶＬ中のアミノ酸残基と接触することができる第２芳香族アミノ酸残基（例えば、チロシン、フェニルアラニン）を含む。任意選択で、結合分子又は抗原結合フラグメントは、Ｋａｂａｔ ＣＤＲ中の残基を介してＶＨのＫａｂａｔ ＣＤＲ３に結合するＶＬを含む。
一実施形態において、ＣＤＲ１は、ＣＤ３９のＮ末端ドメインにアミノ酸残基を接触させることができる残基を含む。任意選択で、ＣＤ３９接触残基は、Ｋａｂａｔ位置３３にあり、任意選択で位置３１及び３３の両方にある。一実施形態において、Ｋａｂａｔ ＦＲ１は、Ｋａｂａｔ位置３０にＣＤ３９接触残基を含み、任意選択で残基がスレオニンである。任意選択で、３１位の残基はヒスチジン又はアスパラギンである。任意選択で、３３位の残基はグリシンである。任意選択で、３２位の残基は、芳香族側鎖を有する残基（芳香族残基）である。
一実施形態において、ＣＤＲ２及びＦＲ３は、ＣＤ３９のＣ末端ドメインのアミノ酸残基に接触することができる残基のセグメントをＫａｂａｔ位置５９〜７１内、任意選択で５９〜７２ｂ内に含み、任意選択で、さらにＫａｂａｔ位置５９〜７１の残基がＣＤ３９の残基Ｎ２９２のグリカンと接触する。例えば、Ｋａｂａｔ ＣＤＲ２及びＦＲ３は、Ｋａｂａｔ位置５９、６５、６７、６８、６９、７０及び／又は７１に、及び任意選択でさらにＣＤ３０のＣ末端に接触することができる残基７２、７２ａ及び／又は７２に、例えば、ＣＤ３９内に存在するアミノ酸及びＣＤ３９ポリペプチドのＮ２９２におけるグリカンを含む、残基を含み得る。
一実施形態において、ＣＤＲ２（例えば、Ｋａｂａｔ ＣＤＲ２−ＦＲ３セグメント）は、Ｋａｂａｔ位置５９〜７１に式Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１３（配列番号１２）を有する残基を含み、Ｘ１はチロシンを表し、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５及びＸ６の各々はそれぞれ任意のアミノ酸を表し、Ｘ７はグリシン又は抗原結合を低下させる立体障害を導入しない別の残基を表し、Ｘ８は任意のアミノ酸を表し、Ｘ９はフェニルアラニン又はβ−ストランドの位置及びＶＨドメイン構造の完全性を維持することができる別の疎水性残基を表し、Ｘ１０はアラニン又はバリン、任意選択でロイシン、任意選択でスレオニン、任意選択で疎水性残基を表し、Ｘ１１はフェニルアラニン又はβ−ストランドの位置及びＶＨドメイン構造の完全性を維持することができる別の疎水性残基（例えば、イソロイシン）を表し、及びＸ１２はセリンを表し、及びＸ１３は任意のアミノ酸、任意選択でロイシン、任意選択でアラニン、バリン、スレオニン又はアルギニンを表す。一実施形態において、Ｋａｂａｔ位置７２、７２ａ及び７２ｂのＶＨＦＲ３残基は式Ｘ１Ｘ２Ｘ３を有し、Ｘ１はアスパラギン酸、グルタミン酸又はアラニンを表し、Ｘ２は任意のアミノ酸、任意選択でアラニン、スレオニン若しくはアスパラギン又はその保存的置換を表し、Ｘ３はセリン、任意選択でアラニン、又はその保存的置換を表す。
一実施形態において、ＶＨは、Ｋａｂａｔ位置７１（ＦＲ３）にロイシン残基を含む。ヒト又はヒト化抗体は、特定のヒトＶＨＦＲドメインに存在するＫａｂａｔ位置６７〜７１にＦＲ３シグネチャー配列ＦＶＦＳＬを有することが有利であり得る。従って、本明細書の任意の実施形態の一態様では、Ｋａｂａｔ位置６７〜７１の残基のセグメントは、アミノ酸配列：ＦＶＦＳＬを含む。
一実施形態において、ＣＤＲ２は、ＣＤ３９のアミノ酸残基と接触することができる（例えば、ＣＤ３９のＮ末端ドメインにおいて）Ｋａｂａｔ位置５０〜５６の残基のセグメント、任意選択で残基５０、５２、５２ａ、５３及び／又は５６を含み、任意選択で、位置５３の芳香族残基はアミノ酸残基である。一実施形態において、ＣＤＲ２は、ＣＤ３９中のアミノ酸残基を接触させることができる残基５０、５２、５２ａ、５３及び／又は５６を含む。一実施形態において、ＣＤＲ２は、Ｋａｂａｔ位置５０〜５６に式Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８（配列番号１３）を有する残基を含み、Ｘ１はトリプトファンを表し、Ｘ２は任意のアミノ酸、任意選択でイソロイシンを表し、Ｘ３はアスパラギン又は任意選択でグルタミンを表し、Ｘ４はスレオニンを表し、Ｘ５は任意のアミノ酸残基、任意選択でチロシン、又は任意選択でフェニルアラニンを表し、Ｘ６は任意のアミノ酸、任意選択でスレオニン、任意選択でセリン、任意選択でアスパラギン、アラニン又はグリシン、任意選択で大きな残基又は疎水性残基以外の残基を表し、Ｘ７は任意のアミノ酸、任意選択でグリシン、任意選択でアラニン、セリン、スレオニン、アスパラギン又はグルタミン、任意選択でアスパラギン酸又はグルタミン酸以外の残基、任意選択でリシン又はアルギニン以外の残基を表し、Ｘ８はグルタミン酸、任意選択でアスパラギン酸を表す。
別の実施形態において、ＶＨは、ＣＤ３９のＮ及びＣ末端ドメインの両方に（例えば、Ｎ及びＣドメイン表面にわたって、基質間隙、溝入口、又は活性部位にわたって）結合するＫａｂａｔ ＣＤＲ２−ＦＲ３セグメントであって、ＣＤＲ２−ＦＲ３セグメントは、式Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１３Ｘ１４Ｘ１５Ｘ１６Ｘ１７Ｘ１８Ｘ１９Ｘ２０Ｘ２１Ｘ２２Ｘ２３（配列番号１４）を有し、Ｘ１はトリプトファンを表し、Ｘ２は任意のアミノ酸、任意選択でイソロイシンを表し、Ｘ３はアスパラギン又は任意選択でグルタミンを表し、Ｘ４はスレオニンを表し、Ｘ５は任意のアミノ酸、任意選択でチロシン又は任意選択でフェニルアラニンを表し、Ｘ６は任意のアミノ酸、任意選択でスレオニン、任意選択でセリン、任意選択でアスパラギン、アラニン又はグリシン、任意選択で大きな残基又は疎水性残基以外の残基を表し、Ｘ７は任意のアミノ酸、任意選択でグリシン、任意選択でアラニン、セリン、スレオニン、アスパラギン又はグルタミン、任意選択でアスパラギン酸又はグルタミン酸以外の残基、任意選択でリシン又はアルギニン以外の残基を表し、Ｘ８はグルタミン酸、任意選択でアスパラギン酸を表し、Ｘ９は任意のアミノ酸、任意選択でプロリンを表し、Ｘ１０は任意のアミノ酸、任意選択でスレオニン、任意選択でセリン、アスパラギン、グルタミン、ヒスチジン、グルタミン酸、アスパラギン酸、アルギニン、リシン、アラニン又はチロシン、任意選択で疎水性残基又はプロリン以外の任意の残基を表し、Ｘ１１はチロシンを表し、Ｘ１２、Ｘ１３、Ｘ１４、Ｘ１５及びＸ１６の各々はそれぞれ任意のアミノ酸を表し、Ｘ１７はグリシン又は抗原結合を低下させる立体障害を導入しない別の残基を表し、Ｘ１８は任意のアミノ酸、任意選択でアルギニンを表し、Ｘ１９はフェニルアラニン又はβ−ストランドの位置及びＶＨドメイン構造の完全性を維持することができる別の疎水性残基を表し、Ｘ２０はアラニン又はバリン、任意選択でロイシン、任意選択で疎水性残基を表し、Ｘ２１はフェニルアラニン又はβ−ストランドの位置及びＶＨドメイン構造の完全性を維持することができる別の疎水性残基を表し、Ｘ２２はセリンを表し、及びＸ２３は任意のアミノ酸、任意選択でロイシン、任意選択でアラニン、バリン又はスレオニンを表す、残基（例えば、Ｋａｂａｔ位置５０〜７１）を含む。一実施形態において、ＣＤＲ２−ＦＲ３セグメントは、Ｋａｂａｔ位置７２、７２ａ及び７２ｂに式Ｘ２４Ｘ２５Ｘ２６を有する残基をさらに含み、Ｘ２４はアスパラギン酸、グルタミン酸又はアラニンを表し、Ｘ２５は任意のアミノ酸、任意選択でアラニン若しくはスレオニン又はその保存的置換を表し、Ｘ２６はセリン、任意選択でアラニン、又はその保存的置換を表す。
一実施形態において、ＣＤＲ３は、ＣＤ３９のアミノ酸残基と接触することができる第１芳香族アミノ酸残基、及びＶＬのアミノ酸残基と接触することができる第２芳香族アミノ酸残基を含み、第１及び第２芳香族残基は、Ｋａｂａｔ位置１００、１００ｂ、１００ｃ、１００ｄ、１００ｅ及び／又は１００ｆのいずれかにある。一実施形態において、Ｋａｂａｔ ＣＤＲ３（例えば、残基がこれらの位置に存在する範囲で、Ｋａｂａｔ位置１００〜１００ｆ）は、式Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５（配列番号１５）を有するアミノ酸残基び配列を含み、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４及びＸ５のいずれか２つ、３つ又はそれ以上は芳香族アミノ酸を表す。
一実施形態において、ヒトＣＤ３９ポリペプチドに結合してその活性を阻害することができる抗原結合タンパク質が提供され、タンパク質はＣＤ３９及びＶＬ（例えば、ＶＨのＣＤＲ３に結合するＶＬ）に結合するＶＨを含み、ＶＨは以下を含む：
（ａ）ＣＤ３９のＮ末端ドメインに接触することができ、任意選択で、ＣＤ３９のアミノ酸残基と接触することができるＫａｂａｔ位置３３に、任意選択で位置３１及び３３の両方に、残基を含むＣＤＲ１；
（ｂ）以下を含むＣＤＲ２−ＦＲ３ドメイン：
ａ．ＣＤ３９のＮ末端ドメインに接触することができるアミノ酸残基を含むセグメントであって、任意選択でセグメントがＫａｂａｔ位置５０〜５６に残基を含み、任意選択でセグメントがＫａｂａｔ位置５０、５２、５２ａ、５３及び／又は５６に、１、２、３、４個又はそれ以上の（又は全ての）残基を含み、任意選択で位置５３の芳香族残基がアミノ酸残基である、セグメント；
ｂ．ＣＤ３９のＣ末端ドメインと接触することができるアミノ酸残基を含むセグメントであって、任意選択でセグメントがＫａｂａｔ位置５９〜７１に残基を含み、任意選択でセグメントがＫａｂａｔ位置５９、６５、６７、６８、６９、７０及び／又は７１に１、２、３、４又はそれ以上の（又は全ての）残基を含み、任意選択でさらにＫａｂａｔ位置５４に残基を含み、任意選択でＫａｂａｔ位置７２、７２ａ及び／又は７２ｂに残基を含む、セグメント；及び
（ｃ）ＣＤ３９のＮ末端ドメインに接触することができるＣＤＲ３（例えば、Ｋａｂａｔによる）であって、任意選択でＣＤ３９及びＶＬのＮ末端ドメインに接触することができ、任意選択でＣＤ３９のアミノ酸残基と接触することができる第１芳香族アミノ酸残基、及びＶＬのアミノ酸残基と接触することができる第２芳香族アミノ酸残基を含み、第１及び第２芳香族残基がＫａｂａｔ位置１００、１００ｂ、１００ｃ、１００ｄ、１００ｅ及び／又は１００ｆのいずれか（残基が特定のＫａｂａｔ位置に存在する範囲で）に存在する、ＣＤＲ３。
任意選択で、ＣＤＲ３は、さらなる（第３）芳香族アミノ酸残基、及び任意選択でさらなる第４芳香族アミノ酸残基をさらに含み、第３芳香族残基（及び存在する場合には第４芳香族残基）はＶＬのアミノ酸残基と接触することができ、第３芳香族残基（及び存在する場合には第４残基）はＫａｂａｔ位置１００、１００ｂ、１００ｃ、１００ｄ、１００ｅ及び／又は１００ｆのいずれかにある。
一実施形態において、ヒトＣＤ３９ポリペプチドに結合してその活性を阻害することができる抗原結合タンパク質が提供され、タンパク質はＣＤ３９及びＶＬ（例えば、ＶＨのＣＤＲ３に結合するＶＬ）に結合するＶＨを含み、ＶＨは以下を含む：
（ａ）ＣＤ３９のＮ末端ドメインに接触することができるＣＤＲ１（例えば、Ｋａｂａｔによる）であって、任意選択で、Ｋａｂａｔ位置３１、３２及び３３の残基が式Ｘ１Ｘ２Ｘ３を有し、Ｘ１は任意のアミノ酸、任意選択でヒスチジン若しくはアスパラギン、又は任意選択でその保存的置換を表し、Ｘ２は任意のアミノ酸、任意選択で芳香族残基、任意選択でチロシン、又は任意選択でその保存的置換、又は任意選択でプロリン又はグリシン以外のアミノ酸残基を表し、Ｘ３はグリシン又は立体障害を回避する別のアミノ酸を表す、ＣＤＲ１；
（ｂ）ＣＤ３９のＣ末端ドメインに接触することができるＣＤＲ２−ＦＲ３セグメント（Ｋａｂａｔによる）であって、任意選択でＫａｂａｔ位置５０〜７１の残基は、式Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１３Ｘ１４Ｘ１５Ｘ１６Ｘ１７Ｘ１８Ｘ１９Ｘ２０Ｘ２１Ｘ２２Ｘ２３（配列番号１４）を有し、Ｘ１はトリプトファンを表し、Ｘ２は任意のアミノ酸、任意選択でイソロイシンを表し、Ｘ３はアスパラギン又は任意選択でグルタミンを表し、Ｘ４はスレオニンを表し、Ｘ５は任意のアミノ酸、任意選択でチロシン又は任意選択でフェニルアラニンを表し、Ｘ６は任意のアミノ酸、任意選択でスレオニン、任意選択でセリン、任意選択でアスパラギン、アラニン又はグリシン、任意選択で大きな残基又は疎水性残基以外の残基を表し、Ｘ７は任意のアミノ酸、任意選択でグリシン、任意選択でアラニン、セリン、スレオニン、アスパラギン又はグルタミン、任意選択でアスパラギン酸又はグルタミン酸以外の残基、任意選択でリシン又はアルギニン以外の残基を表し、Ｘ８はグルタミン酸、任意選択でアスパラギン酸を表し、Ｘ９は任意のアミノ酸、任意選択でプロリンを表し、Ｘ１０は任意のアミノ酸、任意選択でスレオニン、任意選択でセリン、アスパラギン、グルタミン、ヒスチジン、グルタミン酸、アスパラギン酸、アルギニン、リシン、アラニン又はチロシン、任意選択で疎水性残基又はプロリン以外の任意の残基を表し、Ｘ１１はチロシンを表し、Ｘ１２、Ｘ１３、Ｘ１４、Ｘ１５及びＸ１６の各々はそれぞれ任意のアミノ酸を表し、Ｘ１７はグリシン又は抗原結合を低下させる立体障害を導入しない別の残基を表し、Ｘ１８は任意のアミノ酸、任意選択でアルギニンを表し、Ｘ１９はフェニルアラニン又はβ−ストランドの位置及びＶＨドメイン構造の完全性を維持することができる別の疎水性残基を表し、Ｘ２０はアラニン又はバリン、任意選択でロイシン、任意選択で疎水性残基を表し、Ｘ２１はフェニルアラニン又はβ−ストランドの位置及びＶＨドメイン構造の完全性を維持することができる別の疎水性残基を表し、及びＸ２２はセリンを表し、任意選択でさらにＸ２３は任意のアミノ酸、任意選択でロイシン、任意選択でアラニン、バリン又はスレオニンを表し、任意選択でＣＤＲ２−ＦＲ３セグメントはＫａｂａｔ位置７２、７２ａ及び７２ｂに式Ｘ２４Ｘ２５Ｘ２６を有する残基をさらに含み、Ｘ２４はアスパラギン酸、グルタミン酸又はアラニンを表し、Ｘ２５は任意のアミノ酸、任意選択でアラニン若しくはスレオニン又はその保存的置換を表し、Ｘ２６はセリン、任意選択でアラニン又はその保存的置換を表す、ＣＤＲ２−ＦＲ３セグメント；及び
（ｃ）ＣＤ３９のＮ末端と接触することができ、任意選択でＣＤ３９及びＶＬのＮ末端ドメインと接触することができる、ＣＤＲ３（例えば、Ｋａｂａｔによる）であって、任意選択で、Ｋａｂａｔ位置９５〜１０２の残基は、式Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１３Ｘ１４（配列番号１６）を有し、
− Ｘ１はアルギニン若しくはリシン又は任意選択でその保存的置換を表し、
− Ｘ２は任意のアミノ酸、任意選択でアルギニン、任意選択でリシン若しくはアラニン、又は任意選択でその保存的置換を表し、
− Ｘ３は任意のアミノ酸残基、任意選択で芳香環を含む残基、任意選択でチロシンを表し、
− Ｘ４は任意のアミノ酸、任意選択でグルタミン酸若しくはチロシン、又は任意選択でその保存的置換、又はプロリン若しくはグリシン以外のアミノ酸残基を表し、
− Ｘ５はグリシン、任意選択でアルギニン、又は任意選択でその保存的置換を表し、
− Ｘ６は任意のアミノ酸、任意選択でアスパラギン、セリン若しくはチロシン、又は任意選択でその保存的置換を表し、
− Ｘ７は任意のアミノ酸、任意選択でチロシン、アスパラギン若しくはアスパラギン酸、又は任意選択でその保存的置換、任意選択でプロリン若しくはグリシン以外のアミノ酸残基を表し、
− Ｘ８はバリン又は任意選択でアラニン、イソロイシン若しくはロイシン、任意選択で芳香族アミノ酸、任意選択でチロシンを表し、
− Ｘ９は任意のアミノ酸、任意選択で芳香族アミノ酸、任意選択でフェニルアラニン、任意選択でチロシン、任意選択でバリン又はその保存的置換を表し、
− Ｘ１０はチロシン、任意選択でフェニルアラニン、任意選択でメチオニン、又は任意選択でその保存的置換を表し、
− Ｘ１１は存在しないか又は任意のアミノ酸、任意選択でチロシン、任意選択でトリプトファン、又は任意選択でその保存的置換、任意選択でＰ、Ｇ、Ｅ若しくはＤ以外、若しくは小さな疎水性残基（例えば、Ｔ、Ｓ）以外のアミノ酸残基を表し、
− Ｘ１２は存在しないか又は任意のアミノ酸、任意選択でフェニルアラニン、若しくは任意選択でその保存的置換を表し、
− Ｘ１３は任意のアミノ酸、任意選択でアスパラギン酸、又は任意選択でその保存的置換、任意選択でセリン、任意選択でスレオニン、任意選択でグルタミン酸、任意選択でアスパラギン、任意選択で大きな疎水性残基以外の残基を表し、及び
− Ｘ１４は任意のアミノ酸、任意選択でチロシン又は任意選択でその保存的置換、任意選択で芳香族アミノ酸、任意選択で非芳香族アミノ酸を表す。
一実施形態において、ヒトＣＤ３９ポリペプチドに結合してその活性を阻害することができる抗原結合タンパク質が提供され、タンパク質はＣＤ３９及びＶＬ（例えば、ＶＨのＣＤＲ３に結合するＶＬ）に結合するＶＨを含み、ＶＨは以下を含む：
（ａ）ＣＤ３９のＮ末端ドメインに接触することができるＣＤＲ１（例えば、Ｋａｂａｔによる）であって、任意選択で、Ｋａｂａｔ位置３１、３２及び３３の残基が式Ｘ１Ｘ２Ｘ３を有し、Ｘ１は任意のアミノ酸、任意選択でヒスチジン若しくはアスパラギン、又は任意選択でその保存的置換を表し、Ｘ２は任意のアミノ酸、任意選択で芳香族残基、任意選択でチロシン、又は任意選択でその保存的置換、又は任意選択でプロリン又はグリシン以外のアミノ酸残基を表し、Ｘ３はグリシン又は立体障害を回避する別のアミノ酸を表す、ＣＤＲ１；
（ｂ）ＣＤ３９のＣ末端ドメインに接触することができるＣＤＲ２−ＦＲ３セグメント（例えば、Ｋａｂａｔによる）であって、任意選択でＫａｂａｔ位置５９〜７１の残基は、式Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１３（配列番号１２）を有し、Ｘ１はチロシンを表し、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５及びＸ６の各々はそれぞれ任意のアミノ酸を表し、Ｘ７はグリシン又は抗原結合を低下させる立体障害を導入しない別の残基を表し、Ｘ８は任意のアミノ酸を表し、Ｘ９はフェニルアラニン又はβ−ストランドの位置及びＶＨドメイン構造の完全性を維持することができる別の疎水性残基を表し、Ｘ１０はアラニン又はバリン、任意選択でロイシン、任意選択でスレオニン、任意選択で疎水性残基を表し、Ｘ１１はフェニルアラニン又はβ−ストランドの位置及びＶＨドメイン構造の完全性を維持することができる別の疎水性残基を表し、及びＸ１２はセリンを表し、任意選択でさらにＸ１３は任意のアミノ酸、任意選択でロイシン、任意選択でアラニン、バリン、スレオニン又はアルギニンを表す、ＣＤＲ２−ＦＲ３セグメント；及び
（ｃ）ＣＤ３９のＮ末端と接触することができ、任意選択でＣＤ３９及びＶＬのＮ末端ドメインと接触することができる、ＣＤＲ３（例えば、Ｋａｂａｔによる）であって、任意選択で、Ｋａｂａｔ位置９５〜１０２の残基は、式Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１３Ｘ１４（配列番号１６）を有し、
− Ｘ１はアルギニン、リシン若しくはアラニン又は任意選択でその保存的置換を表し、
− Ｘ２は任意のアミノ酸、任意選択でアルギニン、任意選択でリシン若しくはアラニン、任意選択でチロシン、又は任意選択でその保存的置換を表し、
− Ｘ３は任意のアミノ酸残基、任意選択で芳香環を含む残基、任意選択でチロシンを表し、
− Ｘ４は任意のアミノ酸、任意選択でグルタミン酸、チロシン若しくはアスパラギン、又は任意選択でその保存的置換、又はプロリン若しくはグリシン以外のアミノ酸残基を表し、
− Ｘ５はグリシン、任意選択でアルギニン、任意選択でアスパラギン、又は任意選択でその保存的置換を表し、
− Ｘ６は任意のアミノ酸、任意選択でアスパラギン、セリン若しくはチロシン、又は任意選択でその保存的置換を表し、
− Ｘ７は任意のアミノ酸、任意選択でチロシン、アスパラギン若しくはアスパラギン酸、又は任意選択でその保存的置換、任意選択でプロリン若しくはグリシン以外のアミノ酸残基を表し、
− Ｘ８はバリン又は任意選択でアラニン、イソロイシン、グリシン若しくはロイシン、任意選択で芳香族アミノ酸、任意選択でチロシンを表し、
− Ｘ９は任意のアミノ酸、任意選択で芳香族アミノ酸、任意選択でフェニルアラニン、任意選択でチロシン、任意選択でバリン、任意選択でロイシン又はその保存的置換を表し、
− Ｘ１０はチロシン、任意選択でフェニルアラニン、任意選択でメチオニン、又は任意選択でその保存的置換を表し、
− Ｘ１１は存在しないか又は任意のアミノ酸、任意選択でチロシン、任意選択でトリプトファン、任意選択でアラニン、又は任意選択でその保存的置換、任意選択でＰ、Ｇ、Ｅ若しくはＤ以外、若しくは小さな疎水性残基（例えば、Ｔ、Ｓ）以外のアミノ酸残基を表し、
− Ｘ１２は存在しないか又は任意のアミノ酸、任意選択でフェニルアラニン、任意選択でメチオニン、若しくは任意選択でその保存的置換を表し、
− Ｘ１３は任意のアミノ酸、任意選択でアスパラギン酸、又は任意選択でその保存的置換、任意選択でセリン、任意選択でスレオニン、任意選択でグルタミン酸、任意選択でアスパラギン、任意選択で大きな疎水性残基以外の残基を表し、及び
− Ｘ１４は任意のアミノ酸、任意選択でチロシン又は任意選択でその保存的置換、任意選択で芳香族アミノ酸、任意選択で非芳香族アミノ酸、任意選択でアラニンを表す。
本明細書中のいずれかの実施形態の一態様では、ＶＨ又はＶＬ中の任意のアミノ酸残基は、Ｖドメイン（例えば、それぞれＶＨ又はＶＬ）ドメイン構造の完全性を維持する残基として特定され得る。本明細書中のいずれかの実施形態の１つの態様において、抗原又は結合パートナー（例えば、ＣＤ３９、ＶＬ又はＶＬ）と接触することができるＶＨ又はＶＬ中のアミノ酸残基は、抗原又は結合パートナー結合を低下させる立体障害を導入しない残基であると特定することができる。
一態様では、結合分子又はその抗原結合フラグメントは、ヒトフレームワーク領域、例えば、ＶＨＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４アミノ酸配列を含む（任意選択で１つ以上のアミノ酸置換を含む）ＶＨ、及び／又はヒトＶＬＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４アミノ酸配列を含む（任意選択で１つ以上のアミノ酸置換を含む）ＶＬを含む分子を含む。
一実施形態において、ＣＤＲ２は、ＣＤ３９のアミノ酸残基Ｖ９５、Ｑ９６及び／又はＬ１３７と接触する芳香族アミノ酸残基を含む。一実施形態において、芳香族アミノ酸残基は、芳香族残基、例えばチロシン、任意選択でフェニルアラニンである。
一実施形態において、ＶＨは、ＣＤ３９と接触するアミノ酸残基を含むＦＲ３を含み、任意選択で、ＶＨの残基はＫａｂａｔ位置７１のロイシンである。
一実施形態において、ＶＨは、ＣＤ３９と接触するＫａｂａｔ位置１９のＦＲ１のアミノ酸残基を含み、任意選択で残基はリシンである。
一実施形態において、ＶＬは、ＶＨのＣＤＲ３と接触する芳香族アミノ酸残基を含むＦＲ２を含み、任意選択で、ＶＬ中の残基はＫａｂａｔ位置４９にある。任意選択で、ＶＬＫａｂａｔ位置の残基は芳香族残基であり、任意選択でさらにＶＨは共にπスタッキング相互作用を形成することができる芳香族残基（例えば、Ｋａｂａｔ １００ｅ）を含む。
一実施形態において、ＶＨＣＤＲ３は、ＶＬポリペプチド中のアミノ酸残基（例えば、芳香族残基）とπ相互作用（例えば、芳香環と結合パートナーとの間の誘引性非共有結合相互作用、例えば、アミド−πスタッキング相互作用、π−πスタッキング相互作用又はπドナー相互作用）を形成することができる芳香環（任意選択で、チロシン、ヒスチジン、トリプトファン又はフェニルアラニン）を含むアミノ酸残基を含む。一実施形態において、芳香環を含むＣＤＲ３中の残基は、チロシンであり、例えばＫａｂａｔ位置１００ｅにある。一実施形態において、芳香環を含むＶＬの残基は、チロシン、例えばＶＬのＫａｂａｔ位置４９のチロシンである。
一実施形態において、ＶＨＣＤＲ３は、ＣＤ３９ポリペプチド中のアミノ酸残基（例えば、配列番号１のＣＤ３９の残基Ｑ９６）とπ相互作用（例えば、芳香環と結合パートナーとの間の誘引性非共有結合相互作用、例えば、アミド−πスタッキング相互作用）を形成することができる芳香環（任意選択で、チロシン、ヒスチジン、トリプトファン又はフェニルアラニン）を含むアミノ酸残基を含む。一実施形態において、芳香環を含む残基はフェニルアラニンである。
一実施形態において、ＶＨＣＤＲ３は、ＶＬ中の芳香環を含むアミノ酸残基、例えばＶＬ中のＫａｂａｔフレームワーク（ＦＲ２）位置４９のチロシン、とπ−πスタッキング相互作用を形成するか又は形成することができる芳香環（例えば、チロシン、任意選択でフェニルアラニン）を含むアミノ酸残基を（例えば、Ｋａｂａｔ位置１００ｅに）含む。一実施形態において、ＶＨＣＤＲ３は、ＶＬ中の芳香環を含むアミノ酸残基、例えばＶＬ中のＫａｂａｔ ＣＤＲ３位置８９のグルタミン、とπドナー相互作用が可能である芳香環（例えば、フェニルアラニン、任意選択でチロシン）を含むアミノ酸残基を（例えば、Ｋａｂａｔ位置１００ｆに）含む。
一実施形態において、ＶＨＣＤＲ３は、（ｉ）ＶＬ中のアミノ酸残基とのπスタッキング相互作用を形成することができる芳香環を含む第１アミノ酸残基、（ｉｉ）ＣＤ３９ポリペプチド中の芳香環を含むアミノ酸残基とπ相互作用（例えば、アミドπスタッキング相互作用）を形成することができる芳香環を含む第２アミノ酸残基を含む。一実施形態において、芳香環を含むＣＤＲ３の第１及び／又は第２残基はチロシンである。
一実施形態において、ＶＨＣＤＲ３は、（ｉ）ＶＬ中のアミノ酸残基とπ（例えば、πスタッキング）相互作用を形成しているか又はそれが可能である芳香環（任意選択でチロシン又はフェニルアラニン）を含む第１及び第２アミノ酸残基；（ｉｉ）ＣＤ３９ポリペプチド中のアミノ酸残基とπ相互作用を形成しているか又はそれが可能である芳香環（任意選択でチロシン）を含む第３アミノ酸残基を含む。一実施形態において、ＶＨＣＤＲ３の芳香環を含む第１及び第２残基の１つは、ＶＬの芳香環を含むアミノ酸残基とのπスタッキング相互作用が可能であるか又は形成されている。一実施形態において、芳香環を含むＣＤＲ３の第１残基はチロシンであり、芳香環を含むＣＤＲ３の第２残基はフェニルアラニンである。任意選択で、芳香環を含む第３アミノ酸残基はチロシンである。
例示的なＶＬは、以下を含み得る：
− 例えば、ＶＨのＣＤＲ３に接触することができる、Ｋａｂａｔ位置３１、３２、３３及び／又は３４の４つのうち１つ、２つ、３つに、残基を含むＣＤＲ１；
− ＶＨのＣＤＲ３と接触することができるＫａｂａｔ位置４９に芳香族残基、任意選択でチロシンを含むＦＲ２；及び／又は
− 例えば、ＶＨのＣＤＲ３と接触することができるＫａｂａｔ位置８９及び／又は９１に、残基を含むＣＤＲ３。
一実施形態において、本発明は、本明細書の実施形態のいずれかのＶＨ及びＶＬを含むＣＤ３９に結合してその活性を阻害することができる結合分子又はその抗原結合フラグメントを提供し、ＶＬは以下を含む：
− ＶＨのＣＤＲ３と接触することができるＫａｂａｔ位置３１、３２、３３及び／又は３４に残基を含むＣＤＲ１；
− Ｋａｂａｔ位置４９に芳香族残基、任意選択でチロシンを含むＦＲ２；及び／又は
− ＶＨのＣＤＲ３と接触することができるＫａｂａｔ位置８９及び／又は９１に残基を含むＣＤＲ３。
一実施形態において、本発明は、抗体ＶＨ及び抗体ＶＬを含む、ＣＤ３９に結合してその活性を阻害することができる結合分子又はその抗原結合フラグメントを提供し、
ＶＨは、式Ｉのアミノ酸配列を含む：
［ＦＲ１］ＣＤＲ１［ＦＲ２］ＣＤＲ２［ＦＲ３］ＣＤＲ３［ＦＲ４］ （式Ｉ）
式中、［ＦＲ１］、［ＦＲ２］、［ＦＲ３］及び［ＦＲ４］はＶＨフレームワーク領域を表し、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３はＶＨＣＤＲを表し：
・ＣＤＲ１は、任意選択で、ＣＤ３９のＮ末端ドメインに接触することができる、Ｋａｂａｔ位置３１及び／又は３３の残基を含み、
・ＣＤＲ２は、ＣＤ３９と接触することができる残基、任意選択でＣＤ３９のＮ末端ドメインを含み、任意選択でＫａｂａｔ位置５０、５２、５２ａ、５３及び５６のうち２つ、３つ、４つ又は５つは、任意選択でＮ末端ドメインにおいて、ＣＤ３９に接触することができ、任意選択で位置５３の残基が芳香環、任意選択でチロシンを含み、任意選択でさらにＫａｂａｔ ＣＤＲ２中の残基（例えば、Ｋａｂａｔ位置５７、５９及び／又は６５のうちの１つ、２つ又は３つ）は、Ｋａｂａｔ ＦＲ３中の残基（例えば、Ｋａｂａｔ位置６７、６８、６９、７０及び／又は７１のうちの１つ、２つ又は３つ）と組み合わせて、ＣＤ３９のＣ末端ドメインと接触することができ、
・ＣＤＲ３は、任意選択でＣＤ３９のＮ末端ドメインに、ＣＤ３９と接触することができる芳香族残基を含み、任意選択でＣＤＲ３はＶＬと接触することができる芳香族残基をさらに含み、任意選択で芳香族残基がＫａｂａｔ位置１００、１００ｂ、１００ｃ、１００ｄ、１００ｅ及び／又は１００ｆのいずれか（残基が特定のＫａｂａｔ位置に存在する範囲で）に存在し、任意選択でＶＬと接触することができる芳香族残基はチロシン又はフェニルアラニンであり、任意選択でＣＤ３９と接触することができる芳香族残基はチロシン又はフェニルアラニンであり；及び
ＶＬは、式ＩＩのアミノ酸配列を含む：
［ＦＲ１］ＣＤＲ１［ＦＲ２］ＣＤＲ２［ＦＲ３］ＣＤＲ３［ＦＲ４］ （式ＩＩ）
式中、［ＦＲ１］、［ＦＲ２］、［ＦＲ３］及び［ＦＲ４］はＶＬフレームワーク領域を表し、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３はＶＬＣＤＲを表し：
・ＣＤＲ１は、任意選択でＶＨのＣＤＲ３と接触することができるＫａｂａｔ位置３１、３２、３３及び／又は３４に、残基を含み；
・ＦＲ２は残基、任意選択でＶＨのＣＤＲ３に接触することができるＫａｂａｔ位置４９の芳香族残基を含み；及び
・ＣＤＲ３は、任意選択でＶＨのＣＤＲ３と接触することができるＫａｂａｔ位置８９及び／又は９１に、残基を含む。
一実施形態において、ＶＨＣＤＲ１は、ＣＤ３９のＮ末端ドメインと接触する。一実施形態において、ＶＨＣＤＲ２は、ＣＤ３９のＣ末端ドメインと接触する。一実施形態において、ＶＨＣＤＲ３は、ＣＤ３９のＮ末端ドメインと接触する。
任意選択で、式Ｉ及び／又はＩＩにおいて、任意のＣＤＲは、本明細書にさらに記載されるように定義され得る。
一実施形態において、式ＩのＶＨは、ＣＤ３９のＣ末端ドメインのアミノ酸残基に接触することができる残基のセグメントをＫａｂａｔ位置５９〜７１（ＣＤＲ２−ＦＲ３）内、任意選択で５９〜７２ｂ内に含み、任意選択で、さらにＫａｂａｔ位置５９〜７１の残基がＣＤ３９の残基Ｎ２９２のグリカンと接触する。例えば、Ｋａｂａｔ ＣＤＲ２及びＦＲ３は、Ｋａｂａｔ位置５９、６５、６７、６８、６９、７０及び／又は７１に、及び任意選択でさらにＣＤ３９のＣ末端に接触することができる残基７２、７２ａ及び／又は７２ｂに、例えば、ＣＤ３９内に存在するアミノ酸及びＣＤ３９ポリペプチドのＮ２９２におけるグリカンを含む、残基を含み得る。
一実施形態において、ＶＬは、Ｋａｂａｔ位置３１〜３４の残基が式Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４を有するＣＤＲ１を含み、Ｘ１はセリン、任意選択でスレオニン、アラニン若しくはアスパラギン又は任意選択でその保存的置換、又は任意選択でリシン、アルギニン、イソロイシン又はロイシン以外の残基、任意選択でフェニルアラニン、チロシン又はトリプトファン以外の残基を表し、Ｘ２はチロシン又は任意選択でアラニン若しくはアスパラギン又はその保存的置換を表し、Ｘ３はフェニルアラニン又は任意選択でロイシン、イソロイシン、メチオニン、バリン、トリプトファン、任意選択でアスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン又はリシン以外の残基を表し、Ｘ４はセリン、任意選択でアラニン、任意選択で小さな残基（例えば、アラニン、スレオニン、グリシン、アスパラギン又はヒスチジン）、任意選択で大きな疎水性残基以外を表す。
一実施形態においてＶＬは、Ｋａｂａｔ位置３１〜３４の残基が式Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４を有し、Ｘ１はスレオニン又はその保存的置換を表し、Ｘ２はアラニン若しくはアスパラギン又はその保存的置換を表し、Ｘ３はバリン又はその保存的置換を表し、Ｘ４はアラニン又はその保存的置換を表す、ＣＤＲ１を含む。
一実施形態において、ＶＬは、Ｋａｂａｔ位置２４〜３４の残基が式Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１（配列番号１７）を有するＣＤＲ１を含み、
Ｘ１は任意のアミノ酸、任意選択でアルギニン若しくはリシン、又はその保存的置換を表し、
Ｘ２は任意のアミノ酸、任意選択でアラニン、又はその保存的置換を表し、
Ｘ３は任意のアミノ酸、任意選択でセリン、又はその保存的置換を表し、
Ｘ４は任意のアミノ酸、任意選択でグルタミン酸若しくはヒスチジン、又はその保存的置換を表し、
Ｘ５は任意のアミノ酸、任意選択でアスパラギン若しくはアスパラギン酸、又はその保存的置換を表し、
Ｘ６は任意のアミノ酸、任意選択でイソロイシン若しくはバリン、又はその保存的置換を表し、
Ｘ７は任意のアミノ酸、任意選択でチロシン若しくはグリシン、又はその保存的置換を表し、
Ｘ８はセリン若しくはスレオニン又はその保存的置換を表し、
Ｘ９はチロシン、アラニン若しくはアスパラギン又はその保存的置換を表し、
Ｘ１０は疎水性残基、任意選択でフェニルアラニン、イソロイシン若しくはバリン、又はその保存的置換を表し、及び
Ｘ１１はセリン、ヒスチジン若しくはアラニン又はその保存的置換を表す。
一実施形態において、ＶＬは、Ｋａｂａｔ位置５０〜５６の残基が式Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７（配列番号１８）を有するＣＤＲ２を含み、
Ｘ１は任意のアミノ酸、任意選択でスレオニン、セリン若しくはリシン、又はその保存的置換を表し、
Ｘ２は任意のアミノ酸、任意選択でアラニン、又はその保存的置換を表し、
Ｘ３は任意のアミノ酸、任意選択でリシン若しくはセリン、又はその保存的置換を表し、
Ｘ４は任意のアミノ酸、任意選択でスレオニン、チロシン若しくはアスパラギン、又はその保存的置換を表し、
Ｘ５は任意のアミノ酸、任意選択でロイシン若しくはアルギニン、又はその保存的置換を表し、
Ｘ６は任意のアミノ酸、任意選択でアラニン若しくはチロシン、又はその保存的置換を表し、及び
Ｘ７は任意のアミノ酸、任意選択でグルタミン酸、スレオニン若しくはセリン、又はその保存的置換を表す。
一実施形態において、ＶＬは、Ｋａｂａｔ位置５０〜５６の残基が式Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７（配列番号１９）を有するＣＤＲ２を含み、
Ｘ１はセリン又はその保存的置換を表し、
Ｘ２はアラニン又はその保存的置換を表し、
Ｘ３はセリン又はその保存的置換を表し、
Ｘ４はチロシン又はその保存的置換を表し、
Ｘ５はアルギニン又はその保存的置換を表し、
Ｘ６はチロシン又はその保存的置換を表し、及び
Ｘ７はスレオニン、任意選択でセリン、又はその保存的置換を表す。
一実施形態において、ＶＬは、Ｋａｂａｔ位置４９にチロシン又は任意選択でフェニルアラニンを含むＦＲ２を含む。
一実施形態において、ＶＬはＣＤＲ３を含み、Ｋａｂａｔ位置８９〜９１の残基が式Ｘ１Ｘ２Ｘ３を有し、Ｘ１は任意のアミノ酸、任意選択でグルタミン、任意選択でヒスチジン、又はその保存的置換を表し、Ｘ２は任意のアミノ酸、任意選択でグルタミン若しくはヒスチジン、又はその保存的置換を表し、及びＸ３はヒスチジン、又は任意選択でチロシン、又はその保存的置換、又は任意選択でアスパラギン、又は任意選択で大きな残基又は疎水性残基以外の残基を表す。
任意選択で、一実施形態において、ＶＬは、ＶＨドメインフレームワークに接触するＫａｂａｔ位置９４、９５、９６及び９７（Ｋａｂａｔ ＣＤＲ３）のいずれか１つ、２つ、３つ又は４つの残基を含む。
一実施形態において、ＶＬはＣＤＲ３を含み、Ｋａｂａｔ位置８９の残基がグルタミン若しくはヒスチジン又はその保存的置換であり、位置９１の残基がチロシン若しくはヒスチジン又はその保存的置換であり、位置９５の残基がプロリン又はその保存的置換であり、及び位置９６の残基がチロシン又はその保存的置換である。
一実施形態において、ＶＬは、Ｋａｂａｔ位置８９〜９７の残基が式Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０（配列番号２０）を有するＣＤＲ３を含み、
Ｘ１はグルタミン若しくはヒスチジン又はその保存的置換を表し、
Ｘ２は任意のアミノ酸、任意選択でグルタミン若しくはヒスチジン、又はその保存的置換を表し、
Ｘ３はチロシン、ヒスチジン若しくはスレオニン又はその保存的置換を表し、
Ｘ４は任意のアミノ酸、任意選択でチロシン、アスパラギン若しくはトリプトファン、又はその保存的置換を表し、
Ｘ５は任意のアミノ酸、任意選択でバリン若しくはアスパラギン、又はその保存的置換を表し、
Ｘ６は任意のアミノ酸、任意選択でスレオニン、チロシン若しくはアスパラギン酸、又はその保存的置換を表し、
Ｘ７は任意のアミノ酸、任意選択でプロリン、又はその保存的置換を表し、
Ｘ８は存在しないか又は任意の１つ若しくは複数のアミノ酸、任意選択でプロリン、若しくはその保存的置換を表し、
Ｘ９は任意のアミノ酸、任意選択で芳香族残基、任意選択でチロシン、フェニルアラニン、又はその保存的置換を表し、
Ｘ１０は任意のアミノ酸、任意選択でスレオニン、又はその保存的置換を表す。
一実施形態において、ＶＬは、以下を含む：
− Ｋａｂａｔ位置３１、３２、３３及び３４の残基が式Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４を有し、Ｘ１はスレオニン又はその保存的置換を表し、Ｘ２はアラニン若しくはアスパラギン又はその保存的置換を表し、Ｘ３はバリン又はその保存的置換を表し、Ｘ４はアラニン又はその保存的置換を表す、ＣＤＲ１；
− Ｋａｂａｔ位置４９に芳香族残基、任意選択でチロシンを含むＦＲ２；及び
− Ｋａｂａｔ位置８９の残基がグルタミン若しくはヒスチジン又はその保存的置換であり、位置９１の残基がチロシン若しくはヒスチジン（任意選択で位置９１の残基が芳香族残基である）又はその保存的置換であり、任意選択で位置９５の残基がプロリン又はその保存的置換であり、任意選択で位置９６の残基がチロシン又はその保存的置換である、ＣＤＲ３。
別の実施形態において、ＶＬは、以下を含む：
− Ｋａｂａｔ位置３１、３２、３３及び３４の残基が式Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４を有し、Ｘ１はセリン又はその保存的置換を表し、Ｘ２はチロシン又はその保存的置換を表し、Ｘ３は疎水性残基、任意選択でフェニルアラニン又はイソロイシンを表し、Ｘ４は任意のアミノ酸、任意選択でセリン若しくはヒスチジン又はその保存的置換を表す、ＣＤＲ１；
− Ｋａｂａｔ位置４９に芳香族残基、任意選択でチロシンを含むＦＲ２；及び
− Ｋａｂａｔ位置８９の残基がグルタミン若しくはヒスチジン又はその保存的置換であり、任意選択で位置９１の残基がチロシン、ヒスチジン、スレオニン又はその保存的置換であり、任意選択で位置９５の残基がプロリン又はその保存的置換であり、任意選択で位置９６の残基が芳香族残基、任意選択でチロシン若しくはフェニルアラニンである、ＣＤＲ３。
開示された結晶構造は、所望の機能特性を保持しながらＦＲ及びＣＤＲアミノ酸配列の設計を導くために使用され得ることが理解されよう。
特定の実施形態では、結合分子及びドメインは、免疫グロブリン可変ドメイン由来であってもよく、例えば、２本のポリペプチド鎖に見られる関連するＶＬ及びＶＨドメイン、又はｓｃＦｖ、ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、ｄＡｂ、Ｖ−ＮＡＲドメイン又はＶＨＨドメインなどの一本鎖抗原結合ドメインの形態である。
一態様では、ＣＤ３９結合剤又は分子は、完全ヒト抗体、ヒト化抗体、及びキメラ抗体から選択される抗体である。
一態様では、薬剤は、本明細書においてさらに開示されるように、例えば改変された、ヒトＩｇＧ１定常ドメイン又はＦｃドメインに由来する定常ドメイン又はＦｃドメインを含む抗体のフラグメントである。
一態様では、薬剤は、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆａｂ’−ＳＨフラグメント、Ｆ（ａｂ）２フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆｖフラグメント、重鎖Ｉｇ（ラマ又はラクダＩｇ）、ＶＨＨフラグメント、単一ドメインＦＶ、及び一本鎖抗体フラグメントから選択される抗体フラグメントを含む。一態様では、薬剤は、ｓｃＦＶ、ｄｓＦＶ、ミニボディ、ダイアボディ、トリアボディ、カッパボディ、ＩｇＮＡＲから選択される合成又は半合成抗体由来分子；及び多重（例えば、二重特異性）抗体が含まれる。薬剤は、任意選択でＦｃドメインをさらに含んでいてもよい。
一態様では、抗体は少なくとも部分的に精製された形態である。
一態様では、抗体は実質的に単離された形態である。
抗体は、当分野では公知の様々な技術によって生成することができる。典型的に、これらは、抗体ライブラリー（例えば、ファージディスプレイライブラリー）から選択することにより、又はＣＤ３９ポリペプチド、好ましくは、ヒトＣＤ３９ポリペプチドを含む免疫原で、非ヒト動物、好ましくはマウスを免疫することにより生成される。ＣＤ３９ポリペプチドは、ヒトＣＤ３９ポリペプチドの完全長配列、又はその断片若しくは誘導体、典型的には免疫原性断片、すなわちＣＤ３９ポリペプチドを発現する細胞の表面に露出したエピトープを含むポリペプチドの一部を含んでもよい。このような断片は、典型的に、成熟ポリペプチド配列の少なくとも約７個の連続したアミノ酸、さらに好ましくはその少なくとも約１０個の連続したアミノ酸を含む。断片は、典型的に、受容体の細胞外ドメインにほぼ由来する。一実施形態では、免疫原は、典型的に細胞の表面で、脂質膜内に野生型ヒトＣＤ３９ポリペプチドを含む。具体的実施形態では、免疫原は、インタクトな細胞、特に、インタクトなヒト細胞を含み、これは、任意選択で処理又は溶解させる。別の実施形態では、ポリペプチドは、組換えＣＤ３９ポリペプチドである。
抗原で非ヒト哺乳動物を免疫するステップは、マウスにおける抗体の産生を刺激するために、公知の方法で実施してよい（例えば、Ｅ．Ｈａｒｌｏｗ及びＤ．Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８８）、これらの全開示内容は、参照として本明細書に組み込まれる）。免疫原は、任意選択で、完全又は不完全フロインドアジュバントなどのアジュバントと共に、バッファー中に懸濁又は溶解させる。免疫原の量、バッファーの種類及びアジュバントの量を決定する方法は、当業者には周知であり、全く限定的ではない。これらのパラメータは、様々な免疫原で違い得るが、容易に解明される。
同様に、抗体の産生を刺激するのに十分な免疫の位置及び頻度も当分野では公知である。典型的免疫プロトコルでは、非ヒト動物に対し第１日に抗原を腹腔内注射し、約１週間後に再度注射する。これに続き、任意選択で、不完全フロインドアジュバントなどのアジュバントと共に、第２０日前後に抗原のリコール注射を実施する。リコール注射を静脈内に実施し、これを連続して数日にわたり繰り返してもよい。続いて、典型的にアジュバントなしで、静脈内又は腹腔内のいずれかで、第４０日に追加免疫注射を実施する。このプロトコルにより、約４０日後に抗原特異的抗体産生Ｂ細胞の生産が起こる。免疫に用いる抗原に対する抗体を発現Ｂ細胞の生産をもたらすものである限り、他のプロトコルを用いてもよい。
別の実施形態において、非免疫非ヒト哺乳動物からのリンパ球を単離し、ｉｎ ｖｉｖｏで増殖させた後、細胞培養物中の免疫原に暴露する。次に、リンパ球を回収し、以下に記載する融合ステップを実施する。
モノクローナル抗体のために、次のステップは、免疫した非ヒト哺乳動物由来の脾細胞を単離した後、これら脾細胞と、不死化細胞を融合することにより、抗体産生ハイブリドーマを形成することである。非ヒト哺乳動物からの脾細胞の単離は、当分野では公知であり、典型的に、麻酔した非ヒト哺乳動物から脾臓を摘出するステップ、これを細片に切断するステップ、及び細胞ストレイナーのナイロンメッシュを通して脾膜から脾細胞を適切なバッファー中に絞り出し、単細胞懸濁液を生成するステップを含む。細胞を洗浄し、遠心分離して、バッファー中に再懸濁させるが、このバッファーは全ての赤血球を溶解させる。溶液を再度遠心分離し、ペレット中に残るリンパ球を新鮮なバッファー中に最終的に再懸濁させる。
一旦単離して、単細胞懸濁液中に存在させたら、リンパ球を不死化細胞株と融合させることができる。これは、典型的に、マウス骨髄腫細胞株であるが、ハイブリドーマを作出するのに有用な多くの他の不死化細胞株が当分野では公知である。マウス骨髄腫株としては、限定するものではないが、Ｓａｌｋ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｃｅｌｌ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｕ．Ｓ．Ａ．から入手可能なＭＯＰＣ−２１及びＭＰＣ−１１マウス腫瘍、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ Ｕ．Ｓ．Ａ．から入手可能なＸ６３ Ａｇ８６５３及びＳＰ−２細胞が挙げられる。融合は、ポリエチレングリコールなどを用いて実施する。次いで、得られたハイブリドーマを、融合させていない親骨髄腫細胞の増殖又は生存を阻害する１種又は複数の物質を含有する選択培地中で増殖させる。例えば、もし親骨髄腫細胞に、酵素ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ又はＨＰＲＴ）が欠如していれば、ハイブリドーマ用の培地は、典型的に、ヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジン（ＨＡＴ培地）を含み、これらの物質は、ＨＧＰＲＴ欠損細胞の増殖を阻止する。
ハイブリドーマは、典型的に、マクロファージの支持細胞層上に増殖させる。マクロファージは、好ましくは、脾細胞を単離するのに用いられる非ヒト哺乳動物の同腹仔に由来し、典型的に、ハイブリドーマを平板培養する数日前に不完全フロイントアジュバント等で初回免疫する。融合方法は、Ｇｏｄｉｎｇ，“Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，”ｐｐ．５９−１０３（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９８６）に記載されており、その開示内容は、参照として本明細書に組み込む。
コロニー形成及び抗体産生に十分な時間をかけて、細胞を選択培地中で増殖させる。これは、通常、約７〜約１４日である。
次に、ＣＤ３９ポリペプチド遺伝子産物によって特異的に認識されるエピトープに特異的に結合する抗体の産生について、ハイブリドーマコロニーをアッセイする。アッセイは典型的に、比色ＥＬＩＳＡタイプのアッセイであるが、ハイブリドーマを増殖するウェルに適合させることができる任意のアッセイを用いてもよい。他のアッセイとして、放射性免疫アッセイ又は蛍光活性化細胞選別が挙げられる。要望される抗体の産生について陽性のウェルを調べることにより、１つ又は複数のコロニーが存在するかどうかを決定する。２つ以上のコロニーが存在する場合には、単細胞だけが、要望される抗体を産生するコロニーを形成することを確実にするように、細胞を再クローン化し、増殖させる。典型的には、ＣＤ３９ポリペプチド、例えば、ＣＤ３９発現細胞に結合する能力についても抗体を試験する。
モノクローナル抗体を産生することが確認されたハイブリドーマは、ＤＭＥＭ又はＲＰＭＩ−１６４０などの適切な培地中でさらに多量に増殖させることができる。あるいは、ハイブリドーマ細胞を動物における腹水腫瘍としてｉｎ ｖｉｖｏで増殖することもできる。
要望されるモノクローナル抗体を産生するのに十分に増殖させた後、モノクローナル抗体を含む増殖培地（又は腹水）を細胞から分離し、そこに存在するモノクローナル抗体を精製する。精製は、典型的に、ゲル電気泳動、透析、プロテインＡ又はプロテインＧ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを用いたクロマトグラフィー、又はアガロース若しくはＳｅｐｈａｒｏｓｅビーズなどの固体支持体に結合させた抗マウスＩｇにより達成する（全て、例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｈａｎｄｂｏｏｋ，Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．１８−１０３７−４６，Ｅｄｉｔｉｏｎ ＡＣに記載されており、その開示内容は、参照として本明細書に組み込む）。結合抗体は、典型的に、抗体含有画分の即時中和による低ｐＨバッファー（ｐＨ３．０以下のグリシン又は酢酸バッファー）を用いることにより、プロテインＡ／プロテインＧカラムから溶出させる。これらの画分をプール、透析した後、必要に応じて濃縮する。
単一の明瞭なコロニーを含む陽性ウェルを典型的には再クローン化し、再アッセイすることにより、ただ１つのモノクローナル抗体が検出され、産生されることを確実にする。
例えば、（Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ，３４１（１９８９）ｐ．５４４、その全開示内容は、参照として本明細書に組み込む）に開示されるように、免疫グロブリンのコンビナトリアルライブラリーの選択により、抗体を生成してもよい。
ＣＤ３９、特に、モノクローナル抗体Ｉ−３９１若しくはＩ−３９２と実質的に、又はほぼ同じＣＤ３９の領域に結合する１つ又は複数の抗体の同定は、抗体競合を評価することができる様々な免疫学的スクリーニングアッセイのいずれか１つを用いて、容易に決定することができる。多くのこうしたアッセイは常用的に実施されており、当分野では公知である（例えば、１９９７年８月２６日に発行された米国特許第５，６６０，８２７号明細書を参照；これは、参照として本明細書に明示的に組み込む）。
例えば、調べようとする試験抗体を様々な供給源の動物から取得するか、あるいはこれらが異なるＩｇアイソタイプである場合、簡単な競合アッセイを用いてもよく、このアッセイでは、対照（例えば、Ｉ−３９１）と試験抗体を混合し（又は事前に吸着させ）、ＣＤ３９ポリペプチドを含むサンプルに塗布する。ウェスタンブロッティングに基づくプロトコル、及びＢＩＡＣＯＲＥ分析はこのような競合試験での使用に好適である。
特定の実施形態において、対照抗体（例えば、Ｉ−３９１若しくはＩ−３９２）を様々な量の試験抗体（例えば、約１：１０又は約１：１００）と、一定の時間をかけて予め混合した後、ＣＤ３９抗原サンプルに塗布する。別の実施形態では、対照と様々な量の試験抗体は、ＣＤ３９抗原サンプルへの暴露中に単純に混合することができる。遊離抗体から結合抗体を識別する（例えば、非結合抗体を排除するための分離又は洗浄技術を用いることにより）と共に、試験抗体からＩ−３９１を識別する（例えば、種特異的若しくはアイソタイプ特異的二次抗体を用いることにより、又は検出可能な標識でＩ−３９１若しくはＩ−３９２を特異的に標識することにより）ことができる限り、試験抗体が、それぞれＩ−３９１若しくはＩ−３９２と抗原との結合を低減するかどうかを決定することができる。完全に無関係な抗体の非存在下での（標識）対照抗体の結合は、対照の高い値として役立てることができる。対照の低い値は、全く同じタイプの非標識抗体（Ｉ−３９１若しくはＩ−３９２）と一緒に、標識（Ｉ−３９１若しくはＩ−３９２）抗体をインキュベートすることにより取得することができ、ここで、競合が起こり、標識抗体の結合を低減する。試験アッセイにおいて、試験抗体の存在下で標識抗体の反応性が有意に低減すれば、実質的に同じエピトープを認識する試験抗体、すなわち標識（Ｉ−３９１若しくはＩ−３９２）抗体と「交差反応する」か、又は競合する抗体を示している。約１：１０〜約１：１００の範囲の任意のＩ−３９１：試験抗体比で、Ｉ−３９１若しくはＩ−３９２とＣＤ３９抗原の結合を少なくとも５０％、例えば、少なくとも約６０％、又はより好ましくは少なくとも約８０％若しくは９０％（例えば、約６５〜１００％）低減する試験抗体を、選択することができる。好ましくは、このような試験抗体は、Ｉ−３９１若しくはＩ−３９２とＣＤ３９抗原の結合を少なくとも約９０％（例えば、約９５％）低減する。
競合はまた、例えば、フローサイトメトリー試験によって評価することもできる。このような試験では、所与のＣＤ３９ポリペプチドを担持する細胞をまず、例えばＩ−３９１若しくはＩ−３９２とインキュベートした後、蛍光色素又はビオチンで標識する試験抗体と一緒にインキュベートする。飽和量のそれぞれＩ−３９１若しくはＩ−３９２を用いたプレインキュベーションで得られる結合が、Ｉ−３９１若しくはＩ−３９２とのプレインキュベーションなしに抗体により得られた結合（蛍光を用いて測定）の約８０％、好ましくは約５０％、約４０％以下（例えば、約３０％、２０％若しくは１０％）であれば、結合抗体は、Ｉ−３９１若しくはＩ−３９２と競合すると言える。あるいは、飽和量の試験抗体と一緒にプレインキュベートした細胞上での標識Ｉ−３９１若しくはＩ−３９２抗体（蛍光色素又はビオチンによる）を用いて得られる結合が、試験抗体とのプレインキュベーションなしに得られた結合の約８０％、好ましくは約５０％、約４０％、又は４０％未満（例えば、約３０％、２０％若しくは１０％）であれば、結合抗体は、Ｉ−３９１若しくはＩ−３９２と競合すると言える。
試験抗体を予め吸着させ、これを飽和濃度で、ＣＤ３９抗原が固定化された表面に塗布する簡単な競合アッセイも使用することができる。簡単な競合アッセイにおける表面は、好ましくはＢＩＡＣＯＲＥチップ（又は表面プラズモン共鳴分析に適した他の媒体）である。次に、対照抗体（例えば、Ｉ−３９１）をＣＤ３９飽和濃度で前記表面と接触させ、対照抗体のＣＤ３９及び表面結合を測定する。対照抗体の結合を、試験抗体の非存在下での対照抗体とＣＤ３９含有表面との結合と比較する。試験アッセイでは、試験抗体の存在下で、対照抗体によるＣＤ３９含有表面の結合が有意に低減すれば、試験抗体が、対照抗体と実質的に同じＣＤ３９の領域を認識し、これにより試験抗体が、対照抗体と「交差反応する」ことを示す。対照抗体（例えば、Ｉ−３９１）とＣＤ３９抗原の結合を少なくとも約３０％以上、好ましくは約４０％低減する試験抗体は全て、対照（例えば、Ｉ−３９１）と競合する抗体であるとみなすことができる。好ましくは、このような試験抗体は、対照抗体（例えば、Ｉ−３９１）とＣＤ３９抗原の結合を少なくとも約５０％（例えば、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、又はそれ以上）低減する。対照及び試験抗体の順序を逆にしてもよい：すなわち、まず対照抗体を表面に結合させてから、試験抗体を競合アッセイにおいて表面と接触させることができることは理解されよう。好ましくは、第２抗体（抗体は、交差反応すると仮定する）について認められる結合の低減の程度がより大きくなると予想されることから、ＣＤ３９抗原に対し高い親和性を有する抗体をまず表面と結合させる。こうしたアッセイの別の例は、例えば、Ｓａｕｎａｌ（１９９５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １８３：３３−４１に記載されており、その開示内容は、本明細書に参照として組み込む。
抗体は、ＣＤ３９陽性細胞の発現を特徴とする疾患を有する個体、すなわち抗ＣＤ３９抗体を用いた本明細書に記載の方法の１つによる治療の候補である個体からのＣＤ３９発現細胞に結合する。従って、細胞上でＣＤ３９を特異的に認識する抗体が得られると、ＣＤ３９陽性細胞（例えば、癌細胞）に結合するその能力について任意選択で試験することができる。特に、本抗体の１つで患者を治療する前に、患者から採取された悪性細胞に結合する抗体の能力を、例えば、血液サンプル又は腫瘍生検において、治療が患者において有益である可能性を最大にするため、任意選択で試験することができる。
一実施形態において、抗体は、ＣＤ３９発現細胞、例えば悪性細胞に結合するそれらの能力を試験するためのイムノアッセイにおいて検証される。例えば、血液サンプル又は腫瘍生検が実施され、腫瘍細胞が収集される。次いで、所与の抗体が細胞に結合する能力を、当業者に周知の標準的な方法を用いて評価する。抗体は、有意な割合の個体又は患者（例えば、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％又はそれ以上）からの、ＣＤ３９を発現することが知られている細胞、例えば、腫瘍細胞の、例えば実質的な部分（例えば、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％又はそれ以上）に結合し得る。抗体は、例えば、患者が抗ＣＤ３９剤による治療に適しているかどうかを評価するためのバイオマーカーとして、患者の悪性細胞の存在又はレベルを決定するための診断目的で、又は本明細書に記載の治療方法における使用のために用いることができる。抗体の細胞への結合を評価するために、抗体を直接的又は間接的に標識することができる。間接的に標識される場合、典型的には二次標識抗体が添加される。
エピトープ領域内で抗体が結合するかどうかの決定は、当業者には公知の方法で実施することができる。このようなマッピング／特性決定方法の一例として、ＣＤ３９タンパク質中の露出したアミン／カルボキシルの化学修飾を用いたエピトープ「フットプリント法」により、抗ＣＤ３９抗体に対するエピトープ領域を決定してもよい。こうしたフットプリントの具体的一例は、ＨＸＭＳ（質量分析法により検出される水素−重水素交換）の使用であり、この場合、受容体及びリガンドタンパク質アミドプロトンの水素−重水素交換、結合及び逆交換が起こり、タンパク質結合に参加する骨格アミン基は、逆交換から保護されるため、重水素化したまま残る。この時点で関連領域を消化性タンパク質分解、高速マイクロボア高性能液体クロマトグラフィー分離、及び／又はエレクトロスプレーイオン化質量分析法により同定することができる。例えば、Ｅｈｒｉｎｇ Ｈ，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．２６７（２）ｐｐ．２５２−２５９（１９９９）Ｅｎｇｅｎ，Ｊ．Ｒ．及びＳｍｉｔｈ，Ｄ．Ｌ．（２００１）Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７３，２５６Ａ−２６５Ａを参照。好適なエピトープ同定方法の別の例は、核磁気共鳴エピトープマッピング（ＮＭＲ）であり、この場合、典型的に、遊離抗原と、抗体などの抗原結合ペプチドと複合体化した抗原の２次元ＮＭＲスペクトルにおけるシグナルの位置を比較する。典型的に、ＮＭＲスペクトルにおいて、抗原に対応するシグナルだけが認められ、抗原結合ペプチドからのシグナルは全く認められないように、抗原を１５Ｎで選択的に同位体的に標識する。抗原結合ペプチドとの相互作用に関与するアミノ酸に由来する抗原シグナルは、典型的に、遊離抗原のスペクトルと比較して、複合体のスペクトルに位置をシフトするため、結合に関与するアミノ酸をこのようにして同定することができる。例えば、Ｅｒｎｓｔ Ｓｃｈｅｒｉｎｇ Ｒｅｓ Ｆｏｕｎｄ Ｗｏｒｋｓｈｏｐ．２００４；（４４）：１４９−６７；Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２８１（１）ｐｐ．６１−６７（１９９８）；Ｓａｉｔｏ及びＰａｔｔｅｒｓｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ．１９９６ Ｊｕｎ；９（３）：５１６−２４を参照されたい。
また、質量分析法を用いて、エピトープマッピング／特性決定を実施することもできる。例えば、Ｄｏｗｎａｒｄ，Ｊ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．２０００ Ａｐｒ；３５（４）：４９３−５０３、並びにＫｉｓｅｌａｒ及びＤｏｗｎａｒｄ，Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ．１９９９ Ｍａｙ １；７１（９）：１７９２−１８０１を参照されたい。エピトープマッピング及び同定に関連して、プロテアーゼ消化法も有用となり得る。抗原決定基関連領域／配列は、プロテアーゼ消化（例えば、ＣＤ３９に対し約１：５０の比でトリプシン、又はｐＨ７〜８でｏ／ｎ消化を用いることにより）の後、ペプチド同定のための質量分析法（ＭＳ）解析により、決定することができる。続いて、抗ＣＤ３９結合剤によるトリプシン切断から保護されるペプチドを、トリプシン消化に付したサンプルと、抗体と一緒にインキュベートした後、例えば、トリプシンによる消化に付したサンプルとを比較して、同定することができる（これによって結合剤のフットプリントを明らかにする）。加えて、又は上記に代わり、キモトリプシン、ペプシンなどの他の酵素を同様のエピトープ特性決定法に用いることもできる。さらは、酵母消化は、有望な抗原決定基配列が、表面に暴露されていない、従って、免疫原性／抗原性に関して関連しない可能性が非常に高いＣＤ３９ポリペプチドの領域内にあるかどうかを分析するための迅速な方法を提供することができる。
部位指定突然変異誘発は、結合エピトープの解明に有用な別の技術である。例えば、「アラニンスキャニング」において、タンパク質セグメント内の各残基をアラニン残基で置換し、結合親和性の結果を測定する。突然変異によって、結合親和性に有意な低減が起これば、これは結合に関与している可能性が非常に高い。構造エピトープに特異的なモノクローナル抗体（すなわち、変性タンパク質に結合しない抗体）を用いて、アラニン置換が、タンパク質の折り畳み全体に影響を与えないことを確認することができる。例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎ及びＷｅｌｌｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９５；２６７：３８３−３８６；並びにＷｅｌｌｓ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １９９６；９３：１−６を参照されたい。
また、エピトープ「フットプリント法」のために電子顕微鏡観察を用いることもできる。例えば、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ １９９２；３５５：２７５−２７８は、ネイティブのササゲ（ｃｏｗｐｅａ）モザイクウイルスのキャプシド表面上のＦａｂフラグメントの物理的フットプリントを決定するために、低温電子顕微鏡観察、３次元画像再構成、及びＸ線結晶学の協調的適用を用いている。
エピトープ評価のための「無標識」アッセイの他の形態としては、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ、ＢＩＡＣＯＲＥ）及び反射型干渉分光法（ＲｉｆＳ）が挙げられる。例えば、以下を参照されたい：Ｆａｇｅｒｓｔａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ Ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ １９９０；３：２０８−１４；Ｎｉｃｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａ−ｔｏｇｒ．１９９３；６４６：１５９−１６８；Ｌｅｉｐｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．１９９８；３７：３３０８−３３１１；Ｋｒｏｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ ａｎｄ Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ ２００２；１７：９３７−９４４。
抗体と同じエピトープ、又は実質的に同じエピトープに結合する抗体は、本明細書に記載する例示的競合アッセイの１つ又は複数において同定することができることにも留意すべきである。
脊椎動物又は細胞における免疫及び抗体の生成後、特定の選択ステップを実施して、特許請求の範囲に記載する抗体を単離してもよい。これに関して、特定の実施形態では、本開示はまた、このような抗体を産生する方法であって、（ａ）ＣＤ３９ポリペプチドを含む免疫原で、非ヒト哺乳動物を免疫すること；及び（ｂ）前記免疫動物から抗体を調製すること；及び（ｃ）ＣＤ３９に結合することができるステップ（ｂ）からの抗体を選択することを含む、方法に関する。
典型的には、本明細書で提供される抗ＣＤ３９抗体は、約１０４〜約１０１１Ｍ−１（例えば、約１０８〜約１０１０Ｍ−１）の範囲のＣＤ３９ポリペプチド（例えば、本明細書の実施例で生成される単量体ＣＤ３９ポリペプチド）に対する親和性を有する。例えば、特定の態様において、本開示は、例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）スクリーニング（ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）ＳＰＲ分析装置による分析などによる）によって決定される、ＣＤ３９に関する１×１０−９Ｍ未満の平均解離定数（ＫＤ）を有する抗ＣＤ３９抗体を提供する。より特定の例示的な態様において、本開示は、ＣＤについて、約１×１０−８Ｍ〜約１×１０−１０Ｍ、又は約１×１０−９Ｍ〜約１×１０−１１ＭのＫＤを有する抗ＣＤ３９抗体を提供する。
抗体は、例えば約１００、６０、１０、５、若しくは１ナノモル、好ましくはサブモル、又は任意選択で約５００、２００、１００若しくは１０ピコモル以下の平均ＫＤ（すなわち、これより優れた親和性）により特性決定することができる。ＫＤは、例えば、組換え生成したヒトＣＤ３９タンパク質をチップ表面上に固定化した後、溶液状の試験対象の抗体を塗布することにより決定することができる。一実施形態において、本方法は、さらに、ＣＤ３９との結合について、抗体Ｉ−３９１と競合することができる、（ｂ）からの抗体を選択するステップ（ｄ）も含む。
実施形態のいずれかの一態様では、本方法に従い調製された抗体は、モノクローナル抗体である。別の形態では、本明細書での方法に従い抗体を生成するのに用いられる非ヒト動物は、げっ歯類、ウシ、ブタ、家禽、ウマ、ウサギ、ヤギ、又はヒツジなどの哺乳動物である。
ＣＤ３９ポリペプチドに存在するエピトープに結合する抗体をコードするＤＮＡをハイブリドーマから単離し、適切な宿主へのトランスフェクションのための適切な発現ベクター内に導入する。次に、宿主を抗体、又はその変異体、例えば、そのモノクローナル抗体のヒト化形態、抗体の活性フラグメント、抗体の抗原認識部分を含むキメラ抗体、又は検出可能な部分を含む形態の組換え生成のために用いる。
本開示のモノクローナル抗体、例えば、抗体Ｉ−３９１をコードするＤＮＡは、従来の方法（例えば、マウス抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドのプローブの使用により）を用いて、容易に単離し、配列決定することができる。一態様では、本明細書の任意の実施形態の抗ＣＤ３９抗体の重鎖又は軽鎖をコードする核酸が提供される。一旦単離したら、ＤＮＡを発現ベクター中に導入することができ、次に、これらを、他の場合には免疫グロブリンタンパク質を産生しない大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、又は骨髄腫細胞などの宿主細胞にトランスフェクトすることにより、組換え宿主細胞においてモノクローナル抗体の合成を達成する。本明細書の他所に記載するように、このようなＤＮＡ配列は、多くの目的のいずれか、例えば、抗体のヒト化、フラグメント若しくは誘導体の生成の目的、又は例えば、抗体の結合特異性を最適化するために、抗原結合部位における抗体の配列を修飾する目的のために、修飾することができる。一実施形態において、抗体（例えば、Ｉ−３９１）の軽鎖及び／又は重鎖をコードする単離された核酸配列、並びにこのような核酸を（例えばそのゲノムに）含む組換え宿主細胞が提供される。抗体をコードするＤＮＡの細菌中での組換え発現は、当分野において公知である（例えば、Ｓｋｅｒｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，５，ｐｐ．２５６（１９９３）；及びＰｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３０，ｐ．１５１（１９９２）を参照）。
ＣＤ３９と結合することができる、及び／又は他の要望される特性を備えることができる抗体を同定したら、典型的には、非関連ポリペプチドを含む他のポリペプチドに結合するその能力について、本明細書に記載のものなどの方法を用いて、これらの抗体を評価する。理想的には、抗体はＣＤ３９にのみ実質的な親和性で結合し、無関係なポリペプチド又はＮＴＰＤａｓｅファミリーの他のポリペプチド、特にＣＤ３９−Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３及びＬ４又はＮＴＰＤａｓｅ８に有意なレベルで結合しない。しかし、ＣＤ３９に対する親和性が、他の非関連ポリペプチド）に対するものより実質的に高い（例えば、１０ｘ、１００ｘ、５００ｘ、１０００ｘ、１０，０００ｘ、又はそれ以上）限り、抗体は、本発明での使用に適していると認識される。
一実施形態において、抗ＣＤ３９抗体は、それらがヒトＦｃγ受容体、例えばＣＤ１６Ａ、ＣＤ１６Ｂ、ＣＤ３２Ａ、ＣＤ３２Ｂ及び／又はＣＤ６４のいずれか１つ以上）に実質的に特異的結合を有しないように調製することができる。このような抗体は、Ｆｃγ受容体が欠乏しているか、又はＦｃγ受容体との結合が低いことが知られている様々な重鎖の定常領域を含んでいてもよい。あるいは、Ｆｃ受容体結合を回避するために、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントなどの定常領域を含まない（又はその部分を含む）抗体フラグメントを使用することができる。Ｆｃ受容体結合は、例えば、ＢＩＡＣＯＲＥアッセイにおいて抗体のＦｃ受容体タンパク質への結合を試験することを含む、当技術分野で公知の方法に従って評価することができる。また、一般に、Ｆｃ受容体への結合を最小化又は排除するためにＦｃ部分が改変された（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ又はそれ以上のアミノ酸置換を導入することによって）任意の抗体ＩｇＧアイソタイプを使用することができる（例えば、国際公開第０３／１０１４８５号パンフレット参照、その開示は参照として本明細書に組み込む）。Ｆｃ受容体結合を評価するための細胞ベースのアッセイなどのアッセイは、当技術分野で周知であり、例えば国際公開第０３／１０１４８５号パンフレットに記載されている。
一実施形態において、抗体は、エフェクター細胞との最小限の相互作用を有する「Ｆｃサイレント」抗体を生じるＦｃ領域に１つ以上の特異的突然変異を含み得る。サイレンシングされたエフェクター機能は、抗体のＦｃ領域における突然変異によって得ることができ、当該技術分野において記載されている：Ｎ２９７Ａ突然変異、ＬＡＬＡ突然変異（Ｓｔｒｏｈｌ，Ｗ．，２００９，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．ｖｏｌ．２０（６）：６８５−６９１）；及びＤ２６５Ａ（Ｂａｕｄｉｎｏ ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８１：６６６４−６９）、Ｈｅｕｓｓｅｒ ｅｔ ａｌ．，国際公開第２０１２／０６５９５０号パンフレットも参照、その開示内容は、参照として本明細書に組み込む。一実施形態において、抗体は、ヒンジ領域に１、２、３又はそれ以上のアミノ酸置換を含む。一実施形態において、抗体はＩｇＧ１又はＩｇＧ２であり、残基２３３〜２３６、任意選択で２３３〜２３８（ＥＵ番号付け）に１つ、２つ又は３つの置換を含む。一実施形態において、抗体はＩｇＧ４であり、残基３２７、３３０及び／又は３３１（ＥＵ番号付け）に１つ、２つ又は３つの置換を含む。サイレントＦｃ ＩｇＧ１抗体の例は、ＩｇＧ１ Ｆｃアミノ酸配列におけるＬ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ突然変異を含むＬＡＬＡ突然変異体である。Ｆｃサイレント突然変異の別の例は、例えばＤＡＰＡ（Ｄ２６５Ａ、Ｐ３２９Ａ）突然変異（米国特許第６，７３７，０５６号）としてＩｇＧ１抗体に使用される、残基Ｄ２６５又はＤ２６５及びＰ３２９における突然変異である。別のサイレントＩｇＧ１抗体は、残基Ｎ２９７に突然変異を含む（例えば、Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７Ｓ変異）、アグリコシル化／非グリコシル化抗体を生じる。他のサイレント突然変異には、以下が含まれる：残基Ｌ２３４及びＧ２３７（Ｌ２３４Ａ／Ｇ２３７Ａ）における置換；残基Ｓ２２８、Ｌ２３５及びＲ４０９（Ｓ２２８Ｐ／Ｌ２３５Ｅ／Ｒ４０９Ｋ、Ｔ、Ｍ、Ｌ）における置換；残基Ｈ２６８、Ｖ３０９、Ａ３３０及びＡ３３１（Ｈ２６８Ｑ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ａ３３１Ｓ）における置換；残基Ｃ２２０、Ｃ２２６、Ｃ２２９及びＰ２３８（Ｃ２２０Ｓ／Ｃ２２６Ｓ／Ｃ２２９Ｓ／Ｐ２３８Ｓ）における置換；残基Ｃ２２６、Ｃ２２９、Ｅ２３３、Ｌ２３４及びＬ２３５（Ｃ２２６Ｓ／Ｃ２２９Ｓ／Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａにおける置換；残基Ｋ３２２、Ｌ２３５及びＬ２３５（Ｋ３２２Ａ／Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ）における置換；残基Ｌ２３４、Ｌ２３５及びＰ３３１（Ｌ２３４Ｆ／Ｌ２３５Ｅ／Ｐ３３１Ｓ）における置換；残基２３４、２３５及び２９７における置換；残基Ｅ３１８、Ｋ３２０及びＫ３２２（Ｌ２３５Ｅ／Ｅ３１８Ａ／Ｋ３２０Ａ／Ｋ３２２Ａ）における置換；残基（Ｖ２３４Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ｐ２３８Ｓ）における置換；残基２４３及び２６４における置換；残基２９７及び２９９における置換；ＥＵ番号付けシステムによって定義される残基２３３、２３４、２３５、２３７及び２３８がＰＡＡＡＰ、ＰＡＡＡＳ及びＳＡＡＡＳから選択される配列を含むような置換（国際公開第２０１１／０６６５０１号パンフレットを参照）。
一実施形態において、抗体は、Ｆｃ領域に１つ以上の特異的突然変異を含むことができ、その結果、本開示の抗体の改善された安定性を生じる、例えば、複数の芳香族アミノ酸残基を含む及び／又は高い疎水性を有する。例えば、このような抗体は、ヒトＩｇＧ１起源のＦｃドメインを含み、Ｋａｂａｔ残基２３４、２３５、２３７、３３０及び／又は３３１に突然変異を含む。このようなＦｃドメインの一例は、Ｋａｂａｔ残基Ｌ２３４、Ｌ２３５及びＰ３３１（例えば、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ｅ／Ｐ３３１Ｓ又は（Ｌ２３４Ｆ／Ｌ２３５Ｅ／Ｐ３３１Ｓ）における置換を含む。このようなＦｃドメインの別の例は、Ｋａｂａｔ残基Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｇ２３７及びＰ３３１（例えば、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ｅ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ３３１Ｓ）における置換を含む。このようなＦｃドメインの別の例は、Ｋａｂａｔ残基Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｇ２３７、Ａ３３０及びＰ３３１（例えば、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ｅ／Ｇ２３７Ａ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ）における置換を含む。一実施形態において、抗体は、Ｌ２３４Ｘ１置換、Ｌ２３５Ｘ２置換、及びＰ３３１Ｘ３置換を含む、Ｆｃドメイン、任意選択でヒトＩｇＧ１アイソタイプのＦｃドメインを含み、Ｘ１はロイシン以外の任意のアミノ酸残基であり、Ｘ２はロイシン以外の任意のアミノ酸残基であり、Ｘ３はプロリン以外の任意のアミノ酸残基であり；任意選択でＸ１はアラニン若しくはフェニルアラニン又はその保存的置換であり；任意選択でＸ２はグルタミン酸又はその保存的置換であり；任意選択でＸ３はセリン又はその保存的置換である。別の実施形態において、抗体は、Ｌ２３４Ｘ１置換、Ｌ２３５Ｘ２置換、Ｇ２３７Ｘ４置換及びＰ３３１Ｘ４置換を含む、Ｆｃドメイン、任意選択でヒトＩｇＧ１アイソタイプのＦｃドメインを含み、Ｘ１はロイシン以外の任意のアミノ酸残基であり、Ｘ２はロイシン以外の任意のアミノ酸残基であり、Ｘ３はグリシン以外の任意のアミノ酸残基であり、及びＸ４はプロリン以外の任意のアミノ酸残基であり；任意選択でＸ１はアラニン若しくはフェニルアラニン又はその保存的置換であり；任意選択でＸ２はグルタミン酸又はその保存的置換であり；任意選択でＸ３はアラニン又はその保存的置換であり、任意選択でＸ４はセリン又はその保存的置換である。別の実施形態において、抗体は、Ｌ２３４Ｘ１置換、Ｌ２３５Ｘ２置換、Ｇ２３７Ｘ４置換、Ｇ３３０Ｘ４置換及びＰ３３１Ｘ５置換を含む、Ｆｃドメイン、任意選択でヒトＩｇＧ１アイソタイプのＦｃドメインを含み、Ｘ１はロイシン以外の任意のアミノ酸残基であり、Ｘ２はロイシン以外の任意のアミノ酸残基であり、Ｘ３はグリシン以外の任意のアミノ酸残基であり、Ｘ４はアラニン以外の任意のアミノ酸残基であり、及びＸ５はプロリン以外の任意のアミノ酸残基であり；任意選択でＸ１はアラニン若しくはフェニルアラニン又はその保存的置換であり；任意選択でＸ２はグルタミン酸又はその保存的置換であり；任意選択でＸ３はアラニン又はその保存的置換であり、任意選択でＸ４はセリン又はその保存的置換であり、任意選択でＸ５はセリン又はその保存的置換である。本明細書で用いる簡潔な表記では、その構成は、以下：野生型残基：ポリペプチドにおける位置：突然変異体残基のようにし、残基の位置は、ＫａｂａｔによるＥＵ番号付けに従って示される。
一実施形態において、抗体は、以下のアミノ酸配列、又はそれらと少なくとも９０％、９５％又は９９％同一のアミノ酸配列を含むが、Ｋａｂａｔ位置２３４、２３５及び３３１（下線）にアミノ酸残基を保持する重鎖定常領域を含む：
一実施形態において、抗体は、以下のアミノ酸配列、又はそれらと少なくとも９０％、９５％又は９９％同一のアミノ酸配列を含むが、Ｋａｂａｔ位置２３４、２３５及び３３１（下線）にアミノ酸残基を保持する重鎖定常領域を含む：
一実施形態において、抗体は、以下のアミノ酸配列、又はそれらと少なくとも９０％、９５％又は９９％同一のアミノ酸配列を含むが、Ｋａｂａｔ位置２３４、２３５、２３７、３３０及び３３１（下線）にアミノ酸残基を保持する重鎖定常領域を含む：
一実施形態において、抗体は、以下のアミノ酸配列、又はそれらと少なくとも９０％、９５％又は９９％同一の配列を含むが、Ｋａｂａｔ位置２３４、２３５、２３７及び３３１（下線）にアミノ酸残基を保持する重鎖定常領域を含む：
Ｆｃサイレント抗体は、ＡＤＣＣ活性を生じないか、又は低くし、すなわち、Ｆｃサイレント抗体は、５０％未満の特異的細胞溶解であるＡＤＣＣ活性を示す。好ましくは、抗体は実質的にＡＤＣＣ活性を欠き、例えば、Ｆｃサイレント抗体は５％未満又は１％未満のＡＤＣＣ活性（特異的細胞溶解）を示す。Ｆｃサイレント抗体はまた、ＣＤ３９発現の表面でＣＤ３９のＦｃγＲ媒介架橋の欠如を生じ得る。
一実施形態において、抗体は、２２０、２２６、２２９、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２４３、２６４、２６８、２９７、２９８、２９９、３０９、３１０、３１８、３２０、３２２、３２７、３３０、３３１及び４０９（重鎖定常領域の残基番号付けは、ＫａｂａｔによるＥＵ番号付けによる）からなる群から選択される任意の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ又はそれ以上の残基において重鎖定常領域に置換を有する。一実施形態において、抗体は残基２３４、２３５及び３２２での置換を含む。一実施形態において、抗体は残基２３４、２３５及び３３１に置換を有する。一実施形態において、抗体は、残基２３４、２３５、２３７及び３３１に置換を有する。一実施形態において、抗体は、残基２３４、２３５、２３７、３３０及び３３１に置換を有する。一実施形態において、ＦｃドメインはヒトＩｇＧ１サブタイプのものである。アミノ酸残基は、ＫａｂａｔによるＥＵ番号付けに従って示される。
一実施形態において、抗体は、抗体のｉｎ ｖｉｖｏ半減期を増加させるためにヒトＦｃＲｎポリペプチドへの結合を増加させるアミノ酸置換を含むＦｃドメインを含む。例示的な突然変異は、Ｓｔｒｏｈｌ，Ｗ．，２００９，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．ｖｏｌ．２０（６）：６８５−６９１に記載されており、その開示内容は、参照として本明細書に組み込む。ヒトＩｇＧ１アイソタイプの抗体に使用される置換の例は、残基Ｍ２５２、Ｓ２５４及びＴ２５６における置換；残基Ｔ２５０及びＭ４２８における置換；残基Ｎ４３４における置換；残基Ｈ４３３及びＮ４３４における置換；残基Ｔ３０７、Ｅ３８０及びＮ４３４における置換；残基Ｔ３０７、Ｅ３８０及びＮ４３４における置換；残基Ｍ２５２、Ｓ２５４、Ｔ２５６、Ｈ４３３、Ｎ４３４及び４３６における置換；残基Ｉ２５３における置換；残基Ｐ２５７、Ｎ４３４、Ｄ３７６及びＮ４３４における置換である。
一実施形態において、抗体は、プロテアーゼによる切断に対する感受性の低下をもたらすアミノ酸置換を含むＦｃドメインを含む。マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）は、腫瘍形成に関連するプロテイナーゼの最も顕著なファミリーを表す。癌細胞はＭＭＰを発現することができ、細胞外ＭＭＰの大部分は、異なるタイプの腫瘍に浸潤する間質細胞によって提供され、それぞれ、細胞外空間に放出され、腫瘍周囲の環境を特異的に変化させる、特異的なプロテイナーゼ及びプロテイナーゼ阻害剤の特異的なセットを生成する。腫瘍微小環境中に存在するＭＭＰは、ヒンジ領域内で抗体を切断することができ、従って、腫瘍部位内で機能するように設計された治療用抗体の不活性化を導き得る。一実施形態では、アミノ酸置換を含むＦｃドメインは、ＧｌｕＶ８、ＩｄｅＳ、ゼラチナーゼＡ（ＭＭＰ２）、ゼラチナーゼＢ（ＭＭＰ−９）、マトリックスメタロプロテイナーゼ−７（ＭＭＰ−７）、ストロメリシン（ＭＭＰ−３）及びマクロファージエラスターゼ（ＭＭＰ−１２）からなる群から選択されるプロテアーゼの任意の１、２、３個又はそれ以上（又は全て）による切断への感受性が減少した。一実施形態において、抗体の切断に対する感受性の低下は、残基Ｅ２３３〜Ｌ２３４及び／又はＬ２３５でのアミノ酸置換を含むＦｃドメインを含む。一実施形態において、抗体は、残基Ｅ２３３、Ｌ２３４、Ｌ２３５及びＧ２３６にアミノ酸置換を含むＦｃドメインを含む。一実施形態において、抗体は、例えばＥ２３３−Ｌ２３４−Ｌ２３５−Ｇ２３６配列がＰ２３３−Ｖ２３４−Ａ２３５（Ｇ２３６が欠失した）で置換されるように、１つ以上の残基２３３〜２３８でのアミノ酸置換を含むＦｃドメインを含む。例えば、国際公開第９９／５８５７２号パンフレット及び国際公開第２０１２０８７７４６号パンフレットを参照、その開示内容は、参照として本明細書に組み込む。
抗原結合化合物は、ＣＤ３９の酵素活性を阻害する能力、特にＣＤ３９のＡＴＰａｓｅ活性をブロックし、ＣＤ３９発現細胞によるＡＤＰ及びＡＭＰの生成を（ＣＤ７３、アデノシンと共に）低下させ、次にリンパ球のアデノシン媒介阻害の活性を回復させ、及び／又は阻害を緩和する能力について、任意の所望の段階で評価することができる。
抗体の阻害活性（例えば、免疫増強能）は、例えば、ＡＴＰの消失（加水分解）及び／又はＡＭＰの産生を検出するアッセイにおいて評価することができる。一態様では、ＣＤ３９下方制御に非感受性のアッセイが使用される。このようなアッセイの一例は、ＣＤ３９発現細胞（例えば、Ｒａｍｏｓ細胞）を試験抗体でインキュベートした後の検出ＡＭＰによるＡＭＰの産生を評価すること、及び上澄み中でＡＭＰの産生を質量分析（例えば、ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ）によって測定することである。例えば実施例６を参照。
抗体の存在下でのＡＴＰのＡＭＰへの加水分解の減少及び／又はＡＭＰの産生の減少は、抗体がＣＤ３９を阻害することを示す。一実施形態において、抗体調製物は、例えば実施例６のように、ＣＤ３９発現細胞（例えば、Ｒａｍｏｓ細胞）を試験抗体でインキュベートした後の検出ＡＭＰによるＡＭＰの産生を検出すること、及び上澄み中でＡＭＰの産生を質量分析（例えば、ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ）によって測定することによって評価される、ＣＤ３９ポリペプチドの酵素活性の少なくとも６０％の低下、好ましくは、ＣＤ３９ポリペプチドの酵素活性の少なくとも７０％、８０％又は９０％の低下を引き起こすことができる。
抗体の活性は、例えば、リンパ球のアデノシン媒介阻害を緩和する、又はリンパ球活性の活性化を引き起こす、免疫細胞（例えば、アデノシン受容体発現免疫細胞；Ａ２Ａ受容体発現細胞）の活性を調節するその能力について、間接的アッセイで測定することもできる。これは、例えば、サイトカイン放出アッセイを用いて対処し得る。別の例において、抗体は、リンパ球の増殖を調節するその能力についての間接的アッセイで評価することができる。
抗体は、ＣＤ３９のインターナライゼーション又は下方制御を誘発するその能力について、例えば、インターナライゼーションによるものであるか細胞表面からのＣＤ３９放出の誘導によるものであるか、試験することができる。抗ＣＤ３９抗体が哺乳動物細胞上のＣＤ３９に結合するかどうか、又はＣＤ３９ポリペプチドが細胞内インターナライゼーションを受けるかどうか（例えば、抗体により結合された場合）は、本明細書の実験例（例えば、実施例５）に記載されるものを含む様々なアッセイによって決定され得る。他の実施例では、インビボでインターナライゼーションを試験するために、試験抗体を標識し、特定の細胞の表面に発現したＣＤ３９を有することが知られている動物に導入する。抗体は、例えば、放射性標識又は蛍光若しくは金粒子で標識することができる。このアッセイに適した動物は、ヒトＣＤ３９発現Ｂ細胞、Ｔ細胞、ＴＲｅｇ細胞、腫瘍移植又は異種移植片を含有するヌードマウス、若しくはヒトＣＤ３９でトランスフェクトされた細胞が導入されたマウス、又はヒトＣＤ３９導入遺伝子を発現するトランスジェニックマウスなどの哺乳動物を含む。適切な対照には、試験抗体を受けなかった動物又は無関係の抗体を受けた動物、及び抗原に結合する際にインターナライズすることが知られている、目的の細胞上の別の抗原に対する抗体を受けた動物が含まれる。抗体は、動物に、例えば静脈内注射によって、投与することができる。適切な時間間隔で、動物の組織切片を、既知の方法を用いて、又は以下の実験例に記載したように調製し、インターナライゼーション及び細胞内のインターナライズ抗体の位置について、光学顕微鏡検査又は電子顕微鏡検査によって分析することができる。ｉｎ ｖｉｔｒｏでインターナライゼーションするために、細胞を、培養培地に添加された関連抗体の存在下又は非存在下、組織培養皿中でインキュベートし、所望の時点で顕微鏡分析のために処理することができる。細胞内にインターナライズされ標識された抗体の存在は、放射性標識された抗体が使用される場合、顕微鏡検査又はオートラジオグラフィーによって直接視覚化され得る。任意選択で、顕微鏡検査では、既知のポリペプチド又は他の細胞成分との共局在化を評価することができ、例えば、エンドソーム／リソソームマーカーＬＡＭＰ−１（ＣＤ１０７ａ）との共局在により、インターナライズ抗体の細胞内局在に関する情報が提供され得る。あるいは、定量的生化学アッセイでは、ＣＤ３９発現細胞を含む細胞の集団を、放射性標識した試験抗体とｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏで接触させ、細胞（ｉｎ ｖｉｖｏで接触させた場合、適切な時間後に細胞を単離する）はプロテアーゼで処理するか、又は酸洗浄に供し、細胞表面上の非インターナライズ抗体を除去する。細胞を粉砕し、ホモジネートをシンチレーションカウンターに通すことによって、細胞の各バッチに関連する、プロテアーゼ耐性、放射性の１分あたりのカウント（ｃｐｍ）を測定する。放射性標識された抗体の既知の特異的活性に基づいて、細胞あたりインターナライズされた抗体分子の数は、基底細胞のシンチレーションカウントから推定することができる。培養皿又はフラスコ中の細胞培養培地に細胞を添加し、抗体を培地とよく混合して細胞を抗体に確実に均一に曝露させることなどによって、細胞を、好ましくは溶液形態で、抗体とｉｎ ｖｉｔｒｏで「接触させる」。
一例では、抗体スクリーニングは、ＣＤ３９細胞表面発現の誘導又は下方制御の増加に依存することなく、ＣＤ３９の酵素活性に結合して中和する抗体を生成又は試験するための、本明細書に記載のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦに基づくアッセイの使用を含み得、以下を含み得る：
（ａ）ＣＤ３９ポリペプチドに結合する複数の結合分子（例えば、抗体）を提供すること、
（ｂ）結合分子の各々をＣＤ３９発現細胞、任意選択でヒトＢ細胞、任意選択でＲａｍｏｓヒトリンパ腫細胞と接触させること；
（ｃ）産生ＡＭＰの減少がＡＴＰａｓｅ活性の中和を示す、質量分析によりＡＭＰの生成を評価すること；
（ｄ）産生ＡＭＰの少なくとも７０％、任意選択で８０％又は任意選択で９０％の低下を生じる結合分子を（例えば、さらなる評価のために、さらなる処理のために、量の生成のために、治療での使用のために）選択すること；
（ｅ）任意選択で、分子がＦｃドメインを含む場合、ヒトＣＤ１６、ＣＤ３２ａ、ＣＤ３２ｂ及び／又はＣＤ６４ポリペプチドへの結合を減少させるためにＦｃドメインを改変すること（例えば、１つ以上のアミノ酸改変の導入によって）；
（ｆ）ＣＤ３９の細胞内インターナライゼーションを誘発又は増加させる分子の能力を評価すること；及び
（ｇ）任意選択で、ＣＤ３９の細胞内インターナライゼーションを実質的に誘導しないか増加させない結合分子を（例えば、さらなる評価のために、さらなる処理のために、量の生成のために、治療での使用のために）選択すること。
一例では、抗体スクリーニングは、抗体Ｉ−３９１のエピトープに対する抗体の選択を方向付けるための突然変異ＣＤ３９ポリペプチドの使用を含み得る。例えば、ＣＤ３９細胞表面発現の下方制御を誘導又は増加させることなくＣＤ３９の酵素活性に結合して中和する抗体を生成又は試験する方法は、以下のステップを含み得る：
（ａ）ＣＤ３９ポリペプチドに結合する複数の抗体を提供すること、
（ｂ）前記抗体のそれぞれを、Ｑ９６、Ｎ９９、Ｅ１４３及びＲ１４７（配列番号１に関する）から選択される１つ、２つ、３つ又は４つの残基の突然変異を含む、突然変異型ＣＤ３９ポリペプチドと接触させること、及び抗体と配列番号１のアミノ酸配列を含む野生型ＣＤ３９ポリペプチドとの結合と比較して、抗体と突然変異型ＣＤ３９ポリペプチドとの結合を評価すること、並びに
（ｃ）抗体と配列番号１のアミノ酸を含む野生型ＣＤ３９ポリペプチドとの間の結合と比較して、突然変異型ＣＤ３９ポリペプチドへの結合が減少した抗体を選択する（例えば、さらなる評価のために、さらなる処理のために、量の生成のために、治療での使用のために）こと；並びに任意選択でさらに、
（ｄ）ステップ（ｃ）で選択された各抗体をＣＤ３９発現細胞、任意選択でヒトＢ細胞、任意選択でＲａｍｏｓヒトリンパ腫細胞と接触させること；
（ｅ）産生ＡＭＰの減少がＡＴＰａｓｅ活性の中和を示す、質量分析によりＡＭＰの生成を評価すること；及び
（ｆ）少なくとも７０％、任意選択で８０％、又は任意選択で９０％の産生ＡＭＰの減少を生じる抗体を選択すること。
ＣＤ３９上のエピトープ
一態様では、抗体は、細胞表面で発現されるＣＤ３９上に存在する抗原決定基に結合する。
一態様では、抗体は、抗体Ｉ−３９１及び／又はＩ−３９２と実質的に同じエピトープに結合する。一実施形態において、抗体は、抗体Ｉ−３９１及び／又はＩ−３９２によって結合されるエピトープと少なくとも部分的に重複する、又は少なくとも１つの残基を含む、ＣＤ３９のエピトープに結合する。抗体が結合する残基は、ＣＤ３９ポリペプチドの表面上、例えば、細胞の表面上に発現されたＣＤ３９ポリペプチド中に存在するものとして特定することができる。
抗ＣＤ３９抗体と、ＣＤ３９突然変異体でトランスフェクトした細胞との結合を測定し、抗ＣＤ３９抗体が野生型ＣＤ３９ポリペプチド（例えば、配列番号１）に結合する能力と比較することができる。抗ＣＤ３９抗体と突然変異体ＣＤ３９ポリペプチド（例えば、表１の変異体）との結合の低減は、結合親和性の低減（例えば、特定の突然変異体を発現する細胞のＦＡＣＳ試験、又は突然変異ポリペプチドに対する結合のＢｉａｃｏｒｅ試験などの公知の方法により測定される）及び／又は抗ＣＤ３９抗体の総結合能力の低減（例えば、ポリペプチド濃度に対する抗ＣＤ３９抗体濃度のグラフにおけるＢｍａｘの低下により証明される）があることを意味する。結合の有意な低減は、突然変異した残基が、抗ＣＤ３９抗体との結合に直接関与しているか、又は抗ＣＤ３９抗体がＣＤ３９に結合している場合、結合タンパク質に極めて近接していることを示している。
ある実施形態において、結合の有意な低減は、抗ＣＤ３９抗体と突然変異体ＣＤ３９ポリペプチド同士の結合親和性及び／又は結合能力が、抗ＣＤ３９抗体と野生型ＣＤ３９ポリペプチド（例えば、配列番号１に示すポリペプチド）同士の結合に対して、４０％超、５０％超、５５％超、６０％超、６５％超、７０％超、７５％超、８０％超、８５％超、９０％超又は９５％超低減していることを意味する。特定の実施形態では、結合は、検出限界を下回る。ある実施形態では、抗ＣＤ３９抗体と突然変異体ＣＤ３９ポリペプチド同士の結合が、抗ＣＤ３９抗体と野生型ＣＤ３９ポリペプチド同士の場合に観察される結合の５０％を下回る（例えば、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％又は１０％を下回る）とき、結合の有意な低減が証明される。
いくつかの実施形態では、抗体Ｉ−３９１又はＩ−３９２によって結合されたアミノ酸残基を含むセグメント中の残基が異なるアミノ酸で置換された、突然変異体ＣＤ３９ポリペプチドに対する有意により低い結合性を示す抗ＣＤ３９抗体が提供される。
いくつかの実施形態では、抗体Ｉ−３９１又はＩ−３９２によって結合されたＣＤ３９上のエピトープに結合する抗ＣＤ３９抗体（例えば、抗体Ｉ−３９１又はＩ−３９２以外）が提供される。
一態様では、抗ＣＤ３９抗体は、Ｑ９６、Ｎ９９、Ｅ１４３及びＲ１４７（配列番号１に関する）からなる群から選択される残基に突然変異を有するＣＤ３９ポリペプチドへの減少した結合を有し、任意選択で、突然変異ＣＤ３９ポリペプチドは、突然変異：Ｑ９６Ａ、Ｎ９９Ａ、Ｅ１４３Ａ及びＲ１４７Ｅを有する。
いくつかの実施形態では、抗体は、抗体Ａ１によって結合されたアミノ酸残基を含むセグメント中の残基が異なるアミノ酸で置換された突然変異体ＣＤ３９ポリペプチド（例えば、表１の突然変異体７、１６及び１７）、例えば、残基Ａ２７２、Ｎ２７４、Ｉ２７６、Ｒ２７８、Ｑ３３２、Ｑ３２３、Ｑ３２６、Ｅ３３０、Ｎ３３３、Ｓ３３５、Ｙ３３６及びＮ３４５（例えば、配列番号１に関する）のうち１つ以上（又は全て）での置換を含む突然変異体ＣＤ３９ポリペプチドに対し、有意により低い結合性を示さない。例えば、一実施形態において、抗ＣＤ３９抗体のエピトープは、残基Ａ２７２、Ｎ２７４、Ｉ２７６、Ｒ２７８（又はＡ２７２、Ｎ２７４、Ｉ２７６、Ｒ２７８、Ｑ３３２、Ｑ３２３、Ｑ３２６、Ｅ３３０、Ｎ３３３、Ｓ３３５、Ｙ３３６及びＮ３４５）を含有せず、及び／又は抗ＣＤ３９抗体は、Ａ２７２、Ｎ２７４、Ｉ２７６、Ｒ２７８（配列番号１に関する）からなる群から選択される残基に突然変異を有するＣＤ３９ポリペプチドへの減少した結合を有さず、任意選択で、突然変異ＣＤ３９ポリペプチドは、突然変異Ａ２７２Ｓ、Ｎ２７４Ａ、Ｉ２７６Ｓ、Ｒ２７８Ａを有する。
一態様では、抗ＣＤ３９抗体は、Ｑ９６、Ｎ９９、Ｅ１４３及びＲ１４７（配列番号１に関する）からなる群から選択されるアミノ酸残基（例えば、１つ、２つ、３つ又は４つの残基）を含むＣＤ３９上のエピトープに結合する。
一態様では、抗ＣＤ３９抗体は、Ｓ９２、Ｋ９３、Ｖ９５、Ｑ９６、Ｋ９７、Ｖ９８、Ｎ９９、Ｅ１００、Ｌ１３６、Ｌ１３７、Ｅ１４０、Ｓ１４１、Ｌ１４４、Ｒ１４７、Ｄ１５０、Ｖ１５１、Ｒ１５４、Ｓ２９４、Ｄ２９５、Ｙ２９６、Ｋ２９８、Ｐ３００、Ｅ３０６、Ｔ３０８及びＱ３１２（配列番号１に関する）からなる群から選択されるアミノ酸残基（例えば、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ又は６つの残基）を含むＣＤ３９上のエピトープに結合する。
一態様では、抗ＣＤ３９抗体は、（ａ）残基Ｓ９２、Ｋ９３、Ｖ９５、Ｑ９６、Ｋ９７、Ｖ９８、Ｎ９９及びＥ１００を含むＣＤ３９の残基の第１セグメント中のアミノ酸残基（例えば、残基の少なくとも１つ、２つ、３つ）；（ｂ）残基Ｌ１３６、Ｌ１３７、Ｅ１４０、Ｓ１４１、Ｌ１４４、Ｒ１４７、Ｄ１５０、Ｖ１５１、Ｒ１５４を含むＣＤ３９の残基の第２セグメント中のアミノ酸残基（例えば、残基の少なくとも１つ、２つ、３つ）；（ｃ）残基Ｓ２９４、Ｄ２９５、Ｙ２９６、Ｋ２９８、Ｐ３００、Ｅ３０６、Ｔ３０８及びＱ３１２（配列番号１に関する）を含むＣＤ３９の残基の第３セグメント中のアミノ酸残基（例えば、残基の少なくとも１つ、２つ、３つ）、を含むＣＤ３９のエピトープに結合する。
一態様では、抗ＣＤ３９抗体は、Ｑ９６、Ｌ１３７及びＥ１４０（配列番号１に関する）からなる群から選択されるアミノ酸残基（例えば、少なくとも１つ、２つ又は３つの残基）を含むＣＤ３９上のエピトープに結合する。
任意の実施形態の一態様では、抗体はさらに、ＣＤ３９のＮ２９２位のグリカンに結合する。
例示的な抗体可変領域配列
本開示に従って適合させることができる例示的な抗ＣＤ３９ ＶＨ及びＶＬ対は、抗体Ｉ−３９１のものであり、その重鎖可変領域のアミノ酸配列は下記（配列番号６）に挙げられ、及びその軽鎖可変領域のアミノ酸配列は下記（配列番号７）に挙げられる。任意選択で、ＶＨ及びＶＬは、ヒトアクセプターフレームワークを含む（例えば、組み込むように改変されている）。一実施形態において、本開示の抗ＣＤ３９抗体は、配列番号６のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域のＶＨ ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及び／又はＣＤＲ３（例えば、Ｋａｂａｔ番号付けによる）を含む。一実施形態において、本開示の抗ＣＤ３９抗体は、配列番号７のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域のＶＬ ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及び／又はＣＤＲ３（例えば、Ｋａｂａｔ番号付けによる）を含む。一実施形態において、本開示の抗ＣＤ３９抗体は、配列番号６のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域のＫａｂａｔ ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及び／又はＣＤＲ３を含むＶＨ、及び配列番号７のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域のＫａｂａｔ ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及び／又はＣＤＲ３を含むＶＬを含む。
Ｉ−３９１ ＶＨ
Ｉ−３９１ ＶＬ
抗ＣＤ３９抗体は、例えば、以下を含む：アミノ酸残基：ＮＹＧＭＮ（配列番号２５）、又はその少なくとも４，５，６，７，８，９又は１０個の連続するアミノ酸配列を含み、任意選択でこれらのアミノ酸の１つ以上が異なるアミノ酸で置換されていてもよい、ＨＣＤＲ１；アミノ酸残基：ＷＩＮＴＹＴＧＥＰＴＹＡＤＤＦＫＧ（配列番号２６）、又はその少なくとも４，５，６，７，８，９又は１０個の連続するアミノ酸配列を含み、任意選択でこれらのアミノ酸の１つ以上が異なるアミノ酸で置換されていてもよい、ＨＣＤＲ２；Ｋａｂａｔ残基６６〜７０にアミノ酸配列ＲＦＡＦＳＬ（配列番号２７）又はＲＦＶＦＳＬ（配列番号２８）を含み、任意選択でＫａｂａｔ残基７１〜７２ｂにアミノ酸配列ＬＡＴＳ若しくはＬＥＡＳ（又は任意選択でＬＤＴＳ若しくはＬＥＴＳ）を含むＦＲ３；アミノ酸残基：ＫＡＹＹＧＳＮＹＹＦＤＹ（配列番号２９）、又はその少なくとも４，５，６，７，８，９又は１０個の連続するアミノ酸配列を含み、任意選択でこれらのアミノ酸の１つ以上が異なるアミノ酸で置換されていてもよい、ＨＣＤＲ３；アミノ酸残基：ＫＡＳＱＤＶＳＴＡＶＡ（配列番号３０）、又はその少なくとも４，５，６，７，８，９又は１０個の連続するアミノ酸配列を含み、任意選択でこれらのアミノ酸の１つ以上が異なるアミノ酸で置換されていてもよい、ＬＣＤＲ１；Ｋａｂａｔ残基４９にチロシンを含むＦＲ２領域；アミノ酸残基：ＳＡＳＹＲＹＴ（配列番号３１）、又はその少なくとも４，５，６，７，８，９又は１０個の連続するアミノ酸配列を含み、任意選択でこれらのアミノ酸の１つ以上が異なるアミノ酸で置換されていてもよい、ＬＣＤＲ２領域；及び／又はアミノ酸残基：ＱＱＨＹＴＴＰＰＹＴ（配列番号３２）、又はその少なくとも４，５，６，７，８，９又は１０個の連続するアミノ酸配列を含み、任意選択でこれらのアミノ酸の１つ以上が欠失又は異なるアミノ酸で置換されていてもよい、Ｉ−３９１のＬＣＤＲ３領域。ＣＤＲの位置は、Ｋａｂａｔ番号付けによるものであってもよい。
本開示に従って適合させることができる別の例示的な抗ＣＤ３９ ＶＨ及びＶＬ対は、抗体Ｉ−３９２のものであり、その重鎖可変領域のアミノ酸配列は下記（配列番号８）に挙げられ、及びその軽鎖可変領域のアミノ酸配列は下記（配列番号９）に挙げられる。任意選択で、ＶＨ及びＶＬは、ヒトアクセプターフレームワークを含む（例えば、組み込むように改変されている）。一実施形態において、本開示の抗ＣＤ３９抗体は、配列番号８のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域のＶＨＣＤＲ１、ＣＤＲ２及び／又はＣＤＲ３（例えば、Ｋａｂａｔ番号付けによる）を含む。一実施形態において、本開示の抗ＣＤ３９抗体は、配列番号９のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域のＶＬ ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及び／又はＣＤＲ３（例えば、Ｋａｂａｔ番号付けによる）を含む。一実施形態において、本開示の抗ＣＤ３９抗体は、配列番号８のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域のＫａｂａｔ ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及び／又はＣＤＲ３を含むＶＨ、及び配列番号９のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域のＫａｂａｔ ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及び／又はＣＤＲ３を含むＶＬを含む。
Ｉ−３９２ ＶＨ
Ｉ−３９２ ＶＬ
抗ＣＤ３９抗体は、例えば、以下を含む：アミノ酸配列：ＨＹＧＭＮ（配列番号３３）を含むＨＣＤＲ１；アミノ酸配列：ＷＩＮＴＹＴＧＥＰＴＹＡＤＤＦＫＧ（配列番号２６）を含むＨＣＤＲ２；Ｋａｂａｔ残基６６〜７０にアミノ酸配列ＲＦＡＦＳＬ（配列番号２７）又はＲＦＶＦＳＬ（配列番号２８）を含み、任意選択でＫａｂａｔ残基７１〜７２ｂにアミノ酸配列ＬＡＴＳ若しくはＬＥＡＳ（又は任意選択でＬＤＴＳ若しくはＬＥＴＳ）を含むＦＲ３；アミノ酸配列：ＲＲＹＥＧＮＹＶＦＹＹＦＤＹ（配列番号３４）を含むＨＣＤＲ３；アミノ酸配列：ＲＡＳＥＮＩＹＳＹＦＳ（配列番号３５）を含むＬＣＤＲ１；Ｋａｂａｔ残基４９にチロシンを含むＦＲ２領域；アミノ酸配列：ＴＡＫＴＬＡＥ（配列番号３６）を含むＬＣＤＲ２領域；及び／又はアミノ酸配列：ＱＨＨＹＶＴＰＹＴ（配列番号３７）を含むＬＣＤＲ３領域。ＣＤＲの位置は、Ｋａｂａｔ番号付けによるものであってもよい。
本開示に従って適合させることができる別の例示的な抗ＣＤ３９ ＶＨ及びＶＬ対は、抗体のものであり、その重鎖可変領域のアミノ酸配列は下記（配列番号１０）に挙げられ、及びその軽鎖可変領域のアミノ酸配列は下記（配列番号１１）に挙げられる。任意選択で、ＶＨ及びＶＬは、ヒトアクセプターフレームワークを含む（例えば、組み込むように改変されている）。一実施形態において、本開示の抗ＣＤ３９抗体は、配列番号１０のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域のＶＨＣＤＲ１、ＣＤＲ２及び／又はＣＤＲ３（例えば、Ｋａｂａｔ番号付けによる）を含む。一実施形態において、本開示の抗ＣＤ３９抗体は、配列番号１１のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域のＶＬ ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及び／又はＣＤＲ３（例えば、Ｋａｂａｔ番号付けによる）を含む。一実施形態において、本開示の抗ＣＤ３９抗体は、配列番号１０のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域のＫａｂａｔ ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及び／又はＣＤＲ３を含むＶＨ、及び配列番号１１のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域のＫａｂａｔ ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及び／又はＣＤＲ３を含むＶＬを含む。
ＶＨ
ＶＬ
一実施形態において、抗体は、以下を含む：アミノ酸配列：ＨＹＧＭＮ（配列番号３３）を含むＨＣＤＲ１；アミノ酸配列：ＷＩＮＴＹＴＧＥＬＴＹＡＤＤＦＫＧ（配列番号３８）を含むＨＣＤＲ２；任意選択でＫａｂａｔ残基６６〜７０にアミノ酸配列ＲＦＡＦＳＬ（配列番号２７）又はＲＦＶＦＳＬ（配列番号２８）を含み、任意選択でＫａｂａｔ残基７１〜７２ｂにアミノ酸配列ＬＡＴＳ若しくはＬＥＡＳ（又は任意選択でＬＤＴＳ若しくはＬＥＴＳ）を含むＦＲ３；アミノ酸配列：ＲＡＹＹＲＹＤＹＶＭＤＹ（配列番号３９）を含むＨＣＤＲ３；アミノ酸配列：ＫＡＳＨＮＶＧＴＮＶＡ（配列番号４０）を含むＬＣＤＲ１；Ｋａｂａｔ残基４９にチロシンを含むＦＲ２領域；アミノ酸配列：ＳＡＳＹＲＹＳ（配列番号４１）を含むＬＣＤＲ２領域；及び／又はアミノ酸配列：ＨＱＹＮＮＹＰＹＴ（配列番号４２）を含むＬＣＤＲ３を含むＬＣＤＲ３領域。ＣＤＲの位置は、Ｋａｂａｔ番号付けによるものであってもよい。
いずれの抗体においても、所定の可変領域、ＦＲ及び／又はＣＤＲ配列は、１つ以上の配列改変、例えば、置換（１、２、３、４、５、６、７、８又はそれ以上の配列改変）を含み得る。一実施形態において、置換は保存的改変である。
別の態様では、抗ＣＤ３９化合物は、配列番号６のＶＨドメインに対し、少なくとも約６０％、７０％又は８０％の配列同一性、任意選択で少なくとも約８５％、９０％、９５％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有するＶＨドメインを含む。別の態様では、抗ＣＤ３９抗体は、配列番号７のＶＬドメインに対し、少なくとも約６０％、７０％又は８０％の配列同一性、任意選択で少なくとも約８５％、９０％、９５％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有するＶＬドメインを含む。
別の態様では、抗ＣＤ３９化合物は、配列番号８のＶＨドメインに対し、少なくとも約６０％、７０％又は８０％の配列同一性、任意選択で少なくとも約８５％、９０％、９５％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有するＶＨドメインを含む。別の態様では、抗ＣＤ３９抗体は、配列番号９のＶＬドメインに対し、少なくとも約６０％、７０％又は８０％の配列同一性、任意選択で少なくとも約８５％、９０％、９５％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有するＶＬドメインを含む。
別の態様では、抗ＣＤ３９化合物は、配列番号１０のＶＨドメインに対し、少なくとも約６０％、７０％又は８０％の配列同一性、任意選択で少なくとも約８５％、９０％、９５％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有するＶＨドメインを含む。別の態様では、抗ＣＤ３９抗体は、配列番号１１のＶＬドメインに対し、少なくとも約６０％、７０％又は８０％の配列同一性、任意選択で少なくとも約８５％、９０％、９５％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有するＶＬドメインを含む。
他のＶＨ及びＶＬドメインの範囲及びそれを含む抗体は、本明細書で提供される構造情報に基づいて調製することができる。ＣＤ３９に結合し、ＣＤ３９の活性を阻害することができる例示的な結合分子又はその抗原結合フラグメントは、ＶＨ及びＶＬを含み得、ＶＨは以下を含む：
− 任意選択で、ＣＤ３９と接触することができる残基を含み、任意選択で残基がＫａｂａｔ位置３０にあり、任意選択で残基がスレオニンであるＦＲ１、
− ＣＤ３９に接触することができる、Ｋａｂａｔ位置３３、任意選択で位置３１及び３３の両方に残基を含むＣＤＲ１；
− ＣＤ３９と接触することができるＫａｂａｔ位置５０、５２、５２ａ、５３、５４及び５６の６つのうち、任意の１つ、２つ、３つ、４つ、５つに残基を含み、任意選択で位置５３の残基が芳香環、任意選択でチロシンを含む、ＣＤＲ２；
− ＣＤ３９と接触することができるＫａｂａｔ位置６７、６８、６９、７０及び７１の５つのうち、任意の１、２、３、４個に残基を含むＦＲ３を含み、任意選択で、ＣＤ３９と接触することができるＫａｂａｔ位置７２、７２ａ及び７２ｂの３つのうち、任意の１、２個にさらに残基を含むＦＲ３、及び
− ＣＤ３９に接触することができるＫａｂａｔ位置１００、１００ｂ、１００ｃ、１００ｄ、１００ｅ及び／又は１００ｆのいずれか１つ又は２つ以上（残基が特定の位置に存在する範囲で）の残基を含み、残基（単数又は複数）は芳香環、任意選択でチロシンを含む、ＣＤＲ３。任意選択で、ＣＤＲ３は、ＶＬに接触することができるＫａｂａｔ位置１００、１００ｂ、１００ｃ、１００ｄ、１００ｅ及び／又は１００ｆのいずれか１つ又は２つ以上（残基が特定の位置に存在する範囲で）の残基を含み、残基は芳香環を含む。
重鎖ＣＤＲ１（及びＦＲ１）
例示的なＣＤＲ１（任意選択でＦＲ１の１つ以上の残基と共に）は、ＣＤ３９のＮ末端ドメインに結合する。ＶＨは、例えば、Ｋａｂａｔ位置３０（ＣＤＲ１に隣接するＫａｂａｔ ＦＲ１内）のＣＤ３９接触残基を有し、残基３０はＣＤ３９の残基Ｑ９６と接触し得る。一実施形態において、ＶＨは、例えばＫａｂａｔ位置３１（Ｋａｂａｔ ＣＤＲ１内）にＣＤ３９接触残基を有し得る。一実施形態において、ＶＨは、例えばＫａｂａｔ位置３２（Ｋａｂａｔ ＣＤＲ１内）にＣＤ３９接触残基を有し得る。一実施形態において、ＶＨは、例えばＫａｂａｔ位置３３（Ｋａｂａｔ ＣＤＲ１内）にＣＤ３９接触残基を有し得る。
一実施形態において、ＶＨは、Ｋａｂａｔ位置３１，３２及び３３の残基が式Ｘ１Ｘ２Ｘ３を有し、Ｘ１は任意のアミノ酸、任意選択でヒスチジン若しくはアスパラギン、又は任意選択でその保存的置換を表し、Ｘ２は任意のアミノ酸、任意選択で芳香族残基、任意選択でチロシン、又は任意選択でその保存的置換、又は任意選択でプロリン又はグリシン以外のアミノ酸を表し、Ｘ３はグリシンを表す、ＣＤＲ１を含む。任意選択で、Ｋａｂａｔ位置３２，３４及び／又は３５の残基は、ＶＨのヒトアクセプター配列中の対応する残基と同一である。
一実施形態において、ＶＨは、Ｋａｂａｔ位置３１〜３５の残基が式Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５（配列番号４３）を有し、Ｘ１はヒスチジン若しくはアスパラギン又はその保存的置換を表し、Ｘ２は任意のアミノ酸、任意選択で芳香族残基、任意選択でチロシン、又は任意選択でその保存的置換を表し、Ｘ３はグリシン又はその保存的置換を表し、Ｘ４は任意のアミノ酸、任意選択でメチオニン又はその保存的置換を表し、Ｘ５は任意のアミノ酸、任意選択でアスパラギン又はその保存的置換を表す、ＣＤＲ１を含む。一実施形態において、ＣＤＲ１は、任意選択で１つ又は２つのアミノ酸置換を含む、アミノ酸配列ＨＹＧＭＮ（配列番号３３）を含む。一実施形態において、Ｋａｂａｔ位置３１〜３５は、アミノ酸配列ＨＹＧＭＮ（配列番号３３）と（例えば、１つ以上のアミノ酸残基が）異なるアミノ酸配列を有する。
重鎖ＣＤＲ２−ＦＲ３セグメント
ＣＤＲ２（例えば、Ｋａｂａｔによる）は、ＣＤ３９のＮ末端ドメインと接触することができ（例えば、Ｋａｂａｔ位置５０〜５６のセグメント内の残基を介して）、さらに、ＣＤ３９のＣ末端ドメインと接触することができる残基（Ｋａｂａｔ ＦＲ３ドメインの残基と共に、例えば、Ｋａｂａｔ位置５９〜７１又は任意選択で５９〜７２ｂのセグメント内）を含み得る。
例えば、ＣＤＲ２は、ＣＤ３９に接触することができるＫａｂａｔ位置５０に残基を有し得る。一実施形態において、ＣＤＲ２は、ＣＤ３９と接触することができるＫａｂａｔ位置５２に残基を有し得る。一実施形態において、ＣＤＲ２は、ＣＤ３９に接触することができるＫａｂａｔ位置５２ａに残基を有し得る。一実施形態において、ＣＤＲ２は、ＣＤ３９と接触することができるＫａｂａｔ位置５３に残基、任意選択で芳香族残基を有し得る。一実施形態において、ＣＤＲ２は、ＣＤ３９と接触することができるＫａｂａｔ位置５４に残基を有し得る。一実施形態において、ＣＤＲ２は、ＣＤ３９に接触することができるＫａｂａｔ位置５６に残基を有し得る。
一実施形態において、ＶＨはＣＤＲ２を含み、Ｋａｂａｔ位置５０〜５６の残基は式Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８（配列番号１３）を有し、Ｘ１はトリプトファンを表し、Ｘ２は任意のアミノ酸、任意選択でイソロイシンを表し、Ｘ３はアスパラギン又は任意選択でグルタミンを表し、Ｘ４はスレオニンを表し、Ｘ５は任意のアミノ酸、任意選択でチロシン、又は任意選択でフェニルアラニンを表し、Ｘ６は任意のアミノ酸、任意選択でスレオニン、任意選択でセリン、任意選択でアスパラギン、アラニン又はグリシン、任意選択で大きな残基又は疎水性残基以外の残基を表し、Ｘ７は任意のアミノ酸、任意選択でグリシン、任意選択でアラニン、セリン、スレオニン、アスパラギン又はグルタミン、任意選択でアスパラギン酸又はグルタミン酸以外の残基、任意選択でリシン又はアルギニン以外の残基を表し、及びＸ８はグルタミン酸、任意選択でアスパラギン酸を表す。一実施形態において、Ｋａｂａｔ位置５０〜５６は、アミノ酸配列ＷＩＮＴＹＴＧＥ（配列番号４４）を有し、任意選択で１つ又は２つのアミノ酸置換を含む。一実施形態において、Ｋａｂａｔ位置５０〜６５は、アミノ酸配列ＷＩＮＴＹＴＧＥＰＴＹＡＤＤＦＫＧ（配列番号２６）又はＷＩＮＴＹＴＧＥＬＴＹＡＤＤＦＫＧ（配列番号３８）を有する。別の実施形態において、Ｋａｂａｔ位置５０〜６５は、アミノ酸配列ＷＩＮＴＹＴＧＥＰＴＹＡＤＤＦＫＧ（配列番号２６）及び／又はＷＩＮＴＹＴＧＥＬＴＹＡＤＤＦＫＧ（配列番号３８）と（例えば、１つ以上のアミノ酸残基が）異なるアミノ酸配列を有する。
一実施形態において、ＶＨＦＲ３（Ｋａｂａｔによる）は、ＣＤ３９のＣ末端ドメインのアミノ酸残基に接触することができる残基を含み、任意選択で、さらにＫａｂａｔ位置５９〜７１の残基がＣＤ３９の残基Ｎ２９２のグリカンと接触する。一実施形態において、ＶＨＫａｂａｔ ＦＲ３は、Ｋａｂａｔ位置６７、６８、６９、７０及び／又は７１に、及び任意選択でさらにＣＤ３９のＣ末端ドメインに接触することができる残基７２，７２ａ及び／又は７２に、例えば、ＣＤ３９内に存在するアミノ酸及び／又はＣＤ３９ポリペプチドのＮ２９２におけるグリカンを含む、残基を含む。
一実施形態において、Ｋａｂａｔ位置５９〜７１は、アミノ酸配列ＹＡＤＤＦＫＧＲＦＡＦＳＬ（配列番号４５）又はＹＡＤＤＦＫＧＲＦＶＦＳＬ（配列番号４６）を有し、任意選択で１つ又は２つのアミノ酸置換を含み、又はＹＡＤＤＦＫＧＲＦＡＦＳＬ（配列番号４５）又はＹＡＤＤＦＫＧＲＦＶＦＳＬ（配列番号４６）と異なるアミノ酸配列を有する。
例えば、ＣＤＲ２は、ＣＤ３９のＣ末端ドメインと接触することができるＫａｂａｔ位置６７に残基を有し得る。一実施形態において、ＣＤＲ２は、ＣＤ３９と接触することができるＫａｂａｔ位置６８に残基を有し得る。一実施形態において、ＣＤＲ２は、ＣＤ３９に接触することができるＫａｂａｔ位置６９に残基を有し得る。一実施形態において、ＣＤＲ２は、ＣＤ３９に接触することができるＫａｂａｔ位置７０に残基を有し得る。一実施形態において、ＣＤＲ２は、ＣＤ３９に接触することができるＫａｂａｔ位置７１に残基を有し得る。
一実施形態において、ＶＨＦＲ３（例えば、Ｋａｂａｔ ＦＲ３のＮ末端セグメント）は、Ｋａｂａｔ位置６６〜７１に式Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６（配列番号４７）を有する残基を含み、Ｘ１は任意のアミノ酸、任意選択でアルギニンを表し、Ｘ２はフェニルアラニン又はβ−ストランドの位置及びＶＨドメイン構造の完全性を維持することができる別の疎水性残基を表し、Ｘ３はアラニン又はバリン、任意選択でロイシン、任意選択で疎水性残基を表し、Ｘ４はフェニルアラニン又はβ−ストランドの位置及びＶＨドメイン構造の完全性を維持することができる別の疎水性残基を表し、及びＸ５はセリンを表し、及びＸ６は任意のアミノ酸、任意選択でロイシン、任意選択でアラニン、バリン又はスレオニンを表す。
一実施形態において、ＶＨＦＲ３（Ｋａｂａｔによる）は、式Ｘ１Ｘ２Ｘ３を有するＫａｂａｔ位置７２、７２ａ及び７２ｂの残基を含み、Ｘ１はアスパラギン酸、グルタミン酸又はアラニンを表し、Ｘ２は任意のアミノ酸、任意選択でアラニン若しくはスレオニン又はその保存的置換を表し、Ｘ３はセリン、任意選択でアラニン、又はその保存的置換を表す。
一実施形態において、ＶＨは、Ｋａｂａｔ位置６７〜７１のＦＲ３シグネチャー配列ＦＶＦＳＬ（配列番号５９）を含む。一実施形態において、ＶＨは、Ｋａｂａｔ位置６７〜７１のアミノ酸配列ＦＶＦＳＬ（配列番号５９）を天然に含むヒトアクセプターフレームワーク又はその部分（例えば、ＦＲ３ドメイン）を含む。別の実施形態において、ＶＨは、１つ以上のアミノ酸改変（例えば、Ｋａｂａｔ位置６７〜７１での１つ以上の置換）を含み、Ｋａｂａｔ位置６７〜７１のアミノ酸配列ＦＶＦＳＬ（配列番号５９）を含む、ヒトアクセプターフレームワーク又はその部分（例えば、ＦＲ３ドメイン）を含む。
重鎖ＣＤＲ３
一実施形態において、ＶＨは、ＣＤ３９のＮ末端と接触することができ、任意選択でＣＤ３９及びＶＬのＮ末端ドメインと接触することができる、ＣＤＲ３（例えば、Ｋａｂａｔによる）を含み、任意選択で、ＣＤＲ３は、ＣＤ３９のＮ末端ドメイン中のアミノ酸残基に結合することができる芳香族残基（例えば、チロシン、フェニルアラニン）及びＶＬ中のアミノ酸残基と接触することができる第２芳香族アミノ酸残基（例えば、チロシン、フェニルアラニン）を含む。
例示的なＫａｂａｔＣＤＲ３は、式Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５（配列番号１５）（式中、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４及びＸ５のいずれか３つ以上は芳香族アミノ酸を表す）を有するアミノ酸残基の配列を含み得る。任意選択で、芳香族残基のうち少なくとも３つはチロシンである。任意選択で、少なくとも２つの芳香族残基がチロシンであり、少なくとも１つの芳香族残基がフェニルアラニンである。
例えば、ＣＤＲ３は、ＣＤ３９に接触することができるＫａｂａｔ位置９５に残基を有し得る。一実施形態において、ＣＤＲ３は、ＣＤ３９に接触することができるＫａｂａｔ位置９９に残基を有し得る。一実施形態において、ＣＤＲ３は、ＣＤ３９に接触することができるＫａｂａｔ位置１００ｂに残基を有し得る。一実施形態において、ＣＤＲ３は、ＣＤ３９に接触することができるＫａｂａｔ位置１００ｄに残基、任意選択で芳香族残基を有し得る。一実施形態において、ＣＤＲ３は、ＣＤ３９に接触することができるＫａｂａｔ位置１００ｆに残基を有し得る。
任意選択で、Ｋａｂａｔ位置９５〜１０２の残基は、式Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１３Ｘ１４（配列番号１６）を有し、式中：
− Ｘ１はアルギニン若しくはリシン又は任意選択でその保存的置換を表し、
− Ｘ２は任意のアミノ酸、任意選択でアルギニン、任意選択でリシン若しくはアラニン、又は任意選択でその保存的置換を表し、
− Ｘ３は任意のアミノ酸残基、任意選択で芳香環を含む残基、任意選択でチロシンを表し、
− Ｘ４は任意のアミノ酸、任意選択でグルタミン酸若しくはチロシン、又は任意選択でその保存的置換、又はプロリン若しくはグリシン以外のアミノ酸残基を表し、
− Ｘ５はグリシン、任意選択でアルギニン、又は任意選択でその保存的置換を表し、
− Ｘ６は任意のアミノ酸、任意選択でアスパラギン、セリン若しくはチロシン、又は任意選択でその保存的置換を表し、
− Ｘ７は任意のアミノ酸、任意選択でチロシン、アスパラギン若しくはアスパラギン酸、又は任意選択でその保存的置換、任意選択でプロリン若しくはグリシン以外のアミノ酸残基を表し、
− Ｘ８はバリン又は任意選択でアラニン、イソロイシン若しくはロイシン、任意選択で芳香族アミノ酸、任意選択でチロシンを表し、
− Ｘ９は任意のアミノ酸、任意選択で芳香族アミノ酸、任意選択でフェニルアラニン、任意選択でチロシン、任意選択でバリン又はその保存的置換を表し、
− Ｘ１０はチロシン、任意選択でフェニルアラニン、任意選択でメチオニン、又は任意選択でその保存的置換を表し、
− Ｘ１１は存在しないか又は任意のアミノ酸、任意選択でチロシン、任意選択でフェニルアラニン、又は任意選択でその保存的置換、任意選択でＰ、Ｇ、Ｅ若しくはＤ以外、若しくは小さな疎水性残基（例えば、Ｔ、Ｓ）以外のアミノ酸残基を表し、
− Ｘ１２は存在しないか又は任意のアミノ酸、任意選択でフェニルアラニン、若しくは任意選択でその保存的置換を表し、
− Ｘ１３は任意のアミノ酸、任意選択でアスパラギン酸、又は任意選択でその保存的置換、任意選択でセリン、任意選択でスレオニン、任意選択でグルタミン酸、任意選択でアスパラギン、任意選択で大きな疎水性残基以外の残基を表し、及び
− Ｘ１４は任意のアミノ酸、任意選択でチロシン又は任意選択でその保存的置換、任意選択で芳香族アミノ酸、任意選択で非芳香族アミノ酸を表す。
一実施形態において、Ｋａｂａｔ位置９５−１００ｆが存在し、アミノ酸配列ＲＲＹＥＧＮＹＶＦＹＹＦ（配列番号４８）を有する。一実施形態において、Ｋａｂａｔ位置９５〜１００ｄが存在し、アミノ酸配列ＫＡＹＹＧＳＮＹＹＦ（配列番号４９）又はＲＡＹＹＲＹＤＹＶＭ（配列番号５０）を有し、任意選択で１，２，３，４又は５個のアミノ酸置換を含む。一実施形態において、Ｋａｂａｔ位置１０１の残基はアスパラギン酸（Ｄ）である。別の実施形態では、Ｋａｂａｔ位置９５〜１０２は、アミノ酸配列ＲＲＹＥＧＮＹＶＦＹＹＦＤＹ（配列番号４８）、ＫＡＹＹＧＳＮＹＹＦＤＹ（配列番号４９）及び／又はＲＡＹＹＲＹＤＹＶＭＤＹ（配列番号５０）のアミノ酸配列と（例えば、１つ以上のアミノ酸残基が）異なるアミノ酸配列を有する。
例示的なＶＨは、以下を含み得る：
（ａ）ＣＤ３９のＮ末端ドメインに接触することができるＣＤＲ１（例えば、Ｋａｂａｔによる）であって、任意選択で、Ｋａｂａｔ位置３１，３２及び３３の残基が式Ｘ１Ｘ２Ｘ３を有し、Ｘ１は任意のアミノ酸、任意選択でヒスチジン若しくはアスパラギン、又は任意選択でその保存的置換を表し、Ｘ２は任意のアミノ酸、任意選択で芳香族残基、任意選択でチロシン、又は任意選択でその保存的置換、又は任意選択でプロリン又はグリシン以外のアミノ酸を表し、Ｘ３はグリシンを表す、ＣＤＲ１；
（ｂ）ＣＤ３９のＣ末端ドメインに接触することができるＣＤＲ２（例えば、Ｋａｂａｔによる）であって、任意選択でＫａｂａｔ位置５０〜５６の残基は、式Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８（配列番号１３）を有し、Ｘ１はトリプトファンを表し、Ｘ２は任意のアミノ酸、任意選択でイソロイシンを表し、Ｘ３はアスパラギン又は任意選択でグルタミンを表し、Ｘ４はスレオニンを表し、Ｘ５は任意のアミノ酸、任意選択でチロシン、又は任意選択でフェニルアラニンを表し、Ｘ６は任意のアミノ酸、任意選択でスレオニン、任意選択でセリン、任意選択でアスパラギン、アラニン又はグリシン、任意選択で大きな残基又は疎水性残基以外の残基を表し、Ｘ７は任意のアミノ酸、任意選択でグリシン、任意選択でアラニン、セリン、スレオニン、アスパラギン又はグルタミン、任意選択でアスパラギン酸又はグルタミン酸以外の残基、任意選択でリシン又はアルギニン以外の残基を表し、Ｘ８はグルタミン酸、任意選択でアスパラギン酸を表す、ＣＤＲ２；
（ｃ）任意選択で、Ｋａｂａｔ位置６６〜７１に式Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６（配列番号４７）を有する残基を含むＦＲ３であって、Ｘ１は任意のアミノ酸、任意選択でアルギニンを表し、Ｘ２はフェニルアラニン又はβ−ストランドの位置及びＶＨドメイン構造の完全性を維持することができる別の疎水性残基を表し、Ｘ３はアラニン又はバリン、任意選択でロイシン、任意選択で疎水性残基を表し、Ｘ４はフェニルアラニン又はβ−ストランドの位置及びＶＨドメイン構造の完全性を維持することができる別の疎水性残基を表し、及びＸ５はセリンを表し、任意選択で、さらにＸ６は任意のアミノ酸、任意選択でロイシン、任意選択でアラニン、バリン又はスレオニンを表す、ＦＲ３；並びに
（ｄ）ＣＤ３９のＮ末端と接触することができ、任意選択でＣＤ３９及びＶＬのＮ末端ドメインと接触することができる、ＣＤＲ３（例えば、Ｋａｂａｔによる）であって、任意選択で、ＣＤＲ３は、ＣＤ３９のＮ末端ドメイン中のアミノ酸残基に結合することができる芳香族残基（例えば、チロシン、フェニルアラニン）及びＶＬ中のアミノ酸残基と接触することができる第２芳香族アミノ酸残基（例えば、チロシン、フェニルアラニン）を含み、任意選択で、Ｋａｂａｔ位置９５〜１０２の残基は、式Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１３Ｘ１４（配列番号１６）を有し、
− Ｘ１はアルギニン若しくはリシン又は任意選択でその保存的置換を表し、
− Ｘ２は任意のアミノ酸、任意選択でアルギニン、任意選択でリシン若しくはアラニン、又は任意選択でその保存的置換を表し、
− Ｘ３は任意のアミノ酸残基、任意選択で芳香環を含む残基、任意選択でチロシンを表し、
− Ｘ４は任意のアミノ酸、任意選択でグルタミン酸若しくはチロシン、又は任意選択でその保存的置換、又はプロリン若しくはグリシン以外のアミノ酸残基を表し、
− Ｘ５はグリシン、任意選択でアルギニン、又は任意選択でその保存的置換を表し、
− Ｘ６は任意のアミノ酸、任意選択でアスパラギン、セリン若しくはチロシン、又は任意選択でその保存的置換を表し、
− Ｘ７は任意のアミノ酸、任意選択でチロシン、アスパラギン若しくはアスパラギン酸、又は任意選択でその保存的置換、任意選択でプロリン若しくはグリシン以外のアミノ酸残基を表し、
− Ｘ８はバリン又は任意選択でアラニン、イソロイシン若しくはロイシン、任意選択で芳香族アミノ酸、任意選択でチロシンを表し、
− Ｘ９は任意のアミノ酸、任意選択で芳香族アミノ酸、任意選択でフェニルアラニン、任意選択でチロシン、任意選択でバリン又はその保存的置換を表し、
− Ｘ１０はチロシン、任意選択でフェニルアラニン、任意選択でメチオニン、又は任意選択でその保存的置換を表し、
− Ｘ１１は存在しないか又は任意のアミノ酸、任意選択でチロシン、任意選択でフェニルアラニン、又は任意選択でその保存的置換、任意選択でＰ、Ｇ、Ｅ若しくはＤ以外、若しくは小さな疎水性残基（例えば、Ｔ、Ｓ）以外のアミノ酸残基を表し、
− Ｘ１２は存在しないか又は任意のアミノ酸、任意選択でフェニルアラニン、若しくは任意選択でその保存的置換を表し、
− Ｘ１３は任意のアミノ酸、任意選択でアスパラギン酸、又は任意選択でその保存的置換、任意選択でセリン、任意選択でスレオニン、任意選択でグルタミン酸、任意選択でアスパラギン、任意選択で大きな疎水性残基以外の残基を表し、及び
− Ｘ１４は任意のアミノ酸、任意選択でチロシン又は任意選択でその保存的置換、任意選択で芳香族アミノ酸、任意選択で非芳香族アミノ酸を表す、
ＣＤＲ３。任意選択で、Ｋａｂａｔ位置３０（ＦＲ１）の残基はスレオニンである。
別の例示的なＶＨは、以下を含み得る：
（ａ）ＣＤ３９のＮ末端ドメインに接触することができるＣＤＲ１（例えば、Ｋａｂａｔによる）であって、任意選択で、Ｋａｂａｔ位置３１，３２及び３３の残基が式Ｘ１Ｘ２Ｘ３を有し、Ｘ１は任意のアミノ酸、任意選択でヒスチジン又は任意選択でその保存的置換を表し、Ｘ２は任意のアミノ酸、任意選択で芳香族残基、任意選択でチロシン、又は任意選択でその保存的置換、又は任意選択でプロリン又はグリシン以外のアミノ酸残基を表し、Ｘ３はグリシンを表す、ＣＤＲ１；
（ｂ）ＣＤ３９のＣ末端ドメインに接触することができるＣＤＲ２（例えば、Ｋａｂａｔによる）であって、任意選択でＫａｂａｔ位置５０〜５６の残基は、式Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８（配列番号１３）を有し、Ｘ１はトリプトファンを表し、Ｘ２は任意のアミノ酸、任意選択でイソロイシンを表し、Ｘ３はアスパラギン又は任意選択でグルタミンを表し、Ｘ４はスレオニンを表し、Ｘ５は任意のアミノ酸、任意選択でチロシン、又は任意選択でフェニルアラニンを表し、Ｘ６は任意のアミノ酸、任意選択でスレオニン、任意選択でセリン、任意選択でアスパラギン、アラニン又はグリシン、任意選択で大きな残基又は疎水性残基以外の残基を表し、Ｘ７は任意のアミノ酸、任意選択でグリシン、任意選択でアラニン、セリン、スレオニン、アスパラギン又はグルタミン、任意選択でアスパラギン酸又はグルタミン酸以外の残基、任意選択でリシン又はアルギニン以外の残基を表し、Ｘ８はグルタミン酸、任意選択でアスパラギン酸を表す、ＣＤＲ２；
（ｃ）任意選択で、Ｋａｂａｔ位置６６〜７１に式Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６（配列番号４７）を有する残基を含むＦＲ３であって、Ｘ１は任意のアミノ酸を表し、Ｘ２はフェニルアラニン又はβ−ストランドの位置及びＶＨドメイン構造の完全性を維持することができる別の疎水性残基を表し、Ｘ３はアラニン又はバリン、任意選択でロイシン、任意選択で疎水性残基を表し、Ｘ４はフェニルアラニン又はβ−ストランドの位置及びＶＨドメイン構造の完全性を維持することができる別の疎水性残基を表し、及びＸ５はセリンを表し、任意選択で、さらにＸ６は任意のアミノ酸、任意選択でロイシン、任意選択でアラニン、バリン又はスレオニンを表す、ＦＲ３；並びに
（ｄ）ＣＤ３９のＮ末端と接触することができ、任意選択でＣＤ３９及びＶＬのＮ末端ドメインと接触することができる、ＣＤＲ３（例えば、Ｋａｂａｔによる）であって、任意選択で、ＣＤＲ３は、ＣＤ３９のＮ末端ドメイン中のアミノ酸残基に結合することができる芳香族残基（例えば、チロシン、フェニルアラニン）及びＶＬ中のアミノ酸残基と接触することができる第２芳香族アミノ酸残基（例えば、チロシン、フェニルアラニン）を含み、任意選択で、Ｋａｂａｔ位置９５〜１０２の残基は、式Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１３Ｘ１４（配列番号１６）を有し、
− Ｘ１はアルギニン若しくはリシン又は任意選択でその保存的置換を表し、
− Ｘ２は任意のアミノ酸、任意選択でアルギニン、任意選択でリシン、又は任意選択でその保存的置換を表し、
− Ｘ３は任意のアミノ酸残基、任意選択で芳香環を含む残基、任意選択でチロシンを表し、
− Ｘ４は任意のアミノ酸、任意選択でグルタミン酸、又は任意選択でその保存的置換、又はプロリン若しくはグリシン以外のアミノ酸残基を表し、
− Ｘ５はグリシン又は任意選択でその保存的置換を表し、
− Ｘ６は任意のアミノ酸、任意選択でアスパラギン、又は任意選択でその保存的置換を表し、
− Ｘ７は任意のアミノ酸、任意選択でチロシン、アスパラギン若しくはアスパラギン酸、又は任意選択でその保存的置換、任意選択でプロリン若しくはグリシン以外のアミノ酸残基を表し、
− Ｘ８はバリン又は任意選択でアラニン、イソロイシン若しくはロイシンを表し、
− Ｘ９は任意のアミノ酸、任意選択で芳香族アミノ酸、任意選択でフェニルアラニン、任意選択でチロシンを表し、
− Ｘ１０はチロシン、任意選択でフェニルアラニンを表し、
− Ｘ１１すなわち任意のアミノ酸、任意選択でチロシン、任意選択でフェニルアラニン、又は任意選択でその保存的置換、任意選択でＰ、Ｇ、Ｅ若しくはＤ以外、若しくは小さな疎水性残基（例えば、Ｔ、Ｓ）以外のアミノ酸残基を表し、
− Ｘ１２すなわち任意のアミノ酸、任意選択でアスパラギン、又は任意選択でその保存的置換を表し、
− Ｘ１３は任意のアミノ酸、任意選択でアスパラギン酸、又は任意選択でその保存的置換、任意選択でセリン、任意選択でスレオニン、任意選択でグルタミン酸、任意選択でアスパラギン、任意選択で大きな疎水性残基以外の残基を表し、及び
Ｘ１４は任意のアミノ酸、任意選択でチロシン又は任意選択でその保存的置換、任意選択で芳香族アミノ酸、任意選択で非芳香族アミノ酸を表す。
例示的なＶＬは、以下を含み得る：
− ＶＨのＣＤＲ３と接触することができるＫａｂａｔ位置３１，３２，３３及び／又は３４に残基を含むＣＤＲ１；
− Ｋａｂａｔ位置４９に芳香族残基、任意選択でチロシンを含むＦＲ２；及び
− ＶＨのＣＤＲ３と接触することができるＫａｂａｔ位置８９及び／又は９１に残基を含むＣＤＲ３。
軽鎖ＣＤＲ１
一実施形態においてＶＬは、Ｋａｂａｔ位置３１〜３４の残基が式Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４を有し、Ｘ１はセリン若しくはスレオニン又はその保存的置換を表し、Ｘ２はチロシン、アラニン若しくはアスパラギン又はその保存的置換を表し、Ｘ３はフェニルアラニン又はバリンを表し、Ｘ４はセリン若しくはアラニン又はその保存的置換を表す、ＣＤＲ１を含む。
一実施形態においてＶＬは、Ｋａｂａｔ位置３１〜３４の残基が式Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４を有し、Ｘ１はスレオニン又はその保存的置換を表し、Ｘ２はアラニン若しくはアスパラギン又はその保存的置換を表し、Ｘ３はバリン又はその保存的置換を表し、Ｘ４はアラニン又はその保存的置換を表す、ＣＤＲ１を含む。
一実施形態において、ＶＬはＫａｂａｔ位置３１〜３４の残基が式ＳＹＸ１Ｘ２を有し、Ｓはセリンであり、Ｙはチロシンであり、Ｘ１は疎水性残基（例えばフェニルアラニン、イソロイシン、バリン）を表し、Ｘ２は任意のアミノ酸、任意選択でヒスチジン、セリン若しくはアラニン又はその保存的置換を含む。
Ｋａｂａｔ位置３１，３２，３３及び３４の残基が（ａ）式ＴＸ１ＶＡ（式中、Ｔはスレオニンであり、Ｖはバリンであり、Ａはアラニンであり、及びＸ１はアラニン若しくはアスパラギン又はその保存的置換を表す）を有するＣＤＲ１。
一実施形態において、ＶＬは、Ｋａｂａｔ位置２４〜３４の残基が式Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１（配列番号１７）を有するＣＤＲ１を含み、
Ｘ１は任意のアミノ酸、任意選択でアルギニン若しくはリシン、又はその保存的置換を表し、
Ｘ２は任意のアミノ酸、任意選択でアラニン、又はその保存的置換を表し、
Ｘ３は任意のアミノ酸、任意選択でセリン、又はその保存的置換を表し、
Ｘ４は任意のアミノ酸、任意選択でグルタミン酸若しくはヒスチジン、又はその保存的置換を表し、
Ｘ５は任意のアミノ酸、任意選択でアスパラギン若しくはアスパラギン酸、又はその保存的置換を表し、
Ｘ６は任意のアミノ酸、任意選択でイソロイシン若しくはバリン、又はその保存的置換を表し、
Ｘ７は任意のアミノ酸、任意選択でチロシン若しくはグリシン、又はその保存的置換を表し、
Ｘ８はセリン若しくはスレオニン又はその保存的置換を表し、
Ｘ９はチロシン、アラニン若しくはアスパラギン又はその保存的置換を表し、
Ｘ１０はフェニルアラニン若しくはバリン又はその保存的置換を表し、
Ｘ１１はセリン若しくはアラニン又はその保存的置換を表す。
任意選択で、Ｋａｂａｔ位置２４〜３０の残基は、ＶＬのヒトアクセプター配列中の対応する残基と少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％同一、又は１００％同一である。一実施形態において、Ｋａｂａｔ位置２４〜３０は、アミノ酸配列ＲＡＳＥＮＩＹ（配列番号５１）、ＫＡＳＱＤＶＳ（配列番号５２）又はＫＡＳＨＮＶＧ（配列番号５３）を有する。一実施形態において、Ｋａｂａｔ位置３１〜３４は、アミノ酸配列ＳＹＦＳ、ＴＡＶＡ又はＴＮＶＡを有する。一実施形態において、Ｋａｂａｔ位置２４〜３４は、アミノ酸配列ＲＡＳＥＮＩＹＳＹＦＳ（配列番号３５）、ＫＡＳＱＤＶＳＴＡＶＡ（配列番号３０）又はＫＡＳＨＮＶＧＴＮＶＡ（配列番号４０）を有し、任意選択で１，２又は３個のアミノ酸置換を含む。別の実施形態では、Ｋａｂａｔ位置２４〜３４は、アミノ酸配列ＲＡＳＥＮＩＹＳＹＦＳ（配列番号３５）、ＫＡＳＱＤＶＳＴＡＶＡ（配列番号３０）及び／又はＫＡＳＨＮＶＧＴＮＶＡ（配列番号４０）のアミノ酸配列と（例えば、１つ以上のアミノ酸残基が）異なるアミノ酸配列を有する。
軽鎖ＣＤＲ２
一実施形態において、ＶＬは、ＫａｂａｔＦＲ残基を含むＣＤＲ２を含む。一実施形態において、Ｋａｂａｔ位置４９の残基は、芳香族アミノ酸、任意選択でチロシンである。一実施形態において、Ｋａｂａｔ位置５０の残基は、セリン若しくはスレオニン又はその保存的置換である。
一実施形態において、ＶＬは、Ｋａｂａｔ位置４９〜５６の残基が式Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８（配列番号５４）を有するＣＤＲ２を含み、
Ｘ１は芳香族アミノ酸残基、任意選択でチロシンを表し、
Ｘ２はスレオニン若しくはセリン又はその保存的置換を表し、
Ｘ３は任意のアミノ酸、任意選択でアラニン、又はその保存的置換を表し、
Ｘ４は任意のアミノ酸、任意選択でリシン若しくはセリン、又はその保存的置換を表し、
Ｘ５は任意のアミノ酸、任意選択でスレオニン若しくはチロシン、又はその保存的置換を表し、
Ｘ６は任意のアミノ酸、任意選択でロイシン若しくはアルギニン、又はその保存的置換を表し、
Ｘ７は任意のアミノ酸、任意選択でアラニン又はチロシン、又はその保存的置換を表し、及び
Ｘ８は任意のアミノ酸、任意選択でグルタミン酸、スレオニン又はその保存的置換を表す。
一実施形態において、ＶＬは、Ｋａｂａｔ位置５０〜５６の残基が式Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７（配列番号１９）を有するＣＤＲ２を含み、
Ｘ１はセリン又はその保存的置換を表し、
Ｘ２はアラニン又はその保存的置換を表し、
Ｘ３はセリン又はその保存的置換を表し、
Ｘ４はチロシン又はその保存的置換を表し、
Ｘ５はアルギニン又はその保存的置換を表し、
Ｘ６はチロシン又はその保存的置換を表し、及び
Ｘ７はスレオニン又はその保存的置換を表す。任意選択で、ＶＬはさらに芳香族残基、例えばチロシンを、Ｋａｂａｔ残基４９に含む。
任意選択で、Ｋａｂａｔ位置５１〜５６の残基は、ＶＬのヒトアクセプター配列中の対応する残基と少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％同一、又は１００％同一である。一実施形態において、Ｋａｂａｔ位置４９〜５１は、アミノ酸配列ＹＴＡ又はＹＳＡを有する。一実施形態において、Ｋａｂａｔ位置４９〜５６は、アミノ酸配列ＹＴＡＫＴＬＡＥ（配列番号５５）、ＹＳＡＳＹＲＹＴ（配列番号５６）又はＹＳＡＳＹＲＹＳ（配列番号５７）を有する。別の実施形態において、Ｋａｂａｔ位置５０〜５６は、アミノ酸配列ＴＡＫＴＬＡＥ（配列番号３６）、ＹＳＡＳＹＲＹＴ（配列番号３１）及び／又はＹＳＡＳＹＲＹＳ（配列番号４１）のアミノ酸配列と（例えば、１つ以上のアミノ酸残基が）異なるアミノ酸配列を有する。
軽鎖ＣＤＲ３
一実施形態において、ＶＬはＣＤＲ３を含み、Ｋａｂａｔ位置８９〜９１の残基が式Ｘ１Ｘ２Ｘ３を有し、Ｘ１は任意のアミノ酸、任意選択でグルタミン若しくはヒスチジン又はその保存的置換を表し、Ｘ２は任意のアミノ酸、任意選択でグルタミン若しくはヒスチジン、又はその保存的置換を表し、及びＸ３はチロシン若しくはヒスチジン又はその保存的置換を表す。
一実施形態において、ＶＬはＣＤＲ３を含み、Ｋａｂａｔ位置８９の残基がグルタミン若しくはヒスチジン又はその保存的置換であり、位置９１の残基がチロシン若しくはヒスチジン又はその保存的置換であり、位置９５の残基がプロリン又はその保存的置換であり、及び位置９６の残基がチロシン又はその保存的置換である。
一実施形態において、ＶＬは、Ｋａｂａｔ位置８９〜９７の残基が式Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０（配列番号２０）を有するＣＤＲ３を含み、
Ｘ１はグルタミン若しくはヒスチジン又はその保存的置換を表し、
Ｘ２は任意のアミノ酸、任意選択でグルタミン若しくはヒスチジン、又はその保存的置換を表し、
Ｘ３はチロシン若しくはヒスチジン又はその保存的置換を表し、
Ｘ４は任意のアミノ酸、任意選択でチロシン若しくはアスパラギン、又はその保存的置換を表し、
Ｘ５は任意のアミノ酸、任意選択でバリン若しくはアスパラギン、又はその保存的置換を表し、
Ｘ６は任意のアミノ酸、任意選択でスレオニン若しくはチロシン、又はその保存的置換を表し、
Ｘ７は任意のアミノ酸、任意選択でプロリン、又はその保存的置換を表し、
Ｘ８は存在しないか又は任意の１つ若しくは複数のアミノ酸、任意選択でプロリン、若しくはその保存的置換を表し、
Ｘ９は任意のアミノ酸、任意選択でチロシン、又はその保存的置換を表し、及び
Ｘ１０は任意のアミノ酸、任意選択でスレオニン、又はその保存的置換を表す。
一実施形態において、ＶＬは、Ｋａｂａｔ位置８９−９７の残基が式ＱＸ１ＨＸ２Ｘ３ＴＰＹＴ（配列番号５８）を有するＣＤＲ３を含み、
Ｘ１は任意のアミノ酸、任意選択でグルタミン若しくはヒスチジン、又はその保存的置換を表し、
Ｘ２は任意のアミノ酸を表し、及び
Ｘ３は任意のアミノ酸を表す。
一実施形態において、Ｋａｂａｔ位置８９〜９７は、アミノ酸配列ＱＨＨＹＶＴＰＹＴ（配列番号３７）、ＱＱＨＹＴＴＰＰＹＴ（配列番号３２）又はＨＱＹＮＮＹＰＹＴ（配列番号４２）を有する。別の実施形態では、Ｋａｂａｔ位置８９〜９７は、アミノ酸配列ＱＨＨＹＶＴＰＹＴ（配列番号３７）、ＱＱＨＹＴＴＰＰＹＴ（配列番号３２）及び／又はＨＱＹＮＮＹＰＹＴ（配列番号４２）のアミノ酸配列と（例えば１つ以上のアミノ酸残基が）異なるアミノ酸配列を有する。
一実施形態において、ＶＬは、以下を含む：
− Ｋａｂａｔ位置３１、３２、３３及び３４の残基が式Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４を有し、Ｘ１はスレオニン又はその保存的置換を表し、Ｘ２はアラニン若しくはアスパラギン又はその保存的置換を表し、Ｘ３はバリン又はその保存的置換を表し、Ｘ４はアラニン又はその保存的置換を表す、ＣＤＲ１；
− Ｋａｂａｔ位置４９に芳香族残基、任意選択でチロシンを含むＦＲ２；
− Ｋａｂａｔ位置５０の残基がセリン若しくはスレオニン又はその保存的置換であるＣＤＲ２；及び
− Ｋａｂａｔ位置８９の残基がグルタミン若しくはヒスチジン又はその保存的置換であり、位置９１の残基がチロシン若しくはヒスチジン又はその保存的置換であり、任意選択で位置９５の残基がプロリン又はその保存的置換であり、任意選択で位置９６の残基がチロシン又はその保存的置換であるＣＤＲ３。
抗体のフラグメント及び誘導体（特に記載されないか、又は文面と明らかに矛盾しない限り、本出願で用いられる「抗体」又は「（複数の）抗体」という用語により包含される）は、当分野において公知の技術により生成することができる。「フラグメント」は、インタクトな抗体の一部、一般に抗原結合部位又は可変領域を含む。抗体フラグメントの例として、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖフラグメント；ダイアボディ；連続したアミノ酸残基の非分断配列から構成される一次構造を有するポリペプチド（本明細書では、「一本鎖抗体フラグメント」又は「一本鎖ポリペプチド」と呼ぶ）であるあらゆる抗体フラグメントが挙げられ、限定しないが、以下のものを含む：（１）一本鎖Ｆｖ分子、（２）関連重鎖部分を含まず、１つの軽鎖可変ドメインのみ含有する一本鎖ポリペプチド、又は軽鎖可変ドメインの３つのＣＤＲを含有するその断片、並びに（３）関連軽鎖部分を含まず、１つの重鎖可変領域のみ含有する一本鎖ポリペプチド、又は重鎖可変領域の３つのＣＤＲを含有するその断片；並びに抗体フラグメントから形成される多重特異的（例えば、二重特異的）抗体。中でも、ナノボディ、ドメイン抗体、シングルドメイン抗体又は「ｄＡｂ」が含まれる。
特定の実施形態において、抗体を産生するハイブリドーマのＤＮＡは、発現ベクターに挿入する前に、例えば、相同性非ヒト配列をヒト重鎖及び軽鎖定常ドメインのコード配列で置換する（例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ｐｐ．６８５１（１９８４））ことにより、又は免疫グロブリンコード配列に、非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の全部又は一部を共有結合させることにより、修飾することができる。この方法で、元の抗体の結合特異性を有する「キメラ」又は「ハイブリッド」抗体が調製される。典型的に、このような非免疫グロブリンポリペプチドで、抗体の定常ドメインを置換する。
任意選択的に、抗体をヒト化する。抗体の「ヒト化」形態は、マウス免疫グロブリン由来の最小配列を含有する特定のキメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖若しくはそれらの断片（例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、又は抗体の他の抗原結合サブ配列）である。ほとんどの場合、ヒト化抗体は、レシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）からの残基が、元の抗体の要望される特異性、親和性、及び能力を維持しながら、元の抗体（ドナー抗体）のＣＤＲからの残基により置換されたヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。
あるケースでは、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基を、対応する非ヒト残基により置換してもよい。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体又は移入ＣＤＲ若しくはフレームワーク配列のいずれかに存在しない残基を含んでもよい。これらの修飾は、抗体性能をさらに改善及び最適化するために実施する。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全部を含み、これらのドメインにおいて、ＣＤＲ領域の全部又は実質的に全部は、元の抗体のものと一致し、ＦＲ領域の全部又は実質的に全部は、ヒト免疫グロブリン共通配列のものである。ヒト化抗体はまた、任意選択で、免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部（Ｆｃ）、典型的には、ヒト免疫グロブリンの少なくとも一部も含み得る。さらに詳細については、以下を参照されたい：Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２１，ｐｐ．５２２（１９８６）；Ｒｅｉｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ，３３２，ｐｐ．３２３（１９８８）；Ｐｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，２，ｐｐ．５９３（１９９２）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ ｅｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９，ｐｐ．１５３４；米国特許第４，８１６，５６７号明細書（これらの全開示内容は、参照として本明細書に組み込む）。抗体をヒト化する方法は、当分野では公知である。
ヒト化抗体を作製するのに用いるヒト可変ドメイン（軽鎖及び重鎖の両方）の選択は、抗原性を低減する上で非常に重要である。いわゆる「最良適合」法によれば、抗体の可変ドメインの配列を公知のヒト可変ドメイン配列の全ライブラリーに対してスクリーニングする。マウスの配列に最も近いヒト配列がヒトフレームワーク（ＦＲ）として容認されている（Ｓｉｍｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１，ｐｐ．２２９６（１９９３）；Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．１９６，１９８７，ｐｐ．９０１）。別の方法では、特定の亜群の軽鎖又は重鎖の全ヒト抗体の共通配列由来の特定のフレームワークを用いる。複数の異なるヒト化抗体のために同じフレームワークを用いることができる（Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ８９，ｐｐ．４２８５（１９９２）；Ｐｒｅｓｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５１，Ｐ．２６２３（１９９３））。
さらに、抗体は、ＣＤ３９に対する高い親和性及び他の生物学的特性を保持してヒト化することが重要である。この目標を達成するために、一方法によれば、親配列及びヒト化配列の３次元モデルを用いて、親配列と様々な概念上のヒト化産物の分析方法により、ヒト化抗体を調製する。３次元免疫グロブリンモデルは市販されており、当業者には周知である。選択した候補免疫グロブリン配列の予想される３次元構造を描き、ディスプレイするコンピュータプログラムが入手可能である。これらのディスプレイを詳しく調べることにより、候補免疫グロブリンの機能における残基の推定役割の分析が可能になる。このように、要望される抗体特性が達成されるように、共通及び移入配列からＦＲ残基を選択し、組み合わせることができる。
「ヒト化された」モノクローナル抗体を作製する別の方法は、免疫に用いられるマウスとしてＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（Ａｂｇｅｎｉｘ，Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ）を使用するものである。ＸｅｎｏＭｏｕｓｅは、マウス宿主であり、その免疫グロブリン遺伝子は、機能性免疫ヒトグロブリン遺伝子で置換されている。従って、このマウスにより、又はこのマウスのＢ細胞由来のハイブリドーマ中に産生される抗体は、既にヒト化された抗体である。ＸｅｎｏＭｏｕｓｅは、米国特許第６，１６２，９６３号明細書（これは、その全体を参照として本明細書に組み込む）に記載されている。
ヒト抗体は、様々な他の技術に従って、例えば、免疫のためには、ヒト抗体レパトアを発現するように改変された他のトランスジェニック動物（Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３６２（１９９３）２５５）、ファージディスプレイ方法を用いた抗体レパトアの選択により、生成することもできる。こうした技術は、当業者には公知であり、本出願で開示したモノクローナル抗体から出発して実施する。
抗体製剤
抗ＣＤ３９抗体は、１ｍｇ／ｍｌ〜５００ｍｇ／ｍｌの濃度を含む医薬製剤に組み込むことができ、前記製剤は２．０〜１０．０のｐＨを有する。製剤はさらに、バッファー系、保存剤、等張剤、キレート剤、安定剤及び界面活性剤を含んでもよい。一実施形態において、医薬製剤は水性製剤、すなわち水を含む製剤である。そのような製剤は、典型的には、溶液又は懸濁液である。さらなる実施形態において、医薬製剤は水溶液である。「水性製剤」という用語は、少なくとも５０％ｗ／ｗの水を含む製剤として定義される。同様に、「水溶液」という用語は、少なくとも５０％ｗ／ｗの水を含む溶液として定義され、用語「水性懸濁液」は、少なくとも５０％ｗ／ｗの水を含む懸濁液として定義される。
別の実施形態において、医薬製剤は、使用前に医師又は患者が溶媒及び／又は希釈剤を添加する凍結乾燥製剤である。
別の実施形態では、医薬製剤は、事前に溶解することなく使用できる乾燥製剤（例えば、凍結乾燥又は噴霧乾燥）である。
さらなる態様では、医薬製剤は、このような抗体の水溶液と、バッファーとを含み、抗体は１ｍｇ／ｍｌ以上の濃度で存在し、前記製剤は、約２．０〜約１０．０のｐＨを有する。
別の実施形態では、製剤のｐＨは、約２．０〜約１０．０、約３．０〜約９．０、約４．０〜約８．５、約５．０〜約８．０、及び約５．５〜約７．５からなるリストから選択される範囲にある。
さらなる実施形態において、バッファーは、酢酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、クエン酸、グリシルグリシン、ヒスチジン、グリシン、リシン、アルギニン、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸ナトリウム、及びトリス（ヒドロキシメチル）−アミノメタン、ビシン、トリシン、リンゴ酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、アスパラギン酸又はそれらの混合物からなる群から選択される。これらの特定のバッファーは、それぞれ代替的な実施形態を構成する。
さらなる実施形態において、製剤は、薬学的に許容される防腐剤をさらに含む。さらなる実施形態において、製剤はさらに等張剤を含む。さらなる実施形態において、製剤はキレート剤も含む。さらなる実施形態において、製剤はさらに安定剤を含む。さらなる実施形態において、製剤はさらに界面活性剤を含む。便宜上、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，１９ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９５が参照される。
他の成分がペプチド医薬製剤中に存在し得る可能性がある。このような追加成分は、湿潤剤、乳化剤、酸化防止剤、増量剤、張性調整剤、キレート剤、金属イオン、油性ビヒクル、タンパク質（例えば、ヒト血清アルブミン、ゼラチン又はタンパク質）及び両性イオン（例えば、ベタイン、タウリン、アルギニン、グリシン、リシン及びヒスチジンなどのアミノ酸）を含み得る。もちろん、このような追加の成分は、医薬製剤の全体的な安定性に悪影響を与えるべきではない。
抗体を含有する医薬組成物は、このような治療を必要とする患者に、いくつかの部位、例えば局所部位、例えば皮膚及び粘膜部位、吸収をバイパスする部位、例えば、動脈内、静脈内、心臓内、及び吸収に関連する部位、例えば皮膚、皮膚下、筋肉内又は腹内における投与において投与され得る。医薬組成物の投与は、いくつかの投与経路、例えば、皮下、筋肉内、腹腔内、静脈内、舌、舌下、頬、口内、経口、胃及び腸内、鼻、肺（例えば、細気管支及び肺胞又はその組合せを通じて）、表皮、真皮、経皮、経膣、直腸、眼（例えば、結膜を通じて）、尿管及び非経口を介して、このような治療を必要とする患者へ行うことができる。
好適な抗体製剤はまた、既に開発された他の治療用モノクローナル抗体での経験を調べることによって決定することもできる。リツキサン（リツキシマブ）、ハーセプチン（トラスツズマブ）、ゾレア（オマリズマブ）、ベキサール（トシツモマブ）、キャンパス（アレムツズマブ）、ゼバリン、オンコリムなどの、いくつかのモノクローナル抗体が臨床状況において効率的であることが示されており、抗体と共に類似の製剤を用いてもよい。例えば、モノクローナル抗体は、９．０ｍｇ／ｍＬの塩化ナトリウム、７．３５ｍｇ／ｍＬクエン酸ナトリウム二水和物、０．７ｍｇ／ｍＬポリソルベート８０、及び注射用滅菌水中でＩＶ投与用に処方された１００ｍｇ（１０ｍＬ）又は５００ｍｇ（５０ｍＬ）の単回使用バイアル中、１０ｍｇ／ｍＬの濃度で供給され得る。ｐＨは６．５に調整される。別の実施形態では、抗体は、約２０ｍＭのＮａ−クエン酸、約１５０ｍＭのＮａＣｌを含むｐＨ約６．０の製剤中に供給される。
疾患の診断及び治療
本明細書に記載の抗ＣＤ３９抗体を用いて個体、特にヒト患者を治療する方法もまた提供される。一実施形態において、本開示は、ヒト患者に投与するための医薬組成物の調製における、本明細書に記載の抗体の使用を提供する。典型的には、患者は、癌又は感染症（例えば、ウイルス感染、細菌感染）に罹患しているか、又はその恐れがある。
例えば、一態様では、中和抗ＣＤ３９抗体を前記患者に投与するステップを含む、それを必要とする患者におけるリンパ球の活性を回復又は増強する方法が提供される。抗体は、例えば、ＣＤ３９−Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３及び／又はＬ４に結合することなく「血管」ＣＤ３９に特異的に結合するヒト又はヒト化抗ＣＤ３９抗体であってもよく、この抗体はヒトＣＤ３９のＡＴＰａｓｅ活性を低下又は抑制し、ヒトＣＤ１６によって実質的に結合されていない（そして任意選択でさらにＣＤ３２ａ、ＣＤ３２ｂ又はＣＤ６４などの他のヒトＦｃγ受容体に結合されていない）。このような抗体は、血管ＣＤ３９以外のアイソフォームでの結合の欠如による望ましくない副作用又は毒性の減少を有し、枯渇から生じる望ましくない副作用若しくは毒性、又は脈管構造におけるＣＤ３９発現内皮細胞に対する他のＦｃ媒介効果を低減する。
一実施形態において、本方法は、増加したリンパ球活性が有益である疾患、又は免疫抑制、免疫抑制細胞、若しくは例えばＣＤ４ Ｔ細胞、ＣＤ８ Ｔ細胞、Ｂ細胞によって産生されるアデノシンによって引き起こされるか、それを特徴とする疾患を有する患者におけるリンパ球（例えば、Ｔ細胞）の活性を増加させることに指向される。この方法は、例えば、腫瘍微小環境（及びその中のＣＤ３９媒介アデノシン生成）が免疫系による認識の欠如（免疫エスケープ）に寄与している疑いがある固形腫瘍を有する患者にとって特に有用である。腫瘍は、例えば、ＣＤ３９発現免疫細胞、例えば、ＣＤ４ Ｔ細胞、ＣＤ８ Ｔ細胞、Ｂ細胞によって特徴付けられ得る。
より具体的には、本方法及び組成物は、様々な癌及び他の増殖性疾患、並びに感染性疾患の治療に利用される。これらの方法は、リンパ球の抗標的細胞（例えば、抗腫瘍）活性を阻害するアデノシンを低減することによって、及び場合によっては追加的にリンパ球の抗腫瘍活性を増加させることができるＡＴＰを増加させることによって作用するため、非常に広い範囲の癌及び感染症に適用することができる。一実施形態において、抗ＣＤ３９組成物は、ヒトＰＤ−１の阻害活性を中和する（例えば、ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１との間の相互作用を阻害する）薬剤での治療に対する応答が低い（又は感受性でない）個体において癌を治療するのに有用である。治療することができる癌の代表的な例には特に、腫瘍微小環境中のアデノシンが抗腫瘍免疫応答の抑制において強い役割を果たし得る固形腫瘍が含まれる。一実施形態において、抗ＣＤ３９抗体で処置されたヒト患者は、肝臓癌、骨癌、膵臓癌、皮膚癌、頭部又は頸部の癌、乳癌、肺癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、去勢抵抗性前立腺癌（ＣＲＰＣ）、メラノーマ、子宮癌、結腸癌、直腸癌、肛門領域の癌、胃癌、精巣癌、子宮癌、卵管の癌腫、子宮内膜の癌腫、子宮頸部の癌腫、膣の癌腫、外陰部の癌腫、非ホジキンリンパ腫、食道癌、小腸癌、内分泌系の癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟組織、尿道癌、陰茎癌、小児期の固形腫瘍、リンパ球性リンパ腫、膀胱癌、腎癌又は尿管癌、腎盂の癌腫、中枢神経系（ＣＮＳ）の腫瘍、主ＣＮＳリンパ腫、腫瘍血管新生、脊髄軸腫瘍、脳幹神経膠腫、下垂体腺腫、カポジ肉腫、類表皮癌、扁平上皮癌、アスベストによって誘発されるものも含む、環境誘発性癌、例えば、多発性骨髄腫、Ｂ細胞リンパ腫などの血液悪性腫瘍、ホジキンリンパ腫／原発性縦隔Ｂ細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、急性骨髄性リンパ腫、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、濾胞性リンパ腫、大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、免疫大細胞リンパ腫、前駆Ｂリンパ芽球性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、急性リンパ芽球性白血病、菌状息肉腫、未分化大細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、前駆体Ｔリンパ芽球性リンパ腫、及び前記癌の任意の組み合わせを有する。本開示は、転移性癌の治療にも適用可能である。患者は、処置前、処置中又は処置後に、上記の１つ以上の臨床的属性について試験又は選択され得る。
一実施形態において、抗ＣＤ３９抗体は、血管ＣＤ３９を発現する悪性細胞を特徴とする癌の治療に使用される。一実施形態において、抗ＣＤ３９抗体は、ＣＤ３９陽性悪性細胞がＣＤ３９Ｌ１−、−Ｌ２、−Ｌ３及び／又は−Ｌ４を実質的に発現しない、血管ＣＤ３９を発現する悪性細胞を特徴とする癌の治療に使用される。一実施形態において、抗ＣＤ３９抗体は、検出可能な可溶性ＣＤ３９アイソフォーム、任意選択でＣＤ３９−Ｌ２及び／又は−Ｌ４を含む患者の癌の治療に使用される。
一実施形態において、抗ＣＤ３９抗体は、ＣＤ３９の酵素活性の中和について、少なくともＥＣ５０、任意選択でＥＣ７０、任意選択で実質的にＥＣ１００の個体における血中濃度を達成及び／又は維持（例えば、１、２、３、４週間、及び／又は抗原結合化合物のその後の投与まで）するのに有効な量で投与される。一実施形態において、抗ＣＤ３９抗体の活性量は、個体の血管外組織におけるＣＤ３９の酵素活性の中和について、ＥＣ５０、任意選択でＥＣ７０、任意選択で実質的にＥＣ１００を達成するのに有効な量である。一実施形態において、抗ＣＤ３９抗体の活性量は、ＣＤ３９の酵素活性を中和する阻害について、個体においてＥＣ５０、任意選択でＥＣ７０、任意選択で実質的にＥＣ１００を達成（又は維持）するのに有効な量である。
任意選択で、一実施形態において、ＡＤＣＣ（例えば、受容体飽和を提供する濃度と同等又は実質的により低い濃度で完全な有効性を提供することができる）によるＣＤ３９発現腫瘍細胞の枯渇に指向されるいくつかの抗体とは対照的に、抗ＣＤ３９抗体は、実質的なＦｃγ受容体媒介活性を示さず、ＣＤ３９発現の下方制御を実質的に引き起こすことなく、任意選択でさらにＣＤ３９の酵素活性を中和するのに有効な量で、例えば、所望の期間（例えば、１週間、２週間、１ヶ月間、抗ＣＤ３９抗体の次の連続投与まで）投与される。
一実施形態において、抗ＣＤ３９抗体は、ＡＴＰのＡＭＰへのＣＤ３９媒介異化（例えば、ＡＴＰからＡＭＰへの加水分解を定量して、Ｂ細胞、任意選択でＲａｍｏｓリンパ腫細胞中のＡＴＰａｓｅ活性の中和を評価することによって、実施例６を参照）について、少なくともＥＣ５０、任意選択でＥＣ７０、任意選択で実質的にＥＣ１００の個体における血中濃度を達成及び／又は維持（例えば、１、２、３、４週間、及び／又は抗ＣＤ３９抗体のその後の投与まで）するのに有効な量で投与される。一実施形態において、抗ＣＤ３９抗体の量は、個体の血管外組織において、ＡＴＰからＡＭＰへのＣＤ３９媒介異化の阻害について、ＥＣ５０、任意選択でＥＣ７０、任意選択で実質的にＥＣ１００を達成（又は維持）するのに有効な量である。
一実施形態において、個体における癌を治療又は予防する方法が提供され、本方法は、疾患を有する個体に、循環中の濃度を特定の期間達成又は維持する量の抗ＣＤ３９抗体を投与することを含み、濃度は、任意選択で、循環中、目的の血管外組織（例えば、腫瘍又は腫瘍環境）において、５０％、７０％、又は完全（例えば９０％）受容体飽和ＣＤ３９発現細胞に必要な濃度よりも高い濃度である（例えば、ＰＢＭＣで評価したもの）。任意選択で、達成される濃度は、特定の受容体飽和に必要とされる濃度より少なくとも２０％、５０％又は１００％高い。
一実施形態において、個体における癌を治療又は予防する方法が提供され、本方法は、個体に、循環中の濃度を特定の期間達成又は維持する量の抗ＣＤ３９抗体を投与することを含み、濃度は、任意選択で、目的の血管外組織（例えば、腫瘍又は腫瘍環境）において、ＣＤ３９発現細胞への結合（例えば、ＣＤ３９発現細胞（例えば、実施例３のようにＲａｍｏｓ細胞）上の抗ＣＤ３９抗体を滴定することによって評価される）につきＥＣ５０、任意選択でＥＣ７０、又は任意選択でＥＣ１００よりも高い濃度である。任意選択で、達成される濃度は、ＣＤ３９発現細胞との結合について、ＥＣ５０、任意選択でＥＣ７０又は任意選択でＥＣ１００よりも少なくとも２０％、５０％又は１００％高い。
ＥＣ５０、ＥＣ７０又はＥＣ１００は、例えば、本明細書中の実施例に示されるようなＣＤ３９の酵素活性の中和のための細胞アッセイ、例えば、ＡＴＰからＡＭＰへの（又はＡＴＰから下流のアデノシンへの）加水分解を定量することによるＢ細胞におけるＡＴＰａｓｅ活性の中和において評価される（実施例６を参照）。ＣＤ３９の酵素活性の中和に関し、「ＥＣ５０」は、その最大応答又は効果の５０％を生じる抗ＣＤ３９抗体の、酵素活性の中和に関して効率的な濃度を指す。ＣＤ３９の酵素活性の中和に関し、「ＥＣ７０」は、その最大応答又は効果の７０％を生じる抗ＣＤ３９抗体の効率的な濃度を指す。ＣＤ３９の酵素活性の中和に関し、「ＥＣ１００」は、実質的にその最大応答又は効果を生じる抗ＣＤ３９抗体の、そのような酵素活性の中和に関して効率的な濃度を指す。
いくつかの実施形態では、特に固形腫瘍の治療のために、達成される濃度は、酵素活性の中和について少なくともＥＣ５０又はＥＣ７０、又は少なくともＥＣ１００に相当する、組織中（脈管構造の外側、例えば腫瘍又は腫瘍環境中）の濃度を導くよう設計される。
一実施形態において、抗ＣＤ３９抗体の量は、１〜２０ｍｇ／ｋｇ体重である。一実施形態において、量は、個体に毎週、２週間ごと、毎月又は２ヶ月ごとに投与される。
一実施形態において、癌を有するヒト個体を治療する方法が提供され、本方法は、少なくとも１投与サイクル（任意選択で少なくとも２、３、４又はそれ以上の投与サイクル）において、本開示の抗ＣＤ３９抗体の有効量を個体に投与することを含み、サイクルは、８週間以下の期間であり、少なくとも１つのサイクルの各々において、抗ＣＤ３９抗体の１、２、３又は４用量が、１〜２０ｍｇ／ｋｇ体重の用量で投与される。一実施形態において、抗ＣＤ３９抗体は、静脈内注入によって投与される。
ヒトを治療するための好適な治療プロトコルは、例えば、抗ＣＤ３９抗体の本明細書に開示される量を患者に投与することが含み、本方法は、少なくとも１用量の抗ＣＤ３９抗体が投与される、少なくとも１投与サイクルを含む。任意選択で、少なくとも２、３、４、５、６、７又は８用量の抗ＣＤ３９抗体を投与する。一実施形態において、投与サイクルは２週間〜８週間である。
一実施形態において、個体における疾患（例えば、癌、固形腫瘍、血液腫瘍）を治療又は予防する方法であって、方法は、疾患（例えば、癌、固形腫瘍、血液腫瘍）を有する個体に、少なくとも１投与サイクルにおいてＣＤ３９の酵素活性を中和する抗ＣＤ３９抗体を投与することを含み、投与サイクルは、抗ＣＤ３９抗体の少なくとも第１及び第２（及び任意選択で第３、第４、第５、第６、第７及び／又は第８又はそれ以上）の投与を含み、抗ＣＤ３９抗体は、２回の連続投与の間において、少なくとも０．１μｇ／ｍｌ、任意選択で０．２μｇ／ｍｌ、任意選択で少なくとも１μｇ／ｍｌ、又は任意選択で少なくとも２μｇ／ｍｌ（例えば、血液腫瘍の治療について）、又は任意選択で少なくとも約１μｇ／ｍｌ、２μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ又は２０μｇ／ｍｌ、例えば、１〜１００μｇ／ｍｌ、１〜５０μｇ／ｍｌ、１〜２０μｇ／ｍｌ、又は１〜１０μｇ／ｍｌ（例えば、固形腫瘍の治療について、血液腫瘍の治療について）の抗ＣＤ３９抗体の血液（血清）濃度を達成又は維持するのに有効な量で投与される、方法が提供される。一実施形態において、所定の連続血中濃度が維持され、血中濃度は、所定の期間（例えば、抗体の２回の投与の間、数週間、１週間、２週間、３週間、４週間）の間、実質的に所定の血中濃度を下回らず、すなわち、血中濃度は、指定された期間中に変化し得るが、所定の血中濃度は、最小値又は「トラフ」濃度を維持する。一実施形態において、抗ＣＤ３９抗体の治療有効量は、ＣＤ３９の酵素活性の中和について、（少なくとも）ＥＣ５０濃度、任意選択でＥＣ７０濃度、任意選択でＥＣ１００濃度を、血液中及び／又は組織中、抗体の投与後少なくとも約１週間、約２週間、又は約１ヶ月の期間、提供することができるような抗体の量である。
本開示の抗ＣＤ３９抗体による治療経過の前又は最中に、存在又はレベル又はＣＤ３９発現細胞、アデノシン、ＡＴＰ、ＡＤＰ及び／又はＡＭＰレベルを患者の腫瘍内で及び／又はそれに隣接して評価して、患者が治療に適しているかどうかを評価する（例えば、患者が治療に応答する可能性が高いかどうかを予測する）ことができる。増加した存在又はレベル又はＣＤ３９発現細胞、アデノシン、ＡＴＰ、ＡＤＰ及び／又はＡＭＰのレベルは、個体が、本開示の抗ＣＤ３９抗体（限定されないが、基質結合ＣＤ３９を阻害する抗体への結合を含む）による治療に適している（例えば、利益を受ける可能性が高い）かを示し得る。
本開示の抗ＣＤ３９抗体による治療経過の前又は最中に、アデノシン、ＡＤＰ及び／又はＡＭＰレベルを患者の腫瘍内で及び／又はそれに隣接して評価して、患者が抗ＣＤ３９抗体での腫瘍の治療から利益を得ているかどうかを評価することもできる。治療（又は抗体の投与）前のレベルと比較して、投与（又は抗体の投与）後に比較したアデノシン、ＡＴＰ、ＡＤＰ及び／又はＡＭＰのレベルの低下は、個体が、本開示の抗ＣＤ３９抗体（基質結合ＣＤ３９を阻害する抗体を含むが、これに限定されない）による治療から利益を得ていることを示す。任意選択で、患者が抗ＣＤ３９抗体による治療から利益を得ている場合、方法は、さらなる用量の抗ＣＤ３９抗体を患者に投与すること（例えば、継続的な治療）をさらに含み得る。
一実施形態において、患者の腫瘍組織サンプル内及び／又はそれに隣接するアデノシン、ＡＤＰ及び／又はＡＭＰレベルを評価することは、癌患者由来の組織、例えば癌組織、癌隣接組織又は癌周辺組織、隣接非腫瘍性組織又は正常隣接組織、からなる群から選択されるヒト組織の生物学的サンプルを得ること、及び組織内のアデノシン、ＡＴＰ、ＡＤＰ及び／又はＡＭＰレベルを検出することを含む。患者からのレベルは、レベルを基準レベル（例えば、健康な個体に対応する）と比較することができる。
一実施形態において、本開示は、それを必要とする個体における癌の治療又は予防方法を提供し、方法は以下を含む：
ａ）循環中又は腫瘍環境中、任意選択で腫瘍内及び／又は隣接する組織内、のＣＤ３９発現細胞（又はアデノシン、ＡＴＰ、ＡＤＰ及び／又はＡＭＰ）を検出すること、及び
ｂ）ＣＤ３９発現細胞（又はアデノシン、ＡＴＰ、ＡＤＰ及び／又はＡＭＰ）が、任意選択で基準レベル（例えば、健康な個体又は抗ＣＤ３９抗体から実質的に利益を受けない個体に対応する）と比較して増加したレベルで、循環又は腫瘍環境に含まれるとの決定を受けて、個体に抗ＣＤ３９抗体を投与すること。ＣＤ３９発現細胞は、腫瘍細胞又は白血球、例えば循環又は腫瘍浸潤細胞、例えばＣＤ４ Ｔ細胞、ＣＤ８ Ｔ細胞、ＴＲｅｇ細胞、Ｂ細胞を含み得る。
一実施形態において、本開示は、それを必要とする個体における癌の治療又は予防方法を提供し、方法は以下を含む：
ａ）血管ＣＤ３９を発現する循環中の細胞を検出すること（例えば、血液サンプルから）、及び
ｂ）血管ＣＤ３９を発現する循環中の細胞の、任意選択で基準レベル（例えば、健康な個体又は抗ＣＤ３９抗体から実質的に利益を受けない個体に対応する）と比較して増加したレベルでの検出を受けて、個体に抗ＣＤ３９抗体を投与すること。ＣＤ３９発現細胞は、腫瘍細胞又は白血球、例えば循環ＣＤ４ Ｔ細胞、ＣＤ８ Ｔ細胞、ＴＲｅｇ細胞、Ｂ細胞を含み得る。
任意選択で、抗ＣＤ３９抗体は、血管ＣＤ３９に特異的に結合し、例えば、抗体は、配列番号１の配列を有するポリペプチドに結合するが、分泌されたＣＤ３９アイソフォームポリペプチド、例えばＣＤ３９−Ｌ２及び／又は−Ｌ４ポリペプチドに結合しない。任意選択で、抗ＣＤ３９抗体は、血管ＣＤ３９に特異的に結合し、例えば、抗体は、配列番号１の配列を有するポリペプチドに結合するが、膜結合ＣＤ３９アイソフォーム、例えばＣＤ３９−Ｌ１及び／又は−Ｌ３ポリペプチドに結合しない。
一実施形態において、本開示は、それを必要とする個体における癌の治療又は予防方法を提供し、方法は以下を含む：
ａ）任意選択で腫瘍内及び／又は隣接組織内の、腫瘍環境において血管ＣＤ３９を発現する細胞を検出すること、及び
ｂ）血管ＣＤ３９を発現する腫瘍環境中の細胞の、任意選択で基準レベル（例えば、健康な個体又は抗ＣＤ３９抗体から実質的に利益を受けない個体に対応する）と比較して増加したレベルでの検出を受けて、個体に抗ＣＤ３９抗体を投与すること。ＣＤ３９発現細胞は、腫瘍細胞又は白血球、例えば腫瘍浸潤細胞、例えばＣＤ４ Ｔ細胞、ＣＤ８ Ｔ細胞、ＴＲｅｇ細胞、Ｂ細胞を含み得る。任意選択で、抗ＣＤ３９抗体は、血管ＣＤ３９に特異的に結合し、例えば、抗体は、配列番号１の配列を有するポリペプチドに結合するが、分泌されたＣＤ３９アイソフォームポリペプチド、例えばＣＤ３９−Ｌ２及び／又は−Ｌ４ポリペプチドに結合しない。任意選択で、抗ＣＤ３９抗体は、血管ＣＤ３９に特異的に結合し、例えば、抗体は、配列番号１の配列を有するポリペプチドに結合するが、膜結合ＣＤ３９アイソフォーム、例えばＣＤ３９−Ｌ１及び／又は−Ｌ３ポリペプチドに結合しない。
任意選択で、いずれかの方法において、腫瘍環境中でＣＤ３９発現細胞（又はアデノシン、ＡＴＰ、ＡＤＰ及び／又はＡＭＰ）を検出することは、個体から、癌組織及び／又は癌隣接組織又は癌周辺組織（例えば、隣接非腫瘍性組織又は正常隣接組織）を含む生物学的サンプルを得ること、及びＣＤ３９発現細胞（又はアデノシン、ＡＴＰ、ＡＤＰ及び／又はＡＭＰ）のレベルを検出することを含む。ＣＤ３９発現細胞は、例えば、腫瘍細胞、ＣＤ４ Ｔ細胞、ＣＤ８ Ｔ細胞、ＴＲｅｇ細胞、Ｂ細胞を含み得る。
循環細胞又は腫瘍微小環境中の細胞（例えば、腫瘍細胞、ＣＤ４ Ｔ細胞、ＣＤ８ Ｔ細胞、ＴＲｅｇ細胞、Ｂ細胞）上のＣＤ３９の発現を評価するために、先の検出ステップを伴い又は伴わず、抗ＣＤ３９抗体で処置することができる。任意選択で、治療方法は、血液からの生物学的サンプル又は個体からの腫瘍の生物学的サンプル（例えば、癌組織、癌周辺隣接組織又は癌周辺組織、癌隣接組織、隣接非腫瘍性組織又は正常隣接組織）中のＣＤ３９核酸又はポリペプチドを検出するステップを含み得る。生物学的サンプルがＣＤ３９を発現する細胞（例えば、顕著に発現する；基準と比較して高レベルで、抗ＣＤ３９抗体による高強度の染色でＣＤ３９を発現する）を含むとの判定は、患者がＣＤ３９を阻害する薬剤による治療の強い恩恵を受け得る癌を有することを示す。一実施形態において、この方法は、生物学的サンプル中のＣＤ３９核酸又はポリペプチドの発現レベルを決定すること、及びそのレベルを健康な個体に対応する基準レベルと比較することを含む。生物学的試料がＣＤ３９核酸又はポリペプチドを発現する細胞を基準レベルと比較して増加したレベルで含むという判定は、患者が、本開示の抗ＣＤ３９抗体で有利に処置され得る癌を有することを示す。任意選択で、生物学的試料中のＣＤ３９ポリペプチドを検出することは、悪性細胞、ＣＤ４ Ｔ細胞、ＣＤ８ Ｔ細胞、ＴＲｅｇ細胞、Ｂ細胞の表面上に発現されたＣＤ３９ポリペプチドを検出することを含む。一実施形態において、生物学的試料がＣＤ３９核酸又はポリペプチドを顕著に発現する細胞を含むという判定は、患者が、本開示の抗ＣＤ３９抗体で有利に処置され得る癌を有することを示す。「顕著に発現する」とは、ＣＤ３９ポリペプチドに言及する場合、ＣＤ３９ポリペプチドが所与の患者から採取された実質的な数の細胞で発現されることを意味する。「顕著に発現する」という用語の定義は正確な％値に限定されないが、いくつかの例では、「顕著に発現する」と言われる受容体は、患者から採取した腫瘍細胞の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％又はそれ以上に存在する。
個体がＣＤ３９ポリペプチドを発現する細胞を特徴とする癌を有するかどうかを決定することは、癌環境由来の細胞（例えば、腫瘍又は腫瘍隣接組織）を含む個体からの生物学的サンプルを得ること（例えば、生検を行うことによって）、前記細胞をＣＤ３９ポリペプチドに結合する抗体と接触させること、及び細胞がその表面上にＣＤ３９を発現するかどうかを検出することを含む。任意選択で、個体がＣＤ３９を発現する細胞を有するかどうか決定することは、免疫組織化学アッセイを行うことを含む。
抗体組成物は、抗体が投与される特定の治療目的のために通常利用される薬剤を含む、単剤療法又は１以上の他の治療剤との併用療法として使用され得る。さらなる治療薬は、通常、治療対象の特定の疾患又は状態のための単剤療法でその薬剤について典型的に用いられる量及び治療レジメンで投与する。このような治療剤としては、限定されるものではないが、抗癌剤及び化学療法剤が挙げられる。
一実施形態において、抗ＣＤ３９中和抗体はヒトＣＤ１６への結合を欠いているが、ＣＤ１６発現エフェクター細胞（例えば、ＮＫ細胞又はエフェクターＴ細胞）の活性を増強する。従って、一実施形態において、第２又は追加の第２治療薬は、結合している細胞に対して（例えば、ＮＫ細胞によって発現されるＣＤ１６を介して）ＡＤＣＣを誘導することができる、抗体又は他のＦｃドメイン含有タンパク質である。典型的には、このような抗体又は他のタンパク質は、目的の抗原に結合するドメイン、例えば腫瘍細胞（腫瘍抗原）上に存在する抗原、及びＦｃドメイン又はその一部を含み、抗原結合ドメインを介して抗原に、及びＦｃドメインを介してＦｃγ受容体（例えば、ＣＤ１６）に結合する。一実施形態において、そのＡＤＣＣ活性は、少なくとも部分的にＣＤ１６によって媒介される。一実施形態において、追加の治療剤は、天然又は改変ヒトＦｃドメイン、例えばヒトＩｇＧ１又はＩｇＧ３抗体由来のＦｃドメインを有する抗体である。「抗体依存性細胞媒介細胞毒性」又は「ＡＤＣＣ」という用語は、当技術分野で十分に理解されている用語であり、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）を発現する非特異的細胞毒性細胞が、標的細胞上の結合抗体を認識し、続いて標的細胞の溶解を引き起こす、細胞媒介反応を指す。ＡＤＣＣを媒介する非特異的細胞毒性細胞には、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、マクロファージ、単球、好中球及び好酸球が含まれる。「ＡＤＣＣ誘導抗体」という用語は、当業者に公知のアッセイによって測定されるＡＤＣＣを示す抗体を指す。このような活性は、典型的には、Ｆｃ領域と種々のＦｃＲとの結合によって特徴付けられる。いかなる特定の機構によっても限定されるものではないが、当業者は、抗体がＡＤＣＣを示す能力が、例えば、そのサブクラス（例えば、ＩｇＧ１又はＩｇＧ３）による、Ｆｃ領域に導入された突然変異による、又は抗体のＦｃ領域における炭水化物パターンへの改変によるものであり得ると認識するであろう。ＡＤＣＣを誘導する抗体の例としては、リツキシマブ（リンパ腫、ＣＬＬ、トラスツズマブ（乳癌の治療について）、アレムツズマブ（慢性リンパ球性白血病の治療について）及びセツキシマブ（結腸直腸癌、頭部及び頸部扁平上皮癌について）が含まれる。ＡＤＣＣ強化抗体の例としては、限定されないが、ＧＡ−１０１（低フコシル化抗ＣＤ２０）、ｍａｒｇｅｔｕｘｉｍａｂ（Ｆｃ増強抗ＨＥＲ２）、メポリズマブ、ＭＥＤＩ−５５１（Ｆｃ操作抗ＣＤ１９）、オビヌツズマブ（糖操作／低フコシル化抗ＣＤ２０）、オカラツズマブ（Ｆｃ操作抗ＣＤ２０）、ＸｍＡｂ（登録商標）５５７４／ＭＯＲ２０８（Ｆｃ操作抗ＣＤ１９）が含まれる。
一実施形態において、抗ＣＤ３９中和抗体は、ヒトＰＤ−１の阻害活性を中和する（例えば、ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１との間の相互作用を阻害する）薬剤の有効性を、特にヒトＰＤ−１の阻害活性を中和する薬剤による治療に対する応答に乏しい（又は感受性でないでない）個体において、増強する。従って、一実施形態において、第２又は追加の第２治療剤は、ヒトＰＤ−１の阻害活性を中和する抗体又は他の薬剤である。
プログラム死１（ＰＤ−１）（「プログラム細胞死１」とも呼ばれる）は、ＣＤ２８ファミリーの受容体の阻害性メンバーである。完全ヒトＰＤ−１配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ６４８６３に見出すことができる。ＰＤ−１の阻害活性の阻害又は中和は、ＰＤ−Ｌ１誘導ＰＤ−１シグナル伝達を妨げるポリペプチド剤（例えば、抗体、Ｆｃドメインに融合したポリペプチド、イムノアドヘシンなど）の使用を含み得る。現在、市販又は臨床評価中のＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１経路を遮断する少なくとも６つの薬剤が存在する。１つの薬剤は、ＢＭＳ−９３６５５８（ニボルマブ／ＯＮＯ−４５３８、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ、以前はＭＤＸ−１１０６）である。ニボルマブ（商品名Ｏｐｄｉｖｏ（登録商標））は、ＰＤ−１及びＣＤ８０の両方に対するＰＤ−Ｌ１リガンドの結合を阻害する、ＦＤＡに認可された完全ヒトＩｇＧ４抗ＰＤ−Ｌ１ ｍＡｂであり、国際公開第２００６／１２１１６８号パンフレットにおいて抗体５Ｃ４として記載され、その開示内容は、参照として本明細書に組み込む。メラノーマ患者では、３ｍｇ／ｋｇの用量で最も有意なＯＲが観察され、他の癌のタイプでは１０ｍｇ／ｋｇであった。ニボルマブは、一般に癌の進行まで３週間ごとに１０ｍｇ／ｋｇで投与される。「ヒトＰＤ−１の阻害活性を低下させる」、「ＰＤ−１を中和する」又は「ヒトＰＤ−１の阻害活性を中和する」という用語は、ＰＤ−１が、ＰＤ−１又はＰＤ−Ｌ２などの１つ以上のその結合パートナーとＰＤ−Ｌ１との相互作用に起因するシグナル伝達能力を阻害するプロセスを指す。ＰＤ−１の阻害活性を中和する薬剤は、ＰＤ−１と、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２などのその結合パートナーの１つ以上との相互作用に起因するシグナル伝達を減少、遮断、阻害、抑制又は妨害する。これにより、このような薬剤は、増殖、サイトカイン生成及び／又は細胞毒性などのＴ細胞エフェクター機能を増強するように、Ｔリンパ球上に発現される細胞表面タンパク質によって媒介される又はそれを介した、負の共刺激シグナルを減少させることができる。
ランブロリズマブ又はペンブロリズマブ（商品名Ｋｅｙｔｒｕｄａ（登録商標））とも呼ばれるＭＫ−３４７５（ＭｅｒｃｋのヒトＩｇＧ４抗ＰＤ１ ｍＡｂ）は、メラノーマの治療のためにＦＤＡによって承認され、他の癌で試験されている。ペンブロリズマブは、疾患の進行まで２週間又は３週間ごとに２ｍｇ／ｋｇ又は１０ｍｇ／ｋｇで試験した。Ｍｅｒｃｋ３７４５又はＳＣＨ−９００４７５としても知られているＭＫ−３４７５は、国際公開第２００９／１１４３３５号パンフレットにも記載されている。
ＭＰＤＬ３２８０Ａ／ＲＧ７４４６（Ｒｏｃｈｅ／Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈの抗ＰＤ−Ｌ１）は、ＦｃγＲ結合及び結果として生じる抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を最小化することによって、有効性及び安全性を最適化するように設計された、操作されたＦｃドメインを含む、ヒト抗ＰＤ−Ｌ１ ｍＡｂである。１、１０、１５及び２５ｍｇ／ｋｇの用量のＭＰＤＬ３２８０Ａを３週間ごとに最長１年間投与した。第３期試験では、ＭＰＤＬ３２８０ＡをＮＳＣＬＣに３週間ごとに静脈内注入により１２００ｍｇで投与する。
ＡＭＰ−２２４（Ａｍｐｌｉｍｍｕｎｅ及びＧＳＫ）は、Ｆｃドメインに融合したＰＤ−Ｌ２細胞外ドメインを含むイムノアドヘシンである。ＰＤ−１を中和する薬剤の他の例は、ＰＤ−Ｌ２に結合する抗体（抗ＰＤ−Ｌ２抗体）を含み、ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ２との間の相互作用を遮断する。
Ｐｉｄｌｉｚｕｍａｂ（ＣＴ−０１１；ＣｕｒｅＴｅｃｈ）（ＣｕｒｅＴｅｃｈ／Ｔｅｖａのヒト化ＩｇＧ１抗ＰＤ１ｍＡｂ）、Ｐｉｄｌｉｚｕｍａｂ（ＣＴ−０１１；ＣｕｒｅＴｅｃｈ）（例えば国際公開第２００９／１０１６１１号パンフレット参照）は別の例であり、薬剤は、リツキシマブ感受性の３０人の患者において試験された。再発性ＦＬは、ＣＴ−０１１の最初の注入の２週間後に開始され毎週３７５ｍｇ／ｍ２で４週間投与されるリツキシマブと組み合わせて、４週間毎に３ｍｇ／ｋｇの静脈内ＣＴ−０１１、４注入で治療された。
さらなる公知のＰＤ−１抗体及び他のＰＤ−１阻害剤としては、ＡＭＰ−２２４（ＧＳＫにライセンスされたＢ７−ＤＣ／ＩｇＧ１融合タンパク質）、国際公開第２０１２／１４５４９３号パンフレットに記載のＡＭＰ−５１４、抗体ＭＥＤＩ−４７３６（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ／Ｍｅｄｉｍｍｕｎｅにより開発された抗ＰＤ−Ｌ１）、国際公開第２０１０／０７７６３４号パンフレットに記載の抗体ＹＷ２４３．５５．Ｓ７０（抗ＰＤ−Ｌ１）、ＢＭＳ−９３６５５９としても知られているＭＤＸ１１０５（国際公開第２００７／００５８７４号パンフレットに記載のＢｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂによって開発された抗ＰＤ−Ｌ１抗体）、国際公開第２００６／１２１１６８号パンフレット、国際公開第２００９／０１４７０８号パンフレット、国際公開第２００９／１１４３３５号パンフレット及び国際公開第２０１３／０１９９０６号パンフレットに記載の抗体及び阻害剤が挙げられ、その開示内容は、参照として本明細書に組み込む。抗ＰＤ１抗体のさらなる例は、国際公開第２０１５／０８５８４７号パンフレット（Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｈｅｎｇｒｕｉ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏ．Ｌｔｄ．）に開示されており、例えば、それぞれ配列番号６、配列番号７及び／又は配列番号８の軽鎖可変ドメインＣＤＲ１、２及び３、並びにそれぞれ配列番号３、配列番号４又は配列番号５の抗体重鎖可変ドメインＣＤＲ１、２及び３を有する抗体、配列番号の参照は、国際公開第２０１５／０８５８４７による番号であり、その開示は、参照として本明細書に組み込む。ＰＤ−１又はＰＤ−Ｌ１への結合についてこれらの抗体のいずれかと競合する抗体も使用することができる。例示的な抗ＰＤ−１抗体は、ペンブロリズマブ（Ｍｅｒｃｋ＆Ｃｏ．によりＫｅｙｔｒｕｄａ（商標）として市販される。国際公開第２００９／１１４３３５号パンフレットも参照、その開示内容は、参照として本明細書に組み込む）である。
いくつかの実施形態において、ＰＤ−１中和剤は、ＰＤ−Ｌ１のＰＤ−１への結合を阻害する抗ＰＤ−Ｌ１ ｍＡｂである。いくつかの実施形態において、ＰＤ−１中和剤は、ＰＤ−１のＰＤ−Ｌ１への結合を阻害する抗ＰＤ１ ｍＡｂである。いくつかの実施形態では、ＰＤ−１中和剤は、イムノアドヘシン（例えば、定常領域（例えば、免疫グロブリン配列のＦｃ領域）に融合したＰＤ−Ｌ１又はＰＤ−Ｌ２の細胞外又はＰＤ−１結合部分を含むイムノアドヘシンである。
治療方法において、ＣＤ３９結合化合物及び第２治療薬は、個別に、一緒に、若しくは逐次、又はカクテルとして投与することができる。ある実施形態において、抗原結合化合物は、第２治療薬の投与の前に投与する。例えば、ＣＤ３９結合化合物は、第２治療薬の投与の約０〜３０日前に投与することができる。ある実施形態では、ＣＤ３９結合化合物は、第２治療薬の投与の約３０分〜約２週間、約３０分〜約１週間、約１時間〜約２時間、約２時間〜約４時間、約４時間〜約６時間、約６時間〜約８時間、約８時間〜１日、又は約１日〜５日前に投与する。ある実施形態において、ＣＤ３９結合化合物は、上記治療薬の投与と同時に投与する。ある実施形態において、ＣＤ３９結合化合物は、第２治療薬の投与後に投与する。例えば、ＣＤ３９結合化合物は、第２治療薬の投与の約０〜３０日後に投与することができる。ある実施形態では、ＣＤ３９結合化合物は、第２治療薬の投与の約３０分〜約２週間、約３０分〜約１週間、約１時間〜約２時間、約２時間〜約４時間、約４時間〜約６時間、約６時間〜約８時間、約８時間〜１日、又は約１日〜５日後に投与する。
実施例１：新規抗ｈｕＣＤ３９抗体の作製
ｈｕＣＤ３９のクローニング、生成及び精製
分子生物学
ｈｕＣＤ３９タンパク質を、以下のプライマーＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＡＡＧＣＴＴＧＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＡＧＡＴＡＣＡＡＡＧＧＡＧＴＣ（配列番号６０）（フォワード）及び
（リバース）を用いてヒトＰＢＭＣ ｃＤＮＡからクローン化した。次いで、精製したＰＣＲ産物を、ＩｎＦｕｓｉｏｎクローニングシステムを用いて発現ベクターにクローニングした。精製ステップのために、Ｍ２タグをタンパク質のＣ末端部分に付加した。
ｈｕＣＤ３９タンパク質の発現及び精製
クローン化された配列の確認後、ＣＨＯ細胞をヌクレオフェクトし、次いで生成プールをサブクローン化して、ｈｕＣＤ３９タンパク質を生成する細胞クローンを得た。ローラーで増殖させたｈｕＣＤ３９クローンからの上澄みを収集し、Ｍ２クロマトグラフィーカラムを用いて精製し、Ｍ２ペプチドを用いて溶出した。次いで精製したタンパク質をＳ２００サイズ排除クロマトグラフィーカラムに充填した。単量体に相当する精製タンパク質をＴＢＳ ＰＨ７．５バッファー中に配合した。
免疫及びスクリーン
抗ヒトＣＤ３９抗体を取得するために、Ｂａｌｂ／ｃマウスを組換えヒトＣＤ３９−Ｍ２細胞外ドメイン組換えタンパク質で免疫した。マウスは、腹腔内経路で、５０μｇのＣＤ３９タンパク質及び完全フロイントアジュバントのエマルションによる１回の一次免疫と、腹腔内経路で、５０μｇのＣＤ３９タンパク質及び不完全フロイントアジュバントのエマルションによる１回の二次免疫を受け、最終的に、静脈内経路で、１０μｇのＣＤ３９タンパク質による追加免疫を受けた。免疫脾細胞を免疫の３日後にＸ６３．Ａｇ８．６５３不死化Ｂ細胞と融合した後、照射済み脾細胞の存在下で培養した。ハイブリドーマ（Ｈｙｄｒｉｄｏｍａｓ）を半固体のメチルセルロース含有培地に播種し、ｃｌｏｎｅｐｉｘ２装置（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて増殖クローンを採取した。
一次スクリーン：成長するクローンの上澄み（ＳＮ）を、一次スクリーニングで、ｈｕＣＤ３９を発現するＣＨＯ細胞を用いたフローサイトメトリーによって試験した。細胞を０．１μＭ及び０．００５μＭのセルトレースレッドでそれぞれ染色した。フローサイトメトリースクリーニングのために、全ての細胞を等しく混合し、ＰＥで標識したヤギ抗マウスポリクローナル抗体（ｐＡｂ）によって上澄み（ｓｕｐｅｒｎａｎａｎｔ）中の反応抗体の存在を明らかにした。ｈｕＣＤ３９に結合する抗体をクローニングし、Ｎ結合グリコシル化の欠如及びヒトＦｃγ受容体ＣＤ１６Ａ、ＣＤ１６Ｂ、ＣＤ３２Ａ、ＣＤ３２Ｂ及びＣＤ６４への結合の欠如をもたらす重鎖Ｎ２９７Ｑ（Ｋａｂａｔ ＥＵ番号付け）突然変異を有する組換えキメラヒトＩｇＧ１抗体として生成した。
実施例２：突然変異ヒトＩｇＧ１としての抗体Ｉ−３９１及びＩ−３９２の生成
それぞれ配列番号６及び７に示されるＶＨ及びＶｋ可変領域を有する抗体Ｉ−３９１は、Ｎ結合グリコシル化の欠如をもたらし、ヒトＦｃγ受容体ＣＤ１６Ａ、ＣＤ１６Ｂ、ＣＤ３２Ａ、ＣＤ３２Ｂへの結合を減少させ、ＣＤ６４への低残留結合をもたらす重鎖Ｎ２９７Ｑ（Ｋａｂａｔ ＥＵ番号付け）突然変異を有するＦｃサイレント組換えキメラヒトＩｇＧ１抗体として生成した。
手短には、Ｉ−３９１抗体のＶＨ及びＶＫ配列を、それぞれ、（Ｎ２９７Ｑ突然変異を有する）ｈｕＩｇＧ１定常ドメイン及びｈｕＣｋ定常ドメインを含む発現ベクターにクローニングした。得られた２つのベクターをＣＨＯ細胞株に共トランスフェクトした。確立した細胞プールを使用して、ＣＨＯ培地中で抗体を生成した。次いで、抗体をプロテインＡを用いて精製した。Ｉ−３９１のそれぞれの重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列を以下に示す。抗体Ｉ−３９２は、Ｎ２９７Ｑ突然変異を有する同一のｈｕＩｇＧ１定常ドメインを用いて同じ方法で生成された。
Ｉ−３９１重鎖配列：
Ｉ−３９１軽鎖配列：
実施例３：フローサイトメトリーによるＣＤ３９タンパク質に対するＡｂ滴定
抗体Ｉ−３９１を、可溶性組換えヒト及びカニクイザルＣＤ３９への結合について試験した。手短には、１×１０５ＨＥＫ−ｈｕＣＤ３９又はｃｙｎｏＣＤ３９細胞を、９９ｎＭ〜０．０４５ｎＭの様々な濃度の非標識抗ＣＤ３９抗体又はアイソタイプ対照（ＩＣ）と４℃で３０分間インキュベートした。洗浄後、細胞をヤギ抗マウスＨ＋Ｌ標識二次抗体と共に４℃で３０分間インキュベートした。
結果を図１に示す。抗体Ｉ−３９１は、ヒト血管ＣＤ３９及びカニクイザル血管ＣＤ３９の両方に結合した。ヒトＣＤ３９への結合のＥＣ５０値は１４．９ｎＭであり、カニクイザルＣＤ３９への結合は１０．６ｎＭであった。
実施例４：ＣＤ３９−Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４アイソフォームに対するＥＬＩＳＡ滴定
抗体Ｉ−３９１及びＩ−３９２は、以下に示すアミノ酸配列を有する組換えヒトＣＤ３９アイソフォーム（Ｒｅｃ−ｈｕＣＤ３９アイソフォーム）への結合につき試験し、５００ｎｇ／ｍｌ又は１μｇ／ｍｌのＰＢＳ １Ｘ中、９６ウェルプレートで、４℃で一晩被覆した。ウェルをＴＢＳ Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄し、さらにＴＢＳ Ｂｌｏｃｋｉｎｇバッファー中、室温で２時間飽和させた。一次抗体の用量範囲濃度をＴＢＳ遮断バッファー中、室温で２時間インキュベートした。ウェルをＴＢＳ Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄した。二次抗体（ＴＢＳブロッキングバッファー中のＧＡＭ−ＨＲＰ又はＧＡＨ−ＨＲＰ）を室温で１時間インキュベートし、ＴＭＢで表した。Ｅｎｓｐｉｒｅで光学密度をＯＤ＝４５０で測定した。
クローン化したｈｕＣＤ３９（血管アイソフォーム）のアミノ酸配列：
ＮＴＰＤａｓｅ２又はＥＮＴＰＤ２としても知られているヒトＣＤ３９−Ｌ１：
ＮＴＰＤａｓｅ６又はＥＮＴＰＤ６としても知られているヒトＣＤ３９−Ｌ２：
ＮＴＰＤａｓｅ３又はＥＮＴＰＤ３としても知られているヒトＣＤ３９−Ｌ３：
ＮＴＰＤａｓｅ５又はＥＮＴＰＤ５としても知られているヒトＣＤ３９−Ｌ４：
抗体Ｉ−３９１もＩ−３９２も血管ＣＤ３９に結合せず、ＣＤ３９アイソフォームＣＤ３９−Ｌ１、−Ｌ２、−Ｌ３又は−Ｌ４のいずれにも結合しなかった。アイソタイプ対照抗体（ＩＣ）は、いずれのＣＤ３９又はＣＤ３９−Ｌ分子とも結合しなかった。Ｉ−３９１につき結果を図２に示す。上のパネルは、ヒトＦｃγ受容体への結合を失うＮ２９７Ｑ突然変異を有するヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインを有する抗体Ｉ−３９１又はアイソタイプ対照を示す。下のパネルは、マウスＩｇＧａアイソタイプ（ＭＯＧＡ）のＦｃドメインを有する抗体を示す。
実施例５：Ｉ−３９１もＩ−３９２も、ＣＤ３９下方制御を誘導も増加もしない
Ｉ−３９１及びＩ−３９２を、示された期間、４℃又は３７℃で、それぞれ１０μｇ／ｍｌのＲａｍｏｓヒトリンパ腫細胞上でインキュベートした。次いで、細胞をＧＡＭ−ＰＥで染色して、細胞表面で結合したＩ−３９１又はＩ−３９２ Ａｂの存在を明らかにし、又はＩ−３９１又はＩ−３９２と競合しない抗ｈｕＣＤ３９ ＡｂであるＡ１−ＰＥで染色して、細胞表面上のヒトＣＤ３９の総量を明らかにした。Ｉ−３９１について図３に示すように（上パネル：Ｉ−３９１；下パネル：Ａ１）、Ｉ−３９１又はＩ−３９２とのインキュベーション後、ＣＤ３９発現は安定し、Ａｂの非存在下でのインキュベーションと同等のままであり、結合Ｉ−３９１又はＩ−３９２の減少は検出されなかったことを示す。これは、Ｉ−３９１及びＩ−３９２がＣＤ３９下方制御もＣＤ３９インターナライゼーションも誘導しないことを示す。
実施例６：Ｉ−３９１及びＩ−３９２は、ＡＴＰａｓｅ活性の実質的完全中和が可能である
抗体によるＣＤ３９酵素活性の阻害は、Ｍａｌｄｉ ＴＯＦ質量分析法（ＡＭＰの生成）によって評価した。このアッセイは、ＣＤ３９発現の下方制御に比較的非感受性のアッセイを表す。手短には、１０５Ｒａｍｏｓヒトリンパ腫細胞を、Ｉ−３９１又はＩ−３９２又は化学ＣＤ３９阻害剤（ＡＲＬ１００μＭ）と共に３７℃で一晩インキュベートした。洗浄後、細胞を抗ＣＤ３９抗体、アイソタイプ対照、又はＡＲＬ及び５０μＭのＡＴＰとともにＰＢＳ中、４℃で３０分間インキュベートした。産生ＡＭＰをＭａｌｄｉ ＴＯＰにより上澄み中で定量する。
Ｉ−３９１及びＩ−３９２は、どちらもＣＤ３９酵素活性を遮断するのに非常に強力であった。計算されたＥＣ５０（１００，０００Ｒａｍｏｓ細胞によって発現されるＣＤ３９の酵素活性の５０％の阻害）は１．２ｎＭ（ｎ＝３）である。達成された最大阻害は９３．４％である。アイソタイプ対照は効果を有しなかった。
実施例７：インターナライズ及び非インターナライズｍＡｂによるＡＴＰａｓｅ遮断比較
Ｉ−３９１によるＣＤ３９遮断を、他の抗ＣＤ３９抗体及び化学阻害剤ＡＲＬと比較した。試験コンパレータ抗ＣＤ３９体は、細胞表面ＣＤ３９の少なくとも部分的な下方調節を誘発し、及び／又はＣＤ３９から迅速に解離する抗体である、抗体「Ａ１」を含み、これは、ＡＢＤ Ｓｅｒｏｔｅｃ、製品コードＭＣＡ１２６８ＧＡから入手可能で、例えば、Ｈａｕｓｌｅｒ ｅｔ ａｌ．Ａｍ Ｊ Ｔｒａｎｓｌ Ｒｅｓ．２０１４ Ｊａｎ １５；６（２）：１２９−３９）に報告される。
抗体によるＣＤ３９酵素活性の阻害は、Ｍａｌｄｉ ＴＯＦ質量分析法（ＡＭＰの生成）によって評価した。手短には、１０５Ｒａｍｏｓヒトリンパ腫細胞を、抗ＣＤ３９抗体又は化学ＣＤ３９阻害剤（ＡＲＬ１００μＭ）と３７℃で一晩インキュベートした。洗浄後、細胞を抗ＣＤ３９抗体、アイソタイプ対照、又はＡＲＬ及び５０μＭのＡＴＰとともにＰＢＳ中、４℃で３０分間インキュベートした。産生ＡＭＰをＭａｌｄｉ ＴＯＰにより上澄み中で定量する。抗体は、３３ｎＭで使用し、ＡＲＬは１００ｎＭで使用した。
抗体Ｉ−３９１はＡＭＰの強力な阻害を生じ、ＣＤ３９酵素活性を遮断するのに非常に強力であった。化学ＣＤ３９阻害剤ＡＲＬは産生ＡＭＰの強力な阻害を生じたが、Ｉ−３９１よりもＣＤ３９遮断が有意に少なかった。抗体Ａ１は、産生ＡＭＰの最小限の検出可能な減少を生じる。要約すると、Ｉ−３９１は、抗体Ａ１と比較して、又は化学的阻害剤（非特異的ではあるが）と比較して、非常に優れたＣＤ３９遮断能力を有していた。
実施例８−エピトープマッピング
抗ＣＤ３９抗体のエピトープを定義するために、本発明者らは、ＣＤ３９の表面上の分子表面に露出したアミノ酸の置換によって定義されるＣＤ３９突然変異体を設計した。以下の表に示すように、突然変異体をＨｅｋ−２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。配列番号１の番号付けを用いて、以下の表１の標的化アミノ酸突然変異を示す。
突然変異体の産生
ＣＤ３９突然変異体はＰＣＲによって産生した。増幅した配列をアガロースゲル上に流し、Ｍａｃｈｅｒｅｙ Ｎａｇｅｌ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ−Ｕｐゲル抽出キット（参照番号７４０６０９）を用いて精製した。各突然変異体について生成された精製ＰＣＲ産物を、ＣｌｏｎＴｅｃｈ ＩｎＦｕｓｉｏｎシステムを用いて発現ベクターに連結した。突然変異した配列を含むベクターをＭｉｎｉｐｒｅｐとして調製し、配列決定した。配列決定後、突然変異した配列を含むベクターをＭｉｄｉｐｒｅｐとして、Ｐｒｏｍｅｇａ ＰｕｒｅＹｉｅｌｄ（商標）Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｄｉｐｒｅｐ Ｓｙｓｔｅｍを用いて調製した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞をＤＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で増殖させ、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００を用いてベクターでトランスフェクトし、導入遺伝子発現を試験する前に、ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で４８時間インキュベートした。
ＨＥＫ２９３Ｔトランスフェクト細胞への抗ＣＤ３９結合のフローサイトメトリー分析
フローサイトメトリーにより、Ｉ−３９１及びＡ１抗体の用量範囲（１０−２．５−０．６２５−０．１５６３−０．０３９１−０．００９８−０．００２４−０．０００６μｇ／ｍｌ）を２０個の産生突然変異体について試験した。Ｉ−３９１抗体は、ＣＤ３９の突然変異体５への結合を失ったが、他の突然変異体への結合は失わなかった。突然変異体５は、残基Ｑ９６、Ｎ９９、Ｅ１４３及びＲ１４７にアミノ酸置換を含み、突然変異体の残基の１つ以上又は全てがこの抗体のコアエピトープにとって重要であることを示している。抗体Ａ１は、突然変異体７、１６及び１７への結合を失った。突然変異体７は、残基Ａ２７２、Ｎ２７４、Ｉ２７６及びＲ２７８にアミノ酸置換を含み、これらの残基がＡ１のコアエピトープにとって重要であることを示している。突然変異体１６は、残基Ｑ３３２、Ｑ３２３、Ｑ３２６及びＥ３３０にアミノ酸置換を含み、これらの残基がＡ１のコアエピトープにとっても重要であることを示している。突然変異体１７は、残基Ｎ３３３、Ｓ３３５、Ｙ３３６及びＮ３４５にアミノ酸置換を含み、これらの残基がＡ１のコアエピトープにとっても重要であることを示している。
実施例８：Ｘ線回折による抗ＣＤ３９／ＣＤ３９複合体の試験
精製と結晶形成（ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｅｎｅｓｉｓ）
タンパク質生成：タンパク質産生：Ｉ−３９２（配列番号８及び９の親ＶＨ及びＶＬ）のＶＨ及びＶＬ ＣＤＲを有する抗ＣＤ３９抗体を、ヒトＶＨ及びＶＬアクセプターフレームワークの導入によって改変した。この抗体は、ヒトＦｃ受容体への結合を欠くヒトＩｇＧ１として生成され、親Ｉ−３９１抗体についても観察されたように、ＣＤ３９の細胞内インターナライゼーションの誘導なしに、親Ｉ−３９１と同等の効力でＣＤ３９結合及びＡＴＰａｓｅ活性の中和を保持することが見出された。抗体はさらに、ＣＤ３９突然変異体５（実施例７に示す）への結合を失うが、他の突然変異体への結合は失わず、ＣＤ３９と抗体Ｉ−３９１との結合について競合する。各抗体のＶＨ及びＶｋ配列を、それぞれｈｕＩｇＧ１ ＣＨ１定常ドメイン及びｈｕＣｋ定常ドメインを含むベクターにクローニングした。得られた２つのベクターをＣＨＯ細胞株に共トランスフェクトした。確立した細胞プールを使用して、ＣＨＯ培地中でＦａｂ抗体を生成した。ＣＤ３９タンパク質は、標準的な方法を用いてＣＨＯ細胞中で生成された。
タンパク質精製：
抗体Ｆａｂフラグメントを、ニッケルビーズ（Ｎｉ−ＮＴＡ）でのアフィニティークロマトグラフィー、次いでサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により２段階で精製した。
ＣＤ３９／Ｆａｂ複合体を５段階で精製した。まず、精製ＦａｂをＣＤ３９組換えタンパク質培養上澄みに添加して、培養培地に直接複合体を形成させた。複合体は、Ｆａｂ ｈｉｓタグにより、ニッケルビーズ上のアフィニティークロマトグラフィーによって培養上澄みから精製した。次いで、イオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＣ）によってＮｉ−ＮＴＡ精製複合体を遊離Ｆａｂから分離した。抗原グリコシル化の複雑さを低減するために、ＣＤ３９／Ｆａｂ複合体をＰＮＧａｓｅＦで処理した。最後に、脱グリコシル化複合体を第２ＳＥＣによってＰＮＧａｓｅＦから分離し、結晶形成のために約１５ｍｇ／ｍＬに濃縮した。結晶形成は、標準的な結晶形成キット、Ｗｉｚａｒｄ、ＭＤＬ及びＭｏｒｐｈｅｕｓを用いた自動化プロセスによってａｂ Ｆａｂ単独及びＣＤ３９／ｆａｂ複合体に対して別々に実施した。抗ＣＤ３９ Ｆａｂを、０．１Ｍ Ｍｅｓ ｐＨ６．５、１．８Ｍ硫酸アンモニウム緩衝液中で結晶化させた。結晶を３０％グリセロール凍結保護剤で凍結させ、Ｐｒｏｘｉｍａ １ビームラインを用いてＳａｃｌａｙのＳｏｌｅｉｌシンクロトロンで分析した。Ｆａｂ／ＣＤ３９複合体を、０．１Ｍクエン酸塩ｐＨ５．５、２Ｍ硫酸アンモニウムバッファー中で結晶化させた。結晶を２０％グリセロール凍結保護剤で凍結させ、グルノーブルのＩＢＳシンクロトロンで分析した。
Ｆａｂ及びＡｇ／Ａｂ複合体の結晶はそれぞれ２．１４Å及び２．２６Åで回折した。構造は、Ｆａｂのｐｄｂテンプレート及びラットＣＤ３９分子のｐｄｂテンプレートを用いた分子同形置換（ＭＩＲ）によって解決した。
結果
３次元構造は、中和抗ＣＤ３９の標的抗原ＣＤ３９への結合が完全に重鎖可変ドメインに依存することを示した（要約表２；表３；図４）。抗ＣＤ３９抗体軽鎖は抗原と直接接触しない（図４及び図５）。
全部で３７の重鎖残基がＣＤ３９と接している。これらのうち、１１（約３０％）はＫａｂａｔフレームワーク（ＦＲ）残基であり、２６（約７０％）はＫａｂａｔ相補性決定領域（ＣＤＲ）残基である。界面ＦＲ残基のうち７個はＣＤ３９の２９２位におけるアスパラギン残基のグリカンに接触し、４個はＣＤ３９タンパク質と接しているが、全て界面への寄与は小さい。抗原に面する１１個のＦＲ残基のうち、３つは親マウス抗体から保存されなかった（表４参照）。親残基は、非常に保存的な物理化学的性質及び構造を示すヒト残基によって置換された：Ａ６８はＶで置換され、Ｅ７２はＤで置換され、Ａ７２ａはＴで置換された。ＦＲ親界面残基のヒトのものとの置換は、抗原結合活性又は抗体遮断活性に影響を及ぼさなかった。
抗ＣＤ３９軽鎖はＣＤ３９に直接接触しないが、重鎖パラトープの空間的構成において重要な役割を果たすようである。実際、抗ＣＤ３９重鎖は、軽鎖ＣＤＲと強く相互作用する長いＣＤＲ＿Ｈ３を有する（図５；表５）。ＣＤＲ＿Ｈ３は、軽鎖ＣＤＲのすぐ上、抗原とＶＬドメインとの間に位置する。軽鎖ＣＤＲは、ＣＤＲ＿Ｈ３との多数の相互作用を形成する。軽鎖ＣＤＲは、ＣＤＲ＿Ｈ３ループの配向及び配置を駆動し、ＣＤＲ＿Ｈ３ループの柔軟性及び運動を抑制し、ＣＤ３９への結合に間接的に寄与する。興味深いことに、ＣＤＲ＿Ｈ３は、特に多数の芳香族残基（主にチロシン）を有し、これらの芳香族残基は、ＣＤＲ＿Ｈ３がいくつかのＦＲ残基と共に、ＣＤＲ＿Ｈ３及びＣＤ３９に指向したパラトープを形成するＶＬ ＣＤＲ間に捕捉される、軽鎖／ＣＤＲ＿Ｈ３／ＣＤ３９マトリックスを可能にする。マトリックスは、ＣＤＲ＿Ｈ３中の芳香族残基とＶＬ ＣＤＲ及びＣＤ３９中のそれぞれの接触残基との間のいくつかのπ−相互作用によって安定化される。
抗ＣＤ３９重鎖は、ＣＤ３９のＮ末端ドメイン１及びＣＤ３９のＣ末端ドメイン２の両方に結合する）。抗ＣＤ３９結合部位は、２つのＣＤ３９ドメインの尖部及び触媒間隙の入口に位置する（図６；表２；表６）。ＣＤ３９のＮ末端ドメイン１はエピトープ（表６）への主要な寄与を有し、２６の重鎖パラトープ残基の半分（１３）はＣＤ３９−Ｎ末端ドメイン１との直接結合を形成する。対照的に、２つの重鎖パラトープ残基のみがＣＤ３９のＣ末端ドメイン２と直接結合を形成する。代わりに、ＣＤ３９のＣ末端ドメイン２は、Ｎ２９２糖部分及びドメイン尖部及び間隙入口に位置する８個のＡＡ残基によって抗ＣＤ３９抗体と相互作用する（表７）。８アミノ酸残基は、ＣＤＲ（Ｋａｂａｔ ＣＤＲ２中）及びフレームワーク残基（Ｋａｂａｔ ＦＲ１及びＦＲ３の両方中）の両方を含む。
抗ＣＤ３９抗体がＣＤ３９ドメイン１及び２（後者はＮ２９２糖部分を介した結合によって最適化された）の両方に同時に結合するという事実は、抗体がどのようにして酵素活性を遮断するかを説明する可能性が高い。実際に、文献（ＰＤＢデータベース、参照３ＺＸ３）において入手可能な構造データに基づき、ドメイン運動は、基質を加水分解するＣＤ３９の能力に必要な主要パラメータであり得る。さらに、抗ＣＤ３９／ＣＤ３９共結晶複合体から得られたヒトＣＤ３９構造は、２つのドメインの１つの固定された相対的位置に対応する１つの特有の酵素立体配座のみを示す。反対に、ラットＣＤ３９は、単独で結晶化（ｐｄｂエントリー３ＺＸ３）した場合、異なる立体配座（すなわち、ドメイン１及び２のわずかに異なる位置）下に存在する。ヒトＣＤ３９／抗ＣＤ３９凍結立体配座は、ｐｄｂ結晶３ＺＸ３のラットＣＤ３９ Ａ型と完全に重なり合う（図７）。従って、両方のドメインへの抗体の同時結合は、ドメイン運動を阻害し、所定の凍結状態で酵素を遮断する可能性が高い。
実施例９：高い疎水性を有する抗体の安定性を増加させるＦｃ突然変異
実施例８の抗体Ｉ−３９２（Ｉ−３９２のＶＨ及びＶＬ ＣＤＲを有する（ヒトＶＨ及びＶＬアクセプターフレームワークの導入によって改変された配列番号８及び９の親ＶＨ及びＶＬ）は、ＣＤ３９結合を保持しながらヒトＦｃ受容体への結合の減少及び／又は喪失をそれぞれ引き起こす、重鎖定常領域の異なる突然変異を有する様々な異なる突然変異体の中で、ヒトＩｇＧ１として生成した。各抗体のＶＨ及びＶｋ配列を、それぞれｈｕＩｇＧ１ ＣＨ１定常ドメイン及びｈｕＣｋ定常ドメインを含むベクターにクローニングした。得られた２つのベクターをＣＨＯ細胞株に共トランスフェクトした。
全ての抗体は、安定性につき、以下の基準製剤で、およそ７ｍｇ／ｍＬの濃度、ｐＨ６．０で試験した：ヒスチジンバッファー（１０ｍＭ）；スクロース（２００ｍＭ）；ＮａＣｌ（５０ｍＭ）；ポリソルベート８０（ＰＳ８０）（０．２ｇ／Ｌ）。高濃度のＰＳ８０を０．５ｇ／Ｌで別々に試験したが、これは、Ｉ−３９２抗体の巨視的凝集の減少を許容しなかった。従って、この研究では、濃度は０．２ｇ／Ｌに設定される。
製剤の安定性は、２つの保存条件（＋５℃±３℃及び＋４０±３℃）でモニターした。各試験について、３時点で実施した：Ｔ０、Ｔ１５Ｄ（１５日）及びＴ１Ｍ（１ヶ月）。フォーマット比較のために凍結融解（Ｆ／Ｔ）及び熱移動安定性アッセイ（ＴＳＳＡ）を行った。Ｆ／Ｔサイクルを行うために、サンプルを−２０℃で少なくとも２時間凍結し、室温で少なくとも１時間解凍し、Ｆ／Ｔサイクルを３回繰り返し、サンプルを最後の凍結／解凍サイクルの２４時間後に試験する。各時点で、以下の試験を行った：
・粒子状物質（ＭＦＩ）
・目視検査（外観）
・不純物（ＳＥ−ＨＰＬＣ）
・濁度（４００ｎｍ）
・タンパク質濃度（２８０ｎｍ）（Ｎａｎｏｄｒｏｐ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．で実施）
図８に示すように、いくつかの突然変異体は、ヒトＩｇＧ１のＮ２９７Ｑ突然変異体と比較して、より高い凝集温度（ＴＡｇｇ）を示した。凝集温度は、固有の安定性と相関する。ＴＡｇｇがより高いほど、タンパク質の安定性はより高くなる。驚くべきことに、ヒンジに突然変異を有するＦｃドメイン突然変異体は高い安定性を示し、さらにＮ２９７Ｑ突然変異体と比較して抗体の安定性が改善され、さらに親マウス抗体及びヒトＩｇＧ４としての抗体（後者は特に低い安定性（凝集）を示した）と比較して安定性が改善された。Ｋａｂａｔ残基２３４、２３５、２３７、３３０及び／又は３３１（Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ｅ／Ｐ３３１Ｓ置換、Ｌ２３４Ｆ／Ｌ２３５Ｅ／Ｐ３３１Ｓ置換、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ｅ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ３３１Ｓ置換、及びＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ｅ／Ｇ２３７Ａ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ置換）にアミノ酸置換を有するヒトＩｇＧ１アイソタイプのＦｃドメインのそれぞれの安定性は、以下の表に示すように抗体を改善した。従って、このような突然変異は、抗体の薬学的特性及び／又は活性を高め得る。
抗体の安定性を増加させた突然変異Ｆｃドメインのアミノ酸配列を以下に示す：
１．Ｌ２３４Ｆ／Ｌ２３５Ｅ／Ｐ３３１Ｓ突然変異
２．Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ｅ／Ｐ３３１Ｓ突然変異
３．Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ｅ／Ｇ２３７Ａ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ突然変異：
４．Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ｅ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ３３１Ｓ突然変異
Ｉ−３９２は、ＣＤＲに位置するｍＡｂの表面の多数の芳香族アミノ酸残基に起因すると考えられる比較的低い固有の安定性を示す。実施例９に示すように、Ｎ−及びＣ−ドメインの両方に結合し、アロステリック阻害剤として作用するＩ−３９１及びＩ−３９２などの抗体は、そのＣＤＲ中に異常に高い数の芳香族酸残基を有する。これらの芳香族残基は、抗体に対して予測される比較的高い疎水性を付与する。しかしながら、いくつかの残基がＣＤ３９及び／又はＶＨ−ＶＬ相互作用との重要な相互作用に関与していることから、これらの芳香族残基は抗体機能に重要なようであり、おそらく活性の減少又は喪失なしに非芳香族残基で置換することができない。
従って、Ｆｃドメイン置換による高い疎水性を有する抗体の安定性を改善する能力は、それらのＣＤＲ中に高い疎水性及び／又は芳香族残基を有する他の抗体（例えば、重鎖ＣＤＲ３中に複数のチロシンを有する抗ＣＤ３９抗体）に適用可能であり得る。
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要素又は複数の要素と関連するような用語「備える（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」又は「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」を用いた本明細書のあらゆる態様又は実施形態の説明は、本明細書に特に記載がないか、又は本文の内容と明らかに矛盾しない限り、特定の要素又は複数の要素「から構成される」、「からほぼ構成される」、「を実質的に含む」本発明の同様の態様又は実施形態に関する支持を提供することを意図する（例えば、特定の要素を含むものとして本明細書に記載される組成物は、本明細書に特に記載がないか、又は本文の内容と明らかに矛盾しない限り、その要素から構成される組成物を表すものとしても理解すべきである）。
本明細書に記載するあらゆる例、又は例示的語法（例えば、「などの」）は、本発明をより明瞭に説明することを意図するに過ぎず、特に特許請求の範囲に記載のない限り、本発明の範囲に限定を課すものではない。本明細書におけるいかなる言葉も、任意の特許請求の範囲に記載されていない要素が本発明の実施に必須であると示していると解釈すべきではない。

Claims (70)

  1. ＣＤ３９−Ｌ１、−Ｌ２、−Ｌ３又は−Ｌ４ポリペプチドへ結合することなく細胞表面でヒトＣＤ３９（ＮＴＰＤａｓｅ１）に特異的に結合する、細胞表面ＣＤ３９のインターナライゼーションを実質的に誘導又は増加させることなくヒトＣＤ３９（ＮＴＰＤａｓｅ１）のＡＴＰａｓｅ活性を中和することができる抗体であって、前記抗体が実質的にヒトＣＤ１６、ＣＤ３２ａ、ＣＤ３２ｂ及びＣＤ６４ポリペプチドへの結合を欠く、単離された抗体。
  2. ＣＤ３９−Ｌ１、−Ｌ２、−Ｌ３又は−Ｌ４ポリペプチドへ結合することなく細胞表面でヒトＣＤ３９（ＮＴＰＤａｓｅ１）に特異的に結合する、ヒトＣＤ３９（ＮＴＰＤａｓｅ１）のＡＴＰａｓｅ活性を中和することができる抗体であって、前記抗体が実質的にヒトＣＤ１６、ＣＤ３２ａ、ＣＤ３２ｂ及びＣＤ６４ポリペプチドへの結合を欠く、単離された抗体。
  3. 細胞表面でヒトＣＤ３９（ＮＴＰＤａｓｅ１）に特異的に結合する、そのＡＴＰａｓｅ活性を中和することができる抗体であって、前記抗体が実質的にＣＤ３９のインターナライゼーションを誘導又は増加させない、単離された抗体。
  4. 請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗体であって、前記抗体がヒトＣＤ３９ポリペプチドに結合し、その活性を阻害することができ、それぞれがフレームワーク並びにＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む、ＶＨ及びＶＬドメインを含み、前記抗体が、ＣＤ３９のＮ末端ドメイン及びＣＤ３９のＣ末端ドメインに結合することができ、ＣＤ３９に結合したときにＣＤ３９のドメイン運動を制限する、抗体。
  5. 請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗体であって、前記抗体がＣＤ３９に結合するＶＨ及びＶＨのＫａｂａｔ ＣＤＲ３に結合するＶＬを含み、前記ＶＨのＫａｂａｔ ＣＤＲ３が、少なくとも３つ、４つ、５つ、６つ又はそれ以上の芳香族アミノ酸残基を含む、抗体。
  6. 請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗体であって、前記抗体がＫａｂａｔ位置１００ａ〜１００ｆの２つ、３つ、４つ又はそれ以上に存在するアミノ酸残基を含むＶＨＣＤＲ３を含み、任意選択で、前記ＣＤＲ３が少なくとも第１及び第２芳香族アミノ酸残基をＫａｂａｔ位置１００〜１００ｆに含む、抗体。
  7. 請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗体であって、前記抗体がＫａｂａｔ残基２３４、２３５、２３７、３３０及び／又は３３１にアミノ酸置換を有するヒトＩｇＧ１アイソタイプのＦｃドメインを含み、任意選択で前記ＦｃドメインがＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ｅ／Ｐ３３１Ｓ置換、Ｌ２３４Ｆ／Ｌ２３５Ｅ／Ｐ３３１Ｓ置換、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ｅ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ３３１Ｓ置換、又はＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ｅ／Ｇ２３７Ａ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ置換を有する、抗体。
  8. 請求項１〜７のいずれか一項に記載の抗体であって、前記抗体がＶＨ及びＶＬドメインを含み、前記ＶＨが、ＣＤ３９のＮ末端ドメインに結合することができる第１抗原結合ドメイン（任意選択で、ＣＤＲを含む）及びＣＤ３９のＣ末端ドメインのアミノ酸残基に結合することができる第２抗原結合ドメイン（任意選択で、ＣＤＲ及び／又はフレームワークドメインを含む）を含む、抗体。
  9. 請求項１〜８のいずれか一項に記載の抗体であって、ＣＤ３９に結合するＶＨと、ＶＨのＣＤＲ３に結合するＶＬとを含み、ＶＨが以下を含む抗体：
    （ａ）ＣＤ３９のＮ末端ドメインに接触することができ、任意選択で、ＣＤ３９のアミノ酸残基と接触することができるＫａｂａｔ位置３３に、任意選択で位置３１及び３３の両方に、残基を含むＣＤＲ１；
    （ｂ）以下を含むＣＤＲ２−ＦＲ３ドメイン：
    ａ．任意選択で、ＣＤ３９のＮ末端ドメインに接触することができるアミノ酸残基を含むセグメントであって、任意選択でセグメントがＫａｂａｔ位置５０〜５６に残基を含み、任意選択でセグメントがＫａｂａｔ位置５０、５２、５２ａ、５３及び／又は５６に、１、２、３、４個又はそれ以上の（又は全ての）残基を含み、任意選択で位置５３の芳香族残基がアミノ酸残基である、セグメント；
    ｂ．ＣＤ３９のＣ末端ドメインと接触することができるアミノ酸残基を含むセグメントであって、任意選択でセグメントがＫａｂａｔ位置５９〜７１に残基を含み、任意選択でセグメントがＫａｂａｔ位置５９、６５、６７、６８、６９、７０及び／又は７１に１、２、３、４又はそれ以上の（又は全ての）残基を含み、任意選択でセグメントがさらにＫａｂａｔ位置５４に残基を含み、任意選択でＫａｂａｔ位置７２、７２ａ及び／又は７２ｂに残基を含む、セグメント；及び
    （ｃ）ＣＤ３９のＮ末端に接触することができるＣＤＲ３であって、任意選択でＣＤ３９及びＶＬのＮ末端ドメインに接触することができ、任意選択でＣＤ３９のアミノ酸残基と接触することができる第１芳香族アミノ酸残基、及びＶＬのアミノ酸残基と接触することができる第２芳香族アミノ酸残基を含み、任意選択でさらに第１及び第２芳香族残基がＫａｂａｔ位置１００、１００ｂ、１００ｃ、１００ｄ、１００ｅ及び／又は１００ｆのいずれか（残基が特定のＫａｂａｔ位置に存在する範囲で）に存在する、ＣＤＲ３。
  10. 請求項１〜９のいずれか一項に記載の単離された抗体であって、前記抗体が、そのＶＨＣＤＲ３中の複数の表面曝露芳香族アミノ酸残基、及びヒトＦｃγ受容体ＣＤ１６Ａ、ＣＤ１６Ｂ、ＣＤ３２Ａ、ＣＤ３２Ｂ及びＣＤ６４への結合を低減又は消失させるアミノ酸改変を含むＦｃドメインを含み、前記ＦｃドメインがＮ結合グリコシル化を重鎖Ｋａｂａｔ残基２９７に含む、抗体。
  11. 請求項１０に記載の単離された抗体であって、前記抗体がＫａｂａｔ残基２３４、２３５、２３７、３３０及び／又は３３１にアミノ酸置換を有するヒトＩｇＧ１アイソタイプのＦｃドメインを含み、任意選択で前記ＦｃドメインがＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ｅ／Ｐ３３１Ｓ置換、Ｌ２３４Ｆ／Ｌ２３５Ｅ／Ｐ３３１Ｓ置換、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ｅ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ３３１Ｓ置換、又はＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ｅ／Ｇ２３７Ａ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ置換を有する、抗体。
  12. 請求項１〜１１のいずれか一項に記載の組成物であって、前記ＶＨが以下を含む組成物：
    （ａ）ＣＤ３９のＮ末端ドメインに接触することができるＣＤＲ１であって、任意選択で、Ｋａｂａｔ位置３１、３２及び３３の残基が式Ｘ１Ｘ２Ｘ３を有し、Ｘ１は任意のアミノ酸、任意選択でヒスチジン又はアスパラギンを表し、Ｘ２は任意のアミノ酸、任意選択で芳香族残基、任意選択でチロシン、又は任意選択でプロリン又はグリシン以外のアミノ酸残基を表し、Ｘ３はグリシン又は立体障害を回避する別のアミノ酸を表す、ＣＤＲ１；
    （ｂ）ＣＤ３９のＣ末端ドメインに接触することができるＣＤＲ２−ＦＲ３セグメントであって、任意選択でＫａｂａｔ位置５９〜７１の残基は、式Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１３（配列番号１２）を有し、Ｘ１はチロシンを表し、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５及びＸ６の各々はそれぞれ任意のアミノ酸を表し、Ｘ７はグリシン又は抗原結合を低下させる立体障害を導入しない別の残基を表し、Ｘ８は任意のアミノ酸を表し、Ｘ９はフェニルアラニン又はβ−ストランドの位置及びＶＨドメイン構造の完全性を維持することができる別の疎水性残基を表し、Ｘ１０はアラニン又はバリン、又は任意選択でロイシン、任意選択でスレオニン、任意選択で疎水性残基を表し、Ｘ１１はフェニルアラニン又はβ−ストランドの位置及びＶＨドメイン構造の完全性を維持することができる別の疎水性残基（例えば、イソロイシン）を表し、及びＸ１２はセリンを表し、任意選択でさらにＸ１３は任意のアミノ酸、任意選択でロイシン、任意選択でアラニン、バリン、スレオニン又はアルギニンを表し、任意選択でＣＤＲ２−ＦＲ３セグメントはＫａｂａｔ位置７２、７２ａ及び７２ｂに式Ｘ２４Ｘ２５Ｘ２６を有する残基をさらに含み、Ｘ２４はアスパラギン酸、グルタミン酸又はアラニンを表し、Ｘ２５は任意のアミノ酸、任意選択でアラニン又はスレオニンを表し、Ｘ２６はセリン、任意選択でアラニンを表す、ＣＤＲ２−ＦＲ３セグメント；及び
    （ｃ）ＣＤ３９のＮ末端と接触することができるＣＤＲ３であって、任意選択でＫａｂａｔ位置１００〜１００ｆの残基が、残基がこれらの位置に存在する範囲で、式Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５（配列番号１５）（式中、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４及びＸ５のいずれか２つ、３つ又はそれ以上は芳香族アミノ酸を表す）を有するアミノ酸残基の配列を含む、ＣＤＲ３。
  13. 請求項１〜１２のいずれか一項に記載の組成物であって、前記ＶＨがヒトアクセプターフレームワークを含む、組成物。
  14. 請求項１〜１３のいずれか一項に記載の組成物であって、前記ＶＬがヒトアクセプターフレームワーク、並びにＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含み、ここで、少なくとも１つのＣＤＲがＶＨのＣＤＲ３に接触し、任意選択で、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のそれぞれがＶＨのＣＤＲ３に接触する、組成物。
  15. 請求項１〜１４のいずれか一項に記載の組成物であって、前記ＶＬがヒトアクセプターフレームワーク、及び
    ＶＨのＣＤＲ３と接触することができるＫａｂａｔ位置３１、３２、３３及び／又は３４に残基を含むＣＤＲ１；
    ＶＨのＣＤＲ３と接触することができるＫａｂａｔ位置４９に芳香族残基、任意選択でチロシンを含むＦＲ２；
    ＶＨのＣＤＲ３と接触することができるＫａｂａｔ位置５０に残基を含むＣＤＲ２；及び
    ＶＨのＣＤＲ３と接触することができるＫａｂａｔ位置８９及び／又は９１に残基を含むＣＤＲ３、を含む、組成物。
  16. 請求項１〜１５のいずれか一項に記載の組成物であって、前記ＶＬがヒトアクセプターフレームワーク、及び
    ＣＤＲ１であって、Ｋａｂａｔ位置３１、３２、３３及び３４の残基が、（ａ）式ＴＸ１ＶＡ（式中、Ｘ１はアラニン若しくはアスパラギン又はその保存的置換を表す）；又は（ｂ）式ＳＹＸ１Ｘ２（式中、Ｘ１は疎水性残基（例えばフェニルアラニン、イソロイシン、バリン）を表し、Ｘ２は任意のアミノ酸、任意選択でヒスチジン、セリン若しくはアラニン又はその保存的置換を表す）を有するＣＤＲ１、
    Ｋａｂａｔ位置４９に芳香族残基、任意選択でチロシンを含むＦＲ２；
    Ｋａｂａｔ位置５０の残基がセリン、リシン若しくはスレオニン又はその保存的置換であるＣＤＲ２；及び
    グルタミン又はヒスチジンがＫａｂａｔ位置８９及び／又は９０に存在し、Ｋａｂａｔ位置９１の残基がチロシン、スレオニン若しくはヒスチジン又はその保存的置換であり、任意選択で位置９５の残基がプロリン又はその保存的置換であり、任意選択で位置９６の残基が芳香族残基、任意選択でチロシン若しくはフェニルアラニン又はその保存的置換である、ＣＤＲ３。
  17. 請求項１５又は１６に記載の組成物であって、前記ＶＬがＶＨのＣＤＲ３と接触することができるＫａｂａｔ ＦＲ３位置９４、９５、９６及び／又は９７に残基を含む、組成物。
  18. 抗体ＶＨ及びＶＬ、任意選択で、ヒトＣＤ３９の１つ以上の分泌されたアイソフォームに結合することなく、膜結合ヒト「血管」ＣＤ３９に細胞表面で特異的に結合する抗体を含み、前記抗体が「血管」ＣＤ３９のＡＴＰａｓｅ活性を中和することができる、結合分子又はその抗原結合フラグメント。
  19. 請求項１〜１８のいずれか一項に記載の化合物又は抗体であって、前記化合物又は抗体が分泌されたＣＤ３９アイソフォームＬ２又はＬ４に結合せず、及び／又は前記化合物又は抗体が膜結合ＣＤ３９アイソフォームＬ１又はＬ３に結合しない、化合物又は抗体。
  20. ヒトＣＤ３９の１つ以上（又は全て）の分泌されたアイソフォームＬ１、Ｌ２、Ｌ３又はＬ４に結合することなく、ヒトＣＤ３９（ＮＴＰＤａｓｅ１）の血管アイソフォームに特異的に結合する化合物、任意選択で抗体、であって、前記抗体がヒトＣＤ３９の血管アイソフォームのＡＴＰａｓｅ活性を中和することができる、化合物。
  21. ヒトＣＤ３９（ＮＴＰＤａｓｅ１）に特異的に結合し、ＣＤ３９のＡＴＰａｓｅ活性を中和することができる単離された抗体であって、前記抗体が実質的にヒトＣＤ１６、ＣＤ３２ａ、ＣＤ３２ｂ及びＣＤ６４ポリペプチドへのＦｃドメインを介した結合を欠く、抗体。
  22. 請求項１〜２１のいずれか一項に記載の単離された抗体であって、前記ＣＤ３９（ＮＴＰＤａｓｅ１）又は血管ＣＤ３９が配列番号１のアミノ酸配列を有する、抗体。
  23. 請求項２〜２２に記載の単離された抗体であって、ＣＤ３９ポリペプチドの細胞内インターナライゼーションを誘導又は増加させることなく、前記抗体がヒトＣＤ３９ポリペプチドに特異的に結合するモノクローナル抗体である、抗体。
  24. 請求項１〜２３のいずれか一項に記載の単離された抗体であって、前記抗体がＦｃドメインを含み、任意選択で前記Ｆｃドメインが、ヒトＦｃγ受容体ＣＤ１６Ａ、ＣＤ１６Ｂ、ＣＤ３２Ａ、ＣＤ３２Ｂ及び／又はＣＤ６４の１つ以上又は全てへの低減又は消失された結合を有する、野生型Ｆｃドメインと比較したアミノ酸改変を含む、抗体。
  25. 前記抗体が全長抗体である、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の単離された抗体。
  26. 前記抗体が、Ｂ細胞による細胞外ＡＴＰａｓｅ活性において少なくとも８０％の減少を生じ得る、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の単離された抗体。
  27. 請求項１〜２６のいずれか１項に記載の単離された抗体であって、前記抗体が細胞ＣＤ３９のＡＴＰａｓｅ活性の中和について、１μｇ／ｍｌ以下のＥＣ５０を特徴とし、ＣＤ３９の酵素活性の中和が、ＡＴＰのＡＭＰへの加水分解を定量することによりＲＡＭＯＳ細胞におけるＡＴＰａｓｅ活性の中和を評価することによって決定される、抗体。
  28. 請求項１〜２７のいずれか一項に記載の単離された抗体であって、前記抗体が、その表面に配列番号１のアミノ酸配列を有するＣＤ３９ポリペプチドを発現する細胞への結合について、２μｇ／ｍｌ以下、任意選択で１μｇ／ｍｌ以下、０．５μｇ／ｍｌ以下、０．１μｇ／ｍｌ以下の、フローサイトメトリーによって決定されるＥＣ５０を特徴とする、抗体。
  29. 前記抗体が、ヒト膜結合ＣＤ３９ポリペプチドのＡＴＰａｓｅ活性において、７０％以上、任意選択で８０％以上の減少を生じ得る、請求項１〜２８のいずれか１項に記載の単離された抗体。
  30. 以下：
    ａ）細胞表面で発現するヒト「血管」ＣＤ３９ポリペプチドのＡＴＰａｓｅ活性に高親和性を持って特異的に結合し、及び／又は前記活性を中和すること；
    ｂ）溶液中のヒトＣＤ３９ポリペプチドのＡＴＰａｓｅ活性を中和すること；
    ｃ）抗体−ＣＤ３９複合体の下方制御及び／又はインターナライゼーションを誘導又は増加させないこと；
    ｄ）任意選択で、可溶性ヒトＣＤ３９ポリペプチドに結合せず、任意選択で前記可溶性ＣＤ３９ポリペプチドがＬ２及び／又はＬ４アイソフォームであること；及び
    ｅ）ＣＤ１６ヒトＦｃγ受容体に特異的に結合（例えば、そのＦｃドメインを介して）せず、任意選択で、ヒトＣＤ１６Ａ、ＣＤ１６Ｂ、ＣＤ３２Ａ、ＣＤ３２Ｂ及び／又はＣＤ６４に特異的に結合しないこと
    によって特徴付けられる単離されたモノクローナル抗体。
  31. 請求項３０に記載の単離された抗体であって、前記抗体がヒトＣＤ３９Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３又はＬ４ポリペプチドに結合しない、抗体。
  32. 請求項１〜３１のいずれか一項に記載の単離された抗体であって、前記抗体が、抗体Ｉ−３９１の重鎖及び軽鎖ＣＤＲ、又は重鎖及び軽鎖可変領域と、配列番号１のＣＤ３９ポリペプチドへの結合について競合する、抗体。
  33. 抗体Ｉ−３９１の重鎖及び軽鎖ＣＤＲ、又は重鎖及び軽鎖可変領域と、配列番号１のＣＤ３９ポリペプチドへの結合について競合し、ヒトＣＤ３９ポリペプチドのＡＴＰａｓｅ活性を中和する抗体であって、前記抗体がＦｃドメインを欠き、又はヒトＣＤ１６への結合を欠くヒトＦｃドメインを含み、任意選択で、前記Ｆｃドメインが、ヒトＣＤ１６Ａ、ＣＤ１６Ｂ、ＣＤ３２Ａ、ＣＤ３２Ｂ及び／又はＣＤ６４への結合を低減するアミノ酸改変を含み、任意選択で、さらに前記Ｆｃドメインが、Ｋａｂａｔ残基Ｎ２９７におけるＮ結合グリコシル化を含む、抗体。
  34. 請求項３３に記載の抗体であって、前記抗体が複数の、任意選択で３つ、４つ、５つ、６つ又は７つの芳香族アミノ酸残基を含むＶＨＣＤ３を含む、抗体。
  35. 請求項１８〜３４のいずれか一項に記載の抗体であって、前記抗体がヒトＣＤ３９ポリペプチドに結合し、その活性を阻害することができ、それぞれがフレームワーク並びにＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む、ＶＨ及びＶＬドメインを含み、前記抗体が、ＣＤ３９のＮ末端ドメイン及びＣＤ３９のＣ末端ドメインに結合することができ、ＣＤ３９に結合したときにＣＤ３９のドメイン運動を制限する、抗体。
  36. 請求項１〜３５のいずれか一項に記載の抗体であって、前記抗体がＶＨ及びＶＬを含み、前記ＶＨは、式Ｉのアミノ酸配列を含み：
    ［ＦＲ１］ＣＤＲ１［ＦＲ２］ＣＤＲ２［ＦＲ３］ＣＤＲ３［ＦＲ４］ （式Ｉ）
    （式中、［ＦＲ１］、［ＦＲ２］、［ＦＲ３］及び［ＦＲ４］はヒトＶＨフレームワーク領域を表し、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３はＶＨＣＤＲを表し：
    ＣＤＲ１は、任意選択で、ＣＤ３９のＮ末端ドメインに接触することができる、Ｋａｂａｔ位置３１及び／又は３３の残基を含み、
    ＣＤＲ２は、ＣＤ３９と接触することができる残基、任意選択でＣＤ３９のＮ末端ドメインを含み、任意選択でＫａｂａｔ位置５０、５２、５２ａ、５３及び５６のうち２つ、３つ、４つ又は５つは、任意選択でＮ末端ドメインにおいて、ＣＤ３９に接触することができ、任意選択で位置５３の残基が芳香環、任意選択でチロシンを含み、任意選択でさらにＫａｂａｔ ＣＤＲ２中の残基（例えば、Ｋａｂａｔ位置５７、５９及び／又は６５のうちの１つ、２つ又は３つ）は、Ｋａｂａｔ ＦＲ３中の残基（例えば、Ｋａｂａｔ位置６７、６８、６９、７０及び／又は７１のうちの１つ、２つ又は３つ）と組み合わせて、ＣＤ３９のＣ末端ドメインと接触することができ、
    ＣＤＲ３は、任意選択でＣＤ３９のＮ末端ドメインに、ＣＤ３９と接触することができる芳香族残基を含み、任意選択でＣＤ３ＲはＶＬと接触することができる芳香族残基をさらに含み、任意選択で芳香族残基がＫａｂａｔ位置１００、１００ｂ、１００ｃ、１００ｄ、１００ｅ及び／又は１００ｆのいずれか（残基が特定のＫａｂａｔ位置に存在する範囲で）に存在し、任意選択でＶＬと接触することができる芳香族残基はチロシン又はフェニルアラニンであり、任意選択でＣＤ３９と接触することができる芳香族残基はチロシン又はフェニルアラニンであり）；及び
    ＶＬは、式ＩＩのアミノ酸配列を含む：
    ［ＦＲ１］ＣＤＲ１［ＦＲ２］ＣＤＲ２［ＦＲ３］ＣＤＲ３［ＦＲ４］ （式ＩＩ）
    （式中、［ＦＲ１］、［ＦＲ２］、［ＦＲ３］及び［ＦＲ４］はヒトＶＬフレームワーク領域を表し、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３はＶＬＣＤＲを表し：
    ＣＤＲ１は、任意選択でＶＨのＣＤＲ３と接触することができるＫａｂａｔ位置３１、３２、３３及び／又は３４に、残基を含み；
    ＦＲ２は残基、任意選択でＶＨのＣＤＲ３に接触することができるＫａｂａｔ位置４９の芳香族残基を含み；及び
    ＣＤＲ３は、任意選択でＶＨのＣＤＲ３と接触することができるＫａｂａｔ位置８９及び／又は９１に、残基を含む）、抗体。
  37. 請求項１〜３６のいずれか一項に記載の抗体であって、ＣＤ３９に結合するＶＨと、ＶＨのＣＤＲ３に結合するＶＬとを含み、ＶＨが以下を含む抗体：
    （ａ）ＣＤ３９のＮ末端ドメインに接触することができ、任意選択で、ＣＤ３９のアミノ酸残基と接触することができるＫａｂａｔ位置３３に、任意選択で位置３１及び３３の両方に、残基を含むＣＤＲ１；
    （ｂ）以下を含むＣＤＲ２−ＦＲ３ドメイン：
    ｉ．ＣＤ３９のＮ末端ドメインに接触することができるアミノ酸残基を含むセグメントであって、任意選択でセグメントがＫａｂａｔ位置５０〜５６に残基を含み、任意選択でセグメントがＫａｂａｔ位置５０、５２、５２ａ、５３及び／又は５６に、１、２、３、４個又はそれ以上の（又は全ての）残基を含み、任意選択で位置５３の芳香族残基がアミノ酸残基である、セグメント；
    ｉｉ．ＣＤ３９のＣ末端ドメインと接触することができるアミノ酸残基を含むセグメントであって、任意選択でセグメントがＫａｂａｔ位置５９〜７１に残基を含み、任意選択でセグメントがＫａｂａｔ位置５９、６５、６７、６８、６９、７０及び／又は７１に１、２、３、４又はそれ以上の（又は全ての）残基を含み、任意選択でセグメントがさらにＫａｂａｔ位置５４に残基を含み、任意選択でＫａｂａｔ位置７２、７２ａ及び／又は７２ｂに残基を含む、セグメント；及び
    （ｃ）ＣＤ３９のＮ末端に接触することができるＣＤＲ３（例えば、Ｋａｂａｔによる）であって、任意選択でＣＤ３９及びＶＬのＮ末端ドメインに接触することができ、任意選択でＣＤ３９のアミノ酸残基と接触することができる第１芳香族アミノ酸残基、及びＶＬのアミノ酸残基と接触することができる第２芳香族アミノ酸残基を含み、任意選択でさらに第１及び第２芳香族残基がＫａｂａｔ位置１００、１００ｂ、１００ｃ、１００ｄ、１００ｅ及び／又は１００ｆのいずれか（残基が特定のＫａｂａｔ位置に存在する範囲で）に存在する、ＣＤＲ３。
  38. 請求項１〜３７のいずれか一項に記載の組成物であって、前記ＶＨが以下を含む組成物：
    （ａ）ＣＤ３９のＮ末端ドメインに接触することができるＣＤＲ１であって、任意選択で、Ｋａｂａｔ位置３１、３２及び３３の残基が式Ｘ１Ｘ２Ｘ３を有し、Ｘ１は任意のアミノ酸、任意選択でヒスチジン又はアスパラギンを表し、Ｘ２は任意のアミノ酸、任意選択で芳香族残基、任意選択でチロシン、又は任意選択でプロリン又はグリシン以外のアミノ酸残基を表し、Ｘ３はグリシン又は立体障害を回避する別のアミノ酸を表す、ＣＤＲ１；
    （ｂ）ＣＤ３９のＣ末端ドメインに接触することができるＣＤＲ２−ＦＲ３セグメントであって、任意選択でＫａｂａｔ位置５０〜７１の残基は、式Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１３Ｘ１４Ｘ１５Ｘ１６Ｘ１７Ｘ１８Ｘ１９Ｘ２０Ｘ２１Ｘ２２Ｘ２３（配列番号１４）を有し、Ｘ１はトリプトファンを表し、Ｘ２は任意のアミノ酸、任意選択でイソロイシンを表し、Ｘ３はアスパラギン又は任意選択でグルタミンを表し、Ｘ４はスレオニンを表し、Ｘ５は任意のアミノ酸、任意選択でチロシン又は任意選択でフェニルアラニンを表し、Ｘ６は任意のアミノ酸、任意選択でスレオニン、任意選択でセリン、任意選択でアスパラギン、アラニン又はグリシン、任意選択で大きな残基又は疎水性残基以外の残基を表し、Ｘ７は任意のアミノ酸、任意選択でグリシン、任意選択でアラニン、セリン、スレオニン、アスパラギン又はグルタミン、任意選択でアスパラギン酸又はグルタミン酸以外の残基、任意選択でリシン又はアルギニン以外の残基を表し、Ｘ８はグルタミン酸、任意選択でアスパラギン酸を表し、Ｘ９は任意のアミノ酸、任意選択でプロリンを表し、Ｘ１０は任意のアミノ酸、任意選択でスレオニン、任意選択でセリン、アスパラギン、グルタミン、ヒスチジン、グルタミン酸、アスパラギン酸、アルギニン、リシン、アラニン又はチロシン、任意選択で疎水性残基又はプロリン以外の任意の残基を表し、Ｘ１１はチロシンを表し、Ｘ１２、Ｘ１３、Ｘ１４、Ｘ１５及びＸ１６の各々はそれぞれ任意のアミノ酸を表し、Ｘ１７はグリシン又は抗原結合を低下させる立体障害を導入しない別の残基を表し、Ｘ１８は任意のアミノ酸、任意選択でアルギニンを表し、Ｘ１９はフェニルアラニン又はβ−ストランドの位置及びＶＨドメイン構造の完全性を維持することができる別の疎水性残基を表し、Ｘ２０はアラニン又はバリン、任意選択でロイシン、任意選択で疎水性残基を表し、Ｘ２１はフェニルアラニン又はβ−ストランドの位置及びＶＨドメイン構造の完全性を維持することができる別の疎水性残基を表し、及びＸ２２はセリンを表し、任意選択でさらにＸ２３は任意のアミノ酸、任意選択でロイシン、任意選択でアラニン、バリン又はスレオニンを表し、任意選択でＣＤＲ２−ＦＲ３セグメントはＫａｂａｔ位置７２、７２ａ及び７２ｂに式Ｘ２４Ｘ２５Ｘ２６を有する残基をさらに含み、Ｘ２４はアスパラギン酸、グルタミン酸又はアラニンを表し、Ｘ２５は任意のアミノ酸、任意選択でアラニン又はスレオニンを表し、Ｘ２６はセリン、任意選択でアラニンを表す、ＣＤＲ２−ＦＲ３セグメント；及び
    （ｃ）ＣＤ３９のＮ末端と接触することができ、任意選択でＣＤ３９及びＶＬのＮ末端ドメインと接触することができる、ＣＤＲ３であって、任意選択で、Ｋａｂａｔ位置９５〜１０２の残基は、式Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１３Ｘ１４（配列番号１６）を有し、
    − Ｘ１はアルギニン又はリシンを表し、
    − Ｘ２は任意のアミノ酸、任意選択でアルギニン、任意選択でリシン又はアラニンを表し、
    − Ｘ３は任意のアミノ酸残基、任意選択で芳香環を含む残基、任意選択でチロシンを表し、
    − Ｘ４は任意のアミノ酸、任意選択でグルタミン酸若しくはチロシン、又はプロリン若しくはグリシン以外のアミノ酸残基を表し、
    − Ｘ５はグリシン、任意選択でアルギニンを表し、
    − Ｘ６は任意のアミノ酸、任意選択でアスパラギン、セリン又はチロシンを表し、
    − Ｘ７は任意のアミノ酸、任意選択でチロシン、任意選択でアスパラギン若しくはアスパラギン酸、任意選択でプロリン若しくはグリシン以外のアミノ酸残基を表し、
    − Ｘ８はバリン又は任意選択でアラニン、イソロイシン若しくはロイシン、任意選択で芳香族アミノ酸、任意選択でチロシンを表し、
    − Ｘ９は任意のアミノ酸、任意選択で芳香族アミノ酸、任意選択でフェニルアラニン、任意選択でチロシン、任意選択でバリンを表し、
    − Ｘ１０はチロシン、任意選択でフェニルアラニン、任意選択でメチオニンを表し、
    − Ｘ１１は存在しないか又は任意のアミノ酸、任意選択でチロシン、任意選択でトリプトファン、任意選択でＰ、Ｇ、Ｅ若しくはＤ以外、若しくは小さな疎水性残基（例えば、Ｔ、Ｓ）以外のアミノ酸残基を表し、
    − Ｘ１２は存在しないか又は任意のアミノ酸、任意選択でフェニルアラニンを表し、
    − Ｘ１３は任意のアミノ酸、任意選択でアスパラギン酸、任意選択でセリン、任意選択でスレオニン、任意選択でグルタミン酸、任意選択でアスパラギン、任意選択で大きな疎水性残基以外の残基を表し、及び
    − Ｘ１４は任意のアミノ酸、任意選択でチロシン、任意選択で芳香族アミノ酸、任意選択で非芳香族アミノ酸を表す、ＣＤＲ３。
  39. 請求項１〜３８のいずれか一項に記載の組成物であって、前記ＶＨがヒトアクセプターフレームワークを含む、組成物。
  40. ＶＨ及びＶＬドメインを含むモノクローナル抗体であって、前記ＶＬがヒトアクセプターフレームワーク、並びにＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含み、ここで少なくとも１つのＣＤＲがＶＨのＣＤＲ３に接触し、任意選択で、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のそれぞれがＶＨのＣＤＲ３に接触する、抗体。
  41. 請求項１〜４０のいずれか一項に記載の組成物であって、前記ＶＬがヒトアクセプターフレームワーク、及び
    ＶＨのＣＤＲ３と接触することができるＫａｂａｔ位置３１、３２、３３及び／又は３４に残基を含むＣＤＲ１；
    ＶＨのＣＤＲ３と接触することができるＫａｂａｔ位置４９に芳香族残基、任意選択でチロシンを含むＦＲ２；
    ＶＨのＣＤＲ３と接触することができるＫａｂａｔ位置５０に残基を含むＣＤＲ２；及び
    ＶＨのＣＤＲ３と接触することができるＫａｂａｔ位置８９及び／又は９１に残基を含むＣＤＲ３、を含む、組成物。
  42. 請求項４１に記載の組成物であって、前記ＶＬがヒトアクセプターフレームワーク、及び
    ＣＤＲ１であって、Ｋａｂａｔ位置３１、３２、３３及び３４の残基が、（ａ）式ＴＸ１ＶＡ（式中、Ｘ１はアラニン若しくはアスパラギン又はその保存的置換を表す）；又は（ｂ）式ＳＹＸ１Ｘ２（式中、Ｘ１は疎水性残基（例えばフェニルアラニン、イソロイシン、バリン）を表し、Ｘ２は任意のアミノ酸、任意選択でヒスチジン、セリン若しくはアラニン又はその保存的置換を表す）を有するＣＤＲ１；
    Ｋａｂａｔ位置４９に芳香族残基、任意選択でチロシンを含むＦＲ２；
    Ｋａｂａｔ位置５０の残基がセリン若しくはスレオニン又はその保存的置換であるＣＤＲ２；及び
    グルタミン又はヒスチジンがＫａｂａｔ位置８９及び／又は９０に存在し、Ｋａｂａｔ位置９１の残基がチロシン、スレオニン若しくはヒスチジン又はその保存的置換であり、任意選択で位置９５の残基がプロリン又はその保存的置換であり、任意選択で位置９６の残基が芳香族残基、任意選択でチロシン若しくはフェニルアラニン又はその保存的置換である、ＣＤＲ３
    を含む、組成物。
  43. 請求項１〜４２のいずれか一項に記載の単離された抗体であって、前記抗体が、Ｑ９６、Ｎ９９、Ｅ１４３及びＲ１４７（配列番号１に関する）からなる群から選択されるアミノ酸残基を含むＣＤ３９上のエピトープに結合する、抗体。
  44. 請求項１〜４３のいずれか一項に記載の単離された抗体であって、前記抗体は、Ｑ９６、Ｎ９９、Ｅ１４３及びＲ１４７（配列番号１に関する）から選択される１つ、２つ、３つ又は４つの残基の突然変異を含む、突然変異体ＣＤ３９ポリペプチドとの、それぞれ抗体と配列番号１のアミノ酸配列を含む野生型ＣＤ３９ポリペプチドとの結合と比較して、低減された結合を有する、抗体。
  45. 前記抗体が、ネイキッド抗体、任意選択で細胞毒性物質に結合していない抗体である、請求項１〜４４のいずれか一項に記載の抗体。
  46. 前記抗体が抗体フラグメント、任意選択でＦｃドメインを欠く抗体フラグメントである、請求項１〜４５のいずれか一項に記載の抗体。
  47. 前記抗体が、ＦｃドメインとヒトＦｃγ受容体との間の結合を減少させるように改変されたヒトＦｃドメインを有する抗体である、請求項１〜４６のいずれか一項に記載の抗体。
  48. 前記抗体が、ＣＤ３９ポリペプチドへの結合について、１０−９Ｍ未満のＫＤを有する、請求項１〜４７のいずれか１項に記載の抗体。
  49. ＶＨ及びＦｃドメインを含むモノクローナル抗体であって、ＶＨが複数の芳香族アミノ酸残基、任意選択で３つ、４つ、５つ、６つ又は７つの芳香族アミノ酸残基を含む、ＣＤＲを含み、前記Ｆｃドメインが、Ｋａｂａｔ残基Ｎ２９７におけるＮ結合グリコシル化を含み、Ｋａｂａｔ残基２３４及び２３５、任意選択でさらにＫａｂａｔ残基３３１、任意選択でＫａｂａｔ残基２３４、２３５、２３７及びＫａｂａｔ残基３３０及び／又は３３１にアミノ酸置換を含む、改変ヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインを含み、任意選択で前記ＦｃドメインがＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ｅ／Ｐ３３１Ｓ置換、Ｌ２３４Ｆ／Ｌ２３５Ｅ／Ｐ３３１Ｓ置換、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ｅ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ３３１Ｓ置換、又はＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ｅ／Ｇ２３７Ａ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ置換を有する、抗体。
  50. 請求項１〜４９のいずれか１項に記載の抗体と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
  51. 任意選択で、請求項１〜５０のいずれか１項に記載の抗体を特異的に認識する標識二次抗体をさらに含む、請求項１〜５０のいずれか１項に記載の抗体を含むキット。
  52. 請求項１〜４９のいずれか一項の抗体の重鎖及び／又は軽鎖をコードする核酸。
  53. 請求項１〜４９のいずれか１項に記載の抗体を生成する組換え宿主細胞。
  54. それを必要とする患者において疾患を治療又は予防するための方法であって、前記方法が、請求項１〜４９のいずれか一項に記載の抗体又は請求項５０に記載の組成物の有効量を前記患者に投与することを含む、方法。
  55. 前記疾患が癌である、請求項５４に記載の方法。
  56. それを必要とする患者における癌の治療又は予防のための方法であって、前記方法が前記患者にヒトＣＤ３９に細胞表面で結合し、そのＡＴＰａｓｅ活性を中和することができる、抗体の有効量を投与することを含み、前記抗体が、ＦｃドメインとＦｃγ受容体との間の結合を減少させるように改変されたＦｃドメインを含む、方法。
  57. 請求項５６に記載の方法であって、前記抗体が、複数の芳香族アミノ酸残基、任意選択で３つ、４つ、５つ、６つ又は７つの芳香族アミノ酸残基、任意選択で３つ、４つ又はそれ以上のチロシンを含むＣＤＲを含むＶＨを含み、前記Ｆｃドメインが、Ｋａｂａｔ残基Ｎ２９７におけるＮ結合グリコシル化を含み、Ｋａｂａｔ残基２３４及び２３５、任意選択でさらにＫａｂａｔ残基３３１、任意選択でＫａｂａｔ残基２３４、２３５、２３７及びＫａｂａｔ残基３３０及び／又は３３１にアミノ酸置換を含む、改変ヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインを含み、任意選択で前記ＦｃドメインがＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ｅ／Ｐ３３１Ｓ置換、Ｌ２３４Ｆ／Ｌ２３５Ｅ／Ｐ３３１Ｓ置換、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ｅ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ３３１Ｓ置換、又はＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ｅ／Ｇ２３７Ａ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ置換を有する、方法。
  58. 癌を有する対象におけるＴ、ＮＫ及び／又はＢ細胞活性を増加させ、及び／又は対象におけるＴ、ＮＫ及び／又はＢ細胞活性のアデノシン媒介阻害を緩和するための方法であって、前記方法が、前記対象に、請求項１〜４９のいずれかに記載の抗体又は請求項５０に記載の組成物の有効量を投与することを含む、方法。
  59. 個体における癌を治療する方法であって、前記方法が、請求項１〜４９のいずれか一項に記載の抗体又は請求項５０に記載の組成物の有効量を、ヒトＰＤ−１の阻害活性を中和する抗体と組み合わせて、前記個体に投与することを含む、方法。
  60. ヒトＰＤ−１の阻害活性を中和する抗体による治療に対する応答につき予後不良を有する、又は以前にヒトＰＤ−１の阻害活性を中和する抗体による治療を受けたことのある個体において癌を治療する方法であって、前記方法が、請求項１〜４９のいずれか一項に記載の抗体又は請求項５０に記載の組成物の有効量を、前記個体に投与することを含む、方法。
  61. 請求項６０に記載の方法であって、前記方法が、請求項１〜４９のいずれか一項に記載の抗体又は請求項５０に記載の組成物の有効量を、ヒトＰＤ−１の阻害活性を中和する抗体と組み合わせて、前記個体に投与することを含む、方法。
  62. それを必要とする個体における癌の治療又は予防方法であって、以下：
    ａ）循環中又は腫瘍環境中のＣＤ３９発現細胞を検出すること、及び
    ｂ）ＣＤ３９発現細胞が、任意選択で基準レベルと比較して増加したレベルで、循環又は腫瘍環境に含まれるとの決定を受けて、個体に請求項１〜４９のいずれか一項に記載の抗体又は請求項５０に記載の組成物を投与すること
    を含む方法。
  63. 請求項６２に記載の方法であって、循環中又は腫瘍環境中のＣＤ３９発現細胞を検出することが、個体から、癌組織及び／又は癌隣接組織を含む生物学的サンプルを得ること、前記細胞をＣＤ３９ポリペプチドに結合する抗体と接触させること、及びＣＤ３９を発現する細胞を検出することを含む、方法。
  64. 請求項５４〜６３のいずれか一項に記載の方法であって、ＣＤ３９の酵素活性の中和について少なくともＥＣ５０に対応する血液（血清）及び／又は腫瘍組織中の濃度を達成及び／又は維持するのに有効な量で、前記抗ＣＤ３９抗体を少なくとも１回投与する、方法。
  65. 請求項１〜６４のいずれか一項に記載の方法であって、ＣＤ３９発現細胞、任意選択的にＢ細胞、任意選択的にＲａｍｏｓ細胞のＡＴＰａｓｅの中和を評価することによって、ＣＤ３９発現細胞が抗ＣＤ３９抗体とインキュベートされる場合、産生ＡＭＰの減少を定量することによって、ＣＤ３９の酵素活性の中和が決定される、方法。
  66. 前記腫瘍又は癌が固形腫瘍である、請求項５４〜６５のいずれか一項に記載の方法。
  67. 請求項５０〜６６のいずれか一項に記載の方法であって、前記腫瘍又は癌が白血病、膀胱癌、神経膠腫、神経膠芽腫、卵巣癌、黒色腫、前立腺癌、甲状腺癌、食道癌又は乳癌である、方法。
  68. ＣＤ３９細胞表面発現の下方制御を誘導又は増加させることなくＣＤ３９の酵素活性に結合して中和する抗体を生成又は試験する方法であって、以下のステップ：
    （ａ）ＣＤ３９ポリペプチドに結合する複数の抗体を提供すること、
    （ｂ）前記抗体の各々をＣＤ３９発現細胞、任意選択でヒトＢ細胞、任意選択でＲａｍｏｓヒトリンパ腫細胞と接触させること；
    （ｃ）産生ＡＭＰの減少がＡＴＰａｓｅ活性の中和を示す、質量分析によりＡＭＰの生成を評価すること；及び
    （ｄ）少なくとも７０％、任意選択で８０％、又は任意選択で９０％の産生ＡＭＰの減少を生じる抗体を選択すること
    を含む方法。
  69. ＣＤ３９細胞表面発現の下方制御を誘導又は増加させることなくＣＤ３９の酵素活性に結合して中和する抗体を生成又は試験する方法（任意選択で、癌の治療における使用のための方法）であって、以下のステップ：
    （ａ）ＣＤ３９ポリペプチドに結合する複数の抗体を提供すること、
    （ｂ）前記抗体のそれぞれを、Ｑ９６、Ｎ９９、Ｅ１４３及びＲ１４７（配列番号１に関する）から選択される１つ、２つ、３つ又は４つの残基の突然変異を含む、突然変異型ＣＤ３９ポリペプチドと接触させること、及び抗体と配列番号１のアミノ酸配列を含む野生型ＣＤ３９ポリペプチドとの結合と比較して、抗体と突然変異型ＣＤ３９ポリペプチドとの結合を評価すること、並びに
    （ｃ）抗体と配列番号１のアミノ酸を含む野生型ＣＤ３９ポリペプチドとの間の結合と比較して、突然変異型ＣＤ３９ポリペプチドへの結合が減少した抗体を選択すること
    を含む方法。
  70. 請求項６９に記載の方法であって、以下のステップ：
    （ａ）請求項６９に記載のステップ（ｃ）で選択された各抗体をＣＤ３９発現細胞、任意選択でヒトＢ細胞、任意選択でＲａｍｏｓヒトリンパ腫細胞と接触させること；
    （ｂ）産生ＡＭＰの減少がＡＴＰａｓｅ活性の中和を示す、質量分析によりＡＭＰの生成を評価すること；及び
    （ｃ）少なくとも７０％、任意選択で８０％、又は任意選択で９０％の産生ＡＭＰの減少を生じる抗体を選択すること
    をさらに含む、方法。
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