JP2019536734A - ヘテロダイマーＦｃ融合サイトカインおよびそれを含む医薬組成物 - Google Patents

Abstract

本発明は、ヘテロダイマーＦｃ融合タンパク質、およびヘテロダイマーＦｃ融合タンパク質を含む医薬組成物に関し、このヘテロダイマーＦｃ融合タンパク質は、免疫グロブリンのＦｃ領域対の第１のＦｃ領域および第２のＦｃ領域を含み、一方生物活性タンパク質のサブユニットは、第１のＦｃ領域および／または第２のＦｃ領域のＮ末端またはＣ末端の少なくとも１つに結合され、第１のＦｃ領域および第２のＦｃ領域は、ヘテロダイマーの形成を促進するように改変される。本発明によるヘテロダイマーＦｃ融合タンパク質において、２つまたはそれより多くのサブユニットは、生物活性タンパク質を構成するタンパク質が、天然に存在するときの元の形状および構造でＦｃに融合され得、それによりこのタンパク質が、天然に存在するときの元の活性を維持し得るようにタンパク質複合体を形成する。

Description

本発明は、免疫グロブリンＦｃ対の第１のＦｃ領域および第２のＦｃ領域ならびに生理活性タンパク質を含むヘテロダイマーＦｃ融合タンパク質であって、生理活性タンパク質の１つまたは複数のサブユニットは第１のＦｃ領域および／または第２のＦｃ領域のＮ末端またはＣ末端の１つまたは複数の末端に連結され、第１のＦｃ領域および第２のＦｃ領域のＣＨ３ドメインは、Ｆｃヘテロダイマーの形成を促進するように変異させられる、ヘテロダイマーＦｃ融合タンパク質、ならびにヘテロダイマーＦｃ融合タンパク質を含む医薬組成物に関する。

本発明によるヘテロダイマーＦｃ融合タンパク質は、それが、２つまたはそれより多くの異なるサブユニットタンパク質で構成される天然に存在する生理活性タンパク質の活性を保持することができ、それによって、融合タンパク質が天然に存在する形態および構造を可能な最も高い程度で維持することができるように、タンパク質の各サブユニットを免疫グロブリンのヘテロダイマーのＦｃの各鎖に別々に融合させることができるので、組み立てられたタンパク質を形成することによってインタクトな生物学的活性を示すことができるという点で、利点を有する。

本発明によるヘテロダイマーＦｃ融合タンパク質を使用する場合、ｉｎ ｖｉｖｏでのその生理活性が長期持続することができるように、ヘテロダイマーＦｃ融合タンパク質に含有される生理活性タンパク質のｉｎ ｖｉｖｏ半減期を、Ｆｃによって媒介される長い半減期のために有意に増加させることができるという点で、利点がある。

さらに、本発明によるヘテロダイマーＦｃ融合タンパク質は、生理活性タンパク質の１つまたは複数のサブユニットが免疫グロブリンヘテロダイマーＦｃのＮ末端またはＣ末端に融合している構造を有し、ヘテロダイマーＦｃ融合タンパク質は、野生型Ｆｃに基づく融合タンパク質と比較してその発現の後に容易に精製される。

天然に存在するヒト抗体（免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥおよびＩｇＡ）は、同じアミノ酸配列を有する２つの重鎖および同じ配列を有する２つの軽鎖のアセンブリーとして各々存在する。この点に関しては、２つの同一の重鎖間のホモ二量体化は、定常領域末端ドメイン（ＩｇＧ、ＩｇＤおよびＩｇＡのＣＨ３ドメイン、ＩｇＭのＣＨ４ドメインならびにＩｇＥのＣＨ２およびＣＨ４ドメイン）の間の非共有結合性相互作用、およびヒンジドメインの間のジスルフィド結合によって誘導される。

抗体のヘテロダイマーＦｃテクノロジーは、ＣＨ３改変体対を有する操作されたＦｃ断片が、天然に存在する抗体（ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥ）においてＦｃホモダイマーではなくＦｃヘテロダイマーを優先的に形成するように、各ドメインの上の異なる変異により、ＣＨ３ドメイン界面への改変によって免疫グロブリン重鎖定常領域のヘテロダイマーの結晶性断片（Ｆｃ）を作製するテクノロジーである。より具体的には、それは、２つのＦｃ断片が最小限の配列変化でヘテロダイマーを形成するが、それらは天然に存在する抗体のものと非常に類似した三次構造を有するように、遺伝子操作によってＦｃの２つの異なるＣＨ３ドメインにおいて変異を誘導するテクノロジーである（米国特許第７，６９５，９３６号；および韓国特許第１，５２２，９５４号）。ヘテロダイマーＦｃテクノロジーは、二重特異的抗体を作製するためのプラットホームテクノロジーであり、これまで知られているＦｃヘテロダイマー形成を誘導するＣＨ３ドメイン変異体は、抗体の構造に基づく合理的な設計によって非対称の変異対をＣＨ３ドメイン界面に導入することによって大部分生成された（Ｓｐｒｅｔｅｒ Ｖｏｎ Ｋｒｅｕｄｅｎｓｔｅｉｎら、２０１４年）。先駆的な研究には、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈからのｋｎｏｂ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅテクノロジー（Ｒｉｄｇｗａｙら、１９９６年）が含まれ、Ｚｙｍｅｗｏｒｋｓ（ＺＷ１；Ｖｏｎ Ｋｒｅｕｄｅｎｓｔｅｉｎら、２０１３年）、Ｘｅｎｃｏｒ（ＨＡ−ＴＦ；Ｍｏｏｒｅ ＧＬら、２０１１年）、およびＥＭＤ Ｓｅｒｏｎｏ（ＳＥＥＤｂｏｄｙ；Ｄａｖｉｓ ＪＨら、２０１０年）を含む多くの多国籍製薬会社がプラットホームテクノロジーを開発し、報告している。

とりわけ、本発明において使用されるＡ１０７改変体は、酵母細胞表面提示系を使用して構築されたヒト抗体ヘテロダイマーＦｃライブラリーからスクリーニングされた高収量Ｆｃヘテロダイマーであり、立体的に相補性の疎水性相互作用（Ｋ４０９Ｗ_ＣＨ３Ａ−Ｄ３９９Ｖ／Ｆ４０５Ｔ_ＣＨ３Ｂ）を形成するために荷電アミノ酸において変異を誘導し、ＣＨ３ドメイン界面での疎水性のコア完全性を保持する一方で、水素結合（Ｋ３７０Ｅ_ＣＨ３Ａ−Ｅ３５７Ｎ_ＣＨ３Ｂ）を形成することによってヘテロダイマーの形成を促進するヘテロダイマーＦｃ改変体である（Ｃｈｏｉら２０１６年；韓国特許出願番号２０１５−０１４２１８１）。

Ａ１０７改変体を含む、これまでに報告されたヘテロダイマーＦｃ改変体は、全てヒト抗体アイソタイプの最も大きな割合を占めるＩｇＧ１に基づき、ＩｇＧ１以外のアイソタイプ（ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＭおよびＩｇＥ）の改変体はまだ報告されていない。

これは、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）の承認下で市販されている治療用抗体の大部分はＩｇＧ１アイソタイプを採用しているからである（Ｉｒａｎｉら２０１５年）。近年、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）または補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）などの大きな抗体エフェクター機能を有する必要性のない、免疫調節抗体または受容体アゴニスト融合タンパク質のために、そのエフェクター機能がＩｇＧ１のものより有意に低い、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４に基づく治療用タンパク質の開発が行われている。

一方、生理活性タンパク質の大部分は小さいサイズを有し、したがって、短いｉｎ ｖｉｖｏ半減期を有する欠点を有する。この欠点を解決するために、ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）などをコンジュゲートするかまたは抗体Ｆｃ（結晶性断片）領域に融合する試みがあった。しかし、その活性が長期間効率的および十分に維持される生理活性タンパク質の開発はまだ可能でない。

特に、２つまたはそれより多くの異なるサブユニットが生理活性を示すためにタンパク質複合体を形成する、２つまたはそれより多くの異なるサブユニットで構成されるタンパク質の場合、野生型Ｆｃ融合タンパク質はＦｃのホモダイマー的性質のためにホモダイマーを形成するので、野生型Ｆｃとの天然に存在する元のタンパク質複合体構造を有するように形成されるＦｃ融合タンパク質の開発はこれまで可能でなかった。したがって、野生型Ｆｃは、元のタンパク質の活性を適切に示し、それらの活性を長期間十分に維持するような、ヘテロダイマーまたはヘテロオリゴマータンパク質のためのＦｃ融合に適していない。

この技術的背景の下で、本発明者らは、ＩｇＧ１だけでなく、以前に報告されていないＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４などの他のアイソタイプ抗体に由来するＦｃ領域を含むヘテロダイマー改変体を構築し、これらのヘテロダイマー改変体を、２つまたはそれより多くの異なるサブユニットで構成され、２つまたはそれより多くのサブユニットがタンパク質複合体を形成することによって生理活性を示す、タンパク質の１つまたは複数のサブユニットが、Ｆｃ領域の末端に遺伝子的に融合される、ヘテロダイマーＦｃ融合タンパク質の形態の新規治療用融合タンパク質を開発するために使用し、それによって本発明を完成した。

特に、本発明では、好ましくは、２つの異なるサブユニット、ｐ３５およびｐ４０で構成されるタンパク質としてインターロイキン−１２（ＩＬ−１２）を使用することができ、ここで、２つのサブユニットは、ＩＬ−１２タンパク質を形成することによって生理活性を示す。

ＩＬ−１２は、免疫細胞の間で細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）もしくはナチュラルキラー細胞（ＮＫ）などの免疫細胞の活性を増加させることによって腫瘍を直接的に死滅させることができるか、または、免疫応答が阻害される腫瘍微小環境においてインターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）などの炎症促進性サイトカインの分泌を通して免疫応答を活性化することによって腫瘍形成を阻害することができる。したがって、ＩＬ−１２は抗がんサイトカインとして大いに研究されている（Ｌａｓｅｋら、２０１４年）。しかし、ＩＬ−１２を使用した治療方法の開発では、サイトカインの短い半減期自体は、毒性につながる可能性のある頻繁な投与を必要とさせる。この理由から、長期作用型ＩＬ−１２としてそれを使用するために、ＩＬ−１２を抗体またはＦｃと融合させる研究が実行されてきた（Ｔｕｇｕｅｓら、２０１５年）。しかし、これらの研究では、ＣＨ３ドメインの間での相互作用によってホモダイマーを形成する野生型Ｆｃに基づく抗体の融合のために、ＩＬ−１２の内因性の一価形態と異なり、融合したＩＬ１２タンパク質が二価であるという問題が生じ、この理由で、野生型Ｆｃに基づく抗体に融合したＩＬ−１２は、内因性ＩＬ−１２より劣った生理活性を示すか、または免疫細胞へのＩＬ−１２のアビディティによって促進される増加した結合のために望ましくない局在化が出現する（Ｔｚｅｎｇら、２０１５年；Ｄｕｍｏｎｔら、２００６年）。

したがって、図１（Ａ）〜１（Ｃ）に示すように、野生型の抗体またはＦｃ領域を使用して一価の融合タンパク質を作製する取り組みにおいて、さらなる精製のための選択的タグを単一のＦｃ領域のＣ末端だけに融合させること、または、高純度で別々に精製した後にＦｃ領域およびタンパク質を互いに融合させることなどの戦略を通して、融合タンパク質を構築する方法が使用されてきた。しかし、この方法は、大量のタンパク質を生成するために非常に高コストであるだけでなく、さらなる精製過程を最適化するための研究も必要とする。

しかし、本発明によるヘテロダイマーＦｃ融合タンパク質の使用は、さらなる精製過程の最適化を必要とすることなく、図２に示すように一価のヘテロダイマーＦｃ融合タンパク質を容易に生成することを可能にする。

米国特許第７，６９５，９３６号明細書 韓国特許第１，５２２，９５４号明細書

本発明の目的は、新規のヘテロダイマーＦｃ融合タンパク質を提供することであり、そのタンパク質は１つ、２つまたはそれより多くの異なるサブユニットで構成され、それによって、組み立てられたタンパク質を形成することによってインタクトな生物学的活性を示し、したがって、その融合タンパク質の天然の生理活性をｉｎ ｖｉｖｏで長期間維持することができる。

特に、本発明によるヘテロダイマーＦｃ融合タンパク質は、融合タンパク質が天然に存在する形態および構造を可能な最も高い程度で維持することができるように、それが、２つまたはそれより多くのサブユニットが集合してタンパク質を形成して生理活性を示す、天然に存在する生理活性タンパク質の活性を保持することができるように形成される。

さらに、本発明によるヘテロダイマーＦｃ融合タンパク質は、ｉｎ ｖｉｖｏでのその生理活性が長期持続することができるように、ヘテロダイマーＦｃ融合タンパク質に含有される生理活性タンパク質のｉｎ ｖｉｖｏ半減期を、Ｆｃによって媒介される長い半減期のために有意に増加させることができるという点で、利点を有する。

本発明の別の目的は、上記のヘテロダイマーＦｃ融合タンパク質を含む医薬組成物、ならびに、それを使用して疾患、特にがんを処置するための組成物および治療方法を提供することである。

上の目的を達成するために、本発明は、免疫グロブリンＦｃ対の第１のＦｃ領域および第２のＦｃ領域ならびに生理活性タンパク質を含むヘテロダイマーＦｃ融合タンパク質であって、
生理活性タンパク質は２つまたはそれより多くの異なるサブユニットで構成され、２つまたはそれより多くの異なるサブユニットは、タンパク質複合体を形成することによって生理活性を示し、
生理活性タンパク質のサブユニットは第１のＦｃ領域および／または第２のＦｃ領域のＮ末端またはＣ末端の１つまたは複数の末端に連結されるかまたは遺伝子的に融合され、
第１のＦｃ領域および第２のＦｃ領域のＣＨ３ドメインは、Ｆｃヘテロダイマーの形成を促進するように変異させられる、
ヘテロダイマーＦｃ融合タンパク質を提供する。

本発明は、上記のヘテロダイマーＦｃ融合タンパク質を含む医薬組成物、ならびに、それを使用して疾患、特にがんを処置するための組成物および治療方法も提供する。

図１（Ａ）〜１（Ｃ）は、ヒトＩｇＧ抗体の野生型Ｆｃを使用してモノマーおよびヘテロダイマーの融合タンパク質を得るための従来の戦略を図示する。（Ａ）野生型Ｆｃに基づくＥｐｏ−Ｆｃダイマー対Ｅｐｏ−Ｆｃモノマー。（Ｂ）ＬＡＰＳｃｏｖｅｒｙテクノロジーによって生成された無グリコシル化Ｆｃ融合ＧＬＰ−１／ＧＣＧモノマーペプチド。（Ｃ）野生型Ｆｃに基づくＦｃ−ＦＳＨタンデムホモダイマー対Ｆｃ−ＦＳＨヘテロダイマー。Ｅｐｏ、エリスロポイエチン；ＧＬＰ−１／ＧＣＧ、グルカゴン様ペプチド−１／グルカゴン；ＦＳＨ、卵胞刺激ホルモン。 図１（Ｄ）は、以前の文献によるｋｎｏｂ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅ（ＫｉＨ）ヘテロダイマーＦｃ改変体を含むＩｇＧタイプの抗体にモノマーサイトカイン（ＩＬ２）を融合させることによって抗体−サイトカイン（イムノサイトカイン）を構築する例を示す。

図２（Ａ）および２（Ｂ）は、ヘテロダイマーＦｃを使用して構築することができる、モノマーおよびヘテロダイマーの融合タンパク質の形態を図示する。その天然に存在する形態の融合パートナーを提示するためのＦｃ融合モノマーまたはヘテロダイマーのタンパク質の生成のための、ヘテロダイマーＦｃの潜在的使用。Ｆｃ融合モノマーは、１つのヘテロダイマーＦｃ鎖のＮ末端またはＣ末端へのモノマータンパク質の融合によって、容易に生成することができる。 図２（Ｃ）は、ヘテロダイマーＦｃを含むＩｇＧタイプのヒト抗体にヘテロダイマーを融合させることによって形成される融合タンパク質を図示する。Ｆｃ融合ヘテロダイマーは、Ｎ末端またはＣ末端のヘテロダイマーＦｃの各鎖へのヘテロダイマータンパク質の２つのサブユニットの別個の融合によって生成することができる。

図３は、ヒトＩｇＧアイソタイプ抗体（ｈＩｇＧ１、ｈＩｇＧ２、ｈＩｇＧ３、ｈＩｇＧ４）のＣＨ３ドメインの配列アラインメントを示し、Ａ１０７ヘテロダイマーＦｃ改変体の中の変異した残基（Ｋ３７０Ｅ／Ｋ４０９Ｗ_ＣＨ３Ａ−Ｅ３５７Ｎ／Ｄ３９９Ｖ／Ｆ４０５Ｔ_ＣＨ３Ｂ）は強調表示されている。

図４は、図３において選択された位置で誘導された変異を有する配列の使用によって各アイソタイプのためにヘテロダイマーＦｃ改変体の構造的モデル化を実行し、結果として生じたモデル化構造を野生型ＩｇＧ１に基づくＡ１０７改変体と比較して分析した結果を示す。

図５は、動物細胞において配列および構造分析によって構築された、各アイソタイプのためのヘテロダイマーＦｃを発現させるためのベクターの概略図である。変異したヒンジ領域を含む各アイソタイプのためのヘテロダイマーＦｃ改変体は、制限酵素（ＮｏｔＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ）の使用によってベクターにクローニングした。

図６は、発現タンパク質間のダイマーサイズの差によって、ヘテロダイマーを形成するヘテロダイマーＦｃ改変体の能力を評価するための、ｓｃＦｖ−Ｆｃ_ＣＨ３Ａ／Ｆｃ_ＣＨ３Ｂ発現系を図式的に示す。

図７は、図６に示すようなＣＨ３変異体対による抗体Ｆｃのヘテロ二量体化形成収量を評価するために構築された、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）に融合しているｓｃＦｖ−Ｆｃを、動物細胞発現ベクターであるｐｃＤＮＡ３．１ベクターの中にクローニングするための概略図である。

図８は、図６に示すヘテロ二量体化の形成を評価するために、図５および７に示す発現系によって構築されたＣＨ３変異体対導入動物細胞発現ベクターを、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞にコトランスフェクトし、ベクターを一時的に発現させ、精製し、次に、ヘテロ二量体化の形成を評価するために非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥで５μｇのタンパク質を分離し、サイズおよびクーマシーブルー染色による組合せによってタンパク質を分析した結果を示す。陰性対照として、野生型ＣＨ３を有する野生型Ｆｃを使用した。

図９は、図８に示す方法によってＳＤＳ−ＰＡＧＥによってタンパク質を分離し、次に、抗ヒトＩｇＧ−ＡＰコンジュゲート抗体を使用してウェスタンブロッティングを実行した結果を示す。

図１０（Ａ）は、Ｆｃが融合しておらず、本発明において対照として使用される内因性ＩＬ−１２サイトカインの形態を示す概略図である。 図１０（Ｂ）は、アミノ酸リンカーによってＩＬ−１２サイトカインを野生型ＩｇＧ４ Ｆｃに融合させることによって得られ、本発明において比較例として使用される、二価（ｂｉ）ＩＬ−１２−Ｆｃ融合タンパク質の形態を示す概略図である。 図１０（Ｃ）は、ＩＬ−１２サイトカインを、本発明による各アイソタイプのためのヘテロダイマーＦｃ改変体の中の、ＩｇＧ４に基づくγ４−Ａ１０７改変体に融合させることによって得られる、一価（ｍｏｎｏ）ＩＬ−１２−Ｆｃ融合タンパク質の形態を示す概略図である。

図１１（Ａ）および１１（Ｂ）は、動物細胞において本発明の実施例（図１０（Ｃ））の融合タンパク質を発現させ、精製するためのベクターの概略図である。

図１２は、動物細胞において本発明の実施例（図１０（Ｂ））の融合タンパク質を発現させ、精製するためのベクターの概略図である。

図１３は、ヒトおよびマウスのインターロイキン遺伝子を使用して構築された図１１（Ａ）および１１（Ｂ）の動物細胞発現ベクターをＨＥＫ２９３Ｆ細胞にコトランスフェクトし、遺伝子を一時的に発現させ、精製し、次に、非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥで５μｇのタンパク質を分離し、サイズおよびクーマシーブルー染色による組合せによってタンパク質を分析した結果を示す。

図１４は、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって図１３の融合タンパク質を分析した結果を示す。

図１５は、ＩＬ−１２受容体を有していない正常なＰＭＢＣ、およびマイトジェンＰＨＡ（フィトヘムアグルチニン）での処理によってＩＬ−１２受容体を誘導したＰＨＡ活性化ＰＢＭＣの上で、一価ｈＩＬ−１２−Ｆｃおよび野生型二価ｈＩＬ−１２−Ｆｃの結合親和性を分析するために実行したＦＡＣＳ分析の結果を示す。

図１６は、マイトジェンＰＨＡ処理によってＩＬ−１２受容体が誘導されたＰＨＡ活性化ＰＢＭＣの増殖に及ぼす、Ｆｃ（Ａ１０７）、組換えヒトＩＬ−１２（ｒｈＩＬ−１２）、二価ｈＩＬ−１２−Ｆｃおよび一価ｈＩＬ−１２−Ｆｃの様々な濃度の効果を測定するために実行したＷＳＴ−１細胞増殖アッセイの結果を示す。

図１７は、図１６に示す通りに得られた培養上清中のＩＦＮ−γの濃度を測定するために実行したＥＬＩＳＡの結果を示す。

図１８は、活性化ヒトＴ細胞およびＮＫ細胞の上でｍＩＬ−１２はヒトＩＬ−１２Ｒと交差反応するので、ＩＬ−１２受容体を有していない正常なＰＭＢＣ、およびマイトジェンＰＨＡでの処理によってＩＬ−１２受容体を誘導したＰＨＡ活性化ＰＢＭＣの上で、一価ｍＩＬ−１２−Ｆｃおよび二価ｍＩＬ−１２−Ｆｃの結合親和性を測定するために実行したフローサイトメトリー分析の結果を示す。

図１９は、マイトジェンＰＨＡ処理によってＩＬ−１２受容体が誘導されたＰＨＡ活性化ＰＢＭＣの増殖に及ぼす、Ｆｃ（Ａ１０７）、組換えマウスＩＬ−１２（ｒｍＩＬ−１２）、二価ｍＩＬ−１２−Ｆｃおよび一価ｍＩＬ−１２−Ｆｃの様々な濃度の効果を測定するために実行したＷＳＴ−１細胞増殖アッセイの結果を示す。

図２０（Ａ）は、Ｆｃ（Ａ１０７）、ｒｍＩＬ−１２、二価ｍＩＬ−１２−Ｆｃおよび一価ｍＩＬ−１２−Ｆｃの腹腔内投与の間の、ＣＴ２６^ＨＥＲ２／Ｎｅｕ腫瘍を移植したＢａｌｂ／ｃマウスにおける腫瘍体積の変化、ならびに投与終了時の屠殺後の担腫瘍（ｔｕｍｏｒ−ｂｅａｒｉｎｇ）マウスの写真を示す。腫瘍体積が１００ｍｍ３に到達した腫瘍細胞接種の１１日後に、ｍＩＬ１２−Ｆｃタンパク質の注射を開始した。 図２０（Ｂ）は、図２０（Ａ）に示した実験手順の示した時点で測定したマウス体重の変化を示すグラフである。

図２１（Ａ）は、ＣＴ２６^{ＨＥＲ２／Ｎｅｕ}を移植したＢａｌｂ／ｃマウスの腫瘍体積が３００ｍｍ^３に到達したときに、二価ｍＩＬ−１２−Ｆｃおよび一価ｍＩＬ−１２−Ｆｃの様々な濃度を腹腔内に週２回投与した間に測定したマウス腫瘍体積の変化を測定した結果を示す。図２１（Ｂ）は、図２１（Ａ）に示した実験手順の示した時点でｍＩＬ１２−Ｆｃタンパク質で処置した個々のマウス腫瘍体積の変化を示すグラフである。図２１（Ｃ）は、図２１（Ａ）の最終投与から３日後に担腫瘍マウスからとられた腫瘍の写真を示す。図２１（Ｄ）は、図２１（Ａ）に示した実験手順の示した時点で測定したマウス体重の変化を示すグラフである。

図２１（Ｅ）は、図２１（Ａ）の最終投与から１日後にマウス顔面静脈から収集した血液中のアラニンアミノ基転移酵素（ＡＬＴ）（肝毒性マーカーである）を測定した結果を示すグラフである。

図２２（Ａ）は、図２１（Ａ）の最終投与から３日後に屠殺したマウスの脾臓における、ＣＤ４^＋Ｔ細胞、ＣＤ８^＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞の数の増加を測定した結果を示すグラフである。

図２２（Ｂ）は、図２１（Ａ）の３回目の投与から３日後に屠殺したマウスの腫瘍に浸潤した、全免疫細胞、ＣＤ４^＋Ｔ細胞およびＣＤ８^＋Ｔ細胞の数を示すグラフである。

図２３（Ａ）は、ｍＩＬ−１２−Ｆｃタンパク質で処置したＣＴ２６^{ＨＥＲ ２／ｎｅｕ}担腫瘍マウスにおけるＩＦＮ−γの血清中レベルを測定するために実行したＥＬＩＳＡの結果を示す。図２１（Ａ）の最終投与の２４時間後にマウス顔面静脈から採取した血液を凝固させた後に、マウス血清を分離した。

図２３（Ｂ）は、ＣＴ２６^{ＨＥＲ２／Ｎｅｕ}がん細胞を移植したＢａｌｂ／ｃマウスの腫瘍体積が３００ｍｍ^３に到達したときに、二価ｍＩＬ−１２−Ｆｃおよび一価ｍＩＬ−１２−Ｆｃを１μｇのｒｍＩＬ−１２と等モルの濃度で腹腔内に投与してから１、３および５日後にマウス顔面静脈から採取した血液から分離した血清の中のＩＦＮ−γの濃度を測定するために実行したＥＬＩＳＡの結果を示すグラフである。

図２３（Ｃ）は、ＣＴ２６^{ＨＥＲ２／Ｎｅｕ}がん細胞に対する、図２１（Ａ）の最終投与から３日後に屠殺したマウスの脾臓から単離した、細胞傷害性Ｔ細胞の細胞傷害作用を測定した結果を示すグラフである。

図２３（Ｄ）は、図２１（Ａ）の３回目の投与から３日後、続いて腫瘍抗原を発現するＣＴ２６^{ＨＥＲ２／Ｎｅｕ}がん細胞および腫瘍抗原を発現しない４Ｔ１細胞と４時間培養して分析した、ｍＩＬ−１２−Ｆｃタンパク質で処置したＣＴ２６−ＨＥＲ２／ｎｅｕ担腫瘍マウスから単離した脾臓のＣＤ８^＋Ｔ細胞の細胞傷害活性を示す。

図２３（Ｅ）は、ＣＴ２６^{ＨＥＲ２／Ｎｅｕ}がん細胞に対する、図２１（Ａ）の３回目の投与から３日後に屠殺したマウスの脾臓から単離した、ナチュラルキラー細胞の細胞傷害作用を測定した結果を示すグラフである。

図２４（Ａ）は、図２１（Ａ）の最終投与から３日後に屠殺した担腫瘍マウスから単離した脾臓から単離した、ＣＤ８^＋エフェクターＴ細胞の数を測定した結果を示すグラフである。

図２４（Ｂ）は、図２１（Ａ）の最終投与から３日後に屠殺した担腫瘍マウスから単離した脾臓の中の、ＣＤ８^＋エフェクターメモリーＴ細胞の数を測定した結果を示すグラフである。

図２４（Ｃ）は、図２１（Ａ）の最終投与から３日後に屠殺した担腫瘍マウスから単離した脾臓の中の、ＣＤ８^＋セントラルメモリーＴ細胞の数を測定した結果を示すグラフである。

図２４（Ｄ）は、図２１（Ａ）の１μｇの一価ＩＬ−１２−Ｆｃの投与から１２０日後の生存Ｂａｌｂ／ｃマウスにＣＴ２６^{ＨＥＲ２／Ｎｅｕ}がん細胞を再移植し、マウスにおける腫瘍体積の変化を測定することによって得られた結果を示す。

図２４（Ｅ）は、図２１（Ａ）の３回目の投与から３日後に屠殺した担腫瘍マウスから単離した脾臓の中のＣＤ８^＋Ｔ細胞の間のメモリー前駆体エフェクター細胞（ＫＬＲＧ１⁻ＩＬ−７Ｒ^＋）および短寿命エフェクター細胞（ＫＬＲＧ１^＋ＩＬ−７Ｒ⁻）の割合を分析するために実行したフローサイトメトリーの結果を示す。

図２５（Ａ）は、図２１（Ａ）の３回目の投与から３日後に屠殺したマウスから単離した脾細胞の中のＣＤ８^＋Ｔ細胞（メモリー細胞の分化を阻害する転写因子Ｔ−ｂｅｔの高い発現を示した）の割合を測定するために実行したフローサイトメトリー分析の結果を示すグラフである。

図２５（Ｂ）は、図２１（Ａ）の３回目の投与から３日後に屠殺したマウスから単離した脾細胞の中のＣＤ８^＋Ｔ細胞（Ｅｏｍｅｓの高い発現およびＴ−ｂｅｔの低い発現を示した）の割合を測定するために実行したフローサイトメトリー分析の結果を示すグラフである。

図２５（Ｃ）は、ＣＴ２６^{ＨＥＲ２／Ｎｅｕ}がん細胞を移植したＢａｌｂ／ｃマウスの腫瘍体積が３００ｍｍ^３に到達したときに、二価ｍＩＬ−１２−Ｆｃおよび一価ｍＩＬ−１２−Ｆｃを１μｇのｒｍＩＬ−１２と等モルの濃度で腹腔内に一度投与してから２４時間後に腫瘍流入領域（鼠径部）リンパ節から単離したＣＤ８^＋Ｔ細胞の中のリン酸化ＳＴＡＴ４の発現レベルを測定するために実行したフローサイトメトリー分析の結果を示すグラフである。

図２５（Ｄ）は、図２５（Ｃ）の単一の腹腔内投与から７２時間後の腫瘍流入領域（鼠径部）リンパ節の中のＣＤ８^＋Ｔ細胞（メモリー細胞の分化を阻害するＴ−ｂｅｔを発現した）の割合を測定するために実行したフローサイトメトリー分析の結果を示すグラフである。

図２５（Ｅ）は、正常なＢａｌｂ／ｃマウスの脾臓および鼠径部のリンパ節から単離したＣＤ８^＋Ｔ細胞を、抗Ｆｃ抗体と交差反応した一価ｍＩＬ−１２−Ｆｃおよび二価ｍＩＬ−１２−Ｆｃで刺激したときの、ｐＳＴＡＴ４の発現レベルを測定するために実行したフローサイトメトリー分析の結果を示すグラフである。

図２５（Ｆ）は、正常なＢａｌｂ／ｃマウスの脾臓および鼠径部のリンパ節から単離したＣＤ８^＋Ｔ細胞を、抗Ｆｃ抗体と交差反応した一価ｍＩＬ−１２−Ｆｃおよび二価ｍＩＬ−１２−Ｆｃで刺激したときの、Ｔ−ｂｅｔ発現ＣＤ８^＋Ｔ細胞の割合を測定するために実行したフローサイトメトリー分析の結果を示すグラフである。

図２６は、一価ｍＩＬ−１２−Ｆｃによってメモリー前駆体エフェクター細胞の分化を誘導する機構、および二価ｍＩＬ−１２−Ｆｃによって短寿命エフェクター細胞の分化を誘導する機構を示す全体の概略図である。

特記されない限り、本明細書で使用される全ての専門用語および科学用語は、本発明が関する分野の当業者が一般に理解するのと同じ意味を有する。一般的に、本明細書で使用される命名法、および下で記載される実験方法は、当技術分野で周知であり、普通に用いられるものである。

一態様では、本発明は、免疫グロブリンＦｃ対の第１のＦｃ領域および第２のＦｃ領域ならびに生理活性タンパク質を含むヘテロダイマーＦｃ融合タンパク質であって、
生理活性タンパク質は２つまたはそれより多くの異なるサブユニットで構成され、２つまたはそれより多くの異なるサブユニットは、タンパク質複合体を形成することによって生理活性を示し、生理活性タンパク質の１つまたは複数のサブユニットは第１のＦｃ領域および／または第２のＦｃ領域のＮ末端またはＣ末端の１つまたは複数の末端に連結され、
第１のＦｃ領域および第２のＦｃ領域のＣＨ３ドメインは、ヘテロダイマーの形成を促進するように変異させられる、
ヘテロダイマーＦｃ融合タンパク質に関する。

本明細書で使用する場合、用語「Ｆｃ領域」または「重鎖定常領域」は、免疫グロブリンＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメインおよびヒンジドメインを含む領域を意味する。しかし、ＩｇＥの場合、この用語は、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、ＣＨ４ドメインおよびヒンジドメインを含む領域を意味する。

本明細書で使用する場合、表現「第１のＦｃ領域および第２のＦｃ領域はヘテロダイマーの形成を促進するように変異させられる」は、天然に存在する抗体は２つのＦｃ領域が同じ配列を有するホモダイマー形態を有し、これらのＦｃ領域配列の一部は変異させられ、そのために、第１のＦｃ領域と第２のＦｃ領域の間の特異的非共有結合性相互作用を通してヘテロダイマーの形成を促進することができるか、または、ホモダイマーの形成を低減することができるか、もしくは、好ましくはほとんど起こることができないことを意味する。

好ましくは、「第１のＦｃ領域および第２のＦｃ領域はヘテロダイマーの形成を促進するように変異させられる」は、「免疫グロブリンからの第１のＦｃ領域および第２のＦｃ領域に含有されるＣＨ３ドメインの各々は、Ｆｃヘテロダイマーの形成を促進するように変異させられる」ことを含むことができる。

本発明では、「ヘテロダイマーのＦｃまたはＦｃヘテロダイマー」は第１のＦｃ領域および第２のＦｃ領域を含み、第１のＦｃ領域および第２のＦｃ領域は、第１のＦｃ領域および第２のＦｃ領域のＣＨ３ドメインがＦｃヘテロダイマーの形成を促進するように変異させられるヘテロダイマーを意味する。

本発明では、第１のＦｃ領域および第２のＦｃ領域の各々は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥからなる群より選択されるＦｃ領域に由来することができ、好ましくは、第１のＦｃ領域および第２のＦｃ領域の各々は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４に由来する。

さらに、第１のＦｃ領域および第２のＦｃ領域は、アイソタイプ抗体に由来することができる。

別の態様では、ＣＨ３ドメインの変異は、以下の群（本発明における全ての変異位置はＥＵインデックスに従って番号付けされる）から選択される１つまたは複数の変異を含むことができる：

（１）第１のＦｃ領域のＣＨ３ドメインのＫ３７０位のアミノ酸残基の置換；および第２のＦｃ領域のＣＨ３ドメインのＥ３５７位および／もしくはＳ３６４位のアミノ酸残基の置換；ならびに／または
（２）第１のＦｃ領域のＣＨ３ドメインのＫ４０９位のアミノ酸残基の置換；および第２のＦｃ領域のＣＨ３ドメインのＦ４０５位および／もしくはＤ３９９位のアミノ酸残基の置換。

好ましくは、第１のＦｃ領域のＣＨ３ドメインのＫ３７０位のアミノ酸残基の置換は、Ｋ３７０Ｅ、Ｋ３７０Ｒ、Ｋ３７０Ｍ、Ｋ３７０ＤまたはＫ３７０Ｈであってよく、第２のＦｃ領域のＣＨ３ドメインのＥ３５７位のアミノ酸残基の置換は、Ｅ３５７Ｎ、Ｅ３５７Ｄ、Ｅ３５７Ａ、Ｅ３５７Ｉ、Ｅ３５７ＧまたはＥ３５７Ｍであってよく、第２のＦｃ領域のＣＨ３ドメインのＳ３６４位のアミノ酸残基の置換は、Ｓ３６４ＴまたはＳ３６４Ｗであってよい。

さらに、第１のＦｃ領域のＣＨ３ドメインのＫ４０９位のアミノ酸残基の置換は、Ｋ４０９Ｗであってよく、第２のＦｃ領域のＣＨ３ドメインのＦ４０５位のアミノ酸残基の置換は、Ｆ４０５Ｔであってよく、第２のＦｃ領域のＣＨ３ドメインのＤ３９９位のアミノ酸残基の置換は、Ｄ３９９Ｖであってよい。

Ｋ３７０Ｅなどのアミノ酸残基変異は、３７０位のＫがＥに変異させられることを意味し、本発明における全てのアミノ酸残基の変異は、上記と同じ意味で使用される。

最も好ましくは、第１のＦｃ領域または第２のＦｃ領域のＣＨ３ドメインの変異は、以下の群（変異の位置はＥＵインデックスに従って番号付けされる）から選択される１つまたは複数の変異を含むことができる：
（１）第１のＦｃ領域のＣＨ３ドメインのＫ３７０位のアミノ酸残基の置換Ｋ３７０Ｅ、Ｋ３７０Ｒ、Ｋ３７０Ｍ、Ｋ３７０ＤまたはＫ３７０Ｈ；
（２）第２のＦｃ領域のＣＨ３ドメインのＥ３５７位のアミノ酸残基の置換Ｅ３５７Ｎ、Ｅ３５７Ｄ、Ｅ３５７Ａ、Ｅ３５７Ｉ、Ｅ３５７ＧまたはＥ３５７Ｍ、および第２のＦｃ領域のＣＨ３ドメインのＳ３６４位のアミノ酸残基の置換Ｓ３６４ＴまたはＳ３６４Ｗ；
（３）第１のＦｃ領域のＣＨ３ドメインのＫ４０９位のアミノ酸残基の置換Ｋ４０９Ｗ；ならびに
（４）第２のＦｃ領域のＣＨ３ドメインのＦ４０５位のアミノ酸残基の置換Ｆ４０５Ｔ、および第２のＦｃ領域のＣＨ３ドメインのＤ３９９位のアミノ酸残基の置換Ｄ３９９Ｖ。

第１のＦｃ領域および第２のＦｃ領域のＣＨ３ドメインは、以下の残基をさらに含むことができる：
（ｉ）第１のＦｃ領域のＣＨ３ドメインのＹ３４９位で置換されたシステイン（Ｃ）；および
（ｉｉ）第２のＦｃ領域のＣＨ３ドメインのＳ３５４位で置換されたシステイン（Ｃ）。

さらに別の態様では、ＣＨ３ドメインの変異は、以下の群から選択される１つまたは複数の変異を含むことができる：
（１）第１のＦｃ領域のＣＨ３ドメインのＫ３６０位のアミノ酸残基の置換；および第２のＦｃ領域のＣＨ３ドメインのＥ３４７位のアミノ酸残基の置換；ならびに／または
（２）第１のＦｃ領域のＣＨ３ドメインのＫ４０９位のアミノ酸残基の置換；および第２のＦｃ領域のＣＨ３ドメインのＦ４０５位およびＤ３９９位のアミノ酸残基の置換。

好ましくは、第１のＦｃ領域のＣＨ３ドメインのＫ３６０位のアミノ酸残基の置換はＫ３６０Ｅであってよく、第２のＦｃ領域のＣＨ３ドメインのＥ３４７位のアミノ酸残基の置換はＥ３４７Ｒであってよい。

第１のＦｃ領域のＣＨ３ドメインのＫ４０９位のアミノ酸残基の置換はＫ４０９Ｗであってよく、第２のＦｃ領域のＣＨ３ドメインのＦ４０５位のアミノ酸残基の置換はＦ４０５Ｔであってよく、第２のＦｃ領域のＣＨ３ドメインのＤ３９９位のアミノ酸残基の置換はＤ３９９Ｖであってよい。

最も好ましくは、第１のＦｃ領域または第２のＦｃ領域のＣＨ３ドメインの変異は、以下の群（変異の位置はＥＵインデックスに従って番号付けされる）から選択される１つまたは複数の変異を含むことができる：
（１）第１のＦｃ領域のＣＨ３ドメインのＫ３６０位のアミノ酸残基の置換Ｋ３６０Ｅ；
（２）第２のＦｃ領域のＣＨ３ドメインのＥ３４７位のアミノ酸残基の置換Ｅ３４７Ｒ；
（３）第１のＦｃ領域のＣＨ３ドメインのＫ４０９位のアミノ酸残基の置換Ｋ４０９Ｗ；ならびに
（４）第２のＦｃ領域のＣＨ３ドメインのＦ４０５位のアミノ酸残基の置換Ｆ４０５Ｔ、および第２のＦｃ領域のＣＨ３ドメインのＤ３９９位のアミノ酸残基の置換Ｄ３９９Ｖ。

第１のＦｃ領域および第２のＦｃ領域のＣＨ３ドメインは、以下の残基をさらに含むことができる：
（ｉ）第１のＦｃ領域のＣＨ３ドメインのＹ３４９位で置換されたシステイン（Ｃ）；および
（ｉｉ）第２のＦｃ領域のＣＨ３ドメインのＳ３５４位で置換されたシステイン（Ｃ）。

好ましくは、本発明による免疫グロブリンからの第１のＦｃ領域および第２のＦｃ領域に含有されるＣＨ３ドメインの各々は、以下の配列番号によって表されるアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を有することができる：
（１）配列番号１および配列番号２；
（２）配列番号３および配列番号４；
（３）配列番号５および配列番号６；
（４）配列番号８および配列番号９；
（５）配列番号１１および配列番号１２；ならびに
（６）配列番号１４および配列番号１５。

特に、本発明による免疫グロブリンからの第１のＦｃ領域および第２のＦｃ領域は、下の表１に示すＩｇＧ４ ＣＨ３ドメインの配列を好ましくは有する。

本発明によるヘテロダイマーＦｃ融合タンパク質では、生理活性タンパク質のサブユニットは、第１のＦｃ領域または第２のＦｃ領域のＮ末端またはＣ末端の任意の１つの末端だけに連結することができ、単一の生理活性タンパク質の１つまたは複数の異なるサブユニットは、第１のＦｃ領域および第２のＦｃ領域の各々のＮ末端およびＣ末端の各々に連結することができる（図２（Ｂ）および２（Ｃ）を参照されたい）。

「生理活性タンパク質のサブユニットは、第１のＦｃ領域または第２のＦｃ領域のＮ末端またはＣ末端の任意の１つの末端だけに連結される」は、生理活性タンパク質のサブユニットの１つが、第１のＦｃ領域または第２のＦｃ領域のＮ末端またはＣ末端の４つの末端のうちの任意の１つだけに連結されること、および生理活性タンパク質の残りのサブユニット（複数可）が、第１のＦｃ領域または第２のＦｃ領域のＮ末端またはＣ末端の任意の１つの末端に連結されている、生理活性タンパク質のサブユニットにリンカーによって連結されることを意味する。リンカーは好ましくはアミノ酸のリンカーであるが、それに限定されない。

さらに、「単一の生理活性タンパク質の１つまたは複数の異なるサブユニットは、第１のＦｃ領域および第２のＦｃ領域の各々のＮ末端およびＣ末端の各々に連結される」は、単一の生理活性タンパク質の１つまたは複数の異なるサブユニットが、第１のＦｃ領域および第２のＦｃ領域の各々のＮ末端に連結されることか、単一の生理活性タンパク質の１つまたは複数の異なるサブユニットが、第１のＦｃ領域および第２のＦｃ領域の各々のＣ末端に連結されるか、または単一の生理活性タンパク質の１つまたは複数の異なるサブユニットが、第１のＦｃ領域および第２のＦｃ領域の各々のＮ末端およびＣ末端にそれぞれ連結されることを意味する。

本発明によるヘテロダイマーＦｃ融合タンパク質では、生理活性タンパク質のサブユニットは、第１のＦｃ領域および／または第２のＦｃ領域のＮ末端および／またはＣ末端に遺伝子融合によって連結することができる。

さらに別の態様では、生理活性タンパク質のサブユニットは、リンカーを通して第１のＦｃ領域および第２のＦｃ領域に連結することができる。リンカーは好ましくはアミノ酸のリンカーであるが、それに限定されない。

さらに別の態様では、本発明によるヘテロダイマーＦｃ融合タンパク質では、生理活性タンパク質は、それが２つまたはそれより多くの異なるサブユニットで構成され、２つまたはそれより多くの異なるサブユニットはタンパク質複合体を形成することによって生理活性を示すことを特徴とする。

「生理活性タンパク質は２つまたはそれより多くの異なるサブユニットで構成され、２つまたはそれより多くの異なるサブユニットはタンパク質複合体を形成することによって生理活性を示す」は、生理活性タンパク質は、２つまたはそれより多くのサブユニットがタンパク質複合体を形成するときに生理活性を示すことを意味する。

生理活性タンパク質は、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）、インターロイキン−２３（ＩＬ−２３）、インターロイキン−２７（ＩＬ−２７）、インターロイキン−３５（ＩＬ−３５）および卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）からなる群より選択されるが、それに限定されない。その上、本発明の目的に適する任意の生理活性タンパク質を本発明において使用することができることは、当業者にとって明らかになる。

最も好ましくは、本発明による生理活性タンパク質は、ＩＬ−１２である。

２つまたはそれより多くの異なるサブユニットで構成され、２つまたはそれより多くの異なるサブユニットは、本発明によるタンパク質複合体を形成することによって生理活性を示すタンパク質は、好ましい生理活性タンパク質であるＩＬ−１２を例としてここで詳細に記載される。

ＩＬ−１２は２つのサブユニットｐ３５（ＩＬ−１２Ａ）およびｐ４０（ＩＬ−１２Ｂ）で構成され、ＩＬ−１２の生理活性形態はｐ３５およびｐ４０のヘテロダイマーであるｐ７０である。ＩＬ−１２は、ＩＬ−１２が天然の系においてその活性を示すためにｐ３５およびｐ４０のヘテロダイマーであるｐ７０の形態で存在するべきである。

本発明では、天然に存在するＩＬ−１２の形態を可能な最大限に模倣するために、本発明によるヘテロダイマーＦｃ融合タンパク質の形態を具体化した。

具体的には、上記のように、生理活性タンパク質の１つまたは複数のサブユニットが第１のＦｃ領域および第２のＦｃ領域のＮ末端またはＣ末端の１つまたは複数の末端に連結されている、本発明による第１のＦｃ領域および第２のＦｃ領域を含むヘテロダイマーＦｃ融合タンパク質では、
（ｉ）生理活性タンパク質を構成する１つもしくは複数のサブユニットは、第１のＦｃ領域もしくは第２のＦｃ領域のＮ末端もしくはＣ末端の任意の１つの末端だけに連結することができ、生理活性タンパク質の残りのサブユニット（複数可）はリンカーによって連結することができ、または
（ｉｉ）単一の生理活性タンパク質の１つもしくは複数の異なるサブユニットは、第１のＦｃ領域および第２のＦｃ領域の各々のＮ末端および／もしくはＣ末端にそれぞれ連結することができる。

上記の場合には、ＩＬ−１２の例が以降記載される。

（ｉ）の場合、ＩＬ−１２のｐ３５またはｐ４０サブユニットは、第１のＦｃ領域または第２のＦｃ領域のＮ末端またはＣ末端の任意の１つの末端だけに連結することができ、残りのサブユニットは、第１のＦｃ領域または第２のＦｃ領域のＮ末端またはＣ末端の任意の１つの末端に連結されるｐ３５またはｐ４０サブユニットにリンカーによって連結して、ヘテロダイマーＦｃ融合タンパク質を形成することができる（図２（Ｂ）および２（Ｃ）を参照されたい）。

（ｉｉ）の場合、ＩＬ−１２のｐ３５またはｐ４０サブユニットから選択される任意の１つは、第１のＦｃ領域のＮ末端またはＣ末端だけに連結することができ、他のサブユニットは、第２のＦｃ領域のＮ末端またはＣ末端だけに連結して、ヘテロダイマーＦｃ融合タンパク質を形成することができる（図２（Ｂ）および２（Ｃ）を参照されたい）。

この形態が、天然に存在する元のヘテロダイマー形態を維持しつつ、従来の組換えＩＬ−１２タンパク質のそれと類似のｉｎ ｖｉｔｒｏ生理活性を示したことが判明した（図２（Ｂ）、２（Ｃ）および１０（Ｃ）を参照されたい）。

したがって、本発明による好ましい免疫グロブリンヘテロダイマーＦｃ融合タンパク質は、生理活性タンパク質がＩＬ−１２であること、ならびに、ＩＬ−１２のｐ３５もしくはｐ４０サブユニットは、第１のＦｃ領域もしくは第２のＦｃ領域のＮ末端もしくはＣ末端の任意の１つの末端だけに連結され、残りのサブユニットは、第１のＦｃ領域もしくは第２のＦｃ領域のＮ末端もしくはＣ末端の任意の１つの末端に連結されるサブユニットにリンカーによって連結されること、または、ＩＬ−１２のｐ３５およびｐ４０サブユニットは、第１のＦｃ領域および第２のＦｃ領域の各々のＮ末端およびＣ末端の各々に連結されることを特徴とする。

別の態様では、本発明によるヘテロダイマーＦｃ融合タンパク質では、第１のＦｃ領域および第２のＦｃ領域の各々のＮ末端に含まれるヒンジドメインは、ヒンジドメインに含有されるシステイン残基が変異していることを特徴とすることができる。

好ましくは、ヒンジドメインにおけるシステイン残基の変異は、ヘテロダイマー形成のためのコアヒンジドメイン中のシステイン残基以外の、上部ヒンジ領域の中のシステイン残基は、セリン残基で全て置換されることを特徴とすることができるが、本発明の範囲はそれに限定されない。

さらに、本発明で、第１のＦｃ領域および第２のＦｃ領域は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥからなる完全な抗体形態に含まれてもよい。

本発明では、用語「完全な抗体形態」は、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＤのＦｃ領域中のＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメインおよびヒンジドメイン（ＩｇＥではＣＨ４ドメインも含む）に加えて、ＣＨ１ドメイン、ＶＨドメイン、ＣＬドメインおよびＶＬドメインをさらに含むインタクトな抗体を意味する。

さらに別の態様では、本発明は、本発明によるヘテロダイマーＦｃ融合タンパク質を含む医薬組成物に関する。本発明による医薬組成物の使用は、ヘテロダイマーＦｃ融合タンパク質に含有される生理活性タンパク質の使用に依存することができる。

好ましくは、本発明によるヘテロダイマーＦｃ融合タンパク質に含有される生理活性タンパク質は、ＩＬ−１２またはその１つもしくは複数のサブユニットであってよい。したがって、本発明は、生理活性タンパク質としてＩＬ−１２を含むヘテロダイマーＦｃ融合タンパク質を含む、がんの処置のための医薬組成物を提供する。

生理活性タンパク質としてＩＬ−１２または１つまたは複数のサブユニットを含むヘテロダイマーＦｃ融合タンパク質を含む、がんの処置のための医薬組成物で処置することができるがんは、結腸直腸がん、メラノーマ、乳がん、膵臓がん、腎臓がん、前立腺がん、卵巣がん、小腸がん、食道がん、子宮頸がん、肺がん、リンパ腫および血液がんからなる群より選択することができるが、それに限定されない。

本発明による医薬組成物は、薬学的に許容される担体をさらに含むことができる。用語「薬学的に許容される担体」は、調製物の製剤化または安定化を助けるために有効成分に加えることができ、患者に有意な毒物学的作用を引き起こさない物質を指す。

本明細書で使用する場合、用語「薬学的に許容される担体」は、患者を刺激することなく、本発明によるヘテロダイマーＦｃ融合タンパク質の生物学的活性および特性を損なわない担体または希釈剤を指す。液体溶液として製剤化される組成物中の薬学的に許容される担体として、無菌および生体適合性の担体が使用される。薬学的に許容される担体は、生理食塩水、無菌水、リンガー液、緩衝食塩水、アルブミン注射溶液、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、エタノールまたはその２つもしくはそれより多くの混合物であってよい。さらに、本発明の組成物は、抗酸化剤、緩衝液および静菌剤を含む他の従来の添加剤を必要に応じて含むことができる。さらに、本発明の組成物は、希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤および滑沢剤を用いた水溶液、懸濁物または乳剤などの注射可能な形態として製剤化することができる。さらに、本発明による組成物は、丸剤、カプセル剤、顆粒または錠剤の形で製剤化することができる。他の担体は、文献［Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｅ． Ｗ． Ｍａｒｔｉｎ）］に記載されている。

薬学的に許容される担体には、無菌の水性溶液または分散物、および無菌の注射用溶液または分散物の即座の調製のための無菌の粉末が含まれる。薬学的に活性な物質のためのそのような媒体および薬剤の使用は、当技術分野で公知である。組成物は、好ましくは非経口注射のために製剤化される。組成物は、固体、溶液、マイクロエマルジョン、リポソーム、または高い薬物濃度に適する他の秩序だった構造（ｏｒｄｅｒｅｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）として製剤化することができる。担体は、例えば水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコール）、およびその適する混合物を含有する溶媒または分散媒であってもよい。一部の場合には、組成物は、等張性剤（ｉｓｏｔｏｎｉｃ ａｇｅｎｔ）、例えば、糖、多価アルコール、例えばソルビトールまたは塩化ナトリウムを含有することができる。無菌の注射可能な溶液は、必要に応じて上に列挙された成分の１つまたは組合せと一緒に、適当な溶媒に必要な量のヘテロダイマーＦｃ融合タンパク質によって、続いて滅菌精密濾過によって調製することができる。一般に、分散物は、基本分散媒および上に列挙されるものからの必要とされる他の成分を含有する無菌のビヒクルの中に活性化合物を組み込むことによって調製される。無菌の注射可能な溶液の調製のための無菌粉末の場合は、好ましい調製方法は、有効成分と前もって濾過滅菌したその溶液からの任意の追加の所望の成分との粉末を与える、真空乾燥およびフリーズドライである。

さらに、本発明による医薬組成物は、患者に対して、患者の重症度によって異なることができる投薬量および頻度で経口的または非経口的に投与することができる。組成物は、ボーラスとして、または連続注入によって、必要とする患者に投与することができる。別の例では、本発明による医薬組成物は、直腸、静脈内、皮下、子宮内、または脳血管内（ｉｎｔｒａｃｅｒｅｂｒｏｖａｓｃｕｌａｒｌｙ）に投与することができるが、それに限定されない。

さらに、ＩＬ−１２を含む免疫グロブリンヘテロダイマーＦｃ融合タンパク質を含むがん処置のための医薬組成物は、他の抗がん薬との併用療法のために使用することができる。他の抗がん薬は、好ましくは細胞傷害性Ｔ細胞および／またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞であるがそれに限定されず、本発明が関する分野において使用することができる全ての抗がん薬を併用療法のために使用することができる。

特に、ＩＬ−１２を含む免疫グロブリンヘテロダイマーＦｃ融合タンパク質を含むがん処置のための医薬組成物を、細胞傷害性Ｔ細胞および／またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞との併用療法のために使用するとき、それは以下を誘導することができる：
（１）Ｔ細胞もしくはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の刺激によるサイトカイン分泌の増加；
（２）抗体依存性細胞媒介細胞傷害（ＡＤＣＣ）もしくは細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答の増加；
（３）細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）および／もしくはナチュラルキラー細胞の数の増加；
（３）腫瘍周囲のリンパ球導入の増加；または
（４）ｉｎ ｖｉｖｏにおけるリンパ球のＩＬ−１２Ｒベータ１およびＩＬ−１２Ｒベータ２シグナル伝達の増加。

さらに別の態様では、本発明は、疾患を処置または予防する方法であって、処置を必要とする患者に本発明によるヘテロダイマーＦｃ融合タンパク質を含む医薬組成物を投与することを含む方法に関する。

組成物の場合と同様に、処置または予防することができる疾患は、ヘテロダイマーＦｃ融合タンパク質に含有される生理活性タンパク質の使用に依存する。好ましくは、本発明によるヘテロダイマーＦｃ融合タンパク質に含有される生理活性タンパク質の１つまたは複数のサブユニットが、ＩＬ−１２の１つまたは複数のサブユニットであるとき、本発明は、がん、特に結腸直腸がん、メラノーマ、乳がん、膵臓がん、腎臓がん、前立腺がん、卵巣がん、小腸がん、食道がん、子宮頸がん、肺がん、リンパ腫および血液がんからなる群より選択されるがんを患っている患者のためのがんの処置または予防の方法を提供する。

以降では、本発明は、実施例によってさらに詳細に記載される。これらの実施例は例示だけが目的であり、本発明の範囲を限定するものとみなすべきでないことは、当業者に明らかになる。

（実施例１：各ヒト免疫グロブリンアイソタイプのためのヘテロダイマー形成のための抗体Ｆｃ ＣＨ３ドメイン改変体の設計（配列決定））
ヘテロダイマー形成を有利にするＣＨ３ドメイン変異を導入することによって、各ヒト免疫グロブリンアイソタイプのためのヘテロダイマーＦｃ断片を作製するために、ヘテロダイマー形成のための相互作用において主要な役割を演じるＣＨ３ドメイン間のアミノ酸配列類似性を、先ず下記のように分析した。この点に関しては、ＣＨ３Ａ：ＣＨ３Ｂのヘテロ二量体化が、Ｆｃ改変体がヘテロダイマーを高い収量で形成するように駆動するように、以前の文献または特許文書（Ｃｈｏｉら２０１６年；韓国特許出願番号２０１５−０１４２１８１）において公開されている戦略によって、ヘテロダイマーのＣＨ３Ａ：ＣＨ３Ｂ対（本発明では、ＣＨ３ＡおよびＣＨ３Ｂは、第１のＦｃ領域のＣＨ３ドメインおよび第２のＦｃ領域のＣＨ３領域をそれぞれ意味する）を生成するために、ＣＨ３ホモダイマー界面に非対称の変異を導入することによってヘテロダイマーＦｃ改変体（Ａ１０７）を生成した。図３は、各ヒト抗体免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）アイソタイプのためのＣＨ３ドメインの配列を整列させ、比較する。各アミノ酸配列は、国際免疫遺伝学情報システム（ＩＭＧＴ；ＵＲＬ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／）から得た。特に、様々なアロタイプの間で、血清中半減期が他のＩｇＧアイソタイプのものと類似のレベルに維持されることが報告されたＧ３ｍ（ｓ，ｔ）の配列をＩｇＧ３のために使用した（Ｓｔａｐｌｅｔｏｎ ＮＭら、２０１１年）。

配列決定の結果は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２およびＩｇＧ３におけるものと異なり、Ａ１０７変異が導入される位置のうちの４０９位のアミノ酸がアルギニンであることを除いて、ＩｇＧ４が全てのアイソタイプにおいて保存されている配列を有することを示した。したがって、Ａ１０７変異対をＩｇＧ１以外のアイソタイプに導入するための位置として、同じアミノ酸配列番号を有する位置を選択した。本発明における全てのアミノ酸の位置は、ＥＵインデックスに従って番号付けされる。

（実施例２：各ヒト免疫グロブリンアイソタイプのためのヘテロダイマー形成のための免疫グロブリンＦｃ ＣＨ３ドメイン改変体の設計（構造的モデル化））
各アイソタイプのためのＣＨ３ドメイン改変体を実際に構築する前に、ヘテロダイマーを形成するようにＡ１０７変異対を実施例１で選択された位置に安定して導入することができたかどうかを、図３に示すような各変異で導入した改変体配列を使用した構造的モデル化を通して予測した。構造的モデル化は、既知の免疫グロブリンＦｃヘテロダイマー改変体構造（ＰＤＢ ＩＤ：４Ｘ９８）を鋳型として使用して、オンラインモデル化サーバー（ＵＲＬ：ｈｔｔｐｓ：／／ｓｗｉｓｓｍｏｄｅｌ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／；Ｂｉａｓｉｎｉ Ｍら、２０１４年）を通して予測した。ＣＨ３ドメインの構造変化および変異の導入の後のＡ１０７変異の位置を観察するために、タンパク質構造を可視化することができるＰｙｍｏｌソフトウェアを使用して、得られた構造の各々を重ねた。重ねた構造では、Ａ１０７変異が各アイソタイプに導入されたときでも、ＩｇＧ１アイソタイプに基づいて構築され、ＣＨ３Ａ：ＣＨ３Ｂ Ｆｃヘテロダイマーを形成する従来のＡ１０７改変体のモデル化構造と比較して、大きな変化なしで構造が維持されたことが分かった。特に、導入されたＡ１０７変異アミノ酸残基の方向はほとんど一貫していたこと、および変異したアミノ酸の間の相互作用の距離も類似のレベルに維持されたことが示された（図４を参照されたい）。

（実施例３：各ヒト免疫グロブリンアイソタイプのためのＡ１０７ヘテロダイマーＦｃアイソタイプ改変体の構築）
実施例１の配列決定および実施例２の構造的モデル化を通して設計したＡ１０７ヘテロダイマーＦｃアイソタイプ改変体を、当業者によって実行される部位特異的変異誘発方法により、ＮｏｔＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素および合成オリゴヌクレオチド（Ｍａｃｒｏｇｅｎ、Ｋｏｒｅａ）を使用してシグナル配列−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３を有するように、動物細胞発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）の中にインフレームでクローニングした（図５を参照されたい）。

使用したヒンジドメインでは、タンパク質融合の間のジスルフィド結合の生成を阻止するために、ヘテロダイマー形成のためのコアヒンジ領域の中のシステイン残基以外の、上部ヒンジ領域の中のシステイン残基をセリン残基で置換した。特に、ＩｇＧ３の場合、ＩｇＧ３の高い抗体エフェクター機能（ＡＤＣＣおよびＣＤＣ）が、Ｇ３ｍ（ｓ，ｔ）アロタイプのヒンジドメインの４７アミノ酸のうちでコアヒンジドメインのＣ末端の１５アミノ酸だけによっても維持されることが、文献で見出された（Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ ＷＦら、２００６年）。したがって、図５に示す配列のＣ末端の１５アミノ酸だけを使用した。

下の表２は、野生型および本発明のＡ１０７ヘテロダイマーのＦｃ改変体対におけるＣＨ３領域のアミノ酸配列情報を示す。

（実施例４：各ヒト免疫グロブリンアイソタイプのためのＡ１０７ヘテロダイマーＦｃ改変体のヘテロ二量体化能力の評価）
実施例３で構築されたＡ１０７ヘテロダイマーＦｃアイソタイプ改変体が野生型Ａ１０７改変体のものに類似のヘテロ二量体化能力を実際に有するかどうかを調べるために、同じ種類の研究でＦｃ改変体のヘテロ二量体化能力を評価するために主に使用される、ｓｃＦｖ−Ｆｃ_ＣＨ３Ａ／Ｆｃ_ＣＨ３Ｂ発現系を使用した（Ｃｈｏｉら、２０１３年）。図６は、ｓｃＦｖ−Ｆｃ_ＣＨ３Ａ／Ｆｃ_ＣＨ３Ｂ発現系を示す概略図である。ｓｃＦｖ−Ｆｃ_ＣＨ３Ａ／Ｆｃ_ＣＨ３Ｂ発現系において精製される抗体は、ｓｃＦｖ−Ｆｃ_ＣＨ３Ａホモダイマー（１０３ｋＤａ）、ｓｃＦｖ−Ｆｃ_ＣＨ３Ａ／Ｆｃ_ＣＨ３Ｂヘテロダイマー（７８ｋＤａ）およびＦｃ_ＣＨ３Ｂホモダイマー（５３ｋＤａ）の間で異なる分子量を示すので、ヘテロダイマーの形成の程度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで比較することができる。

Ｆｃ_ＣＨ３Ｂベクターとして、実施例３で構築されたベクターを使用した。さらに、ｓｃＦｖをＦｃ_ＣＨ３ＡのＮ末端だけに導入することによって、すなわち、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）−ｓｃＦｖ−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３Ａ（ｓｃＦｖ−Ｆｃ_ＣＨ３Ａ）のフォーマットを提供することによってベクターをクローニングした。図７は、ｓｃＦｖ−Ｆｃ_ＣＨ３Ａ／Ｆｃ_ＣＨ３Ｂ発現系において使用される動物細胞発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）−ｓｃＦｖ−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３Ａ（ｓｃＦｖ−Ｆｃ_ＣＨ３Ａ）の概略図である。使用されるｓｃＦｖ抗体は、ＤＲ４に特異的に結合するヒト化抗体ｈＡＹ４の親和性強化バージョンであるｈＡＹ４ａのＶＨおよびＶＬ領域を連結することによって得られる抗体である（Ｌｅｅ， Ｐａｒｋら２０１０年）。ヒンジドメインの直前に位置するＮｏｔＩ制限酵素およびＢｓｉＷＩ制限酵素を使用して、クローニングを実行した。改変体のための対照として、野生型Ｆｃを同じフォーマット（ｓｃＦｖ−Ｆｃ／Ｆｃ）で構築した。

（実施例５：各ヒト免疫グロブリンアイソタイプのためのＡ１０７ヘテロダイマーＦｃ改変体を含む抗体の発現および精製）
構築されたｓｃＦｖ−Ｆｃ_ＣＨ３ＡおよびＦｃ_ＣＨ３Ｂの同時発現を、ＨＥＫ２９３−Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の中に発現ベクター（１：１の比）およびポリエチレンイミン（ＰＥＩ）（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ）の混合物を一時的にトランスフェクトし、無血清ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ２９３発現培地を含有する振盪フラスコの中で細胞を培養することによって実行した。詳細な方法は、以下の通りである。

振盪フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）中の２００ｍＬのトランスフェクションのために、１００ｍｌの培地にＨＥＫ２９３−Ｆ細胞を２．０×１０^６細胞／ｍｌの密度で播種し、８％のＣＯ_２の下の１５０ｒｐｍで培養した。各ヒト化抗体を生成するために、各抗体のための重鎖および軽鎖プラスミドを、１０ｍｌのＦｒｅｅＳｔｙｌｅ２９３発現培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に２５０μｇの総量（２．５μｇ／ｍｌ）（軽鎖について１２５μｇおよび重鎖について１２５μｇ）で希釈し、培地を、その中に希釈された７５０μｇのＰＥＩを含有する１０ｍｌの培地と混合した（７．５μｇ／ｍｌ）。培地混合物を、室温で１０分間インキュベートした。次に、インキュベートした培地混合物を１００ｍｌの播種した細胞に加え、８％のＣＯ_２の下の１５０ｒｐｍで４時間インキュベートし、その後、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ２９３発現培地の残りの１００ｍｌをそれに加え、続いて５〜７日間インキュベートした。このインキュベーションの間、細胞によって生成されたタンパク質、すなわちＦｃ改変体を含む抗体を細胞から分泌させ、培地に蓄積させた。この理由から、細胞培養の後２５００ｒｐｍで２０分間の遠心分離によって収集した細胞培養上清から、プロテインＡセファロースカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用してタンパク質を精製した。この場合、プロテインＡカラムの会社によって提供された標準プロトコールを参照して、精製工程を実行した。ＢＣＡタンパク質アッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏ）における溶液を使用して５６２ｎｍの波長で吸光度を測定し、作成した標準曲線によってその量を決定することによって、精製されたタンパク質を定量化した。

（実施例６：各ヒト免疫グロブリンアイソタイプのためのＡ１０７ヘテロダイマーＦｃ改変体のヘテロ二量体化能力の評価）
実施例５で精製され、各アイソタイプのＡ１０７ヘテロダイマーＦｃ改変体を含む５μｇの抗体を、非還元条件下において１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した（図８）。ＣＨ３Ａ改変体のホモダイマーは、１０３ｋＤで観察され；ＣＨ３Ｂ改変体のホモダイマーは、５３ｋＤで観察され；ＣＨ３Ｂ改変体のモノマーは、２５ｋＤで観察され；ＣＨ３Ａ改変体およびＣＨ３Ｂ改変体のヘテロダイマーは、７８ｋＤで観察された。ホモ二量体化の程度をより正確に調べるために、ウェスタンブロッティングも実行した。１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析におけるものより小さかったタンパク質の０．１μｇを非還元条件下で単離し、当技術分野で公知の従来の方法によってタンパク質を抗ヒトＩｇＧ−ＡＰコンジュゲート抗体（Ｓｉｇｍａ）で次に処理することによって、ウェスタンブロッティングを実行した（図９）。

図８および９に見られるように、対照である野生型ＣＨ３ドメインを導入したＩｇＧ１ヘテロダイマーでは、ＣＨ３ＡおよびＣＨ３Ｂの各々のホモダイマーならびにＣＨ３Ａ：ＣＨ３ＢヘテロダイマーはＳＤＳ−ＰＡＧＥで全て観察されたが、ＩｇＧ１を除いてＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４の中にＡ１０７ヘテロ二量体化変異を導入することによって得られた、各ヒト免疫グロブリンアイソタイプのためのＡ１０７ヘテロダイマーＦｃ改変体は、以前に報告されたＩｇＧ１に基づくＡ１０７改変体のものに類似のまたはより高い収量でヘテロダイマーを全て形成した。このときに、ＩｇＧ４改変体については、ＣＨ３ＡまたはＣＨ３Ｂを含むＦｃモノマー（半分のＦｃ）も観察されたが、それは天然に存在するＩｇＧ４の特性の１つであり、血液中のＦａｂアーム交換の発生の前にヒンジドメイン（特に、コアヒンジ領域の２２８位にセリン）に対して半分のＦｃを形成する特性から生じる（Ｌｉｕ Ｈら、２０１２年）。

（実施例７：ヒト／マウスＩＬ−１２融合タンパク質の構築）
実施例１〜６のアイソタイプ改変体は、以前に報告されたＩｇＧ１に基づくＡ１０７ヘテロダイマーＦｃ改変体のそれと類似のレベルで、それらのヘテロ二量体化能力を保持することが見出された。これらのアイソタイプ改変体の間で、ＩｇＧ４に基づく改変体（γ４−Ａ１０７）を使用して、長期持続ＩＬ−１２融合タンパク質を構築した。天然に存在するＩＬ−１２は、２つのサブユニット、ｐ３５サブユニット（ｐ３５；ＩＬ−１２Ａ）およびｐ４０サブユニット（ｐ４０；ＩＬ−１２Ｂ）で構成され、２つのサブユニットは相互作用して活性を有するヘテロダイマーを形成する。２つのサブユニットは、２つのサブユニットの間に存在する単一のジスルフィド結合によってより強力におよび安定してカップリングするので、このヘテロダイマーの形成は達成される。したがって、天然に存在するサイトカインのヘテロダイマー形態を維持するために、ＩＬ１２の２つのサブユニット（ｐ３５およびｐ４０）を各ヘテロダイマーＦｃ鎖のＮ末端に遺伝子的に融合させた。

融合タンパク質の構築のためのヘテロダイマーＦｃ改変体として、ＩｇＧ４に基づき、Ａ１０７変異の導入によってヘテロダイマーを形成し得るγ４−Ａ１０７を使用した。以前に報告されたように、抗体およびサイトカインの融合であるイムノサイトカインの構築において、ＩｇＧ１の抗体エフェクター機能（ＡＤＣＣ／ＣＤＣなど）はｉｎ ｖｉｖｏクリアランスをむしろ促進する。この理由から、ＩｇＧ１と比較してＡＤＣＣ／ＣＤＣ機能をほとんど示さないＩｇＧ４アイソタイプを使用して、融合タンパク質を構築した（Ｇｉｌｌｉｅｓ ＳＤら、１９９９年）。

図１０は、本発明におけるＩＬ−１２組換えタンパク質、γ４−Ａ１０７を使用して得られた一価のＩＬ−１２融合タンパク質（一価ＩＬ−１２−Ｆｃ）、および野生型Ｆｃを使用して得られた二価のＩＬ−１２融合タンパク質（二価ＩＬ−１２−Ｆｃ）の概略図を示す。特に、図１０（Ｃ）は、本発明におけるＣＨ３改変体対を導入することによって構築された融合タンパク質を示す。シグナル配列を排除した成熟形態をコードする、ヒトＩＬ−１２（ｈＩＬ−１２、Ｕｎｉｐｒｏｔエントリー名Ｐ２９４６０、Ｐ２９４５９；配列番号１７〜１８）およびマウスＩＬ−１２（ｍＩＬ−１２、Ｕｎｉｐｒｏｔエントリー名Ｐ４３４３２、Ｐ４３４３１；配列番号１９〜２０）の各々のＤＮＡ配列を増幅し、各増幅生成物を、図１１（Ａ）および１１（Ｂ）に示すようにＮｏｔＩ／ＢｓｉＷＩ制限酵素の使用によって、γ４−Ａ１０７改変体を含有する動物細胞発現ベクターの中にインフレームでクローニングした。生じたタンパク質は、それぞれ、一価ｈＩＬ−１２−Ｆｃおよび一価ｍＩＬ−１２−Ｆｃと命名した。特に、ヒト／マウスｐ３５サブユニットがｐ４０サブユニットと十分に相互作用できるように、１５アミノ酸からなる可撓性ペプチドリンカーを、ｐ３５サブユニットとヒンジドメインの間に加えた（可撓性（Ｇ_４Ｓ）_３リンカー）。図１０（Ｃ）に示すタンパク質の比較例として、ヒトＩＬ−１２（ｈＩＬ−１２）およびマウスＩＬ−１２（ｍＩＬ−１２）の各々を野生型ＩｇＧ４ Ｆｃ（ｗｔ ＩｇＧ４）に融合することによって、二価ｈＩＬ−１２−Ｆｃおよび二価ｍＩＬ−１２−Ｆｃを構築した。単一のＦｃをヘテロダイマー形態においてのみ活性を有するＩＬ−１２に融合するために、ＩＬ−１２の２つのサブユニットを１５アミノ酸ペプチドリンカーによって互いに連結し、図１２に示すようにＮｏｔＩ／ＢｓｉＷＩ制限酵素の使用によって、γ４−Ａ１０７改変体を含有する動物細胞発現ベクターの中にインフレームで次にクローニングした。比較例は、ＩＬ−１２融合タンパク質を作製するために以前の研究で使用された融合タンパク質である（Ｌｉｓａｎ Ｓ． Ｐｅｎｇら、１９９９年）。

下の表３は、融合タンパク質の構築のために使用されたヒトおよびマウスのＩＬ−１２のサブユニットの成熟形態のためのアミノ酸配列を示す。

（実施例８：ＩＬ−１２融合タンパク質の発現／精製）
図１０（Ｃ）の一価ＩＬ−１２−Ｆｃ融合タンパク質は、実施例５に記載の方法により、ヒト／マウスＩＬ−１２．ｐ４０−γ４−Ａ１０７Ａおよびヒト／マウスＩＬ−１２．ｐ３５−γ４−Ａ１０７Ｂ発現ベクター（１：１の比）から発現させ／精製した。図１０（Ｂ）の二価ＩＬ−１２−Ｆｃ融合タンパク質は、ヒト／マウスｓｃＩＬ−１２−ＩｇＧ４ Ｆｃ（ｗｔ）発現ベクターの単一のトランスフェクションを通して発現させ／精製した。全ての融合タンパク質は、１００ｍｌのＨＥＫ２９３Ｆ細胞培養物につき１２〜１３ｍｇの量で発現させ／精製した。

精製された一価ＩＬ−１２−Ｆｃおよび二価ＩＬ−１２−Ｆｃ融合タンパク質の各々の５μｇを、非還元条件下において１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した（図１３）。ＩＬ−１２．ｐ４０−ＣＨ３Ａ改変体のモノマーは、６０ｋＤで観察され；ＩＬ−１２．ｐ４０−ＣＨ３Ａ改変体のホモダイマーは、１２０ｋＤで観察され；ＩＬ−１２．ｐ３５−ＣＨ３Ｂ改変体のモノマーは、５０ｋＤで観察され；ＩＬ−１２．ｐ３５−ＣＨ３Ｂ改変体のホモダイマーは、１００ｋＤで観察され；ＩＬ−１２．ｐ４０−ＣＨ３Ａ改変体およびＩＬ−１２．ｐ３５−ＣＨ３Ｂ改変体のヘテロダイマーは、１１０ｋＤで観察された。しかし、ヒトおよびマウスのインターロイキンサブユニットを連結することによって得られたタンパク質については、わずかに異なるサイズのバンドが観察され、これらのバンドは異なるグリコシル化パターンからもたらされることが文献で見出された（Ｌｏら、２００７年）。さらに、上の実施例６の記載と同様に、ＩｇＧ４に基づく全てのＩＬ−１２融合タンパク質においてモノマーが観察された。ｐ３５サブユニットがｐ４０サブユニットの助けを借りずにモノマー形態で天然に発現されないという以前の報告に類似して、ヘテロダイマーＦｃ改変体を使用して得られた一価ＩＬ−１２−Ｆｃ融合タンパク質において、ｐ４０サブユニット連結ＣＨ３Ａモノマーだけが観察された（Ｇｉｌｌｉｅｓら、１９９８年ｂ）。

図１４は、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって融合タンパク質を分析した結果を示す。オリゴマーは、一価ｈＩＬ−１２−Ｆｃ融合タンパク質から部分的に観察された。

（実施例９：ＩＬ−１２受容体への一価ｈＩＬ−１２−Ｆｃ融合タンパク質の結合親和性の評価）
実施例８において発現および精製された、一価ｈＩＬ−１２−ＦｃのＩＬ−１２受容体への結合親和性を、二価ｈＩＬ−１２−Ｆｃのそれと比較分析した。

図１５は、構築された一価ｈＩＬ−１２−Ｆｃが、二価ｈＩＬ−１２−Ｆｃと比較して、ＩＬ−１２受容体への結合親和性を示し得ることを決定するために実行したＦＡＣＳ−Ｃａｌｉｂｕｒ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）分析の結果を示す。

具体的には、ヒト末梢血から免疫細胞（ＰＢＭＣ）を単離するために、５ｍｌのＦｉｃｏｌｌ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を１５ｍｌ試験管に充てんした。採取した血液をＰＢＳ（ｐＨ７．４）と１：１で混合し、振盪させ、次に、１０ｍｌの血液をとり、Ｆｉｃｏｌｌと混合しないように７５０ｇで２０分の間「ブレーキなし」の状態でＦｉｃｏｌｌ含有試験管の中で遠心分離した。次に、Ｆｉｃｏｌｌの上に形成したバフィーコートを回収し、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で２回洗浄し、次に、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞および単球を含むＰＢＭＣを得た。単離した正常なＰＢＭＣは、ＩＬ−１２の結合が観察できるほど大量にＩＬ−１２Ｒを発現しなかった。この理由から、Ｔ細胞およびＮＫ細胞を活性化できるように、マイトジェンＰＨＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）による処理によって細胞を７２時間刺激した。細胞をＰＨＡで処理するとき、免疫細胞が分裂する間にＩＬ−１２受容体がＴ細胞およびＮＫ細胞で発現されることが報告された。ＰＢＭＣを１×１０^６細胞／ｍｌの密度で１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地に加え、マイトジェンＰＨＡを１０μｇ／ｍｌの濃度でそれに加え、その後細胞を３７℃で７２時間、５％ＣＯ_２インキュベーターの中で培養した。正常なＰＢＭＣおよびＰＨＡ活性化ＰＢＭＣを冷ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で洗浄し、試料あたり５×１０^５細胞を調製した。Ｆｃ（Ａ１０７）、二価ｈＩＬ−１２−Ｆｃおよび一価ｈＩＬ−１２−Ｆｃの各々を１μＭの濃度で各試料に加え、４℃で３０分の間インキュベートし、次に冷ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で洗浄した。各試料をＦＩＴＣコンジュゲートヒト抗ＩｇＧ４二次抗体（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）と４℃で３０分間インキュベートし、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で洗浄し、次にフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）によって分析した。分析の後、各試料のヒストグラムグラフを得、ＩＬ−１２受容体への一価ｈＩＬ−１２−Ｆｃの結合親和性を評価した。

分析の結果は、二価ｈＩＬ−１２−Ｆｃおよび一価ｈＩＬ−１２−Ｆｃが、ＩＬ−１２受容体を発現しない正常なＰＢＭＣに結合せず、ＩＬ−１２受容体を発現するＰＨＡ活性化ＰＢＭＣだけに結合したことを示した。したがって、ＩＬ−１２受容体への一価ｈＩＬ−１２−Ｆｃの結合親和性が、二価ｈＩＬ−１２−Ｆｃのものと等しいことが判明した。

（実施例１０：ＰＢＭＣ増殖を誘導する一価ｈＩＬ−１２−Ｆｃ融合タンパク質の能力の評価）
ＩＬ−１２融合タンパク質のＩＬ−１２部分が、ＩＬ−１２受容体へのその結合によって実際の組換えＩＬ−１２（ｒＩＬ−１２）のものに同等の生理活性を保持するかどうかについて、組換えヒトＩＬ−１２（ｒｈＩＬ−１２、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を対照として使用して調べた。

図１６は、ＰＨＡ活性化ＰＢＭＣにおける、Ｆｃ（Ａ１０７）、ｒｈＩＬ−１２、二価ｈＩＬ−１２−Ｆｃおよび一価ｈＩＬ−１２−Ｆｃの細胞増殖能力を調べるために実行したＷＳＴ−１細胞増殖アッセイの結果を示す。

具体的には、実施例９に記載されるのと同じ方法でＰＨＡによって活性化されたＰＢＭＣ（２×１０^４細胞、５０μｌ）を９６ウェルプレート（ＳＰＬ、Ｋｏｒｅａ）に加え、続いて１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地で系列希釈した、５０〜０．４ｐＭのＦｃ（Ａ１０７）、ｒｈＩＬ−１２、二価ｈＩＬ−１２−Ｆｃおよび一価ｈＩＬ−１２−Ｆｃの各々の５０μｌを加えた。次に、５％ＣＯ_２の下で細胞を３７℃で７２時間培養した。細胞増殖アッセイのために、１０μｌのＷＳＴ−１（水溶性テトラゾリウム塩、Ｓｉｇｍａ−ａｌｄｒｉｃｈ）試薬を次に各ウェルに加え、３７℃で４時間インキュベートし、マイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して５７０ｎｍの吸光度を測定した。

その結果、一価ｈＩＬ−１２−Ｆｃが、ｒｈＩＬ−１２のものと類似であるかまたはそれより高いＰＢＭＣ増殖能力を有することが示された。

（実施例１１：ＰＢＭＣからのＩＦＮ−γ分泌を誘導する一価ｈＩＬ−１２−Ｆｃ融合タンパク質の能力の評価）
図１７は、Ｆｃ（Ａ１０７）、ｒｈＩＬ−１２、二価ｈＩＬ−１２−Ｆｃおよび一価ｈＩＬ−１２−ＦｃによりＰＨＡ活性化ＰＢＭＣから分泌されるＩＦＮ−γの量を測定するために実行したＥＬＩＳＡの結果を示す。

具体的には、実施例１０で７２時間培養した培養上清の中のＩＦＮ−γの濃度を測定するために、ＥＬＩＳＡのための９６ウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｋｏｒｅａ）を、ヒトＩＦＮ−γ捕捉抗体（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で１２時間コーティングし、ＰＢＳＴで洗浄し、次に１％ＢＳＡ（１％ウシ血清アルブミンを有するＰＢＳ）により室温で１時間ブロックした。ＰＢＳＴ（０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を有するＰＢＳ）による洗浄の後、実施例２で得られた培養上清を１％ＢＳＡで５倍に希釈し、１００μｌの希釈物を各ウェルに加え、室温で２時間インキュベートした。ＰＢＳＴによる洗浄の後、各ウェルをビオチンコンジュゲートＩＦＮ−γ検出抗体（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳＴ（０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を有するＰＢＳ）による洗浄の後、各ウェルをアビジンコンジュゲート西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と室温で３０分の間インキュベートし、ＰＢＳＴ（０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を有するＰＢＳ）で洗浄し、次に３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン基質（ＴＭＢ、ｓｉｇｍａ−ａｌｄｒｉｃｈ）で処理した。マイクロプレートリーダーを使用して、４０５ｎｍの吸光度を測定した。

その結果、ＰＢＭＣからのＩＦＮ−γ分泌を誘導する一価ｈＩＬ−１２−Ｆｃの能力は、ｒｈＩＬ−１２のものと類似であるかまたはそれより高いことが示された。

（実施例１２：ＩＬ−１２受容体への一価ｍＩＬ−１２−Ｆｃの結合親和性の評価）
実施例８において発現／精製された、一価ｍＩＬ−１２−ＦｃのＩＬ−１２受容体への結合親和性を、二価ｍＩＬ−１２−Ｆｃのものと比較分析した。

図１８は、構築された一価ｍＩＬ−１２−Ｆｃが、二価ｍＩＬ−１２−Ｆｃと比較して、ＩＬ−１２受容体への結合親和性を示すことを決定するために実行したフローサイトメトリーの結果を示す。

具体的には、マウスＩＬ−１２がマウスＩＬ−１２受容体だけでなく、ヒトＩＬ−１２受容体にも結合することが報告された。したがって、実施例９に記載されるのと同じ方法で分析を実行した。分析の結果は、二価ｍＩＬ−１２−Ｆｃおよび一価ｍＩＬ−１２−Ｆｃが、ＩＬ−１２受容体を発現しない正常なＰＢＭＣに結合せず、ＩＬ−１２受容体を発現するＰＨＡ活性化ＰＢＭＣだけに結合したことを示した。したがって、ＩＬ−１２受容体への一価ｍＩＬ−１２−Ｆｃの結合親和性が、二価ｍＩＬ−１２−Ｆｃのものと同じであることが示された。

（実施例１３：ＰＢＭＣ増殖を誘導する一価ｍＩＬ−１２−Ｆｃの能力の評価）
図１９は、ＰＨＡ活性化ＰＢＭＣの細胞増殖に及ぼす、Ｆｃ（Ａ１０７）、組換えマウスＩＬ−１２（ｒｍＩＬ−１２）、二価ｍＩＬ−１２−Ｆｃおよび一価ｍＩＬ−１２−Ｆｃの能力の影響を調べるために実行したＷＳＴ−１細胞増殖アッセイの結果を示す。

具体的には、実施例９に記載されるのと同じ方法でＰＨＡによって活性化されたＰＢＭＣ（２×１０^４細胞、５０μｌ）を９６ウェルプレートに加え、続いて１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地で系列希釈した、５０〜０．４ｐＭのＦｃ（Ａ１０７）、ｒｍＩＬ−１２、二価ｍＩＬ−１２−Ｆｃおよび一価ｍＩＬ−１２−Ｆｃの各々の５０μｌを追加した。次に、５％ＣＯ_２の下で細胞を３７℃で７２時間培養し、その後、実施例１０に記載されるのと同じ方法でＷＳＴアッセイを実行した。その結果、一価ｍＩＬ−１２−ＦｃがｒｍＩＬ−１２と同様にＰＢＭＣ増殖を誘導する能力を有することが示された。

（実施例１４：ｉｎ ｖｉｖｏ腫瘍増殖を阻害する一価ｍＩＬ−１２−Ｆｃの能力の評価）
実施例１３では、ＰＨＡ活性化ＰＢＭＣの増殖を誘導する一価ｍＩＬ−１２−Ｆｃの能力を評価した。一価ｍＩＬ−１２−Ｆｃの同じ作用もｉｎ ｖｉｖｏで出現するかどうかを調べた。

図２０（Ａ）および２０（Ｂ）は、生きているマウスの１００ｍｍ^３の腫瘍への一価ｍＩＬ−１２−Ｆｃの腫瘍増殖阻害活性を測定した結果を示す。

具体的には、４週齢雌Ｂａｌｂ／ｃマウス（ＮＡＲＡ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｋｏｒｅａ）の毛を剃り、１５０μＬのＰＢＳに希釈したＣＴ２６^{ＨＥＲ２／Ｎｅｕ}結腸直腸がん細胞（１×１０^６細胞／マウス）をマウスの皮下に移植した。類似の腫瘍体積（平均体積：１００〜１２０ｍｍ^３）を有するマウスをランダムにグループ化し、Ｆｃ（Ａ１０７）、ｒｍＩＬ−１２）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、二価ｍＩＬ−１２−Ｆｃおよび一価ｍＩＬ−１２−Ｆｃの各々を各マウスの腹腔内に１μｇのＩＬ−１２の等モル量に対応する用量で合計６回（週に２回）注射した。腫瘍を週に２回測定し、腫瘍体積（Ｖ）を以下の式を使用して計算した：Ｖ＝長さ×幅^２／２。

図２０（Ａ）に示すように、対照と比較して、１μｇのｒｍＩＬ−１２の投与は腫瘍増殖の阻害に影響を及ぼさなかったが、等モル濃度の一価ｍＩＬ−１２−Ｆｃおよび二価ｍＩＬ−１２−Ｆｃは腫瘍増殖を阻害した。さらに、図２０（Ｂ）に示すように、一価ｍＩＬ−１２−Ｆｃおよび二価ｍＩＬ−１２−Ｆｃの投与は、対照と比較してマウス体重の変化をほとんど示さないか、変化を示さず、一価ｍＩＬ−１２−Ｆｃおよび二価ｍＩＬ−１２−Ｆｃは毒性でないことを示した。

図２１（Ａ）、２１（Ｂ）および２１（Ｃ）は、生きているマウスの３００ｍｍ^３の腫瘍への一価ｍＩＬ−１２−Ｆｃの様々な濃度の腫瘍増殖阻害活性を測定した結果を示す。

具体的には、４週齢雌Ｂａｌｂ／ｃマウス（ＮＡＲＡ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｋｏｒｅａ）の毛を剃り、１５０μＬのＰＢＳに希釈したＣＴ２６^{ＨＥＲ２／Ｎｅｕ}結腸直腸がん細胞（１×１０^６細胞／マウス）をマウスの皮下に移植した。類似の腫瘍体積（平均体積：３００ｍｍ^３）を有するマウスをランダムにグループ化し、二価ｍＩＬ−１２−Ｆｃおよび一価ｍＩＬ−１２−Ｆｃの各々を各マウスの腹腔内に０．１〜２μｇのｒｍＩＬ−１２と等モルの濃度で合計６回（週に２回）注射した。腫瘍を週に２回測定し、腫瘍体積（Ｖ）を以下の式を使用して計算した：Ｖ＝長さ×幅^２／２。

図２１（Ａ）、２１（Ｂ）および２１（Ｃ）に示すように、１μｇのＩＬ−１２またはそれ未満の等モル量に対応する用量で、一価ｍＩＬ−１２−Ｆｃは、二価ＩＬ−１２−Ｆｃと比較して大きな腫瘍の増殖を阻害する高い作用を示した。０．２５μｇのＩＬ−１２の等モル量に対応する濃度で、二価ｍＩＬ−１２−Ｆｃは腫瘍増殖を阻害する作用を示したが、腫瘍を除去しなかった。しかし、同一の投与レジメンの下で、一価ｍＩＬ−１２−Ｆｃは、マウスの４０％において腫瘍を除去する作用を示した。さらに、二価ｍＩＬ−１２−Ｆｃが腫瘍の除去に失敗した０．５μｇのＩＬ−１２の等モル量に対応する濃度で、一価ｍＩＬ−１２−Ｆｃは、わずか５回投与したときでもマウスの７３％において腫瘍を除去した。

（実施例１５：一価ｍＩＬ−１２−Ｆｃのｉｎ ｖｉｖｏ毒性の評価）
図２１（Ｄ）は、様々な濃度で投与した一価ｍＩＬ−１２−Ｆｃのｉｎ ｖｉｖｏ毒性を決定するために体重変化を測定した結果を示す。

具体的には、図２１（Ａ）に示すように、体重が低減するかどうかを、週に２回一価ｍＩＬ−１２−Ｆｃを投与したマウスの体重を測定することによって観察した。対照群において腫瘍体積の増加と共に体重が増加したが、二価ｍＩＬ−１２−Ｆｃおよび一価ｍＩＬ−１２−Ｆｃの全ての濃度で投与されたマウスは、投与前と比較して体重の減少を示さなかったことが示された。したがって、一価ｍＩＬ−１２−Ｆｃは体重の低減を誘導せず、したがって、有意なｉｎ ｖｉｖｏ毒性を有しないと決定された。

図２１（Ｄ）は、肝毒性マーカーであるアラニンアミノ基転移酵素（ＡＬＴ）を測定した結果を示す。

具体的には、最後の投与から２４時間後に図２１（Ａ）のマウスの顔面静脈から血液を採取した。血液凝固を誘導するように血液を室温で２時間静置し、次に８０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清の血清を収集した。血清中のＡＬＴの濃度を測定するために、ＩＬ−１２−Ｆｃ融合タンパク質の最後の投与の２４時間後に、マウス顔面静脈から血液を採取した。血液凝固を誘導するように血液を室温で２時間静置し、次に８０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清の血清を収集した。血清中のＡＬＴの濃度を測定するために、ＡＬＴ測定のための基質溶液（アラニンおよびα−ケトグルタレートの混合物）を１５ｍｌ試験管にとり、３７℃の一定温度の水浴の中で５分間インキュベートした。二価ｍＩＬ−１２−Ｆｃおよび一価ｍＩＬ−１２−Ｆｃの各々を投与した腫瘍移植マウスの血液から単離した血清を１０倍に希釈し、２００μｌの希釈物を基質溶液に加え、振盪し、３７℃の一定温度の水浴の中で３０分間インキュベートした。一定温度の水浴から取り出した試験管に１ｍｌの発色試薬（２，４−ジニトロフェニル−１−ヒドラゾン）を加え、試験管を室温で２０分間静置した。次に、１０ｍｌの０．４Ｎ水酸化ナトリウム溶液を試験管に加えて混合し、次に、試験管を室温で１０分間静置した。光電分光光度計（ＧｅｎｅＱｕａｎｔ１００、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、５０５ｎｍの吸光度を測定した。血清の代わりに標準曲線試薬を加えることによって作成した標準曲線を使用して、ＡＬＴを単位に変換した。二価ｍＩＬ−１２−Ｆｃまたは一価ｍＩＬ−１２−Ｆｃを投与したマウスから採取した血液由来の血清は、対照または正常なＢａｌｂ／ｃマウスの血液試料から分離された血清のものと類似のＡＬＴ活性を示すことが示された。これは、二価ｍＩＬ−１２−Ｆｃまたは一価ｍＩＬ−１２−Ｆｃを０．５μｇまたは１μｇのＩＬ−１２に等モルの濃度で腫瘍移植マウスに投与するとき、それは肝毒性を誘導しないことを示唆する。

（実施例１６：ｉｎ ｖｉｖｏで免疫細胞増殖を誘導する一価ｍＩＬ−１２−Ｆｃの能力の評価）
実施例１５に示すように、二価ｍＩＬ−１２−Ｆｃおよび一価ｍＩＬ−１２−Ｆｃが２μｇのＩＬ−１２の等モル量に対応する濃度で投与されたとき、二価ｍＩＬ−１２−Ｆｃおよび一価ｍＩＬ−１２−Ｆｃは全て腫瘍を除去したが、それらが１μｇのＩＬ−１２より低いモル濃度で投与されたとき、一価ｍＩＬ−１２−Ｆｃの腫瘍増殖阻害作用は二価ｍＩＬ−１２−Ｆｃのそれより有意に高かった。実際、一価ｍＩＬ−１２−Ｆｃの高い腫瘍増殖阻害作用が、ＩＬ−１２受容体を有するＮＫ細胞、ＣＤ４^＋Ｔ細胞およびＣＤ８^＋Ｔ細胞などの固有のエフェクター細胞の数の増加に関連するかどうかを決定するために、分析を実行した。

図２２（Ａ）は、図２１（Ａ）の最終投与から３日目に屠殺したマウスの脾臓における、ＣＤ４^＋Ｔ細胞、ＣＤ８^＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞の数の増加を測定した結果を示す。

具体的には、図２１（Ａ）に示す処置の後、腫瘍移植の３４日後にマウス脾臓を解剖し、ペトリ皿の中でワイヤメッシュ（ｗｉｄｅ ｍｅｓｈ）を使用して砕き、次に１０ｍｌの２％ＦＢＳ含有培地で洗浄した。次に、１ｍｌの赤血球溶解緩衝液をそれに加えて赤血球を溶解し、生じた細胞をＰＢＳで洗浄して脾細胞懸濁物を調製し、細胞の数を血球計数器で計数した。ＡＰＣ、ＦＩＴＣ、ＰＥまたはＰＥ−ｃｙ５コンジュゲート抗ＣＤ４５、抗ＣＤ３、抗ＣＤ４、抗ＣＤ８および抗ＣＤ４９ｂ抗体を脾臓リンパ球に加え、それは、次に４℃で３０分間染色し、冷ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で洗浄し、次にフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）およびＦｌｏｗ ｊｏ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって分析した。各試料をドットプロットによって分析し、ＣＤ４５^＋ＣＤ３^＋ＣＤ４^＋細胞集団、ＣＤ４５^＋ＣＤ３^＋ＣＤ８^＋細胞集団およびＣＤ４５^＋ＣＤ３⁻ＣＤ４９ｂ^＋細胞集団を、それぞれＣＤ４^＋Ｔ細胞、ＣＤ８^＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞と規定し、全体の脾細胞に対するその割合を計算し、血球計数器で計数した細胞数を掛け算し、一価ｍＩＬ−１２−Ｆｃの投与の後に増加したＣＤ４^＋Ｔ細胞、ＣＤ８^＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞の数を分析した。

その結果、対照と比較して、一価ｍＩＬ−１２−Ｆｃが、腫瘍移植マウスにおけるＣＤ４^＋Ｔ細胞およびＣＤ８^＋Ｔ細胞の数を濃度依存的に増加させたことが分かった。しかし、二価ｍＩＬ−１２−Ｆｃは、０．５μｇのＩＬ−１２の等モル量に対応した濃度でそれを投与した群においてだけＣＤ８^＋Ｔ細胞の数を増加させ、１μｇのＩＬ−１２の等モル量に対応した濃度でそれを投与した群では、それはＣＤ４^＋Ｔ細胞およびＣＤ８^＋Ｔ細胞の数を増加させなかった。ＮＫ細胞は腫瘍移植マウスにおいてメモリー細胞を形成しないという以前の研究結果（ＣｅｒｗｅｎｋａおよびＬａｎｉｅｒ、２０１６年；Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒら、２０１１年）と一貫して、腫瘍移植の３４日後に、一価ｍＩＬ−１２−Ｆｃおよび二価ｍＩＬ−１２−Ｆｃを投与した群におけるＮＫ細胞の数が対照群におけるそれと類似していたことが観察された。その結果、一価ｍＩＬ−１２−ＦｃがＣＤ４^＋Ｔ細胞およびＣＤ８^＋Ｔ細胞のより大きな拡大増殖（ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）を引き起こすことが示されたが、これは、二価ｍＩＬ−１２−Ｆｃと比較してより強い腫瘍増殖阻害を説明する。

腫瘍に浸潤した適応性免疫細胞（ＣＤ４^＋Ｔ細胞およびＣＤ８^＋Ｔ細胞）の数の増加が腫瘍増殖の阻害において重要であるという報告（Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒら、２０１１年）に基づいて、一価ｍＩＬ−１２−Ｆｃが腫瘍に浸潤した適応性免疫細胞の数を増加させるかどうかを分析した。一価ｍＩＬ−１２−Ｆｃを６回投与したとき、腫瘍を有しない多くのマウスがあった。この理由から、一価ｍＩＬ−１２−Ｆｃを３回投与し、次に、マウス腫瘍に浸潤した免疫細胞の数を分析した。

図２２（Ｂ）は、図２１（Ａ）の３回目の投与から３日後に屠殺したマウスの腫瘍に浸潤した、全免疫細胞、ＣＤ４^＋Ｔ細胞およびＣＤ８^＋Ｔ細胞の数を測定した結果を示す。

具体的には、図２１（Ａ）に示す処置の後、腫瘍移植の２４日後にマウス腫瘍を解剖し、計量した。次に、ペトリ皿の中でワイヤメッシュおよびコラゲナーゼ（１００μｇ／ｍｌ）を使用して腫瘍を砕き、５０ｇで５分間、１０ｍｌの２％ＦＢＳ含有培地の中で遠心分離して実質組織を取り出した。次に、１ｍｌの赤血球溶解緩衝液をそれに加えて赤血球を溶解し、生じた細胞をＰＢＳで洗浄して細胞懸濁物を調製し、細胞の数を血球計数器で計数した。ＡＰＣ、ＦＩＴＣまたはＰＥ−ｃｙ５コンジュゲート抗ＣＤ４５、抗ＣＤ３、抗ＣＤ４および抗ＣＤ８抗体を腫瘍から単離した細胞に加え、それを、次に４℃で３０分間染色し、冷ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で洗浄し、次にフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）およびＦｌｏｗ ｊｏ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって分析した。各試料をドットプロットによって分析し、次に、ＣＤ４５^＋細胞集団、ＣＤ４５^＋ＣＤ３^＋ＣＤ４^＋細胞集団およびＣＤ４５^＋ＣＤ３^＋ＣＤ８^＋細胞集団およびＣＤ４５^＋ＣＤ３⁻ＣＤ４９ｂ^＋細胞集団を、それぞれ全腫瘍浸潤免疫細胞、腫瘍浸潤ＣＤ４^＋Ｔ細胞および腫瘍浸潤ＣＤ８^＋Ｔ細胞と規定した。全腫瘍から単離した細胞に対するこれらの細胞の割合を計算し、血球計数器で計数した細胞数を掛け算し、次に、一価ｍＩＬ−１２−Ｆｃの投与の後に増加した全腫瘍浸潤免疫細胞、腫瘍浸潤ＣＤ４^＋Ｔ細胞および腫瘍浸潤ＣＤ８^＋Ｔ細胞の数を分析した。

その結果、対照と比較して、二価ｍＩＬ−１２−Ｆｃおよび一価ｍＩＬ−１２−Ｆｃが、腫瘍に浸潤した全免疫細胞、ＣＤ４^＋Ｔ細胞およびＣＤ８^＋Ｔ細胞の数を濃度依存的に増加させたことが分かった。等モル濃度では、二価ｍＩＬ−１２−Ｆｃと比較して、一価ｍＩＬ−１２−Ｆｃは、腫瘍に浸潤した全免疫細胞、ＣＤ４^＋Ｔ細胞およびＣＤ８^＋Ｔ細胞を有意に増加させた。その結果、一価ｍＩＬ−１２−Ｆｃが腫瘍においてＣＤ４^＋Ｔ細胞およびＣＤ８^＋Ｔ細胞のより大きな浸潤を引き起こすことが示されたが、これは、二価ｍＩＬ−１２−Ｆｃと比較してより強い腫瘍増殖阻害を説明する。

（実施例１７：ｉｎ ｖｉｖｏでの免疫細胞からのサイトカイン分泌および細胞毒性の増加に及ぼす一価ｍＩＬ−１２−Ｆｃの作用の評価）
ＩＬ−１２は、Ｔ細胞およびＮＫ細胞からのＩＦＮ−γの分泌を増加させることによってがん細胞の増殖を阻害することが知られている（Ｔｒｉｎｃｈｉｅｒｉ、２００３年）。さらに、ＩＬ−１２は、がん細胞に対する細胞傷害性Ｔ細胞およびナチュラルキラー細胞の直接的な細胞傷害作用を増強することによって抗がん作用を示す。したがって、一価ＩＬ−１２−Ｆｃの高い抗がん作用が、腫瘍移植マウスの血清中ＩＦＮ−γ濃度の増加に、ならびにがん細胞に対する細胞傷害性Ｔ細胞およびナチュラルキラー細胞の直接的な細胞傷害作用の増強に起因するかどうかを決定するために、分析を実行した。

図２３（Ａ）は、図２１（Ａ）の最終投与の２４時間後にマウス顔面静脈から採取した血液から分離した血清中のＩＦＮ−γの濃度を測定するために実行したＥＬＩＳＡの結果を示す。

具体的には、図２０（Ａ）のｍＩＬ−１２−Ｆｃ融合タンパク質の最終投与の２４時間後に、マウスの顔面静脈から血液を採取した。血液凝固を誘導するように血液を室温で２時間静置し、次に８０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清の血清を収集した。血清中のＩＦＮ−γの濃度を測定するために、ＥＬＩＳＡのための９６ウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、マウスＩＦＮ−γ捕捉抗体で１２時間コーティングし、ＰＢＳＴ（０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を有するＰＢＳ）で洗浄し、次に１％ＢＳＡ（１％ウシ血清アルブミンを有するＰＢＳ）により室温で１時間ブロックした。ＰＢＳＴ（０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を有するＰＢＳ）による洗液の後、血清を１％ＢＳＡで１０倍に希釈し、室温で２時間インキュベートした。ＰＢＳＴ（０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を有するＰＢＳ）による洗浄の後、各ウェルをビオチンコンジュゲートマウスＩＦＮ−γ検出抗体（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳＴ（０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を有するＰＢＳ）による洗浄の後、各ウェルをアビジンコンジュゲート西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と室温で３０分間インキュベートし、ＰＢＳＴ（０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を有するＰＢＳ）で洗浄し、次に３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン基質（ＴＭＢ、ｓｉｇｍａ−ａｌｄｒｉｃｈ）で処理した。マイクロプレートリーダーを使用して、４５０ｎｍの吸光度を測定した。図２３（Ａ）に示すように、二価ｍＩＬ−１２−Ｆｃを投与したマウスの血清中ＩＦＮ−γ濃度は、対照群のものと比較して増加しなかった。しかし、対照群のものと比較して、１ｍｇのｒｍＩＬ１２の等モル量までの用量に比例した一価ｍＩＬ１２−Ｆｃ処置を受けたマウスでは、血清中ＩＦＮ−γレベルが増加することが観察された。さらに、一価ｍＩＬ−１２−Ｆｃが一部のがん細胞の増殖を阻害する作用を有することが知られているＩＦＮ−γの分泌を増加させたので、一価ｍＩＬ−１２−Ｆｃの腫瘍形成阻害作用があったことが示された。

二価ｍＩＬ１２−Ｆｃで処置した腫瘍移植マウスでは、ＩＦＮ−γの血清中レベルは低かった（図２３（Ａ））。したがって、二価ｍＩＬ−１２−ＦｃがＮＫ細胞およびＴ細胞からのＩＦＮ−γの分泌を誘導する能力が低いかどうかを決定するために、一価ｍＩＬ−１２−Ｆｃおよび二価ｍＩＬ−１２−Ｆｃの単一の投与の後の示した時点で血清中ＩＦＮ−γ濃度を測定した。

図２３（Ｂ）は、ＣＴ２６^{ＨＥＲ２／Ｎｅｕ}結腸直腸がん細胞を移植したＢａｌｂ／ｃマウスへの二価ｍＩＬ−１２−Ｆｃおよび一価ｍＩＬ−１２−Ｆｃの単一の腹腔内投与の後の様々な示した時点で、血清中のＩＦＮ−γの濃度を測定するために実行したＥＬＩＳＡの結果を示す。

具体的には、ＣＴ２６^{ＨＥＲ２／Ｎｅｕ}結腸直腸がん細胞を移植したＢａｌｂ／ｃマウスの腫瘍体積が３００ｍｍ^３に到達したときに、二価ｍＩＬ−１２−Ｆｃおよび一価ｍＩＬ−１２−Ｆｃを１μｇのｒｍＩＬ−１２と等モルの濃度で腹腔内に投与した。１、３および５日後に、マウスの顔面静脈から血液を採取した。血液凝固を誘導するように血液を室温で２時間静置し、８０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清の血清を収集した。血清中のＩＦＮ−γの濃度を測定するために、ＥＬＩＳＡのための９６ウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、マウスＩＦＮ−γ捕捉抗体で１２時間コーティングし、ＰＢＳＴ（０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を有するＰＢＳ）で洗浄し、次に１％ＢＳＡ（１％ウシ血清アルブミンを有するＰＢＳ）により室温で１時間ブロックした。ＰＢＳＴ（０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を有するＰＢＳ）による洗液の後、血清を１％ＢＳＡで１０倍に希釈し、室温で２時間インキュベートした。ＰＢＳＴ（０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を有するＰＢＳ）による洗浄の後、各ウェルをビオチンコンジュゲートマウスＩＦＮ−γ検出抗体（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳＴ（０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を有するＰＢＳ）による洗浄の後、各ウェルをアビジンコンジュゲート西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と室温で３０分間インキュベートし、ＰＢＳＴ（０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を有するＰＢＳ）で洗浄し、次に３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン基質（ＴＭＢ、ｓｉｇｍａ−ａｌｄｒｉｃｈ）で処理した。マイクロプレートリーダーを使用して、４５０ｎｍの吸光度を測定した。図２３（Ｂ）に示すように、腫瘍移植マウスでは、二価ｍＩＬ−１２−Ｆｃを投与した群は、５日目まで一価ｍＩＬ−１２−Ｆｃ群のものと類似の血清中ＩＦＮ−γ濃度を示し、二価ｍＩＬ−１２−Ｆｃが、エフェクター細胞からのＩＦＮ−γの分泌を誘導する能力に固有の欠陥を有しないことを示唆した。

図２３（Ｃ）は、ＣＴ２６^{ＨＥＲ２／Ｎｅｕ}がん細胞に対する、図２１（Ａ）の最終投与から３日後に屠殺したマウスの脾臓から単離した、細胞傷害性Ｔ細胞の細胞傷害作用を測定した結果を示すグラフである。

具体的には、図２１（Ａ）のサイトカインの最終投与から７２時間後に、マウスを屠殺し、脾臓をそこから解剖し、７０ミクロンメッシュおよびＰＢＳを含有する６０ｍｍ皿の中で砕いた。遠心分離によって得た細胞に、赤血球溶解緩衝液を加えて赤血球を溶解した。次に、細胞をＰＢＳで洗浄し、ＡＰＣコンジュゲート抗ＣＤ３抗体（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）およびＰＥコンジュゲート抗ＣＤ８抗体と４℃で３０分間インキュベートした。細胞をＰＢＳで洗浄した後、ＦＡＣＳ Ａｒｉａ ＩＩＩ（ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｋｏｒｅａ）を使用して、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＤ３^＋ＣＤ８^＋）を単離した。標的ＣＴ２６^{ＨＥＲ２／Ｎｅｕ}がん細胞に対する細胞傷害性Ｔ細胞の細胞傷害作用を測定するために、ＣＴ２６^{ＨＥＲ２／Ｎｅｕ}がん細胞をカルセインＡＭ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．、１０μＭ）で染色した。ＣＴ２６^{ＨＥＲ２／Ｎｅｕ}がん細胞（２×１０^６）を２ｍｌのＤＰＢＳに懸濁し、２μｌのカルセインＡＭ（１０ｍＭ）と混合し、次に５％ＣＯ_２の下の３７℃で４５分間インキュベートした。１０ｍｌの１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０による洗浄の後、細胞をウェルにつき２×１０^４細胞の密度で９６ウェルプレートの各ウェルに加え、細胞傷害性Ｔ細胞（１×１０^５／１００μｌ／ウェル）を各ウェルに加え、５％ＣＯ_２の下の３７℃で４時間インキュベートした。緑色蛍光を示しているＣＴ２６^{ＨＥＲ２／Ｎｅｕ}がん生細胞および緑色蛍光を示していないＣＴ２６^{ＨＥＲ２／Ｎｅｕ}がん死細胞をフローサイトメトリーによって分析し、細胞傷害性Ｔ細胞の細胞傷害作用を、百分率で表した。二価ｍＩＬ−１２−Ｆｃを投与した腫瘍移植マウスから単離した細胞傷害性Ｔ細胞または対照群から単離した細胞傷害性Ｔ細胞と比較して、一価ｍＩＬ−１２−Ｆｃを投与した腫瘍移植マウスから単離した細胞傷害性Ｔ細胞が、標的ＣＴ２６^{ＨＥＲ２／Ｎｅｕ}がん細胞に対してより高い細胞傷害作用を示したことが示された。さらに、一価ｍＩＬ−１２−Ｆｃの腫瘍形成阻害作用が、がん細胞に対する一部の細胞傷害性Ｔ細胞の直接的細胞傷害作用に帰されたことが示された。

図２３（Ｄ）は、腫瘍移植マウスへの一価ＩＬ−１２−Ｆｃの投与によって増強された細胞傷害性Ｔ細胞の細胞傷害作用が腫瘍抗原特異的であるかどうかを決定するために、腫瘍抗原を発現するＣＴ２６^{ＨＥＲ２／Ｎｅｕ}がん細胞および腫瘍抗原を発現しない４Ｔ１細胞を使用して、図２１（Ａ）の３回目の投与から３日後に屠殺したマウスの脾臓から単離した、細胞傷害性Ｔ細胞の細胞傷害作用を測定した結果を示す。

具体的には、図２０（Ａ）の一価ＩＬ−１２−Ｆｃの３回目の投与から７２時間後に、マウスを屠殺し、脾臓をそこから解剖し、７０ミクロンメッシュおよびＰＢＳを含有する６０ｍｍ皿の中で砕いた。標的ＣＴ２６^{ＨＥＲ２／Ｎｅｕ}がん細胞および非標的４Ｔ１細胞に対する細胞傷害性Ｔ細胞の細胞傷害作用を測定するために、図２１（Ｃ）で使用した方法によって、ＣＴ２６^{ＨＥＲ２／Ｎｅｕ}がん細胞および４Ｔ１がん細胞をカルセインＡＭ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．、１０μＭ）で染色した。１０ｍｌの１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０による３回の洗浄の後、細胞をウェルにつき２×１０^４細胞の密度で９６ウェルプレートの各ウェルに加え、細胞傷害性Ｔ細胞（１×１０^５／１００μｌ／ウェル）を各ウェルに加え、５％ＣＯ_２の下の３７℃のインキュベーターの中で４時間インキュベートした。緑色蛍光を示しているＣＴ２６^{ＨＥＲ２／Ｎｅｕ}がん生細胞および緑色蛍光を示していないＣＴ２６^{ＨＥＲ２／Ｎｅｕ}がん死細胞または４Ｔ１がん細胞をフローサイトメトリーによって分析し、細胞傷害性Ｔ細胞の細胞傷害作用を百分率で表した。その結果、一価ｍＩＬ−１２−Ｆｃの投与によって増強された細胞傷害性Ｔ細胞の細胞傷害作用が標的細胞特異的であることが示された。

図２３（Ｅ）は、ＣＴ２６^{ＨＥＲ２／Ｎｅｕ}がん細胞に対する、図２１（Ａ）の３回目の投与から３日後に屠殺したマウスの脾臓から単離した、ナチュラルキラー細胞の細胞傷害作用を測定した結果を示す。

具体的には、図２１（Ａ）のサイトカインの３回目の投与から３日後に、マウスを屠殺し、脾臓をそこから解剖し、７０ミクロンメッシュおよびＰＢＳを含有する７０ｍｍ皿の中で砕いた。遠心分離によって得た細胞に、赤血球溶解緩衝液を加えて赤血球を溶解した。次に、細胞をＰＢＳで洗浄し、ＡＰＣコンジュゲート抗ＣＤ３抗体（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）およびＰＥコンジュゲート抗ＣＤ４９ｂ抗体と４℃で３０分間インキュベートした。細胞をＰＢＳで洗浄した後、ＦＡＣＳ Ａｒｉａ ＩＩＩ（ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｋｏｒｅａ）を使用して、ナチュラルキラー細胞（ＣＤ３⁻ＣＤ４９ｂ^＋）を単離した。標的ＣＴ２６^{ＨＥＲ２／Ｎｅｕ}がん細胞に対するナチュラルキラー細胞の細胞傷害作用を測定するために、ＣＴ２６^{ＨＥＲ２／Ｎｅｕ}がん細胞をカルセインＡＭ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．、１０μＭ）で染色した。ＣＴ２６^{ＨＥＲ２／Ｎｅｕ}がん細胞（２×１０^６）を２ｍｌのＤＰＢＳに懸濁し、２μｌのカルセインＡＭ（１０ｍＭ）と混合し、次に５％ＣＯ_２の下の３７℃で４５分間インキュベートした。１０ｍｌの１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０による洗浄の後、細胞をウェルにつき２×１０^４細胞の密度で９６ウェルプレートの各ウェルに加え、ナチュラルキラー細胞（１×１０^５／１００μｌ／ウェル）を各ウェルに加え、５％ＣＯ_２の下の３７℃で４時間インキュベートした。緑色蛍光を示しているＣＴ２６^{ＨＥＲ２／Ｎｅｕ}がん生細胞および緑色蛍光を示していないＣＴ２６^{ＨＥＲ２／Ｎｅｕ}がん死細胞をフローサイトメトリーによって分析し、ナチュラルキラー細胞の細胞傷害作用を百分率で表した。二価ｍＩＬ−１２−Ｆｃを投与した腫瘍移植マウスから単離したナチュラルキラー細胞または対照群から単離した細胞傷害性Ｔ細胞と比較して、一価ｍＩＬ−１２−Ｆｃを投与した腫瘍移植マウスから単離したナチュラルキラー細胞が、標的ＣＴ２６^{ＨＥＲ２／Ｎｅｕ}がん細胞に対してより高い細胞傷害作用を示したことが示された。さらに、一価ｍＩＬ−１２−Ｆｃの腫瘍形成阻害作用が、がん細胞に対する一部のナチュラルキラー細胞の直接的細胞傷害作用に帰されたことが示された。

（実施例１８：ｉｎ ｖｉｖｏでエフェクターＣＤ８^＋Ｔ細胞およびメモリーＣＤ８^＋Ｔ細胞を形成する一価ｍＩＬ−１２−Ｆｃの能力の評価）
腫瘍移植マウスでの適応免疫の生成は、エフェクターメモリーＣＤ８^＋Ｔ細胞およびメモリーＣＤ８^＋Ｔ細胞が生成されるかどうかによって評価する。一価ｍＩＬ−１２−Ｆｃの腫瘍除去作用を、エフェクターメモリーＣＤ８^＋Ｔ細胞およびメモリーＣＤ８^＋Ｔ細胞の生成に帰されるかどうかについて、測定した。

図２４（Ａ）、２４（Ｂ）および２４（Ｃ）は、一価ｍＩＬ−１２−Ｆｃを担腫瘍マウスに投与したときに生成された、エフェクターＣＤ８^＋Ｔ細胞、エフェクターメモリーＣＤ８^＋Ｔ細胞およびメモリーＣＤ８^＋Ｔ細胞の数を測定した結果を示す。

具体的には、図２１（Ａ）に示す処置の後、腫瘍移植の３４日後にマウス脾臓を解剖し、ペトリ皿の中でワイヤメッシュを使用して砕き、次に１０ｍｌの２％ＦＢＳ含有培地で洗浄した。次に、１ｍｌの赤血球溶解緩衝液をそれに加えて赤血球を溶解し、生じた細胞をＰＢＳで洗浄して脾細胞懸濁物を調製し、細胞の数を血球計数器で計数した。ＡＰＣ、ＦＩＴＣ、ＰＥまたはＰＥ−ｃｙ５コンジュゲート抗ＣＤ３、抗ＣＤ８、抗ＣＤ６２Ｌおよび抗ＩＬ−７受容体（ＩＬ−７Ｒ）抗体を脾細胞に加え、それは、次に４℃で３０分間染色し、冷ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で洗浄し、次にフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）およびＦｌｏｗ ｊｏ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって分析した。各試料をドットプロットによって分析し、ＣＤ３^＋ＣＤ８^＋ＣＤ６２Ｌ^ｌｏｗＩＬ−７Ｒ^ｌｏｗ細胞集団、ＣＤ３^＋ＣＤ８^＋ＣＤ６２Ｌ^ｌｏｗＩＬ−７Ｒ^ｈｉ細胞集団およびＣＤ３^＋ＣＤ８^＋ＣＤ６２Ｌ^ｈｉＩＬ−７Ｒ^ｈｉ細胞集団を、それぞれエフェクターＣＤ８^＋Ｔ細胞、エフェクターメモリーＣＤ８^＋Ｔ細胞およびメモリーＣＤ８^＋Ｔ細胞と規定し、全体の脾細胞に対するその割合を計算し、血球計数器で計数した細胞数を掛け算し、一価ｍＩＬ−１２−Ｆｃの投与の後に増加したエフェクターＣＤ８^＋Ｔ細胞、エフェクターメモリーＣＤ８^＋Ｔ細胞およびメモリーＣＤ８^＋Ｔ細胞の数を分析した。

その結果、対照と比較して、一価ｍＩＬ−１２−Ｆｃが腫瘍移植マウスにおけるエフェクターメモリーＣＤ８^＋Ｔ細胞およびメモリーＣＤ８^＋Ｔ細胞の数を濃度依存的に増加させたことが分かった。しかし、二価ｍＩＬ−１２−Ｆｃは、０．５μｇのＩＬ−１２の等モル量に対応した濃度で投与した群においてだけエフェクターメモリーＣＤ８^＋Ｔ細胞およびメモリーＣＤ８^＋Ｔ細胞の数を増加させ、１μｇのＩＬ−１２の等モル量に対応した濃度でそれを投与した群では、エフェクターメモリーＣＤ８^＋Ｔ細胞およびメモリーＣＤ８^＋Ｔ細胞の数を増加させなかった。したがって、一価ｍＩＬ−１２−Ｆｃのより高い腫瘍形成阻害作用が、二価ｍＩＬ−１２−Ｆｃと比較して、エフェクターメモリーＣＤ８^＋Ｔ細胞およびメモリーＣＤ８^＋Ｔ細胞の数の増加に帰されたことが見出された。

図２４（Ｄ）は、図２１（Ａ）の１μｇの一価ＩＬ−１２−Ｆｃの投与から１２０日後の生存マウスにＣＴ２６^{ＨＥＲ２／Ｎｅｕ}がん細胞を再移植し、マウスにおける腫瘍体積の変化を測定することによって得られた結果を示す。

具体的には、図２１（Ａ）の雌Ｂａｌｂ／ｃマウス（ＮＡＲＡ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｋｏｒｅａ）への１μｇの一価ＩＬ−１２−Ｆｃの最終投与から１２０日後に、生存マウスの毛を剃り、１５０μＬのＰＢＳに希釈したＣＴ２６^{ＨＥＲ２／Ｎｅｕ}細胞（１×１０^６細胞／マウス）をマウスの皮下に移植した。次に、１μｇの一価ＩＬ−１２−Ｆｃのさらなる投与なしに腫瘍を週に２回測定し、腫瘍体積（Ｖ）を以下の式を使用して計算した：Ｖ＝長さ×幅^２／２。その結果、対照群と比較して、１μｇの一価ｍＩＬ−１２−Ｆｃの投与の後に生存したマウスの腫瘍は、１１日から縮小し始めたことが分かった。したがって、一価ｍＩＬ−１２−Ｆｃを腫瘍移植マウスに投与したとき、それがエフェクターメモリーＣＤ８^＋Ｔ細胞およびメモリーＣＤ８^＋Ｔ細胞を生成したことが判明し、したがって腫瘍をマウスに再び移植したときでさえ、それは除去されるであろう。

（実施例１９：ｉｎ ｖｉｖｏでメモリー前駆体エフェクターＣＤ８^＋Ｔ細胞を形成する一価ｍＩＬ−１２−Ｆｃの能力の評価）
実施例１６および１８では、腫瘍移植マウスにおいてＣＤ８^＋Ｔ細胞、エフェクターメモリーＣＤ８^＋Ｔ細胞およびセントラルメモリーＣＤ８^＋Ｔ細胞の数の増加に及ぼす二価ｍＩＬ−１２−Ｆｃの作用が、一価ｍＩＬ−１２−Ｆｃのものより低いことが観察された。活性化ＣＤ８^＋Ｔ細胞が腫瘍細胞を直接的に破壊するエフェクター段階の後、エフェクターＣＤ８^＋Ｔ細胞はメモリー前駆体エフェクター細胞（ＭＰＥＣ）に、次にメモリーＣＤ８^＋Ｔ細胞に部分的に分化し、大部分は短寿命エフェクター細胞（ＳＬＥＣ）に分化することが報告された。したがって、二価ｍＩＬ−１２−Ｆｃの投与によって活性化されるＣＤ８^＋Ｔ細胞が短寿命エフェクター細胞に分化し、したがって生成されるメモリーＣＤ８^＋Ｔ細胞の数が小さく、そのためそれらが腫瘍を除去できないかどうかを決定するために分析を実行した。

図２４（Ｅ）は、図２１（Ａ）の３回目の投与から３日後に屠殺したマウスの脾臓に存在するＣＤ８^＋Ｔ細胞の中のメモリー前駆体エフェクター細胞（ＫＬＲＧ１⁻ＩＬ−７Ｒ^＋）および短寿命エフェクター細胞（ＫＬＲＧ１^＋ＩＬ−７Ｒ⁻）の割合を分析した結果を示す。

具体的には、図２１（Ａ）に示す処置の後、腫瘍移植の２４日後にマウス脾臓を解剖し、ペトリ皿の中でワイヤメッシュを使用して砕き、次に１０ｍｌの２％ＦＢＳ含有培地で洗浄した。次に、１ｍｌの赤血球溶解緩衝液をそれに加えて赤血球を溶解し、生じた細胞をＰＢＳで洗浄して細胞懸濁物を調製した。ＡＰＣ、ＦＩＴＣ、ＰＥまたはＰＥ−ｃｙ５コンジュゲート抗ＣＤ３、抗ＣＤ８、抗ＫＬＲＧ１および抗ＩＬ−７受容体（ＩＬ−７Ｒ）抗体を脾臓細胞に加え、それを、次に４℃で３０分間染色し、冷ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で洗浄し、次にフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）およびＦｌｏｗ ｊｏ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって分析した。各試料をドットプロットによって分析し、ＣＤ３^＋ＣＤ８^＋ＫＬＲＧ１⁻ＩＬ−７Ｒ^＋細胞集団およびＣＤ３^＋ＣＤ８^＋ＫＬＲＧ１＿^＋ＩＬ−７Ｒ⁻細胞集団を、それぞれメモリー前駆体エフェクター細胞および短寿命エフェクター細胞と規定し、全脾細胞と比較したその割合を分析した。

その結果、対照と比較して、一価ｍＩＬ−１２−Ｆｃが腫瘍移植マウスにおけるメモリー前駆体エフェクター細胞の割合を濃度依存的に増加させたことが分かった。しかし、二価ｍＩＬ−１２−Ｆｃの投与は、対照と比較してメモリー前駆体エフェクター細胞の割合を増加させなかったが、短寿命エフェクター細胞の数をむしろ増加させた。したがって、二価ｍＩＬ−１２−Ｆｃと比較して、一価ｍＩＬ−１２−Ｆｃが、メモリー前駆体エフェクター細胞の生成を促進することによってエフェクターメモリーＣＤ８^＋Ｔ細胞およびメモリーＣＤ８^＋Ｔ細胞の数を有意に増加させたことが見出され、それが腫瘍除去により高い作用を有することを示した。

（実施例２０：メモリー細胞分化の誘導に関与する転写因子の発現に及ぼす一価ｍＩＬ−１２−Ｆｃの作用の評価）
ＣＤ８^＋Ｔ細胞を高濃度のＩＬ−１２と投与したとき、または２日間もしくはそれより長くＩＬ−１２を頻繁に投与することによって活性化したとき、ＣＤ８^＋Ｔ細胞が短寿命エフェクター細胞に分化することを可能にする転写因子Ｔ−ｂｅｔの発現が増加し、ＣＤ８^＋Ｔ細胞がメモリー前駆体エフェクター細胞に分化することを可能にする転写因子ｅｏｍｅｓｏｄｅｒｍｉｎ（Ｅｏｍｅｓ）の発現が低下することが報告された。したがって、一価ｍＩＬ−１２−Ｆｃおよび二価ｍＩＬ−１２−Ｆｃが、短寿命エフェクター細胞に分化するＣＤ８^＋Ｔ細胞の割合を変化させるようにＣＤ８^＋Ｔ細胞においてＴ−ｂｅｔおよびＥｏｍｅｓの発現を差次的に調節するかどうかを決定するために、分析を実行した。

図２５（Ａ）および２５（Ｂ）は、図２１（Ａ）の３回目の投与から３日後に屠殺したマウスの脾臓の中の、ＣＤ８^＋Ｔ細胞（メモリー細胞の分化を阻害するＴ−ｂｅｔの高い発現を示す）およびＣＤ８^＋Ｔ細胞（メモリー細胞の分化を促進するＥｏｍｅｓの低い発現を示す）の割合を測定するために実行したフローサイトメトリー分析の結果を示す。

具体的には、図２１（Ａ）に示す処置の後、腫瘍移植の２４日後にマウス脾臓を解剖し、ペトリ皿の中でワイヤメッシュを使用して砕き、次に１０ｍｌの２％ＦＢＳ含有培地で洗浄した。次に、１ｍｌの赤血球溶解緩衝液をそれに加えて赤血球を溶解し、生じた細胞をＰＢＳで洗浄して細胞懸濁物を調製した。脾細胞をＰＥ−ｃｙ５またはＦＩＴＣコンジュゲート抗ＣＤ３および抗ＣＤ８抗体により４℃で３０分間染色し、冷ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で洗浄した。次に、Ｆｏｘｐ３／転写因子染色緩衝液セット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）（細胞核内転写因子染色試薬である）で細胞を固定し、透過処理した。次に、細胞をＰＥまたはｅｆｌｕｏｒ６６０コンジュゲート抗Ｔ−ｂｅｔまたは抗Ｅｏｍｅｓ抗体により４℃で３０分間染色し、次に透過処理緩衝液でのフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）およびフローサイトメトリーデータ分析のためのＦｌｏｗ ｊｏ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって分析した。各試料をドットプロットによって分析し、ＣＤ３^＋ＣＤ８^＋Ｔ−ｂｅｔ^ｈｉｇｈ細胞集団およびＣＤ３^＋ＣＤ８^＋Ｅｏｍｅｓ^＋Ｔ−ｂｅｔ^ｌｏｗ細胞集団の割合を分析した。その結果、対照と比較して、一価ｍＩＬ−１２−ＦｃがＣＤ３^＋ＣＤ８^＋Ｔ−ｂｅｔ^ｈｉｇｈ細胞集団の割合を濃度依存的に低減させ、ＣＤ３^＋ＣＤ８^＋Ｅｏｍｅｓ^＋Ｔ−ｂｅｔ^ｌｏｗ細胞集団の割合を濃度依存的に増加させたことが見られた。しかし、二価ｍＩＬ−１２−Ｆｃは、０．５μｇのＩＬ−１２の等モル量に対応した濃度でそれを投与した群においてだけＣＤ３^＋ＣＤ８^＋Ｔ−ｂｅｔ^ｈｉｇｈ細胞集団の割合を低減させ、群の中のＣＤ３^＋ＣＤ８^＋Ｅｏｍｅｓ^＋Ｔ−ｂｅｔ^ｌｏｗ細胞集団の割合を増加させた。さらに、二価ｍＩＬ−１２−Ｆｃを１μｇのＩＬ−１２の等モル量に対応した濃度で投与した群においては、二価ｍＩＬ−１２−ＦｃはＣＤ３^＋ＣＤ８^＋Ｔ−ｂｅｔ^ｈｉｇｈ細胞集団の割合を低減させる作用も、ＣＤ３^＋ＣＤ８^＋Ｅｏｍｅｓ^＋Ｔ−ｂｅｔ^ｌｏｗ細胞集団の割合を増加させる作用も示さなかった。したがって、二価ｍＩＬ−１２−Ｆｃと比較して、一価ｍＩＬ−１２−Ｆｃは、エフェクターメモリーＣＤ８^＋Ｔ細胞およびメモリーＣＤ８^＋Ｔ細胞の数を有意に増加させるために、ＣＤ３^＋ＣＤ８^＋Ｔ−ｂｅｔ^ｈｉｇｈ細胞集団の割合を低減させ、ＣＤ３^＋ＣＤ８^＋Ｅｏｍｅｓ^＋Ｔ−ｂｅｔ^ｌｏｗ細胞集団の割合を増加させることによって、より高い腫瘍除去作用を有することが見出された。

Ｔ細胞受容体シグナルおよび共起刺激シグナルの存在下でＣＤ８^＋Ｔ細胞をＩＬ−１２などの炎症性サイトカインで刺激するとき、ＳＴＡＴ４のリン酸化が増加し、リン酸化されたＳＴＡＴ４（ｐＳＴＡＴ４）は核に移動し、Ｔ−ｂｅｔエンハンサーに結合し、それによってＴ−ｂｅｔの発現を増加させることが公知である。したがって、１μｇのＩＬ−１２の等モル量に対応した濃度で二価ｍＩＬ−１２−Ｆｃを投与したときに起こった、短寿命エフェクター細胞へのＣＤ８^＋Ｔ細胞の分化が、一価ｍＩＬ−１２−Ｆｃと比較して、１μｇのＩＬ−１２の等モル量に対応した濃度での二価ｍＩＬ−１２−Ｆｃの投与が、腫瘍移植マウスの腫瘍流入領域リンパ節においてＴ細胞が活性化されたときにｐＳＴＡＴ４およびＴ−ｂｅｔの発現を増加させたことが原因であるかどうかを決定するために、分析を実行した。

図２５（Ｃ）は、ＣＴ２６^{ＨＥＲ２／Ｎｅｕ}を移植したＢａｌｂ／ｃマウスの腫瘍体積が３００ｍｍ^３に到達したときに、二価ｍＩＬ−１２−Ｆｃおよび一価ｍＩＬ−１２−Ｆｃを１μｇのｒｍＩＬ−１２の等モル量に対応した濃度で腹腔内に一度投与してから２４時間後に腫瘍流入領域リンパ節から単離した、ＣＤ８^＋Ｔ細胞の中のリン酸化ＳＴＡＴ４の発現レベルを測定するために実行したフローサイトメトリー分析の結果を示す。

具体的には、図２３（Ｂ）に関して記載されている通り、ＣＴ２６^{ＨＥＲ２／Ｎｅｕ}結腸直腸がん細胞を移植したＢａｌｂ／ｃマウスの腫瘍体積が３００ｍｍ^３に到達したときに、二価ｍＩＬ−１２−Ｆｃおよび一価ｍＩＬ−１２−Ｆｃを１μｇのｒｍＩＬ−１２と等モルの濃度でマウスの腹腔内に投与した。２４時間後にマウスの腫瘍流入領域リンパ節を解剖し、ペトリ皿の中でワイヤメッシュを使用して砕き、次に１０ｍｌの２％ＦＢＳ含有培地で洗浄した。次に、１ｍｌの赤血球溶解緩衝液をそれに加えて赤血球を溶解し、生じた細胞をＰＢＳで洗浄し、このように細胞懸濁物を調製した。流入領域リンパ節細胞をＰＥ−ｃｙ５またはＦＩＴＣコンジュゲート抗ＣＤ３および抗ＣＤ８抗体により４℃で３０分間染色し、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で洗浄し、次に冷メタノールで固定した。次に、流入領域リンパ節細胞を冷ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で洗浄し、ＡＰＣコンジュゲート抗ｐＳＴＡＴ４抗体により４℃で３０分間染色し、冷ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で洗浄し、次にフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）およびＦｌｏｗ ｊｏ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって分析した。各試料をドットプロットによって分析し、ＣＤ３^＋ＣＤ８^＋Ｔ細胞の中のｐＳＴＡＴ４の発現レベルを比較した。その結果、一価ｍＩＬ−１２−Ｆｃと比較して、二価ｍＩＬ−１２−Ｆｃは、腫瘍移植マウスの腫瘍流入領域リンパ節においてＣＤ８^＋Ｔ細胞が活性化されたときにｐＳＴＡＴ４の発現を増加させる作用を示した。

図２５（Ｄ）は、図２５（Ｃ）の単一の腹腔内投与から７２時間後の腫瘍流入領域リンパ節の中のＣＤ８^＋Ｔ細胞（メモリー細胞の分化を阻害するＴ−ｂｅｔを発現する）の割合を測定するために実行したフローサイトメトリーの結果を示す。

具体的には、図２３（Ｂ）に関して記載されている通り、ＣＴ２６^{ＨＥＲ２／Ｎｅｕ}結腸直腸がん細胞を移植したＢａｌｂ／ｃマウスの腫瘍体積が３００ｍｍ^３に到達したときに、二価ｍＩＬ−１２−Ｆｃおよび一価ｍＩＬ−１２−Ｆｃを１μｇのｒｍＩＬ−１２の等モル量に対応する濃度でマウスの腹腔内に投与した。７２時間後にマウスの腫瘍流入領域リンパ節を解剖し、ペトリ皿の中でワイヤメッシュを使用して砕き、次に１０ｍｌの２％ＦＢＳ含有培地で洗浄した。次に、１ｍｌの赤血球溶解緩衝液をそれに加えて赤血球を溶解し、生じた細胞をＰＢＳで洗浄し、このように細胞懸濁物を調製した。流入領域リンパ節細胞をＰＥ−ｃｙ５またはＦＩＴＣコンジュゲート抗ＣＤ３および抗ＣＤ８抗体により４℃で３０分間染色し、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で洗浄し、Ｆｏｘｐ３／転写因子染色緩衝液セット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）（細胞核内転写因子染色試薬である）を使用して固定し、次に透過処理した。次に、細胞をＰＥまたはＡＰＣコンジュゲート抗Ｔ−ｂｅｔ抗体により４℃で３０分間染色し、次に透過処理緩衝液でのフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）およびＦｌｏｗ ｊｏ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）分析によって分析した。各試料をドットプロットによって分析し、Ｔ−ｂｅｔを発現するＣＤ３^＋ＣＤ８^＋Ｔ細胞の割合を比較した。その結果、一価ｍＩＬ−１２−Ｆｃと比較して、二価ｍＩＬ−１２−Ｆｃは、腫瘍移植マウスの流入領域リンパ節においてＣＤ８^＋Ｔ細胞が活性化されたときにＴ−ｂｅｔの発現を増加させる作用を示した。したがって、１μｇのＩＬ−１２の等モル量に対応した濃度で二価ｍＩＬ−１２−Ｆｃを投与したときに起こった、短寿命エフェクター細胞へのＣＤ８^＋Ｔ細胞の分化は、一価ｍＩＬ−１２−Ｆｃと比較して、二価ｍＩＬ−１２−Ｆｃの投与が、腫瘍移植マウスの腫瘍流入領域リンパ節においてＴ細胞が活性化されたときにｐＳＴＡＴ４およびＴ−ｂｅｔの発現を増加させたことが原因であることが見出された。

図２５（Ｅ）および２５（Ｆ）は、一価ｍＩＬ−１２−Ｆｃが、２つのＬ−１２分子を発現し、そのためＣＤ８^＋Ｔ細胞を２つのＬ−１２分子によって刺激することができる二価ｍＩＬ−１２−Ｆｃのように抗Ｆｃ抗体と交差反応したときに、細胞中のｐＳＴＡＴ４およびＴ−ｂｅｔの発現が、細胞を二価ｍＩＬ−１２−Ｆｃで処置したときに示されるレベルに類似のレベルまで増加するかどうかを測定した結果を示す。

具体的には、脾臓および腫瘍流入領域リンパ節を正常なＢａｌｂ／ｃマウスから解剖し、ペトリ皿の中でワイヤメッシュを使用して砕き、次に１０ｍｌの２％ＦＢＳ含有培地で洗浄した。次に、１ｍｌの赤血球溶解緩衝液をそれに加えて赤血球を溶解し、生じた細胞をＰＢＳで洗浄し、このように細胞懸濁物を調製した。リンパ節細胞をＰＥコンジュゲート抗ＣＤ８抗体により４℃で３０分間染色し、冷ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で洗浄し、抗ＰＥミクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）と１５分間インキュベートし、ＭＡＣＳ分離器およびＬＳカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用してＣＤ８^＋Ｔ細胞をそこから分離した。０．５μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３抗体の１００μｌを９６ウェル丸底プレートの各ウェルに加え、それを次に４℃で１２時間インキュベートし、ＰＢＳで洗浄してプレートに付着していない抗ＣＤ３抗体を除去し、２μｇ／ｍｌの抗ＣＤ２８抗体の５０μｌを各ウェルに加えた。次に、一価ｍＩＬ−１２−Ｆｃおよび二価ｍＩＬ−１２−Ｆｃを抗Ｆｃ抗体の様々な濃度と４℃で３０分間反応させ、次に２０ｐＭのＩＬ−１２に等モルの濃度で各ウェルに加えた。次に、ＣＤ８^＋Ｔ細胞（４×１０^４／ウェル）を各ウェルに加え、ｐＳＴＡＴ４の発現を測定するために３時間、Ｔ−ｂｅｔの発現を測定するために３日間、３７℃のインキュベーターの中でインキュベートした。ｐＳＴＡＴ４およびＴ−ｂｅｔの発現を測定するために、図２５（Ｃ）および２５（Ｄ）に関して記載した方法によって細胞を染色し、次にフローサイトメトリーによって分析した。各試料をドットプロットによって分析し、ＣＤ８^＋Ｔ細胞の中のｐＳＴＡＴ４またはＴ−ｂｅｔの発現レベルを比較した。その結果、一価ｍＩＬ−１２−Ｆｃを、ＣＤ８^＋Ｔ細胞を２つのＬ−１２分子によって刺激することができるように抗Ｆｃ抗体と交差反応させたときに、細胞中のｐＳＴＡＴ４およびＴ−ｂｅｔの発現レベルは、細胞を二価ｍＩＬ−１２−Ｆｃで処置したときに示されるレベルまで増加したことが示された。

結論として、図２６に示すように、二価ｍＩＬ−１２−Ｆｃと比較して、一価ｍＩＬ−１２−Ｆｃは、ＣＤ８^＋Ｔ細胞がメモリー前駆体エフェクター細胞に、次にエフェクターメモリー細胞およびセントラルメモリー細胞に分化することができるように、ＣＤ８^＋Ｔ細胞の中でｐＳＴＡＴ４およびＴ−ｂｅｔの低い発現を誘導する。したがって、一価ｍＩＬ−１２−Ｆｃは、低い濃度（０．５μｇのＩＬ−１２の等モル量に対応する）でさえ腫瘍移植マウスから腫瘍を除去することができ、したがってマウスの寿命を長くする。しかし、二価ｍＩＬ−１２−Ｆｃは、短寿命エフェクター細胞に細胞が分化してメモリー細胞の発生を妨げることができるように、ＣＤ８^＋Ｔ細胞の中でｐＳＴＡＴ４およびＴ−ｂｅｔの高い発現を誘導する。したがって、二価ｍＩＬ−１２−Ｆｃが一価ｍＩＬ−１２−Ｆｃと同じモル濃度で投与されるとき、それは腫瘍移植マウスから腫瘍を完全に除去することはできない。したがって、二価ｍＩＬ−１２−Ｆｃがより高い濃度（２μｇのＩＬ−１２の等モル量に対応する）で投与され、腫瘍細胞を直接的に破壊するエフェクター段階において細胞傷害性ＣＤ８^＋Ｔ細胞が拡大増殖されるときに限り、二価ｍＩＬ−１２−Ｆｃは腫瘍を除去することができる。

本発明によるヘテロダイマーＦｃ融合タンパク質は、それが、２つまたはそれより多くの異なるサブユニットタンパク質で構成される天然に存在する生理活性タンパク質の活性を保持することができ、それによって、融合タンパク質が、天然に存在する形態および構造を可能な最も高い程度で維持することができるように、タンパク質の各サブユニットを免疫グロブリンのヘテロダイマーＦｃの各鎖に別々に融合させることができるので、組み立てられたタンパク質を形成することによって生理活性を示すという点で、利点を有する。さらに、ｉｎ ｖｉｖｏでのその生理活性が長期持続することができるように、ヘテロダイマーＦｃ融合タンパク質に含有される生理活性タンパク質のｉｎ ｖｉｖｏ半減期を、ヘテロダイマーＦｃによって媒介される長い半減期に起因して有意に増加させることができる。

さらに、本発明によるヘテロダイマーＦｃ融合タンパク質は、さらなる精製過程の最適化を必要とすることなく、ヘテロダイマーＦｃ融合タンパク質を天然の構成で容易に生成することが可能である点で、利点を有する。

本発明は具体的特徴に関して詳細に記載しているが、この記載は好ましい実施形態のためだけであり、本発明の範囲を限定するものでないことは当業者に明らかになる。したがって、本発明の実質的な範囲は、添付の特許請求の範囲およびその均等物によって規定される。

Claims (17)

1. 免疫グロブリンＦｃ（結晶性断片）対の第１のＦｃ領域および第２のＦｃ領域ならびに生理活性タンパク質を含むヘテロダイマーＦｃ融合タンパク質であって、
   前記生理活性タンパク質は２つまたはそれより多くの異なるサブユニットで構成され、前記２つまたはそれより多くの異なるサブユニットは、タンパク質複合体を形成することによって生理活性を示し、
   前記生理活性タンパク質の前記２つまたはそれより多くの異なるサブユニットは、前記第１のＦｃ領域および／または前記第２のＦｃ領域のＮ末端またはＣ末端の１つまたは複数の末端に連結され、
   前記第１のＦｃ領域および前記第２のＦｃ領域のＣＨ３ドメインは、ヘテロダイマーＦｃの形成を促進するように変異させられる、
   ヘテロダイマーＦｃ融合タンパク質。
2. 前記生理活性タンパク質の前記２つまたはそれより多くの異なるサブユニットのうちの１つは、前記第１のＦｃ領域または前記第２のＦｃ領域の前記Ｎ末端または前記Ｃ末端の任意の１つの末端だけに連結され、前記生理活性タンパク質の残りのサブユニット（複数可）は、前記第１のＦｃ領域および前記第２のＦｃ領域のうちの他方の前記Ｎ末端および前記Ｃ末端の１つの末端に連結される、請求項１に記載のヘテロダイマーＦｃ融合タンパク質。
3. 生理活性タンパク質の前記２つまたはそれより多くの異なるサブユニットが、前記第１のＦｃ領域および前記第２のＦｃ領域の各々の前記Ｎ末端および／または前記Ｃ末端の各々に別々に連結される、請求項１に記載のヘテロダイマーＦｃ融合タンパク質。
4. 前記生理活性タンパク質が、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）、インターロイキン−２３（ＩＬ−２３）、インターロイキン−２７（ＩＬ−２７）、インターロイキン−３５（ＩＬ−３５）および卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）からなる群より選択される、請求項１に記載のヘテロダイマーＦｃ融合タンパク質。
5. 前記生理活性タンパク質がＩＬ−１２である、請求項４に記載のヘテロダイマーＦｃ融合タンパク質。
6. ＩＬ−１２のｐ３５またはｐ４０サブユニットのいずれかは、前記第１のＦｃ領域または前記第２のＦｃ領域の前記Ｎ末端または前記Ｃ末端の任意の１つの末端だけに連結され、他方のサブユニットは、前記第１のＦｃ領域および前記第２のＦｃ領域のうちの他方の前記Ｎ末端または前記Ｃ末端の任意の１つの末端にリンカーによって連結される、請求項５に記載のヘテロダイマーＦｃ融合タンパク質。
7. ＩＬ−１２の前記ｐ３５サブユニットおよび前記ｐ４０サブユニットが、前記第１のＦｃ領域および前記第２のＦｃ領域の各々の前記Ｎ末端および／または前記Ｃ末端の各々に別々に連結される、請求項５に記載のヘテロダイマーＦｃ融合タンパク質。
8. 前記第１のＦｃ領域および前記第２のＦｃ領域の各々が、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥからなる群より選択されるＦｃ領域に由来する、請求項１に記載のヘテロダイマーＦｃ融合タンパク質。
9. 前記第１のＦｃ領域および前記第２のＦｃ領域が、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥからなる完全な抗体形態に含まれる、請求項１に記載のヘテロダイマーＦｃ融合タンパク質。
10. 前記第１のＦｃ領域または前記第２のＦｃ領域の前記ＣＨ３ドメインの変異が、以下の群（変異の位置はＥＵインデックスに従って番号付けされる）：
    （１）前記第１のＦｃ領域の前記ＣＨ３ドメインのＫ３７０位のアミノ酸残基の置換Ｋ３７０Ｅ、Ｋ３７０Ｒ、Ｋ３７０Ｍ、Ｋ３７０ＤまたはＫ３７０Ｈ；
    （２）前記第２のＦｃ領域の前記ＣＨ３ドメインのＥ３５７位のアミノ酸残基の置換Ｅ３５７Ｎ、Ｅ３５７Ｄ、Ｅ３５７Ａ、Ｅ３５７Ｉ、Ｅ３５７ＧまたはＥ３５７Ｍ、および前記第２のＦｃ領域の前記ＣＨ３ドメインのＳ３６４位のアミノ酸残基の置換Ｓ３６４ＴまたはＳ３６４Ｗ；
    （３）前記第１のＦｃ領域の前記ＣＨ３ドメインのＫ４０９位のアミノ酸残基の置換Ｋ４０９Ｗ；ならびに
    （４）前記第２のＦｃ領域の前記ＣＨ３ドメインのＦ４０５位のアミノ酸残基の置換Ｆ４０５Ｔ、および前記第２のＦｃ領域の前記ＣＨ３ドメインのＤ３９９位のアミノ酸残基の置換Ｄ３９９Ｖ
    から選択される１つまたは複数の変異を含む、請求項１に記載のヘテロダイマーＦｃ融合タンパク質。
11. 前記第１のＦｃ領域または前記第２のＦｃ領域の前記ＣＨ３ドメインの変異が、以下の群（変異の位置はＥＵインデックスに従って番号付けされる）：
    （１）前記第１のＦｃ領域の前記ＣＨ３ドメインのＫ３６０位のアミノ酸残基の置換Ｋ３６０Ｅ；
    （２）前記第２のＦｃ領域の前記ＣＨ３ドメインのＥ３４７位のアミノ酸残基の置換Ｅ３４７Ｒ；
    （３）前記第１のＦｃ領域の前記ＣＨ３ドメインのＫ４０９位のアミノ酸残基の置換Ｋ４０９Ｗ；ならびに
    （４）前記第２のＦｃ領域の前記ＣＨ３ドメインのＦ４０５位のアミノ酸残基の置換Ｆ４０５Ｔ、および前記第２のＦｃ領域の前記ＣＨ３ドメインのＤ３９９位のアミノ酸残基の置換Ｄ３９９Ｖ
    から選択される１つまたは複数の変異を含む、請求項１に記載のヘテロダイマーＦｃ融合タンパク質。
12. 前記第１のＦｃ領域および前記第２のＦｃ領域の前記ＣＨ３ドメインが、以下の残基（位置はＥＵインデックスに従って番号付けされる）：
    （ｉ）前記第１のＦｃ領域の前記ＣＨ３ドメインのＹ３４９位で置換されたシステイン（Ｃ）；および
    （ｉｉ）前記第２のＦｃ領域の前記ＣＨ３ドメインのＳ３５４位で置換されたシステイン（Ｃ）
    をさらに含む、請求項１０または１１に記載のヘテロダイマーＦｃ融合タンパク質。
13. 請求項１〜１２のいずれか一項に記載のヘテロダイマーＦｃ融合タンパク質を含む医薬組成物。
14. 前記ヘテロダイマーＦｃ融合タンパク質に含有される生理活性タンパク質がＩＬ−１２（ＩＬ−１２）である、請求項１３に記載の医薬組成物。
15. がんを処置するために使用される、請求項１４に記載の医薬組成物。
16. 前記がんが、結腸直腸がん、メラノーマ、乳がん、膵臓がん、腎臓がん、前立腺がん、卵巣がん、小腸がん、食道がん、子宮頸がん、肺がん、リンパ腫および血液がんからなる群より選択される、請求項１５に記載の医薬組成物。
17. 他の抗がん薬との併用療法のために使用される、請求項１５に記載の医薬組成物。