JP2020002014A - 阻害活性物及びその精製方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】本発明は、真菌株であるアスペルギルス属株（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｕｄａｇａｗａｅ ＩＦＭ５４３０２株）を利用し、血小板凝集阻害活性やがん細胞増殖抑制効果を有効に発揮させることができる阻害活性物を提供するものである。【解決手段】本発明の阻害活性物は、真菌株であるアスペルギルス属株（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｕｄａｇａｗａｅ ＩＦＭ５４３０２株）を精製し、化１の絶対立体化学構造式で特定されるＡＵ−１ａ（１Ｒ，２Ｓ）−メチル ２，８−ジヒドロキシ−６−（ヒドロキシメチル）−９−オキソ−２，９—ジヒドロ−１Ｈ−キサンテン−１−カルボキシレートと、化２の絶対立体化学構造式で特定されるＡＵ−１ｂ（１Ｓ，２Ｒ）−メチル ２，８−ジヒドロキシ−６−（ヒドロキシメチル）−９−オキソ−２，９—ジヒドロ−１Ｈ−キサンテン−１−カルボキシレートと、前記ＡＵ−１ａ、ＡＵ−１ｂのラセミ体であるＡＵ−１ａｂと、を得る構成としたものである。【選択図】図１
Description
本発明は、阻害活性物及びその精製方法に関し、詳しくは、真菌株であるアスペルギルス属株（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｕｄａｇａｗａｅ ＩＦＭ５４３０２株）を基にした血小板凝集阻害活性やがん細胞増殖抑制効果を有効に発揮させることができる阻害活性物及びその精製方法に関するものである。
従来、血小板凝集阻害活性やがん細胞増殖抑制効果を発揮させるための阻害活性物や阻害活性方法が種々提案されている。
特許文献１には、本発明に関連する技術として、所定の植物の抽出物から特定の化合物を得てこれを対象物に添加し、ＵＶを照射しＤＮＡ活性を阻害するように構成したＤＮＡ活性阻害方法が提案されている。
しかし、上述した特許文献１の技術を含め、真菌株であるアスペルギルス属株を利用した阻害活性物は開発されていないのが現状である。
本発明は、従来における上記事情に鑑み開発されたものであり、真菌株であるアスペルギルス属株（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｕｄａｇａｗａｅ ＩＦＭ５４３０２株）を利用し、血小板凝集阻害活性やがん細胞増殖抑制効果を有効に発揮させることができる阻害活性物及びその生成方法を提供するものである。
本発明は、真菌株であるアスペルギルス属株（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｕｄａｇａｗａｅ ＩＦＭ５４３０２株）を精製し、化１の絶対立体化学構造式で特定されるＡＵ−１ａ（１Ｒ，２Ｓ）−メチル ２，８−ジヒドロキシ−６−（ヒドロキシメチル）−９−オキソ−２，９―ジヒドロ−１Ｈ−キサンテン−１−カルボキシレートと、化２の絶対立体化学構造式で特定されるＡＵ−１ｂ（１Ｓ，２Ｒ）−メチル ２，８−ジヒドロキシ−６−（ヒドロキシメチル）−９−オキソ−２，９―ジヒドロ−１Ｈ−キサンテン−１−カルボキシレートと、前記ＡＵ−１ａ、ＡＵ−１ｂのラセミ体であるＡＵ−１ａｂと、を得て、前記ＡＵ−１ａ、ＡＵ−１ｂ、ＡＵ−１ａｂを生体の阻害活性薬として用いることを最も主要な特徴とする。
請求項１記載の発明によれば、血小板凝集を抑制する抗血小板薬として有効で、そして、抗がん剤として有効で、更に、チロシンキナーゼの阻害活性薬として有効な阻害活性物を実現し提供することができる。
請求項２記載の発明によれば、前記ＡＵ−１ａ、ＡＵ−１ｂをそれぞれ血小板凝集を抑制する抗血小板薬として有効に機能させることができる阻害活性物を実現し提供することができる。
請求項３記載の発明によれば、前記ＡＵ−１ａ、ＡＵ−１ｂのラセミ体であるＡＵ−１ａｂを血小板凝集を抑制する抗血小板薬として有効に機能させることができる阻害活性物を実現し提供することができる。
請求項４記載の発明によれば、前記ＡＵ−１ａ、ＡＵ−１ｂ及び前記ＡＵ−１ａｂを抗がん剤として有効に機能させることができる阻害活性物を実現し提供することができる。
請求項５記載の発明によれば、前記ＡＵ−１ｂを、チロシンキナーゼの阻害活性薬として有効に機能させることができる阻害活性物を実現し提供することができる。
請求項６記載の発明によれば、既述した効果を奏する阻害活性物であるＡＵ−１ａｂ、ＡＵ−１ａ及びＡＵ−ｌｂを、主に各種クロマトグラフィー処理により効率よく精製することができる阻害活性物の精製方法を実現し提供することができる。
請求項７記載の発明によれば、請求項６記載の発明と同様に、既述した効果を奏する阻害活性物であるＡＵ−１ａｂ、ＡＵ−１ａ及びＡＵ−ｌｂを、主に各種クロマトグラフィー処理により効率よく精製することができる阻害活性物の精製方法を実現し提供することができる。
本発明は、真菌株であるアスペルギルス属株（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｕｄａｇａｗａｅ ＩＦＭ５４３０２株）を利用し、血小板凝集阻害活性やがん細胞増殖抑制効果を有効に発揮させることができる阻害活性物を実現し提供するという目的を、真菌株であるアスペルギルス属株（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｕｄａｇａｗａｅ ＩＦＭ５４３０２株）を精製し、化１の絶対立体化学構造式で特定されるＡＵ−１ａ（１Ｒ，２Ｓ）−メチル ２，８−ジヒドロキシ−６−（ヒドロキシメチル）−９−オキソ−２，９―ジヒドロ−１Ｈ−キサンテン−１−カルボキシレートと、化２の絶対立体化学構造式で特定されるＡＵ−１ｂ（１Ｓ，２Ｒ）−メチル ２，８−ジヒドロキシ−６−（ヒドロキシメチル）−９−オキソ−２，９―ジヒドロ−１Ｈ−キサンテン−１−カルボキシレートと、前記ＡＵ−１ａ、ＡＵ−１ｂのラセミ体であるＡＵ−１ａｂと、を得て、前記ＡＵ−１ａ、ＡＵ−１ｂ、ＡＵ−１ａｂを、血小板凝集抑制、がん細胞増殖抑制、更にはチロシンキナーゼ阻害活性を発揮する阻害活性薬として用いる構成により実現した。
以下、図面を参照して、本発明の実施例に係る阻害活性物及びその精製方法について詳細に説明する。
まず、本実施例に係る阻害活性物について図１乃至図６を参照して詳細に説明する。
本実施例に係る阻害活性物は、真菌株であるアスペルギルス属株（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｕｄａｇａｗａｅ ＩＦＭ５４３０２株）を精製して、下記の化１の絶対立体化学構造式で特定されるＡＵ−１ａ（１Ｒ，２Ｓ）−メチル ２，８−ジヒドロキシ−６−（ヒドロキシメチル）−９−オキソ−２，９―ジヒドロ−１Ｈ−キサンテン−１−カルボキシレートと、下記の化２の絶対立体化学構造式で特定される前記ＡＵ−１ａの立体異性体であるＡＵ−１ｂ（１Ｓ，２Ｒ）−メチル ２，８−ジヒドロキシ−６−（ヒドロキシメチル）−９−オキソ−２，９―ジヒドロ−１Ｈ−キサンテン−１−カルボキシレートと、前記ＡＵ−１ａ、ＡＵ−１ｂのラセミ体であるＡＵ−１ａｂと、を得て、前記ＡＵ−１ａ、ＡＵ−１ｂ、ＡＵ−１ａｂを生体の阻害活性薬として用いるものである。
図１は本実施例に係る阻害活性物におけるＡＵ−１ｂ及びＡＵ−ｌａｂと、Ｓｙｄｏｗｉｎｉｎ Ｂのコラーゲンに関する血小板凝集に及ぼす影響についての濃度と凝集能との関係を示すものであり、また、図２は本実施例に係る阻害活性物におけるＡＵ−１ｂのコラーゲンに関する血小板凝集に及ぼす影響についての濃度と凝集能との関係を示すものである。
図１から明らかなように、ＡＵ−１ｂ及びＡＵ−ｌａｂはＳｙｄｏｗｉｎｉｎ Ｂに比べ特に低濃度（０以上１０未満）の範囲でコラーゲンに関する血小板凝集能が少なく、優れた阻害活性を発揮することが分かる。
また、図２から明らかなように、ＡＵ−１ａも低濃度の範囲でコラーゲンに関する血小板凝集能が少なく、優れた阻害活性を発揮することが分かる。
図３は、本実施例に係る阻害活性物におけるＡＵ−１ａｂ、ＡＵ−１ａ、ＡＵ−ｌｂと、Ｓｙｄｏｗｉｎｉｎ Ｂのコラーゲンに関する５０％阻害活性値（ＩＣ５０）を示すものであり、ＡＵ−１ａｂのＩＣ５０＝２．５、ＡＵ−１ａのＩＣ５０＝２、ＡＵ−１ｂのＩＣ５０＝４．５、Ｓｙｄｏｗｉｎｉｎ ＢのＩＣ５０＝６．８である。
図４は、本実施例に係る阻害活性物におけるＡＵ−１ａｂ、ＡＵ−ｌｂと、Ｓｙｄｏｗｉｎｉｎ Ｂ及びＥｎｇｙｏｄｏｎｔｉｕｍｏｎｅ Ｈの各種のがん細胞増殖抑制効果を示すものであり、本実施例に係るＡＵ−１ａｂ、ＡＵ−ｌｂの各種のがん細胞増殖に関する５０％阻害活性値（ＩＣ５０）は、Ｓｙｄｏｗｉｎｉｎ Ｂ及びＥｎｇｙｏｄｏｎｔｉｕｍｏｎｅ ＨのＩＣ５０に比べてはるかに小さく、各種のがん細胞増殖抑制に関して優れた阻害活性を発揮することが分かる。
すなわち、本実施例に係るＡＵ−１ａｂ、ＡＵ−ｌｂは、肺がん、胃がん、大腸がん、卵巣がん、脳腫瘍、乳がん、胃がん、前立腺がん、メラノーマ等の治療薬として極めて有益である。
そして、本実施例に係るＡＵ−１ａについても同様な効果が予想される。
そして、本実施例に係るＡＵ−１ａについても同様な効果が予想される。
図５は、本実施例に係る阻害活性物におけるＡＵ−１ａｂ、ＡＵ−１ｂと、Ｓｙｄｏｗｉｎｉｎ Ｂのがん細胞増殖抑制効果に関する５０％阻害活性値ＩＣ５０の逆数プロットを示すものである。
次に、慢性骨髄性白血病というのは、遺伝子の転座により起きており、その転座により新しい遺伝子（フィラデルフィア遺伝子と称される）ができるため、それにより新しいキナーゼの一種である「ｂｃｒ−ａｂｌチロシンキナーゼ」という酵素が合成される。
図６は、ｂｃｒ−ａｂｌチロシンキナーゼとＡＵ−１ｂ分子の分子解析ソフトを用いた分子ドッキングの結合像（立体構造）を示すものであり、ＡＵ−１ｂ分子はｂｃｒ−ａｂｌチロシンキナーゼの酵素を阻害活性するとされており、阻害活性物として機能するものである。
また、ＡＵ−１ａ分子も同様に、阻害活性物として機能すると予想される。
以上説明した本実施例に係る阻害活性物であるＡＵ−１ａ、ＡＵ−１ｂは、血小板凝集を抑制する抗血小板薬として、また、前記ＡＵ−１ａ、ＡＵ−１ｂのラセミ体であるＡＵ−１ａｂも、血小板凝集を抑制する抗血小板薬として有用に用いることができる。
また、前記ＡＵ−１ａ、ＡＵ−１ｂ及び前記ＡＵ−１ａｂは、抗がん剤として、更に前記ＡＵ−１ｂは、チロシンキナーゼの阻害活性薬として有用に用いることができる。
次に、本実施例に係る阻害活性物の精製方法について説明する。
（精製方法Ａ）
真菌株であるアスペルギルス属株（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｕｄａｇａｗａｅ ＩＦＭ５４３０２株）を米培地で、２５℃で２１日間培養した。
真菌株であるアスペルギルス属株（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｕｄａｇａｗａｅ ＩＦＭ５４３０２株）を米培地で、２５℃で２１日間培養した。
そして、ＣＨＣｌ３−ＭｅＯＨ（１：１）で抽出後に溶媒を留去し、水とＥｔＯＡｃで液々分配を行って水可溶部を除き、有機層を濃縮してＥｔＯＡｃエキスを得た。
更に、ＭｅＣＮとｈｅｘａｎｅを加えて、液々分配を行って低極性化合物を多く含むｈｅｘａｎｅ可溶部分及び不溶物を除いた。
ＭｅＣＮ可溶部を濃縮して得たエキスについて、エキスの２０倍量のシリカゲルを用いたカラムクロマトグラフィーに付し、ＣＨＣｌ３−ＥｔＯＨ（１００：１、５０：１、２０：１、１０：１、５：１、１：１、０：１）の混合比を変化させ、順次フラクションを溶出した。
ＣＨＣｌ３−ＥｔＯＨ＝２０：１で溶出したフラクションを濃縮後、再度シリカゲルを用いたカラムクロマトグラフィーに付し、ＣＨＣｌ３−ＥｔＯＨ＝３０：１を移動相に用いて精製した。
得られた粗精製物は、固定相にシリカゲルを用いた中圧クロマトグラフィーでＣｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ−ＣＨＣｌ３−ＥｔＯＨ＝５：５：１にて更に精製した。
ここで得られる粗製生物からＡｃｅｔｏｎｅ又はＭｅＯＨを用いて再結晶化を行うことにより、ＡＵ−１ａ／１ｂのラセミ体であるＡＵ−１ａｂが得られる。
次いで、ＯＤＳ（オクタデシルシリル（Ｏｃｔａ Ｄｅｃｙｌ Ｓｉｌｙｌ） 基）を担体とした逆相のＨＰＬＣでＭｅＣＮ−Ｈ２Ｏ−ＴＦＡ＝３２：６８：０．０３の移動相を使用して、ＡＵ−１ａ及びＡＵ−ｌｂの混合物を得た。
ＡＵ−１ａ及びＡＵ−ｌｂの混合物は、移動相にＭｅＯＨを用いた多糖誘導体キラルカラムＨＰＬＣに付すことにより、ＡＵ−ｌａ、ＡＵ−ｌｂを光学分割した。
更に、Ａｃｅｔｏｎｅ又はＡｃｅｔｏｎｅ−Ｈｅｘａｎｅ混合溶媒により再結晶化を行ってＡＵ−ｌａ、ＡＵ−１ｂを単離した。
以上説明した本実施例に係る阻害活性物の精製方法Ａによれば、既述した効果を奏する阻害活性物であるＡＵ−１ａｂ、ＡＵ−１ａ及びＡＵ−ｌｂを主に各種クロマトグラフィー処理により効率よく精製することができる。
（精製方法Ｂ）
真菌株であるアスペルギルス属株（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｕｄａｇａｗａｅ ＩＦＭ５４３０２株）を米培地で、２５℃で２１日間培養した。
真菌株であるアスペルギルス属株（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｕｄａｇａｗａｅ ＩＦＭ５４３０２株）を米培地で、２５℃で２１日間培養した。
次に、ＣＨＣｌ３−ＭｅＯＨ（１：１）で抽出後に溶媒を留去し、水を加えて懸濁させた。
そして、懸濁溶液に対して、Ｈｅｘａｎｅ、ＥｔＯＡｃ、ｎ−ＢｕＯＨで順に液々分配を行った。
上記ＥｔＯＡｃ可溶部を濃縮して得たエキスについて、エキスの２０倍量のシリカゲルを用いたカラムクロマトグラフィーに付し、ＣＨＣｌ３−ＥｔＯＨ（１：０、１００：１、５０：１、２０：１、１０：１、５：１、１：１、０：１）の混合比を変化させ、順次フラクションを溶出した。
ＣＨＣｌ３−ＥｔＯＨ＝１０：１で溶出したフラクションを濃縮後、再度シリカゲルを用いたカラムクロマトグラフィーに付し、Ｈｅｘａｎｅ−Ａｃｅｔｏｎｅ＝１：１を移動相に用いて精製した。
次に、既述した場合と同様、得られた粗精製物は、固定相にシリカゲルを用いた中圧クロマトグラフィーにてＣｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ−ＣＨＣｌ３−ＥｔＯＨ＝５：５：１にて更に精製した。
ここで得られる粗製生物からＡｃｅｔｏｎｅ又はＭｅＯＨを用いて再結晶化を行うことにより、ＡＵ−１ａ／１ｂのラセミ体であるＡＵ−１ａｂが得られる。
次いでＯＤＳを担体とした逆相のＨＰＬＣでＭｅＣＮ−Ｈ２Ｏ−ＴＦＡ＝３２：６８：０．０３の移動相を使用して、ＡＵ−１ａ及びＡＵ−ｌｂ混合物を得た。
ＡＵ−１ａ及びＡＵ−ｌｂ混合物は、移動相にＭｅＯＨを用いた、多糖誘導体キラルカラムＨＰＬＣに付すことにより、ＡＵ−ｌａ及びＡＵ−ｌｂを光学分割した。
更に、Ａｃｅｔｏｎｅ又はＡｃｅｔｏｎｅ−Ｈｅｘａｎｅ混合溶媒により再結晶化を行ってＡＵ−ｌａ、ＡＵ−１ｂを単離した。
以上説明した本実施例に係る阻害活性物の精製方法Ｂによれば、上述した精製方法Ａの場合と同様、既述した効果を奏する阻害活性物であるＡＵ−１ａｂ、ＡＵ−１ａ及びＡＵ−ｌｂを、主に各種クロマトグラフィー処理により効率よく精製することができる。
本発明の阻害活性物は、上述した場合の他、心筋梗塞、血栓症等の循環器病用の阻害活性物として広範に応用可能である。
ＡＵ−ｌａ 阻害活性物
ＡＵ−１ｂ 阻害活性物
ＡＵ−ｌａｂ ＡＵ−１ａ／１ｂのラセミ体
ＡＵ−１ｂ 阻害活性物
ＡＵ−ｌａｂ ＡＵ−１ａ／１ｂのラセミ体
Claims (7)
- 真菌株であるアスペルギルス属株（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｕｄａｇａｗａｅ ＩＦＭ５４３０２株）を精製し、
下記の化１の絶対立体化学構造式で特定されるＡＵ−１ａ（１Ｒ，２Ｓ）−メチル ２，８−ジヒドロキシ−６−（ヒドロキシメチル）−９−オキソ−２，９―ジヒドロ−１Ｈ−キサンテン−１−カルボキシレートと、
下記の化２の絶対立体化学構造式で特定されるＡＵ−１ｂ（１Ｓ，２Ｒ）−メチル ２，８−ジヒドロキシ−６−（ヒドロキシメチル）−９−オキソ−２，９―ジヒドロ−１Ｈ−キサンテン−１−カルボキシレートと、
前記ＡＵ−１ａ、ＡＵ−１ｂのラセミ体であるＡＵ−１ａｂと、
を得て、
前記ＡＵ−１ａ、ＡＵ−１ｂ、ＡＵ−１ａｂを生体の阻害活性薬として用いることを特徴とする阻害活性物。
- 前記ＡＵ−１ａ、ＡＵ−１ｂは、それぞれ血小板凝集を抑制する抗血小板薬として用いられることを特徴とする請求項１に記載の阻害活性物。
- 前記ＡＵ−１ａ、ＡＵ−１ｂのラセミ体であるＡＵ−１ａｂは、血小板凝集を抑制する抗血小板薬として用いられることを特徴とする請求項１に記載の阻害活性物。
- 前記ＡＵ−１ａ、ＡＵ−１ｂ及び前記ＡＵ−１ａｂは、抗がん剤として用いられることを特徴とする請求項１に記載の阻害活性物。
- 前記ＡＵ−１ｂは、チロシンキナーゼの阻害活性薬として用いられることを特徴とする請求項１に記載の阻害活性物。
- 真菌株であるアスペルギルス属株（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｕｄａｇａｗａｅ ＩＦＭ５４３０２株）を培養し、溶媒を用いた抽出後に溶媒を留去する工程と、
溶媒を留去した生成物から水可溶部を除去しエキスを得て、低極性化合物を含む可溶部及び不溶部の除去、濃縮を行って濃縮エキスを得る工程と、
濃縮エキスに対するシリカゲルを用いたクロマトグラフィー処理により前記濃縮エキスのフラクションを抽出する工程と、
前記フラクションの濃縮、シリカゲルを用いた再度のクロマトグラフィー処理により粗生成物を得る工程と、
前記粗生成物に対するシリカゲルを用いた中圧クロマトグラフィー処理及び処理後の粗生成物の再結晶化処理によりＡＵ−１ａ、ＡＵ−１ｂのラセミ体であるＡＵ−１ａｂを得る工程と、
前記ラセミ体であるＡＵ−１ａｂに対する逆相の高速液体クロマトグラフィー処理によりＡＵ−１ａ、ＡＵ−１ｂの混合物を得る工程と、
ＡＵ−１ａ、ＡＵ−１ｂの混合物に対する多糖誘導体キラルカラム高速液体クロマトグラフィー処理によりＡＵ−１ａ、ＡＵ−１ｂを光学分割する工程と、
光学分割したＡＵ−１ａ、ＡＵ−１ｂの再結晶化によりこれらを単離する工程と、
を有することを特徴とする阻害活性物の精製方法。 - 真菌株であるアスペルギルス属株（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｕｄａｇａｗａｅ ＩＦＭ５４３０２株）を培養し、溶媒を用いた抽出後に溶媒を留去する工程と、
溶媒を留去した生成物に対して水を加えて懸濁させ、懸濁溶液の液々分配を行って可溶部を濃縮して得たエキスについて、シリカゲルを用いたカラムクロマトグラフィー処理によりフラクションを溶出する工程と、
溶出したフラクションを濃縮後、再度シリカゲルを用いたカラムクロマトグラフィー処理により粗生成物を精製する工程と、
前記粗生成物に対するシリカゲルを用いた中圧クロマトグラフィー処理及び処理後の粗生成物の再結晶化処理によりＡＵ−１ａ、ＡＵ−１ｂのラセミ体であるＡＵ−１ａｂを得る工程と、
前記ラセミ体であるＡＵ−１ａｂに対する逆相の高速液体クロマトグラフィー処理によりＡＵ−１ａ、ＡＵ−１ｂの混合物を得る工程と、
ＡＵ−１ａ、ＡＵ−１ｂの混合物に対する多糖誘導体キラルカラム高速液体クロマトグラフィー処理によりＡＵ−１ａ、ＡＵ−１ｂを光学分割する工程と、
光学分割したＡＵ−１ａ、ＡＵ−１ｂの再結晶化によりこれらを単離する工程と、
を有することを特徴とする阻害活性物の精製方法。
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| JP2018119859A JP2020002014A (ja) | 2018-06-25 | 2018-06-25 | 阻害活性物及びその精製方法 |
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